JP2004000197A

JP2004000197A - Method for lowering pollen fertility using gene of tapetum specific zinc finger transfer factor

Info

Publication number: JP2004000197A
Application number: JP2003110911A
Authority: JP
Inventors: Sanjae Kapur; カプール　サンジャエ; Akira Kobayashi; 小林　晃; Hiroshi Takatsuji; 高辻　博志
Original assignee: National Institute of Agrobiological Sciences; Bio Oriented Technology Research Advancement Institution; Sasaki Co Ltd
Current assignee: National Institute of Agrobiological Sciences; Bio Oriented Technology Research Advancement Institution; Sasaki Co Ltd
Priority date: 2003-04-15
Filing date: 2003-04-15
Publication date: 2004-01-08

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a genetic engineering technique useful for reforming a plant character represented by male sterility and using a gene specific to the tissue of an anther. <P>SOLUTION: In a method for creating a plant the character of which is reformed, a promotor, which contains either one of DNA having a specific arrangement and DNA having the arrangement of a part of the arrangement of that DNA and showing a specific promotor activity to the tapectum of the anther, and the gene of a different kind connected to the promotor operatively are added. By this method, male sterility can be imparted to the promotor and the plant containing the promotor and the gene of the different kind to provide a useful plant revealing cassette. <P>COPYRIGHT: (C)2004,JPO

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、雄しべの葯に特異的に発現する遺伝子およびその利用に関する。本発明は、特に、葯のタペート層に特異的に発現する、ペチュニア由来のジンクフィンガー型転写因子（ＺＰＴ３−２）の遺伝子およびその利用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
花粉の稔性は、農業・園芸における様々な局面で問題になる。たとえば、交雑育種における交配の際、自家受粉を避けるために、多くの労力がかかる除雄（雄しべの除去）の作業が行われる。種苗産業においては、交雑育種によって得られた優れた品種を商業的に保護したいという立場から、花粉稔性の無い形質が求められている。このような要請から、花粉の稔性を制御する技術（ｐｏｌｌｉｎａｔｉｏｎ　ｃｏｎｔｒｏｌ）が強く求められてきた。従来、特定の作物では、細胞質雄性不稔性の系統が交雑育種に用いられ、一定の成功を収めてきた。しかし、細胞質不稔形質は多くの場合、耐病性の低下などの好ましくない副次効果を伴い、さらに形質が不安定であること、種子の大量生産が困難なことなどの問題がある。化学薬品処理によって稔性を低下させる方法も研究されているが、安全性評価および作用機作解明が遅れており、実用化には至っていない。そこで、遺伝子工学を用いた優れた雄性不稔化技術が求められている。
【０００３】
タペート層は、葯壁の最も内側に位置し、胞子形成細胞（花粉細胞）を取り囲んでいる組織である。タペート層の役割は、花粉の発達に欠かせない重要なものであり、単に花粉細胞の支持体としてだけでなく、花粉の発達に必要な栄養の供給、四分子（ｔｅｔｒａｄ）を包むカロース層の分解、花粉細胞表面のエキシン層などを構成する化合物の供給など、多岐にわたっている。葯の発達は、胞子形成細胞の減数分裂直後にあたる四分子期、四分子からの微小胞子の放出期、花粉細胞の拡大および空胞形成に特徴付けられる一核期、有糸分裂により栄養細胞および生殖細胞への分化が生じる有糸細胞分裂期、その後の二核期という、各段階に区分される。これらの段階を経て、最終的に葯が開裂し、成熟した花粉粒が放出される。以上の発達過程において、タペート層の機能の一部でも損なわれると、多くの場合、正常な花粉の発達が阻害され、花粉稔性が失われることが知られている。
【０００４】
上記のように、遺伝子工学による雄性不稔化技術には大きな期待が寄せられている。特に、タペート層のような、外部に露出していない小さな領域で特異的に発現する遺伝子を利用できれば、植物に好ましくない形質を付与することなく、雄性不稔化を達成し得る可能性が高いと考えられる。タペート層に特異的なプロモーター、および、それを含む雄生不稔化のための遺伝子構築物の例は、いくつか報告されている（ＳｈｉｖａｎｎａおよびＳａｗｈｎｅｙ編，　Ｐｏｌｌｅｎｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ｆｏｒ　ｃｒｏｐ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ　（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ　ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ）ｐｐ．２３７−２５７，１９９７）。しかし、発現の組織特異性および時期特異性が高い、花粉稔性の制御のために有用な新たな遺伝子に対する要望が依然として存在する。
【０００５】
本発明者らは、最近、ペチュニア由来の新規な転写因子として、ＰＥＴｈｙＺＰＴ３−２（以下、ＺＰＴ３−２と略す）を含む７つのジンクフィンガー（ＺＦ）型転写因子のｃＤＮＡ配列を特定した。そして、ノーザンブロット分析から、それぞれの転写因子が葯特異的に、葯の発達の異なる段階において一過性の発現を示すことを報告した（Ｋｏｂａｙａｓｈｉら，Ｐｌａｎｔ　Ｊ．，１３：５７１，１９９８）。しかし、これらの転写因子の植物における生理的な機能および作用、ならびに転写因子をコードする遺伝子の正確な発現部位およびその発現調節機構は不明であった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、雄性不稔に代表される植物形質の改変に有用な、葯の組織に特異的な遺伝子を利用する遺伝子工学的手法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、以前にペチュニアから単離した、葯特異的な転写因子の一つ（ＺＰＴ３−２）をコードする遺伝子をペチュニアに再導入した。その結果、導入遺伝子が内因性遺伝子の発現を抑制することによって、花粉の正常な発達が阻害され、花粉の稔性が著しく低下することを見出した。さらに本発明者らは、ＺＰＴ３−２のゲノム遺伝子から上流領域を単離し、そのプロモーター活性の組織特異性を調べた。その結果、４分子期から一核期にかけてのタペート層において、プロモーター活性が組織および時期特異的に発現されることを見出した。本発明は、これらの知見に基づいて完成された。
【０００８】
本発明は、その第１の局面において、雄性不稔性の植物を作出する方法であって、以下の工程を包含する方法に関する：（ｉ）配列番号１によって示される塩基配列の第１位から第１８８６位までの配列を有するＤＮＡ、（ｉｉ）（ｉ）の塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、花粉の発達を制御する転写因子をコードするＤＮＡ、または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の断片であるＤＮＡのいずれかである核酸と、上記核酸に作動可能に連結されたプロモーターとを含む、植物発現カセットを提供する工程；花粉の発達を制御する内因性の転写因子を有する植物の細胞を提供する工程であって、ここで、内因性の転写因子をコードする遺伝子は、上記核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、工程；発現カセットを植物細胞に導入する工程；発現カセットが導入された植物細胞を、植物体に再生する工程；および、再生された植物体であって、上記核酸が発現されることによって、内因性の転写因子の発現が抑制された植物体を選択する工程。本発明の上記方法は、植物に雄性不稔性を付与する方法として、利用され得る。
【０００９】
１つの実施態様において、上記核酸は上記プロモーターに対して順方向で連結され、上記植物体の細胞内でセンス方向に転写され得る。
【００１０】
１つの実施態様において、上記核酸は上記プロモーターに対して逆方向で連結され、上記植物体の細胞内でアンチセンス方向に転写され得る。
【００１１】
１つの実施態様において、上記植物は双子葉植物である。双子葉植物は、好ましくはナス科植物であり、より好ましくはペチュニア属植物である。
【００１２】
１つの実施態様において、上記発現カセットは植物発現ベクターに組み込まれている。
【００１３】
本発明の第１の局面によればまた、上記いずれかに記載の方法により作出された、雄性不稔性の植物が提供される。
【００１４】
本発明は、その第２の局面において、雄性不稔性の植物を作出する方法であって、以下の工程を包含する方法に関する：（ａ）配列番号３によって示される塩基配列の第１位から第１９９１位までの配列を有するＤＮＡ、または（ｂ）（ａ）の一部の配列を有し、葯のタペート層に特異的なプロモーター活性を示すＤＮＡのいずれかを含むプロモーターと、上記プロモーターに作動可能に連結された異種遺伝子とを含む、植物発現カセットを提供する工程；発現カセットを植物細胞に導入する工程；および、発現カセットが導入された植物細胞を、植物体に再生する工程。本発明の上記方法は、植物に雄性不稔性を付与する方法として、利用され得る。
【００１５】
１つの実施態様において、上記植物は双子葉植物である。双子葉植物は、好ましくはナス科植物であり、より好ましくはペチュニア属植物である。
【００１６】
１つの実施態様において、上記発現カセットは植物発現ベクターに組み込まれている。
【００１７】
本発明の第２の局面によればまた、上記いずれかに記載の方法により作出された、雄性不稔性の植物が提供される。
【００１８】
本発明は、その第３の局面において、以下の（Ｉ）または（ＩＩ）のＤＮＡを含むプロモーターに関する：（Ｉ）配列番号３によって示される塩基配列の第１位から第１９９１位までの配列を有するＤＮＡ；または、（ＩＩ）（Ｉ）の一部の配列を有し、葯のタペート層に特異的なプロモーター活性を示す、ＤＮＡ。
【００１９】
本発明は、その第４の局面において、上記プロモーターと、上記プロモーターに作動可能に連結された異種遺伝子とを含む、植物に雄性不稔性を付与するために有用な植物発現カセットに関する。
【００２０】
【発明の実施の形態】
本発明について、以下に、より詳細に説明する。
【００２１】
（ＺＰＴ３−２遺伝子由来の転写因子）
本発明の第１の局面である、雄性不稔性の植物を作出する方法において有用な核酸は、（ｉ）配列番号１によって示される塩基配列の第１位から第１８８６位までの配列を有するＤＮＡ、（ｉｉ）（ｉ）の塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、花粉の発達を制御する転写因子をコードするＤＮＡ、または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の断片であるＤＮＡのいずれかである。本発明における上記核酸は、好ましくは（ｉ）のＤＮＡ、すなわち、ＺＰＴ３−２をコードするＤＮＡ、またはその断片であり、より好ましくは（ｉ）のＤＮＡである。
【００２２】
本明細書において「転写因子」とは、遺伝子の調節領域のＤＮＡに結合してｍＲＮＡの合成を制御するタンパク質をいう。ある種の転写因子は、そのＤＮＡ結合ドメインにジンクフィンガーモチーフと呼ばれる保存性の高いアミノ酸配列を有することが知られている。ＺＰＴ３−２は、Ｃｙｓ２／Ｈｉｓ２型（ＥＰＦファミリー）のジンクフィンガータンパク質であって、４４４アミノ酸からなる全長のアミノ酸配列内に３つのジンクフィンガーモチーフを含み、さらにＤＬＮＬ配列と称される疎水性領域を含む転写因子である（Ｋｏｂａｙａｓｈｉら、前出）。ＺＰＴ３−２をコードするｃＤＮＡ配列（配列番号１）を、対応する推定アミノ酸配列（配列番号２）と共に図１Ａ〜１Ｄに示す。
【００２３】
本明細書において、核酸またはＤＮＡの「断片」とは、植物体に導入され、適切な様式で発現されたときに、当該植物の内因性の転写因子の発現を抑制し得る断片をいう。この断片は、上記（ｉ）または（ｉｉ）のＤＮＡの、ジンクフィンガーモチーフをコードする領域以外から選択され、少なくとも約４０塩基対以上、好ましくは約５０塩基対以上、より好ましくは約７０塩基対以上、さらに好ましくは約１００塩基対以上の長さを有する。
【００２４】
本明細書において、ハイブリダイゼーションのための「ストリンジェントな条件」とは、特定の塩基配列（例えば、ペチュニア由来のＺＰＴ３−２をコードするＤＮＡ）と、これと相同性の高い他の塩基配列（例えば、ペチュニア以外の植物に存在する、ＺＰＴ３−２のホモログをコードするＤＮＡ）とのオリゴヌクレオチド二本鎖を形成させるのに十分な条件を意図する。本発明に適用されるストリンジェントな条件の代表的な例として、次の条件が挙げられる：１Ｍ　ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ、１０％デキストラン硫酸、^３２Ｐ標識プローブＤＮＡ（１ｘ１０^７ｃｐｍ）および５０μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で、６０℃で１６時間ハイブリダイズさせた後、２ｘＳＳＣ／１％ＳＤＳで６０℃、３０分間の洗浄を２回繰り返す。
【００２５】
本発明における、ＺＰＴ３−２をコードするＤＮＡ、およびこれとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、花粉の発達を制御する転写因子をコードするＤＮＡを単離するためには、公知の転写因子の遺伝子によりコードされるアミノ酸配列の保存領域に対応するデジェネレートプライマー対を用い得る。このプライマー対を用いて、植物のｃＤＮＡまたはゲノミックＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、その後、得られた増幅ＤＮＡ断片をプローブとして用いて、同じ植物のｃＤＮＡライブラリーまたはゲノミックライブラリーをスクリーニングすることができる。そのようなプライマー対の例として、５’−ＣＡＲＧＣＮＹＴＮＧＧＮＧＧＮＣＡＹ−３’（配列番号４）と、３’−ＲＴＧＮＣＣＮＣＣＮＡＲＮＧＣＹＴＧ−５’（配列番号５）との組合せが挙げられる（ここで、Ｎはイノシンであり、ＲはＧまたはＡであり、そしてＹはＣまたはＴである）。上記プライマー配列は、それぞれ、ＺＰＴ３−２のジンクフィンガーモチーフに含まれるアミノ酸配列ＱＡＬＧＧＨに対応する。
【００２６】
従って、本発明に適用されるストリンジェントなハイブリダイゼーション条件はまた、ＰＣＲの条件としても規定され得、代表的な例においては、上記デジェネレートプライマー（配列番号４および５）が用いられ得る。この際のＰＣＲ反応条件は、９４℃で５分間の変性の後、９４℃で３０秒間、５０℃で３０秒間、そして７２℃で１分間を３０サイクル繰り返し、最後に、７２℃で７分間インキュベーションを行う条件であり得る。
【００２７】
ＰＣＲは、市販のキットおよび装置の製造者の指針に基づいて行うか、当業者に周知の手法で行い得る。遺伝子ライブラリーの作製法、および遺伝子のクローニング法なども当業者に周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、第２版（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８９）を参照のこと。得られた遺伝子の塩基配列は、当該分野で公知のヌクレオチド配列解析法または市販されている自動シーケンサーを利用して決定し得る。
【００２８】
本明細書において、転写因子が「花粉の発達を制御する」とは、代表的には、この転写因子の発現が阻害されるとき、花粉の形態または機能において有意な変化が観察されることをいう。本発明における転写因子は、代表的には、それをコードする遺伝子の発現が阻害されることにより、好ましくは約６０％以上、より好ましくは約７５％以上、さらに好ましくは約９０％以上の花粉細胞を、成熟する前に死滅せしめる。ここで、転写因子の発現が阻害されるとは、ノーザンブロット法により測定したとき、ｍＲＮＡの量が、野生型のコントロール植物と比較して約１０分の１以下になることをいう。
【００２９】
上記のようなスクリーニングによって単離、同定された遺伝子によってコードされる転写因子（すなわち、ＺＰＴ３−２およびＺＰＴ３−２ホモログ）が花粉の発達を制御することは、本明細書の開示に従って形質転換植物を作出し、その花粉の特性を観察することによって、確認し得る。
【００３０】
本発明においては、花粉の発達を制御する転写因子をコードするＤＮＡまたはその断片を利用して、植物細胞において、当該ＤＮＡと同一のまたは相同な塩基配列を含む内因性遺伝子の発現を抑制し得る。標的となる内因性遺伝子もまた、花粉の発達を制御する転写因子である。本発明の方法によれば、好ましくは、花粉の発達を制御する内因性転写因子以外の発現を実質的に抑制することなく、内因性転写因子の発現のみを選択的に抑制することによって、植物に雄性不稔性が付与される。
【００３１】
すなわち、本発明における発現抑制技術が適用される植物細胞は、花粉の発達を制御する内因性の転写因子を有する植物の細胞であって、この内因性の転写因子をコードする遺伝子は、上記ＺＰＴ３−２またはＺＰＴ３−２ホモログのＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするものとして規定される。ここで「ストリンジェントな条件」の定義は、ＺＰＴ３−２ホモログの特定に関連して上述した条件と同じである。本発明の範囲を限定する意図ではないが、上記方法によって雄性不稔性を付与し得る植物は、ＺＰＴ３−２遺伝子が単離されたペチュニア、またはＺＰＴ３−２ホモログをコードする遺伝子が単離された植物と、進化系統学上近縁の植物であることが望ましい。ここで、進化系統学上近縁とは、代表的には同じ目に分類され、好ましくは同じ科に分類され、より好ましくは同じ属に分類され、さらに好ましくは同じ種に分類される植物である。もっとも、葯の最内層にタペート層が存在し花粉の発達に不可欠な機能を果たしていることは、ほとんどの種子植物に共通する事実であるので、この点を考慮すれば、ＺＰＴ３−２と同一または類似の機能を果たす転写因子が他の植物にも広く存在し得ることは容易に理解される。
【００３２】
内因性遺伝子の発現を抑制するための手法として、代表的にはコサプレッションおよびアンチセンス技術を利用し得る。コサプレッションは、植物細胞に組み換え遺伝子を導入したとき、その遺伝子自体、およびその遺伝子の一部と相同な配列を含む内因性遺伝子の両者の発現が抑制されることをいう。コサプレッションが利用される場合、本発明における発現カセットは、転写因子をコードするＤＮＡまたはその断片を、プロモーターに対して順方向で連結された形態で含む。転写因子をコードするＤＮＡまたはその断片は、発現カセットとして植物細胞に導入された後、プロモーターの制御下でセンス方向に転写され得る。この導入ＤＮＡの作用により、所望とする遺伝子発現の抑制が可能となる。コサプレッションは、形質転換植物の一部の個体で認められ、他の個体では十分に起こらない場合が多い。そのため、通常、遺伝子発現が意図されたように抑制された個体が、慣用的な手順に従って選択される。
【００３３】
アンチセンスは、植物細胞に組み換え遺伝子を導入したとき、導入遺伝子の転写産物（ｍＲＮＡ）が、内因性遺伝子の転写産物（ｍＲＮＡ）の相補的な配列とハイブリッドを形成して、内因性遺伝子がコードするタンパク質の翻訳が阻害されることをいう。アンチセンスが利用される場合、本発明における発現カセットは、転写因子をコードするＤＮＡまたはその断片を、プロモーターに対して逆方向で連結された形態で含む。転写因子をコードするＤＮＡまたはその断片は、発現カセットとして植物細胞に導入された後、プロモーターの制御下でアンチセンス方向に転写され得る。このアンチセンス転写物の作用により、所望とする遺伝子発現の抑制が可能となる。
【００３４】
（ＺＰＴ３−２遺伝子由来のプロモーター）
本発明の第２の局面である、形質が改変された植物を作出する方法において有用なプロモーターは、（ａ）配列番号３によって示される塩基配列の第１位から第１９９１位までの配列を有するＤＮＡ、または（ｂ）（ａ）の一部の配列を有し、葯のタペート層に特異的なプロモーター活性を示すＤＮＡのいずれかを含むプロモーターである。本発明における上記プロモーターは、好ましくは（ａ）のプロモーター、すなわち、ＺＰＴ３−２遺伝子のプロモーターである。
【００３５】
ＺＰＴ３−２遺伝子のプロモーター領域の、組識特異的な発現活性に必須でない配列を除去して得られる、タペート層に特異的なプロモーター活性を有する配列は、本発明の範囲内にある。このような配列は、常法に従ってプロモーターのデリーション実験を行うことによって、得ることができる。簡潔には、ＺＰＴ３−２遺伝子のプロモーター領域の様々な欠失変異体（例えば、ＺＰＴ３−２遺伝子のプロモーター領域を、５’上流側から種々の長さに欠失させた変異体）と、適切なレポーター遺伝子（例えば、ＧＵＳ遺伝子）とを融合したプラスミドを用いて、欠失変異体の組識特異的プロモーター活性を測定することによって、その活性に必須な領域を特定し得る。
【００３６】
いったんプロモーター活性に必須の領域が特定されると、さらにその領域内の配列または隣接配列を改変して、プロモーターの発現活性の程度を高めることも可能である。このようにして得られる改変体もまた、タペート層に特異的なプロモーター活性を示す限り、本発明の範囲内にある。
【００３７】
本発明において、「タペート層に特異的なプロモーター活性を示す」とは、プロモーターが、天然の植物中で、または任意の構造遺伝子に連結させた発現カセットとして植物に導入されたときに、ＤＮＡの転写を開始させることにより遺伝子の発現を指示する能力を、タペート層において特異的に示すことを意味する。ここで「特異的」とは、同じ植物体の花の、他のすべての組織（花粉、花糸、花柱、花頭、花弁、萼（がく）などを含む）よりも、プロモーターの発現活性が高いことをいう。上記特異的なプロモーターは、好ましくは、同じ植物体の花の他のすべての組織および花以外の部分（根、葉、茎など）よりも、プロモーターの発現活性が高く、より好ましくは、同じ植物体の花の他のすべての組織および花以外の部分において実質的に活性を示さない。発現活性の程度は、常法に従って、タペート層におけるプロモーターの発現レベルと、花の他の組識における同じプロモータの発現レベルとを比較することによって、評価され得る。プロモーターの発現レベルは、通常、そのプロモーターの制御下で発現される遺伝子産物の産生量によって決定される。
【００３８】
上記の特異的プロモーターを利用する植物への雄性不稔性の付与は、本発明におけるプロモーターに作動可能に連結された任意の異種遺伝子が、この遺伝子を導入された形質転換植物において、プロモーターの制御下でタペート層に特異的に発現される結果として生じ得る。多くの組織特異的プロモーターにおいて、その組織特異性が種間を越えて保存されていることは周知であるので、本発明のプロモーターもまた幅広い植物種に適用し得ることが容易に理解される。
【００３９】
本発明のプロモーターは、例えば、公知のｃＤＮＡをプローブとして用いて、植物のゲノミックライブラリーをスクリーニングし、そして対応のゲノミッククローンからコード領域の上流配列を単離することにより得ることができる。ｃＤＮＡの例として、上述したペチュニア由来の転写因子であるＺＰＴ３−２のｃＤＮＡが挙げられる。
【００４０】
本発明におけるプロモーターは、天然から単離されたものに限定されず、合成ポリヌクレオチドも含み得る。合成ポリヌクレオチドは、例えば、上記のようにして配列決定されたプロモーターの配列またはその活性領域を、当業者に周知の手法によって合成または改変することにより入手し得る。
【００４１】
（発現カセットおよび発現ベクターの構築）
本発明における転写因子をコードするＤＮＡは、当業者に周知の方法を用いて、適切なプロモーターに作動可能に連結された発現カセットとして、公知の遺伝子組換え技術を用いて、植物細胞に導入され得る。同様に、本発明におけるタペート層特異的プロモーターは、所望の異種遺伝子に作動可能に連結された発現カセットとして、植物細胞に導入され得る。
【００４２】
上記転写因子に連結され得る「プロモーター」は、植物で発現する任意のプロモーターを意味し、構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、および誘導性プロモーターのいずれをも含み得る。
【００４３】
「構成的プロモーター」は、植物細胞内外の刺激と関係なく一定のレベルで構造遺伝子を発現せしめるプロモーターをいう。異種遺伝子が植物の他の組織または器官で発現しても、植物に望ましくない形質を与えない場合には、構成的プロモーターの使用が簡便であり、好ましい。構成的プロモーターの例としては、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター（Ｐ３５Ｓ）、およびノパリン合成酵素のプロモーター（Ｔｎｏｓ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４４】
「組織特異的プロモーター」は、本発明においては、少なくともタペート層を含む葯の組織において特異的に構造遺伝子を発現せしめるプロモーターをいう。このような組織特異的プロモーターには、本発明におけるＺＰＴ３−２遺伝子由来のプロモーターに加えて、葯特異的に発現活性を示す他の公知のプロモーターが含まれる。したがって、タペート層特異的プロモーターと転写因子をコードする配列とを含む、天然のＺＰＴ３−２遺伝子の発現カセット自体を、必要に応じて他の調節エレメントと組み合わせて、使用することも本発明の範囲に含まれる。
【００４５】
「誘導性プロモーター」は、化学薬剤、物理的ストレスなどの特定の刺激を与えたときに構造遺伝子を発現せしめ、刺激の非存在下では発現活性を示さないプロモーターをいう。誘導性プロモーターの例としては、オーキシンで誘導可能な、グルタチオン　Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）プロモーター（ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｋｏｐ，Ｄ．Ａ．ら、Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．，３９：９７９，１９９９）が挙げられるが、これに限定されない。
【００４６】
本明細書において、用語「発現カセット」または「植物発現カセット」とは、本発明における転写因子をコードするＤＮＡと、これに作動可能に（すなわち、当該ＤＮＡの発現を制御し得るように）連結された植物発現プロモーターとを含む核酸配列、ならびに、本発明におけるタペート層特異的プロモーターと、これに作動可能に（すなわち、インフレームに）連結された異種遺伝子とを含む核酸配列をいう。
【００４７】
上記のタペート層特異的プロモーターに連結され得る「異種遺伝子」とは、ＺＰＴ３−２遺伝子以外のペチュニアにおける内因性遺伝子、もしくはペチュニア以外の植物における内因性遺伝子、または植物に対して外来の遺伝子（例えば、動物、昆虫、細菌、および真菌に由来する遺伝子）であって、その遺伝子産物の発現がタペート層において所望される任意の遺伝子をいう。本発明における異種遺伝子の好ましい例は、コードする遺伝子産物が細胞毒性を示し、その発現によって花粉の発達を阻害する遺伝子である。このような遺伝子の具体例として、ｂａｒｎａｓｅ遺伝子（Ｂｅａｌｓ，Ｔ．Ｐ．およびＧｏｌｄｂｅｒｇ，Ｒ．Ｂ．，Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ，９：１５２７，１９９７）が挙げられるが、これに限定されない。
【００４８】
「植物発現ベクター」は、発現カセットに加えて、さらに種々の調節エレメントが、宿主植物の細胞中で作動し得る状態で連結されている核酸配列をいう。好適には、ターミネーター、薬剤耐性遺伝子、およびエンハンサーを含み得る。植物発現ベクターのタイプおよび使用される調節エレメントの種類が、宿主細胞に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。本発明に用いる植物発現ベクターは、さらにＴ−ＤＮＡ領域を有し得る。Ｔ−ＤＮＡ領域は、特にアグロバクテリウムを用いて植物を形質転換する場合に遺伝子の導入の効率を高める。
【００４９】
「ターミネーター」は、遺伝子のタンパク質をコードする領域の下流に位置し、ＤＮＡがｍＲＮＡに転写される際の転写の終結、およびポリＡ配列の付加に関与する配列である。ターミネーターは、ｍＲＮＡの安定性に寄与し、そして遺伝子の発現量に影響を及ぼすことが知られている。ターミネーターの例としては、ノパリン合成酵素遺伝子のターミネーター（Ｔｎｏｓ）、およびカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓターミネーターが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５０】
「薬剤耐性遺伝子」は、形質転換植物の選抜を容易にするものであることが望ましい。カナマイシン耐性を付与するためのネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ＮＰＴＩＩ）遺伝子、およびハイグロマイシン耐性を付与するためのハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子などが好適に用いられ得るが、これらに限定されない。
【００５１】
本発明における植物発現ベクターは、当業者に周知の遺伝子組換え技術を用いて作製され得る。植物発現ベクターの構築には、例えば、ｐＢＩ系のベクターまたはｐＵＣ系のベクターが好適に用いられるが、これらに限定されない。
【００５２】
（形質転換植物の作出）
上述のように構築された発現カセット、またはこれを含む発現ベクターは、公知の遺伝子組換え技術を用いて、所望の植物細胞に導入され得る。導入された発現カセットは、植物細胞中のＤＮＡに組み込まれて存在する。なお、植物細胞中のＤＮＡとは、染色体のみならず、植物細胞中に含まれる各種オルガネラ（例えば、ミトコンドリア、葉緑体）に含まれるＤＮＡをも含む。
【００５３】
本明細書において、用語「植物」は、単子葉植物および双子葉植物のいずれも含む。好ましい植物は、双子葉植物である。双子葉植物は、離弁花亜綱および合弁花亜綱のいずれも含む。好ましい亜綱は、合弁花亜綱である。合弁花亜綱は、リンドウ目、ナス目、シソ目、アワゴケ目、オオバコ目、キキョウ目、ゴマノハグサ目、アカネ目、マツムシソウ目、およびキク目のいずれも含む。好ましい目は、ナス目である。ナス目は、ナス科、ハゼリソウ科、ハナシノブ科、ネナシカズラ科、およびヒルガオ科のいずれも含む。好ましい科は、ナス科である。ナス科は、ペチュニア属、チョウセンアサガオ属、タバコ属、ナス属、トマト属、トウガラシ属、ホオズキ属、およびクコ属などを含む。好ましい属は、ペチュニア属、チョウセンアサガオ属、およびタバコ属であり、より好ましくは、ペチュニア属である。ペチュニア属は、Ｐ．ｈｙｂｒｉｄａ種、Ｐ．ａｘｉｌｌａｒｉｓ種、Ｐ．ｉｎｆｌａｔａ種、およびＰ．ｖｉｏｌａｃｅａ種などを含む。好ましい種は、Ｐ．ｈｙｂｒｉｄａ種である。「植物」は、特に他で示さない限り、花を有する植物体および植物体から得られる種子を意味する。
【００５４】
「植物細胞」の例としては、花、葉、および根などの植物器官における各組織の細胞、カルスならびに懸濁培養細胞が挙げられる。
【００５５】
植物細胞への植物発現ベクターの導入には、当業者に周知の方法、例えば、アグロバクテリウムを介する方法、および直接細胞に導入する方法が用いられ得る。アグロバクテリウムを介する方法としては、例えば、Ｎａｇｅｌらの方法（ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，６７：３２５（１９９０））が用いられ得る。この方法は、まず、植物発現ベクターで（例えば、エレクトロポレーションによって）アグロバクテリウムを形質転換し、次いで、形質転換されたアグロバクテリウムをリーフディスク法などの周知の方法により植物細胞に導入する方法である。植物発現ベクターを直接細胞に導入する方法としては、エレクトロポレーション法、パーティクルガン、リン酸カルシウム法、およびポリエチレングリコール法などがある。これらの方法は、当該分野において周知であり、形質転換する植物に適した方法が、当業者により適宜選択され得る。
【００５６】
植物発現ベクターを導入された細胞は、例えば、カナマイシン耐性などの薬剤耐性を基準として選択される。選択された細胞は、常法により植物体に再生され得る。
【００５７】
再生した植物体において、導入した植物発現ベクターが機能的であることは、当業者に周知の手法を用いて確認し得る。例えば、内因性遺伝子の発現の抑制を目的とする場合、この確認は、ノーザンブロット解析を用いた転写レベルの測定によって行い得る。このようにして、内因性の転写因子の発現が抑制された所望とする形質転換植物体を選択することができる。組織特異的プロモーターを用いた異種遺伝子の発現を目的とする場合も、異種遺伝子の発現の確認は、通常、対象組織から抽出されたＲＮＡを試料とするノーザンブロット解析を用いて行い得る。この解析法の手順は当業者に周知である。
【００５８】
本発明の方法に従って内因性の転写因子の発現が抑制され、花粉の稔性が低下したことは、例えば、転写因子をコードするＤＮＡを含む発現ベクターで形質転換して得られた植物の花粉の形態を、必要に応じて組識化学的染色を行ったうえ、顕微鏡観察することで確認できる。
【００５９】
また、本発明の方法に従ってプロモーターがタペート層に特異的に発現されたことは、例えば、プロモータとＧＵＳ遺伝子とが作動可能に連結された発現ベクターで形質転換して得られた植物における、葯を含む花の組織でのＧＵＳ活性の分布を、常法により組識化学的染色を行うことで確認できる。
【００６０】
【実施例】
以下に、実施例に基づいて本発明を説明する。本発明の範囲は、実施例のみに限定されるものではない。実施例で使用される制限酵素、プラスミドなどは、商業的な供給源から入手可能である。
【００６１】
（実施例１：ＺＰＴ３−２をコードするポリヌクレオチドを含む植物発現ベクターの構築）
以前に報告した葯特異的ＺＦ遺伝子（Ｋｏｂａｙａｓｈｉら、前出）のうち、ＰＥＴｈｙＺＰＴ３−２（ＺＰＴ３−２）のｃＤＮＡを、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーターの下流につないで、植物発現ベクターを作成した。
【００６２】
具体的には、プラスミドｐＢＩ２２１（ＣＬＯＮＴＥＣＨ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｉｎｃ．から購入）中のカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターを含むＤＮＡ断片（ＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩ断片）およびＮＯＳターミネーターを含むＤＮＡ断片（ＳａｃＩ−ＥｃｏＲＩ断片）を順次プラスミドｐＵＣＡＰ（ｖａｎ　Ｅｎｇｅｌｅｎ，Ｆ．Ａ．ら、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　Ｒｅｓ．，４：２８８，１９９５）のマルチクローニングサイトに挿入し、ｐＵＣＡＰ３５Ｓを作製した。一方、ＺＰＴ３−２のｃＤＮＡを含むｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ベクターをＫｐｎＩサイトおよびＳａｃＩサイト（いずれもベクター中のサイト）で切断し、上記ｐＵＣＡＰ３５ＳのＫｐｎＩおよびＳａｃＩサイトの間に挿入した。さらにこの組み換えプラスミドをＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ＺＰＴ３−２をコードするＤＮＡ断片をバイナリーベクターｐＢＩＮＰＬＵＳ（ｖａｎ　Ｅｎｇｅｌｅｎ，Ｆ．Ａ．ら、前出）のＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩサイトに導入した。構築されたＺＰＴ３−２遺伝子は、図２から明らかなように、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター領域（Ｐ３５Ｓ；０．９ｋｂ）、本発明におけるＺＰＴ３−２をコードするポリヌクレオチド（ＺＰＴ３−２；約１．９ｋｂ）、およびノパリン合成酵素のターミネーター領域（Ｔｎｏｓ；０．３ｋｂ）から構成されている。図２中のＰｎｏｓは、ノパリン合成酵素のプロモーター領域、ＮＰＴＩＩは、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ遺伝子を示す。
【００６３】
（実施例２：ＺＰＴ３−２プロモーター領域の単離およびＧＵＳレポーター遺伝子との連結）
ＺＰＴ３−２のｃＤＮＡをプローブにして、ペチュニアのゲノムＤＮＡライブラリーから、対応するゲノミック・クローンを単離し、転写開始点上流のＤＮＡ断片（プロモーター領域；約２．０ｋｂ）をサブクローニングした。このＤＮＡ断片をＧＵＳレポーター遺伝子の上流につないでバイナリー・ベクターにクローニングした。
【００６４】
具体的には、ＺＰＴ３−２のｃＤＮＡを、通常のランダムプライム法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出）を用いて［α３２Ｐ］ｄＣＴＰで標識して放射性標識プローブを作製し、これを用いてＥＭＢＬ３ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製）中に作製したペチュニア（Ｐｅｔｕｎｉａ　ｈｙｂｒｉｄａ　ｖａｒ．　Ｍｉｔｃｈｅｌｌ）のゲノミックライブラリーをスクリーニングした。得られたクローンから遺伝子上流領域を含む約２．０ｋｂのゲノムＤＮＡ断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫベクターのＥｃｏＲＩサイトにサブクローニングし（ｐＢＳ−ＺＰＴ３−２−Ｅ）、塩基配列を決定した（図３）。次に、ＺＰＴ３−２遺伝子上流配列中のＢｇｌＩＩサイト（塩基番号２００６）にＳａｌＩ認識配列を含むリンカーＤＮＡを挿入し、ＳａｌＩサイトを導入した（塩基番号２０１６）。そして、ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩで切断して得られたＤＮＡ断片をｐＵＣＡＰＧＵＳＮＴのＧＵＳコード領域の上流に挿入した（ｐＵＣＡＰ−ＺＰＴ３−２−ＧＵＳＮＴ）。これによってＺＰＴ３−２遺伝子コード領域のＮ末端近傍の領域でｉｎ　ｆｒａｍｅでＧＵＳコード領域と接続された。さらにｐＵＣＡＰ−ＺＰＴ３−２−ＧＵＳＮＴをＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断して得られるＤＮＡ断片（ＺＰＴ３−２プロモーター、ＧＵＳコード領域およびＮＯＳターミネーターを含む）をｐＢＩＮＰＬＵＳベクターに挿入し、ｐＢＩＮ−ＺＰＴ３−２−ＧＵＳを得た（図４）。
【００６５】
（実施例３：各融合遺伝子のペチュニア細胞への導入）
上記の各発現ベクターを、以下の手順で、アグロバクテリウムを介して、ペチュニア（Ｐｅｔｕｎｉａ　ｈｙｂｒｉｄａ　ｖａｒ．　Ｍｉｔｃｈｅｌｌ）に導入した。
【００６６】
（１）アグロバクテリウム・チュメファシエンスＬＢＡ４４０４株（ＣＬＯＮＴＥＣＨ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｉｎｃ．から購入）を２５０ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンと５０ｍｇ／ｍｌのリファンピシンを含むＬ培地中、２８℃で培養した。Ｎａｇｅｌら（前出）の方法に従って、細胞懸濁液を調製し、実施例１および２で構築したプラスミドベクターをエレクトロポレーションにより、上記菌株に導入した。
【００６７】
（２）各融合遺伝子をコードするポリヌクレオチドを、以下の方法によって、ペチュニア細胞へ導入した：上記（１）で得られたアグロバクテリウム・チュメファシエンスＬＢＡ４４０４株をＹＥＢ培地（ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　第２巻、７８頁、Ｇｌｏｖｅｒ　Ｄ．Ｍ．編、ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、１９８５）で振とう培養（２８℃、２００ｒｐｍ）した。得られた培養液を、滅菌水で２０倍に希釈し、ペチュニア（Ｐｅｔｕｎｉａ　ｈｙｂｒｉｄａ　ｖａｒ．　Ｍｉｔｃｈｅｌｌ）の葉片と共存培養した。２〜３日後、抗生物質を含む培地で上記細菌を除去し、２週間ごとに選択培地で継代し、上記２種類の融合遺伝子と共に導入された、ｐＢＩＮＰＬＵＳ由来のＮＰＴＩＩ遺伝子の発現によるカナマイシン抵抗性の有無に基づいて、形質転換されたペチュニア細胞を選抜した。選抜した細胞を、常法によりカルスを誘導した後、植物体に再分化した（Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ　Ｒ．Ａ．ら，Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．，３１：９５７，１９９６）。
【００６８】
（実施例４：ＺＰＴ３−２遺伝子を導入した形質転換ペチュニアの表現型）
実施例１のベクターを導入して得られた形質転換体を用い、ＺＰＴ３−２の発現量の測定と花粉の形態の観察とを行うことによって、ＺＰＴ３−２のｃＤＮＡ導入による植物への作用と効果とを検討した。
【００６９】
具体的には、ＺＰＴ３−２のｃＤＮＡを３５Ｓプロモーターの制御下に導入した形質転換体（１５個体）から、ノーザンブロット解析によって、コサプレッションによる遺伝子発現の抑制が起こった個体（４個体）を選抜した。ノーザンブロット解析の条件は、次の通り：７％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ、２％ブロッキング試薬（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ製）、５０ｍＭリン酸ナトリウム・バッファー（ｐＨ７．０）、０．１％ラウリルサルコシン・ナトリウム、５０μｇ／ｍｌ酵母ｔＲＮＡ、および^３２Ｐ標識プローブＤＮＡ（１ｘ１０^７ｃｐｍ）を含む溶液中で、６８℃で１６時間ハイブリダイズさせた後、２ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで６８℃、３０分間の洗浄。
【００７０】
上記のコサプレッション形質転換体４個体において、約９０％の花粉細胞が、成熟する前に死滅することが観察された。常法によるフラボノール染色の結果、これらの形質転換体において破裂した細胞には、花粉細胞表面のエキシン層に含まれるはずのフラボノールがほとんど検出されなった（図５；形質転換植物の花粉を示す写真において、青白く見える不規則な形状の粒子が、破裂した細胞である）。
【００７１】
上記観察結果から、遺伝子発現の抑制が起こった形質転換体の花粉細胞では、エキシン層の蓄積の異常による細胞壁の発達不全のため、浸透圧に耐えられない細胞が破裂したものと推測される。四分子期までの花粉細胞の発達には正常植物との間に違いが認められない。花粉に異常が表れる時期は、エキシン層が蓄積する時期およびＺＰＴ３−２遺伝子が本来発現する時期とよく符合しており、上記の作用機作を支持している。遺伝子発現の抑制が起こった形質転換体において、花粉以外の形質には変化が認められなかった。なお、ＺＰＴ３−２遺伝子を過剰に発現する個体では、花粉および他の形質のいずれについても変化は認められなかった。
【００７２】
以上のように、ＺＰＴ３−２をコードする遺伝子の導入によって、高い効率で花粉の発達を阻害し、稔性を喪失させることができる。この効率は、遺伝子導入の際に用いるプロモーターを最適化することで、さらに高めることが可能である。例えば、実施例１のベクターに用いた単一のＣａＭＶ３５Ｓプロモーターに代えて、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターを２個直列につないで活性を高めたもの（いわゆる、Ｅ２プロモーター）などが利用可能である。また、ＺＰＴ３−２遺伝子の導入は、その効果が花粉に特異的であり、植物の他の形質には影響を与えない点で、選択的な形質改変技術として有用であり得る。
【００７３】
（実施例５：ＺＰＴ３−２プロモーター活性の組織特異性）
実施例２のベクターを導入して得られた形質転換体を用い、ＧＵＳ活性による組織化学的染色を行うことによって、上記ＤＮＡ断片が有する組織特異的プロモーター活性を検出した。
【００７４】
具体的には、ＺＰＴ３−２遺伝子の上流領域とＧＵＳとの融合遺伝子を導入して得られた形質転換体の花を用い、Ｘ−ＧＵＳを基質にしてＧＵＳ活性の分布を調べた（Ｇａｌｌａｇｈｅｒ，Ｓ．Ｒ．編、ＧＵＳ　ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：ｕｓｉｎｇ　ｔｈｅ　ＧＵＳ　ｇｅｎｅ　ａｓ　ａ　ｒｅｐｏｒｔｅｒ　ｏｆ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｎ、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．１０３−１１４，１９９２）。その結果、ＧＵＳ活性は葯のタペート層に特異的に検出された（図６）。発現の時期は一過的で、活性のピークは、花粉細胞における減数分裂直後の四分子期にほぼ相当した。従って、ＺＰＴ３−２遺伝子のプロモーターは、葯のタペート層に特異的な活性を示すことがわかった。
【００７５】
以上のように、ＺＰＴ３−２遺伝子のプロモーターは、四分子期前後のタペート層に特異的な活性を示す。タペート層は、上述のように、花粉の発達に必須の役割を果たす組織である。従って、このプロモーターは、花粉の発達に関連する詳細な研究のためのツールとして有用である。さらに、このプロモーターまたはその活性断片を用いて、細胞毒性のある遺伝子などを特異的に発現させ、タペート層の組織を破壊しまたは機能を失わせることによって、花粉の発達を阻害し得る。
【００７６】
【発明の効果】
ＺＰＴ３−２遺伝子由来の転写因子をコードするＤＮＡ、およびＺＰＴ３−２遺伝子由来のプロモーターを利用する本件発明の方法は、遺伝子工学的に植物の形質を選択的に改変する技術、特に、雄性不稔形質を付与する技術として有用である。
【００７７】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】ＺＰＴ３−２をコードする遺伝子（本明細書中、単に「ＺＰＴ３−２遺伝子」ともいう）のｃＤＮＡ配列、および対応するアミノ酸配列を示す図である。３つのジンクフィンガーモチーフ、およびＤＬＮＬ配列（アミノ酸４１１位〜４２５位）を下線で示す。
【図１Ｂ】図１Ａの続きである。
【図１Ｃ】図１Ｂの続きである。
【図１Ｄ】図１Ｃの続きである。
【図２】ＺＰＴ３−２　ｃＤＮＡ配列を発現するための植物発現ベクター（ｐＢＩＮ−３５Ｓ−ＺＰＴ３−２）の構成を示す概略図である。
【図３】ＺＰＴ３−２遺伝子のコード領域の上流配列を示す図である。転写開始点（１７２１位）を太矢印で、翻訳開始コドン（ＡＴＧ）を下線太字で示す。
【図４】ＺＰＴ３−２遺伝子のプロモーターを解析するための植物発現ベクター（ｐＢＩＮ−ＺＰＴ３−２−ＧＵＳ）の構成を示す概略図である。
【図５】野生型のペチュニアの花粉と、ｐＢＩＮ−３５Ｓ−ＺＰＴ３−２を導入したペチュニアの花粉とを撮影した、生物の形態を示す写真である（倍率は２４０倍）。花粉はいずれもフラボノール染色した。図５（ａ）〜（ｄ）は、野生型ペチュニアのつぼみの異なる成長段階における花粉を、図５（ｅ）〜（ｈ）は、形質転換ペチュニアのつぼみの異なる成長段階における花粉を、それぞれを示す。図５（ａ）および（ｅ）は、つぼみのサイズ５ｍｍでの花粉、図５（ｂ）および（ｆ）は、つぼみのサイズ３５ｍｍでの花粉、図５（ｃ）および（ｇ）は、つぼみのサイズ５０ｍｍでの花粉、そして図５（ｄ）および（ｈ）は、成熟期の花粉である。
【図６】ｐＢＩＮ−ＺＰＴ３−２−ＧＵＳを導入したペチュニアのＧＵＳ染色した花の器官を撮影した、生物の形態を示す写真である。葯が四分子期にある花（つぼみ）を、撮影対象とした。図６（ａ）は、倍率２．５倍での、つぼみの外観を、図６（ｂ）は、葯の低倍率（６０倍）での断面図を、図６（ｃ）は、葯のタペート層周辺の高倍率（２８０倍）での断面図を、それぞれ示す。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a gene specifically expressed in stamen anthers and its use. The present invention particularly relates to a petunia-derived zinc finger transcription factor (ZPT3-2) gene specifically expressed in the tapetate layer of anthers and its use.
[0002]
[Prior art]
Pollen fertility is a problem in various aspects of agriculture and horticulture. For example, at the time of crossing in cross breeding, a work of emasculation (removing stamens), which requires a lot of effort, is performed to avoid self-pollination. In the seed and seedling industry, a trait without pollen fertility is required from the standpoint of commercial protection of excellent varieties obtained by cross breeding. From such a request, a technique for controlling pollen fertility (pollination control) has been strongly demanded. Heretofore, for certain crops, cytoplasmic male sterile lines have been used for cross breeding with some success. However, cytoplasmic sterility traits often have undesired side effects such as reduced disease resistance, and further have problems such as instability of the traits and difficulty in mass production of seeds. Methods for reducing fertility by chemical treatment have been studied, but safety evaluation and elucidation of the mechanism of action have been delayed, and the method has not been put to practical use. Therefore, an excellent male sterilization technique using genetic engineering is required.
[0003]
The tapetate layer is the tissue located at the innermost side of the anther wall and surrounding the spore-forming cells (pollen cells). The role of the tapetate layer is important for pollen development, not only as a support for pollen cells, but also as a supply of nutrients necessary for pollen development, a callose layer enclosing tetrads. Degradation, supply of compounds that make up the exine layer on the pollen cell surface, etc. are wide-ranging. Anther development involves the quaternary phase immediately following meiosis of sporulating cells, the release of microspores from tetrads, the mononuclear phase characterized by pollen cell expansion and vacuole formation, and vegetative cells through mitosis. It is divided into mitotic cells, where differentiation into germ cells occurs, and the subsequent binuclear phase. Through these steps, the anthers eventually cleave and mature pollen grains are released. It is known that, in the above developmental process, if even a part of the function of the tapetate layer is impaired, the development of normal pollen is often inhibited and pollen fertility is lost.
[0004]
As described above, great expectations are placed on male sterilization technology by genetic engineering. In particular, if a gene that is specifically expressed in a small region that is not exposed to the outside, such as a tapetate layer, can be used, male sterilization is likely to be achieved without imparting unfavorable traits to the plant. it is conceivable that. Several examples of promoters specific to the tapetate layer and gene constructs for male sterilization containing the same have been reported (Shivanna and Sawhney, eds., Pollenbiotechnology for crop production and implementationRev. Publishing.com). 237-257, 1997). However, there remains a need for new genes useful for controlling pollen fertility with high tissue and timing specificity of expression.
[0005]
The present inventors recently identified cDNA sequences of seven zinc finger (ZF) -type transcription factors including PETyZPT3-2 (hereinafter abbreviated as ZPT3-2) as a novel petunia-derived transcription factor. Then, Northern blot analysis reported that each transcription factor exhibited an anther-specific, transient expression at different stages of anther development (Kobayashi et al., Plant J., 13: 571, 1998). However, the physiological function and action of these transcription factors in plants, the exact expression site of the gene encoding the transcription factor, and its expression regulation mechanism were unknown.
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a genetic engineering technique utilizing a gene specific to anther tissue, which is useful for modifying plant traits represented by male sterility.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have re-introduced a gene encoding one of anther-specific transcription factors (ZPT3-2), previously isolated from petunia, into petunia. As a result, they have found that normal expression of pollen is inhibited by suppressing the expression of the endogenous gene by the introduced gene, and the fertility of the pollen is significantly reduced. Furthermore, the present inventors isolated the upstream region from the genomic gene of ZPT3-2 and examined the tissue specificity of its promoter activity. As a result, it was found that the promoter activity was tissue- and stage-specifically expressed in the tapetate layer from the 4 molecular stage to the mononuclear stage. The present invention has been completed based on these findings.
[0008]
In a first aspect, the present invention relates to a method for producing a male-sterile plant, comprising the following steps: (i) from the first position of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 A DNA having a sequence up to position 1886, a DNA encoding a transcription factor that hybridizes with a DNA having the nucleotide sequence of (ii) and (i) under stringent conditions and controls pollen development, or (iii) Providing a plant expression cassette comprising a nucleic acid that is either DNA that is a fragment of (i) or (ii) and a promoter operably linked to the nucleic acid; an endogenous control of pollen development Providing a plant cell having the transcription factor, wherein the gene encoding the endogenous transcription factor hybridizes with the nucleic acid under stringent conditions. Introducing an expression cassette into a plant cell; regenerating a plant cell into which the expression cassette has been introduced into a plant; and regenerating the plant, wherein the nucleic acid is expressed. Selecting a plant in which the expression of an endogenous transcription factor is suppressed. The above method of the present invention can be used as a method for imparting male sterility to a plant.
[0009]
In one embodiment, the nucleic acid is ligated in a forward direction to the promoter and transcribed in a sense direction in cells of the plant.
[0010]
In one embodiment, the nucleic acid is ligated in the reverse direction to the promoter and can be transcribed in an antisense direction in cells of the plant.
[0011]
In one embodiment, the plant is a dicotyledon. The dicotyledonous plant is preferably a Solanaceae plant, more preferably a Petunia plant.
[0012]
In one embodiment, the expression cassette is incorporated into a plant expression vector.
[0013]
According to a first aspect of the present invention, there is also provided a male-sterile plant produced by any of the methods described above.
[0014]
In a second aspect, the present invention relates to a method for producing a male-sterile plant, comprising the following steps: (a) from the first position of the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 A promoter comprising any of a DNA having a sequence up to position 1991 or a DNA having a partial sequence of (b) and (a) and exhibiting a promoter activity specific to the tapetate layer of anther; Providing a plant expression cassette comprising an operably linked heterologous gene; introducing the expression cassette into plant cells; and regenerating the plant cells into which the expression cassette has been introduced into a plant. The above method of the present invention can be used as a method for imparting male sterility to a plant.
[0015]
In one embodiment, the plant is a dicotyledon. The dicotyledonous plant is preferably a Solanaceae plant, more preferably a Petunia plant.
[0016]
In one embodiment, the expression cassette is incorporated into a plant expression vector.
[0017]
According to a second aspect of the present invention, there is also provided a male-sterile plant produced by any one of the methods described above.
[0018]
In a third aspect, the present invention relates to a promoter comprising the following DNA of (I) or (II): (I) a sequence from position 1 to position 1991 of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 Or DNA having a partial sequence of (II) or (I) and exhibiting a promoter activity specific to the tapetate layer of anthers.
[0019]
The present invention, in its fourth aspect, relates to a plant expression cassette useful for imparting male sterility to a plant, comprising the above promoter and a heterologous gene operably linked to the above promoter.
[0020]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
The present invention will be described in more detail below.
[0021]
(Transcription factor derived from ZPT3-2 gene)
The nucleic acid useful in the method for producing a male-sterile plant, which is the first aspect of the present invention, has (i) a sequence from position 1 to position 1886 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1. DNA, a DNA encoding a transcription factor that hybridizes with a DNA having the nucleotide sequence of (ii) and (i) under stringent conditions and controls pollen development, or (iii) (i) or (ii) Any of the DNA that is a fragment. The nucleic acid according to the present invention is preferably the DNA of (i), that is, the DNA encoding ZPT3-2, or a fragment thereof, and more preferably the DNA of (i).
[0022]
As used herein, the term "transcription factor" refers to a protein that binds to DNA in a regulatory region of a gene and controls mRNA synthesis. Certain transcription factors are known to have highly conserved amino acid sequences called zinc finger motifs in their DNA binding domains. ZPT3-2 is a zinc finger protein of Cys2 / His2 type (EPF family), which contains three zinc finger motifs in a full-length amino acid sequence consisting of 444 amino acids, and further has a hydrophobic region called a DLNL sequence. Transcription factors (Kobayashi et al., Supra). The cDNA sequence encoding ZPT3-2 (SEQ ID NO: 1) is shown in FIGS. 1A-1D along with the corresponding deduced amino acid sequence (SEQ ID NO: 2).
[0023]
As used herein, the term “fragment” of nucleic acid or DNA refers to a fragment that, when introduced into a plant and expressed in an appropriate manner, can suppress the expression of an endogenous transcription factor of the plant. This fragment is selected from a region other than the region encoding the zinc finger motif of the DNA of the above (i) or (ii), and is at least about 40 base pairs or more, preferably about 50 base pairs or more, more preferably about 70 base pairs. More preferably, it has a length of about 100 base pairs or more.
[0024]
As used herein, the term “stringent conditions” for hybridization refers to a specific nucleotide sequence (eg, a DNA encoding ZPT3-2 derived from petunia) and another nucleotide sequence highly homologous thereto (eg, For example, conditions sufficient to form an oligonucleotide duplex with a DNA encoding a homolog of ZPT3-2 present in plants other than petunia are contemplated. Representative examples of the stringent conditions applied to the present invention include the following conditions: 1 M NaCl, 1% SDS, 10% dextran sulfate, ³² P-labeled probe DNA (1 × 10 ⁷ After hybridization at 60 ° C. for 16 hours in a solution containing cpm) and 50 μg / ml salmon sperm DNA, washing with 2 × SSC / 1% SDS at 60 ° C. for 30 minutes is repeated twice.
[0025]
In order to isolate a DNA encoding ZPT3-2 and a DNA encoding a transcription factor that hybridizes therewith under stringent conditions and controls pollen development in the present invention, a known transcription factor is used. Degenerate primer pairs corresponding to conserved regions of the amino acid sequence encoded by the gene may be used. Using this primer pair, PCR is performed using plant cDNA or genomic DNA as a template, and then, using the amplified DNA fragment obtained as a probe, a cDNA library or genomic library of the same plant can be screened. . An example of such a primer pair is a combination of 5′-CARGCNYTNGGNGGNCAY-3 ′ (SEQ ID NO: 4) and 3′-RTGNCCNCCNARGNGCYTG-5 ′ (SEQ ID NO: 5) (where N is inosine) , R is G or A, and Y is C or T). The above primer sequences respectively correspond to the amino acid sequence QALGGGH contained in the zinc finger motif of ZPT3-2.
[0026]
Therefore, the stringent hybridization conditions applied to the present invention can also be defined as PCR conditions, and in a typical example, the above-described degenerate primers (SEQ ID NOs: 4 and 5) can be used. The PCR reaction conditions were as follows: denaturation at 94 ° C. for 5 minutes, 30 cycles of 94 ° C. for 30 seconds, 50 ° C. for 30 seconds, and 72 ° C. for 1 minute, and finally incubation at 72 ° C. for 7 minutes May be performed.
[0027]
PCR can be performed according to the manufacturer's guidelines for commercially available kits and devices, or by techniques well known to those skilled in the art. Methods for preparing a gene library and cloning a gene are well known to those skilled in the art. See, for example, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition (Cold Spring Harbor Laboratory, 1989). The nucleotide sequence of the obtained gene can be determined using a nucleotide sequence analysis method known in the art or a commercially available automatic sequencer.
[0028]
As used herein, a transcription factor "controls pollen development" typically means that when the expression of this transcription factor is inhibited, a significant change in pollen morphology or function is observed. Say. Typically, the transcription factor of the present invention is pollen, preferably, about 60% or more, more preferably about 75% or more, and still more preferably about 90% or more, by inhibiting the expression of the gene encoding the transcription factor. The cells are killed before they mature. Here, the expression of the transcription factor is inhibited when the amount of mRNA is about 1/10 or less as compared with that of a wild-type control plant, as measured by Northern blotting.
[0029]
The fact that the transcription factor (ie, ZPT3-2 and ZPT3-2 homolog) encoded by the gene isolated and identified by the above-described screening controls pollen development indicates that the transformed plant is in accordance with the disclosure of the present specification. By observing the characteristics of the pollen.
[0030]
In the present invention, expression of an endogenous gene containing the same or homologous nucleotide sequence as the DNA can be suppressed in a plant cell by using a DNA encoding a transcription factor that controls pollen development or a fragment thereof. . Targeted endogenous genes are also transcription factors that control pollen development. According to the method of the present invention, preferably, by substantially suppressing the expression of endogenous transcription factors without substantially suppressing the expression of other than the endogenous transcription factors that control pollen development, plants Is given male sterility.
[0031]
That is, a plant cell to which the expression suppression technique of the present invention is applied is a plant cell having an endogenous transcription factor that controls pollen development, and the gene encoding this endogenous transcription factor is the ZPT3 gene. -2 or ZPT3-2 homologues are defined as those that hybridize under stringent conditions. Here, the definition of “stringent conditions” is the same as the conditions described above in relation to the specification of the ZPT3-2 homolog. Although it is not intended to limit the scope of the present invention, a plant capable of imparting male sterility by the above method is a petunia from which the ZPT3-2 gene is isolated, or a gene encoding the ZPT3-2 homolog. Plants that are closely related to evolutionary phylogeny. Here, closely related to evolutionary phylogeny is a plant that is typically classified into the same order, preferably classified into the same family, more preferably classified into the same genus, and still more preferably classified into the same species. is there. However, it is a common fact in most seed plants that a tapetate layer is present in the innermost layer of anthers and plays a function essential for pollen development. Therefore, considering this point, it is the same as ZPT3-2 or ZPT3-2. It is readily understood that transcription factors that perform similar functions may be widely present in other plants.
[0032]
As a technique for suppressing the expression of an endogenous gene, typically, cosuppression and antisense techniques can be used. Cosuppression means that when a recombinant gene is introduced into a plant cell, the expression of both the gene itself and an endogenous gene containing a sequence homologous to a part of the gene is suppressed. When cosuppression is used, the expression cassette of the present invention contains DNA encoding a transcription factor or a fragment thereof in a form linked to a promoter in the forward direction. A DNA encoding a transcription factor or a fragment thereof can be transcribed in a sense direction under the control of a promoter after being introduced into a plant cell as an expression cassette. By the action of the introduced DNA, the desired gene expression can be suppressed. Cosuppression is observed in some individuals of transformed plants and often does not occur sufficiently in others. Therefore, usually, individuals in which gene expression has been suppressed as intended are selected according to conventional procedures.
[0033]
In antisense, when a recombinant gene is introduced into a plant cell, the transcript (mRNA) of the transgene forms a hybrid with a complementary sequence of the transcript (mRNA) of the endogenous gene, and the endogenous gene is coded. Means that the translation of the protein is inhibited. When antisense is used, the expression cassette of the present invention contains a DNA encoding a transcription factor or a fragment thereof in a form ligated in a reverse direction to a promoter. A DNA encoding a transcription factor or a fragment thereof can be transcribed in an antisense direction under the control of a promoter after being introduced into a plant cell as an expression cassette. By the action of the antisense transcript, desired gene expression can be suppressed.
[0034]
(Promoter derived from ZPT3-2 gene)
The promoter useful in the method for producing a plant with a modified trait, which is the second aspect of the present invention, has (a) a sequence from position 1 to position 1991 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 3. It is a promoter containing either DNA or DNA having a partial sequence of (b) and (a) and showing promoter activity specific to the tapetate layer of anthers. The above-mentioned promoter in the present invention is preferably the promoter of (a), that is, the promoter of the ZPT3-2 gene.
[0035]
A sequence having a promoter activity specific to the tapetate layer, which is obtained by removing a sequence not essential for tissue-specific expression activity in the promoter region of the ZPT3-2 gene, is within the scope of the present invention. Such a sequence can be obtained by performing a promoter deletion experiment according to a conventional method. Briefly, various deletion mutants of the promoter region of the ZPT3-2 gene (for example, mutants in which the promoter region of the ZPT3-2 gene is deleted to various lengths from the 5 ′ upstream side) and By measuring the tissue-specific promoter activity of the deletion mutant using a plasmid fused with a reporter gene (for example, GUS gene), a region essential for the activity can be specified.
[0036]
Once a region essential for promoter activity is specified, it is possible to further modify the sequence in that region or adjacent sequences to increase the degree of promoter expression activity. The variants thus obtained are also within the scope of the present invention, as long as they exhibit promoter activity specific to the tapetate layer.
[0037]
In the present invention, “showing a promoter activity specific to the tapetate layer” means that when a promoter is introduced into a plant in a natural plant or as an expression cassette linked to an arbitrary structural gene, This means that the ability to direct gene expression by initiating transcription is specifically demonstrated in the tapetate layer. Here, the term “specific” means that the promoter expression activity of the flower of the same plant is higher than that of all other tissues (including pollen, flower thread, style, flower head, petals, calyx, etc.). It is expensive. The specific promoter preferably has a higher expression activity of the promoter than all other tissues and non-flower parts (flowers, leaves, stems, etc.) of the flower of the same plant, and more preferably the same plant. It has virtually no activity in all other tissues and non-flower parts of body flowers. The degree of expression activity can be evaluated by comparing the expression level of the promoter in the tapetate layer with the expression level of the same promoter in other tissues of the flower, according to a conventional method. The expression level of a promoter is usually determined by the amount of gene product expressed under the control of the promoter.
[0038]
The provision of male sterility to a plant utilizing the above-described specific promoter can be achieved by controlling a promoter in a transformed plant into which any heterologous gene operably linked to the promoter of the present invention has been introduced with this gene. It can occur as a result of being specifically expressed in the tapetate layer below. It is well known that the tissue specificity of many tissue-specific promoters is conserved across species, so it is readily appreciated that the promoters of the present invention can also be applied to a wide variety of plant species.
[0039]
The promoter of the present invention can be obtained, for example, by screening a genomic library of a plant using a known cDNA as a probe, and isolating the upstream sequence of the coding region from the corresponding genomic clone. Examples of the cDNA include the cDNA of ZPT3-2, which is a petunia-derived transcription factor described above.
[0040]
The promoter in the present invention is not limited to those isolated from nature, and may also include synthetic polynucleotides. The synthetic polynucleotide can be obtained, for example, by synthesizing or modifying the sequence of the promoter sequenced as described above or the active region thereof by a method well known to those skilled in the art.
[0041]
(Construction of expression cassette and expression vector)
The DNA encoding the transcription factor of the present invention is introduced into a plant cell using a known gene recombination technique as an expression cassette operably linked to an appropriate promoter using a method well known to those skilled in the art. obtain. Similarly, a tapetate-specific promoter in the present invention can be introduced into plant cells as an expression cassette operably linked to a desired heterologous gene.
[0042]
“Promoter” which can be linked to the above-mentioned transcription factor means any promoter expressed in a plant, and can include any of a constitutive promoter, a tissue-specific promoter, and an inducible promoter.
[0043]
“Constitutive promoter” refers to a promoter that allows a structural gene to be expressed at a certain level regardless of stimuli inside and outside a plant cell. The use of a constitutive promoter is convenient and preferred if the heterologous gene is expressed in other tissues or organs of the plant but does not impart undesired traits to the plant. Examples of constitutive promoters include, but are not limited to, the cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S promoter (P35S) and the nopaline synthase promoter (Tnos).
[0044]
In the present invention, the “tissue-specific promoter” refers to a promoter that causes a structural gene to be specifically expressed in an anther tissue containing at least a tapetate layer. Such tissue-specific promoters include, in addition to the promoter derived from the ZPT3-2 gene in the present invention, other known promoters that exhibit anther-specific expression activity. Therefore, it is within the scope of the present invention to use the expression cassette of the natural ZPT3-2 gene itself, including the tapetate-layer-specific promoter and the sequence encoding the transcription factor, in combination with other regulatory elements, if necessary. include.
[0045]
An “inducible promoter” refers to a promoter that causes a structural gene to be expressed when given a specific stimulus such as a chemical agent or physical stress, and does not exhibit expression activity in the absence of the stimulus. Examples of inducible promoters include the glutathione S-transferase (GST) promoter (van der Kop, DA, et al., Plant Mol. Biol., 39: 979, 1999) which can be induced by auxin. It is not limited to this.
[0046]
As used herein, the term “expression cassette” or “plant expression cassette” is operably linked to DNA encoding the transcription factor of the present invention (ie, so that the expression of the DNA can be controlled). And a nucleic acid sequence comprising a tapetate-layer-specific promoter of the present invention and a heterologous gene operably (ie, in-frame) linked thereto.
[0047]
The “heterologous gene” that can be linked to the above-described tapetate layer-specific promoter is an endogenous gene in petunia other than the ZPT3-2 gene, an endogenous gene in a plant other than petunia, or a gene foreign to the plant (eg, , Animals, insects, bacteria, and fungi) whose expression is desired in the tapetate layer. Preferred examples of the heterologous gene in the present invention are genes whose encoded gene product exhibits cytotoxicity and whose expression inhibits pollen development. Specific examples of such a gene include, but are not limited to, the barnase gene (Beals, TP and Goldberg, RB, Plant Cell, 9: 1527, 1997).
[0048]
"Plant expression vector" refers to a nucleic acid sequence in which, in addition to an expression cassette, various regulatory elements are operably linked in a host plant cell. Suitably, it may include a terminator, a drug resistance gene, and an enhancer. It is well known to those skilled in the art that the type of plant expression vector and the type of regulatory element used can vary depending on the host cell. The plant expression vector used in the present invention may further have a T-DNA region. The T-DNA region increases the efficiency of gene transfer, particularly when transforming plants with Agrobacterium.
[0049]
A "terminator" is a sequence that is located downstream of a region encoding a protein of a gene and is involved in terminating transcription when DNA is transcribed into mRNA and adding a polyA sequence. Terminators are known to contribute to mRNA stability and affect gene expression. Examples of terminators include, but are not limited to, the nopaline synthase gene terminator (Tnos) and the cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S terminator.
[0050]
It is desirable that the “drug resistance gene” facilitates selection of a transformed plant. A neomycin phosphotransferase II (NPTII) gene for imparting kanamycin resistance, a hygromycin phosphotransferase gene for imparting hygromycin resistance, and the like can be suitably used, but are not limited thereto.
[0051]
The plant expression vector in the present invention can be prepared using a gene recombination technique well known to those skilled in the art. For the construction of a plant expression vector, for example, a pBI-based vector or a pUC-based vector is suitably used, but is not limited thereto.
[0052]
(Production of transgenic plants)
The expression cassette constructed as described above, or an expression vector containing the same, can be introduced into a desired plant cell using a known gene recombination technique. The introduced expression cassette is integrated into DNA in a plant cell. The DNA in plant cells includes not only chromosomes but also DNAs contained in various organelles (eg, mitochondria, chloroplasts) contained in plant cells.
[0053]
As used herein, the term "plant" includes both monocots and dicots. Preferred plants are dicotyledonous plants. The dicotyledonous plant includes both a subphylum and a joint subphylum. A preferred subclass is the joint flower subclass. The joint venture subfamily includes any of the orders Gentian, Eggplant, Lamiaceae, Agonaceae, Psyllium, Ephemeroptera, Scrophulariformes, Rhododendron, Scrophulariformes, and Asteraceae. Preferred eyes are eggplants. The order of Solanaceae includes any of the Solanaceae family, the scrophulariaceae family, the Hanashinobaceae family, the Pondaceae family, and the Convolvulaceae family. A preferred family is the Solanaceae family. The Solanaceae family includes the genus Petunia, Datura, Tobacco, Eggplant, Tomato, Capsicum, Physalis, and Wolfberry. Preferred genera are Petunia, Datura and Tobacco, more preferably Petunia. The genus Petunia is hybrida species, P. axillaris sp. inflata, and P. inflata. violacea species. Preferred species are It is a hybrida species. "Plant" means, unless otherwise indicated, a plant having flowers and seeds obtained from the plant.
[0054]
Examples of “plant cells” include cells of each tissue, callus, and suspension cultured cells in plant organs such as flowers, leaves, and roots.
[0055]
For introducing a plant expression vector into a plant cell, a method well known to those skilled in the art, for example, a method mediated by Agrobacterium, and a method of directly introducing the cell can be used. As a method via Agrobacterium, for example, the method of Nagel et al. (FEMS Microbiol. Lett., 67: 325 (1990)) can be used. In this method, Agrobacterium is first transformed with a plant expression vector (for example, by electroporation), and then the transformed Agrobacterium is introduced into plant cells by a well-known method such as a leaf disk method. Is the way. Methods for directly introducing a plant expression vector into cells include an electroporation method, a particle gun, a calcium phosphate method, and a polyethylene glycol method. These methods are well known in the art, and a method suitable for a plant to be transformed can be appropriately selected by those skilled in the art.
[0056]
Cells into which the plant expression vector has been introduced are selected based on, for example, drug resistance such as kanamycin resistance. The selected cells can be regenerated into a plant by a conventional method.
[0057]
Functionality of the introduced plant expression vector in the regenerated plant can be confirmed using a method well known to those skilled in the art. For example, when the purpose is to suppress the expression of an endogenous gene, this confirmation can be performed by measuring the transcription level using Northern blot analysis. Thus, a desired transformed plant in which the expression of an endogenous transcription factor is suppressed can be selected. Even when the purpose is to express a heterologous gene using a tissue-specific promoter, the expression of the heterologous gene can usually be confirmed using Northern blot analysis using RNA extracted from the target tissue as a sample. The procedure for this analysis is well known to those skilled in the art.
[0058]
The expression of the endogenous transcription factor was suppressed according to the method of the present invention and the pollen fertility was reduced, for example, the fact that the pollen of a plant obtained by transformation with an expression vector containing a DNA encoding the transcription factor was used. The morphology can be confirmed by performing tissue chemical staining as necessary and then observing with a microscope.
[0059]
In addition, the fact that the promoter was specifically expressed in the tapetate layer according to the method of the present invention means that, for example, an anther in a plant obtained by transformation with an expression vector in which a promoter and a GUS gene are operably linked is used. The distribution of GUS activity in the flower tissue including the tissue can be confirmed by performing tissue chemical staining according to a conventional method.
[0060]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described based on examples. The scope of the present invention is not limited only to the examples. Restriction enzymes, plasmids, and the like used in the examples are available from commercial sources.
[0061]
(Example 1: Construction of a plant expression vector containing a polynucleotide encoding ZPT3-2)
Of the previously reported anther-specific ZF genes (Kobayashi et al., Supra), a cDNA for PETyZPT3-2 (ZPT3-2) was ligated downstream of the cauliflower mosaic virus 35S promoter to create a plant expression vector.
[0062]
Specifically, a DNA fragment containing the cauliflower mosaic virus 35S promoter (HindIII-XbaI fragment) and a DNA fragment containing the NOS terminator (SacI-EcoRI fragment) in the plasmid pBI221 (purchased from CLONTECH Laboratories Inc.) were successively inserted into the plasmid pUCAP ( van Engelen, FA, et al., Transgenic Res., 4: 288, 1995) to produce pUCAP35S. On the other hand, the pBluescript vector containing the cDNA of ZPT3-2 was cut at the KpnI site and the SacI site (both sites in the vector) and inserted between the KpnI and SacI sites of pUCAP35S. Further, this recombinant plasmid was digested with EcoRI and HindIII, and a DNA fragment encoding ZPT3-2 was introduced into the EcoRI and HindIII sites of a binary vector pBINPLUS (van Engelen, FA et al., Supra). As is clear from FIG. 2, the constructed ZPT3-2 gene comprises a cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S promoter region (P35S; 0.9 kb), a polynucleotide encoding ZPT3-2 in the present invention (ZPT3-2). 1.9 kb), and a terminator region of nopaline synthase (Tnos; 0.3 kb). Pnos in FIG. 2 indicates a promoter region of nopaline synthase, and NPTII indicates a neomycin phosphotransferase II gene.
[0063]
(Example 2: Isolation of ZPT3-2 promoter region and ligation with GUS reporter gene)
Using the cDNA of ZPT3-2 as a probe, a corresponding genomic clone was isolated from a petunia genomic DNA library, and a DNA fragment (promoter region; about 2.0 kb) upstream of the transcription start site was subcloned. This DNA fragment was ligated upstream of the GUS reporter gene and cloned into a binary vector.
[0064]
Specifically, the cDNA of ZPT3-2 is labeled with [α32P] dCTP using the ordinary random prime method (Sambrook et al., Supra) to produce a radiolabeled probe, which is used to produce an EMBL3 vector (Stratagene). The genomic library of Petunia (Petunia hybrida var. Mitchell) prepared in the above was screened. A genomic DNA fragment of about 2.0 kb including the upstream region of the gene was subcloned from the obtained clone into the EcoRI site of the pBluescript SK vector (pBS-ZPT3-2-E), and the nucleotide sequence was determined (FIG. 3). Next, a linker DNA containing a SalI recognition sequence was inserted into the BglII site (base No. 2006) in the upstream sequence of the ZPT3-2 gene, and the SalI site was introduced (base No. 2016). Then, a DNA fragment obtained by digestion with EcoRI and SalI was inserted upstream of the GUS coding region of pUCAPGUSNT (pUCAP-ZPT3-2-GUSNT). As a result, the region near the N-terminus of the ZPT3-2 gene coding region was connected to the GUS coding region in frame. Further, a DNA fragment (containing a ZPT3-2 promoter, a GUS coding region and a NOS terminator) obtained by cutting pUCAP-ZPT3-2-GUSNT with EcoRI and HindIII was inserted into a pBINPLUS vector, and pBIN-ZPT3-2-GUS was inserted into the pBINPLUS vector. (FIG. 4).
[0065]
(Example 3: Introduction of each fusion gene into petunia cells)
Each of the above expression vectors was introduced into Petunia (Petunia hybrida var. Mitchell) via Agrobacterium by the following procedure.
[0066]
(1) Agrobacterium tumefaciens strain LBA4404 (purchased from CLONTECH Laboratories Inc.) was cultured at 28 ° C. in an L medium containing 250 mg / ml streptomycin and 50 mg / ml rifampicin. A cell suspension was prepared according to the method of Nagel et al. (Supra), and the plasmid vectors constructed in Examples 1 and 2 were introduced into the above strains by electroporation.
[0067]
(2) A polynucleotide encoding each fusion gene was introduced into petunia cells by the following method: Agrobacterium tumefaciens strain LBA4404 obtained in (1) above was transformed into a YEB medium (DNA Cloning No. 2). Volume, page 78, Glover DM, ed., IRL Press, 1985) with shaking culture (28 ° C., 200 rpm). The obtained culture solution was diluted 20-fold with sterile water, and co-cultured with leaf pieces of petunia (Petunia hybrida var. Mitchell). Two to three days later, the bacteria were removed with a medium containing antibiotics, passaged with a selection medium every two weeks, and kanamycin resistance due to expression of the NPTII gene derived from pBINPLUS introduced together with the two fusion genes. Transformed petunia cells were selected based on the presence or absence of. After inducing calli by a conventional method, the selected cells were re-differentiated into plants (Jorgensen RA et al., Plant Mol. Biol., 31: 957, 1996).
[0068]
(Example 4: Phenotype of transformed petunia into which ZPT3-2 gene was introduced)
Using the transformant obtained by introducing the vector of Example 1, measurement of the expression level of ZPT3-2 and observation of the form of pollen were carried out, whereby the effect of ZPT3-2 on cDNA by introducing cDNA was investigated. The effect was examined.
[0069]
Specifically, from the transformants (15 individuals) in which the cDNA of ZPT3-2 was introduced under the control of the 35S promoter, individuals (4 individuals) in which gene expression was suppressed by cosuppression were selected by Northern blot analysis. did. The conditions for Northern blot analysis were as follows: 7% SDS, 50% formamide, 5 × SSC, 2% blocking reagent (manufactured by Boehringer Mannheim), 50 mM sodium phosphate buffer (pH 7.0), 0.1% lauryl sarcosine. Sodium, 50 μg / ml yeast tRNA, and ³² P-labeled probe DNA (1 × 10 ⁷ After hybridization at 68 ° C. for 16 hours in a solution containing cpm), the plate was washed with 2 × SSC / 0.1% SDS at 68 ° C. for 30 minutes.
[0070]
In four cosuppression transformants described above, it was observed that about 90% of the pollen cells died before maturation. As a result of conventional flavonol staining, almost no flavonol contained in the exine layer on the pollen cell surface was detected in the cells ruptured in these transformants (FIG. 5; a photograph showing the pollen of the transformed plant). , Irregularly shaped particles that appear pale are ruptured cells).
[0071]
From the above observation results, it is presumed that, in the pollen cells of the transformant in which gene expression was suppressed, cells that could not withstand osmotic pressure ruptured due to insufficient cell wall development due to abnormal accumulation of the exin layer. There is no difference in pollen cell development from normal plants up to the tetrad stage. The time when the pollen becomes abnormal coincides well with the time when the exin layer accumulates and the time when the ZPT3-2 gene is originally expressed, and supports the above-mentioned mechanism of action. In the transformants in which gene expression was suppressed, no change was observed in the traits other than pollen. In addition, in the individual overexpressing the ZPT3-2 gene, no change was observed in any of pollen and other traits.
[0072]
As described above, by introducing the gene encoding ZPT3-2, pollen development can be inhibited with high efficiency, and fertility can be lost. This efficiency can be further enhanced by optimizing the promoter used for gene transfer. For example, instead of the single CaMV35S promoter used in the vector of Example 1, one having two CaMV35S promoters connected in series to enhance the activity (so-called E2 promoter) can be used. In addition, introduction of the ZPT3-2 gene can be useful as a selective trait modification technique in that its effect is specific to pollen and does not affect other traits of the plant.
[0073]
(Example 5: Tissue specificity of ZPT3-2 promoter activity)
Using the transformant obtained by introducing the vector of Example 2, histochemical staining by GUS activity was performed to detect the tissue-specific promoter activity of the DNA fragment.
[0074]
Specifically, using a flower of a transformant obtained by introducing a fusion gene of the upstream region of the ZPT3-2 gene and GUS, the distribution of GUS activity was examined using X-GUS as a substrate (Galllager, G. S.R., GUS protocols: using the GUS gene as a reporter of gene expression, Academic Press, Inc., pp. 103-114, 1992). As a result, GUS activity was specifically detected in the tapetate layer of the anther (FIG. 6). The time of expression was transient, with a peak of activity approximately corresponding to the quaternary meiotic quadruple phase in pollen cells. Therefore, it was found that the promoter of the ZPT3-2 gene exhibited specific activity in the tapetate layer of anthers.
[0075]
As described above, the promoter of the ZPT3-2 gene exhibits a tapetate-layer-specific activity around the tetramolecular phase. The tapete layer is a tissue that plays an essential role in pollen development, as described above. Thus, this promoter is useful as a tool for detailed studies related to pollen development. Furthermore, using this promoter or an active fragment thereof, it is possible to specifically express a cytotoxic gene or the like, thereby destroying the tissue of the tapetate layer or losing its function, thereby inhibiting pollen development.
[0076]
【The invention's effect】
The method of the present invention using a DNA encoding a transcription factor derived from the ZPT3-2 gene and a promoter derived from the ZPT3-2 gene is a technique for selectively modifying plant traits by genetic engineering, particularly, male sterility. It is useful as a technique for imparting traits.
[0077]
[Sequence list]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1A is a diagram showing a cDNA sequence of a gene encoding ZPT3-2 (hereinafter, also simply referred to as “ZPT3-2 gene”) and a corresponding amino acid sequence. The three zinc finger motifs and the DLNL sequence (amino acids 411-425) are underlined.
FIG. 1B is a continuation of FIG. 1A.
FIG. 1C is a continuation of FIG. 1B.
FIG. 1D is a continuation of FIG. 1C.
FIG. 2 is a schematic diagram showing the structure of a plant expression vector (pBIN-35S-ZPT3-2) for expressing a ZPT3-2 cDNA sequence.
FIG. 3 is a diagram showing an upstream sequence of a coding region of a ZPT3-2 gene. The transcription start point (position 1721) is indicated by a bold arrow, and the translation initiation codon (ATG) is indicated by an underlined bold font.
FIG. 4 is a schematic diagram showing the structure of a plant expression vector (pBIN-ZPT3-2-GUS) for analyzing the promoter of the ZPT3-2 gene.
FIG. 5 is a photograph showing the morphology of an organism (magnification: 240 ×) taken of wild type petunia pollen and petunia pollen into which pBIN-35S-ZPT3-2 has been introduced. All pollens were flavonol stained. 5 (a) to 5 (d) show pollen at different growth stages of buds of wild-type petunia, and FIGS. 5 (e) to 5 (h) show pollen at different growth stages of buds of transformed petunia. Show. 5 (a) and 5 (e) show pollen at a bud size of 5 mm, FIGS. 5 (b) and (f) show pollen at a bud size of 35 mm, and FIGS. 5 (c) and (g) show buds Pollen at a size of 50 mm, and FIGS. 5 (d) and (h) are pollen at maturity.
FIG. 6 is a photograph showing a morphology of an organism, which is obtained by photographing a GUS-stained flower organ of petunia into which pBIN-ZPT3-2-GUS has been introduced. Flowers (buds) with anthers in the tetrad stage were taken as subjects for imaging. 6 (a) shows the appearance of the bud at a magnification of 2.5, FIG. 6 (b) is a cross-sectional view of the anther at a low magnification (60 ×), and FIG. Sectional views at high magnification (280 times) around the tapetate layer are shown respectively.

Claims

A method for producing a male-sterile plant, comprising:
(I) a DNA consisting of the nucleotide sequence from position 1 to position 1886 of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1; DNA encoding a transcription factor that controls the development of, or a nucleic acid that is either (iii) DNA that is a fragment of (i) or (ii), and a promoter operably linked to the nucleic acid. Providing a plant expression cassette,
Providing a plant cell having an endogenous transcription factor that controls pollen development, wherein the gene encoding the endogenous transcription factor hybridizes with the nucleic acid under stringent conditions. Do, process,
Introducing the expression cassette into the plant cell,
A step of regenerating the plant cells into which the expression cassette has been introduced into a plant, and the regenerated plant, wherein the expression of the endogenous transcription factor is suppressed by expressing the nucleic acid The process of choosing a body,
A method comprising: