JP2004083466A - Tyrosinase inhibitor - Google Patents

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a compound having a tyrosinase inhibitory action. <P>SOLUTION: The tyrosinase inhibitor comprises a kinobeon oxidant (1), a kinobeon reductant (2) or a mixture thereof. <P>COPYRIGHT: (C)2004,JPO

Description

で示されるキノベオン酸化体、式（ＩＩ）：
【化４】

で示されるキノベオン還元体又はこれらの混合物を含んでなるチロシナーゼ活性阻害剤が提供される。
【０００５】
本発明に従えば、前記キノベオン酸化体（Ｉ）及び／又はキノベオン還元体（ＩＩ）と、皮膚外用基剤とを含んでなる皮膚外用剤組成物が提供される。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明者は、前述の如く、キノベオンが従来チロシナーゼ活性阻害剤として知られているビタミンＣ及びその誘導体（例えばＬ−アスコルビン酸）、コウジ酸、アルブチンなどに比較して、キノベオンが遙かに高いチロシナーゼ活性阻害作用を有することを見出した。
【０００７】
このキノベオンは前記式（Ｉ）及び（ＩＩ）の酸化体及び還元体又はその混合物の形態をとる化合物として知られており、例えば、特開平６−１９９７２４号公報に記載の方法によって製造することができる。具体的には、例えばシナピン酸１００ｍｇを少量のメタノール溶液に溶解し、蒸留水を加えて１００ｍｌとした溶液を１２０℃で１５分間加熱し、次に２５℃に冷却して等量の酢酸エチルを加える。得られる酢酸エチル層を濃縮し、この濃縮物に１０ｇのセルロースを加えて吸着させ、２５℃で１時間反応させることによってセルロースパウダーに吸着したキノベオンを得ることができる。
【０００８】
メラニン産生は、図１に示すように、チロシン→ＤＯＰＡ→ＤＯＰＡキノン→ロイコＤＯＰＡクローム→ＤＯＰＡクローム→メラニンの過程を経るが、キノベオンは、このメラニン合成の律速段階であるチロシンからＤＯＰＡキノンにいたる反応を触媒する酵素“チロシナーゼ”の酵素活性を抑制することを見出した。
【０００９】
本発明に係る前記式（Ｉ）及び／又は（ＩＩ）のキノベオン酸化体及び／又は還元体からなるチロシナーゼ阻害剤は、それ単独で、又は皮膚外用剤用基剤その他の成分と配合して皮膚外用剤組成物（例えば治療薬、化粧料）として使用することができる。皮膚外用剤組成物として使用する場合のキノベオンの配合量は、好ましくは組成物全重量当り０．０５ｐｐｍ（重量）〜１０重量％、更に好ましくは０．２ｐｐｍ（重量）〜０．５重量％、最も好ましくは０．５〜５０ｐｐｍ（重量）である。
【００１０】
本発明に係る皮膚外用剤を構成するのに適した皮膚外用剤基剤としては、例えば従来から皮膚外用剤に使用する溶剤、水、油（例えばグリセリン、ワセリン、オリーブ油、ハッカ油、ステアリルアルコール、シクロデキストラン）などを用いることができ、これらは溶液状、分散液状、乳化液状、軟膏（剤）状、貼付（剤）状などの形態とすることができる。
【００１１】
本発明に係る皮膚外用剤組成物には、上記皮膚外用剤基剤に加えて、従来から各種皮膚外用剤に一般的に配合されている添加剤や基剤を本発明の目的を損わない範囲及び量で使用することができる。具体的には、保湿剤（例えばキシリトール、ジプロピレングリコール、プロピレングリコール、マンニトール、プロデュウ（ＤＬ−ピロリドンカルボン酸＋Ｌ−プロリン＋乳酸ナトリウム＋ソルビトール＋コラーゲンの水溶液）、異性化糖／ペンタバイテン）、紫外線吸収剤（例えばオキシベンゾン、グアイアズレン、サルチル酸フェニル、シノキサート、パラアミノ安息香酸エステル、２−（２−ヒドロキシ−５−メチルフェニル）−ベンゾントリアゾール）、ビタミン類（例えばビタミンＡ、ビタミンＢ、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ビタミンＤ）、抗酸化剤（例えばコーキュー１０（ＣｏＱ１０）、カロチノイド、ジブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソール、ローズマリー、セージ、オレガノ、セサミノール、カテコール、スーパーオキサイドディスムターゼ（ＳＯＤ）、カタラーゼ、グルタチオン）、油脂（例えばコーン油、オリーブ油）、界面活性剤（例えば塩化ラウリルトリメチルアンモニウム、酢酸ポリオキシンエチレンラノリンアルコール、臭化セチルトリメチルアンモニウム、セチル硫酸ナトリウム、直鎖型アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム、ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸塩類、ポリオキシエチレンラノレン、ポリオキシエチレンラノレンアルコール、ラウリン硫酸塩）、粉体（例えばシクロデキストリン）、着色剤（例えばジハイドロキシアセトン（ＤＨＡ））などがあげられる。
【００１２】
【実施例】
以下、実施例に従って本発明を更に具体的に説明するが、本発明の技術的範囲をこれらの実施例に限定するものでないことはいうまでもない。
【００１３】
実験に供したキノベオンは下記の方法により化学合成したものを用いた。出発物質であるシリンガアルデヒド２５ｇ（０．１４ｍｏｌ　）とベンゼン５０ｍｌ、無水酢酸ナトリウム０．１７ｇを混合し加温しながら攪拌した。これに無水酢酸２１ｇ（０．２１ｍｏｌ　）を加え、２時間還留し、還留終了後、５０℃まで放冷した後、激しく攪拌しながらヘキサン１００ｍｌを滴下して、シリンガアルデヒドアセチル化物（アセチルシリンガアルデヒド）を得た。このアセチルシリンガアルデヒド２６．９ｇ（０．１２ｍｏｌ　）をメタノール１５０ｍｌに溶解し、攪拌しながら約１０℃に冷却しながら、水素化ホウ素ナトリウム２．２５ｇ（０．０６ｍｏｌ　）を４回に分け１時間で加え、さらに１時間攪拌後、クロロホルムで２回抽出を行った。クロロホルム抽出層を硫酸ナトリウム脱水後、減圧濃縮し、得られた沈殿物にイソプロパノール２４ｍｌを加え、６０℃に加温し溶解させた。これにヘキサン２４ｍｌを加えると結晶が析出した。この結晶をろ過し、減圧乾燥してベンジルアルコール型化合物が得た。ベンジルアルコール型化合物からホスホニウム塩の合成は以下の通りである。即ち、得られたベンジルアルコール型化合物５．１０ｇ（０．０２３ｍｏｌ　）にベンゼン１５ｍｌを加え攪拌しながら氷冷し、チオニルクロライド１．８３ｍｌを３０分間で滴下し、その後１時間攪拌した後、４０℃以下で減圧濃縮した。濃縮物にベンゼン５ｍｌを加え溶解後、さらに減圧濃縮し、濃縮後トルエン２０ｍｌを加え、トリフェニルホスフィン８．７ｇ（０．０３３ｍｏｌ　）を加えて、４時間還留し、還留終了後、析出した結晶をろ過し、減圧乾燥することによりホスホニウム塩を得た。このホスホニウム塩３．３１ｇ（０．００６５ｍｏｌ　）をテトラヒドロフラン１５ｍｌに懸濁し、６０℃に加温しながら、４０％のグリオキサール水溶液０．４３５ｇ（０．００３ｍｏｌ　）を加え、窒素置換し、窒素雰囲気下で、４０％水酸化ナトリウム１．５ｇ（０．０１５ｍｏｌ　）を１０分間で滴下した。２時間攪拌後、反応物を１０℃以下に冷却し、生成した沈殿物をろ過し、沈殿物を蒸留水１５０ｍｌに懸濁し、再度ろ過した。ろ液を分液ロートに入れ、ジエチルエーテル４０ｍｌで３回洗浄し、水層をビーカーに移し、６Ｎ−塩酸で弱酸性にしたところ還元型キノベオンが得られた。析出したキノベオン還元体をろ別し、減圧乾燥した。キノベオン還元体１０ｍｇをクロロホルム５ｍｌに溶解し、過酸化ベンゾイル２０ｍｇを加えて、室温で３０分間攪拌したところキノベオン酸化体が得られた。この酸化体は、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより、展開溶媒ベンゼン、アセトン、メタノール（７：２：１）によって展開、精製した。さらに、セファデクスＬＨ−２０（アマシャム　バイオサイエンス（株）より入手）カラムクロマトグラフィーを用いて、メタノールにて展開、精製した。最終的には、アルミナカラムクロマトグラフィーによって、展開溶媒ベンゼン、酢酸エチル、メタノール（７：２：１）により精製し純品を得た。
【００１４】
例１
以下に従来からチロシナーゼ阻害剤として知られているコウジ酸、アルブミン及びＬ−アスコルビン酸と比較したキノベオン酸化体のチロシナーゼ阻害活性作用の試験例を示す。なお、試験に供したキノベオン酸化体は化学合成した。
【００１５】
図２に示すように、キノベオン酸化体、コウジ酸、アルブミン及びＬ−アスコルビン酸を用いてこれらの阻害剤がマッシュルームチロシナーゼ（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ　Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ　ＭＯより入手）の活性を如何に阻害するかを濃度を１μＭより変化させて以下の方法で試験した。結果を図２に示す（試験は各濃度において１０点の結果の平均値である）。
【００１６】
チロシナーゼ活性は、リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中にて１０μｇ／ｍｌのマッシュルームチロシナーゼ及び１ｍＭのＬ−ＤＯＰＡを基質として加え、３７℃にて４時間あるいは１０分間反応した。反応終了後、吸光度（４７５ｎｍ）を測定し、酵素活性を計算した。
【００１７】
図２に示すように、キノベオン酸化体のチロシナーゼ活性阻害作用は、従来から知られているチロシナーゼ阻害剤として作用し結果的に美白化粧料としての作用を示すビタミンＣ及びその誘導体、コウジ酸、アルブチンに比較して遥かに強い阻害作用を示すことがマッシュルームチロシナーゼを用いた実験により判明した。
【００１８】
例２
例１において、マッシュルームチロシナーゼに代えて、ヒトチロシナーゼを用いて、各阻害剤の阻害活性を同様な条件で試験した。なお、実験に供したヒトチロシナーゼは、ヒトメラニン産生細胞ＨＭＶＩＩ：理研ジーンバンク（ＲＣＢ０７７７）より、Ｓｅｉｊｉらの方法により粗精製したものを用いた。結果を図３に示す。図３に示すように、ヒトのチロシナーゼを用いた実験では、キノベオン酸化体は、従来のチロシナーゼ阻害剤に比較して、さらに強い阻害作用を示すことが明らかとなり、チロシナーゼ阻害作用に基づく美白化粧料として有用であることが示された。
【００１９】
例３
この例ではメラニン産生培養細胞株であるＢ１６細胞（理研ジーンバンク（ＲＣＢ０５５７）より入手）内のチロシナーゼ活性をキノベオン酸化体が阻害するか否かを確認するためチロシナーゼ活性染色の試験を行った。結果は図４に示す通り、顕著に阻害することを認めた。なお、試験方法は以下の通りとした。
【００２０】
Ｌ−ＤＯＰＡを基質として、電気泳動のゲル内においてチロシナーゼ活性染色を以下の通り行った。１×１０^６　個のＢ１６細胞に１００μｌの細胞破砕液（１％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００、１ｍＭフェニルメチルスルフォニルフルオライド、１μｇ／ｍｌアプロチン、１０μｇ／ｍｌロイペプチン、０．１Ｍ　リン酸緩衝液（ｐＨ６．８））を加え超音波破砕し細胞溶解液を調製した。この破砕液を用いてドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。電気泳動後、ポリアクリルアミドゲルを２００ｍｌの０．１Ｍ　リン酸緩衝液（ｐＨ６．８）にて洗浄した。洗浄を終えたゲルを２００ｍｌの５ｍＭ　Ｌ−ＤＯＰＡ含有０．１Ｍ　リン酸緩衝液（ｐＨ６．８）に浸し、３７℃、３０分ゆっくりと振盪し、チロシナーゼ活性染色を実施した。
【００２１】
例４
この例では、キノベオン酸化体が、Ｂ１６細胞内のメラニン量を有意に低下させるか否かの確認を行った。その結果が図５に示すように、キノベオン酸化体はＢ１６細胞内のメラニン量を有意に低下させることが判明した。なお、試験方法は以下の通りとした。
【００２２】
約１×１０^６　個のＢ１６細胞をリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）にて洗浄後、５００μｌの１Ｍ　ＮａＯＨを加え超音波破砕し、一昼夜放置し細胞を溶解した。この細胞溶解液の吸光度（４７５ｎｍ）を測定し、既知量の合成メラニンの吸光度から計算し、メラニン量を決定した。
【００２３】
以上、キノベオン酸化体についての実験結果を詳細に説明したが、キノベオン還元体も同様のチロシナーゼ活性阻害作用を有することを確認している。
【００２４】
【発明の効果】
以上の通り、本発明に従ったキノベオン酸化体及び／又は還元体は、メラニン合成の律速段階であるチロシンからＤＯＰＡキノンにいたる反応を触媒する酵素“チロシナーゼ”の酵素活性を効果的に抑制し、そのチロシナーゼ活性阻害作用は、図２に示すように、マッシュルームチロシナーゼを用いた実験により、従来から知られているチロシナーゼ阻害剤として作用し結果的に美白化粧料としての作用を示すビタミンＣ及びその誘導体、コウジ酸、アルブチンに比較して遙かに強い阻害作用を示すことが判明した。さらに、ヒトのチロシナーゼを用いた実験では、キノベオンは他のチロシナーゼ阻害剤に比較してさらに強い阻害作用を示すことも明らかとなり、チロシナーゼ阻害作用に基づく美白化粧料として有用であることが確認できた。
キノベオンは、メラニン産生培養細胞株であるＢ１６細胞内のチロシナーゼ活性を顕著に阻害し、さらにＢ１６細胞内のメラニン量を有意に低下させることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】チロシンからのメラニン産生機構を示す図面である。
【図２】例１のマッシュルームチロシナーゼ活性の阻害率についてコウジ酸、アルブミン及びＬ−アスコルビン酸に対比したキノベオン酸化体の活性を示すグラフ図である。
【図３】例２のヒトチロシナーゼ活性の阻害率について例１と同様にして得られた結果を示すグラフ図である。
【図４】例３におけるキノベオン酸化体のメラニン産生培養細胞株であるＢ１６細胞内のチロシナーゼ活性の阻害効果を示す写真図である。
【図５】例４におけるキノベオン酸化体のＢ１６細胞内の産生メラニン量の低下に及ぼす効果を示すグラフ図である。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a tyrosinase activity inhibitor comprising an oxidized quinoveon and / or a reduced quinoveon, and an external preparation composition containing the same as an active ingredient. More particularly, the present invention relates to a cosmetic composition having excellent fair skin effect and a skin external composition having an excellent effect of preventing stains, freckles and the like, comprising quinoveon as an active ingredient.
The external preparation composition referred to in the present specification is used to mean a drug (ointment, lotion, liniment, emulsion, etc.) used for external use in addition to cosmetics.
[0002]
[Prior art]
The quinoveon used as an active ingredient of the external preparation for skin of the present invention is an quinoveon oxidized form and / or a quinoveon reduced form represented by formulas (I) and (II), and quinoveon is conventionally used as a medicinal ingredient. Was not known.
[0003]
[Problems to be solved by the invention]
BACKGROUND ART Conventionally, as a whitening cosmetic composition, a composition containing a tyrosinase activity inhibitor such as vitamin C and its derivatives, kojic acid, and arbutin has been known. The present inventors have found that quinobeon has a much stronger inhibitory effect on tyrosinase activity than these tyrosinase inhibitors.
[0004]
[Means for Solving the Problems]
According to the present invention, formula (I):
Embedded image

An oxidized quinobeon represented by the formula (II):
Embedded image

A tyrosinase activity inhibitor comprising a quinobeon reduced product represented by the formula (I) or a mixture thereof:
[0005]
According to the present invention, there is provided a skin external preparation composition comprising the quinobeon oxidized form (I) and / or quinoveon reduced form (II) and a skin external base.
[0006]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
As described above, the present inventors have found that quinobeon has a much higher quinobeon as compared to vitamin C and its derivatives (for example, L-ascorbic acid), kojic acid, arbutin, etc. which are conventionally known as tyrosinase activity inhibitors. They have been found to have a tyrosinase activity inhibitory action.
[0007]
This quinobeon is known as a compound in the form of the oxidized form and the reduced form of the above formulas (I) and (II) or a mixture thereof, and can be produced, for example, by the method described in JP-A-6-199724. it can. Specifically, for example, dissolving 100 mg of sinapinic acid in a small amount of a methanol solution, adding distilled water to make 100 ml, heating the solution at 120 ° C. for 15 minutes, and then cooling to 25 ° C. to obtain an equivalent amount of ethyl acetate Add. The obtained ethyl acetate layer is concentrated, 10 g of cellulose is added to the concentrate, and the mixture is adsorbed, and reacted at 25 ° C. for 1 hour, whereby quinoveon adsorbed on cellulose powder can be obtained.
[0008]
As shown in FIG. 1, melanin production goes through a process of tyrosine → DOPA → DOPA quinone → leuco DOPA chrome → DOPA chrome → melanin, and quinobeon reacts from tyrosine to DOPA quinone, which is the rate-limiting step of melanin synthesis. Was found to inhibit the enzyme activity of the enzyme "tyrosinase", which catalyzes the reaction.
[0009]
The tyrosinase inhibitor comprising the oxidized and / or reduced quinoveon of the formula (I) and / or (II) according to the present invention may be used alone or in combination with a base for a skin external preparation or other components. It can be used as an external preparation composition (for example, a therapeutic agent or a cosmetic). When used as a skin external preparation composition, the amount of quinobeon is preferably 0.05 ppm (weight) to 10% by weight, more preferably 0.2 ppm (weight) to 0.5% by weight, based on the total weight of the composition. Most preferably, it is 0.5 to 50 ppm (weight).
[0010]
The skin external preparation base suitable for constituting the skin external preparation according to the present invention includes, for example, solvents, water and oils conventionally used in skin external preparations (for example, glycerin, petrolatum, olive oil, peppermint oil, stearyl alcohol, (Cyclodextran) can be used, and these can be in the form of a solution, a dispersion, an emulsion, an ointment (agent), a patch (agent), or the like.
[0011]
In the skin external preparation composition according to the present invention, in addition to the above-mentioned skin external preparation base, additives and bases which have been conventionally generally added to various skin external preparations do not impair the object of the present invention. It can be used in ranges and amounts. Specifically, humectants (for example, xylitol, dipropylene glycol, propylene glycol, mannitol, produ (aqueous solution of DL-pyrrolidonecarboxylic acid + L-proline + sodium lactate + sorbitol + collagen), isomerized sugar / pentabitene), ultraviolet light Absorbents (e.g., oxybenzone, guaiazulene, phenyl salicylate, sinoxate, paraaminobenzoate, 2- (2-hydroxy-5-methylphenyl) -benzontriazole), vitamins (e.g., vitamin A, vitamin B, vitamin C, Vitamin E, Vitamin D), antioxidants (eg, CoQ10), carotenoids, dibutylhydroxytoluene, butylhydroxyanisole, rosemary, sage, oregano, sesaminol, catechol , Superoxide dismutase (SOD), catalase, glutathione), fats (eg, corn oil, olive oil), surfactants (eg, lauryl trimethyl ammonium chloride, polyoxine ethylene lanolin alcohol, cetyl trimethyl ammonium bromide, sodium cetyl sulfate, linear chain) Type sodium alkylbenzene sulfonate, polyoxyethylene lauryl ether sulfates, polyoxyethylene lanolene, polyoxyethylene lanolene alcohol, laurin sulfate), powder (eg, cyclodextrin), coloring agent (eg, dihydroxyacetone (DHA)) ).
[0012]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to Examples, but it goes without saying that the technical scope of the present invention is not limited to these Examples.
[0013]
The quinobeon used in the experiment was chemically synthesized by the following method. 25 g (0.14 mol) of syringaldehyde, which is a starting material, 50 ml of benzene, and 0.17 g of anhydrous sodium acetate were mixed and stirred while heating. 21 g (0.21 mol) of acetic anhydride was added thereto, and the mixture was refluxed for 2 hours. After the completion of the distillation, the mixture was allowed to cool to 50 ° C., and 100 ml of hexane was added dropwise with vigorous stirring to give acetylated syringaldehyde (acetyl). Syringaldehyde) was obtained. 26.9 g (0.12 mol) of this acetylsyringaldehyde was dissolved in 150 ml of methanol, and 2.25 g (0.06 mol) of sodium borohydride was divided into four portions for 1 hour while cooling to about 10 ° C. while stirring. After further stirring for 1 hour, extraction was performed twice with chloroform. The chloroform-extracted layer was dehydrated with sodium sulfate and then concentrated under reduced pressure. To the obtained precipitate, 24 ml of isopropanol was added, and the mixture was heated to 60 ° C. and dissolved. When 24 ml of hexane was added thereto, crystals precipitated. The crystals were filtered and dried under reduced pressure to obtain a benzyl alcohol type compound. The synthesis of a phosphonium salt from a benzyl alcohol type compound is as follows. That is, 15 ml of benzene was added to 5.10 g (0.023 mol) of the obtained benzyl alcohol compound, and the mixture was ice-cooled with stirring, 1.83 ml of thionyl chloride was added dropwise for 30 minutes, and then stirred for 1 hour, and then stirred at 40 ° C. It concentrated under reduced pressure below. 5 ml of benzene was added to the concentrate for dissolution, and the mixture was further concentrated under reduced pressure. After concentration, 20 ml of toluene was added, 8.7 g (0.033 mol) of triphenylphosphine was added, and the mixture was refluxed for 4 hours. The crystals were filtered and dried under reduced pressure to obtain a phosphonium salt. 3.31 g (0.0065 mol) of this phosphonium salt was suspended in 15 ml of tetrahydrofuran, and while heating to 60 ° C., 0.435 g (0.003 mol) of a 40% aqueous glyoxal solution was added. And 1.5 g (0.015 mol) of 40% sodium hydroxide were added dropwise over 10 minutes. After stirring for 2 hours, the reaction product was cooled to 10 ° C. or lower, the generated precipitate was filtered, the precipitate was suspended in 150 ml of distilled water, and filtered again. The filtrate was put into a separating funnel, washed three times with 40 ml of diethyl ether, and the aqueous layer was transferred to a beaker and weakly acidified with 6N-hydrochloric acid to obtain reduced quinoveon. The precipitated quinoveon reduced product was separated by filtration and dried under reduced pressure. 10 mg of the reduced quinoveon was dissolved in 5 ml of chloroform, 20 mg of benzoyl peroxide was added, and the mixture was stirred at room temperature for 30 minutes to obtain an oxidized quinoveon. The oxidized product was developed and purified by silica gel column chromatography using developing solvents benzene, acetone, and methanol (7: 2: 1). Further, using Sephadex LH-20 (obtained from Amersham Biosciences) column chromatography, the product was developed and purified with methanol. Finally, the product was purified by alumina column chromatography using a developing solvent of benzene, ethyl acetate, and methanol (7: 2: 1) to obtain a pure product.
[0014]
Example 1
The following shows test examples of the tyrosinase inhibitory activity of oxidized quinoveon compared with kojic acid, albumin and L-ascorbic acid, which are conventionally known as tyrosinase inhibitors. The quinobeon oxidant used for the test was chemically synthesized.
[0015]
As shown in Figure 2, how these inhibitors inhibit the activity of mushroom tyrosinase (obtained from Sigma Chemicals Co., St. Louis MO) using quinobeon oxidized form, kojic acid, albumin and L-ascorbic acid. Was tested by the following method while changing the concentration from 1 μM. The results are shown in FIG. 2 (the test is the average of 10 results at each concentration).
[0016]
The tyrosinase activity was determined by adding 10 μg / ml mushroom tyrosinase and 1 mM L-DOPA as substrates in a phosphate buffer (pH 7.4) and reacting at 37 ° C. for 4 hours or 10 minutes. After completion of the reaction, the absorbance (475 nm) was measured, and the enzyme activity was calculated.
[0017]
As shown in FIG. 2, the tyrosinase activity inhibitory action of the oxidized quinoveon is a vitamin C and its derivatives, kojic acid, arbutin, which act as a conventionally known tyrosinase inhibitor and consequently act as a whitening cosmetic. An experiment using mushroom tyrosinase was found to exhibit a much stronger inhibitory effect as compared to
[0018]
Example 2
In Example 1, the inhibitory activity of each inhibitor was tested under similar conditions using human tyrosinase instead of mushroom tyrosinase. In addition, the human tyrosinase used in the experiment was obtained by roughly purifying human melamine-producing cells HMVII from Riken Gene Bank (RCB0777) according to the method of Seiji et al. The results are shown in FIG. As shown in FIG. 3, in the experiment using human tyrosinase, it was revealed that the quinobeon oxidized product exhibited a stronger inhibitory effect than the conventional tyrosinase inhibitor, and a whitening cosmetic based on the tyrosinase inhibitory effect was found. Has been shown to be useful.
[0019]
Example 3
In this example, a test for tyrosinase activity staining was performed to confirm whether or not oxidized quinobeon inhibits tyrosinase activity in B16 cells (obtained from RIKEN Gene Bank (RCB0557)), which is a melanin-producing cultured cell line. As shown in FIG. 4, the results confirmed that the inhibition was significant. The test method was as follows.
[0020]
Using L-DOPA as a substrate, tyrosinase activity staining was performed in an electrophoresis gel as follows. 100 μl of cell lysate (1% Triton X-100, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, 1 μg / ml aprotin, 10 μg / ml leupeptin, 0.1 M phosphate buffer (pH 6.8) was added to 1 × 10 ⁶ B16 cells. )) And sonicated to prepare a cell lysate. Using the crushed liquid, sodium dodecyl sulfate (SDS) -10% polyacrylamide gel electrophoresis was performed. After the electrophoresis, the polyacrylamide gel was washed with 200 ml of a 0.1 M phosphate buffer (pH 6.8). The washed gel was immersed in 200 ml of 0.1 M phosphate buffer (pH 6.8) containing 5 mM L-DOPA, and slowly shaken at 37 ° C for 30 minutes to perform tyrosinase activity staining.
[0021]
Example 4
In this example, it was confirmed whether or not the oxidized quinoveon significantly reduced the amount of melanin in B16 cells. As shown in FIG. 5, the result showed that the oxidized quinoveon significantly reduced the amount of melanin in B16 cells. The test method was as follows.
[0022]
After washing about 1 × 10 ⁶ B16 cells with a phosphate buffer (pH 7.4), 500 μl of 1 M NaOH was added thereto, and the mixture was sonicated and left overnight to dissolve the cells. The absorbance (475 nm) of this cell lysate was measured and calculated from the absorbance of a known amount of synthetic melanin to determine the amount of melanin.
[0023]
The experimental results of the quinoveon oxidized form have been described in detail above, and it has been confirmed that the quinoveon reduced form also has a similar tyrosinase activity inhibitory action.
[0024]
【The invention's effect】
As described above, the quinobeon oxidized form and / or reduced form according to the present invention effectively inhibits the enzyme activity of the enzyme “tyrosinase”, which catalyzes the reaction from tyrosine to DOPA quinone, which is the rate-limiting step of melanin synthesis, As shown in FIG. 2, the tyrosinase activity-inhibiting activity was confirmed by an experiment using mushroom tyrosinase, as a vitamin C and a derivative thereof which act as a conventionally known tyrosinase inhibitor and consequently act as a whitening cosmetic. Showed a much stronger inhibitory effect than kojic acid and arbutin. Furthermore, in experiments using human tyrosinase, it was also clarified that quinobeon exhibited an even stronger inhibitory effect than other tyrosinase inhibitors, confirming that it was useful as a whitening cosmetic based on tyrosinase inhibitory activity. .
Quinobeon significantly inhibits tyrosinase activity in B16 cells, which is a melanin-producing cultured cell line, and can significantly reduce the amount of melanin in B16 cells.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a drawing showing the mechanism of melanin production from tyrosine.
FIG. 2 is a graph showing the activity of oxidized quinoveon as compared to kojic acid, albumin and L-ascorbic acid with respect to the inhibition rate of mushroom tyrosinase activity in Example 1.
FIG. 3 is a graph showing the results obtained in the same manner as in Example 1 for the inhibition rate of human tyrosinase activity in Example 2.
4 is a photograph showing the inhibitory effect of oxidized quinoveon in Example 3 on tyrosinase activity in B16 cells, a melanin-producing cultured cell line. FIG.
FIG. 5 is a graph showing the effect of oxidized quinoveon on the reduction in the amount of melanin produced in B16 cells in Example 4.

Claims (3)

Formula (I):

An oxidized quinobeon represented by the formula (II):

A tyrosinase activity inhibitor comprising a quinobeon reduced form represented by the formula (1) or a mixture thereof. A melanin production inhibitor comprising the compound of the formula (I) and / or the formula (II) according to claim 1 or a mixture thereof. A skin external preparation composition comprising the quinoveon oxidized form (I) and / or quinoveon reduced form (II) according to claim 1 and a skin external preparation base.

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