JP2004000079A - Marker for alzheimer's disease and utilization thereof - Google Patents
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Abstract
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はアルツハイマー病の診断に有用な疾患マーカーに関する。より詳細には、本発明はアルツハイマー病の遺伝子診断において、プライマーまたは検出プローブとして有効に利用できる疾患マーカーに関する。また本発明は、かかる疾患マーカーを利用したアルツハイマー病の検出方法（診断方法）に関する。
【０００２】
さらに本発明は、上記疾患マーカーを利用して、アルツハイマー病の改善薬または治療薬として有効な物質をスクリーニングする方法、並びに該方法で調製される上記物質を有効成分とするアルツハイマー病の改善薬または治療薬に関する。
【０００３】
【従来の技術】
アルツハイマー病は、進行性の記憶障害、知能低下などを主症状とする脳の変性疾患であり、いくつかの要因が重なって発病する多因子性の病気である。発症の危険因子として遺伝的因子、環境因子に関する報告がいくつかあるが、最大の危険因子は脳の老化であると考えられている。
【０００４】
一般に、アルツハイマー病は遺伝的ではないが、まれに家族性アルツハイマー病と呼ばれる、常染色体優性遺伝を示す遺伝性のアルツハイマー病が存在する。前記家族性アルツハイマー病に対し、患者の大部分（９７％−９８％）を占める非遺伝性アルツハイマー病は孤発性アルツハイマー病と呼ばれる。両患者脳の病理学的変化には、シナプスの変性・脱落、ニューロン死、老人斑沈着など共通する病理が多く、遺伝性・非遺伝性アルツハイマー病に同様の発症機序の存在が予想されることから、家族性アルツハイマー病の原因遺伝子を同定することで、孤発性アルツハイマー病の発症機構を解明しようとする試みがなされている。
【０００５】
アルツハイマー病患者の脳に特徴的な病理学的変化として、大脳皮質、海馬等への老人斑の沈着があげられる。前記老人斑の主要構成成分として、βアミロイドペプチド（Ａβ）が単離されている。また、前記Ａβの前駆体として、アミロイド前駆体タンパク質（ａｍｙｌｏｉｄ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ； ＡＰＰ）が単離されている［ゴールドゲーバー（Ｇｏｌｄｇａｂｅｒ， Ｄ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２３５， ８７７−８８０， （１９８７）；タンツィ（Ｔａｎｚｉ， Ｒ． Ｅ．）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２３５， ８８０−８８４， （１９８７）；ロバキス（Ｒｏｂａｋｉｓ， Ｎ． Ｋ．）ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８４， ４１９０−４１９４， （１９８７）；キタグチ（Ｋｉｔａｇｕｃｈｉ， Ｎ．）ら、Ｎａｔｕｒｅ， ３３１， ５３０−５３２， （１９８８）；ポンテ（Ｐｏｎｔｅ， Ｐ．）ら、Ｎａｔｕｒｅ， ３３１， ５２５−５２７， （１９８７）］。
【０００６】
高齢化社会到来に伴い、アルツハイマー病患者数の著しい増加が予想されることから、現在その予防・治療法の開発が望まれている。しかしながら、アルツハイマー病は、その臨床・病理像から、発症機構は多様であり、多くの因子が関与することが予想されること、および脳の老化にともない発病する複雑な病気であることから、その研究、診断、治療が困難である点が多いのが現状である。
【０００７】
一方で、最近の医療現場では、アルツハイマー病に限らず、個々の患者の症状に合わせて治療法を的確に選択することが望まれるようになってきている。高齢化社会でのＱＯＬ（Ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ ｌｉｆｅ）向上の必要性が認識されてきた近年では、特に、万人に共通した治療ではなく、個々の患者の症状に合わせて適切な治療が施されることが強く求められている。このような所謂テイラーメイド治療を行うためには、個々の疾患について患者の症状やその原因（遺伝的背景）を的確に反映する疾患マーカーが有用であり、その探索並びに開発を目指した研究が精力的に行われているのが現状である。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、アルツハイマー病の診断及び治療に有用な疾患マーカーを提供することを目的とする。さらに本発明は該疾患マーカーを利用したアルツハイマー病の検出方法（遺伝子診断方法）、該疾患の改善または治療に有用な薬物をスクリーニングする方法、並びに該疾患の改善または治療に有用な薬物を提供することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行っていたところ、後述する配列表において配列番号：１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５および９６で示される塩基配列（以下、本明細書において「配列番号：１〜９６」ともいう。）を有する遺伝子が、正常の海馬組織における発現に比してアルツハイマー病患者の海馬組織における発現が有意に促進されていること、また配列番号：９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６および２６７で示される塩基配列（以下、本明細書において「配列番号：９７〜２６７」ともいう。）を有する遺伝子が、正常の海馬組織における発現に比してアルツハイマー病患者の海馬組織における発現が有意に抑制されていることを見出した。これらのことから、本発明者らは、かかる遺伝子がアルツハイマー病マーカーとなり得るとの確信を得た。本発明はかかる知見に基づいて完成されたものである。
【００１０】
すなわち、本発明は、下記項１〜１８に掲げるものである：
項１． 配列番号：１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６および２６７（以下、本明細書において「配列番号：１〜２６７」ともいう。）のいずれかに記載の塩基配列において、連続する少なくとも１５塩基を有するポリヌクレオチド及び／または該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドからなる、アルツハイマー病の疾患マーカー。
項２． アルツハイマー病の検出においてプローブまたはプライマーとして使用される項１に記載の疾患マーカー。
項３． 下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む、アルツハイマー病の検出方法：
（ａ）被験者の生体試料から調製されたＲＮＡまたはそれから転写された相補的なポリヌクレオチドと、項１または項２に記載の疾患マーカーとを結合させる工程、
（ｂ）該疾患マーカーに特異的に結合した生体試料由来のＲＮＡまたはそれから転写された相補的なポリヌクレオチドを、上記疾患マーカーを指標として測定する工程、
（ｃ）（ｂ）の測定結果に基づいて、アルツハイマー病の罹患を判断する工程。
項４． 下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む、アルツハイマー病の検出方法：
（ａ）被験者の生体試料から調製されたＲＮＡまたはそれから転写された相補的なポリヌクレオチドと、項１または項２に記載の疾患マーカーのうち、配列番号：１〜９６のいずれかに記載の塩基配列に基づく疾患マーカーとを結合させる工程、
（ｂ）上記疾患マーカーに特異的に結合した生体試料由来のＲＮＡまたはそれから転写された相補的なポリヌクレオチドを、上記疾患マーカーを指標として測定する工程、
（ｃ）（ｂ）で得られる被験者の測定結果が、正常な生体試料について得られる結果に比して疾患マーカーへの結合量が増大していることを指標として、アルツハイマー病の罹患を判断する工程。
項５． 下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む、アルツハイマー病の検出方法：
（ａ）被験者の生体試料から調製されたＲＮＡまたはそれから転写された相補的なポリヌクレオチドと、項１または項２に記載の疾患マーカーのうち、配列番号：９７〜２６７のいずれかに記載の塩基配列に基づく疾患マーカーとを結合させる工程、
（ｂ）上記疾患マーカーに特異的に結合した生体試料由来のＲＮＡまたはそれから転写された相補的なポリヌクレオチドを、上記疾患マーカーを指標として測定する工程、
（ｃ）（ｂ）で得られる被験者の測定結果が、正常な生体試料について得られる結果に比して疾患マーカーへの結合量が減少していることを指標として、アルツハイマー病の罹患を判断する工程。
項６． 配列番号：２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２および２９３（以下、本明細書において「配列番号：２６８〜２９３」ともいう。）のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質を認識する抗体を有する、アルツハイマー病の疾患マーカー。
項７． アルツハイマー病の検出におけるプローブとして使用される項６に記載の疾患マーカー。
項８． 下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む、アルツハイマー病の検出方法：
（ａ）被験者の生体試料から調製されたタンパク質と、項６または項７に記載の疾患マーカーとを結合させる工程、
（ｂ）該疾患マーカーに結合した生体試料由来のタンパク質またはその部分ペプチドを、上記疾患マーカーを指標として測定する工程、
（ｃ）（ｂ）の測定結果に基づいて、アルツハイマー病の罹患を判断する工程。
項９． 下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む、アルツハイマー病の検出方法：
（ａ）被験者の生体試料から調製されたタンパク質と、項６または項７に記載の疾患マーカーのうち、配列番号：２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４および２７５のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質を認識する抗体を有する疾患マーカーとを結合させる工程、
（ｂ）該疾患マーカーに結合した生体試料由来のタンパク質またはその部分ペプチドを、上記疾患マーカーを指標として測定する工程、
（ｃ）（ｂ）で得られる被験者の測定結果が、正常な生体試料について得られる結果に比して疾患マーカーへの結合量が増大していることを指標として、アルツハイマー病の罹患を判断する工程。
項１０．下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む、アルツハイマー病の検出方法：
（ａ）被験者の生体試料から調製されたタンパク質と、項６または項７に記載の疾患マーカーのうち、配列番号：２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２および２９３のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質を認識する抗体を有する疾患マーカーとを結合させる工程、
（ｂ）該疾患マーカーに結合した生体試料由来のタンパク質またはその部分ペプチドを、上記疾患マーカーを指標として測定する工程、
（ｃ）（ｂ）で得られる被験者の測定結果が、正常な生体試料について得られる結果に比して疾患マーカーへの結合量が減少していることを指標として、アルツハイマー病の罹患を判断する工程。
項１１． 下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む、配列番号：１〜２６７のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子の発現を制御する物質のスクリーニング方法：
（ａ）被験物質と配列番号：１〜２６７のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子またはそのホモログを発現可能な細胞とを接触させる工程、
（ｂ）被験物質を接触させた細胞の、配列番号：１〜２６７のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子またはそのホモログの発現量を測定し、該発現量を被験物質を接触させない対照細胞の上記対応する遺伝子の発現量と比較する工程、
（ｃ）（ｂ）の比較結果に基づいて、配列番号：１〜２６７のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子またはそのホモログの発現量を変動させる被験物質を選択する工程、
項１２． 下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む、配列番号：１〜９６のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子の発現を抑制する物質のスクリーニング方法：
（ａ）被験物質と配列番号：１〜９６のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子またはそのホモログを発現可能な細胞とを接触させる工程
（ｂ）被験物質を接触させた細胞の、配列番号：１〜９６のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子またはそのホモログの発現量を測定し、該発現量を被験物質を接触させない対照細胞の上記対応する遺伝子の発現量と比較する工程、
（ｃ）（ｂ）の比較結果に基づいて、配列番号：１〜９６のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子またはそのホモログの発現を抑制する被験物質を選択する工程。
項１３．下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む、配列番号：９７〜２６７のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子の発現を促進する物質のスクリーニング方法：
（ａ）被験物質と配列番号：９７〜２６７のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子またはそのホモログを発現可能な細胞とを接触させる工程
（ｂ）被験物質を接触させた細胞の、配列番号：９７〜２６７のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子またはそのホモログの発現量を測定し、該発現量を被験物質を接触させない対照細胞の上記対応する遺伝子の発現量と比較する工程、
（ｃ）（ｂ）の比較結果に基づいて、配列番号：９７〜２６７のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子またはそのホモログの発現を促進する被験物質を選択する工程。
項１４．アルツハイマー病の改善または治療剤の有効成分を探索するための方法である、項１１乃至項１３のいずれかに記載のスクリーニング方法。
項１５．配列番号：１〜９６のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子の発現を抑制する物質を有効成分とする、アルツハイマー病の改善または治療剤。
項１６．配列番号：１〜９６のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子の発現を抑制する物質が項１２に記載のスクリーニング法により得られるものである、項１５に記載のアルツハイマー病の改善または治療剤。
項１７．配列番号：９７〜２６７のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子の発現を促進する物質を有効成分とする、アルツハイマー病の改善または治療剤。
項１８．配列番号：９７〜２６７のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子の発現を促進する物質が項１３に記載のスクリーニング法により得られるものである、項１７に記載のアルツハイマー病の改善または治療剤。
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下、本明細書において、アミノ酸、（ポリ）ペプチド、（ポリ）ヌクレオチドなどの略号による表示は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢの規定〔ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ ｏｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １３８： ９ （１９８４）〕、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン」（日本国特許庁編）、および当該分野における慣用記号に従う。
【００１２】
本明細書において「遺伝子」または「ＤＮＡ」とは、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖といった各１本鎖ＤＮＡを包含する趣旨で用いられる。またその長さによって特に制限されるものではない。従って、本明細書において遺伝子（ＤＮＡ）とは、特に言及しない限り、ヒトゲノムＤＮＡを含む２本鎖ＤＮＡおよびｃＤＮＡを含む１本鎖ＤＮＡ（正鎖）並びに該正鎖と相補的な配列を有する１本鎖ＤＮＡ（相補鎖）、およびこれらの断片のいずれもが含まれる。
【００１３】
また、当該「遺伝子」または「ＤＮＡ」には、特定の塩基配列で示される「遺伝子」または「ＤＮＡ」だけでなく、これらによりコードされるタンパク質と生物学的機能が同等であるタンパク質（例えば、同族体、変異体、誘導体など）をコードする「遺伝子」または「ＤＮＡ」が包含される（本明細書においては、これらを総括して上記特定の塩基配列で示される「遺伝子」または「ＤＮＡ」の「ホモログ」ともいう。）。かかるホモログとしては、具体的には、後述する（１−１）項に記載のストリンジェントな条件で、前記特定塩基配列で示される「遺伝子」または「ＤＮＡ」とハイブリダイズするものを挙げることができる。
【００１４】
例えば同族体をコードする遺伝子（ホモログ）としては、ヒト遺伝子に対応するマウスやラットなどの他生物種の遺伝子が例示できる。これらの遺伝子（ホモログ）は、ＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅ／）により同定することができる。具体的には、特定ヒト塩基配列をＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．ＵＳＡ．， ９０： ５８７３−５８７７， １９９３、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）にかけて一致する（Ｓｃｏｒｅが最も高く、Ｅ−ｖａｌｕｅが０でかつＩｄｅｎｔｉｔｙが１００％を示す）配列のアクセッション番号を取得する。そのアクセッション番号をＵｎｉＧｅｎｅ （ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＵｎｉＧｅｎｅ／）に入力して得られたＵｎｉＧｅｎｅ Ｃｌｕｓｔｅｒ ＩＤ（Ｈｓ．で示す番号）をＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅに入力する。結果として得られた他生物種遺伝子とヒト遺伝子との遺伝子ホモログの相関を示したリストから、ヒト遺伝子に該当するマウスやラットなどの他生物種の遺伝子を選抜することができる。なお、遺伝子またはＤＮＡは、機能領域の別を問うものではなく、例えば発現制御領域、コード領域、エキソン、またはイントロンを含むことができる。
【００１５】
本明細書において「ポリヌクレオチド」とは、ＲＮＡおよびＤＮＡのいずれをも包含する趣旨で用いられる。なお、上記ＤＮＡには、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、及び合成ＤＮＡのいずれもが含まれる。また上記ＲＮＡには、ｔｏｔａｌ ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、及び合成のＲＮＡのいずれもが含まれる。
【００１６】
本明細書において「タンパク質」または「（ポリ）ペプチド」には、特定の塩基配列で示される「タンパク質」または「（ポリ）ペプチド」だけでなく、これらと生物学的機能が同等である「タンパク質」または「（ポリ）ペプチド」（例えば、同族体、変異体、誘導体など）が包含される。なお、本明細書において、これらを上記特定のアミノ酸配列で示される「タンパク質」または「（ポリ）ペプチド」の「ホモログ」ともいう。例えば、上記同族体（ホモログ）としては、ヒトのタンパク質に該当するマウスやラットなどの他生物種のタンパク質が例示でき、これらはＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅ （ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅ／）により同定された遺伝子（ホモログ）の塩基配列から演繹的に同定することができる。また、上記変異体には、天然に存在するアレル変異体、天然に存在しない変異体、及び人為的に欠失、置換、付加および挿入されることによって改変されたアミノ酸配列を有する変異体が包含される。なお、かかる変異体としては、変異のないタンパク質または（ポリ）ペプチドと、少なくとも７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９５％、さらにより好ましくは９７％相同なものを挙げることができる。
【００１７】
本明細書でいう「抗体」には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、およびＦａｂフラグメントやＦａｂ発現ライブラリーによって生成されるフラグメントなどのような抗原結合性を有する上記抗体の一部が包含される。
【００１８】
さらに本明細書において「疾患マーカー」とは、アルツハイマー病の罹患の有無若しくは罹患の程度を診断するために、また、アルツハイマー病の改善、治療などに有用な候補物質をスクリーニングするために、直接または間接的に利用されるものであり、例えば、神経細胞死の亢進に関連して生体内での発現が変動する遺伝子またはタンパク質を特異的に認識し、また結合することのできる（ポリ）（オリゴ）ヌクレオチドおよび抗体が包含される。これらの（ポリ）（オリゴ）ヌクレオチドおよび抗体は、上記性質に基づいて、生体内、特に海馬組織などで発現した上記遺伝子及びタンパク質を検出するためのプローブとして、また（オリゴ）ヌクレオチドは生体内、特に海馬組織などで発現した上記遺伝子を増幅するためのプライマーとして有効に利用することができる。
【００１９】
本発明は、前述するように、配列番号：１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５および９６（配列番号：１〜９６）のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子（以下、これらの遺伝子を総称して遺伝子Ｉともいう。）が、アルツハイマー病患者の海馬組織で特異的に発現が増加していること、並びに配列番号：９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６および２６７（配列番号：９７〜２６７）のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子（以下、これらの遺伝子を総称して遺伝子ＩＩともいう。）が、アルツハイマー病患者の海馬組織で特異的に発現が抑制されていることを見出したことに基づくものである。
【００２０】
従って、これらの遺伝子及びその発現産物〔タンパク質、（ポリ）（オリゴ）ペプチド〕は、アルツハイマー病の解明、診断、予防及び治療に有効に利用することができ、かかる利用によって医学並びに臨床学上、有用な情報や手段を得ることができる。また、これらの遺伝子及びその発現産物並びにそれらからの派生物（例えば、抗体など）は、上記アルツハイマー病の治療、並びに該治療に有効に用いられる薬剤の開発に好適に利用することができる。さらに、個体または海馬組織における、上記遺伝子の発現またはその発現産物の検出、または該遺伝子の変異またはその発現不全の検出は、アルツハイマー病の解明や診断に有効に利用することができる。
【００２１】
以下、これらのポリヌクレオチド、並びにこれらの発現産物やそれらの派生物について、具体的な用途を説明する。
【００２２】
（１）アルツハイマー病の疾患マーカー及びその応用
（１−１） ポリヌクレオチド
本発明は、前述するように、アルツハイマー病に罹患した患者の海馬組織において、配列番号：１〜９６のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子が特異的に発現しているか、発現が特異的に増大しているという知見、並びに該患者の海馬組織において配列番号：９７〜２６７のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子の発現が特異的に減少しているという知見を発端に、これらの遺伝子発現の有無や発現の程度を検出することによって上記アルツハイマー病の罹患の有無や罹患の程度が検出でき、該疾患の診断を正確に行うことができるという発想に基づくものである。すなわち、本発明は、被験者における上記遺伝子の発現の有無またはその程度を検出することによって、被験者についてアルツハイマー病の罹患の有無または罹患の程度を診断することのできるツール（疾患マーカー）として有用なポリヌクレオチドを提供するものである。
【００２３】
また、本発明のポリヌクレオチドは、後述の（３）項に記載するようなアルツハイマー病の予防、改善または治療に有用な候補物質のスクリーニングにおいて、配列番号：１〜２６７のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子の発現変動を検出するためのスクリーニングツール（疾患マーカー）としても有用である。
【００２４】
本発明の疾患マーカーは、配列番号：１〜２６７のいずれかに記載の塩基配列において、連続する少なくとも１５塩基を有するポリヌクレオチド及び／またはそれに相補的なポリヌクレオチドからなることを特徴とする。
【００２５】
ここで相補的なポリヌクレオチド（相補鎖、逆鎖）とは、上記各配列番号に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドの全長配列、または上記各塩基配列において少なくとも連続した１５塩基長の塩基配列を有するその部分配列（ここでは便宜上、これらを「正鎖」ともいう）に対して、Ａ：ＴおよびＧ：Ｃといった塩基対関係に基づいて、塩基的に相補的な関係にあるポリヌクレオチドを意味するものである。ただし、かかる相補鎖は、対象とする正鎖の塩基配列と完全に相補配列を形成する場合に限らず、対象とする正鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズすることができる程度の相補関係を有するものであってもよい。なお、ここでストリンジェントな条件は、Ｂｅｒｇｅｒ ａｎｄ Ｋｉｍｍｅｌ （１９８７， Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． １５２， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ） に示されるように、複合体或いはプローブと結合する核酸の融解温度（Ｔｍ）に基づいて決定することができる。例えばハイブリダイズ後の洗浄条件として、通常「１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、３７℃」程度の条件を挙げることができる。相補鎖はかかる条件で洗浄しても対象とする正鎖とハイブリダイズ状態を維持するものであることが好ましい。特に制限されないが、より厳しいハイブリダイズ条件として「０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」程度、さらに厳しいハイブリダイズ条件として「０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」程度の洗浄条件を挙げることができる。具体的には、このような相補鎖として、対象の正鎖の塩基配列と完全に相補的な関係にある塩基配列からなる鎖、並びに該正鎖と少なくとも９０％、好ましくは９５％の相同性を有する塩基配列からなる鎖を例示することができる。
【００２６】
また、正鎖側のポリヌクレオチドには、配列番号：１〜２６７のいずれかに記載の塩基配列またはその部分配列を有するものだけでなく、上記相補鎖の塩基配列に対してさらに相補的な関係にある塩基配列からなる鎖を含めることができる。
【００２７】
さらに上記正鎖のポリヌクレオチド及び相補鎖（逆鎖）のポリヌクレオチドは、各々一本鎖の形態で疾患マーカーとして使用されても、また二本鎖の形態で疾患マーカーとして使用されてもよい。
【００２８】
本発明のアルツハイマー病の疾患マーカーは、具体的には配列番号：１〜２６７のいずれかに記載される塩基配列（全長配列）からなるポリヌクレオチドであってもよいし、その相補配列からなるポリヌクレオチドであってもよい。また、配列番号：１〜２６７のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子もしくは該遺伝子に由来するポリヌクレオチドを選択的に（特異的に）認識するものであれば、上記全長配列若しくはその相補配列の部分配列からなるポリヌクレオチドであってもよい。この場合、部分配列としては、上記全長配列若しくはその相補配列の塩基配列から任意に選択される、少なくとも１５個の連続した塩基長を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。
【００２９】
なお、ここで「選択的に（特異的に）認識する」とは、例えばノーザンブロット法においては、配列番号：１〜２６７のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子またはこれらの遺伝子に由来するポリヌクレオチドが特異的に検出できること、またＲＴ−ＰＣＲ法においては配列番号：１〜２６７のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子またはこれらの遺伝子に由来するポリヌクレオチドが特異的に生成されることを意味するが、それに限定されることなく、当業者が上記検出物または生成物がこれらの遺伝子に由来するものであると判断できるものであればよい。
【００３０】
そのような本発明の疾患マーカーは、検出（認識）する対象の遺伝子（配列番号：１〜２６７）に応じて、配列番号：１〜２６７のいずれかに示される塩基配列をもとに、例えばｐｒｉｍｅｒ ３（ ＨＹＰＥＲＬＩＮＫ ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｐｒｉｍｅｒ／ｐｒｉｍｅｒ３．ｃｇｉ）あるいはベクターＮＴＩ（Ｉｎｆｏｍａｘ社製）を利用して設計することができる。具体的には配列番号：１〜２６７のいずれかに示される塩基配列をｐｒｉｍｅｒ３またはベクターＮＴＩのソフトウエアにかけて得られる、プライマーまたはプローブの候補配列、若しくは少なくとも該配列を一部に含む配列をプライマーまたはプローブとして使用することができる。
【００３１】
本発明の疾患マーカーは、上述するように連続する少なくとも１５塩基の長さを有するものであればよいが、具体的にはマーカーの用途に応じて、長さを適宜選択し設定することができる。
【００３２】
（１−２）プローブまたはプライマーとしてのポリヌクレオチド
本発明の疾患マーカーは、上記各遺伝子の発現によって生じたＲＮＡまたはそれに由来するポリヌクレオチドを特異的に認識し増幅するためのプライマーとして、または該ＲＮＡまたはそれに由来するポリヌクレオチドを特異的に検出するためのプローブとして利用することができる。
【００３３】
上記疾患マーカーをアルツハイマー病の検出（遺伝子診断）においてプライマーとして用いる場合には、通常１５ｂｐ〜１００ｂｐ、好ましくは１５ｂｐ〜５０ｂｐ、より好ましくは１５ｂｐ〜３５ｂｐの塩基長を有するものが例示できる。また検出プローブとして用いる場合には、通常１５ｂｐ〜全配列の塩基数、好ましくは１５ｂｐ〜１ｋｂ、より好ましくは１００ｂｐ〜１ｋｂの塩基長を有するものが例示できる。
【００３４】
本発明の疾患マーカーは、ノーザンブロット法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダーゼーション法などといった、特定遺伝子を特異的に検出する公知の方法において、常法に従ってプライマーまたはプローブとして利用することができ、これによってアルツハイマー病に関連する配列番号：１〜２６７のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子の発現の有無または発現レベル（発現量）を評価することができる。
【００３５】
測定対象試料としては、使用する検出方法の種類に応じて適宜選択することができる。該試料は、例えば、被験者の生体組織、特に海馬組織の一部をバイオプシ等で採取し、そこから常法に従って調製したｔｏｔａｌ ＲＮＡを用いてもよいし、さらに該ＲＮＡをもとにして調製される各種のポリヌクレオチドを用いてもよい。
【００３６】
また、配列番号：１〜２６７のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子の生体組織における発現レベルは、ＤＮＡチップを利用して検出あるいは定量することができる。この場合、本発明の疾患マーカーは当該ＤＮＡチップのプローブとして使用することができる（例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社のＧｅｎｅ Ｃｈｉｐ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｕ９５ Ａ， Ｂ， Ｃ， Ｄ， Ｅの場合、２５ｂｐの長さのポリヌクレオチドプローブとして用いられる）。本発明の疾患マーカーをプローブとするＤＮＡチップを、生体組織から採取したＲＮＡをもとに調製される標識ＤＮＡまたはＲＮＡとハイブリダイズさせることにより、本発明の疾患マーカー（プローブ）と標識ＤＮＡまたはＲＮＡとの複合体が形成される。該複合体を該標識ＤＮＡまたはＲＮＡの標識を指標として検出することにより、配列番号：１〜２６７のいずれかに記載の塩基配列からなる遺伝子の生体組織中での発現の有無または発現レベル（発現量）が評価できる。
【００３７】
なお、上記ＤＮＡチップは、配列番号：１〜２６７のいずれかで示される塩基配列を有する遺伝子と結合し得る１種または２種以上の本発明疾患マーカーを含んでいればよい。複数の疾患マーカーを含むＤＮＡチップの利用によれば、ひとつの生体試料について、同時に複数の遺伝子の発現の有無または発現レベルの評価が可能である。
【００３８】
本発明の疾患マーカーは、アルツハイマー病の診断、検出（罹患の有無や罹患の程度の診断）に有用である。具体的には、該疾患マーカーを利用したアルツハイマー病の診断は、被験者の海馬組織と正常者の海馬組織における配列番号：１〜２６７のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子の遺伝子発現レベルの違いを判定することによって行うことができる。
【００３９】
この場合、遺伝子発現レベルの違いには、発現のある／なしの違いだけでなく、被験者の海馬組織と正常者の海馬組織の両者ともに発現がある場合でも、両者間の発現量の格差が２倍以上、好ましくは３倍以上の場合が含まれる。
【００４０】
より具体的には、配列番号：１〜９６に記載の塩基配列を有する遺伝子は、アルツハイマー病患者（初期患者および／または後期患者）の海馬組織で特異的に発現誘導（発現増大）を示していた。従って、配列番号：１〜９６のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子が、被験者の海馬組織で特異的に発現しているか、或いは、該発現量が正常者の海馬組織の発現量と比べて２倍以上、より好ましくは３倍以上増大していれば、被験者についてアルツハイマー病の罹患が疑われる。この場合のアルツハイマー病の検出（診断）には、上記遺伝子に対応するいずれかに記載の塩基配列（配列番号：１〜９６のいずれかに記載の塩基配列）において、連続する少なくとも１５塩基長を有するポリヌクレオチド及び／またはそれに相補的なポリヌクレオチドからなる本発明の疾患マーカーが有用である。
【００４１】
中でも、配列番号：１、２、３、４、５、６、７、４０、４１、４２、４３、４４、７２、７３、７４および８８に記載の塩基配列を有する遺伝子は、正常な海馬組織に比べてアルツハイマー病患者（初期患者および／または後期患者）の海馬組織で４倍以上の発現増大を示していた。従って、これらの遺伝子に対応するいずれかの塩基配列（配列番号：１、２、３、４、５、６、７、４０、４１、４２、４３、４４、７２、７３、７４および８８のいずれかに記載の塩基配列）において、連続する少なくとも１５塩基長を有するポリヌクレオチド及び／またはそれに相補的なポリヌクレオチドからなる本発明の疾患マーカーがより有用である。
【００４２】
特に、配列番号：１、２、４０および７２に記載の塩基配列を有する遺伝子は、正常な海馬組織に比べてアルツハイマー病患者（初期患者および／または後期患者）の海馬組織で５倍以上の発現増大を示していた。従って、これらの遺伝子に対応するいずれかの塩基配列（配列番号：１、２、４０および７２のいずれかに記載の塩基配列）において、連続する少なくとも１５塩基長を有するポリヌクレオチド及び／またはそれに相補的なポリヌクレオチドからなる本発明の疾患マーカーは特に有用である。
【００４３】
一方、配列番号：９７〜２６７に記載の塩基配列を有する遺伝子は、正常な海馬組織に比して、アルツハイマー病患者（初期患者および／または後期患者）の海馬組織で特異的に発現減少を示していた。従って、配列番号：９７〜２６７のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子が、被験者の海馬組織で発現していないか、或いは、該発現量が正常な海馬組織と比べて２倍以上、より好ましくは３倍以上減少していれば、被験者についてアルツハイマー病の罹患が疑われる。この場合のアルツハイマー病の検出（診断）には、上記遺伝子に対応するいずれかの塩基配列（配列番号：９７〜２６７のいずれかに記載の塩基配列）において、連続する少なくとも１５塩基長を有するポリヌクレオチド及び／またはそれに相補的なポリヌクレオチドからなる本発明の疾患マーカーが有用である。
【００４４】
中でも、配列番号：９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１および２２２に記載の塩基配列を有する遺伝子は、正常な海馬組織に比べてアルツハイマー病患者（初期患者および／または後期患者）の海馬組織で４倍以上の発現減少を示していた。従って、これらの遺伝子に対応するいずれかの塩基配列（配列番号：９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１および２２２のいずれかに記載の塩基配列）において、連続する少なくとも１５塩基長を有するポリヌクレオチド及び／またはそれに相補的なポリヌクレオチドからなる本発明の疾患マーカーがより有用である。
【００４５】
特に、配列番号：９７、９８、９９、１００、１２０、１２１、１２２、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、２１５、２１６、２１７および２１８に記載の塩基配列を有する遺伝子は、正常な海馬組織に比べてアルツハイマー病患者（初期患者および／または後期患者）の海馬組織で５倍以上の発現減少を示していた。従って、これらの遺伝子に対応するいずれかの塩基配列（配列番号：９７、９８、９９、１００、１２０、１２１、１２２、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、２１５、２１６、２１７および２１８のいずれかに記載の塩基配列）において、連続する少なくとも１５塩基長を有するポリヌクレオチド及び／またはそれに相補的なポリヌクレオチドからなる本発明の疾患マーカーは特に有用である。
【００４６】
また、配列番号：９８、９９、１００、１０２、１１２、１１５、１２１、１２２、１２３および１３０の塩基配列を有する遺伝子は、正常な海馬組織に比べて、アルツハイマー病初期患者および後期患者双方の海馬組織で、ともに３倍以上の発現減少を示していた。従って、これらの遺伝子に対応するいずれかの塩基配列（配列番号：９８、９９、１００、１０２、１１２、１１５、１２１、１２２、１２３および１３０のいずれかに記載の塩基配列）において、連続する少なくとも１５塩基長を有するポリヌクレオチド及び／またはそれに相補的なポリヌクレオチドからなる本発明の疾患マーカーは特に有用である。
【００４７】
本発明においてアルツハイマー病の検出（診断）は、被験者の生体組織、特に海馬組織における配列番号：１〜２６７のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子の少なくとも１つの発現の有無または発現レベル（発現量）を評価することによって行われる。検出（診断）の精度や正確性を高めるためには、上記遺伝子群の２以上、好ましくは複数個の遺伝子、より好ましくは上記遺伝子群の４分の１以上、さらに好ましくは上記遺伝子群の半数以上の遺伝子について、その発現の有無または発現レベル（発現量）を評価することが望ましい。
【００４８】
（１−３） 抗体
本発明は、アルツハイマー病の疾患マーカーとして、配列番号：１〜２６７のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子の発現産物（タンパク質）を特異的に認識することのできる抗体を提供する。
【００４９】
該遺伝子発現産物（タンパク質）として、具体的には上記配列番号：１〜２６７のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子によってコードされるタンパク質、より具体的にはこれらの遺伝子のうち、配列番号：５、１１、１９、２６、７２、７８、８１、８７、１４２、１４３、１４７、１５６、１６３、１６４、１７６、１８０、１８３、１８４、１８６、１８９、１９２、２０２、２０３、２０４、２０５および２０６のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子（以下、これらの遺伝子を総称して遺伝子ＩＩＩともいう）によってコードされるタンパク質を例示することができる。なお、後者のタンパク質の具体的な態様としては、配列番号：２６８〜２９３で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質が例示できる。
【００５０】
すなわち、配列番号：５に記載の塩基配列を有する遺伝子によってコードされるタンパク質の具体的態様としては、配列番号：２６８で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を、配列番号：１１に記載の塩基配列を有する遺伝子によってコードされるタンパク質の具体的態様としては、配列番号：２６９で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を、配列番号：１９に記載の塩基配列を有する遺伝子によってコードされるタンパク質の具体的態様としては、配列番号：２７０で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を、配列番号：２６に記載の塩基配列を有する遺伝子によってコードされるタンパク質の具体的態様としては、配列番号：２７１で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を、配列番号：７２に記載の塩基配列を有する遺伝子によってコードされるタンパク質の具体的態様としては、配列番号：２７２で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を、配列番号：７８に記載の塩基配列を有する遺伝子によってコードされるタンパク質の具体的態様としては、配列番号：２７３で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を、配列番号：８１に記載の塩基配列を有する遺伝子によってコードされるタンパク質の具体的態様としては、配列番号：２７４で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を、配列番号：８７に記載の塩基配列を有する遺伝子によってコードされるタンパク質の具体的態様としては、配列番号：２７５で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を、配列番号：１４２に記載の塩基配列を有する遺伝子によってコードされるタンパク質の具体的態様としては、配列番号：２７６で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を、配列番号：１４３に記載の塩基配列を有する遺伝子によってコードされるタンパク質の具体的態様としては、配列番号：２７７で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を、配列番号：１４７に記載の塩基配列を有する遺伝子によってコードされるタンパク質の具体的態様としては、配列番号：２７８で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を、配列番号：１５６に記載の塩基配列を有する遺伝子によってコードされるタンパク質の具体的態様としては、配列番号：２７９で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を、配列番号：１６３に記載の塩基配列を有する遺伝子によってコードされるタンパク質の具体的態様としては、配列番号：２８０で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を、配列番号：１６４に記載の塩基配列を有する遺伝子によってコードされるタンパク質の具体的態様としては、配列番号：２８１で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を、配列番号：１７６に記載の塩基配列を有する遺伝子によってコードされるタンパク質の具体的態様としては、配列番号：２８２で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を、配列番号：１８０に記載の塩基配列を有する遺伝子によってコードされるタンパク質の具体的態様としては、配列番号：２８３で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を、配列番号：１８３に記載の塩基配列を有する遺伝子によってコードされるタンパク質の具体的態様としては、配列番号：２８４で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を、配列番号：１８４に記載の塩基配列を有する遺伝子によってコードされるタンパク質の具体的態様としては、配列番号：２８５で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を、配列番号：１８６に記載の塩基配列を有する遺伝子によってコードされるタンパク質の具体的態様としては、配列番号：２８６で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を、配列番号：１８９に記載の塩基配列を有する遺伝子によってコードされるタンパク質の具体的態様としては、配列番号：２８７で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を、配列番号：１９２に記載の塩基配列を有する遺伝子によってコードされるタンパク質の具体的態様としては、配列番号：２８８で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を、配列番号：２０２に記載の塩基配列を有する遺伝子によってコードされるタンパク質の具体的態様としては、配列番号：２８９で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を、配列番号：２０３に記載の塩基配列を有する遺伝子によってコードされるタンパク質の具体的態様としては、配列番号：２９０で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を、配列番号：２０４に記載の塩基配列を有する遺伝子によってコードされるタンパク質の具体的態様としては、配列番号：２９１で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を、配列番号：２０５に記載の塩基配列を有する遺伝子によってコードされるタンパク質の具体的態様としては、配列番号：２９２で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を、また、配列番号：２０６に記載の塩基配列を有する遺伝子によってコードされるタンパク質の具体的態様としては、配列番号：２９３で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を、それぞれ例示することができる。
【００５１】
本発明の抗体は、その形態に特に制限はなく、上記タンパク質を免疫抗原とするポリクローナル抗体であっても、またそのモノクローナル抗体であってもよい。さらに、当該タンパク質を構成するアミノ酸配列のうち少なくとも連続する、通常８アミノ酸、好ましくは１５アミノ酸、更に好ましくは２０アミノ酸からなるポリペプチドに対して抗原結合性を有する抗体も、本発明の抗体に含まれる。
【００５２】
これらの抗体の製造方法は、すでに周知であり、本発明の抗体もこれらの常法に従って製造することができる（Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｅｄｉｔ． Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ． （１９８７） Ｐｕｂｌｉｓｈ． Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ． Ｓｅｃｔｉｏｎ １１．１２〜１１．１３）。具体的には、本発明の抗体がポリクローナル抗体の場合には、常法に従って大腸菌等で発現し精製した上記タンパク質を用いて、あるいは常法に従って当該タンパク質の部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチドを合成して、家兎等の非ヒト動物に免疫し、該免疫動物の血清から常法に従って得ることが可能である。一方、モノクローナル抗体の場合には、常法に従って大腸菌等で発現し精製した上記タンパク質、あるいはこれらタンパク質の部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチドをマウス等の非ヒト動物に免疫し、得られた脾臓細胞と骨髄腫細胞とを細胞融合させて調製したハイブリドーマ細胞の中から得ることができる（Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｅｄｉｔ． Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ． （１９８７） Ｐｕｂｌｉｓｈ． Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ． Ｓｅｃｔｉｏｎ １１．４〜１１．１１）。
【００５３】
また、抗体の作製に使用されるタンパク質は、本発明により提供される遺伝子の配列情報（配列番号：１〜２６７）に基づいて、ＤＮＡクローニング、各プラスミドの構築、宿主へのトランスフェクション、形質転換体の培養および培養物からのタンパク質の回収の操作により得ることができる。これらの操作は、当業者に既知の方法、あるいは文献記載の方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．， ＣＳＨ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ （１９８３）， ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ， ＤＭ． Ｇｌｏｖｅｒ， ＩＲＬ ＰＲＥＳＳ （１９８５））などに準じて行うことができる。具体的には配列番号：１〜２６７のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子、より具体的には、例えば配列番号：５、１１、１９、２６、７２、７８、８１、８７、１４２、１４３、１４７、１５６、１６３、１６４、１７６、１８０、１８３、１８４、１８６、１８９、１９２、２０２、２０３、２０４、２０５および２０６のいずれかに例示される塩基配列を有する遺伝子（遺伝子ＩＩＩ）（配列番号：２６８〜２９３のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子）が所望の宿主細胞中で発現できる組み換えＤＮＡ（発現ベクター）を作製し、これを宿主細胞に導入して形質転換し、該形質転換体を培養して、得られる培養物から、目的タンパク質を回収することによって実施することができる。また、これらのタンパク質は、本発明により提供される遺伝子情報（配列番号１〜２６７）から常法によって得られるアミノ酸配列や本発明により提供されるアミノ酸配列情報（具体的には、例えば配列番号：２６８〜２９３）に従って、一般的な化学合成法（ペプチド合成）によって製造することもできる。
【００５４】
なお、本発明のタンパク質には、配列番号：１〜２６７のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子によりコードされるタンパク質、より具体的には配列番号：５、１１、１９、２６、７２、７８、８１、８７、１４２、１４３、１４７、１５６、１６３、１６４、１７６、１８０、１８３、１８４、１８６、１８９、１９２、２０２、２０３、２０４、２０５および２０６のいずれかに例示される塩基配列を有する遺伝子によりコードされるタンパク質（配列番号：２６８〜２９３のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質）のみならず、その相同物も包含される。該相同物としては、配列番号：１〜２６７のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列、より具体的には配列番号：２６８〜２９３のいずれかで示されるアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、それぞれのタンパク質の機能と同等の生物学的機能を有するか、及び／または免疫学的活性において同等の活性を有するタンパク質を挙げることができる。
【００５５】
なお、ここで配列番号：１〜２６７のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子によりコードされるタンパク質、より具体的には配列番号：５、１１、１９、２６、７２、７８、８１、８７、１４２、１４３、１４７、１５６、１６３、１６４、１７６、１８０、１８３、１８４、１８６、１８９、１９２、２０２、２０３、２０４、２０５および２０６のいずれかに例示される塩基配列を有する遺伝子によりコードされるタンパク質（配列番号：２６８〜２９３のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質）の機能と同等の生物学的機能を有するタンパク質としては、各々対応するタンパク質と生化学的または薬理学的機能において同等の機能を有するタンパク質を挙げることができる。また配列番号：１〜２６７のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子によりコードされるタンパク質、より具体的には配列番号：５、１１、１９、２６、７２、７８、８１、８７、１４２、１４３、１４７、１５６、１６３、１６４、１７６、１８０、１８３、１８４、１８６、１８９、１９２、２０２、２０３、２０４、２０５および２０６のいずれかに例示される塩基配列を有する遺伝子によりコードされるタンパク質（配列番号：２６８〜２９３のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質）と免疫学的活性において同等の活性を有するタンパク質としては、適当な動物あるいはその細胞において特定の免疫反応を誘発し、かつ各対応するタンパク質に対する抗体と特異的に結合する能力を有するタンパク質を挙げることができる。
【００５６】
なお、タンパク質におけるアミノ酸の変異数や変異部位は、その生物学的機能及び／または免疫学的活性が保持される限り制限はない。生物学的機能や免疫学的活性を喪失することなくアミノ酸残基が、どのように、何個置換、挿入あるいは欠失されればよいかを決定する指標は、当業者に周知のコンピュータプログラム、例えばＤＮＡ Ｓｔａｒ ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて見出すことができる。例えば変異数は、典型的には、全アミノ酸の１０％以内であり、好ましくは全アミノ酸の５％以内であり、さらに好ましくは全アミノ酸の１％以内である。また置換されるアミノ酸は、置換後に得られるタンパク質が、置換前のタンパク質（配列番号：１〜２６７のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子によりコードされるタンパク質、より具体的には配列番号：５、１１、１９、２６、７２、７８、８１、８７、１４２、１４３、１４７、１５６、１６３、１６４、１７６、１８０、１８３、１８４、１８６、１８９、１９２、２０２、２０３、２０４、２０５および２０６のいずれかに例示される塩基配列を有する遺伝子によりコードされるタンパク質（配列番号：２６８〜２９３のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質））の生物学的機能及び／または免疫学的活性を保持している限り、特に制限されないが、タンパク質の構造保持の観点から、残基の極性、電荷、可溶性、疎水性、親水性並びに両親媒性など、置換前のアミノ酸と似た性質を有するアミノ酸であることが好ましい。例えば、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ及びＴｒｐは互いに非極性アミノ酸に分類されるアミノ酸であり、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ及びＧｌｎは互いに非荷電性アミノ酸に分類されるアミノ酸であり、Ａｓｐ及びＧｌｕは互いに酸性アミノ酸に分類されるアミノ酸であり、またＬｙｓ、Ａｒｇ及びＨｉｓは互いに塩基性アミノ酸に分類されるアミノ酸である。ゆえに、これらを指標として同群に属するアミノ酸を適宜選択することができる。
【００５７】
また本発明の抗体は、配列番号：１〜２６７のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子によりコードされるタンパク質、より具体的には配列番号：５、１１、１９、２６、７２、７８、８１、８７、１４２、１４３、１４７、１５６、１６３、１６４、１７６、１８０、１８３、１８４、１８６、１８９、１９２、２０２、２０３、２０４、２０５および２０６のいずれかに例示される塩基配列を有する遺伝子によりコードされるタンパク質（配列番号：２６８〜２９３のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質）（または当該タンパク質の相同物）の部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチドを用いて調製されるものであってもよい。かかる抗体誘導のために用いられるオリゴペプチドは、機能的な生物活性を有することは要しないが、各々対応する上記のタンパク質と同様な免疫原特性を有するものであることが望ましい。好ましくはかかる特性を有し、配列番号：１〜２６７のいずれかで示される塩基配列を有する遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列、より具体的には例えば配列番号：５、１１、１９、２６、７２、７８、８１、８７、１４２、１４３、１４７、１５６、１６３、１６４、１７６、１８０、１８３、１８４、１８６、１８９、１９２、２０２、２０３、２０４、２０５および２０６のいずれかに例示される塩基配列を有する遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列（配列番号：２６８〜２９３のいずれかに示されるアミノ酸配列）において少なくとも連続する８アミノ酸、好ましくは１５アミノ酸、より好ましくは２０アミノ酸からなるポリペプチドを例示することができる。
【００５８】
かかるポリペプチドに対する抗体の生成は、宿主に応じて種々のアジュバントを用いて免疫学的反応を高めることによって行うこともできる。限定はされないが、そのようなアジュバントには、フロイントアジュバント、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル、並びにリゾレシチン、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン及びジニトロフェノールのような表面活性物質、ＢＣＧ（カルメット−ゲラン桿菌）やコリネバクテリウム−パルヴムなどのヒトアジュバントなどがある。
【００５９】
本発明の抗体は配列番号：１〜２６７のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子によりコードされるタンパク質、より具体的には配列番号：５、１１、１９、２６、７２、７８、８１、８７、１４２、１４３、１４７、１５６、１６３、１６４、１７６、１８０、１８３、１８４、１８６、１８９、１９２、２０２、２０３、２０４、２０５および２０６のいずれかに例示される塩基配列を有する遺伝子によりコードされるタンパク質（配列番号：２６８〜２９３のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質）（または当該タンパク質の相同物）に特異的に結合する性質を有することから、該抗体を利用することによって、被験者の組織内に発現した上記タンパク質（その相同物を含む）を特異的に検出することができる。すなわち、当該抗体は被験者の組織内における上記タンパク質（その相同物を含む）発現の有無を検出するためのプローブとして有用である。
【００６０】
具体的には、患者の生体組織、特に海馬組織の一部をバイオプシ等で採取し、そこから常法に従ってタンパク質を調製して、例えばウェスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ法など公知の検出方法において、上記抗体を常法に従ってプローブとして使用することによって、上記タンパク質を検出することができる。
【００６１】
アルツハイマー病の診断に際しては、被験者の海馬組織における配列番号：１〜２６７のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子によりコードされるタンパク質、より具体的には配列番号：５、１１、１９、２６、７２、７８、８１、８７、１４２、１４３、１４７、１５６、１６３、１６４、１７６、１８０、１８３、１８４、１８６、１８９、１９２、２０２、２０３、２０４、２０５および２０６のいずれかに例示される塩基配列を有する遺伝子によりコードされるタンパク質（配列番号：２６８〜２９３のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質）のいずれか少なくとも１つの量と、正常な海馬組織における当該タンパク質の量との違いを判定すればよい。この場合、タンパク量の違いには、タンパク質のある／なし、あるいはタンパク量の違いが２倍以上、好ましくは３倍以上の場合が含まれる。
【００６２】
具体的には、配列番号：１〜９６に示される塩基配列を有する遺伝子はアルツハイマー病患者（初期患者および／または後期患者）の海馬組織で特異的に発現誘導（増大）を示していたので、被験者の海馬組織における該遺伝子の発現産物（配列番号：１〜９６のいずれかに示される塩基配列を有する遺伝子によってコードされるタンパク質、より具体的には配列番号：５、１１、１９、２６、７２、７８、８１および８７のいずれかに例示される塩基配列を有する遺伝子によってコードされるタンパク質（配列番号：２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４および２７５のいずれかで示されるアミノ酸配列を有するタンパク質））の量が正常な海馬組織の発現産物量と比べて２倍以上、好ましくは３倍以上多いことが判定されれば、アルツハイマー病の罹患が疑われる。
【００６３】
この場合のアルツハイマー病の検出（診断）には、配列番号：１〜９６のいずれかに示される塩基配列を有する遺伝子によってコードされるタンパク質、より具体的には配列番号：５、１１、１９、２６、７２、７８、８１および８７に例示されるいずれかの塩基配列を有する遺伝子によってコードされるタンパク質（配列番号：２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４および２７５のいずれかで示されるアミノ酸配列を有するタンパク質）を特異的に認識する抗体を有する本発明の疾患マーカーが有用である。
【００６４】
中でも配列番号：１、２、３、４、５、６、７、４０、４１、４２、４３、４４、７２、７３、７４および８８に示される塩基配列を有する遺伝子は、正常な海馬組織に比べてアルツハイマー病患者（初期患者および／または後期患者）の海馬組織で４倍以上の発現誘導（増大）を示していた。このため、配列番号：１、２、３、４、５、６、７、４０、４１、４２、４３、４４、７２、７３、７４および８８のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子によってコードされるタンパク質、より具体的には例えば配列番号：２６８および２７２で示されるいずれかのアミノ酸配列を有するタンパク質を特異的に認識する抗体を有する疾患マーカーは、アルツハイマー病の検出（診断）に特に有用であると考えられる。
【００６５】
一方、配列番号：９７〜２６７に示される塩基配列を有する遺伝子はアルツハイマー病患者（初期患者および／または後期患者）の海馬組織で特異的に発現抑制（減少）を示していたので、被験者の海馬組織における該遺伝子の発現産物（配列番号：９７〜２６７のいずれかに示される塩基配列を有する遺伝子によってコードされるタンパク質、より具体的には配列番号：１４２、１４３、１４７、１５６、１６３、１６４、１７６、１８０、１８３、１８４、１８６、１８９、１９２、２０２、２０３、２０４、２０５および２０６のいずれかに例示される塩基配列を有する遺伝子によってコードされるタンパク質（配列番号：２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２および２９３のいずれかで示されるアミノ酸配列を有するタンパク質））の量が正常な海馬組織の発現産物量と比べて２倍以上、好ましくは３倍以上少ないことが判定されれば、アルツハイマー病の罹患が疑われる。
【００６６】
この場合のアルツハイマー病の検出（診断）には、配列番号：９７〜２６７のいずれかに示される塩基配列を有する遺伝子によってコードされるタンパク質、より具体的には配列番号：１４２、１４３、１４７、１５６、１６３、１６４、１７６、１８０、１８３、１８４、１８６、１８９、１９２、２０２、２０３、２０４、２０５および２０６に例示されるいずれかの塩基配列を有する遺伝子によってコードされるタンパク質（配列番号：２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２および２９３のいずれかで示されるアミノ酸配列を有するタンパク質）を特異的に認識する抗体を有する本発明の疾患マーカーが有用である。
【００６７】
中でも配列番号：９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１および２２２に示される塩基配列を有する遺伝子は、正常な海馬組織に比べてアルツハイマー病患者（初期患者および／または後期患者）の海馬組織で４倍以上の発現抑制（減少）を示していた。このため、配列番号：９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１および２２２のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子によってコードされるタンパク質、より具体的には配列番号：２７６、２７７および２７８で示されるいずれかのアミノ酸配列を有するタンパク質を特異的に認識する抗体を有する疾患マーカーは、アルツハイマー病の検出（診断）に特に有用であると考えられる。
【００６８】
また、配列番号：９８、９９、１００、１０２、１１２、１１５、１２１、１２２、１２３および１３０の塩基配列を有する遺伝子は、正常な海馬組織に比べて、アルツハイマー病初期患者および後期患者双方の海馬組織で、ともに３倍以上の発現減少を示していた。従って、配列番号：９８、９９、１００、１０２、１１２、１１５、１２１、１２２、１２３および１３０のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子によってコードされるタンパク質を特異的に認識する抗体を有する疾患マーカーは、アルツハイマー病の検出（診断）に特に有用であると考えられる。
【００６９】
（２）アルツハイマー病の検出方法（診断方法）
本発明は、前述する本発明のアルツハイマー病の疾患マーカーを利用したアルツハイマー病の診断方法を提供するものである。
【００７０】
具体的には、本発明の検出方法は、被験者の生体組織、特に海馬組織の一部をバイオプシなどで採取し、そこに含まれるアルツハイマー病に関連する配列番号：１〜２６７のいずれかで示される塩基配列を有する遺伝子の遺伝子発現レベル（発現量）、またはこれらの遺伝子に由来するタンパク質を検出し、その発現量またはそのタンパク質量を測定することにより、アルツハイマー病の罹患の有無またはその程度を検出（診断）するものである。
【００７１】
本発明の診断方法は次の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の工程を含むものである：
（ａ） 被験者の生体試料と本発明の疾患マーカーを接触させる工程、
（ｂ） 生体試料中の配列番号：１〜２６７のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子の遺伝子発現レベル、または配列番号：１〜２６７のいずれかに示される塩基配列を有する遺伝子によってコードされるタンパク質の量、具体的には配列番号：２６８〜２９３のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の量を、上記疾患マーカーを指標として測定する工程、
（ｃ） （ｂ）の結果をもとに、アルツハイマー病の罹患を判断する工程。
【００７２】
ここで用いられる生体試料は、被験者の生体組織、特に海馬組織、該組織から調製されるＲＮＡ若しくはそれからさらに調製されるポリヌクレオチド、または上記組織から調製されるタンパク質である。かかるＲＮＡ、ポリヌクレオチドまたはタンパク質は、被験者の生体組織、特に海馬組織の一部をバイオプシ等で採取し、そこから常法に従って調製することができる。
【００７３】
本発明の診断方法は、測定対象として用いる生体試料の種類に応じて、具体的には下記のようにして実施される。
【００７４】
（２−１） 測定対象の生体試料としてＲＮＡを利用する場合
診断に用いる生体試料としてＲＮＡを利用する場合は、本発明の検出方法（診断方法）は該ＲＮＡ中の配列番号：１〜２６７のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子の発現レベルを検出し、測定することによって実施される。
【００７５】
この場合、本発明の検出方法は次の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の工程を含むものである：
（ａ） 被験者の生体試料と本発明の疾患マーカーを接触させる工程、
（ｂ） 上記工程によって本発明の疾患マーカーに特異的に結合した生体試料由来のＲＮＡまたはそれから転写された相補的なポリヌクレオチドを上記疾患マーカーを指標として測定する工程、及び
（ｃ） （ｂ）の結果をもとに、アルツハイマー病の罹患を判断する工程。
【００７６】
本発明のアルツハイマー病の検出方法（診断方法）は、特に測定対象の生体試料としてＲＮＡを利用して、該ＲＮＡ中の配列番号：１〜２６７のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子の発現レベルを検出し、測定することによって実施される。具体的には、上記検出する遺伝子の塩基配列に応じて、前述する本発明の疾患マーカー（配列番号：１〜２６７のいずれかに記載の塩基配列において連続する少なくとも１５塩基を有するポリヌクレオチド及び／又はその相補的なポリヌクレオチド）をプライマーまたはプローブとして用いて、ノーザンブロット法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＤＮＡチップ解析法、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション解析法などの公知の方法を行うことにより実施できる。
【００７７】
ノーザンブロット法を利用する場合は、本発明の上記疾患マーカーをプローブとして用いることによって、ＲＮＡ中の配列番号：１〜２６７のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子の発現の有無やその発現レベルを検出、測定することができる。具体的には、本発明の疾患マーカー（相補鎖）を放射性同位元素（３２Ｐ、３３Ｐなど：ＲＩ）や蛍光物質などで標識し、それを、常法に従ってナイロンメンブレン等にトランスファーした被験者の生体組織由来のＲＮＡとハイブリダイズさせた後、形成された標識疾患マーカー（ＤＮＡ）とＲＮＡとの二重鎖について、該疾患マーカーの標識物（ＲＩ若しくは蛍光物質など）に由来するシグナルを放射線検出器（ＢＡＳ−１８００ＩＩ、富士フィルム社製）または蛍光検出器で検出、測定する方法を例示することができる。また、ＡｌｋＰｈｏｓ Ｄｉｒｅｃｔ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ ａｎｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ （Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用いて、該プロトコールに従って疾患マーカー（プローブＤＮＡ）を標識し、被験者の生体組織由来のＲＮＡとハイブリダイズさせた後、疾患マーカーの標識物に由来するシグナルをマルチバイオイメージャーＳＴＯＲＭ８６０（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）で検出、測定する方法を使用することもできる。
【００７８】
ＲＴ−ＰＣＲ法を利用する場合は、本発明の上記疾患マーカーをプライマーとして用いることによって、ＲＮＡ中の配列番号：１〜２６７のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子の発現の有無や発現レベルを検出、測定することができる。具体的には、被験者の生体組織由来のＲＮＡから常法に従ってｃＤＮＡを調製し、これを鋳型として標的の遺伝子の領域が増幅できるように、本発明の疾患マーカーから調製した一対のプライマー（上記ｃＤＮＡ（−鎖）に結合する正鎖、＋鎖に結合する逆鎖）をこれとハイブリダイズさせて、常法に従ってＰＣＲ法を行い、得られた増幅二本鎖ＤＮＡを検出する方法を例示することができる。なお、増幅された二本鎖ＤＮＡの検出は、予めＲＩや蛍光物質などで標識しておいたプライマーを用いて上記ＰＣＲを行うことによって産生される標識二本鎖ＤＮＡを検出する方法、産生された二本鎖ＤＮＡを常法に従ってナイロンメンブレン等にトランスファーさせて、標識した疾患マーカーをプローブとして使用してこれとハイブリダイズさせて検出する方法などを用いることができる。なお、生成された標識二本鎖ＤＮＡ産物はアジレント２１００バイオアナライザ（横河アナリティカルシステムズ社製）などで測定することができる。また、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＲＴ−ＰＣＲ Ｒｅａｇｅｎｔｓ （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ 社製）で該プロトコールに従ってＲＴ−ＰＣＲ反応液を調製し、ＡＢＩ ＰＲＩＭＥ ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ 社製）で反応させて、該反応物を検出することもできる。
【００７９】
また、ＤＮＡチップ解析を利用する場合は、本発明の上記疾患マーカーをＤＮＡプローブ（１本鎖または２本鎖）として貼り付けたＤＮＡチップを用意し、これに被験者の生体組織由来のＲＮＡから常法によって調製されたｃＲＮＡをハイブリダイズさせて、形成されたＤＮＡとｃＲＮＡとの二本鎖を、本発明の疾患マーカーから調製される標識プローブと結合させて検出する方法を挙げることができる。また、上記ＤＮＡチップとして、配列番号：１〜２６７のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子の遺伝子発現レベルの検出、測定が可能なＤＮＡチップを用いることもできる。かかる遺伝子の発現レベルを検出、測定することができるＤＮＡチップとしては、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社のＧｅｎｅ Ｃｈｉｐ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｕ９５ Ａ， Ｂ，Ｃ， Ｄ， Ｅを挙げることができる。かかるＤＮＡチップを用いた、被験者ＲＮＡ中の配列番号：１〜２６７のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子の遺伝子発現レベルの検出、測定については、実施例において詳細に説明する。
【００８０】
（２−２） 測定対象物としてタンパク質を用いる場合
測定対象物としてタンパク質を用いる場合は、本発明の検出方法（診断方法）は生体試料中に存在する、配列番号：１〜２６７のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子によってコードされるタンパク質、より具体的には配列番号：５、１１、１９、２６、７２、７８、８１、８７、１４２、１４３、１４７、１５６、１６３、１６４、１７６、１８０、１８３、１８４、１８６、１８９、１９２、２０２、２０３、２０４、２０５および２０６に例示されるいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子（遺伝子ＩＩＩ）によりコードされるタンパク質（配列番号：２６８〜２９３のいずれかに示されるアミノ酸配列を有するタンパク質）を検出し、その量（レベル）を測定することによって実施される。より詳しくは、配列番号：１〜２６７のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子によってコードされるタンパク質、より具体的には配列番号：５、１１、１９、２６、７２、７８、８１、８７、１４２、１４３、１４７、１５６、１６３、１６４、１７６、１８０、１８３、１８４、１８６、１８９、１９２、２０２、２０３、２０４、２０５および２０６に例示されるいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子（遺伝子ＩＩＩ）によりコードされるタンパク質（配列番号：２６８〜２９３のいずれかに示されるアミノ酸配列を有するタンパク質）を認識する抗体を疾患マーカーとして用いて、ウエスタンブロット法などの公知方法で、上記タンパク質を検出、定量する方法を挙げることができる。
【００８１】
ウエスタンブロット法は、一次抗体として上記の抗体を用いた後、二次抗体として１２５Ｉなどの放射性同位元素や蛍光物質などで標識した標識抗体（一次抗体に結合する標識抗体）を用いて、標識し、該放射性同位元素若しくは蛍光物質などに由来するシグナルを放射線測定器（ＢＡＳ−１８００ＩＩ：富士フィルム社製など）若しくは蛍光検出器で検出し、測定することによって実施できる。また、一次抗体として本発明の上記疾患マーカーを用いた後、ＥＣＬ Ｐｌｕｓ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ （Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ 社製）を用いて、該プロトコールに従って検出し、マルチバイオイメージャーＳＴＯＲＭ８６０（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ 社製）で測定することもできる。
【００８２】
（２−３）アルツハイマー病の診断
アルツハイマー病の診断は、具体的には、被験者の生体組織、特に海馬組織における配列番号：１〜２６７のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子の遺伝子発現レベル、または配列番号：１〜２６７のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子の発現産物であるタンパク質、より具体的には配列番号：２６８〜２９３のいずれかで示されるアミノ酸配列を有するタンパク質の量（レベル）を、上記と対応する正常な生体組織（特に、正常な海馬組織）における当該遺伝子発現レベルまたは当該タンパク質の量（レベル）と比較し、両者の違いを判定することによって行うことができる。
【００８３】
この場合、正常な生体組織、特に海馬組織から採取調製した生体試料（ＲＮＡまたはタンパク質）が必要であるが、これらはアルツハイマー病に罹患していない人の生体組織、特に海馬組織をバイオプシ等で採取することによって取得することができる。なお、ここでいう「アルツハイマー病に罹患していない人」とは、少なくともアルツハイマー病の自覚症状がなく、好ましくは他の検査方法、例えば改訂長谷川式簡易知能スケール（ＨＤＳ−Ｒ）法により検査の結果、アルツハイマー病でないと診断された人をいう。なお、当該「アルツハイマー病に罹患していない人」を以下、本明細書では単に正常者という場合もある。以下、具体的な診断方法について、海馬組織から採取調製した生体試料を例として記載する。
【００８４】
被験者の海馬組織と正常な海馬組織（アルツハイマー病に罹患していない人の海馬組織）との遺伝子発現レベルまたはその発現産物（タンパク質）量（レベル）の比較は、被験者の生体試料と正常者の生体試料を対象とした測定を並行して行うことで実施できる。並行して行なわない場合は、複数（少なくとも２つ、好ましくは３以上、より好ましくは５以上）の正常な海馬組織を用いて均一な測定条件で測定して得られた上記遺伝子の遺伝子発現レベル、若しくはこれらの遺伝子の発現産物であるタンパク質の量（レベル）の平均値または統計的中間値を予め求めておき、これを正常者の遺伝子発現レベルまたはその発現産物（タンパク質）の量（正常値）として、これらを被験者における測定レベルまたは測定値と比較することができる。
【００８５】
被験者が、アルツハイマー病であるかどうかの判断は、該被験者の海馬組織における配列番号：１〜２６７のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子の遺伝子発現レベル、またはその発現産物（タンパク質）の量（レベル）、より具体的には配列番号：２６８〜２９３のいずれかで示されるアミノ酸配列を有するタンパク質の量（レベル）が、正常者のそれらと比較して２倍以上、好ましくは３倍以上の変動があるか（多いかまたは少ないか）否かを指標として行うことができる。
【００８６】
具体的には、被験者において、上記遺伝子のうち配列番号：１〜９６のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子の遺伝子発現レベル、またはその発現産物（タンパク質）の量（レベル）、より具体的には配列番号：２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４および２７５のいずれかで示されるアミノ酸配列を有するタンパク質の量（レベル）が、正常者の上記に対応する遺伝子の遺伝子発現レベルまたは発現産物の量（レベル）に比べて多い場合、あるいは被験者において、前記遺伝子のうち配列番号：９７〜２６７のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子の遺伝子発現レベル、またはその発現産物（タンパク質）の量（レベル）、より具体的には配列番号：２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２および２９３のいずれかで示されるアミノ酸配列を有するタンパク質の量（レベル）が、正常者のそれらに対応する遺伝子の遺伝子発現レベルまたは発現産物の量（レベル）に比べて少ない場合には、該被験者についてアルツハイマー病が疑われる。
【００８７】
なお、上記方法のうち、（２−１）生体試料としてＲＮＡを利用してアルツハイマー病を検出（診断）する場合、すなわち遺伝子の発現の有無または遺伝子発現レベル（発現量）からアルツハイマー病を検出（診断）する場合は、検出（診断）の精度や正確性を高めるために、配列番号：１〜２６７に示される遺伝子のうち２以上、好ましくは複数個の遺伝子、より好ましくは上記遺伝子群の４分の１以上、さらに好ましくは半数以上について、発現の有無または発現のレベル（発現量）を評価し、その結果からアルツハイマー病を検出（診断）することが望ましい。
【００８８】
また、前記（２−２）測定対象物としてタンパク質を利用してアルツハイマー病を検出（診断）する場合も、上記と同様に、生体試料について、配列番号：１〜２６７に示される遺伝子によりコードされるアミノ酸配列を有するタンパク質（具体的には配列番号：２６８〜２９３のいずれかで示されるアミノ酸配列を有するタンパク質）のうちの２以上、好ましくは複数個のレベルを評価し、その結果からアルツハイマー病を検出（診断）することが望ましい。
【００８９】
複数個の遺伝子またはタンパク質について評価を行う場合には、個々の遺伝子またはタンパク質での評価をスコア化し、総合的にアルツハイマー病を診断することが可能である。一例を挙げると、上記の遺伝子またはタンパク質の中から任意の１０個の遺伝子またはタンパク質について評価を行い、うち９個以上の遺伝子またはタンパク質について上記基準に基づいてアルツハイマー病の病態が疑われると評価される場合は、該疾患である可能性が高いと診断できる。なお、この場合、評価する遺伝子またはタンパク質の数、スコアあるいは診断基準は限定されない。
【００９０】
（３）候補薬のスクリーニング方法
本発明は、配列番号：１〜２６７のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子の発現を制御する物質をスクリーニングする方法を提供する。
【００９１】
本発明のスクリーニング方法は次の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む：
（ａ） 被験物質と、配列番号：１〜２６７のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子またはそのホモログを発現可能な細胞とを接触させる工程、
（ｂ） 被験物質を接触させた細胞について、配列番号：１〜２６７のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子またはそのホモログの遺伝子発現量を測定し、該発現量を被験物質を接触させない対照細胞の上記対応する遺伝子の発現量と比較する工程、
（ｃ） 上記の比較結果に基づいて、配列番号：１〜２６７のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子またはそのホモログの遺伝子発現量を変動させる被験物質を選択する工程。
【００９２】
かかるスクリーニングに用いられる細胞としては、内在性および外来性を問わず、配列番号：１〜２６７のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子を発現し得る神経細胞を挙げることができる。かかる細胞としては、具体的には、脳組織から取得される神経細胞やＩＭＲ３２細胞（ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ／ＳｅａｒｃｈＣａｔａｌｏｇｓ／ＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙ．ｃｆｍ から入手可能）などを挙げることができる。好ましくは脳組織から取得される神経細胞（以下、神経細胞と略記）である。また、かかる神経細胞としては、配列番号：１〜２６７のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子のホモログ、すなわち当該遺伝子のヒト以外の生物種における同族体または変異体をコードする遺伝子を発現し得る細胞を用いることもできる。例えば、配列番号：１〜２６７のいずれかに記載の塩基配列を有するヒト遺伝子に対応するラットホモログ（遺伝子）やマウスホモログ（遺伝子）を内在的に発現している神経細胞を用いることができる。また、かかる神経細胞は、ベータアミロイドなど、神経細胞死の亢進を惹起しうる物質を添加した神経細胞の形でスクリーニングに用いることもできる。さらに本発明のスクリーニングに用いられる細胞の範疇には、細胞の集合体である組織も含まれる。
【００９３】
候補物質となりえるものとしては、制限されないが、核酸（配列番号：１〜９６のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む）、ペプチド、タンパク質、有機化合物、無機化合物などであり、スクリーニングは、具体的にはこれらの候補物質となり得る被験物質を含む試料（被験試料）を上記組織及び／または細胞と接触させて行うことができる。かかる被験試料としては、被験物質を含む、細胞抽出液、遺伝子ライブラリーの発現産物、合成低分子化合物、合成ペプチド、天然化合物、およびこれらの混合物などが挙げられるが、これに制限されない。
【００９４】
本発明スクリーニングに際して、被験物質と細胞とを接触させる条件は、特に制限されないが、該細胞が死滅せず且つ所望遺伝子を発現できる培養条件（温度、ｐＨ、培地組成など）を選択するのが好ましい。
【００９５】
実施例に示すように、アルツハイマー病に罹患した患者の海馬組織では、正常な海馬組織に比して、配列番号：１〜９６のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子（遺伝子Ｉ）の発現レベルの上昇（遺伝子発現の誘導・増大）が認められる。この知見から、配列番号：１〜９６のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子（遺伝子Ｉ）の発現レベルの上昇（遺伝子発現の誘導・増大）は、アルツハイマー病と関連していると考えられる。本発明のスクリーニング方法には、これら遺伝子（遺伝子Ｉ）の発現レベルの上昇（遺伝子発現の誘導・増大）を指標として、当該遺伝子の発現を抑制する物質（発現量を減少させる物質、発現レベルを正常に戻す物質）を探索する方法が包含される。このスクリーニング方法によって、アルツハイマー病の予防、改善ないし治療薬の有効成分となる候補物質が提供できる。
【００９６】
本発明スクリーニング方法は、具体的には以下の工程（ａ）−（ｃ）を含んでいる。
（ａ） 被験物質と、配列番号：１〜９６のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子またはそのホモログを発現可能な細胞とを接触させる工程、
（ｂ） 被験物質を接触させた細胞について、配列番号：１〜９６のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子またはそのホモログの遺伝子発現量を測定し、該発現量を被験物質を接触させない対照細胞の上記対応する遺伝子の発現量と比較する工程、および
（ｃ） 上記の比較結果に基づいて、配列番号：１〜９６のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子またはそのホモログの遺伝子発現を抑制する（遺伝子発現レベルを低下させる）被験物質を選択する工程。
【００９７】
また、実施例に示すように、アルツハイマー病に罹患した患者の海馬組織では、正常な海馬組織に比して、配列番号：９７〜２６７のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子（遺伝子ＩＩ）の発現レベルの低下（遺伝子発現の抑制・減少）が認められる。この知見から、配列番号：９７〜２６７のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子（遺伝子ＩＩ）の発現レベルの低下（遺伝子発現の抑制・減少）は、アルツハイマー病と関連していると考えられる。本発明のスクリーニング方法には、これら遺伝子（遺伝子ＩＩ）の発現レベルの低下（遺伝子発現の抑制・減少）を指標として、当該遺伝子の発現を促進する物質（発現量を増大させる物質、発現レベルを正常レベルに戻す物質）を探索する方法が包含される。このスクリーニング方法によっても、アルツハイマー病の予防、改善ないし治療薬の有効成分となる候補物質が提供できる。
【００９８】
本発明スクリーニング方法は、具体的には以下の（ａ）−（ｃ）工程を含んでいる。
（ａ） 被験物質と、配列番号：９７〜２６７のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子またはそのホモログを発現可能な細胞とを接触させる工程、
（ｂ） 被験物質を接触させた細胞について、配列番号：９７〜２６７のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子またはそのホモログの遺伝子発現量を測定し、該発現量を被験物質を接触させない対照細胞の上記対応する遺伝子の発現量と比較する工程、および
（ｃ） 上記の比較結果に基づいて、配列番号：９７〜２６７のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子またはそのホモログの遺伝子発現を促進する（遺伝子発現レベルを上昇させる）被験物質を選択する工程。
【００９９】
すなわち、本発明スクリーニング方法は、配列番号：１〜９６のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子（遺伝子Ｉ）の発現レベルの上昇（発現誘導）および／または配列番号：９７〜２６７のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子（遺伝子ＩＩ）の発現レベルの低下（発現抑制）が、アルツハイマー病と関連することを利用するものである。よって、該アルツハイマー病の緩和／抑制作用を有する（アルツハイマー病に対して改善／治療効果を発揮する）物質の探索には、配列番号：１〜９６のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子（遺伝子Ｉ）の発現レベルの低下若しくは発現抑制が指標とされ、あるいは配列番号：９７〜２６７のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子（遺伝子ＩＩ）の発現レベルの上昇若しくは発現誘導が指標とされる。
【０１００】
以上のように、本発明のスクリーニング方法は、配列番号：１〜９６のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子（遺伝子Ｉ）の発現を抑制・減少させる物質を探索するか、及び／又は、配列番号：９７〜２６７のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子（遺伝子ＩＩ）の発現を誘導・増大させる物質を探索するものであり、斯くして得られる物質をアルツハイマー病の改善薬または治療薬の有効成分となる候補化合物として提供するものである。
【０１０１】
本発明スクリーニング方法に従う候補物質の選別は、具体的には配列番号：１〜９６のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子（遺伝子Ｉ）またはそのホモログを発現している細胞を用いる場合は、被験物質（候補物質）を添加した細胞における上記各遺伝子の発現レベルが被験物質（候補物質）を添加しない細胞における同遺伝子の発現レベルに比して低くなることをもって、行うことができる。また、該遺伝子Ｉまたはそのホモログの発現に発現誘導物質を必要とする細胞を用いる場合は、発現誘導物質によって誘導される発現が候補物質の存在によって抑制されること、すなわち発現誘導物質存在下で候補物質を接触させた細胞の遺伝子発現が、発現誘導物質存在下で候補物質を接触させない対照細胞（正のコントロール）に比して低くなることをもって行うことができる。
【０１０２】
一方、配列番号：９７〜２６７のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子（遺伝子ＩＩ）またはそのホモログを発現している細胞を用いる場合は、被験物質（候補物質）を添加した細胞における上記各遺伝子の発現レベルが被験物質（候補物質）を添加しない細胞における同遺伝子の発現レベルに比して高くなることをもって、候補物質の選別を行うことができる。該遺伝子ＩＩまたはそのホモログの発現が発現抑制物質によって抑制されている細胞を用いる場合は、発現抑制物質によって抑制される発現が候補物質の存在によって誘導されること、すなわち発現抑制物質存在下で候補物質を接触させた細胞の遺伝子発現が、発現抑制物質存在下で候補物質を接触させない対照細胞（正のコントロール）に比して高くなることをもって、候補物質の選別を行うことができる。
【０１０３】
より具体的には、例えば神経細胞を用いてアルツハイマー病の改善薬または治療薬の有効成分となる候補物質をスクリーニングするには、ベータアミロイドを添加した神経細胞（対照細胞）と、ベータアミロイド及び被験物質を同時に加えた神経細胞とで遺伝子Ｉ（もしくはそのホモログ）又は遺伝子ＩＩ（もしくはそのホモログ）の発現レベルを比較し、それぞれ、その発現レベルの低下又は上昇を指標として候補物質を選別することができる。また、ベータアミロイドを添加して、既に遺伝子Ｉ（もしくはそのホモログ）又は遺伝子ＩＩ（もしくはそのホモログ）が発現誘導又は抑制された状態の神経細胞に被験物質を添加し、被験物質を添加しない対照の神経細胞と遺伝子Ｉ（もしくはそのホモログ）又は遺伝子ＩＩ（もしくはそのホモログ）の発現レベルを比較し、それぞれ、その発現レベルの低下又は上昇を指標として候補物質を選別することもできる。
【０１０４】
このような遺伝子の発現レベルの検出および定量は、前述した細胞から調製したＲＮＡまたはそれから転写された相補的なポリヌクレオチドと本発明疾患マーカーとを用いて、前記（２−１）項に記述したように、ノーザンブロット法、ＲＴ−ＰＣＲ法など公知の方法や、ＤＮＡチップなどを利用して実施できる。指標とする遺伝子発現レベルの変動（発現の抑制・減少または誘導・増大）の程度としては、被験物質（候補物質）を添加した細胞における遺伝子Ｉもしくは遺伝子ＩＩまたはこれらのホモログの発現が、被験物質（候補物質）を添加しない対照細胞での発現量と比較して１０％、好ましくは３０％、特に好ましくは５０％以上の変動（減少または増大）を例示することができる。
【０１０５】
また、遺伝子Ｉもしくは遺伝子ＩＩまたはこれらのホモログの発現レベルの検出および定量は、各遺伝子の発現を制御する遺伝子領域（発現制御領域）に、例えばルシフェラーゼ遺伝子などのマーカー遺伝子をつないだ融合遺伝子を導入した細胞株を用いて、マーカー遺伝子由来のタンパク質の活性を測定することによっても実施できる。本発明の遺伝子Ｉまたは遺伝子ＩＩの発現制御物質のスクリーニング方法には、かかるマーカー遺伝子の発現量を指標として標的物質を探索する方法も包含される。この意味において、本発明でいう配列番号：１〜２６７のいずれかで示される塩基配列を有する遺伝子またはそのホモログの概念には、該遺伝子の発現制御領域とマーカー遺伝子との融合遺伝子が含まれる。
【０１０６】
上記マーカー遺伝子としては、発光反応や呈色反応を触媒する酵素の構造遺伝子が好ましい。具体的には、上記のルシフェラーゼ遺伝子のほか、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ遺伝子、βグルクロニダーゼ遺伝子、βガラクトシダーゼ遺伝子、及びエクオリン遺伝子などのレポーター遺伝子を例示できる。ここで遺伝子またはまたはそのホモログ遺伝子の発現制御領域としては、例えば該遺伝子の転写開始部位上流約１ｋｂ、好ましくは約２ｋｂを用いることができる。融合遺伝子の作成、およびマーカー遺伝子由来の活性測定は公知の方法で行うことができる。
【０１０７】
本発明のスクリーニング方法において、スクリーニングの精度や正確性を高めるためには、前記特定遺伝子（遺伝子Ｉもしくは遺伝子ＩＩまたはこれらのホモログ）の２以上、好ましくは複数個の遺伝子、より好ましくは上記遺伝子群の４分の１以上、さらに好ましくは上記遺伝子群の半数以上の遺伝子について被験物質による遺伝子発現レベルを評価し、候補物質を選別することが望ましい。複数個の遺伝子について評価する場合には、個々の遺伝子での評価をスコア化し、総合的に候補物質を選別することが可能である。例えば、一つの被験物質を用いて、上記の遺伝子の中から任意の１０個の遺伝子について評価を行い、該被験物質がそのうちの９個以上の遺伝子に関してアルツハイマー病の改善薬または治療薬の有効成分となる候補化合物であると上記基準から評価される場合、該被験物質は候補化合物である可能性が高いと判断できる。この場合、評価する遺伝子数、スコアあるいは判断基準は限定されない。
【０１０８】
以上のスクリーニング方法により、被験物質から選別される物質は、配列番号：１〜９６のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子の遺伝子発現抑制剤、または配列番号：９７〜２６７のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子の遺伝子発現増強剤（誘導剤）として位置づけることができる。これらの物質は、生体内において配列番号：１〜９６のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子の発現を抑制・減少するか、または配列番号：９７〜２６７のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子の発現を誘導・増大することによって、神経細胞死の亢進を抑制し、アルツハイマー病を緩和、抑制（改善、治療）し得ると考えられる。よって、これらの物質は、アルツハイマー病を緩和、抑制（改善、治療）する薬物の有力な候補物質となる。
【０１０９】
斯くして選抜取得される被験物質は、アルツハイマー病を緩和、抑制（改善、治療）する薬物の有力な候補物質となる。
【０１１０】
上記に記載する本発明のスクリーニング方法によって選別された候補物質は、さらにアルツハイマー病モデル動物を用いた薬効試験、モデル動物および正常動物を用いた安全性／体内動態試験、さらにアルツハイマー病患者への臨床試験に供してもよく、これらの試験を実施することによって、より実用的なアルツハイマー病改善または治療薬を選別することができる。このようにして選別された物質は、さらにその構造解析結果に基づいて、化学的合成、生物学的合成（発酵）または遺伝子学的操作によって、工業的に製造することができる。
【０１１１】
（４）アルツハイマー病の改善・治療剤
本発明は、アルツハイマー病の改善・治療剤を提供するものである。
【０１１２】
本発明は配列番号：１〜２６７のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子の発現がアルツハイマー病と関連しているという新たな知見から、（１）配列番号：１〜９６のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子の発現を抑制若しくは減少させる物質、および（２）配列番号９７〜２６７のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子の発現を誘導若しくは増大させる物質が、上記疾患の改善または治療に有効であるという考えに基づくものである。すなわち、本発明のアルツハイマー病の改善・治療剤は配列番号：１〜９６のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子の発現を抑制若しくは減少させる物質、及び／または配列番号：９７〜２６７のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子の発現を誘導若しくは増大させる物質を有効成分とするものである。
【０１１３】
当該有効成分となる配列番号：１〜９６のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子の発現抑制（減少）物質、あるいは配列番号：９７〜２６７のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子の発現誘導（増大）物質は、上記のスクリーニング方法を利用して選別されたもののみならず、選別された物質に関する情報に基づいて常法に従って化学・生化学的手法により、若しくは工業的に製造されたものであってもよい。
【０１１４】
かかる発現抑制（減少）物質、あるいは発現誘導（増大）物質は、そのままもしくは自体公知の薬学的に許容される担体（賦形剤、増量剤、結合剤、滑沢剤などが含まれる）や慣用の添加剤などと混合して医薬組成物として調製することができる。当該医薬組成物は、調製する形態（錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤などの経口投与剤；注射剤、点滴剤、外用剤、点鼻剤、点眼剤、吸入剤、坐剤などの非経口投与剤）等に応じて経口投与または非経口投与することができる。また投与量は、有効成分の種類、投与経路、投与対象または患者の年齢、体重、症状などによって異なり一概に規定できないが、１日投与用量として、数ｍｇ〜２ｇ、好ましくは数十ｍｇ程度を、１日１回ないし数回に分けて投与することができる。
【０１１５】
上記有効成分とする物質がＤＮＡによりコードされるものの場合、該ＤＮＡを遺伝子治療用ベクターに組み込み、遺伝子治療を行うことも考えられる。更に、上記有効成分が配列番号：１〜９６のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子のアンチセンスオリゴヌクレオチドの場合は、そのままもしくは遺伝子治療用ベクターにこれを組み込むことにより、遺伝子治療を行うこともできる。これらの場合も、投与量、投与方法は患者の体重や年齢、症状などにより変動するが、当業者であれば適宜選択することが可能である。
【０１１６】
【実施例】
次に、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。しかし、本発明はこれらの実施例になんら限定されるものではない。
【０１１７】
実施例１ ヒトアルツハイマー病の海馬とヒト正常海馬での遺伝子発現の変動解析
アルツハイマー病初期の患者の海馬組織３サンプル、アルツハイマー病後期の患者の海馬組織４サンプル、および正常なヒトの海馬組織５サンプルからｔｏｔａｌ ＲＮＡを調製し、得られたｔｏｔａｌ ＲＮＡを用いてＤＮＡチップ解析を行った。ＤＮＡチップ解析はＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社Ｇｅｎｅ Ｃｈｉｐ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｕ９５Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅを用いて行った。具体的には、解析は、（１） ｔｏｔａｌ ＲＮＡからｃＤＮＡの調製、（２） 該ｃＤＮＡからラベル化ｃＲＮＡの調製、（３） ラベル化ｃＲＮＡのフラグメント化、（４） フラグメント化ｃＲＮＡとプローブアレイとのハイブリダイズ、（５） プローブアレイの染色、（６） プローブアレイのスキャン、及び（７） 遺伝子発現解析、の手順で行った。
【０１１８】
（１） ｔｏｔａｌ ＲＮＡからｃＤＮＡの調製
アルツハイマー病初期の患者の海馬組織３サンプル、アルツハイマー病後期の患者の海馬組織４サンプル、および正常なヒトの海馬組織５サンプルから常法に従って調製した各ｔｏｔａｌ ＲＮＡ １０μｇとＴ７−（ｄＴ）２４プライマー（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製） １００ｐｍｏｌを含む１１μＬの混合液を、７０℃、１０分間加熱した後、氷上で冷却した。冷却後、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｃｈｏｉｃｅ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社製）に含まれる５×Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｂｕｆｆｅｒ ４μＬ、該キットに含まれる０．１Ｍ ＤＴＴ（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）２μＬ、該キットに含まれる１０ｍＭ ｄＮＴＰ Ｍｉｘ １μＬを添加し、４２℃で２分間加熱した。更に、該キットに含まれるＳｕｐｅｒ ＳｃｒｉｐｔＩＩ ＲＴ ２μＬ（４００Ｕ）を添加し、４２℃で１時間加熱した後、氷上で冷却した。冷却後、ＤＥＰＣ処理水（ナカライテスク社製、滅菌蒸留水）９１μＬ、該キットに含まれる５×Ｓｅｃｏｎｄ Ｓｔｒａｎｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ ３０μＬ、１０ｍＭ ｄＮＴＰ Ｍｉｘ ３μＬ、該キットに含まれるＥ． ｃｏｌｉ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ １μＬ（１０Ｕ）、該キットに含まれるＥ． ｃｏｌｉ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｉ ４μＬ（４０Ｕ）、および該キットに含まれるＥ． ｃｏｌｉ ＲＮａｓｅＨ １μＬ（２Ｕ）を添加し、１６℃で２時間反応させた。次いで、該キットに含まれるＴ４ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ２μＬ（１０Ｕ）を加え、１６℃で５分間反応させた後、０．５Ｍ ＥＤＴＡ １０μＬを添加した。次いで、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール溶液（ニッポンジーン社製）１６２μＬを添加し、混合した。該混合液を、予め室温、１４，０００ｒｐｍ、３０秒間遠心分離しておいたＰｈａｓｅ Ｌｏｃｋ Ｇｅｌ Ｌｉｇｈｔ（エッペンドルフ社製）に移し、室温で１４，０００ｒｐｍ、２分間遠心分離した後、１４５μＬの水層をエッペンドルフチューブに移した。得られた溶液に、７．５Ｍ酢酸アンモニウム溶液７２．５μＬ、エタノール３６２．５μＬを加えて混合した後、４℃で１４，０００ｒｐｍ、２０分間遠心分離した。遠心分離後、上清を捨て、作製したｃＤＮＡを含むペレットを得た。
【０１１９】
その後、該ペレットに８０％エタノール０．５ｍＬを添加し、４℃で１４，０００ｒｐｍ、５分間遠心分離した後、上清を捨てた。再度同様の操作を行った後、該ペレットを乾燥させ、ＤＥＰＣ処理水１２μＬに溶解した。
【０１２０】
以上の操作によって、アルツハイマー病初期の患者の海馬組織３サンプル、アルツハイマー病後期の患者の海馬組織４サンプル、および正常なヒトの海馬組織５サンプルから調製した各ｔｏｔａｌ ＲＮＡから、各ｃＤＮＡを取得した。
【０１２１】
（２） ｃＤＮＡからラベル化ｃＲＮＡの調製
各ｃＤＮＡ溶液５μＬに、ＤＥＰＣ処理水１７μＬ、ＢｉｏＡｒｒａｙ Ｈｉｇｈ Ｙｉｅｌｄ ＲＮＡ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（ＥＮＺＯ社製）に含まれる１０×ＨＹ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ ４μＬ、該キットに含まれる１０×Ｂｉｏｔｉｎ Ｌａｂｅｌｅｄ Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ４μＬ、該キットに含まれる１０×ＤＴＴ ４μＬ、該キットに含まれる１０×ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｍｉｘ ４μＬ、および該キットに含まれる２０×Ｔ７ ＲＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ２μＬを混合し、３７℃で５時間反応させて、ラベル化ｃＲＮＡを調製した。反応後、該反応液にＤＥＰＣ処理水６０μＬを加えたのち、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて添付プロトコールに従い、調製したラベル化ｃＲＮＡを精製した。
【０１２２】
（３） ラベル化ｃＲＮＡのフラグメント化
各ラベル化ｃＲＮＡ ２０μｇを含む溶液に、５×Ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（２００ｍＭトリス−酢酸 ｐＨ８．１（Ｓｉｇｍａ社製）、 ５００ｍＭ酢酸カリウム（Ｓｉｇｍａ社製）、１５０ｍＭ酢酸マグネシウム（Ｓｉｇｍａ社製））８μＬを加えた反応液４０μＬを、９４℃で３５分間加熱した後、氷中に置いた。これによって、ラベル化ｃＲＮＡをフラグメント化した。
【０１２３】
（４） フラグメント化ｃＲＮＡとプローブアレイとのハイブリダイズ
各フラグメント化ｃＲＮＡ ４０μＬに、５ｎＭ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｏｌｉｇｏ Ｂ２（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）４μＬ、１００×Ｃｏｎｔｒｏｌ ｃＲＮＡ Ｃｏｃｋｔａｉｌ ４μＬ、Ｈｅｒｒｉｎｇ ｓｐｅｒｍ ＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）４０μｇ、Ａｃｅｔｙｌａｔｅｄ ＢＳＡ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社製）２００μｇ、２×ＭＥＳ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（２００ｍＭ ＭＥＳ、２Ｍ ［Ｎａ＋］， ４０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０２％ Ｔｗｅｅｎ２０ （Ｐｉｅｒｃｅ社製）、ｐＨ６．５〜６．７） ２００μＬ、及びＤＥＰＣ処理水１４４μＬを混合し、４００μＬのハイブリカクテルを得た。得られた各ハイブリカクテルを９９℃で５分間加熱し、更に４５℃で５分間加熱した。加熱後、室温で１４，０００ｒｐｍ、５分間遠心分離し、ハイブリカクテル上清を得た。
【０１２４】
一方、１×ＭＥＳハイブリダイゼーションバッファーで満たしたＨｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｅ Ｕ９５プローブアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）を、ハイブリオーブン内で、４５℃、６０ｒｐｍで１０分間回転させた後、１×ＭＥＳハイブリダイゼーションバッファーを除去してプローブアレイを調製した。上記で得られたハイブリカクテル上清２００μＬを該プローブアレイにそれぞれ添加し、ハイブリオーブン内で４５℃、６０ｒｐｍで１６時間回転させ、フラグメント化ｃＲＮＡとハイブリダイズしたプローブアレイを得た。
【０１２５】
（５） プローブアレイの染色
上記で得られたハイブリダイズ済みプローブアレイそれぞれからハイブリカクテルを回収除去した後、Ｎｏｎ−Ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ（６×ＳＳＰＥ（２０×ＳＳＰＥ（ナカライテスク社製）を希釈）、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０、０．００５％Ａｎｔｉｆｏａｍ０−３０（Ｓｉｇｍａ社製））で満たした。次にＮｏｎ−Ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ Ｗａｓｈ ＢｕｆｆｅｒおよびＳｔｒｉｎｇｅｎｔ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ ＭＥＳ、０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０）をセットしたＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｆｌｕｉｄｉｃｓ Ｓｔａｔｉｏｎ ４００（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）の所定の位置にフラグメント化ｃＲＮＡとハイブリダイズしたプローブアレイを装着した。その後染色プロトコールＥｕＫＧＥ−ＷＳ２に従って、１次染色液（１０μｇ／ｍＬ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ （ＳＡＰＥ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ社製）、２ｍｇ／ｍＬ Ａｃｅｔｙｌａｔｅｄ ＢＳＡ、１００ｍＭ ＭＥＳ、１Ｍ ＮａＣｌ（Ａｍｂｉｏｎ社製）、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、０．００５％Ａｎｔｉｆｏａｍ０−３０）、 ２次染色液（１００μｇ／ｍＬ Ｇｏａｔ ＩｇＧ （Ｓｉｇｍａ社製）、３μｇ／ｍＬ Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ Ａｎｔｉ−Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ （Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）、２ｍｇ／ｍＬ Ａｃｅｔｙｌａｔｅｄ ＢＳＡ、１００ｍＭ ＭＥＳ、１Ｍ ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、０．００５％Ａｎｔｉｆｏａｍ０−３０）により染色した。
【０１２６】
（６） プローブアレイのスキャン、 及び （７） 遺伝子発現解析
染色した各プローブアレイをＨＰ ＧｅｎｅＡｒｒａｙ Ｓｃａｎｎｅｒ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）に供し、染色パターンを読み取った。染色パターンをもとにＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）によってプローブアレイ上の遺伝子の発現を解析した。次に、解析プロトコールに従ってＮｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ、遺伝子発現の比較解析を行った。
【０１２７】
実施例２ アルツハイマー病患者の海馬とヒト正常海馬での遺伝子発現の変動解析
実施例１で行ったＤＮＡチップ解析による遺伝子発現の比較解析結果から、正常海馬組織に比べ、アルツハイマー病（初期または後期）の患者の海馬組織で３倍以上の発現増大を示したプローブ、並びに正常海馬組織に比べ、アルツハイマー病（初期または後期）の患者の海馬組織で３倍以上の発現減少を示したプローブを選抜した。アルツハイマー病初期の患者で発現変動を示したプローブの発現変動の増減および発現変動倍率を表１に、アルツハイマー病後期の患者で発現変動を示したプローブの発現変動の増減および発現変動倍率を表２−３に示す。なお、表中、発現変動倍率は、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｕ９５ Ｃｈｉｐで解析した正常海馬組織の遺伝子発現量を１とした場合におけるアルツハイマー病患者の海馬組織での遺伝子の発現量の増減を比で示すもので、減少の場合はマイナス（−）をつけて示す。表１−３には選抜されたプローブ（Ｈｕｍａｎ Ｕ９５のプローブ名）に対応する遺伝子の塩基配列の配列番号および該遺伝子がコードするアミノ酸配列の配列番号を合わせて示す。
【０１２８】
【表１】
【表２】
【表３】
表１−３の結果からわかるように、配列番号：１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０および７１の塩基配列を有する遺伝子は、正常な海馬組織に比べて、アルツハイマー病初期患者の海馬組織で３倍以上の発現増大を示した。中でも配列番号１、２、３、４、５、６、７、４０、４１、４２、４３および４４の塩基配列を有する遺伝子は、正常な海馬組織に比べて、アルツハイマー病初期患者の海馬組織で４倍以上の発現増大を示した。特に、配列番号：１、２および４０の塩基配列を有する遺伝子は、正常な海馬組織に比べてアルツハイマー病初期患者の海馬組織で５倍以上の発現増大を示した。
【０１３２】
また、配列番号：７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５および９６の塩基配列を有する遺伝子は、正常な海馬組織に比べて、アルツハイマー病後期患者の海馬組織で３倍以上の発現増大を示した。中でも、配列番号：７２、７３、７４および８８の塩基配列を有する遺伝子は、正常な海馬組織に比べてアルツハイマー病後期患者の海馬組織で４倍以上の発現増大を示した。特に、配列番号７２の塩基配列を有する遺伝子は、正常な海馬組織に比べてアルツハイマー病後期患者の海馬組織で５倍以上の発現増大を示した。
【０１３３】
一方、配列番号： ９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４および１３５の塩基配列を有する遺伝子は、正常な海馬組織に比べて、アルツハイマー病初期患者の海馬組織で３倍以上の発現減少を示した。中でも、配列番号：９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６および１２７の塩基配列を有する遺伝子は、正常な海馬組織に比べてアルツハイマー病初期患者の海馬組織で４倍以上の発現減少を示した。特に、配列番号：９７、９８、１２０および１２１の塩基配列を有する遺伝子は、正常な海馬組織に比べてアルツハイマー病初期患者の海馬組織で５倍以上の発現減少を示した。
【０１３４】
また、配列番号：９８、９９、１００、１０２、１１２、１１５、１２１、１２２、１２３、１３０、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６および２６７の塩基配列を有する遺伝子は、正常な海馬組織に比べて、アルツハイマー病後期患者の海馬組織で３倍以上の発現減少を示した。中でも、配列番号：９８、９９、１００、１０２、１２１、１２２、１２３、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１および２２２の塩基配列を有する遺伝子は、正常な海馬組織に比べてアルツハイマー病後期患者の海馬組織で４倍以上の発現減少を示した。特に、配列番号：９９、１００、１２２、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、２１５、２１６、２１７および２１８の塩基配列を有する遺伝子は、正常な海馬組織に比べてアルツハイマー病後期患者の海馬組織で５倍以上の発現減少を示した。
【０１３５】
また、配列番号：９８、９９、１００、１０２、１１２、１１５、１２１、１２２、１２３および１３０の塩基配列を有する遺伝子は、正常な海馬組織に比べて、アルツハイマー病初期患者および後期患者双方の海馬組織で、ともに３倍以上の発現減少を示した。
【０１３６】
以上に示すように、配列番号：１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５および９６（配列番号：１〜９６）の塩基配列を有する遺伝子は、正常な海馬組織に比べて、アルツハイマー病患者の海馬組織で発現が増大し、また配列番号：９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６および２６７（配列番号：９７〜２６７）の塩基配列を有する遺伝子は、正常な海馬組織に比べて、アルツハイマー病患者の海馬組織で発現が減少していることから、これらの遺伝子は、アルツハイマー病に関するマーカー遺伝子として応用可能な遺伝子であると考えられた。また、これらの遺伝子を用いることによってアルツハイマー病を緩和、抑制する治療薬の候補薬をスクリーニングすることが可能である。
【０１３７】
実施例３ 配列番号：１〜９６の塩基配列を有する遺伝子の発現抑制剤のスクリーニング
神経細胞を以下の条件で培養する。 摘出した脳組織を細切後、パパイン処理及びピペッティングにより単細胞懸濁液を調製する。これをＡＭＥＭ培地（２％非働化ウシ胎児血清、５ｍＭ グルコース、２４ｍＭ炭酸水素ナトリウム、１０ｍＭＨＥＰＥＳを含むＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ社製））で希釈し、ポリ−Ｄ−リジン（Ｓｉｇｍａ社製）でコートした９６ウェルのプレート（ファルコン社製）に３００００細胞／ウェルとなるように播種する。ＣＯ２インキュベーター（５％ ＣＯ２、３７℃）内で２時間培養後、培地をＮＢ２７Ｇ 培地（Ｂ２７ 添加物（Ｇｉｂｃｏ社製）、０．５ｍＭグルタミンを含むＮＥＵＲＯＢＡＳＡＬ Ｍｅｄｉｕｍ（登録商標：Ｇｉｂｃｏ社製））に交換し、ＣＯ２インキュベーター（５％ ＣＯ２、３７℃）内で４日間培養する。その後、ベータアミロイドを終濃度２０μＭにて含む培地と交換し、それぞれ１００μＭ、１０μＭ、および１μＭの濃度に調製した被験物質含有溶液を添加し、３７℃、ＣＯ２濃度５％で２日間培養する。ここで、対照実験として、被験物質無添加の細胞についても同様に培養する（コントロール）。これらの各培養細胞より抽出したＲＮＡを用いて実施例１に記載された方法で、配列番号：１〜９６のいずれかに示される塩基配列を有する遺伝子の発現量を調べる。コントロールと比べて、配列番号：１〜９６のいずれかに示される塩基配列を有する遺伝子の発現量が１０％、好ましくは３０％、特に好ましくは５０％以上減少している培養系に添加した被験物質を、アルツハイマー病を緩和、抑制（改善、治療）する候補化合物として選択する。
【０１３８】
実施例４ 配列番号：９７〜２６７の塩基配列を有する遺伝子の発現誘導剤（発現増大剤）のスクリーニング
神経細胞を以下の条件で培養する。 摘出した脳組織を細切後、パパイン処理及びピペッティングにより単細胞懸濁液を調製する。これをＡＭＥＭ培地（２％非働化ウシ胎児血清、５ｍＭ グルコース、２４ｍＭ炭酸水素ナトリウム、１０ｍＭＨＥＰＥＳを含むＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ社製））で希釈し、ポリ−Ｄ−リジン（Ｓｉｇｍａ社製）でコートした９６ウェルのプレート（ファルコン社製）に３００００細胞／ウェルとなるように播種する。ＣＯ２インキュベーター（５％ ＣＯ２、３７℃）内で２時間培養後、培地をＮＢ２７Ｇ 培地（Ｂ２７ 添加物（Ｇｉｂｃｏ社製）、０．５ｍＭグルタミンを含むＮＥＵＲＯＢＡＳＡＬ Ｍｅｄｉｕｍ（登録商標：Ｇｉｂｃｏ社製））に交換し、ＣＯ２インキュベーター（５％ ＣＯ２、３７℃）内で４日間培養する。その後、ベータアミロイドを終濃度２０μＭにて含む培地と交換し、それぞれ１００μＭ、１０μＭ、および１μＭの濃度に調製した被験物質含有溶液を添加し、３７℃、ＣＯ２濃度５％で２日間培養する。ここで、対照実験として、被験物質無添加の細胞についても同様に培養する（コントロール）。これらの各培養細胞より抽出したＲＮＡを用いて実施例１に記載された方法で、配列番号：９７〜２６７のいずれかに示される塩基配列を有する遺伝子の発現量を調べる。コントロールと比べて、配列番号：９７〜２６７のいずれかに示される塩基配列を有する遺伝子の発現量が１０％、好ましくは３０％、特に好ましくは５０％以上増加している培養系に添加した被験物質を、アルツハイマー病を緩和、抑制（改善、治療）する候補化合物として選択する。
【０１３９】
【発明の効果】
本発明によって、アルツハイマー病患者の脳において発現が特異的に増大している遺伝子（配列番号：１〜９６の塩基配列を有する遺伝子）、および発現が特異的に減少している遺伝子（配列番号：９７〜２６７の塩基配列を有する遺伝子）が明らかになった。かかる遺伝子はアルツハイマー病の遺伝子診断に用いられるマーカー遺伝子（プローブ、プライマー）として有用である。かかるマーカー遺伝子によればアルツハイマー病であるかどうか、およびその原因を明らかにすることができ（診断精度が向上）、これによってより適切な治療を施すことが可能となる。すなわち、本発明のマーカー遺伝子はアルツハイマー病の適切な治療のためのツールとして利用することができる。
【０１４０】
また、上記遺伝子の発現増大／減少とアルツハイマー病との関連性から、該遺伝子の発現を抑制／誘導する物質は、上記アルツハイマー病の治療薬として有用であると考えられる。従って、本発明の遺伝子によれば、その発現の抑制／誘導を指標とすることによって、アルツハイマー病の予防、改善ないし治療薬となり得る候補薬をスクリーニングし選別することが可能である。すなわち、本発明は、アルツハイマー病の治療薬などの開発技術をも提供する。
【０１４１】
【配列表】
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a disease marker useful for diagnosing Alzheimer's disease. More specifically, the present invention relates to a disease marker that can be effectively used as a primer or a detection probe in genetic diagnosis of Alzheimer's disease. The present invention also relates to a method for detecting (diagnosing) Alzheimer's disease using such a disease marker.
[0002]
Furthermore, the present invention provides a method for screening a substance effective as an Alzheimer's disease ameliorating or therapeutic agent using the above-mentioned disease marker, and an Alzheimer's disease ameliorating agent containing the substance prepared by the method as an active ingredient or Regarding therapeutic drugs.
[0003]
[Prior art]
Alzheimer's disease is a degenerative disease of the brain whose main symptoms are progressive memory impairment, impaired intelligence, and the like, and is a multifactorial disease that develops due to a combination of several factors. There are several reports on genetic and environmental factors as risk factors for the development, but it is believed that the greatest risk factor is aging of the brain.
[0004]
In general, Alzheimer's disease is not hereditary, but there is an inherited Alzheimer's disease that exhibits autosomal dominant inheritance, rarely called familial Alzheimer's disease. For the familial Alzheimer's disease, the non-hereditary Alzheimer's disease that accounts for the majority (97% -98%) of patients is called sporadic Alzheimer's disease. Pathological changes in the brains of both patients have many common pathologies such as synaptic degeneration and loss, neuronal death, senile plaque deposition, and a similar pathogenic mechanism is expected in hereditary and non-hereditary Alzheimer's disease Thus, attempts have been made to elucidate the pathogenesis of sporadic Alzheimer's disease by identifying the causative gene of familial Alzheimer's disease.
[0005]
Pathological changes characteristic of the brain of Alzheimer's disease patients include the deposition of senile plaques on the cerebral cortex, hippocampus and the like. Β-amyloid peptide (Aβ) has been isolated as a main component of the senile plaque. As a precursor of Aβ, amyloid precursor protein (APP) has been isolated [Goldgaber, D. et al., Science, 235, 877-880, (1987); Tanzi ( Tanzi, RE), et al., Science, 235, 880-884, (1987); Robakis, NK, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 4190-4194, (1987); Kitaguchi, N. et al., Nature, 331, 530-532, (1988); Ponte, P., et al., Nature, 331, 525-527, (1987)].
[0006]
With the advent of an aging society, the number of Alzheimer's disease patients is expected to increase significantly. Therefore, the development of preventive and therapeutic methods is currently desired. However, the pathogenesis of Alzheimer's disease is diverse, based on its clinical and pathological features, and it is expected that many factors are involved.Also, it is a complex disease that develops as the brain ages. At present, research, diagnosis, and treatment are often difficult.
[0007]
On the other hand, in recent medical practice, it has been desired to appropriately select a treatment method not only for Alzheimer's disease but also for individual patient's symptoms. In recent years, the necessity of improving the quality of life (QOL) in an aging society has been recognized, in particular, treatment that is appropriate for the symptoms of individual patients, rather than treatment common to all, Is strongly required. In order to perform such a so-called tailor-made treatment, a disease marker that accurately reflects the patient's symptoms and its cause (genetic background) for each disease is useful, and research aimed at searching for and developing such markers is vital. It is currently being carried out.
[0008]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a disease marker useful for diagnosis and treatment of Alzheimer's disease. Further, the present invention provides a method for detecting Alzheimer's disease using the disease marker (gene diagnosis method), a method for screening a drug useful for improvement or treatment of the disease, and a drug useful for improvement or treatment of the disease. The purpose is to:
[0009]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have conducted intensive studies in order to solve the above problems, and found that SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 in the sequence listing described later. , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 , 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61 , 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86 , 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95 and 96 The expression of a gene having a nucleotide sequence (hereinafter, also referred to as “SEQ ID NOs: 1 to 96” in the present specification) is significantly promoted in the hippocampal tissue of an Alzheimer's disease patient compared to the expression in a normal hippocampal tissue. And SEQ ID NOs: 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117 and 118 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143 , 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 15 , 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180 , 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205 , 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230 , 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266 and 267 (hereinafter also referred to as “SEQ ID NOs: 97 to 267” in the present specification). ) Was found to be significantly suppressed in expression in hippocampal tissues of Alzheimer's disease patients as compared to expression in normal hippocampal tissues. From these, the present inventors have obtained the belief that such a gene can be a marker for Alzheimer's disease. The present invention has been completed based on such findings.
[0010]
That is, the present invention includes the following items 1 to 18:
Item 1. SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 , 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 , 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74 , 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 , 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 10, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 1 3, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266 and 267 ( Hereinafter, also referred to as “SEQ ID NOs: 1 to 267” in the present specification). Or a disease marker for Alzheimer's disease, comprising a polynucleotide having at least 15 consecutive bases and / or a polynucleotide complementary to the polynucleotide in the base sequence described in any one of the above.
Item 2. Item 2. The disease marker according to item 1, which is used as a probe or a primer in detecting Alzheimer's disease.
Item 3. A method for detecting Alzheimer's disease, comprising the following steps (a), (b) and (c):
(A) binding RNA prepared from a biological sample of a subject or a complementary polynucleotide transcribed therefrom to the disease marker according to item 1 or 2;
(B) measuring RNA derived from a biological sample specifically bound to the disease marker or a complementary polynucleotide transcribed therefrom, using the disease marker as an index,
(C) a step of determining the presence of Alzheimer's disease based on the measurement result of (b).
Item 4. A method for detecting Alzheimer's disease, comprising the following steps (a), (b) and (c):
(A) RNA prepared from a biological sample of a subject or a complementary polynucleotide transcribed therefrom and the disease marker according to item 1 or 2, among the bases according to any of SEQ ID NOs: 1 to 96 Binding to a sequence-based disease marker,
(B) measuring RNA from a biological sample specifically bound to the disease marker or a complementary polynucleotide transcribed therefrom, using the disease marker as an index,
(C) The presence of Alzheimer's disease is determined based on the fact that the measurement result of the subject obtained in (b) is increased in the amount of binding to a disease marker as compared to the result obtained for a normal biological sample. Process.
Item 5. A method for detecting Alzheimer's disease, comprising the following steps (a), (b) and (c):
(A) RNA prepared from a biological sample of a subject or a complementary polynucleotide transcribed therefrom and the disease marker according to item 1 or 2, and the base according to any one of SEQ ID NOs: 97 to 267 Binding to a sequence-based disease marker,
(B) measuring RNA from a biological sample specifically bound to the disease marker or a complementary polynucleotide transcribed therefrom, using the disease marker as an index,
(C) Judgment of Alzheimer's disease is based on the fact that the measurement result of the subject obtained in (b) is reduced in the amount of binding to a disease marker as compared with the result obtained for a normal biological sample. Process.
Item 6. SEQ ID NOs: 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291 , 292 and 293 (hereinafter, also referred to as “SEQ ID NOs: 268 to 293” in the present specification), which have an antibody that recognizes a protein having the amino acid sequence described in any of the above.
Item 7. Item 7. The disease marker according to Item 6, which is used as a probe in detecting Alzheimer's disease.
Item 8. A method for detecting Alzheimer's disease, comprising the following steps (a), (b) and (c):
(A) binding a protein prepared from a subject's biological sample to the disease marker according to item 6 or 7;
(B) measuring a protein or a partial peptide derived from a biological sample bound to the disease marker using the disease marker as an index,
(C) a step of determining the presence of Alzheimer's disease based on the measurement result of (b).
Item 9. A method for detecting Alzheimer's disease, comprising the following steps (a), (b) and (c):
(A) Among proteins prepared from a biological sample of a subject and the disease markers described in Item 6 or 7, SEQ ID NOs: 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, and 275 Binding to a disease marker having an antibody that recognizes a protein having the amino acid sequence of
(B) measuring a protein or a partial peptide derived from a biological sample bound to the disease marker using the disease marker as an index,
(C) The presence of Alzheimer's disease is determined based on the fact that the measurement result of the subject obtained in (b) is increased in the amount of binding to a disease marker as compared to the result obtained for a normal biological sample. Process.
Item 10. A method for detecting Alzheimer's disease, comprising the following steps (a), (b) and (c):
(A) Among proteins prepared from a biological sample of a subject and the disease markers described in Item 6 or 7, SEQ ID NOs: 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, and a step of binding to a disease marker having an antibody that recognizes a protein having the amino acid sequence of any of 293,
(B) measuring a protein or a partial peptide derived from a biological sample bound to the disease marker using the disease marker as an index,
(C) Judgment of Alzheimer's disease is based on the fact that the measurement result of the subject obtained in (b) is reduced in the amount of binding to a disease marker as compared with the result obtained for a normal biological sample. Process.
Item 11. A screening method for a substance that controls the expression of a gene having the nucleotide sequence of any of SEQ ID NOs: 1 to 267, comprising the following steps (a), (b), and (c):
(A) a step of contacting a test substance with a cell capable of expressing a gene having the nucleotide sequence of any of SEQ ID NOs: 1 to 267 or a homolog thereof,
(B) The expression level of a gene having the nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 267 or a homolog thereof in cells contacted with the test substance is measured, and the expression level is a control cell not contacted with the test substance. Comparing the expression level of the corresponding gene of the above,
(C) a step of selecting a test substance that changes the expression level of a gene having the nucleotide sequence of any of SEQ ID NOs: 1 to 267 or a homolog thereof based on the comparison result of (b),
Item 12. A screening method for a substance that suppresses the expression of a gene having the nucleotide sequence of any of SEQ ID NOs: 1 to 96, comprising the following steps (a), (b), and (c):
(A) a step of bringing a test substance into contact with a cell having the nucleotide sequence of any of SEQ ID NOs: 1 to 96 or a cell capable of expressing a homolog thereof;
(B) The expression level of the gene having the nucleotide sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 1 to 96 or a homolog thereof in cells contacted with the test substance is measured, and the expression level is compared with a control cell not contacted with the test substance. Comparing the expression level of the corresponding gene of the above,
(C) a step of selecting a test substance that suppresses the expression of a gene having the nucleotide sequence of any of SEQ ID NOs: 1 to 96 or a homolog thereof based on the comparison result of (b).
Item 13. A method for screening a substance that promotes the expression of a gene having the nucleotide sequence of any of SEQ ID NOs: 97 to 267, comprising the following steps (a), (b), and (c):
(A) a step of contacting a test substance with a cell capable of expressing a gene having the nucleotide sequence of any of SEQ ID NOs: 97 to 267 or a homolog thereof.
(B) The expression level of the gene having the nucleotide sequence of any of SEQ ID NOs: 97 to 267 or a homolog thereof in cells contacted with the test substance is measured, and the expression level is compared with a control cell not contacted with the test substance. Comparing the expression level of the corresponding gene of the above,
(C) a step of selecting a test substance that promotes the expression of a gene having the nucleotide sequence of any of SEQ ID NOs: 97 to 267 or a homolog thereof based on the comparison result of (b).
Item 14. Item 14. The screening method according to any one of Items 11 to 13, which is a method for searching for an active ingredient of an agent for improving or treating Alzheimer's disease.
Item 15. An agent for ameliorating or treating Alzheimer's disease, comprising, as an active ingredient, a substance that suppresses the expression of a gene having the nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 96.
Item 16. Item 16. An agent for ameliorating or treating Alzheimer's disease according to Item 15, wherein the substance that suppresses the expression of a gene having the nucleotide sequence according to any one of SEQ ID NOs: 1 to 96 is obtained by the screening method according to Item 12. .
Item 17. An agent for ameliorating or treating Alzheimer's disease, comprising as an active ingredient a substance that promotes the expression of a gene having the nucleotide sequence of any of SEQ ID NOs: 97 to 267.
Item 18. Item 17. An agent for ameliorating or treating Alzheimer's disease according to Item 17, wherein the substance that promotes expression of the gene having the nucleotide sequence according to any one of SEQ ID NOs: 97 to 267 is obtained by the screening method according to Item 13. .
[0011]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Hereinafter, in the present specification, the abbreviations of amino acids, (poly) peptides, (poly) nucleotides, and the like are referred to by the IUPAC-IUB regulations [IUPAC-IUB Communication on Biological Nomenclature, Eur. J. Biochem. , 138: 9 (1984)], "Guidelines for Preparation of Specifications Containing Base Sequences or Amino Acid Sequences" (edited by the Japan Patent Office) and conventional symbols in the art.
[0012]
As used herein, the term "gene" or "DNA" is used to include not only double-stranded DNA but also single-stranded DNA such as a sense strand and an antisense strand that constitute the double-stranded DNA. The length is not particularly limited. Therefore, in the present specification, a gene (DNA) means a double-stranded DNA containing human genomic DNA and a single-stranded DNA containing cDNA (positive strand) and a sequence having a sequence complementary to the positive strand, unless otherwise specified. It includes a main-stranded DNA (complementary strand), and any of these fragments.
[0013]
In addition, the “gene” or “DNA” includes not only “gene” or “DNA” represented by a specific nucleotide sequence, but also a protein having a biological function equivalent to the protein encoded by these (for example, The term "gene" or "DNA" which encodes a homolog, mutant, derivative or the like is included (in the present specification, these are collectively referred to as "gene" or "DNA" represented by the above specific nucleotide sequence). Of "homolog".). Specific examples of such homologs include those that hybridize with the “gene” or “DNA” represented by the specific base sequence under the stringent conditions described in (1-1) below. it can.
[0014]
For example, as a gene (homolog) encoding a homolog, a gene of another species such as mouse or rat corresponding to a human gene can be exemplified. These genes (homologs) can be identified by HomoloGene (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Homologene/). Specifically, the specific human base sequence is matched with BLAST (Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 90: 5873-5877, 1993, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). (The highest score, E-value is 0 and Identity is 100%). The accession number is input to UniGene (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/) and the UniGene Cluster ID (the number indicated by Hs.) Obtained is input to HomoloGene. From the resulting list showing the correlation between the gene homologs of other species genes and human genes, genes of other species such as mice and rats corresponding to the human genes can be selected. The gene or DNA does not matter which functional region is used, and may include, for example, an expression control region, a coding region, an exon, or an intron.
[0015]
As used herein, the term "polynucleotide" is used to include both RNA and DNA. The DNA includes any of cDNA, genomic DNA, and synthetic DNA. In addition, the above-mentioned RNA includes all of total RNA, mRNA, rRNA, and synthetic RNA.
[0016]
As used herein, the term “protein” or “(poly) peptide” includes not only “protein” or “(poly) peptide” represented by a specific base sequence, but also “protein” having a biological function equivalent thereto. Or "(poly) peptides" (eg, homologs, variants, derivatives, etc.). In the present specification, these are also referred to as “homologs” of “protein” or “(poly) peptide” represented by the above specific amino acid sequence. For example, examples of the homologues include homologues, such as proteins of other species, such as mouse and rat, which are human proteins. These are homologene (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/homologene). It can be determined a priori from the base sequence of the gene (homolog) identified by /). In addition, the above mutants include naturally occurring allelic variants, non-naturally occurring variants, and variants having an amino acid sequence modified by artificial deletion, substitution, addition and insertion. Is done. Examples of such mutants include those that are at least 70%, preferably 80%, more preferably 95%, and even more preferably 97% homologous to a protein or (poly) peptide having no mutation.
[0017]
As used herein, the term "antibody" includes polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, chimeric antibodies, single-chain antibodies, and the above-mentioned antibodies having antigen-binding properties such as Fab fragments and fragments produced by Fab expression libraries. Some are included.
[0018]
Furthermore, in the present specification, a `` disease marker '' is used for diagnosing the presence or absence of Alzheimer's disease or the degree of Alzheimer's disease, for improving Alzheimer's disease, for screening a candidate substance useful for treatment, etc., directly or It can be used indirectly. For example, it can specifically recognize and bind to a gene or protein whose expression in a living body fluctuates in association with enhancement of neuronal cell death (poly) (oligo) A) nucleotides and antibodies. These (poly) (oligo) nucleotides and antibodies are used as probes for detecting the above genes and proteins expressed in vivo, particularly in hippocampal tissues, based on the above properties. In particular, it can be effectively used as a primer for amplifying the above gene expressed in hippocampus tissue.
[0019]
The present invention provides, as described above, SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95 and 96 (SEQ ID NOS: 1 to 96). These genes are collectively also referred to as gene I.), whose expression is specifically increased in hippocampal tissues of Alzheimer's disease patients, and that SEQ ID NOs: 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 65, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 24 8, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266 and 267 (SEQ ID NOs: 97 to 267) (Hereinafter, these genes are also collectively referred to as gene II). ) Is based on the finding that expression is specifically suppressed in hippocampal tissues of Alzheimer's disease patients.
[0020]
Therefore, these genes and their expression products [protein, (poly) (oligo) peptide] can be effectively used for elucidation, diagnosis, prevention and treatment of Alzheimer's disease. Useful information and means can be obtained. In addition, these genes, their expression products, and their derivatives (eg, antibodies) can be suitably used for the treatment of Alzheimer's disease and the development of drugs that can be effectively used for the treatment. Furthermore, detection of the expression of the above-mentioned gene or its expression product in an individual or hippocampus tissue, or detection of mutation of the gene or its insufficient expression can be effectively used for elucidation and diagnosis of Alzheimer's disease.
[0021]
Hereinafter, specific uses of these polynucleotides, their expression products and their derivatives will be described.
[0022]
(1) Alzheimer's disease marker and its application
(1-1) Polynucleotide
The present invention provides, as described above, a gene having the nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 96 or a specific expression thereof in hippocampal tissue of a patient suffering from Alzheimer's disease. Starting from the finding that the expression of the gene having the nucleotide sequence of any of SEQ ID NOs: 97 to 267 is specifically decreased in the hippocampus tissue of the patient, This is based on the idea that the presence or absence and the degree of the above-mentioned Alzheimer's disease can be detected by detecting the presence or absence and the degree of the expression of the gene, and the diagnosis of the disease can be performed accurately. That is, the present invention provides a useful poly (disease marker) as a tool (disease marker) for diagnosing the presence or absence of Alzheimer's disease in a subject by detecting the presence or absence or the degree of the expression of the gene in the subject. Providing nucleotides.
[0023]
In addition, the polynucleotide of the present invention can be used for screening a candidate substance useful for prevention, amelioration or treatment of Alzheimer's disease as described in the section (3) below, wherein the polynucleotide according to any one of SEQ ID NOs: 1 to 267 is used. It is also useful as a screening tool (disease marker) for detecting fluctuations in the expression of a gene having a sequence.
[0024]
The disease marker of the present invention is characterized by comprising a polynucleotide having at least 15 consecutive nucleotides and / or a polynucleotide complementary thereto in the nucleotide sequence of any of SEQ ID NOs: 1 to 267.
[0025]
Here, the complementary polynucleotide (complementary strand, reverse strand) refers to the full-length polynucleotide sequence consisting of the nucleotide sequence shown in each of the above SEQ ID NOs, or a nucleotide sequence of at least 15 nucleotides continuous in each of the above nucleotide sequences. A polynucleotide having a base complementary relationship with its partial sequence (for convenience, these are also referred to as “positive strands”) based on a base pairing relationship of A: T and G: C. Is what you do. However, such a complementary strand is not limited to a case where it forms a completely complementary sequence with the base sequence of the target positive chain, and has a complementary relationship that allows hybridization with the target positive strand under stringent conditions. May be provided. Here, the stringent conditions are as follows: Berger and Kimmel (1987, Guide to Molecular Cloning Techniques in Enzymology, Vol. Can be determined based on the melting temperature (Tm). For example, as washing conditions after hybridization, there can be usually mentioned conditions of about “1 × SSC, 0.1% SDS, 37 ° C.”. The complementary strand preferably maintains a hybridized state with the target positive strand even when washed under such conditions. Although not particularly limited, more severe hybridization conditions are about “0.5 × SSC, 0.1% SDS, 42 ° C.”, and more severe hybridization conditions are “0.1 × SSC, 0.1% SDS, 65 ° C.” "Washing conditions. Specifically, as such a complementary strand, a strand consisting of a nucleotide sequence completely complementary to the nucleotide sequence of the target positive strand, and at least 90%, preferably 95% homology with the positive strand. Can be exemplified.
[0026]
In addition, the polynucleotide on the positive strand side has not only the nucleotide sequence of any of SEQ ID NOs: 1 to 267 or a partial sequence thereof, but also a complementary relationship to the nucleotide sequence of the complementary strand. Can be included.
[0027]
Further, each of the above-described positive-chain polynucleotide and complementary-strand (reverse-strand) polynucleotide may be used as a disease marker in a single-stranded form, or may be used as a disease marker in a double-stranded form.
[0028]
The disease marker for Alzheimer's disease of the present invention may be a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence (full-length sequence) described in any of SEQ ID NOs: 1 to 267, or a polynucleotide consisting of a complementary sequence thereof. It may be a nucleotide. In addition, as long as it selectively (specifically) recognizes a gene having the nucleotide sequence of any of SEQ ID NOs: 1 to 267 or a polynucleotide derived from the gene, the above-described full-length sequence or its complementary sequence May be a polynucleotide consisting of the partial sequence of In this case, examples of the partial sequence include a polynucleotide having at least 15 continuous base lengths, which is arbitrarily selected from the base sequence of the above-described full-length sequence or its complementary sequence.
[0029]
Here, “selectively (specifically) recognizes” is, for example, in Northern blotting, a gene having the nucleotide sequence described in any of SEQ ID NOs: 1 to 267 or a gene derived from these genes. That the polynucleotide can be specifically detected, and that in the RT-PCR method, genes having the nucleotide sequence of any of SEQ ID NOs: 1 to 267 or polynucleotides derived from these genes are specifically produced However, the present invention is not limited thereto, and any method can be used as long as a person skilled in the art can judge that the above-mentioned detected substance or product is derived from these genes.
[0030]
Such a disease marker of the present invention is, for example, based on the nucleotide sequence shown in any of SEQ ID NOs: 1 to 267, depending on the gene to be detected (recognized) (SEQ ID NOs: 1 to 267). It can be designed using primer 3 (HYPERLINK http://www.genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3.cgi) or vector NTI (manufactured by Infomax). Specifically, a primer or probe candidate sequence obtained by subjecting the nucleotide sequence shown in any of SEQ ID NOs: 1 to 267 to software of primer3 or vector NTI, or a sequence containing at least a part of the sequence as a primer or Can be used as a probe.
[0031]
The disease marker of the present invention has only to have a length of at least 15 consecutive nucleotides as described above. Specifically, the length can be appropriately selected and set according to the use of the marker. .
[0032]
(1-2) Polynucleotide as probe or primer
The disease marker of the present invention is used as a primer for specifically recognizing and amplifying RNA generated by expression of each of the above genes or a polynucleotide derived therefrom, or specifically detecting the RNA or a polynucleotide derived therefrom. Can be used as a probe.
[0033]
When the above-mentioned disease marker is used as a primer in the detection of Alzheimer's disease (gene diagnosis), a marker having a base length of usually 15 bp to 100 bp, preferably 15 bp to 50 bp, more preferably 15 bp to 35 bp can be exemplified. When used as a detection probe, those having a base length of usually 15 bp to the entire sequence, preferably 15 bp to 1 kb, more preferably 100 bp to 1 kb can be exemplified.
[0034]
The disease marker of the present invention can be used as a primer or probe according to a conventional method in a known method for specifically detecting a specific gene, such as a Northern blot method, an RT-PCR method, and an in situ hybridization method. Thus, the presence or absence or expression level (expression amount) of the gene having the nucleotide sequence described in any one of SEQ ID NOs: 1 to 267 related to Alzheimer's disease can be evaluated.
[0035]
The sample to be measured can be appropriately selected according to the type of detection method used. The sample may be, for example, a biological tissue of a subject, in particular, a part of hippocampus tissue collected by biopsy or the like, and total RNA prepared therefrom according to a conventional method may be used, or further prepared based on the RNA. Various polynucleotides may be used.
[0036]
In addition, the expression level in a living tissue of the gene having the nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 267 can be detected or quantified using a DNA chip. In this case, the disease marker of the present invention can be used as a probe of the DNA chip (for example, in the case of Gene Chip Human Genome U95 A, B, C, D, E from Affymetrix, a polynucleotide of 25 bp in length) Used as a probe). By hybridizing a DNA chip using the disease marker of the present invention as a probe with a labeled DNA or RNA prepared based on RNA collected from a living tissue, the disease marker (probe) of the present invention and the labeled DNA or RNA can be obtained. Is formed. By detecting the complex using the label of the labeled DNA or RNA as an index, the presence or absence or the expression level (expression) of the gene consisting of the nucleotide sequence of any of SEQ ID NOs: 1 to 267 in living tissue is examined. Quantity) can be evaluated.
[0037]
The DNA chip may include one or more disease markers of the present invention that can bind to a gene having the nucleotide sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 267. By using a DNA chip containing a plurality of disease markers, it is possible to simultaneously evaluate the presence or absence or the expression level of a plurality of genes in one biological sample.
[0038]
The disease marker of the present invention is useful for diagnosing and detecting Alzheimer's disease (diagnosis of presence / absence and degree of morbidity). Specifically, the diagnosis of Alzheimer's disease using the disease marker is performed by examining the gene expression level of the gene having the nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 267 in the hippocampus tissue of the subject and the hippocampus tissue of a normal subject. This can be done by determining the difference.
[0039]
In this case, the difference in the gene expression level includes not only the difference between the presence / absence of expression but also the difference between the expression levels of both the hippocampus tissue of the subject and the hippocampus tissue of the normal person even when both of them have expression. It includes the case of double or more, preferably triple or more.
[0040]
More specifically, the genes having the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 to 96 specifically show expression induction (increased expression) in hippocampal tissues of Alzheimer's disease patients (early patients and / or late patients). Was. Therefore, the gene having the nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 96 is specifically expressed in the hippocampus tissue of the subject, or the expression level is higher than that of the normal hippocampus tissue. If the increase is at least two-fold, more preferably at least three-fold, the subject is suspected of having Alzheimer's disease. In the detection (diagnosis) of Alzheimer's disease in this case, at least 15 consecutive nucleotides in the base sequence described in any of the above genes (base sequence described in any of SEQ ID NOs: 1 to 96) are used. The disease marker of the present invention consisting of a polynucleotide having the polynucleotide and / or a polynucleotide complementary thereto is useful.
[0041]
Among them, the gene having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 40, 41, 42, 43, 44, 72, 73, 74, and 88 is a normal hippocampal tissue As compared with, the expression was more than 4-fold increased in hippocampal tissues of Alzheimer's disease patients (early patients and / or late patients). Therefore, any one of the nucleotide sequences corresponding to these genes (SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 40, 41, 42, 43, 44, 72, 73, 74 and 88) In the present invention, the disease marker of the present invention, which comprises a continuous polynucleotide having a length of at least 15 bases and / or a polynucleotide complementary thereto, is more useful.
[0042]
In particular, the gene having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, 2, 40 or 72 is expressed five times or more in hippocampal tissues of Alzheimer's disease patients (early patients and / or late patients) as compared to normal hippocampal tissues. Showed an increase. Therefore, in any of the base sequences corresponding to these genes (the base sequence described in any of SEQ ID NOs: 1, 2, 40 and 72), a continuous polynucleotide having at least 15 bases and / or its complement The disease marker of the present invention comprising a specific polynucleotide is particularly useful.
[0043]
On the other hand, the gene having the nucleotide sequence of SEQ ID NOs: 97 to 267 specifically decreases expression in hippocampal tissues of Alzheimer's disease patients (early patients and / or late patients) as compared to normal hippocampal tissues. I was Therefore, the gene having the nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 97 to 267 is not expressed in the hippocampus tissue of the subject, or the expression level is twice or more as compared with the normal hippocampus tissue. If the decrease is preferably three times or more, the subject is suspected of having Alzheimer's disease. In the detection (diagnosis) of Alzheimer's disease in this case, in any one of the nucleotide sequences corresponding to the above genes (the nucleotide sequence described in any of SEQ ID NOs: 97 to 267), a sequence having at least 15 consecutive nucleotides in length is used. The disease marker of the present invention comprising a nucleotide and / or a polynucleotide complementary thereto is useful.
[0044]
Among them, SEQ ID NOs: 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 136, 137, 138, 139 , 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221 and 222 are obtained from normal hippocampal tissues. As compared with, the expression of hippocampus tissue of Alzheimer's disease patients (early patients and / or late patients) was reduced by a factor of 4 or more. Therefore, any of the nucleotide sequences corresponding to these genes (SEQ ID NOs: 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 120, 121, 122, 123, 124, 125) , 126, 127, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221 and 222 In the present invention, the disease marker of the present invention, which comprises a continuous polynucleotide having a length of at least 15 bases and / or a polynucleotide complementary thereto, is more useful.
[0045]
In particular, the gene having the nucleotide sequence of SEQ ID NOs: 97, 98, 99, 100, 120, 121, 122, 136, 137, 138, 139, 140, 215, 216, 217 and 218 is a normal hippocampal tissue. The expression of the hippocampal tissue of Alzheimer's disease patients (early patients and / or late patients) was reduced by a factor of 5 or more. Therefore, any of the nucleotide sequences corresponding to these genes (SEQ ID NO: 97, 98, 99, 100, 120, 121, 122, 136, 137, 138, 139, 140, 215, 216, 217 and 218) In particular, the disease marker of the present invention, which comprises a continuous polynucleotide having a length of at least 15 bases and / or a polynucleotide complementary thereto, is particularly useful.
[0046]
In addition, the genes having the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 98, 99, 100, 102, 112, 115, 121, 122, 123 and 130 are compared with normal hippocampal tissues in the hippocampus of both early and late Alzheimer's disease patients. Both tissues showed a three-fold or more decrease in expression. Therefore, in any of the nucleotide sequences corresponding to these genes (the nucleotide sequence described in any of SEQ ID NOs: 98, 99, 100, 102, 112, 115, 121, 122, 123 and 130), The disease marker of the present invention comprising a polynucleotide having a length of 15 bases and / or a polynucleotide complementary thereto is particularly useful.
[0047]
In the present invention, the detection (diagnosis) of Alzheimer's disease is carried out by detecting the presence or absence or the expression level (expression) of at least one gene having the nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 267 in a living tissue of a subject, particularly a hippocampus tissue. Quantity). In order to increase the accuracy and precision of detection (diagnosis), two or more of the above-mentioned gene group, preferably a plurality of genes, more preferably one-quarter or more of the above-mentioned gene group, and still more preferably half of the above-mentioned gene group It is desirable to evaluate the presence or absence or the expression level (expression amount) of the above genes.
[0048]
(1-3) Antibody
The present invention provides an antibody capable of specifically recognizing, as a disease marker for Alzheimer's disease, an expression product (protein) of a gene having the nucleotide sequence of any of SEQ ID NOs: 1 to 267.
[0049]
As the gene expression product (protein), specifically, a protein encoded by a gene having the nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOS: 1 to 267, more specifically, among these genes, SEQ ID NO: : 5, 11, 19, 26, 72, 78, 81, 87, 142, 143, 147, 156, 163, 164, 176, 180, 183, 184, 186, 189, 192, 202, 203, 204, 205 And 206 (hereinafter these genes are collectively referred to as gene III). In addition, as a specific aspect of the latter protein, a protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 268 to 293 can be exemplified.
[0050]
That is, as a specific embodiment of the protein encoded by the gene having the base sequence of SEQ ID NO: 5, a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 268 is replaced with a base sequence of SEQ ID NO: 11. As a specific embodiment of the protein encoded by the gene having the same, a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 269 can be used as a specific embodiment of the protein encoded by the gene having the base sequence of SEQ ID NO: 19 Is a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 270. As a specific embodiment of the protein encoded by the gene having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 26, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 271 is Has the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 72. As a specific embodiment of the protein encoded by the gene having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 272, the protein encoded by the gene having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 78 Is a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 273. As a specific embodiment of the protein encoded by the gene having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 81, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 274 is As a specific embodiment of a protein encoded by a gene having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 87, a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 275 is replaced by the nucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 142. Protein encoded by a gene having a sequence As a specific embodiment, a protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 276 is described. As a specific embodiment of a protein encoded by a gene having a base sequence represented by SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 277 is shown. As a specific embodiment of the protein encoded by the protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 147, the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 278 is represented by SEQ ID NO: 156. As a specific embodiment of the protein encoded by the gene having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 279, a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 279 is encoded by the gene having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 163 As a specific embodiment of the protein, SEQ ID NO: 28 As a specific embodiment of the protein encoded by the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 0 and the gene having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 164, a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 281 As a specific embodiment of the protein encoded by the gene having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 176, a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 282 is replaced by a gene having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 180 As a specific embodiment of the encoded protein, a protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 283 is used. As a specific embodiment of a protein encoded by a gene having the base sequence of SEQ ID NO: 183, Having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 284 As a specific embodiment of a protein encoded by a protein having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 184, a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 285 As a specific embodiment of the protein encoded by the gene having the sequence, the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 286 is replaced by the protein encoded by the gene having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 189. As an embodiment, a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 287 is used. As a specific embodiment of a protein encoded by a gene having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 192, the amino acid represented by SEQ ID NO: 288 is used. The protein having the sequence is described in SEQ ID NO: 202. As a specific embodiment of the protein encoded by the gene having the nucleotide sequence, the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 289 is replaced with the protein encoded by the gene having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 203 As a specific embodiment, a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 290 is represented by SEQ ID NO: 204; As a specific embodiment of the protein encoded by the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 205, the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 292; A gene having the nucleotide sequence of As a specific embodiment of the protein encoded by, for example, a protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 293 can be exemplified.
[0051]
The form of the antibody of the present invention is not particularly limited, and may be a polyclonal antibody using the above protein as an immunogen or a monoclonal antibody thereof. Further, the antibody of the present invention also includes an antibody having an antigen-binding property with respect to a polypeptide consisting of at least 8 amino acids, preferably 15 amino acids, and more preferably 20 amino acids, which are continuous at least in the amino acid sequence constituting the protein. It is.
[0052]
Methods for producing these antibodies are already well known, and the antibodies of the present invention can also be produced according to these conventional methods (Current Protocols in Molecular Biology Edit. Ausubel et al. (1987) Publish John Wiley and Sonny. Section 11.12-11.13). Specifically, when the antibody of the present invention is a polyclonal antibody, an oligopeptide having a partial amino acid sequence of the protein is synthesized using the protein expressed and purified in E. coli or the like according to a conventional method, or according to a conventional method. Thus, a non-human animal such as a rabbit can be immunized and obtained from serum of the immunized animal according to a conventional method. On the other hand, in the case of a monoclonal antibody, the above-mentioned protein expressed and purified in E. coli or the like according to a conventional method, or an oligopeptide having a partial amino acid sequence of these proteins is immunized to a non-human animal such as a mouse, and the obtained spleen cells and It can be obtained from hybridoma cells prepared by cell fusion with myeloma cells (Current Protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley and Sons. ).
[0053]
In addition, the protein used for preparing the antibody is based on the sequence information of the gene provided by the present invention (SEQ ID NOs: 1 to 267), DNA cloning, construction of each plasmid, transfection into a host, and transformation. It can be obtained by the operation of culturing the body and recovering the protein from the culture. These operations are performed according to methods known to those skilled in the art, or methods described in the literature (Molecular Cloning, T. Maniatis et al., CSH Laboratory (1983), DNA Cloning, DM. Glover, IRL PRESS (1985)) and the like. Can be done. Specifically, a gene having the nucleotide sequence of any of SEQ ID NOs: 1 to 267, more specifically, for example, SEQ ID NOs: 5, 11, 19, 26, 72, 78, 81, 87, 142, 143, 147, 156, 163, 164, 176, 180, 183, 184, 186, 189, 192, 202, 203, 204, 205 and 206 (gene III) A recombinant DNA (expression vector) capable of expressing a gene having a protein having the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 268 to 293) in a desired host cell is prepared, and this is introduced into a host cell to transform the DNA. The transformation can be carried out by culturing the transformant and recovering the target protein from the resulting culture. In addition, these proteins include amino acid sequences obtained from the genetic information (SEQ ID NOs: 1 to 267) provided by the present invention by ordinary methods and amino acid sequence information provided by the present invention (specifically, for example, SEQ ID NO: 268-293), it can also be produced by a general chemical synthesis method (peptide synthesis).
[0054]
The protein of the present invention includes a protein encoded by a gene having the nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 267, more specifically, SEQ ID NOs: 5, 11, 19, 26, 72, 78, 81, 87, 142, 143, 147, 156, 163, 164, 176, 180, 183, 184, 186, 189, 192, 202, 203, 204, 205 and 206. As well as homologs thereof (proteins having the amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 268 to 293). The homologue includes an amino acid sequence of a protein encoded by a gene having the nucleotide sequence of any of SEQ ID NOs: 1 to 267, more specifically, an amino acid represented by any of SEQ ID NOs: 268 to 293. The sequence consists of an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, substituted or added, and has a biological function equivalent to that of the respective protein, and / or has an equivalent immunological activity. An active protein may be mentioned.
[0055]
Here, a protein encoded by a gene having the nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 267, more specifically, SEQ ID NOs: 5, 11, 19, 26, 72, 78, 81, 87 , 142, 143, 147, 156, 163, 164, 176, 180, 183, 184, 186, 189, 192, 202, 203, 204, 205 and 206. The protein having a biological function equivalent to the function of the protein to be performed (the protein having the amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 268 to 293) includes the corresponding protein and the biochemical or pharmacological function, respectively. And proteins having equivalent functions. A protein encoded by a gene having the nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 267, more specifically, SEQ ID NOs: 5, 11, 19, 26, 72, 78, 81, 87, 142; 143, 147, 156, 163, 164, 176, 180, 183, 184, 186, 189, 192, 202, 203, 204, 205 and 206 (Protein having an amino acid sequence described in any of SEQ ID NOs: 268 to 293) as a protein having an activity equivalent to an immunological activity can induce a specific immune response in a suitable animal or its cells, and List proteins that have the ability to specifically bind to antibodies to each corresponding protein Kill.
[0056]
The number of amino acid mutations and mutation sites in a protein are not limited as long as their biological functions and / or immunological activities are maintained. Indicators for determining how and how many amino acid residues need to be substituted, inserted or deleted without loss of biological function or immunological activity are computer programs well known to those skilled in the art, For example, it can be found using DNA Star software. For example, the number of mutations is typically within 10% of all amino acids, preferably within 5% of all amino acids, and more preferably within 1% of all amino acids. The amino acid to be substituted is a protein obtained after the substitution, wherein the protein before the substitution (a protein encoded by a gene having the nucleotide sequence of any of SEQ ID NOs: 1 to 267, more specifically SEQ ID NO: 5, 11, 19, 26, 72, 78, 81, 87, 142, 143, 147, 156, 163, 164, 176, 180, 183, 184, 186, 189, 192, 202, 203, 204, 205 and Biological function and / or immunological activity of a protein encoded by a gene having a base sequence exemplified by any of SEQ ID NOs: 206 (a protein having the amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 268 to 293)) Is not particularly limited as long as it retains, but from the viewpoint of protein structure retention, residue polarity, charge, and solubility Hydrophobicity, such as hydrophilic and amphiphilic, is preferably an amino acid having properties similar to the amino acid before substitution. For example, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Met, Phe and Trp are amino acids classified as non-polar amino acids, and Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn and Gln are non-charged amino acids. Asp and Glu are amino acids classified as acidic amino acids, and Lys, Arg, and His are amino acids classified as basic amino acids. Therefore, amino acids belonging to the same group can be appropriately selected using these as indices.
[0057]
Further, the antibody of the present invention is a protein encoded by a gene having the nucleotide sequence of any of SEQ ID NOs: 1 to 267, more specifically, SEQ ID NOs: 5, 11, 19, 26, 72, 78, 81, 87, 142, 143, 147, 156, 163, 164, 176, 180, 183, 184, 186, 189, 192, 202, 203, 204, 205 and 206. It is prepared using an oligopeptide having a partial amino acid sequence of a protein encoded by a gene (a protein having the amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 268 to 293) (or a homolog of the protein). You may. The oligopeptide used for such antibody induction does not need to have a functional biological activity, but preferably has the same immunogenic properties as the corresponding proteins described above. Preferably, it has such properties, and the amino acid sequence of a protein encoded by a gene having a base sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 267, more specifically, for example, SEQ ID NOs: 5, 11, 19, 26 , 72, 78, 81, 87, 142, 143, 147, 156, 163, 164, 176, 180, 183, 184, 186, 189, 192, 202, 203, 204, 205 and 206. A polyamino acid sequence consisting of at least 8 consecutive amino acids, preferably 15 amino acids, more preferably 20 amino acids in the amino acid sequence of the protein encoded by the gene having the base sequence (the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 268 to 293). Peptides can be exemplified.
[0058]
Generation of antibodies to such polypeptides can also be performed by increasing the immunological response using various adjuvants depending on the host. Such adjuvants include, but are not limited to, Freund's adjuvant, mineral gels such as aluminum hydroxide, and surfaces such as lysolecithin, pluronic polyols, polyanions, peptides, oil emulsions, keyhole limpet hemocyanin and dinitrophenol. Active substances include BCG (Bacillus Calmette-Guerin) and human adjuvants such as Corynebacterium parvum.
[0059]
The antibody of the present invention is a protein encoded by a gene having the nucleotide sequence of any of SEQ ID NOs: 1 to 267, more specifically, SEQ ID NOs: 5, 11, 19, 26, 72, 78, 81, 87, 142, 143, 147, 156, 163, 164, 176, 180, 183, 184, 186, 189, 192, 202, 203, 204, 205 and 206 It has the property of specifically binding to the encoded protein (a protein having the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 268 to 293) (or a homolog of the protein). The above protein (including homologs thereof) expressed in the tissue of the subject can be specifically detected. That is, the antibody is useful as a probe for detecting the presence or absence of expression of the protein (including its homolog) in the tissue of the subject.
[0060]
Specifically, a part of a patient's living tissue, particularly a hippocampus tissue, is collected by biopsy or the like, and a protein is prepared therefrom in accordance with a conventional method. Can be used as a probe in a conventional manner to detect the above protein.
[0061]
When diagnosing Alzheimer's disease, a protein encoded by a gene having the nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 267 in a hippocampus tissue of a subject, more specifically, SEQ ID NOs: 5, 11, 19, 26 , 72, 78, 81, 87, 142, 143, 147, 156, 163, 164, 176, 180, 183, 184, 186, 189, 192, 202, 203, 204, 205 and 206. Between the amount of at least one of the proteins encoded by the gene having the base sequence (the protein having the amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 268 to 293) and the amount of the protein in normal hippocampal tissue What is necessary is just to judge a difference. In this case, the difference in the protein amount includes the presence / absence of the protein, or the case where the difference in the protein amount is twice or more, preferably three times or more.
[0062]
Specifically, since the gene having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NOs: 1 to 96 specifically showed expression induction (enhancement) in hippocampal tissue of Alzheimer's disease patients (early patients and / or late patients), An expression product of the gene in a hippocampus tissue of a subject (a protein encoded by a gene having the nucleotide sequence shown in any of SEQ ID NOs: 1 to 96, more specifically SEQ ID NOs: 5, 11, 19, 26; A protein (SEQ ID NO: 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, or 275) which is encoded by a gene having a base sequence exemplified by any of 72, 78, 81, and 87 It is found that the amount of the protein having a sequence)) is at least twice, preferably at least three times as large as that of normal hippocampal tissue. If it is, suffering Alzheimer's disease is suspected.
[0063]
In the detection (diagnosis) of Alzheimer's disease in this case, a protein encoded by a gene having the nucleotide sequence shown in any of SEQ ID NOs: 1 to 96, more specifically, SEQ ID NOs: 5, 11, 19, 26, 72, 78, 81, and 87 (shown by any of SEQ ID NOs: 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, and 275) The disease marker of the present invention having an antibody that specifically recognizes a protein having the amino acid sequence of the present invention is useful.
[0064]
Among them, the gene having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 40, 41, 42, 43, 44, 72, 73, 74, and 88 is used in normal hippocampal tissue. In comparison, Alzheimer's disease patients (early patients and / or late patients) showed more than 4-fold expression induction (enhancement) in hippocampal tissues. Therefore, it is encoded by a gene having the nucleotide sequence described in any one of SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 40, 41, 42, 43, 44, 72, 73, 74, and 88. And a disease marker having an antibody that specifically recognizes a protein having the amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 268 and 272, for example, is particularly useful for detecting (diagnosing) Alzheimer's disease. It is considered to be.
[0065]
On the other hand, the gene having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NOs: 97 to 267 specifically suppressed expression (decreased) in the hippocampus tissue of Alzheimer's disease patients (early patients and / or late patients). Expression product of the gene in the tissue (protein encoded by the gene having the nucleotide sequence shown in any of SEQ ID NOs: 97 to 267, more specifically SEQ ID NOs: 142, 143, 147, 156, 163, 164) 176, 180, 183, 184, 186, 189, 192, 202, 203, 204, 205 and 206 (SEQ ID NOs: 276, 277, 278) , 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 28 , 289, 290, 291, 292, and 293) is determined to be twice or more, preferably three times or more smaller than the amount of the expression product of normal hippocampus tissue. If so, Alzheimer's disease is suspected.
[0066]
For detection (diagnosis) of Alzheimer's disease in this case, a protein encoded by a gene having the nucleotide sequence shown in any of SEQ ID NOs: 97 to 267, more specifically, SEQ ID NOs: 142, 143, 147, 156, 163, 164, 176, 180, 183, 184, 186, 189, 192, 202, 203, 204, 205 and 206, a protein encoded by a gene having any of the base sequences (SEQ ID NO: 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292 and 293). The disease marker of the present invention having an antibody recognizing is useful.
[0067]
Among them, SEQ ID NOs: 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 136, 137, 138, 139, Genes having the nucleotide sequences shown at 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221 and 222 are transferred to normal hippocampal tissues. In comparison, hippocampal tissues of Alzheimer's disease patients (early patients and / or late patients) showed expression suppression (reduction) of 4 times or more. Therefore, SEQ ID NOs: 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221 and 222 A disease marker having an antibody that specifically recognizes a protein to be tested, more specifically, a protein having any of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 276, 277, and 278, is particularly useful for detecting (diagnosing) Alzheimer's disease. Deemed useful.
[0068]
In addition, the genes having the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 98, 99, 100, 102, 112, 115, 121, 122, 123 and 130 are compared with normal hippocampal tissues in the hippocampus of both early and late Alzheimer's disease patients. Both tissues showed a three-fold or more decrease in expression. Accordingly, a disease having an antibody that specifically recognizes a protein encoded by a gene having the nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 98, 99, 100, 102, 112, 115, 121, 122, 123, and 130 Markers are believed to be particularly useful for detecting (diagnosing) Alzheimer's disease.
[0069]
(2) Alzheimer's disease detection method (diagnosis method)
The present invention provides a method for diagnosing Alzheimer's disease using the aforementioned Alzheimer's disease disease marker of the present invention.
[0070]
Specifically, in the detection method of the present invention, a part of a biological tissue of a subject, particularly, a hippocampus tissue is collected by biopsy or the like, and contained in any of SEQ ID NOs: 1 to 267 related to Alzheimer's disease contained therein. Gene expression level (expression level) of a gene having a base sequence or a protein derived from these genes is detected, and the expression level or the amount of the protein is measured to determine the presence or absence or the degree of Alzheimer's disease. It is to detect (diagnose).
[0071]
The diagnostic method of the present invention comprises the following steps (a), (b) and (c):
(A) contacting a biological sample of a subject with the disease marker of the present invention;
(B) Gene expression level of a gene having the nucleotide sequence of any of SEQ ID NOs: 1 to 267 in a biological sample, or encoded by a gene having the nucleotide sequence of any of SEQ ID NOs: 1 to 267 Measuring the amount of the protein having the amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 268 to 293 using the disease marker as an index,
(C) a step of determining the presence of Alzheimer's disease based on the result of (b).
[0072]
The biological sample used herein is a biological tissue of a subject, particularly hippocampal tissue, RNA prepared from the tissue or a polynucleotide further prepared therefrom, or a protein prepared from the tissue. Such RNA, polynucleotide or protein can be prepared by collecting a part of a living tissue of a subject, particularly a part of hippocampus tissue, using a biopsy or the like, and preparing therefrom according to a conventional method.
[0073]
The diagnostic method of the present invention is specifically performed as follows according to the type of a biological sample used as a measurement target.
[0074]
(2-1) When RNA is used as a biological sample to be measured
When RNA is used as a biological sample used for diagnosis, the detection method (diagnosis method) of the present invention detects the expression level of a gene having the base sequence described in any of SEQ ID NOs: 1 to 267 in the RNA. , By measuring.
[0075]
In this case, the detection method of the present invention comprises the following steps (a), (b) and (c):
(A) contacting a biological sample of a subject with the disease marker of the present invention;
(B) measuring RNA derived from a biological sample specifically bound to the disease marker of the present invention or a complementary polynucleotide transcribed therefrom using the disease marker as an index, and
(C) a step of determining the presence of Alzheimer's disease based on the result of (b).
[0076]
The method for detecting (diagnosing) Alzheimer's disease of the present invention utilizes RNA as a biological sample to be measured, and particularly, expression of a gene having a base sequence described in any of SEQ ID NOs: 1 to 267 in the RNA. Implemented by detecting and measuring levels. Specifically, depending on the nucleotide sequence of the gene to be detected, the aforementioned disease marker of the present invention (the polynucleotide having at least 15 consecutive nucleotides in the nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 267 and / or Or a complementary polynucleotide thereof) as a primer or a probe, by performing a known method such as Northern blotting, RT-PCR, DNA chip analysis, or in situ hybridization analysis.
[0077]
When the Northern blot method is used, the presence or absence of the expression of the gene having the nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 267 in RNA and the expression level thereof are obtained by using the above-mentioned disease marker of the present invention as a probe. Can be detected and measured. Specifically, the disease marker (complementary strand) of the present invention is 32 P, 33 P or the like: labeled with RI) or a fluorescent substance, and hybridized with RNA derived from a living tissue of a subject, which is transferred to a nylon membrane or the like according to a conventional method, and then formed with a labeled disease marker (DNA) and RNA. A method for detecting and measuring a signal derived from a label (RI or a fluorescent substance, etc.) of the disease marker with a radiation detector (BAS-1800II, manufactured by Fuji Film Co., Ltd.) or a fluorescence detector for the double strand of can do. A disease marker (probe DNA) was labeled using AlkPhos Direct Labeling and Detection System (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech) according to the protocol, and the marker was hybridized with RNA derived from a biological tissue of the subject. A method of detecting and measuring a signal derived from a substance using a multi-bio imager STORM860 (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech) can also be used.
[0078]
When the RT-PCR method is used, the presence or absence and the expression level of the gene having the nucleotide sequence of any of SEQ ID NOs: 1 to 267 in the RNA can be determined by using the disease marker of the present invention as a primer. Can be detected and measured. Specifically, a pair of primers prepared from the disease marker of the present invention (the above-mentioned cDNA) are prepared by preparing a cDNA from RNA derived from a living tissue of a subject according to a conventional method, and amplifying the target gene region using the cDNA as a template. (Positive strand binding to (-strand), reverse strand binding to + strand) are hybridized with this, PCR is performed according to a conventional method, and the method for detecting the amplified double-stranded DNA obtained is exemplified. Can be. The amplified double-stranded DNA is detected by a method for detecting labeled double-stranded DNA produced by performing the above-mentioned PCR using primers that have been labeled with RI or a fluorescent substance in advance. The double-stranded DNA thus obtained can be transferred to a nylon membrane or the like according to a conventional method, and a method can be used in which a labeled disease marker is used as a probe, hybridized with the probe, and detected. The generated labeled double-stranded DNA product can be measured using an Agilent 2100 Bioanalyzer (manufactured by Yokogawa Analytical Systems). In addition, an RT-PCR reaction solution is prepared according to the protocol using SYBR Green RT-PCR Reagents (manufactured by Applied Biosystems), and ABI PRIME 7700 Sequence Detection System (the reaction of Applied Biosystems is performed by Applied Biosystems). You can also.
[0079]
When DNA chip analysis is used, a DNA chip on which the disease marker of the present invention is affixed as a DNA probe (single-stranded or double-stranded) is prepared. The method includes a method in which cRNA prepared by the method is hybridized, and a double strand of the formed DNA and cRNA is detected by binding to a labeled probe prepared from the disease marker of the present invention. Alternatively, a DNA chip capable of detecting and measuring the gene expression level of a gene having the base sequence described in any of SEQ ID NOs: 1 to 267 can be used as the DNA chip. Examples of a DNA chip capable of detecting and measuring the expression level of such a gene include Gene Chip Human Genome U95A, A, B, C, D, and E from Affymetrix. Detection and measurement of the gene expression level of the gene having the nucleotide sequence of any of SEQ ID NOs: 1 to 267 in the subject RNA using such a DNA chip will be described in detail in Examples.
[0080]
(2-2) When using a protein as the measurement target
When a protein is used as the measurement target, the detection method (diagnosis method) of the present invention uses a protein encoded by a gene having a base sequence according to any one of SEQ ID NOS: 1 to 267, which is present in a biological sample. More specifically, SEQ ID NOs: 5, 11, 19, 26, 72, 78, 81, 87, 142, 143, 147, 156, 163, 164, 176, 180, 183, 184, 186, 189, 192, A protein (SEQ ID NO: 268 to 293) encoded by a gene (gene III) having any of the base sequences described in any of 202, 203, 204, 205, and 206 ) Is detected and its amount (level) is measured. More specifically, a protein encoded by a gene having the nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 267, more specifically, SEQ ID NOs: 5, 11, 19, 26, 72, 78, 81, 87 , 142, 143, 147, 156, 163, 164, 176, 180, 183, 184, 186, 189, 192, 202, 203, 204, 205 and 206. Using an antibody recognizing a protein encoded by (gene III) (a protein having the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 268 to 293) as a disease marker, the above protein was obtained by a known method such as Western blotting. Can be detected and quantified.
[0081]
Western blotting uses the above antibody as the primary antibody and then as the secondary antibody 125 I is labeled using a labeled antibody (labeled antibody that binds to the primary antibody) labeled with a radioisotope such as I or a fluorescent substance, and a signal derived from the radioisotope or the fluorescent substance is measured using a radiometer (BAS- 1800II: manufactured by Fuji Film Co., Ltd.) or a fluorescence detector. Further, after using the disease marker of the present invention as a primary antibody, detection was performed using ECL Plus Western Blotting Detection System (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech) according to the protocol, and the multi-bioimager STORM860 (Amersham) was used. Can also be measured.
[0082]
(2-3) Diagnosis of Alzheimer's disease
Specifically, the diagnosis of Alzheimer's disease can be made by determining the gene expression level of a gene having the nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOS: 1 to 267 in a living tissue of a subject, particularly, a hippocampus tissue, or the gene expression level of SEQ ID NOs: 1 to 267. The amount (level) of a protein that is an expression product of a gene having any of the base sequences described in any of the above, and more specifically, a protein having an amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 268 to 293, corresponds to the above. It can be carried out by comparing the expression level of the gene or the amount (level) of the protein in a normal living tissue (particularly, a normal hippocampus tissue), and judging a difference between the two.
[0083]
In this case, a biological sample (RNA or protein) collected and prepared from a normal biological tissue, particularly a hippocampus tissue, is required. Can be obtained by doing In addition, the "person who does not suffer from Alzheimer's disease" here has at least no subjective symptoms of Alzheimer's disease, and is preferably obtained by another test method, for example, the revised Hasegawa-type simplified intelligence scale (HDS-R) method. As a result, it refers to a person diagnosed as not having Alzheimer's disease. In the following, the “person not suffering from Alzheimer's disease” may be simply referred to as a normal person in the present specification. Hereinafter, a specific diagnostic method will be described using a biological sample collected and prepared from hippocampal tissue as an example.
[0084]
Comparison of the gene expression level or the expression product (protein) amount (level) between the hippocampus tissue of the subject and normal hippocampus tissue (hippocampus tissue of a person not affected by Alzheimer's disease) It can be implemented by performing measurements on biological samples in parallel. When not performed in parallel, the gene expression levels of the above genes obtained by measuring a plurality of (at least two, preferably three or more, more preferably five or more) normal hippocampal tissues under uniform measurement conditions Alternatively, an average value or a statistical intermediate value of the amounts (levels) of the proteins which are the expression products of these genes is determined in advance, and this is calculated as the gene expression level of normal subjects or the amount of the expression products (proteins) (normal values). ), These can be compared to measured levels or values in the subject.
[0085]
Whether the subject has Alzheimer's disease is determined by determining the gene expression level of the gene having the nucleotide sequence of any of SEQ ID NOs: 1 to 267 in the hippocampus tissue of the subject, or the amount of the expression product (protein). (Level), more specifically, the amount (level) of the protein having the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 268 to 293 is at least two times, preferably at least three times, that of a normal person. Can be used as an index as to whether or not there is a change (more or less).
[0086]
Specifically, in the subject, the gene expression level of the gene having the base sequence described in any of SEQ ID NOs: 1 to 96 or the amount (level) of the expression product (protein) among the above genes is more specific. Indicates that the amount (level) of the protein having the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274 and 275 is the gene expression level of the gene corresponding to the above in a normal person Or the gene expression level of a gene having the nucleotide sequence of any of SEQ ID NOs: 97 to 267 among the above-mentioned genes, or the expression product (protein ), More specifically SEQ ID NOs: 276, 277, 278, 279, 280, 281, 28 , 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292 and 293, the amount (level) of the protein having the amino acid sequence shown in FIG. If the expression level or the amount (level) of the expression product is low, Alzheimer's disease is suspected for the subject.
[0087]
Among the above methods, (2-1) when detecting (diagnosing) Alzheimer's disease using RNA as a biological sample, that is, detecting Alzheimer's disease from presence or absence of gene expression or gene expression level (expression amount) ( (Diagnosis), in order to increase the accuracy and precision of detection (diagnosis), two or more, preferably a plurality of genes, more preferably 4 It is desirable to evaluate the presence or absence or the level of expression (expression level) in at least one-half, more preferably at least half, and to detect (diagnose) Alzheimer's disease from the results.
[0088]
Also, in the case of detecting (diagnosing) Alzheimer's disease using a protein as the measurement target (2-2), the biological sample is encoded by the genes shown in SEQ ID NOs: 1 to 267 in the same manner as described above. Of two or more, preferably two or more, of the proteins having the same amino acid sequence (specifically, the protein having the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 268 to 293), and from the results, Alzheimer's disease It is desirable to detect (diagnose).
[0089]
When a plurality of genes or proteins are evaluated, it is possible to score the evaluation of each gene or protein and diagnose Alzheimer's disease comprehensively. As an example, an arbitrary 10 genes or proteins are evaluated from the above genes or proteins, and 9 or more genes or proteins are evaluated as suspected of Alzheimer's disease based on the above criteria. If so, it can be diagnosed that the possibility of the disease is high. In this case, the number, score, or diagnostic standard of the gene or protein to be evaluated is not limited.
[0090]
(3) Screening method for drug candidates
The present invention provides a method for screening a substance that regulates the expression of a gene having the nucleotide sequence of any of SEQ ID NOs: 1 to 267.
[0091]
The screening method of the present invention comprises the following steps (a), (b) and (c):
(A) a step of bringing a test substance into contact with a cell capable of expressing a gene having the nucleotide sequence of any of SEQ ID NOs: 1 to 267 or a homolog thereof;
(B) For cells contacted with the test substance, the gene expression level of the gene having the nucleotide sequence of any of SEQ ID NOs: 1 to 267 or a homolog thereof was measured, and the expression level was determined as a control without contacting the test substance. Comparing the expression level of the corresponding gene in the cell,
(C) a step of selecting a test substance that changes the gene expression level of a gene having the nucleotide sequence of any of SEQ ID NOs: 1 to 267 or a homologue thereof based on the above comparison results.
[0092]
Examples of cells used for such screening include neural cells capable of expressing a gene having the nucleotide sequence of any of SEQ ID NOs: 1 to 267 regardless of endogenous or exogenous. Specific examples of such cells include neurons obtained from brain tissue and IMR32 cells (available from American Type Culture Collection http://www.atcc.org/SearchCatalogs/CellBiology.cfm). it can. Preferable is a nerve cell obtained from brain tissue (hereinafter abbreviated as a nerve cell). In addition, such a neuron expresses a homolog of a gene having the nucleotide sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 1 to 267, that is, a gene encoding a homolog or variant of the gene in a species other than human. The cells obtained can also be used. For example, a nerve cell endogenously expressing a rat homolog (gene) or a mouse homolog (gene) corresponding to a human gene having the nucleotide sequence of any of SEQ ID NOs: 1 to 267 can be used. In addition, such a nerve cell can be used for screening in the form of a nerve cell to which a substance such as beta amyloid capable of inducing an increase in nerve cell death has been added. Furthermore, the category of cells used for the screening of the present invention also includes tissues that are aggregates of cells.
[0093]
Examples of the candidate substance include, but are not limited to, a nucleic acid (including an antisense oligonucleotide of a gene having a base sequence described in any of SEQ ID NOs: 1 to 96), a peptide, a protein, an organic compound, an inorganic compound, and the like. Specifically, the screening can be performed by bringing a sample (test sample) containing a test substance that can be a candidate substance into contact with the above-mentioned tissue and / or cell. Examples of such test samples include, but are not limited to, cell extracts, expression products of gene libraries, synthetic low molecular weight compounds, synthetic peptides, natural compounds, and mixtures thereof containing the test substance.
[0094]
In the screening of the present invention, the conditions for contacting the test substance with the cells are not particularly limited, but it is preferable to select culture conditions (temperature, pH, medium composition, etc.) that do not kill the cells and can express the desired gene. .
[0095]
As shown in the Examples, in the hippocampus tissue of a patient suffering from Alzheimer's disease, the expression of the gene (gene I) having the nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 96 is higher than in the normal hippocampus tissue Increased levels (induction / increase of gene expression) are observed. From this finding, an increase in the expression level (induction / increase of gene expression) of the gene (gene I) having the nucleotide sequence of any of SEQ ID NOs: 1 to 96 is considered to be related to Alzheimer's disease. . In the screening method of the present invention, a substance that suppresses the expression of a gene (a substance that decreases the expression level, a (A substance that returns to normal). By this screening method, a candidate substance that can be an active ingredient of a drug for preventing, ameliorating, or treating Alzheimer's disease can be provided.
[0096]
The screening method of the present invention specifically includes the following steps (a) to (c).
(A) a step of bringing a test substance into contact with a cell capable of expressing a gene having the nucleotide sequence of any of SEQ ID NOs: 1 to 96 or a homolog thereof,
(B) For cells contacted with the test substance, the expression level of the gene having the nucleotide sequence of any of SEQ ID NOs: 1 to 96 or a homolog thereof is measured, and the expression level is determined as a control without contacting the test substance. Comparing the expression level of the corresponding gene in the cell, and
(C) Based on the above comparison result, a test substance that suppresses the gene expression of the gene having the nucleotide sequence of any of SEQ ID NOs: 1 to 96 or a homolog thereof (reduces the gene expression level) is selected. Process.
[0097]
Further, as shown in Examples, in the hippocampus tissue of a patient suffering from Alzheimer's disease, a gene (gene II) having the nucleotide sequence described in any of SEQ ID NOs: 97 to 267 as compared to a normal hippocampus tissue Decrease in expression level (suppression / decrease of gene expression) is observed. From this finding, it is considered that a decrease in the expression level (suppression / reduction of gene expression) of the gene (gene II) having the nucleotide sequence of any of SEQ ID NOs: 97 to 267 is associated with Alzheimer's disease. . In the screening method of the present invention, a substance that promotes the expression of the gene (a substance that increases the expression level, a substance that increases the expression level, (A substance that returns to a normal level). This screening method can also provide a candidate substance as an active ingredient of a drug for preventing, ameliorating or treating Alzheimer's disease.
[0098]
The screening method of the present invention specifically includes the following steps (a) to (c).
(A) contacting a test substance with a cell capable of expressing a gene having a nucleotide sequence according to any of SEQ ID NOs: 97 to 267 or a homolog thereof,
(B) For the cells contacted with the test substance, the gene expression level of the gene having the nucleotide sequence of any of SEQ ID NOs: 97 to 267 or the homologue thereof was measured, and the expression level was determined as a control without contacting the test substance. Comparing the expression level of the corresponding gene in the cell, and
(C) Based on the above comparison results, a test substance that promotes gene expression of the gene having the nucleotide sequence of any of SEQ ID NOs: 97 to 267 or a homolog thereof (increases the gene expression level) is selected. Process.
[0099]
That is, the screening method of the present invention provides an increase in the expression level (expression induction) of the gene (gene I) having the nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 96 and / or any one of the SEQ ID NOs: 97 to 267. The use of the fact that a decrease in expression level (expression suppression) of a gene (gene II) having the nucleotide sequence described in (1) is associated with Alzheimer's disease. Therefore, to search for a substance having an action of alleviating / suppressing Alzheimer's disease (having an improving / therapeutic effect against Alzheimer's disease), a gene having the nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 96 ( A decrease in the expression level of gene I) or suppression of the expression is used as an index, or an increase in the expression level or expression induction of the gene (gene II) having the nucleotide sequence described in any of SEQ ID NOs: 97 to 267 is used as an index. You.
[0100]
As described above, the screening method of the present invention searches for a substance that suppresses / reduces the expression of a gene (gene I) having the nucleotide sequence of any of SEQ ID NOs: 1 to 96, and / or It is intended to search for a substance which induces or increases the expression of a gene having the nucleotide sequence of any of SEQ ID NOs: 97 to 267 (gene II), and uses the substance thus obtained as an ameliorating agent or treatment for Alzheimer's disease It is provided as a candidate compound to be an active ingredient of a drug.
[0101]
The screening of candidate substances according to the screening method of the present invention is performed, specifically, when cells expressing the gene (gene I) having the nucleotide sequence of any of SEQ ID NOs: 1 to 96 or a homolog thereof are used, It can be performed when the expression level of each of the above genes in cells to which a test substance (candidate substance) is added is lower than the expression level of the same gene in cells to which no test substance (candidate substance) is added. When cells that require an expression inducer for the expression of the gene I or its homolog are used, the expression induced by the expression inducer is suppressed by the presence of the candidate substance, that is, in the presence of the expression inducer. It can be performed when the gene expression of the cells contacted with the candidate substance is lower in the presence of the expression inducing substance compared to control cells not contacted with the candidate substance (positive control).
[0102]
On the other hand, when cells expressing the gene (gene II) having the nucleotide sequence described in any of SEQ ID NOs: 97 to 267 or a homolog thereof are used, the above-described cells in the cells to which the test substance (candidate substance) has been added are used. The candidate substance can be selected by the fact that the expression level of the gene is higher than the expression level of the gene in cells to which the test substance (candidate substance) is not added. When cells in which the expression of the gene II or a homolog thereof is suppressed by an expression-suppressing substance are used, the expression suppressed by the expression-suppressing substance is induced by the presence of the candidate substance. Selection of the candidate substance can be performed when the gene expression of the cell contacted with the substance is higher than that of the control cell not contacted with the candidate substance in the presence of the expression inhibitory substance (positive control).
[0103]
More specifically, for example, in order to screen a candidate substance serving as an active ingredient of a drug for ameliorating or treating Alzheimer's disease using a nerve cell, a nerve cell to which beta amyloid is added (control cell), a beta amyloid and a test substance It is possible to compare the expression level of gene I (or a homolog thereof) or gene II (or a homolog thereof) with a nerve cell to which a substance has been added at the same time, and to select candidate substances using the decrease or increase in the expression level as an index, respectively. it can. In addition, beta-amyloid was added, and the test substance was added to a nerve cell in which the expression of gene I (or a homolog thereof) or gene II (or a homolog thereof) was induced or suppressed. It is also possible to compare the expression level of the gene I (or a homolog thereof) or the gene II (or a homolog thereof) with a nerve cell, and select a candidate substance using the decrease or increase in the expression level as an index, respectively.
[0104]
The detection and quantification of the expression level of such a gene is described in the above section (2-1) using the RNA prepared from the above-described cells or the complementary polynucleotide transcribed therefrom and the disease marker of the present invention. As described above, the method can be carried out by using a known method such as Northern blotting or RT-PCR, or using a DNA chip. The degree of fluctuation (suppression / decrease or induction / increase in expression) of the gene expression level as an index is determined by the expression of gene I or gene II or a homolog thereof in cells to which a test substance (candidate substance) is added. A variation (decrease or increase) of 10%, preferably 30%, particularly preferably 50% or more compared to the expression level in control cells to which (candidate substance) is not added can be exemplified.
[0105]
Further, the detection and quantification of the expression level of the gene I or the gene II or a homolog thereof is performed by introducing a fusion gene linked to a marker region such as a luciferase gene into a gene region controlling the expression of each gene (expression control region). It can also be performed by measuring the activity of a protein derived from a marker gene using the cell line thus prepared. The method for screening a gene I or gene II expression controlling substance of the present invention includes a method for searching for a target substance using the expression level of such a marker gene as an index. In this sense, the concept of a gene having a base sequence represented by any of SEQ ID NOs: 1 to 267 or a homolog thereof in the present invention includes a fusion gene of an expression control region of the gene and a marker gene.
[0106]
As the marker gene, a structural gene of an enzyme that catalyzes a luminescence reaction or a color reaction is preferable. Specifically, in addition to the luciferase gene described above, reporter genes such as chloramphenicol acetyltransferase gene, β-glucuronidase gene, β-galactosidase gene, and aequorin gene can be exemplified. Here, as the expression control region of the gene or a homolog gene thereof, for example, about 1 kb, preferably about 2 kb upstream of the transcription start site of the gene can be used. Preparation of the fusion gene and measurement of the activity derived from the marker gene can be performed by known methods.
[0107]
In the screening method of the present invention, in order to enhance the accuracy and precision of the screening, two or more, preferably a plurality of the above-mentioned specific genes (gene I or gene II or homologs thereof), more preferably the above-mentioned gene group It is desirable to evaluate the gene expression level of the test substance for at least one-fourth of the genes, more preferably at least half of the genes, to select candidate substances. When evaluating a plurality of genes, it is possible to score the evaluation of each gene and to comprehensively select candidate substances. For example, one test substance is used to evaluate any 10 of the above genes, and the test substance is an active ingredient of a drug for improving or treating Alzheimer's disease with respect to 9 or more of the genes. When it is evaluated from the above criteria that the compound is a candidate compound, it can be determined that the test substance is highly likely to be a candidate compound. In this case, the number of genes to be evaluated, the score, or the criterion are not limited.
[0108]
The substance selected from the test substance by the above screening method is a gene expression inhibitor for a gene having the nucleotide sequence of any of SEQ ID NOs: 1 to 96, or any of the SEQ ID NOs: 97 to 267. As a gene expression enhancer (inducer) for a gene having the following base sequence: These substances suppress or reduce the expression of a gene having the nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 96 in vivo, or reduce the nucleotide sequence of any of SEQ ID NOs: 97 to 267 in vivo. It is thought that by inducing and increasing the expression of a gene having the same, enhancement of neuronal cell death can be suppressed, and Alzheimer's disease can be alleviated or suppressed (improved, treated). Therefore, these substances are potent candidate substances for drugs that reduce or suppress (improve, treat) Alzheimer's disease.
[0109]
The test substance thus selected and obtained is a potential candidate substance for a drug that alleviates or suppresses (improves, treats) Alzheimer's disease.
[0110]
The candidate substances selected by the above-described screening method of the present invention are further subjected to a drug efficacy test using an Alzheimer's disease model animal, a safety / pharmacokinetic test using a model animal and a normal animal, and a clinical test for an Alzheimer's disease patient. It may be subjected to tests, and by conducting these tests, more practical Alzheimer's disease ameliorating or therapeutic agents can be selected. The substances selected in this manner can be industrially produced by chemical synthesis, biological synthesis (fermentation) or genetic manipulation based on the results of the structural analysis.
[0111]
(4) Improvement / treatment agent for Alzheimer's disease
The present invention provides an agent for improving or treating Alzheimer's disease.
[0112]
The present invention provides (1) any one of SEQ ID NOs: 1 to 96, based on a new finding that expression of a gene having the nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 267 is associated with Alzheimer's disease. And (2) a substance that induces or increases the expression of a gene having the nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 97 to 267, or improves or reduces the above-mentioned disease. It is based on the idea that it is effective for treatment. That is, the agent for improving or treating Alzheimer's disease of the present invention suppresses or reduces the expression of a gene having the nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 96, and / or any of SEQ ID NOs: 97 to 267. A substance that induces or increases the expression of a gene having the nucleotide sequence described in (1) or (2) is used as an active ingredient.
[0113]
Expression-suppressing (reducing) substance of the gene having the nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 96, or expression of the gene having the nucleotide sequence of any of SEQ ID NOs: 97 to 267, which is the active ingredient Induced (enhanced) substances are not only selected using the above-mentioned screening method, but also produced by chemical / biochemical methods or industrially according to a conventional method based on information on the selected substances. It may be something.
[0114]
Such an expression-suppressing (decreasing) substance or an expression-inducing (enhancing) substance may be used as it is or as a pharmaceutically acceptable carrier (including excipients, bulking agents, binders, lubricants, etc.) or a known carrier. Can be prepared as a pharmaceutical composition by mixing with an additive or the like. The pharmaceutical composition is prepared in the form (oral administration such as tablets, pills, capsules, powders, granules, syrups, etc .; injections, drops, external preparations, nasal drops, eye drops, inhalants, Oral administration or parenteral administration can be performed depending on the parenteral administration such as a suppository. The dose varies depending on the type of the active ingredient, the route of administration, the subject of administration or the age, weight, and symptoms of the patient and cannot be unconditionally defined. However, the daily dose is several mg to 2 g, preferably about several tens mg. It can be administered once or several times a day.
[0115]
When the substance as the active ingredient is encoded by DNA, the DNA may be incorporated into a vector for gene therapy to perform gene therapy. Furthermore, when the active ingredient is an antisense oligonucleotide of a gene having any one of SEQ ID NOs: 1 to 96, gene therapy can be performed as it is or by incorporating this into a gene therapy vector. You can also. In these cases as well, the dose and administration method vary depending on the patient's weight, age, symptoms, and the like, but those skilled in the art can appropriately select them.
[0116]
【Example】
Next, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the present invention is not limited to these examples.
[0117]
Example 1 Variation analysis of gene expression in hippocampus of human Alzheimer's disease and normal human hippocampus
Total RNA was prepared from 3 samples of hippocampal tissue of patients in the early stage of Alzheimer's disease, 4 samples of hippocampal tissue of patients in the late stage of Alzheimer's disease, and 5 samples of normal human hippocampus, and DNA chip analysis was performed using the obtained total RNA. went. DNA chip analysis was performed using Affymetrix Gene Chip Human Genome U95A, B, C, D, and E. Specifically, analysis includes (1) preparation of cDNA from total RNA, (2) preparation of labeled cRNA from the cDNA, (3) fragmentation of labeled cRNA, and (4) fragmentation of cRNA and probe array. , (5) Probe array staining, (6) Probe array scanning, and (7) Gene expression analysis.
[0118]
(1) Preparation of cDNA from total RNA
10 μg of each total RNA and T7- (dT) 24 primer prepared according to a conventional method from 3 samples of hippocampal tissue of a patient in the early stage of Alzheimer's disease, 4 samples of hippocampal tissue of a patient in the late stage of Alzheimer's disease, and 5 samples of normal human hippocampus tissue 11 μL of a mixed solution containing 100 pmol (Amersham) was heated at 70 ° C. for 10 minutes, and then cooled on ice. After cooling, 4 μL of the 5 × First Strand cDNA Buffer contained in SuperScript Choice System for cDNA Synthesis (manufactured by Gibco-BRL), 0.1 M DTT contained in the kit, 0.1 M DTT contained in the kit, and 10 μM of the TP contained in the kit Was added and heated at 42 ° C. for 2 minutes. Further, 2 μL (400 U) of Super ScriptII RT included in the kit was added, heated at 42 ° C. for 1 hour, and then cooled on ice. After cooling, 91 μL of DEPC-treated water (manufactured by Nacalai Tesque, sterile distilled water), 30 μL of 5 × Second Strand Reaction Buffer included in the kit, 3 μL of 10 mM dNTP Mix, included in the kit E. FIG. coli DNA Ligase 1 μL (10 U), included in the kit E. FIG. coli 4 μL (40 U) of DNA Polymerase I and included in the kit E. FIG. coli 1 μL (2 U) of RNaseH was added and reacted at 16 ° C. for 2 hours. Next, 2 μL (10 U) of T4 DNA Polymerase included in the kit was added, and the mixture was reacted at 16 ° C. for 5 minutes, and then 10 μL of 0.5 M EDTA was added. Next, 162 μL of a phenol / chloroform / isoamyl alcohol solution (Nippon Gene) was added and mixed. The mixed solution was transferred to Phase Lock Gel Light (manufactured by Eppendorf) which had been centrifuged at room temperature, 14,000 rpm, and 30 seconds in advance, and centrifuged at room temperature at 14,000 rpm for 2 minutes. Transferred to Eppendorf tube. To the obtained solution, 72.5 μL of a 7.5 M ammonium acetate solution and 362.5 μL of ethanol were added and mixed, followed by centrifugation at 14,000 rpm at 4 ° C. for 20 minutes. After centrifugation, the supernatant was discarded to obtain a pellet containing the prepared cDNA.
[0119]
Thereafter, 0.5 mL of 80% ethanol was added to the pellet, centrifuged at 14,000 rpm for 5 minutes at 4 ° C., and the supernatant was discarded. After performing the same operation again, the pellet was dried and dissolved in 12 μL of DEPC-treated water.
[0120]
By the above operation, each cDNA was obtained from each total RNA prepared from 3 samples of hippocampal tissue of a patient in the early stage of Alzheimer's disease, 4 samples of hippocampal tissue of a patient in the late stage of Alzheimer's disease, and 5 samples of normal human hippocampus tissue.
[0121]
(2) Preparation of labeled cRNA from cDNA
17 μL of DEPC-treated water, 4 μL of 10 × HY Reaction Buffer contained in the BioArray High Yield RNA Transcript Labeling Kit (manufactured by ENZO), 5 μL of each cDNA solution, 4 μL of 10 × Biotin Labeled Kit included in the kit, and 10 × Biotin Labeled Radio kit included in the kit 4 μL of 10 × DTT, 4 μL of 10 × RNase Inhibitor Mix included in the kit, and 2 μL of 20 × T7 RNA Polymerase included in the kit were mixed and reacted at 37 ° C. for 5 hours to prepare labeled cRNA. After the reaction, 60 μL of DEPC-treated water was added to the reaction solution, and the prepared labeled cRNA was purified using RNeasy Mini Kit (manufactured by QIAGEN) according to the attached protocol.
[0122]
(3) Fragmentation of labeled cRNA
To a solution containing 20 μg of each labeled cRNA, 8 μL of 5 × Fragmentation Buffer (200 mM Tris-acetic acid, pH 8.1 (Sigma), 500 mM potassium acetate (Sigma), 150 mM magnesium acetate (Sigma)) was added. 40 μL of the reaction was heated at 94 ° C. for 35 minutes and then placed on ice. Thereby, the labeled cRNA was fragmented.
[0123]
(4) Hybridization between fragmented cRNA and probe array
To 40 μL of each fragmented cRNA, 4 μL of 5 nM Control Oligo B2 (manufactured by Amersham), 4 μL of 100 × Control cRNA Cocktail, 40 μg of Herring sperm DNA (manufactured by Promega), 40 μg of Acetylated BSAGibRibGibSigBigRig (2) Buffer (200 mM MES, 2 M [Na + ], 40 mM EDTA, 0.02% Tween20 (Pierce), pH 6.5 to 6.7) (200 µL) and DEPC-treated water (144 µL) were mixed to obtain 400 µL of a hybrid cocktail. Each of the obtained hybrid cocktails was heated at 99 ° C. for 5 minutes, and further heated at 45 ° C. for 5 minutes. After heating, the mixture was centrifuged at 14,000 rpm for 5 minutes at room temperature to obtain a hybrid cocktail supernatant.
[0124]
On the other hand, a Human genome U95 probe array (manufactured by Affymetrix) filled with 1 × MES hybridization buffer was rotated in a hybridization oven at 45 ° C. and 60 rpm for 10 minutes, and then the 1 × MES hybridization buffer was removed. A probe array was prepared. 200 μL of the hybrid cocktail supernatant obtained above was added to each of the probe arrays, and the mixture was rotated in a hybridization oven at 45 ° C. and 60 rpm for 16 hours to obtain a probe array hybridized with the fragmented cRNA.
[0125]
(5) Staining of probe array
After collecting and removing the hybrid cocktail from each of the hybridized probe arrays obtained above, Non-Stringent Wash Buffer (diluted 6 × SSPE (diluted 20 × SSPE (manufactured by Nacalai Tesque)), 0.01% Tween 20,0 0.005% Antifoam 0-30 (manufactured by Sigma)). Next, a fragment of a GeneChip Fluidics Station 400 (manufactured by Affymetrix) with a fragment of GeneChip Fluidics Station 400 (manufactured by Affymetrix) containing a Non-Stringent Wash Buffer and a Stringent Wash Buffer (100 mM MES, 0.1 M NaCl, 0.01% Tween 20) was set. The probe array was mounted. Then, according to the staining protocol EuKGE-WS2, a primary staining solution (10 μg / mL Streptavidin Phycoerythrin (SAPE) (Molecular Probe)), 2 mg / mL Acetylated BSA, 100 mM MES, 1M NaCl (Ambion Tween) , 0.005% Antifoam 0-30), secondary staining solution (100 μg / mL Goat IgG (manufactured by Sigma), 3 μg / mL Biotinylated Anti-Streptavidin antibody (Vector Lab. 1 M NaCl, 0.05% Tween 20, 0.005% Antifoam It was stained with -30).
[0126]
(6) Probe array scanning, and (7) Gene expression analysis
Each stained probe array was subjected to an HP GeneArray Scanner (manufactured by Affymetrix), and the staining pattern was read. Based on the staining pattern, the gene expression on the probe array was analyzed by GeneChip Workstation System (manufactured by Affymetrix). Next, according to the analysis protocol, normalization and comparative analysis of gene expression were performed.
[0127]
Example 2 Fluctuation analysis of gene expression in hippocampus and normal human hippocampus of Alzheimer's disease patients
From the results of comparative analysis of gene expression by DNA chip analysis performed in Example 1, a probe showing a three-fold or more increase in expression in the hippocampus tissue of a patient with Alzheimer's disease (early or late) compared to a normal hippocampus tissue, and a normal A probe was selected that showed a three-fold or higher decrease in expression in hippocampus tissue of a patient with Alzheimer's disease (early or late stage) as compared to hippocampus tissue. Table 1 shows the increase / decrease in expression fluctuation and the fold expression fluctuation of the probe showing the expression fluctuation in the patients in the early stage of Alzheimer's disease, and Table 2 shows the increase / decrease and the fold expression fluctuation of the probe showing the expression change in the patients in the late stage of Alzheimer's disease. -3. In the table, the expression fluctuation ratio indicates the ratio of increase or decrease in the expression level of the gene in the hippocampus tissue of an Alzheimer's disease patient when the gene expression level in the normal hippocampus tissue analyzed by the Human Genome U95 Chip is set to 1. , And a decrease is indicated by adding a minus (-). Table 1-3 also shows the nucleotide sequence of the gene corresponding to the selected probe (Human U95 probe name) and the amino acid sequence encoded by the gene.
[0128]
[Table 1]
[Table 2]
[Table 3]
As can be seen from the results in Tables 1-3, SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, The genes having the nucleotide sequences of 69, 70 and 71 showed a three-fold or more increase in the expression in the hippocampus tissue of an early-stage Alzheimer's disease patient compared to the normal hippocampus tissue. Among them, the genes having the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 40, 41, 42, 43, and 44 are more likely to be found in hippocampal tissues of early patients with Alzheimer's disease than normal hippocampal tissues. The expression increased by 4 times or more. In particular, the genes having the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1, 2, and 40 showed a 5-fold or more increase in the expression in the hippocampus tissue of an early-stage Alzheimer's disease patient compared to normal hippocampus tissue.
[0132]
In addition, SEQ ID NOs: 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94 , 95 and 96, showed a three-fold or more increase in expression in hippocampal tissue of late-stage Alzheimer's disease patients compared to normal hippocampal tissue. Among them, the genes having the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 72, 73, 74 and 88 showed a four-fold or more increase in the expression in the hippocampus tissue of the late-stage Alzheimer's disease patient compared to the normal hippocampus tissue. In particular, the gene having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 72 showed a 5-fold or more increase in expression in the hippocampus tissue of a late-stage Alzheimer's disease patient as compared to normal hippocampus tissue.
[0133]
On the other hand, SEQ ID NOs: 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119 , 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, and 135, the genes having Alzheimer's disease compared to normal hippocampal tissues The expression of expression was more than 3-fold lower in hippocampal tissues of early patients. Among them, genes having the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126 and 127 are as follows: Compared to normal hippocampus tissue, the expression decreased more than 4-fold in the hippocampus tissue of patients with early Alzheimer's disease. In particular, the genes having the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 97, 98, 120 and 121 showed a 5-fold or more decrease in the expression in the hippocampus tissue of an early-stage Alzheimer's disease patient compared to the normal hippocampus tissue.
[0134]
Also, SEQ ID NOs: 98, 99, 100, 102, 112, 115, 121, 122, 123, 130, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148 , 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173 , 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198 , 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233,234,235,236,237,238,239,240,241,242,243,244,245,246,247,248,249,250,251,252,253,254,255,256,257, Genes having nucleotide sequences of 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, and 267 have a three-fold or more decrease in expression in hippocampal tissues of late Alzheimer's disease patients compared to normal hippocampal tissues. Indicated. Among them, SEQ ID NOs: 98, 99, 100, 102, 121, 122, 123, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 215 and 216 Genes having nucleotide sequences of 217, 218, 219, 220, 221 and 222 showed a 4-fold or more decrease in expression in hippocampal tissues of late-stage Alzheimer's disease patients compared to normal hippocampal tissues. In particular, the genes having the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 99, 100, 122, 136, 137, 138, 139, 140, 215, 216, 217 and 218 are compared with normal hippocampal tissues in hippocampal tissues of late Alzheimer's disease patients. Showed a 5-fold or more decrease in expression.
[0135]
In addition, the genes having the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 98, 99, 100, 102, 112, 115, 121, 122, 123 and 130 are compared with normal hippocampal tissues in the hippocampus of both early and late Alzheimer's disease patients. Both tissues showed a three-fold or more decrease in expression.
[0136]
As shown above, SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46 , 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71 , 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95 and 96 The gene having the nucleotide sequence of (SEQ ID NOs: 1 to 96) is The expression is increased in hippocampal tissues of patients with Hymer's disease, and SEQ ID NOs: 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 74, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 25 Genes having nucleotide sequences of 7, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, and 267 (SEQ ID NOs: 97 to 267) are compared with normal hippocampus tissues in the hippocampus of Alzheimer's disease patients. These genes were considered to be genes that can be applied as marker genes for Alzheimer's disease because their expression is reduced in tissues. In addition, by using these genes, it is possible to screen candidate therapeutic drugs for alleviating or suppressing Alzheimer's disease.
[0137]
Example 3 Screening of expression inhibitor for gene having base sequence of SEQ ID NOs: 1 to 96
The nerve cells are cultured under the following conditions. After the excised brain tissue is minced, a single cell suspension is prepared by papain treatment and pipetting. This was diluted with an AMEM medium (MEM containing 2% inactivated fetal bovine serum, 5 mM glucose, 24 mM sodium bicarbonate, and 10 mM HEPES (manufactured by Gibco)) and coated with poly-D-lysine (manufactured by Sigma) in 96 wells. (Falcon) at 30,000 cells / well. CO 2 Incubator (5% CO 2 After culturing for 2 hours at 37 ° C.), the medium was replaced with NB27G medium (B27 supplement (manufactured by Gibco), NEUROBASAL Medium containing 0.5 mM glutamine (registered trademark: manufactured by Gibco)), and 2 Incubator (5% CO 2 , 37 ° C) for 4 days. Thereafter, the medium was replaced with a medium containing beta-amyloid at a final concentration of 20 μM, and a test substance-containing solution prepared at a concentration of 100 μM, 10 μM, and 1 μM was added, and the mixture was added at 37 ° C. 2 Incubate at 5% concentration for 2 days. Here, as a control experiment, cells to which no test substance is added are similarly cultured (control). Using the RNA extracted from each of these cultured cells, the expression level of the gene having the base sequence shown in any of SEQ ID NOs: 1 to 96 is examined by the method described in Example 1. A test added to a culture system in which the expression level of a gene having the nucleotide sequence shown in any of SEQ ID NOs: 1 to 96 is reduced by 10%, preferably 30%, particularly preferably 50% or more compared to a control The substance is selected as a candidate compound for alleviating or suppressing (improving, treating) Alzheimer's disease.
[0138]
Example 4 Screening of an expression inducer (expression enhancer) for the gene having the nucleotide sequence of SEQ ID NOs: 97 to 267
The nerve cells are cultured under the following conditions. After the excised brain tissue is minced, a single cell suspension is prepared by papain treatment and pipetting. This was diluted with an AMEM medium (MEM containing 2% inactivated fetal bovine serum, 5 mM glucose, 24 mM sodium bicarbonate, and 10 mM HEPES (manufactured by Gibco)) and coated with poly-D-lysine (manufactured by Sigma) in 96 wells. (Falcon) at 30,000 cells / well. CO 2 Incubator (5% CO 2 After culturing for 2 hours at 37 ° C.), the medium was replaced with NB27G medium (B27 supplement (manufactured by Gibco), NEUROBASAL Medium containing 0.5 mM glutamine (registered trademark: manufactured by Gibco)), and 2 Incubator (5% CO 2 , 37 ° C) for 4 days. Thereafter, the medium was replaced with a medium containing beta-amyloid at a final concentration of 20 μM, and a test substance-containing solution adjusted to a concentration of 100 μM, 10 μM, and 1 μM, respectively, was added. 2 Incubate at 5% concentration for 2 days. Here, as a control experiment, cells to which no test substance is added are similarly cultured (control). Using the RNA extracted from each of these cultured cells, the expression level of the gene having the base sequence shown in any of SEQ ID NOs: 97 to 267 is examined by the method described in Example 1. A test added to a culture system in which the expression level of the gene having the nucleotide sequence shown in any of SEQ ID NOs: 97 to 267 is increased by 10%, preferably 30%, particularly preferably 50% or more compared to the control The substance is selected as a candidate compound for alleviating or suppressing (improving, treating) Alzheimer's disease.
[0139]
【The invention's effect】
According to the present invention, a gene whose expression is specifically increased in the brain of an Alzheimer's disease patient (a gene having the nucleotide sequence of SEQ ID NOS: 1 to 96) and a gene whose expression is specifically decreased (SEQ ID NO: 97 to 267). Such a gene is useful as a marker gene (probe, primer) used for genetic diagnosis of Alzheimer's disease. According to such a marker gene, it is possible to clarify whether or not Alzheimer's disease is present and its cause (improvement in diagnostic accuracy), thereby enabling more appropriate treatment to be performed. That is, the marker gene of the present invention can be used as a tool for appropriate treatment of Alzheimer's disease.
[0140]
Further, from the relationship between the increase / decrease of the expression of the gene and Alzheimer's disease, a substance that suppresses / induces the expression of the gene is considered to be useful as a therapeutic drug for the Alzheimer's disease. Therefore, according to the gene of the present invention, by using the suppression / induction of its expression as an index, it is possible to screen and select a candidate drug that can be a preventive, ameliorating or therapeutic agent for Alzheimer's disease. That is, the present invention also provides a technique for developing a therapeutic agent for Alzheimer's disease and the like.
[0141]
[Sequence list]
Claims (18)
（ａ）被験者の生体試料から調製されたＲＮＡまたはそれから転写された相補的なポリヌクレオチドと、請求項１または請求項２に記載の疾患マーカーとを結合させる工程、
（ｂ）該疾患マーカーに特異的に結合した生体試料由来のＲＮＡまたはそれから転写された相補的なポリヌクレオチドを、上記疾患マーカーを指標として測定する工程、
（ｃ）（ｂ）の測定結果に基づいて、アルツハイマー病の罹患を判断する工程。A method for detecting Alzheimer's disease, comprising the following steps (a), (b) and (c):
(A) binding RNA prepared from a biological sample of a subject or a complementary polynucleotide transcribed therefrom to the disease marker according to claim 1 or 2;
(B) measuring RNA derived from a biological sample specifically bound to the disease marker or a complementary polynucleotide transcribed therefrom, using the disease marker as an index,
(C) a step of determining the presence of Alzheimer's disease based on the measurement result of (b).
（ａ）被験者の生体試料から調製されたＲＮＡまたはそれから転写された相補的なポリヌクレオチドと、請求項１または請求項２に記載の疾患マーカーのうち、配列番号：１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５および９６のいずれかに記載の塩基配列に基づく疾患マーカーとを結合させる工程、
（ｂ）上記疾患マーカーに特異的に結合した生体試料由来のＲＮＡまたはそれから転写された相補的なポリヌクレオチドを、上記疾患マーカーを指標として測定する工程、
（ｃ）（ｂ）で得られる被験者の測定結果が、正常な生体試料について得られる結果に比して疾患マーカーへの結合量が増大していることを指標として、アルツハイマー病の罹患を判断する工程。A method for detecting Alzheimer's disease, comprising the following steps (a), (b) and (c):
(A) RNA prepared from a biological sample of a subject or a complementary polynucleotide transcribed therefrom and the disease marker according to claim 1 or 2, among SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 8 , The step of coupling the disease marker based on the nucleotide sequence of any one of 90,91,92,93,94,95 and 96,
(B) measuring RNA from a biological sample specifically bound to the disease marker or a complementary polynucleotide transcribed therefrom, using the disease marker as an index,
(C) The presence of Alzheimer's disease is determined based on the fact that the measurement result of the subject obtained in (b) is increased in the amount of binding to a disease marker as compared to the result obtained for a normal biological sample. Process.
（ａ）被験者の生体試料から調製されたＲＮＡまたはそれから転写された相補的なポリヌクレオチドと、請求項１または請求項２に記載の疾患マーカーのうち、配列番号：９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６および２６７のいずれかに記載の塩基配列に基づく疾患マーカーとを結合させる工程、
（ｂ）上記疾患マーカーに特異的に結合した生体試料由来のＲＮＡまたはそれから転写された相補的なポリヌクレオチドを、上記疾患マーカーを指標として測定する工程、
（ｃ）（ｂ）で得られる被験者の測定結果が、正常な生体試料について得られる結果に比して疾患マーカーへの結合量が減少していることを指標として、アルツハイマー病の罹患を判断する工程。A method for detecting Alzheimer's disease, comprising the following steps (a), (b) and (c):
(A) RNA prepared from a biological sample of a subject or a complementary polynucleotide transcribed therefrom and the disease marker according to claim 1 or 2, wherein SEQ ID NO: 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 45, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267 Binding a disease marker based on the nucleotide sequence of
(B) measuring RNA from a biological sample specifically bound to the disease marker or a complementary polynucleotide transcribed therefrom, using the disease marker as an index,
(C) Judgment of Alzheimer's disease is based on the fact that the measurement result of the subject obtained in (b) is reduced in the amount of binding to a disease marker as compared with the result obtained for a normal biological sample. Process.
（ａ）被験者の生体試料から調製されたタンパク質と、請求項６または請求項７に記載の疾患マーカーとを結合させる工程、
（ｂ）該疾患マーカーに結合した生体試料由来のタンパク質またはその部分ペプチドを、上記疾患マーカーを指標として測定する工程、
（ｃ）（ｂ）の測定結果に基づいて、アルツハイマー病の罹患を判断する工程。A method for detecting Alzheimer's disease, comprising the following steps (a), (b) and (c):
(A) binding a protein prepared from a subject's biological sample to the disease marker according to claim 6 or 7;
(B) measuring a protein or a partial peptide derived from a biological sample bound to the disease marker using the disease marker as an index,
(C) a step of determining the presence of Alzheimer's disease based on the measurement result of (b).
（ａ）被験者の生体試料から調製されたタンパク質と、請求項６または請求項７に記載の疾患マーカーのうち配列番号：２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４および２７５のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質を認識する抗体を有する疾患マーカーとを結合させる工程、
（ｂ）該疾患マーカーに結合した生体試料由来のタンパク質またはその部分ペプチドを、上記疾患マーカーを指標として測定する工程、
（ｃ）（ｂ）で得られる被験者の測定結果が、正常な生体試料について得られる結果に比して疾患マーカーへの結合量が増大していることを指標として、アルツハイマー病の罹患を判断する工程。A method for detecting Alzheimer's disease, comprising the following steps (a), (b) and (c):
(A) a protein prepared from a biological sample of a subject and any one of SEQ ID NOs: 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274 and 275 among the disease markers according to claim 6 or 7; Binding to a disease marker having an antibody that recognizes a protein having the amino acid sequence described,
(B) measuring a protein or a partial peptide derived from a biological sample bound to the disease marker using the disease marker as an index,
(C) The presence of Alzheimer's disease is determined based on the fact that the measurement result of the subject obtained in (b) is increased in the amount of binding to a disease marker as compared to the result obtained for a normal biological sample. Process.
（ａ）被験者の生体試料から調製されたタンパク質と、請求項６または請求項７に記載の疾患マーカーのうち配列番号：２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２および２９３のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質を認識する抗体を有する疾患マーカーとを結合させる工程、
（ｂ）該疾患マーカーに結合した生体試料由来のタンパク質またはその部分ペプチドを、上記疾患マーカーを指標として測定する工程、
（ｃ）（ｂ）で得られる被験者の測定結果が、正常な生体試料について得られる結果に比して疾患マーカーへの結合量が減少していることを指標として、アルツハイマー病の罹患を判断する工程。A method for detecting Alzheimer's disease, comprising the following steps (a), (b) and (c):
(A) a protein prepared from a biological sample of a subject, and the disease markers according to claim 6 or 7, wherein SEQ ID NOs: 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285; 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, and 293; and binding to a disease marker having an antibody that recognizes a protein having the amino acid sequence of any of
(B) measuring a protein or a partial peptide derived from a biological sample bound to the disease marker using the disease marker as an index,
(C) Judgment of Alzheimer's disease is based on the fact that the measurement result of the subject obtained in (b) is reduced in the amount of binding to a disease marker as compared with the result obtained for a normal biological sample. Process.
（ａ）被験物質と、配列番号：１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６および２６７のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子またはそのホモログを発現可能な細胞とを接触させる工程
（ｂ）被験物質を接触させた細胞の、配列番号：１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６および２６７のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子またはそのホモログの発現量を測定し、該発現量を被験物質を接触させない対照細胞の上記対応する遺伝子の発現量と比較する工程、
（ｃ）（ｂ）の比較結果に基づいて、配列番号：１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６および２６７のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子またはそのホモログの発現量を変動させる被験物質を選択する工程。SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, including the following steps (a), (b) and (c): 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 88, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238,239,240,241,242,243,244,245,246,247,248,249,250,251,252,253,254,255,256,257,258,259,260,261,262, 263, 264, 265, 266 or 267 For screening for a substance that regulates the expression of a gene having
(A) Test substance, SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 91, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266 or a gene having the nucleotide sequence according to any one of 267 or Step (b) of contacting with a cell capable of expressing a homolog (b) SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 10 , 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125 , 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150 , 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175 , 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234,235,236,237,238,239,240,241,242,243,244,245,246,247,248,249,250,251,252,253,254,255,256,257,258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266 and Measuring the expression level of the gene having the nucleotide sequence according to any one of (1) and (267) or a homologue thereof, and comparing the expression level with the expression level of the corresponding gene in a control cell not contacted with the test substance;
(C) SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 89, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266 or 267 A step of selecting a test substance that changes the expression level of the gene or its homolog.
（ａ）被験物質と配列番号：１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５および９６のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子またはそのホモログを発現可能な細胞とを接触させる工程
（ｂ）被験物質を接触させた細胞の、配列番号：１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５および９６のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子またはそのホモログの発現量を測定し、該発現量を被験物質を接触させない対照細胞の上記対応する遺伝子の発現量と比較する工程、
（ｃ）（ｂ）の比較結果に基づいて、配列番号：１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５および９６のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子またはそのホモログの発現量を減少させる被験物質を選択する工程。SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, including the following steps (a), (b) and (c): 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95 and 96, wherein the expression level of the gene having the nucleotide sequence according to any of 91, 92, 93, 94, 95 and 96 is reduced Screening method for a substance which:
(A) Test substance and SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46 , 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71 , 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95 and 96 A gene having the nucleotide sequence according to any of the above or a cell capable of expressing a homolog thereof. Step (b) of contacting the test substance with the cells of SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 , 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42 , 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67 , 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92 , 93, 94, 95 and 96, or a gene having the nucleotide sequence according to any one of Measuring the expression level of homolog, and comparing the expression level of the corresponding gene control cells not the expression level in contact with the test substance,
(C) SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, Genes having the nucleotide sequence according to any one of 93, 94, 95 and 96 or homologs thereof Selecting a test substance that reduces the amount.
（ａ）被験物質と配列番号：９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６および２６７のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子またはそのホモログを発現可能な細胞とを接触させる工程
（ｂ）被験物質を接触させた細胞の、配列番号：９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６および２６７のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子またはそのホモログの発現量を測定し、該発現量を被験物質を接触させない対照細胞の上記対応する遺伝子の発現量と比較する工程、
（ｃ）（ｂ）の比較結果に基づいて、配列番号：９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６および２６７のいずれかに記載の塩基配列を有する遺伝子またはそのホモログの発現量を増大させる被験物質を選択する工程。SEQ ID NOs: 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, including the following steps (a), (b) and (c): 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161; 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 17 , 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199 , 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224 , 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249 , 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257 258,259,260,261,262,263,264,265,266 and 267 either screening method for a substance that increases the expression level of a gene having the nucleotide sequence of the:
(A) Test substance and SEQ ID NO: 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117 , 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142 , 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167 , 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228,229,230,231,232,233,234,235,236,237,238,239,240,241,242,243,244,245,246,247,248,249,250,251,252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 61, 262, 263, 264, 265, 266, and 267. Step (b) of contacting with a cell capable of expressing a gene having the nucleotide sequence according to any of the above or a homolog thereof, the sequence of the cell contacted with the test substance Numbers: 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 2 0, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266 and 267, a step of measuring the expression level of the gene having the nucleotide sequence according to any of the above or a homologue thereof, and comparing the expression level with the expression level of the corresponding gene in a control cell not contacted with the test substance;
(C) Based on the comparison result of (b), SEQ ID NOs: 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 17 , 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200 , 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225 , 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250 , 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258 Selecting a gene or test substance that increases the expression level of the homologues have a nucleotide sequence of any one of 259,260,261,262,263,264,265,266 and 267.
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