JP2003533971A - オリゴヌクレオチドを定量するための方法 - Google Patents

オリゴヌクレオチドを定量するための方法

Info

Publication number
JP2003533971A
JP2003533971A JP2001536770A JP2001536770A JP2003533971A JP 2003533971 A JP2003533971 A JP 2003533971A JP 2001536770 A JP2001536770 A JP 2001536770A JP 2001536770 A JP2001536770 A JP 2001536770A JP 2003533971 A JP2003533971 A JP 2003533971A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
oligonucleotide
probe
oligonucleotides
label
modification
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
JP2001536770A
Other languages
English (en)
Inventor
ベーカー，ブレンダ・エフ
ユー，ジェンロン
リーズ，ジャネット・エム
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Ionis Pharmaceuticals Inc
Original Assignee
Isis Pharmaceuticals Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Isis Pharmaceuticals Inc filed Critical Isis Pharmaceuticals Inc
Publication of JP2003533971A publication Critical patent/JP2003533971A/ja
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/6823—Release of bound markers

Abstract

(57)【要約】 体液および／または抽出物の試料におけるオリゴヌクレオチドの量を定量する方法およびプロセスを提供する。提供する方法およびプロセスは、特異的核酸の配置および構造を認識する酵素を利用する高感度アッセイを提供することにより、治療および／または薬物動態的な目的のためのオリゴヌクレオチドの検出および／または位置測定を可能にする。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 関連する出願 本出願は、1999年11月12日に出願された、米国仮出願シリアルNo. 60/165,184
に対して35 U.S.C. §119(e)のもとで優先権を主張する。
【０００２】 発明の分野 本発明は、体液および／または抽出物の試料においてオリゴヌクレオチドを検
出する方法を示す。本発明は、オリゴヌクレオチド捕獲（capture）技術を、特
異的DNA/RNA構造モチーフを認識する構造特異的酵素および検出／標識化システ
ムを組み合わせた、高感度なプロセスおよび方法が含まれる。これらのプロセス
および方法を使用して、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド療法を行う患
者から得た体液および抽出物において、投与されたオリゴヌクレオチドを検出、
配置および定量することができる。本発明は、動物モデルにおけるオリゴヌクレ
オチドの薬物動態学的特性を研究することに対してさらに使用される。
【０００３】 発明の背景 細胞、細胞群、あるいは溶液中に存在する特異的核酸配列の検出は、一般的に
当該技術分野で知られている。Southern（J.Mol.Biol. 98:503-527 (1975)）は
、DNA断片の膜への“ブロッティング”あるいはトランスファーを使用してゲル
電気泳動、続く放射性プローブおよびオートラジオグラフィーと変性DNA断片と
のハイブリダイゼーションにより、分離されたDNA断片間の特異的配列の検出を
教示する。この手順は、細胞あるいは組織から抽出されたRNA分子の検出にまで
拡大された。さらなる改良は、組織あるいは細胞由来のDNAあるいはRNAを検出す
るためのより迅速でより定量的な“ドット-ブロッティング”手順を含んだ。
【０００４】 特異的核酸配列および配列変化を検出および特徴付けするために使用されうる
様々な方法が、当該技術分野で知られている。これらの方法は、目的の配列の非
常に低いコピー数から検出可能なシグナルをつくることができなければならない
。核酸検出のアプローチの例は；Cohenらの米国特許5,420,265に記載されるよう
なキャピラリーゲル電気泳動（CGE）、たとえば、ポリメラーゼ連鎖反応（Mulli
sおよびMullisらに対する米国特許4,683,195および4,683,202）あるいはリガー
ゼ連鎖反応（Barany, Proc.Natl.Acad.Sci., 88:189 (1991)により記載される）
などのシグナル増幅技術、およびサザンおよびノーザンブロッティングなどの直
接検出技術、である。
【０００５】 最近、かなりの関心が、治療剤としての合成オリゴヌクレオチドの開発におい
て生じた。これらのアンチセンス分子およびそれらの使用に対するアプローチは
、Agarwal, Trends in Biotechnology 10:152-158 (1991)にレビューされた。効
果的なアンチセンス療法のために、オリゴヌクレオチドは患者に導入／投与され
なければならなく、そのように設計された特異的核酸標的に到達しなければなら
ない。従って、体液および抽出物においてオリゴヌクレオチド薬物を検出できる
必要がある。動物モデルでは、放射標識オリゴヌクレオチドを被験体に投与し、
体内のオリゴヌクレオチドの分布をオリゴヌクレオチドの抽出、続くオートラジ
オグラフィーにより評価した（Agarwal et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 88:75
95-7599 (1991)）。現行手順の一般的な観点は、大きなDNAあるいはRNA分子（>
100bp）の検出である。アンチセンス療法で使用されるオリゴヌクレオチドが小
サイズ（20-30bp）であるため、例えば、偽陰性／陰性を産生するプローブに対
する非特異的結合あるいは結合が存在しないなどの、それらの検出に関連する特
別な問題が存在する。
【０００６】 Lyamichevら（Nature Biotechnology 17:292-296 (1999)）は、DNA合成中に発
生するDNAの対になっていない断片の除去を担う酵素を使用するアプローチを記
載し、そのなかで、増幅（growing）上流オリゴヌクレオチドの3'末端において
、下流のオリゴヌクレオチドの5'末端の配列が置換される。このアプローチでは
、ユーバクテリアPol A DNAポリメラーゼ、子ウシ由来5'→3'エクソヌクレアー
ゼ、バクテリオファージT5と関連する5'ヌクレアーゼ、FEN1、RAD2、および真核
生物由来色素性乾皮症-相補性G群エンドヌクレアーゼホモログなどの酵素を使用
して、上流オリゴヌクレオチドの導入、不完全なハイブリダイゼーションの獲得
、およびプライマーが伸展しないことによってつくられる切断可能フラップ（fl
ap）（上流断片の5'末端上のリダンダントな非ハイブリダイズ１本鎖核酸部分）
を除去する。Lyamichevらは、このアプローチを使用してサブ-アトモルレベルで
複合体混合液におけるDNA標的の検出を記載する。
【０００７】 Lyamichevらは、FEN1ヌクレアーゼを使用して、標的DNAを検出および特徴付け
できることを示す。標的DNAの事前に決定された領域に相補的なオリゴヌクレオ
チドプローブの重複する対を加えることにより、下流プローブのオーバーハング
するフラップの切断は、標的配列の存在についての高感受性な指標となる。下流
オリゴヌクレオチドプローブの複数のコピーは、温度循環を用いずに各々の標的
配列について切断され、それは切断シグナルを増幅させ、また標的DNAの定量的
検出を可能にする。FEN1ヌクレアーゼおよび蛍光標識シグナルプローブを使用す
ることにより、Lyamichevらは反応がシグナルプローブの融解温度の近くの温度
で行われるときに、シグナルプローブの循環を起こすことができることを示す。
これらの条件の下、個々のシグナルプローブはほんの一時的にDNA標的上のそれ
らの相補的部位を占有し、（過剰なシグナルプローブを用いた条件の下で行われ
るとき）頻繁なプローブ交換を起こさせ、そのために温度循環を用いずに増幅を
起こさせる。このアプローチのさらなる例および使用は、Dahlbergらの米国特許
5,888,789 (1999)、Kaiser らの米国特許5,843,669 (1998)およびDahlbergらの
米国特許5,837,450に記載される。Lyamichev、Dahlberg、およびKaiserにより記
載される様々なヌクレアーゼは、Harringtonらの米国特許5,874,283（1999）お
よびDahlbergらの米国特許5,614,402において開示された。
【０００８】 米国特許No. 5,637,464は、オリゴヌクレオチドを含む試料と標的と相補的な
標識化プライマーおよび非標識化ヘルパーオリゴヌクレオチドとを接触させるこ
とにより、標的オリゴヌクレオチドを検出する方法を開示する。プライマーおよ
び補助オリゴヌクレオチドは、一度ハイブリダイズすると、DNAリガーゼによっ
て結合する。
【０００９】 特異的核酸配列および配列変化の検出および特徴付けの両方は、感染の指標と
なるウイルス性あるいは細菌性の核酸配列の存在を決定するために有用であった
。そのようなアプローチのさらなる使用により、疾患に関連する哺乳類の遺伝子
の変異あるいはアリルの存在の検出、法廷用の（forensic）試料において見出さ
れる核酸の起源の同定、ならびに父系確定が可能となった。
【００１０】 前述の文献および／または特許のそれぞれは、デオキシリボ-核酸およびリボ-
核酸分子を検出および／または特徴付けするためのアプローチを記載する。アン
チセンス療法などのオリゴヌクレオチド化合物の検出のための感受性な方法ある
いはプロセスの設計が、長い間必要であると思われていた、および思われ続けて
いる。高感度な方法は、動物モデルおよび／または診療所においてオリゴヌクレ
オチド療法の濃度を決定するために有用であろう。さらなる使用により、動物モ
デルおよび／または診療所においてオリゴヌクレオチド療法の薬物動態的特性を
研究できるであろう。
【００１１】 発明の概要 本発明は、体液および抽出物においてオリゴヌクレオチドを検出するための方
法およびプロセスに関する。方法およびプロセスは、投与された修飾あるいは非
修飾オリゴヌクレオチドの定量、および／または修飾あるいは非修飾オリゴヌク
レオチド化合物の薬物動態の研究に関して特に有用である。
【００１２】 本発明の一つの態様は、体液あるいは抽出物中のオリゴヌクレオチドを検出あ
るいは定量する方法であって、以下のステップ：前記液あるいは抽出物と、前記
ヌクレオチドと相補的なプローブであってその一末端に前記オリゴヌクレオチド
とハイブリダイズしない領域を含むもの、とを接触させて、ハイブリッドを形成
させ、二重鎖またはハイブリッドを形成させること；前記ハイブリッドと、前記
オリゴヌクレオチドとハイブリダイズしない前記プローブの前記領域の向かい側
の前記オリゴヌクレオチドに検出可能な標識を取り込ませることを目的とする酵
素および検出可能な標識とを接触させること；および、その存在が前記オリゴヌ
クレオチドの存在を示す、前記標識を検出すること；を含む前記方法である。好
ましくは、体液は血漿である。都合のよいことに、オリゴヌクレオチドは少なく
とも一つのホスホロチオエート結合を含む。この好ましい態様の一つの観点では
、オリゴヌクレオチドは少なくとも一つの糖部分の2'位に修飾を含む。好ましく
は、2'修飾は2'-O-メトキシエチル修飾である。都合のよいことに、オリゴヌク
レオチドは少なくとも一つの修飾塩基を含む。好ましくは、修飾塩基は5-メチル
シトシンである。この好ましい態様の一つの観点では、標識は比色性、放射性、
化学発光性、酵素性あるいは蛍光性である。都合のよいことに、標識はジゴキシ
ゲニンである。好ましくは、酵素はDNAポリメラーゼである。この好ましい態様
の一つの観点では、オリゴヌクレオチドは外来的に投与される。
【００１３】 本発明はまた、体液あるいは抽出物中のオリゴヌクレオチドを検出あるいは定
量する方法であって、以下のステップ：前記液あるいは抽出物と、前記ヌクレオ
チドと相補的な捕獲プローブであってその一末端に前記オリゴヌクレオチドとハ
イブリダイズしない領域を含むもの、とを接触させて、ハイブリッドを形成させ
ること；オリゴヌクレオチドと検出可能なプローブとをライゲートできる酵素の
存在下において、前記ハイブリッドと、前記オリゴヌクレオチドとハイブリダイ
ズしない前記捕獲プローブとを、接触させること；および、その存在が前記オリ
ゴヌクレオチドの存在を示す、前記標識を検出すること；を含む、前記方法も提
供する。好ましくは、体液は血漿である。都合のよいことに、オリゴヌクレオチ
ドは少なくとも一つのホスホロチオエート結合を含む。この好ましい態様の一つ
の観点では、オリゴヌクレオチドは少なくとも一つの糖部分の2'位に修飾を含む
。好ましくは、2'修飾は2'-O-メトキシエチル修飾である。都合のよいことに、
オリゴヌクレオチドは少なくとも一つの修飾塩基を含む。好ましくは、修飾塩基
は5-メチルシトシンである。この好ましい態様の一つの観点では、標識は比色性
、放射性、化学発光性、酵素性あるいは蛍光性である。好ましくは、標識はジゴ
キシゲニンである。この好ましい態様のもう一つの観点では、酵素はDNAリガー
ゼである。都合のよいことに、オリゴヌクレオチドは外来的に投与される。
【００１４】 本発明のもう一つの態様は、体液あるいは抽出物中のオリゴヌクレオチドを検
出あるいは定量する方法であって、以下のステップ：前記液あるいは抽出物と、
前記オリゴヌクレオチドおよび二次プローブに相補的な捕獲プローブとを接触さ
せること；ここで、前記捕獲プローブは検出可能なマーカーと前記オリゴヌクレ
オチドに結合する部分とを含み、前記二次プローブは前記検出可能マーカーと結
合する第1部分と前記オリゴヌクレオチドに結合して複合体を形成する際にフラ
ップを産生する第2部分とを含み；前記複合体とヌクレアーゼとを接触させて、
前記フラップを切断させること；および、前記フラップを検出すること；を含む
、前記方法である。好ましくは、体液は血漿である。都合のよいことに、オリゴ
ヌクレオチドは少なくとも一つのホスホロチオエート結合を含む。この好ましい
態様の一つの観点では、オリゴヌクレオチドは少なくとも一つの糖部分の2'位に
修飾を含む。好ましくは、2'修飾は2'-O-メトキシエチル修飾である。都合のよ
いことに、オリゴヌクレオチドは少なくとも一つの修飾塩基を含む。好ましくは
、修飾塩基は5-メチルシトシンである。この好ましい態様の一つの観点では、ヌ
クレアーゼは、ユーバクテリアPol A DNAポリメラーゼ、子ウシ由来5'→3'エク
ソヌクレアーゼ、バクテリオファージT5と関連する5'ヌクレアーゼ、FEN1、RAD2
、および真核生物由来色素性乾皮症-相補性G群エンドヌクレアーゼホモログであ
る。好ましくは、オリゴヌクレオチドは外来的に投与される。
【００１５】 本発明のさらなる観点は、好ましい態様の記述内に記載される。上記の本発明
の概要は限定されず、本発明のその他の特徴および有利性は、本発明の以下の詳
細な説明および請求項から明らかであろう。
【００１６】 発明の詳細な説明 本発明は、体液および／または抽出物において、オリゴヌクレオチド、特に修
飾オリゴヌクレオチドを検出するための高感度な方法を提供する。一態様におい
て、オリゴヌクレオチドは動物、好ましくは哺乳類、さらに好ましくはヒト、に
外来的に投与される。キャピラリーゲル電気泳動（CGE）などのオリゴヌクレオ
チドを検出および／または定量するための現在の方法は、従来のスラブ-ゲル電
気泳動と比較すると、小分子の向上した検出を提供する。CGEは、DNA制限断片、
タンパク質およびオリゴヌクレオチドなどの生物学的な巨大分子のサイズに基づ
く分離に使用された。本明細書中に記載する方法は、CGEなどの方法と比較する
と、生物学的な試料においてオリゴヌクレオチドの検出の感度に関して500-1000
倍の増加を提供する。
【００１７】 一態様において、被験体に投与したオリゴヌクレオチドは、被験体から体液お
よび／または抽出物の試料を得て、試料とプローブおよび構造特異的ヌクレアー
ゼとを接触させることにより検出する。捕獲プローブは、検出可能な標識と相互
作用することにより検出できる検出可能なマーカーを含む。検出および定量は、
検出可能な標識の（1または複数の）結合パートナーおよび／または（1または複
数の）基質を介する。一態様において、オリゴヌクレオチドは一つあるいはそれ
以上の修飾を含む。
【００１８】 本発明の文脈において、用語“オリゴヌクレオチド”は、リボ核酸あるいはデ
オキシリボ核酸のオリゴマーあるいはポリマーのことである。一態様において、
オリゴヌクレオチドはアンチセンスオリゴヌクレオチドである。用語“オリゴヌ
クレオチド”は、天然に存在する核塩基、糖および共有糖間（バックボーン）結
合から成るオリゴヌクレオチドならびに同様に機能する天然に存在しない部分を
有するオリゴヌクレオチドを含む。そのような“修飾”あるいは置換オリゴヌク
レオチドは、例えば、細胞性取り込みの亢進、標的への結合の亢進、ヌクレアー
ゼの存在下での安定性の増加および生物学的利用能の増加のなどの望ましい特性
のため、しばしば天然型以上に好ましい。
【００１９】 “修飾”オリゴヌクレオチドの概念の中では、本発明はキメラ化合物であるオ
リゴヌクレオチド化合物を用いる組成物の検出も含む。“キメラ”オリゴヌクレ
オチド化合物あるいは“キメラ”は、本発明の文脈において、二つあるいはそれ
以上の化学的に異なる領域、その各々は少なくとも一つのモノマーユニット、す
なわちオリゴヌクレオチド化合物の場合はヌクレオチド、で構成される領域を含
有する核酸化合物、特にはオリゴヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレオ
チドは、オリゴヌクレオチドがヌクレアーゼ分解に対する抵抗性の亢進、細胞性
取り込みの亢進をオリゴヌクレオチドに与えるように修飾される、少なくとも一
つの領域を典型的に含有し、および／または相補活性を修飾することが知られて
いるオリゴマー配列からなる。オリゴヌクレオチドの追加的な領域は、RNA：DNA
あるいはRNA：RNAハイブリッドを切断できる酵素の基質として働きうる。例とし
て、RNase HはRNA：DNA二本鎖のRNA鎖を切断する細胞性エンドヌクレアーゼであ
る。従って、RNase Hの活性化により、RNA標的が切断され、それによって遺伝子
発現のオリゴヌクレオチド阻害の効率が大きく亢進する。結果的に、キメラオリ
ゴヌクレオチドを使用する際に、同じ標的領域にハイブリダイズするホスホロチ
オエートオリゴデオキシヌクレオチドと比較して、より短いオリゴヌクレオチド
を用いて比較可能な結果をしばしば得ることができる。RNA標的の切断は、ゲル
電気泳動により、もし必要なら、当該技術分野で既知の関連する核酸ハイブリダ
イゼーション技術により日常的に検出できる。RNase H媒介標的切断は、核酸を
切断するためのリボザイムの使用とは異なる。
【００２０】 例として、そのような“キメラ”は“ギャップマー”、すなわちオリゴヌクレ
オチドの中央部分（“ギャップ”）が、例えばRNase Hの基質として働き、5'お
よび3'部分（“ウイング”）が標的RNAに対する親和性、あるいは標的RNAと二本
鎖となる際の安定性の増大を有するような様式で修飾されるが、ヌクレアーゼ活
性は支持しない（例えば、2'-フルオロ-あるいは2'-メトキシエトキシ-置換）オ
リゴヌクレオチド、でありうる。その他のキメラは“ヘミマー”、すなわち、オ
リゴヌクレオチドの5'部分が、例えばRNase Hの基質として働くが、3'部分が標
的RNAに対する親和性、あるいは標的RNAと二本鎖となる際の安定性の増大を有す
るような様式で修飾されるが、ヌクレアーゼ活性は支持しない（例えば、2'-フ
ルオロ-あるいは2'-メトキシエトキシ-置換）、あるいはその逆であるオリゴヌ
クレオチド、を含む。
【００２１】 より大きなオリゴヌクレオチド：RNA二本鎖の安定性を与えるオリゴヌクレオ
チドに対する多くの化学的修飾は、Freierら（Nucl. Acids Res., 1997, 25, 44
29）により記載された。そのような修飾は、キメラオリゴヌクレオチドのRNase
H-不応部分にとって好ましく、標的RNAに対するアンチセンス化合物の親和性を
亢進させるために一般的に使用されうる。
【００２２】 キメラ修飾オリゴヌクレオチド化合物は、上記の二つあるいはそれ以上のオリ
ゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシドおよび／または
本明細書に記載されるオリゴヌクレオチド模倣物の合成構築物、リガンド-オリ
ゴヌクレオチド構造物、あるいは補体（complement）タンパク質-オリゴヌクレ
オチド構造物として形成されうる。これらの化合物のいくつかは、ハイブリッド
あるいはギャップマーとして当該技術分野で言及された。これらのハイブリッド
構築物のいくつかの調製を教示する代表的な米国特許は、米国特許5,013,830；5
,149,797；5,220,007；5,256,775；5,366,878；5,403,711；5,491,133；5,565,3
50；5,623,065；5,652,355；5,652,356；5,955,589および5,700,922を含むが、
これらには限定されず、それらの特定のものは一般に所有されるものであり、そ
して参考文献としてそのそれぞれを本明細書中に援用する。
【００２３】 オリゴヌクレオチド分子に対する修飾により、分子を設計する効果を顕在化す
るために必要な分子の濃度を変えることができる。限定的ではない例としては、
オリゴヌクレオチドにおけるホスホロチオエート結合の量の変更、あるいはKrie
gら（Nature 1995 374:546-549）、Weinerら（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 199
7 94:10833-10837）、Liu, HMら（Blood 1998 15;92(10):3730-3736）、Boggs,
RTら（Antisense Nucleic Acid Drug Dev 1997 7(5):461-471）、およびKlineら
（J.Immunol 1998 15;160(6):2555-2559）により記載されるようにCpGオリゴデ
オキシヌクレオチドの調製におけるようなオリゴヌクレオチド塩基組成物および
化学的性質の変化が含まれる。
【００２４】 オリゴヌクレオチド内の特定の位置に関して実質的にキラル的に純粋なオリゴ
ヌクレオチドを用いる組成物もまた、本発明の方法により検出可能である。実質
的にキラル的に純粋なオリゴヌクレオチドの例は、少なくとも75％のSpあるいは
Rpであるホスホロチオエート結合を有するもの（米国特許5,587,361）、および
実質的にキラル的に純粋な（SpあるいはRp）アルカリホスホネート、ホスホール
アミダイトあるいはホスホトリエステル結合（米国特許5,212,295および5,521,3
02）を有するものを含むが、これらには限定されない。
【００２５】 本発明により検出可能ないくつかの好ましい修飾オリゴヌクレオチドの具体的
な例には、ホスホロチオエート（P=Sオリゴヌクレオチド）、ホスホトリエステ
ル、メチルホスホネート、短鎖アルキルあるいはシクロアルキル糖間結合あるい
は短鎖へテロ原子あるいはヘテロ環式糖間結合を含有するものが含まれる。修飾
バックボーンを有するオリゴヌクレオチドには、バックボーンにリン原子を保持
するもの、およびバックボーンにリン原子を保持しないものが含まれる。本明細
書の目的のため、および当該技術分野で時々参照されるように、ヌクレオシド間
バックボーンにリン原子を持たない修飾オリゴヌクレオチドも、オリゴヌクレオ
シドであると考えることもできる。
【００２６】 修飾オリゴヌクレオチドバックボーンの例には、ホスホロチオエート、キラル
ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアル
キルホスホトリエステル、3'-アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネー
トを含むメチルおよびその他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、3'-ア
ミノホスホールアミデートおよびアミノアルキルホスホールアミデートを含むホ
スホールアミデート、チオノホスホールアミデート、チオノアルキルホスホネー
ト、チオノアルキルホスホトリエステル、および正常な3'-5'結合を有するボラ
ノホスホネート、2'-5'結合したこれらの類似体、そしてヌクレオシドユニット
の隣接する塩基対が、5'-3'に対して3'-5'あるいは5'-2'に対して2'-5'に結合す
る、逆向きの極性を有するもの、が含まれる。様々な塩、混合塩、そして遊離酸
型も含まれる。
【００２７】 上述したリン-含有結合の調製を教示する代表的な米国特許には、U.S.: 3,687
,808；4,469,863；4,476,301；5,023,243；5,177,196；5,188,897；5,264,423；
5,276,019；5,278,302；5,286,717；5,321,131；5,399,676；5,405,939；5,453,
496；5,455,233；5,466,677；5,476,925；5,519,126；5,536,821；5,541,306；5
,550,111；5,563,253；5,571,799；5,587,361；および5,625,050が含まれるが、
これらには限定されず、それらの特定のものは、本出願により一般に所有される
ものであり、そして参考文献としてそのそれぞれを本明細書中に援用する。
【００２８】 その中にリン原子を含まない修飾オリゴヌクレオチドバックボーンのさらなる
例は、短鎖アルキルあるいはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合へテロ原
子そしてアルキルあるいはシクロアルキルヌクレオシド間結合、あるいは1ある
いはそれ以上の短鎖へテロ原子あるいはヘテロ環式ヌクレオシド間結合により形
成される、バックボーンを有する。これらには、モルホリノ結合（部分的にヌク
レオシドの糖部分から形成される）；シロキサンバックボーン；スルフィド、ス
ルホキシドおよびスルホンバックボーン；ホルムアセチルおよびチオホルムアセ
チルバックボーン；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチルバックボ
ーン；アルケン含有バックボーン；スルファメートバックボーン；メチレンイミ
ノおよびメチレンヒドラジノバックボーン；スルホネートおよびスルホンアミド
バックボーン；アミドバックボーン；および混合N、O、SおよびCH2構成要素部分
を有するその他のもの、を有するものが含まれる。
【００２９】 上記のオリゴヌクレオシドの調製を教示する代表的な米国特許には、米国特許
5,034,506；5,166,315；5,185,444；5,214,134；5,216,141；5,235,033；5,264,
562；5,264,564；5,405,938；5,434,257；5,466,677；5,470,967；5,489,677；5
,541,307；5,561,225；5,596,086；5,602,240；5,610,289；5,602,240；5,608,0
46；5,610,289；5,618,704；5,623,070；5,663,312；5,633,360；5,677,437；お
よび5,677,439が含まれるが、これらには限定されず、それらの特定のものは、
本出願により一般に所有される。
【００３０】 その他の例のオリゴヌクレオチド模倣物において、ヌクレオチドユニットの糖
およびヌクレオシド間結合の両方、すなわち、バックボーンを、新規の基により
置換する。塩基ユニットは、適した核酸標的化合物とのハイブリダイゼーション
のために維持される。優れたハイブリダイゼーション特性を有すると示されたそ
のようなオリゴマー化合物の一つであるオリゴヌクレオチド模倣物は、ペプチド
核酸（PNA）とも呼ばれている。PNA化合物において、オリゴヌクレオチドの糖-
バックボーンは、アミド含有バックボーン、特にアミノエチルグリシンバックボ
ーンにより置換される。核塩基を保持し、そしてバックボーンのアミド部分のア
ザ窒素原子に直接的あるいは間接的に結合する。PNA化合物の調製を教示する代
表的な米国特許には、米国特許5,539,082；5,714,331；および5,719,262が含ま
れるが、これらだけには限定されない。PNA化合物のさらなる教示は、Nielsenら
（Science, 1991, 254, 1497-1500）中に見出すことができる。
【００３１】 さらなる例は、ホスホロチオエートバックボーンを有するオリゴヌクレオチド
およびヘテロ原子バックボーンを有するオリゴヌクレオシドであり、特に上述の
米国特許5,489,677の-CH2-NH-O-CH2-、-CH2-N（CH3）-O-CH2-〔メチレン（メチ
ルイミノ）あるいはMMIバックボーンとしても知られる〕、-CH2-O-N（CH3）-CH2 -、-CH2-N（CH3）-N（CH3）-CH2-および-O-N（CH3）-CH2-CH2-〔ここで、天然の
ホスホジエステルバックボーンは-O-P-O-CH2-として示される〕そして上述の米
国特許5,602,240のアミドバックボーンである。上述した米国特許5,034,506のモ
ルホリノバックボーン構造を有するオリゴヌクレオチドもまた、本発明の方法を
使用して検出可能である。
【００３２】 修飾オリゴヌクレオチドは、1あるいはそれ以上の置換糖部分も含有する。例
のオリゴヌクレオチドは、2'位に以下のものの一つを含む：OH；F；O-、S-、あ
るいはN-アルキル；O-、S-、あるいはN-アルケニル；O-、S-あるいはN-アルキニ
ル；あるいはO-アルキル-O-アルキル、ここでアルキル、アルケニルおよびアル
キニルは、置換あるいは非置換のC1〜C10アルキルあるいはC2〜C10アルケニルお
よびアルキニルでありうる。限定的ではない例は、O［（CH2）nO］mCH3、O（CH2 ）nOCH3、O（CH2）nNH2、O（CH2）nCH3、O（CH2）nONH2、およびO（CH2）nON［
（CH2）nCH3］］2、ここでnおよびmは1から約10である、である。その他の例の
オリゴヌクレオチドは、2'位に以下のものの一つを含む:C1〜C10の低級アルキル
、置換低級アルキル、アルカリール、アラルキル、O-アルカリールあるいはO-ア
ラルキル、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2 、N3、NH2、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキ
ルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、RNA切断基、リポーター基、イン
ターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を向上するための基、ある
いはオリゴヌクレオチドの薬理特性を向上するための基、そして同様の特性を有
するその他の置換基を含む。その他の例の修飾には、2'-メトキシエトキシ（2'-
O-CH2CH2OCH3、2'-O-（2-メトキシエチル）あるいは2'-MOEとしても知られる）
（Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504）、すなわち、アルコ
キシアルコキシ基が含まれる。修飾には、2'-ジメチルアミノオキシエトキシ、
すなわち、2'-DMAOEとしても知られるO（CH2）2ON（CH3）2基、そして2'-ジメチ
ルアミノエトキシエトキシ（当該技術分野において2'-O-ジメチルアミノエトキ
シエチルあるいは2'-DMAEOEとしても知られる）、すなわち、2'-O-CH2-O-CH2-N
（CH2）2、が含まれる。
【００３３】 さらなる例の修飾には、2'-メトキシ（2'-O-CH3）、2'-アミノプロポキシ（2'
-OCH2CH2CH2NH2）および2'-フルオロ（2'-F）が含まれる。同様の修飾もまた、
オリゴヌクレオチドのその他の位、特に3'末端ヌクレオチドあるいは2'-5'結合
オリゴヌクレオチド中の糖の3'位および5'末端ヌクレオチドの5'位において作製
することもできる。オリゴヌクレオチドは、ペントフラノシル糖の代わりにシク
ロブチル部分などの糖模倣物を有する。修飾糖構造の調製を教示する代表的な米
国特許には、米国特許4,981,957；5,118,800；5,319,080；5,359,044；5,393,87
8；5,446,137；5,466,786；5,514,785；5,519,134；5,567,811；5,576,427；5,5
91,722；5,597,909；5,610,300；5,627,053；5,639,873；5,646,265；5,658,873
；5,670,633；および5,700,920が含まれるが、これらには限定されず、それらの
特定のものは、本出願により一般に所有されるものであり、そしてそのそれぞれ
はその全体を参考文献として本明細書中に援用する。
【００３４】 オリゴヌクレオチドには、核塩基（しばしば当該技術分野において単に“塩基
”としても呼ばれる）修飾あるいは置換も含まれうる。本明細書中に使用される
場合、“非修飾”あるいは“天然”核塩基には、プリン塩基、アデニン（A）お
よびグアニン（G）、そしてピリミジン塩基、チミン（T）、シトシン（C）およ
びウラシル（U）が含まれる。修飾核塩基には、その他の合成および天然核塩基
、例えば5-メチルシトシン（5-me-C）、5-ヒドロキシメチルシトシン、キサンチ
ン、ヒポキサンチン、2-アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの6-メチルお
よびその他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの2-プロピルおよびその
他のアルキル誘導体、2-チオウラシル、2-チオチミンおよび2-チオシトシン、5-
ハロウラシルおよびシトシン、5-プロピニルウラシルおよびシトシン、6-アゾの
ウラシル、シトシンおよびチミン、5-ウラシル（シュードウラシル）、4-チオウ
ラシル、8-ハロ、8-アミノ、8-チオール、8-チオアルキル、8-ヒドロキシルおよ
びその他の8-置換アデニンおよびグアニン、5-ハロ、特に5-ブロモ、5-トリフル
オロメチルおよびその他の5-置換ウラシルおよびシトシン、7-メチルグアニンお
よび7-メチルアデニン、8-アザグアニンおよび8-アザアデニン、7-デアザグアニ
ンおよび7-デアザアデニンおよび3-デアザグアニンおよび3-デアザアデニンが含
まれる。さらなる核塩基には、米国特許3,687,808に開示されたもの、Concise E
ncyclopedia Of Polymer Science And Engineering, pages 858-859、Kroschwit
z, J.I., ed. John Wiley & Sons, 1990に開示されたもの、Englisch et al., A
ngewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613に開示されたもの、
そしてSanghvi, Y.S., Chapter 15, Antisense Research and Applications, pa
ges 289-302, Crooke, S.T. and Lebleu, B. , ed., CRC Press, 1993により開
示されたもの、が含まれる。これらの核塩基の特定のものは、本発明のオリゴマ
ー化合物の結合親和性を増加させるために特に有用である。これらには、2-アミ
ノプロピルアデニン、5-プロピニルウラシルおよび5-プロピニルシトシンを含む
、5-置換ピリミジン、6-アザピリミジンおよびN-2、N-6およびO-6置換プリンが
含まれる。5-メチルシトシン置換は、核酸二重鎖安定性を0.6〜1.2℃増加させる
ことが示された（Sanghvi, Y.S., Crooke, S.T. and Lebleu, B., eds., Antise
nse Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278
）。
【００３５】 上述した修飾核塩基の特定のものならびにその他の修飾核塩基の調製を教示す
る代表的な米国特許には、上述した米国特許3,687,808、ならびに米国特許4,845
,205；5,130,302；5,134,066；5,175,273；5,367,066；5,432,272；5,457,187；
5,459,255；5,484,908；5,502,177；5,525,711；5,552,540；5,587,469；5,594,
121；5,596,091；5,614,617；および5,681,941が含まれるが、これらには限定さ
れず、それらの特定のものは、本出願により一般に所有されるものであり、そし
てそのそれぞれは参考文献として本明細書中に援用し、そして米国特許5,750,69
2が含まれ、これは本出願により一般に所有されるものであり、そしてまた参考
文献として本明細書中に援用する。
【００３６】 本発明により検出可能なオリゴヌクレオチドのその他の修飾には、オリゴヌク
レオチドの活性、細胞分布、あるいは細胞取り込みを亢進する、化学的にオリゴ
ヌクレオチドに結合する1あるいはそれ以上の部分あるいは複合体が含まれる。
そのような部分には、脂質部分、例えばコレステロール部分（Letsinger et al.
, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 6553-6556）、コール酸（Manoharan
et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1994, 4, 1053-1060）、チオエーテル、例
えば、ヘキシル-S-トリチルチオール（Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci
., 1992, 660, 306-309；Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993,
3, 2765-2770）、チオコレステロール（Oberhauser et al., Nucl. Acids Res.,
1992, 20, 533-538）、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオールあるいはウンデシ
ル残基（Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 1991, 10, 1111-1118；Kabanov e
t al., FEBS Lett., 1990, 259, 327-330；Svinarchuk et al., Biochimie, 199
3, 75, 49-54）、リン脂質、例えば、ジ-ヘキサデシル-rac-グリセロールあるい
はトリエチルアンモニウム1,2-ジ-O-ヘキサデシル-rac-グリセロ-3-H-ホスホネ
ート（Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654；Shea et
al., Nucl. Acids Res., 1990, 18, 3777-3783）、ポリアミンあるいはポリエチ
レングリコール鎖（Manoharan et al., Nucleosides & Nucleoside, 1995, 14,
969-973）、あるいはアダマンタン酢酸（Manoharan et al., Tetrahedron Lett.
, 1995, 36, 3651-3654）、パルミチル部分（Mishra et al., Biochim. Biophys
. Acta, 1995, 1264, 229-237）、あるいはオクタデシルアミンあるいはヘキシ
ルアミノ-カルボニル-オキシコレステロール部分（Crooke et al., J. Pharmaco
l. Exp. Ther., 1996, 277, 923-937）が含まれるが、これらには限定されない
。
【００３７】 この様なオリゴヌクレオチド複合体の調製を教示する代表的な米国特許には米
国特許4,828,979；4,948,882；5,218,105；5,525,465；5,541,313；5,545,730；
5,552,538；5,578,717, 5,580,731；5,580,731；5,591,584；5,109,124；5,118,
802；5,138,045；5,414,077；5,486,603；5,512,439；5,578,718；5,608,046；4
,587,044；4,605,735；4,667,025；4,762,779；4,789,737；4,824,941；4,835,2
63；4,876,335；4,904,582；4,958,013；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,
082,830；5,112,963；5,214,136；5,245,022；5,254,469；5,258,506；5,262,53
6；5,272,250；5,292,873；5,317,098；5,371,241, 5,391,723；5,416,203, 5,4
51,463；5,510,475；5,512,667；5,514,785；5,565,552；5,567,810；5,574,142
；5,585,481；5,587,371；5,595,726；5,597,696；5,599,923；5,599,928および
5,688,941が含まれるが、これらには限定されず、それらの特定のものは、本出
願により一般に所有されるものであり、そしてそのそれぞれは参考文献として本
明細書中に援用される。
【００３８】 所定の化合物中のすべての位置を均一に修飾されることが必要とはされず、そ
して実際に、一つ以上の上述した修飾を、単一の化合物中あるいはオリゴヌクレ
オチド中の単一のヌクレオシドにおいても組み込むことができる。
【００３９】 本発明により検出可能なオリゴヌクレオチドに関する修飾のさらなる例は、オ
リゴヌクレオチドの細胞取り込みを亢進する、化学的にオリゴヌクレオチドに結
合する一つあるいはそれ以上の脂質親和性部分を含む。そのような脂肪親和性部
分は、オリゴヌクレオチド上のいくつかの異なる位置でオリゴヌクレオチドに結
合しうる。いくつかの限定されない位置の例には、3'末端ヌクレオチドの糖の3'
位、5'末端ヌクレオチドの糖の5'位、およびいずれかのヌクレオチドの糖の2'位
が含まれる。プリン核塩基のN6位も、本発明のオリゴヌクレオチドに脂肪親和性
部分を結合させるために利用されうる（Gebeyehu, G., et al., Nucleic Acids
Res., 1987, 15, 4513）。そのような脂肪親和性部分には、コレステロール部分
（Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 6553）、コール
酸（Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1994, 4, 1053）、チオエー
テル、例えば、ヘキシル-S-トリチルチオール（Manoharan et al., Ann. N.Y. A
cad. Sci., 1992, 660, 306；Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 19
93, 3, 2765）、チオコレステロール（Oberhauser et al., Nucl. Acids Res.,
1992, 20, 533）、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオールまたはウンデシル残基
（Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 1991, 10, 1111；Kabanov et al., FEBS
Lett., 1990, 259, 327；Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75, 49）、リ
ン脂質、例えば、ジ-ヘキサデシル-rac-グリセロールまたはトリエチルアンモニ
ウム1,2-ジ-O-ヘキサデシル-rac-グリセロ-3-H-ホスホネート（Manoharan et al
., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651；Shea et al., Nucl. Acids Res., 199
0, 18, 3777）、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖（Manoharan et al
., Nucleosides & Nucleoside, 1995, 14, 969）、またはアダマンタン酢酸（Ma
noharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651）、パルミチル部分（Mis
hra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229）、またはオクタデシ
ルアミンまたはヘキシルアミノ-カルボニル-オキシコレステロール部分（Crooke
et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277, 923）が含まれるが、これら
には限定されない。脂肪親和性部分を含むオリゴヌクレオチド、およびそのよう
なオリゴヌクレオチドを調製するための方法は米国特許5,138,045、5,218,105お
よび5,459,255に開示されており、その内容はそれらの全体を本明細書中に参考
文献として援用する。
【００４０】 その他の例において、検出すべき化合物は薬物動態的特性を改良したリガンド
結合オリゴマー化合物でありうる。一つあるいはそれ以上の血清、血管あるいは
細胞性のタンパク質と可逆的に結合あるいは相互作用する、共有結合リガンドあ
るいはタンパク質を有するそのようなオリゴマー化合物が調製される。この可逆
的な結合により、尿排泄の減少、血清半減期の増加およびこのように結合するオ
リゴマー化合物の分布の大幅な増加が期待される。血漿タンパク質への特定の薬
物の結合により、薬物の配置および効率が亢進することは以前に示された（Herv
e et al., Clin. Pharmacokinet., 1994, 26:44）。
【００４１】 多くの薬物は、血漿タンパク質に可逆的に結合する。代表的なリストは、包括
的であることを意味しないが、：アスピリン、ワルファリン、フェニルブタゾン
、イブプロフェン、スプロフェン、フェンブフェン、ケトプロフェン、(S)-(+)-
プラノプロフェン、カルプロフェン、ダンシルサルコシン、2,3,5-トリヨード安
息香酸、フルフェナム酸、フォリン酸、ベンゾサイアジアザイド、クロロサイア
ザイド、ジアゼピン（例えば、フルジアゼパムおよびジアゼパムなど）、インド
メタシン、バルビツレート（例えば、キナルバルビトーンなど）、セファロスポ
リン、サルファ薬物、抗糖尿病薬（例えば、トルブタミドなど）、抗細菌薬（例
えば、キノロン群；ナリジクス酸およびシノキサシンなど）およびいくつかの抗
生物質、を含む。血清アルブミンは、薬物の結合にとって全ての血清タンパク質
の中で最も重要なタンパク質であり、その他のタンパク質（例えば、マクログロ
ブリンG2、イムノグロブリン、リポタンパク質、アルファ-1-酸糖タンパク質、
トロンビン）への結合も重要である。
【００４２】 血清、血管あるいは細胞性タンパク質に結合する上記の薬物などのリガンドは
、至適な結合部分を介して、オリゴヌクレオチドの一つあるいはそれ以上の部位
に連結して、被験体に投与されて、本発明に従って検出されうる。これらの部位
には、2'位、3'位、5'位、ヌクレオチド間結合、およびいずれかのヌクレオチド
残基の核塩基原子の一つあるいはそれ以上が含まれるが、これらには限定されな
い。そのような構造物へのリガンドの接着は、結合基（linking group）を使用
して、あるいは使用せずに、本発明のいくつかの好ましい態様に従って、行うこ
とができる。結合基の例には、6-アミノアコキシリンカー、6-アミノアルキルア
ミノリンカー、システアミン、ヘテロ二機能性 リンカー、ホモ二機能性リンカ
ー、およびユニバーサルリンカー（3-ジメトキシトリチルオキシ-2-アミノプロ
パノール由来）が含まれる。
【００４３】 本発明のリガンド結合オリゴヌクレオチドの合成にとって特に好ましい結合基
は、6-アミノヘキシルオキシ基である。様々なヘテロ二機能性およびホモ二機能
性結合部分は、Pierce Co.（Rockford, IL）から入手可能である。そのようなヘ
テロ二機能性およびホモ二機能性結合部分は、6-アミノアルコキシおよび6-アミ
ノアルキルアミノ部分とともにヌクレオシドとリガンドを結合させるために有用
な拡張されたリンカーを形成するのに特に有用である。商業的に入手可能なさら
に有用な結合基は5'-Amino-Modifier C6および3'-Amino-Modifier剤であり、両
方ともGlen Research Corporation（Sterling, VA）から入手可能である。5'-Am
ino-Modifier C6はAminolink-2としてABI（Applied Biosystems Inc., Foster C
ity, CA）から入手可能であり、一方3'-Amino-ModifierもClontech Laboratorie
s Inc.（Palo Alto, CA）から入手可能である。加えて、ヌクレオシドに既に接
着している結合基を帯びるヌクレオチド類似体は、商品名“Amino-Modifier-dT
”の名称でGlen Research Corporationから商業的に入手可能である。このヌク
レオシド結合基試薬は、ピリミジン環の5位に[N(7-トリフルオロアセチルアミノ
ヘプチル)3-アクリルアミド]置換基を有するウリジン誘導体であり、Jablonski
ら（Nucleic Acid Research, 1986, 14:6115）の手順によるように合成される。
【００４４】 リガンド結合オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド上への結合分子の接
着から誘導されるようなペンダント（pendant）反応性の機能性を帯びるオリゴ
ヌクレオチドの使用により、合成されうる。この反応性オリゴヌクレオチドは商
業的に入手可能なリガンド、様々な保護基を有する合成されるリガンド、あるい
はそれに接着する結合部分を有するリガンド、と直接的に反応しうる。
【００４５】 本発明に従って検出できるオリゴヌクレオチドは、固相合成のよく知られる技
術によって都合よく日常的に作成されうる。そのような合成のための装置は、Ap
plied Biosystemsを含むいくつかの供給者から販売されている。そのような合成
のいずれかの他の手段も使用されうる；オリゴヌクレオチドの実際の合成は、型
どおりに仕事をする人の十分に能力内にある。ホスホロチオエート、および2'-O
-メトキシエチルオリゴヌクレオチドを含む、2'-アルコキシあるいは2'-アルコ
キシアルコキシ誘導体などのオリゴヌクレオチドを調製するために同様な技術を
使用することは、よく知られている（Martin, P., Helv. Chim. Acta, 1995, 78
, 486-504）。同様な技術、およびビオチン、フルオレセイン、アクリジンある
いはソラレン-修飾アミダイトおよび／またはCPG（Glen Research, Sterling VA
から入手可能）などの商業的に入手可能な修飾アミダイトおよび調節孔ガラス（
CPG）産生物を使用して、蛍光標識化、ビオチン化あるいはその他の結合オリゴ
ヌクレオチドを合成することもよく知られている。
【００４６】 用語“投与される”によって、“投与される”は被験体にオリゴヌクレオチド
を与えることを意味する。投与は、局所的（眼、膣、直腸、鼻腔内、表皮および
経皮を含む）、経口的あるいは非経口的、針注射、針なし注射、例えば、MEDI-J
ECTORTMのような器具を使用した注射、およびピペットを使用したアリコートに
よるなど、でありうる。非経口的投与には、静脈内点滴あるいは輸液、皮下、腹
腔内あるいは筋肉内注射、肺投与、例えば、吸入（inhalation）あるいは吹き込
み（insufflation）による、あるいは頭蓋内、例えば、髄膜内あるいは脳室内、
投与が含まれる。オリゴヌクレオチドを投与する様式は、米国特許No. 6,083,92
3に開示されており、その全体の内容は本明細書中で参考文献により援用される
。
【００４７】 局所的投与のための製剤には、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲ
ル、ドロップ、坐薬、スプレー、液体および粉末が含まれる。 経口投与のための組成物には、粉末および顆粒、水あるいは非水性媒介物にお
ける懸濁物あるいは液体、カプセル、サチェット（sachet）あるいは錠剤が含ま
れる。濃厚剤、香料添加剤、希釈剤、乳化剤、分散補助剤あるいは結合剤。
【００４８】 非経口投与のための組成物には、緩衝液、希釈剤およびその他の適した添加剤
も含みうる滅菌水性溶液が含まれうる。被験体に組成物を与える方法はよく知ら
れており、本発明の限定される観点は考慮されない。さらに、投与の部位あるい
は標的も、本発明の限定される観点は考慮されない。
【００４９】 本明細書中で使用される“被験体”は、オリゴヌクレオチドを投与された哺乳
動物のことである。本発明の哺乳動物の限定されない例には、げっ歯類、ウサギ
目の動物、ブタ、イヌ、ネコ、および霊長類が含まれる。好ましい態様において
、哺乳動物は霊長類であり、最も好ましくは哺乳動物はヒトである。
【００５０】 本明細書中で使用されるように、“検出する”あるいは“検出された”は、得
られた体液および／または抽出試料における合成オリゴヌクレオチドの存在のの
指標として検出可能標識を計器により測定あるいは視覚的に観察することを意味
する。様々な検出可能標識が当該技術分野で議論されており、各々の標識はその
使用および検出のためのよく知られたプロトコールを持っている。標識検出プロ
トコールには、分光光度測定、蛍光測定、オートラジオグラフィー測定、比色測
定、視覚的観察、化学発光測定、電気化学測定などが含まれるが、これらには限
定されない。
【００５１】 “試料を得る（こと）”という句は、被験体由来の体液および／または抽出物
の抽出あるいは分離を意味する。被験体由来の、あるいは被験体による体液およ
び／または抽出物の獲得、抽出、切開、解剖、分泌、排出は、よく知られており
、看護師、内科医および研究科学者により行われているあるいは要求されている
。体液および／または抽出物を得るために使用されるアプローチは、本発明の限
定的な観点とはみなされない。
【００５２】 本発明の文脈において、“体液および／または抽出物”は、オリゴヌクレオチ
ドの存在をスクリーニングすべき被験体から取り出された体性物質のいずれかの
ことである。体液および／または抽出物の例には、ホモジナイズされた組織、器
官、あるいは骨試料が含まれるが、これらには限定されない。体のいくつかの部
分は液体として容易にアッセイされないことが理解されているが、ホモジナイズ
してそれらの部分から液体試料を調製する手順は一般的ではないが、よく知られ
ている。水あるいは生理食塩水を通常は液体でない体性部分に加えることは、本
発明の範囲内であり、例えば、骨懸濁液のホモジナイズされた試料は、本明細書
中に記載される方法によりアッセイできる。従って、体液および／または抽出物
は、以下のもの；組織、骨あるいは器官試料、血清、唾液、糞便、涙、汗、およ
び血液細胞、上皮細胞の試料など、から調製あるいは選択されうるが、これらに
は限定されない。
【００５３】 “プローブ”は、標的オリゴヌクレオチド分子と結合するために形成され配列
されるオリゴヌクレオチドを意味する。一態様において、この標的オリゴヌクレ
オチドは被験体に投与されている。好ましくは、プローブは検出可能マーカーを
含有するように形成される。“捕獲プローブ”は、例えば、検出すべきオリゴヌ
クレオチドの“捕獲”を固体支持（support）上で可能にする、ビーズ、培養皿
あるいは96ウェルプレートなどのストレプトアビジン-被膜固体支持体に対して
強力にかつ特異的に結合する、ビオチンなどの固体支持体と結合させるための部
分を含有するプローブである。
【００５４】 好ましい態様（“伸長アッセイ”）において、プローブはポリA末端を含むよ
うに形成され、さらに固体支持体に結合するように配列される。DNAポリメラー
ゼなどの構造特異的酵素、およびdUTP結合ジゴキシゲニンなどの検出可能マーカ
ーの存在下での、プローブと標的オリゴヌクレオチドの陽性な（positive）結合
により、標的オリゴヌクレオチド分子の伸長、およびここで伸長した標的オリゴ
ヌクレオチド分子内への検出可能マーカーの取り込みが開始する（図1）。オリ
ゴヌクレオチド分子の検出は、検出可能標識の形成を触媒するであろう抗ジゴキ
シゲニン抗体-アルカリホスファターゼ構造物に対する、ジゴキシゲニン-dUTPの
結合による。
【００５５】 さらなる態様において、ジゴキシゲニンなどの検出可能マーカーを含み、固体
支持体に結合する捕獲プローブと結合するように配列される検出プローブが調製
される。捕獲プローブは、検出プローブおよびオリゴヌクレオチド分子の両方に
結合するように形成される。検出プローブおよび投与されたオリゴヌクレオチド
の両方は、検出プローブおよびオリゴヌクレオチドは端と端を接して横になる様
式で捕獲プローブと結合する（図2）。その二つの間のギャップの長さは、1-2塩
基長であり、n-1あるいはn-2代謝産物（オリゴヌクレオチド分子の短縮鎖）の検
出を可能にしうる。構造特異的酵素の存在において、ギャップは酵素が検出プロ
ーブおよびオリゴヌクレオチド分子を一緒にライゲートする認識部位として働く
。プローブに対してライゲートされないオリゴヌクレオチド分子は検出されない
（図2）。オリゴヌクレオチド分子の検出は、検出可能産生物を産生する酵素に
結合する抗ジゴキシゲニン抗体を添加することによる（例えば、アルカリホスフ
ァターゼおよびそれに続く蛍光の解析）。
【００５６】 もう一態様において、捕獲プローブは二つの部分、オリゴヌクレオチドに相補
的な結合部分、およびもう一つの既知のオリゴヌクレオチド配列（ポリAなどの
均一な配列、あるいは異質な配列）であってもよい検出可能マーカー、を含有す
る。二次プローブは、フラップ産生プローブであり、また二つの部分を含み、一
つは（ポリTあるいは外来マーカー配列の相補物のどちらかを介する）捕獲プロ
ーブにおける検出可能マーカー配列に特異的に結合し、およびもう一つの部分は
修飾ヌクレオチドへの二つのプローブの結合にオーバーハングする“フラップ”
を産生する。オーバーハングするフラップ部分は、構造特異的酵素、好ましくは
フラップエンドヌクレアーゼ（FEN）により切断する（Lyamichev et al., Natur
e Biotechnology 17:292-296 (1999)）。この方法は、Lyamichevらの方法と同様
であるが、顕著な違いは、既知および未知の配列（検出すべきプローブ対配列）
が逆であることである。Lyamichev らの方法に記載される“侵襲プローブ（inva
sive probe）”は、今の方法において検出すべき修飾オリゴヌクレオチドにより
置換される。Lyamichevらにより開示される標的配列（図4）は、この方法におい
て、5'にオーバーハングする部分は検出可能マーカーである二つの捕獲プローブ
により置換される。Lyamichevらにより開示される“シグナルプローブ”は、こ
の方法においてフラップ産生プローブにより置換される。好ましい態様において
、構造特異的切断酵素は、ユーバクテリアPol A DNAポリメラーゼ、5'から3'エ
クソヌクレアーゼ、バクテリオファージT5と関連する5'ヌクレアーゼ、FEN1、RA
D2および真核生物由来色素性乾皮症-相補性G群エンドヌクレアーゼホモログを含
む群から選ばれるが、これらには限定されない。
【００５７】 次に、切断フラップは当該技術分野で知られる様々な方法、例えば、フラップ
内への蛍光部分の取り込み、あるいは本明細書中に記載されるELISA、により検
出される。
【００５８】 本明細書中で使用される“検出可能マーカー”は、検出可能標識と相互作用お
よび／または結合することが可能な、プローブあるいはプローブの成分に接着す
るその成分あるいは部分のことである。限定的ではない例では、検出可能マーカ
ーは、多くの結合対あるいはジゴキシゲニンなどの酵素反応のための基質と結合
する核酸、本明細書中に記載されるようにフラップを形成するであろう一連のヌ
クレオチド、あるいは既知の（均一なあるいは異質の）配列、例えばポリA、の
一連のヌクレオチド、を含む。
【００５９】 用語“検出可能標識”は、視覚あるいは機械的な手段のどちらかにより観察で
きる化合物および／または分子を意味する。限定的ではない例では、ビフルオロ
-発色団、放射性同位体、化学発光あるいは現在入手可能な色素産生性標識が検
出可能標識として使用されうる。検出可能標識および標識をモニターする様式は
、本発明の限定因子とはみなされない。検出可能標識は、例えばビオチン-スト
レプトアビジン、アルカリホスファターゼ結合ジゴキシゲニンあるいはその他の
抗原-抗体複合体などの、結合対の一部でありうる。検出可能標識は、プローブ
との陽性な相互作用を介して、修飾オリゴヌクレオチドの存在を決定する方法を
提供する。
【００６０】 様々な酵素は、例えば核酸分子を切断させる（ヌクレアーゼ）ための、あるい
は核酸分子を既存鎖（ポリメラーゼ）に加えるための、部位化学反応として特異
的核酸構造を認識する。一つの例では、酵素はDNA合成中に生じるDNAの対になっ
ていない断片を認識するヌクレアーゼであり、その中で増幅する上流のオリゴヌ
クレオチドの3'末端では、下流のオリゴヌクレオチドの5'末端の配列が置換され
て、一本鎖非ハイブリダイズ核酸分子のフラップをつくる。もう一つの例では、
酵素は核酸二本鎖の陥凹3'末端を認識して、適した有用な相同なヌクレオチドを
取り込むことによりそれを伸長するポリメラーゼである。さらにもう一つの例で
は、構造特異的酵素は端と端を接して横たわる二つの核酸分子の末端の間の“ギ
ャップ”を認識して、それらの鎖を一緒にライゲートして、ギャップを閉じるリ
ガーゼである。
【００６１】 本明細書中に記載する方法は、特定のオリゴヌクレオチドの解析に使用される
が、当業者は所望されるオリゴヌクレオチドのいずれかが、検出すべきオリゴヌ
クレオチドに相補的なプローブを設計することにより、本発明に記載する方法を
使用して、定量および解析できることを認識するであろう。従って、本明細書中
に示される例は例証として解釈されるべきであり、本発明の範囲を限定しない。
【００６２】
【実施例】
実施例１ ポリメラーゼ／ELISAアッセイを使用した、血漿中でのホスホロチオエートオ
リゴデオキシヌクレオチド、ISIS 2302、の検出および定量 このアッセイは、オリゴヌクレオチドの投与後、例えばオリゴヌクレオチド薬
物の全身あるいは局所投与の後、血漿中の全暴露を測定するために適用される。
【００６３】 使用されるオリゴヌクレオチドは、ヒトICAM-1を標的とするアンチセンスオリ
ゴヌクレオチドであるISIS 2302（GCC CAA GCT GGC ATC CGT CA；SEQ ID NO: 1
）であった。この化合物は、現在はクローン病、腎移植拒絶に関する臨床試験中
であり、乾癬（局所投与）に関する臨床前試験中である。
【００６４】 配列CGG GTT CGA CCG TAG GCA GT（SEQ ID NO: 2）（ISIS 2302に相補的）を
持ち、3'末端に結合するビオチン分子および5'末端にポリA尾部を有するオリゴ
ヌクレオチドプローブを、37℃で1時間血漿中でISIS 2302とハイブリダイズ（す
なわち、二本鎖の形成）させて、続いて、37℃で30分間ビオチン部分を介してス
トレプトアビジンでコートしたプレートに結合させた。
【００６５】 DNAポリメラーゼ（クレノウ酵素（Klenow fragment））、ジゴキシゲニン-標
識化dUTP（D-dUTP）、dATP、dGTP、およびdCTPをプレートに加えて、混合液を37
℃で30分間インキュベートした。DNAポリメラーゼIラージ（クレノウ）断片は、
未処理のE. coli DNAポリメラーゼIの5'→3'エクソヌクレアーゼ活性を欠くが、
その5'→3'ポリメラーゼ、3'→5'エクソヌクレアーゼおよび鎖置換活性は保持す
る一本のポリペプチド鎖（68kDa）から成る。クレノウ断片の5'→3'ポリメラー
ゼ活性は日常的に使用されて、非標識化あるいは標識化dNTPsを有する5'-突出（
protruding）末端を埋める。本明細書中で使用されるように、これにより、プロ
ーブ／オリゴヌクレオチド二本鎖のオリゴヌクレオチド鎖にのみ、DNAポリメラ
ーゼによるD-dUTPの追加を引き起こし、それは5'-ポリAオーバーハングを有する
。これは図2に示す。
【００６６】 インキュベーションの後、取り込まれたD-dUTPは、蛍光AttoPhosTMの形成を触
媒する、抗ジゴキシゲニンおよびアルカリホスファターゼの抗体結合構造物を加
えることにより、ELISAアッセイによって検出した。蛍光強度は、オリゴヌクレ
オチド化合物（ISIS 2302）の総濃度を定量する方法を提供する、Cytofluorマイ
クロタイタープレートリーダー、励起450/50、放出580/50を使用して決定した。
【００６７】 この方法を使用して、完全長オリゴヌクレオチド分子および1から10のヌクレ
オチドまでに短縮された代謝物の検出が可能であることが見出された。このアッ
セイは、キャピラリーゲル電気泳動（CGE）[定量限界（LOQ）= 10nM]より少なく
とも500倍感受性であることを示し、100μlの血漿を使用したときは、20 pMから
2000 pM（2 nM）までのオリゴヌクレオチド濃度にて直線範囲を提供した。
【００６８】 実施例２ アッセイ間の正確性および精度 ISIS 2302の検出について実施例１に記載されるELISAアッセイは、表１および
２に示すように、許容可能なアッセイ間の正確性および精度を有することが見出
された：
【００６９】
【表１】
【００７０】
【表２】
【００７１】 実施例３ ポリメラーゼ／ELISAアッセイを使用したヒト血漿中でのホスホロチオエート
オリゴデオキシヌクレオチド、ISIS 2503、の検出および定量 ISIS 2503（TCC GTC ATC GCT CCT CAG GG；SEQ ID NO: 3）は、ヒトHa-rasを
標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドである。この化合物は現在、様々な
固形腫瘍型を有する患者において臨床試験中である。ISIS 2503は、ビオチン化
／ポリアデニル化プローブがISIS 2503（ISIS 2302に代わり）に相補的である以
外は、実施例１に記載される方法を使用してヒト血漿中にて検出された。5から1
000 pMまでの濃度でISIS 2503の検出の直線範囲を得た。ヒト血漿中のLOQは10 p
Mであることが見出され、このアッセイはオリゴヌクレオチドの検出についてCGE
よりも1000倍感受性となった。結果は表３に示す。実験はくり返した（n = 5）
。
【００７２】
【表３】
【００７３】 実施例４ DNAリガーゼ／ELISAアッセイを使用した血漿中でのホスホロチオエートオリゴ
デオキシヌクレオチド、ISIS 2302、の検出および定量 実施例１に記載するように、使用するオリゴヌクレオチドテスト化合物はISIS
2302（配列GCC CAA GCT GGC ATC CGT CA；SEQ.ID.NO: 1）であった。先のよう
に、配列CGG GTT CGA CCG TAG GCA GT（SEQ ID NO: 2）（ISIS 2302に相補的）
を持ち、3'末端に結合するビオチン分子および5'末端にポリA尾部を有するオリ
ゴヌクレオチドプローブを、37℃で1時間血漿中でISIS 2302とハイブリダイズ（
すなわち、二本鎖の形成）させて、続いて、37℃で30分間ビオチン部分を介して
ストレプトアビジンでコートしたプレートに結合させた。プレートは、TBS／Twe
enで4回洗浄した。
【００７４】 分子の5'末端にリン酸基を有し、最も3'のTがジゴキシゲニンで標識された配
列5'-TTT TTT TTT-3'（SEQ ID NO: 4）を有する検出プローブを調製した。これ
は図4に示す。このプローブの100 pMを、0.5ユニットT4 DNAリガーゼと共にウェ
ル毎に加えた。ライゲーション反応を室温で30分間進行させた（30分から6時間
の範囲のライゲーション時間をテストして、許容可能であることを見出した）。
プレートはTBS、蒸留水、そして再びTBSで洗浄した。二本鎖化しライゲートされ
た検出プローブ上のD-dUTPは、実施例１および３にあるように、蛍光AttoPhosTM の形成を触媒する、抗ジゴキシゲニンおよびアルカリホスファターゼの抗体結合
構造物を加えることにより検出した。蛍光強度は、オリゴヌクレオチド化合物（
ISIS 2302）の総濃度を定量する方法を提供する、Cytofluorマイクロタイタープ
レートリーダー、 励起450/50、放出580/50を使用して、ISIS 2302なしの対照（
蛍光ブランク）の蛍光値を引いた後に決定した。
【００７５】 得られた蛍光値は表４に示す。同じ方法を使用して、ISIS 2302（19 mer）お
よびISIS 15839、ヌクレオチド1-12（5'末端）がデオキシヌクレオチドでありヌ
クレオチド13-20（3'末端）が2'-O-メトキシエチルヌクレオチドであるISIS 230
2（SEQ ID NO: 1）の配列を有するオリゴヌクレオチド、のn-1代謝物を定量した
。
【００７６】
【表４】
【００７７】 プロットの際、修飾オリゴヌクレオチドISIS 15839の蛍光値は、100〜1000 pM
の間のオリゴヌクレオチド濃度で直線を与えた。ISIS 2302およびn-1は、100〜1
000 pMの濃度で重なる（すなわち、ほとんど同一の）直線を与えた。続いて、n-
2代謝物はn-1および完全長ISIS 2302オリゴヌクレオチドとほとんど同一な蛍光
読みとり値を与えることが見出されたが、n-3およびより短いものについての蛍
光値はこれらより10％少なかった。これにより、この方法が完全長あるいはほぼ
完全長のオリゴヌクレオチドの検出および定量に唯一適しているのに対して、実
施例１および３における方法は全オリゴヌクレオチドの検出により適している。
【００７８】 DNAリガーゼ／ELISA方法の確認はヒト血漿中にて行った。0.05 nMから20 nM（
r≧0.99）の直線範囲をISIS 2302についてヒト血漿中で得た。この直線範囲は二
つの較正曲線（低および高）によりカバーされた。12の被験体由来のブランク血
漿の解析により、ISIS 2302の検出が実質的に内因性に干渉されることはないこ
とが示された。アッセイは、ヒト血漿におけるISIS 2302の定量に関して特異的
、正確、精密および敏感であることが示された。さらに、方法は複数の解析によ
り再現可能であった。
【００７９】 実施例５ 特異性 6被験体由来の対照ヒト血漿を、考えられる内因性干渉に関してトリプリケー
トで解析した。表５に示すように、6被験体のうちの4つからの血漿は、LOQ（50
pM）では反応の2％以下の反応であった。しかし、2被験体はLOQの高い蛍光シグ
ナル439％および41.5％を示した。これらの高い反応の理由は分からない。さら
なる6被験体由来の対照ヒト血漿を研究した。２番目の特異的解析から、全6被験
体由来の血漿はLOQ（50 pM）では反応の11％以下の反応であった。これより、方
法はヒト血漿からのISIS 2302の解析において特異的であった。
【００８０】
【表５】
【００８１】 実施例６ ISIS 2302代謝物に対する交叉反応 N-1からN-3の代謝物に対するアッセイ交叉反応を、マトリックスおいてデュプ
リケートで100 pMから1 μMの濃度範囲で調べた。N-1、N-2およびN-3代謝物は、
各々ISIS 2302の3'末端から1から3少ないヌクレオチドの合成により短縮された
。ISIS 2302の反応曲線をマトリックスおいてデュプリケートで50 pMから0.1 μ
Mの濃度範囲で調べた。図3に示すように、N-1からN-3から発生した蛍光反応は非
常に微少であった。最大ISIS 2302蛍光反応の50％の代謝物の蛍光は測定できな
いため、交叉反応は最大ISIS 2302蛍光反応の10％で評価した。％交叉反応はN-1
では約0.22％であり、N-2およびN-3では0.22％以下であった。
【００８２】 実施例７ 直線範囲 ヒト血漿における較正曲線（50から200 pM）は、異なる3日で2人の分析者によ
って行った。各々の較正曲線は50、100、200、500、1000、1500および2000 pMの
濃度でデュプリケートで行った。各々の曲線は、重みづけをしないでlog/log直
線にあてはめた。研究で行ったさらなる曲線も表６に記録した。表６に示すよう
に、ISIS 2302の相関係数は全ての較正曲線の0.99 より大きいかあるいは等しい
ことが見出された。従って、許容可能な直線性は、ヒト血漿においてISIS 2302
の50から2000 pMまでの範囲の濃度で達成された。代表的な較正曲線を図4に示す
。
【００８３】
【表６】
【００８４】 実施例８ DNAリガーゼ／ELISAアッセイを使用した血漿中でのISIS 2302の検出に関する
日内の正確性および精度 日内の正確性および精度は、ヒト血漿で行われるLOQ（50 pM）、低（100 pM）
、中（500 pM）および高（1500 pM）QC試料から評価した。6回の反復QC試料を使
用した。希釈試料の正確性および精度を証明するために、ヒト血漿中に5000 pM
のISIS 2302を含有する極高QC試料を6回の反復において調製した。試料解析の前
に、ブランクヒト血漿で希釈したこのQC試料について1:10希釈を行った。LOQ、
低、中、高および希釈QC試料由来のISIS 2302の濃度を、較正曲線方法（方程式
１）を使用して解析した、 Log10（C2）=（Log10（Flu）-切片））/傾き（1） ここで、C2=検体（ISIS 2302）の濃度およびFlu=検体の蛍光読みとり値である
。切片および傾きは較正曲線の直線回帰由来である。QC試料の正確性は、ISIS 2
302の公称（nominal）濃度と比較した計算濃度のパーセンテージとして計算した
（実質％）。精度は変動係数（％CV）として表した。結果は表７に要約する。許
容可能なアッセイの正確性は、ISIS 2302について達せられた（1日目は公称スパ
イク濃度の102-122％、2日目では92.3-121％；および3日目では78.3-107％の範
囲内）。
【００８５】
【表７】
【００８６】 許容可能な日内の精度は、相対標準偏差で表し（％RSDは低、中および高QCに
ついて18.1％以下であった）、ISIS 2302については3日目の低QC（％RSD=34.8％
）を除いて得られた。しかし、LOQは高い変動性（％RSDは21.9-69.6％内）を示
した；それゆえ、定量の限界が新たなQCレベル、100 pM（低QC）に対してもたら
された。希釈試料に関するISIS 2302についての正確性（実質％）は118.6-137.3
％の範囲内にあり、正確性合否基準に適合しなかった。希釈試料のためのISIS 2
302についての％RSDは10.9-14.9％の範囲内にあり、精度合否基準に適合した。
それゆえ、より高い血漿濃度の試料を定量するためには、方法は以下に述べるよ
うに高い較正曲線に対して交叉確認（cross-validate）された。
【００８７】 要約すると、LOQ（50 pM）での日内の正確性は、1日目および2日目はプロトコ
ールにおいて設定された正確性合否基準（80-120％）に適合しており、3日目は7
8.3％であった。しかし、LLOQでのISIS 2302についての精度は21.9％-69.6％の
範囲内の％RSDを有しており、確認プロトコールにおいて設定された精度合否基
準に適合しなかった。従って、LLOQは実施例９に記載するように、次のQCレベル
、100 pM（低QC）に対してもたらされた。
【００８８】 実施例９ ヒト血漿中での高い範囲に対する交叉確認 日内の正確性および精度の研究の希釈試料解析から、正確性は3日のうちの2日
で実際の値より20％以上外れていた。従って、較正範囲を越える試料は、試料希
釈を使用しては正確には決定できない。これらの試料を決定するために、高い範
囲での1日交叉確認を行った。
【００８９】 この確認手順において、1 nMから50 nMまでの6点（1、2、5、10、20および50
nM）の較正基準をデュプリケートで調製して、実施例４に記載したELISAにより
解析した。正確性および精度は、ヒト血漿において調製された1 nM（LOQ）、3 n
M（低QC）、10 nM（中QC）および40 nM（高QC）の6回の反復におけるQC試料を用
いて評価した。較正基準およびQC試料の試料調製のため、10μLの標準溶液を10
μLのヒト血漿および80μLの蒸留水中にスパイク（spike）した。
【００９０】 高い曲線の直線範囲は、1から20 nMでありr2は0.9912であった。50 nMの較正
基準は曲線から外れ、それは50 nMでの酵素基質の枯渇に起因していたかもしれ
ない。表８に示すように、LOQ、低および中QCに関する正確性および精度は、設
定された正確性および精度の合否基準に適合した。しかし、64.2％の実質％を有
しており、これには高QCは、酵素基質の枯渇も起因していたかもしれない。要約
すると、高い較正範囲に対する交叉確認により、アッセイがヒト血漿中での1と1
0 nMの間の濃度でISIS 2302の定量に関して正確性および精度がよいことが示さ
れた。
【００９１】
【表８】
【００９２】 実施例１０ 血漿中でのISIS 2302に関する日間の正確性および精度（n=18） 日間の正確性および精度は、2人の分析者により異なる3日に行われた、4つの
異なる濃度（50、100、500および1500 pM）の各々でのQC試料の18回の反復を使
用して、QCのプールされた（pooled）データから計算した。表９に示すように、
ISIS 2302の日間の正確性は、LLOQ、低、中および高QC濃度で90.2-116％の範囲
内であった。LOQ（50 pM）での日間の精度は42.5％であり、これは確認プロトコ
ールにおいて設定された精度合否基準に適合しなかった。日内の正確性および精
度の項目で述べられるように、LOQは低QCレベル（100 pM）に対してもたらされ
た。新たなLOQ（100 pM）では、％RSDは23.9％であり、これは新たに設定された
合否基準（L0Qで≦25％）に適合した。中および高QC濃度（500および1500 pM）
でのISIS 2302の日間の精度は<14.0％の％RSDを有しており、精度合否基準に適
合した。
【００９３】 希釈QCは131％の日間の正確性をもち、14.1％の％RSDを有した。希釈QCの観察
された濃度は期待よりも高く、より高値の実質％となった。従って、より高い較
正範囲に対する交叉確認は、ヒト血漿に存在しうるISIS 2302のより高濃度の定
量に関して調べた。日間のデータは、方法が複数の解析者のおいても再現可能で
あることを示した。
【００９４】
【表９】
【００９５】 実施例１１ ヒト血漿中でのISIS 2302の安定性 ヒト血漿中でのISIS 2302の安定性は、低（100 pM）および高（1500 pM）オリ
ゴヌクレオチド濃度で調べた。凍結／融解、室温および長期間冷凍の安定性を行
った。
【００９６】 凍結／融解の安定性は、各々凍結／融解の1および3周期で調べた。融解は、室
温（非補助融解）および水浴中の37℃で調べた。低濃度（100 pM）では、観察さ
れた濃度は、室温および37℃の両方で融解した1および3周期の両方の公称の濃度
より48％高かった（表１０）。しかし、高濃度（1500 pM)では、ISIS 2303の観
察された濃度は、室温および37℃の両方で融解した凍結／融解の1および3周期後
の公称値の92.5％から108％の範囲内であった。ISIS 2302は100 pMでは安定では
ないが、凍結／融解周期後のヒト血漿中における1500 pMでは安定であることは
明らかであった。融解温度では違いは生じなかった。ISIS 2302中の硫黄は、未
知の機序により低オリゴヌクレオチド濃度で酸素に置換されうる。ライゲーショ
ン効率はホスホロチオエートよりホスホジエステルでより高く、より高い見かけ
濃度を生じた。EDTAはこのプロセスを遅らせうる。
【００９７】
【表１０】
【００９８】 室温での安定性は、各々4時間および24時間室温で貯蔵した低（100 pM）およ
び高（1500 pM）濃度で調べた。低濃度（100 pM）では、観察された濃度は4時間
および24時間の貯蔵時点での公称濃度より各々56％および24％高かった（表１１
）。しかし、高濃度（1500 pM）では、ISIS 2302の観察された濃度は4時間およ
び24時間の貯蔵時点での公称値の濃度より各々95.3％および105％高かった。
【００９９】
【表１１】
【０１００】 長期間冷凍の安定性は、100 pMおよび1500 pMのISIS 2302を1、3および6ヶ月
間貯蔵することにより決定した。結果（表１２）は、オリゴヌクレオチドは1、3
および6ヶ月間の1500 pM、3および6ヶ月間の100 pMでは安定であるが、1ヶ月間
の100 pMでは安定でないことを示す。
【０１０１】
【表１２】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図1は、DNAポリメラーゼを使用するホスホロチオエートオリゴヌク
レオチド、ISIS 2302、のジゴキシゲニン標識化の後のELISAアッセイによる、IS
IS 2302の定量的な検出の方法におけるステップを示すダイアグラムである。
【図２】 図2は、ジゴキシゲニン-標識ポリ（dT）検出プローブのライゲーシ
ョンによるISIS 2302の標識化の後のELISAアッセイによる、ISIS 2302の定量的
な検出の方法におけるステップを示すダイアグラムである。
【図３】 図3は、ヒト血漿におけるISIS 2302代謝物の交叉反応を示すグラフ
である。
【図４】 図4は、ELISA／ライゲーションアッセイにより得たヒト血漿におけ
るISIS 2302の代表的な較正曲線である。各々の較正点は二度行った。
【配列表】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ユー，ジェンロン アメリカ合衆国カリフォルニア州92009， カールズバッド，カレ・ロマス 7808 (72)発明者 リーズ，ジャネット・エム アメリカ合衆国カリフォルニア州92924， エンシニタス，ダンスモア・コート 443 Ｆターム(参考） 2G045 AA35 DA13 FA29 FB01 FB03 FB05 FB07 FB12 GC15 2G054 AA06 CA22 EA01 EA03 GA04 4B063 QA01 QA18 QQ03 QQ42 QQ52 QR08 QR32 QR55 QR66 QR82 QS03 QS15 QS34 QS36 QX02 QX07

Claims (31)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 体液あるいは抽出物中のオリゴヌクレオチドを検出あるいは定
    量する方法であって、以下のステップ： 前記液あるいは抽出物と、前記ヌクレオチドと相補的なプローブであってその
    一末端に前記オリゴヌクレオチドとハイブリダイズしない領域を含むもの、とを
    接触させて、ハイブリッドを形成させること； 前記ハイブリッドと、前記オリゴヌクレオチドとハイブリダイズしない前記プ
    ローブの前記領域の向かい側の前記オリゴヌクレオチドに検出可能な標識を取り
    込ませることを目的とする酵素および検出可能な標識とを接触させること；およ
    び その存在が前記オリゴヌクレオチドの存在を示す、前記標識を検出すること；
    を含む前記方法。
  2. 【請求項２】 前記体液が血漿である、請求項１の方法。
  3. 【請求項３】 前記オリゴヌクレオチドが少なくとも一つのホスホロチオエー
    ト結合を含む、請求項１の方法。
  4. 【請求項４】 前記オリゴヌクレオチドが少なくとも一つの糖部分の2'位に修
    飾を含む、請求項１の方法。
  5. 【請求項５】 前記2'修飾が2'-O-メトキシエチル修飾である、請求項４の方
    法。
  6. 【請求項６】 前記オリゴヌクレオチドが少なくとも一つの修飾塩基を含む、
    請求項１の方法。
  7. 【請求項７】 前記修飾塩基が5-メチルシトシンである、請求項６の方法。
  8. 【請求項８】 前記標識が比色性、放射性、化学発光性、酵素性あるいは蛍光
    性である、請求項１の方法。
  9. 【請求項９】 前記標識がジゴキシゲニンである、請求項１の方法。
  10. 【請求項１０】 前記酵素がDNAポリメラーゼである、請求項１の方法。
  11. 【請求項１１】 前記オリゴヌクレオチドが外来的に投与される、請求項１の
    方法。
  12. 【請求項１２】 体液あるいは抽出物中のオリゴヌクレオチドを検出あるいは
    定量する方法であって、以下のステップ： 前記液あるいは抽出物と、前記ヌクレオチドと相補的な捕獲プローブであって
    その一末端に前記オリゴヌクレオチドとハイブリダイズしない領域を含むもの、
    とを接触させて、ハイブリッドを形成させること； オリゴヌクレオチドと検出可能なプローブとをライゲートできる酵素の存在下
    において、前記ハイブリッドと、前記オリゴヌクレオチドとハイブリダイズしな
    い前記捕獲プローブとを、接触させること；および その存在が前記オリゴヌクレオチドの存在を示す、前記標識を検出すること；
    を含む、前記方法。
  13. 【請求項１３】 前記体液が血漿である、請求項１２の方法。
  14. 【請求項１４】 前記オリゴヌクレオチドが少なくとも一つのホスホロチオエ
    ート結合を含む、請求項１２の方法。
  15. 【請求項１５】 前記オリゴヌクレオチドが少なくとも一つの糖部分の2'位に
    修飾を含む、請求項１２の方法。
  16. 【請求項１６】 前記2'修飾が2'-O-メトキシエチル修飾である、請求項１５
    の方法。
  17. 【請求項１７】 前記オリゴヌクレオチドが少なくとも一つの修飾塩基を含む
    、請求項１２の方法。
  18. 【請求項１８】 前記修飾塩基が5-メチルシトシンである、請求項１７の方法
    。
  19. 【請求項１９】 前記標識が比色性、放射性、化学発光性、酵素性あるいは蛍
    光性である、請求項１２の方法。
  20. 【請求項２０】 前記標識がジゴキシゲニンである、請求項１２の方法。
  21. 【請求項２１】 前記酵素がDNAリガーゼである、請求項１２の方法。
  22. 【請求項２２】 前記オリゴヌクレオチドが外来的に投与される、請求項１２
    の方法。
  23. 【請求項２３】 体液あるいは抽出物中のオリゴヌクレオチドを検出あるいは
    定量する方法であって、以下のステップ： 前記液あるいは抽出物と、前記オリゴヌクレオチドおよび二次プローブに相補
    的な捕獲プローブとを接触させること；ここで、前記捕獲プローブは検出可能な
    マーカーと前記オリゴヌクレオチドに結合する部分とを含み、前記二次プローブ
    は前記検出可能マーカーと結合する第1部分と前記オリゴヌクレオチドに結合し
    て複合体を形成する際にフラップを産生する第2部分とを含み； 前記複合体とヌクレアーゼとを接触させて、前記フラップを切断させること；
    および 前記フラップを検出すること； を含む、前記方法。
  24. 【請求項２４】 前記体液が血漿である、請求項２３の方法。
  25. 【請求項２５】 オリゴヌクレオチドが少なくとも一つのホスホロチオエート
    結合を含む、請求項２３の方法。
  26. 【請求項２６】 前記オリゴヌクレオチドが少なくとも一つの糖部分の2'位に
    修飾を含む、請求項２３の方法。
  27. 【請求項２７】 前記2'修飾が2'-O-メトキシエチル修飾である、請求項２６
    の方法。
  28. 【請求項２８】 前記オリゴヌクレオチドが少なくとも一つの修飾塩基を含む
    、請求項２３の方法。
  29. 【請求項２９】 前記修飾塩基が5-メチルシトシンである、請求項２８の方法
    。
  30. 【請求項３０】 前記ヌクレアーゼが、ユーバクテリアPol A DNAポリメラー
    ゼ、5'→3'エクソヌクレアーゼ、バクテリオファージT5と関連する5'ヌクレアー
    ゼ、FEN1、RAD2、および真核生物由来色素性乾皮症-相補性G群エンドヌクレアー
    ゼホモログからなる群から選択される、請求項２３の方法。
  31. 【請求項３１】 前記オリゴヌクレオチドが外来的に投与される、請求項２３
    の方法。
JP2001536770A 1999-11-12 2000-11-10 オリゴヌクレオチドを定量するための方法 Withdrawn JP2003533971A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US16518499P 1999-11-12 1999-11-12
US60/165,184 1999-11-12
PCT/US2000/031042 WO2001034845A1 (en) 1999-11-12 2000-11-10 Method for quantitating oligonucleotides

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2003533971A true JP2003533971A (ja) 2003-11-18

Family

ID=22597825

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2001536770A Withdrawn JP2003533971A (ja) 1999-11-12 2000-11-10 オリゴヌクレオチドを定量するための方法

Country Status (6)

Country Link
US (1) US6355438B1 (ja)
EP (1) EP1228245A4 (ja)
JP (1) JP2003533971A (ja)
AU (1) AU767490B2 (ja)
CA (1) CA2391004A1 (ja)
WO (1) WO2001034845A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2019534025A (ja) * 2016-11-11 2019-11-28 ロシュ イノベーション センター コペンハーゲン エーエス 治療用オリゴヌクレオチドの捕捉および検出

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7407738B2 (en) * 2004-04-02 2008-08-05 Pavel Kornilovich Fabrication and use of superlattice
US8168600B2 (en) * 2004-04-23 2012-05-01 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for topical delivery of oligonucleotides
WO2006004949A1 (en) * 2004-06-30 2006-01-12 Applera Corporation Compositions and methods for detecting and quantitating polynucleotide sequences
US8232049B2 (en) 2006-09-29 2012-07-31 Case Western Reserve University Method for detecting small oligonucleotides
WO2019011875A1 (en) 2017-07-11 2019-01-17 Qiagen Gmbh QUANTIFICATION OF ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDES (ASOS)
EP3790991A1 (en) 2018-05-07 2021-03-17 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Massively parallel discovery methods for oligonucleotide therapeutics
EP3699297A1 (en) * 2019-02-25 2020-08-26 QIAGEN GmbH A method for determining the level of an antisense oligonucleotide
WO2023086676A2 (en) * 2021-11-15 2023-05-19 Electronic Biosciences, Inc. Methods and compositions for dual nanopore sequencing

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4840892A (en) * 1984-05-15 1989-06-20 Smithkline Beckman Corporation Polynucleotide hybridization probes
US4851331A (en) * 1986-05-16 1989-07-25 Allied Corporation Method and kit for polynucleotide assay including primer-dependant DNA polymerase
WO1990011372A1 (en) * 1989-03-21 1990-10-04 Collaborative Research, Inc. Multiplex dna diagnostic test
ATE269870T1 (de) * 1989-10-24 2004-07-15 Isis Pharmaceuticals Inc 2'-modifizierte oligonukleotide
US5455166A (en) * 1991-01-31 1995-10-03 Becton, Dickinson And Company Strand displacement amplification
US5965722A (en) * 1991-05-21 1999-10-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense inhibition of ras gene with chimeric and alternating oligonucleotides
US5846717A (en) 1996-01-24 1998-12-08 Third Wave Technologies, Inc. Detection of nucleic acid sequences by invader-directed cleavage
US5958772A (en) * 1998-12-03 1999-09-28 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense inhibition of cellular inhibitor of apoptosis-1 expression
US5446137B1 (en) * 1993-12-09 1998-10-06 Behringwerke Ag Oligonucleotides containing 4'-substituted nucleotides
WO1995020679A1 (en) * 1994-01-26 1995-08-03 Hybridon, Inc. Method of detecting sub-ppb levels of oligonucleotides in biological fluids
US5683875A (en) * 1995-05-04 1997-11-04 Hewlett-Packard Company Method for detecting a target nucleic acid analyte in a sample
US5874283A (en) * 1995-05-30 1999-02-23 John Joseph Harrington Mammalian flap-specific endonuclease
US5882867A (en) * 1995-06-07 1999-03-16 Dade Behring Marburg Gmbh Detection of nucleic acids by formation of template-dependent product
AU1428097A (en) * 1996-01-12 1997-08-01 Hybridon, Inc. Method of monitoring pharmacokinetics of oligonucleotide pharmaceuticals

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2019534025A (ja) * 2016-11-11 2019-11-28 ロシュ イノベーション センター コペンハーゲン エーエス 治療用オリゴヌクレオチドの捕捉および検出
JP7033591B2 (ja) 2016-11-11 2022-03-10 ロシュ イノベーション センター コペンハーゲン エーエス 治療用オリゴヌクレオチドの捕捉および検出

Also Published As

Publication number Publication date
EP1228245A1 (en) 2002-08-07
WO2001034845A1 (en) 2001-05-17
CA2391004A1 (en) 2001-05-17
AU1599201A (en) 2001-06-06
US6355438B1 (en) 2002-03-12
AU767490B2 (en) 2003-11-13
EP1228245A4 (en) 2004-03-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101770435B1 (ko) 자연 안티센스 전사체가 아포리포단백질-ａ1로 억제에 의해 아포리포단백-ａ1 관련된 질환의 치료
CN107988228B (zh) 通过抑制沉默调节蛋白(sirt)的天然反义转录物而治疗沉默调节蛋白(sirt)相关疾病
JP3745226B2 (ja) サービビン発現のアンチセンス・モジュレーション
EP1337547B1 (en) Nuclease-based method for detecting and quantitating oligonucleotides
KR20010102992A (ko) 표적 ｒｎａ를 검출하는 비-침입적 방법
US20040009510A1 (en) Allosteric nucleic acid sensor molecules
JP2002526125A (ja) 腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）発現のアンチセンス・オリゴヌクレオチド調節
JP2002526093A (ja) ｂｃｌ−ｘ発現のアンチセンスモジュレーション
JP2003521913A (ja) Ｓｕｒｖｉｖｉｎ発現のアンチセンスモジュレーション
US6436909B1 (en) Antisense inhibition of transforming growth factor-β expression
AU767490B2 (en) Method for quantitating oligonucleotides
US20020102568A1 (en) Nucleic acid sensor molecules
US6399297B1 (en) Antisense modulation of expression of tumor necrosis factor receptor-associated factors (TRAFs)
AU2002364052B2 (en) Novel compositions and methods for cancer
US20030171328A1 (en) Non-invasive method for detecting target-RNA
US20040137501A1 (en) Antisense modulation of TRADD expression
AU2001284570B2 (en) New sequences
EP1086216B1 (en) Pseudo-cyclic oligonucleobases
AU2001284570A1 (en) New sequences
Cooperman et al. Photolabile Oligodeoxyribonucleotide Probes of E. coli Ribosome Structure
EP1316607A1 (en) Pseudo-cyclic oligonucleobases for inhibiting tumor growth
JP2002519015A (ja) Ｔｎｆｒ１発現のアンチセンスモジュレーション
Olivas Characterization and applications of DNA triple helix formation

Legal Events

Date Code Title Description
A761 Written withdrawal of application

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A761

Effective date: 20050428