JP2004081204A - ＲａｓＧＥＦモチーフを有する新規ポリペプチド及びそれをコードするＤＮＡ - Google Patents

Abstract

【課題】脳・神経系疾患の予防薬、治療薬、あるいは検査薬のスクリーニング等に有用な新規ＤＮＡ及び該ＤＮＡを含む遺伝子、該ＤＮＡにコードされる新規ポリペプチド及び該ポリペプチドを含む組換え蛋白質、新規ポリペプチドに対する抗体を提供すること。
【解決手段】特定の塩基配列から成るＤＮＡと同一又は実質的に同一のアミノ酸配列の一部又は全部から成るポリペプチド、一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、前記ポリペプチドと実質的に同質の生物学的活性を有するポリペプチド。
【選択図】図１

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＲａｓＧＥＦ（Ｇｕａｎｉｎｅ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｅｘｃｈａｎｇｅ　Ｆａｃｔｏｒ　ｆｏｒ　Ｒａｓ−ｌｉｋｅ　ｓｍａｌｌ　ＧＴＰａｓｅｓ）蛋白質に特徴的なモチーフを有し、かつ脳に強発現が認められる新規ＤＮＡ及び該ＤＮＡを含む遺伝子、該ＤＮＡにコードされる新規ポリペプチド及び該ポリペプチドを含む組換え蛋白質、並びに、新規ポリペプチドに対する抗体等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年のヒトゲノムプロジェクト及びヒトｃＤＮＡプロジェクトの成功により、多くのヒト疾患関連遺伝子が同定あるいは推定されるにいたった。しかしながらその一方で倫理上の問題からヒト遺伝子を用いた研究には制約があり、新たな研究の方向性が模索されている。このような観点からモデル生物における相同遺伝子を同定することは、研究を進展させる意味できわめて重要なステップと考えられる。特にマウスは最も研究が進んでいるモデル生物で、ゲノム情報や変異種の情報も比較的多く蓄積されているが、蓄積されたゲノム情報はまだ十分なものではない。一方、生体内で発現している遺伝子を解析する手段として、ｃＤＮＡの配列をランダムに解析する研究がなされ、得られたｃＤＮＡの断片配列がＥｘｐｒｅｓｓｅｄ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｔａｇ（ＥＳＴ）としてデータベースに登録、公開がなされた。しかし、多くのＥＳＴは１００塩基長から５００塩基長といった短い塩基配列情報のみであり、その機能を推定することは困難である。
【０００３】
脳、神経系では、多くのホルモン、ホルモン様物質、神経伝達物質あるいは生理活性物質による調節のもとで生理的な機能の調節が行なわれている。また、機能の調節には、機能を受け持つ特異的な細胞の増殖あるいは同細胞の活性化が関係している。従って、脳に強く発現している新規な遺伝子を取得して、それにコードされる脳、神経系における複雑な機能を調節する蛋白質を得ることは、医薬品開発に有用である。また、得られた蛋白質に対するアゴニスト、アンタゴニストを効率よくスクリーニングし、医薬品を開発するためには、生体内で発現している該蛋白質の遺伝子の機能をホモロジー検索から推定し、その情報を基にして該蛋白質を適当な発現系で発現させて組換え蛋白質を得、更にして該蛋白質に特異的に結合する抗体を得ることが必要であった。
【０００４】
長鎖ヒトｃＤＮＡプロジェクトにて、ヒト脳由来のヒトＫＩＡＡ１７６８遺伝子（ＤＮＡ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０００，７：３４７−３５５）が報告されているが、その機能については不明であった。ヒトＫＩＡＡ１７６８遺伝子は染色体１０ｑ２６．３に存在し、更に、ヒトＫＩＡＡ１７６８遺伝子のＳＮＰｓも複数箇所報告されており（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＳＮＰ／ｓｎｐ＿ｒｅｆ．ｃｇｉ？ｌｏｃｕｓＩｄ＝８５４４２）、ヒト疾患の大部分が単なる遺伝子の欠失によって引き起こされるのではなくて、アミノ酸置換によって蛋白質の機能や活性が一部分だけ変化することにより引き起こされることを鑑みると、ヒトＫＩＡＡ１７６８遺伝子は癌やＰｒａｄｅｒ−Ｗｉｌｌｉ−ｌｉｋｅ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ（Ｇｅｎｅｔ　Ｃｏｕｎｓ　２０００；１１（２）：１１９−２６）のような先天性疾患に関与している可能性が考えられる。しかしながら、ヒトＫＩＡＡ１７６８遺伝子にコードされる蛋白質に特徴的なモチーフが認められず遺伝子情報としては不十分であり、ヒトＫＩＡＡ１７６８遺伝子の機能を推定することが出来なかった。
【０００５】
【本発明が解決しようとする課題】
従来、ヒト長鎖ｃＤＮＡプロジェクトでヒトＫＩＡＡ１７６８遺伝子が取得されていたが、遺伝子情報が完全でなくその機能が不明であった。一方、脳・神経系で発現する新規遺伝子を取得し、該遺伝子、該遺伝子がコードする蛋白質あるいはその蛋白質に特異的に結合する抗体を得ることは、細胞内で該蛋白質が他の蛋白質との結合を阻害する化合物を、あるいはシグナル伝達等に影響及ぼす化合物をスクリーニングするのに重要である。
【０００６】
従って、ヒトＫＩＡＡ１７６８遺伝子に関連する新規遺伝子を取得し、新規モチーフを取得し、同遺伝子の組織特異的発現パターンを得て、該新規遺伝子がコードする蛋白質の機能に関する情報を得ることは、該蛋白質の特異的結合蛋白質や、アゴニスト、アンタゴニストを検索する際の非常に重要な手段となる。上記の蛋白質の特異的結合蛋白質が見出されなくても、該蛋白質の不活化実験（例えばノックアウト動物の作製）から該蛋白質の生理作用を解析することにより、該蛋白質に対するアゴニストまたはアンタゴニストを作製することが可能であり、該蛋白質に対する特異的結合蛋白質、アゴニストまたはアンタゴニストなどは、脳・神経系疾患の患者の機能不全に関連する疾患の予防あるいは治療薬や診断薬として活用することが可能となる。生体での該蛋白質の機能の低下または昂進が、脳・神経系の疾患の原因となっている場合が考えられる場合がある。この場合には、該蛋白質に対するアンタゴニストやアゴニストの投与だけでなく、該蛋白質の脳・神経系への投与や、該蛋白質をコードする遺伝子に対するアンチセンス核酸の投与、あるいは該遺伝子を用いた遺伝子治療に応用することもできる。この場合には該蛋白質の塩基配列は、脳・神経系疾患の患者の遺伝子欠失や変異の有無を調べるために必要な情報であり、該蛋白質をコードする遺伝子は、該蛋白質の機能不全に関与する疾患の予防あるいは治療薬や診断薬に応用することが出来る。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、鋭意研究を重ねた結果、マウス脳由来のｃＤＮＡライブラリーから、ヒトＫＩＡＡ１７６８遺伝子に高いホモロジーを示す遺伝子（ＤＮＡ）をクローニングし、Ｎ−末端側及びＣ−末端側にヒトＫＩＡＡ１７６８遺伝子になかった全く新しい配列が付加していること、またＣ−末端側にＲａｓＧＥＦ（Ｇｕａｎｉｎｅ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｅｘｃｈａｎｇｅ　ｆａｃｔｏｒ　ｆｏｒ　Ｒａｓ−ｌｉｋｅ　ｓｍａｌｌ　ＧＴＰａｓｅｓ）に特異的なモチーフを有することを発見し、新規ポリペプチドとそれに特異的な抗体を得て、本発明を完成するに至った。更に、ホモロジー検索により、本発明のマウス由来のポリペプチドと実質的に相同な遺伝子から由来するヒトポリペプチドのアミノ配列取得した。
【０００８】
即ち、本発明は第一の態様として、以下の（ａ）のポリペプチドをコードする塩基配列から成るＤＮＡ：（ａ）配列番号：１又は配列番号：１６で示されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列の一部（例えば、以下に示すＲａｓＧＥＦモチーフの少なくとも一つを有するもの）又は全部から成るポリペプチド；又は（ｂ）配列番号：１又は配列番号：１６で示されるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、（ａ）のポリペプチドの一部又は全部と実質的に同質の生物学的活性を有するポリペプチド、に係る。
本発明の第二の態様として、以下の（ａ）のＤＮＡ：（ａ）配列番号：２で示される塩基配列において、配列番号：１で示されるアミノ酸配列（配列番号：２の塩基対第１〜５３１０番目）の一部（例えば、以下に示すＲａｓＧＥＦモチーフの少なくとも一つを有するもの）又は全部をコードするＤＮＡ；（ｂ）（ａ）のＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ；又は（ｃ）（ａ）のＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、（ａ）のポリペプチドの一部又は全部と実質的に同質の生物学的活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡに係る。以上の本発明の第一及び第二の態様であるＤＮＡをまとめて、以下、「本発明のＤＮＡ」ともいう。本発明のＤＮＡは、新規ポリペプチドをコードするものである。又、本発明はこれらＤＮＡを含む哺乳動物由来遺伝子、哺乳動物が齧歯類又はヒトである該遺伝子、特に齧歯類がマウスであるマウス遺伝子にも係る。特に、マウス遺伝子は「マウスＫＩＡＡ１７６８遺伝子」ともいう。
更に、本発明は本発明のＤＮＡ又は遺伝子にコードされるポリペプチド（以下、「本発明のポリペプチド」ともいう。）、例えば、本発明のＤＮＡ又は遺伝子を導入した宿主細胞で作製される組換え蛋白質であるポリペプチド（以下、「ＫＩＡＡ１７６８蛋白質」ともいう）に係る。
また、本発明は、本発明のＤＮＡ又は遺伝子を含む組換えベクター、及び、本発明のポリペプチド若しくはその部分ペプチド又は該ポリペプチドを含む組換え蛋白質を又はそれらの塩に特異的に結合する抗体に係る。
【０００９】
また、本発明のＤＮＡ及び該ＤＮＡを含む遺伝子、該ＤＮＡにコードされる新規ポリペプチド及び該ポリペプチドを含む組換え蛋白質、該ポリペプチドに対する抗体を用いることによって、該蛋白質の発現量を変化させる化合物、該蛋白質に結合する蛋白質との結合性を変化させる化合物（アンタゴニスト、アゴニスト）のスクリーニング方法、該スクリーニング用キット、該スクリーニング方法などを提供する。更に、本発明ポリペプチド若しくはその部分ペプチド又は該ポリペプチドを含む組換え蛋白質を又はそれらの塩を用いることを特徴とする、それら物質と特異的に結合する物質のスクリーニング方法、並びにスクリーニング用キット等も提供する。
【００１０】
更に、本発明は、本発明のＤＮＡ、本発明のＤＮＡを含有する組換えベクター又は発現ベクター、該ベクターを保持する形質転換体、該形質転換体を培養し、本発明のポリペプチドの一部あるいは全長のポリペプチドを含む組換え蛋白質を生成、蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする、本発明のポリペプチド若しくは該ポリペプチドを含む組換え蛋白質、又はその塩の製造方法、及び、こうして得られる本発明のポリペプチドの一部あるいは全長のポリペプチドを含む組換え蛋白質またはその塩を提供する。又、本発明は、本発明のＤＮＡを含有してなる医薬、本発明のポリペプチド若しくはその部分ペプチド又は該ポリペプチドを含む組換え蛋白質をコードするＤＮＡに実質的に相補的な塩基配列を有するアンチセンスヌクレオチド又はそれらを含有してなる医薬、本発明のポリペプチド若しくはその部分ペプチド又は該ポリペプチドを含む組換え蛋白質を含有してなる医薬を提供する。
更に、本発明は、本発明ＤＮＡ、本発明ポリペプチド、その部分ポリペプチド若しくは該ポリペプチドを含む組換え蛋白質、又は、本発明のＤＮＡ又は遺伝子に対する抗体を網羅的に作成し、それらを集積させて得られる、所謂、ＤＮＡチップ（アレイ）、プロテインチップにも係る。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明のＤＮＡは、かずさＤＮＡ研究所で採取されたマウス脳由来のｍＲＮＡを出発材料として、本発明者が調製したｃＤＮＡライブラリーから、ｃＤＮＡ断片として単離した後に、塩基配列を決定し同定したものである。即ち、具体的には、小原他の方法（ＤＮＡ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９７，４：５３−５９）に従って調製したマウス脳由来のｃＤＮＡライブラリーから、約４５，０００個の組換え体を選択した。次に、このクローンのうち約８，０００個の３’末端ＤＮＡ配列を決定し、その中から、ヒトＫＩＡＡ１７６８遺伝子に高い相同性を有するクローンを選択し全塩基配列の決定を行なった。次に、こうして得られた全塩基配列に基づき、ＤＮＡ解析プログラム（ＧＣＧ，　Ｆａｓｔａ＆　Ｂｌａｓｔ）を用いてホモロジー検索を行なった。その結果、ヒトＫＩＡＡ１７６８遺伝子がコードするアミノ酸配列と配列番号：１で示されるアミノ酸配列の６３番目から１，２１２番目の１，１５０アミノ酸について比較したところ、アミノ酸レベルで約６８％という有意な相同性を有する、配列番号：２に示される塩基配列を有するクローンを取得した（クローン名：ｍｂｇ９９９９８）。
【００１２】
取得したｍｂｇ９９９９８にコードされるポリペプチド（本発明のポリペプチド）のアミノ酸配列は１，７７０アミノ酸であり、ヒトＫＩＡＡ１７６８遺伝子にコードされている蛋白のアミノ酸配列の１，２０７（ＤＮＡ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０００，７：３４７−３５５）に比較し長く伸びていた。得られた本発明のポリペプチドのアミノ酸配列について、以下の実施例に記載したようにホモロジー検索を行った結果、本発明のポリペプチドではヒトＫＩＡＡ１７６８遺伝子にコードされているポリペプチドに比較し、Ｎ−末端側１−６２番目の６２個のアミノ酸配列、及びＣ−末端側の１，２１３−１，７７０番目の５５８個のアミノ酸配列が新規に付加されていることが判明した。新規に付加されていたＮ−末端側６２個のアミノ酸配列、及びＣ−末端側５５８個のアミノ酸配列について公共のデーターベースを用いてホモロジー検索を行った結果、Ｎ−末端側６２個のアミノ酸配列は新規、またＣ−末端側５５８個のアミノ酸配列についてはＣ−末端から１６５個のアミノ酸配列を除き新規であることが判明した。尚、Ｃ−末端から１６５個のアミノ酸配列は、ＧｅｎｅＢａｎｋに登録されているＡＫ０５７７５６の１６５個のアミノ酸配列と高いホモロジー（９４％）を示した。　尚、配列番号：２に示される塩基配列を有する本発明のＤＮＡを含むプラスミド（プラスミド表示名：　ｍｂｇ９９９９８）は、茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに平成１４年６月１１日付けで寄託され、受託番号ＦＥＲＭ　Ｐ−１８８８４が付されている。
【００１３】
ヒトＫＩＡＡ１７６８遺伝子の配列が３９２５ｂｐ（ＤＮＡ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０００，７：３４７−３５５）から５５１４　ｂｐに訂正されているが（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｈｕｇｅ／ｇｆｐａｇｅ／ＫＩＡＡ１７６８／）、コードされているポリペプチドのアミノ酸配列の長さは１，２０７と変更されていない。ヒトＫＩＡＡ１７６８遺伝子ホモログを詳細に研究することにより、Ｎ−末端側にはさらにポリペプチドがコードされている可能性について検証される可能性がある。本発明のＤＮＡにコードされているポリペプチドのアミノ酸配列の長さは１，７７０であるが、本発明のＤＮＡに対するホモログについて更に詳細に研究することにより、Ｎ−末端側に更に伸張してポリペプチドがコードされていることを見つける可能性がある。Ｎ−末端側に存在する可能性のある更なるドメインの解明は、本発明のペプチド、すなわちＫＩＡＡ１７６８蛋白質の新たな機能を明らかにする上で極めて重要な課題と考えられる。尚、本明細書実施例において、実際に、マウス由来の配列番号：１で示されるアミノ酸配列と相同なヒト由来アミノ配列の１つを、公共のデーターベースから取得し、配列番号：１６として示した。
【００１４】
尚、当業者であれば、本明細書によって初めて開示された配列番号：２に示した塩基配列に基づいてクローンの５’側に適当なプライマー（例えば、配列番号：２の塩基対第６１〜８０番目５’−　ＧＣＧＣＡＧＧＣＣＣＴＧＣＴＧＡＧＣＧＣ　−３に対応させて合成した配列５’−　ＧＣＧＣＴＣＡＧＣＡＧＧＧＣＣＴＧＣＧＣ　−３’　）を調製し、該プライマーと市販されている哺乳動物脳由来のｍＲＮＡとハイブリダイゼーションを行なった後に逆転反応を行なうことにより本発明のＤＮＡの上流側（遺伝子の５’側）の領域を含む新たなｃＤＮＡ断片を特異的に合成することができる。合成した５’側の領域を含む新たなｃＤＮＡ断片をプラスミドに挿入した後、配列番号２の一部分をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーションのような相同性クローニングによって、本発明のＤＮＡを含む哺乳動物由来ＫＩＡＡ１７６８遺伝子の全領域を調製することが可能である。あるいは他の方法で、例えば次のような方法を用いても遺伝子の５’側が更に伸張した塩基配列を得ることが出来る。すなわち、本発明のＤＮＡをプローブとして用いれば、コロニーハイブリダイゼーションのような相同性クローニングによって、ヒトを含めた各種哺乳動物由来ＫＩＡＡ１７６８遺伝子の５’末端領域を調製することができる。更に、本発明のＤＮＡ配列及び本発明のポリペプチドのアミノ酸配列が開示されている以上、当業者であれば、これらの情報に基づき、ヒトを含めた各種哺乳動物由来ＫＩＡＡ１７６８遺伝子の５’末端領域を容易に取得することが出来る。又、短い断片や得られた配列に人工的な間違いが起こらないように十分な注意を払いながら、ＲＡＣＥ等のＰＣＲ法を使用することによっても、ヒトを含めた各種哺乳動物由来ＫＩＡＡ１７６８遺伝子の全領域を調製することが可能である。
【００１５】
本発明のＤＮＡとしては、前述した本発明のポリペプチドをコードする塩基配列から成るものであればいかなるものであってもよい。また、脳、又は、それ以外の組織、例えば、心臓、肺、肝臓、脾臓、腎臓、精巣、等の細胞・組織に由来するｃＤＮＡライブラリー等から同定・単離されたｃＤＮＡ、又は、合成ＤＮＡのいずれでもよい。ライブラリー作成に使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、前記した細胞・組織よりｔｏｔａｌＲＮＡ画分またはｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて、直接ＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ（以下、「ＲＴ−ＰＣＲ法」と略称する）によって増幅することもできる。
【００１６】
配列番号：１又は配列番号：１６で示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列とは、配列番号：１又は配列番号：１６で示される全アミノ酸配列との相同性の程度が、全体の平均で約６０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上であるアミノ酸配列を意味する。従って、本発明の配列番号：１又は配列番号：１６で示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列から成るポリペプチドとしては、例えば、前記の配列番号：１又は配列番号：１６で示されるアミノ酸配列に対して上記の相同性を有し、配列番号：１又は配列番号：１６で示されるアミノ酸配列から成るポリペプチドと実質的に同質の生物学的活性を有するポリペプチドを挙げることが出来る。ここで、実質的に同質とは、それらの活性が性質的に同質であることを示す。又、本発明のポリペプチドには、例えば、配列番号：１又は配列番号：１６で示されるアミノ酸配列中の一部（好ましくは、１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個）のアミノ酸が欠失、置換又は付加したアミノ酸配列、或いはそれらを組み合わせたアミノ酸配列から成り、配列番号：１又は配列番号：１６で示されるアミノ酸配列から成るポリペプチドと実質的に同質の生物学的活性を有するポリペプチドも含まれる。
【００１７】
更に、本発明のＤＮＡは、例えば、配列番号：２で示される塩基配列において、配列番号：１で示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、又は、該ＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、好ましくは更に配列番号：１で示されるアミノ酸配列から成るポリペプチドと同質の生物学的活性を有するポリペプチド（蛋白質）をコードするＤＮＡであればいずれのものでもよい。かかる条件下で、配列番号：２で示される塩基配列において、配列番号：１で示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡとハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、該ＤＮＡの全塩基配列との相同性の程度が、全体の平均で、約６０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上である塩基配列を含有するＤＮＡ等を挙げることが出来る。ハイブリダイゼーションは、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）２ｎｄ（Ｊ．　Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔａｌ．，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ．　Ｐｒｅｓｓ，　１９８９）に記載の方法等、当業界で公知の方法あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。ここで、「ストリンジェントな条件」とは、例えば、ＤＩＧ　ＤＮＡ　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　（ベーリンガー・マンハイム社製Ｃａｔ　Ｎｏ．　１１７５０３３）でプローブをラベルした場合に、３２℃のＤＩＧ　Ｅａｓｙ　Ｈｙｂ溶液（ベーリンガー・マンハイム社製Ｃａｔ　Ｎｏ．　１６０３５５８）中でハイブリダイズさせ、４０℃の０．１ｘＳＳＣ溶液（０．１％［ｗ／ｖ］ＳＤＳを含む）中でメンブレンを洗浄する条件（１ｘＳＳＣは０．１５ＭＮａＣｌ，０．０１５Ｍクエン酸ナトリウムである）でのサザンブロットハイブリダイゼーションで本発明ヒトＤＮＡプローブにハイブリダイズする程度の条件である。
【００１８】
本発明のＤＮＡのクローニングの手段としては、本発明のポリペプチドの部分等の適当な塩基配列を有する合成ＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ法によって増幅するか、または適当なベクターに組み込んだＤＮＡを本発明のポリペプチドの一部あるいは全領域をコードするＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを用いて標識したものとのハイブリダイゼーションによって選別することができる。ハイブリダイゼーションの方法は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ２ｎｄ（Ｊ．　Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ．　Ｐｒｅｓｓ，　１９８９）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。ＤＮＡの塩基配列の変換は、公知のキット、例えば、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ　ＩＩ逆転写酵素キット（ギブコＢＲＬ社）等を用いて、Ｇａｐｐｅｄ　ｄｕｐｌｅｘ法やＫｕｎｋｅｌ法などの公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って行なうことができる。クローン化されたポリペプチドをコードするＤＮＡは目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用することができる。該ＤＮＡはその５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもできる。
【００１９】
本発明のポリペプチドの発現ベクターは、当該技術分野で公知の方法に従って作成することが出来る。例えば、（１）本発明のＤＮＡ又は本発明のＤＮＡを含む哺乳動物由来遺伝子を含有するＤＮＡ断片を切り出し、（２）該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１８，ｐＵＣ１１８）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λファージなどのバクテリオファージ、あるいはＳＶ４０、ＣＭＶウイルス、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、ウシパピローマウイルスなどの動物ウイルス由来配列を使用した発現ベクター等を利用することが出来る。本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応した適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、宿主が大腸菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーターなどが、宿主が枯草菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなど、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。動物細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ−ＴＫプロモーター、ＨＳＰプロモーター、メタロチオネインプロモーターなどが挙げられる。
【００２０】
発現ベクターには、以上の他に、所望により当該技術分野で公知の、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）等を付加することができる。また、必要に応じて、本発明のＤＮＡにコードされた蛋白質を他の蛋白質（例えば、グルタチオンＳトランスフェラーゼ、ヒスチジンタグ、カルモデュリンバインディング蛋白質、及びプロテインＡ等）との融合蛋白質として発現させることも可能である。このような融合蛋白質は、適当なプロテアーゼを使用して切断し、それぞれの蛋白質に分離することが出来る。
【００２１】
宿主細胞としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞などが用いられる。エシェリヒア属菌の具体例としては、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）Ｋ１２由来のＤＨ１（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，６０巻，１６０（１９６８）），ＪＭ１０３（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，９巻，３０９（１９８１）），ＪＡ２２１（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，１２０巻，５１７（１９７８）），及びＨＢ１０１（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，４１巻，４５９（１９６９））、あるいはエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）Ｂ株等が用いられる。バチルス属菌としては、例えば、バチルス・サチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＭＩ１１４（Ｇｅｎｅ，２４巻，２５５（１９８３）），２０７−２１〔Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，９５巻，８７（１９８４）〕等が用いられる。酵母としては、例えば、サッカロマイセス　セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＨ２２，ＡＨ２２Ｒ−，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ−１２、シゾサッカロマイセス　ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ）ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹＣ２０３６、ピキア　パストリス（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ）等が用いられる。動物細胞としては、例えば、サル腎臓細胞由来ＣＯＳ−１，ＣＯＳ−７，Ｖｅｒｏ細胞，チャイニーズハムスターＣＨＯ細胞（以下、ＣＨＯ細胞と略記），ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ−）細胞と略記），マウスＬ細胞，マウスＡｔＴ−２０，マウスミエローマ細胞，ラットＧＨ３細胞，ヒトＦＬ細胞、ヒトＨｅｌａ細胞あるいはヒトミエローマ細胞などが用いられる。
【００２２】
これら宿主細胞の形質転換は、当該技術分野で公知の方法に従って行うことが出来る。例えば、以下に記載の文献を参照することが出来る。Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，６９巻，２１１０（１９７２）；　Ｇｅｎｅ，１７巻，１０７（１９８２）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　＆　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６８巻，１１１（１９７９）；Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９４巻，１８２−１８７（１９９１）；Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ），７５巻，１９２９（１９７８）；細胞工学別冊８　新　細胞工学実験プロトコール．２６３−２６７（１９９５）（秀潤社発行）；及びＶｉｒｏｌｏｇｙ，５２巻，４５６（１９７３）。
【００２３】
このようにして得られた、本発明のＤＮＡを含む哺乳動物由来遺伝子を含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体は、当該技術分野で公知の方法に従って培養することが出来る。例えば、宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行ない、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常、約３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通気や撹拌を加えることもできる。宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培養は通常、ｐＨ約５〜８に調整された培地を用いて約２０〜３５℃で約２４〜７２時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加えることもできる。宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、ｐＨは約６〜８に調整された培地を用いて、通常約３０〜４０℃で約１５〜６０時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加えることもできる。
【００２４】
上記培養物から本発明のポリペプチドを分離精製するには、例えば、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過により蛋白質の粗抽出液を得る。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどの蛋白質変性剤や、トリトンＸ−１００^ＴＭなどの界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中に蛋白質が分泌される場合には、培養終了後、公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれる蛋白質の精製は、公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。こうして得られた本発明のポリペプチド（蛋白質）は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体または他の塩に変換することができる。更に、組換え体が産生する蛋白質を、精製前または精製後に、メチオニンアミノペプチダーゼを用いてＮ−末端メチオニンを除去したり、ミリストイル転移酵素を用いてＮ−末端アミノ酸のミリストイル化を行ったり、アセチルトランスフェラーゼを用いてＮ−末端アミノ酸のアセチル化を行ったり、或いはその他の修飾酵素を用いることにより任意にアミノ酸の修飾を行うことが出来る。又、Ｃ−末端を修飾するプロセシングカルボキシルペプチダーゼ、Ｃ−末端アミド化酵素等を作用させてＣ−末端アミノ酸を修飾することも出来る。更に、トリプシン、キモトリプシン、ＦａｃｔｏｒＸａ、トロンビン、又は、ＫＥＸ２プロテアーゼのような適当な蛋白限定分解酵素を作用させることにより、ポリペプチドを部分的に除去することもできる。
融合蛋白質として産生させた場合には、適当な蛋白質限定分解酵素を用いて不必要なポリペプチド部分を除去することもできる。
本発明ポリペプチド（蛋白質）又はその塩の存在は、様々な結合アッセイ及び特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセイ等により測定することができる。
【００２５】
本発明のポリペプチド（蛋白質）は、Ｃ−末端が通常カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）またはカルボキシレート（−ＣＯＯ−）であるが、Ｃ−末端がアミド（−ＣＯＮＨ_２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）であってもよい。ここでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピルもしくはｎ−ブチルなどのＣ１−６アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ３−８シクロアルキル基、例えば、フェニル、α−ナフチルなどのＣ６−１２アリール基、例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ１−２アルキル基もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ１−２アルキル基などのＣ７−１４アラルキル基のほか、経口用エステルとして汎用されるピバロイルオキシメチルエステルなどが用いられる。
【００２６】
本発明のポリペプチド（その存在状態は蛋白質である）がＣ−末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明の蛋白質に含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ−末端のエステルなどが用いられる。さらに、本発明の蛋白質には、Ｎ−末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、生体内で切断されて生成するＮ−末端のグルタミン酸残基がピログルタミン化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上にある、例えばＯＨ、ＣＯＯＨ、ＮＨ_２、ＳＨなどが適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖蛋白質などの複合蛋白質なども含まれる。
【００２７】
本発明のポリペプチドの一部からなるペプチドとしては、前記した本発明のポリペプチド（その存在状態は蛋白質である）の部分ペプチドであって、実質的に同質の活性を有するものであればいずれのものでもよい。例えば、本発明のポリペプチド（蛋白質）の構成アミノ酸配列のうち少なくとも２０個以上、好ましくは５０個以上、さらに好ましくは７０個以上、より好ましくは１００個以上、最も好ましくは２００個以上のアミノ酸配列を有し、例えば、本発明の組換え蛋白質と実質的に同質の生物学的活性を有するするペプチドなどが用いられる。このような部分ペプチドの具体例としては、配列番号：１又は配列番号：１６で示されるアミノ酸配列の中の、以下に記載するようなＲａｓＧＥＦモチーフ部分の少なくとも一つを有するものを挙げることが出来る。
又、本発明の部分ペプチドはＣ−末端が通常カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）またはカルボキシレート（−ＣＯＯ−）であるが、前記した本発明の蛋白質のごとく、Ｃ末端がアミド（−ＣＯＮＨ_２　）またはエステル（−ＣＯＯＲ）であってもよい。さらに、本発明の部分ペプチドには、前記した本発明の蛋白質と同様に、Ｎ−末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基で保護されているもの、Ｎ−末端側が生体内で切断され生成したグルタミル基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含まれる。
【００２８】
本発明のポリペプチド（その存在状態は蛋白質である）又はその一部からなるペプチドの塩としては、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。
【００２９】
本発明のポリペプチド（その存在状態は蛋白質である）、その一部からなるペプチドもしくはそれらの塩またはそれらのアミド体は、当該技術分野で公知の化学合成方法を用いて調製することも出来る。例えば、通常市販されている蛋白質合成用樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的とする蛋白質の配列通りに、当業界において自体公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させる。反応の最後に樹脂から蛋白質を切り出すと同時に各種保護基を除去し、さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合形成反応を実施し、目的の蛋白質、その部分ペプチドまたはそれらのアミド体を取得する。上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、例えば、ＤＣＣ、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド、及びＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロリル）カルボジイミドのようなカルボジイミド類に代表される蛋白質合成に使用できる各種活性化試薬を用いることができる。これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤（例えば、ＨＯＢｔ，　ＨＯＯＢｔ）とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、対照とする酸無水物またはＨＯＢｔエステルあるいはＨＯＯＢｔエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性化を行なった後に樹脂に添加することができる。
【００３０】
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、酸アミド類、ハロゲン化炭化水素類、アルコール類、スルオキシド類、及びエーテル類等、当業界において蛋白質縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。反応温度は蛋白質結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜選択され、通常約−２０〜５０℃の範囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は通常１．５〜４倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行うことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行なうことができる。反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化して、後の反応に影響を及ぼさないようにすることができる。原料の各アミノ基、カルボキシル基、及びセリン水酸基等の保護基としても、当該技術分野において、通常使用される基を使用することができる。原料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、およびその保護基の脱離、反応に関与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段から適宜選択しうる。
【００３１】
一部からなるペプチドまたはそれらの塩は、当該技術分野において自体公知のペプチドの合成法に従って、あるいは本発明の蛋白質を適当な蛋白質限定分解酵素で切断することによって製造することができる。ペプチドの合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによっても良い。公知の縮合方法や保護基の脱離としては、例えば、以下の（１）〜（３）に記載された方法が挙げられる。
（１）泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、　丸善（株）　（１９７５年）
（２）矢島治明　および榊原俊平、生化学実験講座１、　蛋白質の化学ＩＶ、　２０５、（１９７７年）（３）矢島治明監修、続医薬品の開発　第１４巻　ペプチド合成　広川書店。又は、一部からなるペプチドは、例えば、Ｃ−末端から十数残基の配列或いは配列番号：１で示されるアミノ酸配列の任意の場所の十数残基の部分を公知のペプチド合成装置等を用いて合成することが出来る。更に、このような部分ぺプチドは組換え蛋白質として前述の遺伝子組換え技術を用いて製造しても良い。
反応後の精製も自体公知の方法、例えば、溶媒抽出・蒸留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー・再結晶などを組み合わせて本発明の部分ペプチドを精製単離することができる。上記方法で得られる部分ペプチドが遊離体である場合は、公知の方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法によって遊離体に変換することができる。
【００３２】
本発明のポリペプチド（その存在状態は蛋白質である）、その一部からなるペプチドまたはそれらの塩と特異的に結合する抗体は、それらを特異的に認識し得るものであれば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよい。本発明のポリペプチド（蛋白質）、その部分ペプチドまたはそれらの塩に対する抗体は、本発明のポリペプチド（蛋白質）又はその部分ペプチドを抗原として用い、当業者に公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。このように免疫原として使用できる部分ペプチドのれいとして、配列番号１に示される本発明ポリペプチドのＣ末端における十数個〜１００個程度の連続したアミノ酸から成るぺプチドを挙げることが出来る。
例えば、ポリクローナル抗体の場合には、上記抗原を単独、又は、セルロース、重合アミノ酸、アルブミン等の適当な担体に結合させて、アジュバントの存在又は非存在下で、例えば、ラット、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ウマなどの適当な動物に対して免疫誘導することによって容易に得ることが出来る。ポリクローナル抗体は免疫された動物の血清から公知の様々な方法によって回収及び精製することが出来る。
一方、モノクローナル抗体を製造するためには、例えば、上記の免疫された動物から抗体産生細胞（例えば、脾臓又はリンパ節由来）を回収し、公知の不死化増殖細胞（例えば、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８株等の骨髄腫細胞株）との細胞融合により、ハイブリドーマを作成する。これを更にクローニングし、本発明のポリペプチド等に特異的に認識する抗体を生産しているハイブリドーマのクローンを選別し、該ハイブリドーマの培養液からモノクローナル抗体を回収し精製することによって容易に得ることが出来る。
尚、合成ペプチドに対する抗体の作成と精製に関する参考文献として、例えば、新細胞工学実験プロトコル、東大医科学研究所制癌研究部編、秀潤社、１９９３年、２−２−２、「合成ペプチドに対する抗体の作成」、ｐ．２１０−２１７　を挙げることが出来る。
更に、当業者には公知である様々な遺伝子工学的手法により、こうして得られた抗体の抗原決定基等を含む、ヒト化抗体等の各種キメラ抗体も容易に製造することが出来る。
本発明の抗体は、体液や組織などの被検体中に存在する本発明のポリペプチド（蛋白質）等を検出するために使用することができる。また、これらを精製するために使用する抗体カラムの作製、精製時の各分画中の本発明のポリペプチド（蛋白質）の検出、被検細胞内における本発明のポリペプチド（蛋白質）の挙動の分析などのために使用することができる。
【００３３】
更に、本発明の抗体は、公知の方法による被検液中の本発明のポリペプチド（蛋白質）等の定量、特に、モノクローナル抗体を使用したサンドイッチ免疫測定法による定量、及び組織染色等による検出などに使用することができる。それによって、例えば、本発明のポリペプチド（蛋白質）等が関与する疾病の診断を行なうことができる。これらの目的には、抗体分子そのものを用いてもよく、また、抗体分子のＦ（ａｂ’）２　、Ｆａｂ’、あるいはＦａｂ画分を用いてもよい。本発明の抗体を用いる本発明の蛋白質等の定量法は、特に制限されるべきものではなく、被測定液中の抗原量（例えば、蛋白質量）に対応した抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリー、競合法、イムノメトリック法およびサンドイッチ法が好適に用いられるが、感度、特異性の点で、後述するサンドイッチ法を用いるのが好ましい。標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、当該技術分野で公知の、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などを用いることが出来る。
【００３４】
これらの測定・検出方法に関する一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる。例えば、入江　寛編「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和５４年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年発行）、「Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ」Ｖｏｌ．　７０（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ　Ａ））、　同書Ｖｏｌ．　７３（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（ＰａｒｔＢ））、同書Ｖｏｌ．　７４（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ　Ｃ））、　同書Ｖｏｌ．　８４（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ　Ｄ：Ｓｅｌｅｃｔｅｄ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ））、　同書Ｖｏｌ．　９２（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ　Ｅ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ａｎｄ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　Ｍｅｔｈｏｄｓ））、　同書Ｖｏｌ．　１２１（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ　Ｉ：ＨｙｂｒｉｄｏｍａＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ））（以上、アカデミックプレス社発行）などを参照することができる。
【００３５】
本発明のポリペプチド（蛋白質）又はその一部分からなるペプチドをコードするＤＮＡに実質的に相補的な塩基配列を有するアンチセンスＤＮＡとしては、当該ＤＮＡの塩基配列に実質的に相補的な塩基配列を有し、該ＤＮＡの発現を抑制し得る作用を有するものであれば、いずれのアンチセンスＤＮＡであってもよい。実質的に相補的な塩基配列とは、例えば、本発明のＤＮＡに相補的な塩基配列の全塩基配列または部分塩基配列と約９５％以上、最も好ましくは１００％の相同性を有する塩基配列などが挙げられる。又、これらアンチセンスＤＮＡと同様の作用を有する核酸配列（ＲＮＡまたはＤＮＡの修飾体）も本発明でいうアンチセンスＤＮＡに含まれる。これらのアンチセンスＤＮＡは、公知のＤＮＡ合成装置などを用いて製造することができる。
【００３６】
更に、本発明のポリペプチド（蛋白質）等は、これら物質の活性を阻害する化合物またはその塩のスクリーニングのための試薬として有用である。すなわち、本発明は、本発明のポリペプチド（蛋白質）、その一部からなるペプチドまたはそれらの塩を用いることを特徴とする、該物質又はそれらの塩の活性を阻害する化合物（以下、「阻害剤」ともいう）のスクリーニング方法、及びその為のスクリーニング用キットを提供する。本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩は、上記した試験化合物から選ばれた化合物であり、本発明のポリペプチド（蛋白質）等の生物学的活性を阻害する化合物である。該化合物またはその塩は、本発明の蛋白質等の活性を直接阻害するものであってもよいし、本発明のポリペプチド（蛋白質）等の発現を阻害することによって間接的に本発明のポリペプチド（蛋白質）等の活性を阻害するものであってもよい。該化合物の塩としては、例えば、薬学的に許容可能な塩などが用いられる。例えば、無機塩基との塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩、塩基性または酸性アミノ酸との塩などがあげられる。本発明のポリペプチド（蛋白質）等の生物学的活性を阻害する化合物も上記各種疾病に対する治療・予防剤などの医薬として使用できる可能性がある。
【００３７】
本発明のＤＮＡ及び該ＤＮＡを含む哺乳動物由来遺伝子をプローブとして使用することにより、ヒトにおける本発明のポリペプチド又はその一部分からなるペプチドをコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡの異常（遺伝子異常）を検出することができるので、例えば、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの損傷、突然変異あるいは発現低下や、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの増加あるいは発現過多などの遺伝子診断剤として有用である。本発明のＤＮＡを用いる上記の遺伝子診断は、例えば、公知のノーザンハイブリダイゼーションやＰＣＲ−ＳＳＣＰ法（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，第５巻，８７４〜８７９頁（１９８９年）、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓ　ｏｆ　Ａｍｅｒｉｃａ，第８６巻，２７６６〜２７７０頁（１９８９年））などにより実施することができる。更に、ＫＩＡＡ１７６８遺伝子に異常があったり、欠損している場合あるいは発現量が減少している場合、生体内において正常な機能を発揮できない患者に対しては、公知手段に従って（１）レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターをベヒクルとして使用する遺伝子治療によって、本発明のＤＮＡ又は哺乳動物由来遺伝子を該患者体内に導入し、発現させるか、又は（２）本発明のポリペプチド（蛋白質）等を該患者に注入すること等によって、該患者において本発明の蛋白質等の機能を発揮させることができるものと考えられる。前者の場合、本発明のＤＮＡ又は哺乳動物由来遺伝子を適当なベクターをベヒクルとして使用し、ベクターにのせた形の該ＤＮＡを単独、又は、摂取促進のための補助剤とともに、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与することも可能である。
【００３８】
本明細書および図面において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢＣｏｍｍｉｓｉｏｎ　ｏｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによる略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
【００３９】
本願明細書の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。
〔配列番号：１〕本発明のマウス由来のポリペプチドのアミノ酸配列（アミノ酸数：１，７７０）を示す。
〔配列番号：２〕配列番号：１で示されるアミノ酸配列を有する本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列を含む、クローンｍｂｇ９９９９８の全塩基配列（６，８９２塩基対）を示す。
〔配列番号：１６〕本発明のヒト由来のポリペプチドのアミノ酸配列（アミノ酸数：１，７３７）を示す。
【００４０】
【実施例】
以下に、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はそれに限定されるものではない。なお、実施例における各種遺伝子操作は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｔｈｉｒｄ．ｅｄ．（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，２００１）に記載されている方法に従った。
【００４１】
（１）マウス脳由来ｃＤＮＡライブラリーの構築
ＡｔｔｔＢ２部位を有するオリゴヌクレオチド：５’−ＦｇｃＧＣＡＣＣＡＣＴＴＴＧＴＡＣＡＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＧＣＧＧＣＣＧＣ（Ｔ）_１８−３’（Ｆ、ｇおよびｃは、フルオレッセイン基、フォスフォロチオエイト修飾Ｇ、Ｃ残基を表す）をプライマーとして、マウスの成体（８週令雄のＢＡＬＢ／ｃマウス）脳由来ｍＲＮＡを鋳型にＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素キット（インビトロジェン社製）で２本鎖ｃＤＮＡを合成した。これにａｔｔＢ１部位を有するアダプターをｃＤＮＡにライゲーションした。その後、アガロースゲルで１ｋｂ−２ｋｂ、２ｋｂ−３ｋｂ、３ｋｂ−５ｋｂ、５ｋｂ−７ｋｂ、７ｋｂ−１１ｋｂと１１ｋｂ−１３ｋｂにｃＤＮＡをサイズ分画した。これらを、サイズを小さくしたａｔｔＰ　ｐＳＰＯＲＴ−１エントリーベクター（インビトロジェン社製）にＢＰ反応により移し換えた後、大腸菌ＥｌｅｃｔｏｒｏＭａｘ　ＤＨ１０Ｂ株（インビトロジェン社製）にエレクトロポーレーション法により導入した。プレートに出現した１０^６個以上の形質転換体を集め、液体培地中で、３７℃で２−３時間培養した後プラスミドを調製した。スーパーコイルドプラスミドの形でサイズ分画した後、ＬＲ反応によりａｔｔＲｐＢＣデスティネーションベクター（インビトロジェン社製）にｃＤＮＡを移し換えた。このプラスミドを精製後、ＤＨ１０Ｂ株にエレクトロポーレーション法により導入し、各分画が期待されるサイズになるまで、上記の分画操作を２−３回繰り返した。最後に各分画ごとにＤＨ１０Ｂ株にプラスミドを導入した。なお、ここで用いた試験管内での相同組み換え反応を利用したクローニングシステムは小原等の方法　（Ｎｕｃｒｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，　２９，　ｅ２２　（２００１）およびＤＮＡ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｖｏｌ．９，　４７−５７（２００２））　に従った。
次に、５ｋｂ−７ｋｂ画分に含まれる約８，０００個のクローンの末端ＤＮＡ配列を決定した。この中から、ヒトＫＩＡＡ１７６８に相同性が高いクローンのｃＤＮＡに関して全塩基配列の決定を行なった。配列決定には、アプライドバイオシステム社製のＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ３７００）と同社製反応キットを使用した。大部分の配列はショットガンクローンをダイターミネーター法を用いて決定した。一部の塩基配列については、決定した塩基配列を元にしてオリゴヌクレオチドを合成し、プライマーウォーキング法で決定した。
【００４２】
（２）ホモロジー検索による本発明ＤＮＡを含むクローンの決定
次に、こうして得られた全塩基配列に基づき、ＤＮＡ解析プログラム（Ｆａｓｔａ　＆　Ｂｌａｓｔ）を用いたホモロジー検索を実施したところ、公開されているデータベースの中のヒトＫＩＡＡ１７６８遺伝子と高いホモロジーを示す候補クローンｍｂｇ９９９９８が見出された。更に、別のＤＮＡ解析プログラム（ＢＥＳＴＦＩＴ）を用いて、このクローンｍｂｇ９９９９８とヒトＫＩＡＡ１７６８のアミノ酸配列と塩基配列について比較したところ、ヒトＫＩＡＡ１７６８遺伝子がコードするアミノ酸配列と配列番号：１で示されるアミノ酸配列の６３番目から１，２１２番目の１，１５０アミノ酸について、アミノ酸レベルで約６８％のホモロジーを示し、ＤＮＡレベルでは配列番号：２で示される塩基配列の１９３番目から７９９番目の６０７塩基、及び１，４５１番目から１，９９１番目の５４１塩基についてともに約８３％のホモロジーを有していることが判明した。
【００４３】
（３）モチーフ検索
更に，本発明のＤＮＡに関して、ＰＲＯＳＩＴＥ　ｄａｔａｂａｓｅを検索するための蛋白質解析プログラムであるｐｆｔｏｏｌｓ　（Ｂａｉｒｏｃｈ　Ａ，　Ｂｕｃｈｅｒ　Ｐ，　Ｈｏｆｍａｎｎ　Ｋ，　Ｎｕｃｌｅｉｃ　ＡｃｉｄｓＲｅｓ．　１９９７　Ｊａｎ　１；２５（１）：２１７−２１）、及びＰｆａｍ　ｄａｔａｂａｓｅを検索するための蛋白質解析プログラムｈｍｍｅｒ　２．１（Ｓｏｎｎｈａｍｍｅｒ，　Ｅ．　Ｌ．　Ｌ．，　Ｅｄｄｙ，　Ｓ．　Ｒ．，　Ｂｉｒｎｅｙ，　Ｅ．，　Ｂａｔｅｍａｎ，　Ａ．，　ａｎｄ　Ｄｕｒｂｉｎ，　Ｒ．，　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ　１９９８；　２６，　３２０−３２２）を用いてモチーフ検索を行なった　（Ｓｕｙａｍａ　ｅｔ．　ａｌ．　１９９９　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　２７：　３３８−３３９）。本発明のＤＮＡは、６，８９２塩基対あり、１、７７０個のアミノ酸からなる蛋白質をコードしている。現在、取得している本発明のＤＮＡがコードするポリペプチドのアミノ酸配列から、Ｃ末端側に１個のＲａｓＧＥＦ（Ｇｕａｎｉｎｅ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｅｘｃｈａｎｇｅ　ｆａｃｔｏｒ　ｆｏｒ　Ｒａｓ−ｌｉｋｅ　ｓｍａｌｌ　ＧＴＰａｓｅｓ）蛋白質に特徴的なモチーフ（Ｎａｔｕｒｅ，１９９８，３９４：３３７−３４３，　Ｐｒｏｃ．，　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，１９９８　９５，　５８５７−５８６４）（アミノ酸配列番号１，２５４−１，７６２）を有することが判明した（図１）。
詳しくは、ＨＭＭＰｆａｍ検索法によると、配列番号：１に示されるアミノ酸配列のうち１，４８６番目から１，６９５番目までに、また、ＨＭＭＳｍａｒｔ検索法によると、配列番号：１に示されるアミノ酸配列のうち１，４８５番目から１，７６２番目までに、更にＰｒｏｆｉｌｅＳｃａｎ検索法によると、配列番号：１に示されるアミノ酸配列のうち１，２５４番目から１，３１８番目及び１，４８８番目から１，７１２番目の２カ所に、ＲａｓＧＥＦ（Ｇｕａｎｉｎｅ　Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｅｘｃｈａｎｇｅ　Ｆａｃｔｏｒ　ｆｏｒ　Ｒａｓ−ｌｉｋｅ　Ｓｍａｌｌ　ＧＴＰａｓｅｓ、あるいはＧｕａｎｉｎｅ−Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ　Ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｓ　ＣＤＣ２５　Ｆａｍｉｌｙともいう）に特徴的なモチーフが見出され、クローンｍｂｇ９９９９８に含まれるマウスＫＩＡＡ１７６８遺伝子には、ＲａｓＧＥＦの構造的特徴が保存されていることが確認された。
【００４４】
本発明のマウスＫＩＡＡ１７６８遺伝子において見出されたＲａｓＧＥＦ（Ｇｕａｎｉｎｅ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｅｘｃｈａｎｇｅ　ｆａｃｔｏｒ　ｆｏｒ　Ｒａｓ−ｌｉｋｅ　ｓｍａｌｌ　ＧＴＰａｓｅｓ）蛋白質に特徴的なモチーフが関わる機能については、様々な基本的細胞機能の調節に重要な働きを有するＲａｓスーパーファミリー蛋白質を活性化することにある（Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．，１９９３，　１３：７７１８−７７２４，　ＴＩＢＳ，　１９９９，　３０６−３１１，　Ｒｅｖｉｅｗｓ　）。　ＲａｓＧＥＦ（Ｇｕａｎｉｎｅ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｅｘｃｈａｎｇｅ　ｆａｃｔｏｒ　ｆｏｒ　Ｒａｓ−ｌｉｋｅ　ｓｍａｌｌ　ＧＴＰａｓｅｓ）は、Ｒａｓ蛋白質の場合では受容体型チロシンキナーゼから核へのシグナルを中継し、細胞の増殖や分化に関わっている。また、Ｒａｓスーパーファミリーの一員であるＲｈｏ蛋白質は、細胞接着や細胞運動に関与している（Ｇｕａｎｉｎｅ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｅｘｃｈａｎｇｅ　ｆａｃｔｏｒｓ：　ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ　ｏｆ　Ｒａｓ　ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ．　Ｍｏｌ　Ｒｅｐｒｏｄ　Ｄｅｖ．　１９９５　Ｄｅｃ；４２（４）：４６８−７６．）。これら細胞機能に極めて重要なＲａｓスーパーファミリー蛋白質を制御しているＲａｓＧＥＦモチーフを有する蛋白質をコードする遺伝子は、それ自身も直接疾患原因遺伝子となりうる。たとえばＣｄｃ４２のＧＥＦであるＦＧＤ１遺伝子はＡａｒｓｋｏｇ−Ｓｃｏｔｔ症候群の原因遺伝子としてすでに同定されている（Ｐａｓｔｅｒｉｓ，　Ｎ．　Ｇ．，　Ｃａｄｌｅ，　Ａ．，　Ｌｏｇｉｅ，　Ｌ．　Ｊ．，　Ｐｏｒｔｅｏｕｓ，　Ｍ．　Ｅ．　Ｐａｓｔｅｒｉｓ，　Ｎ．　Ｇ．，　Ｃａｄｌｅ，　Ａ．，　Ｌｏｇｉｅ，　Ｌ．　Ｊ．，　Ｐｏｒｔｅｏｕｓ，　Ｍ．　Ｅ．　Ｍ．，　Ｓｃｈｗａｒ，　Ｃ．　Ｅ．，　Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ，　Ｒ．　Ｅ．，　Ｇｌｏｖｅｒ，　Ｔ．　Ｗ．，　Ｗｉｌｒｏｙ，　Ｒ．　Ｓ．，　ａｎｄ　Ｇｏｒｓｋｉ，　Ｊ．　Ｌ．　（１９９４）　Ｃｅｌｌ　７９，　６６９−６７８）。
【００４５】
ＲａｓＧＥＦはＲａｓスーパーファミリーのグアニンヌクレオチド交換促進因子として作用し、Ｒａｓスーパーファミリー蛋白質をＧＴＰ型に還元することで活性型の濃度を細胞内で上昇させる作用がある。その結果、各々のＲａｓスーパーファミリー蛋白質が本来有している細胞増殖活性などが正に加速させることになる（ＧＥＦｓ：　ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ　ｂａｓｉｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅｉｒ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｍａｌｌ　ＧＴＰ−ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ．　Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｓｃｉ．　１９９９　Ａｕｇ；２４（８）：３０６−１１．　Ｒｅｖｉｅｗ．）。これと拮抗する働きをするものとしてＧＡＰ　（ＧＴＰａｓｅ　ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ）が知られているが、それらはＲａｓスーパーファミリーをモチーフを有する分子を負に制御することから癌抑制遺伝子として機能するものもあることが知られている（Ｎｅｕｒｏｆｉｂｒｏｍｉｎ，　ａ　ｔｕｍｏｒ　ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｎｅｒｖｏｕｓ　ｓｙｓｔｅｍ．　Ｅｘｐ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｓ．　２００１　Ｍａｒ　１０；２６４（１）：１９−２８．　Ｒｅｖｉｅｗ．）。
これらの証拠から、ＲａｓＧＥＦモチーフを有する蛋白質と、細胞の増殖性疾患あるいは分化の異常との関連は明らかである。
これらの知見から、ＲａｓＧＥＦ蛋白質に特徴的なモチーフを有する本発明のＤＮＡ及び該ＤＮＡを含む遺伝子、該ＤＮＡにコードされるポリペプチド及び該ポリペプチドを含む組換え蛋白質については、それらが細胞の増殖あるいは分化の調節などに関わることが強く示唆される。
【００４６】
（４）ｍＲＮＡレベルでの発現頻度
ｍＲＮＡレベルでのヒトＫＩＡＡ１７６８遺伝子の発現は脳において、特に海馬領域や胎生期の脳で高いこと（ＤＮＡ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０００，７：３４７−３５５）が判っている。そこで、本発明の遺伝子の一つであるマウスＫＩＡＡ１７６８遺伝子について、ＲＴ−ＰＣＲ法によりマウスにおける同遺伝子の組織特異的及び発生段階特異的発現を解析した。マウスＫＩＡＡ１７６８遺伝子の転写産物をＰＣＲ法で増幅して検出するために必要なフォアワードプライマーとリバースプライマーを市販のＤＮＡ自動合成機を用いて合成した。フォアワードプライマーの配列を５’−ＣＣＴＡＴＧＣＣＡＡＡＧＣＣＡＧＴＧＡＧＡ−３’（配列番号：３）、リバースプライマーの配列を５’−　ＧＧＣＧＡＴＧＴＴＴＣＴＣＡＧＴＴＴＧＣＴ−３’（配列番号：４）とし、それらのプライマーを用いてマウスＫＩＡＡ１７６８遺伝子の転写産物をＲＴ−ＰＣＲ法で増幅すると、約６７５ｂｐＤＮＡ断片が得られる設計にした。マウス各組織から調製されたｍＲＮＡを材料とし、リバーストランスクリプターゼ（ＲＴ）により１ｓｔストランドｃＤＮＡ　まで調製が終了しているＣｌｏｎｔｅｃｈ社製のＭｕｌｔｉｐｌｅ　Ｔｉｓｓｕｅ　ｃＤＮＡ　Ｐａｎｅｌｓ　（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社Ｃａｔ．　Ｎｏ．　＃Ｋ１４２３−１，　＃Ｋ１４３０−１）を用い、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社が示す方法により以下のようにして解析を行った。すなわち、各マウス組織１ｓｔストランドｃＤＮＡと上記プライマーをそれぞれ混合し、各々についてＰＣＲを行い、マウスＫＩＡＡ１７６８遺伝子の転写産物のうち６７５ｂｐＤＮＡ長のＤＮＡ断片の増幅を図った。ＰＣＲは、ＴａｑポリメラーゼとしてＴａＫａＲａ　Ｅｘ　Ｔａｑ（宝酒造，　＃ＲＰ００１Ａ）を用い、上述のＤＮＡ混合液を９５°Ｃ（２．５分）で加熱した後、９５°Ｃ（３０秒）／６０°Ｃ（３０秒）／７２°Ｃ（３０秒）のサイクルを３０回繰り返して行った。コントロールとしてＣｌｏｎｔｅｃｈ社が提供するＧ３ＰＤＨプライマー（＃５４０６−１）を使用したＧ３ＰＤＨ転写産物由来約９３８ｂｐＤＮＡ断片の増幅も同様にして行った。増幅を終えたＰＣＲ産物を、サイズマーカーとともに２％　ａｇａｒｏｓｅ　ｇｅｌ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ社製、＃５００７０）を用いて電気泳動で分画し、分画したＰＣＲ産物の量を半定量的に比較した。その結果、調べた組織別あるいは発生過程のｃＤＮＡパネルの内、脳ではマウスＫＩＡＡ１７６８遺伝子に由来する約６７５ｂｐＤＮＡ断片が特異的に増幅され、濃いバンドとして検出された。また、肺・精巣・眼・胸腺で約６７５ｂｐＤＮＡ断片が特異的に増幅され、弱いバンドとして検出された。その他の臓器由来のｃＤＮＡではバンドは検出されなかった（図２）。また、発生の各段階については、受精１５日目の胚で強く、受精１７日目の胚で弱くバンドが検出され、受精７日目と受精１１日目の胚ではバンドは検出されなかった（図２）。
尚、同図において、下段のＧ３ＰＤＨはコントロールとして用いたハウスキーピング遺伝子（Ｇ３ＰＤＨ）の発現パターンを示す。従って、この蛋白質子が脳の発生・分化や記憶のメカニズムに関わっている可能性が高いといえる。尚、人の発現パターン（ＤＮＡ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０００，７：３４７−３５５）と比較すると肺・精巣・眼・胸腺でも若干の発現が認められた。更に、発生段階においては、発生初期では認めず、胎生１５日ころに最も強い発現が認められた。
【００４７】
（５）合成ペプチドを抗原としたウサギポリクローナル抗体の作製
マウスＫＩＡＡ１７６８遺伝子がコードするポリペプチドの一部からなるアミノ酸配列をもとに、ペプチド合成して作製した合成ペプチドを免疫原（抗原）として、常法に従い、ウサギポリクローナル抗体を作製した。抗原としてはカルボキシル末端の１５個のアミノ酸から成るペプチド（ＲＫＩＱＤＫＬＲＲＭＫＡＴＦＱ）を、そのＮ末で担体とするキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）にキャリアーカップリングさせ、担体と結合した合成ペプチドを８０％から９０％の純度にまで精製したものを抗原として用いた。日本白色種家兎（メス）に初回は抗原量０．１５ｍｇにて皮内免疫を、その後は約１週間ごとに抗原量０．３ｍｇにて５回の感作を実施して合計６回の皮内免疫を行った。３回目、４回目及び５回目の各皮内免疫の後に試験採血を行い、ＨＲＰＯ（ホースラディッシュパーオキシダーゼ）結合ヤギＩｇＧ抗ウサギ抗体（ＣＡＰＰＥＬ社製）を用いたＥＬＩＳＡ法にて抗原に対する抗体値を測定した。上記で示した全部で３回の試験採血のうち２回目と３回目において、夫々、２，０００倍希釈、４，０００倍希釈にて吸光度（４９２ｎｍ）が３となり、３回目の皮内免疫の後に抗体価の十分な上昇を確認された。そこで、この３回目の試験採血の後の６回目の皮内免疫を終了した後に、抗体精製用の全採血を行った。全採血で採取した検体において、８，０００倍希釈にて吸光度（４９２ｎｍ）が３となり抗体価のは更に上昇したことが確認された。採血した血液から血清を遠心にて分離し、ついで、得られた血清を抗原に用いた合成ペプチドをカップリングしたアフイニティビーズを用いたカラムにかけ、精製ウサギポリクローナル抗体（ａｎｔｉ−ｍＫＩＡＡ１７６８　ａｂ）を得た。
【００４８】
（６）精製ウサギポリクローナル抗体を用いたウエスタンブロット法による各種マウス臓器でのマウスＫＩＡＡ１７６８蛋白質の検出
上記で得られた精製ウサギポリクローナル抗体を用い、ウエスタンブロット法にて各種マウス臓器でのマウスＫＩＡＡ１７６８蛋白質の検出を試みた。各種マウス臓器由来の可溶性蛋白質については、ＩＣＲマウスから採取した臓器を蛋白分解阻害剤の存在下で物理的に破砕して遠心して得た上清を用いた。各種マウス臓器としては、心臓、脳、肺、肝臓、筋肉、腎臓、精巣、膵臓、前立腺、胸腺、胃を使用した。ポリアクリルアミドゲル電気泳動は、ポリアクリルアミドゲルの各レーンに約２０マイクログラムの各種マウス臓器由来可溶性蛋白質をアプライして電気泳動で分画し、次に分画した蛋白質をメンブレンにブロットし、ブロットしたメンブレンに対し５００倍希釈した抗体を用いて免疫染色反応を行った。すなわち、ポリアクリルアミドゲル電気泳動はＢｉｏ−Ｒａｄ社製のレディ−ゲルＪ（＃Ｎｏ．　１６１−Ｊ３６１）を用いて行い、ＧｅｎｅＳｙｓｔｅｍｓ社製のＭｕｌｔｉ−Ｒｅｐｌｉｃａ　Ｂｌｏｔｔｉｎｇ　Ｋｉｔ　（＃Ｎｏ．　ＧＳ１００１）を用いて転写し蛋白質をメンブレンにブロットした。二次抗体にはＡｍｅｒｓｈａｍ社製Ａｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ　Ｉｇ，　ＨＲＰ−Ｌｉｎｋｅｄ　Ｗｈｏｌｅ　Ａｂ　（＃Ｎｏ．　ＮＡ９３４）を用い、検出には同社のＥＣＬ　Ｐｌｕｓ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔｔｉｎｇ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔｓ　（＃Ｎｏ．　ＲＰＮ２１３３）を用いた。分子量を知る目的でインビトロジェン社製のＭａｇｉｃＭａｒｋ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｔａｎｄａｒｄ　（＃Ｎｏ．
ＬＣ５６００）を各種臓器サンプルとともに電気泳動した。
ＲＴ−ＰＣＲで解析したマウスＫＩＡＡ１７６８遺伝子のｍＲＮＡレベルの発現では、脳に於いて発現量が特に高いこと、また、肺・精巣・眼・胸腺で弱いが発現していることを確認できたことを上述したが、本精製ウサギポリクローナル抗体を用いたウエスタンブロット法ではいずれの組織においてもマウスＫＩＡＡ１７６８ポリペプチドの存在を検出できなかった。この原因としては、この抗体がウエスタンブロット法に適さない可能性、あるいはマウスＫＩＡＡ１７６８が不溶性の蛋白質として凝集し、マウス各種臓器由来の可溶性蛋白質標品調製の際不溶性画分に移行し、遠心後の上清すなわち可溶性蛋白質を含む標品中に存在しなかった可能性が考えられた。
【００４９】
（７）精製ウサギポリクローナル抗体を用いた免疫組織化学染色法による組織特異的発現の検出
ウエスタンブロット法によりマウスＫＩＡＡ１７６８蛋白質は、マウス各種臓器由来の可溶性蛋白質標品について試験したところいずれに組織においてもマウスＫＩＡＡ１７６８ポリペプチドの存在を検出できなかった。そこで、上記で得られた精製ウサギポリクローナル抗体を用い、免疫組織化学染色法による組織特異的発現の検出を試みた。免疫組織化学染色は定法に基づきＡＢＣ法（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：　ａ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌｓ．　Ｅｄ　Ｈａｒｌｏｗ　＆　Ｄａｖｉｄ　Ｌａｎｅ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，　１９８８，　ｐ３５９−４２０）で行ったが、一次抗体としてはウエスタンブロット法と同じく精製ウサギポリクローナル抗体を５００倍に希釈して用いた。ビオチン化二次抗体及びＡＢＣ試薬はＶｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製Ｅｌｉｔｅ　ＡＢＣ　ｋｉｔ　（＃Ｎｏ．　ＰＫ−６１０１）を使用し、呈色反応にはＫｉｒｋｅｇａａｒｄ　Ｐｅｒｒｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製のＤＡＢ　（３，３’−ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）　Ｒｅａｇｅｎｔ　Ｓｅｔ　（＃Ｎｏ．　５４−１０−００）を使用した。染色された蛋白質は茶色から褐色にて検出された。その結果、対照（ｃｏｎｔｒｏｌ）に比較し精製ウサギポリクローナル抗体（ａｎｔｉ−ｍＫＩＡＡ１７６８　ａｂ）処理にて顕微鏡下で観察すると明らかに茶色から褐色に染色され、白黒写真では濃染として認められ、脳及び腎臓の組織切片にて陽性所見を得た（図３）。
すなわち、脳についてはＲＴ−ＰＣＲによるマウスＫＩＡＡ１７６８遺伝子のｍＲＮＡレベル強い発現が認められていたが、免疫組織化学染色法ではＲＴ−ＰＣＲによる脳特異的発現を強く支持する結果を得た。より詳しくには、図３に示すごとく脳のグリア細胞の細胞質で強い陽性所見を得た。陽性所見はグリア繊維に沿って細かい線状の染色像として認められたが、ニューロンにおいては陽性所見を呈さなかった。したがってマウスＫＩＡＡ１７６８蛋白質は脳内グリアで特異的な分子であることが明らかとなった。
更に興味深いことに、図３の腎臓切片の染色像では尿細管の特定の部位のみが陽性所見を呈した。腎臓切片の染色像では、ごく一部の細胞しか陽性でなかったことを考慮すると必ずしも腎臓でＲＴ−ＰＣＲの結果が陰性であったことと矛盾しない。
【００５０】
（８）ホモロジー検索による本発明のマウス由来のポリペプチドと実質的に相同な遺伝子から由来するヒトポリペプチドのアミノ配列取得
配列番号：１で示されるアミノ酸配列と相同なヒト由来アミノ配列の１つを、以下の方法により公共のデーターベースから取得した。すなわち、配列番号：２で示される塩基配列（ｍｂｇ９９９９８の塩基配列）に部分的に相同なヒトＫＩＡＡ１７６８遺伝子の配列をもとに、ヒトゲノム配列に対してＢｌａｓｔ検索を実施し、ＫＩＡＡ１７６８遺伝子が位置するゲノムコンティグのｇｉ２２０５０８５８領域を見出した。さらに、ＳＩＭ４プログラムを使用して、ヒトＫＩＡＡ１７６８遺伝子のエキソン／イントロン構造をゲノム配列上に予測するとともに、遺伝子予想プログラムを使用して、そのゲノム領域に予想される遺伝子構造とそこにコードされるタンパク質配列を特定した。それらの情報を総合することにより、配列番号：１で示される配列に関連したヒト由来である本発明のポリペプチド全配列を見出した。より詳しくには、ｇｉ２２０５０８５８領域で予測されるポリペプチドのアミノ酸配列のうち９番（＞ｇｉ｜ＧＥＮＳＣＡＮ＿ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ＿ｐｅｐｔｉｄｅ＿９｜４４５＿ａａ）から下記に示す配列番号：５及び配列番号６のアミノ酸配列断片、また、１０番（＞ｇｉ｜ＧＥＮＳＣＡＮ＿ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ＿ｐｅｐｔｉｄｅ＿１０｜２７７０＿ａａ）　から下記に示す配列番号：７から配列番号：１５までのアミノ酸配列断片を得て、それらを順番につなぎ合わせることにより、配列番号：１で示すアミノ酸配列に対応するヒト由来配列の１つの例である配列番号：１６で示されるアミノ酸配列（１，７３７アミノ酸長）を取得するに至った。ＧＥＮＳＣＡＮ及びＳＩＭ４プログラムを使用したｃＤＮＡ配列からゲノム構造を予測する方法は、長瀬等の方法（Ｎａｇａｓｅ，　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．，　２００１，　ＤＮＡ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，　８：１７９−１８７）に従った。
尚、ヒトＫＩＡＡ１７６８蛋白質のアミノ配列情報中に存在し、更にマウスｍｂｇ９９９９８ポリペプチドのアミノ酸配列情報にも相同性を示す２１アミノ酸長の配列（ホモロジー：７１．４３％）が存在するが、配列番号：１６には存在しないＧＳＹＤＳＦＦＬＡＰＥＬＡＥＥＲＬＶＴＥＫという２１アミノ酸長のヒト由来アミノ酸配列について、上記に示した配列番号：１６を構成するアミノ酸配列断片のうち配列番号：８と配列番号：９の間にその２１アミノ酸長が挿入された配列も、ヒト由来の本発明のポリペプチドのアミノ酸配列といえる。
また、ＡＫ０５７７５６（ＦＬＪ２５０２）　遺伝子配列に示される１６５アミノ酸長配列のＣ−末端配列（−ＲＫＩＱＤＫＬＲＲＭＫＡＴＦＱ）情報とｍｂｇ９９９９８のＣ−末端配列（−ＲＫＩＱＤＫＬＲＲＭＫＡＴＦＱ）情報の両者でＣ−末端に、配列番号：１６のＣ−末端配列（−ＲＫＩＱＤＫＬＲＲＭＫＡＴＦ）に対しＱ（Ｇｌｎ）が付加していることから、配列番号：１６のＣ−末端に１つのアミノ酸（Ｑ）が付加した配列もヒト由来の本発明のポリペプチドといえる。
更に、配列番号：１で示すアミノ酸配列のＮ−末端付近の最初のメチオニン（Ｍ）は、２９番目に出現するが、上記のヒト由来ポリペプチド配列の解析結果から、この２９番目のメチオニンが、ｍｂｇ９９９９８がコードするポリペプチドのＮ−末端である可能性が高いと考えられた。
【００５１】
【発明の効果】
ヒトＫＩＡＡ１７６８遺伝子にはその機能を類推するドメイン構造が無く、その機能は全く未知であった。今回、本発明者はマウス脳由来のｃＤＮＡライブラリーから、ヒトＫＩＡＡ１７６８遺伝子に高いホモロジーを示す遺伝子（ＤＮＡ）をクローニングし、Ｎ−末端側及びＣ−末端側に新たにＤＮＡ配列が付加されている新規ＤＮＡ配列、すなわちマウスＫＩＡＡ１７６８遺伝子を取得することに成功した。更に、この遺伝子がコードするポリペプチドに実質的に相同な遺伝子から由来するヒトポリペプチドのアミノ配列を取得することができた。
【００５２】
これまでに記載したことから、本発明のＤＮＡあるいは本発明の遺伝子は、癌などの増殖性疾患や先天奇形など分化異常を含めたヒト疾患の機序解明及び診断・治療上で必要不可欠な役割を果たすと考えられる。また、ＲＴ−ＰＣＲによる各組織及び発生段階での発現のパターン情報は、脳での発現が高いこと及び発生後期での発現が高いことを明らかとし、本発明の遺伝子が特に中枢神経系構築において重要性であること明らかにした。
従って、本発明のＤＮＡ及び該ＤＮＡを含む哺乳動物由来遺伝子、それらがコードするポリペプチドの一部又は全長、該ポリペプチドの一部又は全長に対する抗体、アンチセンスＤＮＡ等は、癌や先天奇形を含めたヒト疾患を治療する為のモデル動物であるマウスを用いた各種治療・予防方法開発において、医薬として使用することが可能である。
【００５３】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のポリペプチドに保存されるＲａｓＧＥＦ（Ｇｕａｎｉｎｅ　Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｅｘｃｈａｎｇｅ　Ｆａｃｔｏｒ　ｆｏｒ　Ｒａｓ−ｌｉｋｅ　Ｓｍａｌｌ　ＧＴＰａｓｅｓ）モチーフ（ａａ：　アミノ酸配列で数字はアミノ酸数、ボックス：上から、ＨＭＭＰｆａｍ検索法、ＨＭＭＳｍａｒｔ検索法、またＰｒｏｆｉｌｅＳｃａｎ検索法によるそれぞれ異なった検索法で同定したＲａｓＧＥＦ（Ｇｕａｎｉｎｅ　Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｅｘｃｈａｎｇｅ　Ｆａｃｔｏｒ　ｆｏｒ　Ｒａｓ−ｌｉｋｅ　Ｓｍａｌｌ　ＧＴＰａｓｅｓ）モチーフ）を示す。
【図２】ＲＴ−ＰＣＲ法によるマウスＫＩＡＡ１７６８遺伝子のマウス各組織における発現強度の比較。上段はＫＩＡＡ１７６８の発現強度、下段はコントロールとして用いたハウスキーピング遺伝子（Ｇ３ＰＤＨ）の発現強度を、アガロース電気泳動で分画した後のエチジウムブロミド染色パターンについての写真で示す。
【図３】精製ウサギポリクローナル抗体を用いた免疫組織化学染色法による組織特異的発現の検出の結果示す写真である。

Claims (9)

1. 以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドをコードする塩基配列から成るＤＮＡ：（ａ）配列番号：１又は配列番号１６で示されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列の一部又は全部から成るポリペプチド；又は（ｂ）配列番号：１又は配列番号：１６で示されるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、（ａ）のポリペプチドと実質的に同質の生物学的活性を有するポリペプチド。
2. 以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のＤＮＡ：（ａ）配列番号：２で示される塩基配列において、配列番号：１で示されるアミノ酸配列の一部又は全部をコードするＤＮＡ；（ｂ）（ａ）のＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ；又は（ｃ）（ａ）のＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、（ａ）のＤＮＡがコードするポリペプチドと実質的に同質の生物学的活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
3. 請求項１又は２記載のＤＮＡを含む哺乳動物由来遺伝子。
4. 哺乳動物が齧歯類又はヒトである請求項３記載の遺伝子。
5. 齧歯類がマウスである請求項４記載の遺伝子。
6. 以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチド：（ａ）配列番号：１又は配列番号：１６で示されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列の一部または全部から成るポリペプチド；又は（ｂ）配列番号：１又は配列番号：１６で示されるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列の一部または全部から成り、（ａ）のポリペプチドと実質的に同質の生物学的活性を有するポリペプチド。
7. 請求項１若しくは２記載のＤＮＡ、又は請求項３ないし５のいずれか一項に記載の遺伝子を導入した宿主細胞で作製される組換え蛋白質である、請求項６記載のポリペプチド。
8. 請求項１若しくは２記載のＤＮＡ、又は請求項３ないし５のいずれか一項に記載の遺伝子を含む組換えベクター。
9. 請求項６又は７記載のポリペプチドに特異的に結合する抗体。

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