JP2004000115A - Method for judging development risk of diabetes - Google Patents

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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a simple method for judging the relative development risk of diabetes. <P>SOLUTION: The method for judging the development risk of diabetes comprises detecting genetic polymorphism existing on one or more positions selected from nucleotides at the 36th of first intron on GFAT1 gene, at the 7th of intron 11, at -147th of 12 intron, at 1853th to 1877th of intron 8, at 1988th to 2007th of 12 intron, at -11th to -22th of intron 18, at 2632th to 2661th of intron 3 and at 66th of exon 18 of GFTA2 gene or a haplotype comprising its combination from a specimen containing a human genome DNA. <P>COPYRIGHT: (C)2004,JPO

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、糖尿病の発症危険性判定方法に関する。より詳しくは、ヒトゲノムＤＮＡを含む試料から、糖尿病の発症に関連した新規遺伝子多型を検出することにより、該試料提供者が糖尿病を発症する潜在的な危険度を判定する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
糖尿病は近年その患者数が増加しており、成人病のひとつとして注目されている。糖尿病には、インスリン依存型の１型糖尿病と非依存型の２型糖尿病があるが、このうち２型糖尿病（インスリン非依存性糖尿病、ＮＩＤＤＭ）は日本人に多い糖尿病のタイプであり、早期発見、早期治療がその予後の点から重要である。
【０００３】
しかし、２型糖尿病はその成因が多様であり、予想される原因についての知見は乏しい。２型糖尿病におけるインスリン作用不足の原因としては、インスリン感受性機構の異常とインスリン分泌の低下が挙げられる。欧米では多くは前者、すなわちインスリン抵抗性が２型糖尿病の主な原因であるが、日本ではインスリン分泌不全が主な原因である場合も少なくない。
【０００４】
一方、糖尿病はその合併症として、網膜症、神経症、動脈硬化、あるいは、腎症などを発症する。特に、糖尿病患者が腎症を併発すると、腎障害が原因となって高血圧症や高脂血症を悪化させ、患者の予後を更に悪化させる。そのため、糖尿病合併症の中でも、腎症の予防や治療は特に重要な問題となる。
【０００５】
近年、分子生物学の急速な進展により、インスリン作用機作に関する知見が集積されてきた。インスリン受容体構造の解明にはじまり、受容体以降のシグナル伝達機構も次第に明らかとなってきた。こうしたなかで、従来の経口血糖低下薬とは作用メカニズムの全く異なる糖尿病治療薬〔α−グリコシダーゼ阻害薬：Ａｃａｒｂｏｓｅ，　Ｖｏｇｌｉｂｏｓｅ（例えば、非特許文献１〜６参照）、インスリン抵抗性改善薬：Ｔｒｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ，　Ｐｉｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ（例えば、非特許文献７〜１１参照）〕も登場し、発売された。一方、米国では１９９６年にビグアナイド剤が糖尿病治療薬として認可され、日常診療での糖尿病治療が可能となり注目を集めている（例えば、非特許文献１２および１３参照）。これらの薬剤はいずれも、日常診療で古くから汎用されてきたスルフォニル尿素（ＳＵ）剤とは異なり、膵β細胞からのインスリン分泌を促進することなく血糖を下げる作用を有している。
【０００６】
現在、インスリン抵抗性を改善する働きをもった糖尿病治療薬の作用メカニズムとしては、以下の９項目が考えられている。インスリン受容体キナーゼの活性化、糖輸送担体の細胞膜への移行促進、糖代謝の律速酵素の働きや糖代謝異常の是正、肝糖新生の抑制、肝による糖取り込み促進、肝グリコーゲン生成の亢進、血中脂質の低下、血中脂質の低下に伴う肝糖新生の減少、血中脂質の低下に伴うインスリン感受性の亢進である。
【０００７】
ところで、グルタミン：フルクトース−６−リン酸アミドトランスフェラーゼ（以下「ＧＦＡＴ」という）は、ヘキソサミン生合成経路において、律速段階であるフルクトース−６−リン酸からグルコサミン−６−リン酸への反応を触媒する重要な酵素である。ＧＦＡＴ活性を阻害する薬剤は細胞内へのグルコースの取り込みを促進し、血糖値を低下させることができると考えられており、そのため糖尿病治療薬としての開発が期待されている。このＧＦＡＴ阻害剤の作用機作は、以下のように説明される。
【０００８】
ヘキソサミン生合成経路はその代謝過程において、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸等を産生するが、これらはタンパク質の糖化修飾やプロテオグリカンあるいはガングリオシド等の粗原料として流れていくと考えられている。
【０００９】
一方、インスリンが細胞表面のレセプターに結合すると細胞内シグナルが活性化され、細胞内にプールされていた糖輸送担体（ＧＬＵＴ４など）が膜表層に移行し、グルコースの取り込みが促進される。取り込まれたグルコースは解糖系により代謝され、エネルギー源としてのＡＴＰを蓄積するが、過剰に取り込まれた場合はグルコース代謝物であるフルクトース−６−リン酸がヘキソサミン生合成経路へ流れることになる。流れたフルクトース−６−リン酸は、ＧＦＡＴによりグルコサミン−６−リン酸に変換される。詳細な機構は不明であるが、様々な状況証拠から、このグルコサミン−６−リン酸代謝産物が糖輸送担体の膜移行を抑制し、それによって細胞内へのグルコース取り込みが抑制されることが判明している（例えば、非特許文献１４〜１８参照）。これらのことから、ヘキソサミン生合成経路は、その一つの役割として、グルコースの過剰取り込みに対するフィードバック機構として機能するものと考えられる。そして、ＧＦＡＴはその経路における律速酵素として重要な役割を担う。
【００１０】
また、最近、ＧＦＡＴのアンチセンスヌクレオチドを過剰発現させたトランスジェニックマウスではＧＦＡＴの発現が構成的に抑制され、膵臓のβ細胞の選択的破壊薬であるストレプトゾトシンを投与すると、β細胞のアポトーシスが抑制されて、血糖値が改善されることが報告されている（例えば、非特許文献１９参照）。
【００１１】
糖尿病患者においては、このＧＦＡＴ活性が一般的に高いことが知られており、高血糖値を示す一つの原因であると考えられる（例えば、非特許文献２０参照）。
【００１２】
ヒト由来のＧＦＡＴは、現在ＧＦＡＴ１（例えば、非特許文献２１参照）とＧＦＡＴ２（例えば、特許文献１および非特許文献２２参照）の２種が知られている。ＧＦＡＴ１は６８１アミノ酸から、ＧＦＡＴ２は６８２アミノ酸からなる、それぞれ７７ｋＤａのタンパク質であることが報告されているが、ＧＦＡＴ１遺伝子については、その全長配列は未だ解明されていない。また、ヒトＧＦＡＴ１と同ＧＦＡＴ２のアミノ酸配列相同性は７８％である。また、マウス由来（例えば、非特許文献２３参照）、酵母由来ＧＦＡＴ（例えば、非特許文献２４参照）、あるいは、大腸菌由来ＧＦＡＴ（例えば、非特許文献２５参照）も報告されているが、いずれもヒトＧＦＡＴに高い相同性を示す。
【００１３】
最近のファーマコジェノミクス研究の進展により、遺伝子多型と薬効、あるいは遺伝子多型と副作用の関係から、個々の患者に対する薬物の効果や副作用を、遺伝子診断で予測することが可能になりつつある。また、遺伝子多型と疾患との関係を調べることにより、一部の疾患の事前診断や予後の判定も可能になりつつある。前者の例としては、薬物代謝酵素の遺伝子多型の例が挙げられる。多型により活性が増加、あるいは、減少する薬物代謝酵素としては、シトクロムＰ４５０１Ａ２、シトクロムＰ４５０２Ａ６、シトクロムＰ４５０２Ｃ９、シトクロムＰ４５０２Ｃ１９，シトクロムＰ４５０２Ｄ６、シトクロムＰ４５０２Ｅ１などが知られている。また、チオプリンメチルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ、ＵＤＰ−グルクウロノシルトランスフェラーゼ、および、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼなど抱合酵素と呼ばれる一群の酵素群にも遺伝子多型が存在し、多型により活性が減少することが報告されている（例えば、非特許文献２６参照）。後者の例としては、多型解析研究から見出された、疾患原因遺伝子が多数報告されている。例えば、▲１▼潰瘍性大腸炎の原因遺伝子としてのＨＬＡ、▲２▼慢性関節リウマチの原因遺伝子としてのＴＣＲα、▲３▼アルツアイマー病の原因遺伝子としてのＡＰＯＥ４、▲４▼精神分裂症の原因遺伝子としてのドーパミンＤ３受容体、▲５▼躁鬱病の原因遺伝子としてのトリプトファン水酸化酵素、▲６▼アルブミン尿症の原因遺伝子としてのアンジオテンシン前駆体、▲７▼心筋梗塞の原因遺伝子としての血液凝固因子ＶＩＩ、▲８▼肥満の原因遺伝子としてのレプチンなどが挙げられる（例えば、非特許文献２７参照）。
【００１４】
ＴＮＦ−αは、各種炎症性疾患の病態形成に関与する重要な物質であると考えられているが、最近、ＴＮＦ−α遺伝子の５’末端側上流域にこの遺伝子の発現を亢進する多型が存在することが見出された（例えば、非特許文献２８参照）。これらの多型は、ＴＮＦ−α遺伝子の発現量を亢進させるものであるため、多型を検出することにより、若年性関節リウマチ、慢性関節リウマチ、糖尿病等のＴＮＦ−αが関与する疾患の事前診断が可能となる（例えば、特許文献２参照）。
【００１５】
糖尿病に関しても、遺伝子の変異と糖尿病発症との関連が検討されている。現在までに明らかになっている、単独の異常によって糖尿病を発症するとされている遺伝子としては、インスリン、インスリン受容体、インスリンプロモーター因子、グルコキナーゼ、ヘパトサイトニュークレアーファクター、アミリン、骨格筋グリコーゲン合成酵素、およびミトコンドリア遺伝子などがある。また、２型糖尿病の発症に関与すると考えられる遺伝子として、インスリンレセプターサブストレイト、グルコーストランスポーター、ミトコンドリアグリセロリン酸デヒドロゲナーゼ、脂肪酸結合タンパク質、アドレナリンレセプター、グルカゴンレセプター、カリウムチャンネル、ＣＤ３８などが挙げられる（例えば、非特許文献２９参照）。
【００１６】
また、最近、ＣＤ３８におけるＡｒｇ１４０Ｔｒｐ多型は、糖尿病のリスクを上昇させることが報告された（例えば、非特許文献３０参照）。この多型は、日本人の糖尿病患者に約１３％の頻度で見出されていることから、糖尿病の対するリスク診断に有用であると考えられている。
【００１７】
しかしながら、ＧＦＡＴ遺伝子の多型と２型糖尿病との関係については何ら知られていない。また、２型糖尿病は、単一の遺伝子の変異や多型によって生じるというよりは、複数の遺伝子多型、あるいは、食生活などの外的要因で発症すると考えられており、その発症機構には未解明な点が多い。したがって、２型糖尿病の発症に関与する遺伝子やその多型については、今後さらにその研究を進めることが望まれている。
【００１８】
【特許文献１】
特開平１０−１０８６８３号公報
【特許文献２】
国際公開第９８／５４３６１号パンフレット
【００１９】
【非特許文献１】
ダイアビティース・フロンティア（Ｄｉａｂｅｔｅｓ　Ｆｒｏｎｔｉｅｒ），　３，　５５７−５６４　（１９９２）
【非特許文献２】
ドラッグス（Ｄｒｕｇｓ），　４６，１０２５−１０５４　（１９９４）
【非特許文献３】
医学のあゆみ，　１４９，　５９１−６１８　（１９８９）
【非特許文献４】
臨床と研究，６７，　２１９−２３３　（１９９０）
【非特許文献５】
臨床と研究，　６９，　９１９−９３２　（１９９２）
【非特許文献６】
臨床医２１（増刊），　５７８−５８７（１９９５）
【非特許文献７】
ダイアビティース（Ｄｉａｂｅｔｅｓ），　３７，　１５４９−１５５８　（１９９８）
【非特許文献８】
ライフ・サイエンス（Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉ．），　６７，　２４０５−２４１６　（２０００）
【非特許文献９】
メタボリズム（Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ），　４４，　４８６−４９０　（１９９５）
【非特許文献１０】
ニュー・イングランド・ジャーナル・オブ・メディシン（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌ．　Ｊ．Ｍｅｄ．），　３３１，　１１８８−１１９３　（１９９４）
【非特許文献１１】
後藤由夫編，「新しい糖尿病治療薬」，医薬ジャーナル社，大阪，　（１９９４）
【非特許文献１２】
ニュー・イングランド・ジャーナル・オブ・メディシン（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌ．　Ｊ．　Ｍｅｄ．），　３３３，　５４１−５４９　（１９９５）
【非特許文献１３】
ダイアビティース・スペクトラム（Ｄｉａｂｅｔｅｓ　Ｓｐｅｃｔｒｕｍ），　８，　１９４　−１９７（１９９５）
【非特許文献１４】
ファセブ・ジャーナル（ＦＡＳＥＢ　Ｊ．），５，　３０３１−３０３６　（１９９１）
【非特許文献１５】
ダイアビィトロジア（Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ），　３８，　５１８−５２４　（１９９５）
【非特許文献１６】
ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．），　２６６，１０１５５−１０１６１　（１９９１）
【非特許文献１７】
ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．），　２６６，４７０６−４７１２　（１９９１）
【非特許文献１８】
エンドクリノロジー（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ），　１３６，　２８０９−２８１６　（１９９５）
【非特許文献１９】
プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミィ・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユナイテット・ステーツ・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ），　９７，　２８２０−２８２５　（２０００）
【非特許文献２０】
ダイアビティース（Ｄｉａｂｅｔｅｓ），　４５，　３０２−３０７　（１９９６）
【非特許文献２１】
ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．），　２６７，２５２０８−２５２１２　（１９９２）
【非特許文献２２】
ゲノミクス（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ），　５７，　２２７−２３４　（１９９９）
【非特許文献２３】
ジーン（Ｇｅｎｅ），　１４０，　２８９−２９０　（１９９４）
【非特許文献２４】
ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．），　２６４，８７５３−８７５８　（１９８９）
【非特許文献２５】
バイオケミカル・ジャーナル（Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｊ．），　２２４，　７７９−８１５　（１９８４）
【非特許文献２６】
中村祐輔編，「ＳＮＰ遺伝子多型の戦略」，中山書店，東京，　（２０００）
【非特許文献２７】
ネイチャー・ジェネティクス（Ｎａｔ．　Ｇｅｎｅｔ．），　２２，　１３９−１４４　（１９９９）
【非特許文献２８】
ティシュー・アンチゲンズ（Ｔｉｓｓｕｅ　Ａｎｔｉｇｅｎｓ），　５１，　６０５−６１２　（１９９８）
【非特許文献２９】
門脇孝編，「糖尿病の最前線」，羊土社，東京，　（１９９７）
【非特許文献３０】
ダイアベトロジア（Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ），　４１，　１０２４−１０２８　（１９９８）
【００２０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、糖尿病、特に２型糖尿病の発症の危険度を判定するための判定方法、および該方法のための試薬およびキットを提供することにある。
【００２１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、糖尿病患者および健常者から単離したＤＮＡ試料を対象として、ＧＦＡＴ１遺伝子およびＧＦＡＴ２遺伝子中に存在する遺伝子多型の頻度を調べた結果、糖尿病患者に高い頻度で現れる複数の遺伝子多型が存在することを見出した。そして、該遺伝子多型を検出することにより、糖尿病を発症する潜在的な危険度を高い確率で判定できることを見出し、本発明を完成させた。
【００２２】
すなわち、本発明は以下の（１）〜（１３）を提供する。
（１）ヒトゲノムＤＮＡを含む試料において、下記ａ）〜ｈ）から選ばれるいずれか一つまたは二つ以上の位置に存在する遺伝子多型、および／またはその組合せからなるハプロタイプを検出することにより、該試料提供者の糖尿病の発症危険度を判定する方法。
ａ）ＧＦＡＴ（グルタミン：フルクトース−６−リン酸アミドトランスフェラーゼ）１遺伝子の第１イントロンの３６番目のヌクレオチド（配列番号１のヌクレオチド番号６３２）
ｂ）ＧＦＡＴ１遺伝子の第１１イントロンの７番目のヌクレオチド（配列番号２のヌクレオチド番号２６６）
ｃ）ＧＦＡＴ１遺伝子の第１２イントロンの−１４７番目のヌクレオチド（配列番号３のヌクレオチド番号３３８）
ｄ）ＧＦＡＴ１遺伝子の第８イントロンの１８５３〜１８７７番目のヌクレオチド（配列番号４のヌクレオチド番号３３６〜３６０）
ｅ）ＧＦＡＴ１遺伝子の第１２イントロンの１９８８〜２００７番目のヌクレオチド（配列番号５のヌクレオチド番号３２８〜３４７）
ｆ）ＧＦＡＴ１遺伝子の第１８イントロンの−１１〜−２２番目のヌクレオチド（配列番号６のヌクレオチド番号２５３〜２６４）
ｇ）ＧＦＡＴ１遺伝子の第３イントロンの２６３２から２６６１番目のヌクレオチド（配列番号７のヌクレオチド番号２３７〜２６６）
ｈ）ＧＦＡＴ２遺伝子の第１８エキソンの６６番目のヌクレオチド（配列番号２３のヌクレオチド番号２２５１）
【００２３】
（２）糖尿病が２型糖尿病である、上記（１）に記載の方法。
【００２４】
（３）検出対象が、下記ａ）〜ｆ）およびｈ）の位置に存在する遺伝子多型、ならびに下記ｘ）〜ｚ）で示されるハプロタイプ、から選ばれるいずれか一つまたは二つ以上である、上記（１）または（２）に記載の方法。
ａ）ＧＦＡＴ１遺伝子の第１イントロンの３６番目のヌクレオチド（配列番号１のヌクレオチド番号６３２）
ｂ）ＧＦＡＴ１遺伝子の第１１イントロンの７番目のヌクレオチド（配列番号２のヌクレオチド番号２６６）
ｃ）ＧＦＡＴ１遺伝子の第１２イントロンの−１４７番目のヌクレオチド（配列番号３のヌクレオチド番号３３８）
ｄ）ＧＦＡＴ１遺伝子の第８イントロンの１８５３〜１８７７番目のヌクレオチド（配列番号４のヌクレオチド番号３３６〜３６０）
ｅ）ＧＦＡＴ１遺伝子の第１２イントロンの１９８８〜２００７番目のヌクレオチド（配列番号５のヌクレオチド番号３２８〜３４７）
ｆ）ＧＦＡＴ１遺伝子の第１８イントロンの−１１〜−２２番目のヌクレオチド（配列番号６のヌクレオチド番号２５３〜２６４）
ｈ）ＧＦＡＴ２遺伝子の第１８エキソンの６６番目のヌクレオチド（配列番号２３のヌクレオチド番号２２５１）
ｘ）ＧＦＡＴ１遺伝子の第１イントロンの３６番目のヌクレオチド（配列番号１のヌクレオチド番号６３２）、および同第１８イントロンの−１１から−２２番目のヌクレオチド（配列番号６のヌクレオチド番号２５３〜２６４）に存在する遺伝子多型の組合せからなるハプロタイプ
ｙ）ＧＦＡＴ１遺伝子の第１１イントロンの７番目のヌクレオチド（配列番号２のヌクレオチド番号２６６）、および同第１８イントロンの−１１から−２２番目のヌクレオチド（配列番号６のヌクレオチド番号２５３〜２６４）に存在する遺伝子多型の組合せからなるハプロタイプ
ｚ）ＧＦＡＴ１遺伝子の第１８イントロンの−１１から−２２番目のヌクレオチド（配列番号６のヌクレオチド番号２５３〜２６４）、および同第３イントロンの２６３２から２６６１番目のヌクレオチド（配列番号７のヌクレオチド番号２３７〜２６６）に存在する遺伝子多型の組合せからなるハプロタイプ
【００２５】
（４）ヒトゲノムＤＮＡを含む試料において、下記ｈ）の位置に存在する遺伝子多型、およびｘ）〜ｚ）で示されるハプロタイプから選ばれるいずれか一つまたは二つ以上を検出することにより、該試料提供者の腎症を伴わない２型糖尿病の発症危険度を判定する方法。
ｈ）ＧＦＡＴ２遺伝子の第１８エキソンの６６番目のヌクレオチド（配列番号２３のヌクレオチド番号２２５１）
ｘ）ＧＦＡＴ１遺伝子の第１イントロンの３６番目のヌクレオチド（配列番号１のヌクレオチド番号６３２）、および同第１８イントロンの−１１から−２２番目のヌクレオチド（配列番号６のヌクレオチド番号２５３〜２６４）に存在する遺伝子多型の組合せからなるハプロタイプ
ｙ）ＧＦＡＴ１遺伝子の第１１イントロンの７番目のヌクレオチド（配列番号２のヌクレオチド番号２６６）、および同第１８イントロンの−１１から−２２番目のヌクレオチド（配列番号６のヌクレオチド番号２５３〜２６４）に存在する遺伝子多型の組合せからなるハプロタイプ
ｚ）ＧＦＡＴ１遺伝子の第１８イントロンの−１１から−２２番目のヌクレオチド（配列番号６のヌクレオチド番号２５３〜２６４）、および同第３イントロンの２６３２から２６６１番目のヌクレオチド（配列番号７のヌクレオチド番号２３７〜２６６）に存在する遺伝子多型の組合せからなるハプロタイプ
【００２６】
（５）ヒトゲノムＤＮＡを含む試料において、下記ａ）、ｂ）の位置に存在する遺伝子多型、およびｚ）で示されるハプロタイプから選ばれるいずれか一つまたは二つ以上を検出することにより、該試料提供者の腎症を伴う２型糖尿病の発症危険度を判定する方法。
ａ）ＧＦＡＴ１遺伝子の第１イントロンの３６番目のヌクレオチド（配列番号１のヌクレオチド番号６３２）
ｂ）ＧＦＡＴ１遺伝子の第１１イントロンの７番目のヌクレオチド（配列番号２のヌクレオチド番号２６６）
ｚ）ＧＦＡＴ１遺伝子の第１８イントロンの−１１から−２２番目のヌクレオチド（配列番号６のヌクレオチド番号２５３〜２６４）、および同第３イントロンの２６３２から２６６１番目のヌクレオチド（配列番号７のヌクレオチド番号２３７〜２６６）に存在する遺伝子多型の組合せからなるハプロタイプ
【００２７】
（６）ヒトゲノムＤＮＡを含む試料において、下記ｚ）で示されるハプロタイプを検出することにより、該試料提供者の１型糖尿病の発症危険度を判定する方法。
ｚ）ＧＦＡＴ１遺伝子の第１８イントロンの−１１から−２２番目のヌクレオチド（配列番号６のヌクレオチド番号２５３〜２６４）、および同第３イントロンの２６３２から２６６１番目のヌクレオチド（配列番号７のヌクレオチド番号２３７〜２６６）に存在する遺伝子多型の組合せからなるハプロタイプ
【００２８】
（７）検出が、ＲＦＬＰ法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法、ＡＳＯハイブリダイゼーション、ダイレクトシークエンス法、ＡＲＭＳ法、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法、ＲＮａｓｅＡ切断法、化学切断法、ＤＯＬ法、ＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ法、インベーダー法、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法、ＴＤＩ法、モレキュラー・ビーコン法、ダイナミック・アレルスペシフィック・ハイブリダイゼーション法、パドロック・プローブ法、ＵＣＡＮ法、ＤＮＡチップまたはＤＮＡマイクロアレイを用いた核酸ハイブリダイゼーション法、、およびＥＣＡ法からなる群より選ばれる一つまたは二つ以上の方法を用いて行われることを特徴とする、上記（１）〜（６）のいずれか１項に記載の方法。
【００２９】
（８）検出が、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法またはダイレクトシークエンス法を用いて行われることを特徴とする、上記（７）に記載の方法。
【００３０】
（９）配列番号２２で示されるＧＦＡＴ１遺伝子上において、下記ａ）〜ｇ）から選ばれるいずれか一つのヌクレオチドまたはヌクレオチド配列を含む、１６〜５００塩基長の連続したポリヌクレオチド、またはその標識物；
ａ）ＧＦＡＴ１遺伝子の第１イントロンの３６番目のヌクレオチド（配列番号１のヌクレオチド番号６３２）
ｂ）ＧＦＡＴ１遺伝子の第１１イントロンの７番目のヌクレオチド（配列番号２のヌクレオチド番号２６６）
ｃ）ＧＦＡＴ１遺伝子の第１２イントロンの−１４７番目のヌクレオチド（配列番号３のヌクレオチド番号３３８）
ｄ）ＧＦＡＴ１遺伝子の第８イントロンの１８５３〜１８７７番目のヌクレオチド（配列番号４のヌクレオチド番号３３６〜３６０）
ｅ）ＧＦＡＴ１遺伝子の第１２イントロンの１９８８〜２００７番目のヌクレオチド（配列番号５のヌクレオチド番号３２８〜３４７）
ｆ）ＧＦＡＴ１遺伝子の第１８イントロンの−１１〜−２２番目のヌクレオチド（配列番号６のヌクレオチド番号２５３〜２６４）
ｇ）ＧＦＡＴ１遺伝子の第３イントロンの２６３２から２６６１番目のヌクレオチド（配列番号７のヌクレオチド番号２３７〜２６６）
もしくは、配列番号２３で示されるＧＦＡＴ２遺伝子断片上において、第１８エキソンの６６番目のヌクレオチド（配列番号２３のヌクレオチド番号２２５１）を含む、１６〜５００塩基長の連続したポリヌクレオチド、またはその標識物。
（ただし、上記ポリヌクレオチドがＲＮＡである場合、配列表中の塩基記号「ｔ」は「ｕ」に読み替えるものとする）。
【００３１】
（１０）配列番号２２で示されるＧＦＡＴ１遺伝子上において、下記ａ）〜ｇ）から選ばれるいずれか一つのヌクレオチドまたはヌクレオチド配列を含む、１６〜１０００塩基長の連続したポリヌクレオチドの一部にハイブリダイズし、該ポリヌクレオチドを特異的に増幅するための、１５〜３０塩基長のオリゴヌクレオチド、またはその標識物；
ａ）ＧＦＡＴ（グルタミン：フルクトース−６−リン酸アミドトランスフェラーゼ）１遺伝子の第１イントロンの３６番目のヌクレオチド（配列番号１のヌクレオチド番号６３２）
ｂ）ＧＦＡＴ１遺伝子の第１１イントロンの７番目のヌクレオチド（配列番号２のヌクレオチド番号２６６）
ｃ）ＧＦＡＴ１遺伝子の第１２イントロンの−１４７番目のヌクレオチド（配列番号３のヌクレオチド番号３３８）
ｄ）ＧＦＡＴ１遺伝子の第８イントロンの１８５３〜１８７７番目のヌクレオチド（配列番号４のヌクレオチド番号３３６〜３６０）
ｅ）ＧＦＡＴ１遺伝子の第１２イントロンの１９８８〜２００７番目のヌクレオチド（配列番号５のヌクレオチド番号３２８〜３４７）
ｆ）ＧＦＡＴ１遺伝子の第１８イントロンの−１１〜−２２番目のヌクレオチド（配列番号６のヌクレオチド番号２５３〜２６４）
ｇ）ＧＦＡＴ１遺伝子の第３イントロンの２６３２から２６６１番目のヌクレオチド（配列番号７のヌクレオチド番号２３７〜２６６）
もしくは、配列番号２３で示されるＧＦＡＴ２遺伝子断片上において、第１８エキソンの６６番目のヌクレオチド（配列番号２３のヌクレオチド番号２２５１）を含む、１６〜１０００塩基長の連続したポリヌクレオチドの一部にハイブリダイズし、該ポリヌクレオチドを特異的に増幅するための、１５〜３０塩基長のオリゴヌクレオチド、またはその標識物。
（ただし、上記ポリヌクレオチドがＲＮＡである場合、配列表中の塩基記号「ｔ」は「ｕ」に読み替えるものとする）。
【００３２】
（１１）上記（９）に記載のポリヌクレオチドを固定した固相化試料。
【００３３】
（１２）以下の１）〜３）から選ばれる少なくとも一つ以上を含む、糖尿病の発症危険性判定用試薬またはキット。
１）上記（９）に記載のポリヌクレオチド、またはその標識物
２）上記（１０）に記載のオリゴヌクレオチド、またはその標識物
３）上記（１１）に記載の固相化試料
【００３４】
（１３）以下の（Ａ）または（Ｂ）のＤＮＡ。
（Ａ）配列番号２２で示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡ
（Ｂ）配列番号２２で示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡと少なくとも８５％以上の相同性を有し、かつＧＦＡＴ活性を有するヒト由来のタンパク質をコードするＤＮＡ
【００３５】
【発明の実施の形態】
本発明の方法は、ヒトゲノムＤＮＡを含む試料において、ＧＦＡＴ１遺伝子および／またはＧＦＡＴ２遺伝子上に存在する新規遺伝子多型を検出することにより、該試料提供者の糖尿病の発症危険度を判定する方法である。
【００３６】
本明細書中において、「遺伝子多型」には、いわゆる単一ヌクレオチド多型（１塩基多型：ｓｉｎｇｌｅ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ：ＳＮＰ）、および連続した複数ヌクレオチドにわたる多型、の両方を含むものとする。すなわち、ヒトの集団において、ある一個体のゲノム配列を基準として、他の１または複数の個体ゲノム中の特定部位に、１または複数ヌクレオチドの置換、欠失、挿入、転位、逆位等の変異が存在するとき、その変異が当該１または複数の個体に生じた突然変異でないことが統計的に確実か、または当該個体内突然変異でなく、１％以上の頻度で集団内に存在することが家系的に証明される場合、その変異を「遺伝子多型」とする。
【００３７】
以下、本発明の方法について詳細に説明する。
１．糖尿病の発症に関連した新規遺伝子多型
本発明で検出対象とする遺伝子多型は、糖尿病患者に高い頻度で現れることが確認された、ＧＦＡＴ１遺伝子またはＧＦＡＴ２遺伝子上に存在する新規遺伝子多型である。該遺伝子多型は、具体的には、以下のａ）〜ｈ）の位置に存在する。
ａ）ＧＦＡＴ１遺伝子の第１イントロンの３６番目のヌクレオチド（配列番号１のヌクレオチド番号６３２）
ｂ）ＧＦＡＴ１遺伝子の第１１イントロンの７番目のヌクレオチド（配列番号２のヌクレオチド番号２６６）
ｃ）ＧＦＡＴ１遺伝子の第１２イントロンの−１４７番目のヌクレオチド（配列番号３のヌクレオチド番号３３８）
ｄ）ＧＦＡＴ１遺伝子の第８イントロンの１８５３から１８７７番目のヌクレオチド（配列番号４のヌクレオチド番号３３６〜３６０）
ｅ）ＧＦＡＴ１遺伝子の第１２イントロンの１９８８から２００７番目のヌクレオチド（配列番号５のヌクレオチド番号３２８〜３４７）
ｆ）ＧＦＡＴ１遺伝子の第１８イントロンの−１１から−２２番目のヌクレオチド（配列番号６のヌクレオチド番号２５３〜２６４）
ｇ）ＧＦＡＴ１遺伝子の第３イントロンの２６３２から２６６１番目のヌクレオチド（配列番号７のヌクレオチド番号２３７〜２６６）
ｈ）ＧＦＡＴ２遺伝子の第１８エキソンの６６番目のヌクレオチド（配列番号２３のヌクレオチド番号２２５１）
【００３８】
本発明の方法においては、上記ａ）〜ｈ）から選ばれるいずれか一つまたは二つ以上の位置に存在する、遺伝子多型および／またはその組合せからなるハプロタイプを検出して、糖尿病の発症危険度を判定する。すなわち、判定は一つまたは二つ以上の遺伝子多型の検出結果に基づいて行っても良いし、二つ以上の遺伝子多型を組合せたハプロタイプの検出結果に基づいて行ってもよい。また、上記多型とハプロタイプを組み合わせて判定してもよい。
【００３９】
２．ヒトゲノムＤＮＡを含む試料の調製
本発明の方法で用いられる「ヒトゲノムＤＮＡを含む試料」は、被験者および臨床検体等から単離されたあらゆる細胞（生殖細胞を除く）、組織、臓器等を材料として調製される。該材料としては、末梢血から分離した白血球または単核球が好ましく、特に白血球が最も好適である。これらの材料は、臨床検査において通常用いられる方法にしたがって単離される。
【００４０】
例えば白血球を材料とする場合、まず被験者より単離した末梢血から常法に従って白血球を分離する。次いで、得られた白血球にプロテイナーゼＫとドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を加えてタンパク質を分解、変性させた後、フェノール／クロロホルム抽出を行うことによりゲノムＤＮＡ（ＲＮＡを含む）を得る。ＲＮＡは、必要に応じてＲＮａｓｅにより除去することができる。ただし、ゲノムＤＮＡの抽出は、上記の方法に限定されず、当該技術分野で周知の方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，　Ｊ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９８９）：”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　（２ｎｄ　Ｅｄ．）”　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，　ＮＹ）や、市販のＤＮＡ抽出キット等を利用して行ってもよい。
【００４１】
３．遺伝子多型の検出
次に、得られたヒトゲノムＤＮＡを含む試料から、本発明者らによって解明された、糖尿病（特に２型糖尿病）と極めて関連の深い新規遺伝子多型を検出する。以下、代表的な遺伝子多型検出方法について説明する。
【００４２】
（１）ＲＦＬＰ（制限酵素切断断片長多型）法
遺伝子多型部位が制限酵素認識部位に含まれる場合、その制限酵素の消化により生じるＤＮＡ断片の長さの違いにから、当該遺伝子多型の検出が可能である。この場合、▲１▼ゲノムＤＮＡを制限酵素で分解後、サザンブロットを行なう方法と、▲２▼多型部位を含むＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅後、制限酵素で切断し、電気泳動により切断されたＤＮＡ断片の大きさを解析する方法が挙げられる。▲１▼の方法で用いられるプローブとしては、目的の多型部位を含んで、かつその多型部位から５’末端側および３’末端側にそれぞれ約０．０５〜２ｋｂにわたる配列に相当するＤＮＡ断片（アイソトープ、ビオチンあるいは蛍光色素等で標識されたもの）が好ましい。また、▲２▼の方法に用いられるＰＣＲプライマーとしては、多型部位を含む約０．０５〜４ｋｂのＤＮＡ断片を増幅するための、１５〜３０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドが好ましい。
【００４３】
（２）ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法（一本鎖ＤＮＡ高次構造多型解析）
ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法は、遺伝子多型部位を含むＤＮＡ断片をＰＣＲで増幅後、熱変性し、電気泳動により、高次構造の異なる１本鎖ＤＮＡを分離する方法である〔Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，　１６，２９６−２９７　（１９９４），　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，　２１，　５１０−５１４　（１９９６）〕。遺伝子多型の有無により、１本鎖ＤＮＡの泳動距離が異なるため、そのパターンを解析することにより、多型のタイピングが可能である。タイピングの標準とするために、予め多型部位のヌクレオチド配列が確認されているヒトゲノム由来のＤＮＡ試料を、ＰＣＲの際の鋳型ＤＮＡとして、被検試料と同時に用いることが好ましい。ＰＣＲ増幅用プライマーとしては、５’末端を蛍光色素で標識した、多型部位を含む約５０〜５００ｂｐのＤＮＡ断片を増幅するための１５〜３０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドが好ましい。
【００４４】
（３）ＡＳＯ（Ａｌｌｅｌｅ　Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）ハイブリダイゼーション法
ＡＳＯハイブリダイゼーション法は、遺伝子多型部位を含むＰＣＲ産物をナイロンフィルターなどの支持体にドットブロットし、それぞれの遺伝子多型に対応したプローブとのハイブリダイゼーション後、そのプローブのＴｍ値に準じた洗浄操作を行い、多型を検出（ミスマッチがあればハイブリッドが外れる）する方法である〔Ｃｌｉｎ．　Ｃｈｉｍ．　Ａｃｔａ，　１８９，　１５３−１５７　（１９９０）〕。プローブとしては、通常１５〜２５ｍｅｒ程度の合成オリゴヌクレオチド（シグナルを得るにはラジオアイソトープ、ビオチンまたは蛍光色素による標識が必要）が用いられる。また、ＰＣＲプライマーとしては、多型部位を含む約０．０５〜４ｋｂのＤＮＡ断片を増幅するための、１５〜３０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドが好ましい。
【００４５】
（４）ダイレクトシークエンス法
ダイレクトシークエンス法は、遺伝子多型部位を含むＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅した後、増幅されたＤＮＡのヌクレオチド配列を直接ダイデオキシ法により解析する方法である〔Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，　１１，　２４６−２４９　（１９９１）〕。この方法で用いられるＰＣＲプライマーは、好ましくは、多型部位を含む約０．０５〜４ｋｂのＤＮＡ断片を増幅するための、１５〜３０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドである。また、シークエンスプライマーとしては、好ましくは、多型部位から５０〜３００ヌクレオチド程度５’末端側の位置に相当する１５〜３０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドを用いる。
【００４６】
（５）ＡＲＭＳ（Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｒｅｆｒａｃｔｉｎｇ　Ｍｕｔａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ）法
ＰＣＲでは、鋳型ＤＮＡにプライマーがアニールした後、ＤＮＡポリメラーゼにより５’末端側から３’末端側に相補鎖ＤＮＡが合成される。プライマーの３’末端ヌクレオチドにミスマッチがあると、ＰＣＲの効率が低下し、電気泳動による検出が不可能になる。ＡＲＭＳ法は、その３’末端ヌクレオチドが検出しようとする変異ヌクレオチドに相補的になるように設計されたプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物の有無で遺伝子多型を検出する方法である〔Ｎｕｃ．　Ａｃｉｄｓ．　Ｒｅｓ．，　１９，　３５６１−３５６７　（１９９１），　Ｎｕｃ．　Ａｃｉｄｓ．　Ｒｅｓ．，　２０，４８３１−４８３７　（１９９２）〕。この方法で用いられるＰＣＲプライマーは、１つは３’末端に多型部位が位置するように設計された、好ましくは１５〜３０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドであり、もう１つは、好ましくは、多型部位から０．０５〜２ｋｂ程度離れた部分の１５〜３０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドである。
【００４７】
（６）変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（Ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ　Ｇｒａｄｉｅｎｔ　Ｇｅｌ　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、以下「ＤＧＧＥ」という）法
ＤＧＧＥ法は、ＰＣＲ産物中の、ミスマッチを有するヘテロデュプレックスが、ホモデュプレックスよりも解離が容易であることを利用して遺伝子多型を検出する方法である〔Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｓ，　２７，　１０１６−１０１８　（１９９９）〕。ヘテロデュプレックスは、解離が進むにつれ、ゲル電気泳動における移動度が低下するので、使用するポリアクリルアミドゲル中に尿素およびホルムアミドの密度勾配を設定しておくと、ホモデュプレックスとの移動度の差がさらに強調され、ミスマッチを含む２本鎖ＤＮＡの存在、すなわち変異の存在が検出される。この方法で用いられるＰＣＲプライマーは通常、多型部位を含む約０．０５〜０．５ｋｂのＤＮＡ断片を増幅するための、１５〜３０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドである。
【００４８】
（７）ＲＮａｓｅＡ切断法
ＲＮａｓｅＡ（ＲＮＡ分解酵素）は、２本鎖ＲＮＡもしくはＲＮＡ／ＤＮＡコンプレックスを分解せず、１本鎖のＲＮＡのみを分解する特性を有する。したがって、多型部位を含むＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅した後、アイソトープ標識したＲＮＡプローブを、変性して１本鎖にしたＰＣＲ産物とハイブリダイズさせ、ＲＮａｓｅＡ処理後、電気泳動により分離すれば、変異型とハイブリダイズしたＲＮＡプローブはミスマッチ部位で切断されるため、２本のバンドとして検出できる〔ＤＮＡ　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．，　１４，　８７−９４　（１９９５）〕。この方法で用いられるＲＮＡプローブとしては、多型部位を含む通常１５〜３０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドが好ましい。
【００４９】
（８）化学切断法
多型部位を含むＤＮＡ断片をＰＣＲにより増幅後、２本鎖ＤＮＡのミスマッチ部位の「ｃ（シトシン）」に対してはヒドロキシルアミン、「ｔ（チミン）」に対してはオスミウムテトラオキシドで別個に修飾し、ピペリジン処理をすると、糖が切断される。標識プローブを用いて２本鎖を形成させ、上記処理を行った後、電気泳動し、プローブのサイズが短くなっていれば変異が検出されたことになる〔Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，　２１，　２１６−２１８　（１９９６）〕。この方法で用いられるＰＣＲプライマーは通常、多型部位を含む約０．０５〜４ｋｂのＤＮＡ断片を増幅するための、１５〜３０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドである。
【００５０】
（９）ＤＯＬ（Ｄｙｅ−ｌａｂｅｌｅｄ　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｌｉｇａｔｉｏｎ）法
ＤＯＬ法は、遺伝子多型を含むＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅した後、蛍光標識された多型部位の直前の塩基まで含むダイプライマーと、それぞれのアレルに特異的な蛍光色素で標識されたダイターミネーターを耐熱性ＤＮＡリガーゼで連結させる方法である〔Ｇｅｎｏｍｅ　Ｒｅｓ．，　８，　５４９−５５６　（１９９８）〕。この方法で用いられるＰＣＲプライマーは、通常多型部位を含む約０．０５〜２ｋｂのＤＮＡ断片を増幅するための、１５〜３０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドである。
【００５１】
（１０）ＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ法
ＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ法は、蛍光標識したアレル特異的オリゴヌクレオチド（ＴａｑＭａｎプローブ）とＴａｑＤＮＡポリメラーゼによるＰＣＲを利用した方法である〔Ｇｅｎｅｔ．　Ａｎａｌ．，　１４，　１４３−１４９　（１９９９），　Ｊ．　Ｃｌｉｎ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，　３４，　２９３３−２９３６　（１９９６）〕。この方法で用いられるＰＣＲプライマーは、通常多型部位を含む約０．０５〜２ｋｂのＤＮＡ断片を増幅するための、１５〜３０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドである。また、ＴａｑＭａｎプローブは、多型部位を含む１５〜３０塩基程度のオリゴヌクレオチドであり、５’末端は蛍光レポーター色素によって標識されており、３’末端はクエンチャー（消光物質）によって標識されている。このプローブを用いることにより、野生型と変異型のヌクレオチド変化の検出が可能である。
【００５２】
（１１）インベーダー法
インベーダー法では、２種類の非蛍光標識オリゴヌクレオチドと１種類の蛍光標識オリゴヌクレオチドが使用される。非蛍光標識オリゴヌクレオチドの一つは、その５’末端側に、検出しようとする多型部位の存在するゲノム配列（以下「鋳型」という）とは無関係な配列（以下「フラップ」という）を有しており、フラップより３’末端側は、鋳型の多型部位から５’末端側の配列に特異的な相補配列となっている（以下「アレルプローブ」という）。すなわちアレルプローブの鋳型に特異的な相補配列部分の５’末端は鋳型の多型部位に相当する。もう一つの非蛍光標識オリゴヌクレオチドは、鋳型の多型部位から３’末端側の配列に特異的な相補配列を有する（以下「インベーダープローブ」という）。インベーダープローブの３’末端も鋳型の多型部位に相当するが、鋳型の多型部位のヌクレオチドとは相補的でなくてもよい。蛍光標識オリゴヌクレオチド（以下「ＦＲＥＴ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｒｅｓｏｎａｎｃｅ　ｅｎｅｒｇｙ　ｔｒａｎｓｆｅｒ）プローブ」という）は、３’末端側部分がフラップと相補的な配列であり、５’末端側はパリンドローム配列になっているため自ら二本鎖を形成している。またＦＲＥＴプローブの５’末端近傍は蛍光色素で標識され、５’末端にはその蛍光を打ち消すクエンチャーが結合している。まず鋳型にアレルプローブとインベーダープローブをハイブリダイズさせると、アレルプローブと鋳型とが多型部位において相補的である場合は、その多型部位において、鋳型、アレルプローブの５’末端およびインベーダープローブの３’末端が特殊な構造を形成する。この構造を特異的に認識してエンドヌクレアーゼ活性を表す酵素（以下「クリベース」という）が、アレルプローブからフラップ部分を切り離す。遊離したフラップはＦＲＥＴプローブの３’末端側とハイブリダイズする。このとき、フラップとＦＲＥＴプローブとが、ＦＲＥＴプローブのクエンチャーが結合している５’末端の位置において、クリベースに特異的に認識される構造を形成するため、クエンチャーが結合している５’末端ヌクレオチドがクリベースによりＦＲＥＴプローブから切り離されて、ＦＲＥＴプローブに残った蛍光色素が蛍光を発する。一方、鋳型配列に変異が存在し、アレルプローブと鋳型とが多型部位において相補的でなく、ミスマッチとなっている場合は、クリベースに特異的に認識される構造が形成されないため、フラップはアレルプローブから切り離されない。このとき、切り離されずにアレルプローブに残ったままのフラップもＦＲＥＴプローブの３’末端側とハイブリダイズ可能であるが、アレルプローブから切り離されたフラップがハイブリダイズした場合と比較すると、クエンチャーが結合している５’末端ヌクレオチドがクリベースによってＦＲＥＴプローブから切り離される反応効率が低いため、ＦＲＥＴプローブが発する蛍光強度も低い。以上の原理により、多型の検出が可能となる〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，　５１０９，　７７８−７８３（１９９３），　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　３０，　２１３８７−２１３９４　（１９９９），　Ｎａｔ．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，　１７，　２９２−２９６　（１９９９）〕。
【００５３】
（１２）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法（Ｍａｔｒｉｘ　Ａｓｓｉｓｔｅｄ　Ｌａｓｅｒ　Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ−ｔｉｍｅ　ｏｆＦｌｉｇｈｔ／Ｍａｓｓ　Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）法
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法は、遺伝子多型のアレルに対応して異なるヌクレオチドを含む１本鎖オリゴヌクレオチドを合成してその質量を測定し、その差異を質量分析器により検出することによりタイピングする方法である〔Ｇｅｎｏｍｅ　Ｒｅｓ．，　７，　３７８−３８８　（１９９７），　Ｅｕｒ．　Ｊ．　Ｃｌｉｎ．　Ｃｈｅｍ．　Ｃｌｉｎ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　３５，　５４５−５４８　（１９９７）〕。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法では、はじめに多型部位を含むＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅し、その後、多型部位に隣接するプライマーを用いた伸張反応により、それぞれのアレルに特異的なＤＮＡ伸張反応物をマススペクトルに基づき解析する。このときに用いられＰＣＲプライマーは、通常多型部位を含む約０．０５〜０．５ｋｂのＤＮＡ断片を増幅するための、１５〜３０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドである。また、多型を検出するためのプライマーは、多型部位に隣接した１５から３０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドを用いる。
【００５４】
（１３）ＴＤＩ（Ｔｅｍｐｌａｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ　Ｄｙｅ−ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）法
ＴＤＩ法は、遺伝子多型を含むＤＮＡ断片をＰＣＲで増幅させた後、多型部位の直前に設計されたプライマーを用いて、プライマー伸張反応により、それぞれのアレルに対応する異なる蛍光色素で標識されたダイデオキシヌクレオチドを多型部位に取りこませる方法である〔Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　９４，　１０７５６−１０７６１　（１９９７）〕。プライマー伸張産物は、ＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩプリズム３７７、アプライドバイオシステムズ社製）などを用いて解析する。このときに用いられるＰＣＲプライマーは、通常多型部位を含む約０．０５〜１ｋｂのＤＮＡ断片を増幅するための、１５〜３０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドである。
【００５５】
（１４）モレキュラー・ビーコン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｅａｃｏｎｓ）法
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｅａｃｏｎｓは両末端に発光抑制体（Ｑｕｅｎｃｈｅｒ）と蛍光体（Ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ）を持ったオリゴヌクレオチドである。通常はステム部分が５−７ヌクレオチドでループ構造が１５−３０ヌクレオチドのステムループ構造である。したがって蛍光体は発光抑制体の働きにより、励起光照射下でも発光しない。一方、ループ構造内の塩基配列と相同なターゲットのＤＮＡとループ構造内の塩基配列がハイブリダイズすると、発光抑制体と蛍光体の距離が離れるために蛍光体が励起光下で励起し蛍光を発する〔Ｎａｔ．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１，　ｐ４９−５３　（１９９８）、遺伝子医学、４，ｐ４６−４８（２０００）〕。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｅａｃｏｎのステム部分の塩基配列は、ターゲットＤＮＡとは相補的でない。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｅａｃｏｎｓのステム構造のＴｍ値（溶解温度：ｍｅｌｔｉｎｇ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）は、ターゲットＤＮＡとＰＣＲプライマーのＴｍ値より、７−１０℃高くなるように設計する。そして、ターゲット領域をＰＣＲで増幅させるときにＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｅａｃｏｎｓを反応液にいれて、ＰＣＲのアニーリング温度で励起光を当て蛍光を測定するとＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｅａｃｏｎｓがターゲット遺伝子に完全に相同な配列であればＨｙｂｒｉｄｉｚｅするため蛍光を発する。逆にミスマッチがあれば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｅａｃｏｎｓはターゲットにハイブリダイズできず蛍光を発することができない。この方法により遺伝子多型を見つけることができる。
【００５６】
（１５）ダイナミック・アレル−スペシフィック・ハイブリダイゼーション法（Ｄｙｎａｍｉｃ　Ａｌｌｅｌｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　（ＤＡＳＨ）法
ターゲットＤＮＡ（６０−９０塩基対）をゲノムＤＮＡからＰＣＲで増幅する際に、末端をビオチン化したプライマーを用いて行う方法である〔Ｎａｔ．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１，　ｐ８７−８８，　（１９９９）、遺伝子医学，　４，　ｐ４７−４８　（２０００）〕。ＰＣＲ終了後、ビオチン化したプライマー側のストランド（ｓｔｒａｎｄ）はストレプトアビジン（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）でコーティングされたマイクロタイターウェルに結合する。これに対して未修飾のＰｒｉｍｅｒ側のストランドは結合することができず、アルカリ溶液でリンスすると除去される。その後、このビオチン化したプライマーのストランドに対して、プローブＤＮＡ（１５−２１ヌクレオチド）をハイブリダイズさせる。この時に２本鎖ＤＮＡに特異的に結合し蛍光を発する蛍光物質（Ｓｙｂｅｒ　Ｇｒｅｅｎ　Ｉ　ｄｙｅ）を一緒に取込ませる。その後、この蛍光強度を観察しながら変性（ｄｅｎａｔｕｒｅ）させる。ターゲットＤＮＡとプローブＤＮＡが完全に相補的でなくミスマッチが有ったときには完全に相補的である場合に比べ変性し発光しなくなる温度が低くなる。この温度の違いを観察することにより、遺伝子多型を検出することができる。
【００５７】
（１６）パドロック・プローブ（Ｐａｄｌｏｃｋ　Ｐｒｏｂｅ）法
Ｌｉｚａｒｄｉらによって開発された方法である〔Ｎａｔ．　Ｇｅｎｅｔ．，　３，　ｐ２２５−２３２　（１９９８）、遺伝子医学，　４，　ｐ５０−５１　（２０００）〕。一本鎖ターゲットＤＮＡにハイブリダイズするとプローブが環状になるように設計したプローブを用い、ターゲットＤＮＡにハイブリダイズした後にＤＮＡリガーゼで結合させて完全な環状にしその後アルカリフォスファターゼ（Ｃａｌｆ　ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ　Ａｌｋａｌｉｎｅ　Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ　（ＣＩＡＰ））の脱リン酸化酵素でリン酸基を除去する。末端にミスマッチがあり環状になれなかった場合リン酸基がなくなり環状化できなくなる。この環状ＤＮＡに対してプライマー（１）を設計し、ＤＮＡポリメラーゼで複製してレプリコン多量体を得る。このレプリコンに対してもプライマー（２）を設計し、この２種類のプライマーを一緒に混ぜてＤＮＡポリメラーゼで反応し、２本鎖ＤＮＡを増幅する。プライマー（１）はターゲットＤＮＡとは相補的でない部分に設計し、プライマー（２）は環状になったプローブ（Ｐａｄｌｏｃｋ　Ｐｒｏｂｅ）の末端部分（ターゲットＤＮＡと相補的な配列（３’末端に遺伝子多型を含む）に設計し、多型検出には３’末端の一塩基置換させたプライマーを用いる。環状化したプローブ（Ｐａｄｌｏｃｋ　Ｐｒｏｂｅ）に対してローリング・サイクル・反応（Ｒｏｌｌｉｎｇ　Ｃｉｒｃｌｅ−Ｒｅａｃｔｉｏｎ：ＲＣＲ）を改良したハイパーブランチド・ローリング−サークル増幅法（Ｈｙｐｅｒｂｒａｎｃｈｅｄ　Ｒｏｌｌｉｎｇ−Ｃｉｒｃｌｅ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　（ＨＲＣＡ））法を用いて増幅させた後に、Ｐａｄｌｏｃｋ　Ｐｒｏｂｅ内にある制限酵素認識サイトの制限酵素で処理し、電気泳動でバンドの有無を確認する。
【００５８】
（１７）ＵＣＡＮ法
ＵＣＡＮ法［タカラ酒造株式会社ホームページ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔａｋａｒａ．ｃｏ．ｊｐ）参照］は、ＲＮＡをＤＮＡが両側からはさんだ型のＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡプライマー（ＤＲＤプライマー）の３’末端のＤＮＡを化学変化させておき、ＤＮＡポリメラーゼによる鋳型ＤＮＡの複製が起こらないようにしておく。次に、一塩基変換が起こっている可能性のある塩基部分に、ＲＮＡ部分が結合するように設計したＤＲＤプライマーと鋳型ＤＮＡを対合させる。ＤＲＤプライマーと鋳型が完全にマッチしている場合のみＲＮａｓｅＨにより、対合したＤＲＤプライマーのＲＮＡ部分が切断される。この切断によって３’末端が新しく出現するのでＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応が進み、鋳型ＤＮＡが増幅される。一方、ＤＲＤプライマーと鋳型ＤＮＡがその場所でマッチしていない場合、つまりＳＮＰが存在するときは、ＲＮａｓｅＨがＤＲＤプライマーを切断しないので、ＤＮＡ増幅が起こらない。この遺伝子増幅の有無を検出することで遺伝子多型を検出することができる。
【００５９】
（１８）ＤＮＡチップまたはＤＮＡマイクロアレイ
ＤＮＡチップまたはＤＮＡマイクロアレイは多種類の多型部位を含むＤＮＡプローブをガラス基盤上に固定したもので、これに標識した核酸試料をハイブリダイゼーションして、蛍光シグナルによって多型の有無を検出する。一般にガラス基盤上にｃＤＮＡを乗せていくものをＤＮＡマイクロアレイ、ＤＮＡをガラス基盤上で合成していくものをＤＮＡチップ（オリゴＤＮＡチップ）という。基盤上に固定（または合成）されるプローブは、オリゴＤＮＡアレイであれば、通常多型部位を含む２０ｍｅｒ程度のオリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡマイクロアレイであれば、１００〜１５００ｍｅｒ程度の２本鎖ＤＮＡが用いられる。
【００６０】
（１９）ＥＣＡ法
ＥＣＡ（Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ａｒｒａｙ）法は、ＤＮＡの２本鎖に結合するインターカレーターの電気化学的性質を利用した遺伝子タイピング法である。すなわち、ゲノム上の多型を含む領域をＰＣＲ法により増幅し、基盤に固定化したそれぞれのアレルと相補するプローブとハイブリダイズ後にインターカレーターを作用させる。このとき、プローブに対して完全相補と不完全相補の場合で結合するインターカレーターの量が異なる。ＥＣＡ法で用いるインターカレーターは、電気化学的性質を有するフェロセンという物質を含有しているため、結合したインターカレーターの量に比例して電気的シグナルが異なる。ＥＣＡ法は、この違いを利用して遺伝子多型を検出する方法である〔Ａｎａｌ．　Ｃｈｅｍ．，　７２，　ｐ１３３４−１３４１，　２０００〕。
【００６１】
以上は代表的な多型検出方法であるが、これらに限定されず、他の公知の遺伝子多型検出方法を本発明の判定方法のために利用することができる。また、本発明の方法においては、これらの遺伝子多型検出方法を単独で用いても、二つ以上を組み合わせて用いてもよい。本発明の好適な実施形態の一つとして、後述する実施例では、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法またはダイレクトシークエンス法を用いた判定方法を示す。
【００６２】
４．糖尿病発症危険性判定用試薬、またはキット
本発明の判定方法では、糖尿病の発症に関連した遺伝子多型を検出するために、検出すべき遺伝子多型が存在する部位またはその近傍の配列を検出するためのプローブまたは固相化試料、もしくは該配列を特異的に増幅するためのプライマーが用いられる。これらのプローブ、プライマーおよび固相化試料は、本発明の判定方法を実施するための試薬、またはキットとして有用である。
【００６３】
すなわち、本発明は、ＧＦＡＴ１遺伝子またはＧＦＡＴ２遺伝子上の遺伝子多型を検出するためのプローブ、プライマーおよび固相化試料、ならびにこれらの少なくとも一つ以上を含む、糖尿病の発症危険性判定用試薬またはキットを提供する。
【００６４】
（１）プローブ
本発明の方法で用いられるプローブは、ＧＦＡＴ１遺伝子またはＧＦＡＴ２遺伝子上の新規遺伝子多型を含む部位に特異的にハイブリダイズし、該多型部位を検出するためのポリヌクレオチドプローブである。
【００６５】
そのようなプローブは、配列番号２２で示されるＧＦＡＴ１遺伝子上において、下記ａ）〜ｇ）から選ばれるいずれか一つのヌクレオチドまたはヌクレオチド配列を含む、１６〜５００塩基長、好ましくは２０〜２００塩基長、より好ましくは２０〜５０塩基長の連続したポリヌクレオチド；
ａ）ＧＦＡＴ（グルタミン：フルクトース−６−リン酸アミドトランスフェラーゼ）１遺伝子の第１イントロンの３６番目のヌクレオチド（配列番号１のヌクレオチド番号６３２）
ｂ）ＧＦＡＴ１遺伝子の第１１イントロンの７番目のヌクレオチド（配列番号２のヌクレオチド番号２６６）
ｃ）ＧＦＡＴ１遺伝子の第１２イントロンの−１４７番目のヌクレオチド（配列番号３のヌクレオチド番号３３８）
ｄ）ＧＦＡＴ１遺伝子の第８イントロンの１８５３〜１８７７番目のヌクレオチド（配列番号４のヌクレオチド番号３３６〜３６０）
ｅ）ＧＦＡＴ１遺伝子の第１２イントロンの１９８８〜２００７番目のヌクレオチド（配列番号５のヌクレオチド番号３２８〜３４７）
ｆ）ＧＦＡＴ１遺伝子の第１８イントロンの−１１〜−２２番目のヌクレオチド（配列番号６のヌクレオチド番号２５３〜２６４）
ｇ）ＧＦＡＴ１遺伝子の第３イントロンの２６３２から２６６１番目のヌクレオチド（配列番号７のヌクレオチド番号２３７〜２６６）
もしくは、配列番号２３で示されるＧＦＡＴ２遺伝子断片上において、第１８エキソンの６６番目のヌクレオチド（配列番号３のヌクレオチド番号２２５１）を含む、１６〜５００塩基長、好ましくは２０〜２００塩基長、より好ましくは２０〜５０塩基長の連続したポリヌクレオチドとして設計される。
【００６６】
（２）プライマー
本発明の方法で用いられるプライマーは、ＧＦＡＴ１遺伝子またはＧＦＡＴ２遺伝子上の新規遺伝子多型を含む部位を特異的に増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマーである。
【００６７】
そのようなプライマーは、配列番号２２で示されるＧＦＡＴ１遺伝子上において、前項ａ）〜ｇ）から選ばれるいずれか一つのヌクレオチドまたはヌクレオチド配列を含む連続したポリヌクレオチドの一部にハイブリダイズし、該ポリヌクレオチドを特異的に増幅するための、１５〜３０塩基長、好ましくは１８〜２５塩基長程度のオリゴヌクレオチド；
もしくは、配列番号２３で示されるＧＦＡＴ２遺伝子断片上において、第１８エキソンの６６番目のヌクレオチドを含む、連続したポリヌクレオチドの一部にハイブリダイズし、該ポリヌクレオチドを特異的に増幅するための、１５〜３０塩基長のオリゴヌクレオチド、好ましくは１８〜２５塩基長程度のオリゴヌクレオチドとして設計される。
【００６８】
増幅するポリヌクレオチドの長さは、用いられる検出方法に応じて適宜設定されるが、一般的には１６〜１０００塩基長、好ましくは２０〜５００塩基長、より好ましくは２０〜２００塩基長である。
【００６９】
以上のことから、多型部位近傍の配列（例えば、配列番号１〜７および配列番号２３のいずれか一つで示されるヌクレオチド配列）に含まれる、１５塩基以上の連続したヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドは、上記プライマーまたはプローブとして利用することができる。
【００７０】
本発明のプライマーまたはプローブには、その配列の末端に、検出のための適当な標識、例えば、蛍光色素、酵素、タンパク、放射性同位体、化学発光物質、ビオチン等が付加されたものも含むものとする。
【００７１】
なお、本発明において用いられる蛍光色素としては、一般にヌクレオチドを標識して、核酸の定量、検出等に用いられるものが好適に使用でき、例えば、ＨＥＸ（４，７，２’，４’，５’，７’−ｈｅｘａｃｈｌｏｒｏ−６−ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ、緑色蛍光色素）、フルオレセイン（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）、ＮＥＤ（アプライドバイオシステムズ社商品名、黄色蛍光色素）、あるいは、６−ＦＡＭ（アプライドバイオシステムズ社商品名、黄緑色蛍光色素）、ローダミン（ｒｈｏｄａｍｉｎ）またはその誘導体（例えば、テトラメチルローダミン（ＴＭＲ））等を挙げることができるが、これらに限定されない。蛍光色素でヌクレオチドを標識する方法は、公知の標識法のうち適当なものを使用できる〔Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，　１４，　ｐ３０３−３０８　（１９９６）参照〕。また、市販の蛍光標識キットを使用することもできる（例えば、アマシャム・ファルマシア社製　オリゴヌクレオチドＥＣＬ　３’−オリゴラベリングシステム等）。
【００７２】
また、本発明のプライマーには、その末端に多型検出のためのリンカー配列が付加されたものも含むものとする。このようなリンカー配列としては、例えば、前述したインベーダー法で用いられるオリゴヌクレオチド５’末端に付加される、フラップ（多型近傍の配列とは全く無関係な配列）等が挙げられる。
【００７３】
なお、本明細書中において、「ポリヌクレオチド」は核酸と同義であって、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方を含むものとする。また、２本鎖であっても１本鎖であってもよく、したがって、ある配列を有するポリヌクレオチドには、これに相補的な配列を有するポリヌクレオチドも常に包含される（オリゴヌクレオチドも同様）。さらに、ポリヌクレオチドがＲＮＡである場合、配列表に示される塩基記号「ｔ」は「ｕ」に読み替えるものとする。
【００７４】
本発明の１つの実施形態である、ＳＳＣＰ法およびダイレクトシークエンス法を用いた検出について、上記プライマーの好適な例を以下に示す。
ｉ）ＧＦＡＴ１遺伝子の第１イントロンの３６番目のヌクレオチド（配列番号１のヌクレオチド番号６３２）の遺伝子多型検出用：
センス鎖プライマーとしては、好適には配列番号１のヌクレオチド番号１から６３１に示されるヌクレオチド配列中、より好適には同ヌクレオチド番号４３２から６３１に示されるヌクレオチド配列中の、１５ヌクレオチド以上（好ましくは１５〜３０ヌクレオチド）の連続したヌクレオチド配列を選択する。例えば、配列番号８に示されるヌクレオチド配列が挙げられる。
【００７５】
アンチセンス鎖プライマーとしては、好適には配列番号１のヌクレオチド番号６３３から７８２に示されるヌクレオチド配列中、より好適には同ヌクレオチド番号６３３から６８２に示されるヌクレオチド配列中の、１５ヌクレオチド以上（好ましくは１５〜３０ヌクレオチド）の連続したヌクレオチド配列のアンチセンス配列を選択する。例えば、配列番号９に示されるヌクレオチド配列が挙げられる。
【００７６】
ｉｉ）ＧＦＡＴ１遺伝子の第１１イントロンの７番目のヌクレオチド（配列番号２のヌクレオチド番号２６６）の遺伝子多型検出用：
センス鎖プライマーとしては、好適には配列番号２のヌクレオチド番号１から２６５に示されるヌクレオチド配列中、より好適には同ヌクレオチド番号６６から２６５に示されるヌクレオチド配列中の、１５ヌクレオチド以上（好ましくは１５〜３０ヌクレオチド）の連続したヌクレオチド配列を選択する。例えば、配列番号１０に示されるヌクレオチド配列が挙げられる。
【００７７】
アンチセンス鎖プライマーとしては、好適には配列番号２のヌクレオチド番号２６７から６７５に示されるヌクレオチド配列中、より好適には同ヌクレオチド番号２６７から４６６に示されるヌクレオチド配列中の、１５ヌクレオチド以上（好ましくは１５〜３０ヌクレオチド）の連続したヌクレオチド配列のアンチセンス配列を選択する。例えば、配列番号１１に示されるヌクレオチド配列が挙げられる。
【００７８】
ｉｉｉ）ＧＦＡＴ１遺伝子の第１２イントロンの−１４７番目のヌクレオチド（配列番号３のヌクレオチド番号３３８）の遺伝子多型検出用：
センス鎖プライマーとしては、好適には配列番号３のヌクレオチド番号１から３３７に示されるヌクレオチド配列中、より好適には同ヌクレオチド番号１３８から３３７に示されるヌクレオチド配列中の、１５ヌクレオチド以上（好ましくは１５〜３０ヌクレオチド）の連続したヌクレオチド配列を選択する。例えば、配列番号１２に示されるヌクレオチド配列が挙げられる。
【００７９】
アンチセンス鎖プライマーとしては、好適には配列番号３のヌクレオチド番号３３９から７８０に示されるヌクレオチド配列中、より好適には同ヌクレオチド番号３３９から５３８に示されるヌクレオチド配列中の、１５ヌクレオチド以上（好ましくは１５〜３０ヌクレオチド）の連続したヌクレオチド配列のアンチセンス配列を選択する。例えば、配列番号１３に示されるヌクレオチド配列が挙げられる。
【００８０】
ｉｖ）ＧＦＡＴ１遺伝子の第８イントロンの１８５３から１８７７番目のヌクレオチド（配列番号４のヌクレオチド番号３３６〜３６０）の遺伝子多型検出用：
センス鎖プライマーとしては、好適には配列番号４のヌクレオチド番号１から３３５に示されるヌクレオチド配列中、より好適には同ヌクレオチド番号１３６から３３５に示されるヌクレオチド配列中の、１５ヌクレオチド以上（好ましくは１５〜３０ヌクレオチド）の連続したヌクレオチド配列を選択する。例えば、配列番号１４に示されるヌクレオチド配列が挙げられる。
【００８１】
アンチセンス鎖プライマーとしては、好適には配列番号４のヌクレオチド番号３６１から７２０に示されるヌクレオチド配列中、より好適には同ヌクレオチド番号３６１から５６０に示されるヌクレオチド配列中の、１５ヌクレオチド以上（好ましくは１５〜３０ヌクレオチド）の連続したヌクレオチド配列のアンチセンス配列を選択する。例えば、配列番号１５に示されるヌクレオチド配列が挙げられる。
【００８２】
ｖ）ＧＦＡＴ１遺伝子の第１２イントロンの１９８８から２００７番目のヌクレオチド（配列番号５のヌクレオチド番号３２８〜３４７）の遺伝子多型検出用：センス鎖プライマーとしては、好適には配列番号５のヌクレオチド番号１から３２７に示されるヌクレオチド配列中、より好適には同ヌクレオチド番号１２８から３２７に示されるヌクレオチド配列中の、１５ヌクレオチド以上（好ましくは１５〜３０ヌクレオチド）の連続したヌクレオチド配列を選択する。例えば、配列番号１６に示されるヌクレオチド配列が挙げられる。
【００８３】
アンチセンス鎖プライマーとしては、好適には配列番号５のヌクレオチド番号３４８から６５９に示されるヌクレオチド配列中、より好適には同ヌクレオチド番号３４８から５４６に示されるヌクレオチド配列中の、１５ヌクレオチド以上（好ましくは１５〜３０ヌクレオチド）の連続したヌクレオチド配列のアンチセンス配列を選択する。例えば、配列番号１７に示されるヌクレオチド配列が挙げられる。
【００８４】
ｖｉ）ＧＦＡＴ１遺伝子の第１８イントロンの−１１から−２２番目のヌクレオチド（配列番号６のヌクレオチド番号２５３〜２６４）の遺伝子多型検出用：
センス鎖プライマーとしては、好適には配列番号６のヌクレオチド番号１から２５２に示されるヌクレオチド配列中、より好適には同ヌクレオチド番号５３から２５２に示されるヌクレオチド配列中の、１５ヌクレオチド以上（好ましくは１５〜３０ヌクレオチド）の連続したヌクレオチド配列を選択する。例えば、配列番号１８に示されるヌクレオチド配列が挙げられる。
【００８５】
アンチセンス鎖プライマーとしては、好適には配列番号６のヌクレオチド番号２６５から５４０に示されるヌクレオチド配列中、より好適には同ヌクレオチド番号２６５から４６４に示されるヌクレオチド配列中の、１５ヌクレオチド以上（好ましくは１５〜３０ヌクレオチド）の連続したヌクレオチド配列のアンチセンス配列を選択する。例えば、配列番号１９に示されるヌクレオチド配列が挙げられる。
【００８６】
ｖｉｉ）ＧＦＡＴ１遺伝子の第３イントロンの２６３２から２６６１番目のヌクレオチド（配列番号７のヌクレオチド番号２３７〜２６６）の遺伝子多型検出用：
センス鎖プライマーとしては、好適には配列番号７のヌクレオチド番号１から２３６に示されるヌクレオチド配列中、より好適には同ヌクレオチド番号３７から２３６に示されるヌクレオチド配列中の、１５ヌクレオチド以上（好ましくは１５〜３０ヌクレオチド）の連続したヌクレオチド配列を選択する。例えば、配列番号２０に示されるヌクレオチド配列が挙げられる。
【００８７】
アンチセンス鎖プライマーとしては、好適には配列番号７のヌクレオチド番号２６７から３６０に示されるヌクレオチド配列中、より好適には同ヌクレオチド番号２６７から３４０に示されるヌクレオチド配列中の、１５ヌクレオチド以上（好ましくは１５〜３０ヌクレオチド）の連続したヌクレオチド配列のアンチセンス配列を選択する。例えば、配列番号２１に示されるヌクレオチド配列。
【００８８】
ｖｉｉｉ）ＧＦＡＴ２遺伝子の第１８エキソンの６６番目のヌクレオチド（配列番号２３のヌクレオチド番号２２５１）の遺伝子多型検出用：
センス鎖プライマーとしては、好適には配列番号２３のヌクレオチド番号１７５１から２２５０に示されるヌクレオチド配列中、より好適には同ヌクレオチド番号２０５１から２１９９に示されるヌクレオチド配列中の、１５ヌクレオチド以上（好ましくは１５〜３０ヌクレオチド）の連続したヌクレオチド配列を選択する。例えば、配列番号２４に示されるヌクレオチド配列が挙げられる。
【００８９】
アンチセンス鎖プライマーとしては、好適には配列番号２３のヌクレオチド番号２２５２から２７５１に示されるヌクレオチド配列中、より好適には同ヌクレオチド番号２２５２から２４５１に示されるヌクレオチド配列中の、１５ヌクレオチド以上（好ましくは１５〜３０ヌクレオチド）の連続したヌクレオチド配列のアンチセンス配列を選択する。例えば、配列番号２５に示されるヌクレオチド配列。
【００９０】
上記プライマーまたはプローブとして用いられ得るポリヌクレオチドは、当該技術分野で周知の方法に基づき化学合成することにより得ることができる。これらのプローブまたはプライマーとして用いられるポリヌクレオチドは、糖尿病発症危険性判定用試薬として利用できる。
【００９１】
（３）固相化試料
本発明の固相化試料は、（１）記載のプローブとして用いられるポリヌクレオチドを、ガラス板、ナイロンメンブレン、マイクロビーズ、シリコンチップ、キャピラリー等の固相に固定することにより作製される。固相への固定は、予め合成したポリヌクレオチドを固相上に乗せる方法であってもよいし、目的とするポリヌクレオチドを固相上で合成する方法であってもよい。固定方法は、例えばＤＮＡマイクロアレイであれば、市販のスポッター（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製等）を利用するなど、目的とする固相化試料に適した方法が、当該技術分野で周知である。このような固相化試料としては、例えば、遺伝子チップ、ｃＤＮＡマイクロアレイ、オリゴアレイ、メンブレンフィルター等を挙げることができる。
【００９２】
（４）キット
本発明のキットは、上記プローブまたはプライマーとして用いられ得るポリヌクレオチド、ならびに固相化試料から選ばれる少なくとも一つ以上を含む。本発明のキットは上記した構成要素のほか、必要に応じて、ハイブリダイゼーション、プローブの標識、ラベル体の検出等、本発明の判定方法に必要な他の試薬、器具等を適宜含んでいてもよい。
【００９３】
５．検出結果の解析と評価
糖尿病患者および健常人における、前記新規遺伝子多型検出の統計解析結果から、本発明の方法は高い確率で１型、２型糖尿病、糖尿病性腎症を伴なう２型糖尿病、あるいは、糖尿病性腎症を伴わない２型糖尿病を発症する潜在的危険度の判定が可能であることが判明している。
【００９４】
例えば、本発明の方法にしたがい、単離されたヒトゲノムＤＮＡを含む試料における遺伝子多型を調べた結果、下記のいずれか一つまたは二つ以上の条件に該当した被験者に対しては、２型糖尿病を発症する危険度が相対的に高いとの情報を提供することができる。
ａ）ＧＦＡＴ１遺伝子の第１イントロンの３６番目（配列表の配列番号１のヌクレオチド番号６３２）のヌクレオチドがｃ（シトシン）である遺伝子を有する；
ｂ）ＧＦＡＴ１遺伝子の第１１イントロンの７番目（配列表の配列番号２のヌクレオチド番号２６６）のヌクレオチドがｇ（グアニン）である遺伝子を有する；
ｃ）ＧＦＡＴ１遺伝子の第１２イントロンの−１４７番目のヌクレオチド（配列番号３のヌクレオチド番号３３８）がｔ（チミン）である遺伝子を有する；
ｄ）ＧＦＡＴ１遺伝子の第８イントロンの１８５３から１８７７番目のヌクレオチド（配列番号４のヌクレオチド番号３３６〜３６０）に存在するｔ（チミン）の繰り返しが２５回である遺伝子を有する；
ｅ）ＧＦＡＴ１遺伝子の第１２イントロンの１９８８から２００７番目のヌクレオチド（配列番号５のヌクレオチド番号３２８〜３４７）に存在するａ（アデニン）の繰り返しが１９回である遺伝子を有する；
ｆ）ＧＦＡＴ１遺伝子の第１８イントロンの−１１から−２２番目のヌクレオチド（配列番号６のヌクレオチド番号２５３〜２６４）に存在するｔ（チミン）の繰り返しが１１または１２回である遺伝子を有する；
ｈ）ＧＦＡＴ２遺伝子の第１８エキソンの６６番目（配列番号３のヌクレオチド番号２２５１）のヌクレオチドがｔ（チミン）である遺伝子を有する；
このうち、ａ）および／またはｂ）の条件に該当した被験者は、特に糖尿病性腎症を伴う２型糖尿病を発症する危険度が相対的に高く、ｈ）の条件に該当した被験者は、特に腎症を伴わない２型糖尿病を発症する危険度が相対的に高い。
【００９５】
また、二つ以上の遺伝子多型を組み合わせたハプロタイプを検出することによっても、糖尿病を発症する潜在的危険度の判定が可能である。たとえば、以下のｘ）〜ｚ）のハプロタイプの一つまたは二つ以上を検出することにより、被験者が２型糖尿病または腎症を伴わない２型糖尿病を発症する危険度を判定することができる。さらに、ｚ）のハプロタイプは、１型糖尿病または腎症を伴う２型糖尿病を発症する危険度の判定にも利用できる。
【００９６】
ｘ）ＧＦＡＴ１遺伝子の第１イントロンの３６番目のヌクレオチド（配列番号１のヌクレオチド番号６３２）、および同第１８イントロンの−１１から−２２番目のヌクレオチド（配列番号６のヌクレオチド番号２５３〜２６４）に存在する遺伝子多型を組合せたハプロタイプ
ｙ）ＧＦＡＴ１遺伝子の第１１イントロンの７番目のヌクレオチド（配列番号２のヌクレオチド番号２６６）、および同第１８イントロンの−１１から−２２番目のヌクレオチド（配列番号６のヌクレオチド番号２５３〜２６４）に存在する遺伝子多型を組合せたハプロタイプ
ｚ）ＧＦＡＴ１遺伝子の第１８イントロンの−１１から−２２番目のヌクレオチド（配列番号６のヌクレオチド番号２５３〜２６４）、および同第３イントロンの２６３２から２６６１番目のヌクレオチド（配列番号７のヌクレオチド番号２３７〜２６６）に存在する遺伝子多型を組合せたハプロタイプ
【００９７】
本発明によって、上記判定基準から糖尿病を発症する危険度が相対的に高いことが判明した被験者に対しては、その旨を告知し、予め糖尿病の発症を防ぐための対策を講じることができる。したがって、本発明は糖尿病（特に、２型糖尿病）を予防するための検査方法としてきわめて有用である。
【００９８】
６．ＧＦＡＴ１をコードするＤＮＡ
本発明はまた、ヒトＧＦＡＴ１（グルタミン：フルクトース−６−リン酸アミドトランスフェラーゼ１）をコードするＤＮＡを提供する。
【００９９】
本発明者らが特定したヒトＧＦＡＴ１をコードするＤＮＡは、配列番号２２に示すようなヌクレオチド配列を有し、全長９３３９０塩基で、１９のエキソンと１８のイントロンからなる。しかし、このヌクレオチド配列に限定されず、配列番号２２で表されるヌクレオチド配列と少なくとも８５％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するヌクレオチド配列からなるＤＮＡも、ヒト由来のＧＦＡＴ活性を有するタンパク質：ＧＦＡＴ１をコードする限り、本発明のＤＮＡに含まれる。
【０１００】
また、配列番号２２で示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡと相補的なヌクレオチド配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡも、ヒト由来のＧＦＡＴ活性を有するタンパク質：ＧＦＡＴ１をコードする限り、本発明のＤＮＡに含まれる。なお、ストリンジェントな条件とは、好ましくは０．５×ＳＳＣかつ温度５５℃、より好ましくは０．１×ＳＳＣかつ温度６５℃の条件をいう。
【０１０１】
ヒトＧＦＡＴ１遺伝子は変異に富んでおり、１．に記載したように、そのヌクレオチド配列上には糖尿病の発症に関連した複数の遺伝子多型が存在する。したがって、本発明のＤＮＡは、糖尿病の発症危険度の判定に極めて有用である。
【０１０２】
また、ＧＦＡＴは、ヘキソサミン生合成経路において、律速段階であるフルクトース−６−リン酸からグルコサミン−６−リン酸への反応を触媒する酵素である。したがって、ＧＦＡＴ活性を阻害する薬剤は、細胞内へのグルコースの取り込みを促進し、血糖値を低下させることができ、糖尿病治療薬としての可能性が期待される。つまり、本発明のＤＮＡの発現量を指標として、糖尿病治療薬のスクリーニングをすることも可能である。
【０１０３】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
〔実施例１〕　末梢血からのゲノムＤＮＡの調製
日本人の健常人、１型糖尿病患者、２型糖尿病患者（腎症なし）、および２型糖尿病患者（腎症あり）の末梢血から白血球を分離した。この白血球より、自動ＤＮＡ抽出装置（ＮＡ−１０００：クラボウ社製）を用いて、各被験者のゲノムＤＮＡ試料を抽出した。得られたＤＮＡ試料について、２６０ｎｍの吸光度を測定し、各試料のＤＮＡ濃度を算出した。その後、滅菌蒸留水を用いてゲノムＤＮＡを５０ｎｇ／μｌに希釈し、ＰＣＲ用試料とした。
【０１０４】
〔実施例２〕　ＰＣＲ法による多型を含むＤＮＡ断片の増幅
実施例１で得られた各被験者のゲノムＤＮＡ試料を鋳型として、以下に記載する方法により、ＧＦＡＴ１遺伝子上の７箇所の多型部位のいずれかを含むＤＮＡ断片を増幅した。
【０１０５】
なお、本実施例で用いた各ＰＣＲプライマーは、５’末端をＨＥＸ（４，７，２’，４’，５’，７’−ｈｅｘａｃｈｌｏｒｏ−６−ｃａｒｂｏｘｙ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ、緑色蛍光色素）、ＮＥＤ（アプライドバイオシステムズ社商品名、黄色蛍光色素）、あるいは、６−ＦＡＭ（アプライドバイオシステムズ社商品名、黄緑色蛍光色素）の蛍光色素で標識されたものをアプライドバイオシステムズ社に発注、購入した。
【０１０６】
１）ＧＦＡＴ１遺伝子の第１イントロンの３６番目（配列番号１のヌクレオチド番号６３２）のヌクレオチドがｃ（シトシン）であるかｔ（チミン）であるかを検出するためのＰＣＲ：
以下のプライマーおよび反応条件でＰＣＲを行い、多型部位を含む０．１６ｋｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。
ＰＣＲプライマー：
プライマーＮｏ．１：　５’−ＣＡＣＣＧＡＡＧＣＴＣＧＴＧＴＧＴＧＣＡ−３’（配列番号８）
プライマーＮｏ．２：　５’−ＣＧＣＣＴＴＧＧＧＣＣＴＴＡＧＣＧＧＣＡ−３’（配列番号９）
（Ｎｏ．１、Ｎｏ．２ともに、ＨＥＸで５’末端を標識）
反応系：　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
ＰＣＲエンハンサー（ギブコ社、１１４９５−０１７）　６μｌ
２．５ｍＭ　ｄＮＴＰ　　　　　　　　　　　　　　　　２．４μｌ
５０ｍＭ　硫酸マグネシウム　　　　　　　　　　　　　１．５μｌ
１０μＭ　プライマーＮｏ．１　　　　　　　　　　　　２μｌ
１０μＭ　プライマーＮｏ．２　　　　　　　　　　　　２μｌ
５０ｎｇ／μｌ　ゲノムＤＮＡ　　　　　　　　　　　　２μｌ
１０×ＰＣＲ反応緩衝液　　　　　　　　　　　　　　　２μｌ
（ＰＣＲｘエンハンサーシステム：キ゛フ゛コ・ヒ゛ーアールエル社製に添付）
滅菌水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２μｌ
Ｔａｑポリメラーゼ　　　　　　　　　　　　　　　　　０．１μｌ
　（ Ｔａｋａｒａ　Ｅｘ　Ｔａｑ ：宝酒造（株）社製、 ５ 単位 ／ μ ｌ ）　　　　　　　　
Ｔｏｔａｌ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０　μｌ
ＰＣＲ条件：９４℃１分、５５℃１分、７２℃２分を４０サイクル
【０１０７】
２）ＧＦＡＴ１遺伝子の第１１イントロンの７番目（配列番号２のヌクレオチド番号２６６）のヌクレオチドがｇ（グアニン）であるか、ａ（アデニン）であるかを検出するためのＰＣＲ：
以下のプライマーおよび反応条件でＰＣＲを行い、多型部位を含む０．２２ｋｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。
ＰＣＲプライマー：
プライマーＮｏ．３：　５’−ＧＧＡＡＡＣＴＴＴＴＡＧＴＴＧＴＧＴＡＣ−３’（配列番号１０）
プライマーＮｏ．４：　５’−ＣＴＧＴＣＡＧＡＧＡＣＡＣＴＧＡＡＡＴＡ−３’（配列番号１１）
（Ｎｏ．３、Ｎｏ．４ともに、ＨＥＸで５’末端を標識）
反応系：　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）　　　　　　　　　１μｌ
２．０ｍＭ　ｄＮＴＰ　　　　　　　　　　　　　　　２μｌ
２５ｍＭ　硫酸マグネシウム　　　　　　　　　　　　１．５μｌ
１０μＭ　プライマーＮｏ．３　　　　　　　　　　　２μｌ
１０μＭ　プライマーＮｏ．４　　　　　　　　　　　２μｌ
５０ｎｇ／μｌ　ゲノムＤＮＡ　　　　　　　　　　　２μｌ
１０×ＰＣＲ反応緩衝液（ＡｍｐｌｉＴａｑ　Ｇｏｌｄに添付）　　２μｌ
滅菌水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　７．４μｌ
Ｔａｑポリメラーゼ　　　　　　　　　　　　　　　　０．１μｌ
　（ Ｇｏｌｄ　Ｔａｑ ： アフ゜ライト゛ハ゛イオシステムス゛ 社製）、 ５ 単位 ／ μ ｌ ）　　　　　　
Ｔｏｔａｌ　　　　　　　　　　　　　　　　　２０μｌ
ＰＣＲ条件：９４℃１分、５５℃１分、７２℃２分を４０サイクル
【０１０８】
３）ＧＦＡＴ１遺伝子の第１２イントロンの−１４７番目のヌクレオチド（配列番号３のヌクレオチド番号３３８）がＡ（アデニン）、Ｔ（チミン）、あるいは、欠失であるかを検出するためのＰＣＲ：
以下のプライマーおよび反応条件でＰＣＲを行い、多型部位を含む０．１４ｋｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。
ＰＣＲプライマー：
プライマーＮｏ．５：　５’−ＧＣＣＡＴＧＣＴＴＡＴＣＴＣＡＡＧＴＧＧＴ−３’（配列番号１２）
プライマーＮｏ．６：　５’−ＣＡＴＣＧＧＡＣＴＴＣＴＴＴＧＧＡＴＴＣＡ−３’（配列番号１３）
（Ｎｏ．５、Ｎｏ．６ともに、ＨＥＸで５’末端を標識）
反応系：　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
２．５ｍＭ　ｄＮＴＰ　　　　　　　　　　　　　　　１．２μｌ
５０ｍＭ　硫酸マグネシウム　　　　　　　　　　　　０．３μｌ
１０μＭ　プライマーＮｏ．５　　　　　　　　　　　０．５μｌ
１０μＭ　プライマーＮｏ．６　　　　　　　　　　　０．５μｌ
５０ｎｇ／μｌ　ゲノムＤＮＡ　　　　　　　　　　　１μｌ
１０×ＰＣＲ反応緩衝液　　　　　　　　　　　　　　１μｌ
（フ゜ラチナＴａｑＤＮＡホ゜リメラーセ゛：インヒ゛トロシ゛ェン社、型番１０９６６−０１８に添付）
滅菌水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　５．４５μｌ
プラチナＴａｑＤＮＡポリメラーゼ　　　　　　　　　０．０５μｌ
　（ インヒ゛トロシ゛ェン 社　型番 １０９６６−０１８ 、 ５ 単位 ／ μ ｌ ）　　　　　　　　　 　　
Ｔｏｔａｌ　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０μｌ
ＰＣＲ条件：９４℃３０秒、５６℃３０秒、７２℃１分を３５サイクル
【０１０９】
４）ＧＦＡＴ１遺伝子の第８イントロンの１８５３から１８７７番目のヌクレオチドＴ（チミン）（配列番号４のヌクレオチド番号３３６〜３６０）の繰り返しが２４回あるいは２５回であるかを検出するためのＰＣＲ：
以下のプライマーおよび反応条件でＰＣＲを行い、多型部位を含む０．２６ｋｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。
ＰＣＲプライマー：
プライマーＮｏ．７：　５’−ＡＡＡＡＡＡＣＡＣＡＧＴＧＡＡＡＣＴＣＡＡＧ−３’（配列番号１４）、
プライマーＮｏ．８：　５’−ＡＡＡＣＣＣＣＧＴＣＴＣＴＡＣＴＡＡＡＡ−３’（配列番号１５）
（Ｎｏ．７、Ｎｏ．８ともに、ＮＥＤで５’末端を標識）
反応系：　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
２．５ｍＭ　ｄＮＴＰ　　　　　　　　　　　　　　　１．２μｌ
２５ｍＭ　硫酸マグネシウム　　　　　　　　　　　　０．７５μｌ
１０μＭ　プライマーＮｏ．７　　　　　　　　　　　０．５μｌ
１０μＭ　プライマーＮｏ．８　　　　　　　　　　　０．５μ
ｌ５０ｎｇ／μｌ　ゲノムＤＮＡ　　　　　　　　　　１μｌ
１０×ＰＣＲ反応緩衝液　　　　　　　　　　　　　　１μｌ
（ＰＣＲｘエンハンサーシステム：キ゛フ゛コ・ヒ゛ーアールエル社製　に添付）
ＰＣＲエンハンサー　　　　　　　　　　　　　　　　３μｌ
（キ゛フ゛コ・ヒ゛ーアールエル社製　に添付）
滅菌水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２μｌ
Ｔａｑポリメラーゼ　　　　　　　　　　　　　　　　０．０５μｌ
　（ Ｔａｋａｒａ　Ｅｘ　Ｔａｑ ：宝酒造（株）社製、 ５ 単位 ／ μ ｌ ）　　　　　　　 　　
Ｔｏｔａｌ　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０μｌ
ＰＣＲ条件：９４℃３０秒、５４℃３０秒、７２℃１分を３５サイクル
【０１１０】
５）ＧＦＡＴ１遺伝子の第１２イントロンの１９８８から２００７番目のヌクレオチドＡ（アデニン）（配列番号５のヌクレオチド番号３２８〜３４７）の繰り返しが１８回、１９回、２４回、あるいは、２５回であるかを検出するためのＰＣＲ：
以下のプライマーおよび反応条件でＰＣＲを行い、多型部位を含む０．２２ｋｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。
ＰＣＲプライマー：
プライマーＮｏ．９：　５’−ＡＧＡＡＴＣＡＴＧＣＣＴＣＴＧＡＡＴＡＧ−３’（配列番号１６）
プライマーＮｏ．１０：　５’−ＧＡＴＧＧＧＧＡＡＡＧＡＡＧＡＧＡＧＡＡ−３’（配列番号１７）
（Ｎｏ．９、Ｎｏ．１０ともに、ＦＡＭで５’末端を標識）
反応系：　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
２．５ｍＭ　ｄＮＴＰ　　　　　　　　　　　　　　　１．２μｌ
５０ｍＭ　硫酸マグネシウム　　　　　　　　　　　　０．３μｌ
１０μＭ　プライマーＮｏ．９　　　　　　　　　　　０．５μｌ
１０μＭ　プライマーＮｏ．１０　　　　　　　　　　０．５μｌ
５０ｎｇ／μｌ　ゲノムＤＮＡ　　　　　　　　　　　１μｌ
１０×ＰＣＲ反応緩衝液　　　　　　　　　　　　　　１μｌ
（フ゜ラチナＴａｑＤＮＡホ゜リメラーセ゛：インヒ゛トロシ゛ェン社、型番１０９６６−０１８　に添付）
滅菌水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　５．４５μｌ
プラチナＴａｑＤＮＡポリメラーゼ　　　　　　　　　０．０５μｌ
　（ インヒ゛トロシ゛ェン 社、型番 １０９６６−０１８ 、 ５ 単位 ／ μ ｌ ）　　　　　　　　　 　　
Ｔｏｔａｌ　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０μｌ
ＰＣＲ条件：９４℃３０秒、５４℃３０秒、７２℃１分を３５サイクル
【０１１１】
６）ＧＦＡＴ１遺伝子の第１８イントロンの−１１から−２２番目のヌクレオチドＴ（チミン）（配列番号６のヌクレオチド番号２５３〜２６４）の繰り返しが１１回、１２回、あるいは、１３回であるかを検出するためのＰＣＲ：
以下のプライマーおよび反応条件でＰＣＲを行い、多型部位を含む０．２１ｋｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。
ＰＣＲプライマー：
プライマーＮｏ．１１：　５’−ＧＡＴＧＧＴＴＡＡＴＧＡＡＴＧＴＡＴＴＧＴ−３’（配列番号１８）
プライマーＮｏ．１２：　５’−ＧＣＴＴＡＡＴＣＡＴＡＣＡＧＴＴＴＣＧＴ−３’（配列番号１９）
（Ｎｏ．１１はＦＡＭで５’末端を標識、Ｎｏ．１２はＨＥＸで５’末端を標識）
反応系：　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
２．５ｍＭ　ｄＮＴＰ　　　　　　　　　　　　　　　１．１μｌ
５０ｍＭ　塩化マグネシウム　　　　　　　　　　　　１μｌ
１０μＭ　プライマーＮｏ．１１　　　　　　　　　　１μｌ
１０μＭ　プライマーＮｏ．１２　　　　　　　　　　１μｌ
５０ｎｇ／μｌ　ゲノムＤＮＡ　　　　　　　　　　　１μｌ
１０×ＰＣＲ反応緩衝液　　　　　　　　　　　　　　１μｌ
（ＬＡ　Ｔａｑ　ＤＮＡホ゜リメラーセ゛：宝酒造社、型番ＲＲ００２Ａ　に添付）
滅菌水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　３．８５μｌ
ＬＡＴａｑＤＮＡポリメラーゼ　　　　　　　　　　０．０５μｌ
　（宝酒造社、型番 ＲＲ００２Ａ 、 ５ 単位 ／ μ ｌ ）　　　　　　　　　　　　　
Ｔｏｔａｌ　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０μｌ
ＰＣＲ条件：９４℃３０秒、５４℃３０秒、７２℃１分３０秒を３５サイクル
【０１１２】
７）ＧＦＡＴ１遺伝子の第３イントロンの２６３２から２６６１番目のマイクロサテライトマーカーＣＡＡ（シトシン、アデニン、アデニン）（配列番号７のヌクレオチド番号２３７〜２６６の領域）の繰り返しが７回、９回、１０回、１１回、あるいは、１２回であるかを検出するためのＰＣＲ：
以下のプライマーおよび反応条件でＰＣＲを行い、多型部位を含む０．２６ｋｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。
ＰＣＲプライマー：
プライマーＮｏ．１３：　５’−ＣＣＣＡＴＣＴＣＴＡＣＴＡＡＡＡＴＡＣＡ−３’（配列番号２０）
プライマーＮｏ．１４：　５’−ＣＡＣＴＴＣＴＴＴＣＡＡＡＡＧＣＴＡＣＡ−３’（配列番号２１）
（Ｎｏ．１３、Ｎｏ．１４ともに、ＨＥＸで５’末端を標識）
反応系：　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
２．５ｍＭ　ｄＮＴＰ　　　　　　　　　　　　　　１．１μｌ
５０ｍＭ　塩化マグネシウム　　　　　　　　　　　０．８μｌ
１０μＭ　プライマーＮｏ．１３　　　　　　　　　１μｌ
１０μＭ　プライマーＮｏ．１４　　　　　　　　　１μｌ
５０ｎｇ／μｌ　ゲノムＤＮＡ　　　　　　　　　　１μｌ
１０×ＰＣＲ反応緩衝液　　　　　　　　　　　　　１μｌ
（ＬＡ　Ｔａｑ　ＤＮＡホ゜リメラーセ゛：宝酒造社、型番ＲＲ００２Ａ　に添付）
滅菌水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　４．０５μｌ
ＬＡＴａｑＤＮＡポリメラーゼ　　　　　　　　　０．０５μｌ
　（宝酒造社、型番 ＲＲ００２Ａ 、 ５ 単位 ／ μ ｌ ）　　　　　　　　　　　　
Ｔｏｔａｌ　　　　　　　　　　　　　　　　　１０μｌ
ＰＣＲ条件：９４℃３０秒、５６℃３０秒、７２℃１分３０秒を４０サイクル
【０１１３】
８）　ＧＦＡＴ２遺伝子の第１８エキソンの６６番目（配列表の配列番号３のヌクレオチド番号２２５１）のヌクレオチドがｃ（シトシン）であるかｔ（チミン）であるかを検出するためのＰＣＲ：
以下のプライマーおよび反応条件でＰＣＲを行い、多型部位を含む２０５ｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。
ＰＣＲプライマー：
プライマーＮｏ．１５：　５’−ＣＣＣＡＴＣＴＣＴＡＣＴＡＡＡＡＴＡＣＡ−３’（配列番号２４）
プライマーＮｏ．１６：　５’−ＣＡＣＴＴＣＴＴＴＣＡＡＡＡＧＣＴＡＣＡ−３’（配列番号２５）
（Ｎｏ．１５、Ｎｏ．１６ともに、ＨＥＸで５’末端を標識）
反応系：　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
２．５ｍＭ　ｄＮＴＰ　　　　　　　　　　　　　　　　３．２μｌ
２．５ｍＭ　硫酸マグネシウム　　　　　　　　　　　　２．８μｌ
１０μＭ　プライマーＮｏ．１５　　　　　　　　　　　２μｌ
１０μＭ　プライマーＮｏ．１６　　　　　　　　　　　２μｌ
５０ｎｇ／μｌ　ゲノムＤＮＡ　　　　　　　　　　　　２μｌ
１０×ＰＣＲ反応緩衝液　　　　　　　　　　　　　　　２μｌ
（ＬＡ　Ｔａｑ　ＤＮＡホ゜リメラーセ゛：宝酒造社、型番ＲＲ００２Ａ　に添付）
滅菌水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　９μｌ
ＬＡＴａｑＤＮＡポリメラーゼ　　　　　　　　　　　０．１μｌ
　（宝酒造社、型番 ＲＲ００２Ａ 、 ５ 単位 ／ μ ｌ ）　　　　　　　　　　　　　
Ｔｏｔａｌ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０μｌ
ＰＣＲ条件：９４℃３０秒、５６℃３０秒、７２℃１分３０秒を４０サイクル
【０１１４】
〔実施例３〕　ＧＦＡＴ遺伝子の多型の検出
１）ＤＮＡシークエンサーによる解析
ＧＦＡＴ遺伝子の各多型部位を同定するためのヌクレオチド配列の決定は、ＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　３７７：アプライドバイオシステムズ社製）を用いて常法により行った。
【０１１５】
その結果、以下の位置に各多型が存在することが確認された。
ａ）ＧＦＡＴ１遺伝子の第１イントロンの３６番目のヌクレオチド（配列番号１のヌクレオチド番号６３２）；
ｂ）ＧＦＡＴ１遺伝子の第１１イントロンの７番目のヌクレオチド（配列番号２のヌクレオチド番号２６６）；
ｃ）ＧＦＡＴ１遺伝子の第１２イントロンの−１４７番目のヌクレオチド（配列番号３のヌクレオチド番号３３８）；
ｄ）ＧＦＡＴ１遺伝子の第８イントロンの１８５３から１８７７番目のヌクレオチド（配列番号４のヌクレオチド番号３３６〜３６０）；
ｅ）ＧＦＡＴ１遺伝子の第１２イントロンの１９８８から２００７番目のヌクレオチド（配列番号５のヌクレオチド番号３２８〜３４７）；
ｆ）ＧＦＡＴ１遺伝子の第１８イントロンの−１１から−２２番目のヌクレオチド（配列番号６のヌクレオチド番号２５３〜２６４）；
ｇ）ＧＦＡＴ１遺伝子の第３イントロンの２６３２から２６６１番目のヌクレオチド（配列番号７のヌクレオチド番号２３７〜２６６）
ｈ）ＧＦＡＴ２遺伝子の第１８エキソンの６６番目のヌクレオチド（配列番号２３のヌクレオチド番号２２５１）
【０１１６】
２）ＳＳＣＰ法
実施例２で得られた各ＰＣＲ産物を、ホルムアミド溶液：ローディングバッファー（０．０３ｇ／ｍｌのブルーデキストランを含む０．０５ＭのＥＤＴＡ水溶液）＝５：１の混合液に１／５量加え混合し、９５℃で２分間の熱変性後、氷冷して電気泳動用試料とした。この試料を非変性ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、アレルの違いに基づくＤＮＡ断片の移動度の違いにより多型を検出した。電気泳動のゲルは、１２％ポリアクリルアミドゲルにグリセロ―ルを５％添加したもの（ゲル厚さ０．２ｍｍ）を用いた。なお、測定条件の違いにより多型検出に変化がないことを確認するために、１０％ポリアクリルアミドにグルセロ―ルを５％添加したもの、および１２％ポリアクリルアミドゲルにグルセロ―ルを１０％添加したもの、の２条件で行った。電気泳動は、ＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　３７７：アプライドバイオシステムズ社製）を用いて、３０ワット定電力でＡフィルターを使用し、３〜１２時間通電した。蛍光バンドはＤＮＡシークエンサーの検出機能を用いて検出した。なお、電気泳動中は、ゲル板温度を保つため、冷却装置（ＲＴＥ−ＩＩＩ、ＮＥＳＬＡＢ社製）で２０℃に調節した水をゲル板外部に循環させるようにした。なお、実施例３の１）で記載した方法にしたがい、多型部位のヌクレオチド配列を決定したＤＮＡ断片をポジティブコントロールとし、ＧＦＡＴ遺伝子多型の遺伝子型を判定した。
【０１１７】
〔実施例４〕　ＧＦＡＴ遺伝子の多型と糖尿病との関連
ＧＦＡＴ１遺伝子と１型糖尿病、２型糖尿病、および糖尿病性腎症との関連を関連解析法（アソシエーション法）により解析した（フィッシャーら、バイオスタティスティクス（Ｂｉｏｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ）、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｌｅｙ　＆Ｓｏｎｓ社、１９９３年）。なお、ハプロタイプ解析は、Ａｒｌｅｑｕｉｎプログラムを用いて行なった（Ｌａｕｒｅｎｔ　Ｅｘｃｏｆｆｉｅｒ社製統計解析ソフトウェア、ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｌｇｂ．ｕｎｉｇｅ．ｃｈ／ａｒｌｅｑｕｉｎ／）。有意差検定には、Ｆｉｓｈｅｒの直接確率計算法を拡張したｅｘａｃｔ　ｔｅｓｔ　ｏｆ　ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　（ＰＤ検定）を用いた（「基礎医学統計学　改訂第４版」、加納克己、高橋秀人共著、南江堂、１９９５年）。有意水準は危険率５％とし、危険率５％未満のものを有意差ありと判定した。
【０１１８】
１）２型糖尿病とＧＦＡＴ１遺伝子の第１イントロンの３６番目のヌクレオチド（配列番号１のヌクレオチド番号６３２）の多型との関係
日本人の健常人１４１名、日本人の２型糖尿病患者３８８名（腎症あり１５６名、腎症なし２３２名）について、ＧＦＡＴ１遺伝子の第１イントロンの３６番目（配列番号１のヌクレオチド番号６３２）における多型頻度を算出し、アソシエーション法により糖尿病との関連を解析した。結果を表１に示す。
【０１１９】
【表１】

Figure 2004000115
【０１２０】
表１において、ＧＦＡＴ１遺伝子の第１イントロンの３６番目がｔ（チミン）である遺伝子をホモで有する被験者は「ＴＴ」、当該部位がｃ（シトシン）である遺伝子をホモで有する被験者は「ＣＣ」、両遺伝子をヘテロで有する被験者は「ＴＣ」として表されている。表１の結果より、健常人と２型糖尿病患者（腎症あり）との間において、ＧＦＡＴ１遺伝子のイントロン１の３６番目ヌクレオチドにおけるアレル頻度が統計的に有意に異なることが示された。このことは、ＧＦＡＴ１遺伝子の第１イントロンの３６番目ヌクレオチドにおける遺伝子多型を調べることにより、糖尿病性腎症を併発する２型糖尿病を発症する相対的危険度を判定できることを示すものである。
【０１２１】
２）２型糖尿病とＧＦＡＴ１遺伝子の第１１イントロンの７番目のヌクレオチド（配列番号２のヌクレオチド番号２６６）における多型との関係
日本人の健常人１３７名、日本人の２型糖尿病患者３７７名（腎症あり１４９名、腎症なし２２８名）について、ＧＦＡＴ１遺伝子の第１１イントロンの７番目（配列番号２のヌクレオチド番号２６６）のヌクレオチドにおける多型頻度を算出し、アソシエーション法により糖尿病との関連を解析した。結果を表２に示す。
【０１２２】
【表２】
Figure 2004000115
【０１２３】
表２において、ＧＦＡＴ１遺伝子の第１１イントロンの７番目がｇ（グアニン）である遺伝子をホモで有する被験者は「ＧＧ」、当該部位がａ（アデニン）である遺伝子をホモで有する被験者は「ＡＡ」、両遺伝子をヘテロで有する被験者は「ＧＡ」として表されている。表２の結果より、健常人と２型糖尿病患者（腎症あり）との間において、ＧＦＡＴ１遺伝子の第１１イントロンの７番目のヌクレオチドにおけるアレル頻度が統計的に有意に異なることが示された。このことは、ＧＦＡＴ１遺伝子の第１１イントロンの７番目のヌクレオチドにおける遺伝子多型を調べることにより、糖尿病性腎症を併発する２型糖尿病を発症する相対的危険度を判定できることを示すものである。
【０１２４】
３）２型糖尿病とＧＦＡＴ２遺伝子の第１８エキソン（配列番号２３のヌクレオチド番号２２５１）の６６番目のヌクレオチドにおける遺伝子多型との関係
日本人の健常人１４４名、日本人の２型糖尿病患者３９８名（腎症あり１５８名、腎症なし２４０名）について、ＧＦＡＴ２遺伝子のエキソン１８の６６番目のヌクレオチド（配列番号３のヌクレオチド番号２２５１）の多型頻度を算出し、アソシエーション法により糖尿病との関連を解析した。結果を表３に示す。
【０１２５】
【表３】
Figure 2004000115
【０１２６】
表３において、ＧＦＡＴ２遺伝子の第１８エキソンの６６番目がｃ（シトシン）である遺伝子をホモで有する被験者は「ＣＣ」、当該部位が、ｔ（チミン）である遺伝子をホモで有する被験者は「ＴＴ」、両遺伝子をヘテロで有する被験者は「ＴＣ」として表されている。表３の結果より、健常人と２型糖尿病患者（腎症なし）との間において、また２型糖尿病患者（腎症あり）と２型糖尿病患者（腎症なし）との間において、それぞれＧＦＡＴ２遺伝子の第１８エキソンの６６番目のヌクレオチドの多型頻度が統計的に有意に異なることが示された。このことは、ＧＦＡＴ２遺伝子の第１８エキソンの６６番目のヌクレオチドの多型を調べることにより、糖尿病性腎症を伴わない２型糖尿病を発症する相対的危険度を判定できることを示すものである。
【０１２７】
４）２型糖尿病とＧＦＡＴ１遺伝子の第８イントロンにおけるＴの繰り返し多型（配列番号４のヌクレオチド番号３３６〜３６０）との関係
日本人の健常人１９１名、日本人の２型糖尿病患者３８４名について、ＧＦＡＴ１遺伝子の第８イントロンにおけるＴの繰り返し多型（配列番号４のヌクレオチド番号３３６〜３６０）におけるアレル頻度を算出し、アソシエーション法により糖尿病との関連を解析した。結果を表４に示す。
【０１２８】
【表４】
Figure 2004000115
【０１２９】
表４において、ＧＦＡＴ１遺伝子の第８イントロンにおけるＴの繰り返し（配列番号４のヌクレオチド番号３３６〜３６０）回数が２４回の場合は「Ｔ２４」、あるいは２５回の場合は「Ｔ２５」として表されている。表４の結果より、健常人と２型糖尿病患者との間において、ＧＦＡＴ１遺伝子の第８イントロンにおけるＴの繰り返し多型のアレル頻度が、統計的に有意に異なることが示された。このことは、ＧＦＡＴ１遺伝子の第８イントロンにおけるＴの繰り返し多型を調べることにより、２型糖尿病を発症する相対的危険度を判定できることを示すものである。
【０１３０】
５）２型糖尿病とＧＦＡＴ１遺伝子の第１２イントロンにおけるＡの繰り返し多型（配列番号５のヌクレオチド番号３２８〜３４７）との関係
日本人の健常人１８９名、日本人の２型糖尿病患者３８９名について、２型糖尿病とＧＦＡＴ１遺伝子の第１２イントロンにおけるＡの繰り返し多型のアレル頻度を算出し、アソシエーション法により糖尿病との関連を解析した。結果を表５に示す。
【０１３１】
【表５】
Figure 2004000115
【０１３２】
表５において、ＧＦＡＴ１遺伝子の第１２イントロンにおけるＡの繰り返し（配列番号５のヌクレオチド番号３２８〜３４７）回数が１８回の場合は「Ａ１８」、１９回の場合は「Ａ１９」、２４回の場合は「Ａ２４」、あるいは２５回の場合は「Ａ２５」として表されている。表５の結果より、健常人と２型糖尿病患者との間において、ＧＦＡＴ１遺伝子の第１２イントロンにおけるＴの繰り返し多型のアレル頻度が統計的に有意に異なることが示された。このことは、ＧＦＡＴ１遺伝子の第１２イントロンにおけるＡの繰り返し多型を調べることにより、２型糖尿病を発症する相対的危険度を判定できることを示すものである。
【０１３３】
６）２型糖尿病とＧＦＡＴ１遺伝子の第１８イントロンにおけるＴの繰り返し多型（配列番号６のヌクレオチド番号２５３〜２６４）との関係
日本人の健常人１９２名、日本人の２型糖尿病患者３７３名について、ＧＦＡＴ１遺伝子の第１８イントロンにおけるＴの繰り返し多型（配列番号６のヌクレオチド番号２５３〜２６４）におけるアレル頻度を算出し、アソシエーション法により糖尿病との関連を解析した。結果を表６に示す。
【０１３４】
【表６】
Figure 2004000115
【０１３５】
表６において、ＧＦＡＴ１遺伝子の第１８イントロンにおけるＴの繰り返し（配列番号６のヌクレオチド番号２５３〜２６４）回数が１１回の場合は「Ｔ１１」、１２回の場合は「Ｔ１２」、あるいは１３回の場合は「Ｔ１３」として表されている。表６の結果より、健常人と２型糖尿病患者との間において、２型糖尿病とＧＦＡＴ１遺伝子の第１８イントロンにおけるＴの繰り返し多型のアレル頻度が統計的に有意に異なることが示された。このことは、ＧＦＡＴ１遺伝子の第１８イントロンにおけるＴの繰り返し多型を調べることにより、２型糖尿病を発症する相対的危険度を判定できることを示すものである。
【０１３６】
７）２型糖尿病とＧＦＡＴ１遺伝子の第１２イントロンにおけるヌクレオチド（配列番号３のヌクレオチド番号３３８）の多型との関係
日本人の健常人１９２名、日本人の２型糖尿病患者３７７名について、２型糖尿病とＧＦＡＴ１遺伝子の第１２イントロンにおけるヌクレオチド（配列番号３のヌクレオチド番号３３８）多型のアレル頻度を算出し、アソシエーション法により糖尿病との関連を解析した。結果を表７に示す。
【０１３７】
【表７】
Figure 2004000115
【０１３８】
表７において、ＧＦＡＴ１遺伝子の第１２イントロンのヌクレオチド（配列番号３のヌクレオチド番号３３８）部位がアデニンの場合は「Ａ」、チミンの場合は「Ｔ」、あるいは、欠失の場合は「ｄｅｌ」として表されている。表７の結果より、健常人と２型糖尿病患者との間において、ＧＦＡＴ１遺伝子の第１２イントロンにおけるヌクレオチド（配列番号３のヌクレオチド番号３３８）多型のアレル頻度が統計的に有意に異なることが示された。このことは、ＧＦＡＴ１遺伝子の第１２イントロンにおけるヌクレオチド（配列番号３のヌクレオチド番号３３８）の多型を調べることにより、２型糖尿病を発症する相対的危険度を判定できることを示すものである。
【０１３９】
８）２型糖尿病とＧＦＡＴ１遺伝子の第１イントロンの３６番目のヌクレオチド（配列番号１のヌクレオチド番号６３２）多型と第１８イントロンにおけるＴの繰り返し（配列番号６のヌクレオチド番号２５３〜２６４）多型を組み合わせたハプロタイプとの関係
日本人の健常人１４１名、日本人の２型糖尿病患者３６６名（腎症あり１４５名、腎症なし２２１名）について、ＧＦＡＴ１遺伝子の第１イントロンの３６番目のヌクレオチド（配列番号１のヌクレオチド番号６３２）多型と第１８イントロンにおけるＴの繰り返し（配列番号６のヌクレオチド番号２５３〜２６４）多型を組み合わせたハプロタイプ頻度を算出し、アソシエーション法により糖尿病との関連を解析した。結果を表８に示す。
【０１４０】
【表８】
Figure 2004000115
【０１４１】
表８において、ＧＦＡＴ１遺伝子の第１イントロンの３６番目がＴ（チミン）である遺伝子をホモで有する被験者は「Ｔ／Ｔ」、当該部位がＣ（シトシン）である遺伝子をホモで有する被験者は「Ｃ／Ｃ」、両遺伝子をヘテロで有する被験者は「Ｔ／Ｃ」として表されている。また、表８において、ＧＦＡＴ１遺伝子の第１８イントロンにおけるＴの繰り返し（配列番号６のヌクレオチド番号２５３〜２６４）回数が１１回の場合は「Ｔ１１」、１２回の場合は「Ｔ１２」、あるいは１３回の場合は「Ｔ１３」として表されている。さらに、それぞれの組み合わせにより生じる遺伝子型は、「Ｔ１３／Ｔ１３」、「Ｔ１３／Ｔ１２」、「Ｔ１２／Ｔ１２」、「Ｔ１３／Ｔ１１」、「Ｔ１２／Ｔ１１」、あるいは、「Ｔ１１／Ｔ１１」として表されている。表８の結果より、健常人と２型糖尿病患者全体との比較、および、健常人と２型糖尿病患者（腎症なし）との比較において、それぞれのハプロタイプにおける頻度分布が有意に異なることが示された。このことは、ＧＦＡＴ１遺伝子のＧＦＡＴ１遺伝子の第１イントロンの３６番目のヌクレオチド（配列番号１のヌクレオチド番号６３２）多型と第１８イントロンにおけるＴの繰り返し（配列番号６のヌクレオチド番号２５３〜２６４）多型を組み合わせたハプロタイプを調べることにより、２型糖尿病あるいは糖尿病性腎症を伴わない２型糖尿病を発症する相対的危険度を判定できることを示すものである。
【０１４２】
９）２型糖尿病とＧＦＡＴ１遺伝子の第１１イントロンの７番目のヌクレオチド（配列番号２のヌクレオチド番号２６６）多型と第１８イントロンにおけるＴの繰り返し（配列番号６のヌクレオチド番号２５３〜２６４）多型を組み合わせたハプロタイプとの関係
日本人の健常人１４３名、日本人の２型糖尿病患者３６７名（腎症あり１４５名、腎症なし２２２名）について、ＧＦＡＴ１遺伝子の第１１イントロンの７番目のヌクレオチド（配列番号２のヌクレオチド番号２６６）多型と第１８イントロンにおけるＴの繰り返し（配列番号６のヌクレオチド番号２５３〜２６４）多型を組み合わせたハプロタイプ頻度を算出し、アソシエーション法により糖尿病との関連を解析した。結果を表９に示す。
【０１４３】
【表９】
Figure 2004000115
【０１４４】
表９において、ＧＦＡＴ１遺伝子の第１１イントロンの７番目がＧ（グアニン）である遺伝子をホモで有する被験者は「Ｇ／Ｇ」、当該部位がＡ（アデニン）である遺伝子をホモで有する被験者は「Ａ／Ａ」、両遺伝子をヘテロで有する被験者は「Ｇ／Ａ」として表されている。また、表９において、ＧＦＡＴ１遺伝子の第１８イントロンにおけるＴの繰り返し（配列番号６のヌクレオチド番号２５３〜２６４）回数が１１回の場合は「Ｔ１１」、１２回の場合は「Ｔ１２」、あるいは１３回の場合は「Ｔ１３」として表されている。さらに、それぞれの組み合わせにより生じる遺伝子型は、「Ｔ１３／Ｔ１３」、「Ｔ１３／Ｔ１２」、「Ｔ１２／Ｔ１２」、「Ｔ１３／Ｔ１１」、「Ｔ１２／Ｔ１１」、あるいは、「Ｔ１１／Ｔ１１」として表されている。表９の結果より、健常人と２型糖尿病患者全体との比較、および、健常人と２型糖尿病患者（腎症なし）との比較において、それぞれのハプロタイプにおける頻度分布が有意に異なることが示された。このことは、ＧＦＡＴ１遺伝子の第１１イントロンの７番目のヌクレオチド（配列番号２のヌクレオチド番号２６６）多型と第１８イントロンにおけるＴの繰り返し（配列番号６のヌクレオチド番号２５３〜２６４）多型を組み合わせたハプロタイプを調べることにより、２型糖尿病あるいは糖尿病性腎症を伴わない２型糖尿病を発症する相対的危険度を判定できることを示すものである。
【０１４５】
１０）１型および２型糖尿病とＧＦＡＴ１遺伝子の第３イントロンにおけるマイクロサテライト（配列番号７のヌクレオチド番号２３７〜２６６）多型と第１８イントロンにおけるＴの繰り返し（配列番号６のヌクレオチド番号２５３〜２６４）多型を組み合わせたハプロタイプとの関係
日本人の健常人１４３名、日本人の１型糖尿病患者６４名、日本人の２型糖尿病患者３７２名（腎症あり１４３名、腎症なし２２９名）について、ＧＦＡＴ１遺伝子の第３イントロンにおけるマイクロサテライト（配列番号７のヌクレオチド番号２３７〜２６６）多型と第１８イントロンにおけるＴの繰り返し（配列番号６のヌクレオチド番号２５３〜２６４）多型を組み合わせたハプロタイプ頻度を算出し、アソシエーション法により糖尿病との関連を解析した。結果を表１０に示す。
【０１４６】
【表１０】
Figure 2004000115
【０１４７】
表１０において、ＧＦＡＴ１遺伝子の第３イントロンにおけるマイクロサテライト（配列番号７のヌクレオチド番号２３７〜２６６）ＣＡＡ（シトシン、アデニン、アデニン）の繰り返し回数が７回の場合は「７」、９回の場合は「９」、１０回の場合は「１０」、１１回の場合は「１１」、あるいは１２回の場合は「１２」として表されている。また、それぞれの組み合わせにより生じる遺伝子型は、「９／９」、「９／１０」、「１０／１０」、「９／１１」、「１０／１１」、「１１／１１」、「９／１２」、「１０／１２」、「１１／１２」、「１２／１２」、「９／７」、「１０／７」、「１１／７」、「１２／７」、あるいは「７／７」として表されている。さらに、表１０において、ＧＦＡＴ１遺伝子の第１８イントロンにおけるＴの繰り返し（配列番号６のヌクレオチド番号２５３〜２６４）回数が１１回の場合は「Ｔ１１」、１２回の場合は「Ｔ１２」、あるいは１３回の場合は「Ｔ１３」として表されており、それぞれの組み合わせにより生じる遺伝子型は、「Ｔ１３／Ｔ１３」、「Ｔ１３／Ｔ１２」、「Ｔ１２／Ｔ１２」、「Ｔ１３／Ｔ１１」、「Ｔ１２／Ｔ１１」、あるいは、「Ｔ１１／Ｔ１１」として表されている。表１０の結果より、健常人と２型糖尿病患者全体との比較、健常人と２型糖尿病患者（腎症あり）、健常人と２型糖尿病患者（腎症なし）、および健常人と１型糖尿病患者との比較すべておいて、それぞれのハプロタイプにおける頻度分布が有意に異なることが示された。このことは、ＧＦＡＴ１遺伝子の第３イントロンにおけるマイクロサテライト（配列番号７のヌクレオチド番号２３７〜２６６）多型と第１８イントロンにおけるＴの繰り返し（配列番号６のヌクレオチド番号２５３〜２６４）多型を組み合わせたハプロタイプを調べることにより、１型、２型糖尿病、糖尿病性腎症を伴なう２型糖尿病、あるいは、糖尿病性腎症を伴わない２型糖尿病を発症する相対的危険度を判定できることを示すものである。
【０１４８】
【発明の効果】
本発明によれば、１型、２型糖尿病、糖尿病性腎症を伴なう２型糖尿病、あるいは、糖尿病性腎症を伴わない２型糖尿病を発症する、相対的危険度を簡便に判定することができる。すなわち、本発明は糖尿病の発症危険性判定方法と該方法のための材料を提供する。
【０１４９】
【配列表】
ＳＥＱＵＥＮＣＥ　ＬＩＳＴＩＮＧ
＜１１０＞　Ｉｔａｋｕｒａ，　Ｍｉｔｓｕｏ
Ｓａｎｋｙｏ　Ｃｏｍｐａｎｙ，　Ｌｉｍｉｔｅｄ
＜１２０＞　Ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ　ａ　ｒｉｓｋ　ｏｆ　ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ　ｄｉａｂｅｔｅｓ＜１３０＞　２００２０９５ＳＵ
＜１５０＞　ＪＰ２００１−２７１８７０
＜１５１＞　２００１−０９−０７
＜１５０＞　ＪＰ２００２−０９０８６１
＜１５１＞　２００２−０３−２８
＜１６０＞　２５
＜１７０＞　ＰａｔｅｎｔＩｎ　Ｖｅｒ．　２．１
＜２１０＞　１
＜２１１＞　７８２
＜２１２＞　ＤＮＡ
＜２１３＞　Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ
＜２２０＞
＜２２３＞　ｉｎｖｅｎｔｏｒ：Ｉｔａｋｕｒａ，　Ｍｉｔｓｕｏ；　Ｙａｓｕｍｏ，　Ｈｉｒｏａｋｉ；　Ｗａｔａｎａｂｅ，　Ｉｃｈｉｒｏ＜２２０＞
＜２２１＞　ｖａｒｉａｔｉｏｎ
＜２２２＞　（６３２）
＜２２３＞　Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｏｆ　ｖａｒｉａｔｉｏｎ：　ｓｉｎｇｌｅ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ　ｉｎｖｏｌｖｉｎｇｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ　ｏｆ　（Ｃ）　ａｎｄ　（Ｔ）
＜４００＞　１
ｃｃａｇｇａｔｔｃｃ　ｃｔｔｔｔｃａｔａｃ　ｔｔｃｃｔｇｃｔｔｔ　ｔｔｔｃｃｔｃｃｔｃ　ｔｔｔｃｃｔｃｇｃｔ　ｔｃｇｔｇｃａｇｔｇ　６０
ｃｔｇｇｃｇｃｃｔｇ　ｇｇｇｃｃｔｇｇｇｇ　ｃｔｇｃａｃｇｇｇｇ　ｃａｃｇｃａｃｃｃｇ　ｇｇｃｔａｔｔｇｃｔ　ｔｔｇｃｔａａｃａａ　１２０
ｔｔｃｃａｔｃｃｔｔ　ｃｔｃｔｔｔｃｃｇｔ　ｃａｔｔｃｃｃｔｇｃ　ｃａｇｇｔｇｃｔｇａ　ｇｔｔｔｃｔｃｃｃｔ　ｃｃｃｔｃｔｃｇｇｃ　１８０
ｔｃｇｇｔｃｃｃｔｃ　ｃｃｇｃｇｇｃｔｃｇ　ｃｃｃｃｇｇｇｇｃｇ　ｇｇｃｇｔｃｔｃｃａ　ｇｇａａｃｔｃｃａｇ　ｇｃｇｇａｃｇｃｇｇ　２４０
ｃｃａｃｇａｇｃｃａ　ｃｔｇｃｃａｃｇｔｃ　ｇｃｃｇｃｃｇｃｃａ　ｇｃａｇｔｃｃａｇｃ　ｇｃｃｔｇｃｇｔｇｇ　ｇｃｔｃｇｇｇｇｇｇ　３００
ｃｇｇｇｇｃａｇｃｇ　ｃｔｇｇｇａｇｇｃｇ　ｇｇａｃｔｔｇｃｇｃ　ｇｔｇａｇｃｇｇｃｇ　ｃｇｔｇａｇｃｇｇｔ　ｔｃａａｔｇｇａｇｃ　３６０
ｃｔａｃｇｇｇｃｇｇ　ｃｇｇｃｇｃｇｃｔｇ　ｃｇｃｇｃｃｇａｇｇ　ｇｇｃｇｇｇｇｃｃｃ　ｇｇｃｇｇｃｇｇｔｔ　ｇｃｔｇｇｃｇｇａｇ　４２０
ｃｃｃｇｇｇａｇｇｃ　ｇｇａｇａａｇｇｃｔ　ｇｔｃｇｔｔｇｃｃｔ　ｔｇｇｃｃｇｔｃｇｃ　ａｔｃｃｃｃｇａｇｇ　ｇａｇｔｃｇｔｇｔｃ　４８０
ｇｇｃｇｃｃａｃｃｃ　ｃｇｇｃｃｃｃｃｇａ　ｇｃｃｃｇｃａｇａｔ　ｔｇｃｃｃａｃｃｇａ　ａｇｃｔｃｇｔｇｔｇ　ｔｇｃａｃｃｃｃｃｇ　５４０
ａｔｃｃｃｇｃｃａｇ　ｃｃａｃｔｃｇｃｃｃ　ｃｔｇｇｃｃｔｃｇｃ　ｇｇｇｃｃｇｔｇｔｃ　ｔｃｃｇｇｃａｔｃａ　ｔｇｔｇｔｇｇｔａａ　６００
ｇｇｇｇｇｃｃｇｇｇ　ａｇｃｇｇｇｇｇｇｃ　ｇｔｇｔｔｇｃｃｇｇ　ｇｙｇｇｃｇｃｔｇｇ　ｇｇｔｇｃｇｇｔｇｃ　ｇｇｇｔｇｃｃｇｃｔ　６６０
ａａｇｇｃｃｃａａｇ　ｇｃｇａｃｇｇｇｃｇ　ｇａａｇｃｇｇｇａｇ　ｔｇｔｇｇａｇｇｇｔ　ｇｃｇａａｇｔｃｔｇ　ｇｇｔｇａｔｇｇｇｃ　７２０
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ｔｇ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　７８２
＜２１０＞　２
＜２１１＞　６７５
＜２１２＞　ＤＮＡ
＜２１３＞　Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ
＜２２０＞
＜２２１＞　ｖａｒｉａｔｉｏｎ
＜２２２＞　（２６６）
＜２２３＞　Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｏｆ　ｖａｒｉａｔｉｏｎ：　ｓｉｎｇｌｅ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ　ｉｎｖｏｌｖｉｎｇｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ　ｏｆ　（Ｇ）　ａｎｄ　（Ａ）
＜４００＞　２
ａｇａｇｔａａａａｔ　ａｔｇｔｔｃａｃｃｃ　ａｇｔｃｔｔｔｔａｇ　ｇｃａｇｔｃａｔｇｔ　ｃｔａｔｔｇｃａｔｇ　ａａｃｔｔｔｔｇｔｔ　６０
ａｔａｔｔｔｔａｔｔ　ｔａｃｃａａｇａｔｔ　ａｔａｔｔａａａｇｇ　ａａａｃｔｔｔｔａｇ　ｔｔｇｔｇｔａｃａａ　ａｔｔｃｔｔｔｔａｔ　１２０
ｔｔｇａｔｔｔｇｔｔ　ｔｔｔｇｔｔｔｔａａ　ｔｔａｔｇｔｇａｔｔ　ｔｃｔａｔｔａｃｔａ　ｔａｇｇｃａａｃｔｔ　ｃａｇｔｔｃａｔｔｔ　１８０
ａｔｇｃａｇａａｇｇ　ａａａｔａｔｔｔｇａ　ｇｃａｇｃｃａｇａｇ　ｔｃｔｇｔｃｇｔｇａ　ａｃａｃａａｔｇａｇ　ａｇｇａａｇａｇｔｃ　２４０
ａａｃｔｔｔｇａｔｇ　ａｃｔａｔａｃｔｇｇ　ｔａａｔｔｒｃａｔａ　ｔｇａａｔｔａｔｔｔ　ｔａｔｔａｔｔｔｃａ　ｇｔｇｔｃｔｃｔｇａ　３００
ｃａｇｔａｇｇａｇｇ　ｔｇｃｃａｔｔａａｃ　ａａｃｃｔｇａａａｇ　ｔｔｃａｔｔｇｃｃｃ　ｔｔａａｔａｇｃｃｔ　ｔｇｔａｇａａｃａａ　３６０
ｃｔａｃａｇｃｔｇｃ　ｃａｇｃｃａｔｃａｇ　ｔｇｇａｇｃｃｃａｇ　ｃｃａｔｃｔｔｇｇａ　ａａａａｇｔｔｃｔｔ　ｔａｇｔｇｔｇｔｇａ　４２０
ｔｔｃｔａｃｃｔａｔ　ａｔａａｇａｔａｔｃ　ｔａｇａａｔａｇｔｃ　ａｇａｔｔｃａｃａｇ　ａａａｇａｇａａａｇ　ｔａｇａｔｔａａｔｇ　４８０
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ａｇｔｔｇｔｇｇｇａ　ｔｇａｔｇａａａｔｔ　ａｃａｇａａａｔｇｇ　ａｔｔｇｔａｇｔｇａ　ｔｇｇｔｔｇｃａｃａ　ａｔａａｔｇｔｇａａ　６００
ｔｇｔｇｃｔｔａａｔ　ｇｃｃａｃｔｇａａｔ　ｔｇｔａｃａｔｔｔａ　ａａｃａｔａｇｔｔａ　ａａａｔｇｇｔａａａ　ｔｔｔｔａｔｇｔｇｔ　６６０
ａｇｇｔｃａｃｃｃａ　ｃｔｇｔｇ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　６７５
＜２１０＞　３
＜２１１＞　７８０
＜２１２＞　ＤＮＡ
＜２１３＞　Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ
＜２２０＞
＜２２１＞　ｖａｒｉａｔｉｏｎ
＜２２２＞　（３３８）
＜２２３＞　Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｏｆ　ｖａｒｉａｔｉｏｎ：　ｓｉｎｇｌｅ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ　ｉｎｖｏｌｖｉｎｇｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ　ｏｆ　（Ａ）　ａｎｄ　（Ｔ）
＜４００＞　３
ｃｔｔｔｇｇｇａｇｇ　ｃｔｇａｇｇｃｇａｇ　ｃａｇａｔｃａｔｇａ　ｇｇｔｃａｇｇａｇａ　ｔｔｇａｇａｃｃａｔ　ｃｃｔｇｇｃｃａａｃ　６０
ａｔｇｇｔｇａａａｃ　ｃｃｃａｔｃｔｃｔａ　ｃｔａａｇｃｔｇｇｇ　ｃａｔｇｇｔｇｇｃｇ　ｃａｃｇｃｃｔａｔａ　ｇｔｃｃｃａｇｃｔａ　１２０
ｃｔｃａｇｇａｇｇｃ　ｔｇａｇｇｃａｇｇａ　ｇａａｔｔｇｃｔｔｇ　ａａｃｃｃｇｇｇａｇ　ｇｃｇｇａｇｇｔｔａ　ｃｇｇｔｇａｇｃｃｇ　１８０
ａｇａｔｇｇｃａｃｃ　ａｃｔｇｃａｃｔｃｃ　ａｇｃｃｔｇｇｃｇａ　ｃａｇａｇｃｇａｇａ　ｃｔｃｃｇｔｃｔｃａ　ａａａａａａａａａａ　２４０
ａａａａａａａａｇｇ　ａａｔｇｔａｔａｃａ　ｔａｇａｔａｇｔｔｇ　ｔｃｔａａａｇａｇａ　ｃｔｇａｔａｇｔａａ　ａａｔｇｔｔａｇｃｃ　３００
ａｔｇｃｔｔａｔｃｔ　ｃａａｇｔｇｇｔａｇ　ｇａｔｔｔｔｇａｔｔ　ｔｔｔｔｔｔｔｗａａ　ａａｔａｔｔｔｔａａ　ｔｃｔｇｇｇｔｔｇｔ　３６０
ｔｔｔｔａｔｔｔｔｃ　ｔａａｃｇｔｇｔｃａ　ｔｔｔｔｔｇｔａａｔ　ｃａｇａａａａａｇｃ　ａａａａａｃｔａｔａ　ｃａｔｔｇａａｔｃｃ　４２０
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ｇｃａｇａｃａｃｇｔ　ｃａａｇｔｔｃｔｔｇ　ａｇｇａｇｃｔｇａｃ　ｔｇａｇｔｔｇｃｃｔ　ｇｔｇａｔｇｇｔｇｇ　ａａｃｔａｇｃａａｇ　５４０
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＜２１０＞　４
＜２１１＞　７２０
＜２１２＞　ＤＮＡ
＜２１３＞　Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ
＜２２０＞
＜２２１＞　ｖａｒｉａｔｉｏｎ
＜２２２＞　（３３６）．．（３６０）
＜２２３＞　Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｏｆ　ｖａｒｉａｔｉｏｎ：　（Ｔ）２４　ｏｒ　（Ｔ）２５　ｒｅｐｅａｔ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ＜４００＞　４
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＜２１０＞　５
＜２１１＞　６６０
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＜２２０＞
＜２２１＞　ｖａｒｉａｔｉｏｎ
＜２２２＞　（３２８）．．（３４７）
＜２２３＞　Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｏｆ　ｖａｒｉａｔｉｏｎ：　（Ａ）１８，　（Ａ）１９，　（Ａ）２４　ｏｒ　（Ａ）２５　ｒｅｐｅａｔ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ
＜４００＞　５
ａｔｇｇａａｃａｃｔ　ａｇｇｃａｔａａａｔ　ｇａｔｔｔａａｇｔａ　ｔａｇｃｃｔａｃｔｔ　ａａｔａｔｇｃｔｔｔ　ｔｃａａａａｔｔｔｔ　６０
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＜２１３＞　Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ
＜２２０＞
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＜２２３＞　Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｏｆ　ｖａｒｉａｔｉｏｎ：　（Ｔ）１１，　（Ｔ）１２，　ｏｒ　（Ｔ）１３　ｒｅｐｅａｔ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ
＜４００＞　６
ｔａｔｇａｇｇｇｃｔ　ａｃｔａｃｔｔｃｔｇ　ｔａｇａｇｇａｃｃａ　ｃａｇｔａｇｃｔｃｔ　ｔｔｃｔｇｔｇｔｇａ　ａｃｔｇｇｃａｃｃｔ　６０
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＜２１３＞　Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ
＜２２０＞
＜２２１＞　ｖａｒｉａｔｉｏｎ
＜２２２＞　（２３７）．．（２６６）
＜２２３＞　Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｏｆ　ｖａｒｉａｔｉｏｎ：　（ＣＡＡ）７，　（ＣＡＡ）９，　（ＣＡＡ）１０，　（ＣＡＡ）１１　ｏｒ　（ＣＡＡ）１２　ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ　ｒｅｐｅａｔ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ
＜４００＞　７
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＜２２０＞
＜２２３＞　Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ｐｒｉｍｅｒ＜４００＞　８
ｃａｃｃｇａａｇｃｔ　ｃｇｔｇｔｇｔｇｃａ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０
＜２１０＞　９
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＜２２３＞　Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ｐｒｉｍｅｒ
＜４００＞　９
ｃｇｃｃｔｔｇｇｇｃ　ｃｔｔａｇｃｇｇｃａ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０
＜２１０＞　１０
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＜２１２＞　ＤＮＡ
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＜２２０＞
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ｇｇａａａｃｔｔｔｔ　ａｇｔｔｇｔｇｔａｃ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０
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＜２１２＞　ＤＮＡ
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＜２２０＞
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ｃｔｇｔｃａｇａｇａ　ｃａｃｔｇａａａｔａ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０
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＜２２３＞　Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ｐｒｉｍｅｒ
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ｇｃｃａｔｇｃｔｔａ　ｔｃｔｃａａｇｔｇｇ　ｔ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２１
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＜２２０＞
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＜２２０＞
＜２２３＞　Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ｐｒｉｍｅｒ
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ａａａａａａｃａｃａ　ｇｔｇａａａｃｔｃａ　ａｇ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２２
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＜２２３＞　Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ｐｒｉｍｅｒ
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ｃｃｃａｔｃｔｃｔａ　ｃｔａａａａｔａｃａ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０
＜２１０＞　２１
＜２１１＞　２０
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＜２１３＞　Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ
＜２２０＞
＜２２３＞　Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ｐｒｉｍｅｒ
＜４００＞　２１
ｃａｃｔｔｃｔｔｔｃ　ａａａａｇｃｔａｃａ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０
＜２１０＞　２２
＜２１１＞　９３３９０
＜２１２＞　ＤＮＡ
＜２１３＞　Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ
＜２２０＞
＜２２１＞　ｅｘｏｎ
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＜２２０＞
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＜２２０＞
＜２２１＞　ｅｘｏｎ
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＜２２０＞
＜２２１＞　ｉｎｔｒｏｎ
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＜２２０＞
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＜２２０＞
＜２２１＞　ｉｎｔｒｏｎ
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＜２２０＞
＜２２１＞　ｅｘｏｎ
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＜２２０＞
＜２２１＞　ｉｎｔｒｏｎ
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＜２２０＞
＜２２１＞　ｅｘｏｎ
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＜２２０＞
＜２２１＞　ｉｎｔｒｏｎ
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＜２２１＞　ｅｘｏｎ
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＜２２１＞　ｉｎｔｒｏｎ
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＜２２１＞　ｉｎｔｒｏｎ
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＜２２１＞　ｉｎｔｒｏｎ
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＜２２１＞　ｉｎｔｒｏｎ
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＜２２１＞　ｅｘｏｎ
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＜２２１＞　ｉｎｔｒｏｎ
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＜２２１＞　ｉｎｔｒｏｎ
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＜２２０＞
＜２２１＞　ｖａｒｉａｔｉｏｎ
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＜２２１＞　ｖａｒｉａｔｉｏｎ
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＜２２３＞　Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｏｆ　ｖａｒｉａｔｉｏｎ：　ｓｉｎｇｌｅ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ　ｉｎｖｏｌｖｉｎｇｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ　ｏｆ　（Ｇ）　ａｎｄ　（Ａ）
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＜２２１＞　ｖａｒｉａｔｉｏｎ
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＜２２１＞　ｖａｒｉａｔｉｏｎ
＜２２２＞　（７７７７３）．．（７７７８４）
＜２２３＞　Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｏｆ　ｖａｒｉａｔｉｏｎ：　（Ｔ）１１，　（Ｔ）１２，　ｏｒ　（Ｔ）１３　ｒｅｐｅａｔ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ
＜４００＞　２２
ａａｃｃｙｔｇｔｃｔ　ｃｔａｔｔａａａａａ　ｔｍｃａａａａａａｔ　ｔａｇｃｃｇｇｇｃａ　ｔｇｇｔｇｇｃｇｇｇ　ｇｇｃｃｔｇｔａｇｔ　６０
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ｃａａｃｔｔｔｇｃｔ　ａａａｃｔｔａｃｔｔ　ｇｔｔａａｔｔｃｔａ　ａｔｇｇａｔｔｔｔｔ　ｃｔａｇｇｔａｔａｔ　ａｃｔｃａｔａｔｔａ　９１４４０
ｃｃｔｇｔｇａａｔａ　ａｃａｇｃａｃｇｔｔ　ｔｇｔｔｔｃｔｔｔｔ　ｃｔｔｃｔａａｔｃｔ　ｔｔａｃｇｔａｔｔｔ　ｔｔａａａａａａｔｔ　９１５００
ｇｃｔｃｔａｃａｇｔ　ｇｃｔｇｃｃｔａｇｇ　ｇｃａｔｃｃａｔｔａ　ｃａｇｔｔｔｇａａｃ　ｔｇａａａｔｇｇｔａ　ａｔｇｇａａａｃａｔ　９１５６０
ｃｔｔｔｇｔｔｔｔｇ　ｔｃｃｃｔｇａｔｃｔ　ｃａａａｇｇａａａｇ　ｇｔｔｔｃａａｃａｔ　ｔｔｔａｔｃａｔｔａ　ｔａｔｔｔａｃｔｇｔ　９１６２０
ａｇａｃｔｔｔｔｇｔ　ａｇａｔａｃｔｃｔｃ　ｔａｔｃａｇｇｔｔａ　ａｇａａｃｔｔｔｔｔ　ｔｃｔｔｃｔｔｃｔｔ　ｃｔｔｇｇｔｔｔｃｔ　９１６８０
ａａｇａｇｇｔａｇｇ　ｇｇｇｔｔｔｔｔｔｇ　ｔｔｔｇｔｔｇｃｔｔ　ｔｔｔｔｇｃｔｔｔｔ　ｇｔｔｔｔｔｇａｇｃ　ａｇｇｇｔｃｔｔｇｃ　９１７４０
ｔｃｔｇｔｃａｃｔｃ　ａｇｇｃｔｇｇａｇｔ　ｇｃａｇｔｇｇｃｇｔ　ｇａｔｃｃｔｇｇｃｔ　ｃａｃｔｇｃａａｃｃ　ｔｃｃａｃｃｔｃｃｃ　９１８００
ｔｇｇｔｔｃａａｇｃ　ｇａｔｔｃｔｃａｔｇ　ｃｃｔｃａｇｃｃｔｃ　ｃｃａａｇｔａｃｃｔ　ｇｔｇａｔｔｔｃａｇ　ｇｔｇｃｃｔｇｃｃａ　９１８６０
ｃｃａｃｇｃｃｔｇｇ　ｃｔａａｔｔｔｔｔｔ　ｔｇｔａｔｔｔｔｔａ　ｇｔａｇａｇａｃａｇ　ｇｇｔｔｔｃａｃｃａ　ｔｇｔｔｇｇｃｃａｇ　９１９２０
ｇｃｔｇｇｔｔｔｔｇ　ａａｃｔｃｃｔｇａｇ　ｃｔｃａｇｇｃａｇｔ　ｃｔａｃｃｃｇｃｃｔ　ｃｇｇｃｃｔｃｃｃａ　ｇａｇｔｇｃｔａｇｇ　９１９８０
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ｔｇｔｇｔｃｃａｔｔ　ｇｔａｃａａｃｃｔｃ　ａｇｇｃａａｃａｇｔ　ｇｔｇｃｇｇｇａｇｃ　ｃａｃｇａｃｔｃｔｇ　ｔｃｔｔｃｃｔｇｇａ　９２１００
ｇｇｇｇｇａａａｔｇ　ｔｔｃａｔｔｇａａａ　ｔｔｔｇｔｔｃａｇｇ　ａａｃｃａｔｔｔｔｃ　ｔｃｔｔｔａｔａｔａ　ｔｇｔｇｇａｃａｇａ　９２１６０
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ａｔａａｃａｃｔｔｔ　ｇａａｇａａａｇｔａ　ａｔｇａｔｇｔａａａ　ａｇｔｃｃａｇａｔｔ　ｔａｔｇｃｔａａｔａ　ｔｔｔｔｇｔｔｔａｇ　９２３４０
ｃｔｔｃｔｃｔｔｔｃ　ｃｃｔｇｃｔｃｔｇａ　ｇｇａｔｔｇｇｔｇｃ　ｔａｇａｇｃｔａａａ　ｇａｇａｇａｇａｃａ　ｔｃａｔｔｔｔｃｔｃ　９２４００
ａｇｔｇｔｔａｔｇｔ　ｔｔｇｇａｔｔｇａａ　ａｃａｃｃａｇｇａｔ　ａａｇｃｃａｇｔｔｔ　ｇｃｃｃｔｔａｔｃｔ　ｇａａａｇｔｃａｔｔ　９２４６０
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ｇａｇａｇｇｇｔｇｇ　ｃｔｃｔｃｃｃａｃｃ　ｔｇｃｃｔｔｃｔｔｇ　ａａｔｇｇｇｃｔｃｔ　ｃｔｃｇｇａｔｇｇａ　ｇａｇｇｔｔｇｇａｇ　９３２４０
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ａｔｇａｔｇａｇｔｔ　ｔｇｃｃｃｔｃａｇｃ　ｃａｃａｇｇａｇｇａ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　９３３９０
＜２１０＞　２３
＜２１１＞　２６８８
＜２１２＞　ＤＮＡ
＜２１３＞　Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ
＜２２０＞
＜２２１＞　ｖａｒｉａｔｉｏｎ
＜２２２＞　（２２５１）
＜２２３＞　Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｏｆ　ｖａｒｉａｔｉｏｎ：　ｓｉｎｇｌｅ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ　ｉｎｖｏｌｖｉｎｇｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ　ｏｆ　（Ｃ）　ａｎｄ　（Ｔ）
＜４００＞　２３
ｇｔｇａｇｇｇｃｔｃ　ｔｃｃａｃｔｇｇａｃ　ｔｇｇｇｃｃａｇｃｔ　ｃｔｃｔｃｃｔｇｃｔ　ｔｔｔｃｃｃｃａｔｇ　ｃａｔｇｃｃｃａｃｃ　６０
ｔｃａｃｃａｃｔｇｔ　ｃｔｇｃｃａａｔａｃ　ｃａｇｔｇａｔｇｇａ　ｔｇｇｔｃｔｇｇｃｃ　ａｇｔｇａｇｔｇｇｃ　ｔｇｔｇａｃｃａｃａ　１２０
ｃａｃｃｃｔｃｃｃｃ　ｃｇｇｇｃｃｃｃｃｔ　ｇｔｇｇｇｇａｇｔｇ　ｃａｃａｃａｃｔｔｇ　ｇａａａｇｇａｇｃｔ　ｇｇｔｃａｇｃｃｃｇ　１８０
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ａｇｔａｇｇｃａｇｇ　ａｔｇｇａｇｔｇａａ　ｃｃａｔｔｇｇｃｃａ　ｔｇｔｇａｔｃｇａａ　ｃｔｃａｇｔｃｇｃｃ　ａｇｃｃｃｃａｃｔｔ　７８０
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ａａｔｃａｔｇｔｇｇ　ｃｔｇｇｃｃｔｔｔｃ　ｔａｇｃａｇｇｇｃｃ　ａｇａｃｇｃｃａｔｃ　ｃｔｇｇａａｃｔａｔ　ｃｔａｃａｇｇｃｃｃ　９００
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ａｔｔｔｔｔｔｇｔａ　ｇａｇａｃｇｇｇｇｔ　ｔｔｃａｃｃｇｔｇｔ　ｔａｇｃｃａｇｇａｔ　ｇａｃｃｔｔｇａ　　　　　　　　　　　　　　２６８８
＜２１０＞　２４
＜２１１＞　２０
＜２１２＞　ＤＮＡ
＜２１３＞　Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ
＜２２０＞
＜２２３＞　Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ｐｒｉｍｅｒ
＜４００＞　２４
ａｔｇｃｔａｔｔｔｃ　ｔｃｔｇｃｔｃｔａｇ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０
＜２１０＞　２５
＜２１１＞　２０
＜２１２＞　ＤＮＡ
＜２１３＞　Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ
＜２２０＞
＜２２３＞　Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ｐｒｉｍｅｒ
＜４００＞　２５
ｔｔａｇｇｔｇｃａｇ　ｔｔｔｔｔａｇａｃｇ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０

【０１５０】
Figure 2004000115
[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for determining the risk of developing diabetes. More specifically, the present invention relates to a method for determining a potential risk of developing diabetes by detecting a novel gene polymorphism associated with the development of diabetes from a sample containing human genomic DNA.
[0002]
[Prior art]
Diabetes has been increasing in the number of patients in recent years and is attracting attention as one of adult diseases. Diabetes includes insulin-dependent type 1 diabetes and non-dependent type 2 diabetes. Among them, type 2 diabetes (non-insulin-dependent diabetes mellitus, NIDDM) is a type of diabetes that is common in Japanese and is detected early. Early treatment is important in terms of its prognosis.
[0003]
However, the causes of type 2 diabetes are diverse and little is known about the possible causes. Causes of insufficient insulin action in type 2 diabetes include abnormalities in the insulin sensitivity mechanism and decreased insulin secretion. In Europe and the United States, the former, that is, insulin resistance is the main cause of type 2 diabetes, but in Japan, insulin secretion deficiency is often the main cause.
[0004]
On the other hand, diabetes develops retinopathy, neuropathy, arteriosclerosis or nephropathy as its complications. In particular, when a diabetic suffers from nephropathy, the renal disorder causes hypertension and hyperlipidemia to worsen, further worsening the prognosis of the patient. Therefore, prevention and treatment of nephropathy are particularly important problems among diabetic complications.
[0005]
In recent years, with the rapid progress of molecular biology, knowledge on the mechanism of insulin action has been accumulated. Beginning to elucidate the structure of the insulin receptor, the signal transduction mechanism after the receptor has also been gradually elucidated. Under these circumstances, a therapeutic agent for diabetes [α-glycosidase inhibitor: Acarbose, ΔVoglibose (for example, see Non-Patent Documents 1 to 6), an insulin sensitizer: Troglitazone, Pioglitazone (for example, see Non-Patent Documents 7 to 11)] has also appeared and been released. On the other hand, in the United States, a biguanide agent was approved as a therapeutic agent for diabetes in 1996, and has been attracting attention because it can be used for daily medical treatment of diabetes (for example, see Non-Patent Documents 12 and 13). All of these drugs, unlike sulfonylurea (SU) drugs which have been widely used in daily medical practice since ancient times, have an action of lowering blood glucose without promoting insulin secretion from pancreatic β cells.
[0006]
At present, the following nine items are considered as an action mechanism of a therapeutic drug for diabetes having a function of improving insulin resistance. Activation of insulin receptor kinase, promotion of transfer of sugar transporter to cell membrane, action of rate-limiting enzyme of glucose metabolism and correction of abnormal glucose metabolism, suppression of hepatic gluconeogenesis, promotion of hepatic glucose uptake, enhancement of hepatic glycogen production, It is a decrease in blood lipid, a decrease in hepatic gluconeogenesis due to a decrease in blood lipid, and an increase in insulin sensitivity due to a decrease in blood lipid.
[0007]
By the way, glutamine: fructose-6-phosphate amide transferase (hereinafter referred to as “GFAT”) catalyzes the rate-limiting reaction of fructose-6-phosphate to glucosamine-6-phosphate in the hexosamine biosynthesis pathway. It is an important enzyme. It is thought that a drug that inhibits GFAT activity promotes the uptake of glucose into cells and can lower the blood glucose level, and is therefore expected to be developed as a therapeutic agent for diabetes. The mechanism of action of this GFAT inhibitor is explained as follows.
[0008]
The hexosamine biosynthesis pathway produces UDP-N-acetylglucosamine, CMP-N-acetylneuraminic acid, and the like in the metabolic process, and these flow as crude materials such as saccharification modification of proteins and proteoglycans or gangliosides. It is considered.
[0009]
On the other hand, when insulin binds to a receptor on the cell surface, an intracellular signal is activated, and a sugar transporter (GLUT4 or the like) pooled in the cell is transferred to the membrane surface, and glucose uptake is promoted. Incorporated glucose is metabolized by the glycolysis system and accumulates ATP as an energy source, but when incorporated in excess, fructose-6-phosphate, a glucose metabolite, will flow to the hexosamine biosynthesis pathway. . The flowing fructose-6-phosphate is converted to glucosamine-6-phosphate by GFAT. Although the detailed mechanism is unknown, various circumstantial evidences have shown that this glucosamine-6-phosphate metabolite suppresses the translocation of the sugar transporter to the membrane, thereby suppressing glucose uptake into cells. (For example, see Non-Patent Documents 14 to 18). From these facts, it is considered that the hexosamine biosynthetic pathway functions as a feedback mechanism for glucose uptake as one of its roles. And GFAT plays an important role as a rate-limiting enzyme in the pathway.
[0010]
In addition, recently, transgenic mice overexpressing antisense nucleotides of GFAT constitutively suppress the expression of GFAT, and administration of streptozotocin, a selective destroyer of pancreatic β cells, inhibits β cell apoptosis. Thus, it has been reported that the blood glucose level is improved (for example, see Non-Patent Document 19).
[0011]
In diabetics, this GFAT activity is generally known to be high, and is considered to be one of the causes of high blood sugar levels (for example, see Non-Patent Document 20).
[0012]
At present, two types of human-derived GFATs are known: GFAT1 (for example, see Non-Patent Document 21) and GFAT2 (for example, see Patent Document 1 and Non-Patent Document 22). It has been reported that GFAT1 is a 77 kDa protein consisting of 681 amino acids and GFAT2 is composed of 682 amino acids, but the full-length sequence of the GFAT1 gene has not yet been elucidated. The amino acid sequence homology between human GFAT1 and GFAT2 is 78%. In addition, mouse-derived (for example, see Non-Patent Document 23), yeast-derived GFAT (for example, see Non-Patent Document 24), or Escherichia coli-derived GFAT (for example, see Non-Patent Document 25) have been reported. Shows high homology to human GFAT.
[0013]
Recent progress in pharmacogenomics research has made it possible to predict the effects and side effects of drugs on individual patients by genetic diagnosis from the relationship between genetic polymorphisms and drug effects or between genetic polymorphisms and side effects. In addition, by examining the relationship between a genetic polymorphism and a disease, it is becoming possible to make a preliminary diagnosis of some diseases and determine a prognosis. Examples of the former include gene polymorphisms of drug metabolizing enzymes. Known drug metabolizing enzymes whose activity increases or decreases due to polymorphism include cytochrome P4501A2, cytochrome P4502A6, cytochrome P4502C9, cytochrome P4502C19, cytochrome P4502D6, and cytochrome P4502E1. In addition, gene polymorphism also exists in a group of enzymes called conjugating enzymes such as thiopurine methyltransferase, N-acetyltransferase, UDP-glucuronosyltransferase, and glutathione S-transferase, and the activity decreases due to the polymorphism. (For example, see Non-Patent Document 26). As an example of the latter, a large number of disease-causing genes found from polymorphism analysis studies have been reported. For example, (1) HLA as a causative gene for ulcerative colitis, (2) TCRa as a causative gene for rheumatoid arthritis, (3) APOE4 as a causative gene for Alzheimer's disease, (4) a causative gene for schizophrenia Dopamine D3 receptor, 5) tryptophan hydroxylase as a causative gene for manic depression, 6) angiotensin precursor as a causative gene for albuminuria, 7) blood coagulation factor as a causative gene for myocardial infarction VII, (8) Leptin as a causal gene of obesity and the like (see, for example, Non-Patent Document 27).
[0014]
TNF-α is considered to be an important substance involved in the pathogenesis of various inflammatory diseases. Recently, a polymorphism that enhances the expression of this gene is located in the 5′-terminal upstream region of the TNF-α gene. Was found to exist (for example, see Non-Patent Document 28). Since these polymorphisms enhance the expression level of the TNF-α gene, detection of the polymorphisms leads to advancement of TNF-α-related diseases such as juvenile rheumatoid arthritis, rheumatoid arthritis and diabetes. Diagnosis becomes possible (for example, see Patent Document 2).
[0015]
Regarding diabetes, the relationship between gene mutation and the onset of diabetes has been studied. Genes that have been identified so far to cause diabetes by a single abnormality include insulin, insulin receptor, insulin promoter factor, glucokinase, hepatocyte nucleus factor, amylin, and skeletal muscle glycogen synthesis. Enzymes and mitochondrial genes. In addition, genes considered to be involved in the development of type 2 diabetes include insulin receptor substrate, glucose transporter, mitochondrial glycerophosphate dehydrogenase, fatty acid binding protein, adrenergic receptor, glucagon receptor, potassium channel, CD38 and the like (for example, Non-Patent Document 29).
[0016]
Recently, it has been reported that the Arg140Trp polymorphism in CD38 increases the risk of diabetes (see, for example, Non-Patent Document 30). Since this polymorphism is found in Japanese diabetic patients at a frequency of about 13%, it is considered to be useful for diagnosing risk for diabetes.
[0017]
However, nothing is known about the relationship between the GFAT gene polymorphism and type 2 diabetes. Type 2 diabetes is thought to be caused by multiple genetic polymorphisms or external factors such as diet, rather than being caused by mutation or polymorphism of a single gene. There are many unclear points. Therefore, it is desired to further study the genes and polymorphisms involved in the onset of type 2 diabetes in the future.
[0018]
[Patent Document 1]
JP-A-10-108683
[Patent Document 2]
International Publication No. 98/54361 Pamphlet
[0019]
[Non-patent document 1]
Diabetes Frontier, {3, 557-564} (1992)
[Non-patent document 2]
Drugs, {46, 1025-1054} (1994)
[Non-Patent Document 3]
History of Medicine, {149, 591-618} (1989)
[Non-patent document 4]
Clinical and Research, 67, {219-233} (1990)
[Non-Patent Document 5]
Clinical and Research, {69, {919-932} (1992)
[Non-Patent Document 6]
Clinician 21 (extra edition), $ 578-587 (1995)
[Non-Patent Document 7]
Diabetes, {37, {1549-1558} (1998)
[Non-Patent Document 8]
Life Science (Life @ Sci.), {67, {2405-2416} (2000)
[Non-Patent Document 9]
Metabolism, {44, 486-490} (1995)
[Non-Patent Document 10]
New England Journal of Medicine (New Engl. J. Med.), 331, 1188-1193 (1994)
[Non-Patent Document 11]
Edited by Yoshio Goto, “New Diabetes Drugs”, Pharmaceutical Journal, Osaka, (1994)
[Non-Patent Document 12]
New England Journal of Medicine (New Engl. J. Med.), 333, 541-549 (1995)
[Non-patent document 13]
Diabetes Spectrum, $ 8, $ 194-197 (1995)
[Non-patent document 14]
Faseb Journal, 5, 3031-3036 (1991)
[Non-Patent Document 15]
Diabetologia, {38, {518-524} (1995)
[Non-Patent Document 16]
Journal of Biological Chemistry (J. Biol. Chem.), {266, 10155-10161} (1991)
[Non-Patent Document 17]
Journal of Biological Chemistry (J. Biol. Chem.), {266, 4706-4712} (1991)
[Non-Patent Document 18]
Endocrinology, {136, {2809-2816} (1995)
[Non-Patent Document 19]
Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), {97, 2820-2825} (2000)
[Non-Patent Document 20]
Diabetes, {45, {302-307} (1996)
[Non-Patent Document 21]
Journal of Biological Chemistry (J. Biol. Chem.), {267, 25208-25212} (1992)
[Non-Patent Document 22]
Genomics, {57, {227-234} (1999).
[Non-Patent Document 23]
Gene, {140, {289-290} (1994)
[Non-Patent Document 24]
Journal of Biological Chemistry (J. Biol. Chem.), {264, 8753-8758} (1989)
[Non-Patent Document 25]
Biochemical Journal (Biochem. @J.), {224, {779-815} (1984)
[Non-Patent Document 26]
Edited by Yusuke Nakamura, "Strategy for SNP gene polymorphism", Nakayama Shoten, Tokyo, (2000)
[Non-Patent Document 27]
Nature Genetics (Nat. Genet.), {22, 139-144} (1999)
[Non-Patent Document 28]
Tissue Antigens, {51, {605-612} (1998)
[Non-Patent Document 29]
Edited by Takashi Kadowaki, "The Forefront of Diabetes", Yodosha, Tokyo, (1997)
[Non-Patent Document 30]
Diabetologia, {41, {1024-1028} (1998)
[0020]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a determination method for determining the risk of developing diabetes, particularly type 2 diabetes, and a reagent and a kit for the method.
[0021]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors examined the frequency of gene polymorphisms present in the GFAT1 gene and the GFAT2 gene for DNA samples isolated from diabetic patients and healthy subjects, and found that a plurality of genes appearing in diabetic patients at a high frequency. We found that polymorphism exists. Then, they have found that by detecting the gene polymorphism, the potential risk of developing diabetes can be determined with a high probability, and completed the present invention.
[0022]
That is, the present invention provides the following (1) to (13).
(1) In a sample containing human genomic DNA, by detecting a gene polymorphism present at any one or more positions selected from the following a) to h), and / or a haplotype consisting of a combination thereof, A method for determining the risk of developing diabetes of the sample provider.
a) The 36th nucleotide of the first intron of the GFAT (glutamine: fructose-6-phosphate amide transferase) 1 gene (nucleotide number 632 of SEQ ID NO: 1)
b) The seventh nucleotide of the eleventh intron of the GFAT1 gene (nucleotide number 266 of SEQ ID NO: 2)
c) The nucleotide at position -147 of intron 12 of the GFAT1 gene (nucleotide number 338 of SEQ ID NO: 3)
d) nucleotides 1853 to 1877 of the eighth intron of the GFAT1 gene (nucleotide numbers 336 to 360 in SEQ ID NO: 4)
e) nucleotides 1988 to 2007 of the twelfth intron of the GFAT1 gene (nucleotide numbers 328 to 347 of SEQ ID NO: 5)
f) -11th to -22nd nucleotides of intron 18 of the GFAT1 gene (nucleotide numbers 253 to 264 of SEQ ID NO: 6)
g) nucleotides 2632 to 2661 of the third intron of the GFAT1 gene (nucleotide numbers 237 to 266 in SEQ ID NO: 7)
h) The 66th nucleotide of the 18th exon of the GFAT2 gene (nucleotide number 2251 of SEQ ID NO: 23)
[0023]
(2) The method according to the above (1), wherein the diabetes is type 2 diabetes.
[0024]
(3) The detection target is any one or two or more selected from the gene polymorphisms present at the following positions a) to f) and h) and the haplotypes indicated by the following x) to z) , The method according to the above (1) or (2).
a) The 36th nucleotide of the first intron of the GFAT1 gene (nucleotide number 632 of SEQ ID NO: 1)
b) The seventh nucleotide of the eleventh intron of the GFAT1 gene (nucleotide number 266 of SEQ ID NO: 2)
c) The nucleotide at position -147 of intron 12 of the GFAT1 gene (nucleotide number 338 of SEQ ID NO: 3)
d) nucleotides 1853 to 1877 of the eighth intron of the GFAT1 gene (nucleotide numbers 336 to 360 in SEQ ID NO: 4)
e) nucleotides 1988 to 2007 of the twelfth intron of the GFAT1 gene (nucleotide numbers 328 to 347 of SEQ ID NO: 5)
f) -11th to -22nd nucleotides of intron 18 of the GFAT1 gene (nucleotide numbers 253 to 264 of SEQ ID NO: 6)
h) The 66th nucleotide of the 18th exon of the GFAT2 gene (nucleotide number 2251 of SEQ ID NO: 23)
x) Present at the 36th nucleotide of the first intron of the GFAT1 gene (nucleotide number 632 of SEQ ID NO: 1) and at the -11th to -22nd nucleotides of the 18th intron (nucleotide numbers 253 to 264 of SEQ ID NO: 6) Haplotype consisting of combinations of genetic polymorphisms
y) Present at the seventh nucleotide of intron 11 of the GFAT1 gene (nucleotide number 266 of SEQ ID NO: 2) and the nucleotides -11 to -22 of the intron 18 (nucleotide numbers 253 to 264 of SEQ ID NO: 6) Haplotype consisting of combinations of genetic polymorphisms
z) The nucleotides -11 to -22 of intron 18 of the GFAT1 gene (nucleotides 253-264 of SEQ ID NO: 6) and the nucleotides 2632-2661 of intron 3 of the GFAT1 gene (nucleotides 237-264 of SEQ ID NO: 7) 266) A haplotype comprising a combination of polymorphisms present in
[0025]
(4) detecting, in a sample containing human genomic DNA, any one or two or more selected from the polymorphisms present at the position h) below and the haplotypes x) to z) A method for determining the risk of developing type 2 diabetes without nephropathy of a sample provider.
h) The 66th nucleotide of the 18th exon of the GFAT2 gene (nucleotide number 2251 of SEQ ID NO: 23)
x) Present at the 36th nucleotide of the first intron of the GFAT1 gene (nucleotide number 632 of SEQ ID NO: 1) and at the -11th to -22nd nucleotides of the 18th intron (nucleotide numbers 253 to 264 of SEQ ID NO: 6) Haplotype consisting of combinations of genetic polymorphisms
y) Present at the seventh nucleotide of intron 11 of the GFAT1 gene (nucleotide number 266 of SEQ ID NO: 2) and the nucleotides -11 to -22 of the intron 18 (nucleotide numbers 253 to 264 of SEQ ID NO: 6) Haplotype consisting of combinations of genetic polymorphisms
z) The nucleotides -11 to -22 of intron 18 of the GFAT1 gene (nucleotides 253-264 of SEQ ID NO: 6) and the nucleotides 2632-2661 of intron 3 of the GFAT1 gene (nucleotides 237-264 of SEQ ID NO: 7) 266) A haplotype comprising a combination of polymorphisms present in
[0026]
(5) detecting, in a sample containing human genomic DNA, any one or two or more selected from the polymorphisms present at the following positions a) and b) and the haplotype represented by z), A method for determining the risk of developing type 2 diabetes associated with nephropathy in a sample provider.
a) The 36th nucleotide of the first intron of the GFAT1 gene (nucleotide number 632 of SEQ ID NO: 1)
b) The seventh nucleotide of the eleventh intron of the GFAT1 gene (nucleotide number 266 of SEQ ID NO: 2)
z) The nucleotides -11 to -22 of intron 18 of the GFAT1 gene (nucleotides 253-264 of SEQ ID NO: 6) and the nucleotides 2632-2661 of intron 3 of the GFAT1 gene (nucleotides 237-264 of SEQ ID NO: 7) 266) A haplotype comprising a combination of polymorphisms present in
[0027]
(6) A method for determining the risk of type 1 diabetes of a sample provider by detecting a haplotype represented by z) in a sample containing human genomic DNA.
z) The nucleotides -11 to -22 of intron 18 of the GFAT1 gene (nucleotides 253-264 of SEQ ID NO: 6) and the nucleotides 2632-2661 of intron 3 of the GFAT1 gene (nucleotides 237-264 of SEQ ID NO: 7) 266) A haplotype comprising a combination of polymorphisms present in
[0028]
(7) Detection is performed by RFLP method, PCR-SSCP method, ASO hybridization, direct sequencing method, ARMS method, denaturing gradient gel electrophoresis, RNaseA cleavage method, chemical cleavage method, DOL method, TaqMan @ PCR method, Invader Method, MALDI-TOF / MS method, TDI method, molecular beacon method, dynamic allele-specific hybridization method, padlock probe method, UCAN method, nucleic acid hybridization method using DNA chip or DNA microarray, and ECA The method according to any one of the above (1) to (6), wherein the method is performed using one or more methods selected from the group consisting of:
[0029]
(8) The method according to (7) above, wherein the detection is performed using a PCR-SSCP method or a direct sequencing method.
[0030]
(9) On the GFAT1 gene represented by SEQ ID NO: 22, a continuous polynucleotide having a length of 16 to 500 bases containing any one nucleotide or nucleotide sequence selected from the following a) to g), or a labeled product thereof;
a) The 36th nucleotide of the first intron of the GFAT1 gene (nucleotide number 632 of SEQ ID NO: 1)
b) The seventh nucleotide of the eleventh intron of the GFAT1 gene (nucleotide number 266 of SEQ ID NO: 2)
c) The nucleotide at position -147 of intron 12 of the GFAT1 gene (nucleotide number 338 of SEQ ID NO: 3)
d) nucleotides 1853 to 1877 of the eighth intron of the GFAT1 gene (nucleotide numbers 336 to 360 in SEQ ID NO: 4)
e) nucleotides 1988 to 2007 of the twelfth intron of the GFAT1 gene (nucleotide numbers 328 to 347 of SEQ ID NO: 5)
f) -11th to -22nd nucleotides of intron 18 of the GFAT1 gene (nucleotide numbers 253 to 264 of SEQ ID NO: 6)
g) nucleotides 2632 to 2661 of the third intron of the GFAT1 gene (nucleotide numbers 237 to 266 in SEQ ID NO: 7)
Alternatively, on the GFAT2 gene fragment represented by SEQ ID NO: 23, a continuous polynucleotide having a length of 16 to 500 bases, including the 66th nucleotide of exon 18 (nucleotide number 2251 of SEQ ID NO: 23), or a labeled product thereof.
(However, when the polynucleotide is RNA, the base symbol “t” in the sequence listing should be read as “u”).
[0031]
(10) On the GFAT1 gene represented by SEQ ID NO: 22, hybridizes to a part of a continuous polynucleotide having a length of 16 to 1000 bases and containing any one nucleotide or nucleotide sequence selected from the following a) to g): An oligonucleotide having a length of 15 to 30 bases, or a labeled product thereof, for specifically amplifying the polynucleotide;
a) The 36th nucleotide of the first intron of the GFAT (glutamine: fructose-6-phosphate amide transferase) 1 gene (nucleotide number 632 of SEQ ID NO: 1)
b) The seventh nucleotide of the eleventh intron of the GFAT1 gene (nucleotide number 266 of SEQ ID NO: 2)
c) The nucleotide at position -147 of intron 12 of the GFAT1 gene (nucleotide number 338 of SEQ ID NO: 3)
d) nucleotides 1853 to 1877 of the eighth intron of the GFAT1 gene (nucleotide numbers 336 to 360 in SEQ ID NO: 4)
e) nucleotides 1988 to 2007 of the twelfth intron of the GFAT1 gene (nucleotide numbers 328 to 347 of SEQ ID NO: 5)
f) -11th to -22nd nucleotides of intron 18 of the GFAT1 gene (nucleotide numbers 253 to 264 of SEQ ID NO: 6)
g) nucleotides 2632 to 2661 of the third intron of the GFAT1 gene (nucleotide numbers 237 to 266 in SEQ ID NO: 7)
Alternatively, on the GFAT2 gene fragment represented by SEQ ID NO: 23, it hybridizes to a part of a continuous polynucleotide having a length of 16 to 1000 bases and including the 66th nucleotide of exon 18 (nucleotide number 2251 of SEQ ID NO: 23). And an oligonucleotide having a length of 15 to 30 bases, or a labeled product thereof, for specifically amplifying the polynucleotide.
(However, when the polynucleotide is RNA, the base symbol “t” in the sequence listing should be read as “u”).
[0032]
(11) An immobilized sample on which the polynucleotide according to (9) is immobilized.
[0033]
(12) A reagent or kit for determining the risk of developing diabetes, comprising at least one or more selected from the following 1) to 3).
1) The polynucleotide according to (9) or a labeled product thereof
2) The oligonucleotide according to (10) or a labeled product thereof
3) The solid-phased sample according to (11) above
[0034]
(13) The DNA of the following (A) or (B).
(A) DNA comprising a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 22
(B) DNA encoding a human-derived protein having at least 85% homology with the DNA consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 22 and having GFAT activity
[0035]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
The method of the present invention is a method for determining the risk of developing diabetes of a sample provider by detecting a novel gene polymorphism present on the GFAT1 gene and / or GFAT2 gene in a sample containing human genomic DNA. .
[0036]
In the present specification, the term “gene polymorphism” includes both so-called single nucleotide polymorphisms (single nucleotide polymorphisms: single nucleotide polymorphism: SNP) and polymorphisms over a plurality of consecutive nucleotides. That is, in a human population, a mutation such as substitution, deletion, insertion, transposition, or inversion of one or more nucleotides at a specific site in one or more other individual genomes with reference to the genome sequence of a certain individual. Is present, it is statistically certain that the mutation is not a mutation that occurred in the one or more individuals, or it is not a mutation within the individual and is present in the population at a frequency of 1% or more. If it is proven in a family, the mutation is called a “gene polymorphism”.
[0037]
Hereinafter, the method of the present invention will be described in detail.
1. Novel genetic polymorphisms associated with the development of diabetes
The gene polymorphism to be detected in the present invention is a novel gene polymorphism present on the GFAT1 gene or GFAT2 gene, which has been confirmed to appear at high frequency in diabetic patients. The gene polymorphism specifically exists at the following positions a) to h).
a) The 36th nucleotide of the first intron of the GFAT1 gene (nucleotide number 632 of SEQ ID NO: 1)
b) The seventh nucleotide of the eleventh intron of the GFAT1 gene (nucleotide number 266 of SEQ ID NO: 2)
c) The nucleotide at position -147 of intron 12 of the GFAT1 gene (nucleotide number 338 of SEQ ID NO: 3)
d) nucleotides 1853 to 1877 of the eighth intron of the GFAT1 gene (nucleotide numbers 336 to 360 in SEQ ID NO: 4)
e) nucleotides 1988 to 2007 of intron 12 of the GFAT1 gene (nucleotide numbers 328 to 347 of SEQ ID NO: 5)
f) nucleotides -11 to -22 of intron 18 of the GFAT1 gene (nucleotide numbers 253 to 264 of SEQ ID NO: 6)
g) nucleotides 2632 to 2661 of the third intron of the GFAT1 gene (nucleotide numbers 237 to 266 in SEQ ID NO: 7)
h) The 66th nucleotide of the 18th exon of the GFAT2 gene (nucleotide number 2251 of SEQ ID NO: 23)
[0038]
In the method of the present invention, a haplotype consisting of a genetic polymorphism and / or a combination thereof present at any one or more positions selected from the above a) to h) is detected, and the risk of developing diabetes is detected. Determine the degree. That is, the determination may be performed based on the detection result of one or more gene polymorphisms, or may be performed based on the detection result of a haplotype in which two or more gene polymorphisms are combined. Alternatively, the determination may be made by combining the polymorphism and the haplotype.
[0039]
2. Preparation of sample containing human genomic DNA
The “sample containing human genomic DNA” used in the method of the present invention is prepared using any cells (excluding germ cells), tissues, organs, and the like isolated from subjects and clinical samples. As the material, leukocytes or mononuclear cells separated from peripheral blood are preferable, and leukocytes are most preferable. These materials are isolated according to methods commonly used in clinical tests.
[0040]
For example, when using leukocytes as a material, first, leukocytes are separated from peripheral blood isolated from a subject according to a conventional method. Next, proteinase K and sodium dodecyl sulfate (SDS) are added to the obtained leukocytes to decompose and denature the protein, followed by phenol / chloroform extraction to obtain genomic DNA (including RNA). RNA can be removed by RNase if necessary. However, the extraction of genomic DNA is not limited to the above-mentioned method, and is well-known in the art (for example, Sambrook, {J. et al. (1989): "Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Ed.)"). Cold Spring Harbor Laboratory, NY) or a commercially available DNA extraction kit or the like.
[0041]
3. Gene polymorphism detection
Next, from the sample containing the obtained human genomic DNA, a novel gene polymorphism which is elucidated by the present inventors and which is extremely related to diabetes (particularly type 2 diabetes) is detected. Hereinafter, a typical gene polymorphism detection method will be described.
[0042]
(1) RFLP (restriction fragment length polymorphism) method
When the gene polymorphism site is included in the restriction enzyme recognition site, the gene polymorphism can be detected from the difference in the length of the DNA fragment generated by digestion of the restriction enzyme. In this case, (1) a method in which genomic DNA is digested with a restriction enzyme, followed by Southern blotting; and (2) a DNA fragment containing a polymorphic site is amplified by PCR, cut with a restriction enzyme, and the DNA cut by electrophoresis. A method of analyzing the size of a fragment is exemplified. The probe used in the method (1) may be a DNA containing a polymorphic site of interest and corresponding to a sequence ranging from about 0.05 to 2 kb on the 5 'end and 3' end from the polymorphic site, respectively. Fragments (labeled with an isotope, biotin, a fluorescent dye, or the like) are preferred. The PCR primer used in the method (2) is preferably a 15-mer to 30-mer oligonucleotide for amplifying a DNA fragment of about 0.05 to 4 kb containing a polymorphic site.
[0043]
(2) PCR-SSCP method (single-stranded DNA higher-order structural polymorphism analysis)
The PCR-SSCP method is a method of amplifying a DNA fragment containing a gene polymorphism site by PCR, heat denaturation, and separating single-stranded DNAs having different higher-order structures by electrophoresis [Biotechniques, # 16, 296- 297 (1994), {Biotechniques, {21, {510-514} (1996)]. Since the migration distance of single-stranded DNA differs depending on the presence or absence of the gene polymorphism, the polymorphism can be typed by analyzing the pattern. In order to use it as a standard for typing, it is preferable to use a DNA sample derived from the human genome in which the nucleotide sequence of the polymorphic site has been confirmed in advance, as a template DNA for PCR, simultaneously with the test sample. As a primer for PCR amplification, a 15 to 30 mer oligonucleotide for amplifying a DNA fragment of about 50 to 500 bp containing a polymorphic site, which is labeled at the 5 'end with a fluorescent dye, is preferable.
[0044]
(3) ASO (Allele Specific Oligonucleotide) hybridization method
In the ASO hybridization method, a PCR product containing a gene polymorphism site is dot-blotted on a support such as a nylon filter, hybridized with a probe corresponding to each gene polymorphism, and then washed according to the Tm value of the probe. This is a method for detecting polymorphisms (hybrids are removed if there is a mismatch) [Clin. {Chim. {Acta, {189, {153-157} (1990)]. As the probe, a synthetic oligonucleotide of about 15 to 25 mer is usually used (labeling with a radioisotope, biotin or a fluorescent dye is necessary to obtain a signal). As the PCR primer, an oligonucleotide of 15 to 30 mer for amplifying a DNA fragment of about 0.05 to 4 kb containing a polymorphic site is preferable.
[0045]
(4) Direct sequence method
The direct sequencing method is a method in which a DNA fragment containing a gene polymorphism site is PCR-amplified and the nucleotide sequence of the amplified DNA is directly analyzed by the dideoxy method [Biotechniques, {11, {246-249} (1991)]. The PCR primer used in this method is preferably a 15 to 30 mer oligonucleotide for amplifying a DNA fragment of about 0.05 to 4 kb containing a polymorphic site. Further, as the sequence primer, preferably, a 15 to 30-mer oligonucleotide corresponding to a position on the 5 'end side of about 50 to 300 nucleotides from the polymorphic site is used.
[0046]
(5) ARMS (Amplification Refracting Mutation System) method
In PCR, after a primer anneals to a template DNA, a complementary strand DNA is synthesized from the 5 'end to the 3' end by a DNA polymerase. If there is a mismatch at the 3 'terminal nucleotide of the primer, the efficiency of the PCR will be reduced, making detection by electrophoresis impossible. The ARMS method is a method in which PCR is performed using primers designed so that the 3 ′ terminal nucleotide is complementary to the mutant nucleotide to be detected, and a gene polymorphism is detected based on the presence or absence of an amplification product [Nuc . {Acids. Res. , {19, {3561-3567} (1991), {Nuc. {Acids. Res. , {20, 4831-4837} (1992)]. The PCR primers used in this method are preferably 15-30 mer oligonucleotides designed such that the polymorphic site is located at the 3 'end, and the other is preferably the polymorphic site. The oligonucleotide is a 15 to 30-mer oligonucleotide at a distance of about 0.05 to 2 kb from the oligonucleotide.
[0047]
(6) Denaturing gradient gel electrophoresis (denaturing gradient gel electrophoresis, hereinafter referred to as "DGGE")
The DGGE method is a method for detecting a genetic polymorphism by utilizing the fact that a heteroduplex having a mismatch in a PCR product is easier to dissociate than a homoduplex [Biotechniques, {27, {1016-1018} (1999). ]. Since the mobility of the heteroduplex in gel electrophoresis decreases as the dissociation progresses, if the density gradient of urea and formamide is set in the polyacrylamide gel to be used, the difference in mobility from the homoduplex will further increase. The presence of the highlighted double-stranded DNA containing the mismatch, ie, the presence of the mutation, is detected. The PCR primer used in this method is usually a 15 to 30 mer oligonucleotide for amplifying a DNA fragment of about 0.05 to 0.5 kb containing a polymorphic site.
[0048]
(7) RNase A cleavage method
RNase A (RNA degrading enzyme) has the property of degrading only single-stranded RNA without degrading double-stranded RNA or RNA / DNA complex. Therefore, after PCR-amplifying a DNA fragment containing a polymorphic site, an isotope-labeled RNA probe is hybridized with a denatured and single-stranded PCR product, treated with RNaseA, and then separated by electrophoresis. Since the RNA probe hybridized with DNA is cleaved at the mismatch site, it can be detected as two bands [DNA @ Cell. {Biol. , {14, {87-94} (1995)]. As the RNA probe used in this method, an oligonucleotide of usually 15 to 30 mer containing a polymorphic site is preferable.
[0049]
(8) Chemical cutting method
After amplifying the DNA fragment containing the polymorphic site by PCR, the mismatch site of the double-stranded DNA, "c (cytosine)", is separately hydroxylamine, and "t (thymine)" is osmium tetraoxide. Modification and piperidine treatment cleaves the sugar. After forming a double strand using a labeled probe and performing the above-mentioned treatment, electrophoresis is performed, and if the size of the probe is short, mutation has been detected [Biotechniques, {21, {216-218} (1996) )]. The PCR primer used in this method is usually a 15 to 30 mer oligonucleotide for amplifying a DNA fragment of about 0.05 to 4 kb containing a polymorphic site.
[0050]
(9) DOL (Dye-labeled Oligonucleotide Ligation) method
In the DOL method, after a DNA fragment containing a gene polymorphism is PCR-amplified, a dye primer containing up to a base immediately before the fluorescently labeled polymorphic site and a dye terminator labeled with a fluorescent dye specific to each allele are used. This is a method of ligation using thermostable DNA ligase [Genome Res. , {8, {549-556} (1998)]. The PCR primer used in this method is usually a 15 to 30 mer oligonucleotide for amplifying a DNA fragment of about 0.05 to 2 kb containing a polymorphic site.
[0051]
(10) TaqMan @ PCR method
The TaqMan @ PCR method is a method using PCR using a fluorescently labeled allele-specific oligonucleotide (TaqMan probe) and Taq DNA polymerase [Genet. {Anal. , {14, {143-149} (1999), {J. Clin. {Microbiol. , {34, 2933-2936} (1996)]. The PCR primer used in this method is usually a 15 to 30 mer oligonucleotide for amplifying a DNA fragment of about 0.05 to 2 kb containing a polymorphic site. The TaqMan probe is an oligonucleotide of about 15 to 30 bases including a polymorphic site, the 5 ′ end is labeled with a fluorescent reporter dye, and the 3 ′ end is labeled with a quencher (quencher). . By using this probe, it is possible to detect a nucleotide change between a wild type and a mutant type.
[0052]
(11) Invader method
In the invader method, two types of non-fluorescently labeled oligonucleotides and one type of fluorescently labeled oligonucleotide are used. One of the non-fluorescent-labeled oligonucleotides has a sequence (hereinafter, referred to as “flap”) at the 5 ′ end thereof, which is unrelated to the genomic sequence (hereinafter, referred to as “template”) in which the polymorphic site to be detected exists. The 3 'end of the flap is a complementary sequence specific to the sequence at the 5' end from the polymorphic site of the template (hereinafter referred to as "allele probe"). That is, the 5 'end of the complementary sequence portion specific to the template of the allele probe corresponds to the polymorphic site of the template. The other non-fluorescently labeled oligonucleotide has a complementary sequence specific to a sequence at the 3 'end from the polymorphic site of the template (hereinafter referred to as "invader probe"). The 3 'end of the invader probe also corresponds to the polymorphic site of the template, but need not be complementary to the nucleotide at the polymorphic site of the template. Fluorescently labeled oligonucleotides (hereinafter referred to as “FRET (fluorescence, energy, energy, transfer) probes”) have a sequence complementary to the flap at the 3 ′ end and a palindromic sequence at the 5 ′ end, so that the oligonucleotide itself has a sequence. It forms a main chain. A portion near the 5 'end of the FRET probe is labeled with a fluorescent dye, and a quencher for canceling the fluorescence is bound to the 5' end. First, when the allele probe and the invader probe are hybridized to the template, if the allele probe and the template are complementary at the polymorphic site, the template, the 5 'end of the allele probe and the 3' 'Terminal forms a special structure. An enzyme that specifically recognizes this structure and exhibits endonuclease activity (hereinafter referred to as “Crybase”) separates the flap portion from the allele probe. The released flap hybridizes with the 3 'end of the FRET probe. At this time, since the flap and the FRET probe form a structure specifically recognized by Clebase at the position of the 5 ′ end where the quencher of the FRET probe is bonded, the 5 ′ to which the quencher is bonded is formed. The terminal nucleotide is cleaved from the FRET probe by the cleabase, and the fluorescent dye remaining on the FRET probe emits fluorescence. On the other hand, when a mutation is present in the template sequence, and the allele probe and the template are not complementary at the polymorphic site and are mismatched, a structure specifically recognized by Clebase is not formed. Not detached from the probe. At this time, the flap remaining on the allele probe without being detached can also hybridize with the 3 ′ end of the FRET probe, but the quencher binds as compared with the case where the flap detached from the allele probe is hybridized. Since the reaction efficiency at which the 5 ′ terminal nucleotide is cleaved from the FRET probe by cleabase is low, the fluorescence intensity emitted by the FRET probe is also low. Based on the above principle, polymorphism can be detected [Science, # 5109, # 778-783 (1993), {J. {Biol. {Chem. , {30, {21387-21394} (1999), {Nat. Biotechnol. , {17, {292-296} (1999)].
[0053]
(12) MALDI-TOF / MS method (Matrix Assisted Laser Desorption-time ofFlight / Mass Spectrometry) method
The MALDI-TOF / MS method is a method of synthesizing a single-stranded oligonucleotide containing a different nucleotide corresponding to an allele of a gene polymorphism, measuring the mass thereof, and detecting the difference with a mass spectrometer for typing. [Genome @ Res. , {7, {378-388} (1997), {Eur. {J. Clin. {Chem. Clin. Biochem. , {35, {545-548} (1997)]. In the MALDI-TOF / MS method, first, a DNA fragment containing a polymorphic site is PCR-amplified, and then a DNA extension reaction product specific to each allele is masked by an extension reaction using primers adjacent to the polymorphic site. Analyze based on spectrum. The PCR primer used at this time is usually a 15 to 30 mer oligonucleotide for amplifying a DNA fragment of about 0.05 to 0.5 kb containing a polymorphic site. As a primer for detecting a polymorphism, an oligonucleotide of 15 to 30 mer adjacent to the polymorphic site is used.
[0054]
(13) TDI (Template-directed Dye-terminator Incorporation) method
In the TDI method, a DNA fragment containing a gene polymorphism is amplified by PCR, and then labeled with different fluorescent dyes corresponding to each allele by a primer extension reaction using a primer designed immediately before the polymorphic site. Is incorporated into a polymorphic site [Proc. {Natl. {Acad. {Sci. {USA, {94, {10756-10761} (1997)]. The primer extension product is analyzed using a DNA sequencer (ABI Prism 377, manufactured by Applied Biosystems) or the like. The PCR primer used at this time is usually a 15 to 30 mer oligonucleotide for amplifying a DNA fragment of about 0.05 to 1 kb containing a polymorphic site.
[0055]
(14) Molecular beacon method
Molecular @ Beacons is an oligonucleotide having a luminescence suppressor (Quencher) and a fluorescent substance (Fluorophore) at both ends. Usually, it is a stem-loop structure having a stem portion of 5 to 7 nucleotides and a loop structure of 15 to 30 nucleotides. Therefore, the phosphor does not emit light even under the excitation light irradiation due to the function of the light emission suppressor. On the other hand, when the target DNA homologous to the base sequence in the loop structure and the base sequence in the loop structure hybridize, the phosphor is excited under the excitation light to emit fluorescence because the distance between the luminescence suppressor and the phosphor is large. [Nat. Biotechnol. , 1, {p49-53} (1998), Gene Medicine, 4, p46-48 (2000)]. The base sequence of the stem of Molecular @ Beacon is not complementary to the target DNA. The Tm value (melting temperature: melting temperature) of the stem structure of Molecular Beacons is designed to be 7-10 ° C. higher than the Tm values of the target DNA and the PCR primer. Then, when the target region is amplified by PCR, Molecular Beacons is added to the reaction solution, and excitation light is measured at the annealing temperature of PCR to measure fluorescence. If Molecular Beacons is a sequence completely homologous to the target gene, it is hybridized. Fluorescent. Conversely, if there is a mismatch, Molecular @ Beacons cannot hybridize to the target and cannot emit fluorescence. Genetic polymorphisms can be found by this method.
[0056]
(15) Dynamic Allele-Specific Hybridization (DASH) method
This is a method in which a target DNA (60-90 base pairs) is amplified from genomic DNA by PCR using primers whose ends are biotinylated [Nat. Biotechnol. , 1, {p87-88, {(1999), Gene Medicine, {4, {p47-48} (2000)]. After completion of the PCR, the strand on the side of the biotinylated primer binds to a microtiter well coated with streptavidin. On the other hand, the unmodified Primer strand cannot be bonded and is removed by rinsing with an alkaline solution. Thereafter, probe DNA (15-21 nucleotides) is hybridized to the biotinylated primer strand. At this time, a fluorescent substance (Syber Green I dye) that specifically binds to the double-stranded DNA and emits fluorescence is incorporated together. Thereafter, denaturation is performed while observing the fluorescence intensity. When the target DNA and the probe DNA are not completely complementary and have a mismatch, the temperature at which the target DNA denatures and emits no light is lower than in the case where it is completely complementary. By observing this difference in temperature, a gene polymorphism can be detected.
[0057]
(16) Padlock Probe method
Lizardi et al. [Nat. {Genet. , {3, {p225-232} (1998), Gene Medicine, {4, {p50-51} (2000)]. A probe designed to be circular when hybridized to a single-stranded target DNA is used. The probe is hybridized to the target DNA, and then ligated with DNA ligase to form a complete circular shape. The phosphate group is removed with the phosphatase of (2). When the terminal cannot be circularized due to a mismatch at the end, the phosphate group is lost and the circularization cannot be performed. A primer (1) is designed for this circular DNA and replicated with a DNA polymerase to obtain a replicon multimer. A primer (2) is also designed for this replicon, and the two types of primers are mixed together and reacted with DNA polymerase to amplify double-stranded DNA. The primer (1) is designed on a portion that is not complementary to the target DNA, and the primer (2) is a terminal portion of a circular probe (Padlock @ Probe) (a sequence complementary to the target DNA (gene polymorphism at the 3 ′ end). ), And a primer having a single nucleotide substitution at the 3 ′ end is used for polymorphism detection.Rolling cycle-reaction (RCR) is performed on the circularized probe (Padlock @ Probe). After amplification using the improved Hyperbranched Rolling-Circle Amplification (HRCA) method, the DNA was treated with a restriction enzyme at a restriction enzyme recognition site in Padlock Probe. To confirm the presence or absence of the band by electrophoresis.
[0058]
(17) UCAN method
The UCAN method [refer to the Takara Shuzo Co., Ltd. homepage (http://www.takara.co.jp)] is based on the 3 ′ end of a DNA-RNA-DNA primer (DRD primer) of a type in which RNA is sandwiched between DNA on both sides. The DNA is chemically changed so that the replication of the template DNA by the DNA polymerase does not occur. Next, the DRD primer designed so that the RNA part binds to the base part where the single base conversion may have occurred is paired with the template DNA. Only when the DRD primer and the template completely match, the RNA portion of the paired DRD primer is cleaved by RNaseH. As a result of this cleavage, a new 3 'end appears, the extension reaction by the DNA polymerase proceeds, and the template DNA is amplified. On the other hand, when the DRD primer and the template DNA do not match at that position, that is, when an SNP is present, RNaseH does not cut the DRD primer, and thus DNA amplification does not occur. By detecting the presence or absence of this gene amplification, a gene polymorphism can be detected.
[0059]
(18) DNA chip or DNA microarray
DNA chips or DNA microarrays are obtained by immobilizing DNA probes containing various types of polymorphic sites on a glass substrate, and hybridizing a labeled nucleic acid sample to detect the presence or absence of the polymorphism by a fluorescent signal. In general, a method of placing cDNA on a glass substrate is called a DNA microarray, and a method of synthesizing DNA on a glass substrate is called a DNA chip (oligo DNA chip). The probe immobilized (or synthesized) on the substrate is usually an oligonucleotide of about 20 mer containing a polymorphic site in the case of an oligo DNA array, or a double-stranded DNA of about 100 to 1500 mer in the case of a cDNA microarray. .
[0060]
(19) ECA method
The ECA (Electrochemical Array) method is a genotyping method utilizing the electrochemical properties of an intercalator that binds to a double strand of DNA. That is, a region containing a polymorphism on the genome is amplified by a PCR method, and an intercalator is acted after hybridizing with a probe complementary to each allele immobilized on a substrate. At this time, the amount of the intercalator to be bound differs depending on whether the probe is completely complementary or incompletely complementary to the probe. Since the intercalator used in the ECA method contains a substance called ferrocene having electrochemical properties, the electrical signal differs in proportion to the amount of the intercalator bound. The ECA method is a method for detecting a gene polymorphism using this difference [Anal. {Chem. , $ 72, $ p1334-1341, $ 2000].
[0061]
The above are typical polymorphism detection methods, but are not limited thereto. Other known gene polymorphism detection methods can be used for the determination method of the present invention. Further, in the method of the present invention, these gene polymorphism detection methods may be used alone or in combination of two or more. As a preferred embodiment of the present invention, a determination method using a PCR-SSCP method or a direct sequence method will be described in Examples described later.
[0062]
4. Diabetes risk assessment reagent or kit
In the determination method of the present invention, in order to detect a genetic polymorphism associated with the onset of diabetes, a probe or solid-phased sample for detecting a sequence at or near the site where the gene polymorphism to be detected is present, or Primers for specifically amplifying the sequence are used. These probes, primers and immobilized samples are useful as reagents or kits for performing the determination method of the present invention.
[0063]
That is, the present invention provides a probe, a primer, and an immobilized sample for detecting a gene polymorphism on the GFAT1 gene or GFAT2 gene, and a reagent or kit for determining the risk of developing diabetes, comprising at least one or more of these. I will provide a.
[0064]
(1) Probe
The probe used in the method of the present invention is a polynucleotide probe that specifically hybridizes to a site containing a novel gene polymorphism on the GFAT1 gene or GFAT2 gene and detects the polymorphic site.
[0065]
Such a probe contains, on the GFAT1 gene represented by SEQ ID NO: 22, any one nucleotide or nucleotide sequence selected from the following a) to g), a length of 16 to 500 nucleotides, preferably a length of 20 to 200 nucleotides: , More preferably a continuous polynucleotide of 20 to 50 bases in length;
a) The 36th nucleotide of the first intron of the GFAT (glutamine: fructose-6-phosphate amide transferase) 1 gene (nucleotide number 632 of SEQ ID NO: 1)
b) The seventh nucleotide of the eleventh intron of the GFAT1 gene (nucleotide number 266 of SEQ ID NO: 2)
c) The nucleotide at position -147 of intron 12 of the GFAT1 gene (nucleotide number 338 of SEQ ID NO: 3)
d) nucleotides 1853 to 1877 of the eighth intron of the GFAT1 gene (nucleotide numbers 336 to 360 in SEQ ID NO: 4)
e) nucleotides 1988 to 2007 of the twelfth intron of the GFAT1 gene (nucleotide numbers 328 to 347 of SEQ ID NO: 5)
f) -11th to -22nd nucleotides of intron 18 of the GFAT1 gene (nucleotide numbers 253 to 264 of SEQ ID NO: 6)
g) nucleotides 2632 to 2661 of the third intron of the GFAT1 gene (nucleotide numbers 237 to 266 in SEQ ID NO: 7)
Alternatively, on the GFAT2 gene fragment represented by SEQ ID NO: 23, the nucleotide containing the 66th nucleotide of exon 18 (nucleotide number 2251 of SEQ ID NO: 3), 16 to 500 bases in length, preferably 20 to 200 bases in length, more preferably Is designed as a continuous polynucleotide of 20-50 bases in length.
[0066]
(2) Primer
The primer used in the method of the present invention is an oligonucleotide primer for specifically amplifying a site containing a novel polymorphism on the GFAT1 gene or GFAT2 gene.
[0067]
Such a primer hybridizes on the GFAT1 gene represented by SEQ ID NO: 22 to a portion of a continuous polynucleotide containing any one nucleotide or nucleotide sequence selected from the above a) to g), and An oligonucleotide having a length of 15 to 30 bases, and preferably about 18 to 25 bases, for specifically amplifying nucleotides;
Alternatively, on the GFAT2 gene fragment represented by SEQ ID NO: 23, a portion of a continuous polynucleotide containing the 66th nucleotide of exon 18 is hybridized to a part of a continuous polynucleotide to specifically amplify the polynucleotide. It is designed as an oligonucleotide having a length of 30 bases, preferably an oligonucleotide having a length of about 18-25 bases.
[0068]
The length of the polynucleotide to be amplified is appropriately set depending on the detection method used, but is generally 16 to 1000 bases, preferably 20 to 500 bases, and more preferably 20 to 200 bases. .
[0069]
From the above, a polynucleotide comprising a continuous nucleotide sequence of 15 nucleotides or more contained in a sequence near the polymorphic site (for example, the nucleotide sequence represented by any one of SEQ ID NOS: 1 to 7 and SEQ ID NO: 23) Can be used as the above primer or probe.
[0070]
The primers or probes of the present invention include those in which an appropriate label for detection, for example, a fluorescent dye, an enzyme, a protein, a radioisotope, a chemiluminescent substance, biotin, or the like is added to the end of the sequence. .
[0071]
As the fluorescent dye used in the present invention, those generally used for labeling nucleotides and used for quantification and detection of nucleic acids can be suitably used. For example, HEX (4, 7, 2 ', 4', 5 ', 7'-hexachloro-6-carboxyfluorescein, green fluorescent dye, fluorescein, NED (Applied Biosystems, trade name, yellow fluorescent dye), or 6-FAM (Applied Biosystems, trade name, yellow green) Fluorescent dye), rhodamine or a derivative thereof (for example, tetramethylrhodamine (TMR)), but are not limited thereto. As a method of labeling nucleotides with a fluorescent dye, an appropriate one of known labeling methods can be used [see Nature {Biotechnology, {14, {p303-308} (1996)]. Alternatively, a commercially available fluorescent labeling kit can be used (for example, oligonucleotide ECL 3'-oligolabeling system manufactured by Amersham Pharmacia).
[0072]
The primers of the present invention also include those to which a linker sequence for detecting a polymorphism is added at the end. Such a linker sequence includes, for example, a flap (a sequence completely unrelated to the sequence near the polymorphism) added to the 5'-terminal of the oligonucleotide used in the aforementioned invader method.
[0073]
In the present specification, “polynucleotide” is synonymous with nucleic acid, and includes both DNA and RNA. It may be double-stranded or single-stranded, and thus, a polynucleotide having a certain sequence always includes a polynucleotide having a sequence complementary thereto (similarly, an oligonucleotide). . Furthermore, when the polynucleotide is RNA, the base symbol “t” shown in the sequence listing shall be read as “u”.
[0074]
Preferred examples of the above primers for detection using the SSCP method and the direct sequence method, which are one embodiment of the present invention, are shown below.
i) For detecting a gene polymorphism at the 36th nucleotide of the first intron of the GFAT1 gene (nucleotide number 632 of SEQ ID NO: 1):
As the sense strand primer, 15 nucleotides or more (preferably 15 nucleotides or more) in the nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 1 to 631 of SEQ ID NO: 1, more preferably in the nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 432 to 631 of SEQ ID NO: 1 30 nucleotides) are selected. For example, the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 8 can be mentioned.
[0075]
As the antisense strand primer, 15 nucleotides or more (preferably, in the nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 633 to 782 of SEQ ID NO: 1), more preferably in the nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 633 to 682 of SEQ ID NO: 1 An antisense sequence of a contiguous nucleotide sequence (15-30 nucleotides) is selected. For example, the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 9 can be mentioned.
[0076]
ii) For the detection of a polymorphism at the seventh nucleotide of the eleventh intron of the GFAT1 gene (nucleotide number 266 of SEQ ID NO: 2):
The sense strand primer is preferably 15 nucleotides or more (preferably 15 nucleotides or more) in the nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 1 to 265 of SEQ ID NO: 2, more preferably in the nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 66 to 265 of the same. 30 nucleotides) are selected. For example, the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 10 can be mentioned.
[0077]
As the antisense strand primer, 15 nucleotides or more (preferably, in the nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 267 to 675 of SEQ ID NO: 2, more preferably in the nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 267 to 466 of SEQ ID NO: 2) An antisense sequence of a contiguous nucleotide sequence (15-30 nucleotides) is selected. For example, the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 11 can be mentioned.
[0078]
iii) For detecting a gene polymorphism at the -147th nucleotide of the intron 12 of the GFAT1 gene (nucleotide number 338 of SEQ ID NO: 3):
The sense strand primer is preferably 15 nucleotides or more (preferably 15 nucleotides or more) in the nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 1 to 337 of SEQ ID NO: 3, more preferably the nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 138 to 337 of the same. 30 nucleotides) are selected. For example, the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 12 can be mentioned.
[0079]
As the antisense strand primer, 15 nucleotides or more (preferably, in the nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 339 to 780 of SEQ ID NO: 3, more preferably in the nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 339 to 538 of SEQ ID NO: 3) An antisense sequence of a contiguous nucleotide sequence (15-30 nucleotides) is selected. For example, the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 13 can be mentioned.
[0080]
iv) For detecting a gene polymorphism at nucleotides 1853 to 1877 of the eighth intron of the GFAT1 gene (nucleotide numbers 336 to 360 in SEQ ID NO: 4):
The sense strand primer is preferably 15 nucleotides or more (preferably 15 nucleotides or more) in the nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 1 to 335 of SEQ ID NO: 4, and more preferably in the nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 136 to 335 of SEQ ID NO: 4. 30 nucleotides) are selected. For example, the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 14 can be mentioned.
[0081]
As the antisense strand primer, 15 nucleotides or more (preferably, in the nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 361 to 720 of SEQ ID NO: 4), more preferably in the nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 361 to 560 of SEQ ID NO: 4 An antisense sequence of a contiguous nucleotide sequence (15-30 nucleotides) is selected. For example, the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 15 can be mentioned.
[0082]
v) For the detection of a gene polymorphism at nucleotides 1988 to 2007 (nucleotide numbers 328 to 347 of SEQ ID NO: 5) of the twelfth intron of the GFAT1 gene. A continuous nucleotide sequence of 15 nucleotides or more (preferably 15 to 30 nucleotides) in the nucleotide sequence of 327, more preferably the nucleotide sequence of nucleotides 128 to 327, is selected. For example, the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 16 can be mentioned.
[0083]
As the antisense strand primer, 15 nucleotides or more (preferably, in the nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 348 to 659 of SEQ ID NO: 5, more preferably in the nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 348 to 546 of SEQ ID NO: 5) An antisense sequence of a contiguous nucleotide sequence (15-30 nucleotides) is selected. An example is the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 17.
[0084]
vi) For detecting a gene polymorphism at nucleotides -11 to -22 of intron 18 of the GFAT1 gene (nucleotide numbers 253-264 in SEQ ID NO: 6):
The sense strand primer is preferably 15 nucleotides or more (preferably 15 nucleotides or more) in the nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 1 to 252 of SEQ ID NO: 6, more preferably in the nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 53 to 252 of the same. 30 nucleotides) are selected. For example, the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 18 can be mentioned.
[0085]
As the antisense strand primer, 15 nucleotides or more (preferably, in the nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 265 to 540 of SEQ ID NO: 6), more preferably in the nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 265 to 464 of SEQ ID NO: 6 An antisense sequence of a contiguous nucleotide sequence (15-30 nucleotides) is selected. For example, the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 19 can be mentioned.
[0086]
vii) For detecting a gene polymorphism at nucleotides 2632 to 2661 of the third intron of the GFAT1 gene (nucleotide numbers 237 to 266 in SEQ ID NO: 7):
The sense strand primer is preferably 15 nucleotides or more (preferably 15 nucleotides or more) in the nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 1 to 236 of SEQ ID NO: 7, more preferably in the nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 37 to 236 of the same. 30 nucleotides) are selected. For example, the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 20 can be mentioned.
[0087]
As the antisense strand primer, 15 nucleotides or more (preferably, in the nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 267 to 360 of SEQ ID NO: 7, more preferably in the nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 267 to 340 of SEQ ID NO: 7) An antisense sequence of a contiguous nucleotide sequence (15-30 nucleotides) is selected. For example, the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 21.
[0088]
viii) For detecting a polymorphism at the 66th nucleotide of exon 18 of the GFAT2 gene (nucleotide number 2251 of SEQ ID NO: 23):
As the sense strand primer, 15 nucleotides or more (preferably 15 nucleotides or more) in the nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 1751 to 2250 of SEQ ID NO: 23, and more preferably in the nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 2051 to 2199 of SEQ ID NO: 23 30 nucleotides) are selected. An example is the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 24.
[0089]
As the antisense strand primer, 15 nucleotides or more (preferably, in the nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 2252 to 2751 of SEQ ID NO: 23, more preferably in the nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 2252 to 2451 of SEQ ID NO: 23) An antisense sequence of a contiguous nucleotide sequence (15-30 nucleotides) is selected. For example, the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 25.
[0090]
The polynucleotide that can be used as the above primer or probe can be obtained by chemical synthesis based on a method well-known in the art. Polynucleotides used as these probes or primers can be used as reagents for determining the risk of developing diabetes.
[0091]
(3) Immobilized sample
The immobilized sample of the present invention is produced by immobilizing the polynucleotide used as the probe described in (1) on a solid phase such as a glass plate, a nylon membrane, a microbead, a silicon chip, or a capillary. Immobilization to a solid phase may be a method of placing a previously synthesized polynucleotide on a solid phase, or a method of synthesizing a target polynucleotide on a solid phase. As a fixing method, for example, in the case of a DNA microarray, a method suitable for a target solid-phased sample, such as using a commercially available spotter (manufactured by Amersham), is well known in the art. Examples of such an immobilized sample include a gene chip, a cDNA microarray, an oligo array, a membrane filter, and the like.
[0092]
(4) Kit
The kit of the present invention contains a polynucleotide that can be used as the probe or the primer, and at least one or more selected from a solid-phased sample. The kit of the present invention may contain, as necessary, other reagents, instruments, and the like necessary for the determination method of the present invention, such as hybridization, labeling of a probe, detection of a label, and the like, as necessary. Good.
[0093]
5. Analysis and evaluation of detection results
From the results of the statistical analysis of the detection of the novel gene polymorphisms in diabetic patients and healthy subjects, the method of the present invention has a high probability that the type 1 diabetes, type 2 diabetes, type 2 diabetes with diabetic nephropathy, or diabetic It has been found that it is possible to determine the potential risk of developing type 2 diabetes without nephropathy.
[0094]
For example, according to the method of the present invention, as a result of examining a gene polymorphism in a sample containing an isolated human genomic DNA, a subject who meets one or more of the following conditions is identified as having the type 2 Information that the risk of developing diabetes is relatively high can be provided.
a) having a gene in which the nucleotide at position 36 (nucleotide number 632 of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing) of the first intron of the GFAT1 gene is c (cytosine);
b) having a gene in which the seventh nucleotide (nucleotide number 266 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing) of the eleventh intron of the GFAT1 gene is g (guanine);
c) having a gene in which the -147th nucleotide (nucleotide number 338 of SEQ ID NO: 3) of intron 12 of the GFAT1 gene is t (thymine);
d) having a gene in which t (thymine) present at nucleotides 1853 to 1877 of the eighth intron of the GFAT1 gene (nucleotide numbers 336 to 360 in SEQ ID NO: 4) is repeated 25 times;
e) the GFAT1 gene has a gene in which a (adenine) is present 19 times at nucleotides 1988 to 2007 (nucleotide numbers 328 to 347 of SEQ ID NO: 5) in the 12th intron of the GFAT1 gene;
f) having a gene in which t (thymine) repeats at nucleotides -11 to -22 (nucleotide numbers 253-264 of SEQ ID NO: 6) of intron 18 of the GFAT1 gene are repeated 11 or 12 times;
h) having a gene in which the nucleotide at position 66 (nucleotide number 2251 in SEQ ID NO: 3) of exon 18 of the GFAT2 gene is t (thymine);
Among them, subjects meeting the conditions of a) and / or b) have a relatively high risk of developing type 2 diabetes with diabetic nephropathy, and subjects meeting the condition of h) have a particularly high risk. The risk of developing type 2 diabetes without nephropathy is relatively high.
[0095]
Also, by detecting a haplotype in which two or more gene polymorphisms are combined, it is possible to determine the potential risk of developing diabetes. For example, by detecting one or two or more of the following haplotypes x) to z), the risk of the subject developing type 2 diabetes or type 2 diabetes without nephropathy can be determined. Furthermore, the haplotype of z) can also be used to determine the risk of developing type 1 diabetes or type 2 diabetes with nephropathy.
[0096]
x) Present at the 36th nucleotide of the first intron of the GFAT1 gene (nucleotide number 632 of SEQ ID NO: 1) and at the -11th to -22nd nucleotides of the 18th intron (nucleotide numbers 253 to 264 of SEQ ID NO: 6) Haplotype combining different genetic polymorphisms
y) Present at the seventh nucleotide of intron 11 of the GFAT1 gene (nucleotide number 266 of SEQ ID NO: 2) and at the nucleotides -11 to -22 of the intron 18 (nucleotide numbers 253-264 of SEQ ID NO: 6) Haplotypes combining different genetic polymorphisms
z) The nucleotides -11 to -22 of intron 18 of the GFAT1 gene (nucleotides 253-264 of SEQ ID NO: 6) and the nucleotides 2632-2661 of intron 3 of the GFAT1 gene (nucleotides 237-264 of SEQ ID NO: 7) 266) Haplotype combining gene polymorphisms
[0097]
According to the present invention, a subject whose relative risk of developing diabetes is found to be relatively high based on the above-described criteria can be notified to that effect, and measures can be taken in advance to prevent the development of diabetes. Therefore, the present invention is extremely useful as a test method for preventing diabetes (particularly, type 2 diabetes).
[0098]
6. DNA encoding GFAT1
The present invention also provides a DNA encoding human GFAT1 (glutamine: fructose-6-phosphate amide transferase 1).
[0099]
The DNA encoding human GFAT1 specified by the present inventors has a nucleotide sequence as shown in SEQ ID NO: 22, is 93390 bases in length, and consists of 19 exons and 18 introns. However, the DNA is not limited to this nucleotide sequence, and DNA consisting of a nucleotide sequence having at least 85% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more homology with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 22 is also a human DNA. Derived protein having GFAT activity: Included in the DNA of the present invention as long as it encodes GFAT1.
[0100]
Further, DNA that hybridizes under stringent conditions with DNA consisting of a nucleotide sequence complementary to the DNA consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 22 is also a human-derived protein having GFAT activity: GFAT1. Included in the DNA of the present invention. Note that the stringent condition preferably refers to a condition of 0.5 × SSC and a temperature of 55 ° C., more preferably 0.1 × SSC and a temperature of 65 ° C.
[0101]
The human GFAT1 gene is rich in mutations. As described above, there are a plurality of genetic polymorphisms associated with the development of diabetes on the nucleotide sequence. Therefore, the DNA of the present invention is extremely useful for determining the risk of developing diabetes.
[0102]
GFAT is an enzyme that catalyzes the reaction from fructose-6-phosphate to glucosamine-6-phosphate, which is the rate-limiting step, in the hexosamine biosynthesis pathway. Therefore, a drug that inhibits GFAT activity can promote uptake of glucose into cells and reduce blood sugar level, and is expected to be a potential therapeutic drug for diabetes. That is, it is possible to screen for a therapeutic agent for diabetes using the expression level of the DNA of the present invention as an index.
[0103]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to Examples, but the present invention is not limited thereto.
Example 1 Preparation of Genomic DNA from Peripheral Blood
Leukocytes were separated from peripheral blood of healthy Japanese healthy subjects, type 1 diabetic patients, type 2 diabetic patients (without nephropathy), and type 2 diabetic patients (with nephropathy). From this leukocyte, a genomic DNA sample of each subject was extracted using an automatic DNA extraction device (NA-1000: manufactured by Kurabo Industries). The absorbance at 260 nm of the obtained DNA samples was measured, and the DNA concentration of each sample was calculated. Thereafter, the genomic DNA was diluted to 50 ng / μl using sterile distilled water to obtain a PCR sample.
[0104]
Example 2 Amplification of DNA fragment containing polymorphism by PCR method
Using the genomic DNA sample of each subject obtained in Example 1 as a template, a DNA fragment containing any of the seven polymorphic sites on the GFAT1 gene was amplified by the method described below.
[0105]
The 5′-end of each PCR primer used in this example was HEX (4,7,2 ′, 4 ′, 5 ′, 7′-hexachloro-6-carboxy @ fluorescein, green fluorescent dye), NED (Applied BioSystems, trade name, yellow fluorescent dye, or 6-FAM (Applied Biosystems, trade name, yellow-green fluorescent dye) labeled with a fluorescent dye was ordered and purchased from Applied Biosystems.
[0106]
1) PCR for detecting whether the nucleotide at position 36 (nucleotide number 632 of SEQ ID NO: 1) of the first intron of the GFAT1 gene is c (cytosine) or t (thymine):
PCR was performed with the following primers and reaction conditions to amplify a 0.16 kbp DNA fragment containing a polymorphic site.
PCR primers:
Primer No. 1: '5'-CACCGAAGCTCGTGTGTGCA-3' (SEQ ID NO: 8)
Primer No. 2: '5'-CGCCTTGGGCCTTAGCGGCA-3' (SEQ ID NO: 9)
(In both No. 1 and No. 2, the 5 'end is labeled with HEX.)
Reaction system:
PCR enhancer (Gibco, 11495-017) 6 μl
2.5 mM dNTP 2.4 μl
50 mM magnesium sulfate 1.5 μl
10 μM Primer No. 1 2μl
10 μM Primer No. 2 2μl
50 ng / μl genomic DNA 2 μl
10 × PCR reaction buffer 2 μl
(PCRx enhancer system: Attached to KYF Co., Ltd.)
Sterile water 2μl
Taq polymerase 0.1μl
( Takara Ex Taq : Takara Shuzo Co., Ltd. 5 unit / μ l )
Total 20 μl
PCR conditions: 94 ° C for 1 minute, 55 ° C for 1 minute, 72 ° C for 2 minutes, 40 cycles
[0107]
2) PCR for detecting whether the seventh nucleotide (nucleotide number 266 of SEQ ID NO: 2) of the 11th intron of the GFAT1 gene is g (guanine) or a (adenine):
PCR was performed using the following primers and reaction conditions to amplify a 0.22 kbp DNA fragment containing a polymorphic site.
PCR primers:
Primer No. 3: '5'-GGAAACTTTTAGTGTGTGTAC-3' (SEQ ID NO: 10)
Primer No. 4: '5'-CTGTCAGAGACACTGAAATA-3' (SEQ ID NO: 11)
(Both No. 3 and No. 4 label the 5 'end with HEX.)
Reaction system:
Dimethyl sulfoxide (DMSO) 1μl
2.0 mM dNTP 2 μl
25 mM magnesium sulfate 1.5 μl
10 μM Primer No. 3 2μl
10 μM Primer No. 4 2μl
50 ng / μl genomic DNA 2 μl
10 x PCR reaction buffer (attached to AmpliTaq Gold) 2 μl
Sterile water 7.4μl
Taq polymerase 0.1μl
( Gold Taq : AFRIO Biosystems Company), 5 unit / μ l )
Total 20μl
PCR conditions: 94 ° C for 1 minute, 55 ° C for 1 minute, 72 ° C for 2 minutes, 40 cycles
[0108]
3) PCR for detecting whether the -147th nucleotide (nucleotide number 338 of SEQ ID NO: 3) of intron 12 of the GFAT1 gene is A (adenine), T (thymine), or deletion:
PCR was performed using the following primers and reaction conditions to amplify a 0.14 kbp DNA fragment containing a polymorphic site.
PCR primers:
Primer No. 5: '5'-GCCATGCTTATCTCAAGTGGT-3' (SEQ ID NO: 12)
Primer No. 6: '5'-CATCGGGACTTCTTTGGATTCA-3' (SEQ ID NO: 13)
(Both No. 5 and No. 6 label the 5 'end with HEX.)
Reaction system:
2.5 mM dNTP 1.2 μl
50 mM {magnesium sulfate} 0.3 μl
10 μM Primer No. 5 0.5μl
10 μM Primer No. 6 0.5μl
50 ng / μl genomic DNA 1 μl
10 × PCR reaction buffer 1 μl
(Furatina Taq DNA polymerase: attached to Invitrogen, model number 10966-018)
Sterile water 5.45 μl
Platinum Taq DNA polymerase 0.05 μl
( Invitrogen Company model number 10966-018 , 5 unit / μ l ) 　　
Total 10μl
PCR conditions: 35 cycles of 94 ° C for 30 seconds, 56 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 1 minute
[0109]
4) PCR for detecting whether the repetition of the nucleotide T (thymine) at nucleotides 1853 to 1877 of the eighth intron of the GFAT1 gene (nucleotide numbers 336 to 360 of SEQ ID NO: 4) is 24 or 25 times:
PCR was performed using the following primers and reaction conditions to amplify a 0.26 kbp DNA fragment containing a polymorphic site.
PCR primers:
Primer No. 7: '5'-AAAAAACACAGTGAAACTCAAG-3' (SEQ ID NO: 14),
Primer No. 8: '5'-AACCCCGTCTCTACTAAAA-3' (SEQ ID NO: 15)
(Both No. 7 and No. 8 label the 5 'end with NED)
Reaction system:
2.5 mM dNTP 1.2 μl
25 mM {magnesium sulfate} 0.75 μl
10 μM Primer No. 7 0.5μl
10 μM Primer No. 8 0.5μ
150 ng / μl genomic DNA 1 μl
10 × PCR reaction buffer 1 μl
(PCRx enhancer system: Attached to KYF Co., Ltd.)
PCR enhancer 3μl
(Attached to KYF Co., Ltd.)
Sterile water 2μl
Taq polymerase 0.05μl
( Takara Ex Taq : Takara Shuzo Co., Ltd. 5 unit / μ l ) 　　
Total 10μl
PCR conditions: 35 cycles of 94 ° C for 30 seconds, 54 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 1 minute
[0110]
5) Determine whether the number of repetitions of the nucleotide A (adenine) at positions 1988 to 2007 of the twelfth intron of the GFAT1 gene (nucleotide numbers 328 to 347 of SEQ ID NO: 5) is 18, 19, 24, or 25 times PCR to detect:
PCR was performed using the following primers and reaction conditions to amplify a 0.22 kbp DNA fragment containing a polymorphic site.
PCR primers:
Primer No. 9: '5'-AGAATCATGCCTCTGAATAG-3' (SEQ ID NO: 16)
Primer No. 10: '5'-GATGGGGAAAGAAGAGAGAAA-3' (SEQ ID NO: 17)
(Both No. 9 and No. 10 label the 5 'end with FAM)
Reaction system:
2.5 mM dNTP 1.2 μl
50 mM {magnesium sulfate} 0.3 μl
10 μM Primer No. 9 0.5μl
10 μM Primer No. 10 0.5μl
50 ng / μl genomic DNA 1 μl
10 × PCR reaction buffer 1 μl
(Furatina Taq DNA polymerase: attached to Invitrogen, Model No. 10966-018)
Sterile water 5.45 μl
Platinum Taq DNA polymerase 0.05 μl
( Invitrogen Company, model number 10966-018 , 5 unit / μ l ) 　　
Total 10μl
PCR conditions: 35 cycles of 94 ° C for 30 seconds, 54 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 1 minute
[0111]
6) Detecting whether the repetition of nucleotides T (thymine) at positions −11 to −22 of intron 18 of the GFAT1 gene (nucleotide numbers 253 to 264 of SEQ ID NO: 6) is 11, 12, or 13 times PCR for:
PCR was performed with the following primers and reaction conditions to amplify a 0.21 kbp DNA fragment containing a polymorphic site.
PCR primers:
Primer No. 11: '5'-GATGGTTAATGAATGTATTGT-3' (SEQ ID NO: 18)
Primer No. 12: '5'-GCTTAATCATACAGTTTCTGT-3' (SEQ ID NO: 19)
(No. 11 labels the 5 'end with FAM, No. 12 labels the 5' end with HEX)
Reaction system:
2.5 mM dNTP 1.1 μl
50 mM {magnesium chloride} 1 μl
10 μM Primer No. 11 1μl
10 μM Primer No. 12 1μl
50 ng / μl genomic DNA 1 μl
10 × PCR reaction buffer 1 μl
(LA Taq DNA Polymerase: Takara Shuzo, attached to model number RR002A)
Sterile water 3.85 μl
LATaq DNA polymerase 0.05 μl
(Takara Shuzo, model number RR002A , 5 unit / μ l )
Total 10μl
PCR conditions: 35 cycles of 94 ° C for 30 seconds, 54 ° C for 30 seconds, 72 ° C for 1 minute and 30 seconds
[0112]
7) Repeating the microsatellite marker CAA (cytosine, adenine, adenine) at positions 2632 to 2661 of the third intron of the GFAT1 gene (the region of nucleotide numbers 237 to 266 of SEQ ID NO: 7) 7 times, 9 times, 10 times, PCR for detecting 11 times or 12 times:
PCR was performed using the following primers and reaction conditions to amplify a 0.26 kbp DNA fragment containing a polymorphic site.
PCR primers:
Primer No. 13: '5'-CCCATCTCTACTAAAATACCA-3' (SEQ ID NO: 20)
Primer No. 14: '5'-CACTTCTTTCAAAAGCTACA-3' (SEQ ID NO: 21)
(In both No. 13 and No. 14, the 5 'end is labeled with HEX.)
Reaction system:
2.5 mM dNTP 1.1 μl
50 mM magnesium chloride 0.8 μl
10 μM Primer No. 13 1μl
10 μM Primer No. 14 1μl
50 ng / μl genomic DNA 1 μl
10 × PCR reaction buffer 1 μl
(LA Taq DNA Polymerase: Takara Shuzo, attached to model number RR002A)
Sterile water 4.05μl
LATaq DNA polymerase 0.05 μl
(Takara Shuzo, model number RR002A , 5 unit / μ l )
Total 10μl
PCR conditions: 94 ° C for 30 seconds, 56 ° C for 30 seconds, 72 ° C for 1 minute and 30 seconds for 40 cycles
[0113]
8) PCR for detecting whether the nucleotide at the 66th position of exon 18 of the GFAT2 gene (nucleotide number 2251 of SEQ ID NO: 3 in the sequence listing) is c (cytosine) or t (thymine):
PCR was performed using the following primers and reaction conditions to amplify a 205 bp DNA fragment containing the polymorphic site.
PCR primers:
Primer No. 15: '5'-CCCATCTCTACTAAAATACCA-3' (SEQ ID NO: 24)
Primer No. 16: '5'-CACTTCTTTCAAAAGCTACA-3' (SEQ ID NO: 25)
(In both No. 15 and No. 16, the 5 'end is labeled with HEX.)
Reaction system:
2.5 mM dNTP 3.2 μl
2.5 mM {magnesium sulfate} 2.8 μl
10 μM Primer No. 15 2μl
10 μM Primer No. 16 2μl
50 ng / μl genomic DNA 2 μl
10 × PCR reaction buffer 2 μl
(LA Taq DNA Polymerase: Takara Shuzo, attached to model number RR002A)
Sterile water 9μl
LATaq DNA polymerase 0.1 μl
(Takara Shuzo, model number RR002A , 5 unit / μ l )
Total 20μl
PCR conditions: 94 ° C for 30 seconds, 56 ° C for 30 seconds, 72 ° C for 1 minute and 30 seconds for 40 cycles
[0114]
[Example 3] Detection of polymorphism of GFAT gene
1) Analysis using DNA sequencer
The nucleotide sequence for identifying each polymorphic site of the GFAT gene was determined by a conventional method using a DNA sequencer (ABI PRISM 377: manufactured by Applied Biosystems).
[0115]
As a result, it was confirmed that each polymorphism exists at the following positions.
a) the 36th nucleotide of the first intron of the GFAT1 gene (nucleotide number 632 of SEQ ID NO: 1);
b) the seventh nucleotide of the eleventh intron of the GFAT1 gene (nucleotide number 266 of SEQ ID NO: 2);
c) nucleotide -147 of intron 12 of the GFAT1 gene (nucleotide number 338 of SEQ ID NO: 3);
d) nucleotides 1853 to 1877 of the eighth intron of the GFAT1 gene (nucleotide numbers 336 to 360 in SEQ ID NO: 4);
e) nucleotides 1988 to 2007 of intron 12 of the GFAT1 gene (nucleotide numbers 328 to 347 of SEQ ID NO: 5);
f) nucleotides -11 to -22 of intron 18 of the GFAT1 gene (nucleotide numbers 253-264 of SEQ ID NO: 6);
g) nucleotides 2632 to 2661 of the third intron of the GFAT1 gene (nucleotide numbers 237 to 266 in SEQ ID NO: 7)
h) The 66th nucleotide of the 18th exon of the GFAT2 gene (nucleotide number 2251 of SEQ ID NO: 23)
[0116]
2) SSCP method
One-fifth of each PCR product obtained in Example 2 was added to a 5: 1 mixture of formamide solution: loading buffer (0.05 M EDTA aqueous solution containing 0.03 g / ml blue dextran) and mixed. After heat denaturation at 95 ° C. for 2 minutes, the mixture was cooled on ice to prepare a sample for electrophoresis. This sample was electrophoresed on a non-denaturing polyacrylamide gel, and a polymorphism was detected based on a difference in mobility of a DNA fragment based on a difference in allele. The electrophoresis gel used was a 12% polyacrylamide gel to which 5% glycerol was added (gel thickness: 0.2 mm). In addition, in order to confirm that there is no change in polymorphism detection due to a difference in measurement conditions, 10% polyacrylamide and 5% glycerol were added, and 12% polyacrylamide gel was added with 10% glycerol. The test was performed under the following two conditions. In the electrophoresis, a DNA sequencer (ABI PRISM 377: manufactured by Applied Biosystems) was used and an A filter was used at a constant power of 30 watts for 3 to 12 hours. The fluorescent band was detected using the detection function of the DNA sequencer. During the electrophoresis, in order to maintain the gel plate temperature, water adjusted to 20 ° C. by a cooling device (RTE-III, manufactured by Neslab) was circulated outside the gel plate. In addition, according to the method described in 1) of Example 3, the genotype of the GFAT gene polymorphism was determined using the DNA fragment for which the nucleotide sequence of the polymorphic site was determined as a positive control.
[0117]
[Example 4] Association between polymorphism of GFAT gene and diabetes
The association of the GFAT1 gene with type 1 diabetes, type 2 diabetes, and diabetic nephropathy was analyzed by association analysis (association method) (Fisher et al., Biostatistics, John Willey & Sons, 1993). . The haplotype analysis was performed using the Arlequin program (statistical analysis software manufactured by Laurent @ Excoffier, URL: http://lgb.unige.ch/arlequin/). For the significance test, exact {test} of {population} differentiation (PD test), which is an extension of Fisher's direct probability calculation method, was used ("Basic Medical Statistics: Revised 4th Edition", co-authored by Katsumi Kano and Hideto Takahashi, Nankodo, 1995). Year). The significance level was set at a risk rate of 5%, and those having a risk rate of less than 5% were determined to have a significant difference.
[0118]
1) Relationship between type 2 diabetes and polymorphism at nucleotide 36 (nucleotide number 632 of SEQ ID NO: 1) of the first intron of the GFAT1 gene
For 141 healthy Japanese subjects and 388 Japanese type 2 diabetic patients (156 with nephropathy and 232 without nephropathy), the 36th position of the first intron of the GFAT1 gene (nucleotide number 632 of SEQ ID NO: 1) The polymorphism frequency in was calculated, and the association with diabetes was analyzed by the association method. Table 1 shows the results.
[0119]
[Table 1]
Figure 2004000115
[0120]
In Table 1, a subject homozygous for the gene in which the thirty-sixth intron of the GFAT1 gene is t (thymine) is “TT”, and a subject homozygous for the gene whose site is c (cytosine) is “CC”. Subjects with both genes heterozygously are designated as "TC". From the results in Table 1, it was shown that the allele frequency at the 36th nucleotide of intron 1 of the GFAT1 gene was statistically significantly different between healthy subjects and type 2 diabetic patients (with nephropathy). This indicates that the relative risk of developing type 2 diabetes associated with diabetic nephropathy can be determined by examining the gene polymorphism at the 36th nucleotide of the first intron of the GFAT1 gene.
[0121]
2) Relationship between type 2 diabetes and polymorphism at the seventh nucleotide (nucleotide number 266 of SEQ ID NO: 2) of intron 11 of the GFAT1 gene
For 137 Japanese healthy people and 377 Japanese type 2 diabetic patients (149 with nephropathy, 228 without nephropathy), the seventh intron 11 of the GFAT1 gene (nucleotide number 266 in SEQ ID NO: 2) The nucleotide polymorphism frequency was calculated, and the association with diabetes was analyzed by the association method. Table 2 shows the results.
[0122]
[Table 2]
Figure 2004000115
[0123]
In Table 2, a subject homozygous for the gene in which the 7th intron of the GFAT1 gene is g (guanine) is “GG”, and a subject homozygous for the gene in which the site is a (adenine) is “AA”. Subjects with heterozygous both genes are designated as "GA". The results in Table 2 showed that the allele frequency at the seventh nucleotide of the eleventh intron of the GFAT1 gene was statistically significantly different between healthy individuals and patients with type 2 diabetes (with nephropathy). This indicates that the relative risk of developing type 2 diabetes associated with diabetic nephropathy can be determined by examining the gene polymorphism at the seventh nucleotide of the 11th intron of the GFAT1 gene.
[0124]
3) Relationship between type 2 diabetes and a genetic polymorphism at the 66th nucleotide of exon 18 (nucleotide number 2251 of SEQ ID NO: 23) of the GFAT2 gene
For 144 Japanese healthy subjects and 398 Japanese patients with type 2 diabetes (158 with nephropathy and 240 without nephropathy), the 66th nucleotide of exon 18 of the GFAT2 gene (nucleotide number 2251 of SEQ ID NO: 3) ) Was calculated, and the association with diabetes was analyzed by the association method. Table 3 shows the results.
[0125]
[Table 3]
Figure 2004000115
[0126]
In Table 3, subjects having a homozygous gene whose c-position is c (cytosine) at exon 18 of the GFAT2 gene are “CC”, and subjects having a homozygous gene whose site is t (thymine) are “TT”. And subjects with both genes heterozygously are designated as "TC". From the results in Table 3, GFAT2 was found between healthy subjects and type 2 diabetic patients (without nephropathy) and between type 2 diabetic patients (with nephropathy) and type 2 diabetic patients (without nephropathy), respectively. It was shown that the polymorphism frequency of nucleotide 66 of exon 18 of the gene was statistically significantly different. This indicates that the relative risk of developing type 2 diabetes without diabetic nephropathy can be determined by examining the polymorphism at the 66th nucleotide of exon 18 of the GFAT2 gene.
[0127]
4) Relationship between type 2 diabetes and the T repetitive polymorphism in the eighth intron of the GFAT1 gene (nucleotide numbers 336 to 360 in SEQ ID NO: 4)
For 191 Japanese healthy people and 384 Japanese type 2 diabetic patients, the allele frequency at the T repeat polymorphism in the eighth intron of the GFAT1 gene (nucleotide numbers 336 to 360 of SEQ ID NO: 4) was calculated, and the association was calculated. The relationship with diabetes was analyzed by the method. Table 4 shows the results.
[0128]
[Table 4]
Figure 2004000115
[0129]
In Table 4, when the number of T repetitions (nucleotide numbers 336 to 360 of SEQ ID NO: 4) in the eighth intron of the GFAT1 gene is 24, it is represented as "T24", and when it is 25, it is represented as "T25". . From the results in Table 4, it was shown that the allele frequency of the T polymorphism in the eighth intron of the GFAT1 gene was statistically significantly different between healthy individuals and patients with type 2 diabetes. This indicates that the relative risk of developing type 2 diabetes can be determined by examining the repeated T polymorphism in the eighth intron of the GFAT1 gene.
[0130]
5) Relationship between type 2 diabetes and the repetitive polymorphism of A in the twelfth intron of the GFAT1 gene (nucleotide numbers 328 to 347 of SEQ ID NO: 5)
For all 189 healthy Japanese people and 389 Japanese type 2 diabetic patients, the allele frequency of type 2 diabetes and the A polymorphism in the intron 12 of the GFAT1 gene was calculated, and the association with diabetes was determined by the association method. Analyzed. Table 5 shows the results.
[0131]
[Table 5]
Figure 2004000115
[0132]
In Table 5, when the number of A repeats (nucleotide numbers 328 to 347 of SEQ ID NO: 5) in the twelfth intron of the GFAT1 gene is 18, "A18", 19 times, "A19", and 24 times It is represented as "A24" or "A25" in the case of 25 times. From the results in Table 5, it was shown that the allele frequency of the T repetitive polymorphism in the intron 12 of the GFAT1 gene was statistically significantly different between healthy individuals and patients with type 2 diabetes. This indicates that the relative risk of developing type 2 diabetes can be determined by examining the repeated A polymorphism in the twelfth intron of the GFAT1 gene.
[0133]
6) Relationship between type 2 diabetes and the T repetitive polymorphism in intron 18 of the GFAT1 gene (nucleotide numbers 253 to 264 of SEQ ID NO: 6)
For 192 Japanese healthy volunteers and 373 Japanese type 2 diabetic patients, the allele frequency at the repeated T polymorphism (nucleotide numbers 253 to 264 of SEQ ID NO: 6) in the 18th intron of the GFAT1 gene was calculated, and the association was calculated. The relationship with diabetes was analyzed by the method. Table 6 shows the results.
[0134]
[Table 6]
Figure 2004000115
[0135]
In Table 6, when the number of T repetitions (nucleotide numbers 253 to 264 of SEQ ID NO: 6) in the 18th intron of the GFAT1 gene is 11, “T11”, 12 times, “T12”, or 13 times Is represented as “T13”. From the results in Table 6, it was shown that the allele frequencies of type 2 diabetes and the T polymorphism in the intron 18 of the GFAT1 gene were statistically significantly different between healthy individuals and patients with type 2 diabetes. This indicates that the relative risk of developing type 2 diabetes can be determined by examining the repeated T polymorphism in the intron 18 of the GFAT1 gene.
[0136]
7) Relationship between type 2 diabetes and nucleotide polymorphism (nucleotide number 338 in SEQ ID NO: 3) in intron 12 of the GFAT1 gene
For 192 Japanese healthy people and 377 Japanese type 2 diabetic patients, the allele frequency of type 2 diabetes and nucleotide polymorphism in the intron 12 of the GFAT1 gene (nucleotide number 338 of SEQ ID NO: 3) was calculated, and the association was calculated. The relationship with diabetes was analyzed by the method. Table 7 shows the results.
[0137]
[Table 7]
Figure 2004000115
[0138]
In Table 7, when the nucleotide (nucleotide number 338 in SEQ ID NO: 3) of the twelfth intron of the GFAT1 gene is adenine, it is expressed as "A", thymine as "T", or deletion as "del". Is represented. The results in Table 7 indicate that the allele frequency of the nucleotide (nucleotide 338 in SEQ ID NO: 338) polymorphism in the 12th intron of the GFAT1 gene is statistically significantly different between healthy individuals and patients with type 2 diabetes. Was done. This indicates that the relative risk of developing type 2 diabetes can be determined by examining the polymorphism of the nucleotide (nucleotide number 338 of SEQ ID NO: 3) in the twelfth intron of the GFAT1 gene.
[0139]
8) Type 2 diabetes and a polymorphism at nucleotide 36 (nucleotide number 632 of SEQ ID NO: 1) of the first intron of the GFAT1 gene and a polymorphism of T repeat (nucleotide numbers 253-264 of SEQ ID NO: 6) at intron 18 Relationship to combined haplotypes
For 141 healthy Japanese subjects and 366 Japanese type 2 diabetic patients (145 with nephropathy and 221 without nephropathy), the 36th nucleotide of the first intron of the GFAT1 gene (nucleotide number of SEQ ID NO: 1) 632) The haplotype frequency was calculated by combining the polymorphism and the polymorphism of T repeats (nucleotide numbers 253 to 264 of SEQ ID NO: 6) in the 18th intron, and the association with diabetes was analyzed by the association method. Table 8 shows the results.
[0140]
[Table 8]
Figure 2004000115
[0141]
In Table 8, subjects having a homozygous gene in which the 36th of the first intron of the GFAT1 gene is T (thymine) are “T / T”, and subjects having a homozygous gene in which the site is C (cytosine) are represented as “T / T”. C / C ”and subjects having both genes heterozygously are represented as“ T / C ”. In Table 8, when the number of T repetitions (nucleotide numbers 253 to 264 of SEQ ID NO: 6) in the 18th intron of the GFAT1 gene is 11, "T11", when it is 12, "T12", or 13 Is represented as “T13”. Furthermore, genotypes generated by each combination are represented as “T13 / T13”, “T13 / T12”, “T12 / T12”, “T13 / T11”, “T12 / T11”, or “T11 / T11”. Have been. From the results in Table 8, it is shown that the frequency distribution of each haplotype is significantly different in the comparison between healthy subjects and type 2 diabetic patients and between healthy subjects and type 2 diabetic patients (without nephropathy). Was done. This indicates that the 36th nucleotide (nucleotide number 632 of SEQ ID NO: 1) polymorphism of the first intron of the GFAT1 gene and the T repetition (nucleotide numbers 253-264 of SEQ ID NO: 6) polymorphism in the 18th intron. This indicates that the relative risk of developing type 2 diabetes or type 2 diabetes without diabetic nephropathy can be determined by examining a haplotype in which is combined.
[0142]
9) Type 2 diabetes and a polymorphism at the seventh nucleotide (nucleotide number 266 of SEQ ID NO: 2) of the 11th intron of the GFAT1 gene and a polymorphism of T repeat (nucleotide numbers 253-264 of SEQ ID NO: 6) at the 18th intron. Relationship to combined haplotypes
For 143 Japanese healthy subjects and 367 Japanese type 2 diabetic patients (145 with nephropathy and 222 without nephropathy), the seventh nucleotide of the 11th intron of the GFAT1 gene (nucleotide number of SEQ ID NO: 2) 266) The haplotype frequency was calculated by combining the polymorphism and the polymorphism of the T repeat (nucleotide numbers 253 to 264 of SEQ ID NO: 6) in the 18th intron, and the association with diabetes was analyzed by the association method. Table 9 shows the results.
[0143]
[Table 9]
Figure 2004000115
[0144]
In Table 9, subjects homozygous for the gene in which the seventh intron of the GFAT1 gene is G (guanine) are “G / G”, and subjects homozygous for the gene whose site is A (adenine) are “G / G”. A / A ", and subjects having both genes heterozygously are represented as" G / A ". In Table 9, “T11” when the number of T repetitions (nucleotide numbers 253 to 264 of SEQ ID NO: 6) in the 18th intron of the GFAT1 gene is 11; “T12” when the number is 12; Is represented as “T13”. Furthermore, genotypes generated by each combination are represented as “T13 / T13”, “T13 / T12”, “T12 / T12”, “T13 / T11”, “T12 / T11”, or “T11 / T11”. Have been. From the results in Table 9, it is shown that the frequency distribution of each haplotype is significantly different in the comparison between healthy subjects and type 2 diabetic patients and between healthy subjects and type 2 diabetic patients (without nephropathy). Was done. This combined the 7th nucleotide (nucleotide number 266 of SEQ ID NO: 2) polymorphism of the 11th intron of the GFAT1 gene with the T repeat (nucleotide numbers 253-264 of SEQ ID NO: 6) polymorphism at the 18th intron. This indicates that the relative risk of developing type 2 diabetes or type 2 diabetes without diabetic nephropathy can be determined by examining haplotypes.
[0145]
10) Type 1 and type 2 diabetes and microsatellite in the third intron of the GFAT1 gene (nucleotide numbers 237 to 266 of SEQ ID NO: 7) and T repeat in intron 18 (nucleotide numbers 253 to 264 of SEQ ID NO: 6) Relationship with haplotypes combining polymorphisms
In 143 Japanese healthy subjects, 64 Japanese type 1 diabetic patients, and 372 Japanese type 2 diabetic patients (143 with nephropathy, 229 without nephropathy), the microstructure in the third intron of the GFAT1 gene was determined. The haplotype frequency was calculated by combining the satellite (nucleotide numbers 237 to 266 of SEQ ID NO: 7) polymorphism and the T repetition (nucleotide numbers 253 to 264 of SEQ ID NO: 6) polymorphism in the 18th intron. The association was analyzed. Table 10 shows the results.
[0146]
[Table 10]
Figure 2004000115
[0147]
In Table 10, when the number of repetitions of the microsatellite (nucleotide numbers 237 to 266 of SEQ ID NO: 7) CAA (cytosine, adenine, adenine) in the third intron of the GFAT1 gene is 7 times, "7"; "9", "10" for 10 times, "11" for 11 times, or "12" for 12 times. The genotypes produced by each combination are “9/9”, “9/10”, “10/10”, “9/11”, “10/11”, “11/11”, “9/9”. 12 "," 10/12 "," 11/12 "," 12/12 "," 9/7 "," 10/7 "," 11/7 "," 12/7 ", or" 7/7 " ”. Furthermore, in Table 10, when the number of T repetitions (nucleotide numbers 253 to 264 of SEQ ID NO: 6) in the 18th intron of the GFAT1 gene is 11, "T11", when it is 12, "T12", or 13 Is represented as “T13”, and the genotypes generated by each combination are “T13 / T13”, “T13 / T12”, “T12 / T12”, “T13 / T11”, and “T12 / T11”. , Or “T11 / T11”. From the results in Table 10, comparison between healthy subjects and type 2 diabetic patients as a whole, healthy subjects and type 2 diabetic patients (with nephropathy), healthy subjects and type 2 diabetic patients (without nephropathy), and healthy subjects with type 1 diabetes All comparisons with diabetic patients showed that the frequency distribution in each haplotype was significantly different. This combined the microsatellite (nucleotide numbers 237-266 of SEQ ID NO: 7) polymorphism in the third intron of the GFAT1 gene with the T repeat (nucleotide numbers 253-264 of SEQ ID NO: 6) polymorphism in the 18th intron. Demonstrates that the relative risk of developing type 1 diabetes, type 2 diabetes, type 2 diabetes with diabetic nephropathy, or type 2 diabetes without diabetic nephropathy can be determined by examining haplotypes It is.
[0148]
【The invention's effect】
According to the present invention, the relative risk of developing type 1 diabetes, type 2 diabetes, type 2 diabetes with diabetic nephropathy, or type 2 diabetes without diabetic nephropathy is easily determined. be able to. That is, the present invention provides a method for determining the risk of developing diabetes and materials for the method.
[0149]
[Sequence list]
SEQUENCE LISTING
<110> @Itakura, @Mitsuo
Sankyo Company, Limited
<120> Method for determining a risk of developing diabetes <130> 20020205SU
<150> JP2001-271870
<151> $ 2001-09-07
<150> JP2002-090861
<151> 2002-03-28
<160> $ 25
<170> \ PatentIn \ Ver. 2.1
<210> 1
<211> $ 782
<212> DNA
<213> \ Homo \ sapiens
<220>
<223> @inventor: Itakura, @Mitsuo; @Yasumo, @Hiroaki; @Watanabe, @Ichiro <220>
<221> @variation
<222> @ (632)
<223> Description of version: single nucleotide polymorphism involving replacement of of (C) and (T)
<400> $ 1
ccagatttcc \ ctttttcatac \ ttcctgcttttttttcctcctc \ ttttcctcgct \ tcgtgcagtg @ 60
ctggcgcctg gggcctggggg ctgcacgggg cacgcacccg ggcttattgct ttgctaacaa 120
ttccatcctt \ ctcttttccgt \ cattcccctgc \ caggtgctga \ gtttctccct \ ccctctcggc 180
tcggtccctc ccgcggctcg ccccgggggcg ggcgtccca ggaactccag gcggacgcgg 240
cccacgccca @ ctgccacgtc @ gccgccgcca @ gcagtccagc @ gcctgcgtgtg @ gctcgggggg300
cgggggagcg ctggggagcg ggacttgcgc gtgagcggcg cgtgagcggt tcaatggagc 360
ctacggggcgg cggcgcgctg cgcgccgagg ggcggggccc ggcggcgggtt gctggcggag 420
cccggggagggc ggagaaggct gtcgttgcct tggccgtcgc atccccgagg gagtcgtgtc 480
ggcgccaccc cggcccccga gccccgcatat tgccccaccga agctcgtgtg tgcacccccg 540
atcccgccag ccactcgccc ctggcctcgc gggccgtgtc tccggcatca tgtgtgggtaaａ600
ggggggccgggg agcggggggggc gtgttgccgg gyggcgctgg gggtgcgggtgc gggtgccgct 660
aagccccaag @ gcgacggggcg @ gaagcgggag @ tgtgggaggt @ gcgaagtctg @ ggtgatggggc720
aagggggcgcc @ cagtgggtgc @ tgcggggggcg @ ggggccggca @ tccacggggcg @ gagaggggg @ 780
tg $ 782
<210> $ 2
<211> $ 675
<212> DNA
<213> \ Homo \ sapiens
<220>
<221> @variation
<222> (266)
<223> Description of version: single nucleotide polymorphism involving replacement of (G) and (A)
<400> $ 2
agtagaaaat \ attgtcaccc \ agtcttttag \ gcagtcatgt \ cttatgcatg \ aacttttttt60
atattttattt @ taccagaattt @ attattaaagg @ aaacttttag @ ttgtgttcaaaa @ attcttttt @ 120
ttgattttgtt ttttgttttaa tttatgtgatt tcttatacta taggcaactt cagttcatt 180
atgcagaagg aaattattga gcagccagag tctgtcgtga acacaatgag aggaagagtc 240
aacttgatg actatactgg taatttrcata tgaattatttt tattattttca gtgtctctgaｇ300
catagtagggg \ tgccattaac \ acctgaaaag \ ttcattgccc \ tatatagcct \ tgttagaaaca 360
ctacagctgc cagccatcag tggagcccag ccatcttga aaaagttcttt tagtgtgtga 420
ttctacctat @ ataagatatc @ tagatagtc @ agattcacag @ aaagaagaag @ tagattataatg @ 480
gttaccagg @ gctgtgggga @ gggggaaatgg @ gagtcactg @ tttaaaagggt @ acagagtttc @ 540
agttgtgggga tgatgaaatt acagaaatgg attgtagtga tggttgcaca ataatgtgaa 600
tgtgcttaat \ gccactgaat \ tgtactattta \ aacatagtta \ aaatggtaaaa \ ttttattgtgt \ 660
aggtacccca ctgtg 675
<210> $ 3
<211> $ 780
<212> DNA
<213> \ Homo \ sapiens
<220>
<221> @variation
<222> (338)
<223> Description of version: single nucleotide polymorphism involving replacement of of (A) and (T)
<400> $ 3
ctttggggagg ctgaggcgag cacatcatga ggtcaggaga ttgagaccat cctggccaac 60
atggtgaaac cccatctctta ctaagctggg catgggtggcg cacgcctata gtccccagcta 120
ctcaggaggc tgaggcagga gaattgctttg aacccggggag gcgggaggtta cgggtgagccg 180
agatggcacc actgcactcc agcctggcga cagagcgaga ctccgtctca aaaaaaaaa 240
aaaaaaaaagg aatgtataca tagatagttg tctaaaagaga ctgatatagtaa aattgttagcc 300
atgcttattct \ caagtggtag \ gattttgatt \ ttttttwaa \ aattttttaa \ tctggggttgt \ 360
tttattttttc \ taacgtgtca \ ttttttgtat \ kagaaaaagc \ aaaaaactata \ cattgaatcc \ 420
aaaagagtcc \ gattgaaaag \ tatttgaagg \ aaagttctgt \ gaccaagtca \ tatttttctct \ 480
gcagacacgt caagtctttg aggagctgac tgagttgcct gtgatgggtggg aactagcaag 540
tgacttcctg \ gacagaaaaca \ caccagtcttt \ tcgagatat \ gtttgcttttt \ tccttagtca \ 600
atcaggtgtg \ ttaattttaa \ agacttaaaa \ ggaaggaaag \ ttattctttttc \ taataatttct \ 660
agcatatcttt ggcaaaagct gattattaaa gataaaactgg cattgcagat gactgacga 720
atacagatttt @ attttattagtt tacataattc @ tttatgaatt @ agtaaaaattg @ aaccacctttt780
<210> $ 4
<211> $ 720
<212> DNA
<213> \ Homo \ sapiens
<220>
<221> @variation
<222> @ (336). . (360)
<223> \ Description \ of \ variation: \ (T) 24 \ or \ (T) 25 \ repeat \ polymorphism <400> \ 4
cgggttcaag \ cgagtctcat \ gcctcagcct \ ccagagtagc \ tgggactaccc \ agtgcaacc \ 60
accacaccccg gctactactt gttatttttag tagagacgggg gttttcgccat tttggccgggg 120
ctaatctcga \ actcctgacc \ tcaggtgac \ cgccccacctc \ ggcctcccaa \ agtgctgggga 180
ttacaggtgt \ gagccgctgc \ accccagcctc \ aaatttttttt \ tacatattttt \ aactaatat \ 240
actttgttat ttgaagaatg aaattattcaa tatttggaga aaaacacag tgaaactcaa 300
gcctattagg \ acattttata \ agcaaaagta \ gttggttttttt \ tttttttttttt \ tttttttttt \ 360
gagacgaagt ctcgctctgtt tgctcaggct gtagtgcagt ggcgtgatct cggctcactg 420
caacctcggc ctcccggggttt caagcgagtc tcttgcctca gcctcctgag tagctgggat 480
tacaggcacg \ tgccaccaca \ ccccagcaat \ ttttcttattt \ ttagtagaga \ cgggggtttca \ 540
ggctgtttgct caggctgggtc tcaactcct gacctcatga tccgcccacc tcggcctccc 600
aaagtgctgg \ gattacaggc \ ctgagccacc \ acacctgtt \ gcatttatttt \ ttttttaaatg \ 660
ctgagctctc \ ttttttagtgg \ ttttttaattt \ actttttttg \ ttttgttttttt \ gagcaaaagt \ 720
<210> $ 5
<211> $ 660
<212> DNA
<213> \ Homo \ sapiens
<220>
<221> @variation
<222> @ (328). . (347)
<223> Description of version: (A) 18, (A) 19, (A) 24 or (A) 25 repeat polymorphism
<400> $ 5
atggaactact aggcataaat gatttaagta taggcctact aatatgcttt tcaaaaatttt 60
aattttctctｃaggtttttgta gtggcattca gtggaatttta tagcattaag tactcttatt 120
gtgatggaaa tatgtcatttt tgtgttattta taaaaagtttg tttgcagctgg ggtgcagtgg 180
tgtgtgccta tagttccagc tcctcggaag ctgggggaggg aggcactt gagaccagga 240
attgaggcc @acagtgccct \ agaatcatgc \ ctctgaatag \ ctactactact \ ccagcctggg \ 300
caacaaacca agaccccatc tttaaccacaa aaaaaaaaaaaaaaaaagtt gccccaacta 360
aaaataaaaaa \ cttattaatta \ gcacagataaa \ attctgagat \ tactttttttg \ gggttttatta \ 420
ctttataata \ tctgggtaagc \ ctccagattt \ ctattctttct \ ctcttctttttc \ ccccatttttt \ 480
tattttgaag ａｔaatatgattc caatgttaaca tttattattat aaactgggtg aaaaggtttg 540
gttttacattt @ attttgtggga \ aaacattag \ cattttaggtg \ tcggtaactt \ aatttatgtat \ 600
aaaaaaatat attaatggaa agaataata aaaaaatagga gcatttttatc ttcaatgatt 660
<210> $ 6
<211> $ 540
<212> DNA
<213> \ Homo \ sapiens
<220>
<221> @variation
<222> @ (253). . (264)
<223> \ Description \ of \ variation: \ (T) 11, \ (T) 12, \ or \ (T) 13 \ repeat \ polymorphism
<400> $ 6
tatgagggct actactctg tagaggcca ctagtagctct ttctgttgtga actggcacct 60
ttagattgctｃttttcctaac caatttcagt ttttttcagg acactattatg tgattattatt 120
ttcttaatcta \ attctttttgta \ gtctgtaata \ agagggtta \ atgaatgtat \ tgtttttctgt180
tttttaaaaac aaaaaaattt tgctttatagt aaccacccccc ttccccaggtc tatataattct 240
ctcaaattctt gcttttttttt ttttcttttttt gcaggttgat ttcccacggga attctgcca 300
atctgtgact \ gtagaggtgag \ gaatatcttat \ acaaaatgta \ cgaaactgta \ tgattatagca \ 360
acacaagaca \ cctttttttat \ ttaaaacctt \ gatttaaaat \ atcaccccttt \ gaagcctttt \ 420
tttagtaat @ cctttatttat @ atcatcatta \ taattatttcc \ actcaatatg \ tgattttttgt \ 480
gagttacct \ ctttacatttt \ cccagtaatt \ tgtgggaggac \ ttttgaataat \ ggaatctata \ 540
<210> $ 7
<211> $ 360
<212> DNA
<213> \ Homo \ sapiens
<220>
<221> @variation
<222> @ (237). . (266)
<223> Description of version: (CAA) 7, (CAA) 9, (CAA) 10, (CAA) 11 or (CAA) 12 microsatellite repeat polymorphism
<400> $ 7
gggcgggattg cctgagctct ggagttttgag accagcctgg gcaacatggt gaaccaccccat 60
ctctactaaa \ atacaaaaaaa \ ttagccgggt \ gtggcggcgt \ gcacctgtag \ ttccagctat \ 120
tcgggaggtt gaggaggag aatcactga g atccaggagg cggaggttgc agtgagctga 180
gatcgtgcca ctgcactcca gcctgggtgaｇcagagtgagaｇctccgttctcc acaaaacaacａ240
aacacaacaaca acaacaacaaa caacaaaaaa taagttgtat atgatagtga atgagcatat 300
gtagctttttg \ aaaagaaggtt \ actgaatctg \ gttctgcata \ tgggaacatg \ gataattcct \ 360
<210> $ 8
<211> $ 20
<212> DNA
<213> \ Artificial \ Sequence
<220>
<223> \ Description \ of \ Artificial \ Sequence: primer <400> \ 8
caccgaagct cgtgtgtggca 20
<210> $ 9
<211> $ 20
<212> DNA
<213> \ Artificial \ Sequence
<220>
<223> \ Description \ of \ Artificial \ Sequence: primer
<400> $ 9
cgccttggggc cttagcggca 20
<210> $ 10
<211> $ 20
<212> DNA
<213> \ Artificial \ Sequence
<220>
<223> \ Description \ of \ Artificial \ Sequence: primer
<400> $ 10
ggaaactttttagttgtgtac $ 20
<210> $ 11
<211> $ 20
<212> DNA
<213> \ Artificial \ Sequence
<220>
<223> \ Description \ of \ Artificial \ Sequence: primer
<400> $ 11
ctgtcagaga actgaaata 20
<210> $ 12
<211> $ 21
<212> DNA
<213> \ Artificial \ Sequence
<220>
<223> \ Description \ of \ Artificial \ Sequence: primer
<400> $ 12
gccatgctta @ tctcaagtgg @ t @ 21
<210> $ 13
<211> $ 21
<212> DNA
<213> \ Artificial \ Sequence
<220>
<223> \ Description \ of \ Artificial \ Sequence: primer
<400> $ 13
catcggactt ctttggattc a 21
<210> $ 14
<211> $ 22
<212> DNA
<213> \ Artificial \ Sequence
<220>
<223> \ Description \ of \ Artificial \ Sequence: primer
<400> $ 14
aaaaaaacaca gtgaaactca ag 22
<210> $ 15
<211> $ 20
<212> DNA
<213> \ Artificial \ Sequence
<220>
<223> \ Description \ of \ Artificial \ Sequence: primer
<400> $ 15
aaaccccgtc tctactaaaaa 20
<210> $ 16
<211> $ 20
<212> DNA
<213> \ Artificial \ Sequence
<220>
<223> \ Description \ of \ Artificial \ Sequence: primer
<400> $ 16
agaatcatgc ctctgaatag 20
<210> $ 17
<211> $ 20
<212> DNA
<213> \ Artificial \ Sequence
<220>
<223> \ Description \ of \ Artificial \ Sequence: primer
<400> $ 17
gatgggggaaaa @ gaagagagaa @ 20
<210> $ 18
<211> $ 21
<212> DNA
<213> \ Artificial \ Sequence
<220>
<223> \ Description \ of \ Artificial \ Sequence: primer
<400> $ 18
gagggttaat @ gaatgttattg @ t @ 21
<210> $ 19
<211> $ 20
<212> DNA
<213> \ Artificial \ Sequence
<220>
<223> \ Description \ of \ Artificial \ Sequence: primer
<400> $ 19
gcttaatcat {acagttttcgt} 20
<210> $ 20
<211> $ 20
<212> DNA
<213> \ Artificial \ Sequence
<220>
<223> \ Description \ of \ Artificial \ Sequence: primer
<400> $ 20
cccatctcta ctaaataacaａｃ20
<210> $ 21
<211> $ 20
<212> DNA
<213> \ Artificial \ Sequence
<220>
<223> \ Description \ of \ Artificial \ Sequence: primer
<400> $ 21
actctttttc aaaagctacaａｃ20
<210> $ 22
<211> $ 93390
<212> DNA
<213> \ Homo \ sapiens
<220>
<221> @exon
<222> @ (16824). . (16952)
<220>
<221> @intron
<222> @ (16953). . (29910)
<220>
<221> @exon
<222> @ (29911). . (30019)
<220>
<221> @intron
<222> @ (30020). . (33917)
<220>
<221> @exon
<222> @ (33918). . (34025)
<220>
<221> @intron
<222> @ (34026). . (40361)
<220>
<221> @exon
<222> @ (40362). . (40487)
<220>
<221> @intron
<222> @ (40488). . (44706)
<220>
<221> @exon
<222> @ (44707). . (44765)
<220>
<221> @intron
<222> @ (44766). . (45569)
<220>
<221> @exon
<222> @ (45570). . (45704)
<220>
<221> @intron
<222> @ (45705). . (47473)
<220>
<221> @exon
<222> @ (47474). . (47535)
<220>
<221> @intron
<222> @ (47536). . (49463)
<220>
<221> @exon
<222> @ (49464). . (49543)
<220>
<221> @intron
<222> @ (49544). . (53849)
<220>
<221> @exon
<222> @ (53850). . (53955)
<220>
<221> @intron
<222> @ (53956). . (55698)
<220>
<221> @exon
<222> @ (55699). . (55862)
<220>
<221> @intron
<222> @ (55863). . (58034)
<220>
<221> @exon
<222> @ (58035). . (58130)
<220>
<221> @intron
<222> @ (58131). . (61782)
<220>
<221> @exon
<222> @ (61783). . (61880)
<220>
<221> @intron
<222> @ (61881). . (65464)
<220>
<221> @exon
<222> @ (65465). . (65585)
<220>
<221> @intron
<222> @ (65586). . (65974)
<220>
<221> @exon
<222> @ (65975). . (66132)
<220>
<221> @intron
<222> @ (66133). . (74228)
<220>
<221> @exon
<222> @ (74229). . (74343)
<220>
<221> @intron
<222> @ (74344). . (74602)
<220>
<221> @exon
<222> @ (74603). . (74730)
<220>
<221> @intron
<222> @ (74731). . (75591)
<220>
<221> @exon
<222> @ (75592). . (75759)
<220>
<221> @intron
<222> @ (75760). . (76953)
<220>
<221> @exon
<222> @ (76954). . (77115)
<220>
<221> @intron
<222> @ (77116). . (77794)
<220>
<221> @exon
<222> @ (77795). . (78753)
<220>
<221> @variation
<222> (16988)
<223> Description of version: single nucleotide polymorphism involving replacement of of (C) and (T)
<220>
<221> @variation
<222> @ (36657). . (36686)
<223> Description of version: (CAA) 7, (CAA) 9, (CAA) 10, (CAA) 11 or (CAA) 12 microsatellite repeat polymorphism
<220>
<221> @variation
<222> @ (51396). . (51420)
<223> \ Description \ of \ variation: \ (T) 24 \ or \ (T) 25 \ repeat \ polymorphism
<220>
<221> @variation
<222> (58137)
<223> Description of version: single nucleotide polymorphism involving replacement of (G) and (A)
<220>
<221> @variation
<222> @ (63868). . (638787)
<223> Description of version: (A) 18, (A) 19, (A) 24 or (A) 25 repeat polymorphism
<220>
<221> @variation
<222> (65318)
<223> Description of version: single nucleotide polymorphism involving replacement of of (A) and (T)
<220>
<221> @variation
<222> @ (77773). . (77784)
<223> \ Description \ of \ variation: \ (T) 11, \ (T) 12, \ or \ (T) 13 \ repeat \ polymorphism
<400> $ 22
aaccygtctct \ cttataaaaaa \ tmcaaaaaaat \ tagccggggca \ tggtgggcgggg \ ggcctgtagt \ 60
cccagctact cggggaggctg aggcaggaga atggcgtgaa cctgggagggc ggagcttgca 120
gtgaccccag attgcaccac tgactcccag cctgggcgac agagtgagac tctatctcaa 180
aaaaaaaaaaa agtaaccctg gaactaaaaat taataactact gaacttaaga actcattaga 240
ttggcatagtttgaagagaa gattatagta ctggaatttta agtcagtaga aaaatttag 300
cctgaagcac \ aggggagagaa \ gagaatagaa \ gatatgggaa \ agaagcatga \ gatgggtgggc \ 360
atgggtgctca cacctaatat tccagcact tggggaggttg aggtaggaggｔattgcttgag 420
ctcagaagtt \ agagaccacc \ ctggcaacat \ agtgagacct \ tgtctctaca \ aaaaattaaaa \ 480
aaatagctg ggtgtggtggg tgtgcacctg tagtctcagc tgttcctgag gcgggaagat 540
tgcttgagcc cgggagattg aggctgcagt gggctgtgat caccaccttg cactctggtc 600
aaggagagag aaaaaagaccc tgtctcacca gaaaaaaaaaaatgaatcaa acctctggag 660
gggaagaata gaataaaaaa taattcatca attctgaaaa atgcaaaaata ggaaacagtaｔ720
aatggtaata \ taaactcaaa \ aggtgttggca \ tttaatatac \ agtaggttga \ tgaacaaaaa \ 780
taagattgtc aaattgggatg taaaaaaacaａｃaaaaaaaaa atcaactata gactgcttag 840
aagagatata gggggccagggc atggcggcta atgcctgtaa tcctagcatt ttggggagcc 900
aaggtggcag \ attgctttgag \ cccaggagtt \ tgagccagc \ ctggggcaaca \ tagtgagcc \ 960
ccgtctctac @ aatgaaaagaaagagagaagagagaagaagaagagagaggggaggggagagagga1020
agtgaaggaa ggaaggggg agggagggga aaagaaaaagaｇgaaaaaggaaaa gaatatagatat 1080
attgttatga ccttcggggta ggcaatttttt ttttttttcc ccaacggggac acaagaaatc 1140
agataaaagac \ cggggcgcggt \ ggcttacacc \ tgtaatccca \ gcactttgag \ aggccgaggt \ 1200
gaatggatca \ tctgaggttg \ ggagttcgag \ accacctga \ ccacatatga \ gaacctttgt \ 1260
gtctactaaaaaaaaaaaaaaaaattagccacgcatgggtggcgggggacctgtaatccccagcta1320
ctcgggaggc @ tgaggcagga @ gaatcccttt @ aaccccgggag @ gcgggggtta @ cagtgagccg @ 1380
agatcgagcc attgcactcc agcctgggca acagaagcga aactccgtct taaaaaaaata 1440
atatatgtat @ atatatatca @ gataaaaatc @ agagaaaaata @ catataattt @ ggactacagt @ 1500
aaaattgtga \ ctgtctctttc \ atcagaagat \ gccatttggct \ gggcacagtg \ gctttgtgcct \ 1560
gtaattccag \ ctacttaaaa \ ggctgaggca \ ggggggggtc \ cctttgagcct \ aggagtttta \ 1620
gggtagcagtg \ agtgagctgt \ gatcatgcca \ ctgtattcca \ gcctatgtga \ caaagcgaga \ 1680
ctgttgaaaa gtgccatttta cagtcaaaag gcagggtaca gattatagagaa tatttacagt 1740
gtttatatga caatataaaａataacttta caatttggta agaaaaagac aatcagacac 1800
tggagcagtt actcgcaaaa agatgatcaa attgggctg ggcgcagtgg ctgacaccca 1860
taatcccggc actttgggag gctgaggtga gcgatcacc tgaggtcagg agttcaagat 1920
cagctttggcc aacatggtga aacatggtct ctactaaaaa tacaaaaaaat tagctgggggg 1980
tatttggtgca tgcctgtgat cccagctatc tgggaggttg aggcaggaga atcacctgta 2040
cccggggaggc @ ggaagttgca @ gtgagctgag @ atcgtgccat @ tgactcccag @ cctgggcaac @ 2100
aggtgagac tctgtctccca aaaaaaaaaaa ggaaaaaaagataatcaagta gccactaac 2160
atgaaaaaaat \ gcttaacctc \ atttagttatt \ gtgaattattc \ aaaccataat \ taaaattttg \ 2220
tacaaaaccca \ gtagatatagt \ taaaactatt \ agagtgaca \ acaccatttg \ ttgggtgagga \ 2280
tgtgggagcaa caagaactact catacactgc tgggtgggaat gtaagttttat actactggaa 2340
aactatggg catagtattat taaattctca catattcata ctcttttattc agcaattttca 2400
ctttcaggta \ tattccccagt \ agtaatat \ atgcatacca \ aaagacattt \ ctagaagaattct \ 2460
tatataactgc \ actattttgta \ aaagccaaaa \ cctaatgtta \ acctaaatgt \ cttatcaacag \ 2520
tagatatgat aaaataattc tggtattattt gcttaatgga gtactatgca gcagtgagag 2580
taaatgacct agtactatac tcagcaatat aggtgaatct cacaaagagc ataggaagcc 2640
agatacaaaaa \ gagtataattct \ acgtgattta \ taatatagaat \ tattatttgtt \ aaattataaaa \ 2700
gttcagagac tggcaaaaact catcaggtgt gatatgaatt aggataatgg cagcattttt 2760
gttgtggggga gtgatttggaa ggaagcccaa aggggactc tggaggttttg gtgttgtttc 2820
ttggttttgggg \ tggttaaaa \ tgtgtgtttca \ ctttgtgaaa \ acttaggtgaa \ ctgtgcatac \ 2880
atgattatagａcatttttctg tattaattgtt gtattttcaat gaaaagtttta cctgaaaaatg 2940
aagccagcat \ gtgacagctct \ ccctttttcct \ tcactcaaaa \ gaagtgactg \ agtatattttt \ 3000
aggtaatcac aataattattt aggaattttg aaattcttagａtgctgtaaaaa tatttgttttta 3060
ttaaaaaaaaa @ atttttttag \ agacagggtc \ tcgctgtgtc \ accccagctg \ gagtgcactg \ 3120
gtgtgataat \ agctcactgc \ agcttccaac \ tcctgggctc \ agaggtcct \ cctaccttttg \ 3180
cctctcaat \ tgctggggat \ ataggtgtga \ gccaccatgc \ ccagccttaa \ aaagatatta3240
gtaagcaaga \ tcaatgcgg \ taagcggagg \ aaattatttgt \ atgagtgaat \ ttttgtatttt \ 3300
tacctgagag \ taaaaaaaaaa \ aaaattttaat \ tctaaaataaaa \ acttaggacac \ agttattatt @ 3360
ctgttatata \ aaagtagctc \ taactttgtg \ aattttactta \ atataaaatt \ taagctctga \ 3420
gctgttattaa @ attttttcaa tgaaaactg @ tatttattaag aaattgtcat @ aaaatttcttt @ 3480
tgacctcaca ggccaactgt gcaggaagat gggggggatg taatctacaa aggctttgaa 3540
gatggcattg \ tacagctgaa \ actccagggt \ tcttgtacca \ gctgccctag \ ttcaatcatt \ 3600
actctgaaaa \ atggaatttca \ gaacatgctg \ cagtttata \ ttccggaggt \ agaagggcgta \ 3660
gaacaggtat \ gccaattata \ tatgacagtc \ tagattttttt \ tcatttttttc \ ttttttctttg \ 3720
tagatacaaaa ggctggaat agattgttag gcaagtattt gaaaaagaagt tcatgaccta 3780
gcttttttttt \ caagggctggg \ attttttgtgt \ tgcaatttttt \ atcagacttg \ aagtctctta \ 3840
ttttagaagt \ aattttggggc \ tggggcgcagt \ ggctcaaacc \ tataatccca \ gcactttggg \ 3900
aggctgaggt gggtggatca cctgaggttg ggagttccag accagcctga ccacatgga 3960
gaaaaccccg tctctactaa aaattacaaaa ttagctgggc atgggtggcag acgcctgtaa 4020
tcccagctac ttggggaggtt ggggcaggag attgctttga acctggggaggg cggaggttgc 4080
ggtgagccga \ gatcgcgcca \ ttgcactcca \ gcctgggcaa \ caaaagcgaa \ actccgttca \ 4140
aaaaaaaaaaaa \ aatgaagtaa \ ctttataggttt \ atgagaacct \ actatgtgcc \ agggcattttt \ 4200
gctcatttca \ tcttctataatg \ acacagtgca \ ttaagtcatt \ cccatttttgc \ actataaggtt \ 4260
acagagactc agagggcata ttgctgccct gattgcaaaaａaaattattgaa aaaggtttaa 4320
aatgtaacac agtgtttttat agatgagatt tagaaattctt tagtggaaga actctactact 4380
atcatattta ccaattttttt ttttttttttt tttttagtaga cgggggtctttg ctatgttgcc 4440
cagttggtc \ ttgaattcct \ ggcctcaggt \ gatcctccca \ aaagctgggg \ attagaggatt \ 4500
aacacaactg \ gcctaatctta \ tgtatttctta \ aatatgcaag \ caagaagccc \ attagaagaat \ 4560
catttttgt tgttatactactg agtagattc tagagcttta cgtgtaggacac atatcaacaａｃ4620
tttttttttttt \ tgccacaata \ cctaaggagt \ ataacacagc \ acctttgtcat \ cagtaataat \ 4680
gagtctcact \ gcagtgattc \ tcaaccaaaaaa \ agcatggcct \ tatgggagaga \ gattattcaag \ 4740
gagtgagggg @ attgtgtggaa @ attagaaatt @ tccaaccccac \ agaatttcag \ gtaattcat @ 4800
ctttttttttt ttttttttttg agacagaatc ttgttctgtt gccccaggctg gagtgcagtg 4860
acacgctatc \ tcggctcact \ gcaacctcca \ cctccccaggt \ tgaagcagtt \ cccatccctc \ 4920
agcctcatga \ gtagctgggga \ ttacaggcac \ atgccaccat \ ttttttgtattt \ ttgttatttta \ 4980
gtagagacgg ggttttcatca tgttgccccag gctgattttca aactcctgag ctcaggcaat 5040
ttgcccgcct \ cggcctccca \ gagtgctagg \ attacaggca \ tgagccaccg \ tgcctgcca \ 5100
cctcaggtaa \ ttctgtgccc \ ttaagggctc \ cattgggaat \ actcatccct \ tgggttagtat \ 5160
taaaattcat \ ctgttccaca \ gtgagcaggt \ ctatatagac \ ctatccccaa \ agtcttaggg \ 5220
agctgagagg ctgaagagag aggctggcaa atccagtttgg tcagaaaaagaa acatttaataａｔ5280
gggactggg aacagaagcc atttatcggg cagctgcaag atgatgggatt cctgcattgt 5340
tacccgctag \ actcagggct \ tatataccag \ gaggaatggg \ tatacatgct \ tcagaagata \ 5400
tgtgtaggac aattgaagtc agcccctctg gaaaaggcaa gaatgctattt tgcctaatag 5460
cctatatttt \ gcttaagggc \ aagatattattg \ ctatagtattgt \ gtttgttttag \ gataacacatca \ 5520
aggtatttttt \ gacctaaaagg \ cagaattatag \ tagaaactt \ agaggcattc \ ctagaactga \ 5580
gggtaggtcaa tgtggcagat tagcatccaa gatggagttgｇctttagcctc caccaccatcg 5640
tttttgtcca \ gtcatcatgaca \ tctcctctttt \ gaagtttttta \ tccatccccc \ acttggaatt \ 5700
aagttcttctｃttgacaggtc caagcttct gtttttgctt tatgttttatg tagcttctg 5760
tatctgttttt agcttttatgt ttacgtggaa gctccctaag agacttgaaaa tcatatccaa 5820
gtctttgtgtgt tcctctgcaa caactagctg tgtgccttac aaatgtccta tacatgcttt 5880
gtattaagta \ ttttgggaata \ ttattccaaa \ ttaaggaata \ attctgccta \ aaaatgagt \ 5940
tggtttgacaa @ attttttttg @ attggggtatt @ gttgaaattg @ gattgaaaaaat @ attatatttct @ 6000
tggaaaaaa \ taccaatttt \ tactcaacca \ aaaagacagc \ ctatgaaaaga \ attctttttttc 6060
tatttatttgt \ ctcagacatcag \ agccagaatc \ tggatttttt \ tttttttttttt \ ttgagaggta \ 6120
gtttactct tgttgcccag gctggagtac aatggctcga tcttggctca ctgcagcctc 6180
cacctcccga gttcaatga ttctcctgcc ttagcttccc aggtagctggg gattacaggc 6240
gcgcgccacc acgcctgggtt attttttata tttttagtag agatggggggt ttcgccatgt 6300
tgaccggggct ggtcttgaac tcttgacctc aggtgatcca cctgcctcag cctcccaaag 6360
tgctggggatt \ acggcatga \ gccactgtgc \ ctggcctaga \ ttttttttttt \ aaaaaaaaaaaa 6420
cctacttttg \ ttccattattc \ atcttatatgc \ cttaaaaat \ tatgttagttt \ gactatttgg \ 6480
tggatttgact \ gaggaactt \ ttttattcaat \ tgtccagggt \ agggtgatga \ attggccttc \ 6540
agtaggaaaa \ ctttgaatttgg \ catcttaattg \ tagtagggtgt \ gatgaggaga \ aaaaaaactt \ 6600
cttaggttta \ tgtaactttt \ tcctctctcca \ atggaggttag \ tctgttattct \ tagtaataca \ 6660
ttaactcatg \ gaaaagataat \ agctgttgta \ actatttcct \ gaggcttaaaa \ atgattcttttt 6720
atctcagtaa @ gactaaaa @ atttagtcct \ aatatggtgg \ ggttttttttg \ ttttgtttttg \ 6780
ttttttactt tccttttggggga tttcattttaa taaaaaaaa tgtttttttaaa aataaatttt 6840
ggttaggctt cacagaatat atttaagtaa ataagatgtt ttttgaaaaaaa agaaaaaaagtc 6900
attacattata \ gtctttatggc \ tagagaatac \ cagttaattt \ gtttttttttt \ ttttgagacg \ 6960
gagctttgctｃctatcacca gccggagtgc tctatacca ggcactagggc tcactgcaac 7020
ctccacctcc ccagttcatg ccattctcct gcctcagtct cccggggtacc tgggactaca 7080
ggcgcccacc accacgaccg gctattatttt tgtatttttta gtagagacgg ggttttcactg 7140
tgttaggccag \ gatgtctttg \ attcttctgcc \ ctcatgatct \ gcccgcctca \ gcctcccaaa \ 7200
gtgctggggat \ tacaggcgtg \ agccaccgcg \ cctggcccca \ gttaattattt \ tatagcttttt \ 7260
tctgcccagc \ tgagactctg \ ctatgggtag \ cctctttgag \ acagaggagaa \ gtgatcaatg \ 7320
ctttaatttaa \ ttttcaaaa \ ttttaattttgc \ ttttattttatattttattttttt \ ttttttgagac 7380
agctctcgc tgtgttgccc acgctggagt gcagtggcgc gatctcggct actgcaagc 7440
tctgcttccc aggttcacgc catcctcctg cctcagcctc ccgagtagct gggactacag 7500
gcgcccgcct ggctaattttt ttgttatttttc agtagagatg gggttgcttt tatgttttta 7560
ggataccgggg ttattgattca acctttgttc ttttggggctg ttgatatagattt tattcttact 7620
ggctttgtcat gcctcattat agaggttatc aggtaaagaa gtatatattaa aatcaggaaaa 7680
acacaaaaat \ ctatacatttt \ tcttaatttct \ taatttgtct \ ttgtttttttg \ gttttagtagtt \ 7740
atgggatgat aatcagatga aaaagaagca aactcacttt aaaataattct ggatttttttt 7800
tggggcataac agtcagactt gttgataata tatatcaagt tttttattatt aatggtgaｇ7860
ggaacttga @ gattataaaa @ atgctcttt @ kagagaatga @ tatataatata @ ttgcatgtttt7920
gcttacctc @ atatgagtta \ ttttaacct \ ctttgaatcat \ ctttctgtaca \ cgtgggatttt \ 7980
atccaaggat @ attttttattt @ ttgtccctca @ tttcccatgg @ ctcctttcttt @ gcatatgtgt @ 8040
gaaggagttt \ aaaatactatt \ tccccccatc \ taattttattt \ actttttttcc \ atacaggaag \ 8100
aaaacagaatg \ cttttttagaa \ tattcttaaaa \ tagctttttg \ tgaaattattct \ aaaactattt \ 8160
ttactgaagt tttttagctta agaaaagagtt aaacaagctct gtttttaaaaaa tggtatctggｇ8220
ctactagccc ccaattaagt agcaaaaac tgcttaagac caaaaaaaag aaaatcaaaaａ8280
tgtccggggta tggtggctaa cgcctaat cccagcactt tgggaggccg aggtggggcag 8340
atcacgaggt \ caggagttttg \ agaccagcct \ gaacacaatg \ gtgaaaacccc \ gtctccacta \ 8400
aaaatacaaa aattagccgggｃgcgggggggc acgcgcctgt aatcccagct acttaggag 8460
ctgggcagg agaactgcttt gaaccccggga ggcgggggtg gcagtgagct gagatcacgc２０8520
actgcactc cagcctggggg gacggagcga gactccatct caaaaaaaaaa aaaaaaaaa 58080
aaaaaaaggtg aaaaaactga aaaactactc cccagaattctg gacaagtttt ctattggtta 8640
agtagggagat \ ggccaaattta \ aaaaaactgc \ ctcagcatgc \ ccagcctttta \ cctttatcaat \ 8700
cagaattgct gaagaaaaaga gaagaagctgt ctttgggtcct cccactgggtt tctgactcag 8760
agatccaaaaaa \ tctgtaccat \ gccagaaggtg \ tgcatcatta \ ttttttgtact \ ctaggggtac \ 8202
tgctttttttca ggtaggccaa agagtgattt agcctctctct ctcattttttc tacagttaatt 8880
cagactactcc agttaacagaa aaattacaggg aaaaggaaaaga tgggaaaaat agttgtgatg 8940
cattgcatct ctggaatttct agtccctcaa attagagaga ttaagatagtt gatggaaaca 9000
ggaagaactc tagcagttgt gagtgctgggg aattgaagtt tttacttttta tcctttggtt 9060
actgacca \ aattagtaggg \ ttggagaatt \ cattccttga \ gatcatcatgt \ atgaattttaa \ 9120
tttagact gggaatttct tcatagcaa ggcaacttaa cctgccctttt agttgaagct 9180
acaggaattt gacatcgtgg atgagatca agtaatggca gattttgtat gtggccatga 9240
aataagtggc @ tgaattggat @ gaggatttag @ ttttattagaa @ gagaggaat @ tggcctggcg @ 9300
cagtggctca \ tgcctgtatat \ ccccactact \ tggggggctg \ aggtggggtgg \ atcactgag \ 9360
gtaaggaatt \ cgagaccagc \ ctggccaatg \ gtgaaaacctt \ gtctctactacta \ aaaatacaac \ 9420
aattagccag gcaaggtggc atgtgcctgt aatccccagct actcaggggg atgaggacag 9480
aaaatccctt @ gaacctgggga @ ggcgggggtt @ gcagtgagct @ gggatcgtgc @ cattgactc $ 9540
caacctgggtt gacagagcga gagctctgtct caaacaaaca aaaaaaaaaa cagagaattta 9600
ttcaattgag aggccaaaga ggaagagagg aaaagattttc tacaaaaagca acagccatga 9660
agaacagagga ggaaaggtgt gggaagaaca ttctagggcat aaagaacagta taatcagaat 9720
tgtaaggtgtg aaattgtattt gggaccaccca agaaactag tatggcttga gtataaggtg 9780
aaaatggtgc @ atgagtaggc @ agtgtagtatatagaggtgc @ cacagaaact @ ctttgtttgcc @ 9840
tacccaacat \ acacccctacac \ ttctttgttatta \ ggaaggactt \ ctcagtaggt \ ctcacctcag \ 9900
tcccggggga \ tagttatgat \ taaccacctc \ actttaactc \ cattttttttt \ ttcccaatcat \ 9960
tagtctgtggg gtagccatat gacctagctc tggccagtaa actggaagag aaaagtctatt 10020
ggagaattct ggaaaagattg tctttcctag ttagagagt gtgtatgttga gttaattctct 10080
ggaaaagagg \ ctctttttttt \ ttttcctccat \ ccattccttt \ tcttcctgct \ tggtactactg \ 10140
tagggtgtga tgttcaaaagc aatgacagtc aactttaat catgactaaaa aggtgtgtca 10200
ctgaagatag caagagcaa agaaaagggtc tgatcctttg gccttgcacg gtggctcaca 10260
cctgtaatcc \ caccactttg \ ggacaccccag \ gcggggtagat \ cacttggggc \ caagggttttg \ 10320
agaccaggtgt ggccaccatg gtgaaacccc attctctact aaaacacaa aaattagcct 10380
ggtgcagtgg cacatgccac ctagtagtcc cagctactag gaggtctgag gcttgagaat 10440
cactgagcc @ tgggaaggtgg @ aggttgcagt @ gagccgagat * cacatcactg @ cactccacca @ 10500
tggggcgacag caagactctg tctcaggaaaa aaaaaaaaaa gggtctgggat ccttgaggca 10560
ttgtttggcct ttttggccaga ctagagaattta ctcactttca gagttttatat gatgtgagat 10620
aaagtttttt ctttgttttag cttattgttat caggtattct gtaacttgaa gctgattgca 10680
ttctgagaga ctgggtaaatg @ atgggagact @ tggtaaatac @ ttttaccgat @ ttttcattttg @ 10740
tggtaaactg ccaaatgtca acctaaaat gaaaaacaggc cggccgcggt ggctcaccacc 10800
tgtataattcca \ gcactttggg \ aggctgaggc \ gggtggatca \ cctgaggtca \ ggagttcgag \ 10860
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ttaattattt @ gaaccactat \ tcaaggtta \ agtttaatca \ ggtaatgggtt \ ttttattctgg @ 11160
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agtacatgct ttttttttctc agaagaagatg atgacataggg ttgactgtga gggaatgtat 23460
agaggtgtca tgacttaact agtgatttga gctccagaat gttaaatgtg caagagaggt 23520
gtcatggagc cccttcttagt ggcaatagtt acagtaaagt aggggagaca tgaaccaatt 23580
aaaacacacaa @ attattgaaaa \ gtcttaatttg \ ttttcactcca \ tatgttatttt \ ttgttatgtgtt \ 23640
gattttatttt @ attttacttt \ tacattttttt \ attttttttga \ gacagagctct \ actctgtgtcg \ 23700
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gctcaagtga ttctcctgcc tcagcctcct gagtagctgg gacaggcacg cgtcaccatg 23820
cctggctaggg \ attttttgtat \ ttttaattgga \ gacggggttt \ caccatgttg \ gccagggctga \ 23880
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gtaaaaaaat @ aaataaaattacaggcacattagcatgtgcc @ tgtgggtccca @ gctacttgg @ 24360
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gttagttttt \ aattattattt \ tatttattattc \ aaatttttaat \ agagagggg \ tctttggtatg \ 24960
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atttttggatc \ catgggttgtt \ tgagtccatg \ gatgtagaac \ ccatgggtac \ aaaggggtga \ 88080
ctgtatcaga \ agcagtaaga \ ggaatcaaat \ gtatgacaaaa \ ggaataagac \ aataaaagaag \ 86940
gacaaggcag @ attttaggaaa @ ggactgaaaa @ tgaatataa @ caattgaaat @ tagatatgat @ 87000
aaaacattatta ggcccagctg agaagagaat tagtgaacaa aaatagaggt ctgaagaaat 87060
aatccagaat \ gcagcattta \ ctatagagag \ tgatagaaaaa \ tgagaaaaagt \ caaaagttct \ 87120
tgactttttaｔgagaattttcｔtagaccagat taagaggcaaa tcctagagaatt tagagtgctt 87180
cacacatcttt aagctgataaa agagaaattg cattcttaaaa cacattgttt tgaaactgaa 87240
cacaaaatag @ gaagagctct @ aaaaaacccag @ agagataaga @ ctaccccacaa @ aaagtcata @ 87300
attagactga cagtctatttt cccactactca ccagtggaaaa caaggcaat ggaactattt 87360
caaagtgctg aaaaaaatat tcatgaaact gaatttgaag actgatgggga aaaattgtgct 87420
atctgatgaa taaaaactgg gactctact aaaattcttcc aaagataaaat gctagaggtga 87480
tggaaaaatga \ tccccaaaaag \ gcttaagata \ caacataatg \ aatggtgggtt \ ggggtgtgtgtg \ 87540
gcacatacct gtagtcccag tactcagga ggctgaggca gcagatcac ttagccaag 87600
gagttcaagg ctgttaggtga ctatgatcat gcctgtgaat agccactgca ctccaggcctg 87660
agcaacatag caagatccca tctctttaaa aaaataaaaaa gaatggtgag cgaaaaaaa 87720
caaaactact ttaagtgagg gtaaattctaa agcactaacg gtctaaaaaca gtataatttt 87780
aggcctata aaacaatcca taatgaacta aaattgctaga caataattt gtaacttagg 87840
agtagatgag cagggttaaa acataaggtt ctttttga tgtggcaaga gggtaaagat 87900
aactctgac \ ttttgtgaagt \ taaatatgga \ tatttaaact \ ttttagaaaaa \ cttagatatag \ 87960
agaatatagttcccaaaagtaacaagaagaaaaaaatggaatttaggaaatcccaagtacat880020
tggtaataat cacaacaagt atagaagaca tctaaaacac agggacacag aaaagttgaa 88080
tgtgaaaaggc @ tggaaaaaaagg @ taaccaccggc @ aaatcccaac @ ccagaggaaaag @ atggcaagct @ 88140
acatgaatat \ gacaagatag \ actgtaagtg \ aaaatgactt \ atttgaaaaat \ agtgcgtcttt \ 88200
ccatggaaaa gtttgggtagc ttctcaaaa gttaacatg gaattaccat acgaaccagc 88260
agttccactc ctaggtatat acccaataga actgaaaaaca gaaactcaggg tactgtaca 88320
ccaattgttta \ tatcagattt \ acttaacaca \ gccaaaaaggc \ ggaaaaaccc \ caaggtgtca \ 88380
tcaacgaatg aataaaaggaa atgtgatata tacacacaat ggaatactac tgagtcataa 88440
agggaatga \ agtcctgata \ actcccaat \ catagctgaa \ cctttaaaaaa \ ataagcaaaa \ 88500
taagccagac @ attacgaac \ aaattatata \ tgattccatt \ tatataaaat \ attctacaata \ 88560
ggcaattattca tagagacaga agattaaatta gagattaccca gaggctttgaa agaggaaaa 88620
atgggggagtt attgcttaat agatacagag ttttcatattt ggggtgatgaa aattttgaa 88680
gattgtagtt ggtgatcatt gcacaactt gtgaatgtaa ttagtgccac tggattgtac 88740
actgaagaat \ ggttaaaatg \ gcaattttta \ tgttattatgt @ attttaccac \ aataaaaaca $ 88800
gtttaagact ggatgtaggtg gctcgtgcct gtaatccaag cactttggga tgctgaagct 88860
ggagcatcac ttgagctcag gagtttatac cagcctgggc cacatagtga gttcctgtgt 88920
ctacaaaacaa aaacaaaaaaac aaaaccctt aactgggtt gggtggtgcat ctgtgggtccc 88980
agctactcag \ gaggctgagg \ tagagaggatc \ acttgtgcca \ ggagctttgag \ tctacagtga \ 89040
gctatgattg \ taccactgca \ ctccagcctg \ ggtaacagag \ caagaccctg \ tccccaaaaaa \ 89100
aagtttaaaa \ agcattact \ agagacaaaa \ attgttaccca \ tcaatgata \ aaagtttcaa 89160
ttcaacgtt @ attgcattta @ actattttgc @ caatgggtga @ ataattcttt @ gtctctcatt @ 89220
atgggttttaa \ ttttattattc \ cttttttttct \ ttttttggag \ atgggagtcttt \ gctctgtcac \ 89280
cccggctggga gtgcagtggc gccatctcgg ctcactgcaa cctctgcctc ccgggttca 89340
gcgattctct tgcctcagcc tcccgagtag ctgagactac aggtgagcgc caccacgccc 89400
agctgatagt ttgttattttt agtagagacg gggtttcacc atttttagcaa ggtaggtctc 89460
gactccctga \ cctcatgatc \ cgccccacctc \ agcctccccaa \ agtgctgggga \ ttaagggcgt \ 89520
gagccactgt gcctggccta tatttccttg atttattaatg atttgagcatｃctttttcatat 89580
gtgttatttgac \ tgctttttttt \ ggtgatgaat \ ctgatcaat \ ctttttaaaaa \ tcagtttttta \ 89640
aaaattggat @ gattttattgt @ tactttttta @ acttggggg @ gtttttttaca @ tattctgaat @ 89700
tcttagtcttt \ tgttgtgtat \ tgcaatatg \ ttctcccctt \ tgtgacctgt \ ctttttcattc \ 89760
tctttttttgtt @ attgtataga \ atttctataac \ tttaatgtag \ tcaatttgat \ tacttattttt \ 89820
ccctgaattt gtgctttttat gtacttgtt caaggaatcc ttcctaggtc ttaaacatat 89880
cctcctgtat \ tgtttttctaa \ aacccctaaa \ gctttttccttttcatcctttgg \ atttttttagtt \ 89940
cacctgaaat \ ggattttatag \ ttttgatatga \ tgtaggaatt \ catttttaact \ tttttttttttt 90000
tttttttggcc \ ggggcatgggtg \ gctcatgcct \ gtaatccccag \ cacttaggga \ ggccgaggtg \ 90060
gatagatctc ttgacgtcag gagttcgaga ccagcctggc caactattaca aaatcccgtc 90120
tgcattaaaa \ atacaaaaaaat \ tagccaggca \ taggtggcgggg \ cgcctgtataat \ cctggctact \ 90180
cggggggctt aggcatgaga atcgcttgaa cctggggagc agaggttgca gtgagccag 90240
gtcacgccat \ tgcactccaa \ cctgggttat \ agagccagtc \ agtctcaaaaaa \ agaaaaaaa90300
caaaaaacaac \ aaaaaaaaaaa \ actttttt \ ttttataatgaatatcccctat \ ttcccagcat \ 90360
gttttcaaaa \ aatcccatcc \ ttttcccaatt \ tctctgcaac \ gtcacctctc \ atatcaagtg \ 90420
ttcatataag \ tgggttttgtt \ tccatggggt \ attttgtctct \ gtaccacaattc \ aactgtctct \ 90480
gcattattgta \ gctttataag \ aagtcttgat \ attctggtaggg \ gcaaccctcc \ ttttcttact \ 90540
gttttttcttc agaatattct tggcttattct ttttctttttc aatttatata aggattttag 90600
aagcagctttg \ tcaagttaca \ caactgctga \ ggttttttatt \ ggaattgcct \ taattatata \ 90660
gatgaatatg \ ggggagaattg \ gcagttttac \ aattgtgagc \ ctttccaggct \ atgcatgttgg \ 90720
tttgagcaca tctctgctta ttttgtgtctc attaattgact ctactatttct ataatttttta 90780
tctagaggt \ ctgtttgtaga \ ctgaatatg \ acttccaaag \ atatcaggtc \ ctaaccctgg \ 90840
gaccttgttaa @ attgttacctt @ atatgggaaaa \ gagtatttgc \ agatgtgattt gagttatagga 90900
tcttgggatg \ cagaggtttt \ cctggattat \ ttgggtggggg \ cctgtaggta \ tcattgtaag \ 90960
aggggggcag aaggagattt gacacaaaaga ggagaaggca cttaaccaca gagtagagaa 91020
ctggggggat @ gcagccacaa @ gccagagat @ gccagcagcc @ accagaagctct @ ggaagggaca @ 91080
agaaaagattt ttcccataga gctgccatac cagcatccac tcagtcatac tgacttcgga 91140
cttctgtgtct \ ccagaacacac \ tgtgaaaagga \ taaattctctg \ ttgttttttag \ gtcaccagt \ 91200
tagtggtaac ttgtttcagc agccacagga aacaattcag aggtttttgca catctttcgt 91260
tattattatt \ cctaggattt \ tgattattttc \ tgttgttcttt \ aaaatgatat @ atttttaaaa \ 91320
gctgtttttgtt @ gctgttatgg @ aaaattccagt @ gaattttgct @ gtgttgatttt @ ttgtttgctg @ 91380
caacttgct \ aaactactt \ gttaatttta \ atggatttttt \ ctaggtatat \ actcatatta \ 91440
cctgtgaata \ acagcacgtt \ tgtttcttttt \ cttttaattct \ ttacgattttt \ ttaaaaatt \ 91500
gctctacagt gctgcctagg gcatcccattaｇcagtttgaacａtgaatgggta atggaaaacat 91560
ctttgtttttg \ tccctgatct \ caaaggaaaag \ gtttcaacat \ tttatcattatatatttactgt \ 91620
agactttttgt agatactctc tatcaggtta agaacttttt tcttcttcttt cttggttct 91680
aagggtaggg gggtttttttg ttttgttgcttt ttttgctttt gttttttgagc agggtctttgc 91740
tctgtcactc aggctgggagt gcagtggcgt gatcctggct cactgcaacc tccacctccc 91800
tggttcaagc \ gattctcatg \ cctcagcctc \ ccaagtacct \ gtgattttcag \ gtgcctgcca \ 91860
ccacgcctgg \ ctatatttttt \ tgtatttttta \ gttagagacag \ ggttttcacca \ tgttgggccag \ 91920
gctgggtttttg \ aactcctgag \ ctcaggcagt \ ctaccccgcct \ cggcctccca \ gagtgctaggg \ 91980
attacagggtg \ tgagccacca \ cgcctggccg \ aaacatcatc \ tttagatctc \ atagttttat @ 92040
tgtgtccattt gtacacctc aggcaacgt gtgcggggagc cacgactctg tcttcctgga 92100
ggggggaaatg ttcattgaaaa ttttgttcagg accattttttc tcttttatata tgtgggagaga 92160
gccactgaaa \ tcttattgttt \ gaaccttgtt \ atggggagga \ gcactgtgtgg \ ctcacgcaga \ 92220
cctgggctcc agtgaaaaaa tagggggcaaaa aggaccttgc atatagttgc ttatatatttｔ92280
ataactacttt \ gaagaaaagta \ atgatgtaaaa \ agtccagatt \ tatgctaata \ ttttgttttag \ 92340
cttctctttttc cctgctctga ggatttggtgc tagagctaaa gagagagaca tcattttctc 92400
agtgttatgtt ttggatttgaa accaccaggat aagccagtttt gcccttatctct gaaaagtcatt 92460
ttgattcccg tctacccctgg gttgagttag aaatgtgtga aatgaatcct gagttgaggt 92520
gtgaaaaagc aaatgaagat cttacacaca tattcattga agaaatgtct ataaaaagggc 92580
ttttaatgct gcaatatagg taacatgtgt aattacctgta acatgtggaa ggtaaaaactc 92640
atcagaaatg tgaatgggaaa gtagaaaatc agagacagaga gacagcatta tttattctct 92700
attaaatgaa @ gaactttaaa @ aacgttgaaaa @ agtaagcaaaa @ actatggcca @ gccaagtag @ 92760
agaagcagag aaaattaccaaa actgccaaa ctcaataaat aactttaact tgggttatttg 92820
caacatcaca gttatctctgc aggtctggtt ccatatcagg ctgtttccct aatgttatctc 92880
taggagaaca \ ttttcaagtca \ agacatact \ tttatgctcag \ ccataaattct \ catgcttttat \ 92940
acgcttgaaaa \ ataataaaag \ ttcttagagtc \ gagttaattt \ actctcttttc \ ttttatatta \ 93000
ttaatgctcc \ catccttttttg \ gagattgggaa \ tgtgggaatgc \ aatgtggcaa \ attattaaaaaa \ 93060
gtgggaaaaag @ atgttaggaaaa @ ataattctgatgtcaattttttcttttccccttggaggtggagca93120
atccttttccc ccagagctca ggcccagcttt ggcttctcgg cagcctcagg cggccacacg 93180
gagggggtgg ctctcccacc tgccttcttg aatggggctct ctcgatggga gaggttgag 93240
aagggacccc @ acttggggct @ aagtggatac @ agagtgtctt @ ggacatgtcg @ gaatgggggcg 93300
gcctggccacacccaaaagacttctttgtgggggagggcctgag gagcttcctgcagggcagaa93360
atgatgagtt @ tgccctcagc @ cacaggagga @ 93390
<210> $ 23
<211> $ 2688
<212> DNA
<213> \ Homo \ sapiens
<220>
<221> @variation
<222> (2251)
<223> Description of version: single nucleotide polymorphism involving replacement of of (C) and (T)
<400> $ 23
gtgggggctc \ tccactgggac \ tgggccagct \ ctctcctgct \ ttttccccatg \ catgcccacc @ 60
tcaccactgt ctgccatac cagtgatggga tggtctgggcc agtgaggtggc tgtgaccaca 120
caccctcccc cggggccccct gtggggaggtg caccacttg gaagaggct ggtcagcccg 180
cagctgtccc acacactct ttggtggggccccagggaccc actgctgt gagcagcack 240
agatcctagc \ ctgggagctca \ ggggggagtac \ tcctggtggga \ catccctgggg \ gcagggtttc 300
cccagttttct gcggccaagc agctccgatg ggaactacct gaggttaggtt caggtctcat 360
aggggcagggg cacagctttc cataagactg cccttgattc agcacctgtt tgcaagccag 420
gggtccaccc \ acactctga \ gcaactgact \ atgaatccaa \ ggattcccac \ tctcccctga \ 480
agttcagtaa \ ttttcttagaa \ cgaccccatag \ aactcatgag \ atgactatat \ gattacagatt \ 540
ttattataaaa \ agataataat \ cacagcccaac \ ccaaaaagaag \ agacccctag \ ttttgagggcc \ 600
ccagatgtga \ agctttgtgtc \ ctcagatgt \ gtcacccctcc \ cagcacgtca \ ctgtgtggtcg \ 660
cccggggagct cccctgagct gctagctcca gtgtccagag ttttgtatttgt ggtttttatta 720
aggtagggag @ atggaggtgaa cccattggcca tgtgatcgaa ctcagtcgcc @agccccactt 780
ttgtcctttgg \ aggttggggag \ gtcagactga \ caggctcatg \ tctcaaaagcc \ ccacctctct \ 840
aatcatgtgg ctgggccttttc tagcagggcc agacgccatc ctgggaactat ctacaggccc 900
accacgagtc \ gtcaccttag \ cataaaagtca \ ggtatagtcc \ aagggacctc \ ccataaaaata \ 960
caagaggtct ttttgtcatat gggaaaactcc agaagccaggg agctccctttc ctgggaaccgg 1020
cccacaagac caaccaatg cttttgtacac agcagctgcc cctgaggtagg aggggagaggt 1080
tcatgaagtt @ tcgggggaggt @ gaaatccaat @ gaggtgcccc @ atccagatgt @ tgccacctgg @ 1140
ctcagcacag aggtcagagt gagggtataa aacacaatgg catcattttcc ccacttaaaa 1200
ccctcccata \ cctgcctgtc \ aagccacaga \ gaccccacagt \ cctgcgttat \ ctggccctttt \ 1260
cctcctgttt \ cagtgagttc \ caggcactcc \ agcctttcctt \ ctgcgtccca \ ctctcattgc \ 1320
gccccgcgccc gcctccggggc ctttgcgctg gccgctcctg ctgtctggaa tgcccttccc 1380
acagaatgct @ ccgccgagggg @ ttgtcccctc @ atcatttagg @ gttcagtcca @ gattgtccct @ 1440
gttttttgaga gagctttgga \ gacctcacca \ gtctcccat \ gacattatcc \ tgtttttctag \ 1500
ccttgggtggc @ atttctttttg \ atttcatttt \ ttttttttttt \ tgtgacgggag \ tctgggtctg \ 1560
tcgccccagcc tggaggtgcag tggcgcaatc tcggctcact gcaagcttccg cctcccaggt 1620
tcacgccatt ctcctgcctc agcctcccga gtagctggga ctacaggcgc ccgccaccgc 1680
gccccggctcaｃtttttttttat tttttagtaga gacggggttt caccggtgtta gccagggg 1740
tctcgatctc ctgacctcgt gatccgcccg cctcagcctc ccaaggtgtt gggattacag 1800
gcgtgagcca ccacgcccgg cctgggaattc attctttattt cttggtttgc ttgtcttaggt 1860
tttttttttc \ taccactaga \ ctatgagccc \ cgtagaggtt \ aggagtgagt \ ctgccccgct \ 1920
ctcggcaagg cacaatggg tgccaatga tgcagcagga tggcaatctc cttaccaggg 1980
aagggggaagaaacccccaaaaagcatcagaactttatcctttcccaagcattttgtgtccc2040
acacatacca ccccaccat gactccagca aatgcaaaag aggactgttc tcatcatacagt 2100
aatgtagctt ccagataactc tgtatgcatc agggatagct tctttcagag agggtctatt 2160
ttatgatgct atttctctgc tcttagggtcg ccccattata ctgtgctcca agggacatac 2220
tgaaagttcc aattttgcgt ataagacaat ygagctgccc cactactgtgg actgcctcca 2280
gggcatcctg agcgtgattc cgctgcagct gctgttccttc cacctggctg ttctccggg 2340
atatgacgtg \ cgtctaaaaaa \ ctgcacctaa \ cagcagagag \ gagagcatata \ accccagagt \ 2400
tccttttctgt \ tctttataata \ cttggagtaa \ atagtcatag \ ataataataat \ ttttattattaa2460
gtagctttttct ttttttttttt ttttgagattg agtctcgctc tgtcgcccag gctggagggc 2520
agtggcacaa cctcggctca ctgcaagctc cacctcctgg gttcaagcga ttctcctgcc 2580
tcagcctccc \ gagtagctggg \ gactacaagc \ acccgccacc \ atgcctggct \ aaattttttgt \ 2640
atttttttgta \ gagacgggggt \ ttcaccgttgt \ tagccaggat \ gaccttga \ 2688
<210> $ 24
<211> $ 20
<212> DNA
<213> \ Artificial \ Sequence
<220>
<223> \ Description \ of \ Artificial \ Sequence: primer
<400> $ 24
atgctattttc tctgctcttag 20
<210> $ 25
<211> $ 20
<212> DNA
<213> \ Artificial \ Sequence
<220>
<223> \ Description \ of \ Artificial \ Sequence: primer
<400> $ 25
ttaggtgcag {tttttagacg} 20

[0150]
Figure 2004000115

Claims (13)

ヒトゲノムＤＮＡを含む試料において、下記ａ）〜ｈ）から選ばれるいずれか一つまたは二つ以上の位置に存在する遺伝子多型、および／またはその組合せからなるハプロタイプを検出することにより、該試料提供者の糖尿病の発症危険度を判定する方法。
ａ）ＧＦＡＴ（グルタミン：フルクトース−６−リン酸アミドトランスフェラーゼ）１遺伝子の第１イントロンの３６番目のヌクレオチド（配列番号１のヌクレオチド番号６３２）
ｂ）ＧＦＡＴ１遺伝子の第１１イントロンの７番目のヌクレオチド（配列番号２のヌクレオチド番号２６６）
ｃ）ＧＦＡＴ１遺伝子の第１２イントロンの−１４７番目のヌクレオチド（配列番号３のヌクレオチド番号３３８）
ｄ）ＧＦＡＴ１遺伝子の第８イントロンの１８５３〜１８７７番目のヌクレオチド（配列番号４のヌクレオチド番号３３６〜３６０）
ｅ）ＧＦＡＴ１遺伝子の第１２イントロンの１９８８〜２００７番目のヌクレオチド（配列番号５のヌクレオチド番号３２８〜３４７）
ｆ）ＧＦＡＴ１遺伝子の第１８イントロンの−１１〜−２２番目のヌクレオチド（配列番号６のヌクレオチド番号２５３〜２６４）
ｇ）ＧＦＡＴ１遺伝子の第３イントロンの２６３２から２６６１番目のヌクレオチド（配列番号７のヌクレオチド番号２３７〜２６６）
ｈ）ＧＦＡＴ２遺伝子の第１８エキソンの６６番目のヌクレオチド（配列番号２３のヌクレオチド番号２２５１）In a sample containing human genomic DNA, the sample is provided by detecting a gene polymorphism present at any one or more positions selected from the following a) to h) and / or a haplotype consisting of a combination thereof. For determining the risk of developing diabetes in an elderly person.
a) The 36th nucleotide of the first intron of the GFAT (glutamine: fructose-6-phosphate amide transferase) 1 gene (nucleotide number 632 of SEQ ID NO: 1)
b) The seventh nucleotide of the eleventh intron of the GFAT1 gene (nucleotide number 266 of SEQ ID NO: 2)
c) The nucleotide at position -147 of intron 12 of the GFAT1 gene (nucleotide number 338 of SEQ ID NO: 3)
d) nucleotides 1853 to 1877 of the eighth intron of the GFAT1 gene (nucleotide numbers 336 to 360 in SEQ ID NO: 4)
e) nucleotides 1988 to 2007 of the intron 12 of the GFAT1 gene (nucleotide numbers 328 to 347 of SEQ ID NO: 5)
f) -11th to -22nd nucleotides of intron 18 of the GFAT1 gene (nucleotide numbers 253 to 264 of SEQ ID NO: 6)
g) nucleotides 2632 to 2661 of the third intron of the GFAT1 gene (nucleotide numbers 237 to 266 in SEQ ID NO: 7)
h) The 66th nucleotide of the 18th exon of the GFAT2 gene (nucleotide number 2251 of SEQ ID NO: 23) 糖尿病が２型糖尿病である、請求項１記載の方法。2. The method of claim 1, wherein the diabetes is type 2 diabetes. 検出対象が、下記ａ）〜ｆ）およびｈ）の位置に存在する遺伝子多型、ならびに下記ｘ）〜ｚ）で示されるハプロタイプ、から選ばれるいずれか一つまたは二つ以上である、請求項１または２記載の方法。
ａ）ＧＦＡＴ１遺伝子の第１イントロンの３６番目のヌクレオチド（配列番号１のヌクレオチド番号６３２）
ｂ）ＧＦＡＴ１遺伝子の第１１イントロンの７番目のヌクレオチド（配列番号２のヌクレオチド番号２６６）
ｃ）ＧＦＡＴ１遺伝子の第１２イントロンの−１４７番目のヌクレオチド（配列番号３のヌクレオチド番号３３８）
ｄ）ＧＦＡＴ１遺伝子の第８イントロンの１８５３〜１８７７番目のヌクレオチド（配列番号４のヌクレオチド番号３３６〜３６０）
ｅ）ＧＦＡＴ１遺伝子の第１２イントロンの１９８８〜２００７番目のヌクレオチド（配列番号５のヌクレオチド番号３２８〜３４７）
ｆ）ＧＦＡＴ１遺伝子の第１８イントロンの−１１〜−２２番目のヌクレオチド（配列番号６のヌクレオチド番号２５３〜２６４）
ｈ）ＧＦＡＴ２遺伝子の第１８エキソンの６６番目のヌクレオチド（配列番号２３のヌクレオチド番号２２５１）
ｘ）ＧＦＡＴ１遺伝子の第１イントロンの３６番目のヌクレオチド（配列番号１のヌクレオチド番号６３２）、および同第１８イントロンの−１１から−２２番目のヌクレオチド（配列番号６のヌクレオチド番号２５３〜２６４）に存在する遺伝子多型の組合せからなるハプロタイプ
ｙ）ＧＦＡＴ１遺伝子の第１１イントロンの７番目のヌクレオチド（配列番号２のヌクレオチド番号２６６）、および同第１８イントロンの−１１から−２２番目のヌクレオチド（配列番号６のヌクレオチド番号２５３〜２６４）に存在する遺伝子多型の組合せからなるハプロタイプ
ｚ）ＧＦＡＴ１遺伝子の第１８イントロンの−１１から−２２番目のヌクレオチド（配列番号６のヌクレオチド番号２５３〜２６４）、および同第３イントロンの２６３２から２６６１番目のヌクレオチド（配列番号７のヌクレオチド番号２３７〜２６６）に存在する遺伝子多型の組合せからなるハプロタイプThe detection target is any one or two or more selected from gene polymorphisms present at the following positions a) to f) and h) and haplotypes indicated by the following x) to z). 3. The method according to 1 or 2.
a) The 36th nucleotide of the first intron of the GFAT1 gene (nucleotide number 632 of SEQ ID NO: 1)
b) The seventh nucleotide of the eleventh intron of the GFAT1 gene (nucleotide number 266 of SEQ ID NO: 2)
c) The nucleotide at position -147 of intron 12 of the GFAT1 gene (nucleotide number 338 of SEQ ID NO: 3)
d) nucleotides 1853 to 1877 of the eighth intron of the GFAT1 gene (nucleotide numbers 336 to 360 in SEQ ID NO: 4)
e) nucleotides 1988 to 2007 of the intron 12 of the GFAT1 gene (nucleotide numbers 328 to 347 of SEQ ID NO: 5)
f) -11th to -22nd nucleotides of intron 18 of the GFAT1 gene (nucleotide numbers 253 to 264 of SEQ ID NO: 6)
h) The 66th nucleotide of the 18th exon of the GFAT2 gene (nucleotide number 2251 of SEQ ID NO: 23)
x) Present at the 36th nucleotide of the first intron of the GFAT1 gene (nucleotide number 632 of SEQ ID NO: 1) and at the -11th to -22nd nucleotides of the 18th intron (nucleotide numbers 253 to 264 of SEQ ID NO: 6) Y) a haplotype consisting of a combination of the following polymorphisms: y) the seventh nucleotide of the intron 11 of the GFAT1 gene (nucleotide number 266 of SEQ ID NO: 2) and the nucleotides -11 to -22 of the intron 18 (SEQ ID NO: 6) A) a haplotype consisting of a combination of genetic polymorphisms present at nucleotide numbers 253 to 264); nucleotides -11 to -22 of the intron 18 of the GFAT1 gene (nucleotide numbers 253 to 264 of SEQ ID NO: 6); From 2632 of 3 introns 661 nt haplotype consisting of the combination of genetic polymorphisms present in the (nucleotide number 237-266 of SEQ ID NO: 7) ヒトゲノムＤＮＡを含む試料において、下記ｈ）の位置に存在する遺伝子多型、およびｘ）〜ｚ）で示されるハプロタイプから選ばれるいずれか一つまたは二つ以上を検出することにより、該試料提供者の腎症を伴わない２型糖尿病の発症危険度を判定する方法。
ｈ）ＧＦＡＴ２遺伝子の第１８エキソンの６６番目のヌクレオチド（配列番号２３のヌクレオチド番号２２５１）
ｘ）ＧＦＡＴ１遺伝子の第１イントロンの３６番目のヌクレオチド（配列番号１のヌクレオチド番号６３２）、および同第１８イントロンの−１１から−２２番目のヌクレオチド（配列番号６のヌクレオチド番号２５３〜２６４）に存在する遺伝子多型の組合せからなるハプロタイプ
ｙ）ＧＦＡＴ１遺伝子の第１１イントロンの７番目のヌクレオチド（配列番号２のヌクレオチド番号２６６）、および同第１８イントロンの−１１から−２２番目のヌクレオチド（配列番号６のヌクレオチド番号２５３〜２６４）に存在する遺伝子多型の組合せからなるハプロタイプ
ｚ）ＧＦＡＴ１遺伝子の第１８イントロンの−１１から−２２番目のヌクレオチド（配列番号６のヌクレオチド番号２５３〜２６４）、および同第３イントロンの２６３２から２６６１番目のヌクレオチド（配列番号７のヌクレオチド番号２３７〜２６６）に存在する遺伝子多型の組合せからなるハプロタイプIn a sample containing human genomic DNA, by detecting any one or two or more selected from the polymorphisms present at the following position h) and the haplotypes x) to z), the sample provider For determining the risk of developing type 2 diabetes without nephropathy.
h) The 66th nucleotide of the 18th exon of the GFAT2 gene (nucleotide number 2251 of SEQ ID NO: 23)
x) Present at the 36th nucleotide of the first intron of the GFAT1 gene (nucleotide number 632 of SEQ ID NO: 1) and at the -11th to -22nd nucleotides of the 18th intron (nucleotide numbers 253 to 264 of SEQ ID NO: 6) Y) a haplotype consisting of a combination of the following polymorphisms: y) the seventh nucleotide of the intron 11 of the GFAT1 gene (nucleotide number 266 of SEQ ID NO: 2) and the nucleotides -11 to -22 of the intron 18 (SEQ ID NO: 6) A) a haplotype consisting of a combination of genetic polymorphisms present at nucleotide numbers 253 to 264); nucleotides -11 to -22 of the intron 18 of the GFAT1 gene (nucleotide numbers 253 to 264 of SEQ ID NO: 6); From 2632 of 3 introns 661 nt haplotype consisting of the combination of genetic polymorphisms present in the (nucleotide number 237-266 of SEQ ID NO: 7) ヒトゲノムＤＮＡを含む試料において、下記ａ）、ｂ）の位置に存在する遺伝子多型、およびｚ）で示されるハプロタイプから選ばれるいずれか一つまたは二つ以上を検出することにより、該試料提供者の腎症を伴う２型糖尿病の発症危険度を判定する方法。
ａ）ＧＦＡＴ１遺伝子の第１イントロンの３６番目のヌクレオチド（配列番号１のヌクレオチド番号６３２）
ｂ）ＧＦＡＴ１遺伝子の第１１イントロンの７番目のヌクレオチド（配列番号２のヌクレオチド番号２６６）
ｚ）ＧＦＡＴ１遺伝子の第１８イントロンの−１１から−２２番目のヌクレオチド（配列番号６のヌクレオチド番号２５３〜２６４）、および同第３イントロンの２６３２から２６６１番目のヌクレオチド（配列番号７のヌクレオチド番号２３７〜２６６）に存在する遺伝子多型の組合せからなるハプロタイプIn a sample containing human genomic DNA, by detecting any one or two or more selected from the gene polymorphisms present at the following positions a) and b) and the haplotype represented by z), the sample provider For determining the risk of developing type 2 diabetes with nephropathy.
a) The 36th nucleotide of the first intron of the GFAT1 gene (nucleotide number 632 of SEQ ID NO: 1)
b) The seventh nucleotide of the eleventh intron of the GFAT1 gene (nucleotide number 266 of SEQ ID NO: 2)
z) The nucleotides -11 to -22 of intron 18 of the GFAT1 gene (nucleotides 253-264 of SEQ ID NO: 6) and the nucleotides 2632-2661 of intron 3 of the GFAT1 gene (nucleotides 237-264 of SEQ ID NO: 7) 266) A haplotype comprising a combination of polymorphisms present in ヒトゲノムＤＮＡを含む試料において、下記ｚ）で示されるハプロタイプを検出することにより、該試料提供者の１型糖尿病の発症危険度を判定する方法。
ｚ）ＧＦＡＴ１遺伝子の第１８イントロンの−１１から−２２番目のヌクレオチド（配列番号６のヌクレオチド番号２５３〜２６４）、および同第３イントロンの２６３２から２６６１番目のヌクレオチド（配列番号７のヌクレオチド番号２３７〜２６６）に存在する遺伝子多型の組合せからなるハプロタイプA method for determining the risk of type 1 diabetes of a sample provider by detecting a haplotype represented by z) below in a sample containing human genomic DNA.
z) The nucleotides -11 to -22 of intron 18 of the GFAT1 gene (nucleotides 253-264 of SEQ ID NO: 6) and the nucleotides 2632-2661 of intron 3 of the GFAT1 gene (nucleotides 237-264 of SEQ ID NO: 7) 266) A haplotype comprising a combination of polymorphisms present in 検出が、ＲＦＬＰ法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法、ＡＳＯハイブリダイゼーション、ダイレクトシークエンス法、ＡＲＭＳ法、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法、ＲＮａｓｅＡ切断法、化学切断法、ＤＯＬ法、ＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ法、インベーダー法、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法、ＴＤＩ法、モレキュラー・ビーコン法、ダイナミック・アレルスペシフィック・ハイブリダイゼーション法、パドロック・プローブ法、ＵＣＡＮ法、ＤＮＡチップまたはＤＮＡマイクロアレイを用いた核酸ハイブリダイゼーション法、およびＥＣＡ法からなる群より選ばれる一つまたは二つ以上の方法を用いて行われることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。Detection includes RFLP, PCR-SSCP, ASO hybridization, direct sequencing, ARMS, denaturing gradient gel electrophoresis, RNaseA cleavage, chemical cleavage, DOL, TaqManｑPCR, Invader, MALDI A group consisting of the TOF / MS method, the TDI method, the molecular beacon method, the dynamic allele-specific hybridization method, the padlock probe method, the UCAN method, the nucleic acid hybridization method using a DNA chip or a DNA microarray, and the ECA method The method according to any one of claims 1 to 6, wherein the method is performed using one or more methods selected from the group consisting of: 検出が、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法またはダイレクトシークエンス法を用いて行われることを特徴とする、請求項７記載の方法。The method according to claim 7, wherein the detection is performed using a PCR-SSCP method or a direct sequence method. 配列番号２２で示されるＧＦＡＴ１遺伝子上において、下記ａ）〜ｇ）から選ばれるいずれか一つのヌクレオチドまたはヌクレオチド配列を含む、１６〜５００塩基長の連続したポリヌクレオチド、またはその標識物；
ａ）ＧＦＡＴ１遺伝子の第１イントロンの３６番目のヌクレオチド（配列番号１のヌクレオチド番号６３２）
ｂ）ＧＦＡＴ１遺伝子の第１１イントロンの７番目のヌクレオチド（配列番号２のヌクレオチド番号２６６）
ｃ）ＧＦＡＴ１遺伝子の第１２イントロンの−１４７番目のヌクレオチド（配列番号３のヌクレオチド番号３３８）
ｄ）ＧＦＡＴ１遺伝子の第８イントロンの１８５３〜１８７７番目のヌクレオチド（配列番号４のヌクレオチド番号３３６〜３６０）
ｅ）ＧＦＡＴ１遺伝子の第１２イントロンの１９８８〜２００７番目のヌクレオチド（配列番号５のヌクレオチド番号３２８〜３４７）
ｆ）ＧＦＡＴ１遺伝子の第１８イントロンの−１１〜−２２番目のヌクレオチド（配列番号６のヌクレオチド番号２５３〜２６４）
ｇ）ＧＦＡＴ１遺伝子の第３イントロンの２６３２から２６６１番目のヌクレオチド（配列番号７のヌクレオチド番号２３７〜２６６）
もしくは、配列番号２３で示されるＧＦＡＴ２遺伝子断片上において、第１８エキソンの６６番目のヌクレオチド（配列番号２３のヌクレオチド番号２２５１）を含む、１６〜５００塩基長の連続したポリヌクレオチド、またはその標識物。
（ただし、上記ポリヌクレオチドがＲＮＡである場合、配列表中の塩基記号「ｔ」は「ｕ」に読み替えるものとする）。On the GFAT1 gene represented by SEQ ID NO: 22, a continuous polynucleotide having a length of 16 to 500 bases, comprising any one nucleotide or nucleotide sequence selected from the following a) to g), or a labeled product thereof:
a) The 36th nucleotide of the first intron of the GFAT1 gene (nucleotide number 632 of SEQ ID NO: 1)
b) The seventh nucleotide of the eleventh intron of the GFAT1 gene (nucleotide number 266 of SEQ ID NO: 2)
c) The nucleotide at position -147 of intron 12 of the GFAT1 gene (nucleotide number 338 of SEQ ID NO: 3)
d) nucleotides 1853 to 1877 of the eighth intron of the GFAT1 gene (nucleotide numbers 336 to 360 in SEQ ID NO: 4)
e) nucleotides 1988 to 2007 of the intron 12 of the GFAT1 gene (nucleotide numbers 328 to 347 of SEQ ID NO: 5)
f) -11th to -22nd nucleotides of intron 18 of the GFAT1 gene (nucleotide numbers 253 to 264 of SEQ ID NO: 6)
g) nucleotides 2632 to 2661 of the third intron of the GFAT1 gene (nucleotide numbers 237 to 266 in SEQ ID NO: 7)
Alternatively, on the GFAT2 gene fragment represented by SEQ ID NO: 23, a continuous polynucleotide having a length of 16 to 500 bases, including the 66th nucleotide of exon 18 (nucleotide number 2251 of SEQ ID NO: 23), or a labeled product thereof.
(However, when the polynucleotide is RNA, the base symbol “t” in the sequence listing should be read as “u”). 配列番号２２で示されるＧＦＡＴ１遺伝子上において、下記ａ）〜ｇ）から選ばれるいずれか一つのヌクレオチドまたはヌクレオチド配列を含む、１６〜１０００塩基長の連続したポリヌクレオチドの一部にハイブリダイズし、該ポリヌクレオチドを特異的に増幅するための、１５〜３０塩基長のオリゴヌクレオチド、またはその標識物；
ａ）ＧＦＡＴ１遺伝子の第１イントロンの３６番目のヌクレオチド（配列番号１のヌクレオチド番号６３２）
ｂ）ＧＦＡＴ１遺伝子の第１１イントロンの７番目のヌクレオチド（配列番号２のヌクレオチド番号２６６）
ｃ）ＧＦＡＴ１遺伝子の第１２イントロンの−１４７番目のヌクレオチド（配列番号３のヌクレオチド番号３３８）
ｄ）ＧＦＡＴ１遺伝子の第８イントロンの１８５３〜１８７７番目のヌクレオチド（配列番号４のヌクレオチド番号３３６〜３６０）
ｅ）ＧＦＡＴ１遺伝子の第１２イントロンの１９８８〜２００７番目のヌクレオチド（配列番号５のヌクレオチド番号３２８〜３４７）
ｆ）ＧＦＡＴ１遺伝子の第１８イントロンの−１１〜−２２番目のヌクレオチド（配列番号６のヌクレオチド番号２５３〜２６４）
ｇ）ＧＦＡＴ１遺伝子の第３イントロンの２６３２から２６６１番目のヌクレオチド（配列番号７のヌクレオチド番号２３７〜２６６）
もしくは、配列番号２３で示されるＧＦＡＴ２遺伝子断片上において、第１８エキソンの６６番目のヌクレオチド（配列番号２３のヌクレオチド番号２２５１）を含む、１６〜１０００塩基長の連続したポリヌクレオチドの一部にハイブリダイズし、該ポリヌクレオチドを特異的に増幅するための、１５〜３０塩基長のオリゴヌクレオチド、またはその標識物。
（ただし、上記ポリヌクレオチドがＲＮＡである場合、配列表中の塩基記号「ｔ」は「ｕ」に読み替えるものとする）。On the GFAT1 gene represented by SEQ ID NO: 22, it hybridizes to a part of a continuous polynucleotide having a length of 16 to 1000 bases, including any one nucleotide or nucleotide sequence selected from the following a) to g); An oligonucleotide having a length of 15 to 30 bases, or a labeled product thereof, for specifically amplifying the polynucleotide;
a) The 36th nucleotide of the first intron of the GFAT1 gene (nucleotide number 632 of SEQ ID NO: 1)
b) The seventh nucleotide of the eleventh intron of the GFAT1 gene (nucleotide number 266 of SEQ ID NO: 2)
c) The nucleotide at position -147 of intron 12 of the GFAT1 gene (nucleotide number 338 of SEQ ID NO: 3)
d) nucleotides 1853 to 1877 of the eighth intron of the GFAT1 gene (nucleotide numbers 336 to 360 in SEQ ID NO: 4)
e) nucleotides 1988 to 2007 of the intron 12 of the GFAT1 gene (nucleotide numbers 328 to 347 of SEQ ID NO: 5)
f) -11th to -22nd nucleotides of intron 18 of the GFAT1 gene (nucleotide numbers 253 to 264 of SEQ ID NO: 6)
g) nucleotides 2632 to 2661 of the third intron of the GFAT1 gene (nucleotide numbers 237 to 266 in SEQ ID NO: 7)
Alternatively, on the GFAT2 gene fragment represented by SEQ ID NO: 23, it hybridizes to a part of a continuous polynucleotide having a length of 16 to 1000 bases and including the 66th nucleotide of exon 18 (nucleotide number 2251 of SEQ ID NO: 23). And an oligonucleotide having a length of 15 to 30 bases, or a labeled product thereof, for specifically amplifying the polynucleotide.
(However, when the polynucleotide is RNA, the base symbol “t” in the sequence listing should be read as “u”). 請求項９記載のポリヌクレオチドを固定した固相化試料。A solid-phased sample on which the polynucleotide according to claim 9 is immobilized. 以下の１）〜３）から選ばれる少なくとも一つ以上を含む、糖尿病の発症危険性判定用試薬またはキット。
１）請求項９記載のポリヌクレオチド、またはその標識物
２）請求項１０記載のオリゴヌクレオチド、またはその標識物
３）請求項１１記載の固相化試料A reagent or kit for determining the risk of developing diabetes, comprising at least one selected from the following 1) to 3):
1) The polynucleotide according to claim 9 or a labeled product thereof 2) The oligonucleotide according to claim 10 or a labeled product thereof 3) The immobilized sample according to claim 11 以下の（Ａ）または（Ｂ）のＤＮＡ。
（Ａ）配列番号２２で示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡ
（Ｂ）配列番号２２で示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡと少なくとも８５％以上の相同性を有し、かつＧＦＡＴ活性を有するヒト由来のタンパク質をコードするＤＮＡDNA of the following (A) or (B):
(A) DNA comprising a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 22
(B) DNA encoding a human-derived protein having at least 85% homology with the DNA consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 22 and having GFAT activity
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