JP2005046032A

JP2005046032A - FUSED PROTEIN HAVING alpha2,3-SIALYL TRANSFERASE ACTIVITY AND METHOD FOR PRODUCING THE SAME

Info

Publication number: JP2005046032A
Application number: JP2003204729A
Authority: JP
Inventors: Shusaku Yanagiya; 周作柳谷; Kazunori Inamori; 和紀稲森; Shigeo Shibatani; 滋郎柴谷; Izumi Inohara; 泉猪原
Original assignee: Toyobo Co Ltd
Current assignee: Toyobo Co Ltd
Priority date: 2003-07-31
Filing date: 2003-07-31
Publication date: 2005-02-24

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To make it possible to easily efficiently and massively produce a fused protein having an α2,3-sialyl transferase activity as a soluble protein, and to make it possible to easily obtain the β2,3-sialyl transferase itself from the fused protein. <P>SOLUTION: The recombinant fused protein comprising a sugar-binding protein and a α2,3-sialyl transferase. The method for producing the recombinant fused protein is characterized by comprising the following processes (1) to (3): (1) transforming Escherichia coli with an expression vector in which a DNA encoding a sugar-binding protein is connected to a DNA encoding the α2,3-sialyl transferase under the control of a promoter capable of acting in the Escherichia coli to express the fused protein of both the proteins, (2) culturing the obtained transformant to produce the fused protein comprising the sugar-binding protein and the α2,3-sialyl transferase VI, and (3) separating the fused protein from the obtained culture product. <P>COPYRIGHT: (C)2005,JPO&NCIPI

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、糖タンパク質プロセッシング酵素の一種である、α２，３−シアリルトランスフェラーゼを、安価に効率よく生産する方法に関する。詳細には、マルトース結合タンパク質とα２，３−シアリルトランスフェラーゼタンパク質との融合タンパク質及び該タンパク質を大腸菌体内で製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
種々の単糖がグリコシド結合により連結した糖鎖は、細胞において、細胞内オルガネラ成分、細胞表層成分、分泌糖タンパク質などとして存在している。これら糖鎖の構造は生物種や組織特異的に異なっているが、同一生物種や同一組織内でも発生時期や疾病等によっても異なることから、従来考えられていたタンパク質の熱安定性、親水性、電荷、プロテアーゼ耐性等のタンパク質に対する物理的性質の付与といった機能の他に、発生・分化、神経系、免疫系、癌の転移等の細胞間認識に糖鎖が関与していることが明らかになり、医薬品等の種々の分野への応用という点から近年非常に注目されるようになった。
【０００３】
これら糖鎖は、生体内においては糖転移酵素によって合成されている。糖転移酵素は、糖ヌクレオチドを糖供与体として、受容体となる糖鎖に糖を転移し、糖鎖伸長を行う酵素であり、また、その糖受容体の糖鎖構造に対する特異性は厳密であり、通用、１つのグリコシド結合は１つの糖転移酵素によって形成されるといわれている。これら糖転移酵素は糖鎖研究、特に有用糖鎖の簡便な合成、天然の糖鎖の修飾に利用されるという点で重要な酵素である。しかしながら、天然に存在する糖転移酵素の量は、極僅かであり大量且つ安定に供給することは事実上困難であった。
【０００４】
α２，３−シアリルトランスフェラーゼは、糖蛋白質或いは糖脂質の糖鎖の形成に関与する重要な酵素であり、ＣＭＰ−Ｓｉａを糖供与体として、糖受容体である糖蛋白質或いは糖脂質のＧａｌβ１−３（４）−Ｒ糖鎖の末端のガラクトースにα２−３結合でシアル酸を転移し、Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ１−３（４）−Ｒ糖鎖を生じる酵素である（但し、Ｒは種々の糖鎖）。α２，３−シアリルトランスフェラーゼはその基質特異性により現在、ＳＴ３ＧａｌＩ〜Ｖの５種類のものが知られている（例えば、非特許文献１及び表−１参照）。
【０００５】
本発明におけるα２，３−シアリルトランスフェラーゼはこれらの内、ＳＴ３ＧａｌＩＩとよばれるものであり、Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ−Ｒに対して強い活性を示し、Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ−Ｒを生成する酵素である（例えば、非特許文献１及び表−１参照）。また、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ−Ｒや、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒに対しても微弱ながらも活性を有しており、Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ−Ｒや、Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒを生成することも知られている（例えば、非特許文献１及び表−１参照）。基本的なキネティクスを比較すると、糖タンパク質よりも糖脂質をよい基質とすると考えられており（例えば、非特許文献１及び２参照）、生体内においては、Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃβ１−４Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−Ｃｅｒ、Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃβ１−４（Ｓｉａα２−３）Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−Ｃｅｒ、Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃβ１−４（Ｓｉａα２−８Ｓｉａα２−３）Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−Ｃｅｒ、Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃβ１−４（Ｓｉａα２−８Ｓｉａα２−８Ｓｉａα２−３）Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−Ｃｅｒ等の糖脂質を基質として、各々Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃβ１−４Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−Ｃｅｒ、Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃβ１−４（Ｓｉａα２−３）Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−Ｃｅｒ、Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃβ１−４（Ｓｉａα２−８Ｓｉａα２−３）Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−Ｃｅｒ、Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃβ１−４（Ｓｉａα２−８Ｓｉａα２−８Ｓｉａα２−３）Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−Ｃｅｒを等の糖鎖を生成し、含シアル酸糖脂質であるガングリオシドの生合成に深く関与していると考えられている。
【０００６】
上記のように、該酵素はガングリオシド糖鎖形成のＫｅｙ糖鎖という理由から、安定した供給が望まれていた。
【０００７】
この、α２，３−シアリルトランスフェラーゼ（以下、ＳＴ３ＧａｌＩＩと省略することもある）は、各種動物の臓器に存在することが知られているが、大量且つ安定した臓器の入手は困難であり、かつ、単一のタンパク質にまで精製しようとすると非常に手間のかかることから、遺伝子組換えによる生産が期待されている。
【０００８】
該酵素をコードするｃＤＮＡは、マウス及びラット由来（非特許文献３参照）、及びヒト由来（非特許文献４参照）のものが辻らによって単離されている。
【０００９】
組換えタンパク質の大量生産には、コスト的な点を考慮すれば、細菌や酵母などの微生物で該タンパク質を発現させる方法が有利である。しかしながら、微生物の発現系では、発現したタンパク質の多くが不溶性の封入体（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎｂｏｄｙ）として存在することがあり、精製に先立って可溶化・再生（ｒｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）の工程を必要とするので、効率的とは言えなかった。さらに、一部可溶性タンパク質として発現した酵素についても、それを高純度で得るためには、各種クロマトグラフィー処理を含む多くの精製工程が必要であり、多大な時間及びコストがかかるため、商業生産用の発現としては十分ではなかった。
【００１０】
一方、目的とする遺伝子を大量に発現させ、かつ、発現産物の精製を容易にする方法として、目的タンパク質をグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）やプロテインＡなどとの融合タンパク質として発現させる方法がある。該方法では、ＧＳＴとの融合タンパク質は。グルタチオンをリガンドとするアフィニティカラムムロマトグラフィーにより、また、プロテインＡとの融合タンパク質はＩｇＧをリガンドとするアフィニティクロマトグラフィーにより、それぞれ容易に精製することができる。しかしながら、この方法を用いた場合、前期と同様に封入体を生成する可能性が高い。このような理由から、ＳＴ３ＧａｌＩＩを大量且つ安定に供給することは事実上困難であった。
【００１１】
【非特許文献１】
「蛋白質核酸酵素１９９８年１２月号増刊糖鎖生物学糖鎖情報発信から受信のメカニズムまで」，共立出版株式会社，ｐ７７，１９９８年
【００１２】
【非特許文献２】
「バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」，３３巻，ｐ５７７２，１９９４年
【００１３】
【非特許文献３】
「ザジャーナルオブバイオロジカルケミストリー（ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｙｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ）」，２６９巻，ｐ１００２８，１９９４年
【００１４】
【非特許文献４】
「バイオケミカルアンドバイオフィジカルリサーチコミュニケーションズ（ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌａｎｄＢｉｏｐｈｙｓｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈＣｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ）」，２２８巻，ｐ３２４，１９９６年
【００１５】
【非特許文献５】
「ザジャーナルオブバイオロジカルケミストリー（ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｙｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ）」，２５９巻，ｐ１０６０６，１９８４年
【００１６】
【非特許文献６】
「プロシーディングスオブザナショナルアカデミーオブサイエンスオブザユナイティッドステイツオブアメリカ（ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｏｆｔｈｅＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓｏｆＡｍｅｒｉｃａ）」，６９巻，ｐ２１１０，１９７２年
【００１７】
【非特許文献７】
「モレキュラージェネティクスアンドゲノミクス（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＧｅｎｅｔｉｃｓａｎｄｇｅｎｏｍｉｃｓ）」，１６８巻，ｐ１１１，１９７９年
【００１８】
【非特許文献８】
「ジャーナルオブモレキュラーバイオロジー（ＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ）」，５６巻，ｐ２０９，１９７１年
【００１９】
【非特許文献９】
「細胞工学別冊実験プロトコールシリーズグライコバイオロジー実験プロトコール糖タンパク質・糖脂質・プロテオグリカン」，秀潤社，１９９６年
【００２０】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、本発明の目的は、ＳＴ３ＧａｌＩＩ活性を有するタンパク質を、安価に且つ効率的に提供することを目的とする。
【００２１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、遺伝子操作によりＳＴ３ＧａｌＩＩを、マルトース結合タンパク質（以下、ＭＢＰと省略する場合もある）等の糖結合性タンパク質との融合タンパク質として大腸菌で発現させると、ＳＴ３ＧａｌＩＩを可溶性タンパク質として得ることができ、また、該タンパク質は糖結合性タンパク質の特異的親和性を利用したアフィニティクロマトグラフィーによって容易に精製でき、得られた融合タンパク質がＳＴ３ＧａｌＩＩ活性を有する事を見いだした。
【００２２】
さらに、本発明者らは、糖結合タンパク質とＳＴ３ＧａｌＩＩとの融合部位の配列を特異的に切断するプロテアーゼにより、該融合タンパク質からＳＴ３ＧａｌＩＩも取得できることを見いだした。
【００２３】
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
【００２４】
項１．糖結合性タンパク質とα２，３−シアリルトランスフェラーゼとの組換え融合タンパク質。
項２．α２，３−シアリルトランスフェラーゼがＧａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ−Ｒ糖鎖の非還元末端に存在するガラクトース残基にα２，３結合によりシアル酸を転移する活性を有する項１に記載の組換え融合タンパク質。
項３．α２，３−シアリルトランスフェラーゼがＧａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃβ１−４Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−Ｒ糖鎖、Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃβ１−４（Ｓｉａα２−３）Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−Ｒ糖鎖、Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃβ１−４（Ｓｉａα２−８Ｓｉａα２−３）Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−Ｒ糖鎖、Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃβ１−４（Ｓｉａα２−８Ｓｉａα２−８Ｓｉａα２−３）Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−Ｒ糖鎖からなる群より得らればれる少なくとも一つの糖鎖の非還元末端に存在するガラクトース残基にα２，３結合によりシアル酸を転移する活性を有する項１記載の組換え融合タンパク質。
項４．α２，３−シアリルトランスフェラーゼがＧａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃβ１−４Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−Ｃｅｒ、Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃβ１−４（Ｓｉａα２−３）Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−Ｃｅｒ、Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃβ１−４（Ｓｉａα２−８Ｓｉａα２−３）Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−Ｃｅｒ、Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃβ１−４（Ｓｉａα２−８Ｓｉａα２−８Ｓｉａα２−３）Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−Ｃｅｒからなる群より得らればれる少なくとも一つの糖鎖の非還元末端に存在するガラクトース残基にα２，３結合によりシアル酸を転移する活性を有する項１記載の組換え融合タンパク質。
項５．α２，３−シアリルトランスフェラーゼがマウス由来である項１〜４のいずれかに記載の組換え融合タンパク質。
項６．α２，３−シアリルトランスフェラーゼが、（ａ）または（ｂ）に記載されるタンパク質である項１〜５のいずれかに記載の組換え融合タンパク質。
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）（ａ）において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、α２，３−シアリルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質
項７．α２，３−シアリルトランスフェラーゼが、配列番号２に示されるアミノ酸配列中、少なくともアミノ酸番号５４〜３５０で示されるアミノ酸配列を含む、項６に記載のタンパク質。
項８．α２，３−シアリルトランスフェラーゼが、該タンパク質の膜貫通領域の全部又は一部に相当するアミノ酸を削除したアミノ酸配列を含む項１〜７のいずれかに記載のタンパク質。
項９．糖結合性タンパク質とα２，３−シアリルトランスフェラーゼとの間にプロテアーゼ認識配列を含む請求項１〜８のいずれかに記載の組換え融合タンパク質。
項１０．糖結合性タンパク質がマルトース結合性タンパク質である項１〜９のいずれかに記載の組換え融合タンパク質。
項１１．プロテアーゼが血液凝固第Ｘａ因子、エンテロキナーゼ、ゲネナーゼＩからなる群から選択されるプロテアーゼである請求項１０記載の組換え融合タンパク質。
項１２．項１〜１１のいずれかに記載の組換え融合タンパク質をコードするＤＮＡ。
項１３．項１２記載のＤＮＡを含んでなる発現ベクター。
項１４．項１３記載の発現ベクターにより形質転換された形質転換体。
項１５．以下の工程（１）〜（３）を含むことを特徴とする項１〜１１のいずれかに記載の組換え融合タンパク質の製造方法。
（１）大腸菌で機能し得るプロモーターの制御下に、糖結合性タンパク質をコードするＤＮＡとα２，３−シアリルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡを、該両タンパク質の融合タンパク質として発現するように連結した発現ベクターを用いて、大腸菌を形質転換し、
（２）得られた形質転換体を培養して、糖結合性タンパク質とα２，３−シアリルトランスフェラーゼとの融合タンパク質を生成させ、
（３）得られた培養物から、該融合タンパク質を分離する
項１６．α２，３−シアリルトランスフェラーゼがマウス由来である項１５記載の方法。
項１７．α２，３−シアリルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡが、配列番号２に示されるアミノ酸配列中、少なくともアミノ酸番号５４〜３５０で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む項１５記載の方法。
項１８．α２，３−シアリルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡが、該タンパク質の膜貫通部位の全部または一部に相当するアミノ酸を削除したアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む項１５〜１７のいずれかに記載の方法。
項１９．α２，３−シアリルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡが、配列番号１に示される塩基配列から該タンパク質の膜貫通部位の全部または一部に相当するアミノ酸をコードする塩基配列を削除した塩基配列を含む項１５〜１８のいずれかに記載の方法。
項２０．糖結合タンパク質が、マルトース結合タンパク質である請求項１５〜１９のいずれかに記載の方法。
項２１．マルトース結合性タンパク質をコードするＤＮＡが、ｐＭＡＬｐ２、ｐＭＡＬｐ２Ｘ、ｐＭＡＬｐ２Ｅ、ｐＭＡＬｐ２Ｇ、ｐＭＡＬｃ２、ｐＭＡＬｃ２Ｘ、ｐＭＡＬｃ２Ｅ、ｐＭＡＬｃ２Ｇからなる群から選択されるベクターにに由来する項２０に記載の方法。
項２２．項１５〜２１のいずれかに記載の方法により得られる融合タンパク質から、糖結合タンパク質部分を除去してα２，３−シアリルトランスフェラーゼを採取する工程を含む、α２，３−シアリルトランスフェラーゼの製造方法。
項２３．糖結合タンパク質をコードするＤＮＡが、該タンパク質のＣ末端側にプロテアーゼ認識配列をコードする塩基配列を含み、該プロテアーゼの作用により融合タンパク質から糖結合タンパク質部分を除去する事を特徴とする項２２記載の方法。
項２４．プロテアーゼが血液凝固第Ｘａ因子、エンテロキナーゼ、ゲネナーゼＩからなる群から選択されるプロテアーゼである項２３記載の方法。
【００２５】
【発明の実施の形態】
本発明は、ＳＴ３ＧａｌＩＩ活性を有するタンパク質を、ＳＴ３ＧａｌＩＩと糖結合タンパク質との融合タンパク質としたこと、該融合タンパク質は可溶性タンパク質であることを特徴とするものである。
【００２６】
さらに、本発明は、ＳＴ３ＧａｌＩＩを糖結合タンパク質との融合タンパク質として大腸菌で発現させることにより、ＳＴ３ＧａｌＩＩを可溶性融合タンパク質として生成させるのを可能にしたこと、並びに糖結合タンパク質の有する特異的親和性を利用して融合タンパク質及びＳＴ３ＧａｌＩＩを容易且つ大量に精製するのを可能にしたことを特徴とする。
【００２７】
本発明の融合タンパク質
本発明において、ＭＢＰなどの糖結合タンパク質とＳＴ３ＧａｌＩＩとの融合タンパク質（以下、マルトース結合タンパク質との融合タンパク質の場合には、「ＭＢＰ−ＳＴ３ＧａｌＩＩ」と省略する場合もある）は、糖結合タンパク質の有する特異的親和性、すなわちＭＢＰの場合にはマルトース並びにマルトース残基を有する少糖類および多糖類に対する高親和性を保持し、且つＳＴ３ＧａｌＩＩが有する酵素活性、すなわちＣＭＰ−Ｓｉａを糖供与体として、糖受容体であるＧａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ−Ｒにシアル酸をα２−３結合で転移し、Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ−Ｒを生成する活性を保持する限り、いかなる形態のものであってもよい。さらに、図１に示すごとく、少なくとも糖結合タンパク質部分を除去した後に得られるＳＴ３ＧａｌＩＩが本来の酵素活性、すわなちＣＭＰ−Ｓｉａを糖供与体として、糖受容体であるＧａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ−Ｒにシアル酸をα２−３結合で転移し、Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ−Ｒを生成する活性を保持するものがよい。
【００２８】
好ましくは、該融合タンパク質は、糖結合タンパク質のＣ末端側にＳＴ３ＧａｌＩＩが連結されたものであり、特に好ましくは糖結合タンパク質とＳＴ３ＧａｌＩＩが融合部位において、酵素学的または化学的手段により容易に切断され得る構造を有するものである。
【００２９】
糖結合タンパク質とは、糖並びに糖残基を有する少糖類および多糖類に対する高親和性を保持するタンパク質であって、例えば、各種レクチン、マルトース結合タンパク質、セルロース結合タンパク質、キチン結合タンパク質などが例示できる。好ましくは、マルトース結合タンパク質、セルロース結合タンパク質、キチン結合タンパク質などであり、より好ましくは、マルトース結合タンパク質（以下、ＭＢＰと省略することがある。）である。
【００３０】
糖結合タンパク質は、いかなる生物種由来のものであっても良いが、このましくは細菌などの原核生物由来であり、より好ましくは大腸菌由来である。
【００３１】
また、該ＭＢＰは、マルトースまたはマルトース残基を有する少糖類（例えば、マルトトリオース等）もしくは多糖類（例えば、アミロース等）に対して特異的親和性を有する部位を有する限り、必ずしも全配列を含む必要はなく、該配列の一部を含むものであっても良い。公知のアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸からなり、マルトースまたはマルトース残基を有する少糖類（例えば、マルトトリオース等）もしくは多糖類（例えば、アミロース等）に対して特異的親和性を有する部位を有するタンパク質が例示できる。
【００３２】
本発明においては、ＭＢＰをコードする遺伝子としてｐＭＡＬｐ２或いはｐＭＡＬｐ２Ｘ或いはｐＭＡＬｐ２Ｅ或いはｐＭＡＬｐ２Ｇ或いはｐＭＡＬｃ２或いはｐＭＡＬｃ２Ｘ或いはｐＭＡＬｃ２Ｅ或いはｐＭＡＬｃ２Ｇ（全てＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ社製）に由来するものを使用することができる。
【００３３】
本発明の糖結合タンパク質は、該タンパク質のＣ末端側に配列特異性の高いプロテアーゼによって認識され切断されるアミノ酸配列を含むことが特に好ましい。そのようなプロテアーゼとしては、第Ｘａ因子、エンテロキナーゼ、ゲネナーゼＩ、トロンビン、レニンなどが挙げられるが、好ましくは、該プロテアーゼは第Ｘａ因子認識配列、すなわち、Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（配列番号３）又はＩｌｅ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（配列番号４）、エンテロキナーゼ認識配列、すなわち、Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ（配列番号５）、ゲネナーゼＩ認識配列、すなわち、Ｈｉｓ−Ｔｙｒ（配列番号６）又はＴｙｒ−Ｈｉｓ（配列番号７）であり、より好ましくは第Ｘａ因子認識配列又はエンテロキナーゼ認識配列である。このようなプロテアーゼ認識配列を糖結合タンパク質のＣ末端側に導入することにより、例えば、ＭＢＰ−ＳＴ３ＧａｌＩＩの精製後に該プロテアーゼを作用させて、ＭＢＰ部分を容易に除去することができる。
【００３４】
また、より好ましい態様においては、糖結合タンパク質は、糖結合タンパク質部位とプロテアーゼ認識部位の間に５〜１５アミノ酸残基程度のスペーサー配列を含む。該スペーサー配列の存在により、糖結合タンパク質はＳＴ３ＧａｌＩＩから遠ざかるために融合タンパク質の分子内相互作用の可能性が減じ、ＭＢＰ−ＳＴ３ＧａｌＩ融合タンパク質の場合、ＭＢＰ部分のマルトースやアミロースに対する特異的親和性が増大する。本発明の場合には、配列番号９（Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ− Ａｓｎ− Ａｓｎ− Ａｓｎ− Ａｓｎ− Ａｓｎ− Ａｓｎ− Ａｓｎ− Ａｓｎ− Ａｓｎ）のスペーサー配列を含むｐＭＡＬｐ２或いはｐＭＡＬｐ２Ｘ或いはｐＭＡＬｐ２Ｅ或いはｐＭＡＬｐ２Ｇ或いはｐＭＡＬｃ２或いはｐＭＡＬｃ２Ｘ或いはｐＭＡＬｃ２Ｅ或いはｐＭＡＬｃ２Ｇ（全てＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ社製）を使用することができる。
【００３５】
ＳＴ３ＧａｌＩＩも、いかなる生物種由来のものであってよいが、好ましくは哺乳動物由来であり、より好ましくはマウス由来である。さらに、本発明において、ＳＴ３ＧａｌＩＩは、ＳＴ３ＧａｌＩＩ活性を保持する限りＳＴ３ＧａｌＩＩ全長配列を含む必要はなく、該配列の一部を含むものであっても良い。例えば、（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質や（ｂ）上記（ａ）において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、α２，３−シアリルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質であってよい。
【００３６】
特に、ＳＴ３ＧａｌＩＩはゴルジ装置に存在する膜貫通タンパク質であるので、ＭＢＰ−ＳＴ３ＧａｌＩＩを可溶性タンパク質として生成させることを考慮すれば、疎水性の高い膜貫通ドメイン領域の全部又は一部を除いたＳＴ３ＧａｌＩＩの一部を使用することも、本発明の好ましい実施態様の１つである。具体的には、配列番号２のアミノ酸配列の少なくとも５４〜３５０で示されるアミノ酸配列を含んでいることが好ましい。
【００３７】
また、配列番号２のアミノ酸配列の少なくとも５４〜３５０で示されるアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸からなり、ＳＴ３ＧａｌＩＩ活性を有するタンパク質であってもよい。
【００３８】
本発明の融合タンパク質の製造方法
本発明において、糖結合タンパク質―ＳＴ３ＧａｌＩＩは、糖結合タンパク質をコードするＤＮＡとＳＴ３ＧａｌＩＩをコードするＤＮＡを、結果的に上記性質を有する融合タンパク質として転写・翻訳されるように−すなわちインフレームに（ｉｎｆｒａｍｅ）−連結したキメラＤＮＡを含む発現ベクターで大腸菌を形質転換し、得られる形質転換体を適当な培地中で培養することにより取得される。
【００３９】
本発明において、ＳＴ３ＧａｌＩＩをコードするＤＮＡは、いかなる生物種由来のものであっても良いが、好ましくは哺乳動物由来であり、より好ましくはマウス由来である。さらに、本発明において、ＳＴ３ＧａｌＩＩをコードするＤＮＡは、その転写翻訳産物がＳＴ３ＧａｌＩＩ活性を保持する限りＳＴ３ＧａｌＩＩ遺伝子の全コード量ＩＩを含む必要はなく、該コード領域に一部を含むものであっても良い。特に、ＳＴ３ＧａｌＩＩはゴルジ装置に存在する膜貫通タンパク質であるので、糖結合タンパク質―ＳＴ３ＧａｌＩＩを可溶性タンパク質として生成させることを考慮すれば、疎水性の高い膜貫通ドメインをコードする領域を除いたＳＴ３ＧａｌＩＩコード配列を使用することも、本発明の好ましい実施態様の１つである。
【００４０】
ＳＴ３ＧａｌＩＩをコードするＤＮＡは、公知のＳＴ３ＧａｌＩＩ遺伝子配列［例えば、非特許文献３又は４］の配列等に基づいて、自体公知のいかなる手法によっても調製することができる。例えば、公知のＳＴ３ＧａｌＩＩ遺伝子配列を基に、ＳＴ３ＧａｌＩＩのコード領域の全部または一部をカバーする適当なオリゴヌクレオチドプライマー対を合成し、ＳＴ３ＧａｌＩＩを発現する細胞又は組織から抽出した全ＲＮＡもしくはポリＡ^（＋）ＲＮＡ或いは染色体ＤＮＡを鋳型としてＲＴ−ＰＣＲを行うことによりクローニングすることができる。このとき、その後ろのベクターへのクローニングを容易にするために、用いるオリゴプライマーの末端に適当な制限酵素認識配列を付加することもできる。
【００４１】
あるいは、公知のＳＴ３ＧａｌＩＩ遺伝子配列を基に適当なオリゴヌクレオチドプローブを合成し、これを用いてＳＴ３ＧａｌＩＩを発現する細胞または組織から常法により調製したｃＤＮＡライブラリーをプラーク（またはコローニー）ハイブリダイゼーションによりスクリーニングすることによってもクローニングすることができる。
【００４２】
さらに、ＳＴ３ＧａｌＩＩをコードするＤＮＡは、部分または完全精製されたＳＴ３ＧａｌＩＩの全部又は一部を抗原として常法により抗体を作成し、これを用いてＳＴ３ＧａｌＩＩを発現する細胞または組織から常法により調製したｃＤＮＡライブラリーを抗体スクリーニングすることによってもクローニングすることができる。
【００４３】
あるいは、当該ＤＮＡは、公知のＳＴ３ＧａｌＩＩ遺伝子配列を基にＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成装置を用いて、センス鎖の部分配列とアンチセンス鎖の部分配列を一部がオーバーラップするように合成し、ＰＣＲ法によってより長い部分配列を二本鎖ＤＮＡとして得るという操作を繰り返すことによって、所望のＤＮＡ配列を得ることもできる。
本発明の好ましい態様においては、マウス由来α２，３−シアリルトランスフェラーゼ（以下、ｍＳＴ３ＧａｌＩＩと省略する場合もある）をコードするＤＮＡの全部または一部を含むものである。例えば、配列番号２に示されるアミノ酸配列中、少なくともアミノ酸番号５４〜３５０で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列、好ましくは配列番号１に示される塩基配列中、少なくとも塩基番号１６０〜１０５０で示される塩基配列を含むＤＮＡである。或いは、ｍＳＴ３ＧａｌＩＩをコードするＤＮＡは、該タンパク質の膜貫通部位の全部または一部に相当するアミノ酸配列を削除したアミノ酸配列をコードする塩基配列、好ましくは該タンパク質の膜貫通部位の全部または一部に相当するアミノ酸配列をコードする塩基配列を削除した塩基配列を含むＤＮＡである。ｍＳＴ３ＧａｌＩＩの膜貫通ドメインは、疎水性プロット分析の結果から、配列番号２に示されるアミノ酸配列中、アミノ酸番号７〜２７で示される部分であると推定されている。したがって、該ドメインをコードするＤＮＡは、好ましくは配列番号１に示される塩基配列中、塩基番号１９〜８１で示される塩基配列である。
【００４４】
もちろん、ｍＳＴ３ＧａｌＩＩをコードするＤＮＡは、配列番号２に示されるアミノ酸配列の全部をコードする塩基配列を含むＤＮＡ、好ましくは配列番号１に示される塩基配列の全部を含むＤＮＡであってもよい。
【００４５】
本発明において、糖結合タンパク質をコードするＤＮＡは、上述の各種タンパク質をコードするＤＮＡが例示され、好ましくは、マルトース結合タンパク質、セルロール結合タンパク質またはキチン結合タンパク質をコードするＤＮＡであり、より好ましくは、マルトース結合タンパク質をコードするＤＮＡである。
【００４６】
また、該ＤＮＡは、いかなる生物種由来のものであってもよいが、好ましくは細菌などの原核生物由来であり、より好ましくは大腸菌由来である。
【００４７】
また、該ＭＢＰをコードするＤＮＡは、マルトースマルトース残基を有する少糖類（例えば、マルトトリオース等）もしくは多糖類（例えば、アミロース等）に対して特異的親和性を有する翻訳産物をコードする限り、必ずしもコード領域の全部を含む必要はなく、該コード領域の一部を含むものであってもよい。
【００４８】
大腸菌由来のＭＢＰは、ペリプラズムに存在する分泌タンパク質であり、初期翻訳産物はそのＮ末端にシグナルペプチドを含む。本発明のＭＢＰをコードするＤＮＡは、宿主大腸菌で機能し得るシグナルペプチドをコードする塩基配列（シグナル配列）を含むものであってもよいし、含まないものであってもよい。大腸菌は細胞壁の外側に外膜を有するグラム陰性菌であるから、ＭＢＰをコードするＤＮＡがシグナル配列を含む場合であっても、発現したＭＢＰ−ＳＴ３ＧａｌＩＩが培地中にまで分泌される可能性は低い。しかしながら、ＭＢＰ−ＳＴ３ＧａｌＩＩがペリプラズム空間に蓄積すれば、菌体を完全に破砕せずにスフェロプラスト化することにより該融合タンパク質を回収することができるので、その後の精製をより容易に行うことができる。但し、この場合には、特にＳＴ３ＧａｌＩＩの膜貫通ドメインを削除しておくことが好ましい。該ドメインが存在すると、ＭＢＰ−ＳＴ３ＧａｌＩＩはペリプラズム空間に到達せずに内膜にとどまる可能性があり、該融合タンパク質の回収が煩雑になるからである。
【００４９】
本発明のＭＢＰをコードするＤＮＡは、該タンパク質のＣ末端側に配列特異性の高いプロテアーゼによって認識され切断されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むことが特に好ましい。そのようなプロテアーゼとしては、第Ｘａ因子、エンテロキナーゼ、ゲネナーゼＩ、トロンビン、レニンなどが挙げられるが、好ましくは、該プロテアーゼは第Ｘａ因子認識配列、すなわち、Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（配列番号３）又はＩｌｅ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（配列番号４）、エンテロキナーゼ認識配列、すなわち、Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ（配列番号５）、ゲネナーゼＩ認識配列、すなわち、Ｈｉｓ−Ｔｙｒ（配列番号６）又はＴｙｒ−Ｈｉｓ（配列番号７）であり、より好ましくは第Ｘａ因子認識配列又はエンテロキナーゼ認識配列である。このようなプロテアーゼ認識配列を糖結合タンパク質のＣ末端側に導入することにより、例えば、ＭＢＰ−ＳＴ３ＧａｌＩＩの精製後に該プロテアーゼを作用させて、ＭＢＰ部分を容易に除去することができる。
【００５０】
より好ましい態様においては、糖結合タンパク質をコードするＤＮＡは、糖結合タンパク質コード領域とプロテアーゼ認識部位の間に５〜１５アミノ酸残基程度のスペーサー配列を含む。該スペーサー配列の存在により、糖結合タンパク質はＳＴ３ＧａｌＩＩから遠ざかるために融合タンパク質の分子内相互作用の可能性が減じ、ＭＢＰ−ＳＴ３ＧａｌＩ融合タンパク質の場合、ＭＢＰ部分のマルトースやアミロースに対する特異的親和性が増大する。
【００５１】
ＭＢＰをコードするＤＮＡは、公知のＭＢＰ遺伝子配列［例えば、大腸菌由来ＭＢＰ、非特許文献５参照］を基に、ＳＴ３ＧａｌＩＩをコードするＤＮＡについて例示したと同様の自体公知の手段を用いてクローニングすることができ、また、常法によりＭＢＰのＣ末端側に上記のプロテアーゼ認識配列およびスペーサー配列を導入することができる。本発明の場合には、配列番号８のスペーサー配列を含む。
【００５２】
また、大腸菌由来ＭＢＰをコードするＤＮＡは、例えば、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ社製のｐＭＡＬｐ２（シグナル配列を含む）或いはｐＭＡＬｐ２Ｘ（シグナル配列を含む）或いはｐＭＡＬｐ２Ｅ（シグナル配列を含む）或いはｐＭＡＬｐ２Ｇ（シグナル配列を含む）或いはｐＭＡＬｃ２（シグナル配列を欠失する）或いはｐＭＡＬｃ２Ｘ（シグナル配列を欠失する）或いはｐＭＡＬｃ２Ｅ（シグナル配列を欠失する）或いはｐＭＡＬｃ２Ｇ（シグナル配列を欠失する）のような市販のベクターから得ることができる。
【００５３】
糖結合タンパク質−ＳＴ３ＧａｌＩＩ融合タンパク質をコードするキメラＤＮＡの構築を容易にするために、糖結合タンパク質をコードするＤＮＡの末端に、常法により適当な制限酵素認識部位を付加することができる。ＳＴ３ＧａｌＩＩをコードするＤＮＡをベクター中にクローニングする際に、ＳＴ３ＧａｌＩＩのＮ末端側に制限酵素認識部位を付加した場合は、糖結合タンパク質をコードするＤＮＡにも同じ制限酵素認識部位（もしくは同じ粘着末端を生じる別の制限酵素認識部位）を導入すればよい。
【００５４】
本発明の発現ベクターは、上記の糖結合タンパク質−ＳＴ３ＧａｌＩＩをコードするキメラＤＮＡが、大腸菌で機能し得るプロモーターの制御下におかれた、任意の発現ベクターである。該プロモータ領域には、ＲＮＡポリメラーゼの結合位置を決定するコンセンサス配列である−３５領域および−１０領域が含まれる。所望の組換えタンパク質を大量に発現させる系として、誘導酵素のプロモーター領域を使用することがより望ましい。このようなプロモーター領域としてｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｔａｃプロモーター等が挙げられる。これらのプロモーター領域は、リプレッサータンパク質が結合するオペレーターをさらに含む。誘導物質（例えば、ｌａｃプロモーターではラクトースやＩＰＴＧ）を添加するとリプレッサータンパク質のオペレーターへの結合が抑制され、プロモーターの制御下におかれた遺伝子が大量に発現する。また、該発現ベクターは、翻訳開始コドンの上流にコンセンサスなＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ（ＳＤ）配列を含む。さらに、該発現ベクターは、糖結合タンパク質−ＳＴ３ＧａｌＩＩをコードするキメラＤＮＡの下流に転写終結シグナル、すなわちターミネーター領域を含有する。ターミネーター領域としては、通常使用されている天然または合成のターミネーターを用いることができる。本発明の発現ベクターは、上記のプロモーター領域およびターミネーター領域に加えて、宿主大腸菌内で自立複製し得る複製起点を含む必要がある。このような複製起点としては、ＣｏｌＥ１ｏｒｉ、Ｍ１３ｏｒｉなどが挙げられる。
【００５５】
本発明の発現ベクターは、形質転換体選択のための選択マーカー遺伝子をさらに含有していることが好ましい。選択マーカー遺伝子としては、テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン等の各種薬剤に対する耐性遺伝子を用いることができる。また、宿主大腸菌が栄養要求性変異株の場合には、選択マーカー遺伝子として当該栄養要求性を相補する野生型遺伝子を用いることもできる。
【００５６】
本発明の形質転換体は、本発明の発現ベクターで宿主大腸菌を形質転換することにより調製することができる。宿主の菌株は特に限定されず、例えば、市販のＸＬ１−Ｂｌｕｅ株、ＢＬ−２１株、ＪＭ１０７株、ＴＢ１株、ＪＭ１０９株、Ｃ６００株、ＤＨ５α株、ＨＢ１０１株等が挙げられる。
【００５７】
発現ベクターの宿主細胞への導入は、従来公知の方法を用いて行うことができる。例えば、Ｃｏｈｅｎらの方法（塩化カルシウム法）（非特許文献６参照）、プロトプラスト法（非特許文献７参照）、コンピテント法（非特許文献８参照）、エレクトロポレーション法等が挙げ有られる。
【００５８】
糖結合タンパク質−ＳＴ３ＧａｌＩＩは、上記の糖結合タンパク質−ＳＴ３ＧａｌＩＩをコードするキメラＤＮＡを含む発現ベクターを発現する形質転換体を、適当な培地中で培養し、得られる培養物から糖結合タンパク質−ＳＴ３ＧａｌＩＩを回収することにより得ることができる。
【００５９】
用いられる培地としては、炭素源としてグルコース、フルクトース、グリセロール、スターチなどの炭水化物を含有するものである。また無機もしくは有機窒素源（例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、カゼインの加水分解物、酵母抽出物、ポリペプトン、バクトトリプトン、ビーフ抽出物等）を含んでいてもよい。これらの炭素源および窒素源は、純粋な形で使用する必要はなく、純度の低いものも微量の生育因子や無機栄養を豊富に含んでいるので有利である。さらに所望により、多の栄養源［例えば、無機塩（例えば、二リン酸ナトリウムまたは二リン酸カリウム、リン酸水素二カリウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシウム）、ビタミン類（例えば、ビタミンＢ１）、抗生物質（例えば、アンピシリン、カナマイシン）など］を培地中に添加しても良い。
【００６０】
形質転換体の培養は、通常ｐＨ５．５〜８．５、好適にはｐＨ６〜８、通常１８〜４０℃、好適には２０〜３５℃で、１〜１５０時間行われるが、これらは培養条件および培養規模によって適宜変更することができる。
【００６１】
培養を大型タンク内で行う場合は、目的タンパク質の生産工程における生育遅延を回避するために、菌体を少量の培地に接種して１〜２４時間前培養した後、得られた種培養液を大型タンク中に接種するのが好ましい。
【００６２】
糖結合タンパク質−ＳＴ３ＧａｌＩＩの発現が、誘導タンパク質遺伝子のプロモーター系によって制御される場合、誘導物質は誘導開始時から添加しておいてもよいが、対数増殖期初期に添加するのがより好ましい。菌の増殖は、培養液の６６０ｎｍにおける吸光度を測定することによってモニタリングできる。例えば、ｌａｃプロモーターやｔａｃプロモーターを使用する場合、６６０ｎｍにおける吸光度が０．４〜０．６になった時点で、誘導物質としてイソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド（以下、ＩＰＴＧと省略する場合もある）を、例えば０．１〜１．０ｍＭとなるように添加することができる。誘導物質の添加時期や添加速度は、培養条件、培養規模、誘導物質の種類によって適宜変更することができる。
【００６３】
本発明の方法では、糖結合タンパク質−ＳＴ３ＧａｌＩＩの精製は、該融合タンパク質の存在する画分を、その糖結合タンパク質と特異的に結合する各種糖残基を含むリガンドを結合した不溶性担体をを用いたアフィニティクロマトグラフィーに付することにより、一段階で達成することができる。
【００６４】
例えば、糖結合タンパク質がＭＢＰの場合、ＭＢＰをコードするＤＮＡが、シグナル配列を欠失している場合、ＭＢＰ−ＳＴ３ＧａｌＩＩは菌体の可溶性画分に局在するので、その場合、培養終了後に培養物を濾過もしくは遠心分離して菌体を回収し、リゾチーム処理および界面活性剤処理、超音波処理、あるいは浸透圧ショック等によって細胞を破砕して、得られる菌体抽出液をアフィニティクロマトグラフィーに用いる。
【００６５】
一方、ＭＢＰをコードするＤＮＡがシグナル配列を有する場合、発現したＭＢＰ−ＳＴ３ＧａｌＩＩは分泌されたペリプラズム空間に蓄積している可能性が高い。したがって、その場合、リゾチーム処理等によって菌体をスフェロプラスト化してＭＢＰ−ＳＴ３ＧａｌＩＩを溶液中に遊離させ、濾過もしくは遠心分離して菌体を除去した後、得られる上清をアフィニティクロマトグラフィーに用いる。
【００６６】
アフィニティクロマトグラフィーの吸着体としては、例えば、ＭＢＰの場合には、アミロースをアガロースビーズに固定化したアミロース樹脂（例えば、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ社製のＡｍｙｌｏｓｅｒｅｓｉｎ等）を使用することができるが、他のＭＢＰに対するリガンド及び他の不溶性マトリックス基（例えばセルロース、デキストラン、合成ポリーマー等）を使用してもよい。
【００６７】
糖結合タンパク質−ＳＴ３ＧａｌＩＩは、上記のように調製されたそれを含む画分に該吸着体を加えて適当な時間撹拌した後濾過して、吸着体を洗浄し、さらに適当な濃度の糖結合タンパク質と吸着体の結合を阻害する糖（例えば、ＭＢＰの場合にはマルトース）を含む溶離液を加えて適当な時間撹拌した後濾過することにより、濾液中に精製される。あるいは、該吸着体をカラムに充填して糖結合タンパク質−ＳＴ３ＧａｌＩＩ含有画分をアプライし、適当な緩衝液で洗浄した後、適当な濃度の上記溶離液をアプライしてカラムに吸着した糖結合タンパク質−ＳＴ３ＧａｌＩＩを溶出することによって得ることもできる。
【００６８】
このようにして得られた本発明のＭＢＰ−ＳＴ３ＧａｌＩＩは、ＳＴ３ＧａｌＩＩ活性を有するので、このまま、酵素として使用することができる。
【００６９】
ＳＴ３ＧａｌＩＩの調製
上述のように、本発明の好ましい態様においては、糖結合タンパク質―ＳＴ３ＧａｌＩＩはその融合部位に配列特異的なプロテアーゼによって認識切断されるアミノ酸配列を含むので、上記のようにして精製された糖結合タンパク質−ＳＴ３ＧａｌＩＩに該プロテアーゼを作用させることにより糖結合タンパク質部分が除去されて、所望のＳＴ３ＧａｌＩＩが生成する。好ましくは、該プロテアーゼは第Ｘａ因子である。本発明においては配列番号３の第Ｘａ因子認識配列を含むｐＭＡＬｐ２、ｐＭＡＬｐ２Ｘ、ｐＭＡＬｃ２、或いはｐＭＡＬｃ２Ｘ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ社製）を使用することができる。糖結合タンパク質―ＳＴ３ＧａｌＩＩにプロテアーゼを作用させる際の反応温度、溶液のｐＨ、反応時間等は、使用するプロテアーゼの種類に応じて適宜選択することができるが、例えば、第Ｘａ因子の場合、中性緩衝液中、４〜４０℃で１〜２５時間反応させることにより、糖結合タンパク質とＳＴ３ＧａｌＩＩとを開裂させることができる。反応終了後、反応液に上記の吸着体を加えて適当な時間撹拌することにより、遊離した糖結合タンパク質のみが吸着体に吸着するので、該吸着体を濾過することによりＳＴ３ＧａｌＩＩのみを精製することができる。あるいは、該吸着体を充填したカラムに反応液をアプライして素通り画分を回収することによってもＳＴ３ＧａｌＩＩを精製することができる。
【００７０】
【実施例】
以下に、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、これらは単なる例示であって、本発明の範囲はかかる実施例に何ら限定されるものではない。
【００７１】
実施例１ＰＣＲによるｍＳＴ３ＧａｌＩＩｃＤＮＡ断片の取得及び発現ベクターの構築
（１）ＰＣＲプライマーの設計
配列番号１記載のマウスα２，３−シアリルトランスフェラーゼ（ＳＴ３ＧａｌＩＩ）ｃＤＮＡの塩基配列をもとに、配列番号１０及び１１に示されるオリゴヌクレオチドを合成した。前者は配列番号１に示される塩基配列中塩基番号１６０〜１７８で示される塩基配列であり、後者は配列番号１に示される塩基配列中塩基番号１０３６〜１０５３で示される塩基配列である。
【００７２】
（２）マウス脳由来ＲＮＡからの逆転写反応
マウス脳からＲＮＡ抽出キット（ＲＮｅａｓｙ：ＱＩＡＧＥＮ社製品）により抽出した５μｇのＴｏｔａｌＲＮＡを鋳型として、ランダムプライマーを用いたＲＴＰＣＲｈｉｇｈ（ＲＴＰＣＲｈｉｇｈ：東洋紡社製）による逆転写反応を行った。得られた反応液をマウス脳１ｓｓｃＤＮＡ溶液とした。
【００７３】
（３）ＰＣＲ反応
上記マウス脳１ｓｓｃＤＮＡ及び上記合成オリゴヌクレオチドを用いて、以下の条件によりＰＣＲ反応を行った。
［マウス脳１ｓｓｃＤＮＡ２．５μｌ、２ｍＭｄＮＴＰｓ（東洋紡社製）２．５μｌ、Ｘ１０ＫＯＤＢｕｆｆｅｒＮｏ．１（東洋紡社製）２．５μｌ、２５ｍＭＭｇＣｌ_２（東洋紡社製）１．０μｌ、１０ｐｍｏｌｅ／μｌの配列番号１０に記載のオリゴヌクレオチド１．０μｌ、１０ｐｍｏｌｅ／μｌの配列番号１１に記載のオリゴヌクレオチド１．０μｌ、０．３Ｕ／μｌＫＯＤＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡社製）０．５μｌ、反応液容量２５μｌ、９８℃（３０秒間）−６１℃（３０秒間−７４℃（３０秒間）を４サイクル後、９８℃（３０秒間）−６４℃（３０秒間）−７４℃（３０秒間）を３１サイクル］。
ＰＣＲ反応後、反応液をアガロースゲル電気泳動に供し、ＰＣＲ産物であるＤＮＡ断片の確認を行った。
【００７４】
（４）塩基配列の確認及び発現ベクターの構築
該ＤＮＡ断片を制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩにて切断した後、予め同制限酵素にて切断しておいたｐＭＡＬｃ２或いはｐＭＡＬｐ２（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ社製）とＬｉｇａｔｉｏｎＨｉｇｈ（東洋紡社製）を用いて連結し、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢプレート培地で選抜した。
【００７５】
大腸菌より該ＤＮＡ断片を保持するプラスミドを調製、該ＤＮＡ断片のヌクレオチド配列を常法に従って決定した結果、配列番号１２に示される塩基配列であることが明らかとなった。本配列は、配列番号１に記載の塩基配列中塩基番号１６０〜１０５３で示される塩基配列と、７７６番目の塩基と７７８番目の塩基が異なる以外は一致することが分かり、所望のｍＳＴ３ＧａｌＩＩのｃＤＮＡ断片が得られたことが確認された。また、ｐＭＡＬｃ２にＰＣＲ断片を連結して構築されたベクターをｐＭＳ３Ｇ２−Ｃ１０１、ｐＭＡＬｐ２にＰＣＲ断片を連結して構築されたベクターをｐＭＳ３Ｇ２−Ｐ１０１と命名し、発現ベクターの構築も同時に完了した。
【００７６】
実施例２ＳＴ３ＧａｌＩＩの発現確認
（１）組換え大腸菌を用いたＭＢＰ−ｍＳＴ３ＧａｌＩＩ融合タンパク質の調製
実施例１で得られた発現ベクターｐＭＳ３Ｇ２−Ｃ１０１或いはｐＭＳ３Ｇ２−Ｐ１０１で形質転換された大腸菌ＪＭ１０９株を５０μｇ／ｍｌアンピシリン、及び０．２％グルコースを含むＬＢ培地５ｍｌの入った試験管に一白金耳植菌し、３７℃にて一晩振とう培養を行った。得られた培養液５００μｌを、同培地５０ｍｌの入った５００ｍｌ培養フラスコに植菌した。３７℃にて振とう培養を行った後、ＯＤ６６０＝３．０〜４．０に達した時点で、培養温度を２５℃に低下させ、そのまま２５℃にて３０分間培養を行った後、最終濃度０．３ｍＭのＩＰＴＧを加え、さらに２５℃にて培養を１６時間続けた。培養後、菌体を遠心分離により集め、緩衝液１（２０ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ７．５０．２ＭＮａＣｌ１ｍＭＥＤＴＡ１ｍＭＢｅｎｚａｍｉｄｉｎｅＨＣｌ１０ｍＭ２メルカプトエタノール）２０ｍｌに懸濁、超音波破砕装置にて菌体を破砕した後、遠心分離により得られた上清を粗酵素液とした。予め緩衝液１で平衡化しておいたアミロースレジン（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ社製）カラム（５ｍｌ）に、該粗酵素液を通過することにより、ＭＢＰ−ｍＳＴ３ＧａｌＩＩ融合タンパク質を吸着させた。緩衝液１でカラムを洗浄した後、１０ｍＭマルトースを含む緩衝液１で吸着したＭＢＰ−ｍＳＴ３ＧａｌＩＩ融合タンパク質を溶出させた。溶出画分を集め、脱塩カラムＰＤ−１０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）にてマルトースを除去したものをＭＢＰ−ｍＳＴ３ＧａｌＩＩ融合タンパク質溶液とした。
【００７７】
（２）ＳＴ３ＧａｌＩＩ基質の調製
ガングリオシドＧＴ１ｂ（東洋紡社製）（化１）１ｍｇをｒＥＧＣａｓｅＩＩ（ＴａＫａＲａ酒造社製）処理・Ｆｏｌｃｈ分配に供し、ＧＴ１ｂ糖鎖（化２）を得た。
得られたＧＴ１ｂ糖鎖を常法に従い（非特許文献９）２アミノピリジンにより蛍光標識・ゲル濾過精製し、ＧＴ１ｐ−ＰＡ（化３）を得た。
得られたＧＴ１ｂ−ＰＡを１Ｎ蟻酸処理・ＨＰＬＣ（ＯＤＳカラム）精製し、アシアロＧＭ１ａ−ＰＡ（化４）の調製を行った。定量の結果、２８６ｎｍｏｌｅのアシアロＧＭ１ａ−ＰＡが得られた。
【００７８】
【化１】

【００７９】
【化２】

【００８０】
【化３】

【００８１】
【化４】

【００８２】
（３）ＳＴ３ＧａｌＩＩ活性測定
０．５ＭＭＥＳ緩衝液ｐＨ６．５を４μｌ、２００ｍＭＭｇＣｌ２を１μｌ、５７２μＭアシアロＧＭ１ａ−ＰＡ（上記（２）で得られたもの）を２μｌ、１ｍＭＣＭＰ−Ｓｉａ（Ｓｉｇｍａ社製）を５μｌ、上記（１）で得られたＭＢＰ−ｍＳＴ３ＧａｌＩＩ融合タンパク質溶液を５μｌからなる反応液２０μｌを３７℃にて１５分間反応後、１分間の煮沸により反応を停止した。該反応液にＭｉｌｌｉＱ水８０μｌを添加、混合後、遠心分離よって得られ上清２０μｌをＨＰＬＣにより分析し、反応産物のＧＭ１ａ−ＰＡの量を測定した。その結果、ｐＭＳ３Ｇ２−Ｃ１０１で形質転換された大腸菌ＪＭ１０９が高いＳＴ３ＧａｌＩＩ活性を示した（図２）。また、ｐＭＳ３Ｇ２−Ｐ１０１で形質転換された大腸菌ＪＭ１０９も弱いながらもＳＴ３ＧａｌＩＩ活性を示した（図２）。ＳＴ３ＧａｌＩＩ活性を上記反応条件により、一分間当たりに１μｍｏｌｅのシアル酸をアシアロＧＭ１ａ−ＰＡに転移する酵素量と定義した場合、ｐＭＳ３Ｇ２−Ｃ１０１で形質転換された大腸菌ＪＭ１０９のＳＴ３ＧａｌＩＩの生産性は、３．５Ｕ／Ｌ−Ｂｒｏｔｈと算出された。
【００８３】
実施例３ＭＢＰ − ｍＳＴ３ＧａｌＩＩ融合タンパク質の諸性質検討
実施例２で得られたｐＭＳ３Ｇ２−Ｃ１０１で形質転換された大腸菌ＪＭ１０９由来のＭＢＰ−ｍＳＴ３ＧａｌＩＩ融合タンパク質の諸性質の検討をおこなった。
【００８４】
（１）至適反応ｐＨの検討
同条件により、ｐＨ４．０〜ｐＨ８．０におけるＳＴ３ＧａｌＩＩ活性の測定を行った結果、ｐＨ５．５〜８．０でＳＴ３ＧａｌＩＩ活性が検出され、至適反応ｐＨはｐＨ６．５付近であることが確認された（図３）。
【００８５】
（２）二価カチオンの影響の検討
同条件により、種々の二価カチオンの活性に及ぼす影響について検討を行った結果、ＥＤＴＡ存在下でも活性が検出されることから、ＳＴ３ＧａｌＩＩ活性には必ずしも二価カチオンは必要ないが、二価カチオン存在下でＳＴ３ＧａｌＩＩ活性が活性化されることが確認された（図４）。
【００８６】
（３）至適ＣＭＰ−Ｓｉａ濃度の検討
同条件により、ＭＢＰ−ＳＴ３ＧａｌＩＩ融合タンパク質の至適ＣＭＰ−Ｓｉａ濃度の検討を行った結果、ＣＭＰ−Ｓｉａの至適濃度は２５０μＭ付近であることが確認された（図５）。
【００８７】
（４）アシアロＧＭ１ａ−ＰＡ濃度の影響についての検討
同条件により、種々の濃度のアシアロＧＭ１ａ−ＰＡにおけるＳＴ３ＧａｌＩＩ活性を測定した結果、ＭＢＰ−ｍＳＴ３ＧａｌＩＩのアシアロＧＭ１ａ−ＰＡに対するＫｍ値は５．７μＭと算出された（図６）。
【００８８】
【表１】

【００８９】
【発明の効果】
本発明の方法では、α２，３−シアリルトランスフェラーゼ（ＳＴ３ａｌＩＩ）活性を有する融合タンパク質を可溶性タンパク質として容易に効率よく大量に生産することができる。また、融合タンパク質からα２，３−シアリルトランスフェラーゼ（ＳＴ３ａｌＩＩ）そのものも容易に得ることができる。
【００９０】
本発明によって得られるα２，３−シアリルトランスフェラーゼ（ＳＴ３ａｌＩＩ）は、自体糖鎖工学研究用試薬として有用で有るだけでなく、得られたα２，３−シアリルトランスフェラーゼ（ＳＴ３ａｌＩＩ）を利用することにより、研究用途或いは医薬用途として有用な種々のガングリオシド、或いはガングリオシド類似体、シアル酸含有糖鎖、シアル酸含有糖鎖を含む種々の化学物質等の糖鎖合成が容易になる。さらに、種々の有用タンパク質や種々の糖鎖含有化学物質の糖鎖修飾にも利用が可能となる。また、研究用途或いは医薬用途として有用なα２，３−シアリルトランスフェラーゼ（ＳＴ３ａｌＩＩ）抗体を容易に得ることが可能となる。
【００９１】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】本図は、ＳＴ３ＧａｌＩＩが触媒する反応を示した図である。即ち、糖ヌクレオチドであるＣＭＰ−シアル酸（ＣＭＰ−Ｓｉａ）をシアル酸供与体として、糖受容体であるＧａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ−Ｒにシアル酸をα２−３結合で転移し、Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ−Ｒを生成せしめる反応を示している。
【図２】本図は、大腸菌で発現させたＭＢＰ−ＳＴ３ＧａｌＩＩ融合タンパク質のＳＴ３ＧａｌＩＩ活性測定の結果を示した図である。
【図３】本図は、大腸菌で発現したＭＢＰ−ＳＴ３ＧａｌＩＩのＳＴ３ＧａｌＩＩ活性に及ぼす反応液のｐＨの影響について示した図である。
【図４】本図は、大腸菌で発現したＭＢＰ−ＳＴ３ＧａｌＩＩのＳＴ３ＧａｌＩＩ活性に及ぼす二価カチオンの影響について示した図である。
【図５】本図は、大腸菌で発現したＭＢＰ−ＳＴ３ＧａｌＩＩのＳＴ３ＧａｌＩＩ活性に及ぼすＣＭＰ−シアル酸濃度の影響について示した図である。
【図６】本図は、大腸菌で発現したＭＢＰ−ＳＴ３ＧａｌＩＩのＳＴ３ＧａｌＩＩ活性に及ぼす糖受容体アシアロＧＭ１ａ−ＰＡ濃度の影響について示した図である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for efficiently producing α2,3-sialyltransferase, which is a kind of glycoprotein processing enzyme, at low cost. Specifically, the present invention relates to a fusion protein of maltose-binding protein and α2,3-sialyltransferase protein and a method for producing the protein in Escherichia coli.
[0002]
[Prior art]
Sugar chains in which various monosaccharides are linked by glycosidic bonds exist in cells as intracellular organelle components, cell surface components, secreted glycoproteins, and the like. The structure of these sugar chains varies depending on the species and tissue, but also varies depending on the time of occurrence and disease within the same organism and tissue, so the previously proposed protein thermal stability and hydrophilicity In addition to functions such as imparting physical properties to proteins such as charge and protease resistance, it is clear that sugar chains are involved in intercellular recognition such as development / differentiation, nervous system, immune system, and metastasis of cancer. In recent years, much attention has been paid to its application to various fields such as pharmaceuticals.
[0003]
These sugar chains are synthesized by glycosyltransferase in vivo. Glycosyltransferase is an enzyme that uses a sugar nucleotide as a sugar donor to transfer sugar to a sugar chain as an acceptor and to extend the sugar chain, and the specificity of the sugar acceptor for the sugar chain structure is strict. In general, it is said that one glycosidic bond is formed by one glycosyltransferase. These glycosyltransferases are important enzymes in that they are used for sugar chain research, particularly for convenient synthesis of useful sugar chains and modification of natural sugar chains. However, the amount of naturally occurring glycosyltransferase is extremely small, and it was practically difficult to supply a large amount stably.
[0004]
α2,3-sialyltransferase is an important enzyme involved in the formation of glycoprotein or glycolipid sugar chains, and CMP-Sia is used as a sugar donor and glycoprotein or glycolipid Galβ1-3 as a sugar acceptor. (4) It is an enzyme that transfers sialic acid to galactose at the terminal of -R sugar chain by α2-3 bond to generate Siaα2-3Galβ1-3 (4) -R sugar chain (where R is various sugar chains) . Currently, five types of α2,3-sialyltransferases, ST3GalI to V, are known due to their substrate specificity (see, for example, Non-Patent Document 1 and Table 1).
[0005]
Among these, α2,3-sialyltransferase in the present invention is called ST3GalII, is an enzyme that exhibits strong activity against Galβ1-3GalNAc-R and generates Siaα2-3Galβ1-3GalNAc-R (for example, Non-Patent Document 1 and Table 1). It is also known that it is weakly active against Galβ1-3GlcNAc-R and Galβ1-4GlcNAc-R, and produces Siaα2-3Galβ1-3GlcNAc-R and Siaα2-3Galβ1-4GlcNAc-R. (For example, see Non-Patent Document 1 and Table 1). Comparing basic kinetics, it is considered that glycolipids are better substrates than glycoproteins (see, for example, Non-Patent Documents 1 and 2). In vivo, Galβ1-3GalNAcβ1-4Galβ1-4Glc-Cer, Galβ1-3GalNAcβ1-4 (Siaα2-3) Galβ1-4Glc-Cer, Galβ1-3GalNAcβ1-4 (Siaα2-8Siaα2-3) Galβ1-4Glc-Cer, Galβ1-3GalNAcβ1-4 (Siaα2-8Siaα2-8Siaα2-3G Using glycolipids such as 4Glc-Cer as a substrate, Siaα2-3Galβ1-3GalNAcβ1-4Galβ1-4Glc-Cer, Siaα2-3Galβ1-3GalNAcβ1-4 (Siaα2-3) Galβ1-4Gl -Cer, Siaα2-3Galβ1-3GalNAcβ1-4 (Siaα2-8Siaα2-3) Galβ1-4Glc-Cer, Siaα2-3Galβ1-3GalNAcβ1-4 (Siaα2-8Siaα2-8Siaα2-3) Galβ1-4Glc-Cer It is thought to be deeply involved in the biosynthesis of ganglioside, a sialic acid-containing glycolipid.
[0006]
As described above, a stable supply of the enzyme has been desired because it is a Key sugar chain for forming a ganglioside sugar chain.
[0007]
This α2,3-sialyltransferase (hereinafter sometimes abbreviated as ST3GalII) is known to exist in various organs of animals, but it is difficult to obtain a large amount and a stable organ, and Since it is very time-consuming to purify to a single protein, production by genetic recombination is expected.
[0008]
As the cDNA encoding the enzyme, those derived from mouse and rat (see Non-Patent Document 3) and human (see Non-Patent Document 4) have been isolated by Tsubaki.
[0009]
In consideration of cost, mass production of a recombinant protein is advantageous by expressing the protein in microorganisms such as bacteria and yeast. However, in the expression system of microorganisms, many of the expressed proteins may exist as insoluble inclusion bodies (inclusion bodies), which requires a solubilization / regeneration process prior to purification. I couldn't say that. Furthermore, in order to obtain an enzyme expressed as a partly soluble protein with high purity, many purification steps including various chromatographic processes are required, and it takes a lot of time and cost. The expression of was not sufficient.
[0010]
On the other hand, as a method of expressing a target gene in a large amount and facilitating purification of an expression product, there is a method of expressing a target protein as a fusion protein with glutathione-S-transferase (GST), protein A or the like. . In the method, a fusion protein with GST. The protein can be easily purified by affinity column chromatography using glutathione as a ligand, and the fusion protein with protein A can be purified by affinity chromatography using IgG as a ligand. However, when this method is used, there is a high possibility of producing inclusion bodies as in the previous period. For these reasons, it has been practically difficult to stably supply a large amount of ST3GalII.
[0011]
[Non-Patent Document 1]
"Protein Nucleic Acid Enzyme December 1998 Special Issue Glycobiology From Glycan Information Transmission to Reception Mechanism", Kyoritsu Shuppan Co., Ltd., p77, 1998
[0012]
[Non-Patent Document 2]
“Biochemistry”, 33, p. 5772, 1994.
[0013]
[Non-Patent Document 3]
“The Journal of Biological Chemistry”, 269, p10028, 1994
[0014]
[Non-Patent Document 4]
“Biochemical and Biophysical Research Communications”, 228, 324, 1996
[0015]
[Non-Patent Document 5]
“The Journal of Biological Chemistry”, 259, p10606, 1984
[0016]
[Non-Patent Document 6]
"Proceedings of the National Academy of the United States of America", Vol. 69, p. 2110, p. 1910, "Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America".
[0017]
[Non-Patent Document 7]
"Molecular Genetics and Genomics", 168, p111, 1979
[0018]
[Non-Patent Document 8]
"Journal of Molecular Biology", 56, p209, 1971
[0019]
[Non-patent document 9]
"Cell engineering separate volume Experimental protocol series Glycobiology experimental protocol glycoprotein, glycolipid, proteoglycan", Shujunsha, 1996
[0020]
[Problems to be solved by the invention]
Therefore, an object of the present invention is to provide a protein having ST3GalII activity inexpensively and efficiently.
[0021]
[Means for Solving the Problems]
As a result of intensive studies to solve the above-mentioned problems, the present inventors have found that E. coli as a fusion protein with a sugar-binding protein such as maltose binding protein (hereinafter sometimes abbreviated as MBP) by ST3GalII by genetic manipulation. ST3GalII can be obtained as a soluble protein, and the protein can be easily purified by affinity chromatography using the specific affinity of a sugar-binding protein, and the resulting fusion protein exhibits ST3GalII activity. I have found it.
[0022]
Furthermore, the present inventors have found that ST3GalII can also be obtained from the fusion protein by a protease that specifically cleaves the sequence of the fusion site between the sugar binding protein and ST3GalII.
[0023]
That is, the present invention includes the following inventions.
[0024]
Item 1. A recombinant fusion protein of a sugar binding protein and α2,3-sialyltransferase.
Item 2. Item 2. The recombinant fusion protein according to Item 1, wherein the α2,3-sialyltransferase has an activity to transfer sialic acid to the galactose residue present at the non-reducing end of the Galβ1-3GalNAc-R sugar chain by α2,3 linkage.
Item 3. α2,3-sialyltransferase is Galβ1-3GalNAcβ1-4Galβ1-4Glc-R sugar chain, Galβ1-3GalNAcβ1-4 (Siaα2-3) Galβ1-4Glc-R sugar chain, Galβ1-3GalNAcβ1-4 (Siaα2-8Siaα2-3) Galβ1 -4Glc-R sugar chain, Galβ1-3GalNAcβ1-4 (Siaα2-8Siaα2-8Siaα2-3) Galactose residue present at the non-reducing end of at least one sugar chain obtained from the group consisting of Galβ1-4Glc-R sugar chains Item 2. The recombinant fusion protein according to Item 1, which has an activity of transferring sialic acid by α2,3 linkage.
Item 4. α2,3-sialyltransferase is Galβ1-3GalNAcβ1-4Galβ1-4Glc-Cer, Galβ1-3GalNAcβ1-4 (Siaα2-3) Galβ1-4Glc-Cer, Galβ1-3GalNAcβ1-4 (Siaα2-8Siaα2-3) Galβ1-4GlcCer Galβ1-3GalNAcβ1-4 (Siaα2-8Siaα2-8Siaα2-3) Galβ1-4Glc-Cer obtained from the group consisting of galactose residues present at the non-reducing end of at least one sugar chain by α2,3 linkages to sialic acid Item 2. The recombinant fusion protein according to Item 1, which has an activity of transferring a protein.
Item 5. Item 5. The recombinant fusion protein according to any one of Items 1 to 4, wherein the α2,3-sialyltransferase is derived from a mouse.
Item 6. Item 6. The recombinant fusion protein according to any one of Items 1 to 5, wherein the α2,3-sialyltransferase is a protein described in (a) or (b).
(A) a protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2
(B) a protein having an α2,3-sialyltransferase activity, comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in (a)
Item 7. Item 7. The protein according to Item 6, wherein the α2,3-sialyltransferase comprises at least the amino acid sequence represented by amino acid numbers 54 to 350 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
Item 8. Item 8. The protein according to any one of Items 1 to 7, wherein the α2,3-sialyltransferase includes an amino acid sequence in which amino acids corresponding to all or part of the transmembrane region of the protein are deleted.
Item 9. The recombinant fusion protein according to any one of claims 1 to 8, comprising a protease recognition sequence between the sugar-binding protein and α2,3-sialyltransferase.
Item 10. Item 10. The recombinant fusion protein according to any one of Items 1 to 9, wherein the sugar binding protein is a maltose binding protein.
Item 11. The recombinant fusion protein according to claim 10, wherein the protease is a protease selected from the group consisting of blood coagulation factor Xa, enterokinase, and genenase I.
Item 12. Item 12. A DNA encoding the recombinant fusion protein according to any one of Items 1 to 11.
Item 13. An expression vector comprising the DNA according to Item 12.
Item 14. Item 14. A transformant transformed with the expression vector according to Item 13.
Item 15. Item 12. The method for producing a recombinant fusion protein according to any one of Items 1 to 11, comprising the following steps (1) to (3).
(1) An expression vector in which a DNA encoding a sugar-binding protein and a DNA encoding an α2,3-sialyltransferase are linked under the control of a promoter capable of functioning in E. coli so as to be expressed as a fusion protein of the two proteins. Is used to transform E. coli,
(2) culturing the obtained transformant to produce a fusion protein of a sugar-binding protein and α2,3-sialyltransferase,
(3) Separating the fusion protein from the obtained culture
Item 16. Item 16. The method according to Item 15, wherein the α2,3-sialyltransferase is derived from a mouse.
Item 17. Item 16. The method according to Item 15, wherein the DNA encoding α2,3-sialyltransferase comprises a base sequence encoding at least the amino acid sequence represented by amino acid numbers 54 to 350 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
Item 18. Item 18. The method according to any one of Items 15 to 17, wherein the DNA encoding α2,3-sialyltransferase includes a base sequence encoding an amino acid sequence in which amino acids corresponding to all or part of the transmembrane site of the protein are deleted. .
Item 19. Item 15 wherein the DNA encoding α2,3-sialyltransferase includes a base sequence obtained by deleting a base sequence encoding amino acids corresponding to all or part of the transmembrane site of the protein from the base sequence represented by SEQ ID NO: 1. The method in any one of -18.
Item 20. The method according to any one of claims 15 to 19, wherein the sugar binding protein is a maltose binding protein.
Item 21. Item 21. The DNA encoding a maltose-binding protein is derived from a vector selected from the group consisting of pMAL p2, pMAL p2X, pMAL p2E, pMAL p2G, pMAL c2, pMAL c2X, pMAL c2E, pMAL c2G. Method.
Item 22. Item 22. A method for producing α2,3-sialyltransferase, comprising a step of removing the sugar-binding protein portion from the fusion protein obtained by the method according to any one of Items 15 to 21 and collecting α2,3-sialyltransferase.
Item 23. Item 23. The DNA encoding a sugar binding protein includes a base sequence encoding a protease recognition sequence on the C-terminal side of the protein, and the sugar binding protein portion is removed from the fusion protein by the action of the protease. the method of.
Item 24. Item 24. The method according to Item 23, wherein the protease is a protease selected from the group consisting of blood coagulation factor Xa, enterokinase, and genenase I.
[0025]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The present invention is characterized in that the protein having ST3GalII activity is a fusion protein of ST3GalII and a sugar-binding protein, and the fusion protein is a soluble protein.
[0026]
Furthermore, the present invention makes it possible to produce ST3GalII as a soluble fusion protein by expressing ST3GalII in E. coli as a fusion protein with a sugar-binding protein, and to utilize the specific affinity possessed by the sugar-binding protein. Thus, the fusion protein and ST3GalII can be purified easily and in large quantities.
[0027]
Fusion protein of the present invention
In the present invention, a fusion protein of a sugar-binding protein such as MBP and ST3GalII (hereinafter, in the case of a fusion protein with a maltose-binding protein, it may be abbreviated as “MBP-ST3GalII”) has a sugar-binding protein. Specific affinity, ie, high affinity for maltose and oligosaccharides and polysaccharides having maltose residues in the case of MBP, and enzymatic activity of ST3GalII, ie, CMP-Sia as a sugar donor, sugar accepting Any form may be used so long as it retains the activity of transferring sialic acid to αβ3-3GalNAc-R by α2-3 linkage to produce Siaα2-3Galβ1-3GalNAc-R. Furthermore, as shown in FIG. 1, ST3GalII obtained after removing at least the sugar-binding protein portion is the original enzyme activity, ie, CMP-Sia is used as a sugar donor, and sialylation is performed on Galβ1-3GalNAc-R which is a sugar acceptor. It is preferable to retain the activity of transferring an acid at an α2-3 bond to generate Siaα2-3Galβ1-3GalNAc-R.
[0028]
Preferably, the fusion protein is one in which ST3GalII is linked to the C-terminal side of the sugar-binding protein, and particularly preferably, the sugar-binding protein and ST3GalII are easily cleaved at the fusion site by enzymatic or chemical means. It has a structure to obtain.
[0029]
A sugar-binding protein is a protein that retains high affinity for sugars and oligosaccharides and polysaccharides having sugar residues, and examples thereof include various lectins, maltose-binding proteins, cellulose-binding proteins, and chitin-binding proteins. . Preferred are maltose binding protein, cellulose binding protein, chitin binding protein and the like, and more preferred is maltose binding protein (hereinafter sometimes abbreviated as MBP).
[0030]
The sugar-binding protein may be derived from any biological species, but is preferably derived from a prokaryotic organism such as a bacterium, and more preferably derived from E. coli.
[0031]
In addition, as long as the MBP has a site having specific affinity for maltose or a oligosaccharide having a maltose residue (for example, maltotriose) or a polysaccharide (for example, amylose), the entire sequence is not necessarily present. It is not necessary to include it, and it may include a part of the sequence. Oligosaccharides (for example, maltotriose, etc.) or polysaccharides (for example, amylose, etc.) consisting of amino acids in which one or more amino acids are deleted, substituted or added in a known amino acid sequence and having maltose or maltose residues A protein having a site having specific affinity for can be exemplified.
[0032]
In the present invention, the gene encoding MBP is derived from pMAL p2, pMAL p2X, pMAL p2E, pMAL p2G, pMAL c2, pMAL c2X, pMAL c2E, or pMAL c2G (all manufactured by New England Biolabs). Can do.
[0033]
The sugar-binding protein of the present invention particularly preferably contains an amino acid sequence that is recognized and cleaved by a protease with high sequence specificity on the C-terminal side of the protein. Such proteases include factor Xa, enterokinase, genenase I, thrombin, renin, etc. Preferably, the protease is a factor Xa recognition sequence, ie, Ile-Glu-Gly-Arg (SEQ ID NO: 3) or Ile-Asp-Gly-Arg (SEQ ID NO: 4), enterokinase recognition sequence, ie Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (SEQ ID NO: 5), genenase I recognition sequence, ie His-Tyr (sequence) No. 6) or Tyr-His (SEQ ID NO: 7), more preferably a factor Xa recognition sequence or enterokinase recognition sequence. By introducing such a protease recognition sequence into the C-terminal side of the sugar-binding protein, for example, the MBP moiety can be easily removed by allowing the protease to act after purification of MBP-ST3GalII.
[0034]
In a more preferred embodiment, the sugar binding protein includes a spacer sequence of about 5 to 15 amino acid residues between the sugar binding protein site and the protease recognition site. Due to the presence of the spacer sequence, the sugar-binding protein moves away from ST3GalII, thereby reducing the possibility of intramolecular interaction of the fusion protein. In the case of MBP-ST3GalI fusion protein, the specific affinity for maltose and amylose of the MBP moiety is increased. To do. In the case of the present invention, pMAL p2 or pMAL p2X or pMAL p2E containing the spacer sequence of SEQ ID NO: 9 (Ser-Ser-Ser-Asn-Asn-Asn- Asn- Asn- Asn- Asn- Asn- Asn- Asn- Asn) Alternatively, pMAL p2G, pMAL c2, pMAL c2X, pMAL c2E, or pMAL c2G (all manufactured by New England Biolabs) can be used.
[0035]
ST3GalII may be derived from any species, but is preferably derived from a mammal, more preferably from a mouse. Furthermore, in the present invention, ST3GalII does not need to include the full-length ST3GalII sequence as long as it retains ST3GalII activity, and may include a part of the sequence. For example, (a) a protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 or (b) an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in (a) above, α2,3- It may be a protein having sialyltransferase activity.
[0036]
In particular, ST3GalII is a transmembrane protein present in the Golgi apparatus. Therefore, considering the generation of MBP-ST3GalII as a soluble protein, one of ST3GalII except for all or part of the highly hydrophobic transmembrane domain region is used. The use of parts is also a preferred embodiment of the present invention. Specifically, it preferably includes an amino acid sequence represented by at least 54 to 350 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
[0037]
Further, it may be a protein having ST3GalII activity consisting of amino acids in which one or more amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by at least 54 to 350 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
[0038]
Method for producing the fusion protein of the present invention
In the present invention, the sugar-binding protein-ST3GalII is prepared so that the DNA encoding the sugar-binding protein and the DNA encoding ST3GalII are eventually transcribed and translated as a fusion protein having the above-described properties—that is, in-frame (in frame) —obtained by transforming E. coli with an expression vector containing the ligated chimeric DNA and culturing the resulting transformant in a suitable medium.
[0039]
In the present invention, the DNA encoding ST3GalII may be derived from any biological species, but is preferably derived from a mammal, more preferably from a mouse. Furthermore, in the present invention, the DNA encoding ST3GalII does not need to contain the entire coding amount II of the ST3GalII gene as long as the transcription and translation product retains ST3GalII activity, and may contain a part in the coding region. good. In particular, since ST3GalII is a transmembrane protein present in the Golgi apparatus, the ST3GalII coding sequence excluding the region encoding a highly hydrophobic transmembrane domain is considered in consideration of generating a sugar-binding protein-ST3GalII as a soluble protein. The use of is also one of the preferred embodiments of the present invention.
[0040]
The DNA encoding ST3GalII can be prepared by any method known per se based on the sequence of a known ST3GalII gene sequence [eg, Non-patent Document 3 or 4]. For example, based on a known ST3GalII gene sequence, an appropriate oligonucleotide primer pair covering all or part of the coding region of ST3GalII is synthesized, and total RNA or polyA extracted from cells or tissues expressing ST3GalII⁽⁺⁾It can be cloned by performing RT-PCR using RNA or chromosomal DNA as a template. At this time, in order to facilitate cloning into the vector behind it, an appropriate restriction enzyme recognition sequence can also be added to the end of the oligo primer to be used.
[0041]
Alternatively, an appropriate oligonucleotide probe is synthesized based on a known ST3GalII gene sequence, and a cDNA library prepared from cells or tissues expressing ST3GalII by a conventional method is screened by plaque (or colony) hybridization. Can also be cloned.
[0042]
In addition, ST3GalII-encoding DNA is prepared by conventional methods using partially or completely purified ST3GalII as an antigen, using conventional methods from cells or tissues that express ST3GalII. The library can also be cloned by antibody screening.
[0043]
Alternatively, the DNA is synthesized by using a DNA / RNA automatic synthesizer based on the known ST3GalII gene sequence so that the partial sequence of the sense strand and the partial sequence of the antisense strand partially overlap, and the PCR method By repeating the operation of obtaining a longer partial sequence as a double-stranded DNA, a desired DNA sequence can be obtained.
In a preferred embodiment of the present invention, it contains all or part of DNA encoding mouse-derived α2,3-sialyltransferase (hereinafter sometimes abbreviated as mST3GalII). For example, in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, at least the base sequence encoding the amino acid sequence shown in amino acid numbers 54 to 350, preferably in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, shown in at least base numbers 160 to 1050 DNA containing a base sequence. Alternatively, the DNA encoding mST3GalII has a nucleotide sequence encoding an amino acid sequence obtained by deleting the amino acid sequence corresponding to all or part of the transmembrane site of the protein, preferably all or part of the transmembrane site of the protein. DNA containing a base sequence from which the base sequence encoding the corresponding amino acid sequence has been deleted The transmembrane domain of mST3GalII is presumed to be a portion represented by amino acid numbers 7 to 27 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 from the results of hydrophobicity plot analysis. Therefore, the DNA encoding the domain is preferably a base sequence represented by base numbers 19 to 81 in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1.
[0044]
Of course, the DNA encoding mST3GalII may be a DNA containing the base sequence encoding all of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, preferably a DNA containing the entire base sequence shown in SEQ ID NO: 1.
[0045]
In the present invention, the DNA encoding a sugar binding protein is exemplified by the DNA encoding the above-mentioned various proteins, preferably a DNA encoding a maltose binding protein, a cellulose binding protein or a chitin binding protein, more preferably DNA encoding maltose binding protein.
[0046]
The DNA may be derived from any biological species, but is preferably derived from prokaryotes such as bacteria, and more preferably derived from E. coli.
[0047]
In addition, as long as the DNA encoding MBP encodes a translation product having specific affinity for a oligosaccharide having a maltose maltose residue (for example, maltotriose) or a polysaccharide (for example, amylose). However, it is not always necessary to include the entire code area, and a part of the code area may be included.
[0048]
MBP derived from E. coli is a secreted protein present in the periplasm, and the initial translation product contains a signal peptide at its N-terminus. The DNA encoding MBP of the present invention may or may not contain a base sequence (signal sequence) encoding a signal peptide that can function in host E. coli. Since Escherichia coli is a Gram-negative bacterium having an outer membrane on the outside of the cell wall, it is unlikely that the expressed MBP-ST3GalII is secreted into the medium even when the DNA encoding MBP contains a signal sequence. . However, if MBP-ST3GalII accumulates in the periplasmic space, the fusion protein can be recovered by spheroplasting without completely disrupting the cells, so that subsequent purification can be performed more easily. it can. However, in this case, it is particularly preferable to delete the transmembrane domain of ST3GalII. If this domain is present, MBP-ST3GalII may not reach the periplasmic space but may remain in the inner membrane, and the recovery of the fusion protein becomes complicated.
[0049]
It is particularly preferable that the DNA encoding MBP of the present invention includes a base sequence encoding an amino acid sequence that is recognized and cleaved by a protease having high sequence specificity on the C-terminal side of the protein. Such proteases include factor Xa, enterokinase, genenase I, thrombin, renin, etc. Preferably, the protease is a factor Xa recognition sequence, ie, Ile-Glu-Gly-Arg (SEQ ID NO: 3) or Ile-Asp-Gly-Arg (SEQ ID NO: 4), enterokinase recognition sequence, ie Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (SEQ ID NO: 5), genenase I recognition sequence, ie His-Tyr (sequence) No. 6) or Tyr-His (SEQ ID NO: 7), more preferably a factor Xa recognition sequence or enterokinase recognition sequence. By introducing such a protease recognition sequence into the C-terminal side of the sugar-binding protein, for example, the MBP moiety can be easily removed by allowing the protease to act after purification of MBP-ST3GalII.
[0050]
In a more preferred embodiment, the DNA encoding a sugar binding protein includes a spacer sequence of about 5 to 15 amino acid residues between the sugar binding protein coding region and the protease recognition site. Due to the presence of the spacer sequence, the sugar-binding protein moves away from ST3GalII, thereby reducing the possibility of intramolecular interaction of the fusion protein. In the case of MBP-ST3GalI fusion protein, the specific affinity for maltose and amylose of the MBP moiety is increased. To do.
[0051]
The DNA encoding MBP should be cloned using a known MBP gene sequence [for example, MBP derived from Escherichia coli, see Non-Patent Document 5] by using a well-known method similar to that exemplified for DNA encoding ST3GalII. In addition, the protease recognition sequence and spacer sequence described above can be introduced into the C-terminal side of MBP by a conventional method. In the case of the present invention, the spacer sequence of SEQ ID NO: 8 is included.
[0052]
Further, DNA encoding E. coli-derived MBP is, for example, pMAL p2 (including signal sequence), pMAL p2X (including signal sequence), pMAL p2E (including signal sequence) or pMAL p2G (signal) manufactured by New England Biolabs. PMAL c2 (deleting the signal sequence) or pMAL c2X (deleting the signal sequence) or pMAL c2E (deleting the signal sequence) or pMAL c2G (deleting the signal sequence) From commercially available vectors.
[0053]
In order to facilitate the construction of a chimeric DNA encoding a sugar binding protein-ST3GalII fusion protein, an appropriate restriction enzyme recognition site can be added to the end of the DNA encoding the sugar binding protein by a conventional method. When cloning a DNA encoding ST3GalII into a vector, if a restriction enzyme recognition site is added to the N-terminal side of ST3GalII, the same restriction enzyme recognition site (or the same sticky end) is also added to the DNA encoding the sugar-binding protein. Another restriction enzyme recognition site to be generated may be introduced.
[0054]
The expression vector of the present invention is an arbitrary expression vector in which the chimeric DNA encoding the sugar-binding protein-ST3GalII is placed under the control of a promoter that can function in E. coli. The promoter region includes a -35 region and a -10 region, which are consensus sequences that determine the binding position of RNA polymerase. As a system for expressing a desired recombinant protein in large quantities, it is more desirable to use a promoter region of an inducible enzyme. Examples of such a promoter region include trp promoter, lac promoter, recA promoter, lpp promoter, tac promoter and the like. These promoter regions further include an operator to which the repressor protein binds. When an inducer (for example, lactose or IPTG for the lac promoter) is added, binding of the repressor protein to the operator is suppressed, and a large amount of the gene placed under the control of the promoter is expressed. The expression vector also contains a consensus Shine-Dalgarno (SD) sequence upstream of the translation initiation codon. Further, the expression vector contains a transcription termination signal, that is, a terminator region, downstream of the chimeric DNA encoding the sugar binding protein-ST3GalII. As the terminator region, a commonly used natural or synthetic terminator can be used. In addition to the promoter region and terminator region described above, the expression vector of the present invention needs to contain a replication origin capable of autonomous replication in host E. coli. Examples of such a replication origin include ColE1 ori, M13 ori, and the like.
[0055]
The expression vector of the present invention preferably further contains a selection marker gene for selecting a transformant. As the selectable marker gene, resistance genes for various drugs such as tetracycline, ampicillin, kanamycin and the like can be used. When the host Escherichia coli is an auxotrophic mutant, a wild-type gene that complements the auxotrophy can be used as a selectable marker gene.
[0056]
The transformant of the present invention can be prepared by transforming host E. coli with the expression vector of the present invention. The host strain is not particularly limited, and examples thereof include commercially available XL1-Blue strain, BL-21 strain, JM107 strain, TB1 strain, JM109 strain, C600 strain, DH5α strain, HB101 strain and the like.
[0057]
Introduction of an expression vector into a host cell can be performed using a conventionally known method. Examples include the method of Cohen et al. (Calcium chloride method) (see non-patent document 6), the protoplast method (see non-patent document 7), the competent method (see non-patent document 8), the electroporation method, and the like.
[0058]
The sugar-binding protein-ST3GalII is obtained by culturing a transformant expressing an expression vector containing the above-described chimeric DNA encoding the sugar-binding protein-ST3GalII in an appropriate medium, and converting the sugar-binding protein-ST3GalII from the resulting culture. It can be obtained by collecting.
[0059]
The medium used contains a carbohydrate such as glucose, fructose, glycerol or starch as a carbon source. Further, it may contain an inorganic or organic nitrogen source (for example, ammonium sulfate, ammonium chloride, casein hydrolyzate, yeast extract, polypeptone, bactotryptone, beef extract, etc.). These carbon sources and nitrogen sources do not need to be used in pure form, and those having low purity are advantageous because they contain abundant amounts of growth factors and inorganic nutrients. Further, if desired, a variety of nutrient sources [eg, inorganic salts (eg, sodium or potassium diphosphate, dipotassium hydrogen phosphate, magnesium chloride, magnesium sulfate, calcium chloride), vitamins (eg, vitamin B1) Antibiotics (eg, ampicillin, kanamycin, etc.)] may be added to the medium.
[0060]
The transformant is usually cultured at pH 5.5 to 8.5, preferably pH 6 to 8, usually 18 to 40 ° C., preferably 20 to 35 ° C., for 1 to 150 hours. It can be appropriately changed depending on the culture scale.
[0061]
When culturing in a large tank, in order to avoid growth delay in the production process of the target protein, after inoculating the microbial cells in a small amount of medium and pre-culturing for 1 to 24 hours, It is preferable to inoculate in a large tank.
[0062]
When the expression of the sugar-binding protein-ST3GalII is controlled by the promoter system of the inducible protein gene, the inducer may be added from the start of induction, but is more preferably added in the early logarithmic growth phase. Bacterial growth can be monitored by measuring the absorbance of the culture at 660 nm. For example, when lac promoter or tac promoter is used, isopropylthio-β-D-galactoside (hereinafter sometimes referred to as IPTG) may be used as an inducer when the absorbance at 660 nm becomes 0.4 to 0.6. For example, 0.1 to 1.0 mM. The timing and rate of addition of the inducer can be appropriately changed depending on the culture conditions, culture scale, and type of inducer.
[0063]
In the method of the present invention, the sugar-binding protein-ST3GalII is purified by using an insoluble carrier in which a fraction containing the fusion protein is bound to a ligand containing various sugar residues that specifically bind to the sugar-binding protein. It can be achieved in one step by subjecting to affinity chromatography.
[0064]
For example, when the sugar-binding protein is MBP, if the DNA encoding MBP lacks the signal sequence, MBP-ST3GalII is localized in the soluble fraction of the cells. The cells are collected by filtration or centrifugation, and the cells are disrupted by lysozyme treatment and surfactant treatment, ultrasonic treatment, osmotic shock, etc., and the resulting cell extract is used for affinity chromatography .
[0065]
On the other hand, when the DNA encoding MBP has a signal sequence, the expressed MBP-ST3GalII is highly likely to accumulate in the secreted periplasmic space. Therefore, in that case, the bacterial cells are spheroplasted by lysozyme treatment or the like to release MBP-ST3GalII into the solution, filtered or centrifuged to remove the bacterial cells, and the resulting supernatant is used for affinity chromatography. .
[0066]
As an adsorbent for affinity chromatography, for example, in the case of MBP, amylose resin in which amylose is immobilized on agarose beads (for example, Amylose resin manufactured by New England Biolabs, etc.) can be used. Ligands for MBP and other insoluble matrix groups (eg, cellulose, dextran, synthetic polymers, etc.) may be used.
[0067]
Glucose-binding protein-ST3GalII is prepared by adding the adsorbent to the fraction containing it and stirring the mixture for an appropriate period of time, filtering the adsorbent, and washing the adsorbent with an appropriate concentration. An eluent containing a sugar that inhibits the binding of the adsorbent (for example, maltose in the case of MBP) is added, stirred for an appropriate time, and then filtered to purify the filtrate. Alternatively, the adsorbent is packed in a column, a sugar-binding protein-ST3GalII-containing fraction is applied, washed with an appropriate buffer, and then the eluent having an appropriate concentration is applied and adsorbed onto the column. It can also be obtained by eluting ST3GalII.
[0068]
The MBP-ST3GalII of the present invention thus obtained has ST3GalII activity and can be used as an enzyme as it is.
[0069]
ST3GalII Preparation of
As described above, in a preferred embodiment of the present invention, since the sugar-binding protein-ST3GalII contains an amino acid sequence that is recognized and cleaved by a sequence-specific protease at its fusion site, the sugar-binding protein purified as described above. -By causing the protease to act on ST3GalII, the sugar-binding protein portion is removed to produce the desired ST3GalII. Preferably the protease is Factor Xa. In the present invention, pMAL p2, pMAL p2X, pMAL c2 or pMAL c2X (manufactured by New England Biolabs) containing the factor Xa recognition sequence of SEQ ID NO: 3 can be used. The reaction temperature, solution pH, reaction time, etc. when the protease is allowed to act on the sugar-binding protein-ST3GalII can be appropriately selected according to the type of protease used. For example, in the case of factor Xa, The sugar-binding protein and ST3GalII can be cleaved by reacting in a buffer solution at 4 to 40 ° C. for 1 to 25 hours. After completion of the reaction, the above adsorbent is added to the reaction solution and stirred for an appropriate time, so that only the released sugar-binding protein is adsorbed on the adsorbent. Therefore, only ST3GalII is purified by filtering the adsorbent. Can do. Alternatively, ST3GalII can also be purified by applying the reaction solution to a column packed with the adsorbent and collecting the flow-through fraction.
[0070]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples. However, these are merely examples, and the scope of the present invention is not limited to the examples.
[0071]
Example 1 PCR by mST3GalII cDNA Fragment acquisition and expression vector construction
(1) PCR primer design
Based on the base sequence of mouse α2,3-sialyltransferase (ST3GalII) cDNA described in SEQ ID NO: 1, oligonucleotides shown in SEQ ID NOs: 10 and 11 were synthesized. The former is a base sequence represented by base numbers 160 to 178 in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, and the latter is a base sequence represented by base numbers 1036 to 1053 in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1.
[0072]
(2) Reverse transcription reaction from mouse brain RNA
A reverse transcription reaction was performed by RT PCR high (RT PCR high: manufactured by Toyobo Co., Ltd.) using random primers, using 5 μg of total RNA extracted from mouse brain by RNA extraction kit (RNeasy: product of QIAGEN) as a template. The obtained reaction solution was used as a mouse brain 1ss cDNA solution.
[0073]
(3) PCR reaction
PCR reaction was performed using the mouse brain 1ss cDNA and the synthetic oligonucleotide under the following conditions.
[Mouse brain 1ss cDNA 2.5 μl, 2 mM dNTPs (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) 2.5 μl, X10KOD Buffer No. 1 (Toyobo Co., Ltd.) 2.5 μl, 25 mM MgCl₂(Manufactured by Toyobo Co., Ltd.) 1.0 μl, 10 pmoles / μl of the oligonucleotide described in SEQ ID NO: 10 1.0 μl, 10 pmoles / μl of the oligonucleotide described in SEQ ID NO: 11, 1.0 U / μl KOD DNA Polymerase ( Toyobo Co., Ltd.) 0.5 μl, reaction solution volume 25 μl, 98 ° C. (30 seconds) -61 ° C. (30 seconds-74 ° C. (30 seconds) after 4 cycles, 98 ° C. (30 seconds) -64 ° C. (30 seconds) -74 ° C. (30 seconds) 31 cycles].
After the PCR reaction, the reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis, and a DNA fragment as a PCR product was confirmed.
[0074]
(4) Confirmation of base sequence and construction of expression vector
The DNA fragment is cleaved with restriction enzymes EcoRI and BamHI, and then ligated using pMAL c2 or pMAL p2 (manufactured by New England Biolabs) and Ligation High (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) that have been cleaved with the restriction enzymes in advance. E. coli strain JM109 was transformed and selected on LB plate medium containing 50 μg / ml ampicillin.
[0075]
A plasmid carrying the DNA fragment was prepared from E. coli, and the nucleotide sequence of the DNA fragment was determined according to a conventional method. As a result, it was revealed that the nucleotide sequence was shown in SEQ ID NO: 12. This sequence is found to be identical to the nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 160 to 1053 in the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 except that the 776th base and the 778th base are different, and the desired mST3GalII cDNA fragment It was confirmed that was obtained. Moreover, the vector constructed by ligating the PCR fragment to pMAL c2 was named pMS3G2-C101, and the vector constructed by ligating the PCR fragment to pMAL p2 was named pMS3G2-P101, and the construction of the expression vector was completed at the same time.
[0076]
Example 2 ST3GalII Confirmation of expression
(1) Preparation of MBP-mST3GalII fusion protein using recombinant E. coli
E. coli JM109 strain transformed with the expression vector pMS3G2-C101 or pMS3G2-P101 obtained in Example 1 was put into a test tube containing 5 ml of LB medium containing 50 μg / ml ampicillin and 0.2% glucose. Inoculated and cultured with shaking overnight at 37 ° C. 500 μl of the obtained culture solution was inoculated into a 500 ml culture flask containing 50 ml of the same medium. After carrying out the shaking culture at 37 ° C., when OD660 = 3.0 to 4.0 is reached, the culture temperature is lowered to 25 ° C., and the culture is continued at 25 ° C. for 30 minutes. IPTG at a concentration of 0.3 mM was added, and the culture was further continued at 25 ° C. for 16 hours. After culturing, the cells were collected by centrifugation, suspended in 20 ml of buffer solution 1 (20 mM HEPES pH 7.5 0.2 M NaCl 1 mM EDTA 1 mM Benzamidine HCl 10 mM 2 mercaptoethanol), and the cells were disrupted with an ultrasonic crusher. Thereafter, the supernatant obtained by centrifugation was used as a crude enzyme solution. The MBP-mST3GalII fusion protein was adsorbed by passing the crude enzyme solution through an amylose resin (New England Biolabs) column (5 ml) that had been equilibrated with buffer 1 in advance. After washing the column with buffer 1, MBP-mST3GalII fusion protein adsorbed with buffer 1 containing 10 mM maltose was eluted. The eluted fractions were collected and the maltose was removed with a desalting column PD-10 (Pharmacia) to obtain an MBP-mST3GalII fusion protein solution.
[0077]
(2) Preparation of ST3GalII substrate
1 mg of ganglioside GT1b (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) (Chemical Formula 1) was subjected to rEGCase II (TaKaRa Shuzo Co., Ltd.) treatment / Folch distribution to obtain a GT1b sugar chain (Chemical Formula 2).
The obtained GT1b sugar chain was purified by fluorescent labeling and gel filtration with 2-aminopyridine according to a conventional method (Non-patent Document 9) to obtain GT1p-PA (Chemical Formula 3).
The obtained GT1b-PA was subjected to 1N formic acid treatment / HPLC (ODS column) purification to prepare Asialo GM1a-PA (Chemical Formula 4). As a result of quantification, 286 nmole Asialo GM1a-PA was obtained.
[0078]
[Chemical 1]

[0079]
[Chemical formula 2]

[0080]
[Chemical Formula 3]

[0081]
[Formula 4]

[0082]
(3) ST3GalII activity measurement
0.5 μM MES buffer pH 6.5 4 μl, 200 mM MgCl 2 1 μl, 572 μM Asialo GM1a-PA (obtained in (2) above) 2 μl, 1 mM CMP-Sia (manufactured by Sigma) 5 μl, above ( After reacting 20 μl of the reaction solution consisting of 5 μl of the MBP-mST3GalII fusion protein solution obtained in 1) at 37 ° C. for 15 minutes, the reaction was stopped by boiling for 1 minute. 80 μl of MilliQ water was added to the reaction solution, mixed, and then 20 μl of the supernatant obtained by centrifugation was analyzed by HPLC to measure the amount of reaction product GM1a-PA. As a result, E. coli JM109 transformed with pMS3G2-C101 showed high ST3GalII activity (FIG. 2). E. coli JM109 transformed with pMS3G2-P101 also showed ST3GalII activity although it was weak (FIG. 2). When the ST3GalII activity is defined as the amount of enzyme that transfers 1 μmole of sialic acid to asialo GM1a-PA per minute under the above reaction conditions, the productivity of ST3GalII of E. coli JM109 transformed with pMS3G2-C101 is 3. It was calculated as 5 U / L-Broth.
[0083]
Example 3 MBP − mST3GalII Examination of various properties of fusion proteins
Various properties of the MBP-mST3GalII fusion protein derived from E. coli JM109 transformed with pMS3G2-C101 obtained in Example 2 were examined.
[0084]
(1) Examination of optimum reaction pH
As a result of measuring ST3GalII activity at pH 4.0 to pH 8.0 under the same conditions, ST3GalII activity was detected at pH 5.5 to 8.0, and it was confirmed that the optimal reaction pH was around pH 6.5. (FIG. 3).
[0085]
(2) Examination of effects of divalent cations
As a result of investigating the influence on the activity of various divalent cations under the same conditions, the activity is detected even in the presence of EDTA. Therefore, the divalent cation is not necessarily required for ST3GalII activity, but the presence of the divalent cation is present. It was confirmed that ST3GalII activity was activated below (FIG. 4).
[0086]
(3) Examination of optimum CMP-Sia concentration
As a result of examining the optimum CMP-Sia concentration of MBP-ST3GalII fusion protein under the same conditions, it was confirmed that the optimum concentration of CMP-Sia was around 250 μM (FIG. 5).
[0087]
(4) Examination of the effect of Asialo GM1a-PA concentration
Under the same conditions, ST3GalII activity in various concentrations of asialo GM1a-PA was measured. As a result, the Km value of MBP-mST3GalII for asialo GM1a-PA was calculated to be 5.7 μM (FIG. 6).
[0088]
[Table 1]

[0089]
【The invention's effect】
In the method of the present invention, a fusion protein having α2,3-sialyltransferase (ST3alII) activity can be easily and efficiently produced in large quantities as a soluble protein. In addition, α2,3-sialyltransferase (ST3alII) itself can be easily obtained from the fusion protein.
[0090]
The α2,3-sialyltransferase (ST3alII) obtained by the present invention is not only useful as a reagent for research on sugar chain engineering, but also by utilizing the obtained α2,3-sialyltransferase (ST3alII). The synthesis of sugar chains such as various gangliosides or ganglioside analogs, sialic acid-containing sugar chains, and various chemical substances including sialic acid-containing sugar chains useful for applications or pharmaceutical applications is facilitated. Furthermore, it can be used for sugar chain modification of various useful proteins and various sugar chain-containing chemical substances. It is also possible to easily obtain an α2,3-sialyltransferase (ST3alII) antibody useful for research use or pharmaceutical use.
[0091]
[Sequence Listing]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing a reaction catalyzed by ST3GalII. That is, the sugar nucleotide CMP-sialic acid (CMP-Sia) is used as a sialic acid donor, the sialic acid is transferred to the sugar acceptor Galβ1-3GalNAc-R by α2-3 bond, and Siaα2-3Galβ1-3GalNAc- The reaction to form R is shown.
FIG. 2 shows the results of ST3GalII activity measurement of MBP-ST3GalII fusion protein expressed in E. coli.
FIG. 3 shows the effect of pH of the reaction solution on ST3GalII activity of MBP-ST3GalII expressed in E. coli.
FIG. 4 shows the effect of divalent cations on ST3GalII activity of MBP-ST3GalII expressed in E. coli.
FIG. 5 shows the effect of CMP-sialic acid concentration on ST3GalII activity of MBP-ST3GalII expressed in E. coli.
FIG. 6 is a graph showing the influence of the sugar receptor asialo GM1a-PA concentration on the ST3GalII activity of MBP-ST3GalII expressed in E. coli.

Claims

A recombinant fusion protein of a sugar binding protein and α2,3-sialyltransferase.

The recombinant fusion protein according to claim 1, wherein the α2,3-sialyltransferase has an activity of transferring sialic acid to the galactose residue present at the non-reducing end of the Galβ1-3GalNAc-R sugar chain by α2,3 linkage.

α2,3-sialyltransferase is Galβ1-3GalNAcβ1-4Galβ1-4Glc-R sugar chain, Galβ1-3GalNAcβ1-4 (Siaα2-3) Galβ1-4Glc-R sugar chain, Galβ1-3GalNAcβ1-4 (Siaα2-8Siaα2-3) Galβ1 -4Glc-R sugar chain, Galβ1-3GalNAcβ1-4 (Siaα2-8Siaα2-8Siaα2-3) Galactose residue present at the non-reducing end of at least one sugar chain obtained from the group consisting of Galβ1-4Glc-R sugar chains The recombinant fusion protein according to claim 1, which has an activity of transferring sialic acid by α2,3 linkage.

α2,3-sialyltransferase is Galβ1-3GalNAcβ1-4Galβ1-4Glc-Cer, Galβ1-3GalNAcβ1-4 (Siaα2-3) Galβ1-4Glc-Cer, Galβ1-3GalNAcβ1-4 (Siaα2-8Siaα2-3) Galβ1-4GlcCer Galβ1-3GalNAcβ1-4 (Siaα2-8Siaα2-8Siaα2-3) Galβ1-4Glc-Cer obtained from the group consisting of galactose residues present at the non-reducing end of at least one sugar chain by α2,3 linkages to sialic acid The recombinant fusion protein according to claim 1, which has an activity of translocating.

The recombinant fusion protein according to any one of claims 1 to 4, wherein α2,3-sialyltransferase is derived from a mouse.

The recombinant fusion protein according to any one of claims 1 to 5, wherein the α2,3-sialyltransferase is a protein described in (a) or (b).
(A) a protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 (b) (a), comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added, and exhibiting α2,3-sialyltransferase activity Protein

The protein according to claim 6, wherein the α2,3-sialyltransferase comprises at least an amino acid sequence represented by amino acid numbers 54 to 350 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.

The protein according to any one of claims 1 to 7, wherein α2,3-sialyltransferase comprises an amino acid sequence in which amino acids corresponding to all or part of the transmembrane region of the protein are deleted.

The recombinant fusion protein according to any one of claims 1 to 8, comprising a protease recognition sequence between the sugar-binding protein and α2,3-sialyltransferase.

The recombinant fusion protein according to any one of claims 1 to 9, wherein the sugar-binding protein is a maltose-binding protein.

The recombinant fusion protein according to claim 10, wherein the protease is a protease selected from the group consisting of blood coagulation factor Xa, enterokinase, and genenase I.

A DNA encoding the recombinant fusion protein according to any one of claims 1 to 11.

An expression vector comprising the DNA according to claim 12.

A transformant transformed with the expression vector according to claim 13.

The method for producing a recombinant fusion protein according to any one of claims 1 to 11, comprising the following steps (1) to (3).
(1) An expression vector in which a DNA encoding a sugar-binding protein and a DNA encoding an α2,3-sialyltransferase are linked under the control of a promoter capable of functioning in E. coli so as to be expressed as a fusion protein of the two proteins. Is used to transform E. coli,
(2) culturing the obtained transformant to produce a fusion protein of a sugar-binding protein and α2,3-sialyltransferase,
(3) Separating the fusion protein from the obtained culture

The method according to claim 15, wherein the α2,3-sialyltransferase is derived from a mouse.

The method according to claim 15, wherein the DNA encoding α2,3-sialyltransferase comprises a base sequence encoding at least the amino acid sequence represented by amino acid numbers 54 to 350 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.

The DNA encoding α2,3-sialyltransferase includes a base sequence encoding an amino acid sequence in which amino acids corresponding to all or part of the transmembrane site of the protein are deleted. Method.

The DNA encoding α2,3-sialyltransferase comprises a base sequence obtained by deleting a base sequence encoding amino acids corresponding to all or part of the transmembrane site of the protein from the base sequence shown in SEQ ID NO: 1. The method according to any one of 15 to 18.

The method according to any one of claims 15 to 19, wherein the sugar binding protein is a maltose binding protein.

21. The DNA encoding a maltose binding protein is derived from a vector selected from the group consisting of pMAL p2, pMAL p2X, pMAL p2E, pMAL p2G, pMAL c2, pMAL c2X, pMAL c2E, pMAL c2G. the method of.

A method for producing α2,3-sialyltransferase, comprising a step of collecting α2,3-sialyltransferase by removing a sugar-binding protein portion from a fusion protein obtained by the method according to any one of claims 15 to 21.

23. The DNA encoding a sugar-binding protein contains a base sequence encoding a protease recognition sequence on the C-terminal side of the protein, and the sugar-binding protein portion is removed from the fusion protein by the action of the protease. The method described.

The method according to claim 23, wherein the protease is a protease selected from the group consisting of blood coagulation factor Xa, enterokinase, and genenase I.