JP2004194534A

JP2004194534A - Inflammatory enteropathy marker and its utilization

Info

Publication number: JP2004194534A
Application number: JP2002365079A
Authority: JP
Inventors: Yosuke Nagasaka; 曜介永坂; Kosei Watanabe; 孝正渡辺; Toru Kimura; 徹木村
Original assignee: Sumitomo Pharmaceuticals Co Ltd
Current assignee: Sumitomo Pharmaceuticals Co Ltd
Priority date: 2002-12-17
Filing date: 2002-12-17
Publication date: 2004-07-15

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a disease marker reflecting inflammatory bowel disease (IBD), to provide an IBD-detecting method utilizing the disease marker, and to provide a method for screening a medicine useful for remedying the disease. <P>SOLUTION: This IBD marker comprises a polynucleotide having at least continuous 15 bases in the base sequence of GIPR gene, the base sequence of GCSFR gene or the base sequence of REG Iα gene, and/or a polynucleotide complementary to the above polynucleotide. <P>COPYRIGHT: (C)2004,JPO&NCIPI

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は炎症性腸疾患（inflammatory bowel disease; 以下IBDと略する）の診断に有用な疾患マーカーに関する。より詳細には、本発明は、IBDの診断においてプライマーまたは検出プローブとして有効に利用できる疾患マーカーに関する。また本発明は、かかる疾患マーカーを利用したIBDの検出方法（診断方法）に関する。
【０００２】
さらに本発明は、上記疾患マーカーを利用して、IBDの改善薬または治療薬として有効な物質をスクリーニングする方法、並びに該方法によって得られる上記物質を有効成分とするIBDの改善薬または治療薬に関する。
【０００３】
【従来の技術】
腸は、生体の生命活動に必須である栄養分・水分を消化吸収する器官である。一方で病原体などの異物を排除するための免疫防御機能も備えており相反する性質をバランスよく制御することで生命の維持を担っている器官でもある。しかしこれら機能バランスに異常が生じると、この動的平衡状態が破綻し様々な腸疾患が引き起こされることが知られている。特に近年患者数が増加してきている炎症性腸疾患（inflammatory bowel disease; IBDと略される）は、スルファサラジン等の５−アミノサリチル酸製剤やステロイド等の薬物療法では満足できる治療効果が得られておらず、そのため腸切除手術、白血球除去等で治療している状態であり、よりよい薬物が必要とされている。
【０００４】
IBDは、その病態から潰瘍性大腸炎（ulcerative colitis; UCと略される）とクローン病（Crohn's disease; CDと略される）とに分類されている。近年、抗TNF抗体などのタンパク製剤がクローン病の治療剤として有効であることが知られている。しかしながら高価な薬剤でありステロイド耐性の患者のみの適応であり、また潰瘍性大腸炎に対する効果も弱いことから、未だ満足できる医療状況に無いのが現状である。
さらに、個々の患者によって薬物療法への反応が異なっており、現在用いられている治療薬すべてにおいて薬物療法に反応しないIBD患者が存在している。また、遺伝子多型と疾患感受性の解析からインターロイキン−１の多型やNOD2遺伝子の多型が疾患原因遺伝子と考えられるケースがあり、基礎医学的な研究においても個々の患者による病態発症の遺伝的背景に差異のあることが明らかになりつつある。
【０００５】
最近の医療現場では、IBDに限らず、個々の患者の症状に合わせて治療法を的確に選択することが望まれるようになってきている。高齢化社会でのQOL（Quality of life）向上の必要性が認識されてきた近年では、特に、万人に共通した治療ではなく、個々の患者の症状に合わせて適切な治療が施されることが強く求められている。このような所謂テイラーメイド治療を行うためには、個々の疾患について患者の症状やその原因（遺伝的背景）を的確に反映する疾患マーカーが有用であり、その探索並びに開発を目指した研究が精力的に行われているのが現状である。
一方、GIPR（ガストリック・インヒビトリー・ポリペプチド受容体、別名グルコース依存性インシュリン分泌ポリペプチド受容体）は、４２アミノ酸残基からなるポリペプチド：GIPの受容体であり、GPCRの一種である。該GIPは、胃酸およびガストリンの分泌阻害活性、及びインスリン刺激活性等を有することが知られている（非特許文献１）。
また、GCSFR（顆粒球コロニー刺激因子受容体）は、血液細胞の増殖と分化に関与するコロニー刺激因子：G-CSFの受容体である。該G-CSFは、好中性顆粒球の増殖および分化に重要な役割を担っており、血液中の好中球濃度の制御、並びに成熟好中球の賦活化に関与することが知られている（非特許文献２）。
また、REG 1αは、カルシウム依存性レクチンファミリーに属する蛋白質であり、膵β細胞（RIN）又は膵腺房細胞（ARIP）に対して細胞分裂促進活性を有することが知られている。（非特許文献３）。
【０００６】
【非特許文献１】
安田他、「日本臨床」，第５４巻，第４号，ｐ．１０７８−１０８２
【非特許文献２】
吉村他、「Bio Science用語ライブラリーサイトカイン・増殖因子改訂版」，羊土社，ｐ．６２−６５
【非特許文献３】
Zenilman, M. E.他，「Gastroenterology」１９９６, 第１１０巻，ｐ．１２０８−１２１４
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、IBDの診断及び治療に有用な疾患マーカーを提供することを目的とする。より詳細には、本発明はIBDを特異的に反映した疾患マーカーを提供することを目的とする。さらに本発明は該疾患マーカーを利用したIBDの検出方法（遺伝子診断方法）、該疾患の改善または治療に有用な薬物をスクリーニングする方法、並びに該疾患の改善または治療に有用な薬物を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行っていたところ、従来はIBDとの関連が明らかではなかった以下の遺伝子：GIPR遺伝子、GCSFR遺伝子、およびREG Iα遺伝子が、IBD患者（潰瘍性大腸炎及びクローン病）の結腸病変組織において、結腸正常組織（正常人の結腸組織）と比較して有意に発現上昇していることを見出した。さらにこれらの遺伝子は、IBD病態関連組織である消化管系組織、およびIBDの発症機構に関与する免疫系組織以外の臓器では、ほとんど発現していないことを見出した。
【０００９】
以上のように本発明者らは、消化管が傷害する自己免疫疾患と考えられているIBDにおいて、これらGIPR遺伝子、GCSFR遺伝子、およびREG Iα遺伝子、及びこれらの発現産物（タンパク質）が、優れた疾患マーカーであるとの知見を得た。さらに、これら遺伝子の発現制御、または当該遺伝子によりコードされるタンパク質の発現制御や機能（活性）制御を指標としたスクリーニング系は、ＩＢＤの予防、改善または治療薬の探索に有効であるとの知見を得た。
本発明はかかる知見を基礎にして完成するに至ったものである。
【００１０】
すなわち、本発明は、下記に掲げるものである：
（１） GIPR遺伝子遺伝子の塩基配列、GCSFR遺伝子の塩基配列、およびREG Iα遺伝子の塩基配列において、連続する少なくとも15塩基を有するポリヌクレオチド及び／または該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドからなる、IBDの疾患マーカー、
（２） IBDの検出においてプローブまたはプライマーとして使用される前記（１）記載の疾患マーカー、
（３）下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む、IBDの検出方法：
（ａ）被験者の生体試料から調製されたRNAまたはそれから転写された相補的ポリヌクレオチドと前記（１）または(２)に記載の疾患マーカーとを結合させる工程、
（ｂ）該疾患マーカーに結合した生体試料由来のRNAまたは該RNAから転写された相補的ポリヌクレオチドを、上記疾患マーカーを指標として測定する工程、
（ｃ）上記（ｂ）の測定結果に基づいて、IBDの罹患を判断する工程、
（４）工程（ｃ）におけるIBDの罹患の判断が、被験者について得られる測定結果を正常者について得られる測定結果と対比して、疾患マーカーへの結合量が増大していることを指標として行われる、前記（３）に記載のIBDの検出方法、
（５） GIPR、GCSFR、またはREG Iαを認識する抗体を含有する、IBDの疾患マーカー、
（６） IBDの検出においてプローブとして使用される前記（５）記載の疾患マーカー、
（７）下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含むIBDの検出方法：
（ａ）被験者の生体試料から調製されたタンパク質と前記（５）または(６)に記載の疾患マーカーとを結合させる工程、
（ｂ）該疾患マーカーに結合した生体試料由来のタンパク質を、上記疾患マーカーを指標として測定する工程、
（ｃ）上記（ｂ）の測定結果に基づいて、IBDの罹患を判断する工程、
（８）工程（ｃ）におけるIBDの罹患の判断が、被験者について得られる測定結果を正常者について得られる測定結果と対比して、疾患マーカーへの結合量が増大していることを指標として行われる前記（７）記載のIBDの検出方法、
（９）下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む、GIPR遺伝子、GCSFR遺伝子、およびREG Iα遺伝子のいずれかの発現を制御する物質のスクリーニング方法：
(ａ)被験物質とGIPR遺伝子、GCSFR遺伝子、およびREG Iα遺伝子のいずれかを発現可能な細胞とを接触させる工程、
(ｂ)被験物質を接触させた細胞におけるGIPR遺伝子、GCSFR遺伝子、およびREG Iα遺伝子のいずれかの発現量を測定し、該発現量を被験物質を接触させない対照細胞における上記に対応する遺伝子の発現量と比較する工程、
(ｃ)上記（ｂ）の比較結果に基づいて、GIPR遺伝子、GCSFR遺伝子、およびREG Iα遺伝子のいずれかの発現量を変動させる被験物質を選択する工程、
（１０）下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む、GIPR、GCSFR、およびREG Iαのいずれかの発現を制御する物質のスクリーニング方法：
(ａ)被験物質とGIPR、GCSFR、およびREG Iαのいずれかを発現可能な細胞とを接触させる工程、
(ｂ)被験物質を接触させた細胞における GIPR、GCSFR、およびREG Iαのいずれかの発現量を測定し、該発現量を被験物質を接触させない対照細胞における上記に対応するタンパク質の発現量と比較する工程、
(ｃ)上記（ｂ）の比較結果に基づいて、GIPR、GCSFR、およびREG Iαのいずれかの発現量を変動させる被験物質を選択する工程、
（１１）下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む、GIPR、GCSFR、またはREG Iαの機能または活性を制御する物質のスクリーニング方法：
(ａ)被験物質を GIPR、GCSFR、またはREG Iαに接触させる工程、
(ｂ)上記（ａ）の工程に起因して生じるGIPR、GCSFR、またはREG Iαの機能または活性を測定し、該機能または活性を被験物質を接触させない場合のGIPR、GCSFR、またはREG Iαの機能または活性と比較する工程、
(ｃ)上記（ｂ）の比較結果に基づいて、GIPR、GCSFR、またはREG Iαの機能または活性の変動をもたらす被験物質を選択する工程、
【００１１】
（１２） GIPRの機能または活性が、GIP結合活性であることを特徴とする、（１１）記載のスクリーニング方法、
（１３） GIPRの機能または活性が、GIP存在下における、cAMP分泌促進活性であることを特徴とする、（１１）記載のスクリーニング方法、
（１４） GIPRの機能または活性が、GIP存在下における、インスリン分泌可能な細胞におけるインスリン分泌促進活性であることを特徴とする、（１１）記載のスクリーニング方法、
（１５）細胞が膵臓組織由来細胞であることを特徴とする、（１４）記載のスクリーニング方法、
【００１２】
（１６） GCSFRの機能または活性が、G-CSF結合活性であることを特徴とする（１１）記載のスクリーニング方法、
（１７） GCSFRの機能または活性が、G-CSF存在下における、G-CSF応答性細胞の細胞増殖促進活性であることを特徴とする、（１１）記載のスクリーニング方法、
（１８） G-CSF応答性細胞が、顆粒球、パターソン-G-CSF細胞、またはマウスNFS60細胞であることを特徴とする（１７）記載のスクリーニング方法、
【００１３】
（１９） REG Iαの機能または活性が、Reg Iα応答性細胞の細胞増殖促進活性であることを特徴とする、（１１）記載のスクリーニング方法、
（２０） Reg Iα応答性細胞が、膵β細胞（RIN）または膵腺房細胞（ARIP）であることを特徴とする（１９）記載のスクリーニング方法、
【００１４】
（２１） IBDの改善または治療剤の有効成分を探索するための方法である、前記（９）乃至(２０)のいずれかに記載のスクリーニング方法、
（２２） GIPR遺伝子、GCSFR遺伝子、およびREG Iα遺伝子のいずれかの発現を制御する物質を有効成分とする、IBDの改善または治療剤、
（２３） GIPR遺伝子、GCSFR遺伝子、およびREG Iα遺伝子のいずれかの発現を制御する物質が前記（９）記載のスクリーニング法により得られるものである、前記（２２）記載のIBDの改善または治療剤、
（２４） GIPR、GCSFR、およびREG Iαのいずれかの発現量、機能または活性を制御する物質を有効成分とする、IBDの改善または治療剤、ならびに
（２５） GIPR、GCSFR、およびREG Iαのいずれかの発現量、機能または活性を制御する物質が、前記（１０）乃至(２０)に記載のスクリーニング法により得られるものである、前記（２４）記載のIBDの改善または治療剤。
【００１５】
上記のように、本発明によれば、IBDの疾患マーカー、該疾患の検出系、GIPR遺伝子、GCSFR遺伝子、またはREG Iα遺伝子の発現を制御する物質のスクリーニング系、GIPR、GCSFR、またはREG Iαの発現、機能もしくは活性を制御する物質のスクリーニング系、およびこれらの物質を有効成分とするIBDの改善および治療剤が提供される。
【００１６】
本発明は、前述するように、GIPR遺伝子、GCSFR遺伝子、およびREG Iα遺伝子が、IBD患者（潰瘍性大腸炎及びクローン病）の結腸病変組織において、結腸正常組織（正常者の結腸組織）と比較して有意に発現上昇しており、またこれらの遺伝子は、正常組織においては、IBD病態関連組織である消化管組織、およびIBDの発症機構に関与する免疫系組織以外の臓器では、ほとんど発現していないことを見出したことに基づくものである。従って、これらの遺伝子及びその発現産物〔タンパク質、（ポリ）（オリゴ）ペプチド〕は、IBDの解明、診断、予防及び治療に有効に利用することができ、かかる利用によって医学並びに臨床学上、有用な情報や手段を得ることができる。さらに、個体（生体組織）における、上記遺伝子の発現またはその発現産物の検出、または該遺伝子の変異またはその発現異常の検出は、IBDの解明や診断に有効に利用することができる。
【００１７】
また、これらの遺伝子およびその発現産物並びにそれらからの派生物(例えば、遺伝子断片、抗体など)は、GIPR遺伝子、GCSFR遺伝子、またはREG Iα遺伝子の発現を制御する物質、およびGIPR、GCSFR、またはREG Iαの発現、機能もしくは活性を制御する物質のスクリーニングに有用であり、該スクリーニングによって得られる物質は、IBDの予防、改善および治療薬として有効である。
【００１８】
【発明の実施の形態】
以下、本明細書において、アミノ酸、（ポリ）ペプチド、（ポリ）ヌクレオチドなどの略号による表示は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢの規定〔IUPAC-IUB Communication on Biological Nomenclature, Eur. J. Biochem., 138: 9 (1984)〕、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン」（日本国特許庁編）、および当該分野における慣用記号に従う。
【００１９】
本明細書において「遺伝子」または「DNA」とは、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖といった各１本鎖ＤＮＡを包含する趣旨で用いられる。またその長さによって特に制限されるものではない。従って、本明細書において遺伝子(DNA)とは、特に言及しない限り、ヒトゲノムＤＮＡを含む２本鎖ＤＮＡおよびｃＤＮＡを含む１本鎖ＤＮＡ（正鎖）並びに該正鎖と相補的な配列を有する１本鎖ＤＮＡ（相補鎖）、およびこれらの断片のいずれもが含まれる。また当該「遺伝子」または「DNA」には、特定の塩基配列（配列番号：1,2,及び3）で示される「遺伝子」または「DNA」だけでなく、これらによりコードされるタンパク質と生物学的機能が同等であるタンパク質（例えば同族体（ホモログやスプライスバリアントなど）、変異体及び誘導体）をコードする「遺伝子」または「DNA」が包含される。かかる同族体、変異体または誘導体をコードする「遺伝子」または「DNA」としては、具体的には、後述の(1-1)項に記載のストリンジェントな条件下で、前記の配列番号：1,2,及び3で示されるいずれかの特定塩基配列の相補配列とハイブリダイズする塩基配列を有する「遺伝子」または「ＤＮＡ」を挙げることができる。
【００２０】
例えばヒト由来のタンパク質のホモログをコードする遺伝子としては、当該タンパク質をコードするヒト遺伝子に対応するマウスやラットなど他生物種の遺伝子が例示でき、これらの遺伝子（ホモログ）は、HomoloGene（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/HomoloGene/）により同定することができる。具体的には、特定ヒト塩基配列をBLAST（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877, 1993、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）にかけて一致する（Scoreが最も高く、E-valueが0でかつIdentityが100%を示す）配列のアクセッション番号を取得する。そのアクセッション番号をUniGene（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/）に入力して得られたUniGene Cluster ID（Hs.で示す番号）をHomoloGeneに入力する。結果として得られた他生物種遺伝子とヒト遺伝子との遺伝子ホモログの相関を示したリストから、特定の塩基配列で示されるヒト遺伝子に対応する遺伝子（ホモログ）としてマウスやラットなど他生物種の遺伝子を選抜することができる。
なお、遺伝子またはDNAは、機能領域の別を問うものではなく、例えば発現制御領域、コード領域、エキソン、またはイントロンを含むことができる。
【００２１】
従って本明細書において「GIPR遺伝子」または「GIPRのDNA」といった用語を用いる場合、配列番号で特に指定しない限り、特定塩基配列（配列番号1）で示されるヒトGIPR遺伝子（DNA）や、その同族体、変異体及び誘導体などをコードする遺伝子（DNA）を包含する趣旨で用いられる。具体的には、配列番号:1に記載のGIPR遺伝子（GenBank Accession No. U39231）や、そのマウスホモログ、ラットホモログなどが包含される。
【００２２】
また本明細書において「GCSFR遺伝子」または「GCSFRのDNA」といった用語を用いる場合、配列番号で特に指定しない限り、特定塩基配列（配列番号2）で示されるヒトGCSFR遺伝子（DNA）や、その同族体、変異体及び誘導体などをコードする遺伝子（DNA）を包含する趣旨で用いられる。具体的には、配列番号:2に記載のヒトGCSFR遺伝子（GenBank Accession No. M38025）や、そのマウスホモログ、ラットホモログなどが包含される。
【００２３】
また本明細書において「REG Iα遺伝子」または「REG IαのDNA」といった用語を用いる場合も、配列番号で特に指定しない限り、特定塩基配列（配列番号3）で示されるヒトREG Iα遺伝子（DNA）や、その同族体、変異体及び誘導体などをコードする遺伝子（DNA）を包含する趣旨で用いられる。具体的には、配列番号:3に記載のヒトREG Iα遺伝子（GenBank Accession No. M18963）や、そのマウス・ラットホモログなどが包含される。
【００２４】
本明細書において「ポリヌクレオチド」とは、RNAおよびDNAのいずれをも包含する趣旨で用いられる。なお、上記DNAには、cDNA、ゲノムDNA、及び合成DNAのいずれもが含まれる。また上記ＲＮＡには、total RNA、mRNA、rRNA、及び合成のRNAのいずれもが含まれる。
【００２５】
本明細書において「タンパク質」または「（ポリ）ペプチド」には、特定のアミノ酸配列（配列番号：4,5,または6）で示される「タンパク質」または「（ポリ）ペプチド」だけでなく、これらと生物学的機能が同等であることを限度として、その同族体（ホモログやスプライスバリアント）、変異体、誘導体、成熟体及びアミノ酸修飾体などが包含される。ここでホモログとしては、ヒトのタンパク質に対応するマウスやラットなど他生物種のタンパク質が例示でき、これらはHomoloGene（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/HomoloGene/）により同定された遺伝子の塩基配列から演繹的に同定することができる。また変異体には、天然に存在するアレル変異体、天然に存在しない変異体、及び人為的に欠失、置換、付加および挿入されることによって改変されたアミノ酸配列を有する変異体が包含される。なお、上記変異体としては、変異のないタンパク質または（ポリ）ペプチドと、少なくとも70％、好ましくは80％、より好ましくは95％、さらにより好ましくは97％相同なものを挙げることができる。またアミノ酸修飾体には、天然に存在するアミノ酸修飾体、天然に存在しないアミノ酸修飾体が包含され、具体的にはアミノ酸のリン酸化体が挙げられる。
【００２６】
従って本明細書において「GIPRタンパク質」または単に「GIPR」といった用語を用いる場合、配列番号で特に指定しない限り、特定アミノ酸配列（配列番号4）で示されるヒトGIPRやその同族体、変異体、誘導体、成熟体及びアミノ酸修飾体などを包含する趣旨で用いられる。具体的には、配列番号:4（GenBank Accession No. U39231）に記載のアミノ酸配列を有するヒトGIPRや、そのマウスホモログ、ラットホモログなどが包含される。
【００２７】
また本明細書において「GCSFRタンパク質」または単に「GCSFR」といった用語を用いる場合、配列番号で特に指定しない限り、特定アミノ酸配列（配列番号5）で示されるヒトGCSFRやその同族体、変異体、誘導体、成熟体及びアミノ酸修飾体などを包含する趣旨で用いられる。具体的には、配列番号:5（GenBank Accession No. M38025）に記載のアミノ酸配列を有するヒトGCSFRや、そのマウスホモログ、ラットホモログなどが包含される。
【００２８】
また本明細書において「REG Iαタンパク質」または単に「REG Iα」といった用語を用いる場合も、配列番号で特に指定しない限り、特定アミノ酸配列（配列番号6）で示されるヒトREG Iαやその同族体、変異体、誘導体、成熟体及びアミノ酸修飾体などを包含する趣旨で用いられる。具体的には、配列番号:6（GenBank Accession No. M18963）に記載のアミノ酸配列を有するヒトREG Iαや、そのマウスホモログ、ラットホモログなどが包含される。
【００２９】
本明細書でいう「抗体」には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、またはFabフラグメントやFab発現ライブラリーによって生成されるフラグメントなどのように抗原結合性を有する上記抗体の一部が包含される。
【００３０】
本明細書における「IBD」とはinflammatory bowel diseaseの略であり、日本では炎症性腸疾患と呼ばれる。病態から潰瘍性大腸炎（ulcerative colitis：UCと略される）とクローン病（Crohn's disease:CDと略される）に分類されている。
【００３１】
さらに本明細書において「疾患マーカー」とは、IBDの罹患の有無、罹患の程度若しくは改善の有無や改善の程度を診断するために、またIBDの予防、改善または治療に有用な候補物質をスクリーニングするために、直接または間接的に利用されるものをいう。これには、IBDの罹患に関連して生体内、特に大腸組織において、発現が変動する遺伝子またはタンパク質を特異的に認識し、また結合することのできる（ポリ）（オリゴ）ヌクレオチドまたは抗体が包含される。これらの（ポリ）（オリゴ）ヌクレオチドおよび抗体は、上記性質に基づいて、生体内、組織や細胞内などで発現した上記遺伝子及びタンパク質を検出するためのプローブとして、また（オリゴ）ヌクレオチドは生体内で発現した上記遺伝子を増幅するためのプライマーとして有効に利用することができる。
【００３２】
さらに本明細書において診断対象となる「生体組織」とは、IBDに伴い本発明のGIPR遺伝子、GCSFR遺伝子、またはREG Iα遺伝子が発現上昇する組織を指す。具体的には大腸組織及びその周辺組織などを指す。
【００３３】
以下、これらのGIPR遺伝子、GCSFR遺伝子、およびREG Iα遺伝子（以下これらの遺伝子を併せて本発明遺伝子と称する場合がある）、並びにこれらの発現産物（GIPR、GCSFR、およびREG Iα、以下これらのタンパク質を併せて本発明タンパク質と称する場合がある）、およびそれらの派生物について、具体的な用途を説明する。
【００３４】
（１）IBDの疾患マーカーおよびその応用
(1-1) ポリヌクレオチド
本発明における GIPR遺伝子は、ガストリック・インヒビトリー・ポリペプチド受容体（gastric inhibitory polypeptide receptor）遺伝子、もしくはもしくはグルコース依存的インシュリン分泌ポリペプチド受容体（glucose-dependant insulinotropic polypeptide receptor）遺伝子とも呼ばれる公知遺伝子である。例えばヒト由来のGIPR遺伝子としては、配列番号1に示すポリヌクレオチドが知られており（GenBank Accession No. U39231）、その取得方法についてもUsdin,T.B. ら, Endocrinology, 133, 2861-2870, 1993に記載されるように公知である。
【００３５】
本発明における GCSFR遺伝子は、コロニー刺激因子3受容体（colony-stimulating factor 3 receptor）遺伝子、もしくは顆粒球コロニー刺激因子受容体（granulocyte colony-stimulating factor receptor）遺伝子とも呼ばれる公知の遺伝子である。例えばヒト由来のGCSFR遺伝子としては、配列番号2に示すポリヌクレオチドが知られており（GenBank Accession No. M38025）、その取得方法についてもFukunaga,R. ら, Proc. Natl. Acad. Sci., 87, 8702-8706, 1990に記載されるように公知である。
【００３６】
本発明における REG Iα遺伝子は、再生膵ランゲルハンス島由来１−α（regenerating islet-derived 1-alpha）、パンクリアティックストーンプロテイン（pancreatic stone protein）、もしくは、パンクリアティックスレッドプロテイン（pancreatic thread protein）とも呼ばれる公知の遺伝子である。例えばヒト由来のREG Iα遺伝子としては、配列番号3に示すポリヌクレオチドが知られており（GenBank Accession No. M18963）、その取得方法についてもTerazono,K. ら, J. Biol. Chem., 263, 2111-2114, 1988 に記載されるように公知である。
【００３７】
本発明は、前述するように、IBDに罹患した患者の大腸（結腸）組織において、正常大腸（結腸）組織に比して、GIPR遺伝子、GCSFR遺伝子、およびREG Iα遺伝子が特異的に発現上昇しているという知見を発端に、これらの遺伝子発現の有無や発現の程度を検出することによって上記IBDの罹患の有無や罹患の程度が特異的に検出でき、該疾患の診断を正確に行うことができるという知見に基づくものである。
【００３８】
上記ポリヌクレオチドは、従って、被験者における上記遺伝子の発現の有無またはその程度を検出することによって、該被験者がIBDに罹患しているか否かまたはその罹患の程度を診断することのできるツール（疾患マーカー）として有用である。
また上記ポリヌクレオチドは、後述の(3-1)項に記載するようなIBDの予防、改善または治療に有用な候補物質のスクリーニングにおいて、GIPR遺伝子、GCSFR遺伝子、またはREG Iα遺伝子の発現変動を検出するためのスクリーニングツール（疾患マーカー）としても有用である。
【００３９】
本発明の疾患マーカーは、前記GIPR遺伝子、GCSFR遺伝子、またはREG Iα遺伝子の塩基配列において、連続する少なくとも15塩基を有するポリヌクレオチド及び／またはそれに相補的なポリヌクレオチドからなることを特徴とするものである。
【００４０】
具体的には、本発明の疾患マーカーは、配列番号1に記載のGIPR遺伝子の塩基配列、配列番号2に記載のGCSFR遺伝子の塩基配列、または配列番号3に記載のREGIα遺伝子の塩基配列において、連続する少なくとも15塩基を有するポリヌクレオチド及び／またはそれに相補的なポリヌクレオチドからなるものを挙げることができる。
【００４１】
ここで相補的なポリヌクレオチド（相補鎖、逆鎖）とは、前記GIPR遺伝子、GCSFR遺伝子、またはREG Iα遺伝子の塩基配列からなるポリヌクレオチドの全長配列、または該塩基配列において少なくとも連続した１５塩基長の塩基配列を有するその部分配列（ここでは便宜上、これらを「正鎖」ともいう）に対して、A:TおよびG:Cといった塩基対関係に基づいて、塩基的に相補的な関係にあるポリヌクレオチドを意味するものである。ただし、かかる相補鎖は、対象とする正鎖の塩基配列と完全に相補配列を形成する場合に限らず、対象とする正鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズすることができる程度の相補関係を有するものであってもよい。なお、ここでストリンジェントな条件は、Berger and Kimmel (1987, Guide to Molecular Cloning Techniques Methods in Enzymology, Vol.152, Academic Press, San Diego CA) に教示されるように、複合体或いはプローブを結合する核酸の融解温度(Tm)に基づいて決定することができる。例えばハイブリダイズ後の洗浄条件として、通常「１×SSC、0.1%SDS、37℃」程度の条件を挙げることができる。相補鎖はかかる条件で洗浄しても対象とする正鎖とハイブリダイズ状態を維持するものであることが好ましい。特に制限されないが、より厳しいハイブリダイズ条件として「0.5×SSC、0.1%SDS、42℃」程度、さらに厳しいハイブリダイズ条件として「0.1×SSC、0.1%SDS、65℃」程度の洗浄条件を挙げることができる。具体的には、このような相補鎖として、対象の正鎖の塩基配列と完全に相補的な関係にある塩基配列からなる鎖、並びに該鎖と少なくとも90％、好ましくは95％の相同性を有する塩基配列からなる鎖を例示することができる。
【００４２】
ここで、正鎖側のポリヌクレオチドには、前記GIPR遺伝子、GCSFR遺伝子、またはREG Iα遺伝子の塩基配列、またはその部分配列を有するものだけでなく、上記相補鎖の塩基配列に対してさらに相補的な関係にある塩基配列からなる鎖を含めることができる。
【００４３】
さらに上記正鎖のポリヌクレオチド及び相補鎖（逆鎖）のポリヌクレオチドは、各々一本鎖の形態で疾患マーカーとして使用されても、また二本鎖の形態で疾患マーカーとして使用されてもよい。
【００４４】
本発明のIBDの疾患マーカーは、具体的には、前記GIPR遺伝子、GCSFR遺伝子、またはREG Iα遺伝子の塩基配列（全長配列）からなるポリヌクレオチドであってもよいし、その相補配列からなるポリヌクレオチドであってもよい。またこれら本発明遺伝子もしくは該遺伝子に由来するポリヌクレオチドを選択的に（特異的に）認識するものであれば、上記全長配列またはその相補配列の部分配列からなるポリヌクレオチドであってもよい。この場合、部分配列としては、上記全長配列またはその相補配列の塩基配列から任意に選択される少なくとも15個の連続した塩基長を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。
【００４５】
なお、ここで「選択的に（特異的に）認識する」とは、例えばノーザンブロット法においては、GIPR遺伝子、GCSFR遺伝子、REG Iα遺伝子、またはこれらに由来するポリヌクレオチドが特異的に検出できること、またRT-PCR法においては、GIPR遺伝子、GCSFR遺伝子、REG Iα遺伝子、またはこれらに由来するポリヌクレオチドが特異的に生成されることを意味するが、それに限定されることなく、当業者が上記検出物または生成物がこれらの遺伝子に由来するものであると判断できるものであればよい。
【００４６】
本発明の疾患マーカーは、例えば配列番号1に記載のGIPR遺伝子の塩基配列、配列番号2に記載のGCSFR遺伝子の塩基配列、または配列番号3に記載のREG Iα遺伝子の塩基配列をもとに、例えばprimer 3（ http://www.genome.wi.mit.edu/ cgi-bin/primer/primer3.cgi）あるいはベクターNTI（Infomax社製）を利用して設計することができる。具体的には前記本発明遺伝子の塩基配列を primer 3またはベクターNTIのソフトウエアにかけて得られる、プライマーまたはプローブの候補配列、若しくは少なくとも該配列を一部に含む配列をプライマーまたはプローブとして使用することができる。
【００４７】
本発明の疾患マーカーは、上述するように連続する少なくとも15塩基の長さを有するものであればよいが、具体的にはマーカーの用途に応じて、長さを適宜選択し設定することができる。
【００４８】
(1-2)プローブまたはプライマーとしてのポリヌクレオチド
本発明においてIBDの検出（診断）は、被験者の生体組織、特に大腸組織におけるGIPR遺伝子、GCSFR遺伝子、およびREG Iα遺伝子から選ばれるいずれかの遺伝子の発現の有無または発現レベル（発現量）を評価することによって行われる。この場合、上記本発明の疾患マーカーは、上記遺伝子の発現によって生じたＲＮＡまたはそれに由来するポリヌクレオチドを特異的に認識し増幅するためのプライマーとして、または該ＲＮＡまたはそれに由来するポリヌクレオチドを特異的に検出するためのプローブとして利用することができる。
【００４９】
本発明疾患マーカーをIBDの検出（遺伝子診断）においてプライマーとして用いる場合には、通常15bp〜100bp、好ましくは15bp〜50bp、より好ましくは15bp〜35bpの塩基長を有するものが例示できる。また検出プローブとして用いる場合には、通常15bp〜全配列の塩基数、好ましくは15bp〜1kb、より好ましくは100bp〜1kbの塩基長を有するものが例示できる。
【００５０】
本発明の疾患マーカーは、ノーザンブロット法、RT-PCR法、in situハイブリダーゼーション法などといった、特定遺伝子を特異的に検出する公知の方法において、常法に従ってプライマーまたはプローブとして利用することができる。該利用によってIBDにおけるGIPR遺伝子、GCSFR遺伝子、またはREG Iα遺伝子の発現の有無または発現レベル（発現量）を評価することができる。
測定対象試料としては、使用する検出方法の種類に応じて、被験者の大腸組織の一部をバイオプシ等で採取するか、若しくは腸管洗浄液等から回収し、そこから常法に従って調製したtotal RNAを用いてもよいし、さらに該RNAをもとにして調製される各種のポリヌクレオチドを用いてもよい。
【００５１】
また、生体組織における本発明遺伝子の遺伝子発現レベルは、DNAチップを利用して検出あるいは定量することができる。この場合、本発明の疾患マーカーは当該DNAチップのプローブとして使用することができる（例えば、アフィメトリックス社の Gene Chip Human Genome U95 A,B,C,D,Eの場合、25bpの長さのポリヌクレオチドプローブとして用いられる）。かかるDNAチップを、生体組織から採取したRNAをもとに調製される標識DNAまたはRNAとハイブリダイズさせ、該ハイブリダイズによって形成された上記プローブ（本発明疾患マーカー）と標識DNAまたはRNAとの複合体を、該標識DNAまたはRNAの標識を指標として検出することにより、生体組織中での本発明遺伝子の発現の有無または発現レベル（発現量）が評価できる。
【００５２】
上記DNAチップは、本発明遺伝子のいずれかと結合し得る1種または2種以上の本発明疾患マーカーを含んでいれば良い。複数の疾患マーカーを含むDNAチップの利用によれば、ひとつの生体試料について、同時に複数の遺伝子の発現の有無または発現レベルの評価が可能である。
【００５３】
本発明の疾患マーカーは、IBDの診断、検出（罹患の有無や罹患の程度の診断）に有用である。具体的には、該疾患マーカーを利用したIBDの診断は、被験者の大腸組織と正常者の大腸組織におけるGIPR遺伝子、GCSFR遺伝子、およびREG Iα遺伝子のいずれかの遺伝子の遺伝子発現レベルの違いを判定することによって行うことができる。この場合、遺伝子発現レベルの違いには、発現のある／なしの違いだけでなく、被験者の大腸組織と正常者の大腸組織の両者ともに発現がある場合でも、両者間の発現量の格差が2倍以上、好ましくは3倍以上の場合が含まれる。具体的にはGIPR遺伝子、GCSFR遺伝子、およびREG Iα遺伝子はIBDで発現誘導を示すので、被験者の大腸組織で発現しており、該発現量が正常者の大腸組織の発現量と比べて2倍以上、好ましくは3倍以上多ければ、被験者についてIBDの罹患が疑われる。
【００５４】
（1-3）抗体
本発明は、IBDの疾患マーカーとして、GIPR遺伝子の発現産物（タンパク質）（これを本明細書においては「GIPR」ともいう）、GCSFR遺伝子の発現産物（タンパク質）（これを本明細書においては「GCSFR」ともいう）、またはREG Iα遺伝子の発現産物（タンパク質）（これを本明細書においては「REG Iα」ともいう）、を特異的に認識することのできる抗体を提供する。
【００５５】
ここで、GIPRとしては配列番号1に示されるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質、GCSFRとしては配列番号2に示されるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質、REG Iαとしては配列番号3に示されるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質を挙げることができる。
【００５６】
なお、配列番号1に示されるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質の具体的様態としては配列番号4で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を、配列番号2に示されるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質の具体的様態としては配列番号5で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を、配列番号3に示されるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質の具体的様態としては配列番号6で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を例示することができる。
【００５７】
なお、配列番号4に示すタンパク質はヒト由来のGIPR遺伝子によってコードされる公知のタンパク質であり、その取得方法についても文献（Usdin,T.B. ら, Endocrinology, 133, 2861-2870, 1993）に記載されるように公知である。
【００５８】
また配列番号5に示すタンパク質はヒト由来のGCSFR遺伝子によってコードされる公知のタンパク質であり、その取得方法についても文献（Fukunaga,R. ら, Proc. Natl. Acad. Sci., 87, 8702-8706, 1990）に記載されるように公知である。
【００５９】
また配列番号6に示すタンパク質はヒト由来のREG Iα遺伝子によってコードされる公知のタンパク質であり、その取得方法についても文献（Terazono,K. ら, J. Biol. Chem., 263, 2111-2114, 1988）に記載されるように公知である。
【００６０】
本発明は、前述するように、IBDに罹患した患者の大腸（結腸）組織において、正常な大腸（結腸）組織に比して、GIPR遺伝子、GCSFR遺伝子、およびREG Iα遺伝子が特異的に発現上昇しているという知見を発端に、これらの遺伝子の発現産物（タンパク質）の有無やその発現の程度を検出することによって上記IBDの罹患の有無や罹患の程度が特異的に検出でき、該疾患の診断を正確に行うことができるという発想に基づくものである。
上記抗体は、従って、被験者における上記タンパク質の発現の有無またはその程度を検出することによって、該被験者がIBDに罹患しているか否かまたはその疾患の程度を診断することのできるツール（疾患マーカー）として有用である。
また上記抗体は、後述の(3-2)項に記載するようなIBDの予防、改善または治療に有用な候補物質のスクリーニングにおいて、GIPR、GCSFR、およびREG Iαのいずれかの発現変動を検出するためのスクリーニングツール（疾患マーカー）としても有用である。
【００６１】
本発明の抗体は、その形態に特に制限はなく、GIPR、GCSFR、およびREG Iαのいずれかを免疫抗原とするポリクローナル抗体であっても、またそのモノクローナル抗体であってもよい。さらにこれら本発明タンパク質のアミノ酸配列のうち少なくとも連続する、通常８アミノ酸、好ましくは15アミノ酸、より好ましくは20アミノ酸からなるポリペプチドに対して抗原結合性を有する抗体も、本発明の抗体に含まれる。
【００６２】
これらの抗体の製造方法は、すでに周知であり、本発明の抗体もこれらの常法に従って製造することができる（Current Protocol in Molecular Biology, Chapter 11.12〜11.13(2000)）。具体的には、本発明の抗体がポリクローナル抗体の場合には、常法に従って大腸菌等で発現し精製したGIPR、GCSFR、またはREG Iαを用いて、あるいは常法に従ってこれら本発明タンパク質の部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチドを合成して、家兎等の非ヒト動物に免疫し、該免疫動物の血清から常法に従って得ることが可能である。一方、モノクローナル抗体の場合には、常法に従って大腸菌等で発現し精製したGIPR、GCSFRもしくはREG Iα、またはこれらタンパク質の部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチドをマウス等の非ヒト動物に免疫し、得られた脾臓細胞と骨髄腫細胞とを細胞融合させて調製したハイブリドーマ細胞の中から得ることができる（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley and Sons.
Section 11.4〜11.11）。
【００６３】
抗体の作製に免疫抗原として使用されるGIPR、GCSFR、またはREG Iαは、本発明により提供される遺伝子の配列情報（配列番号1〜3）に基づいて、ＤＮＡクローニング、各プラスミドの構築、宿主へのトランスフェクション、形質転換体の培養および培養物からのタンパク質の回収の操作により得ることができる。これらの操作は、当業者に既知の方法、あるいは文献記載の方法（Molecular Cloning, T.Maniatis et al., CSH Laboratory (1983), DNA Cloning, DM. Glover, IRL PRESS (1985)）などに準じて行うことができる。
【００６４】
具体的には、GIPR、GCSFR、またはREG Iαをコードする遺伝子が所望の宿主細胞中で発現できる組み換えDNA（発現ベクター）を作製し、これを宿主細胞に導入して形質転換し、該形質転換体を培養して、得られる培養物から、目的タンパク質を回収することによって、本発明抗体の製造のための免疫抗原としてのタンパク質を得ることができる。また、これらGIPR、GCSFR、またはREG Iαの部分ペプチドは、本発明により提供されるアミノ酸配列の情報（配列番号4〜6）に従って、一般的な化学合成法（ペプチド合成）によって製造することもできる。
【００６５】
なお、本発明のGIPR、GCSFR、またはREGには、配列番号4,5または6に示す各アミノ酸配列に関わるタンパク質のみならず、その相同物も包含される。該相同物としては、上記配列番号4〜6のいずれかで示されるアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、且つ改変前の元のタンパク質と免疫学的に同等の活性を有するタンパク質を挙げることができる。
【００６６】
ここで同等の免疫学的活性を有するタンパク質としては、適当な動物あるいはその細胞において特定の免疫反応を誘発し、かつGIPR、GCSFR、またはREG Iαに対する抗体と特異的に結合する能力を有するタンパク質を挙げることができる。
【００６７】
なお、タンパク質におけるアミノ酸の変異数や変異部位は、その免疫学的活性が保持される限り制限はない。免疫学的活性を喪失することなくアミノ酸残基が、どのように、何個置換、挿入あるいは欠失されればよいかを決定する指標は、当業者に周知のコンピュータプログラム、例えばDNA Star softwareを用いて見出すことができる。例えば変異数は、典型的には、全アミノ酸の１０％以内であり、好ましくは全アミノ酸の５％以内であり、さらに好ましくは全アミノ酸の１％以内である。また置換されるアミノ酸は、置換後に得られるタンパク質がGIPR、GCSFR、またはREG Iαと同等の免疫学的活性を保持している限り、特に制限されないが、タンパク質の構造保持の観点から、残基の極性、電荷、可溶性、疎水性、親水性並びに両親媒性など、置換前のアミノ酸と似た性質を有するアミノ酸であることが好ましい。例えば、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Met、Phe及びTrpは互いに非極性アミノ酸に分類されるアミノ酸であり、Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn及びGlnは互いに非荷電性アミノ酸に分類されるアミノ酸であり、Asp及びGluは互いに酸性アミノ酸に分類されるアミノ酸であり、またLys、Arg及びHisは互いに塩基性アミノ酸に分類されるアミノ酸である。ゆえに、これらを指標として同群に属するアミノ酸を適宜選択することができる。
【００６８】
本発明抗体は、また、GIPR、GCSFR、またはREG Iαの部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチドを用いて調製されるものであってよい。かかる抗体の製造のために用いられるオリゴ（ポリ）ペプチドは、機能的な生物活性を有することは要しないが、GIPR、GCSFR、またはREG Iαと同様な免疫原特性を有するものであることが望ましい。好ましくはこの免疫原特性を有し、且つGIPR、GCSFR、またはREG Iαのアミノ酸配列において少なくとも連続する８アミノ酸、好ましくは15アミノ酸、より好ましくは20アミノ酸からなるオリゴ（ポリ）ペプチドを例示することができる。
【００６９】
かかるオリゴ（ポリ）ペプチドに対する抗体の製造は、宿主に応じて種々のアジュバントを用いて免疫学的反応を高めることによって行うこともできる。限定はされないが、そのようなアジュバントには、フロイントアジュバント、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル、並びにリゾレシチン、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン及びジニトロフェノールのような表面活性物質、ＢＣＧ（カルメット−ゲラン桿菌）やコリネバクテリウム-パルヴムなどのヒトアジュバントが含まれる。
【００７０】
本発明の抗体は、GIPR、GCSFR、またはREG Iαに特異的に結合する性質を有することから、該抗体を利用することによって、被験者の組織内に発現した上記タンパク質を特異的に検出することができる。すなわち、当該抗体は被験者の組織内におけるGIPR、GCSFR、またはREG Iαのタンパク発現の有無を検出するためのプローブとして有用である。
【００７１】
具体的には、患者の大腸組織の一部をバイオプシ等で採取、もしくは腸管洗浄液等から回収し、そこから常法に従ってタンパク質を調製して、例えばウェスタンブロット法、ELISA法など公知の検出方法において、上記抗体を常法に従ってプローブとして使用することによって、GIPR、GCSFR、またはREG Iαを検出することができる。
【００７２】
IBDの診断に際しては、被験者の大腸組織におけるGIPR、GCSFR、およびREG Iαのいずれか少なくとも一つと正常な大腸組織におけるこれらのタンパク質との量の違いを判定すればよい。この場合、タンパク量の違いには、タンパクのある／なし、あるいはタンパク量の違いが2倍以上、好ましくは3倍以上の場合が含まれる。具体的には、GIPR、GCSFR、およびREG IαはIBDで発現誘導を示すので、被験者の大腸組織で該遺伝子の発現産物（GIPR、GCSFR、REG Iα）が存在しており、該量が正常な大腸組織の発現産物量と比べて2倍以上、好ましくは3倍以上多いことが判定されれば、IBDの罹患が疑われる。
【００７３】
（２）IBDの検出方法（診断方法）
本発明は、前述した本発明疾患マーカーを利用したIBDの検出方法（診断方法）を提供するものである。
【００７４】
具体的には、本発明の検出方法（診断方法）は、被験者の大腸組織の一部をバイオプシ等で採取するか、もしくは腸管洗浄液等から回収し、そこに含まれるIBDに関連するGIPR遺伝子、GCSFR遺伝子、およびREG Iα遺伝子のいずれかの遺伝子発現レベル、ならびにこれらの遺伝子に由来するタンパク質（GIPR、GCSFR、REG Iα）の量(レベル)を検出し、その発現量またはそのタンパク質量を測定することにより、IBDの罹患の有無またはその程度を診断するものである。また本発明の検出（診断）方法は、例えばIBD患者において、該疾患の改善のために治療薬を投与した場合における、該疾患の改善の有無またはその程度を検出（診断）することもできる。
【００７５】
本発明の検出方法は次の(a)、(b)及び(c)の工程を含むものである：
(a) 被験者の生体試料と本発明の疾患マーカーを接触させる工程、
(b) 生体試料中のGIPR遺伝子、GCSFR遺伝子、およびREG Iα遺伝子のいずれかの遺伝子発現レベル、またはGIPR、GCSFR、およびREG Iαのいずれかのタンパク質量を、上記疾患マーカーを指標として測定する工程、
(c) (b)の結果をもとに、IBDの罹患を判断する工程。
【００７６】
ここで用いられる生体試料としては、被験者の生体組織（大腸組織及びその周辺組織など）から調製される試料を挙げることができる。具体的には、該組織から調製されるRNA含有試料、若しくはそれからさらに調製されるポリヌクレオチドを含む試料、または上記組織から調製されるタンパク質を含む試料を挙げることができる。かかるRNA、ポリヌクレオチドまたはタンパク質を含む試料は、被験者の大腸組織の一部をバイオプシ等で採取するか、もしくは腸管洗浄液等から回収し、そこから常法に従って調製することができる。
本発明の診断方法は、測定対象として用いる生体試料の種類に応じて、具体的には下記のようにして実施される。
【００７７】
(2-1) 測定対象の生体試料としてRNAを利用する場合
測定対象物としてRNAを利用する場合、IBDの検出は、具体的に下記の工程(a)、(b)及び(c)を含む方法によって実施することができる：
(a)被験者の生体試料から調製されたRNAまたはそれから転写された相補的ポリヌクレオチドと、前記本発明の疾患マーカー（GIPR遺伝子、GCSFR遺伝子、またはREG Iα遺伝子の塩基配列において連続する少なくとも15塩基を有するポリヌクレオチド及び/又は該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド）とを結合させる工程、
(b)該疾患マーカーに結合した生体試料由来のRNAまたは該RNAから転写された相補的ポリヌクレオチドを、上記疾患マーカーを指標として測定する工程、
(c)上記(b)の測定結果に基づいて、IBDの罹患を判断する工程。
【００７８】
測定対象物としてRNAを利用する場合は、本発明の検出方法（診断方法）は、該RNA中のGIPR遺伝子、GCSFR遺伝子、およびREG Iα遺伝子のいずれかの発現レベルを検出し、測定することによって実施される。具体的には、前述のポリヌクレオチドからなる本発明の疾患マーカー（GIPR遺伝子、GCSFR遺伝子、またはREGIα遺伝子の塩基配列において連続する少なくとも15塩基を有するポリヌクレオチド及び／又はその相補的なポリヌクレオチド）をプライマーまたはプローブとして用いて、ノーザンブロット法、ＲＴ-ＰＣＲ法、ＤＮＡチップ解析法、in situハイブリダイゼーション解析法などの公知の方法を行うことにより実施できる。
【００７９】
ノーザンブロット法を利用する場合は、本発明の上記疾患マーカーをプローブとして用いることによって、RNA中のGIPR遺伝子、GCSFR遺伝子、およびREG Iα遺伝子のいずれかの発現の有無やその発現レベルを検出、測定することができる。具体的には、本発明の疾患マーカー（相補鎖）を放射性同位元素（³²P、³³Pなど：RI）や蛍光物質などで標識し、それを、常法に従ってナイロンメンブレン等にトランスファーした被験者の生体組織由来のRNAとハイブリダイズさせた後、形成された疾患マーカー（DNA）とRNAとの二重鎖を、疾患マーカーの標識物（RI若しくは蛍光物質）に由来するシグナルを放射線検出器（BAS-1800II、富士フィルム社製）または蛍光検出器で検出、測定する方法を例示することができる。また、AlkPhos Direct Labelling and Detection System (Amersham Pharmacia Biotech社製)を用いて、該プロトコールに従って疾患マーカー（プローブDNA）を標識し、被験者の生体組織由来のRNAとハイブリダイズさせた後、疾患マーカーの標識物に由来するシグナルをマルチバイオイメージャーSTORM860（Amersham Pharmacia Biotech社製）で検出、測定する方法を使用することもできる。
【００８０】
RT-PCR法を利用する場合は、本発明の上記疾患マーカーをプライマーとして用いることによって、RNA中のGIPR遺伝子、GCSFR遺伝子、およびREG Iα遺伝子のいずれかの発現の有無や発現レベルを検出、測定することができる。具体的には、被験者の生体組織由来のRNAから常法に従ってcDNAを調製して、これを鋳型として標的のGIPR遺伝子、GCSFR遺伝子、またはREG Iα遺伝子の領域が増幅できるように、本発明の疾患マーカーから調製した一対のプライマー（上記ｃＤＮＡ（−鎖）に結合する正鎖、＋鎖に結合する逆鎖）をこれとハイブリダイズさせて、常法に従ってＰＣＲ法を行い、得られた増幅二本鎖ＤＮＡを検出する方法を例示することができる。なお、増幅された二本鎖ＤＮＡの検出は、上記ＰＣＲを予めRIや蛍光物質で標識しておいたプライマーを用いて行うことによって産生される標識二本鎖ＤＮＡを検出する方法、産生された二本鎖ＤＮＡを常法に従ってナイロンメンブレン等にトランスファーさせて、標識した疾患マーカーをプローブとして使用してこれとハイブリダイズさせて検出する方法などを用いることができる。なお、生成された標識二本鎖ＤＮＡ産物はアジレント2100バイオアナライザ（横河アナリティカルシステムズ社製）などで測定することができる。また、SYBR Green RT-PCR Reagents (Applied Biosystems 社製)で該プロトコールに従ってRT-PCR反応液を調製し、ABI PRISM 7700 Sequence Detection System (Applied Biosystems 社製)で反応させて、該反応物を検出することもできる。
【００８１】
ＤＮＡチップ解析を利用する場合は、本発明の上記疾患マーカーをＤＮＡプローブ（１本鎖または２本鎖）として貼り付けたＤＮＡチップを用意し、これに被験者の生体組織由来のRNAから常法によって調製されたcRNAとハイブリダイズさせて、形成されたDNAとcRNAとの二本鎖を、本発明の疾患マーカーから調製される標識プローブと結合させて検出する方法を挙げることができる。また、上記DNAチップとして、GIPR遺伝子、GCSFR遺伝子、およびREG Iα遺伝子のいずれかの遺伝子発現レベルの検出、測定が可能なＤＮＡチップを用いることもできる。かかる遺伝子の発現レベルを検出、測定することができるＤＮＡチップとしては、Affymetrix社のGene Chip Human Genome U95 A, B,C, D, Eを挙げることができる。かかるＤＮＡチップを用いた、被験者RNA中のGIPR遺伝子、GCSFR遺伝子、およびREG Iα遺伝子のいずれかの遺伝子発現レベルの検出、測定については、実施例において詳細に説明する。
【００８２】
(2-2) 測定対象の生体試料としてタンパク質を用いる場合
測定対象物としてタンパク質を用いる場合は、本発明のIBDの検出方法（診断方法）は、生体試料中のGIPR、GCSFR、およびREG Iαのいずれかを検出し、その量を測定することによって実施される。具体的には下記の工程(a)、(b)及び(c)を含む方法によって実施することができる：
(a)被験者の生体試料から調製されたタンパク質と抗体に関する本発明の疾患マーカー（GIPR、GCSFR、またはREG Iαを認識する抗体）とを結合させる工程、
(b)該疾患マーカーに結合した生体試料由来のタンパク質を、上記疾患マーカーを指標として測定する工程、
(c)上記(b)の測定結果に基づいて、IBDの罹患を判断する工程。
【００８３】
より具体的には、本発明の疾患マーカーとして抗体（GIPR、GCSFR、またはREGIαを認識する抗体）を用いて、ウエスタンブロット法などの公知方法で、GIPR、GCSFR、およびREG Iαのいずれかを検出、定量する方法を挙げることができる。
【００８４】
ウエスタンブロット法は、一次抗体として本発明疾患マーカーを用いた後、二次抗体として¹²⁵Ｉなどの放射性同位元素、蛍光物質、ホースラディッシュペルオキシターゼ（HRP）などの酵素等で標識した標識抗体（一次抗体に結合する抗体）を用い、得られる標識化合物の放射性同位元素、蛍光物質などに由来するシグナルを放射線測定器（BAS-1800II：富士フィルム社製など）、蛍光検出器などで検出し、測定することによって実施できる。また、一次抗体として本発明疾患マーカーを用いた後、ECL Plus Western Blotting Detction System (アマシャムファルマシアバイオテク社製)を用いて、該プロトコールに従って検出し、マルチバイオイメージャーSTORM860(アマシャムファルマシアバイオテク社製)で測定することもできる。
【００８５】
なお、上記において測定対象とするGIPR、GCSFR、およびREG Iαの機能または活性は、既に知られており、該タンパク質の量と機能乃至活性とは一定の相関関係を有している。従って、上記タンパク質の量の測定に代えて、該タンパク質の機能または活性の測定を行うことによっても、本発明のIBDの検出（診断）を実施することができる。すなわち本発明は、GIPR、GCSFR、またはREG Iαの公知の機能または活性を指標として、これを公知の方法（具体的には後述の(3-3)項を参照）に従って測定、評価することからなる、IBDの検出（診断）方法をも包含する。
【００８６】
(2-3)IBDの診断
IBDの診断は、例えば、被験者の大腸組織におけるGIPR遺伝子、GCSFR遺伝子、およびREG Iα遺伝子のいずれかの遺伝子発現レベル、もしくはこれらの遺伝子の発現産物であるタンパク質（GIPR、GCSFR、REG Iα）の量、機能若しくは活性（以下これらを合わせて「タンパク質レベル」ということがある）を、正常な大腸組織における当該遺伝子発現レベルまたは当該タンパク質レベルと比較し、両者の違いを判定することによって行うことができる。
【００８７】
この場合、正常な大腸組織から採取調製した生体試料（RNAまたはタンパク質を含む試料）が必要であるが、これらはIBDに罹患していない人の大腸組織をバイオプシ等で採取するか、もしくは腸管洗浄液等から回収することによって取得することができる。なお、ここでいう「IBDに罹患していない人」とは、少なくともIBDの自覚症状がなく、好ましくは他の検査方法、例えば内視鏡検査や、注腸X腺検査、消化管の生検などの結果、IBDでないと診断された人をいう。なお、当該「IBDに罹患していない人」を以下、本明細書では単に正常者という場合もある。
【００８８】
被験者の大腸組織と正常な大腸組織（IBDに罹患していない人の大腸組織）との遺伝子発現レベルまたはタンパク質の量（レベル）の比較は、被験者の生体試料と正常者の生体試料を対象とした測定を並行して行うことで実施できる。並行して行わない場合は、複数（少なくとも２つ、好ましくは３以上、より好ましくは５以上）の正常な大腸組織を用いて均一な測定条件で測定して得られたGIPR遺伝子、GCSFR遺伝子、およびREG Iα遺伝子のいずれかの遺伝子発現レベル、若しくはこれらの遺伝子の発現産物であるタンパク質（GIPR、GCSFR、REG Iα）の量（レベル）の平均値または統計的中間値を、正常者の遺伝子発現レベル若しくはタンパク質の量として、比較に用いることができる。
【００８９】
被験者が、IBDであるかどうかの判断は、該被験者の大腸組織におけるGIPR遺伝子、GCSFR遺伝子、およびREG Iα遺伝子のいずれかの遺伝子発現レベル、またはその発現産物であるタンパク質（GIPR、GCSFR、REG Iα）の量（レベル）が、正常者のそれらのレベルと比較して２倍以上、好ましくは３倍以上多いことを指標として行うことができる。また、被験者の上記遺伝子発現レベルまたはタンパク質レベルが、いかなる正常者のそれらのレベルに比べて多ければ、該被験者はIBDであると判断できるか、該疾患の罹患が疑われる。
【００９０】
（３）候補薬のスクリーニング方法
(3-1) 遺伝子発現レベルを指標とするスクリーニング方法
本発明は、GIPR遺伝子、GCSFR遺伝子、およびREG Iα遺伝子のいずれかの発現を制御する物質のスクリーニング方法を提供する。
【００９１】
本発明のスクリーニング方法は次の工程(a)、(b)及び(c)を含む：
(a)被験物質とGIPR遺伝子、GCSFR遺伝子、およびREG Iα遺伝子のいずれかを発現可能な細胞とを接触させる工程、
(b)被験物質を接触させた細胞におけるGIPR遺伝子、GCSFR遺伝子、およびREG Iα遺伝子のいずれかの発現量を測定し、該発現量を被験物質を接触させない対照細胞における上記に対応する遺伝子の発現量と比較する工程、
(c)上記(b)の比較結果に基づいて、GIPR遺伝子、GCSFR遺伝子、およびREG Iα遺伝子のいずれかの発現量を変動させる被験物質を選択する工程。
【００９２】
かかるスクリーニングに用いられる細胞としては、内在性および外来性を問わず、GIPR遺伝子、GCSFR遺伝子、およびREG Iα遺伝子のいずれかを発現する培養細胞全般を挙げることができる。培養細胞においてこれら本発明遺伝子が発現しているか否かは、公知のノーザンブロット法やRT-PCR法にてこれらの遺伝子発現を検出することにより、容易に確認することができる。
【００９３】
当該スクリーニングに用いられる細胞の具体例としては、例えば以下の(1)〜(3)：
(1) IBDの動物モデルより単離、調製した腸管組織やリンパ系組織由来の細胞、
(2) 種々の刺激剤で処理又は未処理の腸管組織やリンパ系組織由来の細胞、
(3) 本発明遺伝子のいずれかを導入した細胞、
等を挙げることができる。
【００９４】
ここで前記(1)の動物モデルとしては、IBDの動物モデルとして周知である如何なる動物モデルをも用いることができ、具体的には、(1)自然発症IBDモデル（C3H/HeJBirマウス、Cotton top tamarins等）、(2)化学物質誘発モデル（ジニトロクロロベンゼン誘発モデル（ラット）、酢酸モデル（ラット）、トリニトロスルホン酸誘発モデル(マウス、ラット、ウサギ)、デキストラン硫酸誘発モデル(マウス、ラット、ハムスター)、カラゲナン誘発モデル（ラット、モルモット）、インドメタシン誘発モデル（ラット）等）、(3)トランスジェニック、ミュータント（IL-2ノックアウトマウス、IL-10ノックアウトマウス、TCRノックアウトマウス等）、または(4)移入モデル（CD45RBhi移入SCIDマウス等）を挙げることができる。
また前記(1)の腸管組織由来の細胞としては、好ましくは大腸（結腸）由来の初代培養細胞が挙げられる。
【００９５】
前記(2)の腸管組織由来の細胞としては、好ましくは大腸（結腸）由来の株化細胞が挙げられ、具体的には Caco-2細胞（ヒト結腸腺癌由来、ATTC株番号HTB-37）、HT-29細胞（ヒト結腸腺癌由来、ATTC株番号HTB-38）またはCOLO 205 細胞（ヒト結腸腺癌由来、ATTC株番号CCL-222）等を挙げることができる。また前記（2）のリンパ系組織由来の細胞としては、好ましくはリンパ球、単球、マクロファージ、好中球または好酸球が挙げられる。また株化細胞としてRAW 264.7細胞（マウス単球由来、ATTC株番号TIB-71）、U-937細胞（ヒト組織球性リンパ腫由来、ATTC株番号CRL-1593.2）、THP-1細胞（ヒト単球由来、ATTC株番号TIB-202）またはJurkat細胞（ヒトT細胞リンパ腫由来、ATTC株番号TIB-152）等を挙げることができる。
前記(2)において刺激剤とは、リポポリサッカライド（Lipopolysaccharide :LPS）、ホルボールエステル（PMA等）、カルシウムイオノフォア、サイトカイン（IL-1、IL−6、IL-12、IL-18、TNFα、IFNγ等）等を挙げることができる。これら刺激剤で刺激することにより、細胞は炎症部位の環境により近い活性化状態になることが知られている。
【００９６】
前記(3)の遺伝子導入細胞としては、前記(1)及び(2)に挙げた細胞の他、通常遺伝子導入に用いられる宿主細胞、すなわちCOP、L、C127、Sp2/0、NS-1、NIH3T3、ST2等のマウス由来細胞、ラット由来細胞、BHK、CHO等のハムスター由来細胞、COS1、COS3、COS7、CV1、Vero等のサル由来細胞、HeLa、293等のヒト由来細胞、およびSf9、Sf21、High Five等の昆虫由来細胞などが例示される。
さらに、本発明のスクリーニング方法に用いられる細胞には、細胞の集合体である組織なども含まれる。
本発明スクリーニングに用いられる細胞として、より具体的には、例えば結腸由来細胞であるCaco-2細胞、HT-29細胞またはCOLO 205 細胞等の細胞が挙げられる。
【００９７】
本発明スクリーニング方法によってスクリーニングされる被験物質（候補物質）は、制限されないが、核酸（本発明遺伝子のアンチセンスヌクレオチドを含む）、ペプチド、タンパク質、有機化合物、無機化合物などであり、本発明スクリーニングは、具体的にはこれらの被験物質またはこれらを含む試料（被験試料）を上記細胞および／または組織と接触させることにより行われる。かかる被験試料としては、被験物質を含む細胞抽出液、遺伝子ライブラリーの発現産物、合成低分子化合物、合成ペプチド、天然化合物などが挙げられるが、これらに制限されない。
【００９８】
また本発明スクリーニングに際して、被験物質と細胞とを接触させる条件は、特に制限されないが、該細胞が死滅せず且つ本発明遺伝子を発現できる培養条件（温度、ｐＨ、培地組成など）を選択するのが好ましい。
【００９９】
実施例に示すように、IBDに罹患した患者の大腸（結腸）組織では、正常な大腸（結腸）組織に比して、特異的にGIPR遺伝子、GCSFR遺伝子、およびREG Iα遺伝子が発現上昇している。この知見から、これら本発明遺伝子の発現亢進はIBDと関連していると考えられる。よって本発明のスクリーニング方法には、GIPR遺伝子、GCSFR遺伝子、およびREG Iα遺伝子のいずれかの発現レベルを指標として、その発現を制御する物質を探索する方法が包含される。このスクリーニング方法によって、IBDの緩和／抑制作用を有する（IBDに対して改善／治療効果を発揮する）候補物質を提供することができる。すなわち本発明のスクリーニング方法は、GIPR遺伝子、GCSFR遺伝子、およびREG Iα遺伝子のいずれかの発現を制御する物質を探索することによって、IBDの改善薬または治療薬の有効成分となる候補物質を提供するものである。
【０１００】
候補物質の選別は、具体的にはGIPR遺伝子、GCSFR遺伝子、およびREG Iα遺伝子のいずれかが発現している細胞を用いる場合は、被験物質（候補物質）を添加した上記（1)〜(3)のいずれかの細胞における前記本発明遺伝子の発現レベルが、被験物質（候補物質）を添加しない細胞のそのレベルに比して低くなること／高くなることをもって、行うことができる。また、これらGIPR遺伝子、GCSFR遺伝子、およびREG Iα遺伝子のいずれかの発現に発現誘導物質を必要とする細胞を用いる場合は、発現誘導物質［例えばリポポリサッカライド（Lipopolysaccharide:LPS）、ホルボールエステル（PMA等）、カルシウムイオノフォア、サイトカイン（IL-1、IL−6、IL-12、IL-18、TNFα、IFNγ等）等］を刺激剤として用いることによって誘導される発現が被験物質の存在によって制御されること、すなわち発現誘導物質の存在下で被験物質を接触させた細胞の遺伝子発現が、発現誘導物質存在下で被験物質を接触させなかった対照細胞（正のコントロール）に比して低くなること／高くなることを指標として、当該被験物質を候補物質として選別することができる。
【０１０１】
上記いずれかの遺伝子の発現を制御する物質のうち、発現を抑制（発現レベルの減少、発現誘導の抑制）するように制御する物質の探索は、具体的には被験物質を添加した細胞のGIPR遺伝子、GCSFR遺伝子、またはREG Iα遺伝子の発現レベルが、被験物質を添加しない細胞のそのレベルに比して低くなることを指標にして行うことができる。また、これらGIPR遺伝子、GCSFR遺伝子、およびREG Iα遺伝子のいずれかの発現に発現誘導物質を必要とする細胞を用いる場合は、発現誘導物質の存在下で被験物質を接触させた細胞の遺伝子発現が、発現誘導物質存在下で被験物質を接触させなかった対照細胞（正のコントロール）に比して低くなることを指標として、当該被験物質を候補物質として選別することができる。
【０１０２】
また、上記いずれかの遺伝子の発現を制御する物質のうち、発現を上昇（発現レベルの増加、発現誘導の亢進）するように制御する物質の探索は、具体的には被験物質を添加した細胞のGIPR遺伝子、GCSFR遺伝子、またはREG Iα遺伝子の発現レベルが、被験物質を添加しない細胞のそのレベルに比して高くなることをもって、行うことができる。また、これらGIPR遺伝子、GCSFR遺伝子、およびREG Iα遺伝子のいずれかの発現に発現誘導物質を必要とする細胞を用いる場合は、発現誘導物質の存在下で被験物質を接触させた細胞の遺伝子発現が、発現誘導物質存在下で被験物質を接触させなかった対照細胞（正のコントロール）に比して高くなることを指標として、当該被験物質を候補物質として選別することができる。
【０１０３】
また、本発明のスクリーニング方法を実施する前に、上記に掲げる本発明の各遺伝子について、あらかじめ下記に説明する実験をすることにより、該遺伝子の発現を抑制する物質が、IBDの緩和／抑制作用を有するIBDの改善薬または治療薬の有効成分（候補物質）として有用なのか、また発現を誘導する物質がIBDの改善薬または治療薬の有効成分（候補物質）として有用なのかを判断することができる。各々の遺伝子について、その発現を抑制する物質が候補物質として有用と判断された場合は、該遺伝子についての上記スクリーニング方法は、その発現の抑制を指標として実施することができ、逆にその発現を誘導する物質が候補物質として有用と判断された場合は、該遺伝子についての上記スクリーニング方法は、その発現の誘導を指標として実施することができる。
【０１０４】
かかる実験としては、例えば、IBDモデル各種に本発明遺伝子を遺伝子発現導入（組換えアデノウイルス、レトロウイルス等のウイルスベクター、HVJリポソーム、ｃDNA直接注射法、遺伝子銃）、遺伝子機能阻害（ドミナントネガティブ法、ノックアウト法、アンチセンス法、リボザイム法、RNAi、DNA-RNAキメラ法、CALI法）し、便状態の悪化、腸組織病理標本の観察、腸の短縮等を指標にターゲット遺伝子の誘導剤が有効なのか阻害剤が有効なのかを決定する方法を挙げることができる。具体的には、下記の実験において病態の改善が観察される場合は、本発明遺伝子の発現抑制物質を選別することによって、より高い精度でIBDの改善薬または治療薬の候補物質を取得することが可能となる。
すなわち、本発明遺伝子の配列の一部（約19ベース）を用い、センス側、アンチセンス側のそれぞれの配列の下流に4ベースのポリT（チミジン）塩基を付加し、EBVを基にした真核細胞発現エピソームベクターであるpCEP4（Invitrogen社）に連結し、siRNA発現ベクターを作製する。キトサン1000（和光純薬工業、800〜1500 cps）をpH 5.7の25 mM 酢酸-酢酸Na緩衝液に55℃にて溶解し、0.02％キトサン溶液を作製する。作製したsiRNA発現ベクター50 ug/ml溶液（50 mM 酢酸Na溶液）を等量添加し、ボルテックスミキサーにて攪拌する。生じたキトサン／DNA複合体を凍結乾燥した後、5%の無水酢酸を含むエタノール溶液に10分間浸しアセチル化する。0.1%NaOH水溶液にて中和した後、水洗し乾燥させる。0.5％メチルセルロース溶液にプラスミドDNA 50ugに相当するアセチル化-キトサン／DNA複合体を懸濁し、モデル動物（4日前にTNBSを感作させたSJL/Jマウス）へ強制経口投与を行う。1日1回の投与を2日間行い、3日目にTNBSを注腸し、続いて起こる病態の発症を観察する。
本発明遺伝子のsiRNAにより当該病態のスコアの平均が30%以上改善される場合は、その遺伝子発現抑制物質が治療薬になる可能性が高いと考えられる。
また下記の実験において病態の改善が観察される場合は、その遺伝子発現誘導（亢進）物質を選別することによって、より高い精度でIBDの改善薬または治療薬の候補物質を取得することが可能となる。すなわち、哺乳動物細胞発現ベクター（上記pCEP4等）を用い、本発明遺伝子の発現ベクターを作製し、病態モデル動物に導入する。なお、導入は上記の方法と同様に行うことができる。本発明遺伝子の導入により当該病態のスコアの平均が30%以上改善される場合は、その遺伝子発現誘導（亢進）物質が治療薬になる可能性が高いと考えられる。
【０１０５】
このような本発明のスクリーニング方法における遺伝子発現レベルの検出及び定量は、前記細胞から調製したRNAまたは該RNAから転写された相補的ポリヌクレオチドと本発明の疾患マーカーとを用いて、前記(2-1)項に記述したように、ノーザンブロット法、RT-PCR法など公知の方法、あるいはDNAチップを利用する方法に従って実施できる。指標とする遺伝子発現レベルの変動（抑制、促進、減少、増加）の程度は、被験物質（候補物質）を接触させた細胞におけるGIPR遺伝子、GCSFR遺伝子、およびREG Iα遺伝子のいずれかの発現が、被験物質（候補物質）を接触させない対照細胞における発現量と比較して10%、好ましくは30%、特に好ましくは50%以上の変動（抑制、促進、減少、増加）を例示することができる。
【０１０６】
またGIPR遺伝子、GCSFR遺伝子、およびREG Iα遺伝子のいずれかの発現レベルの検出及び定量は、これら本発明遺伝子の発現を制御する遺伝子領域（発現制御領域）に、例えばルシフェラーゼ遺伝子などのマーカー遺伝子をつないだ融合遺伝子を導入した細胞株を用いて、マーカー遺伝子由来のタンパク質の活性を測定することによっても実施できる。本発明のGIPR遺伝子、GCSFR遺伝子、およびREGIα遺伝子のいずれかの発現制御物質のスクリーニング方法には、かかるマーカー遺伝子の発現量を指標として標的物質を探索する方法も包含されるものであり、この意味において、請求項９に記載する「GIPR遺伝子、GCSFR遺伝子、REG Iα遺伝子」の概念には、これら本発明遺伝子の発現制御領域とマーカー遺伝子との融合遺伝子が含まれる。
【０１０７】
なお、上記マーカー遺伝子としては、発光反応や呈色反応を触媒する酵素の構造遺伝子が好ましい。具体的には、上記のルシフェラーゼ遺伝子のほか、分泌型アルカリフォスファターゼ遺伝子、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ遺伝子、βグルクロニダーゼ遺伝子、βガラクトシダーゼ遺伝子、及びエクオリン遺伝子などのレポーター遺伝子が例示できる。
また、ここで前記本発明遺伝子の発現制御領域は、例えば該遺伝子の転写開始部位上流約１kb、好ましくは約2kbを用いることができる。
【０１０８】
本発明遺伝子の発現制御領域は、例えば(i)5'-RACE法（例えば、5'full Race Core Kit(宝酒造社製)等を用いて実施される）、オリゴキャップ法、S1プライマーマッピング等の通常の方法により、5'末端を決定するステップ；(ii)Genome Walker Kit(クローンテック社製)等を用いて5'-上流領域を取得し、得られた上流領域について、プロモーター活性を測定するステップ；を含む手法等により同定することができる。また融合遺伝子の作成、およびマーカー遺伝子由来の活性測定は公知の方法で行うことができる。
【０１０９】
本発明のスクリーニング方法により選別される物質は、GIPR遺伝子、GCSFR遺伝子、およびREG Iα遺伝子の少なくとも一種の遺伝子の遺伝子発現制御剤として位置づけることができる。これらの物質が有する本発明遺伝子に対する発現制御作用は、大腸組織障害の発症に深く関わっているものと考えられる。よってこれらの物質は、IBDを緩和、抑制（改善、治療）する薬物の有力な候補物質となる。
【０１１０】
(3-2)タンパク質の発現量を指標とするスクリーニング方法
本発明は、GIPR （GIPRタンパク質）、GCSFR（GCSFRタンパク質）、およびREGIα（REG Iαタンパク質）のいずれかの発現を制御する（減少させる／増大させる）物質をスクリーニングする方法を提供する。
本発明スクリーニング方法は、次の工程(a)、(b)および(c)を含む：
【０１１１】
(ａ)被験物質とGIPR、GCSFR、およびREG Iαのいずれかを発現可能な細胞とを接触させる工程、
(ｂ)被験物質を接触させた細胞におけるGIPR、GCSFR、およびREG Iαのいずれかの発現量を測定し、該発現量を被験物質を接触させない対照細胞における上記に対応するタンパク質の発現量と比較する工程、
(ｃ)上記（ｂ）の比較結果に基づいて、GIPR、GCSFR、およびREG Iαのいずれかの発現量を変動させる被験物質を選択する工程。
【０１１２】
本発明スクリーニングに用いられる細胞は、内在性および外来性を問わず、GIPR遺伝子、GCSFR遺伝子、およびREG Iα遺伝子のいずれかを発現し、発現産物としてのGIPR、GCSFR、およびREG Iαのいずれかを有する培養細胞全般を挙げることができる。ここでGIPR、GCSFR、およびREG Iαの発現は、遺伝子産物であるタンパク質を公知のウエスタン法にて検出することにより、容易に確認することができる。該細胞としては、具体的には、前記(3−1)項の(1)〜(3)に記載したような、IBDの動物モデルより単離、調製した腸管組織やリンパ系組織由来の初代培養細胞、種々の刺激剤で処理した腸管組織やリンパ系組織由来の初代培養細胞若しくは株化細胞、または本発明遺伝子のいずれかを導入した株化細胞などが挙げられる。また当該細胞の範疇には、その細胞膜画分、細胞質画分、細胞核画分なども含まれる。
【０１１３】
本発明スクリーニング方法によってスクリーニングされる被験物質（候補物質）は、制限されないが、核酸（本発明遺伝子のアンチセンスヌクレオチドを含む）、ペプチド、タンパク質、有機化合物、無機化合物などであり、本発明スクリーニングは、具体的にはこれらの被験物質またはこれらを含む試料（被験試料）を上記細胞や細胞膜画分と接触させることにより行われる。かかる被験試料としては、被験物質を含む細胞抽出液、遺伝子ライブラリーの発現産物、合成低分子化合物、合成ペプチド、天然化合物などが挙げられるが、これらに制限されない。
【０１１４】
実施例に示すように、IBDに罹患した患者の大腸（結腸）組織では、正常な大腸（結腸）組織に比して、特異的にGIPR遺伝子、GCSFR遺伝子、およびREG Iα遺伝子が発現上昇している。この知見から、これら本発明遺伝子の発現産物（タンパク質）の発現亢進はIBDと関連していると考えられる。よって本発明のスクリーニング方法には、これらGIPR、GCSFR、およびREG Iαのいずれかのタンパク発現レベルを指標として、その発現量を変動させる物質を探索する方法が包含される。このスクリーニング方法によって、IBDの緩和／抑制作用を有する（IBDに対して改善／治療効果を発揮する）候補物質を提供することができる。
【０１１５】
すなわち本発明のスクリーニング方法は、GIPR、GCSFR、およびREG Iαのいずれかの発現量を変動させる物質を探索することによって、IBDの改善薬または治療薬の有効成分となる候補物質を提供するものである。
【０１１６】
候補物質の選別は、具体的にはGIPR、GCSFR、およびREG Iαのいずれかを発現産生している細胞を用いる場合は、被験物質（候補物質）を添加した細胞における前記本発明タンパク質のタンパク量（レベル）が、被験物質（候補物質）を添加しない細胞のその量（レベル）に比して変動する（低くなる／高くなる）ことを指標として、行うことができる。また、これらGIPR、GCSFR、およびREG Iαのいずれかの発現産生に発現誘導物質を必要とする細胞を用いる場合は、発現誘導物質［例えばリポポリサッカライド（Lipopolysaccharide:LPS）、ホルボールエステル（PMA等）、カルシウムイオノフォア、サイトカイン（IL-1、IL−6、IL-12、IL-18、TNFα、IFNγ等）等］によって誘導される当該タンパクの産生が被験物質の存在によって制御されること、すなわち発現誘導物質の存在下で被験物質を接触させた細胞の遺伝子発現が、発現誘導物質存在下で被験物質を接触させなかった対照細胞（正のコントロール）に比して変動する（低くなる／高くなる）ことを指標として、当該被験物質を候補物質として選別することができる。
【０１１７】
用いられる細胞としては、例えば結腸由来細胞であるCaco-2細胞、HT-29細胞またはCOLO 205 細胞等が挙げられる。
【０１１８】
上記いずれかのタンパク質の発現を制御する物質のうち、発現を低下（発現レベルの減少、発現誘導の抑制）するように制御する候補物質の選別は、具体的にはGIPR、GCSFR、またはREG Iαを発現産生している細胞を用いる場合は、被験物質（候補物質）を添加した細胞における、GIPR、GCSFR、またはREG Iαの蛋白量（レベル）が、被験物質（候補物質）を添加しない細胞のその量（レベル）に比して低くなることを指標として、行うことができる。また、これらGIPR、GCSFR、およびREG Iαのいずれかの発現に発現誘導物質を必要とする細胞を用いる場合は、発現誘導物質の存在下で被験物質を接触させた細胞のタンパク質の発現が、発現誘導物質存在下で被験物質を接触させなかった対照細胞（正のコントロール）に比して低くなることを指標として、当該被験物質を候補物質として選別することができる。
【０１１９】
上記いずれかのタンパク質の発現を制御する物質のうち、発現を上昇（発現レベルの増加、発現誘導の亢進）するように制御する候補物質の選別は、具体的にはGIPR、GCSFR、またはREG Iαを発現産生している細胞を用いる場合は、被験物質（候補物質）を添加した細胞における、GIPR、GCSFR、またはREG Iαの蛋白量（レベル）が、被験物質（候補物質）を添加しない細胞のその量（レベル）に比して高くなることを指標として、行うことができる。また、これらGIPR、GCSFR、およびREG Iαのいずれかの発現に発現誘導物質を必要とする細胞を用いる場合は、発現誘導物質の存在下で被験物質を接触させた細胞のタンパク質の発現が、発現誘導物質存在下で被験物質を接触させなかった対照細胞（正のコントロール）に比して高くなることを指標として、当該被験物質を候補物質として選別することができる。
【０１２０】
本発明のスクリーニング方法にかかるGIPR、GCSFR、およびREG Iαのいずれかの産生量は、前述したように、例えば抗体に関する本発明疾患マーカー(例えばヒトGIPRタンパク質もしくはそのホモログ、ヒトGCSFRタンパク質もしくはそのホモログ、またはヒトREG Iαタンパク質もしくはそのホモログを認識する抗体)を用いたウエスタンブロット法などの公知方法に従って定量できる。ウエスタンブロット法は、一次抗体として本発明疾患マーカーを用いた後、二次抗体として¹²⁵Iなどの放射性同位元素、蛍光物質、ホースラディッシュペルオキシターゼ（HRP）などの酵素等で標識した一次抗体に結合する抗体を用いて標識し、これら標識物質由来のシグナルを放射線測定器(BAS-1800II：富士フィルム社製など)、蛍光検出器などで測定することによって実施できる。また、一次抗体として本発明疾患マーカーを用いた後、ECL Plus Western Blotting Detction System (アマシャムファルマシアバイオテク社製)を利用して、該プロトコールに従って検出し、マルチバイオイメージャーSTORM860(アマシャムファルマシアバイオテク社製)で測定することもできる。
【０１２１】
(3-3) タンパク質の機能（活性）を指標とするスクリーニング方法
本発明は、GIPR、GCSFR、およびREG Iαの機能（活性）を制御する物質をスクリーニングする方法を提供する。
本発明のスクリーニング方法は次の工程(a)、(b)及び(c)を含む：
【０１２２】
(a)被験物質を GIPR、GCSFR、またはREG Iαに接触させる工程、
(b)上記(a)の工程に起因して生じるGIPR、GCSFR、またはREG Iαの機能または活性を測定し、該機能または活性を被験物質を接触させない場合のGIPR、GCSFR、またはREG Iαの機能または活性と比較する工程、
(c)上記(b)の比較結果に基づいて、GIPR、GCSFR、またはREG Iαの機能または活性の変動をもたらす被験物質を選択する工程。
【０１２３】
本発明のスクリーニング方法おいては、GIPR、GCSFR、またはREG Iαの公知の機能・活性に基づく如何なる機能・活性測定方法をも利用することができる。すなわち、GIPR、GCSFR、またはREG Iαの公知の機能・活性測定系に被験物質を添加し、当該GIPR、GCSFR、またはREG Iαの公知の機能・活性を制御（亢進・抑制・促進・阻害）する被験物質を、IBDに対して改善／治療効果を有する候補物質として選択するスクリーニング方法であれば、本発明のスクリーニング方法の範疇に含まれる。
【０１２４】
前記本発明のスクリーニングは、GIPR、GCSFR、またはREG Iαを含む水溶液、細胞または該細胞から調製した細胞画分と、被験物質とを接触させることにより行うことができる。
【０１２５】
ここでGIPR、GCSFR、またはREG Iαを含む水溶液としては、例えばGIPR、GCSFR、またはREG Iαを含む通常の水溶液の他、これらのタンパク質を含む細胞溶解液、細胞破砕液、核抽出液あるいは細胞の培養上清などを例示することができる。
【０１２６】
また、本発明のスクリーニング方法に用いられる細胞としては、内在性及び外来性を問わず、GIPR、GCSFR、またはREG Iαを発現し得る細胞を挙げることができる。該細胞としては、具体的には、前記(3−1)項の(1)〜(3)に記載したような、IBDの動物モデルより単離、調製したリンパ系組織や腸管組織由来の初代培養細胞、種々の刺激剤で処理したリンパ系組織や腸管組織由来の初代培養細胞若しくは株化細胞、または本発明遺伝子のいずれかを導入した株化細胞などを用いることができる。
また本発明のスクリーニング方法に用いられる細胞画分とは、上記細胞に由来する各種の画分を意味し、これには、例えば細胞膜画分、細胞質画分、細胞核画分などが含まれる。
【０１２７】
前記スクリーニングにおいて用いられるGIPR、GCSFR、およびREG Iαは、いずれも公知のタンパク質であり、前記（1-3）に記述したように、本発明により提供される遺伝子の配列情報（配列番号1〜14,29）に基づいて、ＤＮＡクローニング、各プラスミドの構築、宿主へのトランスフェクション、形質転換細胞の培養、および必要に応じて培養物からのタンパク質の回収の操作により得ることができる。これらの操作は、当業者に既知の方法、あるいは文献記載の方法（Molecular Cloning, T.Maniatis et al., CSH Laboratory (1983), DNA Cloning, DM. Glover, IRL PRESS (1985)）などに準じて行うことができる。
【０１２８】
実施例に示すように、IBDに罹患した患者の大腸（結腸）組織では、正常な大腸（結腸）組織に比して、特異的にGIPR遺伝子、GCSFR遺伝子、およびREG Iα遺伝子が発現上昇している。この知見から、これらの遺伝子の発現産物（タンパク質）の機能（活性）亢進は、IBDと関連していると考えられる。よって本発明のスクリーニング方法には、これらGIPR、GCSFR、またはREG Iαの機能（活性）を指標として、該タンパク質の機能（活性）を制御する物質を探索する方法が包含される。本発明スクリーニング方法によれば、GIPR、GCSFR、またはREG Iαの機能または活性を制御する物質を探索でき、かくしてIBDの緩和／抑制作用を有する（IBDに対して改善／治療効果を発揮する）候補物質が提供される。
【０１２９】
本発明タンパク質の機能（活性）制御の１つの態様として、該タンパク質の機能（活性）を抑制（低下）させる方向に制御する物質の探索は、例えばGIPR遺伝子、GCSFR遺伝子、またはREG Iα遺伝子を含む水溶液、細胞または該細胞から調製した細胞画分に被験物質を接触させた場合に得られる上記の少なくとも１つのタンパク質の機能（活性）が、被験物質を添加しない対照の水溶液、細胞または細胞画分の上記対応するタンパク質の機能（活性）に比して低くなることを指標として行うことができる。
【０１３０】
また本発明タンパク質の機能（活性）制御のもう１つの態様として、該タンパク質の機能（活性）を亢進（上昇、増加）させる方向に制御する物質の探索は、例えばGIPR、GCSFR、またはREG Iαを含む水溶液、細胞または該細胞から調製した細胞画分に被験物質を接触させた場合に得られる上記の少なくとも１つのタンパク質の機能（活性）が、被験物質を添加しない対照の水溶液、細胞または細胞画分の上記対応するタンパク質の機能（活性）に比して高くなることを指標として行うことができる。
すなわち本発明のスクリーニング方法は、GIPR、GCSFR、またはREG Iαの機能または活性を制御する物質を探索することによって、IBDの改善薬または治療薬の有効成分となる候補物質を提供するものである。
【０１３１】
本発明スクリーニング方法によってスクリーニングされる被験物質(候補物質)は、制限されないが、核酸、ペプチド、蛋白質（GIPR、GCSFR、またはREG Iαに対する抗体を含む）、有機化合物、無機化合物などであり、本発明スクリーニングは、具体的にはこれらの被験物質またはこれらを含む試料(被験試料)を上記水溶液、細胞または細胞画分と接触させることにより行われる。被験試料としては、被験物質を含む、細胞抽出液、遺伝子ライブラリーの発現産物、合成低分子化合物、合成ペプチド、天然化合物などが挙げられるが、これらに制限されない。
【０１３２】
本発明の各タンパク質の機能または活性に基づくスクリーニング方法のうち、共通のアッセイ法に基づくスクリーニング方法については、以下の「I.受容体結合阻害活性に基づくスクリーニング」、および「II.GPCR活性に基づくスクリーニング」の項に記述する。また本発明の各タンパク質の個々のスクリーニング方法については、以下の「III.本発明の各タンパク質の機能（活性）に基づくスクリーニング」の項に記述する。
【０１３３】
I. 受容体結合阻害活性に基づくスクリーニング
本発明タンパク質のうち、GIPR及びGCSFRは受容体であり、そのリガンド（受容体結合物質）としては、それぞれ天然リガンドであるガストリック・インヒビトリー・ポリペプチド（GIP）及び顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF)が知られている。
【０１３４】
よって、GIPR、又はGCSFRの機能または活性の変動をもたらす被験物質（候補物質）のスクリーニングは、被験物質が、前記受容体とリガンドとの結合を阻害するか否かを測定することによって行うことができる。具体的には本発明のスクリーニング方法は、次の工程(a)、(b)及び(c)を含む：
(a) 被験物質の存在下で、前記受容体と前記リガンドとを接触させる工程、
(b) 上記受容体に対するリガンドの結合量を測定し、当該結合量を、被験物質非存在下で受容体とリガンドとを接触させることによって得られる受容体に対するリガンドの結合量（対照結合量）と比較する工程、及び
(c) 上記(b)の結果に基づいて、対照結合量に比して結合量を変動させる被験物質を選択する工程。
【０１３５】
この場合、前記受容体とリガンドとの結合阻害は、▲１▼受容体に結合することによって、リガンドの受容体への結合を阻害する態様のものであってもよいし、▲２▼リガンドに結合することによって、リガンドの受容体への結合を阻害する態様のものであってもよい。但し、とりわけ▲１▼の態様の場合は、受容体に結合してもリガンドと同じ作用を発揮しない被験物質を選択することが必要である。このため、上記のスクリーニング方法で選別された被験物質は更に、下記：
(d)上記(c)で選択された被験物質の中から、更にリガンドと同じ作用を有する被験物質、又はリガンドの作用を拮抗する被験物質を選択する工程、
に供することが好ましい。
前記（d)の工程としては、例えば後述する、「II.GPCR活性に基づくスクリーニング」や「III.本発明の各タンパク質の機能（活性）に基づくスクリーニング」の項に記載された方法を挙げることができる。
【０１３６】
本発明スクリーニングで用いる受容体は、精製物（単離物）であっても良いし、当該受容体を含有する細胞またはその細胞画分の形態であっても良い。
本発明スクリーニングで用いる受容体を含有する細胞は、当該受容体を天然に発現している細胞を用いても良いし、また当該受容体をコードする遺伝子を細胞に導入して作製した形質転換細胞を用いても良い。
【０１３７】
前記形質転換細胞は、Molecular Cloning 2nd Edt., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)等の基本書に従い、当業者にとって公知の方法で調製することができる。例えば、前記受容体のｃＤＮＡをｐＣＡＧＧＳ（Ｇｅｎｅ 108,193-199（１９９１））、pcDNA1.1、pcDNA3.1誘導体（インビトロジェン社）などの公知の発現ベクターに挿入する。その後、適当な宿主に導入し、培養することにより、導入した受容体のＤＮＡに対応するタンパク質を発現させた形質転換細胞を作製することができる。宿主としては、一般的に広く普及している、ＣＨＯ細胞、Ｃ１２７細胞、ＢＨＫ２１細胞、ＣＯＳ細胞などを用いることができるが、これに限定されることなく、酵母、細菌、昆虫細胞などを用いることもできる。
【０１３８】
受容体タンパク質のｃDNAを有する発現ベクターの宿主細胞への導入方法としては、公知の発現ベクターの宿主細胞への導入方法であれば、どのような方法でもよく、例えばリン酸カルシウム法（J. Virol., 52, 456-467(1973))、LT-1（Panvera社製）を用いる方法、遺伝子導入用リピッド（Lipofectamine、Lipofectin；Gibco−BRL社製）を用いる方法などが挙げられる。
前記受容体を天然に発現する細胞、および前記受容体を発現する形質転換細胞は、そのままスクリーニングに用いることができるが、細胞膜をスクリーニングに用いる場合は、例えば以下のようにして細胞膜画分を得ることができる。すなわちまず細胞に低張バッファーを添加し、細胞を低張破壊した後、ホモジナイズし、遠心分離することにより細胞膜画分の沈殿物を得る。そしてこの沈殿物をバッファーに懸濁することにより、受容体を含有する細胞膜画分を得ることができる。得られた細胞膜画分は、抗体を結合させたカラム等により常法で精製することもできる。
【０１３９】
本発明スクリーニングで用いられる前記リガンド、具体的にはGIP及びG-CSFも、前記受容体と同様の手法で調製された形質転換細胞から、常法により組換えタンパクを回収することにより得ることができる。さらに、前記天然リガンドの他、アゴニストリガンドを用いることもできる。
これらリガンドは、そのままで用いても良いし、任意の標識物質で標識されたものを用いることもできる。ここで標識物質としては、放射性同位体（³H、¹⁴C、³⁵S、¹²⁵I等）、蛍光物質（Molecular Probes社Alexa Protein Labeling Kits等）、化学発光物質（Assay Designs社Chemiluminescence Labeling Kit等）、ビオチン（Pierce社EZ-Link Biotinylation Kits等）、マーカータンパク質、またはペプチドタグなどを例示することができる。マーカータンパク質としては、例えばアルカリフォスファターゼ（Cell, 63,185-194,1990）、抗体のＦｃ領域（Genbank accession number M87789）、またはＨＲＰ(Horse radish peroxidase)などの従来公知のマーカータンパク質を挙げることができる。またペプチドタグとしては、例えばＭｙｃタグ、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグなどの従来公知のペプチドタグを挙げることができる。
【０１４０】
受容体結合阻害活性の測定は、具体的には、以下の方法が例示される。すなわち、前記受容体を含有する水溶液（通常緩衝液が用いられる）、前記細胞若しくは細胞膜画分に、10^-3〜10^-10Mの適当な濃度に調製した被験化合物溶液(通常溶媒には水もしくは緩衝液が用いられるが、溶解度に応じてエタノールやDMSOを添加することもできる)を加えた後、標識した前記リガンドを加え、一定時間（通常、10分〜2時間）反応させる。その後遠心分離等により上清を単離して放射活性を測定し、上清中に含まれる標識したリガンド量を計測することができる。あるいは、形質転換細胞もしくは細胞膜画分を含む沈殿物を界面活性剤、塩基を含む溶液に溶解し、その放射活性を測定し、沈殿物に含まれる標識リガンド量を計測することもできる。
【０１４１】
上記の数値を、被験化合物の代わりに溶媒をブランクとして用いて実施した場合の値（対照結合量）と比較することにより、被験化合物が、受容体と標識リガンドの結合を阻害するか否かを評価することができる。すなわち候補物質のスクリーニングは、被験物質存在下での結合量が、被験物質非存在下での結合量に比して、変動するか否かを指標にして行うことができる。
具体的な阻害率（％）については、以下の式：
{1-（被験物質を添加した場合に本発明タンパク質と結合した標識アゴニストリガンド量）/（被験物質非添加時における本発明タンパク質と結合した標識アゴニストリガンド量）}X100
で算出することによって求めることができる。
【０１４２】
II. GPCR 活性に基づくスクリーニング
本発明タンパク質のうち、GIPRはGPCR(G蛋白共役型受容体；G-protein coupled receptor)であり、そのリガンド（受容体結合物質）としては、天然のアゴニストリガンドであるガストリック・インヒビトリー・ポリペプチド（GIP、別名グルコース依存性インシュリン分泌ポリペプチド）等が知られている。GIPは42アミノ酸残基からなるポリペプチドである。
よって、これらGIPRの機能または活性の変動をもたらす被験物質（候補物質）のスクリーニングは、GPCR活性を阻害するか否かを測定することによって、行うことができる。以下、代表的な手法として、(1) GTPとの結合活性に基づくスクリーニング、及び(2) GPCRの生理活性に基づくスクリーニングについて記述する。
【０１４３】
(1)GTP との結合活性に基づくスクリーニング
GPCRとの結合活性に基づくスクリーニングは、GPCRがGDP存在下でGTPアナログであるGTPγSと結合する性質を利用して行うことが出来る。すなわち本発明のスクリーニングは、GPCRとGTPγSとの結合（より具体的にはGPCRとGタンパク質との複合体とGTPγSとの結合）を被験物質が阻害（制御）するか否かを測定することによって、行うことができる。具体的には本発明のスクリーニング方法は、次の工程(a)、(b)及び(c)を含む：
(a) 被験物質の存在下で、前記GPCR、前記リガンドおよびGTPを接触させる工程、
(b) 上記(a)の工程に起因して生じるGTP結合量を測定し、当該結合量を、被験物質非存在下でGPCR、リガンドおよびGTPを接触させることによって得られるGTP結合量（対照結合量）と比較する工程、及び
(c) 上記(b)の結果に基づいて、対照結合量に比してGTP結合量を変動させる被験物質を選択する工程。
【０１４４】
本発明スクリーニングで用いるGPCRを含有する細胞は、当該GPCRを天然に発現している細胞を用いても良いし、また当該GPCRをコードする遺伝子を細胞に導入して作製した形質転換細胞を用いても良い。具体的には、以下の方法が例示される。
すなわち、当業者に公知の方法を用いて、前記GPCRの発現ベクターを作製し、CHO-K1細胞・HEK293細胞等に過剰発現させた形質転換細胞か、若しくは前記GPCRを天然に発現している細胞を準備する。ここで、必要に応じて、Gタンパク質の発現ベクターを共発現させることもできる。次に、前記細胞から遠心分離等の操作により、細胞膜画分を調製する。これを、適当な緩衝液などの溶媒中で、前記リガンドおよび被験物質とともに混合し、一定時間（例えば、30分〜２時間）インキュベートする。更に、[³⁵S]-GTPγSを混合し、一定時間（例えば、30分〜２時間）インキュベートする。グラスフィルター上で、緩衝液で洗浄することにより結合反応を終了させた後、フィルター上の放射活性を測定することにより、前記GPCRとGタンパク質との複合体に結合した[³⁵S]-GTPγS 量を算出することができる。候補物質のスクリーニングは、被験物質存在下での[³⁵S]-GTPγS結合量が、被験物質非存在下での[³⁵S]-GTPγS結合量に比して、変動するか否かを指標にして行うことができる。
【０１４５】
(2) GPCR の生理活性に基づくスクリーニング
GPCRにアゴニストリガンドが結合することによって生ずる生理活性を指標として、GPCRの機能（活性）を制御する候補物質を選別することもできる。具体的には本発明のスクリーニング方法は、次の工程(a)、(b)及び(c)を含む：
(a) 被験物質の存在下で、前記受容体と前記リガンドとを接触させる工程、
(b) 上記(a)の工程に起因して生じるGPCRを介した生理活性を測定し、当該生理活性を、被験物質非存在下で受容体とリガンドとを接触させることによって得られるGPCRを介した生理活性（対照生理活性）と比較する工程、及び
(c) 上記(b)の結果に基づいて、対照生理活性に比して生理活性を変動させる被験物質を選択する工程。
【０１４６】
ここでGPCRを介した生理活性としては、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内カルシウムイオン濃度の増加もしくはその制御、細胞内cAMP濃度の増加もしくはその制御、細胞内cGMP生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内タンパク質のリン酸化、c-fos活性化、cAMP応答性エレメントのレポータージーンの活性化もしくはその制御等が挙げられる。
該生理活性は、公知の方法、または市販の測定用キットを用いて測定することができる。すなわち、前記GPCRを含有する細胞をマルチウェルプレート等に培養する。新鮮な培地、あるいは細胞毒性を示さない適当なバッファーに交換し、被験化合物、および/またはリガンド等を添加して一定時間インキュベートした後、細胞を抽出、あるいは上清液を回収して生成した産物をそれぞれ該当する方法に従って定量する。生理活性の指標とする物質（例えばアラキドン酸など）の生成が、細胞が含有する分解酵素によって測定不能な場合は、該分解酵素に対する阻害剤を併用することもできる。また、cAMP産生制御などの活性については、フォルスコリンなどで細胞の産生量を増大させて、感度良く測定することもできる。
【０１４７】
具体的な測定手順としては、以下の▲１▼または▲２▼が挙げられる。
▲１▼Fluorescent imaging plate reader(FLIPR)法
細胞内カルシウム濃度の変動を検出することによりGIPRの活性を測定することができる。前記GPCRが、Gq蛋白ではなくGs蛋白もしくはGi蛋白と共役して存在する場合でも、そのシグナルをGqタイプのシグナルに変換し、細胞内カルシウムイオン量を測定することにより、スクリーニングを行うことができる。すなわち、
１）前記GIPR遺伝子の発現ベクターと、Gq蛋白、もしくはGqs5蛋白（Gqs5とは、C末端に、Gs蛋白のC末端アミノ酸５残基を置換したGq蛋白を意味する。）、もしくはGqi5蛋白（Gqi5とは、C末端に、Gi蛋白のC末端アミノ酸５残基を置換したGq蛋白を意味する。）の発現ベクターを作製する。ここで、細胞株としては、CHO-K1細胞等を用いることができ、上記発現ベクターを遺伝子導入試薬Lipofectoamine (Invitrogen社)等を用いて共導入することができる。
２）次に該細胞を、probenecid（色素を細胞内に保持するために、multiple drug-resistance pumpの阻害剤として用いる。）、およびFluo-3 AM(Molecular Probe社)等のカルシウムイオンによって蛍光活性を示す色素を含むF12培養培地中で、CO₂インキュベーターにて一定時間（例えば３０分〜2時間）培養する。
３）リガンドをprobenecidを含むHBSS等の培養培地に溶解した溶液を、添加し、2分後までFLIPRにて計測する。検出は、488nmのアルゴンレーザーで細胞を励起し、カルシウムイオンが結合したFluo-3の蛍光を500-560nmの波長でとらえることによって行う。リガンド添加直後から60秒後までの蛍光強度から、添加前の値をバックグラウンドとして差し引いた値を活性とする。被験物質を添加する場合はリガンドを添加する前に添加し、その後リガンドを添加する。
４）候補物質の選択は、被験物質の存在下におけるカルシウムイオン量が、被験物質非存在下におけるカルシウムイオン量に比して変動するか否かを指標にして行うことができる。
【０１４８】
▲２▼cAMP量の測定
cAMP応答性エレメントのレポータージーンアッセイを用いる方法は、GIPRにリガンドが結合して生じるシグナル伝達により活性化されるcAMP応答性エレメント（CRE）の下流にルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、成長ホルモン、GFPなどのレポーター遺伝子を連結し、レポータージーンアッセイを行うことができる。該方法については、例えば、Ishiharaら、EMBO J., 10, 1635-1641（1991）等に記載されている。具体的には、
１)前記GIPR遺伝子の発現ベクターと、Gタンパク（Gs、Gi）の発現ベクター、およびcAMP応答性エレメント（CRE）の下流にルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、成長ホルモン、GFPなどのレポーター遺伝子を連結した遺伝子を作製する。ここで、細胞株としては、CHO-K1細胞等を用いることができ、上記発現ベクターを遺伝子導入試薬Lipofectoamine (Invitrogen社)等を用いて共導入することができる。また、前記Gタンパクを発現している細胞を用いる場合は、前記GIPRの遺伝子発現ベクターおよびレポーターベクターのみを導入する。
２）次に該細胞を、適当な培地中で、CO₂インキュベーターにて一定時間（例えば4〜8時間）培養する。
３）培地交換後、リガンドGIPを適当な培養培地に溶解した溶液を添加し、一定時間（4時間〜24時間）後、レポーター活性を測定する。例えばルシフェラーゼの場合は、細胞溶解液で細胞を溶かし、その一部分を用いてルシフェラーゼ基質溶液（プロメガ社Luciferase assay system等）と反応させた際の発光をルミノメーターで測定する。被験物質はリガンドを添加する前に添加する。
４）候補物質の選択は、被験物質の存在下におけるレポーター活性が、被験物質非存在下におけるレポーター活性に比して変動するか否かを指標にして行うことができる。
上記測定には、市販されているサイクリックAMP検出キット（例えばアマシャム社：TRK.432）を使用することもできる。
【０１４９】
III. 本発明の各タンパク質の機能（活性）に基づくスクリーニング
以下、本発明タンパク質の各々の機能（活性）に基づくスクリーニング方法につき例示する。
【０１５０】
(1) GIPRの機能（活性）に基くスクリーニング方法
GIPRのリガンドであるGIPは４２アミノ酸残基からなるポリペプチドで、十二指腸や小腸のK細胞で合成される。胃酸とガストリンの分泌を阻害する機能や、膵臓β細胞のインスリン分泌を刺激することが知られている。すなわち、GIPRの公知の性質を利用することにより、以下のような測定方法を用いて、GIPRの機能（活性）を制御する制御物質または候補物質をスクリーニングすることができる。具体的には、以下のインスリン刺激活性に基づくスクリーニング方法を例示することができる。
GIPRのインスリン刺激活性は、例えば公開特許公報：特開平７-１９６６９５に記載の方法を参考にして測定することができる。すなわち、GIPを動物細胞に添加するかまたは動物に投与し、動物の媒介系または循環系組織における免疫反応性インスリン(IRI)の放出を観測することによって定量することができる。IRIの存在は、インスリンを特異的に検出しうるラジオイムノアッセイを用いて検出する。すなわち本発明のスクリーニング方法は、次の工程(a)、(b)及び(c)を含む：
(a) 被験物質の存在下で、インスリンを発現し得る細胞とGIPを接触させる工程、
(b) 上記（a)におけるインスリン放出量を測定し、当該放出量を、被験物質非存在下で前記細胞及びGIPを接触させることによって得られる放出量（対照放出量）と比較する工程、及び
(c) 上記(b)の結果に基づいて、対照放出量に比して放出量を変動させる被験物質を選択する工程。
ここで用いられる細胞としては、灌流された膵臓（特開平７-１９６６９５に記述の方法のように、小部分の腸のみを灌流し、グルカゴン様免疫反応性をもつ腸内物質によって起こり得る妨害を最小化したものが望ましい。）や、膵臓より単離したラ氏島（特開平２０００-３４２１０９）等が挙げられる。好ましくは、ラットインスリノーマ細胞が用いられ、特に好ましくはＲＩＮ−３８ラットインスリノーマ細胞が用いられる。
一方、GIPは当業者に公知のペプチド固相合成法によって調製することができる。例えば、泉屋ら、「ペプチド合成の基礎と実験」（丸善；１９８５）等に記載された方法で得ることができる。
前記（b)におけるインスリン量の測定は、モリナガ超高感度ラットインスリン測定キット（生化学工業株式会社製）等を用いて行うことができる。
【０１５１】
(2) GCSFRの機能（活性）に基くスクリーニング方法
GCSFR（顆粒球コロニー刺激因子受容体）、別名コロニー刺激因子３受容体（CSF３R）のリガンドであるG-CSFは、血液細胞の増殖と分化に関与するコロニー刺激因子の１員であり、好中性顆粒球の増殖および分化に重要な役割を担っている。この因子は、血液中の好中球濃度の制御、並びに成熟好中球の賦活化に深く関与していることが分かっている。例えば、G-CSFは好中球の前駆細胞等の受容体(GCSFR)を介して該細胞に作用し、その増殖、あるいは分化を刺激して主に好中性顆粒球を与えることが知られている。すなわち、GCSFRの公知の性質である細胞増殖活性の測定等を用いて、GCSFRの機能（活性）を制御する制御物質または候補物質をスクリーニングすることができる。具体的には、例えば公開特許公報：特開平6-100593に記載の方法を参考にしてG-CSFのG-CSF応答細胞に対する増殖促進活性を測定する方法や、以下の方法が挙げられる。
【０１５２】
すなわち本発明のスクリーニング方法は、次の工程(a)、(b)及び(c)を含む：
(a) 被験物質の存在下で、GCSFRを発現し得る細胞とG -CSFを接触させる工程、
(b) 上記（a)における、細胞増殖活性値を測定し、当該活性値を、被験物質非存在下で前記細胞及びG-CSFを接触させることによって得られる活性値（対照活性値）と比較する工程、及び
(c) 上記(b)の結果に基づいて、対照活性値に比して活性値を変動させる被験物質を選択する工程。
ここで、GCSFRを発現し得る細胞としては、GCSFR遺伝子を導入した形質転換細胞、又は、因子依存性細胞ラインとして、パターソン(Paterson)−G-CSF（FDCP-G）[英国パターソン研究所(Paterson Institute)]をG-CSFの存在下に限界希釈法によりクローン化した細胞等が挙げられる。G-CSFは市販品（フナコシ／R&D SYSTEMS社）を用いることができる。
上記において、細胞増殖活性は、例えば[3H] チミジン (アマシャム社)取り込み量を指標にして測定することができる。すなわち、細胞を調湿インキュベーター中でＣＯ_２存在下で２〜６日間インキュベートする。ウエル１個当りに約１．０μＣｉの滴定したチミジンを添加し、最後に４〜８時間に亘ってインキュベートする。細胞をガラス繊維の濾紙上に採取し、放射能の濃度を液体シンチレーション計数によって測定することができる。
【０１５３】
(3) Reg Iαの機能（活性）に基くスクリーニング方法
REG 及び REG related genes はカルシウム依存性レクチンファミリーにし、消化管基底部や組織損傷部において発現される再生に関与する遺伝子群である。Reg Iα遺伝子は166アミノ酸残基の蛋白質をコードしており、C-type レクチンの糖結合ドメインと相同性のある配列を持つ（Hartupee, J. C.ら、Biochim Biophys Acta, 1518, 287-293, 2001）。Reg Iαは別に、PSP(Pancreatic Stone Protein)もしくはPTP (Pancreatic Thread Protein) とも呼ばれる。Reg Iαは膵液に豊富に含まれ（全タンパク質の10〜14％）、In vitro で炭酸カルシウムの結晶化を阻害することがわかっている（Rouimi, FEBS Lett., 216, 195-199, 1987）。また、３種類のラット膵臓由来細胞株、ARIP（膵管）、AR42J（腺房）、RIN（β細胞）のうち、AR42J に発現が認められ、ARIP及びRINに対して細胞増殖促進活性を有することが報告されている（Zenilman, MEら、Gastro-enterology,110, 1208-1214, 1996）。
すなわち、Reg Iαの公知の性質である細胞増殖促進活性を測定することによって、Reg Iαの機能（活性）を制御する制御物質または候補物質をスクリーニングすることができる。
【０１５４】
すなわち本発明のスクリーニング方法は、次の工程(a)、(b)及び(c)を含む：
(a) 被験物質の存在下で、Reg Iαに対して応答性を有する細胞及びReg Iαを接触させる工程、
(b) 上記（a)における、細胞増殖促進活性を測定し、当該活性値を、被験物質非存在下で前記細胞及びReg Iαを接触させることによって得られる活性値（対照活性値）と比較する工程、及び
(c) 上記(b)の結果に基づいて、対照活性値に比して活性値を変動させる被験物質を選択する工程。
ここで、REG Iαの細胞増殖促進活性は、例えばZenilman, MEら、Gastroenterology, 110, 1208-1214, 1996の方法を参考にして測定することができる。Reg Iαに応答性を有する細胞としては、特に限定はないが、膵β細胞（RIN）、又は膵腺房細胞（ARIP）を用いることができる。細胞増殖促進活性は、前記（2)と同様に、 [3H] チミジン (アマシャム社)の取り込み量を指標として測定することができる。
また、Reg IαはZenilman, M. E. ら、Gastroenterology, 110, 1208-1214, 1996、および、Gross, J.ら、J. Clin. Invest., 76, 2115-2126, 1985に記載された方法に従って、ウシまたはヒト胎盤より単離・精製することができる。すなわち、ウシまたはヒト胎盤をホモジナイズし、硫酸アンモニウム画分を行い、酸性下における溶解、中性下における沈殿を繰り返し、最終的に、HPLC（phenyl-TSK カラム）、およびモノクローナル抗体を用いたウエスタンブロティングにて単一であることが確認できる程度に精製することが可能である。
【０１５５】
かくして選抜取得される被験物質は、IBDを緩和、抑制（改善、治療）する薬物の有力な候補となる。
【０１５６】
上記(3-1)〜(3-3)に記載する本発明のスクリーニング方法によって選別された候補物質は、さらにIBDのモデル動物である以下の(1)〜（3）の動物：(1)自然発症IBDモデル（C3H/HeJBirマウス、Cotton top tamarins等）、(2)化学物質誘発モデル（ジニトロクロロベンゼン誘発モデル（ラット）、酢酸モデル（ラット）、トリニトロスルホン酸誘発モデル(マウス、ラット、ウサギ)、デキストラン硫酸誘発モデル(マウス、ラット、ハムスター)、カラゲナン誘発モデル（ラット、モルモット）、インドメタシン誘発モデル（ラット）等）、(3)トランスジェニック、ミュータント（IL-2ノックアウトマウス、IL-10ノックアウトマウス、TCRノックアウトマウス等）、または(4)移入モデル（CD45RBhi移入SCIDマウス等）、を用いた薬効試験、安全性試験、さらにIBD患者への臨床試験に供してもよく、これらの試験を実施することによって、より実用的なIBDの改善または治療薬を取得することができる。このようにして選別された物質は、さらにその構造解析結果に基づいて、化学的合成、生物学的合成（発酵）または遺伝子学的操作によって、工業的に製造することができる。
【０１５７】
なお、上記(3-1)〜(3-3)に記載するスクリーニング方法は、IBDの改善または治療薬の候補物質を選別するのみならず、IBDの既存の若しくは新規な改善または治療薬（候補薬）が、GIPR遺伝子、GCSFR遺伝子、およびREG Iα遺伝子のいずれかの発現を制御するか否か、あるいはGIPR、GCSFR、およびREG Iαのいずれかの発現若しくは機能・活性を制御するか否かを評価、確認するためにも用いることができる。すなわち本発明のスクリーニング方法の範疇には、候補物質の探索のみならず、このような評価あるいは確認を目的とするものも含まれる。
【０１５８】
また、本発明のスクリーニング方法を実施する前に、上記に掲げる各本発明タンパク質をコードする遺伝子について、あらかじめ実験により、該遺伝子の発現を抑制する物質がIBDの改善薬または治療薬の有効成分（候補物質）として有用なのか、また発現を誘導する物質がIBDの改善薬または治療薬の有効成分（候補物質）として有用なのかを判断することは可能であり、その具体的な方法については前述の通りである。当該実験によって本発明遺伝子の発現抑制物質が候補物質になる可能性が高いと判断された場合は、当該遺伝子がコードする本発明タンパク質の機能（活性）の抑制を指標としてスクリーニングを行うことにより、より高い精度で候補物質を選別することができ、また当該実験によって本発明遺伝子の発現誘導物質が候補物質になる可能性が高いと判断された場合は、当該遺伝子がコードする本発明タンパク質の機能（活性）の亢進を指標としてスクリーニングを行うことにより、より高い精度で候補物質を選別することができる。
【０１５９】
上記(3-1)または(3-2)に記載する本発明のスクリーニング方法によって選択された制御物質または候補物質は、さらにIBDの動物モデルとして周知である動物モデルなどを用いた薬効試験、安全性試験、さらにIBDに罹患した患者への臨床試験に供してもよく、これらの試験を実施することによって、より実用的なIBDの改善または治療薬を取得することができる。このようにして選別された物質は、さらにその構造解析結果に基づいて、化学的合成、生物学的合成（発酵）または遺伝子学的操作によって、工業的に製造することができる。
【０１６０】
尚、上記動物モデルはいずれも当業者にとって公知であり、例えば「In vivo models of Inflammation」D.W.Morganら編（1999、Birkhauser Verlag Basel/Switzerland)に記載された動物モデルを用いることができる。具体的には、自然発症IBDモデル（C3H/HeJBirマウス、Cotton top tamarins等）は、Gastroenterology、107巻、1726-1735頁（1994）等に記載の方法により作製することができる。
また、化学物質（2,4,6-ニトロベンゼンスルホン酸等が用いられる。）誘発モデルは、Gastroenterology、96巻、795-803頁（1989）等に記載の方法により作製することができる。
【０１６１】
（４）IBDの改善・治療剤
本発明は、IBDの改善・治療剤を提供するものである。
本発明はGIPR遺伝子、GCSFR遺伝子、REG Iα遺伝子及びこれらの遺伝子によりコードされるタンパク質が、IBDと関係しているという新たな知見から、これら遺伝子の発現を制御する物質、あるいは、これら遺伝子によりコードされるタンパク質の発現若しくは機能（活性）を制御する物質が、上記疾患の改善または治療に有効であるという考えに基づくものである。すなわち、本発明のIBDの改善・治療剤は、GIPR遺伝子、GCSFR遺伝子、およびREG Iα遺伝子のいずれかの発現を制御する物質、あるいはGIPR、GCSFR、およびREG Iαのいずれかの発現若しくは機能（活性）を制御する物質を有効成分とするものである。
【０１６２】
当該有効成分となるGIPR遺伝子、GCSFR遺伝子、およびREG Iα遺伝子のいずれかの発現制御物質、あるいはGIPR、GCSFR、およびREG Iαのいずれかの発現若しくは機能（活性）制御物質は、上記のスクリーニング方法を利用して選別されたもののみならず、選別された物質に関する情報に基づいて常法に従って工業的に製造されたものであってもよい。
【０１６３】
GIPR遺伝子、GCSFR遺伝子、およびREG Iα遺伝子のいずれかの発現制御物質、あるいはGIPR、GCSFR、およびREG Iαのいずれかの発現若しくは機能（活性）制御物質は、そのままもしくは自体公知の薬学的に許容される担体（賦形剤、増量剤、結合剤、滑沢剤などが含まれる）や慣用の添加剤などと混合して医薬組成物として調製することができる。当該医薬組成物は、調製する形態（錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤などの経口投与剤；注射剤、点滴剤、外用剤、坐剤などの非経口投与剤）等に応じて経口投与または非経口投与することができる。また投与量は、有効成分の種類、投与経路、投与対象または患者の年齢、体重、症状などによって異なり一概に規定できないが、通常、１日投与用量として、数ｍｇ〜２ｇ程度、好ましくは数十ｍｇ程度を、１日１〜数回にわけて投与することができる。
【０１６４】
また、上記の物質がDNAによりコードされるものであれば、該DNAを遺伝子治療用ベクターに組み込み、遺伝子治療を行うことも考えられる。更に、上記有効成分物質がGIPR遺伝子、GCSFR遺伝子、およびREG Iα遺伝子のいずれかに対するアンチセンスヌクレオチドの場合は、そのままもしくは遺伝子治療用ベクターにこれを組込むことにより、遺伝子治療を行うこともできる。これらの場合も、遺伝子治療用組成物の投与量、投与方法は患者の体重、年齢、症状などにより変動し、当業者であれば適宜選択することが可能である。
【０１６５】
上記アンチセンスヌクレオチドを利用する遺伝子治療につき詳述すれば、該遺伝子治療は、通常のこの種の遺伝子治療と同様にして、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその化学的修飾体を直接患者の体内に投与することにより目的遺伝子の発現を制御する方法、もしくはアンチセンスRNAを患者の標的細胞に導入することにより該細胞による目的遺伝子の発現を制御する方法により実施できる。
【０１６６】
ここで「アンチセンスヌクレオチド」には、GIPR遺伝子、GCSFR遺伝子、またはREG Iα遺伝子の少なくとも8塩基以上の部分に対応するアンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスRNA、アンチセンスDNAなどが含まれる。具体的には、配列番号：1〜3のいずれかに記載の塩基配列の少なくとも8塩基以上の部分に対応するアンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスRNA、アンチセンスDNAなどが含まれる。
【０１６７】
また、その化学修飾体には、例えばホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホトリエステル、アルキルホスホナート、アルキルホスホアミデートなどの、細胞内への移行性または細胞内での安定性を高め得る誘導体（"Antisense RNA and DNA" WILEY-LISS刊、1992年、pp.1-50、J. Med. Chem. 36, 1923-1937(1993)）が含まれる。これらは常法に従い合成することができる。
【０１６８】
アンチセンスヌクレオチドまたはその化学的修飾体は、細胞内でセンス鎖mRNAに結合して、目的遺伝子の発現、即ちGIPR遺伝子、GCSFR遺伝子、またはREG Iα遺伝子の発現を制御することができ、かくしてGIPR、GCSFR、またはREG Iαの機能(活性)を制御することができる。
【０１６９】
アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその化学的修飾体を直接生体内に投与する方法において、用いられるアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその化学修飾体は、好ましくは5-200塩基、さらに好ましくは8-25塩基、最も好ましくは12-25塩基の長さを有するものとすればよい。その投与に当たり、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその化学的修飾体は、通常慣用される安定化剤、緩衝液、溶媒などを用いて製剤化され得る。
アンチセンスRNAを患者の標的細胞に導入する方法において、用いられるアンチセンスRNAは、好ましくは100塩基以上、より好ましくは300塩基以上、さらに好ましくは500塩基以上の長さを有するものとすればよい。また、この方法は、生体内の細胞にアンチセンス遺伝子を導入するin vivo法および一旦体外に取り出した細胞にアンチセンス遺伝子を導入し、該細胞を体内に戻すex vivo法を包含する(日経サイエンス, 1994年4月号, 20-45頁、月刊薬事, 36 (1), 23-48 (1994)、実験医学増刊, 12 (15), 全頁 (1994)など参照)。この内ではin vivo法が好ましく、これには、ウイルス的導入法(組換えウイルスを用いる方法)と非ウイルス的導入法がある（前記各文献参照）。
【０１７０】
上記組換えウイルスを用いる方法としては、例えばレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルスなどのウイルスゲノムにアンチセンスヌクレオチドを組込んで生体内に導入する方法が挙げられる。この中では、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルスなどを用いる方法が特に好ましい。非ウイルス的導入法としては、リポソーム法、リポフェクチン法などが挙げられ、特にリポソーム法が好ましい。他の非ウイルス的導入法としては、例えばマイクロインジェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法なども挙げられる。
【０１７１】
遺伝子治療用製剤組成物は、上述したアンチセンスヌクレオチドまたはその化学修飾体、これらを含む組換えウイルスおよびこれらウイルスが導入された感染細胞などを有効成分とするものである。該組成物の患者への投与形態、投与経路などは、治療目的とする疾患、症状などに応じて適宜決定できる。例えば注射剤などの適当な投与形態で、静脈、動脈、皮下、筋肉内などに投与することができ、また患者の疾患対象部位に直接投与、導入することもできる。in vivo法を採用する場合、遺伝子治療用組成物は、GIPR遺伝子、GCSFR遺伝子、またはREG Iα遺伝子のアンチセンスヌクレオチドを含む注射剤などの投与形態の他に、例えばGIPR遺伝子、GCSFR遺伝子、またはREG Iα遺伝子のアンチセンスヌクレオチドを含有するウイルスベクターをリポソームまたは膜融合リポソームに包埋した形態(センダイウイルス(HVJ)-リポソームなど)とすることができる。これらのリポソーム製剤形態には、懸濁剤、凍結剤、遠心分離濃縮凍結剤などが含まれる。また、遺伝子治療用組成物は、上記GIPR遺伝子、GCSFR遺伝子、またはREG Iα遺伝子のアンチセンスヌクレオチドを含有するベクターを導入されたウイルスで感染された細胞培養液の形態とすることもできる。これら各種形態の製剤中の有効成分の投与量は、治療目的である疾患の程度、患者の年齢、体重などにより適宜調節することができる。通常、GIPR遺伝子、GCSFR遺伝子、またはREG Iα遺伝子に対するアンチセンスヌクレオチドの場合は、患者成人1人当たり約0.0001-100mg、好ましくは約0.001-10mgが数日ないし数カ月に1回投与される量とすればよい。アンチセンスヌクレオチドを含むレトロウイルスベクターの場合は、レトロウイルス力価として、1日患者体重1kg当たり約1×10³pfu-1×10¹⁵pfuとなる量範囲から選ぶことができる。アンチセンスヌクレオチドを導入した細胞の場合は、1×10⁴細胞/body-1×10¹⁵細胞/body程度を投与すればよい。
【０１７２】
【実施例】
次に、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。しかし、本発明はこれらの実施例になんら限定されるものではない。
【０１７３】
実施例１ヒト組織サンプルからトータルRNAの調製
ヒトの正常な結腸組織117サンプル、潰瘍性大腸炎患者の結腸病変組織３サンプル、およびクローン病患者の結腸病変組織２サンプルから、それぞれ常法に従いトータル RNA を調製した。
【０１７４】
さらにヒトの右心房正常組織151サンプル、右心室正常組織140サンプル、左心房正常組織132サンプル、子宮筋層正常組織90サンプル、子宮頚部正常組織90サンプル、胸正常組織84サンプル、肺正常組織77サンプル、胸腺正常組織67サンプル、卵巣正常組織62サンプル、腎臓正常組織61サンプル、皮膚正常組織56サンプル、小腸正常組織48サンプル、直腸正常組織46サンプル、肝臓正常組織42サンプル、白血球正常組織37サンプル、胃正常組織37サンプル、子宮正常組織32サンプル、子宮内膜正常組織31サンプル、筋肉正常組織30サンプル、前立腺正常組織28サンプル、脾臓正常組織26サンプル、脂肪組織正常組織25サンプル、膵臓正常組織20サンプル、食道正常組織20サンプル、十二指腸正常組織17サンプル、甲状腺正常組織13サンプル、卵管正常組織13サンプル、リンパ節正常組織11サンプル、静脈正常組織8サンプル、軟組織正常組織7サンプル、前頭葉皮質正常組織7サンプル、海馬正常組織6サンプル、網正常組織5サンプル、左心室正常組織5サンプル、喉頭正常組織5サンプル、心臓正常組織5サンプル、側頭葉皮質正常組織5サンプル、骨正常組織5サンプル、副腎正常組織5サンプル、精嚢正常組織4サンプル、小脳正常組織4サンプルおよび膀胱正常組織4サンプルより、それぞれ常法に従いトータル RNA を調製した。
【０１７５】
実施例２ DNAチップ解析
実施例１に示したサンプルより調製したtotal RNAを用いて、DNAチップ解析を行った。なお、DNAチップ解析はAffymetrix社Gene Chip Human Genome U95セットを用いて行った。具体的には、解析は、(1) total RNAからcDNAの調製、(2) 該cDNAからラベル化cRNAの調製、(3) ラベル化cRNAのフラグメント化、(4) フラグメント化cRNAとプローブアレイとのハイブリダイズ、(5) プローブアレイの染色、(6) プローブアレイのスキャン、及び(7) 遺伝子発現解析、の手順で行った。
【０１７６】
(1) total RNAからcDNAの調製
実施例１で得られた各total RNA 10μgとT7-(dT)24プライマー(Amersham社製)100pmolを含む11μLの混合液を、70℃、10分間加熱した後、氷上で冷却した。冷却後、SuperScript Choice System for cDNA Synthesis(Gibco-BRL社製)に含まれる5×First Strand cDNA Buffer 4μL、該キットに含まれる0.1M DTT （dithiothreitol）2μL、該キットに含まれる10mM dNTP Mix 1μLを添加し、42℃で2分間加熱した。更に、該キットに含まれるSuper ScriptII RT 2μL(400U)を添加し、42℃で1時間加熱した後、氷上で冷却した。冷却後、DEPC処理水（ナカライテスク社製）滅菌蒸留水91μL、該キットに含まれる5×Second Strand Reaction Buffer 30μL、10mM dNTP Mix 3μL、該キットに含まれるE. coli DNA Ligase 1μL(10U)、該キットに含まれるE. coli DNA Polymerase I 4μL(40U)、該キットに含まれるE. coli RNaseH 1μL(2U)を添加し、16℃で2時間反応させた。次いで、該キットに含まれるT4 DNA Polymerase 2μL(10U)を加え、16℃で5分間反応させた後、0.5M EDTA 10μLを添加した。次いで、フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール溶液（ニッポンジーン社製）162μLを添加し、混合した。該混合液を、予め室温、14,000rpm、30秒間遠心分離しておいたPhase Lock Gel Light(エッペンドルフ社製)に移し、室温で14,000rpm、2分間遠心分離した後、145μLの水層をエッペンドルフチューブに移した。得られた溶液に、7.5M酢酸アンモニウム溶液72.5μL、エタノール362.5μLを加えて混合した後、4℃で14,000rpm、20分間遠心分離した。遠心分離後、上清を捨て、作製したcDNAを含むペレットを得た。その後、該ペレットに80%エタノール0.5mLを添加し、4℃で14,000rpm、5分間遠心分離した後、上清を捨てた。再度同様の操作を行った後、該ペレットを乾燥させ、DEPC処理水12μLに溶解した。以上の操作により実施例１で調製した各トータル RNAから、各cDNAを取得した。
【０１７７】
(2) cDNAからラベル化cRNAの調製
各cDNA溶液5μLに、DEPC処理水17μL、BioArray High Yield RNA Transcript Labeling Kit(ENZO社製)に含まれる10×HY Reaction Buffer 4μL、該キットに含まれる10×Biotin Labeled Ribonucleotides 4μL、該キットに含まれる10×DTT 4μL、該キットに含まれる10×RNase Inhibitor Mix 4μL、該キットに含まれる20×T7 RNA Polymerase 2μLを混合し、37℃で5時間反応させて、ラベル化cRNAを調製した。反応後、該反応液にDEPC処理水60μLを加えたのち、RNeasy Mini Kit（GIAGEN社製）を用いて添付プロトコールに従い、調製したラベル化cRNAを精製した。
【０１７８】
(3) ラベル化cRNAのフラグメント化
各ラベル化cRNA 20μgを含む溶液に、5×Fragmentation Buffer（200mMトリス−酢酸 pH8.1(Sigma社製)、 500mM酢酸カリウム(Sigma社製)、150mM酢酸マグネシウム(Sigma社製)）8μLを加えた反応液40μLを、94℃で35分間加熱した後、氷中に置いた。これによって、ラベル化cRNAをフラグメント化した。
【０１７９】
(4) フラグメント化cRNAとプローブアレイとのハイブリダイズ
各フラグメント化cRNA 40μLに、5nM Control Oligo B2（Amersham社製）4μL、100×Control cRNA Cocktail 4μL、Herring sperm DNA（Promega社製）40μg、Acetylated BSA（Gibco-BRL社製）200μg、2×MES Hybridization Buffer(200mM MES、2M [Na⁺], 40mM EDTA、0.02% Tween20 (Pierce社製)、pH6.5〜6.7) 200μL、及びDEPC処理水144μLを混合し、400μLのハイブリカクテルを得た。得られた各ハイブリカクテルを99℃で5分間加熱し、更に45℃で5分間加熱した。加熱後、室温で14,000rpm、5分間遠心分離し、ハイブリカクテル上清を得た。
【０１８０】
一方、1×MESハイブリダイゼーションバッファーで満たしたHuman genome U95プローブアレイ（Affymetrix社製）を、ハイブリオーブン内で、45℃、60rpmで10分間回転させた後、1×MESハイブリダイゼーションバッファーを除去してプローブアレイを調製した。上記で得られたハイブリカクテル上清200μLを該プローブアレイにそれぞれ添加し、ハイブリオーブン内で45℃、60rpmで16時間回転させ、フラグメント化cRNAとハイブリダイズしたプローブアレイを得た。
【０１８１】
(5) プローブアレイの染色
上記で得られたハイブリダイズ済みプローブアレイそれぞれからハイブリカクテルを回収除去した後、Non-Stringent Wash Buffer(6×SSPE(20×SSPE(ナカライテスク社製)を希釈)、0.01%Tween20、0.005%Antifoam0-30(Sigma社製))で満たした。次にNon-Stringent Wash BufferおよびStringent Wash Buffer(100mM MES、0.1M NaCl、0.01%Tween20)をセットしたGeneChip Fluidics Station 400(Affymetrix社製)の所定の位置にフラグメント化cRNAとハイブリダイズしたプローブアレイを装着した。その後染色プロトコールEuKGE-WS2に従って、１次染色液(10μg/mL Streptavidin Phycoerythrin (SAPE)(MolecμLar Probe社製)、2mg/mL Acetylated BSA、100mM MES、1M NaCl(Ambion社製)、0.05%Tween20、0.005%Antifoam0-30)、 2次染色液（100μg/mL Goat IgG (Sigma社製)、3μg/mL Biotinylated Anti-Streptavidin antibody (Vector Laboratories社製)、2mg/mL Acetylated BSA、100mM MES、1M NaCl、0.05%Tween20、0.005%Antifoam0-30）により染色した。
【０１８２】
(6) プローブアレイのスキャン、及び (7) 遺伝子発現量解析
染色した各プローブアレイをHP GeneArray Scanner(Affymetrix社製)に供し、染色パターンを読み取った。染色パターンをもとにGeneChip Workstation System(Affymetrix社製)によってプローブアレイ上の遺伝子の発現を解析した。次に、解析プロトコールに従ってNormalizationを行ったのち、各サンプルにおける各プローブ（各遺伝子）の発現量（average difference）を算出した。同一のプローブにつき、サンプルの種類ごとに遺伝子発現量の平均値を求め、さらに各サンプル種類間における発現量の変化率を求めた。
【０１８３】
実施例３発現変動解析
潰瘍性大腸炎患者およびクローン病患者の結腸病変組織にて発現増加している遺伝子を、以下のようにして選択した。
【０１８４】
実施例２で行ったDNAチップ解析による遺伝子発現の解析結果から、結腸正常組織に比べて潰瘍性大腸炎患者の結腸病変組織で発現が増加しているプローブセットのうち、最も変化率の大きいプローブから400番目までを選択した。また、結腸正常組織に比べてクローン病患者の結腸病変組織で発現が増加しているプローブセットについても変化率の大きいものから400番目までを選択した。両グループで共通に選抜したプローブにつき解析し、共通に発現増加するプローブとして142プローブを選択した。
【０１８５】
次にこれら142プローブの中から、より病態との関連性の高いプローブを選択する目的で、IBD病変関連組織（大腸を含む消化管）およびIBDの発症機構に関与する免疫系組織以外の組織において発現量の低いプローブを選択した。すなわち、これら142プローブについて、結腸正常組織を含む43種類の正常組織における発現量をDNAチップの結果より解析し、消化管もしくは免疫系組織以外の組織において発現量の低いプローブを選択した。次に、これら選択されたプローブの対応遺伝子を調べ、これらの遺伝子の中から、さらに薬剤ターゲットとなる機能を有する遺伝子を選別した。
その結果、GIPR遺伝子、GCSFR遺伝子、およびREG Iα遺伝子の、計3遺伝子が選択された。
【０１８６】
【表１】

【０１８７】
表中、Human U95プローブ名は Human Genome U95 Chip におけるプローブ名を示す。また表中 Acc Noは、GenBankデータベースにおけるアクセッション番号を示す。また表中、変動倍率は、Human Genome U95 Chipで解析した結腸正常組織の遺伝子発現量を１とした場合における潰瘍性大腸炎患者若しくはクローン病患者の結腸病変組織での遺伝子発現量を示す。また各遺伝子の塩基配列およびアミノ酸配列を示す後記配列表の配列番号も合わせて示す。
【０１８８】
選択された遺伝子の中には、既にIBDの治療薬開発のターゲットとなっているインターロイキン１β、マトリックスプロテアーゼ１、マトリックスプロテアーゼ９などが含まれており、上記の選抜方法で確かにIBD患者特異的に発現が増加し、かつ治療薬のターゲットとなる遺伝子が選抜されていることが明らかとなった。選択された遺伝子の中からこれら公知のターゲット遺伝子を除外したものが、表１に記載の3遺伝子である。
【０１８９】
以上のように、選別された前記3個の遺伝子は、正常な結腸組織と比較して IBD患者の結腸組織で特異的に発現上昇しており、また病態との関連性の高い遺伝子であった。従ってこれら3遺伝子およびその発現産物（タンパク質）は、IBDに関する疾患マーカーとして応用可能であると考えられた。また、これらの遺伝子またはその発現産物（タンパク質）を用いることによって、IBDを緩和、制御する治療薬の候補薬をスクリーニングすることが可能であると考えられた。
【０１９０】
実施例４ GIPR遺伝子、GCSFR遺伝子、および／またはREG Iα遺伝子発現制御剤のスクリーニング
【０１９１】
Caco-2細胞（ヒト結腸腺癌由来、ATTC株番号HTB-37、大日本製薬株式会社）、HT-29細胞（ヒト結腸腺癌由来、ATTC株番号HTB-38、大日本製薬株式会社）、またはCOLO 205 細胞（ヒト結腸腺癌由来、ATTC株番号CCL-222、大日本製薬株式会社）を、10% 不活性化牛胎児血清、2mMグルタミン、50IU/mlペニシリン、50mg/mlストレプトマイシン含有Dulbecco's Modified Eagle培地を用い、37℃、CO2濃度5%の条件下で培養する。計数したCaco-2細胞、HT-29細胞またはCOLO 205 細胞を24穴組織培養プレートに0.6-1.2x10⁵ cells/cm²で播種し、37℃、CO₂濃度5%で培養する。これらの細胞に対して刺激剤（ホルボール１２−ミリステート１３アセテート、サイトカイン（Interferonγ、Tumor necrosis factor-α、Interleukin-1、Interleukin-6等）あるいはButyrate）の存在下で被験物質含有溶液（100 μM、10 μM、および 1 μMの各濃度の被験物質を含む溶液）を添加する。ここで対照実験として、被験物質無添加の細胞についても同様の培養を行う（コントロール）。これらの各培養細胞より抽出したRNAを用いて実施例２に記載された方法で、GIPR遺伝子、GCSFR遺伝子、および／またはREG Iα遺伝子の発現量を調べる。その発現量からコントロールと比べて、GIPR遺伝子、GCSFR遺伝子、および／またはREG Iα遺伝子の発現量が10%、好ましくは30%、特に好ましくは50%以上変動している培養系に添加した被験物質を、IBDを緩和、制御（改善、治療）する候補化合物として選択する。
【０１９２】
実施例５ GCSFRの機能（活性）制御剤のスクリーニング
特開平６−１００５９３を参考に、GCSFRの機能制御剤のスクリーニングを実施することができる。すなわち、英国パターソン研究所(Paterson Institute)から入手可能である因子依存性細胞ライン、パターソン(Paterson)−Ｇ−ＣＳＦ（ＦＤＣＰ−Ｇ）をＧ−ＣＳＦの存在下に限界希釈法によりクローン化する。１００μｌのＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＣＳに入れた２．５×１０³ ＦＤＣＰ−Ｇクローン化細胞に、被験物質の存在下および非存在下、Ｇ−ＣＳＦを含有する等容量のＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＣＳを添加する。９６個のウエルを有する微量滴定板の各々のウエル中のＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＣＳの最終容量は２００μｌである。微量滴定板を調湿インキュベーター中で４日間５％ＣＯ2 中で３７℃でインキュベートする。ウエル１個当りに１．０μＣｉの滴定したチミジンを添加し、最後に６時間に亘ってインキュベートする。細胞をガラス繊維の濾紙上に採取し、放射能の濃度を液体シンチレーション計数によって測定する。Ｇ−ＣＳＦはアマシャム社(Amersham)から入手可能な組換え体のヒトＧ−ＣＳＦを用い、添加量は上記実験系被験化合物非存在下にて3Ｈ−チミジン組込みにおける５０％の最大増大を与える量とする。
被験物質のGCSFR活性制御率は、以下の式：
｜（被験物質非存在下での3H-チミジン取り込み量）−（被験物質存在下での3H-チミジン取り込み量）｜／（被験物質非存在下での3H-チミジン取り込み量）
で表される。
GCSFR活性制御率が10%、好ましくは30%、特に好ましくは50% 以上変動した系に添加していた被験物質を、IBDを緩和、制御（改善、治療）する候補化合物として選択する。
【０１９３】
実施例６ REG Iαの機能（活性）制御剤のスクリーニング
Zenilman, MEら、Gastroenterology, 110, 1208-1214, 1996およびGross, Jら、J Clin Invest, 76, 2115-2126, 1985の方法に従って、REG Iαを調製することができる。すなわち、ウシまたはヒト胎盤をホモジナイズし、硫酸アンモニウム画分を行い、最終段階70%飽和時の沈殿画分を溶解した後、酸性下における溶解、中性下における沈殿を繰り返し、最終的に、HPLC（phenyl-TSK カラム）、およびモノクローナル抗体を用いたウエスタンブロティングにて単一であることが確認できる程度に精製することができる。
RIN（膵β細胞）もしくはARIP （膵腺房細胞）を 1-2×10⁵ 個ウェルにプレートし Dulbecco's modified Ragle medium (DMEM) と 10% fetal calf serum で一晩培養する。ウェルを 1mL phosphate-buffer sarine で3回洗浄し、その後0.5-2μCi/mL [3H] thymidine (アマシャム社), DMEM と 1% fetal calf serum 及びReg Iαを添加し、被験物質の存在下及び非存在下にて30時間から72時間培養する。1 mLの氷冷phosphate-buffered saline で5回洗浄し、 1 mLの10% trichloroacetic acid と 10 mmol/L cold thymidine を加えて氷上でウェルに沈降させる。100% methanol で3回洗浄した後乾燥する。沈降物を 400 μL の0.5 N NaOH に溶解し 5 mLのAquasol を加えた後、シンチレーションカウンターでカウントすることによって、細胞分裂促進活性を測定することができる。Reg Iαの添加量は上記実験系被験化合物非存在下にて３H-チミジン組込みにおける50%の最大増大を与える量とする。
被験物質の細胞分裂促進活性の制御率は、以下の式：
｜（被験物質非存在下での3H-チミジン取り込み量）−（被験物質存在下での3H-チミジン取り込み量）｜／（被験物質非存在下での3H-チミジン取り込み量）
で表される。
細胞分裂促進活性の制御率が10%、好ましくは30%、特に好ましくは50% 以上変動した系に添加していた被験物質を、IBDを緩和、制御（改善、治療）する候補化合物として選択する。
【０１９４】
実施例８ GIPRの機能（活性）制御剤のスクリーニング
GIPのインスリン刺激活性に基づくスクリーニングは、特開平２０００-３４２１０９（GIP受容体遺伝子機能欠損動物）を参考に実施することができる。すなわち、バッチインキュベート法によるＧＩＰ刺激時の膵β細胞インスリン分泌能を測定する。雄の野生型マウス（12週齢）の膵臓よりラ氏島を単離し、被験物質存在下及び非存在下にて、8.3mMのグルコースおよび100nMのＧＩＰとともに３７℃、30分間インキュベートする。遠心分離により上清を採取し、ラットインスリン(ノボ社)を標準として、抗インスリン抗体を用いたラジオイムノアッセイにより、インスリン濃度を測定する。
被験物質のインシュリン分泌活性の制御率は、以下の式：
｜（被験物質非存在下でのインスリン分泌量）−（被験物質存在下でのインスリン分泌量）｜／（被験物質非存在下でのインスリン分泌量）
で表される。
インスリン分泌活性の制御率が10%、好ましくは30%、特に好ましくは50% 以上変動した系に添加していた被験物質を、IBDを緩和、制御（改善、治療）する候補化合物として選択する。
【０１９５】
実施例９ GIPRの機能（活性）制御剤のスクリーニング
GIPRのcAMP上昇活性に基づくスクリーニングは、特開平６−２３９８９５を参考に実施することができる。すなわち、ｐRc/CMV2発現ベクター（インビトロジェン）にGIPR遺伝子を連結したものを含有する安定な２９３セルラインを２４ウエル平板内にて全面成長するまで発育させる。
次いで、得られた細胞を、インキュベーション緩衝液［０．５mＭ１−メチル−３−イソブチルキサンチン及び１mｇ/ml ＢＳＡを含有するDulbecco's 改変 Eagle's 培地］で２回洗浄する。被験物質の存在下および非存在下、GIPを含有する緩衝液（０．５ml）中にて３７℃で約４５分間インキュベートする。溶液を除去した後、６０％エタノール０．５ml を加え、各ウエル中の細胞を細胞溶解する。試料１０μlを取り出し、減圧下に乾燥し、ｃＡＭＰレベルを測定する。細胞内ｃＡＭＰレベルの測定は、Ishihara et al., (1991) に記載されている操作によって、Amersham社から市販されているサイクリックＡＭＰ検定キット（カタログ番号ＴＲＫ.４３２)を使用して行う。GIP添加量は上記実験系被験化合物非存在下にて細胞内ｃＡＭＰレベルの５０％の最大増大を与える量とする。
被験物質のcAMP上昇活性の制御率は、以下の式：
｜（被験物質非存在下でのcAMP上昇活性）−（被験物質存在下でのcAMP上昇活性）｜／（被験物質非存在下でのcAMP上昇活性）
で表される。
cAMP上昇活性の制御率が10%、好ましくは30%、特に好ましくは50% 以上変動した系に添加していた被験物質を、IBDを緩和、制御（改善、治療）する候補化合物として選択する。
【０１９６】
【発明の効果】
本発明によって、IBD患者（潰瘍性大腸炎及びクローン病）の結腸病変組織において、結腸正常組織と比較して特異的に発現増大している遺伝子（GIPR遺伝子、GCSFR遺伝子、及びREG Iα遺伝子）が明らかになった。かかる遺伝子はIBDの遺伝子診断に用いられるマーカー遺伝子（プローブ、プライマー）として有用である。かかるマーカー遺伝子によればIBDであるかどうかを明らかにすることができ（診断精度が向上）、これによりより適切な治療を施すことが可能となる。すなわち、IBDの適切な治療のためのツールとして利用することができる。
【０１９７】
また、上記遺伝子の発現増加とIBDとの関連性から、該遺伝子の発現を制御する化合物は、IBDの治療薬として有用と考えられる。従って、これら遺伝子の発現の制御または変動、または当該遺伝子がコードするタンパク質の発現や機能(活性)の制御または変動を指標とすることによって、IBDの治療薬となり得る候補薬をスクリーニングし選別することが可能である。本発明は、このようなIBD治療薬の開発技術をも提供する。
【０１９８】
【配列表】

[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a disease marker useful for diagnosing inflammatory bowel disease (IBD). More specifically, the present invention relates to a disease marker that can be effectively used as a primer or a detection probe in diagnosis of IBD. The present invention also relates to a method for detecting (diagnosing) IBD using such a disease marker.
[0002]
Furthermore, the present invention relates to a method for screening a substance effective as an IBD ameliorating or therapeutic agent using the above-mentioned disease marker, and an IBD ameliorating or therapeutic agent comprising the above substance obtained as an active ingredient as an active ingredient. .
[0003]
[Prior art]
The intestine is an organ that digests and absorbs nutrients and water that are indispensable for vital activities of living organisms. On the other hand, it also has an immune defense function to eliminate foreign substances such as pathogens, and is an organ responsible for maintaining life by controlling conflicting properties in a well-balanced manner. However, it is known that when an abnormality occurs in these functional balances, the dynamic equilibrium state is broken and various intestinal diseases are caused. In particular, inflammatory bowel disease (abbreviated as IBD), for which the number of patients has been increasing in recent years, has not been able to obtain satisfactory therapeutic effects with 5-aminosalicylic acid preparations such as sulfasalazine and drug treatments such as steroids. Therefore, the condition is being treated by intestinal resection surgery, leukocyte removal and the like, and a better drug is needed.
[0004]
IBD is classified according to its pathology into ulcerative colitis (abbreviated as UC) and Crohn's disease (abbreviated as CD). In recent years, it has been known that protein preparations such as anti-TNF antibodies are effective as therapeutic agents for Crohn's disease. However, since it is an expensive drug, it is indicated only for steroid-resistant patients, and its effect on ulcerative colitis is weak, there is still no satisfactory medical situation at present.
In addition, individual patients respond differently to pharmacotherapy, and there are IBD patients who do not respond to pharmacotherapy with all currently used therapeutics. In some cases, interleukin-1 polymorphisms and NOD2 polymorphisms are considered to be disease-causing genes based on analysis of gene polymorphisms and disease susceptibility. It is becoming clear that there is a difference in the background.
[0005]
In recent medical practice, it has been desired to appropriately select a treatment method not only for IBD but also for individual patient's symptoms. In recent years, the necessity of improving the quality of life (QOL) in an aging society has been recognized, in particular, treatment that is appropriate for the symptoms of individual patients, rather than treatment that is common to all people Is strongly required. In order to perform such a so-called tailor-made treatment, a disease marker that accurately reflects the patient's symptoms and its cause (genetic background) for each disease is useful, and research aimed at searching for and developing such markers is vital. It is currently being carried out.
On the other hand, GIPR (Gastric Inhibitory Polypeptide Receptor, also known as glucose-dependent insulin-secreting polypeptide receptor) is a receptor of a polypeptide consisting of 42 amino acid residues: GIP, and is a kind of GPCR. The GIP is known to have a gastric acid and gastrin secretion inhibitory activity, an insulin stimulating activity, and the like (Non-Patent Document 1).
GCSFR (granulocyte colony stimulating factor receptor) is a receptor for a colony stimulating factor: G-CSF involved in blood cell proliferation and differentiation. The G-CSF plays an important role in the proliferation and differentiation of neutrophil granulocytes, and is known to be involved in controlling neutrophil concentration in blood and in activating mature neutrophils. (Non-Patent Document 2).
REG1α is a protein belonging to the calcium-dependent lectin family, and is known to have a mitogenic activity on pancreatic β cells (RIN) or pancreatic acinar cells (ARIP). (Non-Patent Document 3).
[0006]
[Non-patent document 1]
Yasuda et al., "Japan Clinical," Vol. 54, No. 4, p. 1078-1082
[Non-patent document 2]
Yoshimura et al., “Bio Science Terminology Library Cytokine and Growth Factor Revised Edition”, Yodosha, p. 62-65
[Non-Patent Document 3]
Zenilman, ME et al., "Gastroenterology" 1996, Vol. 110, p. 1208-1214
[0007]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a disease marker useful for diagnosis and treatment of IBD. More specifically, an object of the present invention is to provide a disease marker that specifically reflects IBD. Further, the present invention provides a method for detecting IBD (gene diagnosis method) using the disease marker, a method for screening a drug useful for improvement or treatment of the disease, and a drug useful for improvement or treatment of the disease. With the goal.
[0008]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have conducted intensive studies in order to solve the above-mentioned problems, and have found that the following genes that have not been clearly related to IBD: GIPR gene, GCSFR gene, and REG Iα gene It was found that the expression was significantly increased in colon lesion tissues of (ulcerative colitis and Crohn's disease) as compared with colon normal tissues (normal human colon tissues). Furthermore, they found that these genes were hardly expressed in the tissues other than the digestive tract tissue, which is an IBD-related tissue, and the immune system tissues involved in the mechanism of IBD pathogenesis.
[0009]
As described above, the present inventors have found that these GIPR gene, GCSFR gene, and REG Iα gene, and their expression products (proteins) are excellent in IBD, which is considered to be an autoimmune disease that damages the digestive tract. The knowledge that it is a disease marker was obtained. Furthermore, the finding that a screening system using the expression control of these genes, or the expression control or function (activity) control of a protein encoded by the gene as an index, is effective for preventing, ameliorating, or searching for a therapeutic agent for IBD. Got.
The present invention has been completed based on such findings.
[0010]
That is, the present invention is as follows:
(1) An IBD comprising a polynucleotide having at least 15 consecutive nucleotides and / or a polynucleotide complementary to the polynucleotide in the nucleotide sequence of the GIPR gene gene, the nucleotide sequence of the GCSFR gene, and the nucleotide sequence of the REG Iα gene. Disease markers,
(2) The disease marker according to (1), which is used as a probe or a primer in the detection of IBD.
(3) A method for detecting IBD, comprising the following steps (a), (b) and (c):
(A) binding RNA prepared from a biological sample of a subject or a complementary polynucleotide transcribed therefrom to the disease marker according to (1) or (2),
(B) measuring RNA from a biological sample bound to the disease marker or a complementary polynucleotide transcribed from the RNA, using the disease marker as an index,
(C) determining the presence of IBD based on the measurement result of (b),
(4) The determination of the presence of IBD in step (c) is performed using the measurement result obtained for the subject as an index, as compared with the measurement result obtained for a normal person, as an index of an increase in the amount of binding to the disease marker. The method for detecting IBD according to (3) above,
(5) an IBD disease marker containing an antibody that recognizes GIPR, GCSFR, or REG Iα;
(6) The disease marker according to (5), which is used as a probe in detecting IBD.
(7) A method for detecting IBD comprising the following steps (a), (b) and (c):
(A) binding a protein prepared from a biological sample of a subject to the disease marker according to (5) or (6),
(B) measuring a protein derived from a biological sample bound to the disease marker using the disease marker as an index,
(C) determining the presence of IBD based on the measurement result of (b),
(8) The determination of the presence of IBD in step (c) is performed by comparing the measurement results obtained for the subject with the measurement results obtained for the normal person using the increase in the amount of binding to the disease marker as an index. (7) The method for detecting an IBD according to the above (7),
(9) A method for screening a substance that regulates the expression of any of the GIPR gene, GCSFR gene, and REG Iα gene, comprising the following steps (a), (b), and (c):
(a) contacting a test substance with a cell capable of expressing any of the GIPR gene, GCSFR gene, and REG Iα gene,
(b) measuring the expression level of any of the GIPR gene, GCSFR gene, and REG Iα gene in the cells contacted with the test substance, and measuring the expression level of the corresponding gene in control cells not contacted with the test substance; The process of comparing with the quantity,
(c) selecting a test substance that changes the expression level of any of the GIPR gene, GCSFR gene, and REG Iα gene based on the comparison result of (b) above;
(10) A method for screening a substance that controls the expression of any of GIPR, GCSFR, and REG Iα, comprising the following steps (a), (b), and (c):
(a) contacting the test substance with GIPR, GCSFR, and cells capable of expressing any of REG Iα,
(b) The expression level of any of GIPR, GCSFR, and REG Iα in the cells contacted with the test substance is measured, and the expression level is compared with the expression level of the corresponding protein in control cells not contacted with the test substance. Process,
(c) selecting a test substance that changes the expression level of any of GIPR, GCSFR, and REG Iα based on the comparison result of (b),
(11) A method for screening a substance that controls the function or activity of GIPR, GCSFR or REG Iα, comprising the following steps (a), (b) and (c):
(a) contacting the test substance with GIPR, GCSFR, or REG Iα;
(b) measuring the function or activity of GIPR, GCSFR, or REG Iα caused by the step (a), and measuring the function or activity of GIPR, GCSFR, or REG Iα when the test substance is not brought into contact with the function or activity. Or a step of comparing with activity,
(c) selecting a test substance that causes a change in the function or activity of GIPR, GCSFR, or REG Iα based on the comparison result of (b) above;
[0011]
(12) The screening method according to (11), wherein the function or activity of GIPR is a GIP binding activity.
(13) The screening method according to (11), wherein the function or activity of GIPR is cAMP secretion promoting activity in the presence of GIP.
(14) The screening method according to (11), wherein the function or activity of GIPR is an insulin secretion promoting activity in cells capable of secreting insulin in the presence of GIP.
(15) The screening method according to (14), wherein the cell is a pancreatic tissue-derived cell,
[0012]
(16) the screening method according to (11), wherein the function or activity of GCSFR is G-CSF binding activity;
(17) the screening method according to (11), wherein the function or activity of GCSFR is a cell growth promoting activity of G-CSF-responsive cells in the presence of G-CSF;
(18) The screening method according to (17), wherein the G-CSF-responsive cells are granulocytes, Patterson-G-CSF cells, or mouse NFS60 cells,
[0013]
(19) The screening method according to (11), wherein the function or activity of REG Iα is a cell proliferation promoting activity of Reg Iα-responsive cells.
(20) The screening method according to (19), wherein the Reg Iα-responsive cells are pancreatic β cells (RIN) or pancreatic acinar cells (ARIP),
[0014]
(21) The screening method according to any one of (9) to (20), which is a method for searching for an active ingredient of an agent for improving or treating IBD.
(22) an IBD-improving or therapeutic agent comprising, as an active ingredient, a substance that controls the expression of any of the GIPR gene, the GCSFR gene, and the REG Iα gene;
(23) The agent for improving or treating IBD according to (22), wherein the substance that controls the expression of any of the GIPR gene, GCSFR gene, and REG Iα gene is obtained by the screening method according to (9). ,
(24) an agent for improving or treating IBD, comprising a substance that controls the expression level, function or activity of any of GIPR, GCSFR and REG Iα as an active ingredient;
(25) The substance according to (24), wherein the substance that controls the expression level, function or activity of any of GIPR, GCSFR, and REG Iα is obtained by the screening method according to any of (10) to (20). The ameliorating or therapeutic agent for IBD according to the above.
[0015]
As described above, according to the present invention, a disease marker for IBD, a detection system for the disease, a GIPR gene, a GCSFR gene, or a screening system for a substance that regulates the expression of a REG Iα gene, GIPR, GCSFR, or REG Iα A screening system for substances that regulate expression, function or activity, and an IBD improving and treating agent containing these substances as active ingredients are provided.
[0016]
As described above, in the present invention, the GIPR gene, the GCSFR gene, and the REG Iα gene are compared with normal colon tissue (normal colon tissue) in colon lesion tissues of IBD patients (ulcerative colitis and Crohn's disease). In normal tissues, these genes are almost exclusively expressed in the gastrointestinal tract tissue, which is an IBD disease-related tissue, and in organs other than the immune system tissues involved in the mechanism of IBD pathogenesis. It is based on the finding that they did not. Therefore, these genes and their expression products [protein, (poly) (oligo) peptide] can be effectively used for elucidation, diagnosis, prevention and treatment of IBD, and such use is useful in medicine and clinical science. Information and means can be obtained. Furthermore, detection of the expression of the above-mentioned gene or its expression product in an individual (living tissue), or detection of mutation of the gene or abnormal expression thereof can be effectively used for elucidation and diagnosis of IBD.
[0017]
In addition, these genes and their expression products and their derivatives (e.g., gene fragments, antibodies, etc.) are substances that control the expression of the GIPR, GCSFR, or REG Iα gene, and GIPR, GCSFR, or REG. It is useful for screening for a substance that regulates the expression, function or activity of Iα, and the substance obtained by the screening is effective as a preventive, ameliorating and therapeutic agent for IBD.
[0018]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Hereinafter, in the present specification, the abbreviations of amino acids, (poly) peptides, (poly) nucleotides and the like are referred to by the IUPAC-IUB [IUPAC-IUB Communication on Biological Nomenclature, Eur. J. Biochem., 138: 9 ( 1984)], "Guidelines for Preparation of Specifications Containing Base Sequences or Amino Acid Sequences" (edited by the Japan Patent Office), and conventional symbols in the art.
[0019]
In the present specification, the term "gene" or "DNA" is used to include not only double-stranded DNA but also single-stranded DNAs such as a sense strand and an antisense strand constituting the same. The length is not particularly limited. Therefore, in the present specification, a gene (DNA) means a double-stranded DNA including human genomic DNA and a single-stranded DNA including cDNA (positive strand) and a sequence having a sequence complementary to the positive strand unless otherwise specified. It includes a main-stranded DNA (complementary strand), and any of these fragments. The term “gene” or “DNA” includes not only “gene” or “DNA” represented by a specific base sequence (SEQ ID NOs: 1, 2, and 3), but also proteins encoded by these. “Genes” or “DNAs” that encode proteins having similar functional functions (eg, homologs (homologs and splice variants), variants and derivatives) are included. As the “gene” or “DNA” encoding such a homologue, mutant or derivative, specifically, the above-mentioned SEQ ID NO: 1 under stringent conditions described in (1-1) below , 2, and 3, a "gene" or "DNA" having a base sequence that hybridizes to the complementary sequence of any of the specific base sequences shown in Tables 1 to 3 can be mentioned.
[0020]
For example, a gene encoding a homolog of a human-derived protein can be exemplified by genes of other organisms such as mice and rats corresponding to the human gene encoding the protein, and these genes (homologs) are homologene (http: // /www.ncbi.nlm.nih.gov/HomoloGene/). Specifically, the specific human nucleotide sequence is subjected to BLAST (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877, 1993, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) to be matched ( (The highest score, the E-value is 0, and the Identity is 100%.) The accession number is input to UniGene (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/), and the obtained UniGene Cluster ID (number indicated by Hs.) Is input to HomoloGene. From the list showing the correlation of the gene homologue between the resulting other species gene and the human gene, the gene (homolog) corresponding to the human gene represented by the specific nucleotide sequence is a gene of another species such as mouse or rat. Can be selected.
The gene or DNA does not matter which functional region is used, and may include, for example, an expression control region, a coding region, an exon, or an intron.
[0021]
Therefore, when a term such as “GIPR gene” or “GIPR DNA” is used in the present specification, unless otherwise specified by the SEQ ID NO, the human GIPR gene (DNA) represented by the specific base sequence (SEQ ID NO: 1) or its cognate It is used for the purpose of including genes (DNA) coding for a body, a mutant, a derivative, and the like. Specifically, it includes the GIPR gene (GenBank Accession No. U39231) described in SEQ ID NO: 1, its mouse homolog, rat homolog, and the like.
[0022]
Further, in the present specification, when a term such as “GCSFR gene” or “DNA of GCSFR” is used, the human GCSFR gene (DNA) represented by the specific base sequence (SEQ ID NO: 2) or a cognate thereof, unless otherwise specified by SEQ ID NO: It is used for the purpose of including genes (DNA) coding for a body, a mutant, a derivative, and the like. Specifically, it includes the human GCSFR gene (GenBank Accession No. M38025) described in SEQ ID NO: 2, its mouse homolog, rat homolog and the like.
[0023]
Also, in the present specification, when terms such as “REG Iα gene” or “REG Iα DNA” are used, the human REG Iα gene (DNA) represented by the specific base sequence (SEQ ID NO: 3) unless otherwise specified by SEQ ID NO: And a gene (DNA) encoding a homologue, a mutant or a derivative thereof. Specifically, it includes the human REG Iα gene (GenBank Accession No. M18963) described in SEQ ID NO: 3, its mouse / rat homologue, and the like.
[0024]
As used herein, the term "polynucleotide" is used to include both RNA and DNA. Note that the DNA includes any of cDNA, genomic DNA, and synthetic DNA. The above-mentioned RNA includes all of total RNA, mRNA, rRNA, and synthetic RNA.
[0025]
As used herein, “protein” or “(poly) peptide” includes not only “protein” or “(poly) peptide” represented by a specific amino acid sequence (SEQ ID NO: 4, 5, or 6) but also these Homologues (homologs and splice variants), variants, derivatives, mature forms, amino acid modifications, and the like are included as long as the biological functions are equivalent. Here, examples of homologues include proteins of other species such as mouse and rat corresponding to human proteins, and these were identified by HomoloGene (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/HomoloGene/). It can be identified a priori from the nucleotide sequence of the gene. Variants also include naturally occurring allelic variants, non-naturally occurring variants, and variants having amino acid sequences altered by artificial deletion, substitution, addition and insertion. . In addition, examples of the mutant include those that are at least 70%, preferably 80%, more preferably 95%, and still more preferably 97% homologous to a protein or (poly) peptide having no mutation. Amino acid modifications include naturally occurring amino acids and non-naturally occurring amino acids, and specifically include phosphorylated amino acids.
[0026]
Therefore, when using the term “GIPR protein” or simply “GIPR” in the present specification, unless otherwise specified by the SEQ ID NO, the human GIPR represented by the specific amino acid sequence (SEQ ID NO: 4) and homologues, variants and derivatives thereof , Mature forms and modified amino acids. Specifically, human GIPR having the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 4 (GenBank Accession No. U39231), a mouse homolog thereof, a rat homolog thereof, and the like are included.
[0027]
In the present specification, when terms such as “GCSFR protein” or simply “GCSFR” are used, unless otherwise specified by SEQ ID NO: human GCSFR represented by the specific amino acid sequence (SEQ ID NO: 5) and homologs, variants, and derivatives thereof , Mature forms and modified amino acids. Specifically, human GCSFR having the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 5 (GenBank Accession No. M38025), its mouse homolog, rat homolog and the like are included.
[0028]
In the present specification, when terms such as “REG Iα protein” or simply “REG Iα” are also used, unless otherwise specified by the SEQ ID NO, human REG Iα represented by the specific amino acid sequence (SEQ ID NO: 6) or a homolog thereof, It is used to encompass mutants, derivatives, matures, amino acid modifications and the like. Specifically, human REG Iα having the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 6 (GenBank Accession No. M18963), its mouse homolog, rat homolog and the like are included.
[0029]
As used herein, the term `` antibody '' includes polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, chimeric antibodies, single-chain antibodies, or the above-mentioned antibodies having antigen-binding properties such as Fab fragments and fragments generated by Fab expression libraries. Some are included.
[0030]
“IBD” in this specification is an abbreviation for inflammatory bowel disease, and is called inflammatory bowel disease in Japan. It is classified into ulcerative colitis (abbreviated as UC) and Crohn's disease (abbreviated as Crohn's disease: CD) based on the condition.
[0031]
Further, as used herein, the term "disease marker" refers to the presence or absence of IBD, the degree of morbidity or the degree of improvement or the degree of improvement, and the screening of candidate substances useful for the prevention, amelioration or treatment of IBD. That are used directly or indirectly to do so. This includes (poly) (oligo) nucleotides or antibodies capable of specifically recognizing and binding to genes or proteins whose expression is fluctuated in vivo in the context of IBD, especially in colon tissue. Is done. Based on the above properties, these (poly) (oligo) nucleotides and antibodies are used as probes for detecting the above genes and proteins expressed in vivo, in tissues and cells, and (oligo) nucleotides are used in vivo. Can be effectively used as a primer for amplifying the above gene expressed in the above.
[0032]
Further, the term "living tissue" to be diagnosed in the present specification refers to a tissue in which the expression of the GIPR gene, GCSFR gene, or REG Iα gene of the present invention increases with IBD. Specifically, it refers to the large intestine tissue and its surrounding tissue.
[0033]
Hereinafter, these GIPR gene, GCSFR gene, and REG Iα gene (hereinafter, these genes may be collectively referred to as “gene of the present invention”), and their expression products (GIPR, GCSFR, and REG Iα; Are sometimes referred to as the protein of the present invention), and their derivatives.
[0034]
(1) IBD disease markers and their applications
(1-1) Polynucleotide
The GIPR gene in the present invention is a known gene also called a gastric inhibitory polypeptide receptor gene or a glucose-dependent insulinotropic polypeptide receptor gene. . For example, as a human-derived GIPR gene, the polynucleotide shown in SEQ ID NO: 1 is known (GenBank Accession No. U39231), and its obtaining method is described in Usdin, TB et al., Endocrinology, 133, 2861-2870, 1993. As is well known.
[0035]
The GCSFR gene in the present invention is a known gene also called a colony-stimulating factor 3 receptor gene or a granulocyte colony-stimulating factor receptor gene. For example, as a human-derived GCSFR gene, the polynucleotide shown in SEQ ID NO: 2 is known (GenBank Accession No. M38025), and the method for obtaining it is also described in Fukunaga, R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87 , 8702-8706, 1990.
[0036]
In the present invention, the REG Iα gene may be derived from regenerated pancreatic islet-derived 1-alpha, pancreatic stone protein, or pancreatic thread protein. It is a known gene called. For example, as a human-derived REG Iα gene, the polynucleotide shown in SEQ ID NO: 3 is known (GenBank Accession No. M18963), and its obtaining method is also described in Terazono, K. et al., J. Biol. Chem., 263, Known as described in 2111-2114, 1988.
[0037]
As described above, the present invention specifically increases the expression of the GIPR gene, GCSFR gene, and REG Iα gene in the large intestine (colon) tissue of a patient suffering from IBD compared to normal large intestine (colon) tissue. Starting from the finding that the presence or absence of these genes is detected, the presence or absence of the above-mentioned IBD can be specifically detected, and the diagnosis of the disease can be performed accurately. It is based on the knowledge that it can be done.
[0038]
Therefore, the polynucleotide can be used as a tool (disease marker) for diagnosing whether or not the subject is suffering from IBD by detecting the presence or absence or the degree of expression of the gene in the subject. ) Is useful.
In addition, the above-described polynucleotide detects fluctuations in the expression of the GIPR gene, GCSFR gene, or REG Iα gene in screening for a candidate substance useful for prevention, improvement or treatment of IBD as described in (3-1) below. It is also useful as a screening tool (disease marker).
[0039]
The disease marker of the present invention comprises a polynucleotide having at least 15 consecutive bases and / or a polynucleotide complementary thereto in the nucleotide sequence of the GIPR gene, GCSFR gene, or REG Iα gene. is there.
[0040]
Specifically, the disease marker of the present invention is the nucleotide sequence of the GIPR gene described in SEQ ID NO: 1, the nucleotide sequence of the GCSFR gene described in SEQ ID NO: 2, or the nucleotide sequence of the REGIα gene described in SEQ ID NO: 3, Examples include a polynucleotide consisting of a polynucleotide having at least 15 consecutive bases and / or a polynucleotide complementary thereto.
[0041]
Here, the complementary polynucleotide (complementary strand, reverse strand) refers to the full-length sequence of a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of the GIPR gene, GCSFR gene, or REG Iα gene, or at least 15 nucleotides continuous in the nucleotide sequence. Has a base complementary relationship to its partial sequence having a base sequence of (for convenience, these are also referred to as “positive strands”) based on base pairs such as A: T and G: C. It means a polynucleotide. However, such a complementary strand is not limited to a case where it forms a completely complementary sequence with the base sequence of the target positive chain, and has a complementary relationship that allows hybridization with the target positive strand under stringent conditions. You may have. Note that the stringent condition here is to bind the complex or probe as taught in Berger and Kimmel (1987, Guide to Molecular Cloning Techniques Methods in Enzymology, Vol. 152, Academic Press, San Diego CA). It can be determined based on the melting temperature (Tm) of the nucleic acid. For example, as washing conditions after hybridization, conditions of about “1 × SSC, 0.1% SDS, 37 ° C.” can be usually mentioned. The complementary strand preferably maintains a hybridized state with the target positive strand even when washed under such conditions. Although not particularly limited, the more stringent hybridization conditions are about 0.5 × SSC, 0.1% SDS, 42 ° C., and the more stringent hybridization conditions are about 0.1 × SSC, 0.1% SDS, 65 ° C. Can be. Specifically, as such a complementary strand, a strand consisting of a nucleotide sequence completely complementary to the nucleotide sequence of the target positive strand, and at least 90%, and preferably 95% homology with the strand. A chain comprising a base sequence can be exemplified.
[0042]
Here, the polynucleotide on the positive strand side includes not only those having the nucleotide sequence of the GIPR gene, GCSFR gene, or REG Iα gene, or a partial sequence thereof, but also those complementary to the nucleotide sequence of the complementary strand. A strand consisting of a base sequence having the following relationship can be included.
[0043]
Further, each of the above-described positive-chain polynucleotide and complementary-strand (reverse-strand) polynucleotide may be used as a disease marker in a single-stranded form, or may be used as a disease marker in a double-stranded form.
[0044]
The IBD disease marker of the present invention may be, specifically, a polynucleotide consisting of the base sequence (full length sequence) of the GIPR gene, GCSFR gene, or REG Iα gene, or a polynucleotide consisting of its complementary sequence It may be. Further, a polynucleotide comprising a partial sequence of the above-described full-length sequence or its complementary sequence may be used as long as it selectively (specifically) recognizes the gene of the present invention or a polynucleotide derived from the gene. In this case, examples of the partial sequence include a polynucleotide having at least 15 consecutive base lengths arbitrarily selected from the base sequence of the above full-length sequence or its complementary sequence.
[0045]
Here, “selectively (specifically) recognizes” means that, for example, in a Northern blot method, a GIPR gene, a GCSFR gene, a REG Iα gene, or a polynucleotide derived therefrom can be specifically detected; The RT-PCR method also means that the GIPR gene, GCSFR gene, REG Iα gene, or a polynucleotide derived therefrom is specifically produced, but the present invention is not limited to this. What is necessary is just to be able to judge that the product or product is derived from these genes.
[0046]
The disease marker of the present invention, for example, based on the nucleotide sequence of the GIPR gene described in SEQ ID NO: 1, the nucleotide sequence of the GCSFR gene described in SEQ ID NO: 2, or the nucleotide sequence of the REG Iα gene described in SEQ ID NO: 3, For example, it can be designed using primer 3 (http://www.genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3.cgi) or Vector NTI (manufactured by Infomax). Specifically, the nucleotide sequence of the gene of the present invention obtained by applying software of primer 3 or vector NTI, a candidate sequence of a primer or a probe, or a sequence containing at least a part of the sequence may be used as a primer or a probe. it can.
[0047]
The disease marker of the present invention may be any as long as it has a length of at least 15 consecutive nucleotides as described above.Specifically, depending on the use of the marker, the length can be appropriately selected and set. .
[0048]
(1-2) polynucleotide as a probe or primer
In the present invention, the detection (diagnosis) of IBD is performed by evaluating the presence or absence or the expression level (expression level) of any gene selected from the GIPR gene, GCSFR gene, and REG Iα gene in the living tissue of the subject, particularly the colon tissue. It is done by doing. In this case, the disease marker of the present invention is used as a primer for specifically recognizing and amplifying RNA generated by expression of the gene or a polynucleotide derived therefrom, or specifically as a primer for the RNA or a polynucleotide derived therefrom. The probe can be used as a probe for detection.
[0049]
When the disease marker of the present invention is used as a primer in the detection of IBD (gene diagnosis), a marker having a base length of usually 15 bp to 100 bp, preferably 15 bp to 50 bp, more preferably 15 bp to 35 bp can be exemplified. When used as a detection probe, those having a base length of usually 15 bp to the entire sequence, preferably 15 bp to 1 kb, more preferably 100 bp to 1 kb can be exemplified.
[0050]
Disease markers of the present invention, Northern blot, RT-PCR,in situIn a known method such as a hybridization method for specifically detecting a specific gene, it can be used as a primer or a probe according to a conventional method. By the use, the presence or absence or the expression level (expression amount) of the GIPR gene, GCSFR gene, or REG Iα gene in IBD can be evaluated.
Depending on the type of detection method to be used, a part of the large intestine tissue of the subject may be collected by biopsy or the like, or may be collected from intestinal lavage fluid or the like, and total RNA prepared therefrom in accordance with a conventional method may be used. Alternatively, various polynucleotides prepared based on the RNA may be used.
[0051]
Further, the gene expression level of the gene of the present invention in a living tissue can be detected or quantified using a DNA chip. In this case, the disease marker of the present invention can be used as a probe for the DNA chip (for example, in the case of Gene Chip Human Genome U95 A, B, C, D, E of Affymetrix Co. Used as nucleotide probes). Such a DNA chip is hybridized with a labeled DNA or RNA prepared based on RNA collected from a living tissue, and a complex of the probe (the disease marker of the present invention) formed by the hybridization with a labeled DNA or RNA is obtained. By detecting the body using the label of the labeled DNA or RNA as an indicator, the presence or absence or the expression level (expression amount) of the gene of the present invention in living tissue can be evaluated.
[0052]
The DNA chip may include one or more disease markers of the present invention that can bind to any of the genes of the present invention. By using a DNA chip containing a plurality of disease markers, it is possible to simultaneously evaluate the presence or absence or the expression level of a plurality of genes in one biological sample.
[0053]
The disease marker of the present invention is useful for diagnosis and detection of IBD (diagnosis of presence / absence and degree of disease). Specifically, the diagnosis of IBD using the disease marker determines the difference in the gene expression level of any one of the GIPR gene, GCSFR gene, and REG Iα gene in the colon tissue of the subject and the colon tissue of a normal subject Can be done by doing In this case, the difference in the gene expression level includes not only the difference between the presence / absence of expression but also the difference in the expression level between the large intestine tissue of the subject and the large intestine tissue of the normal person. The case where the number is twice or more, preferably three times or more is included. Specifically, since the GIPR gene, GCSFR gene, and REG Iα gene show expression induction in IBD, they are expressed in the large intestine tissue of the subject, and the expression amount is twice as large as the expression amount in the large intestine tissue of normal subjects. If the number is at least three times, preferably at least three times, the subject is suspected of having IBD.
[0054]
(1-3) Antibody
The present invention provides, as IBD disease markers, expression products (proteins) of the GIPR gene (this is also referred to as “GIPR”) and expression products (proteins) of the GCSFR gene (this is referred to as “GIPR” in the present specification). GCSFR), or an expression product (protein) of the REG Iα gene (this is also referred to as “REG Iα” in the present specification).
[0055]
Here, GIPR is a protein encoded by the polynucleotide shown in SEQ ID NO: 1, GCSFR is a protein encoded by the polynucleotide shown in SEQ ID NO: 2, REG Iα is the polynucleotide shown in SEQ ID NO: 3 Mention may be made of the encoded protein.
[0056]
Incidentally, as a specific embodiment of the protein encoded by the polynucleotide shown in SEQ ID NO: 1, a protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4, the specific protein encoded by the polynucleotide shown in SEQ ID NO: 2 As an embodiment, a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 is exemplified, and as a specific embodiment of the protein encoded by the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 3, a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 is exemplified. Can be.
[0057]
The protein shown in SEQ ID NO: 4 is a known protein encoded by a human-derived GIPR gene, and its obtaining method is also described in the literature (Usdin, TB et al., Endocrinology, 133, 2861-2870, 1993). It is known as such.
[0058]
The protein shown in SEQ ID NO: 5 is a known protein encoded by a human-derived GCSFR gene, and its obtaining method is also described in the literature (Fukunaga, R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87, 8702-8706). , 1990).
[0059]
The protein shown in SEQ ID NO: 6 is a known protein encoded by the human-derived REG Iα gene, and its obtaining method is also described in the literature (Terazono, K. et al., J. Biol. Chem., 263, 2111-2114, 1988).
[0060]
As described above, the present invention specifically increases the expression of the GIPR gene, GCSFR gene, and REG Iα gene in the large intestine (colon) tissue of a patient suffering from IBD compared to normal large intestine (colon) tissue. Starting from the knowledge that the IBD is present, the presence or absence and the extent of the above IBD can be specifically detected by detecting the presence or absence of the expression products (proteins) of these genes and the degree of their expression, This is based on the idea that diagnosis can be performed accurately.
The antibody is therefore a tool (disease marker) capable of diagnosing whether or not the subject has IBD or the degree of the disease by detecting the presence or absence or the degree of expression of the protein in the subject. Useful as
In addition, the antibody detects a change in expression of any of GIPR, GCSFR, and REG Iα in screening for a candidate substance useful for preventing, ameliorating, or treating IBD as described in (3-2) below. It is also useful as a screening tool (disease marker).
[0061]
The form of the antibody of the present invention is not particularly limited, and may be a polyclonal antibody using any one of GIPR, GCSFR and REG Iα as an immunogen, or a monoclonal antibody thereof. Antibodies of the present invention also include antibodies having antigen-binding properties to a polypeptide consisting of at least 8 amino acids, preferably 15 amino acids, more preferably 20 amino acids, which are at least continuous among the amino acid sequences of the protein of the present invention. .
[0062]
Methods for producing these antibodies are already well known, and the antibodies of the present invention can also be produced according to these conventional methods (Current Protocol in Molecular Biology, Chapter 11.12 to 11.13 (2000)). Specifically, when the antibody of the present invention is a polyclonal antibody, using GIPR, GCSFR, or REG Iα expressed and purified in E. coli or the like according to a conventional method, or a partial amino acid sequence of the protein of the present invention according to a conventional method Can be synthesized and immunized to a non-human animal such as a rabbit, and can be obtained from serum of the immunized animal according to a conventional method. On the other hand, in the case of a monoclonal antibody, GIPR, GCSFR or REG Iα expressed and purified in E. coli or the like according to a conventional method, or an oligopeptide having a partial amino acid sequence of these proteins is immunized to a non-human animal such as a mouse. (Supra), and can be obtained from hybridoma cells prepared by cell fusion of spleen cells and myeloma cells (Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley and Sons.
Section 11.4-11.11).
[0063]
GIPR, GCSFR, or REG Iα used as an immunizing antigen for the production of an antibody can be obtained by DNA cloning, construction of each plasmid, transfer to a host, based on the sequence information (SEQ ID NOS: 1 to 3) of the gene provided by the present invention. , Culturing a transformant, and recovering a protein from the culture. These operations are carried out according to methods known to those skilled in the art or methods described in the literature (Molecular Cloning, T. Maniatis et al., CSH Laboratory (1983), DNA Cloning, DM. Glover, IRL PRESS (1985)) and the like. Can be done.
[0064]
Specifically, a recombinant DNA (expression vector) capable of expressing a gene encoding GIPR, GCSFR, or REG Iα in a desired host cell is prepared, and this is introduced into a host cell, transformed, and transformed. By culturing the body and collecting the target protein from the resulting culture, a protein as an immunizing antigen for producing the antibody of the present invention can be obtained. These partial peptides of GIPR, GCSFR, or REG Iα can also be produced by a general chemical synthesis method (peptide synthesis) according to the amino acid sequence information (SEQ ID NOs: 4 to 6) provided by the present invention. .
[0065]
The GIPR, GCSFR, or REG of the present invention includes not only proteins related to the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 4, 5, or 6, but also homologs thereof. The homologue includes an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by any one of the above SEQ ID NOs: 4 to 6, and immunizes with the original protein before modification. Proteins having chemically equivalent activities can be mentioned.
[0066]
Here, the protein having the same immunological activity includes a protein capable of inducing a specific immune response in an appropriate animal or its cells and capable of specifically binding to an antibody against GIPR, GCSFR, or REG Iα. Can be mentioned.
[0067]
The number and location of amino acid mutations in the protein are not limited as long as the immunological activity is maintained. Indices for determining how many amino acid residues need to be substituted, inserted or deleted without losing immunological activity can be obtained by computer programs well known to those skilled in the art, for example, DNA Star software. Can be found using For example, the number of mutations is typically within 10% of all amino acids, preferably within 5% of all amino acids, and more preferably within 1% of all amino acids. The amino acid to be substituted is not particularly limited as long as the protein obtained after the substitution retains an immunological activity equivalent to GIPR, GCSFR, or REG Iα, but from the viewpoint of retaining the structure of the protein, It is preferable that the amino acid has properties similar to the amino acid before substitution, such as polarity, charge, solubility, hydrophobicity, hydrophilicity and amphiphilicity. For example, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Met, Phe and Trp are amino acids classified as non-polar amino acids, and Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn and Gln are non-charged amino acids. Asp and Glu are amino acids classified as acidic amino acids, and Lys, Arg, and His are amino acids classified as basic amino acids. Therefore, amino acids belonging to the same group can be appropriately selected using these as indices.
[0068]
The antibody of the present invention may be prepared using an oligopeptide having a partial amino acid sequence of GIPR, GCSFR, or REG Iα. The oligo (poly) peptide used for the production of such antibodies does not need to have functional biological activity, but preferably has immunogenic properties similar to GIPR, GCSFR, or REG Iα. . An oligo (poly) peptide preferably having this immunogenic property and comprising at least 8 amino acids, preferably 15 amino acids, more preferably 20 amino acids in the amino acid sequence of GIPR, GCSFR or REG Iα is exemplified. it can.
[0069]
The production of antibodies against such oligo (poly) peptides can also be carried out by increasing the immunological response using various adjuvants depending on the host. Such adjuvants include, but are not limited to, Freund's adjuvant, mineral gels such as aluminum hydroxide, and surfaces such as lysolecithin, pluronic polyols, polyanions, peptides, oil emulsions, keyhole limpet hemocyanin and dinitrophenol. Active substances include human adjuvants such as BCG (bacilli Calmette-Guerin) and Corynebacterium parvum.
[0070]
Since the antibody of the present invention has a property of specifically binding to GIPR, GCSFR, or REG Iα, it is possible to specifically detect the protein expressed in the tissue of the subject by using the antibody. it can. That is, the antibody is useful as a probe for detecting the presence or absence of GIPR, GCSFR, or REG Iα protein expression in a subject's tissue.
[0071]
Specifically, a part of a patient's large intestine tissue is collected by biopsy or the like, or collected from an intestinal washing solution or the like, and a protein is prepared therefrom according to a conventional method, for example, by a known detection method such as a Western blotting method or an ELISA method. GIPR, GCSFR, or REG Iα can be detected by using the above antibody as a probe in a conventional manner.
[0072]
When diagnosing IBD, the difference between the amount of at least one of GIPR, GCSFR, and REG Iα in the large intestine tissue of the subject and the amount of these proteins in the normal large intestine tissue may be determined. In this case, the difference in protein amount includes the presence / absence of protein or the case where the difference in protein amount is twice or more, preferably three times or more. Specifically, since GIPR, GCSFR, and REG Iα show expression induction in IBD, the expression product of the gene (GIPR, GCSFR, REG Iα) is present in the colon tissue of the subject, and If it is determined that the amount of the expression product is at least twice, preferably at least three times as large as the amount of the expression product in the large intestine tissue, IBD is suspected.
[0073]
(2) IBD detection method (diagnosis method)
The present invention provides a method for detecting (diagnosing) IBD using the above-mentioned disease marker of the present invention.
[0074]
Specifically, the detection method (diagnosis method) of the present invention comprises collecting a part of the large intestine tissue of a subject by biopsy or the like, or recovering it from an intestinal lavage fluid or the like, and including a GIPR gene related to IBD contained therein, Detect gene expression levels of GCSFR gene and REG Iα gene, and the amount (level) of proteins (GIPR, GCSFR, REG Iα) derived from these genes, and measure the expression level or the protein amount Thus, the presence or absence or the degree of IBD is diagnosed. In addition, the detection (diagnosis) method of the present invention can also detect (diagnose) the presence or absence or the degree of improvement of the disease, for example, when a therapeutic agent is administered to the IBD patient to improve the disease.
[0075]
The detection method of the present invention comprises the following steps (a), (b) and (c):
(A) contacting a biological sample of the subject with the disease marker of the present invention,
(b) measuring the gene expression level of any of the GIPR gene, the GCSFR gene, and the REG Iα gene, or the amount of any of the GIPR, GCSFR, and REG Iα proteins in the biological sample, using the disease marker as an index; ,
(c) a step of judging the presence of IBD based on the result of (b).
[0076]
Examples of the biological sample used herein include a sample prepared from a biological tissue (a large intestine tissue and its surrounding tissue) of a subject. Specific examples include an RNA-containing sample prepared from the tissue, a sample containing a polynucleotide further prepared from the sample, and a sample containing a protein prepared from the tissue. Such a sample containing RNA, polynucleotide or protein can be prepared by collecting a part of the large intestine tissue of a subject using a biopsy or the like, or collecting it from an intestinal washing solution or the like, and then preparing the same according to a conventional method.
The diagnostic method of the present invention is specifically carried out as follows according to the type of a biological sample used as a measurement target.
[0077]
(2-1) When using RNA as a biological sample to be measured
When using RNA as a measurement target, the detection of IBD can be specifically performed by a method including the following steps (a), (b), and (c):
(a) RNA prepared from a biological sample of a subject or a complementary polynucleotide transcribed therefrom, and the disease marker of the present invention (GIPR gene, GCSFR gene, or at least 15 consecutive nucleotides in the nucleotide sequence of REG Iα gene Having a polynucleotide and / or a polynucleotide complementary to the polynucleotide).
(b) measuring the RNA from a biological sample bound to the disease marker or a complementary polynucleotide transcribed from the RNA, using the disease marker as an index,
(c) a step of judging the presence of IBD based on the measurement result of the above (b).
[0078]
When RNA is used as the measurement object, the detection method (diagnosis method) of the present invention is performed by detecting and measuring the expression level of any of the GIPR gene, GCSFR gene, and REG Iα gene in the RNA. Will be implemented. Specifically, the disease marker (polynucleotide having at least 15 contiguous bases in the nucleotide sequence of the GIPR gene, GCSFR gene, or REGIα gene and / or its complementary polynucleotide) comprising the above-mentioned polynucleotide is specifically described. Using as a primer or a probe, Northern blotting, RT-PCR, DNA chip analysis,in situIt can be carried out by performing a known method such as a hybridization analysis method.
[0079]
When using the Northern blot method, by using the disease marker of the present invention as a probe, the presence or absence and expression level of any of the GIPR gene, GCSFR gene, and REG Iα gene in RNA is detected and measured. can do. Specifically, the disease marker (complementary strand) of the present invention is³²P,³³P, etc .: After labeling with RI) or a fluorescent substance, and hybridizing it with RNA derived from the biological tissue of the subject, which has been transferred to a nylon membrane or the like according to a conventional method, the disease marker (DNA) and RNA formed An example of a method for detecting and measuring a signal derived from a disease marker label (RI or a fluorescent substance) with a radiation detector (BAS-1800II, manufactured by Fuji Film Co., Ltd.) or a fluorescence detector with a double strand of it can. Further, using an AlkPhos Direct Labeling and Detection System (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech), a disease marker (probe DNA) is labeled according to the protocol, and the disease marker is hybridized with RNA derived from a living tissue of a subject. A method of detecting and measuring a signal derived from a substance using a multi-bioimager STORM860 (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech) can also be used.
[0080]
When using the RT-PCR method, by using the disease marker of the present invention as a primer, the presence or absence or expression level of any of the GIPR gene, GCSFR gene, and REG Iα gene in RNA is detected and measured. can do. Specifically, a cDNA is prepared from RNA derived from a living tissue of a subject according to a conventional method, and the target GIPR gene, GCSFR gene, or REG Iα gene region can be amplified using the cDNA as a template. A pair of primers prepared from the marker (positive strand binding to the above-mentioned cDNA (-strand) and reverse strand binding to the + strand) were hybridized with this, and PCR was carried out according to a conventional method. A method for detecting strand DNA can be exemplified. The amplified double-stranded DNA was detected by a method for detecting labeled double-stranded DNA produced by performing the PCR using primers previously labeled with RI or a fluorescent substance. A method in which double-stranded DNA is transferred to a nylon membrane or the like according to a conventional method, and a labeled disease marker is used as a probe, hybridized with the probe, and detected can be used. The generated labeled double-stranded DNA product can be measured using an Agilent 2100 bioanalyzer (manufactured by Yokogawa Analytical Systems). Further, an RT-PCR reaction solution is prepared according to the protocol using SYBR Green RT-PCR Reagents (manufactured by Applied Biosystems) and reacted with the ABI PRISM 7700 Sequence Detection System (manufactured by Applied Biosystems) to detect the reaction product. You can also.
[0081]
When DNA chip analysis is used, a DNA chip on which the disease marker of the present invention is attached as a DNA probe (single- or double-stranded) is prepared, and RNA is derived from the biological tissue of the subject by a conventional method. Examples of the method include a method of hybridizing with the prepared cRNA and detecting a double-stranded DNA and cRNA formed by binding to a labeled probe prepared from the disease marker of the present invention. Further, a DNA chip capable of detecting and measuring the gene expression level of any of the GIPR gene, GCSFR gene, and REG Iα gene can also be used as the DNA chip. Examples of a DNA chip capable of detecting and measuring the expression level of such a gene include Gene Chip Human Genome U95 A, B, C, D and E of Affymetrix. The detection and measurement of the gene expression level of any of the GIPR gene, GCSFR gene, and REG Iα gene in subject RNA using such a DNA chip will be described in detail in Examples.
[0082]
(2-2) When using protein as a biological sample to be measured
When a protein is used as the measurement target, the IBD detection method (diagnosis method) of the present invention is performed by detecting any of GIPR, GCSFR, and REG Iα in a biological sample and measuring the amount thereof. You. Specifically, it can be carried out by a method comprising the following steps (a), (b) and (c):
(a) binding a protein prepared from a biological sample of a subject to a disease marker of the present invention relating to an antibody (GIPR, GCSFR, or an antibody that recognizes REG Iα);
(b) measuring a protein derived from a biological sample bound to the disease marker using the disease marker as an index,
(c) a step of judging the presence of IBD based on the measurement result of the above (b).
[0083]
More specifically, using an antibody (an antibody recognizing GIPR, GCSFR, or REGIα) as a disease marker of the present invention, any one of GIPR, GCSFR, and REGIα is detected by a known method such as Western blotting. And quantification methods.
[0084]
Western blotting uses the disease marker of the present invention as the primary antibody and then uses the disease marker as the secondary antibody.¹²⁵Using a labeled antibody (an antibody that binds to the primary antibody) labeled with a radioisotope such as I, a fluorescent substance, an enzyme such as horseradish peroxidase (HRP), etc., derived from the radioisotope or fluorescent substance of the resulting labeled compound This can be performed by detecting and measuring a signal to be emitted with a radiation meter (BAS-1800II: manufactured by Fuji Film Co., Ltd.), a fluorescence detector, or the like. In addition, after using the disease marker of the present invention as a primary antibody, using the ECL Plus Western Blotting Detction System (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech), detection was performed according to the protocol, and measurement was performed using a multi-bio imager STORM860 (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech). You can also.
[0085]
The function or activity of GIPR, GCSFR, and REG Iα to be measured in the above is already known, and the amount and function or activity of the protein have a certain correlation. Therefore, the detection (diagnosis) of the IBD of the present invention can also be performed by measuring the function or activity of the protein instead of measuring the amount of the protein. That is, the present invention uses a known function or activity of GIPR, GCSFR, or REG Iα as an index, and measures and evaluates it according to a known method (specifically, see (3-3) below). The present invention also includes a method for detecting (diagnosing) IBD.
[0086]
(2-3) Diagnosis of IBD
The diagnosis of IBD is performed, for example, by determining the gene expression level of any of the GIPR gene, GCSFR gene, and REG Iα gene in the large intestine tissue of the subject, or the amount of the protein (GIPR, GCSFR, REG Iα) that is the expression product of these genes. , Function or activity (hereinafter, these may be collectively referred to as “protein level”) by comparing the gene expression level or protein level in normal colon tissue and judging the difference between the two. .
[0087]
In this case, a biological sample (sample containing RNA or protein) collected and prepared from normal large intestine tissue is required. These samples are obtained by collecting the large intestine tissue of a person not suffering from IBD using a biopsy or the like. It can be obtained by collecting from such as. In addition, "the person who does not have IBD" here does not have the subjective symptom of at least IBD, and preferably uses another examination method, for example, an endoscopy, an enema X-ray test, a biopsy of the digestive tract. As a result, a person diagnosed as not having IBD is referred to. Hereinafter, the “person not suffering from IBD” may be simply referred to as “normal person” in the present specification.
[0088]
Comparison of gene expression levels or protein levels (levels) between the subject's large intestine tissue and normal large intestine tissue (the colorectal tissue of a person not suffering from IBD) can be performed on the subject's biological sample and the normal subject's biological sample. The measurement can be performed in parallel. When not performed in parallel, a GIPR gene, a GCSFR gene, and a GIPR gene obtained by measuring a plurality (at least two, preferably three or more, more preferably five or more) of normal colon tissues under uniform measurement conditions are used. And REG Iα gene expression levels, or the mean or statistical intermediate value of the amounts (levels) of the proteins (GIPR, GCSFR, REG Iα) that are the expression products of these genes, The level or amount of protein can be used for comparison.
[0089]
Whether the subject has IBD is determined by determining the gene expression level of any of the GIPR gene, GCSFR gene, and REG Iα gene in the large intestine tissue of the subject, or a protein (GIPR, GCSFR, REG Iα )) Can be used as an index when the amount (level) of the normal person is twice or more, preferably three times or more as compared with those of a normal person. In addition, if the gene expression level or protein level of the subject is higher than those of any normal person, the subject can be determined to have IBD or suspected of having the disease.
[0090]
(3) Screening method for drug candidates
(3-1) Screening method using gene expression level as an index
The present invention provides a method for screening a substance that regulates the expression of any of the GIPR gene, GCSFR gene, and REG Iα gene.
[0091]
The screening method of the present invention comprises the following steps (a), (b) and (c):
(a) contacting a test substance with a cell capable of expressing either the GIPR gene, the GCSFR gene, and the REG Iα gene,
(b) measuring the expression level of any of the GIPR gene, GCSFR gene, and REG Iα gene in the cells contacted with the test substance, and expressing the expression level of the corresponding gene in control cells not contacting the test substance with the expression level The process of comparing with the quantity,
(c) a step of selecting a test substance that changes the expression level of any of the GIPR gene, GCSFR gene, and REG Iα gene based on the comparison result in (b) above.
[0092]
Examples of cells used for such screening include all cultured cells expressing any of the GIPR gene, GCSFR gene, and REGIα gene regardless of endogenous or exogenous. Whether or not these genes of the present invention are expressed in cultured cells can be easily confirmed by detecting the expression of these genes by a known Northern blot method or RT-PCR method.
[0093]
Specific examples of the cells used for the screening include, for example, the following (1) to (3):
(1) Intestinal and lymphoid tissue-derived cells isolated and prepared from animal models of IBD,
(2) cells derived from intestinal tissue or lymphoid tissue treated or untreated with various stimulants,
(3) cells into which any of the genes of the present invention have been introduced,
And the like.
[0094]
Here, as the animal model (1), any animal model known as an IBD animal model can be used. Specifically, (1) a spontaneously occurring IBD model (C3H / HeJBir mouse, Cotton top tamarins, etc.), (2) Chemical substance induced model (dinitrochlorobenzene induced model (rat), acetic acid model (rat), trinitrosulfonic acid induced model (mouse, rat, rabbit), dextran sulfate induced model (mouse, rat, hamster) ), Carrageenan-induced model (rat, guinea pig), indomethacin-induced model (rat), etc., (3) transgenic, mutant (IL-2 knockout mouse, IL-10 knockout mouse, TCR knockout mouse, etc.), or (4) A transfer model (such as a CD45RBhi transfer SCID mouse) can be mentioned.
The cells derived from the intestinal tract tissue of the above (1) preferably include primary cultured cells derived from the large intestine (colon).
[0095]
The cell derived from the intestinal tract tissue of the above (2) preferably includes a cell line derived from the large intestine (colon), and specifically, Caco-2 cells (derived from human colon adenocarcinoma, ATTC strain number HTB-37) , HT-29 cells (derived from human colon adenocarcinoma, ATTC strain number HTB-38) or COLO 205 cells (derived from human colon adenocarcinoma, ATTC strain number CCL-222). Further, the lymphoid tissue-derived cells of the above (2) preferably include lymphocytes, monocytes, macrophages, neutrophils or eosinophils. As cell lines, RAW 264.7 cells (derived from mouse monocytes, ATTC strain number TIB-71), U-937 cells (derived from human histiocytic lymphoma, ATTC strain number CRL-1593.2), THP-1 cells (human monocytes) Origin, ATTC strain number TIB-202) or Jurkat cells (derived from human T-cell lymphoma, ATTC strain number TIB-152).
In the above (2), the stimulant includes lipopolysaccharide (Lipopolysaccharide: LPS), phorbol ester (PMA and the like), calcium ionophore, cytokine (IL-1, IL-6, IL-12, IL-18, TNFα, IFNγ). It is known that stimulation with these stimulants causes cells to be in an activated state closer to the environment of the inflammatory site.
[0096]
As the gene-transfected cell of the (3), in addition to the cells listed in the above (1) and (2), host cells usually used for gene transfer, that is, COP, L, C127, Sp2 / 0, NS-1, NIH3T3, mouse-derived cells such as ST2, rat-derived cells, BHK, hamster-derived cells such as CHO, COS1, COS3, COS7, CV1, monkey-derived cells such as Vero, HeLa, human-derived cells such as 293, and Sf9, Sf21 , High Five and the like.
Furthermore, the cells used in the screening method of the present invention also include tissues that are aggregates of cells.
More specifically, cells used in the screening of the present invention include, for example, colon-derived cells such as Caco-2 cells, HT-29 cells, and COLO 205 cells.
[0097]
The test substance (candidate substance) screened by the screening method of the present invention is not limited, but includes nucleic acids (including antisense nucleotides of the gene of the present invention), peptides, proteins, organic compounds, inorganic compounds, and the like. Specifically, the test is carried out by bringing these test substances or a sample containing them (test sample) into contact with the cells and / or tissues. Such test samples include, but are not limited to, cell extracts containing test substances, expression products of gene libraries, synthetic low molecular weight compounds, synthetic peptides, natural compounds, and the like.
[0098]
In the screening of the present invention, the conditions under which the test substance is brought into contact with the cells are not particularly limited, and culture conditions (temperature, pH, medium composition, etc.) that do not kill the cells and can express the gene of the present invention are selected. Is preferred.
[0099]
As shown in the Examples, the GIPR gene, the GCSFR gene, and the REG Iα gene are specifically up-regulated in the colon (colon) tissue of patients suffering from IBD as compared to normal colon (colon) tissue. I have. From this finding, it is considered that the enhanced expression of these genes of the present invention is related to IBD. Therefore, the screening method of the present invention includes a method of searching for a substance that regulates the expression using any one of the expression levels of the GIPR gene, GCSFR gene, and REG Iα gene as an index. By this screening method, it is possible to provide a candidate substance having an action of alleviating / suppressing IBD (improving / treating IBD). That is, the screening method of the present invention provides a candidate substance to be an active ingredient of an IBD ameliorating or therapeutic drug by searching for a substance that controls the expression of any of the GIPR gene, GCSFR gene, and REG Iα gene. Things.
[0100]
Specifically, in the case of using cells expressing any of the GIPR gene, the GCSFR gene, and the REG Iα gene, the candidate substances are selected by adding the test substance (candidate substance) to the above (1) to (3). ), The expression level of the gene of the present invention in any of the cells is lower / higher than that of cells to which the test substance (candidate substance) is not added. When cells that require an expression inducer for expression of any of these GIPR gene, GCSFR gene, and REG Iα gene are used, expression inducers [eg, lipopolysaccharide (Lipopolysaccharide: LPS), phorbol ester ( PMA), calcium ionophore, cytokines (IL-1, IL-6, IL-12, IL-18, TNFα, IFNγ, etc.) as stimulants control the expression induced by the presence of the test substance That is, the gene expression of the cells contacted with the test substance in the presence of the expression inducer is lower than that of the control cells not contacted with the test substance in the presence of the expression inducer (positive control) The test substance can be selected as a candidate substance by using the fact that it becomes higher / higher as an index.
[0101]
Among the substances that control the expression of any of the above genes, those that control the expression so as to suppress it (reduce the expression level and suppress the induction of expression) are specifically searched for by the GIPR of the cells to which the test substance is added. The expression can be determined based on the fact that the expression level of the gene, GCSFR gene, or REG Iα gene is lower than that of cells to which the test substance is not added. When cells that require an expression inducer for the expression of any of these GIPR gene, GCSFR gene, and REG Iα gene are used, the gene expression of cells contacted with the test substance in the presence of the expression inducer is reduced. The test substance can be selected as a candidate substance, using the index as being lower than that of a control cell (positive control) not contacted with the test substance in the presence of the expression inducing substance as an index.
[0102]
Further, among the substances that regulate the expression of any of the above genes, a substance that regulates the expression so as to increase the expression level (increase in the expression level and enhance the induction of the expression) is specifically searched for in the cells to which the test substance is added. The expression level of the GIPR gene, GCSFR gene, or REG Iα gene is higher than that of cells to which the test substance is not added. When cells that require an expression inducer for the expression of any of these GIPR gene, GCSFR gene, and REG Iα gene are used, the gene expression of cells contacted with the test substance in the presence of the expression inducer is reduced. The test substance can be selected as a candidate substance by using an index that is higher than control cells (positive control) not contacted with the test substance in the presence of the expression inducing substance as an index.
[0103]
Before the screening method of the present invention is carried out, a substance that suppresses the expression of the gene of the present invention can be obtained by conducting an experiment described below in advance for each of the genes of the present invention. To determine whether a substance that induces expression is useful as an active ingredient (candidate) of an IBD ameliorating or therapeutic agent, or whether a substance that induces expression is useful as an active ingredient (candidate) of an IBD ameliorating or therapeutic agent Can be. When a substance that suppresses the expression of each gene is determined to be useful as a candidate substance, the above-described screening method for the gene can be performed using the suppression of the expression as an index. When the substance to be induced is determined to be useful as a candidate substance, the above-described screening method for the gene can be performed using the induction of its expression as an index.
[0104]
Examples of such experiments include, for example, gene expression introduction of the gene of the present invention into various IBD models (recombinant adenovirus, retrovirus and other viral vectors, HVJ liposome, cDNA direct injection method, gene gun), gene function inhibition (dominant negative method) , Knockout method, antisense method, ribozyme method, RNAi, DNA-RNA chimera method, CALI method), and inducing agent of target gene is effective for deterioration of stool condition, observation of intestinal histopathological specimen, intestinal shortening, etc. Methods can be used to determine whether an inhibitor is effective. Specifically, if the improvement of the disease state is observed in the following experiment, by selecting the expression suppressor of the gene of the present invention, it is possible to obtain a candidate substance of an IBD improving drug or a therapeutic drug with higher accuracy. Becomes possible.
That is, a part of the sequence of the gene of the present invention (about 19 bases) is used, and a 4-base poly-T (thymidine) base is added downstream of each of the sense side and antisense side sequences. It is linked to pCEP4 (Invitrogen) which is a nuclear cell expression episomal vector to prepare an siRNA expression vector. Chitosan 1000 (Wako Pure Chemical Industries, 800-1500 cps) is dissolved in 25 mM acetic acid-Na acetate buffer at pH 5.7 at 55 ° C. to prepare a 0.02% chitosan solution. An equal amount of the prepared siRNA expression vector 50 ug / ml solution (50 mM sodium acetate solution) is added, and the mixture is stirred with a vortex mixer. The resulting chitosan / DNA complex is lyophilized, and then immersed in an ethanol solution containing 5% acetic anhydride for 10 minutes for acetylation. After neutralizing with a 0.1% aqueous NaOH solution, wash with water and dry. An acetylated-chitosan / DNA complex corresponding to 50 ug of plasmid DNA is suspended in a 0.5% methylcellulose solution, and administered to a model animal (SJL / J mouse sensitized with TNBS 4 days before) by oral gavage. Administer once daily for 2 days, enema TNBS on day 3, and observe the subsequent onset of pathology.
When the average of the score of the disease state is improved by 30% or more by the siRNA of the gene of the present invention, it is considered that the gene expression inhibitor is likely to be a therapeutic drug.
In the case where improvement of the disease state is observed in the following experiment, it is possible to obtain a candidate substance for an IBD improving drug or a therapeutic drug with higher accuracy by selecting the gene expression inducing (enhancing) substance. Become. That is, using a mammalian cell expression vector (such as the above pCEP4), an expression vector for the gene of the present invention is prepared and introduced into a disease model animal. The introduction can be performed in the same manner as in the above method. When the average of the scores of the disease state is improved by 30% or more by introducing the gene of the present invention, it is considered that the gene expression inducing (enhancing) substance is likely to be a therapeutic agent.
[0105]
The detection and quantification of the gene expression level in the screening method of the present invention is carried out by using RNA prepared from the cells or a complementary polynucleotide transcribed from the RNA and the disease marker of the present invention, using the (2- As described in section 1), the method can be carried out according to a known method such as Northern blotting or RT-PCR, or a method using a DNA chip. The degree of fluctuation (suppression, promotion, decrease, increase) of the gene expression level used as an index depends on the expression of any of the GIPR gene, GCSFR gene, and REG Iα gene in cells contacted with the test substance (candidate substance). A change (suppression, promotion, decrease, increase) of 10%, preferably 30%, particularly preferably 50% or more as compared with the expression level in control cells not contacted with the test substance (candidate substance) can be exemplified.
[0106]
Further, the detection and quantification of the expression level of any of the GIPR gene, GCSFR gene and REG Iα gene is performed by connecting a marker region such as a luciferase gene to a gene region (expression control region) that controls the expression of the gene of the present invention. It can also be carried out by measuring the activity of a marker gene-derived protein using a cell line into which a fusion gene has been introduced. The method for screening an expression control substance of any of the GIPR gene, GCSFR gene, and REGIα gene of the present invention includes a method of searching for a target substance using the expression level of such a marker gene as an index. In the above, the concept of the “GIPR gene, GCSFR gene, REG Iα gene” described in claim 9 includes a fusion gene of the expression control region of the gene of the present invention and a marker gene.
[0107]
The marker gene is preferably a structural gene of an enzyme that catalyzes a luminescence reaction or a color reaction. Specifically, in addition to the above-mentioned luciferase gene, reporter genes such as secreted alkaline phosphatase gene, chloramphenicol acetyltransferase gene, β-glucuronidase gene, β-galactosidase gene, and aequorin gene can be exemplified.
The expression control region of the gene of the present invention may be, for example, about 1 kb, preferably about 2 kb upstream of the transcription start site of the gene.
[0108]
The expression control region of the gene of the present invention can be prepared by, for example, (i) 5′-RACE method (for example, using 5′full Race Core Kit (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.)), oligocap method, S1 primer mapping, etc. Step of determining the 5 'end by a usual method; (ii) Obtaining the 5'-upstream region using Genome Walker Kit (manufactured by Clontech) or the like, and measuring the promoter activity of the obtained upstream region And the like. Preparation of the fusion gene and measurement of the activity derived from the marker gene can be performed by known methods.
[0109]
The substance selected by the screening method of the present invention can be positioned as a gene expression regulator of at least one gene of the GIPR gene, GCSFR gene, and REG Iα gene. It is considered that the expression controlling action of these substances on the gene of the present invention is deeply involved in the development of colorectal tissue disorders. Therefore, these substances are potential candidates for drugs that alleviate or suppress (improve, treat) IBD.
[0110]
(3-2) Screening method using protein expression level as an index
The present invention provides a method for screening a substance that regulates (decreases / increases) the expression of any of GIPR (GIPR protein), GCSFR (GCSFR protein), and REGIα (REGIα protein).
The screening method of the present invention comprises the following steps (a), (b) and (c):
[0111]
(a) contacting the test substance with GIPR, GCSFR, and cells capable of expressing any of REG Iα,
(b) measuring the expression level of any of GIPR, GCSFR, and REG Iα in the cells contacted with the test substance, and comparing the expression level with the expression level of the corresponding protein in control cells not contacted with the test substance; Process,
(c) a step of selecting a test substance that changes the expression level of any of GIPR, GCSFR, and REG Iα based on the comparison result of (b) above.
[0112]
Cells used in the screening of the present invention, whether endogenous or exogenous, express any of the GIPR gene, GCSFR gene, and REG Iα gene, and express any of GIPR, GCSFR, and REG Iα as expression products. And all cultured cells having the same. Here, the expression of GIPR, GCSFR and REG Iα can be easily confirmed by detecting the gene product protein by a known Western method. Specific examples of the cells include primary intestinal tissue and lymphoid tissue isolated and prepared from an IBD animal model, as described in (1) to (3) of (3-1) above. Examples include cultured cells, primary cultured cells or cell lines derived from intestinal tissues or lymphoid tissues treated with various stimulants, or cell lines into which any of the genes of the present invention has been introduced. The category of the cell also includes a cell membrane fraction, a cytoplasmic fraction, a cell nuclear fraction and the like.
[0113]
The test substance (candidate substance) screened by the screening method of the present invention is not limited, but includes nucleic acids (including antisense nucleotides of the gene of the present invention), peptides, proteins, organic compounds, inorganic compounds, and the like. Specifically, the test is carried out by bringing these test substances or a sample containing them (test sample) into contact with the cells or the cell membrane fraction. Such test samples include, but are not limited to, cell extracts containing test substances, expression products of gene libraries, synthetic low molecular weight compounds, synthetic peptides, natural compounds, and the like.
[0114]
As shown in the Examples, the GIPR gene, the GCSFR gene, and the REG Iα gene are specifically up-regulated in the colon (colon) tissue of patients suffering from IBD as compared to normal colon (colon) tissue. I have. From this finding, it is considered that the enhanced expression of the expression product (protein) of the gene of the present invention is related to IBD. Therefore, the screening method of the present invention includes a method of searching for a substance that changes the expression level using any one of the protein expression levels of GIPR, GCSFR, and REG Iα as an index. By this screening method, it is possible to provide a candidate substance having an action of alleviating / suppressing IBD (improving / treating IBD).
[0115]
That is, the screening method of the present invention provides a candidate substance to be an active ingredient of an IBD ameliorating or therapeutic agent by searching for a substance that changes the expression level of any of GIPR, GCSFR, and REG Iα. is there.
[0116]
Specifically, when cells that express or produce any of GIPR, GCSFR, and REG Iα are used, the amount of the protein of the protein of the present invention in the cells to which the test substance (candidate substance) is added is selected. (Level) fluctuates (becomes lower / higher) as compared with the amount (level) of cells to which the test substance (candidate substance) is not added. When cells that require an expression inducer for expression and production of any of these GIPR, GCSFR, and REG Iα are used, the expression inducer [eg, lipopolysaccharide (Lipopolysaccharide: LPS), phorbol ester (PMA, etc.) ), Calcium ionophore, cytokines (IL-1, IL-6, IL-12, IL-18, TNFα, IFNγ, etc.), etc.] are controlled by the presence of the test substance, The gene expression of cells contacted with the test substance in the presence of the expression inducer fluctuates (lower / higher) compared to control cells (positive control) not contacted with the test substance in the presence of the expression inducer. ) Can be used as an index to select the test substance as a candidate substance.
[0117]
Examples of cells to be used include colon-derived cells such as Caco-2 cells, HT-29 cells, and COLO 205 cells.
[0118]
Among the substances that regulate the expression of any of the above proteins, candidate substances that regulate the expression so as to reduce the expression level (reduction of the expression level and suppression of the induction of the expression) are specifically determined by GIPR, GCSFR, or REG Iα. When using cells that express and produce E. coli, the amount (level) of GIPR, GCSFR, or REG Iα protein in cells to which the test substance (candidate substance) has been added is higher than that in cells to which the test substance (candidate substance) is not added. It can be carried out by using an index that becomes lower than the amount (level) as an index. When cells that require an expression inducer for the expression of any of these GIPR, GCSFR, and REG Iα are used, the expression of the protein in the cells contacted with the test substance in the presence of the expression inducer causes The test substance can be selected as a candidate substance by using the index as being lower than that of control cells (positive control) not contacted with the test substance in the presence of the inducer as an index.
[0119]
Among the substances that regulate the expression of any of the above proteins, candidate substances that regulate the expression so as to increase the expression (increase the expression level and enhance the induction of expression) are specifically selected from GIPR, GCSFR, or REG Iα. When using cells that express and produce E. coli, the amount (level) of GIPR, GCSFR, or REG Iα protein in cells to which the test substance (candidate substance) has been added is higher than that in cells to which the test substance (candidate substance) is not added. It can be performed by using an index that becomes higher than the amount (level) as an index. When cells that require an expression inducer for the expression of any of these GIPR, GCSFR, and REG Iα are used, the expression of the protein in the cells contacted with the test substance in the presence of the expression inducer causes The test substance can be selected as a candidate substance by using the index as being higher than that of a control cell not contacted with the test substance in the presence of the inducer (positive control) as an index.
[0120]
As described above, the amount of GIPR, GCSFR, or REG Iα production according to the screening method of the present invention is, for example, the disease marker of the present invention relating to an antibody (for example, a human GIPR protein or a homolog thereof, a human GCSFR protein or a homolog thereof, Alternatively, the quantification can be carried out according to a known method such as Western blotting using a human REG Iα protein or an homolog thereof. Western blotting uses the disease marker of the present invention as the primary antibody and then uses the disease marker as the secondary antibody.¹²⁵Labeling is performed using an antibody that binds to a primary antibody labeled with a radioisotope such as I, a fluorescent substance, or an enzyme such as horseradish peroxidase (HRP), and signals derived from these labeled substances are measured using a radiometer (BAS-1800II: Fuji Film Co., Ltd.), a fluorescence detector or the like. In addition, after using the disease marker of the present invention as a primary antibody, using the ECL Plus Western Blotting Detction System (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech), detection was performed according to the protocol, and a multi-bio imager STORM860 (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech) was used. It can also be measured.
[0121]
(3-3) Screening method using protein function (activity) as an index
The present invention provides a method for screening a substance that controls the function (activity) of GIPR, GCSFR, and REG Iα.
The screening method of the present invention comprises the following steps (a), (b) and (c):
[0122]
(a) contacting the test substance with GIPR, GCSFR, or REG Iα,
(b) measuring the function or activity of GIPR, GCSFR, or REG Iα resulting from the step (a), and the function or activity of GIPR, GCSFR, or REG Iα when the test substance is not contacted with the function or activity. Or a step of comparing with activity,
(c) a step of selecting a test substance that causes a change in the function or activity of GIPR, GCSFR, or REG Iα based on the comparison result in (b) above.
[0123]
In the screening method of the present invention, any function / activity measurement method based on the known function / activity of GIPR, GCSFR or REG Iα can be used. That is, a test substance is added to a known function / activity measurement system of GIPR, GCSFR, or REG Iα, and the known function / activity of GIPR, GCSFR, or REG Iα is controlled (enhancement, suppression, promotion, inhibition). Any screening method that selects a test substance as a candidate substance having an improvement / therapeutic effect on IBD is included in the category of the screening method of the present invention.
[0124]
The screening of the present invention can be performed by contacting an aqueous solution, cells containing GIPR, GCSFR, or REG Iα or a cell fraction prepared from the cells with a test substance.
[0125]
Here, the aqueous solution containing GIPR, GCSFR, or REG Iα includes, for example, a normal aqueous solution containing GIPR, GCSFR, or REG Iα, a cell lysate containing these proteins, a cell lysate, a nuclear extract, or a cell extract. A culture supernatant and the like can be exemplified.
[0126]
In addition, examples of the cells used in the screening method of the present invention include cells that can express GIPR, GCSFR, or REG Iα regardless of whether they are endogenous or exogenous. As the cells, specifically, primary cells derived from lymphoid tissues or intestinal tissues isolated and prepared from an IBD animal model as described in the above (3-1) (1) to (3) Cultured cells, primary cultured cells or cell lines derived from lymphoid tissue or intestinal tissue treated with various stimulants, or cell lines into which any of the genes of the present invention have been introduced can be used.
The cell fraction used in the screening method of the present invention refers to various fractions derived from the above cells, and includes, for example, a cell membrane fraction, a cytoplasmic fraction, a cell nucleus fraction, and the like.
[0127]
GIPR, GCSFR, and REG Iα used in the screening are all known proteins, and as described in the above (1-3), the sequence information of the gene provided by the present invention (SEQ ID NOS: 1 to 14) , 29), DNA cloning, construction of each plasmid, transfection into a host, culturing of transformed cells, and, if necessary, recovery of protein from the culture. These operations are carried out according to methods known to those skilled in the art or methods described in the literature (Molecular Cloning, T. Maniatis et al., CSH Laboratory (1983), DNA Cloning, DM. Glover, IRL PRESS (1985)) and the like. Can be done.
[0128]
As shown in the Examples, the GIPR gene, the GCSFR gene, and the REG Iα gene are specifically up-regulated in the colon (colon) tissue of patients suffering from IBD as compared to normal colon (colon) tissue. I have. From this finding, it is considered that the function (activity) enhancement of the expression products (proteins) of these genes is related to IBD. Therefore, the screening method of the present invention includes a method of searching for a substance that controls the function (activity) of the protein using the function (activity) of GIPR, GCSFR, or REG Iα as an index. According to the screening method of the present invention, a substance that regulates the function or activity of GIPR, GCSFR, or REG Iα can be searched for, and thus a candidate having a moderating / suppressing action on IBD (improving / treating IBD). A substance is provided.
[0129]
As one embodiment of the function (activity) control of the protein of the present invention, the search for a substance that controls (reduces) the function (activity) of the protein includes, for example, the GIPR gene, GCSFR gene, or REG Iα gene. The function (activity) of the at least one protein obtained when the test substance is brought into contact with the aqueous solution, the cells, or the cell fraction prepared from the cells, is such that the control aqueous solution, cell or cell fraction to which the test substance is not added is obtained. Can be used as an indicator that the function (activity) is lower than the function (activity) of the corresponding protein.
[0130]
In another embodiment of the function (activity) control of the protein of the present invention, the search for a substance that controls the function (activity) of the protein in a direction that enhances (increases or increases) the function (eg, GIPR, GCSFR, or REG Iα) is performed. A control aqueous solution, cell or cell fraction to which the function (activity) of at least one of the above-mentioned proteins obtained when the test substance is brought into contact with an aqueous solution, cells or a cell fraction prepared from the cells containing the test substance is not added. The increase can be performed as an index, as compared with the function (activity) of the corresponding protein.
That is, the screening method of the present invention provides a candidate substance to be an active ingredient of an IBD ameliorating or therapeutic drug by searching for a substance that controls the function or activity of GIPR, GCSFR, or REG Iα.
[0131]
The test substance (candidate substance) screened by the screening method of the present invention is not limited, but includes nucleic acids, peptides, proteins (including antibodies against GIPR, GCSFR, or REG Iα), organic compounds, inorganic compounds, and the like. The screening is specifically carried out by bringing these test substances or a sample containing them (test sample) into contact with the above aqueous solution, cells or cell fraction. Test samples include, but are not limited to, cell extracts, gene library expression products, synthetic low molecular weight compounds, synthetic peptides, natural compounds, etc., containing test substances.
[0132]
Among the screening methods based on the function or activity of each protein of the present invention, screening methods based on a common assay are described below in "I. Screening based on receptor binding inhibitory activity" and "II. Screening ”. The individual screening method for each protein of the present invention is described in the following section “III. Screening based on function (activity) of each protein of the present invention”.
[0133]
I. Screening based on receptor binding inhibitory activity
Among the proteins of the present invention, GIPR and GCSFR are receptors, and their ligands (receptor binding substances) include natural ligands, gastric inhibitory polypeptide (GIP) and granulocyte colony stimulating factor (G-FR), respectively. CSF) is known.
[0134]
Therefore, screening of a test substance (candidate substance) that causes a change in the function or activity of GIPR or GCSFR can be performed by measuring whether or not the test substance inhibits the binding between the receptor and the ligand. it can. Specifically, the screening method of the present invention comprises the following steps (a), (b) and (c):
(a) contacting the receptor with the ligand in the presence of a test substance,
(b) measuring the amount of binding of the ligand to the receptor, and determining the amount of binding of the ligand to the receptor obtained by contacting the receptor with the ligand in the absence of the test substance (control binding amount) Comparing with and
(c) a step of selecting, based on the result of the above (b), a test substance whose binding amount is varied as compared with a control binding amount.
[0135]
In this case, the binding inhibition between the receptor and the ligand may be (1) a mode in which the binding to the receptor is inhibited by binding to the receptor, or (2) a mode in which the binding to the ligand is inhibited. An embodiment may be such that binding inhibits the binding of the ligand to the receptor. However, in particular, in the case of the mode (1), it is necessary to select a test substance which does not exert the same action as a ligand even when bound to a receptor. Therefore, the test substance selected by the above-mentioned screening method further includes the following:
(d) selecting a test substance having the same action as the ligand, or a test substance that antagonizes the action of the ligand, from the test substances selected in (c) above,
It is preferable to subject to.
The step (d) includes, for example, the methods described in “II. Screening based on GPCR activity” and “III. Screening based on function (activity) of each protein of the present invention” described later. Can be.
[0136]
The receptor used in the screening of the present invention may be a purified product (isolate), or may be a cell containing the receptor or a cell fraction thereof.
As the cells containing the receptor used in the screening of the present invention, cells that naturally express the receptor may be used, or transformed cells prepared by introducing a gene encoding the receptor into cells. May be used.
[0137]
The transformed cells can be prepared by a method known to those skilled in the art according to a basic book such as Molecular Cloning 2nd Edt., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). For example, the cDNA of the receptor is inserted into a known expression vector such as pCAGGS (Gene 108, 193-199 (1991)), pcDNA1.1 and pcDNA3.1 derivatives (Invitrogen). Thereafter, the cells are introduced into an appropriate host and cultured, whereby a transformed cell expressing a protein corresponding to the DNA of the introduced receptor can be prepared. As the host, CHO cells, C127 cells, BHK21 cells, COS cells, and the like, which are generally widely used, can be used, but are not limited thereto, and yeast, bacteria, insect cells, and the like can be used. You can also.
[0138]
As a method for introducing an expression vector having a receptor protein cDNA into a host cell, any method may be used as long as it is a method for introducing a known expression vector into a host cell. For example, a calcium phosphate method (J. Virol., 52, 456-467 (1973)), a method using LT-1 (manufactured by Panvera), a method using a lipid for gene transfer (Lipofectamine, Lipofectin; manufactured by Gibco-BRL), and the like.
Cells that naturally express the receptor and transformed cells that express the receptor can be used for screening as they are. When a cell membrane is used for screening, for example, a cell membrane fraction is obtained as follows. be able to. That is, first, a hypotonic buffer is added to the cells, the cells are hypotonically disrupted, homogenized, and centrifuged to obtain a precipitate of the cell membrane fraction. By suspending the precipitate in a buffer, a cell membrane fraction containing the receptor can be obtained. The obtained cell membrane fraction can be purified by a conventional method using a column to which an antibody is bound.
[0139]
The ligand used in the screening of the present invention, specifically GIP and G-CSF, can also be obtained by recovering a recombinant protein by a conventional method from a transformed cell prepared by the same method as the receptor. it can. Further, in addition to the natural ligand, an agonist ligand can be used.
These ligands may be used as they are, or may be those labeled with any labeling substance. Here, as a labeling substance, a radioisotope (^ThreeH,¹⁴C,³⁵S,¹²⁵I), fluorescent substances (such as Alexa Protein Labeling Kits from Molecular Probes), chemiluminescent substances (such as Chemiluminescence Labeling Kit from Assay Designs), biotin (such as EZ-Link Biotinylation Kits from Pierce), marker proteins or peptide tags. Examples can be given. Examples of the marker protein include conventionally known marker proteins such as alkaline phosphatase (Cell, 63, 185-194, 1990), the Fc region of an antibody (Genbank accession number M87789), and HRP (Horse radish peroxidase). Examples of the peptide tag include a conventionally known peptide tag such as a Myc tag, a His tag, and a FLAG tag.
[0140]
The measurement of the receptor binding inhibitory activity is specifically exemplified by the following method. That is, an aqueous solution containing the receptor (usually a buffer solution is used), the cell or cell membrane fraction^-3~Ten^-TenAfter adding a test compound solution prepared at an appropriate concentration of M (usually water or a buffer is used as a solvent, ethanol or DMSO can be added depending on the solubility), and then the labeled ligand is added. The reaction is carried out for a certain time (usually 10 minutes to 2 hours). Thereafter, the supernatant is isolated by centrifugation or the like, the radioactivity is measured, and the amount of the labeled ligand contained in the supernatant can be measured. Alternatively, the precipitate containing the transformed cells or the cell membrane fraction may be dissolved in a solution containing a surfactant and a base, and the radioactivity thereof may be measured to measure the amount of the labeled ligand contained in the precipitate.
[0141]
By comparing the above values with the values obtained when a solvent was used as a blank in place of the test compound (control binding amount), it was determined whether or not the test compound inhibited the binding between the receptor and the labeled ligand. Can be evaluated. That is, screening of a candidate substance can be performed by using, as an index, whether or not the amount of binding in the presence of the test substance fluctuates compared to the amount of binding in the absence of the test substance.
For the specific inhibition rate (%), the following formula:
{1- (amount of labeled agonist ligand bound to protein of the present invention when test substance is added) / (amount of labeled agonist ligand bound to protein of the present invention when no test substance is added)} X100
Can be obtained by calculating
[0142]
II. GPCR Activity-based screening
Among the proteins of the present invention, GIPR is a GPCR (G-protein coupled receptor), and its ligand (receptor binding substance) is a gastric inhibitory polypeptide which is a natural agonist ligand (GIP, also known as glucose-dependent insulin-secreting polypeptide) and the like are known. GIP is a polypeptide consisting of 42 amino acid residues.
Therefore, screening of a test substance (candidate substance) that causes a change in the function or activity of GIPR can be performed by measuring whether or not GPCR activity is inhibited. Hereinafter, (1) screening based on the binding activity to GTP and (2) screening based on the physiological activity of GPCR will be described as representative techniques.
[0143]
(1) GTP Screening based on binding activity to
Screening based on the binding activity to GPCR can be performed by utilizing the property of GPCR binding to GTPγS which is a GTP analog in the presence of GDP. That is, the screening of the present invention is carried out by measuring whether or not the test substance inhibits (controls) the binding between GPCR and GTPγS (more specifically, the binding between the complex of GPCR and G protein and GTPγS). ,It can be carried out. Specifically, the screening method of the present invention comprises the following steps (a), (b) and (c):
(a) contacting the GPCR, the ligand and GTP in the presence of a test substance,
(b) The amount of GTP binding resulting from the above step (a) is measured, and the amount of GTP binding is determined by contacting GPCR, ligand and GTP in the absence of the test substance (control binding Amount), and
(c) a step of selecting a test substance that changes the amount of GTP binding relative to the amount of control binding based on the result of (b) above.
[0144]
Cells containing a GPCR used in the screening of the present invention may be cells that naturally express the GPCR, or may be a transformed cell prepared by introducing a gene encoding the GPCR into the cell. Is also good. Specifically, the following method is exemplified.
That is, using a method known to those skilled in the art, the expression vector of the GPCR was prepared and transformed cells overexpressed in CHO-K1 cells, HEK293 cells, or cells expressing the GPCR naturally. Prepare Here, if necessary, a G protein expression vector can be co-expressed. Next, a cell membrane fraction is prepared from the cells by an operation such as centrifugation. This is mixed with the ligand and the test substance in a solvent such as an appropriate buffer, and incubated for a certain time (for example, 30 minutes to 2 hours). In addition, [³⁵S] -GTPγS is mixed and incubated for a certain period of time (for example, 30 minutes to 2 hours). After the binding reaction was terminated by washing with a buffer solution on a glass filter, the radioactivity on the filter was measured to bind to the complex between the GPCR and the G protein [³⁵The amount of S] -GTPγS can be calculated. Screening for candidate substances is performed in the presence of the test substance [³⁵The [S] -GTPγS binding amount was increased in the absence of the test substance.³⁵It can be performed by using as an index whether or not the amount fluctuates as compared with the amount of S] -GTPγS binding.
[0145]
(2) GPCR Based on biological activity
A candidate substance that controls the function (activity) of the GPCR can also be selected by using, as an index, a physiological activity generated by binding of the agonist ligand to the GPCR. Specifically, the screening method of the present invention comprises the following steps (a), (b) and (c):
(a) contacting the receptor with the ligand in the presence of a test substance,
(b) measuring the bioactivity mediated by the GPCR resulting from the step (a), and measuring the bioactivity mediated by the GPCR obtained by contacting the receptor with the ligand in the absence of the test substance. Comparing with the obtained physiological activity (control biological activity), and
(c) a step of selecting a test substance that changes the biological activity compared to the control biological activity based on the result of the above (b).
[0146]
Here, physiological activities through GPCR include arachidonic acid release, acetylcholine release, increase or control of intracellular calcium ion concentration, increase or control of intracellular cAMP concentration, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane Potential fluctuation, phosphorylation of intracellular protein, c-fos activation, activation of a reporter gene of cAMP responsive element or control thereof, and the like.
The physiological activity can be measured using a known method or a commercially available measurement kit. That is, the cells containing the GPCR are cultured in a multiwell plate or the like. Replace with a fresh medium or an appropriate buffer that does not show cytotoxicity, add the test compound and / or ligand, etc., incubate for a certain period of time, and then extract the cells or collect the supernatant to produce the product Is quantified according to the respective method. When the production of a substance (for example, arachidonic acid) as an indicator of a physiological activity cannot be measured by a degrading enzyme contained in a cell, an inhibitor for the degrading enzyme can be used in combination. In addition, activities such as cAMP production control can be measured with high sensitivity by increasing the amount of cells produced with forskolin or the like.
[0147]
Specific measurement procedures include the following (1) or (2).
(1) Fluorescent imaging plate reader (FLIPR) method
GIPR activity can be measured by detecting a change in intracellular calcium concentration. Even when the GPCR is present in conjugate with Gs protein or Gi protein instead of Gq protein, screening can be performed by converting the signal into a Gq-type signal and measuring the amount of intracellular calcium ions. . That is,
1) The above-mentioned GIPR gene expression vector, Gq protein or Gqs5 protein (Gqs5 means Gq protein in which the C-terminal is substituted with 5 C-terminal amino acid residues of Gs protein) or Gqi5 protein (Gqi5 Means a Gq protein in which the C-terminal is replaced with 5 amino acids at the C-terminal amino acid of Gi protein.) To prepare an expression vector. Here, a CHO-K1 cell or the like can be used as a cell line, and the above-described expression vector can be co-transfected with a gene transfer reagent Lipofectoamine (Invitrogen) or the like.
2) The cells are then fluorescently activated by calcium ions such as probenecid (used as an inhibitor of multiple drug-resistance pumps to retain the dye inside the cells) and Fluo-3 AM (Molecular Probe). CO2 in F12 culture medium containing the dye_TwoIncubate for a certain period of time (for example, 30 minutes to 2 hours).
3) Add a solution of the ligand dissolved in a culture medium such as HBSS containing probenecid, and measure by FLIPR until 2 minutes later. Detection is performed by exciting the cells with an argon laser at 488 nm and capturing the fluorescence of Fluo-3 bound to calcium ions at a wavelength of 500-560 nm. The value obtained by subtracting the value before the addition as the background from the fluorescence intensity from immediately after the addition of the ligand to 60 seconds later is defined as the activity. When adding a test substance, add it before adding the ligand, and then add the ligand.
4) Candidate substances can be selected by using as an index whether or not the amount of calcium ions in the presence of the test substance fluctuates as compared to the amount of calcium ions in the absence of the test substance.
[0148]
(2) Measurement of cAMP level
The method using the reporter gene assay for cAMP responsive element is based on the following: luciferase, chloramphenicol acetyltransferase, alkaline phosphatase, downstream of cAMP responsive element (CRE) activated by signal transduction generated by binding of ligand to GIPR. A reporter gene assay can be performed by linking reporter genes such as hormones and GFP. The method is described, for example, in Ishihara et al., EMBO J., 10, 1635-1641 (1991). In particular,
1) An expression vector for the GIPR gene, an expression vector for G protein (Gs, Gi), and luciferase, chloramphenicol acetyltransferase, alkaline phosphatase, growth hormone, GFP, etc. downstream of the cAMP responsive element (CRE). A reporter gene-linked gene is prepared. Here, a CHO-K1 cell or the like can be used as a cell line, and the above-described expression vector can be co-transfected with a gene transfer reagent Lipofectoamine (Invitrogen) or the like. When cells expressing the G protein are used, only the GIPR gene expression vector and reporter vector are introduced.
2) The cells are then placed in a suitable medium with CO2_TwoIncubate in an incubator for a certain time (for example, 4 to 8 hours).
3) After replacing the medium, a solution in which the ligand GIP is dissolved in an appropriate culture medium is added, and after a predetermined time (4 hours to 24 hours), the reporter activity is measured. For example, in the case of luciferase, the cells are lysed with a cell lysate, and a portion of the lysate is reacted with a luciferase substrate solution (Promega's Luciferase assay system or the like), and the luminescence is measured with a luminometer. The test substance is added before adding the ligand.
4) The selection of the candidate substance can be performed by using as an index whether or not the reporter activity in the presence of the test substance fluctuates as compared with the reporter activity in the absence of the test substance.
For the above measurement, a commercially available cyclic AMP detection kit (for example, Amersham: TRK.432) can also be used.
[0149]
III. Screening based on the function (activity) of each protein of the present invention
Hereinafter, a screening method based on each function (activity) of the protein of the present invention will be exemplified.
[0150]
(1) Screening method based on GIPR function (activity)
GIP, a ligand of GIPR, is a polypeptide consisting of 42 amino acid residues and is synthesized in K cells of the duodenum and the small intestine. It is known to inhibit the secretion of gastric acid and gastrin and to stimulate insulin secretion of pancreatic β cells. That is, by utilizing the known properties of GIPR, a control substance or a candidate substance that controls the function (activity) of GIPR can be screened using the following measurement method. Specifically, the following screening method based on insulin stimulating activity can be exemplified.
The insulin stimulating activity of GIPR can be measured, for example, with reference to the method described in Japanese Patent Laid-Open Publication No. Hei 7-196965. That is, GIP can be quantified by adding it to animal cells or administering it to an animal and observing the release of immunoreactive insulin (IRI) in the animal's mediated or circulating tissue. The presence of the IRI is detected using a radioimmunoassay that can specifically detect insulin. That is, the screening method of the present invention includes the following steps (a), (b) and (c):
(a) contacting cells capable of expressing insulin with GIP in the presence of the test substance,
(b) measuring the amount of insulin release in (a) above, and comparing the amount of release with the amount of release obtained by contacting the cells and GIP in the absence of a test substance (control release amount); and
(c) a step of selecting a test substance whose release amount fluctuates relative to a control release amount based on the result of the above (b).
The cells used herein include the perfused pancreas (as described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 7-196695, only a small part of the intestine is perfused to prevent possible interference with intestinal substances having glucagon-like immunoreactivity. And Lajishima isolated from the pancreas (JP-A-2000-342109). Preferably, rat insulinoma cells are used, and particularly preferably, RIN-38 rat insulinoma cells are used.
On the other hand, GIP can be prepared by a peptide solid phase synthesis method known to those skilled in the art. For example, it can be obtained by the method described in Izumiya et al., "Basics and Experiment of Peptide Synthesis" (Maruzen; 1985).
The measurement of the amount of insulin in the above (b) can be performed using a Morinaga ultra-sensitive rat insulin measurement kit (manufactured by Seikagaku Corporation) or the like.
[0151]
(2) Screening method based on GCSFR function (activity)
G-CSF, a ligand for GCSFR (granulocyte colony stimulating factor receptor), also known as colony stimulating factor 3 receptor (CSF3R), is a member of the colony stimulating factor involved in blood cell proliferation and differentiation. It plays an important role in the proliferation and differentiation of sexual granulocytes. This factor has been shown to be deeply involved in controlling neutrophil concentration in blood, as well as in activating mature neutrophils. For example, it is known that G-CSF acts on neutrophil precursor cells and other cells via receptors (GCSFR) and stimulates their proliferation or differentiation to mainly give neutrophil granulocytes. ing. That is, a control substance or a candidate substance that controls the function (activity) of GCSFR can be screened using measurement of the cell proliferation activity, which is a known property of GCSFR. Specifically, for example, a method for measuring the growth promoting activity of G-CSF on G-CSF-responsive cells with reference to the method described in Japanese Patent Application Laid-Open No. Hei 6-005983, and the following method are mentioned.
[0152]
That is, the screening method of the present invention includes the following steps (a), (b) and (c):
(a) contacting cells capable of expressing GCSFR with G-CSF in the presence of the test substance,
(b) measuring the cell proliferation activity value in the above (a) and comparing the activity value with the activity value obtained by contacting the cells and G-CSF in the absence of a test substance (control activity value) The step of
(c) a step of selecting a test substance whose activity value fluctuates compared to a control activity value based on the result of (b) above.
Here, as a cell capable of expressing GCSFR, a transformed cell into which a GCSFR gene has been introduced, or a factor-dependent cell line, Paterson-G-CSF (FDCP-G) [Patterson Institute (Paterson Institute)] in the presence of G-CSF by the limiting dilution method. As the G-CSF, a commercially available product (Funakoshi / R & D SYSTEMS) can be used.
In the above, the cell proliferation activity can be measured, for example, using the amount of [3H] thymidine (Amersham) uptake as an index. That is, the cells were placed in a humidified incubator in CO2₂Incubate in the presence for 2-6 days. Approximately 1.0 μCi of titrated thymidine is added per well and finally incubated for 4-8 hours. Cells are harvested on glass fiber filter paper and the concentration of radioactivity can be determined by liquid scintillation counting.
[0153]
(3) Screening method based on the function (activity) of Reg Iα
REG and REG related genes belong to the calcium-dependent lectin family, and are a group of genes involved in regeneration expressed in the basal part of the digestive tract and tissue damage. The Reg Iα gene encodes a protein of 166 amino acid residues and has a sequence homologous to the sugar-binding domain of C-type lectin (Hartupee, JC et al., Biochim Biophys Acta, 1518, 287-293, 2001). . Reg Iα is also called PSP (Pancreatic Stone Protein) or PTP (Pancreatic Thread Protein). Reg Iα is abundant in pancreatic juice (10-14% of total protein) and is known to inhibit crystallization of calcium carbonate in vitro (Rouimi, FEBS Lett., 216, 195-199, 1987) . Among the three rat pancreas-derived cell lines, ARIP (pancreatic duct), AR42J (acini), and RIN (β cells), expression is observed in AR42J, and it has cell growth promoting activity against ARIP and RIN (Zenilman, ME et al., Gastro-enterology, 110, 1208-1214, 1996).
That is, a regulatory substance or a candidate substance that controls the function (activity) of Reg Iα can be screened by measuring the cell proliferation promoting activity, which is a known property of Reg Iα.
[0154]
That is, the screening method of the present invention includes the following steps (a), (b) and (c):
(a) in the presence of a test substance, a step of contacting cells having responsiveness to Reg Iα and Reg Iα,
(b) The cell growth promoting activity in (a) above is measured, and the activity value is compared with the activity value (control activity value) obtained by contacting the cells with Reg Iα in the absence of a test substance. Process, and
(c) a step of selecting a test substance whose activity value fluctuates compared to a control activity value based on the result of (b) above.
Here, the cell growth promoting activity of REG Iα can be measured with reference to, for example, the method of Zenilman, ME et al., Gastroenterology, 110, 1208-1214, 1996. Cells that are responsive to Reg Iα are not particularly limited, and pancreatic β cells (RIN) or pancreatic acinar cells (ARIP) can be used. The cell growth promoting activity can be measured using the amount of [3H] thymidine (Amersham) uptake as an index, as in (2) above.
Reg Iα was obtained from cattle according to the method described in Zenilman, ME et al., Gastroenterology, 110, 1208-1214, 1996, and Gross, J. et al., J. Clin. Invest., 76, 2115-2126, 1985. Alternatively, it can be isolated and purified from human placenta. In other words, bovine or human placenta is homogenized, ammonium sulfate fractionation is performed, dissolution under acidic conditions and precipitation under neutral conditions are repeated, and finally Western blotting using HPLC (phenyl-TSK column) and monoclonal antibody Can be purified to such an extent that it can be confirmed to be single.
[0155]
The test substance thus selected is a potential candidate for a drug that alleviates or suppresses (improves, treats) IBD.
[0156]
The candidate substances selected by the screening method of the present invention described in the above (3-1) to (3-3) are further the following animals (1) to (3), which are model animals of IBD: (1) Spontaneous IBD model (C3H / HeJBir mouse, Cotton top tamarins, etc.), (2) Chemical substance induced model (dinitrochlorobenzene induced model (rat), acetic acid model (rat), trinitrosulfonic acid induced model (mouse, rat, rabbit) ), Dextran sulfate-induced model (mouse, rat, hamster), carrageenan-induced model (rat, guinea pig), indomethacin-induced model (rat), etc.), (3) transgenic, mutant (IL-2 knockout mouse, IL-10 knockout mouse) (C) Mouse, TCR knockout mouse, etc.) or (4) Transfer model (CD45RBhi-transferred SCID mouse, etc.), drug efficacy test, safety test, and clinical treatment for IBD patients May be subjected to test, by performing these tests, it is possible to obtain a more practical IBD improving or treating agent. The substances selected in this manner can be industrially produced by chemical synthesis, biological synthesis (fermentation) or genetic manipulation based on the results of the structural analysis.
[0157]
The screening methods described in the above (3-1) to (3-3) not only select candidate substances for improvement or treatment of IBD, but also select an existing or new improvement of IBD or treatment (candidate). Drug) regulates the expression of any of the GIPR gene, GCSFR gene and REG Iα gene, or regulates the expression or function / activity of any of GIPR, GCSFR and REG Iα It can also be used for evaluation and confirmation. That is, the category of the screening method of the present invention includes not only the search for candidate substances but also those for the purpose of such evaluation or confirmation.
[0158]
Further, before carrying out the screening method of the present invention, a substance that suppresses the expression of the gene encoding each of the above-mentioned proteins of the present invention is determined to have a substance that suppresses the expression of the active ingredient of an IBD ameliorating or therapeutic drug ( It is possible to determine whether a substance that induces expression is useful as an active ingredient (candidate substance) for an IBD ameliorating or therapeutic agent. It is as follows. If it is determined by the experiment that the expression-suppressing substance of the gene of the present invention is likely to be a candidate substance, screening is performed by using the suppression of the function (activity) of the protein of the present invention encoded by the gene as an index, Candidate substances can be selected with higher accuracy, and when it is determined by the experiment that the expression-inducing substance of the gene of the present invention is highly likely to be a candidate substance, the function of the protein of the present invention encoded by the gene is determined. By performing screening using an increase in (activity) as an index, a candidate substance can be selected with higher accuracy.
[0159]
The control substance or the candidate substance selected by the screening method of the present invention described in the above (3-1) or (3-2) further includes a drug efficacy test using an animal model or the like well-known as an IBD animal model, It may be subjected to a sex test and further a clinical test for a patient suffering from IBD, and by performing these tests, a more practical improvement or therapeutic drug for IBD can be obtained. The substances selected in this manner can be industrially produced by chemical synthesis, biological synthesis (fermentation) or genetic manipulation based on the results of the structural analysis.
[0160]
All of the above animal models are known to those skilled in the art. For example, an animal model described in "In vivo models of Inflammation" edited by D.W. Morgan et al. (1999, Birkhauser Verlag Basel / Switzerland) can be used. Specifically, a spontaneously developing IBD model (C3H / HeJBir mouse, Cotton top tamarins, etc.) can be prepared by the method described in Gastroenterology, Vol. 107, pp. 1726-1735 (1994) and the like.
In addition, a model for inducing a chemical substance (for example, 2,4,6-nitrobenzenesulfonic acid or the like is used) can be prepared by the method described in Gastroenterology, Vol. 96, pp. 795-803 (1989).
[0161]
(4) IBD improvement / treatment agent
The present invention provides an agent for improving or treating IBD.
The present invention is based on the new finding that GIPR gene, GCSFR gene, REG Iα gene and proteins encoded by these genes are related to IBD. It is based on the idea that a substance that controls the expression or function (activity) of the protein to be produced is effective for ameliorating or treating the above-mentioned diseases. That is, the agent for improving or treating IBD of the present invention is a substance that controls the expression of any of the GIPR gene, GCSFR gene, and REG Iα gene, or the expression or function (activity) of any of GIPR, GCSFR, and REG Iα. ) Is used as an active ingredient.
[0162]
The GIPR gene, GCSFR gene, and REG Iα gene expression control substance, or GIPR, GCSFR, and REG Iα expression or function (activity) control substance, which are any of the active ingredients, can be obtained by the screening method described above. Not only those that have been selected by utilizing, but also those that have been industrially manufactured in accordance with ordinary methods based on information on the selected substances.
[0163]
A GIPR gene, GCSFR gene, or REG Iα gene expression control substance, or GIPR, GCSFR, or REG Iα expression or function (activity) control substance, as it is or a pharmaceutically acceptable substance known per se And a carrier (including excipients, extenders, binders, lubricants, etc.) and conventional additives to prepare a pharmaceutical composition. The pharmaceutical composition is prepared in the form (oral administration such as tablets, pills, capsules, powders, granules and syrups; parenteral administration such as injections, drops, external preparations and suppositories), etc. Can be administered orally or parenterally, depending on the patient. The dose varies depending on the kind of the active ingredient, the route of administration, the subject of administration or the age, body weight, symptoms of the patient and the like, and cannot be specified unconditionally. About mg can be administered once to several times a day.
[0164]
Further, if the above-mentioned substance is encoded by DNA, the DNA may be incorporated into a gene therapy vector to perform gene therapy. Furthermore, when the above-mentioned active ingredient substance is an antisense nucleotide against any of the GIPR gene, GCSFR gene and REG Iα gene, gene therapy can be performed as it is or by incorporating it into a gene therapy vector. Also in these cases, the dose and administration method of the gene therapy composition vary depending on the patient's body weight, age, symptoms, and the like, and can be appropriately selected by those skilled in the art.
[0165]
The gene therapy using the antisense nucleotide will be described in detail. In the gene therapy, for example, an antisense oligonucleotide or a chemically modified product thereof is directly administered into the body of a patient in the same manner as this type of gene therapy. By controlling the expression of the target gene by introducing the antisense RNA into a target cell of a patient, the expression of the target gene can be controlled by the method.
[0166]
Here, the “antisense nucleotide” includes an antisense oligonucleotide, an antisense RNA, an antisense DNA, and the like corresponding to a portion of at least 8 bases or more of the GIPR gene, GCSFR gene, or REG Iα gene. Specifically, antisense oligonucleotides, antisense RNAs, antisense DNAs, and the like corresponding to at least 8 bases or more of the base sequence described in any of SEQ ID NOs: 1 to 3 are included.
[0167]
Further, the chemically modified products include derivatives capable of enhancing the translocation into cells or the stability in cells, such as phosphorothioate, phosphorodithioate, alkylphosphotriester, alkylphosphonate, and alkylphosphamidate. ("Antisense RNA and DNA" published by WILEY-LISS, 1992, pp. 1-50, J. Med. Chem. 36, 1923-1937 (1993)). These can be synthesized according to a conventional method.
[0168]
The antisense nucleotide or a chemically modified product thereof can bind to the sense strand mRNA in the cell and regulate the expression of the gene of interest, that is, the expression of the GIPR gene, GCSFR gene, or REG Iα gene, and thus, GIPR, The function (activity) of GCSFR or REG Iα can be controlled.
[0169]
In a method of directly administering an antisense oligonucleotide or a chemically modified product thereof to a living body, the antisense oligonucleotide or a chemically modified product thereof is preferably 5-200 bases, more preferably 8-25 bases, and most preferably. Should have a length of 12-25 bases. Upon administration, the antisense oligonucleotide or a chemically modified product thereof can be formulated using commonly used stabilizers, buffers, solvents and the like.
In the method of introducing an antisense RNA into a target cell of a patient, the antisense RNA used is preferably at least 100 nucleotides, more preferably at least 300 nucleotides, and even more preferably at least 500 nucleotides in length. . In addition, this method introduces an antisense gene into cells in a living body.in vivoMethod and introducing the antisense gene into cells once removed from the body and returning the cells to the bodyex vivoIncluding the law (see Nikkei Science, April 1994, pp. 20-45, Monthly Pharmaceutical Affairs, 36 (1), 23-48 (1994), Experimental Medicine, 12 (15), all pages (1994), etc. ). Within thisin vivoThe method is preferably a viral transfer method (a method using a recombinant virus) or a non-viral transfer method (see the above-mentioned references).
[0170]
As a method using the above-mentioned recombinant virus, for example, an antisense nucleotide is incorporated into a virus genome of a retrovirus, an adenovirus, an adeno-associated virus, a herpes virus, a vaccinia virus, a polio virus, a simbis virus, etc., and introduced into a living body. Method. Among them, a method using a retrovirus, an adenovirus, an adeno-associated virus or the like is particularly preferable. Examples of the non-viral transfer method include a liposome method and a lipofectin method, and the liposome method is particularly preferable. Other non-viral introduction methods include, for example, a microinjection method, a calcium phosphate method, an electroporation method, and the like.
[0171]
The pharmaceutical composition for gene therapy contains, as an active ingredient, the above-described antisense nucleotide or a chemically modified product thereof, a recombinant virus containing the same, an infected cell into which the virus has been introduced, and the like. The form of administration of the composition to a patient, the route of administration, and the like can be appropriately determined depending on the disease, symptom, and the like to be treated. For example, it can be administered in a venous, arterial, subcutaneous, intramuscular, or the like in a suitable administration form such as an injection, or can be directly administered or introduced to a diseased site of a patient.in vivoWhen the method is employed, the composition for gene therapy may be, in addition to a dosage form such as an injection containing an antisense nucleotide of the GIPR gene, GCSFR gene, or REG Iα gene, for example, GIPR gene, GCSFR gene, or REG Iα gene. (Sendai virus (HVJ) -liposome or the like) in which a virus vector containing the antisense nucleotide of Example 1 is embedded in a liposome or a membrane fusion liposome. These liposome formulations include suspensions, freezers, centrifugal concentrates and freezers. The composition for gene therapy can also be in the form of a cell culture solution infected with a virus into which a vector containing the antisense nucleotide of the GIPR gene, GCSFR gene, or REG Iα gene has been introduced. The dosage of the active ingredient in these various forms of preparations can be appropriately adjusted depending on the degree of the disease to be treated, the age and weight of the patient, and the like. Usually, in the case of an antisense nucleotide for the GIPR gene, GCSFR gene, or REG Iα gene, an amount of about 0.0001-100 mg, preferably about 0.001-10 mg per adult patient is administered once every few days to several months. Good. In the case of a retroviral vector containing an antisense nucleotide, the retroviral titer is about 1 × 10^Threepfu-1 × 10^FifteenIt can be selected from the range of pfu. 1 x 10 for cells into which antisense nucleotides have been introduced^FourCells / body-1 × 10^FifteenCells / body may be administered.
[0172]
【Example】
Next, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the present invention is not limited to these examples.
[0173]
Example 1    Preparation of total RNA from human tissue samples
Total RNA was prepared from 117 samples of normal human colon tissue, 3 samples of colonic lesion tissue of a patient with ulcerative colitis, and 2 samples of colonic lesion tissue of a patient with Crohn's disease in accordance with a conventional method.
[0174]
In addition, 151 samples of normal human right atrial tissue, 140 samples of normal right ventricular tissue, 132 samples of normal left atrial tissue, 90 samples of normal myometrium, 90 samples of normal uterine cervix, 84 samples of normal breast tissue, and 77 samples of normal lung tissue , Thymus normal tissue 67 samples, ovarian normal tissue 62 samples, kidney normal tissue 61 samples, skin normal tissue 56 samples, small intestine normal tissue 48 samples, rectum normal tissue 46 samples, liver normal tissue 42 samples, leukocyte normal tissue 37 samples, stomach 37 normal tissue samples, 32 normal uterine tissues, 31 normal endometrial tissues, 30 normal muscle tissues, 28 normal prostate tissues, 26 normal spleen tissues, 25 normal adipose tissue samples, 20 normal pancreatic tissues, Esophageal normal tissue 20 samples, duodenal normal tissue 17 samples, thyroid normal tissue 13 samples, fallopian tube normal tissue 13 samples , Normal lymph node tissue 11 samples, venous normal tissue 8 samples, soft tissue normal tissue 7 samples, frontal cortex normal tissue 7 samples, hippocampal normal tissue 6 samples, retinal normal tissue 5 samples, left ventricular normal tissue 5 samples, larynx normal tissue 5 5 samples of normal heart tissue, 5 samples of normal temporal lobe cortex, 5 samples of bone normal tissue, 5 samples of adrenal normal tissue, 4 samples of seminal vesicle normal tissue, 4 samples of cerebellar normal tissue, and 4 samples of normal bladder tissue Total RNA was prepared according to a conventional method.
[0175]
Example 2    DNA chip analysis
DNA chip analysis was performed using total RNA prepared from the sample shown in Example 1. In addition, DNA chip analysis was performed using Affymetrix Gene Chip Human Genome U95 set. Specifically, analysis includes (1) preparation of cDNA from total RNA, (2) preparation of labeled cRNA from the cDNA, (3) fragmentation of labeled cRNA, and (4) fragmentation of cRNA and probe array. , (5) Probe array staining, (6) Probe array scanning, and (7) Gene expression analysis.
[0176]
(1) Preparation of cDNA from total RNA
11 μL of a mixed solution containing 10 μg of each total RNA obtained in Example 1 and 100 pmol of T7- (dT) 24 primer (manufactured by Amersham) was heated at 70 ° C. for 10 minutes, and then cooled on ice. After cooling, 4 μL of 5 × First Strand cDNA Buffer contained in SuperScript Choice System for cDNA Synthesis (manufactured by Gibco-BRL), 2 μL of 0.1 M DTT (dithiothreitol) included in the kit, and 1 μL of 10 mM dNTP Mix included in the kit Was added and heated at 42 ° C. for 2 minutes. Further, 2 μL (400 U) of Super ScriptII RT included in the kit was added, heated at 42 ° C. for 1 hour, and then cooled on ice. After cooling, 91 μL of DEPC-treated water (Nacalai Tesque) sterilized distilled water, 30 μL of 5 × Second Strand Reaction Buffer included in the kit, 3 μL of 10 mM dNTP Mix, included in the kitE. coli DNA Ligase 1μL (10U), included in the kitE. coli DNA Polymerase I 4 μL (40 U), included in the kitE. coli 1 μL (2 U) of RNaseH was added and reacted at 16 ° C. for 2 hours. Next, 2 μL (10 U) of T4 DNA Polymerase included in the kit was added, and the mixture was reacted at 16 ° C. for 5 minutes, and then 10 μL of 0.5 M EDTA was added. Next, 162 μL of a phenol / chloroform / isoamyl alcohol solution (Nippon Gene) was added and mixed. The mixture was transferred to Phase Lock Gel Light (manufactured by Eppendorf) that had been centrifuged at room temperature, 14,000 rpm and 30 seconds in advance, centrifuged at 14,000 rpm at room temperature for 2 minutes, and the 145 μL aqueous layer was placed in an Eppendorf tube. Moved to To the resulting solution, 72.5 μL of a 7.5 M ammonium acetate solution and 362.5 μL of ethanol were added and mixed, and then centrifuged at 14,000 rpm at 4 ° C. for 20 minutes. After centrifugation, the supernatant was discarded to obtain a pellet containing the produced cDNA. Thereafter, 0.5 mL of 80% ethanol was added to the pellet, and the mixture was centrifuged at 14,000 rpm at 4 ° C. for 5 minutes, and the supernatant was discarded. After performing the same operation again, the pellet was dried and dissolved in 12 μL of DEPC-treated water. Each cDNA was obtained from each total RNA prepared in Example 1 by the above operation.
[0177]
(2) Preparation of labeled cRNA from cDNA
5 μL of each cDNA solution, 17 μL of DEPC-treated water, 4 μL of 10 × HY Reaction Buffer contained in the BioArray High Yield RNA Transcript Labeling Kit (manufactured by ENZO), 4 μL of 10 × Biotin Labeled Ribonucleotides contained in the kit, contained in the kit 4 μL of 10 × DTT, 4 μL of 10 × RNase Inhibitor Mix included in the kit, and 2 μL of 20 × T7 RNA Polymerase included in the kit were mixed and reacted at 37 ° C. for 5 hours to prepare labeled cRNA. After the reaction, 60 μL of DEPC-treated water was added to the reaction solution, and the prepared labeled cRNA was purified using an RNeasy Mini Kit (GIAGEN) according to the attached protocol.
[0178]
(3) Fragmentation of labeled cRNA
To a solution containing 20 μg of each labeled cRNA, 8 μL of 5 × Fragmentation Buffer (200 mM Tris-acetic acid, pH 8.1 (Sigma), 500 mM potassium acetate (Sigma), 150 mM magnesium acetate (Sigma)) was added. 40 μL of the reaction solution was heated at 94 ° C. for 35 minutes and then placed on ice. Thereby, the labeled cRNA was fragmented.
[0179]
(4) Hybridization of fragmented cRNA and probe array
In 40 μL of each fragmented cRNA, 4 μL of 5 nM Control Oligo B2 (Amersham), 4 μL of 100 × Control cRNA Cocktail, 40 μg of Herring sperm DNA (Promega), 200 μg of Acetylated BSA (Gibco-BRL), 2 × MES Hybridization Buffer (200mM MES, 2M [Na⁺], 40 mM EDTA, 0.02% Tween20 (Pierce), pH 6.5 to 6.7) 200 μL and DEPC-treated water 144 μL were mixed to obtain 400 μL of a hybrid cocktail. Each of the obtained hybrid cocktails was heated at 99 ° C for 5 minutes, and further heated at 45 ° C for 5 minutes. After heating, the mixture was centrifuged at 14,000 rpm for 5 minutes at room temperature to obtain a hybrid cocktail supernatant.
[0180]
On the other hand, a Human genome U95 probe array (manufactured by Affymetrix) filled with 1 × MES hybridization buffer was rotated in a hybridization oven at 45 ° C. and 60 rpm for 10 minutes, and then the 1 × MES hybridization buffer was removed. A probe array was prepared. 200 μL of the hybrid cocktail supernatant obtained above was added to each of the probe arrays, and the mixture was rotated in a hybridization oven at 45 ° C. and 60 rpm for 16 hours to obtain a probe array hybridized with the fragmented cRNA.
[0181]
(5) Staining of probe array
After collecting and removing the hybrid cocktail from each of the hybridized probe arrays obtained above, Non-Stringent Wash Buffer (6 × SSPE (diluted 20 × SSPE (manufactured by Nacalai Tesque)), 0.01% Tween20, 0.005% Antifoam0 -30 (Sigma)). Next, a probe array hybridized with fragmented cRNA at a predetermined position of GeneChip Fluidics Station 400 (manufactured by Affymetrix) in which Non-Stringent Wash Buffer and Stringent Wash Buffer (100 mM MES, 0.1 M NaCl, 0.01% Tween 20) were set. I attached it. Then, according to the staining protocol EuKGE-WS2, primary staining solution (10 μg / mL Streptavidin Phycoerythrin (SAPE) (MolecμLar Probe), 2 mg / mL Acetylated BSA, 100 mM MES, 1 M NaCl (Ambion), 0.05% Tween 20, 0.005 % Antifoam 0-30), secondary staining solution (100 μg / mL Goat IgG (Sigma), 3 μg / mL Biotinylated Anti-Streptavidin antibody (Vector Laboratories), 2 mg / mL Acetylated BSA, 100 mM MES, 1 M NaCl, 0.05 % Tween 20, 0.005% Antifoam 0-30).
[0182]
(6) Probe array scan, and (7) Gene expression level analysis
Each stained probe array was subjected to HP GeneArray Scanner (manufactured by Affymetrix), and the staining pattern was read. Gene expression on the probe array was analyzed by GeneChip Workstation System (Affymetrix) based on the staining pattern. Next, after normalization was performed according to the analysis protocol, the expression level (average difference) of each probe (each gene) in each sample was calculated. With respect to the same probe, the average value of the gene expression level was determined for each sample type, and the rate of change in the expression level between each sample type was determined.
[0183]
Example 3    Expression fluctuation analysis
Genes with increased expression in colon lesion tissues of ulcerative colitis patients and Crohn's disease patients were selected as follows.
[0184]
From the results of gene expression analysis by DNA chip analysis performed in Example 2, the probe with the largest change rate among the probe sets whose expression is increased in the colon lesion tissue of the ulcerative colitis patient as compared with the normal colon tissue From the 400th to the 400th. In addition, as for the probe sets whose expression was increased in the colon lesion tissues of Crohn's disease patients as compared with the normal colon tissues, the 400th to the 400th probe sets were selected from those having a large change rate. Analyzes were performed on probes selected in common in both groups, and 142 probes were selected as probes that commonly increase expression.
[0185]
Next, from among these 142 probes, in order to select a probe having a higher relevance to the disease state, in a tissue other than an IBD-related tissue (gastrointestinal tract including the large intestine) and an immune system tissue involved in the mechanism of IBD pathogenesis, Probes with low expression levels were selected. That is, the expression levels of these 142 probes in 43 types of normal tissues including normal colon tissues were analyzed from the results of the DNA chip, and probes with low expression levels in tissues other than the digestive tract or immune system tissues were selected. Next, the genes corresponding to the selected probes were examined, and from these genes, genes having a function as a drug target were further selected.
As a result, a total of three genes, GIPR gene, GCSFR gene, and REG Iα gene, were selected.
[0186]
[Table 1]

[0187]
In the table, the Human U95 probe name indicates the probe name in the Human Genome U95 Chip. Acc No in the table indicates an accession number in the GenBank database. In the table, the fold variation indicates the gene expression level in the colon lesion tissue of a patient with ulcerative colitis or Crohn's disease when the gene expression level in normal colon tissue analyzed by the Human Genome U95 Chip is set to 1. In addition, SEQ ID NOs in the following sequence listing showing the nucleotide sequence and amino acid sequence of each gene are also shown.
[0188]
Among the selected genes, interleukin 1β, matrix protease 1, matrix protease 9, etc., which are already targets for IBD therapeutic drug development, are included. It was found that the expression increased and that the target gene for the therapeutic agent was selected. Those genes excluding these known target genes from the selected genes are the three genes described in Table 1.
[0189]
As described above, the three genes selected were specifically up-regulated in the colon tissue of IBD patients as compared to normal colon tissue, and were highly relevant to the disease state. . Therefore, these three genes and their expression products (proteins) were considered to be applicable as disease markers for IBD. In addition, it was considered that by using these genes or their expression products (proteins), it was possible to screen candidate therapeutic drugs that alleviate or control IBD.
[0190]
Example 4  Screening of GIPR gene, GCSFR gene and / or REG Iα gene expression regulator
[0191]
Caco-2 cells (derived from human colon adenocarcinoma, ATTC strain number HTB-37, Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.), HT-29 cells (derived from human colon adenocarcinoma, ATTC strain number HTB-38, Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.), Alternatively, COLO 205 cells (derived from human colon adenocarcinoma, ATTC strain number CCL-222, Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) were prepared by injecting 10% inactivated fetal calf serum, 2 mM glutamine, 50 IU / ml penicillin, and 50 mg / ml streptomycin-containing Dulbecco's Modified Culture in Eagle's medium at 37 ° C and 5% CO2 concentration. Transfer the counted Caco-2, HT-29 or COLO 205 cells to a 24-well tissue culture plate at 0.6-1.2 × 10^Five cells / cm^TwoSeed at 37 ℃, CO_TwoIncubate at a concentration of 5%. These cells are subjected to a test substance-containing solution (100 μM) in the presence of a stimulant (phorbol 12-myristate 13 acetate, cytokines (Interferonγ, Tumor necrosis factor-α, Interleukin-1, Interleukin-6, etc.) or Butyrate). , 10 μM, and 1 μM each containing a test substance). Here, as a control experiment, the same culture is performed for cells to which no test substance is added (control). Using the RNA extracted from each of these cultured cells, the expression level of the GIPR gene, GCSFR gene, and / or REG Iα gene is examined by the method described in Example 2. A test substance added to a culture system in which the expression level of the GIPR gene, GCSFR gene, and / or REG Iα gene varies by 10%, preferably 30%, particularly preferably 50% or more compared to the control based on the expression level Is selected as a candidate compound for alleviating and controlling (improving, treating) IBD.
[0192]
Example 5    Screening of GCSFR function (activity) regulator
Screening of a GCSFR function controlling agent can be carried out with reference to JP-A-6-100593. That is, a factor-dependent cell line, Paterson-G-CSF (FDCP-G), available from the Paterson Institute, UK, is cloned by limiting dilution in the presence of G-CSF. 2.5 × 10 in 100 μl RPMI 1640 + 10% FCS^Three An equal volume of RPMI 1640 + 10% FCS containing G-CSF is added to the FDCP-G cloned cells in the presence and absence of the test substance. The final volume of RPMI 1640 + 10% FCS in each well of a 96-well microtiter plate is 200 μl. The microtiter plate is incubated at 37 ° C. in 5% CO 2 for 4 days in a humidified incubator. 1.0 μCi of titrated thymidine is added per well and finally incubated for 6 hours. Cells are harvested on glass fiber filter paper and the concentration of radioactivity is determined by liquid scintillation counting. The G-CSF used was a recombinant human G-CSF available from Amersham (Amersham), and the amount of addition was an amount that gave a 50% maximum increase in 3H-thymidine incorporation in the absence of the above-mentioned experimental test compound. And
The GCSFR activity control rate of the test substance is calculated by the following formula:
| (3H-thymidine incorporation in the absence of test substance)-(3H-thymidine incorporation in the presence of test substance) | / (3H-thymidine incorporation in absence of test substance)
Is represented by
A test substance added to a system in which the GCSFR activity control rate fluctuates by 10%, preferably 30%, particularly preferably 50% or more, is selected as a candidate compound for reducing or controlling (improving or treating) IBD.
[0193]
Example 6  Screening of REG Iα function (activity) regulator
REG Iα can be prepared according to the method of Zenilman, ME et al., Gastroenterology, 110, 1208-1214, 1996 and Gross, J et al., J Clin Invest, 76, 2115-2126, 1985. That is, the bovine or human placenta is homogenized, ammonium sulfate fractionation is performed, and the precipitate fraction at the final stage of 70% saturation is dissolved, and then dissolution under acidic conditions and precipitation under neutral conditions are repeated. phenyl-TSK column) and Western blotting using a monoclonal antibody.
1-2 × 10 for RIN (pancreatic β cells) or ARIP (pancreatic acinar cells)^Five Plate in individual wells and culture overnight with Dulbecco's modified Ragle medium (DMEM) and 10% fetal calf serum. Wash wells 3 times with 1 mL phosphate-buffer sarine, then add 0.5-2 μCi / mL [3H] thymidine (Amersham), DMEM, 1% fetal calf serum and Reg Iα, in the presence and absence of test substance Incubate below for 30 to 72 hours. Wash 5 times with 1 mL of ice-cold phosphate-buffered saline, add 1 mL of 10% trichloroacetic acid and 10 mmol / L cold thymidine, and sediment the wells on ice. Wash three times with 100% methanol and dry. The precipitate can be dissolved in 400 μL of 0.5 N NaOH, added with 5 mL of Aquasol, and counted with a scintillation counter to measure the mitogenic activity. The addition amount of Reg Iα is an amount that gives a maximum increase of 50% in the incorporation of 3H-thymidine in the absence of the test compound in the experimental system.
The control rate of the mitogenic activity of the test substance is calculated by the following formula:
| (3H-thymidine incorporation in the absence of test substance)-(3H-thymidine incorporation in the presence of test substance) | / (3H-thymidine incorporation in absence of test substance)
Is represented by
A test substance that has been added to a system in which the control rate of mitogenic activity fluctuates by 10%, preferably 30%, particularly preferably 50% or more, is selected as a candidate compound for alleviating or controlling (improving or treating) IBD. .
[0194]
Example 8  Screening of GIPR function (activity) regulator
Screening based on the insulin stimulating activity of GIP can be carried out with reference to JP-A-2000-342109 (animals deficient in GIP receptor gene function). That is, insulin secretion ability of pancreatic β cells during GIP stimulation by the batch incubation method is measured. La islet is isolated from the pancreas of a male wild-type mouse (12 weeks old) and incubated with 8.3 mM glucose and 100 nM GIP at 37 ° C. for 30 minutes in the presence and absence of a test substance. The supernatant is collected by centrifugation, and the insulin concentration is measured by radioimmunoassay using an anti-insulin antibody using rat insulin (Novo) as a standard.
The control rate of the insulin secretion activity of the test substance is calculated by the following formula:
│ (insulin secretion in the absence of test substance) − (insulin secretion in the presence of test substance) │ / (insulin secretion in the absence of test substance)
Is represented by
A test substance added to a system in which the control rate of insulin secretion activity fluctuates by 10%, preferably 30%, particularly preferably 50% or more is selected as a candidate compound for alleviating or controlling (improving or treating) IBD.
[0195]
Example 9  Screening of GIPR function (activity) regulator
Screening based on cAMP increasing activity of GIPR can be carried out with reference to JP-A-6-239895. That is, a stable 293 cell line containing a PGPR gene linked to a pRc / CMV2 expression vector (Invitrogen) is grown in a 24-well plate until it is fully grown.
The cells obtained are then washed twice with incubation buffer [Dulbecco's modified Eagle's medium containing 0.5 mM 1-methyl-3-isobutylxanthine and 1 mg / ml BSA]. Incubate for about 45 minutes at 37 ° C. in a buffer containing GIP (0.5 ml) in the presence and absence of the test substance. After removing the solution, 0.5 ml of 60% ethanol is added to lyse the cells in each well. Remove 10 μl of sample, dry under reduced pressure and measure cAMP level. The measurement of the intracellular cAMP level is performed by a procedure described in Ishihara et al., (1991) using a cyclic AMP assay kit (catalog number TRK.432) commercially available from Amersham. The amount of GIP added is an amount that gives the maximum increase of intracellular cAMP level by 50% in the absence of the test compound in the experimental system.
The control rate of the cAMP elevating activity of the test substance is calculated by the following formula:
| (CAMP increasing activity in the absence of test substance)-(cAMP increasing activity in presence of test substance) | / (cAMP increasing activity in absence of test substance)
Is represented by
A test substance added to a system in which the control rate of cAMP elevating activity fluctuates by 10%, preferably 30%, particularly preferably 50% or more is selected as a candidate compound for alleviating and controlling (improving, treating) IBD.
[0196]
【The invention's effect】
According to the present invention, genes (GIPR gene, GCSFR gene, and REG Iα gene) whose expression is specifically increased in colon lesion tissues of IBD patients (ulcerative colitis and Crohn's disease) as compared with normal colon tissues are identified. It was revealed. Such a gene is useful as a marker gene (probe, primer) used for genetic diagnosis of IBD. According to such a marker gene, it is possible to clarify whether or not the disease is IBD (improvement in diagnostic accuracy), thereby enabling more appropriate treatment to be performed. That is, it can be used as a tool for appropriate treatment of IBD.
[0197]
Further, from the relationship between the increase in the expression of the above gene and IBD, a compound that regulates the expression of the gene is considered to be useful as a therapeutic drug for IBD. Therefore, by controlling or varying the expression of these genes, or controlling or varying the expression or function (activity) of the protein encoded by the gene as an index, screening and selecting candidate drugs that can be therapeutic agents for IBD. Is possible. The present invention also provides such an IBD therapeutic drug development technique.
[0198]
[Sequence list]

Claims

An inflammatory bowel disease comprising a polynucleotide having at least 15 consecutive nucleotides and / or a polynucleotide complementary to the polynucleotide in the nucleotide sequence of the GIPR gene, the nucleotide sequence of the GCSFR gene, or the nucleotide sequence of the REG Iα gene ( Inflammatory bowel disease (hereinafter IBD).

The disease marker according to claim 1, which is used as a probe or a primer in the detection of IBD.

A method for detecting IBD, comprising the following steps (a), (b) and (c):
(A) binding RNA prepared from a biological sample of a subject or a complementary polynucleotide transcribed therefrom to the disease marker according to claim 1 or 2,
(B) measuring RNA from a biological sample bound to the disease marker or a complementary polynucleotide transcribed from the RNA, using the disease marker as an index,
(C) determining the presence of IBD based on the measurement result of (b).

The determination of the presence of IBD in the step (c) is performed using the measurement result obtained for the subject as a marker as compared with the measurement result obtained for a normal person as an index of an increase in the amount of binding to a disease marker. Item 4. The method for detecting an IBD according to Item 3.

An IBD disease marker containing an antibody that recognizes GIPR, GCSFR, or REG Iα.

The disease marker according to claim 5, which is used as a probe in detecting IBD.

An IBD detection method comprising the following steps (a), (b) and (c):
(A) binding a protein prepared from a subject's biological sample to the disease marker according to claim 5 or 6;
(B) measuring a protein derived from a biological sample bound to the disease marker using the disease marker as an index,
(C) determining the presence of IBD based on the measurement result of (b).

The method according to claim 1, wherein the determination of the presence of IBD in the step (c) is performed by comparing the measurement result obtained for the subject with the measurement result obtained for a normal person and using the increase in the amount of binding to the disease marker as an index. 7. The method for detecting IBD according to 7.

A method for screening a substance that regulates the expression of any of the GIPR gene, GCSFR gene, or REG Iα gene, comprising the following steps (a), (b), and (c):
(a) contacting a test substance with a cell capable of expressing any of the GIPR gene, GCSFR gene, and REG Iα gene,
(b) measuring the expression level of any of the GIPR gene, GCSFR gene, and REG Iα gene in the cells contacted with the test substance, and measuring the expression level of the corresponding gene in control cells not contacted with the test substance; The process of comparing with the quantity,
(c) a step of selecting a test substance that changes the expression level of any of the GIPR gene, GCSFR gene, and REG Iα gene based on the comparison result of (b).

A method for screening a substance that regulates the expression of any of GIPR, GCSFR and REG Iα, comprising the following steps (a), (b) and (c):
(a) contacting the test substance with GIPR, GCSFR, and cells capable of expressing any of REG Iα,
(b) The expression level of any of GIPR, GCSFR, and REG Iα in the cells contacted with the test substance is measured, and the expression level is compared with the expression level of the corresponding protein in control cells not contacted with the test substance. Process,
(c) a step of selecting a test substance that changes the expression level of any of GIPR, GCSFR, and REG Iα based on the comparison result of (b) above.

A method for screening a substance that controls the function or activity of GIPR, GCSFR, or REG Iα, comprising the following steps (a), (b), and (c):
(a) contacting the test substance with GIPR, GCSFR, or REG Iα;
(b) measuring the function or activity of GIPR, GCSFR, or REG Iα resulting from the step (a), and measuring the function or activity of GIPR, GCSFR, or REG Iα when the test substance is not contacted with the function or activity. Or a step of comparing with activity,
(c) a step of selecting a test substance that causes a change in the function or activity of GIPR, GCSFR, or REG Iα based on the comparison result of (b).

The screening method according to any one of claims 9 to 11, which is a method for searching for an active ingredient of an agent for improving or treating IBD.

An agent for improving or treating IBD, comprising a substance that controls the expression of any of the GIPR gene, GCSFR gene, and REG Iα gene as an active ingredient.

14. The agent for improving or treating IBD according to claim 13, wherein the substance that controls the expression of any of the GIPR gene, GCSFR gene, and REG Iα gene is obtained by the screening method according to claim 9.

An agent for improving or treating IBD, comprising, as an active ingredient, a substance that controls the expression level, function or activity of any one of GIPR, GCSFR and REG Iα.

The improvement or treatment of IBD according to claim 15, wherein the substance that controls the expression level, function, or activity of any of GIPR, GCSFR, and REG Iα is obtained by the screening method according to claim 10 or 11. Agent.