JP2004061345A

JP2004061345A - Method for judging extension degree of diabetic nephropathy by plasminogen activator inhibitor-1 measurement in urine

Info

Publication number: JP2004061345A
Application number: JP2002221102A
Authority: JP
Inventors: Hideki Kimura; 木村　秀樹; Haruyoshi Yoshida; 吉田　治義; Fumio Furusaki; 古崎　文雄; Tomoko Ono; 小野　智子
Original assignee: Mitsubishi Kagaku Iatron Inc
Current assignee: Mitsubishi Kagaku Iatron Inc
Priority date: 2002-07-30
Filing date: 2002-07-30
Publication date: 2004-02-26
Anticipated expiration: 2022-07-30
Also published as: JP4098020B2

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for judging an extension degree of a diabetic nephropathy by early detecting the diabetic nephropathy before judgment of a regular urine testing paper method or a clinical symptom is conducted. <P>SOLUTION: The presence or quantity of a complex of a plasminogen activator inhibitor-1 and/or an urokinase and a plasminogen activator inhibitor-1 in a human urine is detected by an immunological process, and thereby the extension degree of the diabetic nephropathy is judged. <P>COPYRIGHT: (C)2004,JPO

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、尿中のプラスミノーゲン　アクチベーター　インヒビター−１および／またはウロキナーゼとプラスミノーゲン　アクチベーター　インヒビター−１の複合体の存在または量を検出することを特徴とする糖尿病性腎症の進展度を判定する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
糖尿病性腎症は、腎生検が困難なことから持続性蛋白尿、腎機能障害、高血圧等の知見から臨床診断がなされてきた。しかし、尿蛋白が出現すると治療が難しく、５〜６年経過で末期腎不全に陥るのが通例である。そのため、通常の尿試験紙法で尿蛋白が陽性となる前に腎病変の進展度を判定して、早期治療を行うことが臨床医学の立場から強く望まれている。
【０００３】
約３０年前から、放射線免疫測定法、酵素免疫測定法、ラテックス凝集免疫比濁法、免疫沈降法により尿中の微量アルブミンの測定が行われるようになり、尿試験紙法による尿蛋白が陰性の早期から糖尿病腎症の診断ができるようになった。しかし、尿中アルブミンは日内変動および日差変動が大きく、１回のみの検査では確定診断ができない。さらには、微量アルブミン尿の診断には蓄尿が必要である。そこで、一般的には、より実用的な随時尿を用いての尿アルブミン指数：アルブミン・クレアチン比が実用的表示法として多用されているが、この方法も、測定物質と補正物質の排泄動態が両成分とも子宮体血圧により制御されている関係上、補正値は生データの特性を示さなくなることが知られている。このように、糖尿病性腎症の進展度を判定する方法は確立されているとはいえなかった。
【０００４】
プラスミノーゲン　アクチベーター　インヒビター−１（以下、これを「ＰＡＩ−１」と称することがある）は、血糖値やインスリン、血清脂質、炎症性サイトカインなどにより発現調節を受ける線溶因子であるが、プラスミンの抑制を介して、血栓傾向と組織での細胞外基質の増加、線維化を誘導すると考えられている。該因子は、従来、急性心筋梗塞症、深部動脈血栓症、アテローマ性動脈硬化症、敗血症、ＤＩＣ（播種性血管内凝固症候群）等の疾患における血管内皮障害を反映し、血液中のＰＡＩ−１の測定はこのような疾患の検出等に有用であることが報告されている。また、ＰＡＩ−１と腎疾患との関連性を示唆する報告もなされている。例えば、糖尿病性腎症は糸球体内の細胞外基質の増加と間質の線維化が特徴であり、組織免疫染色では、ＰＡＩ−１の糸球体と尿細管における発現が増強されるとの報告がある［Ａｙａ　Ｎ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ　Ｐａｔｈｏｌ，　１６６，　Ｐ２８９−２９５　（１９９２）］。近位尿細管培養では高血糖条件でＰＡＩ−１の産生増加が認められ、腎間質線維化モデルマウスではＰＡＩ−１の腎組織内発現とマクロファージの浸潤との関連性が指摘されている。
【０００５】
近年、ネフローゼ症候群患者の１日の蓄尿を濃縮し、ＰＡＩ−１に対するモノクローナル抗体とポリクローナル抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡキット（”ｔｉｎｔＥｌｉｚｅ　ＰＡＩ−１”，　Ｂｉｏｐｏｏｌ社製（Ｕｍｅａ，　Ｓｗｅｄｅｎ））により尿中のＰＡＩ−１濃度を測定した結果、ネフローゼ症候群患者でＰＡＩ−１濃度が高くなることが報告された［Ｙ．　Ｙｏｓｈｉｄａ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎｅｐｈｒｏｎ，　８８，　Ｐ２４−２９　（２００１）］　。しかし、この方法では、使用したＥＬＩＳＡキットの感度が２ｎｇ／ｍＬであることより患者尿の濃縮操作が必須であり、臨床医学の立場からは実用的とは言い難い。また、前述したように、糖尿病性腎症ではネフローゼを発症する前の早期腎症の時期に診断を行い適切な治療方針を立てることが病気の重篤化の予防に役立つが、早期の糖尿病性腎症の検出とＰＡＩ−１との関連性については一切知見が得られていなかった。
【０００６】
本発明者らは、先に急性心筋梗塞、深部静脈血栓症、糸球体腎炎、アテローマ性動脈硬化症、敗血症、ＤＩＣ（汎種性血管内凝固症候群）等を検知するために、試料中のＰＡＩ−１を検出するラテックス凝集免疫測定法を完成させている（特開平９−３３５２４号公報）。この方法では、主に血液試料中の８ｎｇ／ｍＬ〜２７０ｎｇ／ｍＬの濃度範囲のＰＡＩ−１を測定することができるが、尿を試料とする場合については詳しい検討がなされていなかった。尿を試料とする場合には血液試料中よりも含まれるＰＡＩ−１濃度が低いことが推測され、未濃縮尿を用いても十分な測定感度で尿中のＰＡＩ−１を測定するために、従来の測定系の改良が要望されていた。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、通常の尿試験紙法や臨床症状による判定がなされるより前に、早期に糖尿病性腎症を検出し進展度を判定する方法を提供するためになされたものである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を進めた結果、ヒト尿中のＰＡＩ−１、および／または、ウロキナーゼとＰＡＩ−１の複合体の存在または量を検出することにより、糖尿病性腎症の進展度を判定できることを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて成し遂げられたものである。
すなわち本発明は、以下のとおりである。
【０００９】
（１）ヒト尿中の、ＰＡＩ−１、および／または、ウロキナーゼとＰＡＩ−１の複合体の存在または量を免疫学的手法により検出することを特徴とする糖尿病性腎症の進展度の判定方法。
（２）ＰＡＩ−１、および、ウロキナーゼとＰＡＩ−１の複合体の存在または量を免疫学的手法により検出することを特徴とする（１）に記載の方法。
（３）ヒト尿が未濃縮尿であることを特徴とする（１）または（２）に記載の方法。
（４）免疫学的手法による検出が、ＰＡＩ−１、および、ウロキナーゼとＰＡＩ−１の複合体に特異的に結合するポリクローナル抗体を用いて行われることを特徴とする（２）に記載の方法。
（５）免疫学的手法が、酵素免疫測定法またはラテックス凝集免疫測定法である（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６）ＰＡＩ−１、および、ウロキナーゼとＰＡＩ−１の複合体に特異的に結合する抗体を少なくとも含み、ヒト尿中の、ＰＡＩ−１、および／または、ウロキナーゼとＰＡＩ−１の複合体の存在または量を免疫学的手法により検出することにより、糖尿病性腎症の進展度を判定するためのキット。
（７）前記抗体がポリクローナル抗体であることを特徴とする（６）に記載のキット。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。なお、本明細書において、蛋白質の精製、解析、抗体の作製等の手法は、特に明記しない限り、「新生化学実験講座（日本生化学会編、東京化学同人）」、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　−　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ（Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ，ｅｔ　ａｌ．，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８））」、「臨床病理臨時増刊特集第５３号　臨床検査のためのイムノアッセイ−技術と応用−（日本臨床病理学会編、臨床病理刊行会（１９８３））」等の一般的実験書に記載の方法又はそれに準じて行うことができる。
【００１１】
＜１＞糖尿病性腎症およびＰＡＩ−１
糖尿病性腎症とは、糖尿病患者における合併症のひとつであり、腎臓透析患者の原因疾患の上位を占める重篤な疾患である。糖尿病性腎症の病期分類として知られるＭｏｇｅｎｓｅｎの分類によれば、該疾患は第Ｉ期から第Ｖ期に分類される。疾患の初期にあたる第Ｉ期から臨床症状のない病変期である第ＩＩ期まで（以下、これらを「腎症前期」と称することがある）は、通常の尿試験紙法による尿蛋白の検出は陰性である。第ＩＩＩ期は糖尿病性腎症の初期にあたり、腎臓の形態的変化に加えて尿蛋白が検出される。第ＩＶ期では明らかな糖尿病性腎症を呈し、尿蛋白の他に、浮腫、高血圧、糸球体濾過量（ＧＦＲ）の低下が見られる。第Ｖ期になると腎不全を呈する。
【００１２】
尿蛋白の出現以後は治療が困難で、予後が悪く、５〜６年経過で末期腎不全に陥るのが通例である。しかし、早期に適切な治療を施すことによりその発症率を大きく抑制できることも知られており、その進展度の把握及び進展の抑制は臨床上大きな意義を持っている。
【００１３】
本発明の糖尿病性腎症の進展度の判定方法は、ヒト尿中の、ＰＡＩ−１、および／または、ウロキナーゼとＰＡＩ−１の複合体の存在または量を免疫学的手法により検出することを特徴とする方法である。本法によれば、通常の尿試験紙法により尿蛋白が検出されるより前の、腎症前期の段階から糖尿病性腎症の進展度を判定することができ、早期治療の指針として役立てることができる。ここでＰＡＩ−１とは、分子量が約５万の３７９アミノ酸残基からなる一本鎖の糖蛋白であり（Ｐｒｏｇｒｅｓｓ　ｉｎ　Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ　ａｎｄ　Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ，　　Ｃｏｌｌｅｒ，　Ｂ．Ｓ．，　ｅｄ．　ＷＢ　Ｓａｕｎｄｅａｒｓ　Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，　８７−１１５　（１９８９））、ヒト尿においてウロキナーゼをはじめとするプラスミノーゲン　アクチベーターと複合体を形成したり（以下、これを「複合体」と称することがある）、それ自体フリーで存在（以下、これを「遊離体」と称することがある）したりする。本発明おいて単に「ＰＡＩ−１」と称した場合には、ＰＡＩ−１活性の有無に関わらず、主にヒト尿に存在するＰＡＩ−１の遊離体を意味する。「ウロキナーゼとプラスミノーゲン　アクチベーター　インヒビター−１の複合体」とは、腎臓で合成されて尿中に排泄されるプラスミノーゲン　アクチベーターの一つであるウロキナーゼとＰＡＩ−１が尿中で複合体を形成して存在しているものをいう。すなわち、本発明の方法は、このような複合体又は遊離体の一方又は両方の存在又は量を免疫学的手法により検出することを含んでいる。尚、本発明においては、前記複合体又は遊離体の両方を測定することが好ましい。
【００１４】
＜２＞ＰＡＩ−１および／またはウロキナーゼとＰＡＩ−１の複合体の存在または量の検出に用いられる抗体
本発明においては、ヒト尿中の、ＰＡＩ−１および／またはウロキナーゼとＰＡＩ−１の複合体の存在または量の検出は免疫学的手法により行われる。ＰＡＩ−１、および／またはウロキナーゼとＰＡＩ−１の複合体の存在または量を検出するための抗体としては、ＰＡＩ−１、および／またはウロキナーゼとＰＡＩ−１の複合体に特異的に結合する能力を有するものであればいかなるものでもよく、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよい。その中でも、ＰＡＩ−１、および、ウロキナーゼとＰＡＩ−１の複合体の両方に特異的に結合する能力を有する抗体（以下、これを「抗ＰＡＩ−１抗体」と称することがある）が好ましく、特にポリクローナル抗体が特に好ましく用いられる。
【００１５】
このような抗ＰＡＩ−１抗体は、例えば、公知の手法に従ってＰＡＩ−１に対するポリクローナル抗体を作製して、作製されたポリクローナル抗体の中から、ＰＡＩ−１にもウロキナーゼとＰＡＩ−１の複合体にも結合するものを選択して用いればよい。このような抗体を選択することにより、糖尿病性腎症の進展に従って病態が変化し、尿中のＰＡＩ−１の存在形態やその比率に変化が生じた場合でも、測定値が影響を受けることがなく、安定的に前記進展度の判定を行うことができる。
【００１６】
抗体の作製方法としては、それ自体公知の通常用いられる抗体の作製方法を用いることができるが、具体的には、特開平９−３３５２４号公報に記載の方法等に準じて行うことができる。例えば、ポリクローナル抗体を作製する場合には、抗原として調製したＰＡＩ−１を必要に応じてアジュバントと混合し、ラット、モルモット、ウサギ、マウス、ヤギ、ヒツジ、馬、牛、ニワトリなどの通常抗体の製造に用いられる動物の皮下又は腹腔に２〜３週間毎に繰り返し免疫する。免疫後、適宜試験的に採血を行って、酵素免疫測定法（以下、これを「ＥＬＩＳＡ法」と称することがある）、ウエスタンブロッティング法等の免疫学的方法により力価（抗体価）が十分に上昇していることを確認することが好ましい。十分な力価の上昇が確認された動物から採血を行い、血清を分離することによって抗血清が得られる。ニワトリの場合には、鶏卵から採取した卵黄から水溶性の画分を分取して卵黄抽出液を調製し、これも抗血清同様に用いることができる。
【００１７】
本発明においては、得られた抗血清等を精製することなくそのまま用いることもできるが、以下の方法により精製して用いることが好ましい。精製法としては、例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａを用いた精製法、硫酸アンモニウムを用いた塩析による方法（例えば、Ｎｉｓｏｎｏｆｆらの方法（Ｎｉｓｏｎｏｆｆ，　Ａ．　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　ＭｅｄｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈ，　Ｅｉｓｅｎ　Ｈ．　Ｎ．　（ｅｄ）．　Ｙｅａｒ　Ｂｏｏｋ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，　Ｃｈｉｃａｇｏ，　（１９６４）　１０，　１３４−１４１））、イオン交換クロマトグラフィー等によって、イムノグロブリン画分を精製する方法、あるいは、特定のポリペプチドを固定化したカラムを用いたアフィニティーカラムクロマトグラフィーによって精製する方法等が挙げられる。
【００１８】
また、モノクローナル抗体を作製する場合には、上記と同様にして免疫した動物の脾臓から抗体産生細胞を採取し、常法によって、同系動物等由来のミエローマ細胞等の培養細胞と融合させてハイブリドーマを作製（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎａｔｕｒｅ，　２５６，　４９５（１９７５））する。培養を行って、適宜ＥＬＩＳＡ法やウエスタンブロッティング法等により抗体価を確認して、目的のエピトープを認識するモノクローナル抗体を産生し、かつ、抗体産生能の高いハイブリドーマを選択すればよい。かくして選択されるハイブリドーマの培養上清から、目的のモノクローナル抗体を得ることができる。モノクローナル抗体を用いる場合には、ＰＡＩ−１とウロキナーゼとＰＡＩ−１の複合体とをそれぞれ認識することができるように、エピトープが異なる２種類以上のモノクローナル抗体を組み合わせて用いてもよい。
【００１９】
免疫に用いるＰＡＩ−１としては、例えば、ＷＩ３８　ＶＡ１３　２ＲＡ株（ＡＴＣＣＣＣＬ７５．１）、ＨＴ１０８０株（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ１２１）、ＣａＳＫｉ株（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ１５５０）等のヒト由来ＰＡＩ−１産生細胞株の培養上清から得ることができる。このような細胞株を、無血清ＤＭＥＭ培地等の適当な培地で培養すれば、培養液中にＰＡＩ−１が分泌される。その際、培地にデキサメタゾンを２×１０^−６Ｍ程度添加しておくと、ＰＡＩ−１が効率よく産生される。これを任意の蛋白質の精製法を用いて精製すれば、精製ＰＡＩ−１を得ることができる。尚、細胞株の培養にウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含む培地を用いた場合は、抗ＦＣＳポリクローナル抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーにより、ＰＡＩ−１標品からＦＣＳを除去することができる。
【００２０】
また、ＰＡＩ−１は、遺伝子組換え技術により作製されたＰＡＩ−１を発現する大腸菌を培養することによっても得られる。培養上清からのＰＡＩ−１の粗精製は、後記実施例では、抗ＰＡＩ−１マウスモノクローナル抗体固定セファロース４Ｂ（ファルマシア社製）を用いたアフィニティクロマトグラフィーにより行ったが、モノクローナル抗体の代わりにコンカナバリンＡ固定セファロースによって粗精製することもできる。得られた粗精製物をゲル濾過クロマトグラフィーにより分画することによって、さらに精製されたＰＡＩ−１が得られる。各フラクション中のＰＡＩ−１の相対量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウェスタンブロット法で確認できる。
【００２１】
かくして得られる精製ＰＡＩ−１は、免疫原として用い得るだけでなく、各種の免疫学的手法において、標準品としても用いることができる。例えば、上記のようにして得られたＰＡＩ−１に対する抗体は、精製ＰＡＩ−１との反応性を、ラテックス凝集免疫測定法やウエスタンブロッティング法等により調べることによって評価することができる。例えば、ウエスタンブロッティング法により調べる場合には、精製ＰＡＩ−１をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供し、泳動後のゲルをニトロセルロース膜等に転写し、前記抗体、抗体の調製に用いた免疫動物のイムノグロブリンに対する他の動物の抗体をアルカリフォスファターゼ等で標識した二次抗体、及び酵素反応により発色する基質色素と順次インキュベートして発色させることにより、精製ＰＡＩ−１と作製された抗体との反応性を調べることができる。かくして評価されたポリクローナル抗体の中から、ＰＡＩ−１の遊離体とウロキナーゼとＰＡＩ−１の複合体との両方に対して特異的に結合する抗体を選択し、これを本発明の方法に用いることが好ましい。すなわち、反応性を評価する際に、ウロキナーゼとの複合体等を含む種々の形態のＰＡＩ−１や、他の血漿タンパクも同じゲルで泳動し、前記抗体がＰＡＩ−１の活性や形態に関わらず結合し、他の血漿タンパクには結合しないことを確認して選択することが好ましい。
【００２２】
例えば、ＰＡＩ−１の遊離体として、精製ＰＡＩ−１を活性化することにより得られる活性型ＰＡＩ−１や、これを不活性化することにより得られる潜在型ＰＡＩ−１等を用いることができる。また、ＰＡＩ−１の複合体として、ウロキナーゼとＰＡＩ−１との複合体を用いることができる。具体的には、例えば、活性型ＰＡＩ−１は、精製ＰＡＩ−１を４Ｍグアニジン塩酸（ｐＨ７．２）中、３７℃２時間反応させた後、少量の０．１Ｍ酢酸を添加し反応を停止し、２０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．６）／０．０１％　Ｔｗｅｅｎ８０で４℃２０時間透析することにより得ることができる。潜在型ＰＡＩ−１は、活性型ＰＡＩ−１を２回凍結融解することにより調製することができる。ウロキナーゼとＰＡＩ−１の複合体は、前記活性型ＰＡＩ−１をヒト重鎖ウロキナーゼ（Ａｍｅｒｉｃａｎ　　ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ社製）とともに３７℃　３０分間反応させることにより複合体を形成させ、これを用いることができる。本発明においては、これら全ての形態のＰＡＩ−１に結合する能力を有する抗体が特に好ましく用いられる。
【００２３】
なお、本発明において抗体とは、全長の抗体のみならずその断片をも含む。例えば、抗体は、ＩｇＧそのものでもよいが、ＩｇＧをペプシン、パパインなどの消化酵素、あるいはジチオスレイトール、メルカプトエタノールなどの還元剤を用いてＦ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’などにフラグメント化した機能性のある断片も同様に用いることができる。ＩｇＭなどの他のクラスの抗体も同様の処理をして使用することができる。
【００２４】
また、本発明の抗体は、後述する種々の免疫学的手法において用いられる際に、適宜固相に担持されたり、標識化されて用いられることがある。このような抗体も、すべて本発明の範囲内である。
【００２５】
＜３＞ＰＡＩ−１、および／または、ウロキナーゼとＰＡＩ−１の複合体の存在または量の免疫学的手法による検出
本発明においては、ヒト尿中のＰＡＩ−１、および／または、ウロキナーゼとＰＡＩ−１の複合体の存在または量の検出は、免疫学的手法により行われる。免疫学的手法としては、それ自体公知の通常用いられる蛋白質の免疫学的検出方法から任意に選択して用い得る。具体的には、例えば、酵素免疫測定法、ラテックス凝集免疫測定法、化学発光免疫測定法、蛍光抗体法、放射免疫測定法、免疫沈降法等が挙げられ、その中でも、酵素免疫測定法もしくはラテックス凝集免疫測定法が好ましく用いられる。
【００２６】
酵素免疫測定法、化学発光免疫測定法、蛍光抗体法、放射免疫測定法等の標識化された二次抗体を用いる方法により検出を行う場合には、サンドイッチ法または競合法により行うこともできる。サンドイッチ法の場合には、固相化される一次抗体あるいは標識化抗体のいずれかが抗ＰＡＩ−１抗体であればよい。例えば、ウロキナーゼとＰＡＩ−１の複合体の存在または量を検出する場合には抗ＰＡＩ−１抗体と抗ウロキナーゼ抗体を組み合わせて用いることができる。ＰＡＩ−１、および、ウロキナーゼとＰＡＩ−１の複合体の両方の存在または量を検出する場合には、一次抗体および標識化抗体の両方に抗ＰＡＩ−１抗体を用いる。本発明においては、一次抗体と標識化抗体の両方に抗ＰＡＩ−１抗体を用いることが好ましい。
【００２７】
固相としては、抗体を担持させるのに使用できる不溶性担体であればよく、プラスチック、ガラス等の物質からなるプレート、試験管もしくはチューブ等、ビーズ、ボール、フィルター、メンブレン等を用いることができる。また、磁性粒子等を用いることもでき、具体的には、例えば、四酸化三鉄（Ｆｅ_３Ｏ_４）、三酸化二鉄（Ｆｅ_２Ｏ_３）、種々のフェライト、鉄、マンガン、ニッケル、コバルト、クロムなどの金属、コバルト、ニッケル、マンガンなどの合金からなる微粒子等の磁性粒子が好ましく用いられる。さらに、これらの磁性粒子を、ポリスチレン等の高分子のラテックスや、ゼラチン、リポソーム等の内部に含まれる形で調製したり、表面に固定化したものも用いることができる
【００２８】
一般的な測定の手法は、それ自体公知の通常用いられる方法に準じて行うことができるが、例えば、固相化抗体と試料とを反応させ、同時に、または洗浄の後に標識化抗体と反応させて、免疫複合体を形成させる。未反応の標識化抗体を洗浄除去した後に、結合した標識化抗体の量により試料中に存在する抗原の量を求めることができる。
前記したような磁性粒子を用いた場合には、例えば、永久磁石、電磁石等で磁場を与え、磁力を利用することにより未反応の抗体等の洗浄操作（Ｂ／Ｆ分離）を行うこともできる。
【００２９】
標識化抗体の量は、酵素免疫測定法の場合には、標識化した酵素にその基質を反応させ、反応生成物の量を光学的手法等により測定すればよい。化学発光免疫測定法の場合には、発光反応系による発光量を測定する。蛍光抗体法の場合には蛍光物質に由来する蛍光強度を、放射免疫測定法の場合には、放射性物質由来の放射線量を測定すればよい。標識物質の具体例としては、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ等の酵素、フルオレセインイソチアネート、希土類金属キレート等の蛍光物質、^３Ｈ、^１４Ｃ、^１２５Ｉ等の放射性同位体、ビオチン、アビジン、化学発光物質等が挙げられる。酵素、化学発光物質等の場合には、それ自体単独では測定可能なシグナルをもたらすことはできないことから、それぞれ対応する適当な基質等を選択して用いればよい。
【００３０】
ラテックス凝集免疫測定法を用いる場合には、例えば、抗体を担持させる固相担体としては、ラテックス、ゼラチン、リポソーム、赤血球、シリカ、スチレン−ブタジエン共重合体、アルミナ、またはセラミックス等の粒子を用いることができる。中でもラテックス粒子が好ましく用いられ、ポリスチレンラテックス、スチレンとジビニルベンゼンの共重合体、アクリル酸とスチレンの共重合体、スチレンとマレイン酸の共重合体、スチレンとメタクリル酸の共重合体、スチレンとアクリル酸とアルキルアクリレートなどの共重合体、酢酸ビニルとアクリル酸の共重合体等が挙げられる。ラテックス粒子の粒径としては、０．１〜１．０μｍ程度が好ましい。これらの担体粒子に、物理的吸着法、化学結合法等を利用して抗ＰＡＩ−１抗体を担持させる。この固相担体に担持された抗体と試料とを反応させ、免疫複合体を形成させることにより凝集体を生じさせ、透過光や散乱光を利用して光学的方法により測定したり、目視により判定すればよい。
【００３１】
本発明において試料として用いられるヒト尿としては、随時尿、蓄尿等があるが、臨床医学的な立場から、随時尿が好ましく用いられる。採取された尿は、直ちに解析に供されることが好ましいが、４〜−８０℃、好ましくは４〜−２０℃等の低温条件下で保存しておくこともできる。保存に際しては、必要に応じて蛋白質の変性等を抑制するような保存剤や、腐敗を防止するための防腐剤等を添加してもよい。また、これらの試料は、必要に応じて濃縮、精製等の前処理を行ってから解析に供してもよいが、濃縮の操作を加えずに未濃縮尿のまま解析に供されることが好ましい。
【００３２】
試料として解析に供されるヒト尿の量としては、用いる免疫学的手法や抗体の感度等により適宜調節すればよい。具体的には、例えば、酵素免疫測定法を用いて測定を行う場合には、用いるＥＬＩＳＡプレートのウェルの内容量等に応じて、試料量を決定すればよい。例えば、ラテックス凝集免疫測定法を用いる場合には、試料量とラテックス試薬の量の比率を様々に変えて凝集の程度を確認し、最も良く凝集を生じる比率に設定すればよい。
【００３３】
＜４＞本発明の糖尿病性腎症の進展度の判定方法
上記＜２＞および＜３＞において詳述した抗体および免疫学的手法を用いて、ヒト尿中のＰＡＩ−１および／またはウロキナーゼとＰＡＩ−１の複合体の存在または量の検出を行い、糖尿病性腎症の進展度の判定を行う。
【００３４】
具体的には、例えば、糖尿病性腎症の疑いのある患者から検体として採取された尿を、前記抗体を用いた免疫学的手法により解析し、該尿中のＰＡＩ−１および／またはウロキナーゼとＰＡＩ−１の複合体の存在または量を検出する。一方で健常人から検体として採取された尿を同様に解析し、該尿中のＰＡＩ−１および／またはウロキナーゼとＰＡＩ−１の複合体の存在または量を検出し、これらの結果を比較、解析すればよい。
【００３５】
ここで、健常人の検体ではＰＡＩ−１および／またはウロキナーゼとＰＡＩ−１の複合体が実質的に検出されず、糖尿病性腎症の疑いのある患者から採取された検体においてＰＡＩ−１および／またはウロキナーゼとＰＡＩ−１の複合体の存在が検出された場合に、該患者は糖尿病性腎症であると判定することができる。あるいは、健常人の検体において検出されたＰＡＩ−１および／またはウロキナーゼとＰＡＩ−１の複合体の量に比べて、糖尿病性腎症の疑いのある患者の検体において検出されたＰＡＩ−１および／またはウロキナーゼとＰＡＩ−１の複合体の量が有意に多い場合に、該患者は糖尿病性腎症であると判定することができる。また、糖尿病性腎症の疑いのある患者の検体において検出されたＰＡＩ−１および／またはウロキナーゼとＰＡＩ−１の複合体の量に応じて、その量が多いほど、糖尿病性腎症が進展していると判定することができる。
【００３６】
一方、糖尿病性腎症の疑いのある患者の検体においても、健常人の検体においても、ＰＡＩ−１および／またはウロキナーゼとＰＡＩ−１の複合体が検出されなかった場合、もしくは、糖尿病性腎症の疑いのある患者の検体において検出されたＰＡＩ−１および／またはウロキナーゼとＰＡＩ−１の複合体の量と、健常人において検出されたＰＡＩ−１および／またはウロキナーゼとＰＡＩ−１の複合体の量に有意な差がない場合には、該患者は糖尿病性腎症ではないと判定される。
【００３７】
ここで、健常人において検出されたＰＡＩ−１および／またはウロキナーゼとＰＡＩ−１の複合体の量は、あらかじめ多数の検体を用いて解析を行った結果から平均値もしくは平均的な濃度範囲を求めておいて、これらを用いて比較、解析を行ってもよい。また、例えば、糖尿病性腎症の疑いのある患者の検体において検出されるＰＡＩ−１および／またはウロキナーゼとＰＡＩ−１の複合体の量と、健常人において検出されるＰＡＩ−１および／またはウロキナーゼとＰＡＩ−１の複合体の量のそれぞれの平均値もしくは平均的な濃度範囲が得られている場合には、判定のための閾値を設定し、測定した検体中に存在するＰＡＩ−１および／またはウロキナーゼとＰＡＩ−１の複合体の量が該閾値よりも大きかった場合に、該患者は糖尿病性腎症であると判定することができる。
【００３８】
また、さらに、糖尿病性腎症の病期分類に応じて、第Ｉ期〜第Ｖ期のそれぞれの期にある患者から得られた複数の検体を用いて、各期におけるＰＡＩ−１および／またはウロキナーゼとＰＡＩ−１の複合体の量の平均値もしくは平均的な濃度範囲を求め、それぞれの期ごとに判定のための濃度範囲を設定しておくことにより、糖尿病性腎症の疑いのある患者から得られた検体を解析し、得られた測定値がどの期の濃度範囲に含まれるかを指標にして、該患者の糖尿病性腎症の進展度を判定することもできる。
【００３９】
ここで、解析において「有意に多い」とは、統計学的な解析の結果、有意差があることを意味する。また、検体として用いられるヒト尿は、採取方法、採取時間帯、保存方法等をそろえたもので比較、解析されることが好ましい。
【００４０】
免疫学的手法を用いて検出された、尿中のＰＡＩ−１および／またはウロキナーゼとＰＡＩ−１の複合体の量を示す値は、患者間の腎機能の差を補正する補正処理等を行って、統計処理を行ってもよい。このような補正により、患者の個体差、尿を採取した時間等により生じる差を補正して比較、解析を行うことができる。ただし、腎機能の差を補正する指標は、腎不全患者等の腎機能が失われた患者の尿においては無意味であるので、腎機能が保持されている患者から採取された尿において行われることが好ましい。
【００４１】
このような補正に用いられる腎機能の指標としては、クレアチニン（Ｃｒ）、クレアチニンクリアランス（ＣＣｒ）、尿素窒素（ＢＵＮ）、尿中β−Ｄ−Ｎアセチルグルコサミニダーゼ等が挙げられる。中でも、医薬・臨床検査分野では、一般的にＣＣｒまたはＣｒが好ましく用いられる。
【００４２】
具体的には、例えば、ＰＡＩ−１値の生データについてクレアチニンを指標にした補正を行う方法としては、尿中ＰＡＩ−１値が一定の値よりも低い検体、例えば０．０３ｎｇ／ｍＬ未満の検体では、尿中Ｃｒ値が中央値以上の試料のみを採用する。尿中ＰＡＩ−１値を尿中Ｃｒ値で除した値を、尿中補正ＰＡＩ−１値とすればよい。
【００４３】
【実施例】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。
【００４４】
【実施例１】精製ＰＡＩ−１、抗ＰＡＩ−１ポリクローナル抗体、ラテックス試薬、及びウロキナーゼとＰＡＩ−１の複合体の調製
特開平９−３３５２４号公報に記載の方法に準じて、抗ＰＡＩ−１抗体、該抗体を担持させたラテックス試薬、および精製ＰＡＩ−１（ＰＡＩ−１標準品）を調製した。
【００４５】
（１）精製ＰＡＩ−１は、具体的には、以下のようにして調製した。ヒト由来ＰＡＩ−１産生細胞株ＷＩ３８　ＶＡ１３　２ＲＡ（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ７５．１）を、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）添加ＤＭＥＭ培地（日水製）で、ローラーボトル中で増殖させ、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で細胞を洗浄した後、デキサメタゾン２×１０^−６Ｍを含む無血清ＤＭＥＭ培地中で１０日間培養した。その後、培養上清を回収し、抗ＰＡＩ−１マウスモノクローナル抗体固定セファロース４Ｂアフィニティカラムに通してＰＡＩ−１を吸着させた後、３Ｍ　ＭｇＣｌ_２で溶出し、粗精製ＰＡＩ−１を得た。抗ＰＡＩ−１マウスモノクローナル抗体固定セファロース４Ｂは、マウスモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ（米国カリフォルニア、ラ　ジョラのスクリップスクリニック　アンド　リサーチファウンデーション（Ｓｃｒｉｐｐｓ　Ｃｌｉｎｉｃ　ａｎｄ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）のＤ．Ｊ．ロスクトフ（Ｄ．　Ｊ．　Ｌｏｓｋｕｔｏｆｆ）博士より恵与された。Ｊ．　Ｃｌｉｎ．　Ｉｎｖｅｓｔ．，　８３，　１７４７−１７５２　（１９８９）参照）から抗ＰＡＩ−１モノクローナル抗体を調製し、これをＣＮＢｒ−セファロース４Ｂ（ファルマシア社製）に結合することにより作製した。
【００４６】
上記で得られた溶出物を、抗ＦＣＳポリクローナル抗体固定化セファロース４Ｂアフィニティカラムに通して培養液中の残存ＦＣＳの吸着除去を行い、精製ＰＡＩ−１を得た。
【００４７】
（２）抗ＰＡＩ−１ポリクローナル抗体及びラテックス試薬は、次のようにして調製した。上記で得られたＰＡＩ−１を、限外濾過膜（アミコン社、ＹＭ−１０）を用いて４００μｇ／ｍｌに濃縮した。これとフロイントの完全アジュバントとの混合物でニュージーランド白色ウサギを免疫し、８〜１０週間後に追加免疫を行った。初回免疫より１０〜１４週間後に採血し、抗ＰＡＩ−１抗血清を得た。この上記抗ＰＡＩ−１血清を、Ｎｉｓｏｎｏｆｆらの方法（Ｎｉｓｏｎｏｆｆ，　Ａ．　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，　Ｅｉｓｅｎ　Ｈ．　Ｎ．　（ｅｄ）．　Ｙｅａｒ　Ｂｏｏｋ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，　Ｃｈｉｃａｇｏ，　（１９６４）　１０，　１３４−１４１）により精製し、抗ＰＡＩ−１ポリクローナル抗体を得た。すなわち、抗血清から硫酸アンモニウム塩析により、粗γ−グロブリン分画を得、ペプシン消化によりＦ（ａｂ’）_２を得た（以下、「抗ＰＡＩ−１抗体」という）。このＰＡＩ−１　Ｆ（ａｂ’）_２を、平均粒径０．５３μｍのポリスチレンラテックス（アレクソントレンド社製）表面に常法により固定し、ラテックス試薬とした。試薬中のラテックス濃度は０．１〜０．５％であり、ＰＡＩ−１　Ｆ（ａｂ’）_２の濃度は０．０２５〜０．２５μｇ／μｌであった。
【００４８】
抗ＰＡＩ−１抗体は、活性型ＰＡＩ−１、潜在型ＰＡＩ−１、およびウロキナーゼとＰＡＩ−１の複合体に反応性を有することを、あらかじめＬＰＩＡ法（ラテックス凝集免疫測定法）により確認した。
活性型ＰＡＩ−１は、精製ＰＡＩ−１を４Ｍグアニジン塩酸（ｐＨ７．２）中、３７℃２時間反応させた後、少量の０．１Ｍ酢酸を添加し反応を停止し、２０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．６）／０．０１％　Ｔｗｅｅｎ８０で４℃２０時間透析することにより得た。潜在型ＰＡＩ−１は、活性型ＰＡＩ−１を２回凍結融解することにより調製した。また、活性型ＰＡＩ−１をヒト重鎖ウロキナーゼ（Ａｍｅｒｉｃａｎ　　ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ社製）とともに３７℃　３０分間反応させることにより複合体を形成させ、これをウロキナーゼとＰＡＩ−１の複合体として用いた。
【００４９】
【実施例２】ラテックス凝集免疫測定法を用いた測定系の構築
まず、精製ＰＡＩ−１を用いてＰＡＩ−１測定用検量線を作製した。Ｂｒａｄｆｏｒｄの方法（Ａｎａｌ．　　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　７２，　２４８−２５４　（１９７６））を用いて精製ＰＡＩ−１のタンパク質量を定量し、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）添加トリス緩衝液で０．０９４、１．８８、３．７５、７．５、１５ｎｇ／ｍｌに希釈し、ＰＡＩ−１測定用標準品とした。
【００５０】
このＰＡＩ−１標準品溶液各４０μｌ、ＢＳＡ含有トリス−塩酸緩衝液３５μｌ、前記ラテックス試薬４０μｌを混合し、反応キュベットに自動分注後、近赤外（９５０ｎｍ）の吸収の増加を１０分間測定することにより、免疫反応を観察した。測定は、ラテックス凝集全自動測定器（三菱化学（株）製：ＬＰＩＡ−２００システム）を用いて行い、２０分以内に完了した。その結果、ＰＡＩ−１量とラテックス凝集率は直線性を示し、検量線を得た。
【００５１】
【実施例３】各種腎臓病患者の随時尿のラテックス凝集免疫測定法による解析
上記実施例２で構築したラテックス凝集免疫測定法および検量線を用いて、慢性腎炎患者１１名、糖尿病性腎症患者２５名、ネフローゼ症候群患者６名、健常人１２名の随時尿を検体として解析を行った。
【００５２】
各検体４０μｌ、ＢＳＡ含有トリス−塩酸緩衝液３５μｌ、前記ラテックス試薬４０μｌを混合し、反応キュベットに自動分注後、近赤外（９５０ｎｍ）の吸収の増加を１０分間測定することにより、免疫反応を観察した。測定は、ラテックス凝集全自動測定器（三菱化学（株）製：ＬＰＩＡ−２００システム）を用いて行い、２０分以内に完了した。
【００５３】
得られた測定値の中で、尿中ＰＡＩ−１値が０．０３ｎｇ／ｍＬ未満の検体では、尿中Ｃｒ値が中央値の５６ｍｇ／ｍｌ以上のサンプルのみを採用して尿中ＰＡＩ−１値を０．０２ｎｇ／ｍｌと仮定し、尿中ＰＡＩ−１値を尿中Ｃｒ値で除した値を尿中補正ＰＡＩ−１値とした。
【００５４】
その結果、糖尿病性腎症群では尿中補正ＰＡＩ−１値が０．２０（尿中ＰＡＩ−１＝０．００−８．５０）であったのに対して、慢性腎炎群は０．０３（尿中ＰＡＩ−１＝０．００−０．２８）、ネフローゼ症候群の群では０．０５（尿中ＰＡＩ−１＝０．０１−０．４４）、健常人群は０．０２（尿中ＰＡＩ−１＝０．００−０．０５）であった。これらの値より、糖尿病性腎症のみにおいて尿中補正ＰＡＩ−１値が有意に高く、尿中ＰＡＩ−１値が糖尿病性腎症の検出に非常に有用な指標となることが示された（図１）。
【００５５】
【実施例４】酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）を用いた測定系の構築
実施例１で得た抗ＰＡＩ−１ポリクローナル抗体を精製し、ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒｅｄ　ｓａｌｉｎｅ）にて０．３ｍｇ／ｍＬに希釈し、９６穴ＥＩＡプレート（ヌンク社製）に各ウェル１００μＬずつ添加し、４℃にて一晩コーティングした。次に過剰の抗体をＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄除去したのち、６％ＢＳＡを含むＰＢＳを各ウェル２００μＬずつ添加し、４℃で一晩ブロッキングを行った。
【００５６】
ＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０でブロッキング液を洗浄除去したのち、１００μＬの尿検体、または実施例２で得たＰＡＩ−１測定用標準品を添加し、室温にて１時間反応を行った。ＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で反応液を洗浄除去したのち、Ｐｉｅｒｃｅ社製ビオチン標識試薬を用いて標識化しておいた０．０５ｍｇ／ｍＬビオチン標識抗ＰＡＩ−１ポリクローナル抗体１００μＬを添加し、室温にて１時間反応を行った。反応後、上記と同様に洗浄を行ったのち、０．１μｇ／ｍＬアビジン結合アルカリフォスファターゼ溶液（Ｐｉｅｒｃｅ社製）１００μＬを添加し、室温にて１時間反応を行い、洗浄後、アルカリフォスファターゼ／リン酸基質液（Ｐｉｅｒｃｅ社製）を各ウェルに１００μＬ添加し、３７℃にて３０分間反応させた。
【００５７】
マイクロプレート用比色計で４５０ｎｍの吸光値を測定し、６９５ｎｍの吸光値をバックグランウンドとして差し引き、解析を行った。
【００５８】
【実施例５】健常人および糖尿病患者の随時尿のＥＬＩＳＡ法による解析健常人３名、糖尿病患者でＤＩＣから多臓器不全を起こして入院中の患者５名、糖尿病と診断された外来患者６名の随時尿を検体として、上記実施例４に記載の方法に従って、ＥＬＩＳＡ法を用いて測定した。測定にあたっては、採取された尿は濃縮せずにそのまま用いた。ここで、糖尿病患者でＤＩＣから多臓器不全を起こして入院中の患者とは、糖尿病製腎症が進行している患者であり、本発明の方法で判定結果が陽性になると考えられる群である。糖尿病と診断された外来患者とは、糖尿病性腎症を発症しているかどうかが不明の群である。
【００５９】
解析の結果、ＤＩＣから多臓器不全を起こして入院中の重症患者群では、全例において尿中ＰＡＩ−１値が有意に高値を示した。一方、糖尿病と診断された外来患者群は健常人に比べ有意に高値を示したが、各検体ごとの測定値にはばらつきが見られ、有意に高値をしめしたものと、健常人との有意差が見られないものとがあった（図２）。この結果より、本発明の方法を用いれば、糖尿病性腎症の進展度を判定することができることが示された。
【００６０】
【発明の効果】
本発明の方法によって、簡便性、迅速性、および特異性に優れた糖尿病性腎症の進展度の判定法が提供される。本発明の方法によれば、通常の尿試験紙法や臨床症状による判定がなされるより前に、患者への侵襲性の低い尿検体を用いて、早期に糖尿病性腎症を検出し進展度を判定することができる。早期に糖尿病性腎症を検出し進展度を判定することにより、早期に適切な治療を施すことができ、その発症率や腎不全への進行を大きく抑制することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】各種腎疾患での尿中補正ＰＡＩ−１値の補正値の比較を示す図である。縦軸にＰＡＩ−１量（クレアチニン（ｇ）に対する総ＰＡＩ−１量（μｇ））、横軸に各検体名を示した。
【図２】健常人及び患者における尿中ＰＡＩ−１濃度を示した図である。縦軸にＰＡＩ−１濃度、横軸に各検体名を示した。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a progression of diabetic nephropathy characterized by detecting the presence or amount of plasminogen activator inhibitor-1 and / or a complex of urokinase and plasminogen activator inhibitor-1 in urine. The method of determining
[0002]
[Prior art]
Diabetic nephropathy has been clinically diagnosed based on knowledge of persistent proteinuria, renal dysfunction, hypertension and the like due to difficulty in renal biopsy. However, the appearance of urinary protein is difficult to treat, and usually results in end-stage renal failure after 5 to 6 years. Therefore, it is strongly desired from the standpoint of clinical medicine to determine the degree of development of a renal lesion before urine protein becomes positive by a normal urine test strip method and to perform early treatment from the viewpoint of clinical medicine.
[0003]
Approximately 30 years ago, measurement of trace albumin in urine has been performed by radioimmunoassay, enzyme immunoassay, latex agglutination immunoturbidimetry, and immunoprecipitation, and urine protein is negative by a urine test paper method. Diagnosis of diabetic nephropathy became possible from an early stage. However, urinary albumin has large daily fluctuations and daily fluctuations, so that a single test cannot make a definitive diagnosis. Furthermore, urine collection is necessary for the diagnosis of microalbuminuria. Therefore, in general, the urinary albumin index: albumin / creatine ratio using a more practical random urine is frequently used as a practical display method, but this method also requires the excretion kinetics of the measurement substance and the correction substance. Since both components are controlled by the uterine blood pressure, it is known that the correction value does not show the characteristics of the raw data. Thus, a method for determining the degree of progression of diabetic nephropathy has not been established.
[0004]
Plasminogen activator inhibitor-1 (hereinafter sometimes referred to as "PAI-1") is a fibrinolytic factor whose expression is regulated by blood sugar levels, insulin, serum lipids, inflammatory cytokines and the like. Through suppression of plasmin, it is thought to induce thrombotic tendency, increase in extracellular matrix in tissues, and fibrosis. The factor has been conventionally reflected in vascular endothelial disorders in diseases such as acute myocardial infarction, deep arterial thrombosis, atherosclerosis, sepsis, DIC (disseminated intravascular coagulation syndrome) and PAI-1 in blood. Has been reported to be useful for detecting such diseases and the like. There have also been reports suggesting a relationship between PAI-1 and renal disease. For example, diabetic nephropathy is characterized by increased extracellular matrix in the glomerulus and fibrosis of the interstitium, and tissue immunostaining reports that expression of PAI-1 in the glomerulus and tubule is enhanced. [Aya N, et al. , J Pathol, 166, P289-295 (1992)]. Increased production of PAI-1 was observed in the proximal tubule culture under hyperglycemic conditions, and a relationship between the expression of PAI-1 in renal tissues and infiltration of macrophages in renal interstitial fibrosis model mice has been pointed out.
[0005]
In recent years, the daily urine collection of a nephrotic syndrome patient has been concentrated, and the urinary urine has been collected using a sandwich ELISA kit ("tintElize PAI-1", Biopool (Umea, Sweden)) using a monoclonal antibody and a polyclonal antibody against PAI-1. As a result of measuring the PAI-1 concentration, it was reported that the PAI-1 concentration was increased in patients with nephrotic syndrome [Y. Yoshida et al. , Nephron, 88, P24-29 (2001)]. However, in this method, since the sensitivity of the used ELISA kit is 2 ng / mL, the operation of concentrating the urine of the patient is indispensable, and is not practical from the viewpoint of clinical medicine. Also, as mentioned above, in diabetic nephropathy, it is helpful to diagnose at the stage of early nephropathy before the onset of nephrosis and to make an appropriate treatment policy to prevent the disease from becoming serious. No knowledge has been obtained regarding the relationship between the detection of nephropathy and PAI-1.
[0006]
The present inventors have previously developed PAI in a sample to detect acute myocardial infarction, deep vein thrombosis, glomerulonephritis, atherosclerosis, sepsis, DIC (pancreatic intravascular coagulation syndrome) and the like. A latex agglutination immunoassay for detecting -1 has been completed (JP-A-9-33524). According to this method, PAI-1 in a concentration range of 8 ng / mL to 270 ng / mL in a blood sample can be mainly measured, but no detailed study has been made when urine is used as a sample. When urine is used as a sample, it is estimated that the PAI-1 concentration contained in the blood sample is lower than that in the blood sample. In order to measure PAI-1 in urine with sufficient measurement sensitivity even using unconcentrated urine, Improvements in conventional measurement systems have been desired.
[0007]
[Problems to be solved by the invention]
The present invention has been made to provide a method for detecting diabetic nephropathy and judging the progress thereof at an early stage before the judgment based on the usual urinary test strip method or clinical symptoms.
[0008]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have conducted intensive studies in order to solve the above problems, and as a result, by detecting the presence or amount of PAI-1 and / or a complex of urokinase and PAI-1 in human urine, It has been found that the degree of progression of diabetic nephropathy can be determined. The present invention has been accomplished based on these findings.
That is, the present invention is as follows.
[0009]
(1) Determination of the degree of progression of diabetic nephropathy, wherein the presence or amount of PAI-1 and / or a complex of urokinase and PAI-1 in human urine is detected by an immunological technique. Method.
(2) The method according to (1), wherein the presence or amount of PAI-1 and a complex of urokinase and PAI-1 is detected by an immunological technique.
(3) The method according to (1) or (2), wherein the human urine is unconcentrated urine.
(4) The method according to (2), wherein the detection by an immunological technique is performed using PAI-1 and a polyclonal antibody that specifically binds to a complex of urokinase and PAI-1. .
(5) The method according to any one of (1) to (4), wherein the immunological technique is an enzyme immunoassay or a latex agglutination immunoassay.
(6) at least an antibody which specifically binds to PAI-1 and a complex of urokinase and PAI-1; and, in human urine, PAI-1 and / or a complex of urokinase and PAI-1 A kit for determining the progress of diabetic nephropathy by detecting the presence or amount by an immunological technique.
(7) The kit according to (6), wherein the antibody is a polyclonal antibody.
[0010]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in detail. In the present specification, unless otherwise specified, methods for protein purification, analysis, production of antibodies, and the like are described in “Shinsei Kagaku Kenkyusho (edited by The Biochemical Society of Japan, Tokyo Kagaku Dojin)” and “Antibodies-A Laboratory Manual ( E. Harlow, et al., Cold Spring Harbor Laboratory (1988)), "Clinical Pathology Extra Edition Special Issue No. 53, Immunoassay for Clinical Examinations-Techniques and Applications-(Japanese Society of Clinical Pathology, Clinical Pathology Publishing ( 1983)) "and the like, or a method analogous thereto.
[0011]
<1> Diabetic nephropathy and PAI-1
Diabetic nephropathy is one of the complications in diabetic patients and is a serious disease that ranks high in the causative diseases of renal dialysis patients. According to Mogensen's classification, which is known as the staging of diabetic nephropathy, the disease is classified from stage I to stage V. From stage I, which is the early stage of the disease, to stage II, which is a lesion stage without clinical symptoms (hereinafter, these may be referred to as "prenephropathy"), detection of urine protein by the usual urine test strip method is not possible. Negative. Stage III is an early stage of diabetic nephropathy, in which urine proteins are detected in addition to morphological changes in the kidney. Stage IV presents with apparent diabetic nephropathy, edema, hypertension, and decreased glomerular filtration rate (GFR) in addition to urinary protein. In stage V, renal failure is exhibited.
[0012]
After the appearance of urine protein, treatment is difficult and the prognosis is poor, and end-stage renal failure usually occurs after 5 to 6 years. However, it is also known that the onset rate can be largely suppressed by giving an appropriate treatment early, and the grasp of the degree of progress and suppression of the progress are of great clinical significance.
[0013]
The method for determining the degree of progression of diabetic nephropathy of the present invention comprises detecting the presence or amount of PAI-1 and / or a complex of urokinase and PAI-1 in human urine by an immunological technique. Characteristic method. According to this method, the degree of progression of diabetic nephropathy can be determined from the early stage of nephropathy before urine protein is detected by the normal urine test strip method, and it can be used as a guideline for early treatment Can be. Here, PAI-1 is a single-chain glycoprotein having a molecular weight of about 50,000 and consisting of 379 amino acid residues (Progress in Hemostasis and Thrombosis, Coller, BS, ed. WB Saundears Philadelphia, 87- 115 (1989)), forms a complex with plasminogen activator such as urokinase in human urine (hereinafter, this may be referred to as “complex”), or exists as a free substance (hereinafter, referred to as “complex”). This is sometimes referred to as “free form”). In the present invention, when simply referred to as "PAI-1", it means a free form of PAI-1 mainly present in human urine regardless of the presence or absence of PAI-1 activity. The “complex of urokinase and plasminogen activator inhibitor-1” is a complex of urokinase and PAI-1 which are one of plasminogen activators synthesized in the kidney and excreted in urine. Are formed and exist. That is, the method of the present invention involves detecting the presence or amount of one or both of such complexes or educts by an immunological technique. In the present invention, it is preferable to measure both the complex and the educt.
[0014]
<2> Antibody used for detecting the presence or amount of a complex of PAI-1 and / or urokinase with PAI-1
In the present invention, detection of the presence or amount of the complex of PAI-1 and / or urokinase and PAI-1 in human urine is performed by an immunological technique. Antibodies for detecting the presence or amount of PAI-1 and / or a complex of urokinase and PAI-1 include an ability to specifically bind to PAI-1 and / or a complex of urokinase and PAI-1. Any one having the above may be used, and a polyclonal antibody or a monoclonal antibody may be used. Among them, PAI-1 and an antibody capable of specifically binding to both urokinase and a complex of PAI-1 (hereinafter sometimes referred to as “anti-PAI-1 antibody”) are preferable, Particularly, a polyclonal antibody is particularly preferably used.
[0015]
Such an anti-PAI-1 antibody is prepared, for example, by preparing a polyclonal antibody against PAI-1 according to a known technique, and converting PAI-1 into a complex of urokinase and PAI-1 from the prepared polyclonal antibodies. May be selected and used. By selecting such an antibody, the pathology changes in accordance with the progress of diabetic nephropathy, and even if the presence form or the ratio of PAI-1 in urine changes, the measured value may be affected. And the determination of the degree of progress can be performed stably.
[0016]
As a method for producing the antibody, a commonly used method for producing an antibody known per se can be used, and specifically, it can be carried out according to the method described in JP-A-9-33524. For example, when preparing a polyclonal antibody, PAI-1 prepared as an antigen is mixed with an adjuvant, if necessary, and a normal antibody such as rat, guinea pig, rabbit, mouse, goat, sheep, horse, cow, chicken or the like is used. Animals used for production are repeatedly immunized subcutaneously or intraperitoneally every 2-3 weeks. After immunization, blood is appropriately collected on a trial basis, and the titer (antibody titer) is sufficiently determined by an immunological method such as an enzyme immunoassay (hereinafter sometimes referred to as “ELISA”) or Western blotting. It is preferable to confirm that the temperature has risen. Blood is collected from animals in which a sufficient increase in titer has been confirmed, and serum is separated to obtain antiserum. In the case of chicken, a water-soluble fraction is collected from egg yolk collected from chicken eggs to prepare an egg yolk extract, which can be used in the same manner as antiserum.
[0017]
In the present invention, the obtained antiserum or the like can be used as it is without purification, but it is preferable to purify and use it by the following method. Examples of the purification method include a purification method using Protein A, a method by salting out using ammonium sulfate (for example, a method of Nisonoff et al. (Nisonoff, A. Methods in Medical Research, Eisen H. N. (ed). Year Book). Medical Publishers, Chicago, (1964) 10, 134-141)), a method of purifying an immunoglobulin fraction by ion exchange chromatography, or affinity column chromatography using a column on which a specific polypeptide is immobilized. And the like.
[0018]
When a monoclonal antibody is prepared, antibody-producing cells are collected from the spleen of an animal immunized in the same manner as described above, and fused with cultured cells such as myeloma cells derived from a syngeneic animal, etc., according to a conventional method to obtain a hybridoma. (Milstein et al., Nature, 256, 495 (1975)). After culturing, the antibody titer is appropriately confirmed by ELISA, Western blotting, or the like, and a hybridoma that produces a monoclonal antibody that recognizes the target epitope and has high antibody-producing ability may be selected. The desired monoclonal antibody can be obtained from the culture supernatant of the hybridoma thus selected. When a monoclonal antibody is used, two or more kinds of monoclonal antibodies having different epitopes may be used in combination so that PAI-1, urokinase, and a complex of PAI-1 can be respectively recognized.
[0019]
PAI-1 used for immunization is obtained, for example, from a culture supernatant of a human-derived PAI-1 producing cell line such as WI38 VA132RA strain (ATCC CCL75.1), HT1080 strain (ATCC CCL121), and CaSKi strain (ATCC CRL1550). be able to. When such a cell line is cultured in an appropriate medium such as a serum-free DMEM medium, PAI-1 is secreted into the culture solution. At that time, dexamethasone was added to the medium at 2 × 10 ^-6 If about M is added, PAI-1 is efficiently produced. If this is purified using any protein purification method, purified PAI-1 can be obtained. When a culture medium containing fetal calf serum (FCS) is used for culturing the cell line, FCS can be removed from the PAI-1 standard by affinity chromatography using an anti-FCS polyclonal antibody.
[0020]
PAI-1 can also be obtained by culturing Escherichia coli expressing PAI-1 produced by a gene recombination technique. The crude purification of PAI-1 from the culture supernatant was performed by affinity chromatography using Sepharose 4B (manufactured by Pharmacia) immobilized with anti-PAI-1 mouse monoclonal antibody in Examples described later, but instead of concanavalin, the monoclonal antibody was used. Crude purification can also be performed using A-fixed Sepharose. By further fractionating the obtained crude product by gel filtration chromatography, further purified PAI-1 is obtained. The relative amount of PAI-1 in each fraction can be confirmed by SDS-PAGE and Western blot.
[0021]
The purified PAI-1 thus obtained can be used not only as an immunogen, but also as a standard in various immunological techniques. For example, an antibody against PAI-1 obtained as described above can be evaluated by examining the reactivity with purified PAI-1 by a latex agglutination immunoassay, western blotting, or the like. For example, when examining by Western blotting, purified PAI-1 is subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), and the gel after electrophoresis is transferred to a nitrocellulose membrane or the like, to prepare the antibody or antibody. Purified PAI-1 is produced by sequentially incubating another animal's antibody against the immunoglobulin of the immunized animal used in step 2 with a secondary antibody labeled with alkaline phosphatase or the like, and a substrate dye which develops a color by an enzyme reaction. The reactivity with the antibody can be determined. An antibody that specifically binds to both the free form of PAI-1 and the complex of urokinase and PAI-1 is selected from the polyclonal antibodies thus evaluated, and used in the method of the present invention. Is preferred. That is, when evaluating the reactivity, various forms of PAI-1 including a complex with urokinase and other plasma proteins are also electrophoresed on the same gel, and the antibody is not affected by the activity or form of PAI-1. It is preferable to select after confirming that it does not bind to other plasma proteins.
[0022]
For example, as a free form of PAI-1, active PAI-1 obtained by activating purified PAI-1 or latent PAI-1 obtained by inactivating the same can be used. . In addition, a complex of urokinase and PAI-1 can be used as the complex of PAI-1. Specifically, for example, activated PAI-1 is obtained by reacting purified PAI-1 in 4 M guanidine hydrochloride (pH 7.2) at 37 ° C. for 2 hours, and adding a small amount of 0.1 M acetic acid to stop the reaction. Then, it can be obtained by dialysis with 20 mM Tris-hydrochloric acid (pH 7.6) /0.01% Tween 80 at 4 ° C. for 20 hours. Latent PAI-1 can be prepared by freeze-thawing active PAI-1 twice. The complex of urokinase and PAI-1 can be used by reacting the active form of PAI-1 with human heavy chain urokinase (manufactured by American diagnostica) at 37 ° C. for 30 minutes to form a complex. In the present invention, antibodies having the ability to bind to all of these forms of PAI-1 are particularly preferably used.
[0023]
In the present invention, the antibody includes not only a full-length antibody but also a fragment thereof. For example, the antibody may be IgG itself, but IgG may be converted to F (ab ') using a digestive enzyme such as pepsin or papain, or a reducing agent such as dithiothreitol or mercaptoethanol. ₂ , Fab, Fab ′ and the like can also be used. Other classes of antibodies, such as IgM, can be used with similar treatment.
[0024]
Further, when the antibody of the present invention is used in various immunological techniques described below, it may be appropriately supported on a solid phase or used after being labeled. All such antibodies are also within the scope of the present invention.
[0025]
<3> Detection of presence or amount of PAI-1 and / or complex of urokinase and PAI-1 by immunological technique
In the present invention, detection of the presence or amount of PAI-1 and / or the complex of urokinase and PAI-1 in human urine is performed by an immunological technique. The immunological technique may be arbitrarily selected from commonly used methods for immunologically detecting proteins known per se. Specifically, for example, enzyme immunoassay, latex agglutination immunoassay, chemiluminescence immunoassay, fluorescent antibody method, radioimmunoassay, immunoprecipitation, etc. Agglutination immunoassay is preferably used.
[0026]
When detection is performed by a method using a labeled secondary antibody such as an enzyme immunoassay, a chemiluminescence immunoassay, a fluorescent antibody method, or a radioimmunoassay, the detection can also be performed by a sandwich method or a competition method. In the case of the sandwich method, either the primary antibody or the labeled antibody to be immobilized may be an anti-PAI-1 antibody. For example, when detecting the presence or amount of a complex of urokinase and PAI-1, an anti-PAI-1 antibody and an anti-urokinase antibody can be used in combination. When detecting the presence or amount of both PAI-1 and the complex of urokinase and PAI-1, an anti-PAI-1 antibody is used for both the primary antibody and the labeled antibody. In the present invention, it is preferable to use an anti-PAI-1 antibody for both the primary antibody and the labeled antibody.
[0027]
The solid phase may be any insoluble carrier that can be used to carry the antibody, and may be a plate, test tube or tube made of a substance such as plastic or glass, beads, balls, a filter, a membrane, or the like. Further, magnetic particles and the like can be used. Specifically, for example, triiron tetroxide (Fe ₃ O ₄ ), Diiron trioxide (Fe ₂ O ₃ And magnetic particles such as fine particles made of various metals such as ferrite, iron, manganese, nickel, cobalt and chromium, and alloys such as cobalt, nickel and manganese. Furthermore, these magnetic particles may be prepared in a form contained in a polymer latex such as polystyrene, gelatin, liposome, or the like, or may be those immobilized on the surface.
[0028]
A general measuring method can be performed according to a method generally used, which is known per se.For example, a solid-phased antibody is reacted with a sample, and simultaneously, or after washing, is reacted with a labeled antibody. To form an immune complex. After washing away the unreacted labeled antibody, the amount of antigen present in the sample can be determined from the amount of bound labeled antibody.
When the above magnetic particles are used, for example, a magnetic field is applied by a permanent magnet, an electromagnet, or the like, and the unreacted antibody or the like can be washed (B / F separation) by utilizing the magnetic force. .
[0029]
In the case of the enzyme immunoassay, the amount of the labeled antibody may be determined by reacting the substrate with the labeled enzyme and measuring the amount of the reaction product by an optical method or the like. In the case of a chemiluminescence immunoassay, the amount of luminescence by a luminescence reaction system is measured. In the case of the fluorescent antibody method, the fluorescence intensity derived from the fluorescent substance may be measured, and in the case of the radioimmunoassay method, the radiation dose derived from the radioactive substance may be measured. Specific examples of the labeling substance include enzymes such as peroxidase, alkaline phosphatase, β-D-galactosidase, and glucose oxidase, fluorescein isothiocyanate, and fluorescent substances such as rare earth metal chelates; ³ H, ¹⁴ C, ¹²⁵ Radioisotopes such as I, biotin, avidin, chemiluminescent substances and the like. In the case of an enzyme, a chemiluminescent substance, or the like, since a measurable signal cannot be provided by itself, an appropriate corresponding substrate or the like may be selected and used.
[0030]
When using the latex agglutination immunoassay, for example, particles such as latex, gelatin, liposomes, erythrocytes, silica, styrene-butadiene copolymer, alumina, or ceramics are used as the solid support for carrying the antibody. Can be. Among them, latex particles are preferably used, and polystyrene latex, a copolymer of styrene and divinylbenzene, a copolymer of acrylic acid and styrene, a copolymer of styrene and maleic acid, a copolymer of styrene and methacrylic acid, and a copolymer of styrene and acryl Copolymers of acid and alkyl acrylate, and copolymers of vinyl acetate and acrylic acid, and the like are included. The particle size of the latex particles is preferably about 0.1 to 1.0 μm. An anti-PAI-1 antibody is carried on these carrier particles using a physical adsorption method, a chemical bonding method, or the like. The antibody supported on the solid phase carrier is reacted with the sample to form an immune complex to form an aggregate, which is measured by an optical method using transmitted light or scattered light, or visually determined. do it.
[0031]
The human urine used as a sample in the present invention includes anytime urine, urine collection, and the like. From the viewpoint of clinical medicine, anytime urine is preferably used. The collected urine is preferably immediately subjected to analysis, but may be stored under low-temperature conditions such as 4 to -80 ° C, preferably 4 to -20 ° C. During storage, a preservative for suppressing protein denaturation or the like, a preservative for preventing spoilage, and the like may be added as necessary. In addition, these samples may be subjected to analysis after performing pretreatments such as concentration and purification, if necessary, but are preferably subjected to analysis as unconcentrated urine without adding a concentration operation. .
[0032]
The amount of human urine to be analyzed as a sample may be appropriately adjusted depending on the immunological technique used, the sensitivity of the antibody, and the like. Specifically, for example, when the measurement is performed using the enzyme immunoassay, the amount of the sample may be determined according to the inner volume of the well of the ELISA plate to be used. For example, when the latex agglutination immunoassay is used, the ratio of the amount of the sample to the amount of the latex reagent may be variously changed to confirm the degree of agglutination, and set to the ratio that produces the best aggregation.
[0033]
<4> Method for determining progress of diabetic nephropathy of the present invention
Using the antibodies and immunological techniques described in detail in <2> and <3> above, the presence or amount of PAI-1 and / or a complex of urokinase and PAI-1 in human urine was detected, and diabetes was detected. The extent of progression of genital nephropathy is determined.
[0034]
Specifically, for example, urine collected as a specimen from a patient suspected of having diabetic nephropathy is analyzed by an immunological technique using the antibody, and PAI-1 and / or urokinase in the urine are analyzed. The presence or amount of the complex of PAI-1 is detected. On the other hand, urine collected as a sample from a healthy person is similarly analyzed, and the presence or amount of PAI-1 and / or a complex of urokinase and PAI-1 in the urine is detected, and these results are compared and analyzed. do it.
[0035]
Here, PAI-1 and / or a complex of urokinase and PAI-1 was not substantially detected in a sample of a healthy subject, and PAI-1 and / or a complex of a sample collected from a patient suspected of having diabetic nephropathy were not detected. Alternatively, when the presence of a complex of urokinase and PAI-1 is detected, the patient can be determined to have diabetic nephropathy. Alternatively, compared to the amount of PAI-1 and / or the complex of urokinase and PAI-1 detected in a sample of a healthy subject, PAI-1 and / or // detected in a sample of a patient suspected of having diabetic nephropathy are compared. Alternatively, when the amount of the complex of urokinase and PAI-1 is significantly large, the patient can be determined to have diabetic nephropathy. Further, depending on the amount of PAI-1 and / or the complex of urokinase and PAI-1 detected in a sample of a patient suspected of having diabetic nephropathy, the larger the amount, the more diabetic nephropathy develops. Can be determined.
[0036]
On the other hand, when PAI-1 and / or a complex of urokinase and PAI-1 are not detected in a sample of a patient suspected of having diabetic nephropathy or in a sample of a healthy subject, Of the complex of PAI-1 and / or urokinase and PAI-1 detected in a sample of a patient suspected of having a phenotype and the complex of PAI-1 and / or urokinase and PAI-1 detected in a healthy subject If there is no significant difference in the amount, the patient is determined not to have diabetic nephropathy.
[0037]
Here, the amount of the complex of PAI-1 and / or urokinase and PAI-1 detected in a healthy person was determined by calculating the average value or the average concentration range from the results of analysis using a large number of samples in advance. These may be used for comparison and analysis. Also, for example, the amount of PAI-1 and / or urokinase / PAI-1 complex detected in a sample of a patient suspected of having diabetic nephropathy and the amount of PAI-1 and / or urokinase detected in a healthy subject When the average value or the average concentration range of the amount of the complex of PAI-1 and PAI-1 is obtained, a threshold for determination is set, and PAI-1 and / or PAI-1 present in the measured sample are set. Alternatively, if the amount of the complex of urokinase and PAI-1 is larger than the threshold, the patient can be determined to have diabetic nephropathy.
[0038]
Further, depending on the stage classification of diabetic nephropathy, PAI-1 and / or PAI at each stage can be determined using a plurality of samples obtained from patients in each of the stages I to V. The average value or average concentration range of the amount of the complex of urokinase and PAI-1 is determined, and the concentration range for determination is set for each period, so that patients suspected of having diabetic nephropathy can be obtained. The degree of progression of diabetic nephropathy of the patient can be determined by analyzing the sample obtained from the above and using the obtained measurement value in which concentration range the index is in as an index.
[0039]
Here, “significantly” in the analysis means that there is a significant difference as a result of the statistical analysis. Further, it is preferable that human urine used as a sample is compared and analyzed using a collection method, a collection time zone, a storage method, and the like which are prepared.
[0040]
The value indicating the amount of PAI-1 and / or the complex of urokinase and PAI-1 in urine, which is detected by using an immunological technique, is subjected to a correction process or the like for correcting a difference in renal function between patients. Then, statistical processing may be performed. By such a correction, differences caused by individual differences between patients, the time at which urine is collected, and the like can be corrected and compared and analyzed. However, since the index for correcting the difference in renal function is meaningless in urine of a patient who has lost renal function such as a patient with renal failure, the index is performed in urine collected from a patient having renal function retained. Is preferred.
[0041]
Indicators of renal function used for such correction include creatinine (Cr), creatinine clearance (CCr), urea nitrogen (BUN), urinary β-DN acetylglucosaminidase and the like. Among them, CCr or Cr is generally preferably used in the field of medicine and clinical examination.
[0042]
Specifically, for example, as a method of correcting raw data of PAI-1 value using creatinine as an index, a urinary PAI-1 value of a sample lower than a certain value, for example, less than 0.03 ng / mL, As the specimen, only a sample in which the urine Cr value is equal to or more than the median value is employed. The value obtained by dividing the urine PAI-1 value by the urine Cr value may be used as the urine corrected PAI-1 value.
[0043]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
[0044]
Example 1 Preparation of purified PAI-1, anti-PAI-1 polyclonal antibody, latex reagent, and complex of urokinase and PAI-1
According to the method described in JP-A-9-33524, an anti-PAI-1 antibody, a latex reagent carrying the antibody, and purified PAI-1 (PAI-1 standard) were prepared.
[0045]
(1) Purified PAI-1 was specifically prepared as follows. The human-derived PAI-1-producing cell line WI38 VA132RA (ATCC CCL75.1) was grown in a roller bottle in a DMEM medium (Nissui) supplemented with 10% fetal calf serum (FCS), and PBS (phosphate buffered physiology). Saline) and then dexamethasone 2 × 10 ^-6 The cells were cultured in a serum-free DMEM medium containing M for 10 days. Thereafter, the culture supernatant was collected and passed through an anti-PAI-1 mouse monoclonal antibody-fixed Sepharose 4B affinity column to adsorb PAI-1, followed by 3M MgCl 2 ₂ And crude purified PAI-1 was obtained. Anti-PAI-1 mouse monoclonal antibody-immobilized Sepharose 4B is a hybridoma producing mouse monoclonal antibody (DJ Rostokh of Scripps Clinic and Research Foundation of La Jolla, California, USA). Lokoffoff) J. Clin. Invest., 83, 1747-1752 (1989), prepared an anti-PAI-1 monoclonal antibody, and conjugated it to CNBr-Sepharose 4B (Pharmacia). It produced by doing.
[0046]
The eluate obtained above was passed through an anti-FCS polyclonal antibody-immobilized Sepharose 4B affinity column to remove adsorbed FCS remaining in the culture solution to obtain purified PAI-1.
[0047]
(2) The anti-PAI-1 polyclonal antibody and latex reagent were prepared as follows. The PAI-1 obtained above was concentrated to 400 μg / ml using an ultrafiltration membrane (Amicon, YM-10). New Zealand white rabbits were immunized with a mixture of this and complete Freund's adjuvant, and boosted 8 to 10 weeks later. Blood was collected 10 to 14 weeks after the initial immunization to obtain an anti-PAI-1 antiserum. This anti-PAI-1 serum was purified by the method of Nisonoff et al. (Nisonoff, A. Methods in Medical Research, Eisen HN (ed). Year Book Medical Publishers, Chicago, (11344-1)). Then, an anti-PAI-1 polyclonal antibody was obtained. That is, a crude γ-globulin fraction was obtained from the antiserum by ammonium sulfate salting out, and F (ab ′) was digested with pepsin. ₂ (Hereinafter referred to as “anti-PAI-1 antibody”). This PAI-1 F (ab ') ₂ Was fixed on a polystyrene latex (manufactured by Alexon Trend) having an average particle size of 0.53 μm by a conventional method to obtain a latex reagent. The latex concentration in the reagent is 0.1-0.5%, and PAI-1 F (ab ') ₂ Was between 0.025 and 0.25 μg / μl.
[0048]
The anti-PAI-1 antibody was previously confirmed to have reactivity with active PAI-1, latent PAI-1, and a complex of urokinase and PAI-1 by the LPIA method (latex agglutination immunoassay).
The activated PAI-1 was prepared by reacting purified PAI-1 in 4 M guanidine hydrochloride (pH 7.2) at 37 ° C. for 2 hours, adding a small amount of 0.1 M acetic acid to stop the reaction, and adding 20 mM Tris-hydrochloride ( (pH 7.6) /0.01% Tween 80 at 4 ° C. for 20 hours. Latent PAI-1 was prepared by freeze-thawing active PAI-1 twice. Further, a complex was formed by reacting activated PAI-1 with human heavy chain urokinase (American diagnostics) for 30 minutes at 37 ° C., and this was used as a complex of urokinase and PAI-1.
[0049]
[Example 2] Construction of an assay system using latex agglutination immunoassay
First, a calibration curve for PAI-1 measurement was prepared using purified PAI-1. The protein amount of the purified PAI-1 was quantified by the method of Bradford (Anal. Biochem., 72, 248-254 (1976)), and 0.094, 1.88 with Tris buffer containing BSA (bovine serum albumin). , 3.75, 7.5, and 15 ng / ml, and used as a standard for PAI-1 measurement.
[0050]
This PAI-1 standard solution (40 μl), BSA-containing Tris-HCl buffer (35 μl), and the latex reagent (40 μl) are mixed, and the mixture is automatically dispensed into a reaction cuvette, and the increase in near-infrared (950 nm) absorption is measured for 10 minutes. Thereby, an immune reaction was observed. The measurement was performed using a latex agglutination fully automatic measuring device (LPIA-200 system manufactured by Mitsubishi Chemical Corporation), and was completed within 20 minutes. As a result, the PAI-1 amount and the latex agglutination ratio showed linearity, and a calibration curve was obtained.
[0051]
[Example 3] Analysis of random urine of patients with various kidney diseases by latex agglutination immunoassay
Using the latex agglutination immunoassay and the calibration curve constructed in Example 2 above, the urine of 11 patients with chronic nephritis, 25 patients with diabetic nephropathy, 6 patients with nephrotic syndrome, and 12 healthy persons was analyzed as samples. Was done.
[0052]
40 μl of each sample, 35 μl of BSA-containing Tris-HCl buffer, and 40 μl of the latex reagent were mixed, and the mixture was automatically dispensed into a reaction cuvette. Then, the increase in near-infrared (950 nm) absorption was measured for 10 minutes, thereby measuring the immune reaction. Observed. The measurement was performed using a latex agglutination fully automatic measuring device (LPIA-200 system manufactured by Mitsubishi Chemical Corporation), and was completed within 20 minutes.
[0053]
Among the obtained measured values, for a specimen having a urinary PAI-1 value of less than 0.03 ng / mL, only a sample having a urinary Cr value of 56 mg / ml or more of the median value was employed and the urinary PAI-1 was measured. Assuming that the value was 0.02 ng / ml, the value obtained by dividing the urinary PAI-1 value by the urine Cr value was defined as the urinary corrected PAI-1 value.
[0054]
As a result, in the diabetic nephropathy group, the urinary corrected PAI-1 value was 0.20 (urinary PAI-1 = 0.00-8.50), whereas in the chronic nephritis group, it was 0.03. (Urine PAI-1 = 0.00-0.28), 0.05 (Urine PAI-1 = 0.01-0.44) in the group with nephrotic syndrome, and 0.02 (Urine PAI) in the healthy group. -1 = 0.00-0.05). From these values, the urinary corrected PAI-1 value was significantly higher only in diabetic nephropathy, indicating that the urinary PAI-1 value was a very useful index for detecting diabetic nephropathy ( (Fig. 1).
[0055]
Example 4 Construction of Measurement System Using Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)
The anti-PAI-1 polyclonal antibody obtained in Example 1 was purified, diluted to 0.3 mg / mL with PBS (Phosphate buffered saline), and added to a 96-well EIA plate (manufactured by Nunc) at 100 μL / well. Coated overnight at 4 ° C. Next, after removing excess antibody by washing with PBS + 0.1% Tween 20, 200 μL of PBS containing 6% BSA was added to each well, and blocking was performed at 4 ° C. overnight.
[0056]
After the blocking solution was removed by washing with PBS + 0.1% Tween 20, 100 μL of a urine sample or the standard for measuring PAI-1 obtained in Example 2 was added, and reacted at room temperature for 1 hour. After washing and removing the reaction solution with PBS + 0.1% Tween 20, 100 μL of a 0.05 mg / mL biotin-labeled anti-PAI-1 polyclonal antibody labeled with a biotin-labeling reagent manufactured by Pierce was added, and the mixture was added at room temperature. The reaction was performed for a time. After the reaction, washing was carried out in the same manner as above, then 100 μL of 0.1 μg / mL avidin-bound alkaline phosphatase solution (manufactured by Pierce) was added, and the reaction was carried out at room temperature for 1 hour. After washing, alkaline phosphatase / phosphate was added. 100 μL of a substrate solution (manufactured by Pierce) was added to each well, and reacted at 37 ° C. for 30 minutes.
[0057]
The absorbance at 450 nm was measured with a colorimeter for microplate, and the absorbance at 695 nm was subtracted as the background, and analyzed.
[0058]
[Example 5] Analysis of occasional urine of healthy subjects and diabetic patients by ELISA method Three healthy subjects, five diabetic patients hospitalized due to multiple organ failure from DIC, and six outpatients diagnosed with diabetes Was measured using the urine as a sample according to the method described in Example 4 above by ELISA. In the measurement, the collected urine was used without concentration. Here, the diabetic patients who are hospitalized due to multiple organ failure from DIC are patients in whom diabetic nephropathy is progressing, and a group in which the determination result is considered to be positive by the method of the present invention. . Outpatients diagnosed with diabetes are those groups for which it is unknown whether they have developed diabetic nephropathy.
[0059]
As a result of the analysis, urinary PAI-1 levels were significantly higher in all patients in the severely ill patient group who were hospitalized due to multiple organ failure from DIC. On the other hand, the outpatient group diagnosed with diabetes showed a significantly higher value than the healthy person, but the measured values for each sample varied, indicating that the significantly higher value was significantly higher than that of the healthy person. In some cases, no difference was observed (FIG. 2). These results indicate that the degree of progression of diabetic nephropathy can be determined by using the method of the present invention.
[0060]
【The invention's effect】
The method of the present invention provides a method for judging the degree of progression of diabetic nephropathy, which is simple, rapid, and specific. According to the method of the present invention, diabetic nephropathy is detected and diagnosed at an early stage by using a urine specimen with low invasiveness to a patient before judgment by a normal urine test strip method or clinical symptoms is performed. Can be determined. By detecting diabetic nephropathy at an early stage and judging the degree of progress, appropriate treatment can be performed at an early stage, and the incidence rate and progression to renal failure can be greatly suppressed.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a graph showing a comparison of corrected values of urinary corrected PAI-1 values in various renal diseases. The vertical axis shows the amount of PAI-1 (total PAI-1 amount (μg) relative to creatinine (g)), and the horizontal axis shows the name of each specimen.
FIG. 2 is a diagram showing urinary PAI-1 concentrations in healthy persons and patients. The vertical axis shows the PAI-1 concentration, and the horizontal axis shows each specimen name.

Claims

Diabetic characterized by detecting the presence or amount of plasminogen activator inhibitor-1 and / or a complex of urokinase and plasminogen activator inhibitor-1 in human urine by an immunological technique A method for determining the degree of progression of nephropathy.

The method according to claim 1, wherein the presence or amount of plasminogen-activator-inhibitor-1 and a complex of urokinase and plasminogen-activator-inhibitor-1 are detected by an immunological technique.

The method according to claim 1 or 2, wherein the human urine is unconcentrated urine.

The detection by an immunological technique is performed using plasminogen activator inhibitor-1 and a polyclonal antibody that specifically binds to a complex of urokinase and plasminogen activator inhibitor-1. The method according to claim 2.

The method according to any one of claims 1 to 4, wherein the immunological technique is an enzyme immunoassay or a latex agglutination immunoassay.

Plasminogen activator inhibitor-1, and at least an antibody that specifically binds to a complex of urokinase and plasminogen activator inhibitor-1;
By detecting the presence or amount of plasminogen activator inhibitor-1 and / or a complex of urokinase and plasminogen activator inhibitor-1 in human urine by an immunological technique, diabetic nephropathy can be obtained. Kit for determining the degree of progress.

The kit according to claim 6, wherein the antibody is a polyclonal antibody.