JP2004002213A - Acat-1 inhibitor - Google Patents

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide an acyl-coenzyme A: cholesterol acyltransferase-1 (ACAT-1) inhibitor comprising a phosphonic acid diester derivative. <P>SOLUTION: The ACAT-1 inhibitor comprises the phosphonic acid diester derivative represented by the formula (wherein, R<SB>1</SB>, R<SB>2</SB>, R<SB>3</SB>and R<SB>4</SB>are each the same or different and denote each a hydrogen atom, a halogen atom or a lower alkyl group; R<SB>5</SB>denotes a phenyl group or a pyridyl group which may have a lower alkoxy group on the phenyl ring; and R<SB>6</SB>denotes a lower alkyl group) as an active ingredient. <P>COPYRIGHT: (C)2004,JPO

Description

【００１２】
〔式中、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３およびＲ_４は、同一または異なって水素原子、ハロゲン原子または低級アルキル基を示す。Ｒ_５はフェニル環上に低級アルコキシ基を有することのあるフェニル基またはピリジル基を示す。Ｒ_６は低級アルキル基を示す。〕
特に、本発明は、一般式（１）中、Ｒ_３がハロゲン原子であるホスホン酸ジエステル誘導体を有効成分とするＡＣＡＴ−１阻害剤を提供する。
【００１３】
一般式（１）で表されるホスホン酸ジエステル誘導体は、動脈硬化症予防剤およびコレステロール吸収阻害剤として有用である。
【００１４】
【発明の実施の形態】
本発明ＡＣＡＴ−１阻害剤の有効成分であるホスホン酸ジエステル誘導体を表す前記一般式（１）およびその他の本明細書中に用いられている各基は、それらが各式に示される基として用いられる場合および該基の置換基として用いられる場合のいずれの場合も、具体的にはそれぞれ次の通りである。本明細書において炭素を含む各基につき用いられる「低級」なる語は、「炭素数１−６の」なる意味で用いられるものとする。
【００１５】
ハロゲン原子としては、弗素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子を例示することができる。
【００１６】
低級アルキル基としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル基などの炭素数１−６の直鎖または分枝鎖状のアルキル基を例示することができる。
【００１７】
フェニル環上に低級アルコキシ基を有することのあるフェニル基としては、無置換のフェニル基に加えて、例えば、２−メトキシフェニル、３−メトキシフェニル、４−メトキシフェニル、４−エトキシフェニル、４−プロポキシフェニル、４−イソプロポキシフェニル、４−ブトキシフェニル、４−イソブトキシフェニル、４−ｔｅｒｔ−ブトキシフェニル、４−ペンチルオキシフェニル、４−ヘキシルオキシフェニル基などの、フェニル環上に炭素数１−６の直鎖状または分枝鎖状アルコキシ基を有するフェニル基を挙げることができる。
【００１８】
低級アルコキシ基としては、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ペンチルオキシ、ヘキシルオキシ基などの炭素数１−６の直鎖状または分岐鎖状のアルコキシ基を例示することができる。
【００１９】
一般式（１）で表される誘導体は、優れたＡＣＡＴ−１阻害活性を有しており、ＡＣＡＴ−１阻害剤として有用である。また、この活性に基づいて、動脈硬化症予防剤、コレステロール吸収阻害剤などとして、医薬品分野で有用である。
【００２０】
特に、医薬品分野で好適な上記誘導体としては、以下の各化合物を挙げることができる。
（ａ）：Ｒ_５がピリジル基であるホスホン酸ジエステル誘導体、および
（ｂ）：Ｒ_３がハロゲン原子であるホスホン酸ジエステル誘導体。
【００２１】
上記（ａ）の化合物は、特にＴＨＰ−１細胞泡沫化抑制作用で評価されるＡＣＡＴ−１阻害作用が強い利点があり、また、（ｂ）の化合物は経口投与によって血中濃度を高く維持できる利点がある。
【００２２】
本発明ＡＣＡＴ−１阻害剤において有効成分とする上記一般式（１）で表される誘導体は、本出願人の先の出願（特開平８−１４３５８６号）に記載の方法に従い製造することができる。例えば、４−クロロアントラニル酸などの２−アミノ安息香酸誘導体と、４−［（ジエトキシホスホリル）メチル］安息香酸クロライドなどの酸ハロゲン化物との反応によって得られる化合物に、ヒドラジンを反応させることによって、キナゾリン骨格の３位にアミノ基を有する誘導体を得、次いで、これにベンズアルデヒドなどの適当なアルデヒド類を反応させることによって、製造することができる。その詳細は、後記参考例に詳述するとおりである。
【００２３】
得られる目的化合物は、通常の分離、精製手段、例えば、吸着クロマトグラフィー、プレパラティブ薄層クロマトグラフィー、再結晶、溶媒抽出などにより容易に単離、精製できる。
【００２４】
本発明ＡＣＡＴ−１阻害剤は、一般式（１）で表される化合物とともに、製剤学的に許容される担体を用いて、一般的な医薬組成物の形態に調製されて実用される。
【００２５】
本発明医薬組成物に利用される製剤学的に許容される担体としては、製剤の使用形態に応じて通常使用される希釈剤または賦形剤、例えば充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤などを例示できる。これらは調整される医薬製剤の投与単位形態に応じて適宜選択使用される。
【００２６】
医薬製剤の投与単位形態としては、各種の形態が治療目的に応じて適宜選択できる。その代表的なものとしては、錠剤、丸剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、カプセル剤、坐剤、注射剤（液剤、懸濁剤など）、軟膏剤などが挙げられる。
【００２７】
錠剤の形態に成形するに際しては、製剤学的に許容される担体として、例えば、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、尿素、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、ケイ酸、リン酸カリウムなどの賦形剤；水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン溶液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどの結合剤；カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、ナミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウムなどの崩壊剤；ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリドなどの界面活性剤；白糖、ステアリン、カカオバター、水素添加油などの崩壊抑制剤；第４級アンモニウム塩基、ラウリル硫酸ナトリウムなどの吸収促進剤；グリセリン、デンプンなどの保湿剤；デンプン、乳糖、カオリン、ベンナイト、コロイド状ケイ酸などの吸着剤；精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ酸末、ポリエチレングリコールなどの滑沢剤などを使用できる。更に、錠剤は、必要に応じ通常の剤皮を施した錠剤、例えば糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶被錠、フィルムコーティング錠または二重錠、多層錠とすることができる。
【００２８】
丸剤の形態に成形するに際しては、製剤学的に許容される担体として、例えば、ブドウ糖、乳糖、デンプン、カカオ脂、硬化植物油、カオリン、タルクなどの賦形剤；アラビアゴム末、トラガント末、ゼラチン、エタノールなどの結合剤；ラミナラン、カンテンなどの崩壊剤などを使用できる。
【００２９】
坐剤の形態に形成するに際しては、製剤学的に許容される担体として、例えば、ポリエチレングリコール、カカオ脂、高級アルコール、高級アルコールのエステル類、ゼラチン、半合成グリセライドなどを使用できる。
【００３０】
カプセル剤は、常法に従い、通常本発明化合物を上記で例示した各種の製剤学的に許容される担体と混合して、硬質ゼラチンカプセル、軟質ゼラチンカプセルなどの充填して調製される。
【００３１】
液剤、乳剤、懸濁剤などの注射剤として調製される場合、これらは殺菌され且つ血液と等張であるのが好ましい。これらの形態にするに際しては、希釈剤として、例えば、水、エタノール、マクロゴール、プロピレングリコール、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルなどを使用できる。尚、この場合、等張性の溶液を調製するに充分な量の食塩、ブドウ糖またはグリセリンを医薬製剤中に含有させてもよく、また通常の溶解補助剤、緩衝剤、無痛化剤などを添加してもよい。
【００３２】
ペースト、クリーム、ゲルなどの軟膏剤の形態に調製するに際しては、希釈剤として、例えば、白色ワセリン、パラフィン、グリセリン、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベンナイトなどを使用できる。
【００３３】
更に、本発明医薬組成物中には、必要に応じて着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤などや他の医薬品を含有させることもできる。
【００３４】
本発明医薬組成物中に配合される本発明化合物（有効成分化合物）の量は、特に限定されず広範囲より適宜選択される。通常医薬組成物中に、約０．５−９０重量％、好ましくは約１−８５重量％程度配合されるのがよい。
【００３５】
本発明医薬製剤の投与方法は特に制限がなく、各種製剤形態、患者の年齢、性別その他の条件、疾患の程度などに応じて決定される。例えば、錠剤、丸剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤およびカプセル剤は経口投与され、注射剤は単独でまたはブドウ糖、アミノ酸などの通常の補液と混合して静脈内に、或いは筋肉内、皮内、皮下または腹腔内に投与され、坐剤は直腸内投与される。
【００３６】
本発明医薬製剤の投与量は、その用法、患者の年齢、性別その他の条件、疾患の程度などにより適宜選択される。通常有効成分である本発明化合物の量が１日成人１人当たり体重１ｋｇ当たり約０．５−２０ｍｇ程度、好ましくは１−１０ｍｇ程度とするのがよい。該製剤は１日に１回または２−４回に分けて投与することができる。
【００３７】
【実施例】
以下、本発明を更に詳しく説明するため、本発明化合物の製造例を参考例として挙げ、次いで本発明化合物につき行われた薬理試験例および本発明化合物を有効成分とする医薬の製剤例を挙げる。
【００３８】
各例において、^１Ｈ−ＮＭＲは、特に明示しない限りクロロホルム−ｄ_１（ＣＤＣｌ_３）溶媒中、内部標準としてテトラメチルシラン（ＴＭＳ）を用いて測定した。
【００３９】
【参考例１】
（１）ジエチル　４−（３−アミノ−７−クロロ−４（３Ｈ）−キナゾリノン−２−イル）ベンジルホスホナートの製造
４−クロロアントラニル酸１８８ｇをピリジン１２００ｍＬに溶解させ、氷冷撹拌下に４−［（ジエトキシホスホリル）メチル］安息香酸クロリド６４１ｇの塩化メチレン２５０ｍＬ溶液をゆっくりと滴下した。室温で２０時間撹拌後、反応混合物に水１５００ｍＬを加え、析出した結晶を濾取して、４−（７−クロロ−４Ｈ−１，３−ベンゾオキサジン−４−オン−２−イル）ベンジルホスホナート２３３ｇを得た。
【００４０】
上記で得られたオキサジン化合物２０．０ｇと抱水ヒドラジン２．５ｇをピリジン２００ｍＬに懸濁させ、１６時間還流撹拌した。反応混合物を室温まで冷却後、減圧濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；塩化メチレン−メタノール＝５０：１）で精製し、得られた粗結晶を塩化メチレン−ジエチルエーテルより再結晶して、目的化合物の無色結晶１４．１ｇを得た。
【００４１】
（２）ジエチル　４−（７−クロロ−３−Ｎ−（３−メトキシベンジリデンアミノ）−４（３Ｈ）−キナゾリノン−２−イル）ベンジルホスホナートの製造
ジエチル　４−（３−アミノ−７−クロロ−４（３Ｈ）−キナゾリノン−２−イル）ベンジルホスホナート７０ｇ、３−メトキシベンズアルデヒド４０．４ｍＬおよびｐ−トルエンスルホン酸１０．８ｇをＤＭＦ　３５０ｍＬに溶かし、室温で１５時間撹拌した。反応混合物を氷水５００ｍＬに注ぎ込み析出した結晶を濾取した。水洗後、得られた粗結晶をクロロホルム−ジエチルエーテルより再結晶して、目的化合物の無色結晶７６．４ｇを得た。
【００４２】
得られた化合物の構造および物性を表１に示す。
【００４３】
また上記において、３−メトキシベンズアルデヒドに代えて適当なアルデヒド類を用いて同様にして、表１−表５に示す各化合物（化合物番号：４−２９）を合成した。得られた各化合物の構造および物性を表１−表５に並記する。
【００４４】
なお、各表における基の略号による表示は、それぞれ以下のことを示す。
ＯＭｅ：メトキシ基、ＯＥｔ：エトキシ基、Ｍｅ：メチル基
【００４５】
【表１】

【００４６】
【表２】

【００４７】
【表３】

【００４８】
【表４】

【００４９】
【表５】

【００５０】
【薬理試験例１】ＡＣＡＴ−１阻害作用試験１
表１−５に記載の各化合物および下記表６に記載の３種の化合物を被験物質として利用して、これら各化合物の有するＡＣＡＴ−１阻害作用を以下の通り試験した。
【００５１】
【表６】

【００５２】
ＡＣＡＴ−１酵素活性の測定は、再構成法（ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅｄ　ｖｅｓｉｃｌｅ　ａｓｓａｙ）　［Ｊ．　Ｌｉｐｉｄ　Ｒｅｓ．，２９，　１６８３−１６９２　（１９８８）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ａｃｔａ，９８２，　１８７−１９５　（１９８９）、Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，２７０，　２９５３２−２９５４０　（１９９５）］に従った。
【００５３】
Ｉ．　Ｂｒｏｋｅｎ　Ｈｏｍｏｇｉｎａｔｅ の作製
ＳＷ−１３細胞（ヒト副腎皮質癌由来細胞）を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）含有Ｌ−１５培地中、炭酸ガスインキュベーター内で、培養プレートにコンフレントになるまで培養した。
【００５４】
文献記載の方法［ｈｙｐｏｔｏｎｉｃ　ｓｈｏｃｋ　ａｎｄ　ｓｃｒａｐｐｉｎｇ　ｍｅｔｈｏｄ，　Ａｎａｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１，　２９８−３０２　（１９８１）］に従い、Ｂｒｏｋｅｎ　Ｈｏｍｏｇｉｎａｔｅを採取した。蛋白定量（Ｂｒａｄｆｏｒｄ法）を行い、使用するまで、−８０℃で保存した。
【００５５】
ＩＩ．　Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ／Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ　（Ｃｈｏｌ／ＰＣ）　ｖｅｓｉｃｌｅ の作製
チャンらの方法［Ｃｈａｎｇ，　Ｔ．Ｙ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ａｎａｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１５７，　３２３−３３０　（１９８６）］に従い、Ｃｈｏｌ／ＰＣ　ｖｅｓｉｃｌｅ　（Ｃｈｏｌ／ＰＣ＝３．９　ｍＭ／１２．８ｍＭ）を作製した。
【００５６】
ＩＩＩ．　５ × ＤＯＣ／ＰＣ の作製
ホスファチジルコリン（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）５０ｍｇを５０ｍｇ／ｍＬ　ｓｏｄｉｕｍ　ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒ　Ａ　（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，　５ｍＭ　ＥＤＴＡ，　０．０５ｍＭ　ＰＭＳＦ（ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌ　ｓｕｌｆｏｎｙｌ　ｆｌｕｏｒｉｄｅ，和光純薬株式会社），　ｐＨ　７．８）　５ｍＬに溶解した。
【００５７】
ＩＶ． 酵素液の作製
蛋白濃度２．５ｍｇ／ｍＬのＢｒｏｋｅｎ　Ｈｏｍｏｇｉｎａｔｅ　２．６ｍＬに、５×ＤＯＣ／ＰＣ　０．６５ｍＬを加え、攪拌後、氷中で２０分放置した。これに、Ｃｈｏｌ／ＰＣ　ｖｅｓｉｃｌｅ　２２ｍＬを加え、攪拌し、さらに氷中で２０分放置した。遠心後、浮遊物を除去し、これを酵素液とした。
【００５８】
Ｖ． アッセイ
被験物質は、１×１０^−３ｍｏｌ／Ｌの濃度となるようにＤＭＳＯに溶解した。
【００５９】
ネジ口ガラス試験管に、被験物質またはＤＭＳＯ（コントロールとして）２．５μＬ、酵素液２００μＬおよび基質溶液（１５０　ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、１５ｍｇ／ｍＬ　ＢＳＡ　（ＦＦＡ　ｆｒｅｅ）、２ｍＭ　ＤＴＴおよび０．１ｍＭ　［１−^１４Ｃ］ｏｌｅｏｙｌ　ｃｏｅｎｚｙｍｅ　Ａ　（８．０Ｃｉ／ｍｏｌ））５０μＬを加え、３７℃で３０分間反応させた。ヘキサン４ｍＬ、２Ｍ　ＮａＣｌ　１ｍＬおよび［^３Ｈ］−ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｙｌ　ｏｌｅａｔｅ添加エタノール１ｍＬ（約１００００　ｄｐｍ）を加えて反応を停止させた。５分間振盪後、遠心し、上層のヘキサン相のうちの２ｍＬをガラス試験管に移し、また１ｍＬをシンチレションバイアルに移した。
【００６０】
ガラス試験管中のヘキサン相は、窒素ガス気流下で溶媒を除去し、得られた脂質抽出物をクロロホルム／メタノール（２：１）混合液１００μＬに再溶解後、ＴＬＣプレートへスポットした。ＴＬＣプレートを、ヘキサン／ジエチルエーテル／酢酸（７３：２５：２）で展開し、バイオイメージアナライザー（ＢＡＳ２０００ＩＩ，富士フィルム株式会社製）で、コレステロールエステル画分の^１４Ｃを定量した。
【００６１】
また、シンチレーションバイアル中のヘキサン相は、シンチレーションカクテルを加え、^３Ｈをカウントし、加えた［^３Ｈ］−ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｙｌ　ｏｌｅａｔｅ添加エタノールの^３Ｈ量より抽出効率を計算した。抽出効率より生成した全コレステロールエステル量を計算した。コントロールの場合と比べ、被験物質添加時に減少する生成全コレステロールエステル量を、パーセント表示したものを、ＡＣＡＴ−１酵素阻害率とした。
【００６２】
ＶＩ． 結果
結果を、下記表７に示す。
【００６３】
【表７】

【００６４】
ＶＩＩ．　考察
表７に示される結果より、本発明において有効成分とする一般式（１）に属する各化合物は、いずれも優れたＡＣＡＴ−１阻害活性を有することが明らかである。
【００６５】
【薬理試験例２】ＡＣＡＴ−１阻害作用試験２（ＴＨＰ−１細胞泡沫化抑制作用試験）
表１−６に示される被験物質のＴＨＰ−１細胞泡沫化抑制作用（ＡＣＡＴ−１阻害作用）を以下のとおり試験した。
【００６６】
Ｉ． 試験方法
２４ウェルプレートに、１ウェルあたり７．５×１０^５細胞となるように２００　ｎＭフォルボール　１２−ミリステート　１３−アセテート（ｐｈｏｒｂｏｌ　１２−ｍｙｒｉｓｔａｔｅ　１３−ａｃｅｔａｔｅ，　ＰＭＡ）添加１０％　ＦＢＳ−ＲＰＭＩ１６４０培養液で調整したＴＨＰ−１細胞を播種し、炭酸ガスインキュベーター内で３日間培養して、マクロファージ様細胞へと分化させた。ＲＰＭＩ１６４０培養液で１回洗浄した後、培養液を５％　Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ　Ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ　Ｓｅｒｕｍ　（ＬＰＤＳ；　Ｒ．Ｊ．　Ｍａｙｅｒ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，２６６，　２００７０　（１９９１）：　Ｄ．　Ｅ．　Ｖａｎｃｅ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ａｃｔａ，７９２，　３９　（１９８４））−ＲＰＭＩ１６４０　１ｍＬ／ウェルに変更して、更に８時間培養した。８時間後、蛋白濃度５０μｇ／ｍＬのアセチルＬＤＬ　（Ａｃ　ＬＤＬ；袴田秀樹ら、「動脈硬化＋高脂血症研究ストラテジー」、ｐｐ３６−４１（１９９６）秀潤社）、ＢＳＡ−［^１４Ｃ］　ｏｌｅａｔｅ　ｃｏｍｐｌｅｘ（Ｊ．　Ｌ．　Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ，　ｅｔ　ａｌ，　Ｍｅｔｈｏｄ．　Ｅｎｚｙｍｏｌ．，９８，　２４１　（１９８３））２．５μＬおよび被験物質（最終濃度１×１０^−５ｍｏｌ／Ｌ）を加えた５％　ＬＰＤＳ−ＲＰＭＩ１６４０培養液５００μＬに培養液を交換した。１６時間培養した後、細胞を０．３％　ＢＳＡ−ＰＢＳ（−）で１回、ＰＢＳ（−）で２回洗浄した。細胞内の脂質成分を抽出するために、１ウェルあたりヘキサン／２−プロパノール（３：２）　０．５ｍＬを加えて静置した。３０分後、抽出液をガラス試験管にプールした。同じ抽出操作をもう一度繰り返し、先の抽出液と合わせ、窒素ガス気流下で溶媒を除去した。得られた脂質抽出物をクロロホルム／メタノール（２：１）１００μＬで再溶解し、ＴＬＣプレートにスポットした。ＴＬＣプレートは、ヘキサン／ジエチルエーテル／酢酸（７３：２５：２）で展開し、オートラジオグラフィーにより、コレステロールエステル画分の^１４Ｃを定量した。定量には、バイオイメージアナライザーＢＡＳ２０００ＩＩ（富士フィルム株式会社製）を用いた。また、脂質抽出の終わった各ウェルに０．１Ｎ　ＮａＯＨ−０．１％　ＳＤＳ　０．３ｍＬを加え、ラバーポリスマンでプレートに付着している細胞を剥がし回収した。この細胞可溶化液中の蛋白量をＢＣＡ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｓｓａｙキット（ＰＩＥＲＣＥ社）にて定量した。
【００６７】
定量したコレステロールエステル量（ｐｍｏｌ）を蛋白量（ｍｇ）で割った値と、被験物質を加えなかった場合のそれとを比較して減少率（％）を算出し、これを被験物質のＴＨＰ−１細胞泡沫化抑制率（％）として、被験物質のＡＣＡＴ−１活性の指標とした。
【００６８】
ＩＩ． 結果
試験の結果を、下記表８に示す。
【００６９】
【表８】

【００７０】
ＩＩＩ．　考察
表８に示される結果からも、表７と同様に、本発明において有効成分とする一般式（１）に属する各化合物は、優れたＡＣＡＴ−１阻害活性を有することが明らかである。
【００７１】
このようなＡＣＡＴ−１阻害活性を有する化合物が、動脈硬化予防剤およびコレステロール吸収阻害剤として有効であることは、例えばＴｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，　Ｖｏｌ．２７６，　Ｎｏ．２８，　Ｊｕｌｙ　１４，　ｐｐ．２１３２４−２１３３０，　２０００およびＴｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，　Ｖｏｌ．２７５，　Ｎｏ．３６，　Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ　８，　ｐｐ．２８０８３−２８０９２，　２０００の記載から明らかである。
【００７２】
【製剤例１】
有効成分として、参考例１で得た化合物４を用いて、１錠当りその３００ｍｇを含有する錠剤（２０００錠）を、次の処方により調製した。
参考例１で得た化合物４　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　６００ｇ
乳糖（日本薬局方品）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　６７ｇ
コーンスターチ（日本薬局方品）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　３３ｇ
カルボキシメチルセルロースカルシウム（日本薬局方品）　　　２５ｇ
メチルセルロース（日本薬局方品）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１２ｇ
ステアリン酸マグネシウム（日本薬局方品）　　　　　　　　　　　　　　　　３ｇ
即ち、上記処方に従い、参考例１で得た化合物４、乳糖、コーンスターチおよびカルボキシメチルセルロースカルシウムを充分混合し、メチルセルロース水溶液を用いて混合物を顆粒化し、２４メッシュの篩を通し、これをステアリン酸マグネシウムと混合して、錠剤にプレスして、目的の錠剤を得た。
【００７３】
【製剤例２】
有効成分として、参考例１で得た化合物４を用いて、１カプセル当りその２００ｍｇを含有する硬質ゼラチンカプセル剤（２０００カプセル）を、次の処方により調製した。
参考例１で得た化合物４　　　　　　　　　　　　４００ｇ
結晶セルロース（日本薬局方品）　　　　　　　　　　　　６０ｇ
コーンスターチ（日本薬局方品）　　　　　　　　　　　　３４ｇ
タルク（日本薬局方品）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　４ｇ
ステアリン酸マグネシウム（日本薬局方品）　　　２ｇ
即ち、上記処方に従い、各成分を細かく粉末にし、均一な混合物となるように混和した後、所望の寸法を有する経口投与用ゼラチンカプセルに充填して、目的のカプセル剤を得た。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to an ACAT-1 inhibitor (acyl-coenzyme A: cholesterol acyltransferase-1 inhibitor) containing a phosphonic acid diester derivative.
[0002]
[Prior art]
ACAT is an intracellular enzyme that catalyzes the reaction of transferring a long-chain fatty acid from acyl coenzyme A to the hydroxyl group at the 3-position of cholesterol to produce a cholesterol ester (Chang, TY, et al., Annu. Rev. {Biochem., {66, {613-638} (1997)). The general role of this enzyme is to esterify excess intracellular free cholesterol and to keep free cholesterol levels constant, with different roles for different organs. For example, in the small intestine, cholesterol is absorbed from the intestinal tract into the small intestinal epithelium, converted into cholesterol ester by ACAT, and then incorporated as a constituent lipid of kainamicron. In the liver, cholesterol esters synthesized by ACAT are incorporated as constituent lipids present in the core of VLDL and released into the blood. In steroid hormone-producing cells such as the adrenal cortex and macrophages of arteriosclerotic lesions, cholesterol esters are significantly accumulated by the action of ACAT.
[0003]
Therefore, according to the administration of a drug having an ACAT inhibitory activity, in the small intestine, the esterification of cholesterol in the small intestinal epithelium is suppressed, and the free cholesterol level in the small intestinal epithelium is increased. It is lost and cholesterol absorption is inhibited, thus lowering blood cholesterol levels. In the liver, inhibition of cholesterol ester synthesis by ACAT inhibition promotes intracellular degradation of VLDL, suppresses extracellular secretion of VLDL, and thus can be expected to lower blood LDL levels. In arteriosclerotic lesions, ACAT inhibition suppresses the accumulation of cholesterol ester at the lesions, so that a direct anti-atherosclerotic effect can be expected.
[0004]
As the above-mentioned drug having ACAT inhibitory activity (ACAT inhibitor), at present, FR145237 (NipponRinsho, 2001 2001 Mar; 59 Suppl. 3: 675-680), F-1394 (Nippon Yakurigaku Zasshi, 2001 Dec: 118); -395), {Dup128} (Nippon Rinsho, {2001} Mar; {59} Suppl. 3: {675-680), {E5324} (Jpn. {J. {Pharmacol., {1999} Feb; {79 (2): {151-158), {CL27708is, M) {47 (3): {325-332), {NTE-122} (Jpn. @ J. @ Pharmaco); ., 2001 May; 86 (1): 120-123) urea such as (H₂N-CO-NH₂Urea agent having a structure derived from the following: 58-035 (J. Pharm. Sci., 2001 Nov; 90 (11): 1859-1867), {CI-976} (J. Pharm. Sci., 2001 Nov; 90) (11): amide agents having an amide (-NH-CO-) structure, such as {1859-1868), {CI-1011} (Biochem. Pharmacol., {2002} Feb. 1; {63 (3): $ 349-360). Have been.
[0005]
However, many ACAT inhibitors so far have been studied and developed as antihyperlipidemic agents with emphasis on cholesterol absorption inhibitory action.
[0006]
Recently, it has been reported that ACAT has two subtypes, a type present only in the small intestine (ACAT-2) and a type present in the liver, macrophages, adrenal glands, and the small intestine (ACAT-1). According to this subtype, it has been revealed that many of the ACAT inhibitors developed so far are aimed at inhibiting the above-mentioned ACAT-2.
[0007]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide an ACAT-1 inhibitor having a novel structure which has not been known hitherto.
[0008]
The present applicant has developed a series of novel phosphonic acid diester derivatives having lipid-lowering action, hypotensive action and hypoglycemic action in the course of intensive research and development of active ingredient compounds usable in the pharmaceutical field. (See Japanese Patent Application Laid-Open No. 8-143586).
[0009]
As a result of subsequent studies, the present inventors have found that a compound having ACAT-1 inhibitory activity meeting the above-mentioned object exists in the above-mentioned phosphonic acid diester derivative, and thus completed the present invention.
[0010]
[Means for Solving the Problems]
The present invention provides an ACAT-1 inhibitor comprising a phosphonic acid diester derivative represented by the following general formula (1) as an active ingredient.
General formula (1):
[0011]
Embedded image

[0012]
[Wherein, R₁, R₂, R₃And R₄Represents the same or different and represents a hydrogen atom, a halogen atom or a lower alkyl group. R₅Represents a phenyl group or a pyridyl group which may have a lower alkoxy group on the phenyl ring. R₆Represents a lower alkyl group. ]
In particular, the present invention provides a compound represented by the general formula (1)₃An ACAT-1 inhibitor comprising, as an active ingredient, a phosphonic acid diester derivative wherein is a halogen atom.
[0013]
The phosphonic acid diester derivatives represented by the general formula (1) are useful as arteriosclerosis preventive agents and cholesterol absorption inhibitors.
[0014]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
The above-mentioned general formula (1) representing the phosphonic acid diester derivative which is an active ingredient of the ACAT-1 inhibitor of the present invention and other groups used in the present specification are used as the groups represented by the respective formulas. In both cases where it is used and when it is used as a substituent of the group, the following are concrete examples. As used herein, the term "lower" used for each group containing carbon is intended to mean "having 1 to 6 carbon atoms".
[0015]
Examples of the halogen atom include a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom, and an iodine atom.
[0016]
Examples of the lower alkyl group include linear or branched alkyl groups having 1 to 6 carbon atoms such as methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, tert-butyl, pentyl, and hexyl groups. .
[0017]
As the phenyl group which may have a lower alkoxy group on the phenyl ring, in addition to an unsubstituted phenyl group, for example, 2-methoxyphenyl, 3-methoxyphenyl, 4-methoxyphenyl, 4-ethoxyphenyl, 4-ethoxyphenyl, 1-carbon atoms on a phenyl ring such as propoxyphenyl, 4-isopropoxyphenyl, 4-butoxyphenyl, 4-isobutoxyphenyl, 4-tert-butoxyphenyl, 4-pentyloxyphenyl, and 4-hexyloxyphenyl groups. And a phenyl group having 6 linear or branched alkoxy groups.
[0018]
Examples of the lower alkoxy group include linear or branched alkoxy groups having 1 to 6 carbon atoms such as methoxy, ethoxy, propoxy, isopropoxy, butoxy, isobutoxy, tert-butoxy, pentyloxy, and hexyloxy groups. be able to.
[0019]
The derivative represented by the general formula (1) has an excellent ACAT-1 inhibitory activity and is useful as an ACAT-1 inhibitor. Further, based on this activity, it is useful in the pharmaceutical field as a prophylactic agent for arteriosclerosis, a cholesterol absorption inhibitor and the like.
[0020]
In particular, the above-mentioned derivatives suitable in the pharmaceutical field include the following compounds.
(A): R₅Is a pyridyl group phosphonic acid diester derivative, and
(B): R₃Is a phosphonic acid diester derivative wherein is a halogen atom.
[0021]
The compound of the above (a) has a strong advantage of an ACAT-1 inhibitory effect, which is particularly evaluated as a THP-1 cell foaming inhibitory effect, and the compound of (b) can maintain a high blood concentration by oral administration. There are advantages.
[0022]
The derivative represented by the above general formula (1) as an active ingredient in the ACAT-1 inhibitor of the present invention can be produced according to the method described in the applicant's earlier application (JP-A-8-143586). . For example, a compound obtained by reacting a 2-aminobenzoic acid derivative such as 4-chloroanthranilic acid with an acid halide such as 4-[(diethoxyphosphoryl) methyl] benzoic acid chloride is reacted with hydrazine. A derivative having an amino group at the 3-position of the quinazoline skeleton, and then reacting the derivative with an appropriate aldehyde such as benzaldehyde. The details are as described in the following Reference Example.
[0023]
The obtained target compound can be easily isolated and purified by usual separation and purification means, for example, adsorption chromatography, preparative thin-layer chromatography, recrystallization, and solvent extraction.
[0024]
The ACAT-1 inhibitor of the present invention is prepared and used in the form of a general pharmaceutical composition using a compound represented by the general formula (1) and a pharmaceutically acceptable carrier.
[0025]
Pharmaceutically acceptable carriers used in the pharmaceutical composition of the present invention include diluents or excipients usually used depending on the use form of the preparation, such as fillers, extenders, binders, moisturizers. Agents, disintegrants, surfactants, lubricants and the like. These are appropriately selected and used depending on the dosage unit form of the pharmaceutical preparation to be adjusted.
[0026]
As the dosage unit form of the pharmaceutical preparation, various forms can be appropriately selected according to the purpose of treatment. Representative examples include tablets, pills, powders, solutions, suspensions, emulsions, granules, capsules, suppositories, injections (solutions, suspensions, etc.), ointments and the like.
[0027]
When formed into tablets, pharmaceutically acceptable carriers include, for example, lactose, sucrose, sodium chloride, glucose, urea, starch, calcium carbonate, kaolin, crystalline cellulose, silicic acid, potassium phosphate and the like. Excipients; binders such as water, ethanol, propanol, simple syrup, glucose solution, starch solution, gelatin solution, carboxymethylcellulose, hydroxypropylcellulose, methylcellulose, polyvinylpyrrolidone; sodium carboxymethylcellulose, calcium carboxymethylcellulose, low-substituted hydroxy Disintegrators such as propylcellulose, dried starch, sodium alginate, agar powder, naminaran powder, sodium hydrogen carbonate, calcium carbonate; polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters, Surfactants such as sodium rill sulfate and stearic acid monoglyceride; disintegration inhibitors such as sucrose, stearin, cocoa butter, and hydrogenated oil; absorption promoters such as quaternary ammonium base and sodium lauryl sulfate; moisturizing glycerin and starch Agents; adsorbents such as starch, lactose, kaolin, benite, and colloidal silicic acid; lubricating agents such as purified talc, stearates, boric acid powder, and polyethylene glycol; Further, the tablet can be a tablet coated with a usual coating, if necessary, for example, a sugar-coated tablet, a gelatin-encapsulated tablet, an enteric-coated tablet, a film-coated tablet or a double tablet, or a multilayer tablet.
[0028]
When formed into pill form, as a pharmaceutically acceptable carrier, for example, excipients such as glucose, lactose, starch, cocoa butter, hydrogenated vegetable oil, kaolin, talc; gum arabic powder, tragacanth powder, Binders such as gelatin and ethanol; disintegrants such as laminaran and agar can be used.
[0029]
In forming a suppository, pharmaceutically acceptable carriers such as polyethylene glycol, cocoa butter, higher alcohols, higher alcohol esters, gelatin, and semi-synthetic glyceride can be used.
[0030]
Capsules are prepared according to a conventional method, usually by mixing the compound of the present invention with the various pharmaceutically acceptable carriers exemplified above and filling in hard gelatin capsules, soft gelatin capsules and the like.
[0031]
When prepared as injections, such as solutions, emulsions, suspensions, etc., they are preferably sterilized and isotonic with blood. In making these forms, for example, water, ethanol, macrogol, propylene glycol, ethoxylated isostearyl alcohol, polyoxylated isostearyl alcohol, polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester and the like can be used as the diluent. In this case, a sufficient amount of salt, glucose or glycerin for preparing an isotonic solution may be contained in the pharmaceutical preparation, and ordinary dissolution aids, buffers, soothing agents and the like are added. May be.
[0032]
When preparing the composition in the form of an ointment such as a paste, cream, or gel, as a diluent, for example, white petrolatum, paraffin, glycerin, a cellulose derivative, polyethylene glycol, silicone, benite, or the like can be used.
[0033]
Further, the pharmaceutical composition of the present invention may contain a coloring agent, a preservative, a flavor, a flavoring agent, a sweetening agent, and other pharmaceuticals as necessary.
[0034]
The amount of the compound of the present invention (active ingredient compound) to be blended in the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited and is appropriately selected from a wide range. Usually, about 0.5-90% by weight, preferably about 1-85% by weight is added to the pharmaceutical composition.
[0035]
The administration method of the pharmaceutical preparation of the present invention is not particularly limited, and is determined according to various preparation forms, patient age, gender and other conditions, degree of disease, and the like. For example, tablets, pills, solutions, suspensions, emulsions, granules, and capsules are administered orally, and injections are used alone or mixed with normal replenishers such as glucose and amino acids for intravenous or intramuscular use It is administered intradermally, subcutaneously or intraperitoneally, and suppositories are rectal.
[0036]
The dose of the pharmaceutical preparation of the present invention is appropriately selected depending on the usage, age, sex and other conditions of the patient, degree of disease and the like. Usually, the amount of the compound of the present invention, which is an active ingredient, is about 0.5 to 20 mg, preferably about 1 to 10 mg per kg of body weight per adult per day. The formulation can be administered once a day or divided into 2-4 times.
[0037]
【Example】
Hereinafter, in order to explain the present invention in more detail, Production Examples of the compound of the present invention will be cited as Reference Examples, followed by pharmacological test examples of the compound of the present invention and pharmaceutical preparations containing the compound of the present invention as an active ingredient.
[0038]
In each example,¹H-NMR was measured using chloroform-d unless otherwise specified.₁(CDCl₃) Measured in solvent using tetramethylsilane (TMS) as internal standard.
[0039]
[Reference Example 1]
(1) Production of diethyl 4- (3-amino-7-chloro-4 (3H) -quinazolinon-2-yl) benzylphosphonate
188 g of 4-chloroanthranilic acid was dissolved in 1200 mL of pyridine, and a solution of 641 g of 4-[(diethoxyphosphoryl) methyl] benzoic acid chloride in 250 mL of methylene chloride was slowly added dropwise with stirring under ice cooling. After stirring at room temperature for 20 hours, 1500 mL of water was added to the reaction mixture, and the precipitated crystals were collected by filtration to give 4- (7-chloro-4H-1,3-benzoxazin-4-one-2-yl) benzylphosphonate. 233 g of natto were obtained.
[0040]
20.0 g of the oxazine compound obtained above and 2.5 g of hydrazine hydrate were suspended in 200 mL of pyridine, and stirred under reflux for 16 hours. The reaction mixture was cooled to room temperature, concentrated under reduced pressure, and the residue was purified by silica gel column chromatography (eluent; methylene chloride-methanol = 50: 1). The obtained crude crystals were recrystallized from methylene chloride-diethyl ether. Thus, 14.1 g of colorless crystals of the target compound were obtained.
[0041]
(2) Preparation of diethyl 4- (7-chloro-3-N- (3-methoxybenzylideneamino) -4 (3H) -quinazolinon-2-yl) benzylphosphonate
Dissolve 70 g of diethyl 4- (3-amino-7-chloro-4 (3H) -quinazolinon-2-yl) benzylphosphonate, 40.4 mL of 3-methoxybenzaldehyde and 10.8 g of p-toluenesulfonic acid in 350 mL of DMF, Stirred at room temperature for 15 hours. The reaction mixture was poured into 500 mL of ice water, and the precipitated crystals were collected by filtration. After washing with water, the obtained crude crystals were recrystallized from chloroform-diethyl ether to obtain 76.4 g of colorless crystals of the target compound.
[0042]
Table 1 shows the structure and physical properties of the obtained compound.
[0043]
In the above, each compound (Compound No. 4-29) shown in Table 1 to Table 5 was synthesized in the same manner using appropriate aldehydes instead of 3-methoxybenzaldehyde. The structures and physical properties of the obtained compounds are shown in Tables 1 to 5.
[0044]
In addition, the indication by the abbreviation of the group in each table shows the following, respectively.
OMe: methoxy group, OEt: ethoxy group, Me: methyl group
[0045]
[Table 1]

[0046]
[Table 2]

[0047]
[Table 3]

[0048]
[Table 4]

[0049]
[Table 5]

[0050]
[Pharmacological test example 1] ACAT-1 inhibitory action test 1
Utilizing the compounds shown in Tables 1 to 5 and the three compounds shown in Table 6 below as test substances, the ACAT-1 inhibitory effects of these compounds were tested as follows.
[0051]
[Table 6]

[0052]
The measurement of the ACAT-1 enzyme activity was performed by a reconstituted method (reconstructed vessel assay) [J. {Lipid} Res. ,29, {1683-1692} (1988), Biochem. {Biophys. Acta,982, {187-195} (1989); {Biol. {Chem. ,270, {29532-29540} (1995)].
[0053]
I. Broken Homogenate Production of
SW-13 cells (human adrenocortical carcinoma-derived cells) were cultured in an L-15 medium containing 10% fetal bovine serum (FBS) in a carbon dioxide gas incubator until the culture plate became confluent.
[0054]
The method described in the literature [hypotonic @ shock | and \ strapping \ method, {Anal. Biochem. ,11, {298-302} (1981)], and Broken @ Homoginate was collected. Protein quantification (Bradford method) was performed and stored at -80 ° C until use.
[0055]
II. Cholesterol / Phosphatidylcholine (Chol / PC) vessel Production of
Chang et al. [Chang, @T. Y. , {Et} al. , {Anal. Biochem. ,157, {323-330} (1986)] to produce Chol / PC vehicles (Chol / PC = 3.9 mM / 12.8 mM).
[0056]
III. 5 × DOC / PC Production of
50 mg of phosphatidylcholine (phosphatidylcholine) was added to 50 mg / mL sodium deoxycholate-Buffer A (50 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA, 0.05 mM PMSF (Phenylmethyl Sulfonyl Fluoride, Inc.).
[0057]
IV. Preparation of enzyme solution
5 × DOC / PC 0.65 mL was added to Broken Homoginate 2.6 mL having a protein concentration of 2.5 mg / mL, and the mixture was stirred and left on ice for 20 minutes. To this was added 22 mL of Chol / PC vehicle, stirred, and allowed to stand on ice for 20 minutes. After centrifugation, the suspended matter was removed, and this was used as an enzyme solution.
[0058]
V. Assay
The test substance is 1 × 10^-3It was dissolved in DMSO to a concentration of mol / L.
[0059]
2.5 μL of test substance or DMSO (as a control), 200 μL of enzyme solution and substrate solution (150 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0), 15 mg / mL BSA (FFA free), 2 mM DTT And 0.1 mM [1-¹⁴C] oleoyl {coenzyme A} (8.0 Ci / mol)) was added, and reacted at 37 ° C for 30 minutes. Hexane 4 mL, 2 M NaCl 1 mL and [³The reaction was stopped by adding 1 mL (about 10,000 dpm) of ethanol with [H] -cholesteryl oleate. After shaking for 5 minutes, centrifugation was performed, and 2 mL of the upper hexane phase was transferred to a glass test tube, and 1 mL was transferred to a scintillation vial.
[0060]
The solvent was removed from the hexane phase in the glass test tube under a stream of nitrogen gas, and the obtained lipid extract was redissolved in 100 μL of a chloroform / methanol (2: 1) mixed solution, and then spotted on a TLC plate. The TLC plate was developed with hexane / diethyl ether / acetic acid (73: 25: 2), and the cholesterol ester fraction was analyzed using a bioimage analyzer (BAS2000II, manufactured by Fuji Film Co., Ltd.).¹⁴C was quantified.
[0061]
Also, the hexane phase in the scintillation vial adds scintillation cocktail,³H was counted and added [³H] -cholesteryl @ oleate added ethanol³The extraction efficiency was calculated from the amount of H. The total cholesterol ester produced was calculated from the extraction efficiency. The amount of the total cholesterol ester produced which decreased when the test substance was added, as compared with the control, was expressed as a percentage and was defined as the ACAT-1 enzyme inhibition rate.
[0062]
VI. result
The results are shown in Table 7 below.
[0063]
[Table 7]

[0064]
VII. Consideration
From the results shown in Table 7, it is clear that each compound belonging to the general formula (1) as an active ingredient in the present invention has excellent ACAT-1 inhibitory activity.
[0065]
[Pharmacological Test Example 2] ACAT-1 inhibitory activity test 2 (THP-1 cell foaming inhibitory activity test)
The THP-1 cell foaming inhibitory activity (ACAT-1 inhibitory activity) of the test substances shown in Table 1-6 was tested as follows.
[0066]
I. Test method
7.5 × 10 per well in a 24-well plate⁵THP-1 cells prepared with a 10% FBS-RPMI1640 culture solution supplemented with 200% nM phorbol 12-myristate 13-acetate (phorbol 12-myristate 13-acetate, PMA) so as to become cells are seeded, and placed in a carbon dioxide gas incubator. For 3 days to differentiate into macrophage-like cells. After washing once with the RPMI 1640 culture solution, the culture solution was washed with 5% Lipoprotein Definitive Serum (LPDS; RJ Mayer, et al., J. Biol. Chem.,266, {20070} (1991): {D. E. Vance, et al. , @Biochem. {Biophys. Acta,792, {39} (1984))-RPMI1640 @ 1 mL / well and further cultured for 8 hours. Eight hours later, acetyl LDL (Ac LDL; Hideki Hakamada et al., “Atherosclerosis + Hyperlipidemia Research Strategy”, pp36-41 (1996) Shujunsha) with a protein concentration of 50 μg / mL, BSA- [¹⁴C] oleate complex (J. L. Goldstein, et al, Method. Enzymol.,98, {241} (1983)) and test substance (final concentration 1 × 10^-5(mol / L) was added to 500 μL of a 5% ΔLPDS-RPMI1640 culture solution. After culturing for 16 hours, the cells were washed once with 0.3% BSA-PBS (-) and twice with PBS (-). To extract lipid components in the cells, hexane / 2-propanol (3: 2) 0.5 mL per well was added and allowed to stand. After 30 minutes, the extracts were pooled in glass tubes. The same extraction operation was repeated once, combined with the previous extract, and the solvent was removed under a stream of nitrogen gas. The obtained lipid extract was redissolved in 100 μL of chloroform / methanol (2: 1) and spotted on a TLC plate. TLC plates were developed with hexane / diethyl ether / acetic acid (73: 25: 2) and autoradiography revealed the cholesterol ester fraction.¹⁴C was quantified. For the quantification, a bioimage analyzer BAS2000II (manufactured by Fuji Film Co., Ltd.) was used. To each well after lipid extraction, 0.1N NaOH-0.1% SDS 0.3 mL was added, and cells attached to the plate were peeled off and collected using a rubber policeman. The amount of protein in the cell lysate was quantified using a BCA Protein Assay kit (PIERCE).
[0067]
A reduction rate (%) was calculated by comparing a value obtained by dividing the determined amount of cholesterol ester (pmol) by the amount of protein (mg) and that in the case where the test substance was not added. The cell foaming inhibition rate (%) was used as an index of the ACAT-1 activity of the test substance.
[0068]
II. result
The results of the test are shown in Table 8 below.
[0069]
[Table 8]

[0070]
III. Consideration
From the results shown in Table 8, similarly to Table 7, it is clear that each compound belonging to the general formula (1) as an active ingredient in the present invention has excellent ACAT-1 inhibitory activity.
[0071]
The fact that such a compound having ACAT-1 inhibitory activity is effective as an arteriosclerosis preventive agent and a cholesterol absorption inhibitor is described in, for example, The Journal of Biological Chemistry, Vol. 276, {No. 28, \ Jully \ 14, \ pp. 21324-21330, 2000 and The Journal of Biological Chemistry, Vol. 275, {No. 36, $ Septmber 8, $ pp. 28083-28092, # 2000.
[0072]
[Formulation Example 1]
Using the compound 4 obtained in Reference Example 1 as an active ingredient, tablets (2000 tablets) containing 300 mg per tablet were prepared according to the following formulation.
4 600 g of the compound obtained in Reference Example 1
Lactose (Japanese Pharmacopoeia) ¥ 67g
Cornstarch (Japanese Pharmacopoeia) ¥ 33g
Carboxymethylcellulose calcium (Japanese Pharmacopoeia product) ¥ 25g
Methylcellulose (Japanese Pharmacopoeia) ¥ 12g
Magnesium stearate (Japanese Pharmacopoeia) ¥ 3g
That is, according to the above formulation, the compound 4, lactose, corn starch and carboxymethylcellulose calcium obtained in Reference Example 1 were sufficiently mixed, the mixture was granulated with an aqueous methylcellulose solution, and passed through a 24-mesh sieve. Mixing and pressing into tablets yielded the desired tablets.
[0073]
[Formulation Example 2]
Using Compound 4 obtained in Reference Example 1 as an active ingredient, a hard gelatin capsule (2000 capsules) containing 200 mg per capsule was prepared according to the following formulation.
4 to 400 g of the compound obtained in Reference Example 1
Crystalline cellulose (Japanese Pharmacopoeia) 60g
Cornstarch (Japanese Pharmacopoeia) ¥ 34g
Talc (Japanese Pharmacopoeia) ¥ 4g
Magnesium stearate (Japanese Pharmacopoeia) 2g
That is, each component was finely powdered according to the above formulation, mixed into a uniform mixture, and then filled into a gelatin capsule for oral administration having a desired size to obtain a desired capsule.

Claims (2)

General formula (1):

[Wherein, R ₁ , R ₂ , R ₃ and R ₄ are the same or different and represent a hydrogen atom, a halogen atom or a lower alkyl group. R ₅ represents a phenyl group or a pyridyl group which may have a lower alkoxy group on the phenyl ring. R ₆ represents a lower alkyl group. ]
An ACAT-1 inhibitor comprising, as an active ingredient, a phosphonic acid diester derivative represented by the following formula: The ACAT-1 inhibitor according to claim 1, wherein a compound of the general formula (1) wherein R ₃ is a halogen atom is an active ingredient.