JP2004016117A

JP2004016117A - FUSED PROTEIN HAVING beta1,3-GALACTOSYLTRANSFERASE ACTIVITY AND METHOD FOR PRODUCING THE SAME

Info

Publication number: JP2004016117A
Application number: JP2002176132A
Authority: JP
Inventors: Kazunori Inamori; 稲森　和紀; Shigeo Shibatani; 柴谷　滋郎; Shusaku Yanagiya; 柳谷　周作; Izumi Inohara; 猪原　泉
Original assignee: Toyobo Co Ltd
Current assignee: Toyobo Co Ltd
Priority date: 2002-06-17
Filing date: 2002-06-17
Publication date: 2004-01-22

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To inexpensively and efficiently supply β1,3-galactosyltransferase. <P>SOLUTION: The fused protein is obtained by fusing a sugar-binding protein, especially a maltose-binding protein with β1,3-galactosyltransferase. The DNA encoding the fused protein and the vector containing the DNA are also provided. The transformant is transformed by the vector. The β1,3-galactosyltransferase is efficiently produced by expressing the protein as the fused protein in Escherichia coli. <P>COPYRIGHT: (C)2004,JPO

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、糖転移酵素の一つであるβ１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を有する融合蛋白質及びその製造方法に関する。より具体的には、マルトース結合性蛋白質（以下、ＭＢＰと略することもある）とβ１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ蛋白質との融合蛋白質及びその製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
種々の単糖がグリコシド結合により連結した糖鎖は、細胞において、細胞内オルガネラ成分、細胞表層成分、分泌糖蛋白質成分などとして存在している。これら糖鎖の構造は、生物種や組織特異的に異なっているが、同一生物種や同一組織内でもその発生時期や疾病等によっても異なることから、従来考えられていた蛋白質の熱安定性、親水性、電荷、プロテアーゼ耐性等の蛋白質に対する物理的性質の付与といった機能の他に、発生・分化、神経系、免疫系、ガンの転移等の細胞間認識に糖鎖が関与していることが明らかになり、医薬品等の種々の分野への応用という点から近年非常に注目されるようになった。
【０００３】
これら糖鎖は、生体内においては糖転移酵素によって合成されている。糖転移酵素は、糖ヌクレオチドを糖供与体として、受容体となる糖鎖に糖を転移し、糖鎖伸長を行う酵素であり、また、その糖受容体の糖鎖構造に対する特異性は厳密であり、通常、１つのグリコシド結合は対応する１つの糖転移酵素によって形成されると言われている。これら糖転移酵素は、糖鎖研究、特に有用糖鎖の簡便な合成、天然の糖鎖の修飾に利用されるという点で重要な酵素である。しかしながら、天然に存在する糖転移酵素の量は極僅かであり、大量且つ安定に供給することは事実上困難であった。
【０００４】
糖転移酵素の中でも、β１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ（以下、β１，３ＧａｌＴと示すこともある。）は、ＵＤＰ−Ｇａｌからのガラクトースをβ１，３結合で転移する糖転移酵素であり、これまでに種々のタイプのものが報告されている。なかでも、β１，３ＧａｌＴ−Ｖは、特開２０００−２４５４６４号公報において記載されているように、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ構造を有する、ルイス式血液型抗原やガン関連糖鎖抗原の骨格を構成するタイプＩ糖鎖の合成に関与する得に重要な酵素であり、安定した供給が強く望まれていたものの一つである。β１，３ＧａｌＴ−Ｖは、ヒト由来のものが、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２７４巻、第１８号、第１２４９９〜１２５０７頁（１９９９年）において報告されている。
しかしながら、これまでは大量且つ安定した細胞の確保が困難であることや、単一の酵素に精製するとなれば非常に手間を要することから、遺伝子組換え技術によるβ１，３ＧａｌＴの生産が要望されている。上述したβ１，３ＧａｌＴ−Ｖをコードする遺伝子は、例えばヒト大腸がん細胞であるＳＷ１１１６細胞より単離されたものが報告されている。
【０００５】
組換え蛋白質の大量生産には、コスト的な点を考慮すれば、細菌や酵母などの微生物に発現させる方法が有利である。しかしながら、微生物の発現系では、発現した蛋白質の多くが不溶性の封入体（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ　ｂｏｄｙ）として存在することがあり、精製に際して可溶化・再生（ｒｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）の工程を必要とするので、効率的とは言えなかった。さらに、一部可溶性蛋白質として発現した酵素についても、高純度に得るためには、各種クロマトグラフィ処理を含む多くの精製工程が必要であり、多大な時間及びコストがかかるために、商業的生産用の発現系としては十分ではなかった。
【０００６】
一方、目的とする遺伝子を大量に発現させ、且つ発現産物の精製を容易にする方法として、目的蛋白質をグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）やプロテインＡなどとの融合蛋白質として発現させる方法がある。これらの方法では、ＧＳＴとの融合蛋白質はグルタチオンをリガンドとするアフィニティカラムクロマトグラフィにより、また、プロテインＡとの融合蛋白質はＩｇＧをリガンドとするアフィニティカラムクロマトグラフィにより、それぞれ容易に精製することができる。しかしながら、この方法を用いた場合、前記と同様に、封入体を生成する可能性が高い。このような理由から、β１，３ＧａｌＴを大量且つ安定に供給することは事実上困難であった。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、本発明は、β１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼを安価に且つ効率的に供給せしめることを目的とするものである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上述したような事情に鑑み、鋭意研究を重ねた結果、遺伝子組換え技術により、β１，３ＧａｌＴを糖結合性蛋白質との融合蛋白質として宿主に発現させると、β１，３ＧａｌＴを可溶性蛋白質として得ることができ、さらに該糖結合性蛋白質の特異的親和性を利用したアフィニティクロマトグラフィにより容易に精製することが可能であり、得られた融合蛋白質がβ１，３ＧａｌＴの活性を有していることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
項１．結合性蛋白質とβ１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼとの組換え融合蛋白質。
項２．１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼが糖鎖の非還元末端に存在するＮ−アセチルグルコサミン残基にβ１，３結合によりガラクトースを転移する活性を有する項１記載の組換え融合蛋白質。
項３．１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼがＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃの非還元末端に存在するＮ−アセチルグルコサミン残基若しくはＮ−アセチルグルコサミン単糖にβ１，３結合によりガラクトースを転移する活性を有する項１記載の組換え融合蛋白質。
項４．１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼがヒト由来である項１〜３のいずれかに記載の組換え融合蛋白質。
項５．１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼが、（ａ）または（ｂ）に記載される蛋白質である項１〜４のいずれかに記載の組換え融合蛋白質。
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質
（ｂ）（ａ）において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、β１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質
項６．結合性蛋白質がマルトース結合性蛋白質である項１〜５のいずれかに記載の組換え融合蛋白質。
項７．結合性蛋白質とβ１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼとの間にプロテアーゼ認識配列を含む項１〜６のいずれかに記載の組換え融合蛋白質。
項８．ロテアーゼが血液凝固第Ｘａ因子である項７記載の組換え融合蛋白質。
項９．１〜８のいずれかに記載の組換え融合蛋白質をコードするＤＮＡ。
項１０．項９記載のＤＮＡを含んでなるベクター。
項１１．項１０記載のベクターにより形質転換された形質転換体。
項１２．以下の工程（Ａ）〜（Ｃ）を含むことを特徴とする項１〜８のいずれかに記載の組換え融合蛋白質の製造方法。
（Ａ）大腸菌で機能し得るプロモーターの制御下に、糖結合性蛋白質をコードするＤＮＡとβ１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡを、該両蛋白質の融合蛋白質として発現するように連結した発現ベクターを用いて、大腸菌を形質転換し、
（Ｂ）得られた形質転換体を培養して、糖結合性蛋白質とβ１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼとの融合蛋白質を生成させ、
（Ｃ）得られた培養物から、該融合蛋白質を分離する
項１３．糖結合性蛋白質がマルトース結合性蛋白質である項１２記載の組換え融合蛋白質の製造方法。
項１４．マルトース結合性蛋白質をコードするＤＮＡが、ｐＭＡＬ−ｐ２もしくはｐＭＡＬ−ｃ２に由来する項１３記載の組換え融合蛋白質の製造方法。
項１５．項１２〜１４のいずれかに記載の方法により得られる融合蛋白質から、糖結合性蛋白質部分を除去してβ１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼを採取する工程を含む、β１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼの製造方法。
項１６．糖結合性蛋白質部分の除去に際してプロテアーゼを用いる項１５記載のβ１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼの製造方法。
項１７．プロテアーゼが血液凝固第Ｘａ因子である項１６記載のβ１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼの製造方法。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を具体的に説明する。
本発明は、β１，３ＧａｌＴ活性を有する蛋白質を、β１，３ＧａｌＴと糖結合性蛋白質との融合蛋白質としたこと、該融合蛋白質は可溶性蛋白質であることを特徴とする。
さらに、本発明は、β１，３ＧａｌＴを糖結合性蛋白質との融合蛋白質として大腸菌に発現させることにより、β１，３ＧａｌＴを可溶性融合蛋白質として生成させることを可能としたこと、並びに、糖結合性蛋白質の有する特異的親和性を利用することにより、融合蛋白質及びβ１，３ＧａｌＴを容易且つ大量に精製することを可能ならしめたことを特徴とするものである。
【００１１】
本発明において、糖結合性蛋白質とは、糖もしくは糖残基を有する少糖類及び多糖類に対して高い親和性を保持する蛋白質である。該糖結合性蛋白質は、いかなる生物種に由来するものであってもよいが、好ましくは細菌等の原核生物に由来するものであり、より好ましくは大腸菌に由来するものである。
具体的には、各種レクチン、マルトース結合性蛋白質、セルロース結合性蛋白質、キチン結合性蛋白質などが例示される。なかでも、マルトース結合性蛋白質（以下、ＭＢＰと示すこともある。）が特に好ましい。
【００１２】
ＭＢＰは、マルトース又はマルトース残基を有する少糖類（例えば、マルトトリオース等）もしくは多糖類（例えば、アミロース等）に対して特異的親和性を有する部位を有していれば、必ずしもその全配列を含む必要はなく、該配列の一部を含むものであってもよい。したがって、公知のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された配列からなり、マルトース又はマルトース残基を有する少糖類（例えば、マルトトリオース等）もしくは多糖類（例えば、アミロース等）に対して特異的親和性を有する部位を有する蛋白質も、本発明におけるＭＢＰに含めることができる。
【００１３】
本発明において、ＭＢＰをコードする遺伝子としてはその由来は特に限定されるものではないが、ｐＭＡＬ−ｐ２もしくはｐＭＡＬ−ｃ２（いずれも、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ製）に由来するものが挙げられる。
【００１４】
本発明における糖結合性蛋白質は、そのＣ末端側に配列特異性の高いプロテアーゼにより認識され切断されるアミノ酸配列を含むことが特に好ましい。該プロテアーゼとしては、血液凝固第Ｘａ因子（以下、Ｆａｃｔｏｒ　Ｘａと示すこともある。）、トロンビン、レニン等を例示することができるが、好ましくはＦａｃｔｏｒ　Ｘａ認識配列、すなわち、Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（配列番号３）である。こうしたプロテアーゼ認識配列を糖結合性蛋白質のＣ末端側に導入することにより、例えば、ＭＢＰ融合β１，３ＧａｌＴ（以下、ＭＢＰ−β１，３ＧａｌＴと示すこともある。）の精製後に、上記のようなプロテアーゼを作用させることによりＭＢＰ部分を容易に除去することも可能である。
【００１５】
また、より好ましい態様としては、糖結合性蛋白質は、糖結合蛋白質部位とプロテアーゼ認識部位の間に、５〜１５アミノ酸残基程度のスペーサー配列を含むものが挙げられる。該スペーサー配列の存在により、糖結合性蛋白質はβ１，３ＧａｌＴから遠ざかるために融合蛋白質における分子内相互作用の可能性が減じ、ＭＢＰ−β１，３ＧａｌＴ融合蛋白質の場合、ＭＢＰ部分のマルトースやアミロースに対する特異的親和性が増大する。本発明においては、配列番号７のスペーサー配列を含むｐＭＡＬ−ｐ２もしくはｐＭＡＬ−ｃ２（いずれも、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ製）を用いることができる。
【００１６】
本発明において、β１，３ＧａｌＴは、糖鎖の非還元末端に存在するＮ−アセチルグルコサミン残基にβ１，３結合によりガラクトースを転移する活性を有するものが好ましい。また、ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃの非還元末端に存在するＮ−アセチルグルコサミン残基若しくはＮ−アセチルグルコサミン単糖にβ１，３結合によりガラクトースを転移する活性を有するものが好ましい。すなわち、上述したβ１，３ＧａｌＴ−Ｖであることが特に好ましいが、ＵＤＰ−Ｇａｌからのガラクトースをβ１，３結合で転移する反応を触媒するものであれば限定されるものではなく、広く種々のいかなるβ１，３ＧａｌＴにも適用することが可能である。β１，３ＧａｌＴ−Ｖ以外のものとして、例えば、β１，３ＧａｌＴ−Ｉ、β１，３ＧａｌＴ−ＩＩ、β１，３ＧａｌＴ−ＩＩＩ、β１，３ＧａｌＴ−ＩＶ等が挙げられる。
【００１７】
β１，３ＧａｌＴについては、いかなる生物種に由来するものであってもよいが、好ましくは哺乳動物由来、より好ましくはヒト由来である。また、本発明においては、β１，３ＧａｌＴは、その活性を保持する限りにおいては必ずしもβ１，３ＧａｌＴ全長配列を含む必要はなく、該配列の一部を含むものであってもよい。例えば、（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質や、（ｂ）（ａ）において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、β１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質であってもよい。
【００１８】
本発明において、糖結合性蛋白質−β１，３ＧａｌＴは、糖結合性蛋白質をコードするＤＮＡと、β１，３ＧａｌＴをコードするＤＮＡを、結果的に上記の性質を有する融合蛋白質として翻訳されるように、すなわち、イン・フレームに（ｉｎ　ｆｒａｍｅ）連結したキメラＤＮＡを含む発現ベクターにより宿主細胞を形質転換し、得られた形質転換体を適当な培地中で培養することにより取得される。
【００１９】
β１，３ＧａｌＴをコードするＤＮＡは、公知の遺伝子配列（例えば、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２７４巻、第１８号、第１２４９９〜１２５０７頁（１９９９年）など）の配列等に基づいて、公知のいかなる手法によっても調製することができる。例えば、公知のβ１，３ＧａｌＴ遺伝子配列を基に、β１，３ＧａｌＴのコード領域の全部又は一部をカバーする適当なオリゴヌクレオチドプライマー対を合成し、β１，３ＧａｌＴを発現する細胞又は組織から抽出した全ＲＮＡ若しくはポリＡ^＋ＲＮＡあるいは染色体ＤＮＡを鋳型としてＲＴ−ＰＣＲ又はＰＣＲを行うことによりクローニングすることが可能である。この際、その後のベクターへのクローニングを容易にするために、用いるオリゴヌクレオチドプライマーの末端に適当な制限酵素認識配列を付加してもよい。
【００２０】
あるいは、公知のβ１，３ＧａｌＴ遺伝子配列を基に適当なオリゴヌクレオチドプローブを合成し、これを用いてβ１，３ＧａｌＴを発現する細胞若しくは組織から常法により調製されたｃＤＮＡライブラリーをプラーク（又はコロニー）ハイブリダイゼーションによりスクリーニングすることによってもクローニングをすることができる。
【００２１】
さらに、β１，３ＧａｌＴをコードするＤＮＡは、部分又は完全精製されたβ１，３ＧａｌＴの全部又は一部を抗原として常法により調製されたｃＤＮＡライブラリーを抗体スクリーニングすることによってもクローニングをすることができる。
【００２２】
あるいは、当該ＤＮＡは、公知のβ１，３ＧａｌＴ遺伝子配列を基にＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成装置を用いて、センス鎖の部分配列とアンチセンス鎖の部分配列を一部がオーバーラップするように合成し、ＰＣＲによってより長い部分配列を二本鎖ＤＮＡとして得るという操作を繰り返すことによって、所望のＤＮＡ配列を得ることもできる。
【００２３】
本発明において、β１，３ＧａｌＴをコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号２に示されるアミノ酸配列の全て若しくは一部をコードする塩基配列を含むＤＮＡ、好ましくは配列番号１に示される塩基配列の全て若しくは一部を含むＤＮＡが挙げられる。
【００２４】
ところで、大腸菌に由来するＭＢＰは、ペリプラズムに存在する分泌蛋白質であり、初期翻訳産物はそのＮ末端にシグナルペプチドを含む。本発明のＭＢＰをコードするＤＮＡは、宿主大腸菌で機能し得るシグナルペプチドをコードする塩基配列（シグナルコドン）を含むものであってもよい。大腸菌は細胞壁の外側に外膜を有するグラム陰性細菌であるから、ＭＢＰをコードするＤＮＡがシグナルコドンを含む場合があっても、発現したＭＢＰ−β１，３ＧａｌＴが培地中にまで分泌される可能性は低い。しかしながら、ＭＢＰ−β１，３ＧａｌＴがペリプラズム空間に蓄積すれば、菌体を完全に破砕せずにスフェロプラスト化することにより該融合蛋白質を回収することができるので、その後の精製を容易に行うことができる。但し、この場合には、特にβ１，３ＧａｌＴの膜貫通ドメインを削除しておくことが好ましい。該ドメインが存在すると、ＭＢＰ−β１，３ＧａｌＴはペリプラズム空間に到達せずに内膜に留まる可能性があり、該融合蛋白質の回収が困難になる。
【００２５】
本発明において、ＭＢＰをコードするＤＮＡは、該蛋白質のＣ末端側に配列特異性の高いプロテアーゼにより認識され切断されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むことが特に好ましい。該プロテアーゼとしては、血液凝固第Ｘａ因子（Ｆａｃｔｏｒ　Ｘａ）、トロンビン、レニン等を例示することができるが、好ましくはＦａｃｔｏｒ　Ｘａ認識配列、すなわち、Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（配列番号３）である。このようなプロテアーゼ認識配列を糖結合性蛋白質のＣ末端側に導入することにより、例えば、ＭＢＰ融合β１，３ＧａｌＴ（以下、ＭＢＰ−β１，３ＧａｌＴと示すこともある。）の精製後に、上記のようなプロテアーゼを作用させることによりＭＢＰ部分を容易に除去することができる
【００２６】
より好ましい態様としては、糖結合性蛋白質をコードするＤＮＡは糖結合性蛋白質コード領域とプロテアーゼ認識部位の間に５〜１５アミノ酸残基程度のスペーサー配列をコードする塩基配列を含む。該スペーサー配列の存在により、糖結合性蛋白質はβ１，３ＧａｌＴから遠ざかるために融合蛋白質の分子内相互作用の可能性が減じ、ＭＢＰ−β１，３ＧａｌＴ融合蛋白質の場合、ＭＢＰ部分のマルトースやアミロースに対する特異的親和性が増大する。
【００２７】
ＭＢＰをコードするＤＮＡは、公知のＭＢＰ遺伝子配列（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２５９巻、第１０６０６〜１０６１３頁（１９８４年）等）を基に、β１，３ＧａｌＴをコードするＤＮＡについて例示したと同様の公知の手法を用いてクローニングすることができ、また、常法によりＭＢＰのＣ末端側に上記のプロテアーゼ認識配列及びスペーサー配列を導入することができる。本発明においては、配列番号６のスペーサー配列を含むことが好ましい。
【００２８】
大腸菌由来のＭＢＰをコードするＤＮＡは、例えば、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂ社製のｐＭＡＬｐ２（シグナルコドンを含む）、若しくはｐＭＡＬｃ２（シグナルコドンを欠失する）のような市販のベクターから得ることも可能である。
【００２９】
糖結合性蛋白質とβ１，３ＧａｌＴとの融合蛋白質（以下、糖結合性蛋白質−β１，３ＧａｌＴと示すこともある）をコードするキメラＤＮＡの構築を容易にするために、糖結合性蛋白質をコードするＤＮＡの末端に、常法により適当な制限酵素認識部位を付加することができる。β１，３ＧａｌＴをコードするＤＮＡをベクター中にクローニングする際に、β１，３ＧａｌＴのＮ末端側に制限酵素認識部位を付加した場合は、糖結合性蛋白質をコードするＤＮＡにも同じ制限酵素認識部位（若しくは同じ粘着末端を生じる別の制限酵素認識部位）を導入すればよい。
【００３０】
本発明の発現ベクターは、上記の糖結合性蛋白質−β１，３ＧａｌＴをコードするキメラＤＮＡが、大腸菌で機能し得るプロモーターの制御下におかれた、任意の発現ベクターである。該プロモーター領域には、ＲＮＡポリメラーゼの結合位置を決定するコンセンサス配列である−３５領域及び−１０領域が含まれる。所望の組換え蛋白質を大量に発現させる系として、誘導酵素のプロモーター領域を使用することがより好ましい。このようなプロモーター領域として、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｔａｃプロモーター等が挙げられる。これらのプロモーター領域は、リプレッサー蛋白質が結合するオペレーターをさらに含む。誘導物質（例えば、ｌａｃプロモーターではラクトースやＩＰＴＧ）を添加するとリプレッサー蛋白質のオペレーターへの結合が抑制され、プロモーターの制御下におかれた遺伝子が大量に発現する。また、該発現ベクターは、翻訳開始コドンの上流にコンセンサスなＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ（ＳＤ）配列を含む。さらに、該発現ベクターは、糖結合性蛋白質−β１，３ＧａｌＴをコードするキメラＤＮＡの下流に転写終結シグナル、すなわちターミネーター領域を含有する。ターミネーター領域としては、通常使用されている天然又は合成のターミネーターを用いることができる。本発明の発現ベクターは、上記のプロモーター領域及びターミネーター領域に加えて、宿主大腸菌内で自律複製し得る複製起点を含む必要がある。このような複製起点としては、ＣｏｌＥｌ　ｏｒｉ、Ｍ１３　ｏｒｉ等が挙げられる。
【００３１】
本発明の発現ベクターは、形質転換体選択のための選択マーカー遺伝子をさらに含有していることが好ましい。選択マーカー遺伝子としては、テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン等の各種薬剤に対する耐性遺伝子を用いることができる。また、宿主大腸菌が栄養要求性変異株の場合には、選択マーカー遺伝子として当該栄養要求性を相補する野生型遺伝子を用いることもできる。
【００３２】
本発明の形質転換体は、本発明の発現ベクターで宿主細胞を形質転換することにより調製することができる。宿主細胞は、特に限定されるものではなく、大腸菌、枯草菌、酵母、動物細胞、植物細胞など一般的に用いられているものであれがいずれも用いることができるが、なかでも、大腸菌が特に好ましい。大腸菌の場合、その菌株は特に限定されず、例えば、市販のＸＬ１−Ｂｌｕｅ株、ＢＬ−２１株、ＪＭ１０７株、ＴＢ１株、ＪＭ１０９株、Ｃ６００株、ＤＨ５α株、ＨＢ１０１株等が挙げられる。
【００３３】
発現ベクターの宿主細胞への導入は、従来公知の方法を用いて行うことができる。例えば、Ｃｏｈｅｎらの方法（塩化カルシウム法；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　第６９巻、第２１１０頁（１９７２年））、プロトプラスト法（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．　第１６８巻、第１１１頁（１９７９年））、コンピテント法（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．　第５６巻、第２０９頁（１９７１年））、エレクトロポレーション法などが挙げられる。
【００３４】
糖結合性蛋白質−β１，３ＧａｌＴは、上記キメラＤＮＡを含む発現ベクターを発現する形質転換体を、適当な培地中で培養し、得られる培養物から糖結合性蛋白質−β１，３ＧａｌＴを回収することにより得ることができる。
【００３５】
用いられる培地としては、炭素源としてグルコース、フルクトース、グリセロール、スターチなどの炭水化物を含有するものである。また無機もしくは有機窒素源（例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、カゼインの加水分解物、酵母抽出物、ポリペプトン、バクトトリプトン、ビーフ抽出物等）を含んでいてもよい。これらの炭素源及び窒素源は、純粋な形で使用する必要はなく、純度の低いものも微量の生育因子や無機栄養素を豊富に含んでいるので有利である。さらに所望により、他の栄養源（例えば、無機塩（例えば、二リン酸ナトリウム又は二リン酸カリウム、リン酸水素二カリウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシウム）、ビタミン類（例えば、ビタミンＢ１）、抗生物質（例えば、アンピシリン、カナマイシン）など）を培地中に添加してもよい。
【００３６】
形質転換体の培養は、通常ｐＨ５．５〜８．５、好適には６〜８、通常１８〜４０℃、好適には２０〜３５℃で１〜１５０時間行われるが、これらは培養条件及び培養規模により適宜変更することができる。
【００３７】
培養を大型タンク内で行う場合は、目的蛋白質の生産工程における生育遅延を回避するために、菌体を少量の培地に接種して１〜２４時間前培養した後、得られた種培養を大型タンク中に接種するのが好ましい。
【００３８】
糖結合性蛋白質−β１，３ＧａｌＴが、誘導蛋白質遺伝子のプロモーター系により制御される場合、誘導物質は培養開始時から添加しておいてもよいが、対数増殖期初期に添加するのがより好ましい。菌の増殖は、培養液の６６０ｎｍにおける吸光度を測定することによってモニタリングできる。例えば、ｌａｃプロモーターやｔａｃプロモーターを使用する場合、６６０ｎｍにおける吸光度が０．４〜０．６になった時点で、誘導物質としてイソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド（以下、ＩＰＴＧと示す）を、例えば０．１〜１．０ｍＭとなるように添加することができる。誘導物質の添加時期や添加速度は、培養条件、培養規模、誘導物質の種類等によって適宜変更することができる。
【００３９】
本発明の方法では、糖結合性蛋白質−β１，３ＧａｌＴの精製は、該融合蛋白質の存在する画分を、その糖結合性蛋白質と特異的に結合する各種糖残基を含むリガンドを結合した不溶性担体を用いたアフィニティクロマトグラフィに供することにより、一段階で容易に達成することができる。また。リガンドとして該糖結合性蛋白質に特異的な抗体（モノクロナール抗体若しくはポリクロナール抗体）を用いてもよい。
【００４０】
例えば、該糖結合性蛋白質がＭＢＰの場合、ＭＢＰをコードするＤＮＡがシグナルコドンを欠失している場合、ＭＢＰ−β１，３ＧａｌＴは菌体の可溶性画分に局在するので、その場合、培養終了後に培養物を濾過もしくは遠心分離して菌体を回収し、リゾチーム処理及び界面活性剤処理、超音波処理、あるいは浸透圧ショック等によって細胞を破砕して、得られる菌体抽出液をアフィニティクロマトグラフィに用いる。
【００４１】
一方、ＭＢＰをコードするＤＮＡがシグナルコドンを有する場合、発現したＭＢＰ−β１，３ＧａｌＴは分泌されてペリプラズム空間に蓄積している可能性が高い。したがって、その場合、リゾチーム処理等によって菌体をスフェロプラスト化してＭＢＰ−β１，３ＧａｌＴを溶液中に遊離させ、濾過もしくは遠心分離して菌体を除去した後、得られる上清をアフィニティクロマトグラフィに用いる。
【００４２】
本発明において、糖結合性蛋白質−β１，３ＧａｌＴ含有画分は、２価金属イオンの存在下上記精製を行うのが好ましい。具体的には、培養終了後２価金属イオンの存在下で、培養物から菌体を集め、菌体破砕等を行って、糖結合性蛋白質−β１，３ＧａｌＴ含有画分を得るのがよい。２価金属としては、マンガン、マグネシウムなどが例示されるが、好ましくはマンガンである。
【００４３】
アフィニティクロマトグラフィの吸着体としては、例えばＭＢＰの場合には、アミロースをアガロースビーズに固定化したアミロース樹脂（例えば、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂ社製Ａｍｙｌｏｓｅ　ｒｅｓｉｎ　ｃｏｌｕｍｎ等）を使用することができるが、他のＭＢＰに対するリガンド及び他の不溶性マトリックス基（例えば、セルロース、デキストラン、合成ポリマー等）を使用してもよい。
【００４４】
糖結合性蛋白質−β１，３ＧａｌＴは上記のように調製されたそれを含む画分に該吸着体を加えて適当な時間攪拌した後、濾過して、吸着体を洗浄し、さらに適当な濃度の糖結合性蛋白質と吸着体の結合を阻害する糖（例えばＭＢＰの場合には、マルトース）を含む溶離液を加えて適当な時間攪拌した後濾過することにより、濾液中に精製される。あるいは、該吸着体をカラムに充填して糖結合性蛋白質−β１，３ＧａｌＴ画分をアプライし、適当な緩衝液で洗浄した後、適当な濃度の上記溶離液をアプライしてカラムに吸着した糖結合性蛋白質−β１，３ＧａｌＴを溶出させることにより得ることもできる。このようにして得られた糖結合性蛋白質−β１，３ＧａｌＴは、β１，３ＧａｌＴ活性を有するので、このまま酵素として使用することができる。
【００４５】
上述のように、本発明の好ましい態様においては、糖結合性蛋白質−β１，３ＧａｌＴはその融合部位に配列特異的なプロテアーゼによって認識切断されるアミノ酸配列を含むので、上記のようにして精製された糖結合性蛋白質−β１，３ＧａｌＴに、該プロテアーゼを作用させることにより糖結合性蛋白質部分が除去されて、所望のβ１，３ＧａｌＴが生成する。好ましくは、該プロテアーゼは血液凝固第Ｘａ因子（Ｆａｃｔｏｒ　Ｘａ）である。本発明においては、配列番号３のＦａｃｔｏｒ　Ｘａ認識配列を含むｐＭＡＬ−ｐ２若しくはｐＭＡＬ−ｃ２（いずれも、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ製）を使用することができる。糖結合性蛋白質−β１，３ＧａｌＴにプロテアーゼを作用させる際の反応温度、溶液のｐＨ、反応時間等は、用いるプロテアーゼの種類に応じて適宜選択することができるが、例えばＦａｃｔｏｒ　Ｘａの場合、中性緩衝液中、４〜４０℃で１〜２５時間反応させることにより、糖結合性蛋白質とβ１，３ＧａｌＴとを開裂させることができる。反応終了後、反応液に上記の吸着体を加えて適当な時間攪拌することにより、遊離した糖結合性蛋白質のみが該吸着体に吸着するので、該吸着体を濾過することによりβ１，３ＧａｌＴのみを精製することができる。あるいは、該吸着体を充填したカラムに反応液をアプライして素通り画分を回収することによってもβ１，３ＧａｌＴを精製することができる。
【００４６】
【実施例】
以下、実施例を挙げることにより、本発明をより具体的に説明する。なお、本発明は実施例に特に限定されるものではない。
【００４７】
実施例１：ＰＣＲによるβ１，３ＧａｌＴ−Ｖ　ｃＤＮＡ断片の取得
まず、ＳＷ１１１６細胞（ＡＴＣＣより入手）を、１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ培地にて培養し、２０ｍｌの培養液から細胞を遠心分離により集め、ＰＢＳで２回遠心洗浄を行った。得られた細胞塊から、ＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ（キアゲン製）を用いて全ＲＮＡを抽出した。Ｔ−２５フラスコ１枚に換算して３５．４ｇの収率であった。この全ＲＮＡから、ＲＴ−ＰＣＲ　ｈｉｇｈ（東洋紡績製）を用いて一本鎖ｃＤＮＡを調製した。条件は、７０℃で１０分の処理後、３０℃・１０分、４２℃・３０分、９９℃・５分で行った。
【００４８】
配列番号１に記載のヒトβ１，３ＧａｌＴ−ＶのｃＤＮＡの塩基配列を基に、配列番号４及び５に示されるオリゴヌクレオチドを合成した。前者は配列番号１に示される塩基配列の塩基番号７９〜１０５で示される塩基配列であり、ＢａｍＨＩの認識部位を付加している。後者は配列番号１に示される塩基配列の塩基番号９１３〜９３３で示される塩基配列に対するアンチセンス配列であり、ＢａｍＨＩの認識部位を付加している。これらのオリゴヌクレオチドをプライマー対として用いて、ＫＯＤ　ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績製）を用いて、上記一本鎖ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ（９８℃・３０秒、５８℃・３０秒、７４℃・３０秒を４サイクル後、９８℃・３０秒、６８℃・３０秒、７４℃・３０秒を２８サイクル）を行った。このＰＣＲ産物を１．５％アガロース電気泳動に供したところ、目的遺伝子と同サイズである約９００ｂｐのＤＮＡ断片を得ることができた。
【００４９】
得られた上記ＤＮＡ断片を、ＱＩＡ　Ｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（キアゲン製）を用いて精製し、さらにＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ　Ａｍｐ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（寶酒造製）を用いて、このＤＮＡ断片の末端平滑化、ｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ　Ａｍｐ　ＳＫ（＋）ベクターへの挿入を行い、大腸菌ＤＨ５α株を形質転換し、５０μｇ／ｍｌのアンピシリン、ＩＰＴＧ、Ｘ−ｇａｌを含むＬＢ寒天培地で選抜した。
得られた白色コロニーより該ＤＮＡ断片を保持するプラスミドを調製した。プラスミド調製は、ＱＩＡ　ｐｒｅｐ　Ｓｐｉｎ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｋｉｔ（キアゲン製）を用いて行った。該ＤＮＡ断片の塩基配列を、Ｔ３プライマー及びＴ７プライマーをシーケンシング用プライマーとしてシーケンス反応を行い、オートシーケンサー（ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ３１０；Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ａｎａｌｙｚｅｒ；アプライドバイオシステムズ製）を用いて常法により決定した。その結果、所望の遺伝子がクローニングできたことが確認された。
【００５０】
実施例２：発現ベクターの構築
上記のように、目的遺伝子の挿入が確認できた形質転換体を培養し、ＱＩＡ　ｐｒｅｐＳｐｉｎ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｋｉｔ（キアゲン製）を用いてプラスミドの抽出を行った。このプラスミドを、ＢａｍＨＩで３７℃、２時間処理した後、１．５％アガロース電気泳動に供し、目的遺伝子を含むＤＮＡ断片を切り出して、ＱＩＡ　Ｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（キアゲン製）を用いて精製した。一方、ベクターであるｐＭＡＬｃ２（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂ社製）についても、ＢａｍＨＩで３７℃、２時間処理した後、１．５％アガロース電気泳動に供し、同様に精製を行った。上記ＤＮＡ断片と制限酵素処理した上記ベクターをＬｉｇａｔｉｏｎ　Ｈｉｇｈ（東洋紡績製）を用いて、１６℃、１時間のライゲーション反応を行った。さらに、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地で選抜した。得られたコロニーをさらに液体培養して、ＱＩＡ　ｐｒｅｐ　Ｓｐｉｎ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｋｉｔ（キアゲン製）を用いてプラスミドの抽出を行った。インサート確認、その方向確認をそれぞれ、プラスミドをＢａｍＨＩ、ＰｓｔＩで処理することにより行い、正しい方向に目的遺伝子を含むＤＮＡ断片の挿入されているプラスミドを得た。
【００５１】
実施例３：組換え大腸菌によるＭＢＰ−β１，３ＧａｌＴ−Ｖの調製
上記発現ベクターにより形質転換されたクローン１白金耳を５０μｇ／ｍｌのアンピシリン、０．２％グルコースを含むＬＢ液体培地１０ｍｌ中にて、３７℃で終夜培養を行い、さらにこの培養液２５０μｌを、同培地２５ｍｌに接種して３７℃、４時間の培養を行い、２５℃に温度を下げた後、０．３Ｍ　ＩＰＴＧ２５μｌを加えて、終夜培養を行った。菌体を遠心分離により集め、緩衝液（１００ｍＭ　ＭＥＳ（ｐＨ６．５）−２０ｍＭ　ＭｎＣｌ_２−５０ｍＭ　ＮａＣｌ−１ｍＭ　２−メルカプトエタノール）８０μｌ（培養液１ｍｌ分あたり）で懸濁した。この懸濁液を３０分間の超音波処理を行い、１４０００ｒｐｍで１０分間、４℃で遠心分離を行い、その培養上清を酵素溶液とした。この酵素溶液についてウエスタンブロッティングを行ったところ、ＭＢＰ−β１，３ＧａｌＴ−Ｖと思われる分子量約７５０００のバンドを確認することができた。
【００５２】
実施例４：β１，３ＧａｌＴ−Ｖ活性の確認
上記酵素液を用いて、ＨＰＬＣによるβ１，３ＧａｌＴ−Ｖ活性の確認を行った。表１に示すような組成で、上記酵素溶液の酵素反応を行った。基質には、アミノピリジン（ＰＡ）で蛍光標識したラクト−Ｎ−ネオテトラオース（ＬＮｎＴ）をβガラクトシダーゼで処理することにより末端のガラクトース残基を除去したアガラクトＬＮｎＴ（以下、ＡＧ−ＬＮｎＴ−ＰＡと示す。）を用いた。糖供与体としてＵＤＰ−Ｇａｌを用い、これを加えない系を対照とした。酵素反応は３７℃で１５分又は１時間行った。反応液を逆相ＨＰＬＣに供して、反応生成物のピークを確認することにより活性を測定した。ＨＰＬＣの条件は表２に示す通りである。
【００５３】
【表１】

【００５４】
【表２】

【００５５】
ＨＰＬＣの結果は図１に示す通りである。図１より明らかなように、糖供与体が共存する場合にのみ、反応生成物のピークが確認された。反応が進むにつれて、そのピーク強度が強くなることも確認された。したがって、β１，３ＧａｌＴ−Ｖ活性を確認することができた。
【００５６】
また、β１，３ＧａｌＴ−Ｖ活性の反応ｐＨの至適化も検討した。表１と同じ条件で、ｐＨ５．５，６．０，６．５，７．０は０．５Ｍ　ＭＥＳ緩衝液、ｐＨ７．０，７．５，８．０は０．５Ｍ　ＨＥＰＥＳ緩衝液を用いた。その結果、ｐＨ７．０〜７．５が至適条件であることが確認された。一方、共存するマンガン濃度は、表１に示した濃度よりも低いと活性が大きく低下することも確認された。なお、界面活性剤であるＴｒｉｔｏｎＸ１００は共存しなくても、活性には影響しないことも確認された。
【００５７】
実施例５：ＭＢＰ−β１，３ＧａｌＴ−Ｖの精製
上記酵素溶液を、アミロースのアガロースビーズに固定化された樹脂である、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂ社製Ａｍｙｌｏｓｅ　ｒｅｓｉｎ　ｃｏｌｕｍｎを用いて精製を行った。得られた溶出画分について、実施例４と同様にして、β１，３ＧａｌＴ活性を確認することができた。また、精製されたＭＢＰ−β１，３ＧａｌＴをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供したところ、電気泳動的にもほぼ単一に精製されていることが確認された。
【００５８】
【発明の効果】
上述したように、本発明により、糖結合性蛋白質と−β１，３ＧａｌＴとの組換え融合蛋白質、特にＭＢＰ−β１，３ＧａｌＴ−Ｖを低コストで、しかも効率の優れた製造を実現することが可能となった。この酵素は、抗炎症、抗感染症又はガン転移抑制等の医薬品、有用糖鎖の合成、乳製品等の食品、蛋白質の改善法、ガン等の疾患の診断等に有用である。
【００５９】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】ＨＰＬＣにより、β１，３ＧａｌＴ−Ｖの活性の発現を確認した結果を示す図である。
【図２】β１，３ＧａｌＴ−Ｖの活性のｐＨプロフィールを示す図である。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a fusion protein having β1,3-galactosyltransferase activity, which is one of glycosyltransferases, and a method for producing the same. More specifically, the present invention relates to a fusion protein of a maltose binding protein (hereinafter, sometimes abbreviated as MBP) and a β1,3-galactosyltransferase protein and a method for producing the same.
[0002]
[Prior art]
Sugar chains in which various monosaccharides are linked by glycosidic bonds are present in cells as an intracellular organelle component, a cell surface component, a secreted glycoprotein component, and the like. Although the structures of these sugar chains are different depending on the species or tissue, they differ depending on the time of occurrence or disease in the same species or tissue. In addition to functions such as imparting physical properties to proteins such as hydrophilicity, charge, and protease resistance, sugar chains are involved in intercellular recognition such as development and differentiation, nervous system, immune system, cancer metastasis, etc. In recent years, it has become very popular in terms of application to various fields such as pharmaceuticals.
[0003]
These sugar chains are synthesized in vivo by glycosyltransferases. Glycosyltransferases are enzymes that use sugar nucleotides as sugar donors to transfer sugars to acceptor sugar chains and perform sugar chain elongation.The specificity of the sugar acceptor for the sugar chain structure is strict. In general, it is said that one glycosidic bond is formed by one corresponding glycosyltransferase. These glycosyltransferases are important enzymes in that they are used for sugar chain research, particularly for convenient synthesis of useful sugar chains and modification of natural sugar chains. However, the amount of naturally occurring glycosyltransferase is extremely small, and it has been practically difficult to supply it stably in large quantities.
[0004]
Among the glycosyltransferases, β1,3-galactosyltransferase (hereinafter sometimes referred to as β1,3GalT) is a glycosyltransferase that transfers galactose from UDP-Gal by β1,3 bonds. Various types have been reported. Among them, β1,3GalT-V is, as described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2000-245264, a type I which has a Galβ1-3GlcNAc structure and constitutes a skeleton of a Lewis blood group antigen or a cancer-related sugar chain antigen. It is an extremely important enzyme involved in the synthesis of sugar chains, and is one of those for which stable supply has been strongly desired. β1,3GalT-V is derived from humans. Biol. Chem. Vol. 274, No. 18, pages 12499-12507 (1999).
However, since it has been difficult to secure large and stable cells, and if it is necessary to purify the enzyme into a single enzyme, it takes much time and effort, so that production of β1,3GalT by genetic recombination technology has been demanded. I have. It has been reported that the above-mentioned gene encoding β1,3GalT-V was isolated from, for example, human colon cancer cells, SW1116 cells.
[0005]
For mass production of recombinant proteins, a method of expressing in microorganisms such as bacteria and yeast is advantageous in view of cost. However, in a microbial expression system, most of the expressed protein may be present as an insoluble inclusion body, which requires a solubilization / regeneration step for purification. I could not say. Furthermore, even for enzymes expressed as partially soluble proteins, in order to obtain high purity, many purification steps including various chromatographic treatments are required, and it takes a lot of time and cost, so that it is necessary for commercial production. It was not enough as an expression system.
[0006]
On the other hand, as a method for expressing a target gene in a large amount and facilitating purification of an expression product, there is a method for expressing a target protein as a fusion protein with glutathione-S-transferase (GST), protein A, or the like. In these methods, the fusion protein with GST can be easily purified by affinity column chromatography using glutathione as a ligand, and the fusion protein with protein A can be easily purified by affinity column chromatography using IgG as a ligand. However, when this method is used, there is a high possibility that an inclusion body will be generated as described above. For these reasons, it has been practically difficult to stably supply β1,3GalT in large quantities.
[0007]
[Problems to be solved by the invention]
Therefore, an object of the present invention is to supply β1,3-galactosyltransferase at low cost and efficiently.
[0008]
[Means for Solving the Problems]
In view of the circumstances described above, the present inventors have conducted intensive studies. As a result, when β1,3GalT was expressed in a host as a fusion protein with a sugar-binding protein by gene recombination technology, β1,3GalT was expressed. It can be obtained as a soluble protein, and can be easily purified by affinity chromatography utilizing the specific affinity of the sugar-binding protein. The obtained fusion protein has β1,3GalT activity. And completed the present invention.
[0009]
That is, the present invention has the following configuration.
Item 1. A recombinant fusion protein of a binding protein and β1,3-galactosyltransferase.
Item 2.1. The recombinant fusion protein according to Item 1, wherein the 1,3-galactosyltransferase has an activity of transferring galactose to a N-acetylglucosamine residue present at a non-reducing end of a sugar chain by β1,3 bond.
Item 3. Item 1, in which 1,3-galactosyltransferase has an activity of transferring galactose to an N-acetylglucosamine residue or N-acetylglucosamine monosaccharide present at the non-reducing end of GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc by β1,3 bond. The recombinant fusion protein according to the above.
Item 4. The recombinant fusion protein according to any one of Items 1 to 3, wherein the 1,3-galactosyltransferase is derived from human.
Item 5. The recombinant fusion protein according to any one of Items 1 to 4, wherein the 1,3-galactosyltransferase is the protein described in (a) or (b).
(A) a protein (b) (a) comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added, and having β1,3-galactosyltransferase activity; Protein having item 6. Item 6. The recombinant fusion protein according to any one of Items 1 to 5, wherein the binding protein is a maltose binding protein.
Item 7. Item 7. The recombinant fusion protein according to any one of Items 1 to 6, which comprises a protease recognition sequence between the binding protein and β1,3-galactosyltransferase.
Item 8. Item 8. The recombinant fusion protein according to Item 7, wherein the Rotase is blood coagulation factor Xa.
Item 9. A DNA encoding the recombinant fusion protein according to any one of Items 9.1 to 8.
Item 10. Item 10. A vector comprising the DNA according to Item 9.
Item 11. Item 11. A transformant transformed by the vector according to Item 10.
Item 12. Item 9. The method for producing a recombinant fusion protein according to any one of Items 1 to 8, comprising the following steps (A) to (C).
(A) An expression vector in which a DNA encoding a sugar-binding protein and a DNA encoding β1,3-galactosyltransferase are ligated under the control of a promoter capable of functioning in Escherichia coli so as to be expressed as a fusion protein of the two proteins. Is used to transform E. coli,
(B) culturing the resulting transformant to produce a fusion protein of a sugar-binding protein and β1,3-galactosyltransferase;
(C) Isolation of the fusion protein from the obtained culture. Item 13. The method for producing a recombinant fusion protein according to Item 12, wherein the sugar-binding protein is a maltose-binding protein.
Item 14. Item 14. The method for producing a recombinant fusion protein according to Item 13, wherein the DNA encoding the maltose binding protein is derived from pMAL-p2 or pMAL-c2.
Item 15. Item 15. A method for producing β1,3-galactosyltransferase, comprising a step of removing a sugar-binding protein portion from a fusion protein obtained by the method according to any one of Items 12 to 14 to collect β1,3-galactosyltransferase.
Item 16. Item 16. The method for producing β1,3-galactosyltransferase according to Item 15, wherein a protease is used for removing the sugar-binding protein portion.
Item 17. Item 17. The method for producing β1,3-galactosyltransferase according to Item 16, wherein the protease is blood coagulation factor Xa.
[0010]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described specifically.
The present invention is characterized in that the protein having β1,3GalT activity is a fusion protein of β1,3GalT and a sugar-binding protein, and the fusion protein is a soluble protein.
Furthermore, the present invention has made it possible to produce β1,3GalT as a soluble fusion protein by expressing β1,3GalT as a fusion protein with a sugar-binding protein in Escherichia coli. By utilizing its specific affinity, it is possible to purify the fusion protein and β1,3GalT easily and in large quantities.
[0011]
In the present invention, a sugar-binding protein is a protein that retains high affinity for oligosaccharides and polysaccharides having a sugar or a sugar residue. The sugar-binding protein may be derived from any species, but is preferably derived from prokaryotes such as bacteria, and more preferably derived from Escherichia coli.
Specific examples include various lectins, maltose binding protein, cellulose binding protein, chitin binding protein and the like. Among them, maltose binding protein (hereinafter sometimes referred to as MBP) is particularly preferred.
[0012]
If the MBP has a site having a specific affinity for maltose or an oligosaccharide having a maltose residue (for example, maltotriose or the like) or a polysaccharide (for example, amylose or the like), the entire sequence thereof is not necessarily required. Need not be included, and may include a part of the sequence. Therefore, in a known amino acid sequence, one or several amino acids are deleted, substituted or added, and are composed of maltose or a maltose-containing oligosaccharide (for example, maltotriose or the like) or a polysaccharide (for example, A protein having a site having specific affinity for amylose) can also be included in the MBP of the present invention.
[0013]
In the present invention, the origin of the MBP-encoding gene is not particularly limited, but examples include those derived from pMAL-p2 or pMAL-c2 (both from New England Biolabs).
[0014]
It is particularly preferable that the sugar-binding protein in the present invention contains an amino acid sequence which is recognized and cleaved by a protease having high sequence specificity on the C-terminal side. Examples of the protease include blood coagulation factor Xa (hereinafter sometimes referred to as Factor Xa), thrombin, renin, and the like. Preferably, it is a Factor Xa recognition sequence, that is, Ile-Glu-Gly-. Arg (SEQ ID NO: 3). By introducing such a protease recognition sequence to the C-terminal side of the sugar-binding protein, for example, after purification of MBP-fused β1,3GalT (hereinafter sometimes referred to as MBP-β1,3GalT), the protease as described above is obtained. , The MBP portion can be easily removed.
[0015]
In a more preferred embodiment, the sugar-binding protein includes a protein having a spacer sequence of about 5 to 15 amino acid residues between the sugar-binding protein site and the protease recognition site. Due to the presence of the spacer sequence, the sugar-binding protein moves away from β1,3GalT, thereby reducing the possibility of intramolecular interaction in the fusion protein. In the case of MBP-β1,3GalT fusion protein, the specificity of the MBP portion to maltose or amylose is reduced. Affinity increases. In the present invention, pMAL-p2 or pMAL-c2 containing a spacer sequence of SEQ ID NO: 7 (both manufactured by New England Biolabs) can be used.
[0016]
In the present invention, β1,3GalT preferably has an activity of transferring galactose to a N-acetylglucosamine residue present at the non-reducing terminal of a sugar chain by β1,3 bond. Further, those having an activity of transferring galactose to an N-acetylglucosamine residue or N-acetylglucosamine monosaccharide present at the non-reducing end of GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc by β1,3 bond are preferable. That is, the above-mentioned β1,3GalT-V is particularly preferable, but is not limited as long as it catalyzes a reaction of transferring galactose from UDP-Gal by β1,3 bond. It can be applied to β1,3GalT. Other than β1,3GalT-V, for example, β1,3GalT-I, β1,3GalT-II, β1,3GalT-III, β1,3GalT-IV and the like can be mentioned.
[0017]
β1,3GalT may be derived from any species, but is preferably derived from mammals, more preferably human. In the present invention, β1,3GalT does not necessarily need to include the full-length sequence of β1,3GalT as long as it retains its activity, and may include a part of the sequence. For example, (a) a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or (b) (a) consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added, and β1,3- It may be a protein having galactosyltransferase activity.
[0018]
In the present invention, the sugar-binding protein-β1,3GalT is obtained by translating a DNA encoding the sugar-binding protein and a DNA encoding β1,3GalT into a fusion protein having the above-mentioned properties. That is, it is obtained by transforming a host cell with an expression vector containing a chimeric DNA linked in frame, and culturing the resulting transformant in a suitable medium.
[0019]
The DNA encoding β1,3GalT is based on a known gene sequence (eg, J. Biol. Chem. Vol. 274, No. 18, pp. 12499-12507 (1999)), and the like. It can be prepared by any technique. For example, based on the known β1,3GalT gene sequence, an appropriate pair of oligonucleotide primers covering all or a part of the coding region of β1,3GalT is synthesized, and a total of primers extracted from cells or tissues expressing β1,3GalT are synthesized. Cloning can be performed by performing RT-PCR or PCR using RNA or poly A ⁺ RNA or chromosomal DNA as a template. At this time, in order to facilitate subsequent cloning into a vector, an appropriate restriction enzyme recognition sequence may be added to the end of the oligonucleotide primer to be used.
[0020]
Alternatively, a suitable oligonucleotide probe is synthesized based on a known β1,3GalT gene sequence, and using this, a cDNA library prepared from cells or tissues expressing β1,3GalT by a conventional method is used as a plaque (or colony). Cloning can also be performed by screening by hybridization.
[0021]
Furthermore, the DNA encoding β1,3GalT can also be cloned by subjecting a partially or completely purified β1,3GalT cDNA library, prepared as a whole, or a part thereof to an antigen, as an antigen by screening the cDNA library with an antibody. .
[0022]
Alternatively, the DNA is synthesized based on the known β1,3GalT gene sequence using a DNA / RNA automatic synthesizer so that the partial sequence of the sense strand and the partial sequence of the antisense strand partially overlap, A desired DNA sequence can also be obtained by repeating the operation of obtaining a longer partial sequence as double-stranded DNA by PCR.
[0023]
In the present invention, examples of the DNA encoding β1,3GalT include, for example, a DNA containing a nucleotide sequence encoding all or a part of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, preferably all of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 Alternatively, a DNA containing a part thereof may be used.
[0024]
By the way, MBP derived from Escherichia coli is a secretory protein present in the periplasm, and the initial translation product contains a signal peptide at its N-terminus. The DNA encoding the MBP of the present invention may include a base sequence (signal codon) encoding a signal peptide capable of functioning in host Escherichia coli. Since Escherichia coli is a gram-negative bacterium having an outer membrane outside the cell wall, even if the DNA encoding MBP may contain a signal codon, the expressed MBP-β1,3GalT may be secreted into the medium. Is low. However, if MBP-β1,3GalT accumulates in the periplasmic space, the fusion protein can be recovered by spheroplasting without completely disrupting the cells, so that subsequent purification can be performed easily. Can be. However, in this case, it is particularly preferable to delete the transmembrane domain of β1,3GalT. In the presence of the domain, MBP-β1,3GalT may not reach the periplasmic space and may remain in the inner membrane, making recovery of the fusion protein difficult.
[0025]
In the present invention, it is particularly preferable that the DNA encoding MBP contains a nucleotide sequence encoding an amino acid sequence recognized and cleaved by a protease having high sequence specificity at the C-terminal side of the protein. Examples of the protease include blood coagulation factor Xa (Factor Xa), thrombin, renin, and the like. Preferably, the protease is a Factor Xa recognition sequence, that is, Ile-Glu-Gly-Arg (SEQ ID NO: 3). . By introducing such a protease recognition sequence to the C-terminal side of the sugar-binding protein, for example, after purification of MBP-fused β1,3GalT (hereinafter sometimes referred to as MBP-β1,3GalT), it is performed as described above. The MBP portion can be easily removed by the action of various proteases.
In a more preferred embodiment, the DNA encoding the sugar-binding protein contains a nucleotide sequence encoding a spacer sequence of about 5 to 15 amino acid residues between the sugar-binding protein coding region and the protease recognition site. Due to the presence of the spacer sequence, the sugar-binding protein moves away from β1,3GalT, thereby reducing the possibility of intramolecular interaction of the fusion protein. In the case of MBP-β1,3GalT fusion protein, the specificity of the MBP portion to maltose or amylose is reduced. Affinity increases.
[0027]
The DNA encoding MBP is based on the known MBP gene sequence (J. Biol. Chem. 259, 10606-10613 (1984), etc.), and is the same as exemplified for the DNA encoding β1,3GalT. And the above-mentioned protease recognition sequence and spacer sequence can be introduced into the C-terminal side of MBP by a conventional method. In the present invention, it preferably contains the spacer sequence of SEQ ID NO: 6.
[0028]
The DNA encoding MBP derived from Escherichia coli can be obtained from a commercially available vector such as pMALp2 (containing a signal codon) or pMALc2 (lacking a signal codon) manufactured by New England Biolab.
[0029]
In order to facilitate the construction of a chimeric DNA encoding a fusion protein of a sugar-binding protein and β1,3GalT (hereinafter sometimes referred to as a sugar-binding protein-β1,3GalT), a sugar-binding protein is encoded. An appropriate restriction enzyme recognition site can be added to the end of the DNA by a conventional method. When a DNA encoding β1,3GalT is cloned into a vector and a restriction enzyme recognition site is added to the N-terminal side of β1,3GalT, the same restriction enzyme recognition site ( Alternatively, another restriction enzyme recognition site that generates the same sticky end may be introduced.
[0030]
The expression vector of the present invention is any expression vector in which the chimeric DNA encoding the above-mentioned sugar-binding protein-β1,3GalT is placed under the control of a promoter that can function in Escherichia coli. The promoter region includes -35 region and -10 region, which are consensus sequences that determine the binding position of RNA polymerase. As a system for expressing a desired recombinant protein in a large amount, it is more preferable to use a promoter region of an inducible enzyme. Such promoter regions include the trp promoter, lac promoter, recA promoter, lpp promoter, tac promoter and the like. These promoter regions further include an operator to which the repressor protein binds. Addition of an inducer (eg, lactose or IPTG in the case of the lac promoter) suppresses the binding of the repressor protein to the operator, and causes the expression of a large number of genes under the control of the promoter. The expression vector also contains a consensus Shine-Dalgarno (SD) sequence upstream of the translation initiation codon. Furthermore, the expression vector contains a transcription termination signal, that is, a terminator region, downstream of the chimeric DNA encoding the sugar-binding protein-β1,3GalT. As the terminator region, a commonly used natural or synthetic terminator can be used. The expression vector of the present invention must contain an origin of replication capable of autonomous replication in host Escherichia coli, in addition to the above-mentioned promoter region and terminator region. Examples of such a replication origin include ColEl ori and M13 ori.
[0031]
The expression vector of the present invention preferably further contains a selectable marker gene for selecting a transformant. As the selectable marker gene, resistance genes to various drugs such as tetracycline, ampicillin, and kanamycin can be used. When the host Escherichia coli is an auxotrophic mutant, a wild-type gene that complements the auxotrophy can be used as a selectable marker gene.
[0032]
The transformant of the present invention can be prepared by transforming a host cell with the expression vector of the present invention. The host cell is not particularly limited, and Escherichia coli, Bacillus subtilis, yeast, animal cells, plant cells, and any other commonly used host cells can be used. preferable. In the case of Escherichia coli, the strain is not particularly limited, and examples thereof include commercially available XL1-Blue strain, BL-21 strain, JM107 strain, TB1, JM109 strain, C600 strain, DH5α strain, HB101 strain and the like.
[0033]
Introduction of an expression vector into a host cell can be performed using a conventionally known method. For example, the method of Cohen et al. (Calcium chloride method; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 69, p. 2110 (1972)), the protoplast method (Mol. Gen. Genet., 168, 111 ( 1979)), the competent method (J. Mol. Biol. 56, 209 (1971)), the electroporation method, and the like.
[0034]
The sugar-binding protein-β1,3GalT is obtained by culturing a transformant expressing the expression vector containing the chimeric DNA in a suitable medium, and recovering the sugar-binding protein-β1,3GalT from the resulting culture. Can be obtained by
[0035]
The medium used contains a carbohydrate such as glucose, fructose, glycerol or starch as a carbon source. It may also contain an inorganic or organic nitrogen source (for example, ammonium sulfate, ammonium chloride, casein hydrolyzate, yeast extract, polypeptone, bactotripton, beef extract, etc.). These carbon and nitrogen sources do not need to be used in a pure form, and those having low purity are advantageous because they are rich in trace amounts of growth factors and inorganic nutrients. If desired, other nutrient sources (eg, inorganic salts (eg, sodium or potassium diphosphate, dipotassium hydrogen phosphate, magnesium chloride, magnesium sulfate, calcium chloride), vitamins (eg, vitamin B1)) And an antibiotic (eg, ampicillin, kanamycin) and the like may be added to the medium.
[0036]
Culture of the transformant is usually performed at pH 5.5 to 8.5, preferably 6 to 8, usually 18 to 40 ° C., preferably 20 to 35 ° C. for 1 to 150 hours. It can be appropriately changed depending on the culture scale.
[0037]
When culturing is performed in a large tank, in order to avoid growth delay in the production process of the target protein, the cells are inoculated into a small amount of medium and pre-cultured for 1 to 24 hours. Preferably, it is inoculated in a tank.
[0038]
When the sugar-binding protein-β1,3GalT is controlled by the promoter system of the inducible protein gene, the inducer may be added from the beginning of the culture, but is more preferably added in the early logarithmic growth phase. Bacterial growth can be monitored by measuring the absorbance of the culture at 660 nm. For example, when using a lac promoter or a tac promoter, when the absorbance at 660 nm becomes 0.4 to 0.6, isopropylthio-β-D-galactoside (hereinafter, referred to as IPTG) is used as an inducer, for example. It can be added to be 0.1 to 1.0 mM. The timing and rate of addition of the inducer can be appropriately changed depending on the culture conditions, culture scale, type of inducer, and the like.
[0039]
In the method of the present invention, the purification of the sugar-binding protein-β1,3GalT is carried out by separating the fraction containing the fusion protein with an insoluble ligand bound with a ligand containing various sugar residues specifically binding to the sugar-binding protein. By subjecting it to affinity chromatography using a carrier, it can be easily achieved in one step. Also. As the ligand, an antibody (monoclonal antibody or polyclonal antibody) specific to the sugar-binding protein may be used.
[0040]
For example, when the sugar-binding protein is MBP, when the DNA encoding MBP lacks a signal codon, MBP-β1,3GalT is localized in the soluble fraction of the bacterial cells. After completion, the culture is filtered or centrifuged to collect the cells, and the cells are disrupted by lysozyme treatment and detergent treatment, ultrasonic treatment, or osmotic shock, and the resulting cell extract is subjected to affinity chromatography. Used for
[0041]
On the other hand, when the DNA encoding MBP has a signal codon, the expressed MBP-β1,3GalT is likely to be secreted and accumulated in the periplasmic space. Therefore, in this case, the cells are spheroplasted by lysozyme treatment or the like to release MBP-β1,3GalT in the solution, and the cells are removed by filtration or centrifugation, and the resulting supernatant is subjected to affinity chromatography. Used.
[0042]
In the present invention, the fraction containing sugar-binding protein-β1,3GalT is preferably subjected to the above purification in the presence of a divalent metal ion. Specifically, it is preferable to collect the cells from the culture in the presence of divalent metal ions after the completion of the cultivation, crush the cells, and the like, to obtain a sugar-binding protein-β1,3GalT-containing fraction. Examples of the divalent metal include manganese and magnesium, but manganese is preferred.
[0043]
As an adsorbent for affinity chromatography, for example, in the case of MBP, an amylose resin in which amylose is immobilized on agarose beads (eg, Amylose resin column manufactured by New England Biolab) can be used. Ligands and other insoluble matrix groups (eg, cellulose, dextran, synthetic polymers, etc.) may be used.
[0044]
The sugar-binding protein-β1,3GalT is added to the fraction containing it prepared as described above, the adsorbent is added thereto, and the mixture is stirred for an appropriate period of time, and then filtered to wash the adsorbent. An eluent containing a saccharide (for example, maltose in the case of MBP) that inhibits the binding between the saccharide-binding protein and the adsorbent is added, and the mixture is stirred for an appropriate time and then filtered, whereby the filtrate is purified. Alternatively, the adsorbent is packed in a column, a sugar-binding protein-β1,3GalT fraction is applied, washed with an appropriate buffer, and then an eluent having an appropriate concentration is applied, and the sugar adsorbed on the column is applied. It can also be obtained by eluting the binding protein-β1,3GalT. The thus obtained sugar-binding protein-β1,3GalT has β1,3GalT activity and can be used as it is as an enzyme.
[0045]
As described above, in a preferred embodiment of the present invention, since the sugar-binding protein-β1,3GalT contains an amino acid sequence that is recognized and cleaved by a sequence-specific protease at its fusion site, it was purified as described above. By acting the protease on the sugar-binding protein-β1,3GalT, the sugar-binding protein portion is removed to produce a desired β1,3GalT. Preferably, the protease is blood coagulation factor Xa (Factor Xa). In the present invention, pMAL-p2 or pMAL-c2 containing a Factor Xa recognition sequence of SEQ ID NO: 3 (both manufactured by New England Biolabs) can be used. The reaction temperature, the pH of the solution, the reaction time, etc., when the protease is allowed to act on the sugar-binding protein-β1,3GalT can be appropriately selected depending on the type of the protease to be used. For example, in the case of Factor Xa, neutral By reacting in a buffer at 4 to 40 ° C. for 1 to 25 hours, the sugar-binding protein and β1,3GalT can be cleaved. After completion of the reaction, the above adsorbent is added to the reaction solution, and the mixture is stirred for an appropriate time, so that only the released sugar-binding protein is adsorbed on the adsorbent. By filtering the adsorbent, only β1,3GalT is obtained. Can be purified. Alternatively, β1,3GalT can be purified by applying the reaction solution to a column packed with the adsorbent and collecting the flow-through fraction.
[0046]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. The present invention is not particularly limited to the examples.
[0047]
Example 1 Acquisition of β1,3GalT-V cDNA Fragment by PCR First, SW1116 cells (obtained from ATCC) were cultured in a DMEM medium containing 10% FCS, and the cells were collected from a 20 ml culture by centrifugation. Was performed twice for centrifugal washing. Total RNA was extracted from the obtained cell mass using RNeasy Mini (manufactured by Qiagen). The yield was 35.4 g in terms of one T-25 flask. From this total RNA, single-stranded cDNA was prepared using RT-PCR high (manufactured by Toyobo). The conditions were as follows: treatment at 70 ° C. for 10 minutes, 30 ° C. for 10 minutes, 42 ° C. for 30 minutes, and 99 ° C. for 5 minutes.
[0048]
Based on the nucleotide sequence of the cDNA of human β1,3GalT-V shown in SEQ ID NO: 1, the oligonucleotides shown in SEQ ID NOs: 4 and 5 were synthesized. The former is a base sequence represented by base numbers 79 to 105 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, and has a BamHI recognition site added thereto. The latter is an antisense sequence to the base sequence shown by base numbers 913 to 933 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, and has a BamHI recognition site added thereto. Using these oligonucleotides as a primer pair and KOD DNA polymerase (manufactured by Toyobo Co., Ltd.), PCR (98 ° C./30 seconds, 58 ° C./30 seconds, 58 ° C./30 seconds, 74 ° C./30 seconds) using the single-stranded cDNA as a template After 4 cycles, 28 cycles of 98 ° C. for 30 seconds, 68 ° C. for 30 seconds, and 74 ° C. for 30 seconds) were performed. When this PCR product was subjected to 1.5% agarose electrophoresis, a DNA fragment of about 900 bp having the same size as the target gene could be obtained.
[0049]
The obtained DNA fragment is purified using QIA Quick Gel Extraction Kit (manufactured by Qiagen), and further, the end of this DNA fragment is blunted using PCR-Script Amp Cloning Kit (manufactured by Takara Shuzo), and pPCR-Script Amp is used. Escherichia coli DH5α strain was transformed by insertion into SK (+) vector, and selected on LB agar medium containing 50 μg / ml ampicillin, IPTG, and X-gal.
A plasmid holding the DNA fragment was prepared from the obtained white colony. The plasmid was prepared using QIA prep Spin Miniprep Kit (manufactured by Qiagen). The nucleotide sequence of the DNA fragment was determined by a conventional method using a sequence reaction using the T3 primer and the T7 primer as sequencing primers, and using an auto-sequencer (ABI PRISM310; Genetic Analyzer; manufactured by Applied Biosystems). As a result, it was confirmed that the desired gene could be cloned.
[0050]
Example 2 Construction of Expression Vector As described above, a transformant in which insertion of the target gene was confirmed was cultured, and a plasmid was extracted using QIA prepSpin Miniprep Kit (manufactured by Qiagen). This plasmid was treated with BamHI at 37 ° C. for 2 hours, subjected to 1.5% agarose electrophoresis, cut out a DNA fragment containing the target gene, and purified using a QIA Quick Gel Extraction Kit (Qiagen). On the other hand, pMALc2 (New England Biolab), which is a vector, was treated with BamHI at 37 ° C. for 2 hours, subjected to 1.5% agarose electrophoresis, and purified similarly. A ligation reaction was performed at 16 ° C. for 1 hour using the above DNA fragment and the above vector that had been treated with a restriction enzyme, using Ligation High (manufactured by Toyobo). Further, Escherichia coli JM109 strain was transformed and selected on LB agar medium containing 50 μg / ml ampicillin. The obtained colonies were further subjected to liquid culture, and plasmids were extracted using QIAprep Spin Miniprep Kit (manufactured by Qiagen). The insert and the orientation were confirmed by treating the plasmid with BamHI and PstI, respectively, to obtain a plasmid in which a DNA fragment containing the target gene was inserted in the correct direction.
[0051]
Example 3 Preparation of MBP-β1,3GalT-V by Recombinant E. coli A platinum loop of clone 1 transformed with the above expression vector was placed in 10 ml of LB liquid medium containing 50 μg / ml ampicillin and 0.2% glucose. After culturing at 37 ° C. overnight, 250 μl of this culture was inoculated into 25 ml of the same medium, culturing was performed at 37 ° C. for 4 hours, the temperature was lowered to 25 ° C., and 25 μl of 0.3 M IPTG was added. Culture was performed overnight. The cells were collected by centrifugation, and suspended in 80 μl of buffer (100 mM MES (pH 6.5) -20 mM MnCl ₂ -50 mM NaCl-1 mM 2-mercaptoethanol) (per 1 ml of culture solution). This suspension was subjected to ultrasonic treatment for 30 minutes, centrifuged at 14000 rpm for 10 minutes at 4 ° C., and the culture supernatant was used as an enzyme solution. When this enzyme solution was subjected to Western blotting, a band having a molecular weight of about 75,000, which was considered to be MBP-β1,3GalT-V, could be confirmed.
[0052]
Example 4: Confirmation of β1,3GalT-V activity Using the enzyme solution, β1,3GalT-V activity was confirmed by HPLC. The enzyme reaction of the above enzyme solution was performed with the composition shown in Table 1. As a substrate, lacto-N-neotetraose (LNnT) fluorescently labeled with aminopyridine (PA) was treated with β-galactosidase to remove a terminal galactose residue. Shown). UDP-Gal was used as a sugar donor, and a system without this was used as a control. The enzyme reaction was performed at 37 ° C. for 15 minutes or 1 hour. The reaction solution was subjected to reverse phase HPLC, and the activity was measured by confirming the peak of the reaction product. HPLC conditions are as shown in Table 2.
[0053]
[Table 1]

[0054]
[Table 2]

[0055]
The results of HPLC are as shown in FIG. As apparent from FIG. 1, the peak of the reaction product was confirmed only when the sugar donor coexisted. It was also confirmed that the peak intensity increased as the reaction proceeded. Therefore, β1,3GalT-V activity could be confirmed.
[0056]
The optimization of the reaction pH for β1,3GalT-V activity was also studied. Under the same conditions as in Table 1, use a 0.5 M MES buffer for pH 5.5, 6.0, 6.5, and 7.0, and use a 0.5 M HEPES buffer for pH 7.0, 7.5, and 8.0. Was. As a result, it was confirmed that pH 7.0 to 7.5 was the optimum condition. On the other hand, it was also confirmed that when the coexisting manganese concentration was lower than the concentration shown in Table 1, the activity was greatly reduced. In addition, it was also confirmed that even if Triton X100, which is a surfactant, was not present, the activity was not affected.
[0057]
Example 5: Purification of MBP-β1,3GalT-V The enzyme solution was purified using Amylose resin column manufactured by New England Biolab, which is a resin immobilized on agarose beads of amylose. The β1,3GalT activity of the obtained eluted fraction was confirmed in the same manner as in Example 4. In addition, when the purified MBP-β1,3GalT was subjected to SDS-PAGE, it was confirmed that the purified MBP-β1,3GalT was almost uniformly purified by electrophoresis.
[0058]
【The invention's effect】
As described above, according to the present invention, a recombinant fusion protein of a sugar-binding protein and -β1,3GalT, in particular, MBP-β1,3GalT-V can be produced at low cost and with high efficiency. It became. This enzyme is useful for pharmaceuticals such as anti-inflammatory, anti-infectious diseases or cancer metastasis suppression, synthesis of useful sugar chains, foods such as dairy products, methods for improving proteins, and diagnosis of diseases such as cancer.
[0059]
[Sequence list]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows the results of confirming the expression of β1,3GalT-V activity by HPLC.
FIG. 2 shows the pH profile of β1,3GalT-V activity.

Claims

A recombinant fusion protein of a sugar-binding protein and β1,3-galactosyltransferase.

The recombinant fusion protein according to claim 1, wherein the β1,3-galactosyltransferase has an activity of transferring galactose to a N-acetylglucosamine residue present at a non-reducing end of a sugar chain by β1,3 bond.

The method according to claim 1, wherein the β1,3-galactosyltransferase has an activity of transferring galactose to an N-acetylglucosamine residue or an N-acetylglucosamine monosaccharide present at the non-reducing end of GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc by β1,3 bond. Recombinant fusion protein.

The recombinant fusion protein according to any one of claims 1 to 3, wherein the β1,3-galactosyltransferase is derived from a human.

The recombinant fusion protein according to any one of claims 1 to 4, wherein the β1,3-galactosyltransferase is the protein described in (a) or (b).
(A) a protein (b) (a) comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added, and having β1,3-galactosyltransferase activity; Protein

The recombinant fusion protein according to any one of claims 1 to 5, wherein the sugar-binding protein is a maltose-binding protein.

The recombinant fusion protein according to any one of claims 1 to 6, further comprising a protease recognition sequence between the sugar-binding protein and β1,3-galactosyltransferase.

The recombinant fusion protein according to claim 7, wherein the protease is blood coagulation factor Xa.

A DNA encoding the recombinant fusion protein according to any one of claims 1 to 8.

A vector comprising the DNA according to claim 9.

A transformant transformed by the vector according to claim 10.

The method for producing a recombinant fusion protein according to any one of claims 1 to 8, comprising the following steps (A) to (C).
(A) An expression vector in which a DNA encoding a sugar-binding protein and a DNA encoding β1,3-galactosyltransferase are ligated under the control of a promoter capable of functioning in Escherichia coli so as to be expressed as a fusion protein of the two proteins. Is used to transform E. coli,
(B) culturing the resulting transformant to produce a fusion protein of a sugar-binding protein and β1,3-galactosyltransferase;
(C) isolating the fusion protein from the obtained culture

The method for producing a recombinant fusion protein according to claim 12, wherein the sugar-binding protein is a maltose-binding protein.

14. The method for producing a recombinant fusion protein according to claim 13, wherein the DNA encoding the maltose binding protein is derived from pMAL-p2 or pMAL-c2.

A method for producing β1,3-galactosyltransferase, comprising a step of removing a sugar-binding protein portion from a fusion protein obtained by the method according to any one of claims 12 to 14 to collect β1,3-galactosyltransferase. .

The method for producing β1,3-galactosyltransferase according to claim 15, wherein a protease is used for removing the sugar-binding protein portion.

The method for producing β1,3-galactosyltransferase according to claim 16, wherein the protease is blood coagulation factor Xa.