JP2004016042A - Variant polynucleotide and nucleic acid molecule which can be used for genetic diagnosis of medicine absorption abnormality in which abcg2 protein participate - Google Patents
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Abstract
Description
【０００１】
【発明の背景】
発明の分野
本発明は、ＡＢＣＧ２タンパク質が関与する薬物吸収の異常の遺伝子診断に用いることができる変異型ポリヌクレオチドおよび核酸分子に関する。
【０００２】
背景技術
ＡＢＣＧ２遺伝子はＡｌｌｉｋｍｅｔｓらにより初めて単離された（Ａｌｌｉｋｍｅｔｓ Ｒ， Ｇｅｒｒａｒｄ Ｂ， Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ Ａ， Ｄｅａｎ Ｍ： Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ＡＢＣ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ： ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ２１ ｎｅｗ ｇｅｎｅｓ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔａｇｓ ｄａｔａｂａｓｅ． Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌ． Ｇｅｎｅｔ． ５， １６４９−１６５５ （１９９６））。本遺伝子は染色体４ｑ２２に位置することが明らかにされ（Ａｌｌｉｋｍｅｔｓ Ｒ， Ｓｃｈｒｉｍｌ ＬＭ， Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ Ａ， Ｒｏｍａｎｏ−Ｓｐｉｃａ Ｖ， Ｄｅａｎ Ｍ： Ａ ｈｕｍａｎ ｐｌａｃｅｎｔａ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＡＴＰ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｃａｓｓｅｔｔｅ ｇｅｎｅ （ＡＢＣＰ） ｏｎ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ４ｑ２２ ｔｈａｔ ｉｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５８， ５３３７−５３３９ （１９９８））、１６個のエクソンから構成されている。
【０００３】
さらに、抗癌剤耐性のヒト乳癌細胞などより本遺伝子をコードするｃＤＮＡが単離され、このタンパク質は薬剤耐性の原因となるトランスポータであり、抗癌剤を細胞外に排出する機能を有することが明らかにされている（Ｄｏｙｌｅ ＬＡ， ＹａｎｇＷ， Ａｂｒｕｚｚｏ ＬＶ， Ｋｒｏｇｍａｎｎ Ｔ， Ｇａｏ Ｙ， Ｒｉｓｈｉ ＡＫ， Ｒｏｓｓ ＤＤ： Ａ ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ＭＣＦ−７ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ９５， １５６６５−１５６７０ （１９９８）； Ｍａｌｉｅｐａａｒｄ Ｍ， ｖａｎ Ｇａｓｔｅｌｅｎ ＭＡ， Ｔｏｈｇｏ Ａ， Ｈａｕｓｈｅｅｒ ＦＨ， ｖａｎ Ｗａａｒｄｅｎｂｕｒｇ ＲＣＡＭ， ｄｅ Ｊｏｎｇ ＬＡ， Ｐｌｕｉｍ Ｄ， Ｂｅｉｊｎｅｎ ＪＨ， Ｓｃｈｅｌｌｅｎｓ ＪＨＭ： Ｃｉｒｃｕｍｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ （ＢＣＲＰ）−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｕｓｉｎｇ ｎｏｎ−ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｄｒｕｇｓ ｏｒ ｔｈｅＢＣＲＰ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ＧＦ１２０９１８． Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ７， ９３５−９４１ （２００１）； Ｋａｗａｂａｔａ Ｓ， Ｏｋａ Ｍ， Ｓｈｉｏｚａｗａ Ｋ， Ｔｓｕｋａｍｏｔｏ Ｋ， Ｎａｋａｔｏｍｉ Ｋ， Ｓｏｄａ Ｈ， Ｆｕｋｕｄａ Ｍ， ＩｋｅｇａｍｉＹ， Ｓｕｇａｈａｒａ Ｋ， Ｙａｍａｄａ Ｙ， Ｋａｍｉｈｉｒａ Ｓ， Ｄｏｙｌｅ ＬＡ， Ｒｏｓｓ ＤＤ， Ｋｏｈｎｏ Ｓ： Ｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｉｒｅｃｔｌｙ ｃｏｎｆｅｒｓ ＳＮ−３８ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｏｆ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２８０， １２１６−１２２３ （２００１）； Ｌｉｔｍａｎ Ｔ， Ｂｒａｎｇ Ｍ， Ｈｕｄｓｏｎ Ｅ， Ｆｅｔｓｃｈ Ｐ， Ａｂａｔｉ Ａ， Ｒｏｓｓ ＤＤ， Ｍｉｙａｋｅ Ｋ， Ｒｅｓａｕ ＪＨ， Ｂａｔｅｓ ＳＥ： Ｔｈｅ ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ
−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｎｅｗ ＡＢＣ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ， ＭＸＲ （ＡＢＣＧ２）． Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｓｃｉ． １１３， ２０１１−２０２１ （２０００））。
【０００４】
さらに、カンプトテシンの７−位が置換された誘導体がＡＢＣＧ２の過剰発現による抗癌剤ミトキサントロン耐性を克服することが明らかにされている（Ｐｅｒｅｇｏ Ｐ， ｄｅ Ｃｅｓａｒｅ Ｍ， ｄｅ Ｉｓａｂｅｌｌａ Ｐ， Ｃａｒｅｎｉｎｉ Ｎ， Ｂｅｇｇｉｏｌｉｎ Ｇ， Ｐｅｚｚｏｎｉ Ｇ， Ｐａｌｕｍｂｏ Ｍ， Ｔａｒｔａｇｌｉａ Ｌ， Ｐｒａｔｅｓｉ， Ｇ， Ｐｉｓａｎｏ Ｃ， Ｃａｒｍｉｎａｔｉ Ｐ， Ｓｃｈｅｆｆｅｒ ＧＬ， Ｚｕｎｉｎｏ Ｆ： Ａ ｎｏｖｅｌ ７−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ ａｎａｌｏｇ ｏｖｅｒｃｏｍｅｓ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ ａ ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ−ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｃｏｌｏｎｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ６１， ６０３４−６０３７ （２００１））。
【０００５】
また、ＨＥＲチロシンキナーゼ阻害剤とされていたＣＩ１０３３が、ＡＢＣＧ２の機能を抑制することにより７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトテシン （ＳＮ−３８， イリノテカンの活性代謝産物）やトポテカン耐性を克服することが示されている（Ｅｒｌｉｃｈｍａｎ Ｃ， Ｂｏｅｒｎｅｒ ＳＡ， Ｈａｌｌｇｒｅｎ ＣＧ， Ｓｐｉｅｋｅｒ Ｒ， Ｗａｎｇ ＸＹ， Ｊａｍｅｓ ＣＤ， Ｓｃｈｅｆｆｅｒ ＧＬ， Ｍａｌｉｅｐａａｒｄ Ｍ， Ｒｏｓｓ ＤＤ， Ｂｉｂｌｅ ＫＣ， Ｋａｕｆｍａｎｎ ＳＨ： Ｔｈｅ ＨＥＲ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ＣＩ１０３３ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ ７−ｅｔｈｙｌ−１０−ｈｙｄｒｏｘｙｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ ａｎｄ ｔｏｐｏｔｅｃａｎ ｂｙ ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄｄｒｕｇ ｅｆｆｌｕｘ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ６１， ７３９−７４８ （２００１））。
【０００６】
これらのことより、ＡＢＣＧ２の発現により抗癌剤の細胞外排出が起こり、癌細胞が薬剤耐性を示すことが支持されている。
【０００７】
また、本トランスポータの３番目の膜貫通ドメイン上に存在する４８２番目のアルギニンがスレオニンやグリシンに変化すると、排出に関与する薬剤に変化がみられ、このことから、本タンパク質の機能に４８２番目のアミノ酸が重要であることが明らかにされている（Ｈｏｎｊｏ Ｙ， Ｈｒｙｃｙｎａ ＣＡ， Ｙａｎ ＱＷ， Ｍｅｄｉｎａ−Ｐｅｒｅｚ ＷＹ， Ｒｏｂｅｙ ＲＷ， ｖａｎ ｄｅ Ｌａａｒ Ａ， Ｌｉｔｍａｎ Ｔ， Ｄｅａｎ Ｍ， Ｂａｔｅｓ ＳＥ： Ａｃｑｕｉｒｅｄ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ＭＸＲ／ＢＣＲＰ／ＡＢＣＰ ｇｅｎｅ ａｌｔｅｒ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｉｎ ＭＸＲ／ＢＣＲＰ／ＡＢＣＰ−ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｃｅｌｌｓ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ６１， ６６３５−６６３９ （２００１））。
【０００８】
さらに、ＡＢＣＧ２の正常細胞における機能について、胎盤に存在し、血液−胎盤関門を構成することで胎児を脂溶性化合物より保護しているとの報告がある（Ｊｏｎｋｅｒ ＪＷ， Ｓｍｉｔ ＪＷ， Ｂｒｉｎｋｈｕｉｓ ＲＦ， Ｍａｌｉｅｐａａｒｄ Ｍ， Ｂｅｉｊｎｅｎ ＪＨ， Ｓｃｈｅｌｌｅｎｓ ＪＨ， Ｓｃｈｉｎｋｅｌ ＡＨ： Ｒｏｌｅ ｏｆ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｔｈｅ ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｆｅｔａｌ ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｏｐｏｔｅｃａｎ． Ｊ． Ｎａｔｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ． ９２， １６５１−１６５６ （２０００））。他に、ヒト小腸上皮細胞や、血液幹細胞におけるＡＢＣＧ２の発現の報告がある（Ｔａｉｐａｌｅｎｓｕｕ Ｊ， Ｔｏｒｎｂｌｏｍ Ｈ， Ｌｉｎｄｂｅｒｇ Ｇ， Ｅｉｎａｒｓｓｏｎ Ｃ， Ｓｊｏｑｖｉｓｔ Ｆ， Ｍｅｌｈｕｓ Ｈ， Ｇａｒｂｅｒｇ Ｐ， Ｓｊｏｓｔｒｏｍ Ｂ， Ｌｕｎｄｇｒｅｎ Ｂ， Ａｒｔｕｒｓｓｏｎ Ｐ： Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｅｎ ｄｒｕｇ ｅｆｆｌｕｘ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ＡＴＰ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｃａｓｓｅｔｔｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ｆａｍｉｌｙ ｉｎ ｎｏｒｍａｌ ｈｕｍａｎ ｊｅｊｕｎｕｍ ａｎｄ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｃａｃｏ−２ ｃｅｌｌ ｍｏｎｏｌａｙｅｒｓ． Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｅｘｐ． Ｔｈｅｒ． ２９９， １６４−１７０ （２００１）； Ｍａｌｉｅｐａａｒｄ Ｍ， Ｓｃｈｅｆｆｅｒ ＧＬ， Ｇａｎｅｙｔｅ ＩＦ， ｖａｎ Ｇａｓｔｅｌｅｎ ＭＡ， Ｐｉｊｎｅｎｂｏｒｇ ＡＣＬＭ， Ｓｃｈｉｎｋｅｌ ＡＨ， ｖａｎ ｄｅ Ｖｉｊｖｅｒ ＭＪ， Ｓｃｈｅｐｅｒ ＲＪ， ＳｃｈｅｌｌｅｎｓＪＨＭ： Ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ｉｎ ｎｏｒｍａｌ ｈｕｍａｎ ｔｉｓｓｕｅｓ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６１， ３４５８−３４６４ （２００１）； Ｋｉｍ Ｍ， Ｔｕｒｎｑｕｉｓｔ Ｈ，Ｊａｃｋｓｏｎ Ｊ， Ｓｇａｇｉａｓ Ｍ， Ｙａｎ Ｙ， Ｇｏｎｇ Ｍ， Ｄｅａｎ Ｍ， Ｓｈａｒｐ ＪＧ， Ｃｏｗａｎ Ｋ： Ｔｈｅ ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ＡＢＣＧ２ （ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ １） ｅｆｆｌｕｘｅｓ Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２ ａｎｄ ｉｓ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ． Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ８， ２２−２８ （２００２））。これらの文献によれば、特にヒト小腸でのＡＢＣＧ２の発現は経口摂取した薬物吸収に対する障壁になっていると考えられている。
【０００９】
【発明の概要】
本発明者らは、薬物輸送体ＡＢＣＧ２遺伝子において、ＡＢＣＧ２タンパク質の第１２６番目のグルタミン残基をコードするコドンが翻訳終止コドンとなり、ＡＢＣＧ２タンパク質の活性が欠失する遺伝子多型を見出した。本発明はこの知見に基づくものである。
【００１０】
従って、本発明は、ＡＢＣＧ２タンパク質が関与する薬物吸収の異常の遺伝子診断に用いることができる変異型ポリヌクレオチドおよび核酸分子の提供を目的とする。
【００１１】
そして、本発明による変異型ポリヌクレオチドは、配列番号２で表わされるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドにおいて、配列番号２中の第１２６番目のグルタミン残基をコードするコドンの終止コドンへの変異を有してなる、ポリヌクレオチドである。
【００１２】
さらに、本発明による核酸分子は、ＡＢＣＧ２遺伝子における、ＡＢＣＧ２タンパク質の第１２６番目のグルタミン残基をコードするコドンが終止コドンとなる変異を検出しうる核酸分子であって、本発明による変異型ポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなる、核酸分子である。
【００１３】
【発明の具体的説明】
本発明によれば、ＡＢＣＧ２遺伝子における、ＡＢＣＧ２タンパク質の第１２６番目のグルタミン残基をコードするコドンが終止コドンとなる変異（本発明において「Ｑ１２６ＳＴＯＰ変異」という）を検出することができる。
【００１４】
ＡＢＣＧ２タンパク質は、ＡＢＣファミリー輸送体の一種であり、そのアミノ酸配列は配列番号２に示されている。ＡＢＣファミリー輸送体は、一般に、ＡＴＰ加水分解のエネルギーを用いて、様々な物質を、細胞膜の外側から内側へ、または内側から外側へ能動輸送する。ＡＢＣＧ２タンパク質は、いくつかの薬物の、細胞膜内側から外側への輸送に関与している。従って、ＡＢＣＧ２タンパク質の機能が失われると、これらの薬物を投与されている患者においてその薬物の吸収が過剰となり、有害な副作用が起こるものと考えられる。ＡＢＣＧ２タンパク質がその輸送に関与している薬物には、イリノテカン、ミトキサントロン、アドリアマイシン、ダウノルビシン、およびトポテカン（いずれも抗癌剤）がある。
【００１５】
本発明により検出されるＡＢＣＧ２遺伝子中の変異は、ＡＢＣＧ２タンパク質の第１２６番目のグルタミン残基をコードするコドンが終止コドンとなるものである。このような変異としては、例えば、翻訳開始コドンから数えて第３７６番目（配列番号１中では第５８０番目）のシトシン残基のチミン残基への変異が挙げられる。ＡＢＣＧ２タンパク質は６５５個のアミノ酸残基を含んでなるため、第１２６番目のグルタミン残基以降のアミノ酸が欠失すると、約８０％のアミノ酸が失われることになる。このため、上記のＡＢＣＧ２遺伝子中の変異により、ＡＢＣＧ２タンパク質の機能は失われる。従って、上記の変異を検出することにより、ＡＢＣＧ２タンパク質が関与する薬物吸収の異常に起因する病態の予測または診断が可能となる。
【００１６】
変異型ポリヌクレオチド
Ｑ１２６ＳＴＯＰ変異を検出するためには、配列番号２で表わされるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドにおいて、配列番号２中の第１２６番目のグルタミン残基をコードするコドンの終止コドンへの変異を有してなるポリヌクレオチドを標的とすることができる。すなわち、このような変異型ポリヌクレオチドの存在を確認することにより、Ｑ１２６ＳＴＯＰ変異を検出することができる。
【００１７】
Ｑ１２６ＳＴＯＰ変異を検出する際には、ゲノム中の上記変異型ポリヌクレオチドを標的とすることができる。従って、本発明の好ましい実施態様によれば、検出の標的となる変異型ポリヌクレオチドは、ヒトＡＢＣＧ２遺伝子のゲノムＤＮＡ配列を含んでなるポリヌクレオチドにおいて、配列番号２中の第１２６番目のグルタミン残基をコードするコドンの終止コドンへの変異を有してなるポリヌクレオチドとされる。ヒトＡＢＣＧ２遺伝子のゲノムＤＮＡ配列は、配列番号２で表わされるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質を発現しうる限り、特に限定されないが、好ましくは、配列番号１で表わされるヌクレオチド配列中のチミン（Ｔ）残基がウラシル（Ｕ）残基に置換されたヌクレオチド配列を含んでなるｍＲＮＡを生体内において生産しうるヌクレオチド配列とされ、例えば、ＮＣＢＩデータベースに登録番号ＮＴ０２２９５９として登録されているゲノム配列中のＡＢＣＧ２遺伝子配列が挙げられる。ＮＴ０２２９５９のゲノム配列中におけるＡＢＣＧ２遺伝子には１６個のエクソンが含まれる。ＡＢＣＧ２遺伝子の両末端部位は当業者にとって明らかであるが、好ましくはＡＢＣＧ２遺伝子のエクソン１の５’末端からエクソン１６の３’末端までとする。
【００１８】
また、Ｑ１２６ＳＴＯＰ変異を検出する際に、ゲノムにおける上記変異型ポリヌクレオチドの転写産物であるｍＲＮＡを標的とすることもできる。従って、本発明の好ましい実施態様によれば、検出の標的となる変異型ポリヌクレオチドは、配列番号１で表わされるヌクレオチド配列（特に、第２０５〜２１６９ヌクレオチドで表わされるヌクレオチド配列）において、配列番号１に示される第５８０番目のシトシン（Ｃ）残基がチミン（Ｔ）残基に置換されたヌクレオチド配列を含んでなるものとされる。
【００１９】
さらに、Ｑ１２６ＳＴＯＰ変異を検出する際に、上記ｍＲＮＡに対して生成させたｃＤＮＡを標的とすることもできる。従って、本発明の好ましい実施態様によれば、検出の標的となる変異型ポリヌクレオチドは、配列番号１で表わされるヌクレオチド配列（特に、第２０５〜２１６９ヌクレオチドで表わされるヌクレオチド配列）において、配列番号１に示される第５８０番目のシトシン（Ｃ）残基がチミン（Ｔ）残基に置換されたヌクレオチド配列を含んでなるものとされる。
【００２０】
本発明による変異型ポリヌクレオチドは、一本鎖であっても、相補鎖がハイブリダイズした二本鎖であってもよい。
【００２１】
本発明による変異型ポリヌクレオチドは、既述の通り、Ｑ１２６ＳＴＯＰ変異を検出する際の標的として有用であるが、さらには、ＡＢＣＧ２タンパク質の活性を増強する化合物をスクリーニングするためにも有用である。
【００２２】
核酸分子およびこれを用いた病態予知／検出方法
本発明による核酸分子は、ＡＢＣＧ２遺伝子におけるＱ１２６ＳＴＯＰ変異を検出しうるものであり、該核酸分子は、本発明による変異型ポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなる。
【００２３】
本発明において「ハイブリダイズする」とは、本発明による核酸分子がストリンジェントな条件下で標的ヌクレオチド分子にハイブリダイズし、標的ヌクレオチド分子以外のヌクレオチド分子にはハイブリダイズしないことを意味する。ストリンジェントな条件は、本発明による核酸分子とその相補鎖との二重鎖の融解温度Ｔｍ（℃）およびハイブリダイゼーション溶液の塩濃度などに依存して決定することができ、例えば、Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｅ． Ｆ． Ｆｒｉｓｃｈ， Ｔ． Ｍａｎｉａｔｉｓ； Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ （１９８９）等を参照することができる。例えば、使用する核酸分子の融解温度よりわずかに低い温度下でハイブリダイゼーションを行なうと、核酸分子を標的ヌクレオチド分子に特異的にハイブリダイズさせることができる。本発明の好ましい実施態様によれば、あるポリヌクレオチドにハイブリダイズする核酸分子は、そのポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドの全部または一部の配列を含んでなるものとする。
【００２４】
本発明において「核酸分子」は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびＰＮＡ（ｐｅｐｔｉｄｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）を含む意味で用いられる。本発明の好ましい実施態様によれば、核酸分子はＤＮＡである。
【００２５】
本発明による核酸分子のヌクレオチド配列は、当業者により適宜設計されうる。例えば、検出の標的をゲノムとする場合には、本発明による核酸分子は、エクソンにハイブリダイズする部分だけでなく、イントロンにハイブリダイズする部分をも含むことができ、あるいは、これらのどちらか一方のみにより構成されていてもよい。
【００２６】
本発明による核酸分子は、ＡＢＣＧ２遺伝子におけるＱ１２６ＳＴＯＰ変異の検出において、核酸プローブとして用いることができる。この目的のためには、本発明による核酸分子は、本発明による変異型ポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドの、配列番号２中の第１２６番目のグルタミン残基に対応する部分を含む領域にハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなることが好ましい。
【００２７】
本発明による核酸分子を核酸プローブとして用いる場合、核酸分子の鎖長は１０〜１００ヌクレオチドとすることが好ましく、より好ましくは少なくとも１２ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも１５ヌクレオチド、さらに好ましくは１５〜５０ヌクレオチドとする。
【００２８】
また、本発明による核酸分子は、ＡＢＣＧ２遺伝子におけるＱ１２６ＳＴＯＰ変異の検出において、核酸増幅用プライマーとして用いることができる。この目的のためには、本発明による核酸分子は、本発明による変異型ポリヌクレオチドの、配列番号２中の第１２６番目のグルタミン残基に対応する部分を含む領域を核酸増幅法において増幅することができるものであることが好ましい。
【００２９】
本発明による核酸分子を核酸増幅用プライマーとして用いる場合、核酸分子の鎖長は１０〜５０ヌクレオチドとすることが好ましく、より好ましくは少なくとも１２ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも１５ヌクレオチド、さらに好ましくは１５〜３０ヌクレオチドとする。
【００３０】
本発明の他の好ましい実施態様によれば、本発明による核酸分子の鎖長は、１５〜１００ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１７ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも１８ヌクレオチド、さらに好ましくは１８〜５０ヌクレオチドとする。このような鎖長を有する本発明による核酸分子は、特に夾雑物を含む核酸試料から上記Ｑ１２６ＳＴＯＰ変異を検出する上で好ましいものである。
【００３１】
核酸増幅法は通常プライマーのペアを用いて実施される。従って、本発明によれば、ＡＢＣＧ２遺伝子におけるＱ１２６ＳＴＯＰ変異を検出するためのプライマーペアであって、本発明による変異型ポリヌクレオチドの、配列番号２中の第１２６番目のグルタミン残基に対応する部分を含む領域を核酸増幅法において増幅しうるプライマーペアが提供される。このようなプライマーペアを構成する２本のプライマーとしては、本発明による核酸分子を用いることができる。このようなプライマーは、増幅の対象となる領域のヌクレオチド配列に基づいて当業者が適宜設計することができる。例えば、プライマーペアの一方のプライマーを、増幅対象領域のヌクレオチド配列中における５’末端部分の配列を有するものとし、他方のプライマーを、増幅対象領域の相補鎖のヌクレオチド配列中における５’末端部分の配列を有するものとすることができる。
【００３２】
本発明による核酸分子または本発明によるプライマーペアを用いることにより、ＡＢＣＧ２遺伝子におけるＱ１２６ＳＴＯＰ変異の有無を検出することができ、これにより、ＡＢＣＧ２タンパク質が関与する薬物吸収の異常に起因する病態を予知または検出することができる。
【００３３】
具体的には、本発明による核酸分子または本発明によるプライマーペアは、ＡＢＣＧ２遺伝子におけるＱ１２６ＳＴＯＰ変異を検出するための核酸増幅法においてプライマーとして用いることができ、より具体的には、本発明による変異型ポリヌクレオチドの、配列番号２中の第１２６番目のグルタミン残基に対応する部分を含む領域を増幅するための核酸増幅法においてプライマーとして用いることができる。従って、本発明によれば、本発明による核酸分子またはプライマーペアを用いて、被検者由来の核酸試料を鋳型とする核酸増幅法を行ない、得られた増幅産物中においてＱ１２６ＳＴＯＰ変異を検出する工程を含んでなる、ＡＢＣＧ２タンパク質が関与する薬物吸収の異常に起因する病態の予知法もしくは検出法または診断法が提供される。
【００３４】
この方法による診断に当たっては、例えば、被験者から血液等の試料を採取し、得られた試料からゲノムＤＮＡやｍＲＮＡ等の核酸試料を抽出し、必要であればｍＲＮＡから逆転写酵素によりｃＤＮＡを作製し、得られた核酸試料を鋳型として、本発明による核酸分子またはプライマーペアを用いて核酸増幅法を実施し、得られた増幅産物のヌクレオチド配列を解析することにより、ＡＢＣＧ２遺伝子におけるＱ１２６ＳＴＯＰ変異を検出することができる。核酸増幅法およびこれによる変異の検出法としては、当技術分野において公知のいずれの方法を用いてもよい。例えば、核酸増幅法としては、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを鋳型とする場合には通常のＰＣＲ法等を用いることができ、ｍＲＮＡを鋳型とする場合には、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＮＡＳＢＡ法等を用いることができる。
【００３５】
核酸増幅法により得られた増幅産物のヌクレオチド配列の解析は、例えば、シークエンス用プライマーを用いるダイレクトシークエンス法等により容易に行なうことができる。このような方法は当技術分野において周知であり、例えば、市販のキットを用いて実施することができる。
【００３６】
本発明による診断法においては、アレル特異的ＰＣＲ法を実施できるようにプライマーを設計することもできる。具体的には、プライマーの一方を変異部位に対合できるように設計し、他方を変異部位を含まない領域に対合できるように設計することができる。このように設計されたプライマーペアを用いて核酸増幅法を実施すると、核酸試料中に変異が存在する場合には増幅産物が得られ、変異が存在しない場合には増幅産物が得られない。従って、この場合には、増幅産物の有無を検出することにより変異の有無を判定することができる。
【００３７】
本発明による核酸分子は、ハイブリダイゼーション法等による変異の検出にプローブとして用いることができる。従って、本発明によれば、本発明による核酸分子と被検者由来の核酸試料とのハイブリダイゼーションを行ない、次いでハイブリダイゼーション複合体の存在を検出する工程を含んでなる、ＡＢＣＧ２タンパク質が関与する薬物吸収の異常に起因する病態の予知法もしくは検出法または診断法が提供される。ハイブリダイゼーション複合体の存在は、ＡＢＣＧ２遺伝子におけるＱ１２６ＳＴＯＰ変異の存在を示す。このハイブリダイゼーション法を用いる方法は、上述の核酸増幅法を用いる方法により得られる増幅産物に対して適用することもできる。
【００３８】
この方法による診断に当たっては、例えば、被検者から血液等の試料を採取し、得られた試料からゲノムＤＮＡやｍＲＮＡ等の核酸試料を抽出し、必要であればｍＲＮＡから逆転写酵素によりｃＤＮＡを作製し、ストリンジェントな条件下、本発明による核酸分子とのハイブリダイゼーションの有無を検出することにより、ＡＢＣＧ２遺伝子におけるＱ１２６ＳＴＯＰ変異を検出することができる。核酸試料は必要であれば制限酵素処理等を施し、ハイブリダイゼーションに適切な長さとすることもできる。ハイブリダイゼーション法とこれによる変異の検出法としては、当技術分野において公知のいずれの方法を用いてもよい。例えば、サザンハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション等の技術を用いることができ、これらの方法については、例えば、Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｅ． Ｆ． Ｆｒｉｓｃｈ， Ｔ． Ｍａｎｉａｔｉｓ； Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ （１９８９）を参照することができる。
【００３９】
ＡＢＣＧ２遺伝子におけるＱ１２６ＳＴＯＰ変異を検出する場合には、また、本発明による核酸分子をプライマーとして使用するプライマーエクステンション法を用いることもできる。この方法は、Ｑ１２６ＳＴＯＰ変異が一塩基多型である場合において特に好ましい。このような一塩基多型としては、例えば、翻訳開始コドンから数えて第３７６番目（配列番号１中では第５８０番目）のシトシン残基のチミン残基への変異が挙げられる。プライマーエクステンション法は当業者に公知であり、その操作手順および使用するプライマーの具体的ヌクレオチド配列は、当業者であれば容易に決定することができる。
【００４０】
本発明の好ましい実施態様によれば、上記のプライマーエクステンション法としては、ＳＮａＰｓｈｏｔＴＭ法またはＰｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法として知られる方法が用いられる。
【００４１】
ＳＮａＰｓｈｏｔＴＭ法においては、一塩基多型の部位に隣接するプライマーであって、伸長反応によりその３’末端に付加するヌクレオチドが前記一塩基多型の部位に相補的なものとなるプライマーが用いられる。このようなプライマーを使用し、被検者からの核酸試料を鋳型としてプライマーの伸長反応が行なわれるが、その際にｄｄＮＴＰ（ジデオキシＮＴＰ）を用いることにより、伸長反応は、上記の多型部位に対応する一個のヌクレオチドを取り込んだ時点で終了する。取り込まれたヌクレオチドは、蛍光標識等で予め標識しておくことにより容易に同定され、従って、多型部位のヌクレオチドが同定される。このような方法は当業者に公知であり、その操作手順および使用するプライマーの具体的ヌクレオチド配列は、当業者であれば容易に決定することができる。
【００４２】
Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法においては、被検者からの核酸試料を鋳型とするプライマーの伸長反応の際に、４種のｄＮＴＰを１種ずつ反応させる。ｄＮＴＰのいずれかが取り込まれると、等量のピロリン酸塩（ＰＰｉ）が遊離し、遊離したＰＰｉはスルフリラーゼと反応してＡＴＰを生成させ、このＡＴＰによりルシフェラーゼの反応が起こり、発光が起こる。従って、ある特定のｄＮＴＰを加えたときに発光が起こった場合には、そのｄＮＴＰに対応するヌクレオチドが取り込まれたことが明らかとなり、これにより核酸試料中の対象部位のヌクレオチドが同定される。この方法においては、ｄＮＴＰが用いられるため、ＳＮａＰｓｈｏｔＴＭ法で用いられるような多型部位に隣接するプライマーを用いる必要はなく、数塩基はなれたプライマーを用いてもよい。このような方法は当業者に公知であり、その操作手順および使用するプライマーの具体的ヌクレオチド配列は、当業者であれば容易に決定することができる。
【００４３】
本発明による予知法、検出法および診断法において、ＡＢＣＧ２遺伝子におけるＱ１２６ＳＴＯＰ変異が存在すると評価されたサンプルは、ＡＢＣＧ２タンパク質が関与する薬物吸収の異常に起因する病態を有するものと、あるいは将来においてその可能性があると診断することができる。また、本発明によれば、出生前および出生直後の診断も可能である。
【００４４】
【実施例】
例１：ヒトゲノムＤＮＡ中のＡＢＣＧ２（ＢＣＲＰ）のエクソンおよびその周辺配列の解析
ヒトゲノムＤＮＡを用い、ＡＢＣＧ２遺伝子のエクソンおよびその周辺の塩基配列を解読した。ヒトゲノムＤＮＡを鋳型として、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いてエクソン及び周辺領域を増幅する段階から、最終的に塩基配列の解読を行ない、変異を検出するまでを記述した。
【００４５】
材料および試薬
日本人由来樹立細胞株８４系
タカラ Ｅｘ−Ｔａｑ （ＰＣＲ増幅用試薬キット）
ＰＣＲ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｐｒｅ−Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｋｉｔ （ＵＳＢ Ｃｏ．， Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ， ＯＨ）：ＥｘｏｎｕｃｌｅａｓｅＩ （１０ Ｕ／μＬ）およびＳｈｒｉｍｐ ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ （２Ｕ／μＬ）が別々に含まれている。
ＡＢＩ ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｋｉｔ （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ）
ＤｙｅＥｘ９６ ｐｌａｔｅ （Ｑｉａｇｅｎ， Ｈｉｌｄｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）
【００４６】
装置および機器
ＰＣＲ９７００ （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ）
冷却遠心機（Ｓａｋｕｍａ Ｍ２００−ＩＶＤ）
ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３７００ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）
【００４７】
作業手順
ＡＢＣＧ２のゲノム配列（ＮＣＢＩ， 登録番号 ＮＴ ０２２９５９）に基づき、ＡＢＣＧ２遺伝子の各エクソン増幅用（表１）およびシークエンス用（表２）のプライマーセットを、イントロン中にＡＢＣＧ２特異的となるよう設計した。
【００４８】
【表１】
【表２】
シークエンス手順としては、まず、各エクソン増幅用のプライマーセット（表１、各０．５μＭ）全てとＥｘ−Ｔａｑ（０．６２５ｕｎｉｔｓ； Ｔａｋａｒａ Ｓｈｕｚｏ， Ｋｙｏｔｏ， Ｊａｐａｎ）を用いて、ゲノムＤＮＡ（４００ ｎｇ）よりＡＢＣＧ２遺伝子の各エクソンを全て増幅した。この際の反応液の全量は５０μＬで、８００μＭの ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（通常の４倍量）を加え、下記表３に示す組成とした。
【００５１】
【表３】
ＰＣＲの条件は、９４℃で５分処理後、「９４℃で３０秒、５５℃で１分および７２℃で２分」を３０サイクル行い、その後７２℃で７分処理した。その反応液にＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔ Ｐｒｅ−Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔに含まれるＥｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ ＩとＳｈｒｉｍｐ ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅを２０μＬずつ加えて３７℃で１５分、ついで８０℃で１５分反応させ、４℃に冷却した。
【００５３】
次に各エクソンのＰＣＲ増幅用プライマーセット（表１、各０．５μＭ）を用いて、ＡＢＣＧ２遺伝子の全エクソンを含むＤＮＡ断片（前記、ＰＣＲ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｐｒｅ−Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔによる処理を行った反応液を３μｌ用いる）より、各エクソンを含むＤＮＡ断片をＥｘ−Ｔａｑ（０．６２５ｕｎｉｔｓ； Ｔａｋａｒａ Ｓｈｕｚｏ， Ｋｙｏｔｏ， Ｊａｐａｎ）を用いて増幅した。この際の反応液の全量は５０μＬで、下記表４に示す組成とした。
【００５４】
【表４】
ＰＣＲの条件は、９４℃で５分処理後、「９４℃で３０秒、５５℃で１分および７２℃で２分」を３０サイクル行い、その後７２℃で７分処理した。その後、ＰＣＲ増幅産物のうち５μＬにＰＣＲ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｐｒｅ−Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（ＵＳＢ Ｃｏ．，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ， ＯＨ）に含まれるＥｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｉを０．２μＬ、Ｓｈｒｉｍｐ ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅを０．２μＬ、精製水を１．６μＬ加えて３７℃で１５分、８０℃で１５分処理し、その後４℃に冷却した。このような処理を行ったＰＣＲ産物を両鎖につき表２のプライマーを用いて、ＡＢＩ ＢｉｇＤｙｅ ＴｅｒｍｉｎａｔｏｒＣｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｖｅｒｓｉｏｎ ３， Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ）により直接塩基配列決定した。そのため、計７μＬのＰＣＲ増幅産物に１μＭのプライマー１．６μＬ、ＢｉｇＤｙｅ（Ｖｅｒ． ３）を２μＬ、５ｘ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒを３μＬ、精製水６．４μＬを加え合計２０μＬとして「９６℃で１０秒、５０℃で５秒、６０℃で４分」を２５サイクル行い、その後、４℃に冷却した。過剰な色素をＤｙｅＥｘ９６ ｐｌａｔｅ（Ｑｉａｇｅｎ， Ｈｉｌｄｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて除去し、溶出液２０μＬをＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３７００ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて分析した。その際、溶出液に精製水２５μＬを加え、９４℃で２分間、ヒートショックを行った。
【００５６】
結果および考察
上述のように、日本人由来樹立細胞株８４系からのＡＢＣＧ２遺伝子のエクソン領域を中心に配列決定し、これを参照配列（ＮＣＢＩ， 登録番号：ＮＴ ０２２９５９）と比較したところ、エクソン４内に存在する、翻訳開始コドンから数えて第３７６番目（配列番号１中では第５８０番目）のシトシン残基のチミン残基への変異が検出された。この変異により、ＡＢＣＧ２タンパク質の第１２６番目のグルタミン残基をコードするコドンは終止コドンとなるため、ＡＢＣＧ２タンパク質の第１２６番目以降のアミノ酸は欠失することとなる。完全なＡＢＣＧ２タンパク質は６５５個のアミノ酸残基からなるため、この変異により、ＡＢＣＧ２タンパク質の約８０％が欠失し、従って、ＡＢＣＧ２タンパク質の機能は失われる。ＡＢＣＧ２タンパク質の機能不全は、薬物吸収の異常、特に薬物の過剰吸収を引き起こすため、薬物による副作用を増強する。
【配列表】
BACKGROUND OF THE INVENTION
Field of the invention
The present invention relates to mutant polynucleotides and nucleic acid molecules that can be used for genetic diagnosis of abnormal drug absorption involving the ABCG2 protein.
[0002]
Background art
ABCG2 gene was first isolated (Allikmets R by Allikmets et al., Gerrard B, Hutchinson A, Dean M: Characterization of the human ABC superfamily:.. Isolation and mapping of 21 new genes using the expressed sequence tags database Human Mol Genet. 5, {1649-1655} (1996)). This gene has been shown to be located on chromosome 4q22 (Allikmets R, Schriml LM, Hutchinson A, Romano-Spica V, Dean M: A human plentia-spectroscopy, ATP-binding vec. in {multidrug} resistance. {Cancer Res. # 58, {5337-5339} (1998)), which is composed of 16 exons.
[0003]
Furthermore, cDNA encoding this gene was isolated from anti-cancer drug-resistant human breast cancer cells, etc., and it was revealed that this protein is a transporter responsible for drug resistance and has a function to excrete anti-cancer drugs outside the cells. Doyle (LA, Yang W, Abruzzo LV, Krogmann T, Gao Y, Rishi AK, Ross DD: A multidrug resistance @ trans. @ Trans.franc.mance.Fran. 1998); Maliepaard M, van Gastelen MA, Tohgo A, Haushee FH, van Waardenburg RCAM, de Jong LA, Pluim D, Beijnen JH, Schellens JHM:.. Circumvention of breast cancer resistance protein (BCRP) -mediated resistance to camptothecins in vitro using non-substrate drugs or theBCRP inhibitor GF120918 Clin Cancer Res. 7, {935-941} (2001); Kawabata S, Oka M, Shiozawa K, Tsukamoto K, Nakatomi K, Soda H, Fukuda M, IkegamiY, Sugahara K, Yamada Y, Kamihira S, Doyle LA, Ross DD, Kohno S:..... Breastcancer resistance protein directly confers SN-38 resistance of lung cancer cells Biochem Biophys Res Commun 280, 1216 -1223 (2001); Litman T, Blang M, Hudson E, Fetsch P, Abati A, Ross DD, Miyake K, Resau JH, Bates SE: Themultrug
-Resistant \ phenotype \ associated \ with \ overexpression \ of \ the \ new \ ABC \ transporter, {MXR} (ABCG2). {J. {Cell. {Sci. {113, {2011-2021} (2000)).
[0004]
Furthermore, it has been shown that derivatives substituted at the 7-position of camptothecin overcome the resistance to the anticancer drug mitoxantrone due to overexpression of ABCG2 (Perego P, de Cesaré M, de Isabella P, Carenini N, Beggiolin G). , Pezzoni G, Palumbo M, Tartaglia L, Pratesi, G, Pisano C, Carminati P, Scheffer GL, Zunino F: A novel 7-modified camptothecin analog overcomes breast cancer resistance protein-associated resistance in a mitoxantrone-selected coloncarcinoma cell line. Cancer Res. 61, 6034-6037 (2001)).
[0005]
In addition, it has been shown that CI1033, which has been regarded as a HER tyrosine kinase inhibitor, overcomes 7-ethyl-10-hydroxycamptothecin (SN-38, an active metabolite of irinotecan) and topotecan resistance by suppressing the function of ABCG2. has been that (Erlichman C, Boerner SA, Hallgren CG, Spieker R, Wang XY, James CD, Scheffer GL, Maliepaard M, Ross DD, Bible KC, Kaufmann SH: the HER tyrosine kinase inhibitor CI1033 enhances cytotoxicity of 7-ethyl- 10-hydroxycampto hecin and topotecan by inhibiting breast cancer resistance protein-mediateddrug efflux. Cancer Res. 61, 739-748 (2001)).
[0006]
From these facts, it is supported that the expression of ABCG2 causes the extracellular excretion of the anticancer agent to occur, and that the cancer cells exhibit drug resistance.
[0007]
In addition, when arginine 482 present on the third transmembrane domain of this transporter is changed to threonine or glycine, the drug involved in efflux is changed. Have been shown to be important (Honjo Y, Hrycyna CA, Yan QW, Medina-Perez WY, Robey RW, van de laar A, Litman T, Dean M, Mutes XeRem, XM, XM, XM) /BCRP/ABCP\gene\alter\substrate\specificity\in\MXR/BCRP/ABCP-overexpressing\cells.\C ncer Res. 61, 6635-6639 (2001)).
[0008]
Furthermore, it has been reported that the function of ABCG2 in normal cells exists in the placenta and protects the fetus from fat-soluble compounds by constituting the blood-placental barrier (JonkerｋJW, Smit JW, Brinkhus RF, Malipadard). M, \ Beijnen \ JH, \ Schellens \ JH, \ Schinkel \ AH: \ Role of Breast \ cancer \ Resistance \ protein \ in \ the \ bioavailability \\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\ \\ In addition, there have been reports of the expression of ABCG2 in human small intestinal epithelial cells and blood stem cells (Taipalensuu J, Tornblom H, Lindberg G, Einarsson C, Sjoqvist F, Melhus H, Garb, Pr, Bjr, Gersberg, Pger, Gersberg, Pger, Gersberg, Prussell, Gersberg, Prussell, Gersberg, Prussell, Gersberg, Prussell, Gersberg, Prussell, Gersberg, Prussell, Gersberg, Prussels, Gersberg, Gersberg, Gersberg) Correlation \ of \ gene \ expression \ of \ ten \ drug \ efflux \ proteins \ of \ the \ ATP-binding \ cassette \ transporter \ family \ internal \ human \ judgement \ .... L monolayers J. Pharmacol Exp Ther 299, 164-170 (2001); Maliepaard M, Scheffer GL, Ganeyte IF, van Gastelen MA, Pijnenborg ACLM, Schinkel AH, van de Vijver MJ, Scheper RJ, SchellensJHM: Subcellular localizationanddistributionofofthecancerresistanceproteintransporterinnormalmalhumanissue.CancerRes61, 3458-346 (2001); Kim M, Turnquist H, Jackson J, Sgagias M, Yan Y, Gong M, Dean M, Sharp JG, Cowan K: The multidrug resistance transporter ABCG2 (breast cancer resistance protein 1) effluxes Hoechst 33342 and is overexpressed in hematopoietic stem cells. Clin Cancer Res 8, {22-28} (2002)). According to these documents, the expression of ABCG2, particularly in the human small intestine, is considered to be a barrier to the absorption of orally ingested drugs.
[0009]
Summary of the Invention
The present inventors have found a polymorphism in the ABCG2 drug transporter gene in which the codon encoding the 126th glutamine residue of the ABCG2 protein becomes a translation termination codon and the activity of the ABCG2 protein is deleted. The present invention is based on this finding.
[0010]
Accordingly, an object of the present invention is to provide mutant polynucleotides and nucleic acid molecules that can be used for genetic diagnosis of abnormal drug absorption involving ABCG2 protein.
[0011]
The mutant polynucleotide according to the present invention is a polynucleotide encoding a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, a termination codon of a codon encoding a glutamine residue at position 126 in SEQ ID NO: 2. A polynucleotide having a mutation to
[0012]
Furthermore, the nucleic acid molecule according to the present invention is a nucleic acid molecule capable of detecting a mutation in the ABCG2 gene in which the codon encoding the glutamine residue at position 126 of the ABCG2 protein is a termination codon, and the mutant polynucleotide according to the present invention. Or a nucleic acid molecule comprising a nucleotide fragment that hybridizes to a polynucleotide complementary thereto.
[0013]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
According to the present invention, a mutation in the ABCG2 gene in which the codon encoding the glutamine residue at position 126 of the ABCG2 protein is a termination codon (referred to as “Q126STOP mutation” in the present invention) can be detected.
[0014]
ABCG2 protein is a kind of ABC family transporter, and its amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 2. ABC family transporters generally use the energy of ATP hydrolysis to actively transport various substances from the outside to the inside or from the inside to the outside of the cell membrane. The ABCG2 protein is involved in the transport of some drugs from the inside to the outside of the cell membrane. Therefore, if the function of the ABCG2 protein is lost, it is considered that in patients receiving these drugs, the absorption of the drugs becomes excessive and adverse side effects occur. Drugs in which the ABCG2 protein is involved in its transport include irinotecan, mitoxantrone, adriamycin, daunorubicin, and topotecan (all anticancer agents).
[0015]
The mutation in the ABCG2 gene detected according to the present invention is such that the codon encoding the glutamine residue at position 126 of the ABCG2 protein is a termination codon. Such a mutation includes, for example, a mutation of the 376th cytosine residue (580th in SEQ ID NO: 1) from the translation initiation codon to a thymine residue. Since the ABCG2 protein comprises 655 amino acid residues, about 80% of the amino acids will be lost if the amino acids after the 126th glutamine residue are deleted. Therefore, the function of the ABCG2 protein is lost due to the above mutation in the ABCG2 gene. Therefore, by detecting the above mutations, it becomes possible to predict or diagnose a disease state caused by abnormal drug absorption involving the ABCG2 protein.
[0016]
Mutant polynucleotide
In order to detect the Q126STOP mutation, in a polynucleotide encoding a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, the codon encoding the glutamine residue at position 126 in SEQ ID NO: 2 is changed to a stop codon. A polynucleotide comprising the mutation can be targeted. That is, the Q126STOP mutation can be detected by confirming the presence of such a mutant polynucleotide.
[0017]
When detecting the Q126STOP mutation, the mutant polynucleotide in the genome can be targeted. Therefore, according to a preferred embodiment of the present invention, the mutant polynucleotide to be detected is a glutamine residue at position 126 in SEQ ID NO: 2 in a polynucleotide comprising the genomic DNA sequence of the human ABCG2 gene. Is mutated to a stop codon. The genomic DNA sequence of the human ABCG2 gene is not particularly limited, as long as it can express a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, but is preferably thymine (T) in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1. A nucleotide sequence capable of producing in vivo a mRNA comprising a nucleotide sequence in which a residue is substituted with a uracil (U) residue is defined as a nucleotide sequence, for example, ABCG2 in a genomic sequence registered as accession number NT022959 in the NCBI database. Gene sequences. The ABCG2 gene in the NT022959 genomic sequence contains 16 exons. Although both ends of the ABCG2 gene will be apparent to those skilled in the art, it is preferably from the 5 'end of exon 1 to the 3' end of exon 16 of the ABCG2 gene.
[0018]
When detecting the Q126STOP mutation, mRNA that is a transcription product of the mutant polynucleotide in the genome can also be targeted. Therefore, according to a preferred embodiment of the present invention, the mutant polynucleotide to be detected is the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 (particularly, the nucleotide sequence represented by nucleotides 205 to 2169). And a nucleotide sequence in which the 580th cytosine (C) residue is replaced with a thymine (T) residue.
[0019]
Furthermore, when detecting the Q126STOP mutation, cDNA generated for the above mRNA can be targeted. Therefore, according to a preferred embodiment of the present invention, the mutant polynucleotide to be detected is the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 (particularly, the nucleotide sequence represented by nucleotides 205 to 2169). And a nucleotide sequence in which the 580th cytosine (C) residue is replaced with a thymine (T) residue.
[0020]
The mutant polynucleotide according to the present invention may be a single strand or a double strand in which a complementary strand has hybridized.
[0021]
As described above, the mutant polynucleotide according to the present invention is useful as a target for detecting the Q126STOP mutation, and is also useful for screening for a compound that enhances the activity of ABCG2 protein.
[0022]
Nucleic acid molecule and disease state prediction / detection method using the same
The nucleic acid molecule according to the present invention is capable of detecting the Q126STOP mutation in the ABCG2 gene, and the nucleic acid molecule comprises a nucleotide fragment that hybridizes to the mutant polynucleotide according to the present invention or a polynucleotide complementary thereto. .
[0023]
In the present invention, "hybridize" means that the nucleic acid molecule according to the present invention hybridizes to a target nucleotide molecule under stringent conditions and does not hybridize to a nucleotide molecule other than the target nucleotide molecule. Stringent conditions can be determined depending on the melting temperature Tm (° C.) of the duplex of the nucleic acid molecule of the present invention and its complementary strand, the salt concentration of the hybridization solution, and the like. Sambrook, E. F. Frisch, T. {Maniatis; Molecular Cloning} 2nd edition, {Cold Spring Harbor} Laboratory (1989) and the like can be referred to. For example, when hybridization is performed at a temperature slightly lower than the melting temperature of the nucleic acid molecule used, the nucleic acid molecule can specifically hybridize to the target nucleotide molecule. According to a preferred embodiment of the present invention, the nucleic acid molecule that hybridizes to a polynucleotide comprises the sequence of all or a part of the polynucleotide complementary to the polynucleotide.
[0024]
In the present invention, the term “nucleic acid molecule” is used to include DNA, RNA, and PNA (peptide @ nucleoic @ acid). According to a preferred embodiment of the present invention, the nucleic acid molecule is DNA.
[0025]
The nucleotide sequence of the nucleic acid molecule according to the present invention can be appropriately designed by those skilled in the art. For example, when the detection target is a genome, the nucleic acid molecule according to the present invention can include not only a portion that hybridizes to an exon but also a portion that hybridizes to an intron, or either one of them. It may be constituted only by.
[0026]
The nucleic acid molecule according to the present invention can be used as a nucleic acid probe in detecting a Q126STOP mutation in the ABCG2 gene. For this purpose, the nucleic acid molecule according to the invention comprises a region of the variant polynucleotide according to the invention or a polynucleotide complementary thereto comprising the part corresponding to the glutamine residue at position 126 in SEQ ID NO: 2. It is preferred to comprise a nucleotide fragment that hybridizes to
[0027]
When the nucleic acid molecule according to the present invention is used as a nucleic acid probe, the nucleic acid molecule preferably has a chain length of 10 to 100 nucleotides, more preferably at least 12 nucleotides, still more preferably at least 15 nucleotides, and still more preferably 15 to 50 nucleotides. I do.
[0028]
In addition, the nucleic acid molecule according to the present invention can be used as a nucleic acid amplification primer in detecting a Q126STOP mutation in the ABCG2 gene. For this purpose, the nucleic acid molecule according to the present invention is obtained by amplifying, in a nucleic acid amplification method, a region of the mutant polynucleotide according to the present invention, which contains a portion corresponding to the glutamine residue at position 126 in SEQ ID NO: 2. It is preferable that it can be.
[0029]
When the nucleic acid molecule according to the present invention is used as a primer for nucleic acid amplification, the nucleic acid molecule preferably has a chain length of 10 to 50 nucleotides, more preferably at least 12 nucleotides, still more preferably at least 15 nucleotides, and still more preferably 15 to 30 nucleotides. Nucleotide.
[0030]
According to another preferred embodiment of the invention, the length of the nucleic acid molecule according to the invention is between 15 and 100 nucleotides, more preferably at least 17 nucleotides, even more preferably at least 18 nucleotides, even more preferably between 18 and 50 nucleotides. . The nucleic acid molecule according to the present invention having such a chain length is particularly preferable for detecting the above-mentioned Q126STOP mutation from a nucleic acid sample containing contaminants.
[0031]
The nucleic acid amplification method is usually performed using a pair of primers. Therefore, according to the present invention, a primer pair for detecting the Q126STOP mutation in the ABCG2 gene, which corresponds to the glutamine residue at position 126 in SEQ ID NO: 2 of the mutant polynucleotide according to the present invention. A primer pair capable of amplifying a region containing the same in a nucleic acid amplification method is provided. As the two primers constituting such a primer pair, the nucleic acid molecule according to the present invention can be used. Such primers can be appropriately designed by those skilled in the art based on the nucleotide sequence of the region to be amplified. For example, one primer of the primer pair has a sequence at the 5 ′ end in the nucleotide sequence of the amplification target region, and the other primer has a 5 ′ end in the nucleotide sequence of the complementary strand of the amplification target region. It can have an array.
[0032]
The presence or absence of the Q126STOP mutation in the ABCG2 gene can be detected by using the nucleic acid molecule according to the present invention or the primer pair according to the present invention, thereby predicting or detecting a disease state caused by an abnormal drug absorption involving the ABCG2 protein. can do.
[0033]
Specifically, the nucleic acid molecule according to the present invention or the primer pair according to the present invention can be used as a primer in a nucleic acid amplification method for detecting the Q126STOP mutation in the ABCG2 gene. The polynucleotide can be used as a primer in a nucleic acid amplification method for amplifying a region containing a portion corresponding to the glutamine residue at position 126 in SEQ ID NO: 2. Therefore, according to the present invention, a step of performing a nucleic acid amplification method using a nucleic acid molecule or a primer pair according to the present invention and using a nucleic acid sample derived from a subject as a template, and detecting a Q126STOP mutation in the obtained amplification product And a method for predicting, detecting or diagnosing a condition caused by abnormal drug absorption involving ABCG2 protein.
[0034]
For the diagnosis by this method, for example, a sample such as blood is collected from a subject, a nucleic acid sample such as genomic DNA or mRNA is extracted from the obtained sample, and cDNA is prepared from the mRNA using reverse transcriptase if necessary. Using the obtained nucleic acid sample as a template, a nucleic acid amplification method is performed using a nucleic acid molecule or a primer pair according to the present invention, and the nucleotide sequence of the obtained amplification product is analyzed to detect the Q126STOP mutation in the ABCG2 gene. be able to. Any method known in the art may be used as a nucleic acid amplification method and a mutation detection method using the nucleic acid amplification method. For example, as a nucleic acid amplification method, when genomic DNA or cDNA is used as a template, an ordinary PCR method or the like can be used. When mRNA is used as a template, an RT-PCR method, a NASBA method, or the like is used. Can be.
[0035]
Analysis of the nucleotide sequence of the amplification product obtained by the nucleic acid amplification method can be easily performed by, for example, a direct sequencing method using a sequencing primer. Such methods are well known in the art and can be performed, for example, using commercially available kits.
[0036]
In the diagnostic method according to the present invention, primers can also be designed so that allele-specific PCR can be performed. Specifically, one of the primers can be designed to be able to pair with the mutation site, and the other can be designed to be able to pair with a region not containing the mutation site. When a nucleic acid amplification method is performed using a primer pair designed in this manner, an amplification product is obtained when a mutation is present in the nucleic acid sample, and an amplification product is not obtained when the mutation is not present. Therefore, in this case, the presence or absence of the mutation can be determined by detecting the presence or absence of the amplification product.
[0037]
The nucleic acid molecule according to the present invention can be used as a probe for detecting a mutation by a hybridization method or the like. Therefore, according to the present invention, there is provided a drug involving ABCG2 protein, comprising a step of performing hybridization between a nucleic acid molecule according to the present invention and a nucleic acid sample derived from a subject, and then detecting the presence of a hybridization complex. Methods for predicting or detecting or diagnosing a condition resulting from abnormal absorption are provided. The presence of the hybridization complex indicates the presence of the Q126STOP mutation in the ABCG2 gene. The method using the hybridization method can also be applied to an amplification product obtained by the method using the nucleic acid amplification method described above.
[0038]
In the diagnosis by this method, for example, a sample such as blood is collected from a subject, a nucleic acid sample such as genomic DNA or mRNA is extracted from the obtained sample, and if necessary, cDNA is extracted from the mRNA using a reverse transcriptase. The Q126STOP mutation in the ABCG2 gene can be detected by preparing and detecting the presence or absence of hybridization with the nucleic acid molecule according to the present invention under stringent conditions. The nucleic acid sample can be subjected to restriction enzyme treatment or the like, if necessary, to have a length suitable for hybridization. Any method known in the art may be used as a hybridization method and a method for detecting a mutation using the hybridization method. For example, techniques such as Southern hybridization and colony hybridization can be used. Sambrook, E. F. Frisch, T. {Maniatis; Molecular Cloning 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory} (1989).
[0039]
When detecting the Q126STOP mutation in the ABCG2 gene, a primer extension method using the nucleic acid molecule according to the present invention as a primer can also be used. This method is particularly preferred when the Q126STOP mutation is a single nucleotide polymorphism. Such a single nucleotide polymorphism includes, for example, a mutation of the 376th cytosine residue (580th in SEQ ID NO: 1) from the translation initiation codon to a thymine residue. The primer extension method is known to those skilled in the art, and the operating procedure and the specific nucleotide sequence of the primer to be used can be easily determined by those skilled in the art.
[0040]
According to a preferred embodiment of the present invention, the primer extension method includes SNaPshotTMThe method known as the Pyrosequencing method is used.
[0041]
SNaPshotTMIn the method, a primer which is adjacent to the single nucleotide polymorphism site and whose nucleotide added to its 3 'end by extension reaction is complementary to the single nucleotide polymorphism site is used. Using such a primer, a primer extension reaction is carried out using a nucleic acid sample from a subject as a template. At this time, by using ddNTP (dideoxy NTP), the extension reaction is carried out at the above polymorphic site. Stop when the corresponding single nucleotide is taken up. The incorporated nucleotide is easily identified by labeling it with a fluorescent label or the like in advance, and thus the nucleotide at the polymorphic site is identified. Such methods are known to those skilled in the art, and the procedure of operation and the specific nucleotide sequence of the primer used can be easily determined by those skilled in the art.
[0042]
In the Pyrosequencing method, four dNTPs are reacted one by one at the time of a primer extension reaction using a nucleic acid sample from a subject as a template. When any of the dNTPs is incorporated, an equal amount of pyrophosphate (PPi) is released, and the released PPi reacts with sulfurylase to generate ATP, and the ATP causes a luciferase reaction to cause luminescence. Therefore, when luminescence occurs when a particular dNTP is added, it is clear that the nucleotide corresponding to the dNTP has been incorporated, and thereby the nucleotide at the target site in the nucleic acid sample is identified. In this method, since dNTP is used, SNaPshotTMIt is not necessary to use a primer adjacent to the polymorphic site as used in the method, and a primer separated by several bases may be used. Such methods are known to those skilled in the art, and the procedure of operation and the specific nucleotide sequence of the primer used can be easily determined by those skilled in the art.
[0043]
In the prediction method, the detection method and the diagnosis method according to the present invention, a sample evaluated to have a Q126STOP mutation in the ABCG2 gene has a pathological condition caused by an abnormal drug absorption involving the ABCG2 protein, or is possible in the future. Can be diagnosed. Further, according to the present invention, a diagnosis can be made before birth and immediately after birth.
[0044]
【Example】
Example 1: Analysis of ABCG2 (BCRP) exon and its surrounding sequences in human genomic DNA
Using human genomic DNA, the exon of the ABCG2 gene and the nucleotide sequence around it were decoded. From the stage of amplifying exons and peripheral regions using the polymerase chain reaction (PCR) using human genomic DNA as a template, the steps from the decoding of the base sequence to the detection of the mutation are described.
[0045]
Materials and reagents
Japanese derived cell line 84
TAKARA {Ex-Taq} (Reagent kit for PCR amplification)
PCR Product Pre-Sequence Kit (USB Co., Cleveland, OH): Exonuclease I (10 U / μL) and Shrimk alkaline phosphatase (2U / μL) are separately included.
ABI BigDye Terminator Cycle Sequence Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA)
DyeEx96 {plate} (Qiagen, Hilden, Germany)
[0046]
Equipment and equipment
PCR 9700 (Applied Biosystems, Foster City, CA)
Cooling centrifuge (Sakuma @ M200-IVD)
ABI Prism 3700 DNA Analyzer (Applied Biosystems)
[0047]
Work procedure
Based on the genomic sequence of ABCG2 (NCBI, accession number NT 022959), primer sets for amplifying each exon of the ABCG2 gene (Table 1) and for sequencing (Table 2) were designed to be ABCG2-specific in the intron.
[0048]
[Table 1]
[Table 2]
As a sequencing procedure, first, genomic DNA (400 ng) was used by using all of the primer sets for amplifying each exon (Table 1, 0.5 μM each) and Ex-Taq (0.625 units; Takara Shuzo, Kyoto, Japan). All the exons of the ABCG2 gene were all amplified. At this time, the total volume of the reaction solution was 50 μL, and 800 μM of {dNTP} Mixture (4 times the normal amount) was added to obtain the composition shown in Table 3 below.
[0051]
[Table 3]
The PCR conditions were as follows: after treatment at 94 ° C. for 5 minutes, 30 cycles of “94 ° C. for 30 seconds, 55 ° C. for 1 minute and 72 ° C. for 2 minutes” were performed, followed by treatment at 72 ° C. for 7 minutes. To the reaction solution, 20 μL each of Exonuclease I and Shrimp alkaline phosphatase contained in the PCR product Pre-Sequencing Kit were added, and the mixture was reacted at 37 ° C. for 15 minutes, then at 80 ° C. for 15 minutes, and cooled to 4 ° C.
[0053]
Next, using a primer set for PCR amplification of each exon (Table 1, 0.5 μM each), a DNA fragment containing all exons of the ABCG2 gene (3 μl of the reaction solution after the treatment with the PCR Product Pre-Sequencing Kit described above) was used. DNA fragments containing each exon were amplified using Ex-Taq (0.625 units; @Takara @Shuzo, @Kyoto, @Japan). At this time, the total amount of the reaction solution was 50 μL, and the composition was as shown in Table 4 below.
[0054]
[Table 4]
The PCR conditions were as follows: after treatment at 94 ° C. for 5 minutes, 30 cycles of “94 ° C. for 30 seconds, 55 ° C. for 1 minute and 72 ° C. for 2 minutes” were performed, followed by treatment at 72 ° C. for 7 minutes. Thereafter, 0.2 μL of Exonuclease I contained in PCR Product Pre-Sequencing Kit (USB Co., Cleveland, OH) was added to 5 μL of the PCR amplification product, 0.2 μL of Shrimpe alkaline phosphatase, and 1.6 μL of purified water. The mixture was treated at 37 ° C. for 15 minutes and at 80 ° C. for 15 minutes, and then cooled to 4 ° C. The PCR product thus treated was directly sequenced by ABI BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit (Version 3, Applied Biosystems, Foster City, CA) using the primers in Table 2 for both strands. Therefore, 1.6 μL of 1 μM primer, 2 μL of BigDye (Ver. $ 3), 3 μL of 5x Sequencing buffer, and 6.4 μL of purified water are added to a total of 7 μL of the PCR amplification product, and a total of 20 μL is added. For 5 seconds and 60 ° C. for 4 minutes ”for 25 cycles, and then cooled to 4 ° C. Excess dye was removed using a DyeEx 96 plate (Qiagen, Hilden, Germany) and 20 μL of the eluate was analyzed using ABI Prism 3700 DNA Analyzer (Applied Biosystems). At that time, 25 μL of purified water was added to the eluate, and heat shock was performed at 94 ° C. for 2 minutes.
[0056]
Results and Discussion
As described above, sequencing was performed centering on the exon region of the ABCG2 gene from the Japanese-established cell line 84, and this was compared with the reference sequence (NCBI, accession number: NT 022959). A mutation of the 376th cytosine residue (580th in SEQ ID NO: 1) from the translation initiation codon to a thymine residue was detected. Due to this mutation, the codon encoding the glutamine residue at position 126 of the ABCG2 protein becomes a stop codon, and thus the amino acids after position 126 of the ABCG2 protein are deleted. Since the complete ABCG2 protein consists of 655 amino acid residues, this mutation results in the deletion of about 80% of the ABCG2 protein and therefore the function of the ABCG2 protein is lost. The dysfunction of the ABCG2 protein causes abnormal drug absorption, particularly excessive drug absorption, and thus enhances the side effects of the drug.
[Sequence list]
Claims (11)
請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなる、核酸分子。A nucleic acid molecule capable of detecting a mutation in the ABCG2 gene in which a codon encoding the glutamine residue at position 126 of the ABCG2 protein is a termination codon,
A nucleic acid molecule comprising a nucleotide fragment that hybridizes to the polynucleotide according to any one of claims 1 to 4 or a polynucleotide complementary thereto.
請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドの、配列番号２中の第１２６番目のグルタミン残基に対応する部分を含む領域を核酸増幅法において増幅しうる、プライマーペア。A primer pair for detecting a mutation in the ABCG2 gene in which a codon encoding the glutamine residue at position 126 of the ABCG2 protein is a stop codon,
A primer pair capable of amplifying a region containing a portion corresponding to the glutamine residue at position 126 in SEQ ID NO: 2 of the polynucleotide according to any one of claims 1 to 4 by a nucleic acid amplification method.
請求項５〜８のいずれか一項に記載の核酸分子、および／または請求項９または１０に記載のプライマーペアを用いて、ＡＢＣＧ２遺伝子における、ＡＢＣＧ２タンパク質の第１２６番目のグルタミン残基をコードするコドンが終止コドンとなる変異の有無を検出する工程を含んでなる、方法。A method for predicting or detecting a disease state caused by abnormal drug absorption involving ABCG2 protein by detecting a mutation in ABCG2 gene,
The nucleic acid molecule according to any one of claims 5 to 8 and / or the primer pair according to claim 9 or 10, which encodes the glutamine residue at position 126 of the ABCG2 protein in the ABCG2 gene. Detecting the presence or absence of a mutation in which the codon is a stop codon.
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