JP2004033136A - Carrier for culturing cell - Google Patents
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Abstract
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、細胞培養技術や細胞シート工学に利用可能な細胞培養担体に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、各種幹細胞ならびに体細胞への分化誘導法の発見も多数有り臓器移植に変わる新たな医療としてＴｉｓｓｕｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇが大きく注目されている。この技術はヒトの治療に直接使用する臓器を体内外で構築することを目的としているが、ｉｎｖｉｔｒｏで臓器様の機能を発現させる手法を数多く実現している。このことから直接臓器を作らず薬理試験用ができ、かつ創薬研究・診断といった膨大な試験数にも対応できるハイスループット（ＨＴＳ）な細胞評価系として期待されている。また、哺乳類の細胞特有の物質生産が可能な新たな技術としても期待されている。
【０００３】
一方、ヒトゲノム計画によるヒトＤＮＡ塩基配列の解析がほぼ終了し、世の中の研究はこの情報を利用したポストゲノムへと移りつつある。近年新聞を賑わしているテーラーメード医薬もその一つであり、医薬品のみならず創薬、投薬の支援ツールも莫大な市場を生むことが期待されている。現在、このようなツールとしてＤＮＡチップやプロテインチップが注目されており米国ベンチャーをはじめ各社が鎬を削っている。
【０００４】
しかしながら、ヒトゲノムプロジェクトの報告したヒト遺伝子の数は３〜４万程度であり、ハエの１．３万と大差が無いうえに種を超えて同一である相同遺伝子が多数ある。このことから、種内の個性をＤＮＡのみで判断することはできないこともわかってきた。ヒト遺伝情報はセントラルドグマに従いＤＮＡ、ＲＮＡ、蛋白と経て細胞が構築されるが、情報伝達は一方通行でなく多くの相互作用やフィードック系を引き連れた非線形な系いわゆる複雑系となっている。生命体にはスタビリティーとロバストネスを持たせる機構が存在する。例えば、肝臓は空腹時、満腹時、飲酒時で同じ遺伝子、細胞、組織でも違う発現系が働く。このため、生命現象を解明するには分子反応のみに注目するのではなく、生命体をシステムとして捕らえたうえでｉｎ ｖｉｖｏで細胞や臓器を解析することで得られる境界条件元にシミュレーションで考える試みがされている。この新しい分野はバイオシステム工学と呼ばれにわかに注目されている。
【０００５】
生命現象を的確に捉えるには最低限細胞以上のシステムを取り扱う必要があるが、細胞や組織の本来の機能を維持しつつこれらをアレイとして並べたものが要望されており、細胞アレイ構築法の研究が盛となっている。具体的には、リソグラフィーを用いてガラスなどの固体基板表面の親疎水性を制御する方法（Ｓ． Ｎ． Ｂｈａｔｉａ ｅｔ ａｌ， Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌ． Ｐｒｏｇ．， １４， ３７８ （１９９８）、赤池敏宏ら， 特開平５−１７６７５３号公報、大塚ら， 第３０回医用高分子シンポジウム講演要旨集９頁（２００１）、菊地ら，第３０回医用高分子シンポジウム講演要旨集３５頁（２００１）など）が知られている。もっとも、こうした方法はリソグラフィー用の高価な装置が必要であり、簡便に細胞培養担体を調製することができない問題がある。
【０００６】
一方、細胞は生体内で組織を形成する際に極性を持って配列することが知られている。例えば、肝細胞は血管内皮細胞側から血液成分を吸収し、逆側から胆汁酸などの代謝物を排泄する。この胆汁酸は細胞毒性が強いため、ガラスなどの不透過性支持体上に細胞を付着させて培養したのでは、長期間の安定な培養が難しいという問題がある。細胞に対して一方向から刺激を与えることで細胞の極性が発現することも知られているが、不透過性支持体上に細胞を付着させて培養したのでは刺激を接着側から与えられない問題がある。また、リソグラフィーを行なうためには光感受性液を予め塗布する必要があるが、物質透過性支持体ではこの光感受性液のほか、反応生成物および現像／定着液が支持体内に浸透してしまい、支持体の変性や支持体中への化合物の残留などにより培養細胞への毒性や刺激が発生するという問題がある。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題及び課題を解決するための手段】
本発明の課題は、細胞アレイを簡便に調製するための手段としての細胞培養担体を提供することにある。また、本発明の別の課題は、細胞の両面を異なる培地として培養でき、かつ細胞の生育状況を光学顕微鏡で簡便に行なえる細胞培養担体を提供することを目的とする。本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、下記の構成を採用した細胞培養担体を提供することにより上記の課題を解決できることを見出した。
【０００８】
すなわち、本発明は、カチオン性基を有する担体を含み、該担体の表面に形成された海島状のポリペプチド修飾部位を含む細胞培養担体を提供するものである。この発明の好ましい態様によれば、カチオン性基を有する担体が高分子化合物、無機化合物、又は有機化合物である上記の細胞培養担体；カチオン性基を有する担体がカチオン性基を有する高分子化合物、又は表面修飾によりカチオン性基が導入された無機化合物若しくは有機化合物である上記の細胞培養担体が提供される。また、この発明の好ましい態様によれば、該ポリペプチド修飾部位以外の該担体表面がアニオン性多糖類で被覆された上記の細胞培養担体が提供される。
【０００９】
また、上記の発明の別の好ましい態様として、担体が含水ゲルである上記の細胞培養担体が提供され、さらに好ましい態様として含水ゲルが高分子含水ゲルである上記の細胞培養担体、及び含水ゲルがアニオン性高分子含水ゲルである上記の細胞培養担体が提供される。この態様では、カチオン性基を有する担体として、高分子含水ゲルにキトサンを配合した含水ゲル又はアニオン性高分子含水ゲルにキトサンを吸着させた含水ゲルを用いることが好ましい。特に好ましい態様として、担体がアルギン酸を含む含水ゲルであり、カチオン性基を有する担体が該含水ゲルの表面に水溶性カチオン性高分子の水溶液を塗布することにより形成された細胞培養担体、及び担体がアルギン酸を含む含水ゲルであり、カチオン性基を有する担体が該含水ゲルを水溶性カチオン性高分子の水溶液へ浸漬することにより形成された細胞培養担体が提供される。この好ましい態様において、水溶性カチオン性高分子としてキトサンを特に好ましく用いることができる。
【００１０】
さらに好ましい態様では、カチオン性基を有する担体の表面を修飾するポリペプチドが細胞接着性ポリペプチドである上記の細胞培養担体；カチオン性基を有する担体の表面を修飾するポリペプチドが細胞外マトリックス成分である上記の細胞培養担体；カチオン性基を有する担体の表面を修飾するポリペプチドがゲル状の細胞外マトリックス成分である上記の細胞培養担体が提供される。また、１つの独立したポリペプチド修飾部位の面積が５０μｍ２〜２ｍｍ２である上記の細胞培養担体；１つの独立したポリペプチド修飾部位の面積が１００μｍ２〜１ｍｍ２である上記の細胞培養担体が提供される。好ましくは、ポリペプチドの修飾部位は印刷法、スポッティング法、及び／又はインクジェット法により担体表面に形成される。
【００１１】
さらに別の観点からは、上記の細胞培養担体の表面に細胞を播種する工程を含む細胞培養方法；上記の細胞培養担体の表面に細胞層を形成させる工程を含む細胞培養方法；及び、上記の細胞培養方法により得られた細胞培養物が提供される。上記の細胞培養物は、担体表面に海島状に配置されたポリペプチドの表面に形成された細胞層を含んでいる。上記の細胞培養担体の担体がアルギン酸を含む含水ゲルである場合、この細胞培養物からアルギン酸を含む含水ゲルを可溶化することにより実質的に含水ゲルを含まない細胞培養物を得ることができる。すなわち、本発明により、上記の細胞培養担体の表面に細胞層を形成させる工程；及びアルギン酸を含む含水ゲルを可溶化する工程を含む細胞培養物の製造方法が提供される。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本明細書において「細胞培養担体」とは、細胞を培養する際に培養液中で細胞を保持することができる構造体を意味しているが、この用語はいかなる意味においても限定的に解釈してはならず、最も広義に解釈する必要がある。
【００１３】
本発明の細胞培養担体は、カチオン性基を有する担体を含み、該担体の表面がポリペプチドで海島状に修飾されていることを特徴としている。本発明の細胞培養担体に含まれる担体としては、高分子化合物、無機化合物、又は有機化合物などを含む単体を挙げることができるが、これらに限定されることはない。例えば金属板やガラスなどを担体として用いることもできる。より具体的には、カチオン性基を有する担体の例としては、例えば、カチオン性基を有する高分子化合物のほか、表面修飾によりカチオン性基が導入された無機化合物若しくは有機化合物などを挙げることができる。カチオン性基としてはｐＨ８以下で正荷電を有する基であればその種類は特に限定されないが、例えば、アミノ基；メチルアミノ基、エチルアミノ基等のモノアルキルアミノ基；ジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基等のジアルキルアミノ基；イミノ基；グアジニノ基などが挙げられる。
【００１４】
担体として利用可能なカチオン性基を有する高分子化合物としては、例えば、キトサン、部分脱アセチルキチン、アミノ化セルロース、ポリリジン、ポリアルギニン、リジンとアルギニンの共重合体、ポリビニルアミン、ポリアニリンやこれらの化合物のアニオンポリマーとのポリイオン錯合体などが挙げられる。無機化合物からなる担体の例としては、ガラスを挙げることができる。
【００１５】
表面修飾によりカチオン性基が導入された無機化合物や有機化合物を担体として用いる場合、表面修飾の方法は特に限定されないが、例えば、共有結合を形成する化学反応を用いる方法、イオンの静電相互作用により吸着させる方法、疎水相互作用によりアミノ基を有する化合物を付着させる方法、水不溶性アミノ基含有化合物を塗布する方法などが挙げられる。
【００１６】
より具体的には、共有結合を形成する化学反応を用いる方法としてはカップリング剤（シラン、チタンなど）を用いる方法、メルカプト化合物を用いた自己組織化膜、反応活性基（グアニジル、アルデヒドなど）を有するカチオン性化合物を用いた反応などが挙げられる。イオンの静電相互作用により吸着させる方法としてはアニオン性表面に多価カチオン性化合物やカチオン性高分子化合物を吸着させる方法が挙げられる。疎水相互作用によりアミノ基を有する化合物を付着させる方法としてはＬＢ膜などが挙げられる。水不溶性アミノ基含有化合物を塗布する方法としては油溶性化合物（アルキルアミン、ポリアニリンなど）を有機溶剤に溶解し塗布する方法や酸可溶性化合物（キトサンなど）を酸性溶液で塗布したのちｐＨを上昇させ析出させる方法などが挙げられる。もっとも、表面修飾の方法はこれらの具体例に限定されることはなく、当業者が担体の種類や修飾の目的などに応じて適宜選択可能である。
【００１７】
本発明の細胞培養担体の好ましい態様として、担体が含水ゲルである場合を挙げることができ、含水ゲルの好ましい例として、高分子含水ゲルを挙げることができる。本明細書において、高分子含水ゲルとは化学結合によって網目状構造をとり、網目に多量の水を保有したゲル状の物質を意味しているが、この用語はいかなる意味においても限定的に解釈してはならず、最も広義に解釈しなければならない。担体を形成する含水ゲルとして無機物質（シリカゲルなど）の含水ゲルを用いてもよい。
【００１８】
高分子含水ゲルを形成する高分子化合物としては、例えば、アニオン性多糖類（アルギン酸、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デキストラン硫酸、アガロペクチン、カラギーナン、カルボキシメチルセルロースなど）やその塩、カチオン性多糖類（キトサン、部分脱アセチルキチン、アミノ化セルロースなど）やその塩、ノニオン性多糖類（デキストラン、セルロース、酢酸セルロース、ヒドロキシエチルセルロース、メチルセルロース、アガロース、アミロース、グリコマンナンなど）、ポリペプチド（コラーゲン、ゼラチン、絹フィブロインなど）、合成高分子（ポリアクリル酸、ポリアクリルアミド、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、ポリエチレンイミン、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコールなど）、及びこれらの混合物や複合体などを挙げることができる。
【００１９】
カチオン性基を有する含水ゲルとしては、例えば、キトサンの含水ゲルのほか、高分子含水ゲルにキトサンを配合した含水ゲルや、アニオン性高分子含水ゲルにキトサンを吸着させた含水ゲルを好ましく用いることができる。例えば、キトサンを酸で溶解し、ｐＨを上昇させ水不溶化することにより調製された水性ゲル、あるいはキトサンと水溶性アニオン性高分子（アルギン酸、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デキストラン硫酸、アガロペクチン、カラギーナン、カルボキシメチルセルロース、ポリアクリル酸やその共重合体、ポリメタクリル酸やその共重合体、ポリスチレンスルホン酸やその共重合体など）又は両性高分子（ゼラチン、コラーゲンなど）とのポリイオンコンプレックスによる水性ゲルが挙げられる。ポリイオンコンプレックスによる水性ゲルの製造方法としては、例えば、キトサン水溶液とアニオン性又は両性高分子水溶液とを混合する方法、あるいはキトサン水溶液とアニオン性又は両高分子水溶液に水性ゲルを交互に浸漬するいわゆる交互積層（ｌａｙｅｒ−ｂｙ−ｌａｙｅｒ）法などが挙げられる。ここで交互積層法を用いる場合は最上層（最終浸漬液）をキトサンとすることが好ましい。キトサンを含む上記の含水ゲルにはゲル化に直接寄与しない化合物を添加してもよい。
【００２０】
担体を構成する含水ゲルとして、アニオン性高分子含水ゲルを用いることができる。アニオン性高分子ゲルとは、アニオン性高分子の分子中の酸基と多価金属イオンとがキレート構造を形成してゲル化したものを意味しているが、この用語はいかなる意味においても限定的に解釈してはならない。アニオン性高分子のゲル化を引き起こし得る多価金属カチオンの具体例としては、例えば、バリウム（Ｂａ）、鉛（Ｐｂ）、銅（Ｃｕ）、ストロンチウム（Ｓｒ）、カドミウム（Ｃｄ）、カルシウム（Ｃａ）、亜鉛（Ｚｎ）、ニッケル（Ｎｉ）、コバルト（Ｃｏ）、マンガン（Ｍｎ）、鉄（Ｆｅ）、マグネシウム（Ｍｇ）等の金属イオンを例示でき、これらのうち特に好ましいものとして、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、バリウムイオン、ストロンチウムイオンを例示できる。また、アニオン性高分子含水ゲルは酸基とカチオン残基を有する有機高分子化合物のポリイオンコンプレックスによる含水ゲルでもよい。カチオン残基を有する有機高分子化合物の例としては、ポリリジン、キトサン、ゼラチン、コラーゲンなどの複数のアミノ基を有する化合物が挙げられる。
【００２１】
本発明の細胞培養担体を構成する担体として、アニオン性高分子含水ゲルを好ましく用いることができ、アルギン酸を含む含水ゲルが特に好ましく用いられる。アルギン酸を含む含水ゲルとは、アルギン酸の分子中のカルボン酸基と多価金属イオンとがキレート構造を形成してゲル化したものを意味する。アルギン酸は、グルクロン酸（Ｇ）とマンヌロン酸（Ｍ）よりなるブロック共重合体であり、Ｍブロックが有するポケット構造に多価金属カチオンが侵入してエッグボックスを形成してゲル化すると考えられている。
【００２２】
アルギン酸は、褐藻類の細胞壁構成多糖又は細胞間充填物質として天然に存在しており、これらを原料として採取可能である。原料褐藻類の具体例としては、ヒバマタ目ダービリア科ダービリア属（例えばＤ．ｐｏｔａｔｏｒｕｍ）、ヒバマタ目ヒバマタ科アスコフィラム属（例えばＡ．ｎｏｄｏｓｕｍ）、コンブ目コンブ科コンブ属（例えばマコンブ、ナガコンブ）、コンブ目コンブ科アラメ属（例えばアラメ）、コンブ目コンブ科カジメ属（例えばカジメ、ウロメ）、コンブ目レッソニア科レッソニア属（例えばＬ．ｆｌａｖｉｋａｎｓ）の褐藻類を例示できる。また、市販のアルギン酸を使用することもできる。アルギン酸のＧ／Ｍの比は特に限定されないが、Ｇ／Ｍの比が大きいほどゲル形成能が大きいので、Ｇ／Ｍの比は大きい方が好ましく、具体的には０．１〜１であるのが好ましく、０．２〜０．５であるのがさらに好ましい（本明細書において「〜」で示される数値範囲は上限及び下限の数値を含む）。
【００２３】
アルギン酸のゲル化は、常法に従って行なうことができる。アルギン酸のゲル化は、例えばイオン交換を利用して行なうことができる。例えば、アルギン酸ナトリウム水溶液にカルシウムイオンを添加すると速やかにイオン交換が生じ、アルギン酸カルシウムゲルが得られる。より具体的には、アルギン酸ナトリウム水溶液を所望の厚さで塗布用基板上に塗布し、次いで多価金属カチオンもしくはカチオン残基を有する有機高分子化合物の溶液に浸漬することでアルギン酸カルシウムゲル層が得られる。
【００２４】
上記の方法を行うにあたり、アルギン酸ナトリウムの濃度は特に限定されないが、例えば０．０５質量％〜２０質量％が好ましく、０．５質量％〜１０質量％以下が特に好ましい（本明細書において「〜」で示される数値範囲は上限及び下限の数値を含む）。また、アルギン酸ナトリウムを塗布する厚さとしては、例えば１μｍ〜１００ｍｍが好ましく、１０μｍ〜１０ｍｍが特に好ましい。多価金属カチオン溶液の濃度としては０．０５ｍｏｌ／Ｌ〜１０ｍｏｌ／Ｌが好ましく、０．１ｍｏｌ／Ｌ〜５ｍｏｌ／Ｌが特に好ましい。多価金属カチオン溶液の溶媒としては、例えば、水、水溶性有機溶剤、又は水と水溶性有機溶剤との混合物を例示することができ、より具体的には、水、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、又はこれらの混合物が好ましく用いられ、水及びメタノールの混合物が特に好ましく用いられる。
【００２５】
上記の方法を行うにあたり、カチオン残基を有する有機高分子化合物としてポリリジンを用いる場合には、アルギン酸溶液内においてＮ−ヒドロキシコハクイミドと１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩でリジンを重合しポリリジンを形成させる方法が好ましく用いられる。もっとも、アルギン酸ゲルを形成する方法は上記の特定の方法に限定されるわけではない。当業者は上記の方法を適宜改変ないし修飾し、あるいは他の手段を適宜選択することにより、アルギン酸ゲルを容易に製造することが可能である。
【００２６】
細胞培養担体における担体としてアニオン性高分子含水ゲルを用いる場合、該含水ゲル表面にカチオン性基を導入する方法は特に限定されないが、例えば、アニオン性高分子含水ゲルを水溶性カチオン性高分子の水溶液と接触させる方法が好ましく用いられる。該水溶液への接触方法としては、アニオン性高分子含水ゲルの表面に水溶性カチオン性高分子の水溶液を塗布する方法、又はアニオン性高分子含水ゲルを水溶性カチオン性高分子の水溶液へ浸漬する方法が好ましく用いられる。
【００２７】
本発明の細胞培養担体では、カチオン性基を有する担体の表面がポリペプチドで海島状に修飾されていることを特徴としている。ポリペプチドとしては細胞接着性ポリペプチドを用いることができる。細胞接着性ポリペプチドとしては、細胞毒性がなく、かつ通常の培養条件で細胞が付着するポリペプチドであればその種類は特に限定されず、天然又は合成の任意のポリペプチドを用いることができる。細胞接着性ポリペプチドの性状は特に限定されないが、好ましくはゲル状の細胞瀬着性ポリペプチドを用いることができる。特に好ましいのは、層状の細胞外マトリックス成分ゲルである。
【００２８】
細胞外マトリックスは、一般的には「動物組織中の細胞の外側に存在する安定な生体構造物で、細胞が合成し、細胞外に分泌・蓄積した生体高分子の複雑な会合体」と定義されており（生化学辞典（第３版）ｐ．５７０，東京化学同人（株））、細胞を物質的に支持する役割や細胞の活性を調節する役割（すなわち細胞外の情報を細胞に伝えその活性に変化を与える役割）等を担っている。細胞外マトリックス成分であるポリペプチドとしては、例えば、コラーゲン、エラスチン、プロテオグリカン、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、ゼラチン等を例示でき、これらのうち特に好ましいものとして、コラーゲン、アテロコラーゲン、マトリゲル（ＩＶ型コラーゲン、ラミニン、ヘパラン硫酸よりなるゲル）を例示できる。細胞外マトリックス成分は、常法に従って得ることができる。また、市販の細胞外マトリックス成分を使用してもよい。細胞接着性成分のゲル化は、常法に従って行なうことができる。例えば、細胞接着性成分がコラーゲンである場合には、０．３〜０．５％コラーゲン水溶液を３７℃で１０〜２０分間インキュベーションすることにより、コラーゲンゲルを得ることができる。細胞外マトリックス成分のゲル化の際には、必要に応じてゲル化剤を使用してもよい。
【００２９】
本明細書において「海島状に修飾」という用語は、カチオン性基を有する担体の表面にポリペプチド修飾部位が複数点在していることを意味しており、典型的にはポリペプチド修飾部位が相互に不連続な独立した部位を形成しているものを意味しているが、２以上の修飾部位が相互に連結していてもよい。「海島状」の用語をいかなる意味においても限定的に解釈してはならない。例えば、１つの独立したポリペプチド修飾部位の面積が５０μｍ２〜２ｍｍ２であることが好ましく、１００μｍ２〜１ｍｍ２であることが特に好ましい。カチオン性基を有する担体の表面に海島状にポリペプチド修飾部位を形成する方法は特に限定されないが、例えば、該ポリペプチドの溶液を印刷法（平版、凸版、凹版、グラビアなど）、ピン（キャピラリー、先端凹型、先端烏口など）によるスポッティング法、インクジェット法により担体表面に配置する方法など挙げられるがこれらに限定されることはない。
【００３０】
本発明の細胞培養担体において、海島状のポリペプチド修飾部位以外はアニオン性多糖類で被覆されていることが好ましい。アニオン性多糖類での被覆法としては海島状のポリペプチド修飾部位を担体表面に形成した後、アニオン性多糖類の溶液を該担体表面に塗布するか、該担体をアニオン性多糖類の溶液中に浸漬する方法などが好ましく用いられる。
【００３１】
本発明の細胞培養担体は基板上に形成されていてもよい。担体として含水ゲルを用いる場合には含水ゲルを基板上に形成することが好ましい。基板としては多孔質膜が好ましく用いられるが、多孔質膜の種類は特に限定されない。例えば、アルギン酸ゲルを透過させず、金属イオンなどを透過させることができるものが好ましく用いられる。多孔質膜としては、細孔を有する膜以外に、空隙を有する膜や、細孔と空隙の両方を有する膜等を用いてもよい。多孔質膜の具体例としては、濾紙、限外濾過膜、シリコーンゴム膜、四フッ化エチレン樹脂多孔質膜（ＰＴＦＥ多孔質膜）、不織布、ガーゼ様メッシュ、各種メンブレンフィルター（ナイロン、ポリフッ化ビニリデン、アセチルセルロース、ニトロセルロース、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネートなど）等を例示でき、好ましいものとしては、メンブレンフィルターであり、特にナイロンメンブレンフィルター膜が好ましい。多孔質膜が細孔を有するものである場合、細孔の大きさは通常は０．０２〜１，０００μｍであり、好ましくは０．０２〜１００μｍであり、さらに好ましくは０．１〜１０μｍである。
【００３２】
本発明の細胞培養担体を用いて、その表面上に細胞を培養することができる。培養し得る細胞の種類は特に限定されないが、例えば、繊維芽細胞、血管内皮細胞、軟骨細胞、肝細胞、小腸上皮細胞、表皮角化細胞、骨芽細胞、骨髄間葉細胞、胚性幹細胞、体性幹細胞等を例示できる。細胞の培養の際には、通常、細胞濃度１〜１．５万ｃｅｌｌｓ／ｍｌの培養液（例えば、Ｄ−ＭＥＭ培地、ＭＥＭ培地、ＨａｍＦ１２培地、ＨａｍＦ１０培地）を本発明の細胞培養担体の表面に添加する。細胞の培養条件は、培養する細胞に従って適宜選択し得る。通常、培養は担体表面にコンフルエントな単層の細胞層が形成されるまで行なうことができる。
【００３３】
本発明の細胞培養担体を用いて、担体表面に複数種の細胞を平面共培養することができる。例えば、細胞接着性ポリペプチド上でのみ増殖可能な繊維芽細胞や肝細胞等の細胞を培養して担体表面のポリペプチド修飾部位に該細胞の単層を形成させた後、ポリペプチド修飾部位以外の表面を被覆しているアニオン性多糖類上に接着する血管内細胞等の細胞を培養することにより、２種類の細胞を含む細胞培養物を製造できる。
【００３４】
本発明の細胞培養担体を用いた細胞の培養は具体的には次のようにして行なうことができる。細胞培養担体をシャーレ等の内部に設置し、シャーレ内に適当な培養液（例えば、Ｄ−ＭＥＭ培地、ＭＥＭ培地、ＨａｍＦ１２培地、ＨａｍＦ１０培地）を添加して５分浸漬後、培地交換を３回繰り返したのち１２〜２４時間放置し、培養液を細胞培養担体中に浸潤させる。シャーレ内の培養液を捨て、細胞培養担体のゲル層上に細胞を播き、シャーレ内に適当な培養液（例えば、Ｄ−ＭＥＭ培地、ＭＥＭ培地、ＨａｍＦ１２培地、ＨａｍＦ１０培地）を添加する。３７℃で１〜２時間放置し、担体表面に細胞を保持（接着）させた後、３７℃で培養を続ける。培養の際には、必要に応じて培養液を交換してもよい。通常は培養０．５〜２日ごとに培養液を交換する。もっとも、細胞培養の方法は上記の特定の方法に限定されることはなく、当業者が適宜選択可能であることは言うまでもない。
【００３５】
本発明の細胞培養担体を用いて細胞を培養により得られる細胞培養物は、本発明の細胞培養担体と該担体表面に保持された細胞層からなる細胞アレイとを含んでいるが、細胞培養担体の表面に保持された細胞アレイは、例えば細胞接着性ポリペプチドであるコラーゲンの表面に形成された細胞層であり、例えば単層の細胞層を含む細胞アレイである。
【００３６】
本発明の細胞培養担体を用いた細胞培養物上に、別に調製した細胞シートを載せることによって、重層化培養を行ってもよい。重層化する細胞層として、例えば、血管内皮細胞層、肝細胞層を使用すれば、肝臓の３次元組織構造物を構築できる。この３次元組織構造物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける薬物の透過性試験へ適用できるとともに、動物実験代替モデルや移植用臓器へ応用できる。重層化した細胞層は、細胞層を構成する細胞の種類に応じた培養条件で培養することができる。培養の際には、例えば、Ｄ−ＭＥＭ培地、ＭＥＭ培地、ＨａｍＦ１２培地、ＨａｍＦ１０培地等の培地を使用できる。例えば、本発明の細胞培養担体を用いた細胞培養物が平面共培養となっている場合、さらに重層化することで３次元状に細胞組織を構築することが可能となる。
【００３７】
担体としてアルギン酸を含む含水ゲルを用いた場合には、上記のようにして得られた細胞培養物のアルギン酸ゲル層を可溶化処理することにより、培養された細胞を細胞シート又は細胞アレイとして脱離させることもできる。アルギン酸ゲル層の可溶化処理は、アルギン酸ゲルを構成するカチオン成分を除去することにより行うことができる。カチオン種が多価金属イオンの場合は、例えば、リン酸などの多価金属カチオンと錯形成又は難溶性塩を形成するイオンの添加、キレート剤水溶液の使用、培地中の多価金属イオンの低減、培地中の多価金属イオンのキレート剤による隠蔽によって実施できる。通常、細胞培養用の培地にはリン酸イオンが多く存在するため、予め多価金属イオンを除去した培地もしくは多価金属カチオンの総和モル数に対して９０モル％以上のキレート剤を添加した培地に浸漬する方法が細胞への侵襲を低減する観点から好ましく用いられる。該キレート剤の濃度は９０モル％〜１００００モル％が好ましく、９０モル％〜１０００モル％がさらに好ましい。
【００３８】
キレート剤の種類は特に限定されないが、例えば、エチレンジアミンジオルトヒドロキシフェニル酢酸、ジアミノプロパン四酢酸、ニトリロ三酢酸、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸、ジヒドロキシエチルグリシン、エチレンジアミン二酢酸、エチレンジアミン二プロピオン酸、イミノ二酢酸、ジエチレントリアミン五酢酸、ヒドロキシエチルイミノ二酢酸、１，３−ジアミノプロパノール四酢酸、トリエチレンテトラミン六酢酸、トランスシクロヘキサンジアミン四酢酸、エチレンジアミン四酢酸（ｅｄｔａ）、グリコールエーテルジアミン四酢酸、Ｏ，Ｏ’−ビス（２−アミノエチル）エチレングリコール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ｅｇｔａ）、エチレンジアミンテトラキスメチレンホスホン酸、ジエチレントリアミンペンタメチレンホスホン酸、ニトリロトリメチレンホスホン酸、１−ヒドロキシエチリデン−１，１−ジホスホン酸、１，１−ジホスホノエタン−２−カルボン酸、２−ホスホノブタン−１，２，４−トリカルボン酸、１−ヒドロキシ−１−ホスホノプロパン−１，３，３−トリカルボン酸、カテコール−３，５−ジスルホン酸、ピロリン酸ナトリウム、テトラポリリン酸ナトリウム、ヘキサメタリン酸ナトリウムが挙げられ、特に好ましくは例えばジエチレントリアミン五酢酸、トリエチレンテトラミン六酢酸、１，３−ジアミノプロパノール四酢酸、グリコールエーテルジアミン四酢酸、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸、２−ホスホノブタン−１，２，４−トリカルボン酸、１，１−ジホスホノエタン−２−カルボン酸、ニトリロトリメチレンホスホン酸、エチレンジアミンテトラホスホン酸、ジエチレントリアミンペンタホスホン酸、１−ヒドロキシプロピリデン−１，１−ジホスホン酸、１−アミノエチリデン−１，１−ジホスホン酸、１−ヒドロキシエチリデン−１，１−ジホスホン酸やこれらの塩を挙げることができる。これらのうち特に好ましいものとしてはｅｄｔａ、ｅｇｔａを例示できる。
【００３９】
キレート化剤を用いたアルギン酸ゲル層の可溶化処理は、その表面にアルギン酸を含む水性ゲルが形成された多孔質膜からキレート化剤をしみこませて行なうのが好ましい。これによって、多孔質膜とアルギン酸ゲル層とを容易に分離することができ、細胞培養物を多孔質膜から容易に脱離させることができる。アルギン酸ゲル層の可溶化処理によってアルギン酸ゲル層を完全に除去する必要はなく、可溶化されなかったアルギン酸ゲル層が残っていてもよいが、アルギン酸ゲル層はできるだけ可溶化して除去するのが好ましい。
【００４０】
アルギン酸ゲル層を可溶化処理して得られる細胞培養物は細胞層又は細胞アレイを含んでいるので、細胞層の重層化又は転写などに使用できる。細胞層の重層化の際には、予め培養した細胞上に荷重をかけた状態で培養したのちアルギン酸ゲルを可溶化してもよく、あるいはアルギン酸ゲル層を可溶化して得られる細胞培養物同士を重層化してもよい。また、アルギン酸ゲル層を可溶化して得られる細胞培養物を別に作製した細胞層に重層化してもよい。重層化する細胞層の細胞の種類は、同一であっても異なっていてもよい。重層化する細胞層の数は特に限定されないが、通常１〜１０、好ましくは１〜５、さらに好ましくは１〜３である。また、細胞層の転写際には、別の細胞培養用基材上に荷重をかけた状態で培養したのちアルギン酸ゲルを可溶化してもよく、あるいはアルギン酸ゲル層を可溶化して得られる細胞培養物を他の媒体に転写してもよい。好ましい重層化又は転写方法としては予め培養した細胞上もしくは別の細胞培養基材上に荷重をかけた状態で培養したのちアルギン酸ゲルを溶解する方法を挙げることができる。
【００４１】
荷重をかけた細胞の培養法は特に限定されず、細胞が転写される細胞又は基材にムラが生じない程度に充分荷重がかけられていればいかなる方法でもよい。ここで、荷重をかける際に細胞が密閉されると窒息をすることから、転写する側もしくは受ける側の少なくとも一方が細胞培養基材が水透過性のゲルや多孔質膜もしくはこれらの組み合わせでできていることが好ましい。また、ムラ無く転写するには細胞面を充分に覆う状態で荷重をかける必要があるが、均一に接触することで酸素の拡散を妨害することとなるため、不織布（ナイロン、ポリエステル、ステンレスなど）等を介して酸素の拡散を妨げないで荷重することが好ましい。
【００４２】
荷重をかけた細胞の培養法における荷重は０．１ｇ／ｃｍ２〜５０ｇ／ｃｍ２であることが好
ましく、０．５ｇ／ｃｍ２〜１０ｇ／ｃｍ２であることがさらに好ましい。荷重をかけた細胞の培養の時間は充分な細胞の転写が実現できれば特に限定されないが、４時間〜７２時間が好ましく、６時間〜４８時間がさらに好ましい。
【００４３】
本発明の細胞培養担体は、いかなる方法で滅菌されてもよいが、電子線、γ線、Ｘ線、紫外線などの放射線による滅菌が好ましく用いられ、電子線、γ線、紫外線がさらに好ましく用いられ、電子線滅菌が特に好ましい。本発明の電子線滅菌の照射線量としては０．１ｋＧｙ以上６５ｋＧｙ以下が好ましく、１ｋＧｙ以上４０ｋＧｙ以下が特に好ましい。ＥＯＧ滅菌などの化学滅菌、高圧蒸気ガス滅菌などの高熱をかける滅菌は細胞接着性層やアルギン酸ゲル層を分解するため好ましくない。このように滅菌した細胞培養担体は無菌条件下であれば長期間に渡って室温保管が可能である。上記滅菌法は単独もしくは複数種の組み合わせで実施されてもよく、同一種の滅菌法を繰り返し使用してもよい。
【００４４】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。
実施例１：細胞培養担体の作製
（１）アルギン酸含水ゲル膜の調製
５重量％のアルギン酸ナトリウム（和光純薬製）水溶液を５００μｍの厚さでステンレス基板上に塗布し、塗布物を０．５ｍｏｌ／ｌの塩化カルシウム水／メタノール（容量比８０／２０）溶液に浸漬した。塗布物が充分ゲル化したのち、塗布物を流水で洗浄した。さらに、膜が変形しないように４辺を挟んだ状態で乾燥し、アルギン酸カルシウム含水ゲル膜を得た。
【００４５】
（２）キトサン修飾
上記（１）で得たアルギン酸含水ゲル膜を１重量％の水溶性キトサン（和光純薬製）水溶液に１時間浸漬したのち、流水で１時間以上洗浄した。キトサン修飾膜は乾燥せず水中に保管した。
（３）コラーゲン修飾
上記（２）で得たキトサン修飾膜を０．０３ｍｇ／ｍｌとなるように水で希釈したＣｅｌｌｍａｔｒｉｘＩＣ（新田ゼラチン製ｔｙｐｅＩコラーゲン水溶液）を先端烏口状のステンレスピンでスポットしたのち、流水で１時間以上洗浄した。さらに、膜が変形しないように４辺を挟んだ状態で乾燥し、海島状にコラーゲンで表面修飾したアルギン酸カルシウム含水ゲル膜（サンプル１）を得た。このときのスポットの様子を図１に示す。また、スポットをキャピラリー（Ｄｒｕｍｍｍｏｎｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製ＭＩＣＲＯＣＡＰＳ、容量５μｌ）でスポットしたものをサンプル２とした。
【００４６】
（４）ヒアルロン酸修飾
サンプル１および２を０．１重量％ヒアルロン酸ナトリウム（和光純薬製、鶏冠製）水溶液に１時間浸漬したのち、流水で１時間以上洗浄した。さらに、膜が変形しないように４辺を挟んだ状態で乾燥し、サンプル３および４（海島状にコラーゲンで表面修飾し、コラーゲン修飾部位以外をヒアルロン酸で被覆したアルギン酸カルシウム含水ゲル膜）を得た。
【００４７】
（５）コラーゲン付着部の評価
▲１▼免疫染色
上記で得たサンプルをＰＢＳ＋（ＧＩＢＣＯ製１０×Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ， ｗｉｔｈｏｕｔ Ｃａｌｃｉｕｍ Ｃｈｌｏｒｉｄｅ， ｗｉｔｈｏｕｔ Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ Ｃｈｌｏｒｉｄｅ １００ｍｌに水８９９ｍｌと１００ｇ／ｌ塩化マグネシウム六水和物と１００ｇ／ｌ塩化カルシウムを含んだ水溶液１ｍｌを混合）で膜を洗浄したのち、マニュアルに従って調製したＴＢＳ Ｂｌｏｔｔｏ Ｂ溶液に室温で２時間浸漬した。ＴＢＳ Ｂｌｏｔｔｏ Ｂ溶を充分に除去したのち、一次抗体として抗Ｔｙｐｅ−Ｉコラーゲンウサギ抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ製）をかけ１時間放置し、その後ＰＢＳ＋で洗浄した。次いで、二次抗体としてペルオコシダーゼ標識した抗ウサギ抗体（ＤＡＫＯ製Ｅｎｖｉｓｉｏｎ＋ ＴＭ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）をかけ１時間放置したのち、ＰＢＳ＋で洗浄した。洗浄液を充分除去したのち、氷冷下ＤＡＢ基質液（ＤＡＫＯ製Ｌｉｑｕｉｄ ＤＡＢ＋ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ−Ｃｒｏｍｏｇｅｎ Ｓｙｓｔｅｍをマニュアルに従って調液したもの）で２分間反応させた。サンプル１〜４にはいずれも海島状のコラーゲン付着部が形成されえていることがわかった。１つの独立したコラーゲン付着部の面積はサンプル１及び３で０．０５ｍｍ２、サンプル２及び４では０．８ｍｍ２であった。サンプル３の染色の様子を図２に示す。
【００４８】
▲２▼ＸＰＳ
上記で得たサンプルの表面をＸＰＳのＮ原子、Ｃ原子、Ｏ原子それぞれの１ｓ軌道の化学シフトを解析することで最表層の化合物を評価したところ、サンプル１〜４のコラーゲンスポット部がコラーゲンからなること、及びコラーゲンスポット部以外の部分はサンプル１及び２ではキトサン、サンプル３及び４ではヒアルロン酸からなることがわかった。
【００４９】
（６）滅菌
上記で得られた担体に対してＵＶ滅菌３時間、電子線滅菌２０ｋＧｙの６種類の滅菌を施したところ、いずれも菌が確認されなかった。滅菌処理を施していないサンプルからは５９００個／ｍ２の菌が確認された。
【００５０】
比較例１
実施例１においてアルギン酸含水ゲルの代わりにポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）およびガラスを用いてコラーゲン修飾までの操作を行ったところ、コラーゲンの付着は確認されなかった。
【００５１】
実施例２：ガラスの修飾
担体としてガラスを用い、１０重量％の３−アミノプロピルトリエトキシシラン（和光純薬製）水溶液に浸漬し、５０℃で２時間放置したのち、流水で１時間洗浄してアミノ基導入ガラスを調製した。実施例１においてアルギン酸含水ゲルの代わりにこのアミノ基導入ガラスを用いてコラーゲン修飾までの操作を行ったところ、コラーゲンの付着が確認された。
【００５２】
実施例３：細胞の培養
次のようにして細胞培養担体を用いた細胞の培養を行なった。
（１）使用細胞
ＣＨＬ（Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｌｕｎｇ Ｃｅｌｌ）
（２）使用培地
Ｅａｇｌｅ最小培地、１０％牛胎児血清
（３）細胞培養担体
実施例１のサンプル３及び４、並びに細胞培養担体をポリスチレン製細胞培養用シャーレの底面に両面テープで貼り付けたものをＵＶ滅菌した後、培地を添加して５分浸漬し、培地交換を３回繰り返したのち一晩放置して培地を細胞培養担体中に浸潤させた。ポリスチレン製細胞培養用シャーレのみを比較例として同様の操作を行った。
【００５３】
（４）細胞の播種
予め培養しておいた細胞をトリプシン処理で回収し、細胞濃度を５００００ｃｅｌｌ／ｍｌに調整した。セル及びシャーレ内の培地を捨てた後、この細胞液を細胞数１００００ｃｅｌｌ／ｃｍ２となるようにシャーレ内に播種して培地を添加した。
（５）培養
ＣＯ２インキュベーターを用いて３７℃で２日間培養した。
【００５４】
（６）結果
いずれのサンプルも細胞接着性、細胞培養担体の剥離、及び細胞毒性に問題はなかった。実施例１のサンプル３及び４についてはコラーゲン付着部のみに細胞が海島状に培養され、細胞アレイが形成されていた。
【００５５】
試験例：アルギン酸カルシウム、キトサンおよびコラーゲンへの吸着評価
実施例１で調製したアルギン酸カルシウム含水ゲル、キトサン修飾したアルギン酸カルシウム含水ゲル、及びキトサン修飾したアルギン酸カルシウム含水ゲルを０．０３ｍｇ／ｍｌとなるように水で希釈したＣｅｌｌｍａｔｒｉｘＩＣ（新田ゼラチン製ｔｙｐｅＩコラーゲン水溶液）に浸漬した後に水洗して調製したコラーゲン修飾ゲルを、コラーゲン、キトサン、ヒアルロン酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウムのそれぞれ０．１重量％の水溶液に浸漬し、水洗したのちＸＰＳで吸着性を評価した。結果を表１に示す。キトサン上には評価した全ての高分子化合物が付着し、コラーゲン上には評価した全ての高分子化合物が付着しなかった。
【００５６】
【表１】
【発明の効果】
本発明の細胞培養担体を用いて細胞を培養することにより細胞アレイを容易に形成することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】細胞接着性ポリペプチド（コラーゲン）を担体表面にスポットして海島状の修飾部位を形成する様子を示した図である。
【図２】担体表面に形成された海島状のコラーゲン修飾部位を免疫染色した結果を示した図である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a cell culture carrier that can be used for cell culture technology and cell sheet engineering.
[0002]
[Prior art]
In recent years, there have been many discoveries of methods for inducing differentiation into various stem cells and somatic cells, and Tissue Engineering has attracted a great deal of attention as a new medical treatment that replaces organ transplantation. This technique is aimed at constructing an organ directly used for human treatment inside and outside the body, but has realized many techniques for expressing an organ-like function in vitro. For this reason, it is expected as a high-throughput (HTS) cell evaluation system that can be used for pharmacological tests without directly creating organs and can handle a huge number of tests such as drug discovery research and diagnosis. In addition, it is also expected as a new technology capable of producing substances specific to mammalian cells.
[0003]
On the other hand, the analysis of the human DNA base sequence by the Human Genome Project is almost finished, and the world's research is moving to the post-genome using this information. Tailor-made medicine, which has been popular in newspapers in recent years, is one of them, and it is expected that not only medicine but also drug discovery and medication support tools will create a huge market. At present, DNA chips and protein chips are attracting attention as such tools, and various companies such as US venture companies are sharpening their habits.
[0004]
However, the number of human genes reported by the Human Genome Project is about 30,000 to 40,000, and there are many homologous genes that are not different from the flies of 13,000 and are identical across species. From this, it has also been found that the individuality within a species cannot be determined only by DNA. Human genetic information is constructed through DNA, RNA, and protein according to the central dogma, but information transmission is not one-way, but is a non-linear system with many interactions and feedback systems, so-called complex systems. There is a mechanism that gives stability and robustness to life forms. For example, different expression systems work in the same genes, cells, and tissues in the liver during fasting, fulling, and drinking. For this reason, in order to elucidate biological phenomena, we do not focus only on molecular reactions, but try to think by simulation based on boundary conditions obtained by analyzing cells and organs in vivo after capturing living organisms as a system. Has been. This new field has been attracting a great deal of attention called biosystem engineering.
[0005]
Although it is necessary to handle systems that are more than cells at least to accurately grasp life phenomena, there is a demand for an array of cells and tissues that maintain the original functions of cells and tissues. Research is thriving. Specifically, a method for controlling the hydrophilicity / hydrophobicity of the surface of a solid substrate such as glass using lithography (S. N. Bhatia et al, Biotechnol. Prog., 14, 378 (1998), Toshihiro Akaike et al. No. 176753, Otsuka et al., 30th Annual Symposium on Medical Polymer Symposium 9 (2001), Kikuchi et al., 30th Annual Symposium on Medical Polymer Symposium 35 (2001), etc.) are known. However, such a method requires an expensive apparatus for lithography, and has a problem that a cell culture carrier cannot be easily prepared.
[0006]
On the other hand, it is known that cells are arranged with polarity when forming a tissue in vivo. For example, hepatocytes absorb blood components from the vascular endothelial cell side and excrete metabolites such as bile acids from the opposite side. Since this bile acid has strong cytotoxicity, there is a problem that stable culture for a long period of time is difficult if the cells are cultured on an impermeable support such as glass. It is also known that cell polarity is expressed by stimulating cells from one direction, but when cells are cultured on an impermeable support, they cannot be stimulated from the adhesion side. There's a problem. Further, in order to perform lithography, it is necessary to apply a photosensitive solution in advance, but in the substance-permeable support, in addition to the photosensitive solution, the reaction product and the developing / fixing solution penetrate into the support, There is a problem that toxicity or irritation to cultured cells occurs due to the denaturation of the support or the retention of the compound in the support.
[0007]
SUMMARY OF THE INVENTION Problems to be Solved by the Invention and Means for Solving the Problems
An object of the present invention is to provide a cell culture carrier as a means for easily preparing a cell array. Another object of the present invention is to provide a cell culture carrier capable of culturing both surfaces of cells as different culture media and easily performing cell growth with an optical microscope. As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have found that the above problems can be solved by providing a cell culture carrier adopting the following configuration.
[0008]
That is, the present invention provides a cell culture carrier comprising a carrier having a cationic group and comprising a sea-island-like polypeptide modification site formed on the surface of the carrier. According to a preferred aspect of the present invention, the cell culture carrier wherein the carrier having a cationic group is a polymer compound, an inorganic compound, or an organic compound; the polymer compound having a cationic group as a carrier having a cationic group, Alternatively, the above cell culture carrier that is an inorganic compound or an organic compound into which a cationic group has been introduced by surface modification is provided. Moreover, according to a preferred embodiment of the present invention, there is provided the above cell culture carrier in which the surface of the carrier other than the polypeptide modification site is coated with an anionic polysaccharide.
[0009]
Further, as another preferred embodiment of the above invention, there is provided the above cell culture carrier in which the carrier is a hydrous gel, and in a more preferred embodiment, the above cell culture carrier and hydrous gel in which the hydrogel is a polymer hydrous gel. The above cell culture carrier which is an anionic polymer hydrogel is provided. In this embodiment, it is preferable to use, as the carrier having a cationic group, a water-containing gel in which chitosan is mixed with a polymer water-containing gel or a water-containing gel in which chitosan is adsorbed on an anionic polymer water-containing gel. As a particularly preferred embodiment, the carrier is a hydrogel containing alginic acid, and the carrier having a cationic group is formed by applying an aqueous solution of a water-soluble cationic polymer to the surface of the hydrogel, and the carrier Is a water-containing gel containing alginic acid, and a cell culture carrier formed by immersing the water-containing gel in an aqueous solution of a water-soluble cationic polymer is provided. In this preferred embodiment, chitosan can be particularly preferably used as the water-soluble cationic polymer.
[0010]
In a further preferred embodiment, the cell culture carrier, wherein the polypeptide that modifies the surface of the carrier having a cationic group is a cell adhesion polypeptide; the polypeptide that modifies the surface of the carrier having a cationic group is an extracellular matrix component The above cell culture carrier, wherein the polypeptide that modifies the surface of the carrier having a cationic group is a gel-like extracellular matrix component. In addition, the area of one independent polypeptide modification site is 50 μm 2 ~ 2mm 2 The cell culture carrier as described above; the area of one independent polypeptide modification site is 100 μm 2 ~ 1mm 2 The above cell culture carrier is provided. Preferably, the modification site of the polypeptide is formed on the surface of the carrier by a printing method, a spotting method, and / or an inkjet method.
[0011]
From another aspect, a cell culture method including a step of seeding cells on the surface of the cell culture carrier; a cell culture method including a step of forming a cell layer on the surface of the cell culture carrier; and A cell culture obtained by the cell culture method is provided. The cell culture described above includes a cell layer formed on the surface of the polypeptide arranged in a sea-island shape on the surface of the carrier. When the carrier of the cell culture carrier is a hydrogel containing alginic acid, a cell culture substantially free of hydrogel can be obtained by solubilizing the hydrogel containing alginic acid from the cell culture. That is, the present invention provides a method for producing a cell culture, comprising the steps of forming a cell layer on the surface of the cell culture carrier; and solubilizing a hydrous gel containing alginic acid.
[0012]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
In the present specification, the “cell culture carrier” means a structure capable of holding cells in a culture solution when the cells are cultured, but this term is limitedly interpreted in any sense. It must not be interpreted in the broadest sense.
[0013]
The cell culture carrier of the present invention includes a carrier having a cationic group, and the surface of the carrier is modified with a polypeptide into a sea-island shape. Examples of the carrier contained in the cell culture carrier of the present invention include, but are not limited to, a simple substance including a polymer compound, an inorganic compound, or an organic compound. For example, a metal plate or glass can be used as the carrier. More specifically, examples of the carrier having a cationic group include an inorganic compound or an organic compound in which a cationic group is introduced by surface modification in addition to a polymer compound having a cationic group. it can. The type of the cationic group is not particularly limited as long as it is a group having a positive charge at pH 8 or lower. For example, an amino group; a monoalkylamino group such as a methylamino group or an ethylamino group; a dimethylamino group or a diethylamino group A dialkylamino group, an imino group, a guanidino group, and the like.
[0014]
Examples of the polymer compound having a cationic group that can be used as a carrier include chitosan, partially deacetylated chitin, aminated cellulose, polylysine, polyarginine, a copolymer of lysine and arginine, polyvinylamine, polyaniline, and these compounds. And a polyion complex with an anionic polymer. An example of the carrier made of an inorganic compound is glass.
[0015]
When an inorganic compound or an organic compound having a cationic group introduced by surface modification is used as a carrier, the surface modification method is not particularly limited. For example, a method using a chemical reaction that forms a covalent bond, an electrostatic interaction of ions And a method of adsorbing a compound having an amino group by hydrophobic interaction, a method of applying a water-insoluble amino group-containing compound, and the like.
[0016]
More specifically, as a method using a chemical reaction for forming a covalent bond, a method using a coupling agent (silane, titanium, etc.), a self-assembled film using a mercapto compound, a reactive group (guanidyl, aldehyde, etc.) Reaction using a cationic compound having Examples of the method of adsorbing by electrostatic interaction of ions include a method of adsorbing a polyvalent cationic compound or a cationic polymer compound on an anionic surface. Examples of a method for attaching a compound having an amino group by hydrophobic interaction include an LB film. The water-insoluble amino group-containing compound can be applied by dissolving an oil-soluble compound (alkylamine, polyaniline, etc.) in an organic solvent or by applying an acid-soluble compound (chitosan, etc.) with an acidic solution and then increasing the pH. The method of making it precipitate etc. is mentioned. However, the method of surface modification is not limited to these specific examples, and those skilled in the art can appropriately select the method according to the type of carrier and the purpose of modification.
[0017]
A preferred embodiment of the cell culture carrier of the present invention is a case where the carrier is a hydrous gel, and a preferred example of the hydrogel is a polymer hydrogel. In the present specification, the polymer hydrogel means a gel-like substance having a network structure by chemical bonds and having a large amount of water in the network, but this term is interpreted in a limited way in any sense. It must not be interpreted in the broadest sense. A hydrogel of an inorganic substance (silica gel or the like) may be used as the hydrogel that forms the carrier.
[0018]
Examples of the polymer compound that forms the polymer hydrogel include anionic polysaccharides (alginic acid, hyaluronic acid, chondroitin sulfate, dextran sulfate, agaropectin, carrageenan, carboxymethylcellulose, etc.) and salts thereof, cationic polysaccharides (chitosan, Partially deacetylated chitin, aminated cellulose, etc.) and salts thereof, nonionic polysaccharides (dextran, cellulose, cellulose acetate, hydroxyethylcellulose, methylcellulose, agarose, amylose, glycomannan, etc.), polypeptides (collagen, gelatin, silk fibroin, etc.) ), Synthetic polymers (polyacrylic acid, polyacrylamide, poly-N-isopropylacrylamide, polyethyleneimine, polyvinyl alcohol, polyethylene glycol, etc.), and Such as a mixture or complex of al and the like.
[0019]
As the water-containing gel having a cationic group, for example, a water-containing gel in which chitosan is mixed with a polymer water-containing gel, or a water-containing gel in which chitosan is adsorbed in an anionic polymer water-containing gel is preferably used in addition to the water-containing gel of chitosan. Can do. For example, an aqueous gel prepared by dissolving chitosan with an acid and raising the pH to insolubilize it, or chitosan and a water-soluble anionic polymer (alginic acid, hyaluronic acid, chondroitin sulfate, dextran sulfate, agaropectin, carrageenan, carboxy And aqueous gels based on polyion complexes with methylcellulose, polyacrylic acid and copolymers thereof, polymethacrylic acid and copolymers thereof, polystyrenesulfonic acid and copolymers thereof, and amphoteric polymers (gelatin, collagen, etc.). . Examples of a method for producing an aqueous gel using a polyion complex include a method of mixing a chitosan aqueous solution with an anionic or amphoteric polymer aqueous solution, or a so-called alternating method in which an aqueous gel is alternately immersed in a chitosan aqueous solution and an anionic or amphoteric polymer aqueous solution. Examples include a layer-by-layer method. Here, when using the alternate lamination method, it is preferable that the uppermost layer (final immersion liquid) is chitosan. A compound that does not directly contribute to gelation may be added to the water-containing gel containing chitosan.
[0020]
As the water-containing gel constituting the carrier, an anionic polymer water-containing gel can be used. An anionic polymer gel means a gel formed by forming a chelate structure between an acid group in a molecule of an anionic polymer and a polyvalent metal ion, but this term is limited in any sense. Should not be interpreted. Specific examples of the polyvalent metal cation capable of causing gelation of the anionic polymer include, for example, barium (Ba), lead (Pb), copper (Cu), strontium (Sr), cadmium (Cd), calcium (Ca ), Zinc (Zn), nickel (Ni), cobalt (Co), manganese (Mn), iron (Fe), magnesium (Mg), etc., and among these, calcium ions, Examples include magnesium ion, barium ion, and strontium ion. The anionic polymer hydrogel may also be a hydrogel made of a polyion complex of an organic polymer compound having an acid group and a cation residue. Examples of the organic polymer compound having a cationic residue include compounds having a plurality of amino groups, such as polylysine, chitosan, gelatin, and collagen.
[0021]
As the carrier constituting the cell culture carrier of the present invention, an anionic polymer hydrogel can be preferably used, and a hydrogel containing alginic acid is particularly preferably used. The hydrogel containing alginic acid means a gel formed by forming a chelate structure between a carboxylic acid group in a molecule of alginic acid and a polyvalent metal ion. Alginic acid is a block copolymer composed of glucuronic acid (G) and mannuronic acid (M), and it is thought that polyvalent metal cations invade into the pocket structure of M block to form an egg box and gel. Yes.
[0022]
Alginic acid exists naturally as a cell wall-constituting polysaccharide or intercellular packing material of brown algae, and these can be collected as raw materials. Specific examples of the raw material brown algae include the genus Dilviaiaceae (for example, D. potatorum), the Asbestosaceae genus Ascophilum (for example, A. nodosum), the genus Kombuaceae (for example Macombu, Nagacomb), Examples include brown algae of the genus Alameda (for example, arame), the order of the genus Coleaceae (for example, Kajime, urome), and the genus Lesoniaceae (for example, L. flavikans). Commercially available alginic acid can also be used. The G / M ratio of alginic acid is not particularly limited, but the larger the G / M ratio, the greater the gel-forming ability. Therefore, the larger G / M ratio is preferred, specifically 0.1 to 1. Is more preferably 0.2 to 0.5 (the numerical range indicated by “to” in the present specification includes upper and lower numerical values).
[0023]
The gelation of alginic acid can be performed according to a conventional method. The gelation of alginic acid can be performed using, for example, ion exchange. For example, when calcium ions are added to a sodium alginate aqueous solution, ion exchange occurs rapidly, and a calcium alginate gel is obtained. More specifically, a calcium alginate gel layer is formed by applying an aqueous solution of sodium alginate at a desired thickness on a coating substrate and then immersing it in a solution of an organic polymer compound having a polyvalent metal cation or a cation residue. can get.
[0024]
In carrying out the above method, the concentration of sodium alginate is not particularly limited, but is preferably, for example, 0.05% by mass to 20% by mass, and particularly preferably 0.5% by mass to 10% by mass or less (in this specification, “ The numerical range indicated by "includes the upper and lower numerical values). Moreover, as thickness which apply | coats sodium alginate, 1 micrometer-100 mm are preferable, for example, and 10 micrometers-10 mm are especially preferable. The concentration of the polyvalent metal cation solution is preferably 0.05 mol / L to 10 mol / L, particularly preferably 0.1 mol / L to 5 mol / L. Examples of the solvent for the polyvalent metal cation solution include water, a water-soluble organic solvent, or a mixture of water and a water-soluble organic solvent, and more specifically, water, methanol, ethanol, isopropyl alcohol. Or a mixture thereof, and a mixture of water and methanol is particularly preferably used.
[0025]
In performing the above method, when polylysine is used as the organic polymer compound having a cation residue, N-hydroxysuccinimide and 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) -carbodiimide hydrochloride in an alginic acid solution are used. A method of polymerizing lysine with a salt to form polylysine is preferably used. However, the method of forming an alginate gel is not limited to the specific method described above. A person skilled in the art can easily produce an alginic acid gel by appropriately modifying or modifying the above-mentioned method or selecting other means as appropriate.
[0026]
When an anionic polymer hydrated gel is used as a carrier in a cell culture carrier, the method for introducing a cationic group onto the surface of the hydrated gel is not particularly limited. For example, an anionic polymer hydrated gel is used as a water-soluble cationic polymer. A method of contacting with an aqueous solution is preferably used. As a method of contacting the aqueous solution, a method of applying an aqueous solution of a water-soluble cationic polymer to the surface of an anionic polymer hydrogel, or immersing the anionic polymer hydrogel in an aqueous solution of a water-soluble cationic polymer The method is preferably used.
[0027]
The cell culture carrier of the present invention is characterized in that the surface of the carrier having a cationic group is modified in a sea-island shape with a polypeptide. As the polypeptide, a cell adhesive polypeptide can be used. The cell adhesion polypeptide is not particularly limited as long as it is non-cytotoxic and can adhere to cells under normal culture conditions, and any natural or synthetic polypeptide can be used. The properties of the cell adhesion polypeptide are not particularly limited, but preferably a gel-like cell-seeding polypeptide can be used. Particularly preferred is a layered extracellular matrix component gel.
[0028]
The extracellular matrix is generally defined as "a complex body of biopolymers, which are stable biological structures that exist outside the cells in animal tissues and are synthesized and secreted and accumulated outside the cells." (Biochemical Dictionary (Third Edition) p. 570, Tokyo Chemical Doujin Co., Ltd.), the role of material support for cells and the role of regulating cell activity (ie, transmitting extracellular information to cells) It plays a role in changing its activity). Examples of the polypeptide that is an extracellular matrix component include collagen, elastin, proteoglycan, fibronectin, laminin, vitronectin, gelatin and the like. Among these, collagen, atelocollagen, matrigel (type IV collagen, laminin) are particularly preferable. And a gel made of heparan sulfate). The extracellular matrix component can be obtained according to a conventional method. Commercially available extracellular matrix components may also be used. Gelation of the cell adhesion component can be performed according to a conventional method. For example, when the cell adhesive component is collagen, a collagen gel can be obtained by incubating a 0.3 to 0.5% aqueous collagen solution at 37 ° C. for 10 to 20 minutes. When the extracellular matrix component is gelled, a gelling agent may be used as necessary.
[0029]
In this specification, the term “modified in the form of a sea island” means that a plurality of polypeptide modification sites are scattered on the surface of a carrier having a cationic group, It means what forms discontinuous independent sites, but two or more modification sites may be linked to each other. The term “sea-island” should not be interpreted in any way restrictive. For example, the area of one independent polypeptide modification site is 50 μm 2 ~ 2mm 2 Preferably 100 μm 2 ~ 1mm 2 It is particularly preferred that A method for forming a polypeptide modification site in the shape of a sea island on the surface of a carrier having a cationic group is not particularly limited. For example, a solution of the polypeptide is printed (lithographic, relief, intaglio, gravure, etc.), pin (capillary) , Spotting method using a tip concave shape, tip throat, etc.) and a method of disposing on the surface of the carrier by an ink jet method, but are not limited thereto.
[0030]
The cell culture carrier of the present invention is preferably coated with an anionic polysaccharide other than the sea-island polypeptide modification site. As a coating method with an anionic polysaccharide, after forming a sea-island-like polypeptide modification site on the surface of the carrier, a solution of the anionic polysaccharide is applied to the surface of the carrier, or the carrier is applied in the solution of the anionic polysaccharide. A method of immersing in a substrate is preferably used.
[0031]
The cell culture carrier of the present invention may be formed on a substrate. When a hydrogel is used as the carrier, it is preferable to form the hydrogel on the substrate. A porous film is preferably used as the substrate, but the type of the porous film is not particularly limited. For example, a material that can permeate metal ions and the like without permeating alginic acid gel is preferably used. As the porous film, in addition to the film having pores, a film having voids, a film having both pores and voids, or the like may be used. Specific examples of the porous membrane include filter paper, ultrafiltration membrane, silicone rubber membrane, tetrafluoroethylene resin porous membrane (PTFE porous membrane), non-woven fabric, gauze-like mesh, various membrane filters (nylon, polyvinylidene fluoride) , Acetylcellulose, nitrocellulose, polyethylene terephthalate, polycarbonate, etc.), and the like is preferably a membrane filter, and particularly preferably a nylon membrane filter membrane. When the porous membrane has pores, the pore size is usually 0.02 to 1,000 μm, preferably 0.02 to 100 μm, more preferably 0.1 to 10 μm. is there.
[0032]
Using the cell culture carrier of the present invention, cells can be cultured on its surface. The types of cells that can be cultured are not particularly limited, but for example, fibroblasts, vascular endothelial cells, chondrocytes, hepatocytes, small intestinal epithelial cells, epidermal keratinocytes, osteoblasts, bone marrow mesenchymal cells, embryonic stem cells, Examples include somatic stem cells. When culturing cells, a culture solution (eg, D-MEM medium, MEM medium, HamF12 medium, HamF10 medium) having a cell concentration of 1 to 15,000 cells / ml is usually applied to the surface of the cell culture carrier of the present invention. Add to. Cell culture conditions can be appropriately selected according to the cells to be cultured. Usually, the culture can be carried out until a confluent monolayer cell layer is formed on the surface of the carrier.
[0033]
Using the cell culture carrier of the present invention, a plurality of types of cells can be co-cultured on the surface of the carrier. For example, after culturing cells such as fibroblasts and hepatocytes that can grow only on cell adhesion polypeptides to form a monolayer of the cells on the polypeptide modification site on the surface of the carrier, other than the polypeptide modification site A cell culture containing two types of cells can be produced by culturing cells such as intravascular cells that adhere to the anionic polysaccharide covering the surface of the cells.
[0034]
Specifically, the cell culture using the cell culture carrier of the present invention can be performed as follows. Place the cell culture carrier inside a petri dish or the like, add an appropriate culture solution (for example, D-MEM medium, MEM medium, HamF12 medium, HamF10 medium) in the petri dish, soak for 5 minutes, and then change the medium three times. After repeating, it is allowed to stand for 12 to 24 hours to infiltrate the culture solution into the cell culture carrier. The culture solution in the petri dish is discarded, the cells are seeded on the gel layer of the cell culture carrier, and an appropriate culture solution (for example, D-MEM medium, MEM medium, HamF12 medium, HamF10 medium) is added to the petri dish. The cells are allowed to stand at 37 ° C. for 1 to 2 hours to retain (adhere) the cells on the surface of the carrier, and then culture is continued at 37 ° C. When culturing, the culture solution may be exchanged as necessary. Usually, the culture solution is changed every 0.5 to 2 days of culture. Needless to say, the method of cell culture is not limited to the specific method described above and can be appropriately selected by those skilled in the art.
[0035]
The cell culture obtained by culturing cells using the cell culture carrier of the present invention includes the cell culture carrier of the present invention and a cell array composed of cell layers held on the surface of the carrier. The cell array held on the surface is a cell layer formed on the surface of collagen, which is a cell adhesion polypeptide, for example, a cell array including a single cell layer.
[0036]
Multilayer culture may be performed by placing a separately prepared cell sheet on a cell culture using the cell culture carrier of the present invention. If, for example, a vascular endothelial cell layer or a hepatocyte layer is used as the cell layer to be layered, a three-dimensional tissue structure of the liver can be constructed. This three-dimensional tissue structure can be applied to a drug permeability test in vitro, and can also be applied to an animal experiment alternative model and a transplant organ. The layered cell layer can be cultured under culture conditions according to the type of cells constituting the cell layer. In culturing, for example, a medium such as D-MEM medium, MEM medium, HamF12 medium, HamF10 medium, or the like can be used. For example, when the cell culture using the cell culture carrier of the present invention is planar co-culture, it is possible to construct a three-dimensional cell tissue by further layering.
[0037]
When a hydrogel containing alginic acid is used as a carrier, the cultured cells are solubilized as a cell sheet or cell array by solubilizing the alginate gel layer of the cell culture obtained as described above. It can also be made. The solubilization treatment of the alginic acid gel layer can be performed by removing the cationic component constituting the alginic acid gel. When the cation species is a polyvalent metal ion, for example, the addition of an ion that forms a complex or hardly soluble salt with a polyvalent metal cation such as phosphoric acid, the use of an aqueous chelating agent, the reduction of the polyvalent metal ion in the medium It can be carried out by concealing polyvalent metal ions in the medium with a chelating agent. Usually, since there are many phosphate ions in a medium for cell culture, a medium from which polyvalent metal ions have been removed in advance or a medium to which 90 mol% or more of a chelating agent is added relative to the total number of moles of polyvalent metal cations The method of immersing in a cell is preferably used from the viewpoint of reducing invasion to cells. The concentration of the chelating agent is preferably 90 mol% to 10000 mol%, more preferably 90 mol% to 1000 mol%.
[0038]
The type of chelating agent is not particularly limited. , Diethylenetriaminepentaacetic acid, hydroxyethyliminodiacetic acid, 1,3-diaminopropanoltetraacetic acid, triethylenetetraminehexaacetic acid, transcyclohexanediaminetetraacetic acid, ethylenediaminetetraacetic acid (edta), glycol etherdiaminetetraacetic acid, O, O'- Bis (2-aminoethyl) ethylene glycol-N, N, N ′, N′-tetraacetic acid (egta), ethylenediaminetetrakismethylenephosphonic acid, diethylenetriaminepenta Tylene phosphonic acid, nitrilotrimethylene phosphonic acid, 1-hydroxyethylidene-1,1-diphosphonic acid, 1,1-diphosphonoethane-2-carboxylic acid, 2-phosphonobutane-1,2,4-tricarboxylic acid, 1-hydroxy-1- Examples thereof include phosphonopropane-1,3,3-tricarboxylic acid, catechol-3,5-disulfonic acid, sodium pyrophosphate, sodium tetrapolyphosphate and sodium hexametaphosphate, and particularly preferably, for example, diethylenetriaminepentaacetic acid, triethylenetetramine hexa Acetic acid, 1,3-diaminopropanoltetraacetic acid, glycol etherdiaminetetraacetic acid, hydroxyethylethylenediaminetriacetic acid, 2-phosphonobutane-1,2,4-tricarboxylic acid, 1,1-diphosphonoethane-2-carboxylic acid, nitriloto Methylenephosphonic acid, ethylenediaminetetraphosphonic acid, diethylenetriaminepentaphosphonic acid, 1-hydroxypropylidene-1,1-diphosphonic acid, 1-aminoethylidene-1,1-diphosphonic acid, 1-hydroxyethylidene-1,1-diphosphonic acid And salts thereof. Of these, edta and egta are particularly preferable.
[0039]
The solubilization treatment of the alginic acid gel layer using a chelating agent is preferably carried out by soaking the chelating agent from a porous membrane having an aqueous gel containing alginic acid formed on the surface thereof. Thereby, the porous membrane and the alginate gel layer can be easily separated, and the cell culture can be easily detached from the porous membrane. It is not necessary to completely remove the alginate gel layer by the solubilization treatment of the alginate gel layer, and the alginic acid gel layer that has not been solubilized may remain, but it is preferable that the alginate gel layer be solubilized and removed as much as possible. .
[0040]
Since the cell culture obtained by solubilizing the alginate gel layer contains a cell layer or a cell array, it can be used for layering or transferring the cell layer. In the case of cell layer stratification, the alginate gel may be solubilized after culturing in a state in which a load is applied on the cells cultured in advance, or cell cultures obtained by solubilizing the alginate gel layer May be layered. Alternatively, a cell culture obtained by solubilizing the alginate gel layer may be layered on a separately prepared cell layer. The cell type of the cell layer to be stratified may be the same or different. The number of cell layers to be stratified is not particularly limited, but is usually 1 to 10, preferably 1 to 5, and more preferably 1 to 3. When transferring the cell layer, the alginate gel may be solubilized after culturing under a load on another cell culture substrate, or cells obtained by solubilizing the alginate gel layer The culture may be transferred to other media. As a preferable layering or transferring method, there can be mentioned a method in which alginate gel is dissolved after culturing in a state where a load is applied on a cell cultured in advance or on another cell culture substrate.
[0041]
The method for culturing a cell under load is not particularly limited, and any method may be used as long as the load is sufficiently applied so that unevenness does not occur in the cell or substrate to which the cell is transferred. Here, when cells are sealed when a load is applied, they suffocate, so at least one of the transfer side or the receiving side can be made of a water-permeable gel, porous membrane, or a combination thereof. It is preferable. In addition, in order to transfer without unevenness, it is necessary to apply a load in a state where the cell surface is sufficiently covered. However, since uniform contact prevents oxygen diffusion, nonwoven fabric (nylon, polyester, stainless steel, etc.) It is preferable to apply the load without hindering the diffusion of oxygen through the like.
[0042]
The load in the culture method of the loaded cell is 0.1 g / cm 2 ~ 50g / cm 2 Good to be
Preferably, 0.5g / cm 2 -10 g / cm 2 More preferably. The time for culturing the loaded cells is not particularly limited as long as sufficient cell transfer can be realized, but is preferably 4 hours to 72 hours, more preferably 6 hours to 48 hours.
[0043]
The cell culture carrier of the present invention may be sterilized by any method, but sterilization by radiation such as electron beam, γ-ray, X-ray, ultraviolet ray is preferably used, and electron beam, γ-ray, ultraviolet ray is more preferably used. Electron beam sterilization is particularly preferred. The irradiation dose for electron beam sterilization of the present invention is preferably 0.1 kGy or more and 65 kGy or less, and particularly preferably 1 kGy or more and 40 kGy or less. Sterilization by applying high heat such as chemical sterilization such as EOG sterilization or high-pressure steam gas sterilization is not preferable because it degrades the cell adhesive layer or the alginate gel layer. The cell culture carrier thus sterilized can be stored at room temperature for a long time under aseptic conditions. The sterilization method may be carried out alone or in combination of a plurality of types, and the same type of sterilization method may be used repeatedly.
[0044]
【Example】
EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention further more concretely, the scope of the present invention is not limited to the following Example.
Example 1: Preparation of cell culture carrier
(1) Preparation of alginate hydrous gel membrane
A 5% by weight aqueous solution of sodium alginate (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was applied on a stainless steel substrate to a thickness of 500 μm, and the coating was immersed in a 0.5 mol / l calcium chloride water / methanol (volume ratio 80/20) solution. did. After the coated material was sufficiently gelled, the coated material was washed with running water. Furthermore, it dried in the state which pinched | interposed four sides so that a film | membrane may not deform | transform, and the calcium alginate hydrous gel film | membrane was obtained.
[0045]
(2) Chitosan modification
The alginic acid hydrogel membrane obtained in (1) above was immersed in a 1% by weight aqueous solution of water-soluble chitosan (manufactured by Wako Pure Chemical Industries) for 1 hour, and then washed with running water for 1 hour or more. The chitosan modified membrane was not dried and stored in water.
(3) Collagen modification
Cellmatrix IC (type I collagen aqueous solution manufactured by Nitta Gelatin Co., Ltd.) diluted with water so that the chitosan modified membrane obtained in the above (2) was 0.03 mg / ml was spotted with a tip-shaped stainless steel pin, and then running under running water for 1 hour The above was washed. Furthermore, it dried in the state which pinched | interposed four sides so that a film | membrane might not deform | transform, and obtained the calcium alginate hydrous gel film | membrane (sample 1) surface-modified with collagen in the shape of a sea island. The state of the spot at this time is shown in FIG. Sample 2 was spotted with a capillary (MICROCAPS made by Drummond Scientific, volume 5 μl).
[0046]
(4) Hyaluronic acid modification
Samples 1 and 2 were immersed in an aqueous solution of 0.1% by weight sodium hyaluronate (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Inc.) and washed for 1 hour or longer with running water. Further, the sample was dried with the four sides sandwiched so that the membrane was not deformed, and samples 3 and 4 (calcium alginate hydrogel membrane coated with collagen in a sea-island shape and covered with hyaluronic acid other than the collagen modification site) were obtained. It was.
[0047]
(5) Evaluation of collagen adhesion part
(1) Immunostaining
The sample obtained above was PBS + (10 × Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, WITHOUT Calcium Chloride, WITHOUT MAGNESIUM CHLORIDE, 100 ml of water and 899 ml of water and 100 g / l magnesium chloride hexachloride / 100 g / l magnesium chloride hexahydrate. The membrane was washed with 1 ml of an aqueous solution) and then immersed in a TBS Blotto B solution prepared according to the manual at room temperature for 2 hours. After sufficiently removing the TBS Blotto B solution, an anti-Type-I collagen rabbit antibody (manufactured by Santa Cruz Biotechnology) was applied as a primary antibody and allowed to stand for 1 hour, followed by washing with PBS +. Subsequently, perocosidase-labeled anti-rabbit antibody (Envision manufactured by DAKO) was used as the secondary antibody. + TM (Peroxidase) and left for 1 hour, and then washed with PBS +. After sufficiently removing the washing solution, the mixture was reacted with a DAB substrate solution (liquid DAB + Substrate-Cromogen System manufactured by DAKO according to the manual) under ice-cooling for 2 minutes. It turned out that the sea-island-like collagen adhesion part can be formed in all samples 1-4. The area of one independent collagen attachment is 0.05 mm for samples 1 and 3 2 , 0.8mm for samples 2 and 4 2 Met. The state of staining of sample 3 is shown in FIG.
[0048]
(2) XPS
The surface of the sample obtained above was evaluated by analyzing the chemical shift of the 1s orbital of each of the N, C, and O atoms of XPS. It was found that the parts other than the collagen spot part consisted of chitosan in samples 1 and 2 and hyaluronic acid in samples 3 and 4.
[0049]
(6) Sterilization
The carrier obtained above was subjected to UV sterilization for 3 hours and 6 types of sterilization with electron beam sterilization of 20 kGy, and no bacteria were confirmed. 5900 / m from unsterilized sample 2 Was confirmed.
[0050]
Comparative Example 1
In Example 1, when the operation up to collagen modification was performed using polyethylene terephthalate (PET) and glass instead of the alginate hydrogel, adhesion of collagen was not confirmed.
[0051]
Example 2: Modification of glass
Glass is used as a carrier, immersed in an aqueous solution of 10% by weight of 3-aminopropyltriethoxysilane (manufactured by Wako Pure Chemical Industries), left at 50 ° C. for 2 hours, and then washed with running water for 1 hour to prepare an amino group-introduced glass. did. In Example 1, the amino group-introduced glass was used instead of the alginic acid-containing gel, and the operations up to collagen modification were carried out. As a result, adhesion of collagen was confirmed.
[0052]
Example 3: Cell culture
Cells were cultured using a cell culture carrier as follows.
(1) Cells used
CHL (Chinese Hamster Lung Cell)
(2) Medium used
Eagle's minimum medium, 10% fetal bovine serum
(3) Cell culture carrier
Samples 3 and 4 of Example 1 and the cell culture carrier attached to the bottom of a polystyrene cell culture petri dish with double-sided tape were sterilized with UV, and then the medium was added and immersed for 5 minutes. The culture medium was infiltrated into the cell culture carrier by allowing the medium to stand overnight. The same operation was performed using only a petri dish for cell culture made of polystyrene as a comparative example.
[0053]
(4) Cell seeding
Cells cultured in advance were collected by trypsin treatment, and the cell concentration was adjusted to 50000 cells / ml. After discarding the cell and the medium in the petri dish, the cell solution was treated with a cell count of 10,000 cells / cm. 2 Inoculated in a petri dish so that the medium was added.
(5) Culture
CO 2 The cells were cultured at 37 ° C. for 2 days using an incubator.
[0054]
(6) Results
None of the samples had problems with cell adhesion, peeling of cell culture carrier, and cytotoxicity. For samples 3 and 4 of Example 1, cells were cultured in a sea-island shape only at the collagen adhesion part, and a cell array was formed.
[0055]
Test example: Adsorption evaluation on calcium alginate, chitosan and collagen
Cellmatrix IC (type I collagen aqueous solution manufactured by Nitta Gelatin Co., Ltd.) prepared by diluting the calcium alginate hydrogel prepared in Example 1, the chitosan-modified calcium alginate hydrogel, and the chitosan-modified calcium alginate hydrogel to 0.03 mg / ml with water The collagen-modified gel prepared by rinsing with water and then rinsing with water was immersed in 0.1% by weight aqueous solutions of collagen, chitosan, sodium hyaluronate, and sodium alginate, washed with water, and the adsorptivity was evaluated by XPS. The results are shown in Table 1. All the polymer compounds evaluated adhered on the chitosan, and all the polymer compounds evaluated did not adhere on the collagen.
[0056]
[Table 1]
【The invention's effect】
A cell array can be easily formed by culturing cells using the cell culture carrier of the present invention.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a view showing a state where a cell adhesion polypeptide (collagen) is spotted on a carrier surface to form a sea-island-like modified site.
FIG. 2 is a diagram showing the result of immunostaining a sea-island-like collagen modification site formed on a carrier surface.
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