JP2004000156A - アンドロゲン受容体を過度発現する骨格筋芽細胞 - Google Patents
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Abstract
【課題】アンドロゲン受容体を過度発現する骨格筋芽細胞と、アンドロゲン受容体モジュレーターを同定し、特徴付けるためのスクリーニング方法を提供すること。
【解決手段】アンドロゲン受容体を過度発現する哺乳動物骨格筋芽細胞であって、前記アンドロゲン受容体が、特定配列から選択されるポリヌクレオチド配列に高ストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列である前記骨格筋芽細胞。
【選択図】 なし
【解決手段】アンドロゲン受容体を過度発現する哺乳動物骨格筋芽細胞であって、前記アンドロゲン受容体が、特定配列から選択されるポリヌクレオチド配列に高ストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列である前記骨格筋芽細胞。
【選択図】 なし
Description
【0001】
【発明が属する技術分野】
本発明は、アンドロゲン受容体を過度発現する哺乳動物骨格筋芽細胞、及びアンドロゲン受容体モジュレーターの同定及び特徴付けにおけるこのような筋芽細胞の使用に関する。
【0002】
【従来の技術】
本発明は一般に、アンドロゲン受容体を過度発現する哺乳動物骨格筋芽細胞、及びアンドロゲン受容体モジュレーターを同定し、特徴付けるためのスクリーニング方法に関する。
【0003】
哺乳動物アンドロゲン受容体は核ホルモン受容体スーパーファミリーのメンバーである。例えばテストステロンとその活性代謝産物、ジヒドロテストステロン(DHT)のようなアンドロゲンは、アンドロゲン受容体と高アフィニティで結合する。動物モデルにおいて、睾丸摘出術によるテストステロン欠乏症が雄骨格からの骨の損失を生じること、及び外因性アンドロゲンの投与がこの損失を防止するか又は失われた骨量を修復することが述べられている(HofbauerとKhosla(1999))。
【0004】
ヒトでは、骨量及び循環アンドロゲンレベルが加齢によって減少する。骨粗しょう症とテストステロンレベル減少との相関関係が報告されている(Jackson(1993))。高齢者のアンドロゲン補充が骨格に対して有益な効果を及ぼしうることも、研究が示唆している(Hofbauer等(2000))。
【0005】
米国特許第5,614,620号は、ヒトアンドロゲン受容体に関する3715塩基対ヌクレオチド配列と、734及び918アミノ酸残基の演繹された配列を開示している。米国特許第5,614,620号はまた、真核細胞及び原核細胞におけるクローン化ヒトアンドロゲン受容体遺伝子の発現を開示している。ヒトアンドロゲン受容体cDNA配列はGenbank Accession No.M34233とGenbank Accession No.M23263にも開示されている。
【0006】
国際特許出願公開第WO02/00716号は、安定に導入されたラットアンドロゲン受容体を有するC2C12マウス骨格筋細胞と、アンドロゲン受容体モジュレーターとしての化合物効力の評価における、機能的トランス活性化アッセイ(functional transactivation assay)による、これらの細胞の使用を開示している。
【0007】
アンドロゲン受容体モジュレーターを同定し、特徴付けるための迅速で、費用のかからない、信頼できる方法が必要とされている。
【0008】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の1態様は、アンドロゲン受容体、好ましくはヒトアンドロゲン受容体を過度発現する哺乳動物骨格筋芽細胞を提供する。
【0009】
本発明の他の態様は、ヒトアンドロゲン受容体をコードするポリヌクレオチド配列を含む挿入ポリヌクレオチドを含む形質転換哺乳動物骨格筋芽細胞、又は前記ポリヌクレオチド配列を含むその子孫細胞(progeny cell)を提供する。
【0010】
本発明の筋芽細胞態様の好ましい実施態様では、前記アンドロゲン受容体は、配列番号:1及び配列番号:2から選択されるポリヌクレオチド配列に高ストリンジェント条件(high stringency conditions)下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列である。より好ましい実施態様では、前記アンドロゲン受容体は配列番号:1及び配列番号:2から選択されるポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列である。さらにより好ましい実施態様では、前記アンドロゲン受容体は、配列番号:3及び配列番号:4から選択されるポリペプチド配列である。
【0011】
本発明の形質転換された哺乳動物骨格筋芽細胞態様の好ましい実施態様では、前記ポリヌクレオチド配列は、配列番号:1及び配列番号:2から選択されるポリヌクレオチド配列に高ストリンジェント条件下でハイブリダイズする。より好ましい実施態様では、前記ポリヌクレオチド配列は配列番号:1及び配列番号:2から選択される。
【0012】
本発明の筋芽細胞態様のさらなる好ましい実施態様では、前記筋芽細胞はネズミ骨格筋芽細胞である。より好ましい実施態様では、前記筋芽細胞はC2ネズミ骨格筋芽細胞系に由来する。
本発明のさらなる態様はC2hAR57細胞を提供する。
本発明の他の態様は、請求項1〜10のいずれかに記載の細胞から選択される細胞を、アンドロゲン受容体をモジュレートする作用剤によって処理する工程;及び前記細胞に対する前記作用剤の効果を評価する工程を含むスクリーニング方法を提供する。
【0013】
本発明のさらなる態様は、本発明の細胞をアンドロゲン受容体をモジュレートする作用剤によって処理する工程;及び前記細胞の持続される増殖、前記細胞の分化、前記細胞のチミジン取り込みレベル、前記細胞が細胞周期のG0若しくはG1期のいずれにあるか、前記細胞が細胞周期のG2−M若しくはS期のいずれにあるか、前記細胞の筋管形成、前記細胞のタンパク質含量のレベル、前記細胞のIGF−II発現のレベル、又は前記細胞のIGFBP4発現のレベルに対する前記作用剤の効果を評価する工程を含むスクリーニング方法を提供する。
【0014】
本発明の他の態様は、アンドロゲン受容体アゴニストを同定するためのスクリーニング方法であって、本発明の細胞を試験作用剤によって処理する工程;前記細胞の増殖に対する前記作用剤の効果を評価する工程;及び試験作用剤を下記のいずれかとして:作用剤が前記細胞の増殖を阻害若しくは防止するならば、アンドロゲン受容体アゴニストとして、又は作用剤が前記細胞の増殖を阻害も防止もしないならば、アンドロゲン受容体アゴニストでない作用剤として特徴付ける工程を含む前記方法を提供する。
【0015】
前記細胞の増殖に対する前記作用剤の効果を評価することを含む本発明のスクリーニング方法態様の好ましい実施態様では、前記細胞のチミジン取り込みを測定する方法によって、増殖の阻害又は停止が判定される。他の好ましい実施態様では、細胞が細胞周期のG0又はG1期のいずれにあるかを測定することを含む方法によって、増殖の阻害又は停止が判定される。さらなる好ましい実施態様では、細胞が細胞周期のG2−M又はS期のいずれにあるかを測定することを含む方法によって、増殖の阻害又は停止が判定される。
【0016】
本発明のさらなる態様は、アンドロゲン受容体アゴニストを同定するためのスクリーニング方法であって、本発明の細胞を試験作用剤によって処理する工程;前記細胞の分化に対する前記作用剤の効果を評価する工程;及び試験作用剤を下記のいずれかとして:作用剤が前記細胞の分化を促進するならば、アンドロゲン受容体アゴニストとして、又は作用剤が前記細胞の分化を促進しないならば、アンドロゲン受容体アゴニストでない作用剤として特徴付ける工程を含む前記方法を提供する。
【0017】
前記細胞の分化に対する前記作用剤の効果を評価することを含む本発明のスクリーニング方法態様の好ましい実施態様では、前記細胞の筋管形成を測定することを含む方法によって、前記細胞の分化の促進が判定される。他の好ましい実施態様では、前記細胞のタンパク質含量レベルを測定することを含む方法によって、前記細胞の分化の促進が判定される。さらに他の好ましい実施態様では、前記細胞のIGF−II発現レベルを測定することを含む方法によって、前記細胞の分化の促進が判定される。さらなる好ましい実施態様では、前記細胞のIGFBP4発現レベルを測定することを含む方法によって、前記細胞の分化の促進が判定される。
【0018】
本発明のさらなる態様は、アンドロゲン受容体アゴニストを同定するためのスクリーニング方法であって、本発明の細胞を試験作用剤とマイトジェンによって処理する工程;前記マイトジェンを取り出す工程;前記マイトジェン取り出しの結果としてのアポトーシスに対する前記作用剤の効果を評価する工程;及び試験作用剤を下記のいずれかとして:作用剤が前記細胞のアポトーシスを阻害若しくは防止するならば、アンドロゲン受容体アゴニストとして、又は作用剤が前記細胞のアポトーシスを阻害も防止もしないならば、アンドロゲン受容体アゴニストでない作用剤として特徴付ける工程を含む前記スクリーニング方法を提供する。
【0019】
本発明の他の態様は、アンドロゲン受容体アンタゴニストを同定するためのスクリーニング方法であって、本発明の細胞をアンドロゲン受容体アゴニストと試験作用剤とによって処理する工程;及び前記細胞の持続される増殖、前記細胞の分化、前記細胞のチミジン取り込みレベル、前記細胞が細胞周期のG0若しくはG1期のいずれにあるか、前記細胞が細胞周期のG2−M若しくはS期のいずれにあるか、前記細胞の筋管形成、前記細胞のタンパク質含量のレベル、前記細胞のIGF−II発現のレベル、又は前記細胞のIGFBP4発現のレベルに対する前記作用剤の効果を評価する工程を含む前記スクリーニング方法を提供する。
【0020】
本発明のさらに他の態様は、アンドロゲン受容体アンタゴニストを同定するためのスクリーニング方法であって、本発明の細胞をマイトジェン、アンドロゲン受容体アゴニスト及び試験作用剤によって処理する工程;前記マイトジェンを取り出す工程;及び細胞のアポトーシスに対する前記作用剤の効果を評価する工程を含む前記スクリーニング方法を提供する。
アンドロゲン受容体アゴニストを同定する及び/又は特徴付けるための本発明のスクリーニング方法の好ましい実施態様では、アンドロゲン受容体をアゴナイズする(agonize)ために充分な量の試験作用剤によって、本発明の細胞を処理する。
【0021】
アンドロゲン受容体アンタゴニストを同定する及び/又は特徴付けるための本発明のスクリーニング方法の好ましい実施態様では、本発明の細胞をアンドロゲン受容体をアゴナイズするために充分な量のアンドロゲン受容体アゴニストによって処理し、前記細胞をアンドロゲン受容体をアンタゴナイズする(antagonize)ために充分な量の試験作用剤によって処理する。
【0022】
本発明の細胞をマイトジェンによって処理する、本発明のスクリーニング方法の好ましい実施態様では、細胞を有糸分裂又は細胞増殖を刺激するために充分な量の前記マイトジェンによって処理する。
【0023】
本発明の細胞をマイトジェンによって処理してから、マイトジェンを取り出す本発明のスクリーニング方法の好ましい実施態様では、前記細胞の有糸分裂又は細胞増殖の速度を低下させるために充分な量だけ、前記マイトジェンを取り出す。
本発明のさらなる態様は、骨量の損失を特徴とする状態又は疾患の治療方法であって、本発明のスクリーニング方法によって同定された作用剤のアンドロゲン受容体アゴナイジング量(androgen receptor agonizing amount)をそれを必要とする対象、好ましくはヒトに投与することを含む前記治療方法を提供する。
【0024】
本発明のさらなる態様は、筋肉量の損失と筋肉衰弱とを特徴とする状態又は疾患の治療方法であって、本発明のスクリーニング方法によって同定された作用剤のアンドロゲン受容体アゴナイジング量をそれを必要とする対象、好ましくはヒトに投与することを含む前記治療方法を提供する。
【0025】
他に定義しない限り、本明細書で用いる技術的及び科学的用語の全ては、本発明が属する技術分野の通常に熟練した人によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に開示したものと同様な又は同等な、如何なる装置、物質及び方法を本発明を実施する又は試験するために用いることができるとしても、好ましい装置、物質及び方法を次に説明する。本明細書に挙げる全ての刊行物は、これらの刊行物中に報告され、本発明に関連して用いられうる細胞系、プロトコール、試薬及びベクターを説明し、開示するために引用される。本明細書における何物も、本発明が先行発明によるこのような開示に先んずる権利を与えられていないとの容認として、解釈されるべきではない。
【0026】
“アゴニスト”は、アンドロゲン受容体を活性化するか又はアンドロゲン受容体の生物学的活性を強化する作用剤を意味する。“アンドロゲン受容体アゴニスト”なる用語は、“アンドロゲン”なる用語の同意語として用いられる。“アゴナイズする(agonize)”という動詞は、アゴニストによるアンドロゲン受容体の活性化又はアンドロゲン受容体の生物学的活性の強化を意味する。より好ましくは、アゴニストは、10,000nM以下の濃度において、アンドロゲン受容体をDHTの最大有効用量の少なくとも約1%、より好ましくは約5%、さらにより好ましくは約10%、特により好ましくは約25%だけ活性化する作用剤である。アゴニストは、アンドロゲン受容体と直接相互作用することによって又はアンドロゲン受容体が関与する生物学的経路の要素(components)に作用することによってアンドロゲン受容体の活性をモジュレートする、タンパク質、核酸、炭水化物、小分子又は任意の他の作用剤を包含しうる。DHTの最大有効用量は、それを超えた場合に、観察される反応の大きさを高めることができない用量である。最大有効用量が、反応の測定に用いられる方法及び、妥当な場合には、反応の測定に用いられる、細胞の種類及び/又はアンドロゲン受容体発現レベルを包含する多くの要因に依存することを、当業者は認識するであろう。
【0027】
“アンタゴニスト”は、哺乳動物骨格筋細胞のアンドロゲン受容体の生物学的活性を阻害するか又は弱める作用剤を意味する。好ましくは、アンタゴニストは、10,000nM以下の濃度において、DHTの最大有効用量に暴露された哺乳動物骨格筋細胞のアンドロゲン受容体の生物学的活性を少なくとも約1%、より好ましくは約5%、さらにより好ましくは約10%、特により好ましくは約25%だけ阻害するか又は弱める作用剤である。“アンタゴナイズする(antagonize)”という動詞は、アンタゴニストによるアンドロゲン受容体の生物学的活性の阻害又は弱化を意味する。アンタゴニストは、アンドロゲン受容体と直接相互作用することによって又はアンドロゲン受容体が関与する生物学的経路の要素に作用することによってアンドロゲン受容体の活性をモジュレートする、タンパク質、核酸、炭水化物、小分子又は任意の他の作用剤を包含しうる。アンタゴニストはまた、アゴニストがアンドロゲン受容体活性をモジュレートするのをブロック又は防止する作用剤を包含しうる。
【0028】
“ハイブリダイゼーション”は、ポリヌクレオチド鎖が一定のハイブリダイゼーション条件下で塩基対合によって相補的鎖とアニールするプロセスを意味する。特異的ハイブリダイゼーションは、2つの核酸配列が高度なアイデンティティを共有することの表示である。特異的ハイブリダイゼーション複合体は、許容アニーリング状態下で形成され、“洗浄”工程(単数又は複数)後にハイブリダイズされた状態に留まる。洗浄工程(単数又は複数)はハイブリダイゼーションプロセスのストリンジェント性(stringency)の決定において特に重要であり、条件がストリンジェントであればあるほど、非特異的結合、即ち、完全には適合しない核酸鎖対の間の結合は許容されなくなる。核酸配列のアニーリングのための許容条件は当業者によってルーチンに決定されることができ、複数のハイブリダイゼーション実験間で一致することができる、然るに、洗浄条件は所望のストリンジェント性に、それ故ハイブリダイゼーション特異性に達するように実験間で変えることができる。許容アニーリング条件は例えば68℃において約6xSSC、約1%(w/v)SDS及び約100μg/ml変性サケ精子DNAの存在下で生じる。
【0029】
一般に、ハイブリダイゼーションのストリンジェント性は一部は、洗浄工程が実施される温度に関連して表現される。一般に、このような洗浄温度は、一定のイオン強度及びpHにおいて、特異的配列の熱融解点(Tm)よりも約5℃〜20℃低いように選択される。このTmは、標的配列の50%が完全適合プローブにハイブリダイズする温度(一定のイオン強度及びpH下)である。Tmを算出するための式及び核酸ハイブリダイゼーションのための条件は周知であり、Sambrook等,1989,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版,1〜3巻,Cold Spring Harbor Press,Plainview,NYに見出されうる(2巻,9章参照)。
【0030】
“高ストリンジェント条件”は、約0.2xSSC及び約0.1%SDSの存在下、68℃、1時間の洗浄条件を包含する、本発明のポリヌクレオチド間のハイブリダイゼーションを意味する。代替え的に、約65℃、60℃、55℃又は42℃の温度を用いることができる。SDSが約0.1%で存在するときに、SSC濃度は約0.1〜2xSSCまで変化することができる。典型的には、非特異的ハイブリダイゼーションをブロックするために、ブロッキング試薬が用いられる。このようなブロッキング試薬は、例えば、約100〜200μg/mlでの変性サケ精子DNAを包含する。例えばRNA:DNAハイブリダイゼーションのためのような、特定の状況下で例えばホルムアミドのような有機溶媒を約35〜50%v/vの濃度で用いることもできる。これらの洗浄条件に関する有用な変化は当業者に容易に明らかであろう。特に高ストリンジェント条件下でのハイブリダイゼーションは、ヌクレオチド間の進化的類似性(evolutionary similarity)を示唆することができる。このような類似性はヌクレオチドとそれらにコードされるポリペプチドとの同様な役割りを強く暗示する。
【0031】
“モジュレーター”は、アンドロゲン受容体アゴニスト又はアンドロゲン受容体アンタゴニストのいずれかである作用剤を意味する。
“マイトジェン”は、筋芽細胞の有糸分裂又は細胞増殖を刺激する作用剤を意味する。例えば、ウシ胎仔血清、塩基性線維芽細胞増殖因子及び上皮増殖因子(TGF−αとしても知られる)が、筋芽細胞の有糸分裂又は細胞増殖を刺激するマイトジェンである。
【0032】
“筋芽細胞”はミオサイト(myocytes)又は筋管を包含する1つ以上の分化筋細胞を生じる(即ち、筋形成)ことができる単核未分化細胞を意味し、天然に生ずるような、又は天然若しくは人為的突然変異、DNA組換え、形質転換等によって変化されうるような細胞を包含する。
【0033】
“過度発現する”又は“過度発現”は、少なくとも約2.2フェムトモルDHT/mgタンパク質、好ましくは約5フェムトモルDHT/mgタンパク質、より好ましくは少なくとも約10フェムトモルDHT/mgタンパク質を特異的に結合するために必要なレベルよりも高いレベルでアンドロゲン受容体を発現する哺乳動物骨格筋芽細胞又は筋芽細胞系を意味し、この場合、該筋芽細胞又は筋芽細胞系は生存能力があり、アンドロゲン受容体アゴニストに暴露されたときに筋形成機能(myogenic function)を示す。筋形成機能は、例えば、筋芽細胞が高マイトジェン増殖培地から低マイトジェン縮合培地(fusion medium)に切り替えられたときに、分化筋管の形成によって例示される。高マイトジェン増殖培地と低マイトジェン縮合培地の適当な調製は、以下の(課題を実施するための手段)及び(実施例)に述べる。
【0034】
“特異的結合”又は“特異的に結合する”は、タンパク質又はペプチドと、アゴニスト、抗体、アンタゴニスト、小分子又は任意の天然若しくは合成結合組成物(natural or synthetic binding composition)との間の相互作用を意味する。この相互作用は、結合分子によって認識される、特定構造のタンパク質、例えば、抗原決定基又はエピトープの存在に依存する。例えば、抗体がエピトープ“A”に特異的である場合には、遊離の標識A及び抗体を含有する反応におけるエピトープA含有ポリペプチドの存在又は遊離の非標識Aの存在が、抗体と結合する標識Aの量を減ずる。
【0035】
“形質転換”は、外因性DNAがレシピエント細胞に侵入して、これを変化させるプロセスを表す。形質転換は、当該技術分野において、周知の種々な方法によって天然又は人為的条件下で生じることができ、場合に応じて、原核宿主細胞又は真核宿主細胞中に異種核酸配列を挿入するために、任意のこのような既知方法を用いることができる。形質転換方法は、例えば、形質転換される宿主細胞の種類に基づいて選択されることができ、非限定的に、ウイルス感染、エレクトロポレーション、熱ショック(heat shock)、リポフェクション及び粒子衝突(particle bombardment)を包含することができる。“形質転換”細胞は、挿入されたDNAが自律複製プラスミドとして又は宿主染色体の一部として複製可能である、安定に形質転換された細胞、並びに挿入されたDNA若しくはRNAを限られた期間発現する一時的形質転換細胞を包含する。
【0036】
【課題を解決するための手段】
本発明は、一部は、アンドロゲン受容体を過度発現する哺乳動物骨格筋芽細胞に関する。生物学的に活性なアンドロゲン受容体を発現するために、アンドロゲン受容体をコードする適当なヌクレオチド配列を適当な発現ベクター中に挿入することができる。本願の開示に基づいて、当業者は適当な既知方法を用いて、アンドロゲン受容体をコードする配列と、転写及び翻訳調節要素とを含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法は例えばin vitro組換えDNA手法、合成方法、及びin vivo遺伝的組換えを包含する(例えば、Sambrook,J.等(1989);Ausubel,F.M.等(2001)参照)。
【0037】
アンドロゲン受容体の挿入コーディング配列の適当な宿主における転写及び翻訳調節のための要素は、該ベクター中及びアンドロゲン受容体をコードするポリヌクレオチド配列中に例えばエンハンサー、構成及び誘導プロモーター、並びに5’及び3’非翻訳領域のような調節配列を包含しうる。当業者が理解するように、このような要素はそれらの強度及び特異性において変化する。アンドロゲン受容体をコードする配列のより効果的な翻訳を達成するために、特異的な開始シグナルを用いることもできる。このようなシグナルはATG開始コドンと、隣接配列、例えばKozak配列を包含する。アンドロゲン受容体及びその開始コドンをコードする配列と上流の調節配列とが適当な発現ベクター中に挿入される本発明を実施するために、付加的な転写又は翻訳調節シグナルが必要とされることはない。しかし、コーディング配列又はそのフラグメントのみが挿入される場合には、イン−フレームATG開始コドンを包含する外因性翻訳調節シグナルがベクターによって与えられるべきである。外因性翻訳要素と開始コドンとは種々な起源、天然と合成の両方であることができる。用いる特定の宿主細胞系のために適当なエンハンサーを含めることによって、発現効率を強化することができる(例えば、Scharf,D.等(1994)参照)。
【0038】
好ましくは、本発明の細胞の調製に用いる発現ベクターは、プロモーター領域及び/又は、エンハンサー領域に動作的に(operatively)結合するプロモーター領域(即ち、エンハンサー−プロモーター)に動作的に結合する、アンドロゲン受容体をコードするポリヌクレオチドを含む。プロモーター及びエンハンサー−プロモーターは、宿主細胞中の標的ペプチドの発現を推進しうるDNA分子の領域である。pBI−EGFP Tetベクター(Clontech,Cat.#6154−1,Palo Alto,CA)は、それぞれTet−OffTM及びTet−OnTM遺伝子発現系におけるtTA及びrtTA調節タンパク質に反応する二方向性プロモーターPbi−1を含有する。Tet−OnTM及びTet−OffTM系は、テトラサイクリン又はテトラサイクリン誘導体の種々な濃度を用いる遺伝子発現の調節を可能にする。
【0039】
本発明の細胞の調製に用いる発現ベクターは、本願の開示に基づいて、当業者に周知の標準組換えDNAクローニング手法によって調製することができる。このような発現ベクターを調製するための好ましい方法では、アンドロゲン受容体コーディング配列、好ましくは2577−bpヒトアンドロゲン受容体コーディング配列(Genbank Accession No.M23263)を含有するDNAフラグメントを、図9に示すように、pBI−EGFP Tetベクターの固有Pvull部位にライゲートする。次に、得られた発現ベクターを大腸菌株DH5α(Life Technologies,Rockville,MD)中で形質変換して、増殖させる。
【0040】
宿主哺乳動物骨格筋芽細胞株を本発明の細胞の調製に用いることができることは、本願の開示に基づいて当業者によって理解されるであろう。非限定的にL6(YaffeとSaxel(1977))、L6E9(Benoff,S.とB.N.Nadal−Ginard(1979))、L8(RichlerとYaffe(1970))、C2C12(以下参照)、MM14(LimとHauschka(1984))、G7(Christian,C.N.等(1977))、G8(Christian、C.N.等(1977))、So18(Daubas,P.等(1988))、BC3H1(Schubert,D.等(1974))、H9c2(Kimes,B.W.とB.L.Brandt(1976))、SJRH30[RMS13](Douglass等(1987))、及びP19(McBurney,M.W.等(1982))を包含する哺乳動物骨格筋芽細胞系のいずれも本発明の細胞の調製に用いることができる。本発明の細胞の調製に用いるために好ましい哺乳動物骨格筋芽細胞は、YaffeとSaxel(1977)及びBlau,H.M.,G.K.Pavlath等(1985)Science 230(4727),758−766によって述べられているネズミ筋肉由来細胞系、C2C12(American Type Tissue Culture Collection(ATCC)から入手可能、ATCC No.CRL−1772,Manassas,VA,B.Patersonによって寄贈)からのものである。
【0041】
哺乳動物骨格筋芽細胞系の調製及び使用は、当該技術分野に知られた方法に準じて、本願の記載に基づいて実施されうる。例えば、アンドロゲン受容体をコードする配列は、上記の好ましい方法によって調製される発現ベクターを用いて細胞系中に形質変換することができ、同ベクター上に又は別のベクター上に選択マーカー遺伝子を有する。形質転換方法は、非限定的に、ウイルス感染、エレクトロポレーション、熱ショック、リポフェクション、及び粒子衝突を包含することができる。アンドロゲン受容体を過度発現する細胞系を生成するために、例えばLipofectamineTM試薬(Life Technologies)を利用して、多重DNA分子による逐次トランスフェクションを用いることが好ましい。
【0042】
ベクターの導入後に、選択的培地に切り替える前に、富化培地中で例えば約1〜2日間のような適当な期間、細胞を増殖させることができる。選択マーカーの目的は、選択的作用剤に対する耐性を与えることであり、その存在は、導入された配列を上首尾に発現する細胞の増殖と回収を可能にする。本願の記載に基づいて当業者が理解するように、細胞種類に適当な組織培養手法を用いて、安定に形質転換された細胞の耐性クローンを増殖させることができる。
【0043】
形質転換細胞系を回収するために、任意の適当な選択系(“選択マーカー”)を用いることができることは、本願の記載に基づいて、当業者によってさらに理解されるであろう。これらは、非限定的に、それぞれtk−及びapr−細胞に用いるための単純ヘルペスウイルス・チミジンキナーゼ及びアデニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子を包含する(例えば、Wigler,M.等(1977);Lowy,I.等(1980)Cell 22,817−823参照)。抗代謝物質(antimetabolite)、抗生物質及び除草剤耐性も選択の根拠として用いることができる。例えば、dhfr(ジヒドロ葉酸レダクターゼ)はメトトレキセートに対する耐性を与え;neoはアミノグリコシド・ネオマイシン及びG−418に対する耐性を与え;alsとpatは、それぞれ、クロルスルフロンとホスフィノトリシン・アセチルトランスフェラーゼに対する耐性を与える(Wigler,M.等(1980);Colbere−Garapin,F.等(1981)参照)。他の選択遺伝子、例えば、代謝産物のための細胞必要条件を変化させる、trpBとhisDも述べられている(例えば、Hartman,S.C.等(1988)参照)。可視選択マーカー、例えば、アントシアニン、緑色蛍光タンパク質(Clontech,Palo Alto,CA)、βグルクロニダーゼとその基質β−グルクロニド、又はルシフェラーゼとその基質ルシフェリンを用いることができる。これらのマーカーは形質転換細胞(transformants)の同定のみならず、特定のベクター系に帰因する一過性又は安定なタンパク質発現量の定量にも用いることができる(例えば、Rhodes,C.A.(1995)参照)。
【0044】
選択マーカー遺伝子発現の有無は、場合に応じて、問題の遺伝子がさらに存在することを示唆するが、如何なるこのような場合にも、該遺伝子の存在と発現を確認することが望ましいと考えられる。例えば、アンドロゲン受容体をコードする配列を選択マーカー遺伝子配列内に挿入する場合に、アンドロゲン受容体をコードする配列を含有する形質転換哺乳動物骨格筋芽細胞を選択マーカー遺伝子機能の不存在によって同定することができる。或いは、選択マーカー遺伝子を単独プロモーターの制御下でアンドロゲン受容体をコードする配列と連結して配置することができる。本願の記載に基づいて当業者が理解するように、誘導又は選択に応じたマーカー遺伝子の発現は一般に、縦に並んだ遺伝子(tandem gene)の発現をも示唆する。
【0045】
アンドロゲン受容体をコードするヌクレオチド配列を含有し、アンドロゲン受容体ポリペプチドを過度発現する宿主哺乳動物骨格筋芽細胞は、本願の記載に基づいて、当業者に知られた多様な手段によって同定されうる。これらの手段は、非限定的に、DNA−DNA若しくはDNA−RNAハイブリダイゼーション、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅、並びにヌクレオチド若しくはアミノ酸配列の検出及び/又は定量のためのメンブラン−、溶液−及び/又はチップ−に基づくテクノロジーを包含するタンパク質バイオアッセイ又はイムノアッセイ手法を包含する。このような方法及び手法は、例えば、Ausubel,F.M.等(2001)に述べられている。
【0046】
アンドロゲン受容体の過度発現を確認するための好ましい方法は、例えばLiao,S.等(1984)に述べられているように、[3H]−DHT競合結合アッセイの使用による。アンドロゲン受容体の発現を検出し、測定するための免疫学的方法も、本発明の実施に用いるために好ましい方法である。例えば、このような方法は特異的なポリクローナル又はモノクローナル抗体の使用を包含する。このような方法は当該技術分野において周知である。このような手法の例は、酵素免疫測定法(ELISAs)、ラジオイムノアッセイ(RIAs)及び蛍光活性化セルソーティング(FACS)を包含する。これらのアッセイ及びその他のアッセイは当該技術分野において周知である(例えば、Hampton,R.等(1990);Coligan,J.E.等(1997);及びPound,J.D.(1998)参照)。
【0047】
本発明の筋芽細胞の調製には、任意の哺乳動物アンドロゲン受容体を用いることができる。本発明に有用なアンドロゲン受容体は種々な哺乳動物種から単離することができる。ラット・アンドロゲン受容体はGenbank Accession No.M23264とJO5454に並びにChang等(1988),324−326によって述べられている。マウス・アンドロゲン受容体はGenbank Accession No.M37890に並びにGaspar等(1991)及びHe等(1990)によって述べられている。ハムスター・アンドロゲン受容体はShiba等(2001)によって述べられている。イヌ・アンドロゲン受容体はLu,B.,S.Smock等(2001)に述べられている。ヒトアンドロゲン受容体はGenbank Accession No.M34233及びGenbank Accession No.M23263に述べられている。
【0048】
本発明の筋芽細胞の調製に用いられる哺乳動物アンドロゲン受容体は、アンドロゲン受容体が本発明の細胞中で発現され、アンドロゲン受容体モジュレーターに暴露されたときに、Genbank Accession No.M23263に述べられるヒトアンドロゲン受容体と実質的に同様に本発明の細胞において生物学的に機能する限り、それをコードするアミノ酸配列又はヌクレオチド配列の長さ又はアイデンティティに関して変化しうる。
【0049】
本発明の好ましい実施態様では、アンドロゲン受容体コーディング配列、好ましくはヒトアンドロゲン受容体コーディング配列(Genbank Accession No.M23263)を含有する発現ベクターを用いて、アンドロゲン受容体を過度発現する哺乳動物骨格筋芽細胞を結果として得る、本願の開示に基づいて、当業者に知られた方法で形質転換される宿主細胞として、ネズミ筋肉由来細胞系、C2C12(ATCC No.CRL−1772)を用いて、本発明の筋芽細胞が本願の開示に基づいて、当業者に知られた方法に従って調製される。本発明の好ましい細胞は、C2hAR57と表示される細胞系の細胞である。
【0050】
本発明の細胞は、アンドロゲン受容体のモジュレーターである作用剤の同定のために特に有用である。このような同定に用いられる方法は、細胞の増殖のレベル及び/若しくは速度、細胞の分化のレベル及び/若しくは速度、並びに/又は細胞のアポトーシスのレベル及び/若しくは速度を包含する、このような細胞における変化の検出に基づく。それ故、好ましくは、このような細胞を15%ウシ胎仔血清(Gemini Bio−Products,Calabasas,CA)と10pM塩基性線維芽細胞増殖因子(Collaborative Biomedical Products,Bedford,MA)とを補充したDulbecco改変Eagle培地(Life Technologies)の高マイトジェン増殖培地中で増殖させることによって、細胞を増殖する未分化状態に維持することが特に有用である。
【0051】
本発明のスクリーニング方法の1実施態様では、本発明の細胞の増殖速度に対する効果を用いて、可能なアンドロゲン受容体モジュレーター(“試験作用剤”)を同定し、及び/又は特徴付けることができる。この実施態様は、アンドロゲン受容体アゴニストの存在下では本発明の細胞がそれらの増殖レベルを減ずるという観察に基づく。好ましい実施態様では、チミジン、好ましくは放射能標識チミジン、より好ましくは[3H]−チミジンの取り込みを用いて、アンドロゲン受容体アゴニストを同定し、特徴付ける。この方法は、本発明のアンドロゲン受容体を過度発現する、活性に増殖する骨格筋芽細胞を増殖培地中の試験作用剤に、例えば約48時間のような、適当な期間暴露させ、次に、培養培地中の放射能標識チミジン(好ましくは、[3H]−チミジン,Amersham,Buckinghamshire,UK)に、例えば約2時間のような、適当な期間暴露させることを含む。チミジン取り込みは、培養培地を除去し、次に氷冷リン酸塩緩衝化生理食塩水によって、続いて5%トリクロロ酢酸によって洗浄することによって停止する。次に、細胞を溶解させる。次に、溶解物の放射能を測定して、細胞中に取り込まれた放射能標識チミジンの度合いを知る。試験作用剤が、アンドロゲン受容体アゴニストを含有しない対照サンプルに比べて、チミジン取り込み速度を検出可能に低下させる場合には、該試験作用剤はアンドロゲン受容体アゴニストとして陽性の試験結果になると考えられる。好ましくは、このような減少は対照よりも少なくとも約30%低く、より好ましくは、対照よりも少なくとも約50%低い。
【0052】
本発明のスクリーニング方法の他の実施態様では、上記のような、本発明の細胞中の放射能標識チミジンの取り込みを測定するための方法を、アンドロゲン受容体モジュレーターを特徴付けるためにも用いることができる。このことは、アンドロゲン受容体アゴニストが[3H]−チミジン取り込みを阻害する度合いがアンドロゲン受容体に対する該アゴニストの既知アフィニティに一致するという観察に基づく。この効果は、図4に示すように、天然アンドロゲン受容体アゴニスト、テストステロン及びDHTに関して、並びに例えばオキサンドロロン及びスタノゾロールのような合成アンドロゲン受容体アゴニストに関して明らかにされている。アンドロゲン受容体アゴニストは上述したチミジン取り込み方法を用いて試験することができ、結果を他のアンドロゲン受容体アゴニストの既知効果と比較することができる。これらの結果を用いて、既知アンドロゲン受容体アゴニストと比較して、試験作用剤のアンドロゲン受容体に対する相対的アフィニティを予測することができる。
【0053】
本発明のスクリーニング方法の他の実施態様では、細胞周期のG0及びG1期にある細胞の割合の増加及び/又は複製(replicative)(S)及び複製後(post−replicative)(G2/M)期にある細胞の画分の同時減少を用いて、試験作用剤による細胞増殖の阻害を評価する。G0/G1において、細胞DNAの量は染色体の二倍体含量(2N)に対応する。S期中に、染色体複製がDNA含量を2Nから4Nに高め、G2/M(細胞分割の前)における細胞の染色体含量は4Nである。
【0054】
好ましい定量的(quantitative)DNAステインはヨウ化プロピジウム(PI;Molecular Probes,製品 no.P−3566,Calbiochem;La Jolla,Calif.)である。他の有用な定量的DNAステインは蛍光核酸ステインを包含する。当業者が本願の開示に基づいて理解するように、非限定的にチアゾール・オレンジ、エチジウム・ホモダイマー、臭化エチジウム、HOECHST33258及びDAPIを包含する、多様な、適当な核酸ステインが当該技術分野に知られている。核酸ステインは、例えばフェナントリジン及びアクリジンのようなインターカレーティング・ダイ、例えば臭化エチジウム及びヨウ化プロピジウム;例えばDAPI及びHoechstダイのような副溝結合剤(minor−groove binder);又はこれらの2つのカテゴリーのいずれにも属さないダイ、例えばアクリジン・オレンジ、7−AAD及びヒドロキシスチルバアミジンでありうる。シアニン・ダイは、それらの高いモル吸光性、非常に低い固有蛍光、核酸への結合時の大きい蛍光強化、核酸に対する中程度から非常に高いまでのアフィニティに基づいて選択されるダイであり、他のバイオポリマーを殆ど又は全く染色しない。幾つかの核酸ステインは細胞不浸透性であり、他のステインは細胞浸透性ステインである。細胞浸透性ステインは染色前の細胞の浸透性化(permeabilization)を必要としない。典型的な細胞浸透性ダイはシアニン・ダイ(SYTO核酸ステイン)、ヨウ化ヘキシジウム、ジヒドロエチジウム、及びエチジウムホモダイマーである。
【0055】
他の利用可能なダイはインターカレーター 7−アミノアクチノマイシンDとアクチノマイシンD、マルチカラー・ヒドロキシスチルバアミジン、長波長LDS751及びNeurtrace Fluorescent Nissl Stainsを包含する。他の定量的DNAステインは塩基類似体5−ブロモ−2’−デオキシウリジン(BrdU、Sigma−Aldrich,St.Louis,MO)である。その他の有用な核酸ステインは国際特許出願公開WO93/06482(米国特許第5,582,977号として発行)とWO94/24213(米国特許第5,436,134号として発行)、及び米国特許第5,321,130号;第5,410,030号;第5,436,134号;及び第5,437,980号に述べられている。
【0056】
ヨウ化プロピジウム(PI;Calbiochem)は細胞集団に少なくとも約0.1μg/ml〜約100μg/ml、好ましくは少なくとも約0.1〜約10μg/ml、最も好ましくは約1〜約5μg/mlの濃度で加えることができる。該細胞を任意に暗所において室温で約1分間〜約2時間、好ましくは約10分間〜1時間、最も好ましくは約15〜約30分間インキュベートすることができる。インキュベーションは氷上において少なくとも約1分間、好ましくは少なくとも約5分間、最も好ましくは少なくとも約15分間行なうこともできる。
【0057】
一般に、細胞を定量的DNAステインによって、細胞中のDNAの検出及び定量を可能にするために充分な量及び時間で染色する。特定の細胞種類及び検出方法に適した染色手段は、当該技術分野に知られた方法によって、例えば如何なる条件が細胞の適当な染色を可能にするかを知るためのように、幾つかのDNAステイン、濃度及びインキュベーション時間を用いてアッセイを実施することによって決定することができる。
【0058】
DNA含量に関する細胞の染色に付随して、染色体DNA以外の核酸(例えば、RNA)の染色を防止する作用剤による細胞の処理を行なうことができる。例示的な実施態様では、RNAを分解する作用剤、例えばRNアーゼによって細胞を処理する。例えば、RNアーゼ(BD Clontech)を約100〜500μg/mlで加えることができる。一般に、他の核酸の染色よりも染色体DNAの優先的な染色を可能にするために充分な濃度及び時間で、染色体DNA以外の核酸の染色を防止する作用剤を用いて、細胞をインキュベートする。適当な条件は当該技術分野の方法によって、例えば、用いる方法に適した条件を知るためのように、種々な作用剤を種々な条件下で用いてアッセイを実施することによって決定することができる。
【0059】
染色された細胞を分析するための好ましい方法は、マルチ−パラメータ(又はカラー)ディスプレイを用いた、フローサイトメトリー又はレーザー走査サイトメトリーによる方法である。フローサイトメトリーは、本明細書でさらに説明する、当該技術分野において知られた蛍光活性化セルソーター(FACS)によって行なうことができる。用いることができる、典型的なFACS装置はFACSCaliburTM Flow Cytometry Systemフローサイトメーター(Becton Dickinson Immunocytometry Systems,San Jose,CA)と、Coulterフローサイトメーター(Hialeah,Fla.,USA)EPICS Elite(登録商標)を包含する。定量はCellQuest(Becton Dickinson;Mountain View,CA)、WinList(VeritySoftware House,Inc.Topsham,Maine)、Multicycleソフトウェア(Phoenix Flow Systems,San Diego,CA)及びFACScan(Becton Dickinson,Mountain View,CA)ソフトウェアを用いて行なうことができる。フローサイトメーターは各細胞に関連した発光性物質量及び他のパラメーターを測定して、例えばヒストグラム、ドットプロット又は画分表(fraction table)の形式で出力を提供する。流体含有細胞が光源を、典型的に1つずつ、通過するにつれて、これらの細胞は種々な波長の光に暴露される。サイトメーターによって検出される各粒子は“イベント”と呼ばれる。イベントが入射光の一部を伝達するか又は散乱させる程度は、イベントの特徴、例えば関連発光性物質の尺度を与える。例えば、イベントは自発的に発光することができる、又は該イベントに導入された蛍光物質によって生じる蛍光を発光することができる。発光又は反射光の強度はサイトメーターによって測定され、記憶される。
【0060】
細胞周期のG0及びG1期にある細胞の割合の増加及び/又は複製(S)及び複製後(G2/M)期にある細胞の画分の同時減少を用いて、細胞増殖の阻害を評価する本発明のスクリーニング方法の好ましい実施態様では、Krishan,A.(1975)に従ってヨウ化プロピジウムによって染色した後にフローサイトメトリーによって、細胞周期の各期の細胞のパーセンテージを知ることができる。この方法によると、細胞を高マイトジェン増殖培地に低密度でプレーティングして(plated)、試験化合物によって約24時間〜約48時間処理する。次に、トリプシン化によって細胞を回収して、Dulbecco’sリン酸塩緩衝化生理食塩水(Life Technologies)中70%エタノール中に−20℃において少なくとも2時間再懸濁させる。次に、細胞を低速度遠心分離を用いてペレット化して、リボヌクレアーゼAとヨウ化プロピジウムとを含有するリン酸塩緩衝化生理食塩水中に再懸濁させる。細胞をリボヌクレアーゼAとヨウ化プロピジウムとによって室温において約30分間処理する。G0及びG1期の細胞対S、G2及びM期の細胞の定量は、例えば、アルゴンレーザー(488nm 発光波長)とModfitTMソフトウェア(Becton Dickinson Immunocytometry Systems)とを装備したFACScanTMフローサイトメーターのような、フローサイトメーターを用いて行なうことができる。
【0061】
試験作用剤が、アンドロゲン受容体アゴニストを含有しない対照サンプルに比べて、細胞周期のG0及びG1期の細胞の割合を検出可能に増加させ、及び/又は細胞周期のS及びG2/M期の細胞の割合を減少させる場合には、該試験作用剤はアンドロゲン受容体アゴニストとして陽性の試験結果になると考えられる。好ましくは、G0及びG1期の細胞の増加は対照に比べて少なくとも約5%、より好ましくは、対照に比べて少なくとも約10%である。好ましくは、S及びG2/M期の細胞の減少は対照に比べて少なくとも約5%、より好ましくは、対照に比べて少なくとも約10%である。
【0062】
本発明のスクリーニング方法の他の実施態様では、本発明の細胞に対する筋芽細胞分化の効果を用いて、アンドロゲン受容体モジュレーターを同定することができる。この実施態様は、本発明の細胞がアンドロゲン受容体アゴニストによって処理されたときに細胞分化のそれらのレベルを促進するという観察に基づいている。好ましい実施態様では、本発明の細胞を用いて、分化した筋管形成のレベル及び速度に対する試験作用剤の効果を決定する。本発明の細胞が高マイトジェン増殖培地中で増殖するときに、それらは小さい付着単核細胞として出現する。しかし、培地を2%ウマ血清を補充したDulbecco改変Eagle培地の低マイトジェン融合培地(fusion medium)(Life Technologies)に切り替えると、単核筋芽細胞の大部分が融合して、細長い多核筋管を形成する。本発明の細胞を例えばDHTのようなアンドロゲン受容体アゴニストに暴露させると、アンドロゲン受容体アゴニストの無い場合よりも迅速に筋管が形成されることが観察された。アンドロゲン受容体を過度発現しない骨格筋芽細胞も、培地を融合培地に切り替えるときに、筋管を形成するが、筋管形成の速度も程度も例えばDHTのようなアンドロゲン受容体アゴニストの添加によって目に見えるほどに影響されない。本発明の細胞に対するアンドロゲン受容体アゴニストの効果を図3に示す。本発明のスクリーニング方法の好ましい実施態様では、実施例4に述べる方法に従ってスクリーニング・アッセイを行なう。試験作用剤は、アンドロゲン受容体アゴニストを含有しない対照サンプルに比べて、筋管形成速度を検出可能に増加させる場合には、該試験作用剤はアンドロゲン受容体アゴニストとして陽性の試験結果になると考えられる。
【0063】
本発明のスクリーニング方法の他の実施態様では、総タンパク質含量に対する効果を利用して、本発明の細胞に対する試験作用剤の効果を評価する。この実施態様は、アンドロゲン受容体アゴニストの存在下での本発明の細胞の培養が細胞中のタンパク質含量の蓄積を促進するという観察に基づく。このスクリーニング方法の好ましい実施方法では、本発明の細胞を最初に高マイトジェン増殖培地中で約24時間増殖させる。次に、培地を、15%チャーコール−デキストラン処理ウシ胎仔血清(Gemini Bio−Products)と10pM塩基性線維芽細胞増殖因子(Collaborative Biomedical Products)とを有するDulbecco改変Eagle培地の無ステロイド増殖培地と交換する。約38時間後に、培地を、試験作用剤を含有する上記融合培地と交換して、細胞を該作用剤に少なくとも約48時間暴露させ、次に、少なくとも50%集密度(confluence)に達するために必要に応じて、付加的期間暴露させる。次に、培地を、試験作用剤を含有する融合培地に3日間まで交換する。細胞の溶解、超音波処理及び遠心分離によって調製された細胞抽出物のタンパク質濃度を、例えばBradford,M.(1976)に述べられたCoomassie Blue ダイ結合方法のような、任意の適当な方法によって測定することができる。好ましい実施態様では、実施例5に述べる方法に従ってスクリーニング・アッセイを実施する。試験作用剤がアンドロゲン受容体アゴニストを含有しない対照サンプルに比べて、総タンパク質含量を検出可能に増加させるならば、該試験作用剤はアンドロゲン受容体アゴニストとして陽性の試験結果になると考えられる。好ましくは、このような増加は対照に比べて少なくとも約20%、より好ましくは対照に比べて少なくとも約50%である。
【0064】
本発明のスクリーニング方法の他の実施態様では、試験作用剤を本発明の細胞の細胞死又はアポトーシスに対するその効果に基づいて評価することができる(Kaufmann,S.H.,Hengartner,M.O.(2001);Arends,A.J.,Wyllie,A.H.(1991);及びWyllie,A.H.等(1980)参照)。何らかの特定の理論又はメカニズムに縛られることを望む訳ではないが、アンドロゲン受容体アゴニストが筋芽細胞分化を強化するメカニズムはマイトジェン取り出し後のプログラム化細胞死又はアポトーシスの発生率を減ずることによると、提案される。この実施態様は、マイトジェン取り出し後に、アンドロゲン受容体アゴニストによって処理された本発明の細胞が、本発明の未処理細胞に比べて、アポトーシスのレベル減少を示すという観察に基づく。マイトジェン取り出し後に、あるパーセンテージの前付着細胞(previously adherent cells)が培養皿から剥離して、アポトーシスを受けるように思われる。アポトーシスを受ける細胞の顕著な特徴は、ゲル電気泳動、Rosl,F.(1992)によって分析されたときに、ヌクレオソーム内フラグメント化(internucleosomal fragmentation)によって特徴的なラダーリング効果を生じるDNAフラグメント化のパターンである。付着細胞に対比した非付着細胞におけるアポトーシスは、非付着細胞に対比した付着細胞のDNAサンプルの電気泳動によって確認することができる(図7参照)。スクリーニング方法の実施態様の実施では、本発明の細胞を上記高マイトジェン増殖培地において試験作用剤と共に適当な期間、好ましくは約4日間培養する。培地を、試験作用剤を含有する上述したような融合培地に変えて、細胞をさらに約24時間増殖させる。穏やかな洗浄を繰り返して、非付着細胞を回収して、溶解させる。付着細胞をトリプシン化によって回収して、次に溶解させる。例えば、Blin,N.及びD.Stafford(1976)におけるような、当該技術分野において周知の手段に従って総DNAを単離する。DNA収率は260nmにおけるUV分光法によって測定することができる。本発明の細胞のアポトーシスの減少は、本発明の付着細胞中のDNA量に比べた、アンドロゲン受容体アゴニストによって処理した本発明非付着細胞のDNAの割合の減少によって明らかになる。好ましい実施態様では、実施例7に述べる方法を用いる。試験作用剤がアンドロゲン受容体アゴニストを含有しない対照サンプルに比べて、非付着細胞のパーセンテージを検出可能に減少させるならば、該試験作用剤はアンドロゲン受容体アゴニストとして陽性の試験結果になると考えられる。
【0065】
本発明の他のスクリーニング方法では、試験作用剤を例えばIGF−I及びIGF−IIのような、インシュリン様増殖因子(IGFs)の発現に対するその効果に基づいて評価することができる。IGFsが筋管への筋芽細胞の分化に重要な役割を果たすことは周知である(Florini,J.,D.Ewton等(1996);Tollefsen,S.,R.Lajara等(1989);及びTollefsen,S.,J.Sadow等(1989)参照)。スクリーニング方法の実施では、本発明の細胞を増殖する筋芽細胞として試験作用剤を含む高マイトジェン増殖培地中に少なくとも2日間維持して、これらを高密度(>70%集密度)に達しさせる。細胞が高密度に達したときに、細胞を直ちに回収することができるか、又は好ましくは、試験作用剤を含む融合培地に約1〜2日間切り替えることができる。次に、細胞を回収して、総RNAをTrizol(登録商標)試薬(Life Technologies)を用いて製造者が薦める標準方法に従って単離する。20μg(UV分光法によって測定されるRNAの濃度に基づいて)を含有するサンプルをホルムアルデヒド含有アガロースゲル上での電気泳動によって分離する。分離済みサンプルをDuralon−UVTMナイロン・メンブラン(Stratagene,La Jolla,CA)に5xSSPE中での毛管ブロッティングによって移し、ラットIGF−IIプローブによって調べる。この方法におけるプローブとしては、任意の哺乳動物IGF−II cDNA又はRNAを用いることができる。好ましくは、前記プローブはマウスIGF−IIcDNA又はRNAの対応領域に>90%同じの配列相同性を有する。IGF−IIプローブはラット胚総RNAを鋳型として、5’−TGTTGGTGCTTCTCATCTCTTTGG−3’をフォワードプライマーとして、5’−CACAGACTGATGGTACTACATTGC−3’をリバースプライマーとして用いることができ、続いて、トリス−ボレート−EDTA(TBE)バッファー中1%アガロースゲル上でのDNAフラグメントの電気泳動分離を行い、QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen,Valencia,CA)を用いて、ゲルスライスから562−塩基対生成物を回収することができる。Feinberg,A.及びB.Vogelstein(1983)と、Feinberg,A.P.及びB.Vogelstein(1984)によるランダムプライマー伸長によって、二本鎖32P標識プローブを合成することができる。プローブを煮沸によって変性させて、約1〜2x106dpm/mlハイブリダイゼーション溶液(50%ホルムアミド、6xSSC、1%SDS、15xDenhardt溶液、0.1mg/ml剪断サケ精子DNA)の濃度において用いる。ハイブリダイゼーションを42℃において少なくとも約24時間行なって、次に、メンブランを中程度のストリンジェント条件(即ち、0.3xSSC/0.1%SDS、55℃)下で洗浄する。CycloneTM Storage Phosphor Systemを用いた、OptiQuantTM,バージョン3.15ソフトウェア(Packard Instrument Corporation,Meriden,CT)によるリン光イメージング(phosphorimaging)によってハイブリダイゼーション・シグナルを検出して、定量する。次に、試験作用剤によって処理した細胞におけるIGF−II発現を、アンドロゲン受容体アゴニストを含有しない非処理対照サンプルにおけるIGF−II発現と比較する。試験作用剤が対照サンプルに比べてIGF−II発現レベルを検出可能に増加させるならば、該試験作用剤はアンドロゲン受容体アゴニストとして陽性の試験結果になると考えられる。好ましくは、このような増加は対象に比べて少なくとも約2倍の増加、より好ましくは、対照に比べて少なくとも約3倍の増加である。
【0066】
本発明のスクリーニング方法の他の実施態様では、試験作用剤をIGFBP’sとして知られるファミリーのタンパク質のいずれか、好ましくはIGFBP4の発現に対するその効果に基づいて評価することができる。IGFsの生物学的活性はIGFBP’sとして知られるファミリーの高アフィニティ結合タンパク質によってモジュレートされる。IGFBP4が筋芽細胞におけるIGF−Iの作用を阻害することは判明している(McCusker,R.とD.Clemmons(1994))。骨格筋IGFBP4 RNAレベルはアンドロゲン受容体アゴニスト、テストステロンによってIGF−Iとは反対の方法で調節される(Urban,R.,Y.Bondenburg等(1986))。スクリーニング方法の実施では、本発明の細胞を増殖させ、IGF発現の測定方法と実質的に同じ方法で、RNAを単離し、分離して、ブロットする。任意のIGFBPをこのスクリーニング方法のためのプローブとして用いることができる。プローブがIGFBP4であることが好ましい。ラットIGFBP4のコーディング領域からの469bpフラグメントを、鋳型としてラット骨格筋ポリA+RNAを用い、フォワードプライマーとして5’−GGCGACGAAGCCATCCACTG−3’を用い、リバースプライマーとして5’−CCCGGTGCAGCTCACTCTGG−3’を用いて逆転写ポリメラーゼ連鎖反応によってプローブとして調製することができる。該プローブの変性及びハイブリダイゼーションと、ハイブリダイゼーション・シグナルの検出とはIGF発現の測定方法と実質的に同じ方法で行なうことができる。次に、試験作用剤によって処理した細胞におけるIGFBP4発現をアンドロゲン受容体アゴニストを含有しない非処理対照サンプルにおけるIGFBP4発現と比較する。試験作用剤が対照サンプルに比べて、IGFBP4発現レベルを検出可能に減少させるならば、該試験作用剤はアンドロゲン受容体アゴニストとして陽性の試験結果になると考えられる。好ましくは、このような減少は対照に比べて少なくとも約50%、より好ましくは、対照に比べて少なくとも約70%である。
【0067】
本発明のスクリーニング方法における活性に関して試験し、及び/又は特徴付けすべき試験作用剤を、好ましくは、約0.001nM〜約10,000nMの範囲である濃度範囲において試験する。
【0068】
本発明のスクリーニング方法がアンドロゲン受容体アゴニストの同定及び/又は特徴付けに、並びにアンドロゲン受容体アンタゴニストである作用剤の同定及び/又は特徴付けに使用可能であることは、この開示に基づいて、当業者に明らかであろう。例えば、本発明の方法のいずれも、可能なアンドロゲン受容体アンタゴニスト活性を有する作用剤を試験するために既知アンドロゲン受容体アゴニストと共に用いることができる。スクリーニング方法の実施において期待される陽性結果の減少は、未知作用剤がアンドロゲン受容体アンタゴニストであることを示唆しうる。例えば、上述したような、本発明の細胞におけるチミジン取り込みに基づく本発明のスクリーニング方法では、アンドロゲン受容体アゴニストによって生じるチミジン取り込み阻害効果を、アンタゴニストが抑制する。
【0069】
本明細書に引用した、全ての特許、出願、刊行物及び資料、例えば、パンフレット又は技術公報(technical bulletin)の開示はそれらの全体において本明細書に援用される。
【0070】
当業者は、実施例、図面、配列一覧表及び特許請求の範囲を包含する本願の記載を用いて、本発明をその完全な程度まで利用することができると考えられる。以下の実施例は本発明の実施の単なる例示と見なされるべきであり、この開示の残りの部分を如何なる意味でも少しでも限定するものと見なすべきではない。
【0071】
【実施例】
実施例
実施例1は、ヒトアンドロゲン受容体を過度発現する哺乳動物細胞系の調製を提供する。実施例2は、[3H]−チミジン取り込みアッセイにおいてアンドロゲン受容体を過度発現する筋芽細胞系の細胞増殖に対するアンドロゲンの効果を例示する。実施例3は、アンドロゲン受容体を過度発現する細胞における筋芽細胞分化に対するアンドロゲンの効果を細胞周期における変化に従って例示する。実施例4は、筋管形成に対するアンドロゲンの効果を例示する。実施例5はinvitro筋形成中のタンパク質蓄積に対するアンドロゲンの効果を例示する。実施例6は、アンドロゲン受容体を過度発現する筋芽細胞におけるIGF−II及びIGFBP4遺伝子発現に対するアンドロゲンの効果を例示する。実施例7は、アポトーシスに対するアンドロゲン処理の効果を例示する。
【0072】
実施例1
ヒトアンドロゲン受容体を過度発現する哺乳動物細胞
A.発現ベクターの調製
哺乳動物細胞におけるヒトアンドロゲン受容体の発現を可能にするプラスミドを標準組換えDNAクローニング手法によって生成した。ヒトアンドロゲン受容体のための2577−bpヒトアンドロゲン受容体コーディング配列(Genbank Accession No.M23263)を含有するDNAフラグメントをpBI−EGFP Tetベクター(Clontech,Cat.#6154−1,Palo Alto,CA)の固有Pvull部位中にライゲートした。得られた発現ベクターを大腸菌株DH5α(Life Technologies)中に形質転換して、増幅させた。得られたクローンを、クローニング結合(cloning junctions)を包含する領域の制限マッピングとDNA塩基配列決定とに基づいて、選択して、それらが発現のための適当な部位及びオリエンテーションで完全なヒトアンドロゲン受容体コーディング配列を含有することを発見した。
【0073】
B.細胞の調製
ヒトアンドロゲン受容体含有発現ベクターを包含する全てのプラスミドDNAをマウス筋肉由来C2C12細胞(YaffeとSaxel(1977);ATCC No.CRL−1772)中に、トランスフェクション試薬、LipofectamineTM(Life Technologies)を用いて、製造者の薦める方法及び条件に従って導入した。C2C12細胞に最初にTet−OnTMベクター(Clontech,Palo Alto,CA)を製造者の指示に従い、LipofectamineTMを用いてトランスフェクトして、逆テトラサイクリン調節トランス作用因子タンパク質を発現する細胞系を生成した。得られた細胞を15%ウシ胎仔血清(Gemini Bio−Products)と10pM塩基性線維芽細胞増殖因子(Collaborative Biomedical Products)とを補充した、1.5g/Lグルコース含有Dulbecco改変Eagle培地(DMEM−LG,Life Technologies)から成る高マイトジェン増殖培地中で増殖させた。得られたクローン(抗生物質G418に対する耐性を有する)の幾つかを、それらがTRE2−Lucレポーター遺伝子(Clontech,Palo Alto,CA)の発現をテトラサイクリン依存的に調節することができるかに関して評価した。1つの高応答クローンに対して、選択ベクターとしてのヒトアンドロゲン受容体含有発現ベクタープラスpTK−hyg(Clontech,Palo Alto,CA)による第2ラウンドのトランスフェクションを行なった。得られたトランスフェクト済み細胞プールを414〜517U/mlヒグロマイシンB(Calbiochem)の存在下での増殖に関して選択した。
【0074】
C.ヒトアンドロゲン受容体の発現の確認
ヒグロマイシン耐性プールを高レベルのヒトアンドロゲン受容体mRNAを有するクローンに関してNorthernブロット分析によってスクリーニングすることによって、“C2hAR57”と表示される細胞系を同定した。50〜70%集密度培養からTrizol(登録商標)(Life Technologies)を用いて製造者のプロトコールに従って、総RNAを単離した。20μgの総RNAを含有するサンプルをホルムアルデヒド含有アガロースゲル上での電気泳動によって分離し、Duralon−UVTMナイロンメンブラン(Stratagene,La Jolla,CA)に5xSSPE中での毛管ブロッティングによって移し、全イヌアンドロゲン受容体タンパク質コーディング領域に及ぶ32P標識DNAフラグメントにハイブリダイズさせた(Lu,B.,S.Smock等(2001))。ハイブリダイゼーション後に、55℃において0.3xSSC/0.1%SDS中でブロットを洗浄して、ストリンジェント性を緩和した。アンドロゲン受容体転写体(transcripts)をリン光イメージング(CycloneTM Storage Phosphor System,Packard Instrument Corporation)によって検出した。Northernブロット分析において、3.0−kbハイブリダイジング帯がC2hAR57細胞からのRNA中では検出されたが、C2C12細胞では検出されなかったので、C2hAR57中でのアンドロゲン受容体発現が確認された。
【0075】
D.アンドロゲン受容体の過度発現の確認
結合バッファー(50mM Hepes pH7.2、1.5mM EDTA、5mM DTT、10mM NaF、10mM Na2MoO4、10%グリセロール、0.1mg/mlバシトラシン、及び1mM Pefabloc;7.5μl/cm2)中でのC2hAR57細胞の超音波処理によって、細胞抽出物を調製した。該抽出物を遠心分離して(10,000xg、10分間、4℃)、得られた上清を液体窒素中で凍結させ、−80℃において貯蔵した。解凍時に、該抽出物を結合バッファーによって希釈して、10mg/mlの総タンパク質を得た。10μlの細胞抽出物と、1nMの[1,2,4,5,6,7−3H(N)]−5α−アンドロスタン−17β−オール−3−オン([3H]−DHT,110キューリー/mM,New England Nuclear)プラス0、0.5、1、2、4、8、16、32、64又は2000nM非標識DHTを含有する0.2mlの量で、結合反応を4℃において1時間行なった。アンドロゲン受容体−リガンド複合体を4℃において1時間かけて形成させてから、ヒドロキシルアパタイト含有96穴プレート式フィルター(96−well plate format filters)(MultiScreen,Millipore,Bedford,MA)上に捕捉した。プレートを結合バッファーによって3回洗浄して、結合した放射能をシンチレーション計数によって定量した。表Iと図1における結果は、C2hAR抽出物への[3H]−DHTの結合が特異的であることを示す。図1の挿入図に示す、結合データの飽和可能なScatchard分析は、単一クラスの結合部位及び1.15nMの解離定数(Kd=−1/勾配)による11.4フェムトモル/mgタンパク質の受容体アバンダンス(receptor abundance)と一致した。Scatchardプロット分析の説明に関しては、Hulme,E.C.e.(1992)69頁を参照のこと。これとは対照的に、トランスフェクトされないC2C12細胞からの細胞抽出物への[3H]−DHTの特異的結合(specific binding)は実証することはできなかったので、これは、このアッセイの検出下限である、2.2フェムトモルのアンドロゲン受容体/mgタンパク質より小さいと推定される。
【0076】
表I.C2hAR抽出物への[3H]−DHTの結合
【表1】
【0077】
さらに、間接免疫蛍光を用いて、アンドロゲン受容体発現を確認した。C2hAR57細胞をポリ−D−リシン被覆ガラス・チャンバ・スライド(glass chamber slides)(Lab−Tek,Nunc,Naperville,IL)上で培養し、100nM DHTによって2時間処理し、次に、リン酸塩緩衝化生理食塩水によってすすぎ洗いして、0.1Mリン酸ナトリウム、pH7.4中2%パラホルムアルデヒドを用いて室温において15分間固定した。以後の工程も室温において行なった。0.1%Triton X−100を用いて、細胞を10分間浸透性化してから、0.1%ウシ血清アルブミンを含むDulbeccoリン酸塩緩衝化生理食塩水(PBS/BSA)(Sigma−Aldrich)中に5%正常ロバ血清(Jackson Immunoresearch Laboratories,West Grove,PA)を含有するブロッキング溶液(blocking solution)中で20分間インキュベートした。ポリクローナル・ウサギ抗アンドロゲン受容体抗血清(PA1−111,Affinity Bioreagents,Golden,CO)をブロッキング溶液中4μg/mlの濃度においてスライド上で1時間インキュベートし、続いてCy3−複合(conjugated)抗ウサギ免疫グロブリンG(1:5000,Jackson ImmunoResearch Laboratories)も1時間インキュベートした。Olympus BH−2蛍光顕微鏡上でローダミン・フィルターによって免疫蛍光を可視化した(図2B、2D及び2F参照)。さらに、同じフィールドを位相差照明下でも撮影した(図2A、2C及び2E参照)。アンドロゲン受容体免疫蛍光が大部分のC2hAR57細胞において、主として細胞核に局在して検出された。一次抗体を省略した場合には、免疫蛍光は存在しなかった。上記手段を用いたDHT処理C2C12細胞では、暴露時間を増加した場合にさえも、核蛍光は殆ど見られなかった。
【0078】
したがって、実施例1は、アンドロゲン受容体を過度発現する哺乳動物骨格筋筋芽細胞の調製を例示する。
【0079】
E.C2hAR57細胞の寄託
細胞系、C2hAR57はAmerican Type Tissue Culture Collection(ATCC)、Manassas,VA ATCCに寄託され、Patent Deposit Designation、PTA−4126を与えられた。寄託された細胞系は、特許手続きのための微生物寄託についての国際的認識に基づくブタペスト条約下での寄託のために、2002年3月6日にATCCによって受理された。このように寄託された細胞系の公衆への利用可能性に対する全ての制限は、特許の付与時に、適切な場合には、決定的に除去される。
【0080】
実施例2
本発明の筋細胞を用いた[ 3 H]−チミジン取り込みアッセイ
実施例1によって調製したC2hAR57細胞を96穴組織培養プレート(Costar,Corning,NY)に1000細胞/穴で、15%ウシ胎仔血清を補充したDMEM−LG(Gemini Bio−Products)を用いてプレーティングして、5%CO2/95%空気中、37℃において一晩インキュベートした。翌日、培地を、試験作用剤、DHT、オキサンドロロン、テストステロン、スタノゾロール、2−ヒドロキシフルタミド、17β−エストラジオール及びプロゲステロンを含有する培地と交換した。試験作用剤に48時間暴露させた後に、0.1μCi[3H]−チミジン(82Ci/mmol,Amersham,Buckinghamshire,UK)/穴を含有する培地を加え、インキュベーションを37℃においてさらに2時間続けた。培養培地を吸引して、氷冷リン酸塩緩衝化生理食塩水によって、続いて5%トリクロロ酢酸によって洗浄することによって、アッセイを終了させた。次に、0.3N NaOH(75μl/穴)を加え、続いて、NaOHを中和するために0.3N HCl(75μl/穴)を加えることによって、細胞を溶解した。50μlアリコート中の放射能を、TopCountTMシンチレーション・カウンター(Packard Instrument Corporation)を用いた96穴プレート(Packard Instrument Corporation)中での液体シンチレーション計数によって測定した。天然アンドロゲン(テストステロン及びDHT)並びに合成アンドロゲン(オキサンドロロン及びスタノゾロール)が全て、C2hAR57細胞による[3H]−チミジン取り込みに対して用量依存性の阻害効果を示した(図4参照)。1μMまでの濃度はC2C12細胞に殆ど効果を及ぼさなかった(図5参照)。[3H]−チミジン取り込みの阻害に対するこれら4種類のアンドロゲンの効力順序(rank order potency)は、アンドロゲン受容体に対するそれらの既知アフィニティと一致した(DHT、スタノゾロール、テストステロン及びオキサンドロロンに関してIC50は、それぞれ、3.5nM、4.4nM、8.6nM及び28.4nMである)。さらに、0.1nM DHTによる阻害を、アンドロゲン・アンタゴニスト2−ヒドロキシフルタミドの同時添加によって完全に逆転させることができた(図6参照)。
【0081】
したがって、実施例2は、[3H]−チミジン取り込みレベルの変化によって例証されるような、細胞増殖レベルの変化を用いて、アンドロゲン受容体アゴニスト及びアンタゴニストを同定し、特徴付けるための本発明の細胞の使用を実証する。
【0082】
実施例3
本発明の筋細胞の細胞周期の変化のアッセイ
細胞周期の各期におけるC2hAR57細胞のパーセンテージを、Krishan,A.(1975)に従ったヨウ化プロピジウムによる染色後のフローサイトメトリーによって測定した。実施例1によって調製したC2hAR57細胞を高マイトジェン増殖培地に低密度でプレーティングした。100nM DHT又はビヒクルによる24時間及び48時間の処理(これらの時間中に、細胞が30%集密度を越えることは決してなかった)後に、細胞をトリプシン化によって回収し、リン酸塩緩衝化生理食塩水中の70%エタノール中に−20℃において少なくとも2時間再懸濁させた。各細胞サンプルを低速度遠心分離によってペレット化して、100μg/mlのリボヌクレアーゼAと20μg/mlのヨウ化プロピジウムを含有する0.5mlリン酸塩緩衝化生理食塩水中に室温において30分間再懸濁させた。正常前方/側方分散比率(forward/side scatter ratio)を示す細胞をそれらのヨウ化プロピジウム蛍光の分析のために選択し、アルゴンレーザー(488nm 発光波長)とModfitTMソフトウェア(BectonDickinson Immunocytometry Systems,San Jose,CA)とを装備したFACScanTMフローサイトメーターを用いて、104イベント/サンプルを記録した。100nM DHTによる24時間又は48時間のC2hAR57細胞の処理はG0−G1画分を高めた(以下の表II参照)。S及びG2−M画分の同時減少が24時間目に観察され(p<0.05)、48時間後に同じ方向の傾向が観察された(p<0.1)。細胞周期の各期におけるC2C12細胞の画分はビヒクル処理C2hAR57培養の場合と同様であり、100nM DHTによって影響されなかった。
【0083】
したがって、細胞の増殖レベルの変化の測定によってアンドロゲン受容体アゴニスト及びアンタゴニストを同定し、特徴付けるための本発明の細胞の使用の実証において、実施例3は実施例2に一致し、このような変化は細胞周期のG0−G1、G2−M及びS期にある細胞レベルによって判定される。
【0084】
表II.ヨウ化プロピジウム染色のフローサイトメトリー分析による細胞周期の一定の期における細胞のパーセンテージ
数値は反復培養(N=4又は5)の平均値+SEMである。★P<0.1、★★P<0.05、★★★P<0.005(ビヒクルに対比して)
【表2】
【0085】
実施例4
本発明の筋細胞における筋管形成のアッセイ
実施例1によって調製したC2hAR57細胞を高マイトジェン増殖培地において50〜70%集密度に達しさせて、次に、培地を2%ウマ血清を補充したDulbecco改変Eagle培地(“融合培地”)に切り替えた。融合培地を毎日交換した。高マイトジェン増殖培地中の低密度のC2hAR57細胞は小さい付着単核細胞として出現した。融合培地への切り替えの3日間以内に、単核筋芽細胞の大部分は融合して、細長い多核筋管を形成した。100nM DHTに暴露させたC2hAR57の培養では外因性アンドロゲンの不存在下で培養したものに比べて、より迅速に筋管が形成された。このことは、図3に示すように、融合培地中では1、2又は3日間後の培養物中で容易に観察される。これとは対照的に、C2C12の培養物では、筋管形成の速度も程度もDHTの添加によって可視的に影響されなかった。
【0086】
したがって、実施例4は、筋管形成の速度の変化によって例証されるような、細胞の分化レベルの変化によってアンドロゲン受容体アゴニスト及びアンタゴニストを同定し、特徴付けるための本発明の細胞の使用を実証する。
【0087】
実施例5
分化する筋管中のタンパク質含量のアッセイ
手段A−融合培地中で3日間。C2hAR57細胞を12穴組織培養プレート(Costar,Corning,NY)において高マイトジェン増殖培地中4x104細胞/穴でプレーティングした。24時間後に、培地を無ステロイド増殖培地(15%チャーコール−デキストラン処理ウシ胎仔血清+10pM塩基性線維芽細胞増殖因子を含むDMEM)と交換した。38時間後に、ビヒクル(0.1%ジメチルスルホキシド)又はDHT(10−12〜10−6M)を加えた。少なくとも48時間後に、培養物が50%集密度を越えるまでに達したときに、培地を前記と同じ濃度のDHTを含む融合培地に切り替えた。融合培地での3日間後の培養物から、上記実施例2で述べたような、結合バッファー(0.125ml/cm2)中での溶解、超音波処理及び遠心分離によって細胞抽出物を調製した。上清画分中でのCoomassie Blueダイ結合方法(Bradford,M.(1976)Anal Biochem.72,248−54)によって、タンパク質濃度を測定した。表IIIに示すように、DHTによって処理された分化するC2hAR57培養物では、71%までの総タンパク質含量の用量関連増加が見られたが、同様に処理されたC2C12培養物では一貫した変化(consistent change)は存在しなかった。全体として、C2hAR57培養物中の低いタンパク質含量は、これらの培養物が融合培地に切り替えられた時点でのこれらの培養物の低い密度を反映する。
【0088】
表III.融合培地での3日間後のタンパク質含量(μg)/穴(手段A)
括弧内の数値はビヒクルとのパーセンテージ差である。
【表3】
【0089】
手段B−融合培地中で24時間。完全血清+ビヒクル(0.1%ジメチルスルホキシド)又はDHT(10−12〜10−6M)を含有する高マイトジェン増殖培地中で低密度において、C2hAR57細胞を48時間培養してから、トリプシン化して、前記と同じ濃度のDHTを含む12穴組織培養プレートに5x105細胞/穴において再プレーティングした(replated)。再プレーティング(0日目)後1日目に、タンパク質測定のために1セットの培養物から細胞抽出物を調製し、控えのセットを融合培地に切り替えて、DHT処理を続けた。融合培地における24時間(0日目)後の培養物の第2セットから細胞抽出物を調製した。1日目の平均タンパク質含量から0日目の各処理に関する平均タンパク質含量を控除することによって、タンパク質含量の変化を算出した。ビヒクルによって処理した分化する培養物はタンパク質の正味損失を示した、この正味損失は、表IVに示すように、増加する濃度のDHTによって処理した培養物では軽減され、逆転さえした。
【0090】
表IV.融合培地における24時間中のC2hAR57培養物のタンパク質含量の正味変化(手段B)
【表4】
【0091】
したがって、実施例5は、細胞分化レベルの変化を用いてアンドロゲン受容体アゴニスト及びアンタゴニストを同定し、特徴付けるための本発明の細胞の使用の実証において、実施例4と一致する、この場合このような変化は細胞中のタンパク質含量のレベルに従って測定される。
【0092】
実施例6
アンドロゲン受容体を過度発現する細胞におけるIGF−II及びIGFBP4遺伝子発現のアッセイ
C2C12細胞及びC2hAR57細胞を、ビヒクル(0.1%DMSO)又は100nM DHTを含む高マイトジェン増殖培地中に4日間増殖する筋芽細胞の培養物として維持し、次に、高密度(>70%集密度)に達しさせてから、融合培地に切り替えた。分化の誘導の直前に、0日目サンプルを回収した。融合培地における1日、2日、3日又は5日間(ビヒクル又はDHTの添加を続けながら)後に、追加のサンプルを回収した。Trizol(登録商標)を用いて、総RNAを単離し、UV分光法によってRNA濃度を測定した。20μgの総RNAを含有するサンプルをホルムアルデヒド含有アガロースゲル上での電気泳動によって分離して、5xSSPE中での毛管ブロッティングによってDuralon−UVTMナイロン・メンブラン(Stratagene,La Jolla,CA)に移し、IGFBP4、IGF−II及び18SリボソームRNAに関して連続的に検査した。鋳型としてラット骨格筋ポリA+ RNAを用いて、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応によって、プローブとして用いるDNAフラグメントを形成した。フォワードプライマー、5’−GGCGACGAAGCCATCCACTG−3’と、リバースプライマー、5’−CCCGGTGCAGCTCACTCTGG−3’とを用いて、ラットIGFBP4のコーディング領域からの469−bpフラグメントを増幅させた。フォワードプライマー、5’−TGTTGGTGCTTCTCATCTCTTTGG−3’と、リバースプライマー、5’−CACAGACTGATGGTACTACATTGC−3’とを用いて、ラットIGF−IIコーディング領域の大部分を包含する562−塩基対フラグメントを増幅させた(pGEM1(Promega Corporation,Madison,Wisconsin)のEcoRI及びBamHI部位にクローン化された、Soares,M.,D.Ishii等(1985)Nuc.Acids Res.13(4),1119−1134に開示された562bp部分ラットIGF−II配列参照)。フォワードプライマー、5’−ACTTTCGATGGTAGTCGCCGTGC−3’と、リバースプライマー、5’−ATCTGATCGTCTTCGAACCTCCGAとを用いて、18SrRNAをコーディングする遺伝子からの674−bpフラグメントを増幅させた。ランダムプライマー伸長によって、二本鎖32P標識プローブを合成した(Feinberg,A.とB.Vogelstein(1983)及びFeinberg,A.P.とB.Vogelstein(1984)参照)。プローブを煮沸によって変性させて、1〜2x106dpm/mlハイブリダイゼーション溶液(50%ホルムアミド、6xSSC、1%SDS、15xDenhardt溶液、0.1mg/ml剪断サケ精子DNA)の濃度において用いた。42℃における少なくとも24時間のハイブリダイゼーション後に、メンブランを0.3xSSC/0.1%SDSによって55℃において洗浄して、ストリンジェント性を緩和した。CycloneTM Storage Phosphor Systemを用いた、OptiQuantTM,バージョン3.15ソフトウェア(Packard Instrument Corporation)によるリン光イメージングによってハイブリダイゼーション・シグナルを検出して、定量した。連続的な検査の間に、メンブランを5mM TrisHCl、pH8、0.2mM Na2EDTA、0.05%ピロリン酸ナトリウム及び0.1xDenhard溶液から成る溶液中で70℃において1〜3時間インキュベートすることによって、ストリップした。イメージング・プレートをIGFBP4ハイブリダイゼーションとIGF−IIハイブリダイゼーションとに、それぞれ、42時間と90分間暴露した。18Sシグナルを用いて、他のプローブの各々からのハイブリダイゼーション・シグナルを標準化した。
【0093】
図8はNorthernブロット分析の結果を示す。DHTはC2hAR57細胞中での4遺伝子全ての発現をC2C12細胞中に比べて大きく修正した。DHT処理はIGFBP4とIGF−II RNAのレベルに相反する変化を生じて、2.6−kb IGFBP4転写体のアバンダンスを減じるが、4.2−kb IGF−II転写体を刺激した。融合培地(FM)における0〜2日間後のDHTによるIGFBP4抑制の大きさは、C2hAR57細胞では75%、86%及び70%であったが、C2C12細胞では20%、51%及び44%に過ぎなかった。同じ時点において、DHTはDHT処理C2hAR57においてIGF−II転写体を10.2X、3.6X及び2X増加させたが、C2C12では0.8X、1.5X及び1.0X増加させたに過ぎなかった。
【0094】
したがって、実施例6は、細胞の分化のレベルの変化を用いてアンドロゲン受容体アゴニスト及びアンタゴニストを同定し、特徴付けるための本発明の細胞の使用の実証において、実施例4及び5と一致する、この場合、このような変化はIGF−II及びIGFBP4発現レベルによって測定される。
【0095】
実施例7
本発明の筋細胞におけるアポトーシスの分析
実施例1によって調製されたC2hAR57と、C2C12細胞との並行培養物を100mm直径円形組織培養皿(Falcon,Becton−Dickinson Labware,Franklin Lakes,NJ)において100nM DHT又はビヒクルを含む高マイトジェン増殖培地中で4日間培養してから、融合培地(前記と同様にDHT又はビヒクルを含む)に切り替えた。全ての培養物はマイトジェン取り出しの時点において約80%集密度であった。融合培地における24時間後に、非付着細胞を含有する培地を遠心分離管に移した。次に、皿をリン酸塩緩衝化生理食塩水によってすすぎ洗いして、トリプシン化によって付着細胞を回収した。遠心分離によって細胞ペレットを回収して、50mM TrisHCl、pH8、100mM Na2EDTA、0.5%ドデシル硫酸ナトリウム中で溶解した。総DNAを付着細胞画分と非付着細胞画分の両方から標準手段によって単離した(Blin,N.とD.Stafford(1976)参照)。5皿のプールからのDNA収量を260nmにおけるUV分光法によって測定した。10μg DNAに相当するアリコートをTBEバッファー中の1%アガロースゲル上での電気泳動によって分析し、UVトランスイルミネーション(transillumination)による臭化エチジウム蛍光によって可視化した。
【0096】
各細胞系及び処理からのDNAの収量を表Vに要約する。DHT処理C2hAR57培養物の非付着画分中のDNA割合(fraction)はビヒクル処理C2hAR57培養物中に見られる該割合よりも顕著に小さかった。DHT処理は、C2C12細胞系における非付着細胞の割合を感知できるほどには変えなかった。各サンプル中のDNAを、図7に示すように、アガロースゲル電気泳動によって定性的に評価した。両方のC2hAR57培養物の非付着細胞画分からのDNAは、アポトーシスを経験した細胞の特色であるような、180bpの倍数(multiples)でフラグメントの明確なラダーを示した。臭化エチジウム蛍光の相対強度に基づくと、ビヒクル処理C2hAR57サンプル中ではDHT処理サンプル中よりも大きい割合のDNAがフラグメント化したように見えた。これとは対照的に、付着細胞画分の全てと非付着C2C12細胞画分とにおけるDNAは主として高分子量(>10kb)であり、明確なフラグメント化は見られなかった。したがって、マイトジェン取り出し後24時間中に、或るパーセンテージのC2hAR57細胞が培養皿から分離して、アポトーシスを受けたように思われ、DHT処理がアポトーシス細胞の発生を約75%減少した。同じような量のDNAがC2C12培養物の非付着画分から回収されたが、このDNAはフラグメント化せず、このことは、これらの細胞がアポトーシスではないことを実証した;その上、いずれの細胞画分のDNAの収量にも質にもDHTの効果は無かった。
【0097】
表V.融合培地における24時間後の細胞培養物から回収された総DNA
【表5】
【0098】
したがって、実施例7は、マイトジェン取り出し後の細胞のアポトーシスレベルの変化によってアンドロゲン受容体アゴニスト及びアンタゴニストを同定し、特徴付けるための本発明の細胞の使用を実証する。
【0099】
参考文献
【表6】
【表7】
【表8】
【0100】
略号
“DHT”はジヒドロテストステロンを意味する。
“DNA”はデオキシリボ核酸を意味する。
“cDNA”は相補的DNAを意味する。
“nm”はナノメートルを意味する。
“nM”はナノモルを意味する。
“RNA”はリボ核酸を意味する。
“mRNA”はメッセンジャーRNAを意味する。
“UV”は紫外線を意味する。
“SDS”はドデシル硫酸ナトリウムを意味する。
“SSC”は生理食塩水塩類クエン酸塩(saline saline citrate)を意味する。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図1】図1は、C2hAR57細胞からの細胞抽出物に対する[3H]−DHTの特異性を示す。
【図2】図2Bと2Dは、それぞれ、C2C12細胞とC2hAR57細胞の免疫蛍光顕微鏡写真であり、一次抗体としてのウサギ抗アンドロゲン受容体抗血清(PA1−111)と、二次抗体としてのCy−3−複合抗ウサギ免疫グロブリンとの結合度を示す。図2Fは、二次Cy−3−抗ウサギ免疫グロブリンのみによって処理したC2hAR57細胞の免疫蛍光顕微鏡写真である。図2A、2C及び2Eは、それぞれ、2B、2D及び2Fに対応する位相差照明顕微鏡写真である。
【図3】図3は、C2C12細胞及びC2hAR57細胞における筋管形成に対するDHTの効果を示す。
【図4A】図4は、C2hAR57細胞への[3H]−チミジン取り込みに対する4種類のアンドロゲン受容体アゴニストの効果を示す。図4AはDHTの効果を示す。
【図4B】図4は、C2hAR57細胞への[3H]−チミジン取り込みに対する4種類のアンドロゲン受容体アゴニストの効果を示す。図4Bはオキサンドロロンの効果を示す。
【図4C】図4は、C2hAR57細胞への[3H]−チミジン取り込みに対する4種類のアンドロゲン受容体アゴニストの効果を示す。図4Cはテストステロンの効果を示す。
【図4D】図4は、C2hAR57細胞への[3H]−チミジン取り込みに対する4種類のアンドロゲン受容体アゴニストの効果を示す。図4Dはスタノゾロールの効果を示す。
【図5】図5は、C2C12細胞への[3H]−チミジン取り込みに対する2種類のアンドロゲン受容体アゴニストの効果を示す。
【図6】図6は、C2hAR57細胞への[3H]−チミジン取り込みに対するアンドロゲン受容体アンタゴニスト、2−ヒドロキシフルタミドの効果を示す。
【図7】図7は、C2C12細胞及びC2hAR57細胞における細胞アポトーシスに対するDHTの効果を示す。
【図8A】図8は、Northernブロット分析に基づいた、C2C12細胞及びC2hAR57細胞におけるIGF−II及びIGFBP4発現に対するDHTの効果を示す。図8AはC2C12細胞におけるIGFBP4発現に対するDHTの効果を示す。
【図8B】図8は、Northernブロット分析に基づいた、C2C12細胞及びC2hAR57細胞におけるIGF−II及びIGFBP4発現に対するDHTの効果を示す。図8BはC2C12細胞におけるIGF−II発現に対するDHTの効果を示す。
【図8C】図8は、Northernブロット分析に基づいた、C2C12細胞及びC2hAR57細胞におけるIGF−II及びIGFBP4発現に対するDHTの効果を示す。図8CはC2hAR57細胞におけるIGFBP4発現に対するDHTの効果を示す。
【図8D】図8は、Northernブロット分析に基づいた、C2C12細胞及びC2hAR57細胞におけるIGF−II及びIGFBP4発現に対するDHTの効果を示す。図8DはC2hAR57細胞におけるIGF−II発現に対するDHTの効果を示す。
【図9】図9は、挿入されたヒトアンドロゲン受容体を示すpBI−EGFP発現ベクターのマップである。
【発明が属する技術分野】
本発明は、アンドロゲン受容体を過度発現する哺乳動物骨格筋芽細胞、及びアンドロゲン受容体モジュレーターの同定及び特徴付けにおけるこのような筋芽細胞の使用に関する。
【0002】
【従来の技術】
本発明は一般に、アンドロゲン受容体を過度発現する哺乳動物骨格筋芽細胞、及びアンドロゲン受容体モジュレーターを同定し、特徴付けるためのスクリーニング方法に関する。
【0003】
哺乳動物アンドロゲン受容体は核ホルモン受容体スーパーファミリーのメンバーである。例えばテストステロンとその活性代謝産物、ジヒドロテストステロン(DHT)のようなアンドロゲンは、アンドロゲン受容体と高アフィニティで結合する。動物モデルにおいて、睾丸摘出術によるテストステロン欠乏症が雄骨格からの骨の損失を生じること、及び外因性アンドロゲンの投与がこの損失を防止するか又は失われた骨量を修復することが述べられている(HofbauerとKhosla(1999))。
【0004】
ヒトでは、骨量及び循環アンドロゲンレベルが加齢によって減少する。骨粗しょう症とテストステロンレベル減少との相関関係が報告されている(Jackson(1993))。高齢者のアンドロゲン補充が骨格に対して有益な効果を及ぼしうることも、研究が示唆している(Hofbauer等(2000))。
【0005】
米国特許第5,614,620号は、ヒトアンドロゲン受容体に関する3715塩基対ヌクレオチド配列と、734及び918アミノ酸残基の演繹された配列を開示している。米国特許第5,614,620号はまた、真核細胞及び原核細胞におけるクローン化ヒトアンドロゲン受容体遺伝子の発現を開示している。ヒトアンドロゲン受容体cDNA配列はGenbank Accession No.M34233とGenbank Accession No.M23263にも開示されている。
【0006】
国際特許出願公開第WO02/00716号は、安定に導入されたラットアンドロゲン受容体を有するC2C12マウス骨格筋細胞と、アンドロゲン受容体モジュレーターとしての化合物効力の評価における、機能的トランス活性化アッセイ(functional transactivation assay)による、これらの細胞の使用を開示している。
【0007】
アンドロゲン受容体モジュレーターを同定し、特徴付けるための迅速で、費用のかからない、信頼できる方法が必要とされている。
【0008】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の1態様は、アンドロゲン受容体、好ましくはヒトアンドロゲン受容体を過度発現する哺乳動物骨格筋芽細胞を提供する。
【0009】
本発明の他の態様は、ヒトアンドロゲン受容体をコードするポリヌクレオチド配列を含む挿入ポリヌクレオチドを含む形質転換哺乳動物骨格筋芽細胞、又は前記ポリヌクレオチド配列を含むその子孫細胞(progeny cell)を提供する。
【0010】
本発明の筋芽細胞態様の好ましい実施態様では、前記アンドロゲン受容体は、配列番号:1及び配列番号:2から選択されるポリヌクレオチド配列に高ストリンジェント条件(high stringency conditions)下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列である。より好ましい実施態様では、前記アンドロゲン受容体は配列番号:1及び配列番号:2から選択されるポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列である。さらにより好ましい実施態様では、前記アンドロゲン受容体は、配列番号:3及び配列番号:4から選択されるポリペプチド配列である。
【0011】
本発明の形質転換された哺乳動物骨格筋芽細胞態様の好ましい実施態様では、前記ポリヌクレオチド配列は、配列番号:1及び配列番号:2から選択されるポリヌクレオチド配列に高ストリンジェント条件下でハイブリダイズする。より好ましい実施態様では、前記ポリヌクレオチド配列は配列番号:1及び配列番号:2から選択される。
【0012】
本発明の筋芽細胞態様のさらなる好ましい実施態様では、前記筋芽細胞はネズミ骨格筋芽細胞である。より好ましい実施態様では、前記筋芽細胞はC2ネズミ骨格筋芽細胞系に由来する。
本発明のさらなる態様はC2hAR57細胞を提供する。
本発明の他の態様は、請求項1〜10のいずれかに記載の細胞から選択される細胞を、アンドロゲン受容体をモジュレートする作用剤によって処理する工程;及び前記細胞に対する前記作用剤の効果を評価する工程を含むスクリーニング方法を提供する。
【0013】
本発明のさらなる態様は、本発明の細胞をアンドロゲン受容体をモジュレートする作用剤によって処理する工程;及び前記細胞の持続される増殖、前記細胞の分化、前記細胞のチミジン取り込みレベル、前記細胞が細胞周期のG0若しくはG1期のいずれにあるか、前記細胞が細胞周期のG2−M若しくはS期のいずれにあるか、前記細胞の筋管形成、前記細胞のタンパク質含量のレベル、前記細胞のIGF−II発現のレベル、又は前記細胞のIGFBP4発現のレベルに対する前記作用剤の効果を評価する工程を含むスクリーニング方法を提供する。
【0014】
本発明の他の態様は、アンドロゲン受容体アゴニストを同定するためのスクリーニング方法であって、本発明の細胞を試験作用剤によって処理する工程;前記細胞の増殖に対する前記作用剤の効果を評価する工程;及び試験作用剤を下記のいずれかとして:作用剤が前記細胞の増殖を阻害若しくは防止するならば、アンドロゲン受容体アゴニストとして、又は作用剤が前記細胞の増殖を阻害も防止もしないならば、アンドロゲン受容体アゴニストでない作用剤として特徴付ける工程を含む前記方法を提供する。
【0015】
前記細胞の増殖に対する前記作用剤の効果を評価することを含む本発明のスクリーニング方法態様の好ましい実施態様では、前記細胞のチミジン取り込みを測定する方法によって、増殖の阻害又は停止が判定される。他の好ましい実施態様では、細胞が細胞周期のG0又はG1期のいずれにあるかを測定することを含む方法によって、増殖の阻害又は停止が判定される。さらなる好ましい実施態様では、細胞が細胞周期のG2−M又はS期のいずれにあるかを測定することを含む方法によって、増殖の阻害又は停止が判定される。
【0016】
本発明のさらなる態様は、アンドロゲン受容体アゴニストを同定するためのスクリーニング方法であって、本発明の細胞を試験作用剤によって処理する工程;前記細胞の分化に対する前記作用剤の効果を評価する工程;及び試験作用剤を下記のいずれかとして:作用剤が前記細胞の分化を促進するならば、アンドロゲン受容体アゴニストとして、又は作用剤が前記細胞の分化を促進しないならば、アンドロゲン受容体アゴニストでない作用剤として特徴付ける工程を含む前記方法を提供する。
【0017】
前記細胞の分化に対する前記作用剤の効果を評価することを含む本発明のスクリーニング方法態様の好ましい実施態様では、前記細胞の筋管形成を測定することを含む方法によって、前記細胞の分化の促進が判定される。他の好ましい実施態様では、前記細胞のタンパク質含量レベルを測定することを含む方法によって、前記細胞の分化の促進が判定される。さらに他の好ましい実施態様では、前記細胞のIGF−II発現レベルを測定することを含む方法によって、前記細胞の分化の促進が判定される。さらなる好ましい実施態様では、前記細胞のIGFBP4発現レベルを測定することを含む方法によって、前記細胞の分化の促進が判定される。
【0018】
本発明のさらなる態様は、アンドロゲン受容体アゴニストを同定するためのスクリーニング方法であって、本発明の細胞を試験作用剤とマイトジェンによって処理する工程;前記マイトジェンを取り出す工程;前記マイトジェン取り出しの結果としてのアポトーシスに対する前記作用剤の効果を評価する工程;及び試験作用剤を下記のいずれかとして:作用剤が前記細胞のアポトーシスを阻害若しくは防止するならば、アンドロゲン受容体アゴニストとして、又は作用剤が前記細胞のアポトーシスを阻害も防止もしないならば、アンドロゲン受容体アゴニストでない作用剤として特徴付ける工程を含む前記スクリーニング方法を提供する。
【0019】
本発明の他の態様は、アンドロゲン受容体アンタゴニストを同定するためのスクリーニング方法であって、本発明の細胞をアンドロゲン受容体アゴニストと試験作用剤とによって処理する工程;及び前記細胞の持続される増殖、前記細胞の分化、前記細胞のチミジン取り込みレベル、前記細胞が細胞周期のG0若しくはG1期のいずれにあるか、前記細胞が細胞周期のG2−M若しくはS期のいずれにあるか、前記細胞の筋管形成、前記細胞のタンパク質含量のレベル、前記細胞のIGF−II発現のレベル、又は前記細胞のIGFBP4発現のレベルに対する前記作用剤の効果を評価する工程を含む前記スクリーニング方法を提供する。
【0020】
本発明のさらに他の態様は、アンドロゲン受容体アンタゴニストを同定するためのスクリーニング方法であって、本発明の細胞をマイトジェン、アンドロゲン受容体アゴニスト及び試験作用剤によって処理する工程;前記マイトジェンを取り出す工程;及び細胞のアポトーシスに対する前記作用剤の効果を評価する工程を含む前記スクリーニング方法を提供する。
アンドロゲン受容体アゴニストを同定する及び/又は特徴付けるための本発明のスクリーニング方法の好ましい実施態様では、アンドロゲン受容体をアゴナイズする(agonize)ために充分な量の試験作用剤によって、本発明の細胞を処理する。
【0021】
アンドロゲン受容体アンタゴニストを同定する及び/又は特徴付けるための本発明のスクリーニング方法の好ましい実施態様では、本発明の細胞をアンドロゲン受容体をアゴナイズするために充分な量のアンドロゲン受容体アゴニストによって処理し、前記細胞をアンドロゲン受容体をアンタゴナイズする(antagonize)ために充分な量の試験作用剤によって処理する。
【0022】
本発明の細胞をマイトジェンによって処理する、本発明のスクリーニング方法の好ましい実施態様では、細胞を有糸分裂又は細胞増殖を刺激するために充分な量の前記マイトジェンによって処理する。
【0023】
本発明の細胞をマイトジェンによって処理してから、マイトジェンを取り出す本発明のスクリーニング方法の好ましい実施態様では、前記細胞の有糸分裂又は細胞増殖の速度を低下させるために充分な量だけ、前記マイトジェンを取り出す。
本発明のさらなる態様は、骨量の損失を特徴とする状態又は疾患の治療方法であって、本発明のスクリーニング方法によって同定された作用剤のアンドロゲン受容体アゴナイジング量(androgen receptor agonizing amount)をそれを必要とする対象、好ましくはヒトに投与することを含む前記治療方法を提供する。
【0024】
本発明のさらなる態様は、筋肉量の損失と筋肉衰弱とを特徴とする状態又は疾患の治療方法であって、本発明のスクリーニング方法によって同定された作用剤のアンドロゲン受容体アゴナイジング量をそれを必要とする対象、好ましくはヒトに投与することを含む前記治療方法を提供する。
【0025】
他に定義しない限り、本明細書で用いる技術的及び科学的用語の全ては、本発明が属する技術分野の通常に熟練した人によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に開示したものと同様な又は同等な、如何なる装置、物質及び方法を本発明を実施する又は試験するために用いることができるとしても、好ましい装置、物質及び方法を次に説明する。本明細書に挙げる全ての刊行物は、これらの刊行物中に報告され、本発明に関連して用いられうる細胞系、プロトコール、試薬及びベクターを説明し、開示するために引用される。本明細書における何物も、本発明が先行発明によるこのような開示に先んずる権利を与えられていないとの容認として、解釈されるべきではない。
【0026】
“アゴニスト”は、アンドロゲン受容体を活性化するか又はアンドロゲン受容体の生物学的活性を強化する作用剤を意味する。“アンドロゲン受容体アゴニスト”なる用語は、“アンドロゲン”なる用語の同意語として用いられる。“アゴナイズする(agonize)”という動詞は、アゴニストによるアンドロゲン受容体の活性化又はアンドロゲン受容体の生物学的活性の強化を意味する。より好ましくは、アゴニストは、10,000nM以下の濃度において、アンドロゲン受容体をDHTの最大有効用量の少なくとも約1%、より好ましくは約5%、さらにより好ましくは約10%、特により好ましくは約25%だけ活性化する作用剤である。アゴニストは、アンドロゲン受容体と直接相互作用することによって又はアンドロゲン受容体が関与する生物学的経路の要素(components)に作用することによってアンドロゲン受容体の活性をモジュレートする、タンパク質、核酸、炭水化物、小分子又は任意の他の作用剤を包含しうる。DHTの最大有効用量は、それを超えた場合に、観察される反応の大きさを高めることができない用量である。最大有効用量が、反応の測定に用いられる方法及び、妥当な場合には、反応の測定に用いられる、細胞の種類及び/又はアンドロゲン受容体発現レベルを包含する多くの要因に依存することを、当業者は認識するであろう。
【0027】
“アンタゴニスト”は、哺乳動物骨格筋細胞のアンドロゲン受容体の生物学的活性を阻害するか又は弱める作用剤を意味する。好ましくは、アンタゴニストは、10,000nM以下の濃度において、DHTの最大有効用量に暴露された哺乳動物骨格筋細胞のアンドロゲン受容体の生物学的活性を少なくとも約1%、より好ましくは約5%、さらにより好ましくは約10%、特により好ましくは約25%だけ阻害するか又は弱める作用剤である。“アンタゴナイズする(antagonize)”という動詞は、アンタゴニストによるアンドロゲン受容体の生物学的活性の阻害又は弱化を意味する。アンタゴニストは、アンドロゲン受容体と直接相互作用することによって又はアンドロゲン受容体が関与する生物学的経路の要素に作用することによってアンドロゲン受容体の活性をモジュレートする、タンパク質、核酸、炭水化物、小分子又は任意の他の作用剤を包含しうる。アンタゴニストはまた、アゴニストがアンドロゲン受容体活性をモジュレートするのをブロック又は防止する作用剤を包含しうる。
【0028】
“ハイブリダイゼーション”は、ポリヌクレオチド鎖が一定のハイブリダイゼーション条件下で塩基対合によって相補的鎖とアニールするプロセスを意味する。特異的ハイブリダイゼーションは、2つの核酸配列が高度なアイデンティティを共有することの表示である。特異的ハイブリダイゼーション複合体は、許容アニーリング状態下で形成され、“洗浄”工程(単数又は複数)後にハイブリダイズされた状態に留まる。洗浄工程(単数又は複数)はハイブリダイゼーションプロセスのストリンジェント性(stringency)の決定において特に重要であり、条件がストリンジェントであればあるほど、非特異的結合、即ち、完全には適合しない核酸鎖対の間の結合は許容されなくなる。核酸配列のアニーリングのための許容条件は当業者によってルーチンに決定されることができ、複数のハイブリダイゼーション実験間で一致することができる、然るに、洗浄条件は所望のストリンジェント性に、それ故ハイブリダイゼーション特異性に達するように実験間で変えることができる。許容アニーリング条件は例えば68℃において約6xSSC、約1%(w/v)SDS及び約100μg/ml変性サケ精子DNAの存在下で生じる。
【0029】
一般に、ハイブリダイゼーションのストリンジェント性は一部は、洗浄工程が実施される温度に関連して表現される。一般に、このような洗浄温度は、一定のイオン強度及びpHにおいて、特異的配列の熱融解点(Tm)よりも約5℃〜20℃低いように選択される。このTmは、標的配列の50%が完全適合プローブにハイブリダイズする温度(一定のイオン強度及びpH下)である。Tmを算出するための式及び核酸ハイブリダイゼーションのための条件は周知であり、Sambrook等,1989,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版,1〜3巻,Cold Spring Harbor Press,Plainview,NYに見出されうる(2巻,9章参照)。
【0030】
“高ストリンジェント条件”は、約0.2xSSC及び約0.1%SDSの存在下、68℃、1時間の洗浄条件を包含する、本発明のポリヌクレオチド間のハイブリダイゼーションを意味する。代替え的に、約65℃、60℃、55℃又は42℃の温度を用いることができる。SDSが約0.1%で存在するときに、SSC濃度は約0.1〜2xSSCまで変化することができる。典型的には、非特異的ハイブリダイゼーションをブロックするために、ブロッキング試薬が用いられる。このようなブロッキング試薬は、例えば、約100〜200μg/mlでの変性サケ精子DNAを包含する。例えばRNA:DNAハイブリダイゼーションのためのような、特定の状況下で例えばホルムアミドのような有機溶媒を約35〜50%v/vの濃度で用いることもできる。これらの洗浄条件に関する有用な変化は当業者に容易に明らかであろう。特に高ストリンジェント条件下でのハイブリダイゼーションは、ヌクレオチド間の進化的類似性(evolutionary similarity)を示唆することができる。このような類似性はヌクレオチドとそれらにコードされるポリペプチドとの同様な役割りを強く暗示する。
【0031】
“モジュレーター”は、アンドロゲン受容体アゴニスト又はアンドロゲン受容体アンタゴニストのいずれかである作用剤を意味する。
“マイトジェン”は、筋芽細胞の有糸分裂又は細胞増殖を刺激する作用剤を意味する。例えば、ウシ胎仔血清、塩基性線維芽細胞増殖因子及び上皮増殖因子(TGF−αとしても知られる)が、筋芽細胞の有糸分裂又は細胞増殖を刺激するマイトジェンである。
【0032】
“筋芽細胞”はミオサイト(myocytes)又は筋管を包含する1つ以上の分化筋細胞を生じる(即ち、筋形成)ことができる単核未分化細胞を意味し、天然に生ずるような、又は天然若しくは人為的突然変異、DNA組換え、形質転換等によって変化されうるような細胞を包含する。
【0033】
“過度発現する”又は“過度発現”は、少なくとも約2.2フェムトモルDHT/mgタンパク質、好ましくは約5フェムトモルDHT/mgタンパク質、より好ましくは少なくとも約10フェムトモルDHT/mgタンパク質を特異的に結合するために必要なレベルよりも高いレベルでアンドロゲン受容体を発現する哺乳動物骨格筋芽細胞又は筋芽細胞系を意味し、この場合、該筋芽細胞又は筋芽細胞系は生存能力があり、アンドロゲン受容体アゴニストに暴露されたときに筋形成機能(myogenic function)を示す。筋形成機能は、例えば、筋芽細胞が高マイトジェン増殖培地から低マイトジェン縮合培地(fusion medium)に切り替えられたときに、分化筋管の形成によって例示される。高マイトジェン増殖培地と低マイトジェン縮合培地の適当な調製は、以下の(課題を実施するための手段)及び(実施例)に述べる。
【0034】
“特異的結合”又は“特異的に結合する”は、タンパク質又はペプチドと、アゴニスト、抗体、アンタゴニスト、小分子又は任意の天然若しくは合成結合組成物(natural or synthetic binding composition)との間の相互作用を意味する。この相互作用は、結合分子によって認識される、特定構造のタンパク質、例えば、抗原決定基又はエピトープの存在に依存する。例えば、抗体がエピトープ“A”に特異的である場合には、遊離の標識A及び抗体を含有する反応におけるエピトープA含有ポリペプチドの存在又は遊離の非標識Aの存在が、抗体と結合する標識Aの量を減ずる。
【0035】
“形質転換”は、外因性DNAがレシピエント細胞に侵入して、これを変化させるプロセスを表す。形質転換は、当該技術分野において、周知の種々な方法によって天然又は人為的条件下で生じることができ、場合に応じて、原核宿主細胞又は真核宿主細胞中に異種核酸配列を挿入するために、任意のこのような既知方法を用いることができる。形質転換方法は、例えば、形質転換される宿主細胞の種類に基づいて選択されることができ、非限定的に、ウイルス感染、エレクトロポレーション、熱ショック(heat shock)、リポフェクション及び粒子衝突(particle bombardment)を包含することができる。“形質転換”細胞は、挿入されたDNAが自律複製プラスミドとして又は宿主染色体の一部として複製可能である、安定に形質転換された細胞、並びに挿入されたDNA若しくはRNAを限られた期間発現する一時的形質転換細胞を包含する。
【0036】
【課題を解決するための手段】
本発明は、一部は、アンドロゲン受容体を過度発現する哺乳動物骨格筋芽細胞に関する。生物学的に活性なアンドロゲン受容体を発現するために、アンドロゲン受容体をコードする適当なヌクレオチド配列を適当な発現ベクター中に挿入することができる。本願の開示に基づいて、当業者は適当な既知方法を用いて、アンドロゲン受容体をコードする配列と、転写及び翻訳調節要素とを含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法は例えばin vitro組換えDNA手法、合成方法、及びin vivo遺伝的組換えを包含する(例えば、Sambrook,J.等(1989);Ausubel,F.M.等(2001)参照)。
【0037】
アンドロゲン受容体の挿入コーディング配列の適当な宿主における転写及び翻訳調節のための要素は、該ベクター中及びアンドロゲン受容体をコードするポリヌクレオチド配列中に例えばエンハンサー、構成及び誘導プロモーター、並びに5’及び3’非翻訳領域のような調節配列を包含しうる。当業者が理解するように、このような要素はそれらの強度及び特異性において変化する。アンドロゲン受容体をコードする配列のより効果的な翻訳を達成するために、特異的な開始シグナルを用いることもできる。このようなシグナルはATG開始コドンと、隣接配列、例えばKozak配列を包含する。アンドロゲン受容体及びその開始コドンをコードする配列と上流の調節配列とが適当な発現ベクター中に挿入される本発明を実施するために、付加的な転写又は翻訳調節シグナルが必要とされることはない。しかし、コーディング配列又はそのフラグメントのみが挿入される場合には、イン−フレームATG開始コドンを包含する外因性翻訳調節シグナルがベクターによって与えられるべきである。外因性翻訳要素と開始コドンとは種々な起源、天然と合成の両方であることができる。用いる特定の宿主細胞系のために適当なエンハンサーを含めることによって、発現効率を強化することができる(例えば、Scharf,D.等(1994)参照)。
【0038】
好ましくは、本発明の細胞の調製に用いる発現ベクターは、プロモーター領域及び/又は、エンハンサー領域に動作的に(operatively)結合するプロモーター領域(即ち、エンハンサー−プロモーター)に動作的に結合する、アンドロゲン受容体をコードするポリヌクレオチドを含む。プロモーター及びエンハンサー−プロモーターは、宿主細胞中の標的ペプチドの発現を推進しうるDNA分子の領域である。pBI−EGFP Tetベクター(Clontech,Cat.#6154−1,Palo Alto,CA)は、それぞれTet−OffTM及びTet−OnTM遺伝子発現系におけるtTA及びrtTA調節タンパク質に反応する二方向性プロモーターPbi−1を含有する。Tet−OnTM及びTet−OffTM系は、テトラサイクリン又はテトラサイクリン誘導体の種々な濃度を用いる遺伝子発現の調節を可能にする。
【0039】
本発明の細胞の調製に用いる発現ベクターは、本願の開示に基づいて、当業者に周知の標準組換えDNAクローニング手法によって調製することができる。このような発現ベクターを調製するための好ましい方法では、アンドロゲン受容体コーディング配列、好ましくは2577−bpヒトアンドロゲン受容体コーディング配列(Genbank Accession No.M23263)を含有するDNAフラグメントを、図9に示すように、pBI−EGFP Tetベクターの固有Pvull部位にライゲートする。次に、得られた発現ベクターを大腸菌株DH5α(Life Technologies,Rockville,MD)中で形質変換して、増殖させる。
【0040】
宿主哺乳動物骨格筋芽細胞株を本発明の細胞の調製に用いることができることは、本願の開示に基づいて当業者によって理解されるであろう。非限定的にL6(YaffeとSaxel(1977))、L6E9(Benoff,S.とB.N.Nadal−Ginard(1979))、L8(RichlerとYaffe(1970))、C2C12(以下参照)、MM14(LimとHauschka(1984))、G7(Christian,C.N.等(1977))、G8(Christian、C.N.等(1977))、So18(Daubas,P.等(1988))、BC3H1(Schubert,D.等(1974))、H9c2(Kimes,B.W.とB.L.Brandt(1976))、SJRH30[RMS13](Douglass等(1987))、及びP19(McBurney,M.W.等(1982))を包含する哺乳動物骨格筋芽細胞系のいずれも本発明の細胞の調製に用いることができる。本発明の細胞の調製に用いるために好ましい哺乳動物骨格筋芽細胞は、YaffeとSaxel(1977)及びBlau,H.M.,G.K.Pavlath等(1985)Science 230(4727),758−766によって述べられているネズミ筋肉由来細胞系、C2C12(American Type Tissue Culture Collection(ATCC)から入手可能、ATCC No.CRL−1772,Manassas,VA,B.Patersonによって寄贈)からのものである。
【0041】
哺乳動物骨格筋芽細胞系の調製及び使用は、当該技術分野に知られた方法に準じて、本願の記載に基づいて実施されうる。例えば、アンドロゲン受容体をコードする配列は、上記の好ましい方法によって調製される発現ベクターを用いて細胞系中に形質変換することができ、同ベクター上に又は別のベクター上に選択マーカー遺伝子を有する。形質転換方法は、非限定的に、ウイルス感染、エレクトロポレーション、熱ショック、リポフェクション、及び粒子衝突を包含することができる。アンドロゲン受容体を過度発現する細胞系を生成するために、例えばLipofectamineTM試薬(Life Technologies)を利用して、多重DNA分子による逐次トランスフェクションを用いることが好ましい。
【0042】
ベクターの導入後に、選択的培地に切り替える前に、富化培地中で例えば約1〜2日間のような適当な期間、細胞を増殖させることができる。選択マーカーの目的は、選択的作用剤に対する耐性を与えることであり、その存在は、導入された配列を上首尾に発現する細胞の増殖と回収を可能にする。本願の記載に基づいて当業者が理解するように、細胞種類に適当な組織培養手法を用いて、安定に形質転換された細胞の耐性クローンを増殖させることができる。
【0043】
形質転換細胞系を回収するために、任意の適当な選択系(“選択マーカー”)を用いることができることは、本願の記載に基づいて、当業者によってさらに理解されるであろう。これらは、非限定的に、それぞれtk−及びapr−細胞に用いるための単純ヘルペスウイルス・チミジンキナーゼ及びアデニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子を包含する(例えば、Wigler,M.等(1977);Lowy,I.等(1980)Cell 22,817−823参照)。抗代謝物質(antimetabolite)、抗生物質及び除草剤耐性も選択の根拠として用いることができる。例えば、dhfr(ジヒドロ葉酸レダクターゼ)はメトトレキセートに対する耐性を与え;neoはアミノグリコシド・ネオマイシン及びG−418に対する耐性を与え;alsとpatは、それぞれ、クロルスルフロンとホスフィノトリシン・アセチルトランスフェラーゼに対する耐性を与える(Wigler,M.等(1980);Colbere−Garapin,F.等(1981)参照)。他の選択遺伝子、例えば、代謝産物のための細胞必要条件を変化させる、trpBとhisDも述べられている(例えば、Hartman,S.C.等(1988)参照)。可視選択マーカー、例えば、アントシアニン、緑色蛍光タンパク質(Clontech,Palo Alto,CA)、βグルクロニダーゼとその基質β−グルクロニド、又はルシフェラーゼとその基質ルシフェリンを用いることができる。これらのマーカーは形質転換細胞(transformants)の同定のみならず、特定のベクター系に帰因する一過性又は安定なタンパク質発現量の定量にも用いることができる(例えば、Rhodes,C.A.(1995)参照)。
【0044】
選択マーカー遺伝子発現の有無は、場合に応じて、問題の遺伝子がさらに存在することを示唆するが、如何なるこのような場合にも、該遺伝子の存在と発現を確認することが望ましいと考えられる。例えば、アンドロゲン受容体をコードする配列を選択マーカー遺伝子配列内に挿入する場合に、アンドロゲン受容体をコードする配列を含有する形質転換哺乳動物骨格筋芽細胞を選択マーカー遺伝子機能の不存在によって同定することができる。或いは、選択マーカー遺伝子を単独プロモーターの制御下でアンドロゲン受容体をコードする配列と連結して配置することができる。本願の記載に基づいて当業者が理解するように、誘導又は選択に応じたマーカー遺伝子の発現は一般に、縦に並んだ遺伝子(tandem gene)の発現をも示唆する。
【0045】
アンドロゲン受容体をコードするヌクレオチド配列を含有し、アンドロゲン受容体ポリペプチドを過度発現する宿主哺乳動物骨格筋芽細胞は、本願の記載に基づいて、当業者に知られた多様な手段によって同定されうる。これらの手段は、非限定的に、DNA−DNA若しくはDNA−RNAハイブリダイゼーション、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅、並びにヌクレオチド若しくはアミノ酸配列の検出及び/又は定量のためのメンブラン−、溶液−及び/又はチップ−に基づくテクノロジーを包含するタンパク質バイオアッセイ又はイムノアッセイ手法を包含する。このような方法及び手法は、例えば、Ausubel,F.M.等(2001)に述べられている。
【0046】
アンドロゲン受容体の過度発現を確認するための好ましい方法は、例えばLiao,S.等(1984)に述べられているように、[3H]−DHT競合結合アッセイの使用による。アンドロゲン受容体の発現を検出し、測定するための免疫学的方法も、本発明の実施に用いるために好ましい方法である。例えば、このような方法は特異的なポリクローナル又はモノクローナル抗体の使用を包含する。このような方法は当該技術分野において周知である。このような手法の例は、酵素免疫測定法(ELISAs)、ラジオイムノアッセイ(RIAs)及び蛍光活性化セルソーティング(FACS)を包含する。これらのアッセイ及びその他のアッセイは当該技術分野において周知である(例えば、Hampton,R.等(1990);Coligan,J.E.等(1997);及びPound,J.D.(1998)参照)。
【0047】
本発明の筋芽細胞の調製には、任意の哺乳動物アンドロゲン受容体を用いることができる。本発明に有用なアンドロゲン受容体は種々な哺乳動物種から単離することができる。ラット・アンドロゲン受容体はGenbank Accession No.M23264とJO5454に並びにChang等(1988),324−326によって述べられている。マウス・アンドロゲン受容体はGenbank Accession No.M37890に並びにGaspar等(1991)及びHe等(1990)によって述べられている。ハムスター・アンドロゲン受容体はShiba等(2001)によって述べられている。イヌ・アンドロゲン受容体はLu,B.,S.Smock等(2001)に述べられている。ヒトアンドロゲン受容体はGenbank Accession No.M34233及びGenbank Accession No.M23263に述べられている。
【0048】
本発明の筋芽細胞の調製に用いられる哺乳動物アンドロゲン受容体は、アンドロゲン受容体が本発明の細胞中で発現され、アンドロゲン受容体モジュレーターに暴露されたときに、Genbank Accession No.M23263に述べられるヒトアンドロゲン受容体と実質的に同様に本発明の細胞において生物学的に機能する限り、それをコードするアミノ酸配列又はヌクレオチド配列の長さ又はアイデンティティに関して変化しうる。
【0049】
本発明の好ましい実施態様では、アンドロゲン受容体コーディング配列、好ましくはヒトアンドロゲン受容体コーディング配列(Genbank Accession No.M23263)を含有する発現ベクターを用いて、アンドロゲン受容体を過度発現する哺乳動物骨格筋芽細胞を結果として得る、本願の開示に基づいて、当業者に知られた方法で形質転換される宿主細胞として、ネズミ筋肉由来細胞系、C2C12(ATCC No.CRL−1772)を用いて、本発明の筋芽細胞が本願の開示に基づいて、当業者に知られた方法に従って調製される。本発明の好ましい細胞は、C2hAR57と表示される細胞系の細胞である。
【0050】
本発明の細胞は、アンドロゲン受容体のモジュレーターである作用剤の同定のために特に有用である。このような同定に用いられる方法は、細胞の増殖のレベル及び/若しくは速度、細胞の分化のレベル及び/若しくは速度、並びに/又は細胞のアポトーシスのレベル及び/若しくは速度を包含する、このような細胞における変化の検出に基づく。それ故、好ましくは、このような細胞を15%ウシ胎仔血清(Gemini Bio−Products,Calabasas,CA)と10pM塩基性線維芽細胞増殖因子(Collaborative Biomedical Products,Bedford,MA)とを補充したDulbecco改変Eagle培地(Life Technologies)の高マイトジェン増殖培地中で増殖させることによって、細胞を増殖する未分化状態に維持することが特に有用である。
【0051】
本発明のスクリーニング方法の1実施態様では、本発明の細胞の増殖速度に対する効果を用いて、可能なアンドロゲン受容体モジュレーター(“試験作用剤”)を同定し、及び/又は特徴付けることができる。この実施態様は、アンドロゲン受容体アゴニストの存在下では本発明の細胞がそれらの増殖レベルを減ずるという観察に基づく。好ましい実施態様では、チミジン、好ましくは放射能標識チミジン、より好ましくは[3H]−チミジンの取り込みを用いて、アンドロゲン受容体アゴニストを同定し、特徴付ける。この方法は、本発明のアンドロゲン受容体を過度発現する、活性に増殖する骨格筋芽細胞を増殖培地中の試験作用剤に、例えば約48時間のような、適当な期間暴露させ、次に、培養培地中の放射能標識チミジン(好ましくは、[3H]−チミジン,Amersham,Buckinghamshire,UK)に、例えば約2時間のような、適当な期間暴露させることを含む。チミジン取り込みは、培養培地を除去し、次に氷冷リン酸塩緩衝化生理食塩水によって、続いて5%トリクロロ酢酸によって洗浄することによって停止する。次に、細胞を溶解させる。次に、溶解物の放射能を測定して、細胞中に取り込まれた放射能標識チミジンの度合いを知る。試験作用剤が、アンドロゲン受容体アゴニストを含有しない対照サンプルに比べて、チミジン取り込み速度を検出可能に低下させる場合には、該試験作用剤はアンドロゲン受容体アゴニストとして陽性の試験結果になると考えられる。好ましくは、このような減少は対照よりも少なくとも約30%低く、より好ましくは、対照よりも少なくとも約50%低い。
【0052】
本発明のスクリーニング方法の他の実施態様では、上記のような、本発明の細胞中の放射能標識チミジンの取り込みを測定するための方法を、アンドロゲン受容体モジュレーターを特徴付けるためにも用いることができる。このことは、アンドロゲン受容体アゴニストが[3H]−チミジン取り込みを阻害する度合いがアンドロゲン受容体に対する該アゴニストの既知アフィニティに一致するという観察に基づく。この効果は、図4に示すように、天然アンドロゲン受容体アゴニスト、テストステロン及びDHTに関して、並びに例えばオキサンドロロン及びスタノゾロールのような合成アンドロゲン受容体アゴニストに関して明らかにされている。アンドロゲン受容体アゴニストは上述したチミジン取り込み方法を用いて試験することができ、結果を他のアンドロゲン受容体アゴニストの既知効果と比較することができる。これらの結果を用いて、既知アンドロゲン受容体アゴニストと比較して、試験作用剤のアンドロゲン受容体に対する相対的アフィニティを予測することができる。
【0053】
本発明のスクリーニング方法の他の実施態様では、細胞周期のG0及びG1期にある細胞の割合の増加及び/又は複製(replicative)(S)及び複製後(post−replicative)(G2/M)期にある細胞の画分の同時減少を用いて、試験作用剤による細胞増殖の阻害を評価する。G0/G1において、細胞DNAの量は染色体の二倍体含量(2N)に対応する。S期中に、染色体複製がDNA含量を2Nから4Nに高め、G2/M(細胞分割の前)における細胞の染色体含量は4Nである。
【0054】
好ましい定量的(quantitative)DNAステインはヨウ化プロピジウム(PI;Molecular Probes,製品 no.P−3566,Calbiochem;La Jolla,Calif.)である。他の有用な定量的DNAステインは蛍光核酸ステインを包含する。当業者が本願の開示に基づいて理解するように、非限定的にチアゾール・オレンジ、エチジウム・ホモダイマー、臭化エチジウム、HOECHST33258及びDAPIを包含する、多様な、適当な核酸ステインが当該技術分野に知られている。核酸ステインは、例えばフェナントリジン及びアクリジンのようなインターカレーティング・ダイ、例えば臭化エチジウム及びヨウ化プロピジウム;例えばDAPI及びHoechstダイのような副溝結合剤(minor−groove binder);又はこれらの2つのカテゴリーのいずれにも属さないダイ、例えばアクリジン・オレンジ、7−AAD及びヒドロキシスチルバアミジンでありうる。シアニン・ダイは、それらの高いモル吸光性、非常に低い固有蛍光、核酸への結合時の大きい蛍光強化、核酸に対する中程度から非常に高いまでのアフィニティに基づいて選択されるダイであり、他のバイオポリマーを殆ど又は全く染色しない。幾つかの核酸ステインは細胞不浸透性であり、他のステインは細胞浸透性ステインである。細胞浸透性ステインは染色前の細胞の浸透性化(permeabilization)を必要としない。典型的な細胞浸透性ダイはシアニン・ダイ(SYTO核酸ステイン)、ヨウ化ヘキシジウム、ジヒドロエチジウム、及びエチジウムホモダイマーである。
【0055】
他の利用可能なダイはインターカレーター 7−アミノアクチノマイシンDとアクチノマイシンD、マルチカラー・ヒドロキシスチルバアミジン、長波長LDS751及びNeurtrace Fluorescent Nissl Stainsを包含する。他の定量的DNAステインは塩基類似体5−ブロモ−2’−デオキシウリジン(BrdU、Sigma−Aldrich,St.Louis,MO)である。その他の有用な核酸ステインは国際特許出願公開WO93/06482(米国特許第5,582,977号として発行)とWO94/24213(米国特許第5,436,134号として発行)、及び米国特許第5,321,130号;第5,410,030号;第5,436,134号;及び第5,437,980号に述べられている。
【0056】
ヨウ化プロピジウム(PI;Calbiochem)は細胞集団に少なくとも約0.1μg/ml〜約100μg/ml、好ましくは少なくとも約0.1〜約10μg/ml、最も好ましくは約1〜約5μg/mlの濃度で加えることができる。該細胞を任意に暗所において室温で約1分間〜約2時間、好ましくは約10分間〜1時間、最も好ましくは約15〜約30分間インキュベートすることができる。インキュベーションは氷上において少なくとも約1分間、好ましくは少なくとも約5分間、最も好ましくは少なくとも約15分間行なうこともできる。
【0057】
一般に、細胞を定量的DNAステインによって、細胞中のDNAの検出及び定量を可能にするために充分な量及び時間で染色する。特定の細胞種類及び検出方法に適した染色手段は、当該技術分野に知られた方法によって、例えば如何なる条件が細胞の適当な染色を可能にするかを知るためのように、幾つかのDNAステイン、濃度及びインキュベーション時間を用いてアッセイを実施することによって決定することができる。
【0058】
DNA含量に関する細胞の染色に付随して、染色体DNA以外の核酸(例えば、RNA)の染色を防止する作用剤による細胞の処理を行なうことができる。例示的な実施態様では、RNAを分解する作用剤、例えばRNアーゼによって細胞を処理する。例えば、RNアーゼ(BD Clontech)を約100〜500μg/mlで加えることができる。一般に、他の核酸の染色よりも染色体DNAの優先的な染色を可能にするために充分な濃度及び時間で、染色体DNA以外の核酸の染色を防止する作用剤を用いて、細胞をインキュベートする。適当な条件は当該技術分野の方法によって、例えば、用いる方法に適した条件を知るためのように、種々な作用剤を種々な条件下で用いてアッセイを実施することによって決定することができる。
【0059】
染色された細胞を分析するための好ましい方法は、マルチ−パラメータ(又はカラー)ディスプレイを用いた、フローサイトメトリー又はレーザー走査サイトメトリーによる方法である。フローサイトメトリーは、本明細書でさらに説明する、当該技術分野において知られた蛍光活性化セルソーター(FACS)によって行なうことができる。用いることができる、典型的なFACS装置はFACSCaliburTM Flow Cytometry Systemフローサイトメーター(Becton Dickinson Immunocytometry Systems,San Jose,CA)と、Coulterフローサイトメーター(Hialeah,Fla.,USA)EPICS Elite(登録商標)を包含する。定量はCellQuest(Becton Dickinson;Mountain View,CA)、WinList(VeritySoftware House,Inc.Topsham,Maine)、Multicycleソフトウェア(Phoenix Flow Systems,San Diego,CA)及びFACScan(Becton Dickinson,Mountain View,CA)ソフトウェアを用いて行なうことができる。フローサイトメーターは各細胞に関連した発光性物質量及び他のパラメーターを測定して、例えばヒストグラム、ドットプロット又は画分表(fraction table)の形式で出力を提供する。流体含有細胞が光源を、典型的に1つずつ、通過するにつれて、これらの細胞は種々な波長の光に暴露される。サイトメーターによって検出される各粒子は“イベント”と呼ばれる。イベントが入射光の一部を伝達するか又は散乱させる程度は、イベントの特徴、例えば関連発光性物質の尺度を与える。例えば、イベントは自発的に発光することができる、又は該イベントに導入された蛍光物質によって生じる蛍光を発光することができる。発光又は反射光の強度はサイトメーターによって測定され、記憶される。
【0060】
細胞周期のG0及びG1期にある細胞の割合の増加及び/又は複製(S)及び複製後(G2/M)期にある細胞の画分の同時減少を用いて、細胞増殖の阻害を評価する本発明のスクリーニング方法の好ましい実施態様では、Krishan,A.(1975)に従ってヨウ化プロピジウムによって染色した後にフローサイトメトリーによって、細胞周期の各期の細胞のパーセンテージを知ることができる。この方法によると、細胞を高マイトジェン増殖培地に低密度でプレーティングして(plated)、試験化合物によって約24時間〜約48時間処理する。次に、トリプシン化によって細胞を回収して、Dulbecco’sリン酸塩緩衝化生理食塩水(Life Technologies)中70%エタノール中に−20℃において少なくとも2時間再懸濁させる。次に、細胞を低速度遠心分離を用いてペレット化して、リボヌクレアーゼAとヨウ化プロピジウムとを含有するリン酸塩緩衝化生理食塩水中に再懸濁させる。細胞をリボヌクレアーゼAとヨウ化プロピジウムとによって室温において約30分間処理する。G0及びG1期の細胞対S、G2及びM期の細胞の定量は、例えば、アルゴンレーザー(488nm 発光波長)とModfitTMソフトウェア(Becton Dickinson Immunocytometry Systems)とを装備したFACScanTMフローサイトメーターのような、フローサイトメーターを用いて行なうことができる。
【0061】
試験作用剤が、アンドロゲン受容体アゴニストを含有しない対照サンプルに比べて、細胞周期のG0及びG1期の細胞の割合を検出可能に増加させ、及び/又は細胞周期のS及びG2/M期の細胞の割合を減少させる場合には、該試験作用剤はアンドロゲン受容体アゴニストとして陽性の試験結果になると考えられる。好ましくは、G0及びG1期の細胞の増加は対照に比べて少なくとも約5%、より好ましくは、対照に比べて少なくとも約10%である。好ましくは、S及びG2/M期の細胞の減少は対照に比べて少なくとも約5%、より好ましくは、対照に比べて少なくとも約10%である。
【0062】
本発明のスクリーニング方法の他の実施態様では、本発明の細胞に対する筋芽細胞分化の効果を用いて、アンドロゲン受容体モジュレーターを同定することができる。この実施態様は、本発明の細胞がアンドロゲン受容体アゴニストによって処理されたときに細胞分化のそれらのレベルを促進するという観察に基づいている。好ましい実施態様では、本発明の細胞を用いて、分化した筋管形成のレベル及び速度に対する試験作用剤の効果を決定する。本発明の細胞が高マイトジェン増殖培地中で増殖するときに、それらは小さい付着単核細胞として出現する。しかし、培地を2%ウマ血清を補充したDulbecco改変Eagle培地の低マイトジェン融合培地(fusion medium)(Life Technologies)に切り替えると、単核筋芽細胞の大部分が融合して、細長い多核筋管を形成する。本発明の細胞を例えばDHTのようなアンドロゲン受容体アゴニストに暴露させると、アンドロゲン受容体アゴニストの無い場合よりも迅速に筋管が形成されることが観察された。アンドロゲン受容体を過度発現しない骨格筋芽細胞も、培地を融合培地に切り替えるときに、筋管を形成するが、筋管形成の速度も程度も例えばDHTのようなアンドロゲン受容体アゴニストの添加によって目に見えるほどに影響されない。本発明の細胞に対するアンドロゲン受容体アゴニストの効果を図3に示す。本発明のスクリーニング方法の好ましい実施態様では、実施例4に述べる方法に従ってスクリーニング・アッセイを行なう。試験作用剤は、アンドロゲン受容体アゴニストを含有しない対照サンプルに比べて、筋管形成速度を検出可能に増加させる場合には、該試験作用剤はアンドロゲン受容体アゴニストとして陽性の試験結果になると考えられる。
【0063】
本発明のスクリーニング方法の他の実施態様では、総タンパク質含量に対する効果を利用して、本発明の細胞に対する試験作用剤の効果を評価する。この実施態様は、アンドロゲン受容体アゴニストの存在下での本発明の細胞の培養が細胞中のタンパク質含量の蓄積を促進するという観察に基づく。このスクリーニング方法の好ましい実施方法では、本発明の細胞を最初に高マイトジェン増殖培地中で約24時間増殖させる。次に、培地を、15%チャーコール−デキストラン処理ウシ胎仔血清(Gemini Bio−Products)と10pM塩基性線維芽細胞増殖因子(Collaborative Biomedical Products)とを有するDulbecco改変Eagle培地の無ステロイド増殖培地と交換する。約38時間後に、培地を、試験作用剤を含有する上記融合培地と交換して、細胞を該作用剤に少なくとも約48時間暴露させ、次に、少なくとも50%集密度(confluence)に達するために必要に応じて、付加的期間暴露させる。次に、培地を、試験作用剤を含有する融合培地に3日間まで交換する。細胞の溶解、超音波処理及び遠心分離によって調製された細胞抽出物のタンパク質濃度を、例えばBradford,M.(1976)に述べられたCoomassie Blue ダイ結合方法のような、任意の適当な方法によって測定することができる。好ましい実施態様では、実施例5に述べる方法に従ってスクリーニング・アッセイを実施する。試験作用剤がアンドロゲン受容体アゴニストを含有しない対照サンプルに比べて、総タンパク質含量を検出可能に増加させるならば、該試験作用剤はアンドロゲン受容体アゴニストとして陽性の試験結果になると考えられる。好ましくは、このような増加は対照に比べて少なくとも約20%、より好ましくは対照に比べて少なくとも約50%である。
【0064】
本発明のスクリーニング方法の他の実施態様では、試験作用剤を本発明の細胞の細胞死又はアポトーシスに対するその効果に基づいて評価することができる(Kaufmann,S.H.,Hengartner,M.O.(2001);Arends,A.J.,Wyllie,A.H.(1991);及びWyllie,A.H.等(1980)参照)。何らかの特定の理論又はメカニズムに縛られることを望む訳ではないが、アンドロゲン受容体アゴニストが筋芽細胞分化を強化するメカニズムはマイトジェン取り出し後のプログラム化細胞死又はアポトーシスの発生率を減ずることによると、提案される。この実施態様は、マイトジェン取り出し後に、アンドロゲン受容体アゴニストによって処理された本発明の細胞が、本発明の未処理細胞に比べて、アポトーシスのレベル減少を示すという観察に基づく。マイトジェン取り出し後に、あるパーセンテージの前付着細胞(previously adherent cells)が培養皿から剥離して、アポトーシスを受けるように思われる。アポトーシスを受ける細胞の顕著な特徴は、ゲル電気泳動、Rosl,F.(1992)によって分析されたときに、ヌクレオソーム内フラグメント化(internucleosomal fragmentation)によって特徴的なラダーリング効果を生じるDNAフラグメント化のパターンである。付着細胞に対比した非付着細胞におけるアポトーシスは、非付着細胞に対比した付着細胞のDNAサンプルの電気泳動によって確認することができる(図7参照)。スクリーニング方法の実施態様の実施では、本発明の細胞を上記高マイトジェン増殖培地において試験作用剤と共に適当な期間、好ましくは約4日間培養する。培地を、試験作用剤を含有する上述したような融合培地に変えて、細胞をさらに約24時間増殖させる。穏やかな洗浄を繰り返して、非付着細胞を回収して、溶解させる。付着細胞をトリプシン化によって回収して、次に溶解させる。例えば、Blin,N.及びD.Stafford(1976)におけるような、当該技術分野において周知の手段に従って総DNAを単離する。DNA収率は260nmにおけるUV分光法によって測定することができる。本発明の細胞のアポトーシスの減少は、本発明の付着細胞中のDNA量に比べた、アンドロゲン受容体アゴニストによって処理した本発明非付着細胞のDNAの割合の減少によって明らかになる。好ましい実施態様では、実施例7に述べる方法を用いる。試験作用剤がアンドロゲン受容体アゴニストを含有しない対照サンプルに比べて、非付着細胞のパーセンテージを検出可能に減少させるならば、該試験作用剤はアンドロゲン受容体アゴニストとして陽性の試験結果になると考えられる。
【0065】
本発明の他のスクリーニング方法では、試験作用剤を例えばIGF−I及びIGF−IIのような、インシュリン様増殖因子(IGFs)の発現に対するその効果に基づいて評価することができる。IGFsが筋管への筋芽細胞の分化に重要な役割を果たすことは周知である(Florini,J.,D.Ewton等(1996);Tollefsen,S.,R.Lajara等(1989);及びTollefsen,S.,J.Sadow等(1989)参照)。スクリーニング方法の実施では、本発明の細胞を増殖する筋芽細胞として試験作用剤を含む高マイトジェン増殖培地中に少なくとも2日間維持して、これらを高密度(>70%集密度)に達しさせる。細胞が高密度に達したときに、細胞を直ちに回収することができるか、又は好ましくは、試験作用剤を含む融合培地に約1〜2日間切り替えることができる。次に、細胞を回収して、総RNAをTrizol(登録商標)試薬(Life Technologies)を用いて製造者が薦める標準方法に従って単離する。20μg(UV分光法によって測定されるRNAの濃度に基づいて)を含有するサンプルをホルムアルデヒド含有アガロースゲル上での電気泳動によって分離する。分離済みサンプルをDuralon−UVTMナイロン・メンブラン(Stratagene,La Jolla,CA)に5xSSPE中での毛管ブロッティングによって移し、ラットIGF−IIプローブによって調べる。この方法におけるプローブとしては、任意の哺乳動物IGF−II cDNA又はRNAを用いることができる。好ましくは、前記プローブはマウスIGF−IIcDNA又はRNAの対応領域に>90%同じの配列相同性を有する。IGF−IIプローブはラット胚総RNAを鋳型として、5’−TGTTGGTGCTTCTCATCTCTTTGG−3’をフォワードプライマーとして、5’−CACAGACTGATGGTACTACATTGC−3’をリバースプライマーとして用いることができ、続いて、トリス−ボレート−EDTA(TBE)バッファー中1%アガロースゲル上でのDNAフラグメントの電気泳動分離を行い、QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen,Valencia,CA)を用いて、ゲルスライスから562−塩基対生成物を回収することができる。Feinberg,A.及びB.Vogelstein(1983)と、Feinberg,A.P.及びB.Vogelstein(1984)によるランダムプライマー伸長によって、二本鎖32P標識プローブを合成することができる。プローブを煮沸によって変性させて、約1〜2x106dpm/mlハイブリダイゼーション溶液(50%ホルムアミド、6xSSC、1%SDS、15xDenhardt溶液、0.1mg/ml剪断サケ精子DNA)の濃度において用いる。ハイブリダイゼーションを42℃において少なくとも約24時間行なって、次に、メンブランを中程度のストリンジェント条件(即ち、0.3xSSC/0.1%SDS、55℃)下で洗浄する。CycloneTM Storage Phosphor Systemを用いた、OptiQuantTM,バージョン3.15ソフトウェア(Packard Instrument Corporation,Meriden,CT)によるリン光イメージング(phosphorimaging)によってハイブリダイゼーション・シグナルを検出して、定量する。次に、試験作用剤によって処理した細胞におけるIGF−II発現を、アンドロゲン受容体アゴニストを含有しない非処理対照サンプルにおけるIGF−II発現と比較する。試験作用剤が対照サンプルに比べてIGF−II発現レベルを検出可能に増加させるならば、該試験作用剤はアンドロゲン受容体アゴニストとして陽性の試験結果になると考えられる。好ましくは、このような増加は対象に比べて少なくとも約2倍の増加、より好ましくは、対照に比べて少なくとも約3倍の増加である。
【0066】
本発明のスクリーニング方法の他の実施態様では、試験作用剤をIGFBP’sとして知られるファミリーのタンパク質のいずれか、好ましくはIGFBP4の発現に対するその効果に基づいて評価することができる。IGFsの生物学的活性はIGFBP’sとして知られるファミリーの高アフィニティ結合タンパク質によってモジュレートされる。IGFBP4が筋芽細胞におけるIGF−Iの作用を阻害することは判明している(McCusker,R.とD.Clemmons(1994))。骨格筋IGFBP4 RNAレベルはアンドロゲン受容体アゴニスト、テストステロンによってIGF−Iとは反対の方法で調節される(Urban,R.,Y.Bondenburg等(1986))。スクリーニング方法の実施では、本発明の細胞を増殖させ、IGF発現の測定方法と実質的に同じ方法で、RNAを単離し、分離して、ブロットする。任意のIGFBPをこのスクリーニング方法のためのプローブとして用いることができる。プローブがIGFBP4であることが好ましい。ラットIGFBP4のコーディング領域からの469bpフラグメントを、鋳型としてラット骨格筋ポリA+RNAを用い、フォワードプライマーとして5’−GGCGACGAAGCCATCCACTG−3’を用い、リバースプライマーとして5’−CCCGGTGCAGCTCACTCTGG−3’を用いて逆転写ポリメラーゼ連鎖反応によってプローブとして調製することができる。該プローブの変性及びハイブリダイゼーションと、ハイブリダイゼーション・シグナルの検出とはIGF発現の測定方法と実質的に同じ方法で行なうことができる。次に、試験作用剤によって処理した細胞におけるIGFBP4発現をアンドロゲン受容体アゴニストを含有しない非処理対照サンプルにおけるIGFBP4発現と比較する。試験作用剤が対照サンプルに比べて、IGFBP4発現レベルを検出可能に減少させるならば、該試験作用剤はアンドロゲン受容体アゴニストとして陽性の試験結果になると考えられる。好ましくは、このような減少は対照に比べて少なくとも約50%、より好ましくは、対照に比べて少なくとも約70%である。
【0067】
本発明のスクリーニング方法における活性に関して試験し、及び/又は特徴付けすべき試験作用剤を、好ましくは、約0.001nM〜約10,000nMの範囲である濃度範囲において試験する。
【0068】
本発明のスクリーニング方法がアンドロゲン受容体アゴニストの同定及び/又は特徴付けに、並びにアンドロゲン受容体アンタゴニストである作用剤の同定及び/又は特徴付けに使用可能であることは、この開示に基づいて、当業者に明らかであろう。例えば、本発明の方法のいずれも、可能なアンドロゲン受容体アンタゴニスト活性を有する作用剤を試験するために既知アンドロゲン受容体アゴニストと共に用いることができる。スクリーニング方法の実施において期待される陽性結果の減少は、未知作用剤がアンドロゲン受容体アンタゴニストであることを示唆しうる。例えば、上述したような、本発明の細胞におけるチミジン取り込みに基づく本発明のスクリーニング方法では、アンドロゲン受容体アゴニストによって生じるチミジン取り込み阻害効果を、アンタゴニストが抑制する。
【0069】
本明細書に引用した、全ての特許、出願、刊行物及び資料、例えば、パンフレット又は技術公報(technical bulletin)の開示はそれらの全体において本明細書に援用される。
【0070】
当業者は、実施例、図面、配列一覧表及び特許請求の範囲を包含する本願の記載を用いて、本発明をその完全な程度まで利用することができると考えられる。以下の実施例は本発明の実施の単なる例示と見なされるべきであり、この開示の残りの部分を如何なる意味でも少しでも限定するものと見なすべきではない。
【0071】
【実施例】
実施例
実施例1は、ヒトアンドロゲン受容体を過度発現する哺乳動物細胞系の調製を提供する。実施例2は、[3H]−チミジン取り込みアッセイにおいてアンドロゲン受容体を過度発現する筋芽細胞系の細胞増殖に対するアンドロゲンの効果を例示する。実施例3は、アンドロゲン受容体を過度発現する細胞における筋芽細胞分化に対するアンドロゲンの効果を細胞周期における変化に従って例示する。実施例4は、筋管形成に対するアンドロゲンの効果を例示する。実施例5はinvitro筋形成中のタンパク質蓄積に対するアンドロゲンの効果を例示する。実施例6は、アンドロゲン受容体を過度発現する筋芽細胞におけるIGF−II及びIGFBP4遺伝子発現に対するアンドロゲンの効果を例示する。実施例7は、アポトーシスに対するアンドロゲン処理の効果を例示する。
【0072】
実施例1
ヒトアンドロゲン受容体を過度発現する哺乳動物細胞
A.発現ベクターの調製
哺乳動物細胞におけるヒトアンドロゲン受容体の発現を可能にするプラスミドを標準組換えDNAクローニング手法によって生成した。ヒトアンドロゲン受容体のための2577−bpヒトアンドロゲン受容体コーディング配列(Genbank Accession No.M23263)を含有するDNAフラグメントをpBI−EGFP Tetベクター(Clontech,Cat.#6154−1,Palo Alto,CA)の固有Pvull部位中にライゲートした。得られた発現ベクターを大腸菌株DH5α(Life Technologies)中に形質転換して、増幅させた。得られたクローンを、クローニング結合(cloning junctions)を包含する領域の制限マッピングとDNA塩基配列決定とに基づいて、選択して、それらが発現のための適当な部位及びオリエンテーションで完全なヒトアンドロゲン受容体コーディング配列を含有することを発見した。
【0073】
B.細胞の調製
ヒトアンドロゲン受容体含有発現ベクターを包含する全てのプラスミドDNAをマウス筋肉由来C2C12細胞(YaffeとSaxel(1977);ATCC No.CRL−1772)中に、トランスフェクション試薬、LipofectamineTM(Life Technologies)を用いて、製造者の薦める方法及び条件に従って導入した。C2C12細胞に最初にTet−OnTMベクター(Clontech,Palo Alto,CA)を製造者の指示に従い、LipofectamineTMを用いてトランスフェクトして、逆テトラサイクリン調節トランス作用因子タンパク質を発現する細胞系を生成した。得られた細胞を15%ウシ胎仔血清(Gemini Bio−Products)と10pM塩基性線維芽細胞増殖因子(Collaborative Biomedical Products)とを補充した、1.5g/Lグルコース含有Dulbecco改変Eagle培地(DMEM−LG,Life Technologies)から成る高マイトジェン増殖培地中で増殖させた。得られたクローン(抗生物質G418に対する耐性を有する)の幾つかを、それらがTRE2−Lucレポーター遺伝子(Clontech,Palo Alto,CA)の発現をテトラサイクリン依存的に調節することができるかに関して評価した。1つの高応答クローンに対して、選択ベクターとしてのヒトアンドロゲン受容体含有発現ベクタープラスpTK−hyg(Clontech,Palo Alto,CA)による第2ラウンドのトランスフェクションを行なった。得られたトランスフェクト済み細胞プールを414〜517U/mlヒグロマイシンB(Calbiochem)の存在下での増殖に関して選択した。
【0074】
C.ヒトアンドロゲン受容体の発現の確認
ヒグロマイシン耐性プールを高レベルのヒトアンドロゲン受容体mRNAを有するクローンに関してNorthernブロット分析によってスクリーニングすることによって、“C2hAR57”と表示される細胞系を同定した。50〜70%集密度培養からTrizol(登録商標)(Life Technologies)を用いて製造者のプロトコールに従って、総RNAを単離した。20μgの総RNAを含有するサンプルをホルムアルデヒド含有アガロースゲル上での電気泳動によって分離し、Duralon−UVTMナイロンメンブラン(Stratagene,La Jolla,CA)に5xSSPE中での毛管ブロッティングによって移し、全イヌアンドロゲン受容体タンパク質コーディング領域に及ぶ32P標識DNAフラグメントにハイブリダイズさせた(Lu,B.,S.Smock等(2001))。ハイブリダイゼーション後に、55℃において0.3xSSC/0.1%SDS中でブロットを洗浄して、ストリンジェント性を緩和した。アンドロゲン受容体転写体(transcripts)をリン光イメージング(CycloneTM Storage Phosphor System,Packard Instrument Corporation)によって検出した。Northernブロット分析において、3.0−kbハイブリダイジング帯がC2hAR57細胞からのRNA中では検出されたが、C2C12細胞では検出されなかったので、C2hAR57中でのアンドロゲン受容体発現が確認された。
【0075】
D.アンドロゲン受容体の過度発現の確認
結合バッファー(50mM Hepes pH7.2、1.5mM EDTA、5mM DTT、10mM NaF、10mM Na2MoO4、10%グリセロール、0.1mg/mlバシトラシン、及び1mM Pefabloc;7.5μl/cm2)中でのC2hAR57細胞の超音波処理によって、細胞抽出物を調製した。該抽出物を遠心分離して(10,000xg、10分間、4℃)、得られた上清を液体窒素中で凍結させ、−80℃において貯蔵した。解凍時に、該抽出物を結合バッファーによって希釈して、10mg/mlの総タンパク質を得た。10μlの細胞抽出物と、1nMの[1,2,4,5,6,7−3H(N)]−5α−アンドロスタン−17β−オール−3−オン([3H]−DHT,110キューリー/mM,New England Nuclear)プラス0、0.5、1、2、4、8、16、32、64又は2000nM非標識DHTを含有する0.2mlの量で、結合反応を4℃において1時間行なった。アンドロゲン受容体−リガンド複合体を4℃において1時間かけて形成させてから、ヒドロキシルアパタイト含有96穴プレート式フィルター(96−well plate format filters)(MultiScreen,Millipore,Bedford,MA)上に捕捉した。プレートを結合バッファーによって3回洗浄して、結合した放射能をシンチレーション計数によって定量した。表Iと図1における結果は、C2hAR抽出物への[3H]−DHTの結合が特異的であることを示す。図1の挿入図に示す、結合データの飽和可能なScatchard分析は、単一クラスの結合部位及び1.15nMの解離定数(Kd=−1/勾配)による11.4フェムトモル/mgタンパク質の受容体アバンダンス(receptor abundance)と一致した。Scatchardプロット分析の説明に関しては、Hulme,E.C.e.(1992)69頁を参照のこと。これとは対照的に、トランスフェクトされないC2C12細胞からの細胞抽出物への[3H]−DHTの特異的結合(specific binding)は実証することはできなかったので、これは、このアッセイの検出下限である、2.2フェムトモルのアンドロゲン受容体/mgタンパク質より小さいと推定される。
【0076】
表I.C2hAR抽出物への[3H]−DHTの結合
【表1】
【0077】
さらに、間接免疫蛍光を用いて、アンドロゲン受容体発現を確認した。C2hAR57細胞をポリ−D−リシン被覆ガラス・チャンバ・スライド(glass chamber slides)(Lab−Tek,Nunc,Naperville,IL)上で培養し、100nM DHTによって2時間処理し、次に、リン酸塩緩衝化生理食塩水によってすすぎ洗いして、0.1Mリン酸ナトリウム、pH7.4中2%パラホルムアルデヒドを用いて室温において15分間固定した。以後の工程も室温において行なった。0.1%Triton X−100を用いて、細胞を10分間浸透性化してから、0.1%ウシ血清アルブミンを含むDulbeccoリン酸塩緩衝化生理食塩水(PBS/BSA)(Sigma−Aldrich)中に5%正常ロバ血清(Jackson Immunoresearch Laboratories,West Grove,PA)を含有するブロッキング溶液(blocking solution)中で20分間インキュベートした。ポリクローナル・ウサギ抗アンドロゲン受容体抗血清(PA1−111,Affinity Bioreagents,Golden,CO)をブロッキング溶液中4μg/mlの濃度においてスライド上で1時間インキュベートし、続いてCy3−複合(conjugated)抗ウサギ免疫グロブリンG(1:5000,Jackson ImmunoResearch Laboratories)も1時間インキュベートした。Olympus BH−2蛍光顕微鏡上でローダミン・フィルターによって免疫蛍光を可視化した(図2B、2D及び2F参照)。さらに、同じフィールドを位相差照明下でも撮影した(図2A、2C及び2E参照)。アンドロゲン受容体免疫蛍光が大部分のC2hAR57細胞において、主として細胞核に局在して検出された。一次抗体を省略した場合には、免疫蛍光は存在しなかった。上記手段を用いたDHT処理C2C12細胞では、暴露時間を増加した場合にさえも、核蛍光は殆ど見られなかった。
【0078】
したがって、実施例1は、アンドロゲン受容体を過度発現する哺乳動物骨格筋筋芽細胞の調製を例示する。
【0079】
E.C2hAR57細胞の寄託
細胞系、C2hAR57はAmerican Type Tissue Culture Collection(ATCC)、Manassas,VA ATCCに寄託され、Patent Deposit Designation、PTA−4126を与えられた。寄託された細胞系は、特許手続きのための微生物寄託についての国際的認識に基づくブタペスト条約下での寄託のために、2002年3月6日にATCCによって受理された。このように寄託された細胞系の公衆への利用可能性に対する全ての制限は、特許の付与時に、適切な場合には、決定的に除去される。
【0080】
実施例2
本発明の筋細胞を用いた[ 3 H]−チミジン取り込みアッセイ
実施例1によって調製したC2hAR57細胞を96穴組織培養プレート(Costar,Corning,NY)に1000細胞/穴で、15%ウシ胎仔血清を補充したDMEM−LG(Gemini Bio−Products)を用いてプレーティングして、5%CO2/95%空気中、37℃において一晩インキュベートした。翌日、培地を、試験作用剤、DHT、オキサンドロロン、テストステロン、スタノゾロール、2−ヒドロキシフルタミド、17β−エストラジオール及びプロゲステロンを含有する培地と交換した。試験作用剤に48時間暴露させた後に、0.1μCi[3H]−チミジン(82Ci/mmol,Amersham,Buckinghamshire,UK)/穴を含有する培地を加え、インキュベーションを37℃においてさらに2時間続けた。培養培地を吸引して、氷冷リン酸塩緩衝化生理食塩水によって、続いて5%トリクロロ酢酸によって洗浄することによって、アッセイを終了させた。次に、0.3N NaOH(75μl/穴)を加え、続いて、NaOHを中和するために0.3N HCl(75μl/穴)を加えることによって、細胞を溶解した。50μlアリコート中の放射能を、TopCountTMシンチレーション・カウンター(Packard Instrument Corporation)を用いた96穴プレート(Packard Instrument Corporation)中での液体シンチレーション計数によって測定した。天然アンドロゲン(テストステロン及びDHT)並びに合成アンドロゲン(オキサンドロロン及びスタノゾロール)が全て、C2hAR57細胞による[3H]−チミジン取り込みに対して用量依存性の阻害効果を示した(図4参照)。1μMまでの濃度はC2C12細胞に殆ど効果を及ぼさなかった(図5参照)。[3H]−チミジン取り込みの阻害に対するこれら4種類のアンドロゲンの効力順序(rank order potency)は、アンドロゲン受容体に対するそれらの既知アフィニティと一致した(DHT、スタノゾロール、テストステロン及びオキサンドロロンに関してIC50は、それぞれ、3.5nM、4.4nM、8.6nM及び28.4nMである)。さらに、0.1nM DHTによる阻害を、アンドロゲン・アンタゴニスト2−ヒドロキシフルタミドの同時添加によって完全に逆転させることができた(図6参照)。
【0081】
したがって、実施例2は、[3H]−チミジン取り込みレベルの変化によって例証されるような、細胞増殖レベルの変化を用いて、アンドロゲン受容体アゴニスト及びアンタゴニストを同定し、特徴付けるための本発明の細胞の使用を実証する。
【0082】
実施例3
本発明の筋細胞の細胞周期の変化のアッセイ
細胞周期の各期におけるC2hAR57細胞のパーセンテージを、Krishan,A.(1975)に従ったヨウ化プロピジウムによる染色後のフローサイトメトリーによって測定した。実施例1によって調製したC2hAR57細胞を高マイトジェン増殖培地に低密度でプレーティングした。100nM DHT又はビヒクルによる24時間及び48時間の処理(これらの時間中に、細胞が30%集密度を越えることは決してなかった)後に、細胞をトリプシン化によって回収し、リン酸塩緩衝化生理食塩水中の70%エタノール中に−20℃において少なくとも2時間再懸濁させた。各細胞サンプルを低速度遠心分離によってペレット化して、100μg/mlのリボヌクレアーゼAと20μg/mlのヨウ化プロピジウムを含有する0.5mlリン酸塩緩衝化生理食塩水中に室温において30分間再懸濁させた。正常前方/側方分散比率(forward/side scatter ratio)を示す細胞をそれらのヨウ化プロピジウム蛍光の分析のために選択し、アルゴンレーザー(488nm 発光波長)とModfitTMソフトウェア(BectonDickinson Immunocytometry Systems,San Jose,CA)とを装備したFACScanTMフローサイトメーターを用いて、104イベント/サンプルを記録した。100nM DHTによる24時間又は48時間のC2hAR57細胞の処理はG0−G1画分を高めた(以下の表II参照)。S及びG2−M画分の同時減少が24時間目に観察され(p<0.05)、48時間後に同じ方向の傾向が観察された(p<0.1)。細胞周期の各期におけるC2C12細胞の画分はビヒクル処理C2hAR57培養の場合と同様であり、100nM DHTによって影響されなかった。
【0083】
したがって、細胞の増殖レベルの変化の測定によってアンドロゲン受容体アゴニスト及びアンタゴニストを同定し、特徴付けるための本発明の細胞の使用の実証において、実施例3は実施例2に一致し、このような変化は細胞周期のG0−G1、G2−M及びS期にある細胞レベルによって判定される。
【0084】
表II.ヨウ化プロピジウム染色のフローサイトメトリー分析による細胞周期の一定の期における細胞のパーセンテージ
数値は反復培養(N=4又は5)の平均値+SEMである。★P<0.1、★★P<0.05、★★★P<0.005(ビヒクルに対比して)
【表2】
【0085】
実施例4
本発明の筋細胞における筋管形成のアッセイ
実施例1によって調製したC2hAR57細胞を高マイトジェン増殖培地において50〜70%集密度に達しさせて、次に、培地を2%ウマ血清を補充したDulbecco改変Eagle培地(“融合培地”)に切り替えた。融合培地を毎日交換した。高マイトジェン増殖培地中の低密度のC2hAR57細胞は小さい付着単核細胞として出現した。融合培地への切り替えの3日間以内に、単核筋芽細胞の大部分は融合して、細長い多核筋管を形成した。100nM DHTに暴露させたC2hAR57の培養では外因性アンドロゲンの不存在下で培養したものに比べて、より迅速に筋管が形成された。このことは、図3に示すように、融合培地中では1、2又は3日間後の培養物中で容易に観察される。これとは対照的に、C2C12の培養物では、筋管形成の速度も程度もDHTの添加によって可視的に影響されなかった。
【0086】
したがって、実施例4は、筋管形成の速度の変化によって例証されるような、細胞の分化レベルの変化によってアンドロゲン受容体アゴニスト及びアンタゴニストを同定し、特徴付けるための本発明の細胞の使用を実証する。
【0087】
実施例5
分化する筋管中のタンパク質含量のアッセイ
手段A−融合培地中で3日間。C2hAR57細胞を12穴組織培養プレート(Costar,Corning,NY)において高マイトジェン増殖培地中4x104細胞/穴でプレーティングした。24時間後に、培地を無ステロイド増殖培地(15%チャーコール−デキストラン処理ウシ胎仔血清+10pM塩基性線維芽細胞増殖因子を含むDMEM)と交換した。38時間後に、ビヒクル(0.1%ジメチルスルホキシド)又はDHT(10−12〜10−6M)を加えた。少なくとも48時間後に、培養物が50%集密度を越えるまでに達したときに、培地を前記と同じ濃度のDHTを含む融合培地に切り替えた。融合培地での3日間後の培養物から、上記実施例2で述べたような、結合バッファー(0.125ml/cm2)中での溶解、超音波処理及び遠心分離によって細胞抽出物を調製した。上清画分中でのCoomassie Blueダイ結合方法(Bradford,M.(1976)Anal Biochem.72,248−54)によって、タンパク質濃度を測定した。表IIIに示すように、DHTによって処理された分化するC2hAR57培養物では、71%までの総タンパク質含量の用量関連増加が見られたが、同様に処理されたC2C12培養物では一貫した変化(consistent change)は存在しなかった。全体として、C2hAR57培養物中の低いタンパク質含量は、これらの培養物が融合培地に切り替えられた時点でのこれらの培養物の低い密度を反映する。
【0088】
表III.融合培地での3日間後のタンパク質含量(μg)/穴(手段A)
括弧内の数値はビヒクルとのパーセンテージ差である。
【表3】
【0089】
手段B−融合培地中で24時間。完全血清+ビヒクル(0.1%ジメチルスルホキシド)又はDHT(10−12〜10−6M)を含有する高マイトジェン増殖培地中で低密度において、C2hAR57細胞を48時間培養してから、トリプシン化して、前記と同じ濃度のDHTを含む12穴組織培養プレートに5x105細胞/穴において再プレーティングした(replated)。再プレーティング(0日目)後1日目に、タンパク質測定のために1セットの培養物から細胞抽出物を調製し、控えのセットを融合培地に切り替えて、DHT処理を続けた。融合培地における24時間(0日目)後の培養物の第2セットから細胞抽出物を調製した。1日目の平均タンパク質含量から0日目の各処理に関する平均タンパク質含量を控除することによって、タンパク質含量の変化を算出した。ビヒクルによって処理した分化する培養物はタンパク質の正味損失を示した、この正味損失は、表IVに示すように、増加する濃度のDHTによって処理した培養物では軽減され、逆転さえした。
【0090】
表IV.融合培地における24時間中のC2hAR57培養物のタンパク質含量の正味変化(手段B)
【表4】
【0091】
したがって、実施例5は、細胞分化レベルの変化を用いてアンドロゲン受容体アゴニスト及びアンタゴニストを同定し、特徴付けるための本発明の細胞の使用の実証において、実施例4と一致する、この場合このような変化は細胞中のタンパク質含量のレベルに従って測定される。
【0092】
実施例6
アンドロゲン受容体を過度発現する細胞におけるIGF−II及びIGFBP4遺伝子発現のアッセイ
C2C12細胞及びC2hAR57細胞を、ビヒクル(0.1%DMSO)又は100nM DHTを含む高マイトジェン増殖培地中に4日間増殖する筋芽細胞の培養物として維持し、次に、高密度(>70%集密度)に達しさせてから、融合培地に切り替えた。分化の誘導の直前に、0日目サンプルを回収した。融合培地における1日、2日、3日又は5日間(ビヒクル又はDHTの添加を続けながら)後に、追加のサンプルを回収した。Trizol(登録商標)を用いて、総RNAを単離し、UV分光法によってRNA濃度を測定した。20μgの総RNAを含有するサンプルをホルムアルデヒド含有アガロースゲル上での電気泳動によって分離して、5xSSPE中での毛管ブロッティングによってDuralon−UVTMナイロン・メンブラン(Stratagene,La Jolla,CA)に移し、IGFBP4、IGF−II及び18SリボソームRNAに関して連続的に検査した。鋳型としてラット骨格筋ポリA+ RNAを用いて、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応によって、プローブとして用いるDNAフラグメントを形成した。フォワードプライマー、5’−GGCGACGAAGCCATCCACTG−3’と、リバースプライマー、5’−CCCGGTGCAGCTCACTCTGG−3’とを用いて、ラットIGFBP4のコーディング領域からの469−bpフラグメントを増幅させた。フォワードプライマー、5’−TGTTGGTGCTTCTCATCTCTTTGG−3’と、リバースプライマー、5’−CACAGACTGATGGTACTACATTGC−3’とを用いて、ラットIGF−IIコーディング領域の大部分を包含する562−塩基対フラグメントを増幅させた(pGEM1(Promega Corporation,Madison,Wisconsin)のEcoRI及びBamHI部位にクローン化された、Soares,M.,D.Ishii等(1985)Nuc.Acids Res.13(4),1119−1134に開示された562bp部分ラットIGF−II配列参照)。フォワードプライマー、5’−ACTTTCGATGGTAGTCGCCGTGC−3’と、リバースプライマー、5’−ATCTGATCGTCTTCGAACCTCCGAとを用いて、18SrRNAをコーディングする遺伝子からの674−bpフラグメントを増幅させた。ランダムプライマー伸長によって、二本鎖32P標識プローブを合成した(Feinberg,A.とB.Vogelstein(1983)及びFeinberg,A.P.とB.Vogelstein(1984)参照)。プローブを煮沸によって変性させて、1〜2x106dpm/mlハイブリダイゼーション溶液(50%ホルムアミド、6xSSC、1%SDS、15xDenhardt溶液、0.1mg/ml剪断サケ精子DNA)の濃度において用いた。42℃における少なくとも24時間のハイブリダイゼーション後に、メンブランを0.3xSSC/0.1%SDSによって55℃において洗浄して、ストリンジェント性を緩和した。CycloneTM Storage Phosphor Systemを用いた、OptiQuantTM,バージョン3.15ソフトウェア(Packard Instrument Corporation)によるリン光イメージングによってハイブリダイゼーション・シグナルを検出して、定量した。連続的な検査の間に、メンブランを5mM TrisHCl、pH8、0.2mM Na2EDTA、0.05%ピロリン酸ナトリウム及び0.1xDenhard溶液から成る溶液中で70℃において1〜3時間インキュベートすることによって、ストリップした。イメージング・プレートをIGFBP4ハイブリダイゼーションとIGF−IIハイブリダイゼーションとに、それぞれ、42時間と90分間暴露した。18Sシグナルを用いて、他のプローブの各々からのハイブリダイゼーション・シグナルを標準化した。
【0093】
図8はNorthernブロット分析の結果を示す。DHTはC2hAR57細胞中での4遺伝子全ての発現をC2C12細胞中に比べて大きく修正した。DHT処理はIGFBP4とIGF−II RNAのレベルに相反する変化を生じて、2.6−kb IGFBP4転写体のアバンダンスを減じるが、4.2−kb IGF−II転写体を刺激した。融合培地(FM)における0〜2日間後のDHTによるIGFBP4抑制の大きさは、C2hAR57細胞では75%、86%及び70%であったが、C2C12細胞では20%、51%及び44%に過ぎなかった。同じ時点において、DHTはDHT処理C2hAR57においてIGF−II転写体を10.2X、3.6X及び2X増加させたが、C2C12では0.8X、1.5X及び1.0X増加させたに過ぎなかった。
【0094】
したがって、実施例6は、細胞の分化のレベルの変化を用いてアンドロゲン受容体アゴニスト及びアンタゴニストを同定し、特徴付けるための本発明の細胞の使用の実証において、実施例4及び5と一致する、この場合、このような変化はIGF−II及びIGFBP4発現レベルによって測定される。
【0095】
実施例7
本発明の筋細胞におけるアポトーシスの分析
実施例1によって調製されたC2hAR57と、C2C12細胞との並行培養物を100mm直径円形組織培養皿(Falcon,Becton−Dickinson Labware,Franklin Lakes,NJ)において100nM DHT又はビヒクルを含む高マイトジェン増殖培地中で4日間培養してから、融合培地(前記と同様にDHT又はビヒクルを含む)に切り替えた。全ての培養物はマイトジェン取り出しの時点において約80%集密度であった。融合培地における24時間後に、非付着細胞を含有する培地を遠心分離管に移した。次に、皿をリン酸塩緩衝化生理食塩水によってすすぎ洗いして、トリプシン化によって付着細胞を回収した。遠心分離によって細胞ペレットを回収して、50mM TrisHCl、pH8、100mM Na2EDTA、0.5%ドデシル硫酸ナトリウム中で溶解した。総DNAを付着細胞画分と非付着細胞画分の両方から標準手段によって単離した(Blin,N.とD.Stafford(1976)参照)。5皿のプールからのDNA収量を260nmにおけるUV分光法によって測定した。10μg DNAに相当するアリコートをTBEバッファー中の1%アガロースゲル上での電気泳動によって分析し、UVトランスイルミネーション(transillumination)による臭化エチジウム蛍光によって可視化した。
【0096】
各細胞系及び処理からのDNAの収量を表Vに要約する。DHT処理C2hAR57培養物の非付着画分中のDNA割合(fraction)はビヒクル処理C2hAR57培養物中に見られる該割合よりも顕著に小さかった。DHT処理は、C2C12細胞系における非付着細胞の割合を感知できるほどには変えなかった。各サンプル中のDNAを、図7に示すように、アガロースゲル電気泳動によって定性的に評価した。両方のC2hAR57培養物の非付着細胞画分からのDNAは、アポトーシスを経験した細胞の特色であるような、180bpの倍数(multiples)でフラグメントの明確なラダーを示した。臭化エチジウム蛍光の相対強度に基づくと、ビヒクル処理C2hAR57サンプル中ではDHT処理サンプル中よりも大きい割合のDNAがフラグメント化したように見えた。これとは対照的に、付着細胞画分の全てと非付着C2C12細胞画分とにおけるDNAは主として高分子量(>10kb)であり、明確なフラグメント化は見られなかった。したがって、マイトジェン取り出し後24時間中に、或るパーセンテージのC2hAR57細胞が培養皿から分離して、アポトーシスを受けたように思われ、DHT処理がアポトーシス細胞の発生を約75%減少した。同じような量のDNAがC2C12培養物の非付着画分から回収されたが、このDNAはフラグメント化せず、このことは、これらの細胞がアポトーシスではないことを実証した;その上、いずれの細胞画分のDNAの収量にも質にもDHTの効果は無かった。
【0097】
表V.融合培地における24時間後の細胞培養物から回収された総DNA
【表5】
【0098】
したがって、実施例7は、マイトジェン取り出し後の細胞のアポトーシスレベルの変化によってアンドロゲン受容体アゴニスト及びアンタゴニストを同定し、特徴付けるための本発明の細胞の使用を実証する。
【0099】
参考文献
【表6】
【表7】
【表8】
【0100】
略号
“DHT”はジヒドロテストステロンを意味する。
“DNA”はデオキシリボ核酸を意味する。
“cDNA”は相補的DNAを意味する。
“nm”はナノメートルを意味する。
“nM”はナノモルを意味する。
“RNA”はリボ核酸を意味する。
“mRNA”はメッセンジャーRNAを意味する。
“UV”は紫外線を意味する。
“SDS”はドデシル硫酸ナトリウムを意味する。
“SSC”は生理食塩水塩類クエン酸塩(saline saline citrate)を意味する。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図1】図1は、C2hAR57細胞からの細胞抽出物に対する[3H]−DHTの特異性を示す。
【図2】図2Bと2Dは、それぞれ、C2C12細胞とC2hAR57細胞の免疫蛍光顕微鏡写真であり、一次抗体としてのウサギ抗アンドロゲン受容体抗血清(PA1−111)と、二次抗体としてのCy−3−複合抗ウサギ免疫グロブリンとの結合度を示す。図2Fは、二次Cy−3−抗ウサギ免疫グロブリンのみによって処理したC2hAR57細胞の免疫蛍光顕微鏡写真である。図2A、2C及び2Eは、それぞれ、2B、2D及び2Fに対応する位相差照明顕微鏡写真である。
【図3】図3は、C2C12細胞及びC2hAR57細胞における筋管形成に対するDHTの効果を示す。
【図4A】図4は、C2hAR57細胞への[3H]−チミジン取り込みに対する4種類のアンドロゲン受容体アゴニストの効果を示す。図4AはDHTの効果を示す。
【図4B】図4は、C2hAR57細胞への[3H]−チミジン取り込みに対する4種類のアンドロゲン受容体アゴニストの効果を示す。図4Bはオキサンドロロンの効果を示す。
【図4C】図4は、C2hAR57細胞への[3H]−チミジン取り込みに対する4種類のアンドロゲン受容体アゴニストの効果を示す。図4Cはテストステロンの効果を示す。
【図4D】図4は、C2hAR57細胞への[3H]−チミジン取り込みに対する4種類のアンドロゲン受容体アゴニストの効果を示す。図4Dはスタノゾロールの効果を示す。
【図5】図5は、C2C12細胞への[3H]−チミジン取り込みに対する2種類のアンドロゲン受容体アゴニストの効果を示す。
【図6】図6は、C2hAR57細胞への[3H]−チミジン取り込みに対するアンドロゲン受容体アンタゴニスト、2−ヒドロキシフルタミドの効果を示す。
【図7】図7は、C2C12細胞及びC2hAR57細胞における細胞アポトーシスに対するDHTの効果を示す。
【図8A】図8は、Northernブロット分析に基づいた、C2C12細胞及びC2hAR57細胞におけるIGF−II及びIGFBP4発現に対するDHTの効果を示す。図8AはC2C12細胞におけるIGFBP4発現に対するDHTの効果を示す。
【図8B】図8は、Northernブロット分析に基づいた、C2C12細胞及びC2hAR57細胞におけるIGF−II及びIGFBP4発現に対するDHTの効果を示す。図8BはC2C12細胞におけるIGF−II発現に対するDHTの効果を示す。
【図8C】図8は、Northernブロット分析に基づいた、C2C12細胞及びC2hAR57細胞におけるIGF−II及びIGFBP4発現に対するDHTの効果を示す。図8CはC2hAR57細胞におけるIGFBP4発現に対するDHTの効果を示す。
【図8D】図8は、Northernブロット分析に基づいた、C2C12細胞及びC2hAR57細胞におけるIGF−II及びIGFBP4発現に対するDHTの効果を示す。図8DはC2hAR57細胞におけるIGF−II発現に対するDHTの効果を示す。
【図9】図9は、挿入されたヒトアンドロゲン受容体を示すpBI−EGFP発現ベクターのマップである。
Claims (14)
- アンドロゲン受容体を過度発現する哺乳動物骨格筋芽細胞であって、前記アンドロゲン受容体が、配列番号:1及び配列番号:2から選択されるポリヌクレオチド配列に高ストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列である前記骨格筋芽細胞。
- 前記アンドロゲン受容体が配列番号:1及び配列番号:2から選択されるポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列である、請求項1記載の筋芽細胞。
- 挿入されたポリヌクレオチド配列を含む形質転換哺乳動物骨格筋芽細胞であって、前記挿入ポリヌクレオチド配列が配列番号:1及び配列番号:2から選択されるポリヌクレオチド配列に高ストリンジェント条件下でハイブリダイズする前記筋芽細胞。
- 前記挿入ポリヌクレオチド配列が配列番号:1及び配列番号:2から選択される、請求項3記載の筋芽細胞。
- 筋芽細胞がネズミ骨格筋芽細胞である、請求項1〜4のいずれかに記載の筋芽細胞。
- C2hAR57細胞。
- 請求項1〜6のいずれかに記載の細胞から選択される細胞を、アンドロゲン受容体をモジュレートする作用剤によって処理する工程;及び前記細胞に対する前記作用剤の効果を評価する工程を含むスクリーニング方法。
- 請求項1〜6のいずれかに記載の細胞から選択される細胞を、アンドロゲン受容体をモジュレートする作用剤によって処理する工程;及び前記細胞の持続される増殖、前記細胞の分化、前記細胞のチミジン取り込みレベル、前記細胞が細胞周期のG0若しくはG1期のいずれにあるか、前記細胞が細胞周期のG2−M若しくはS期のいずれにあるか、前記細胞の筋管形成、前記細胞のタンパク質含量のレベル、前記細胞のIGF−II発現のレベル、又は前記細胞のIGFBP4発現のレベルに対する前記作用剤の効果を評価する工程を含むスクリーニング方法。
- アンドロゲン受容体アゴニストを同定するためのスクリーニング方法であって、請求項1〜6のいずれかに記載の細胞を試験作用剤によって処理する工程;前記細胞の増殖に対する前記作用剤の効果を評価する工程;及び試験作用剤を下記のいずれかとして:作用剤が前記細胞の増殖を阻害する若しくは停止させるならば、アンドロゲン受容体アゴニストとして、又は作用剤が前記細胞の増殖を阻害せず、停止もさせないならば、アンドロゲン受容体アゴニストでない作用剤として特徴付ける工程を含む前記方法。
- 増殖の阻害又は停止を、前記細胞のチミジン取り込みを測定することを含む方法によって評価する、請求項9記載のスクリーニング方法。
- アンドロゲン受容体アゴニストを同定するためのスクリーニング方法であって、請求項1〜6のいずれかに記載の細胞を試験作用剤によって処理する工程;前記細胞の分化に対する前記作用剤の効果を評価する工程;及び試験作用剤を下記のいずれかとして:作用剤が前記細胞の分化を促進するならば、アンドロゲン受容体アゴニストとして、又は作用剤が前記細胞の分化を促進しないならば、アンドロゲン受容体アゴニストでない作用剤として特徴付ける工程を含む前記方法。
- アンドロゲン受容体アゴニストを同定するためのスクリーニング方法であって、請求項1〜6のいずれかに記載の細胞を試験作用剤とマイトジェンとによって処理する工程;前記マイトジェンを取り出す工程;前記マイトジェン取り出しの結果としての、前記細胞のアポトーシスに対する前記作用剤の効果を評価する工程;及び試験作用剤を下記のいずれかとして:作用剤が前記細胞のアポトーシスを阻害若しくは防止するならば、アンドロゲン受容体アゴニストとして、又は作用剤が前記細胞のアポトーシスを阻害も防止もしないならば、アンドロゲン受容体アゴニストでない作用剤として特徴付ける工程を含む前記方法。
- アンドロゲン受容体アンタゴニストを同定するためのスクリーニング方法であって、請求項1〜6のいずれかに記載の細胞をアンドロゲン受容体アゴニストと試験作用剤とによって処理する工程;及び前記細胞の持続される増殖、前記細胞の分化、前記細胞のチミジン取り込みレベル、前記細胞が細胞周期のG0若しくはG1期のいずれにあるか、前記細胞が細胞周期のG2−M若しくはS期のいずれにあるか、前記細胞の筋管形成、前記細胞のタンパク質含量のレベル、前記細胞のIGF−II発現のレベル、又は前記細胞のIGFBP4発現のレベルに対する前記作用剤の効果を評価する工程を含む前記スクリーニング方法。
- アンドロゲン受容体アンタゴニストを同定するためのスクリーニング方法であって、請求項1〜6のいずれかに記載の細胞をマイトジェン、アンドロゲン受容体アゴニスト及び試験作用剤によって処理する工程;前記マイトジェンを取り出す工程;及び細胞のアポトーシスに対する前記作用剤の効果を評価する工程を含む前記スクリーニング方法。
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