JP2003533546A - Mura活性をモジュレーションする方法 - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、MurAポリペプチドの活性をモジュレーションする方法、詳細には、疾病の治療方法を提供する。
Description
【0001】
発明の分野
本発明は、UDP−N−アセチルグルコサミンエノールピルビルトランスフェ
ラーゼファミリーのポリヌクレオチドおよびポリペプチドの活性をモジュレーシ
ョンする方法、特に、疾病の治療方法に関する。
ラーゼファミリーのポリヌクレオチドおよびポリペプチドの活性をモジュレーシ
ョンする方法、特に、疾病の治療方法に関する。
【0002】
発明の背景
ストレプトコッカス属(Streptococci)は医学的に重要な微生物属を形成して
おり、ヒトにおいて、例えば中耳炎、結膜炎、肺炎、菌血症、髄膜炎、静脈洞炎
、膿胸および心内膜炎、最も詳細には例えば脳脊髄液の感染のごとき髄膜炎を包
含する、いくつかの型の疾患を引き起こすことが知られている。ストレプトコッ
カス属の単離から100年以上も経過しているため、ストレプトコッカス・ニュ
ーモニアエ(Streptococcus pneumoniae)は、より詳細な研究がなされた微生物
の一つである。例えば、事実、DNAが遺伝物質であるという初期の見解の大部
分は、この微生物を用いたGriffithならびに、Avery、MacleodおよびMcCartyの
研究において述べられた。ストレプトコッカス・ニューモニアエに関する研究は
膨大であるにも関わらず、この微生物の毒性に関しては多くの疑問が残されてい
る。抗生物質の開発のための標的としてストレプトコッカス属の遺伝子および遺
伝子産物を用いるのはとりわけ好ましいことである。
おり、ヒトにおいて、例えば中耳炎、結膜炎、肺炎、菌血症、髄膜炎、静脈洞炎
、膿胸および心内膜炎、最も詳細には例えば脳脊髄液の感染のごとき髄膜炎を包
含する、いくつかの型の疾患を引き起こすことが知られている。ストレプトコッ
カス属の単離から100年以上も経過しているため、ストレプトコッカス・ニュ
ーモニアエ(Streptococcus pneumoniae)は、より詳細な研究がなされた微生物
の一つである。例えば、事実、DNAが遺伝物質であるという初期の見解の大部
分は、この微生物を用いたGriffithならびに、Avery、MacleodおよびMcCartyの
研究において述べられた。ストレプトコッカス・ニューモニアエに関する研究は
膨大であるにも関わらず、この微生物の毒性に関しては多くの疑問が残されてい
る。抗生物質の開発のための標的としてストレプトコッカス属の遺伝子および遺
伝子産物を用いるのはとりわけ好ましいことである。
【0003】
ストレプトコッカス・ニューモニアエ感染の頻度は過去20年間に劇的に上昇
している。これは多重抗生物質耐性株の出現、および免疫系が低下した人の集団
の増加に起因している。いくつかのまたは全ての標準的な抗生物質に対して耐性
を有するストレプトコッカス・ニューモニアエ株を単離することはもはやめずら
しいことではない。この現象がこの生物に対する新しい抗菌剤、ワクチンおよび
診断試験についての必要性を形成した。
している。これは多重抗生物質耐性株の出現、および免疫系が低下した人の集団
の増加に起因している。いくつかのまたは全ての標準的な抗生物質に対して耐性
を有するストレプトコッカス・ニューモニアエ株を単離することはもはやめずら
しいことではない。この現象がこの生物に対する新しい抗菌剤、ワクチンおよび
診断試験についての必要性を形成した。
【0004】
そのうえ、薬剤の発見方法は、現在のところ、「機能的遺伝学」、すなわち、
高処理量のゲノムまたは遺伝子に基づく生物学を包含するので抜本的な改革を受
けている。このアプローチは、「位置的クローニング」に基づく初期のアプロー
チおよび他の方法に取って代わりつつある。機能的遺伝学は、現在利用可能な多
くの分子生物学的データベースならびに他のソースから潜在的に興味ある遺伝子
配列を同定するための種々の道具に大きく依存している。薬剤の発見の標的とし
ての、さらなる遺伝子および他のポリヌクレオチド配列ならびにそれらの関連ポ
リペプチドの同定および特徴づけをする必要性があり続けている。
高処理量のゲノムまたは遺伝子に基づく生物学を包含するので抜本的な改革を受
けている。このアプローチは、「位置的クローニング」に基づく初期のアプロー
チおよび他の方法に取って代わりつつある。機能的遺伝学は、現在利用可能な多
くの分子生物学的データベースならびに他のソースから潜在的に興味ある遺伝子
配列を同定するための種々の道具に大きく依存している。薬剤の発見の標的とし
ての、さらなる遺伝子および他のポリヌクレオチド配列ならびにそれらの関連ポ
リペプチドの同定および特徴づけをする必要性があり続けている。
【0005】
抗微生物活性に関して化合物をスクリーニングするために有用であるという利
点を有した、本発明のMurA具体例のごとき因子に対する要望があることは明
白である。かかる因子はまた、感染、機能不全および疾患の発生病理における役
割を決定するのに有用である。感染、機能不全および疾患を予防、改善または治
癒するための方法を見出すために、かかる因子ならびにそのアンタゴニストおよ
びアゴニストを同定および特徴づけする必要も明らかにある。
点を有した、本発明のMurA具体例のごとき因子に対する要望があることは明
白である。かかる因子はまた、感染、機能不全および疾患の発生病理における役
割を決定するのに有用である。感染、機能不全および疾患を予防、改善または治
癒するための方法を見出すために、かかる因子ならびにそのアンタゴニストおよ
びアゴニストを同定および特徴づけする必要も明らかにある。
【0006】
発明の概要
UDP−N−アセチルグルコサミンエノールピルビルトランスフェラーゼファ
ミリーの蛋白およびポリペプチドならびにそれらの変種を、本発明において「M
urAポリヌクレオチド」および「MurAポリペプチド」という場合がある。
ミリーの蛋白およびポリペプチドならびにそれらの変種を、本発明において「M
urAポリヌクレオチド」および「MurAポリペプチド」という場合がある。
【0007】
本発明は、MurA、詳細にはMurAポリペプチドおよびMurAポリヌク
レオチド、組み換え物質ならびにそれらの製造方法に関する。もう1つの態様に
おいて、本発明は、かかるポリペプチドおよびポリヌクレオチドの使用方法に関
し、とりわけ、微生物による疾病の治療を包含する。さらなる態様において、本
発明は、本発明により提供される材料を用いるアゴニストおよびアンタゴニスト
の同定方法、ならびに同定されたアゴニストまたはアンタゴニスト化合物を用い
る微生物による感染およびかかる感染に関連した症状の治療方法に関する。さら
なる態様において、本発明は、微生物による感染およびかかる感染に関連した症
状の検出のための診断アッセイ、例えば、MurAの発現または活性の検出のた
めのアッセイに関する。
レオチド、組み換え物質ならびにそれらの製造方法に関する。もう1つの態様に
おいて、本発明は、かかるポリペプチドおよびポリヌクレオチドの使用方法に関
し、とりわけ、微生物による疾病の治療を包含する。さらなる態様において、本
発明は、本発明により提供される材料を用いるアゴニストおよびアンタゴニスト
の同定方法、ならびに同定されたアゴニストまたはアンタゴニスト化合物を用い
る微生物による感染およびかかる感染に関連した症状の治療方法に関する。さら
なる態様において、本発明は、微生物による感染およびかかる感染に関連した症
状の検出のための診断アッセイ、例えば、MurAの発現または活性の検出のた
めのアッセイに関する。
【0008】
本発明は、下記の群から選択されるポリペプチドの発現をモジュレーションす
る化合物を提供する:ここにポリペプチドは配列番号:2または4のアミノ酸配
列に対して少なくとも40、50、60、70、80または90%同一であるア
ミノ酸配列を含むポリペプチド、ならびに配列番号:2または4に示すアミノ酸
配列を含むポリペプチドである。
る化合物を提供する:ここにポリペプチドは配列番号:2または4のアミノ酸配
列に対して少なくとも40、50、60、70、80または90%同一であるア
ミノ酸配列を含むポリペプチド、ならびに配列番号:2または4に示すアミノ酸
配列を含むポリペプチドである。
【0009】
さらに本発明は、MurAポリペプチドを阻害する必要のある個体の治療方法
を提供し、該方法は、下記の群から選択されるポリペプチドの活性または発現を
阻害する抗細菌的に有効量のアンタゴニストを個体に投与することを含む:ここ
にポリペプチドは配列番号:2または4のアミノ酸配列に対して少なくとも40
、50、60、70、80または90%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプ
チド、ならびに配列番号:2または4に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドで
ある。
を提供し、該方法は、下記の群から選択されるポリペプチドの活性または発現を
阻害する抗細菌的に有効量のアンタゴニストを個体に投与することを含む:ここ
にポリペプチドは配列番号:2または4のアミノ酸配列に対して少なくとも40
、50、60、70、80または90%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプ
チド、ならびに配列番号:2または4に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドで
ある。
【0010】
さらに本発明は、細菌感染した個体の治療方法を提供し、該方法は、配列番号
:2または4のアミノ酸配列に対して少なくとも40、50、60、70、80
または90%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、ならびに配列番号:
2または4に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドから選択されるポリペプチド
の活性または発現を阻害する抗細菌的に有効量のアンタゴニストを個体に投与す
ることを含む。
:2または4のアミノ酸配列に対して少なくとも40、50、60、70、80
または90%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、ならびに配列番号:
2または4に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドから選択されるポリペプチド
の活性または発現を阻害する抗細菌的に有効量のアンタゴニストを個体に投与す
ることを含む。
【0011】
さらにMurAポリペプチドを阻害する必要のある個体の治療方法も提供され
、該方法は、(i)アウリントリカルボン酸によるEPSPSおよび/またはM
urAの阻害、(ii)好ましくは、ポリアニオン性基質といずれかの酵素との
間の相互作用と類似の様式の、正に帯電した活性部位残基とアニオン性トリカル
ボキシラートとの間の相互作用、および/または(iii)好ましくは、EPS
PSの活性に影響しないものである、ロゾール酸によるMurAの阻害、を阻害
または活性化する抗細菌的に有効量の化合物または組成物を個体に投与する工程
を含む。
、該方法は、(i)アウリントリカルボン酸によるEPSPSおよび/またはM
urAの阻害、(ii)好ましくは、ポリアニオン性基質といずれかの酵素との
間の相互作用と類似の様式の、正に帯電した活性部位残基とアニオン性トリカル
ボキシラートとの間の相互作用、および/または(iii)好ましくは、EPS
PSの活性に影響しないものである、ロゾール酸によるMurAの阻害、を阻害
または活性化する抗細菌的に有効量の化合物または組成物を個体に投与する工程
を含む。
【0012】
また本発明は、細菌に感染した個体の治療方法も提供し、該方法は、(i)ア
ウリントリカルボン酸によるEPSPSおよび/またはMurAの阻害、(ii
)好ましくは、ポリアニオン性基質といずれかの酵素との間の相互作用と類似の
様式の、正に帯電した活性部位残基とアニオン性トリカルボキシラートとの間の
相互作用、および/または(iii)好ましくは、EPSPSの活性に影響しな
いものである、ロゾール酸によるMurAの阻害、を阻害または活性化する抗細
菌的に有効量の化合物または組成物を個体に投与する工程を含む。
ウリントリカルボン酸によるEPSPSおよび/またはMurAの阻害、(ii
)好ましくは、ポリアニオン性基質といずれかの酵素との間の相互作用と類似の
様式の、正に帯電した活性部位残基とアニオン性トリカルボキシラートとの間の
相互作用、および/または(iii)好ましくは、EPSPSの活性に影響しな
いものである、ロゾール酸によるMurAの阻害、を阻害または活性化する抗細
菌的に有効量の化合物または組成物を個体に投与する工程を含む。
【0013】
さらにもう1つの方法は、配列番号:2または4のアミノ酸配列に対して少な
くとも40、50、60、70、80または90%同一であるアミノ酸配列を含
むポリペプチド、ならびに配列番号:2または4に示すアミノ酸配列を含むポリ
ペプチドからなる群より選択されるポリペプチドの活性を阻害する化合物または
組成物を提供し、ここに該活性は、(i)アウリントリカルボン酸によるEPS
PSおよび/またはMurAの阻害、(ii)好ましくは、ポリアニオン性基質
といずれかの酵素との間の相互作用と類似の様式の、正に帯電した活性部位残基
とアニオン性トリカルボキシラートとの間の相互作用、および/または(iii
)好ましくは、EPSPSの活性に影響しないものである、ロゾール酸によるM
urAの阻害、である。
くとも40、50、60、70、80または90%同一であるアミノ酸配列を含
むポリペプチド、ならびに配列番号:2または4に示すアミノ酸配列を含むポリ
ペプチドからなる群より選択されるポリペプチドの活性を阻害する化合物または
組成物を提供し、ここに該活性は、(i)アウリントリカルボン酸によるEPS
PSおよび/またはMurAの阻害、(ii)好ましくは、ポリアニオン性基質
といずれかの酵素との間の相互作用と類似の様式の、正に帯電した活性部位残基
とアニオン性トリカルボキシラートとの間の相互作用、および/または(iii
)好ましくは、EPSPSの活性に影響しないものである、ロゾール酸によるM
urAの阻害、である。
【0014】
本発明は、MurAポリペプチドの阻害を必要とする個体のもう1つの治療方
法を提供し、該方法は、配列番号:2または4のアミノ酸配列に対して少なくと
も40、50、60、70、80または90%同一であるアミノ酸配列を含むポ
リペプチド、ならびに配列番号:2または4に示すアミノ酸配列を含むポリペプ
チドからなる群より選択されるポリペプチドの活性を阻害する抗細菌的に有効量
の化合物または組成物を投与する工程を含み、ここに該活性は、(i)アウリン
トリカルボン酸によるEPSPSおよび/またはMurAの阻害、(ii)好ま
しくは、ポリアニオン性基質といずれかの酵素との間の相互作用と類似の様式の
、正に帯電した活性部位残基とアニオン性トリカルボキシラートとの間の相互作
用、および/または(iii)好ましくは、EPSPSの活性に影響しないもの
である、ロゾール酸によるMurAの阻害、である。
法を提供し、該方法は、配列番号:2または4のアミノ酸配列に対して少なくと
も40、50、60、70、80または90%同一であるアミノ酸配列を含むポ
リペプチド、ならびに配列番号:2または4に示すアミノ酸配列を含むポリペプ
チドからなる群より選択されるポリペプチドの活性を阻害する抗細菌的に有効量
の化合物または組成物を投与する工程を含み、ここに該活性は、(i)アウリン
トリカルボン酸によるEPSPSおよび/またはMurAの阻害、(ii)好ま
しくは、ポリアニオン性基質といずれかの酵素との間の相互作用と類似の様式の
、正に帯電した活性部位残基とアニオン性トリカルボキシラートとの間の相互作
用、および/または(iii)好ましくは、EPSPSの活性に影響しないもの
である、ロゾール酸によるMurAの阻害、である。
【0015】
また、細菌感染した個体の治療方法も本発明により提供され、該方法は、配列
番号:2または4のアミノ酸配列に対して少なくとも40、50、60、70、
80または90%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、ならびに配列番
号:2または4に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドからなる群より選択され
るポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチドの活性を阻害する抗細菌
的に有効量の化合物または組成物を個体に投与する工程を含み、ここに該活性は
、(i)アウリントリカルボン酸によるEPSPSおよび/またはMurAの阻
害、(ii)好ましくは、ポリアニオン性基質といずれかの酵素との間の相互作
用と類似の様式の、正に帯電した活性部位残基とアニオン性トリカルボキシラー
トとの間の相互作用、および/または(iii)好ましくは、EPSPSの活性
に影響しないものである、ロゾール酸によるMurAの阻害、である。
番号:2または4のアミノ酸配列に対して少なくとも40、50、60、70、
80または90%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、ならびに配列番
号:2または4に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドからなる群より選択され
るポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチドの活性を阻害する抗細菌
的に有効量の化合物または組成物を個体に投与する工程を含み、ここに該活性は
、(i)アウリントリカルボン酸によるEPSPSおよび/またはMurAの阻
害、(ii)好ましくは、ポリアニオン性基質といずれかの酵素との間の相互作
用と類似の様式の、正に帯電した活性部位残基とアニオン性トリカルボキシラー
トとの間の相互作用、および/または(iii)好ましくは、EPSPSの活性
に影響しないものである、ロゾール酸によるMurAの阻害、である。
【0016】
MurAポリペプチドを阻害する方法もまた本発明により提供され、(i)ア
ウリントリカルボン酸によるEPSPSおよび/またはMurAの阻害、(ii
)好ましくは、ポリアニオン性基質といずれかの酵素との間の相互作用と類似の
様式の、正に帯電した活性部位残基とアニオン性トリカルボキシラートとの間の
相互作用、および/または(iii)好ましくは、EPSPSの活性に影響しな
いものである、ロゾール酸によるMurAの阻害、を阻害または活性化する有効
量の化合物に、該ポリペプチドを含む化合物または組成物を接触させる工程を含
む。
ウリントリカルボン酸によるEPSPSおよび/またはMurAの阻害、(ii
)好ましくは、ポリアニオン性基質といずれかの酵素との間の相互作用と類似の
様式の、正に帯電した活性部位残基とアニオン性トリカルボキシラートとの間の
相互作用、および/または(iii)好ましくは、EPSPSの活性に影響しな
いものである、ロゾール酸によるMurAの阻害、を阻害または活性化する有効
量の化合物に、該ポリペプチドを含む化合物または組成物を接触させる工程を含
む。
【0017】
(i)アウリントリカルボン酸によるEPSPSおよび/またはMurAの阻
害、(ii)好ましくは、ポリアニオン性基質といずれかの酵素との間の相互作
用と類似の様式の、正に帯電した活性部位残基とアニオン性トリカルボキシラー
トとの間の相互作用、および/または(iii)好ましくは、EPSPSの活性
に影響しないものである、ロゾール酸によるMurAの阻害、を阻害または活性
化する方法も提供され、該方法は、細菌を含む化合物または組成物を、工程(i
)、(ii)、(iii)および/または(iv)の活性を阻害または活性化す
る化合物に、該細菌を殺しあるいはその増殖を遅くするのに効果的なな時間接触
させることを含む。
害、(ii)好ましくは、ポリアニオン性基質といずれかの酵素との間の相互作
用と類似の様式の、正に帯電した活性部位残基とアニオン性トリカルボキシラー
トとの間の相互作用、および/または(iii)好ましくは、EPSPSの活性
に影響しないものである、ロゾール酸によるMurAの阻害、を阻害または活性
化する方法も提供され、該方法は、細菌を含む化合物または組成物を、工程(i
)、(ii)、(iii)および/または(iv)の活性を阻害または活性化す
る化合物に、該細菌を殺しあるいはその増殖を遅くするのに効果的なな時間接触
させることを含む。
【0018】
細菌を含む本発明の方法において、該細菌は、Staphylococcus属のメンバーで
あるStaphylococcus aureus、Streptococcus属のメンバーであるStreptococcus
pneumoniaeからなる群より選択されることが好ましい。
あるStaphylococcus aureus、Streptococcus属のメンバーであるStreptococcus
pneumoniaeからなる群より選択されることが好ましい。
【0019】
本発明のさらなる態様によれば、MurAアゴニストおよびアンタゴニスト、
好ましくは静細菌性または殺細菌性アゴニストおよびアンタゴニストが提供され
る。
好ましくは静細菌性または殺細菌性アゴニストおよびアンタゴニストが提供され
る。
【0020】
本発明のさらなる態様において、MurAポリペプチド、MurAポリペプチ
ドまたはそのアゴニストもしくはアンタゴニストを含む組成物であって、単細胞
または多細胞生物に投与されるものが提供される。
ドまたはそのアゴニストもしくはアンタゴニストを含む組成物であって、単細胞
または多細胞生物に投与されるものが提供される。
【0021】
開示された発明の精神および範囲内の変更および修飾は、以下の説明を読み、
本開示の他の部分を読んだ当業者に容易に明らかとなろう。
本開示の他の部分を読んだ当業者に容易に明らかとなろう。
【0022】
発明の説明
本発明は、以下においてより詳細に説明するように、MurAポリペプチドお
よびポリヌクレオチドならびにそれらの活性をモジュレーションする方法に関す
る。詳細には、本発明は、Streptpcoccus pneumoniaeのMurAのポリペプチド
およびポリヌクレオチドに関し、該ポリペプチドはBacillus subtilis由来のポ
リペプチドに対してアミノ酸相同性を有する。特に、本発明は、表3ならびに配
列番号:1および配列番号:2にそれぞれ示されるヌクレオチドおよびアミノ酸
配列を有するMurAに関する。「DNA」として後で示す配列表に記載された
配列は本発明の典型例を示す。なぜなら当業者は、リボポリヌクレオチドを包含
するポリヌクレオチドにおいてかかる配列を有用に使用できるからである。
よびポリヌクレオチドならびにそれらの活性をモジュレーションする方法に関す
る。詳細には、本発明は、Streptpcoccus pneumoniaeのMurAのポリペプチド
およびポリヌクレオチドに関し、該ポリペプチドはBacillus subtilis由来のポ
リペプチドに対してアミノ酸相同性を有する。特に、本発明は、表3ならびに配
列番号:1および配列番号:2にそれぞれ示されるヌクレオチドおよびアミノ酸
配列を有するMurAに関する。「DNA」として後で示す配列表に記載された
配列は本発明の典型例を示す。なぜなら当業者は、リボポリヌクレオチドを包含
するポリヌクレオチドにおいてかかる配列を有用に使用できるからである。
【0023】
UDP−N−アセチルグルコサミン(本明細書において「UDPAG」という
)エノールピルビルトランスフェラーゼ(MurA)および5−エノールピルビ
ルシキマート−3−ホスファートシンターゼ(本明細書において「EPSPS」
という)は、それぞれ、細菌細胞壁生合成およびアミノ酸生合成において重要な
機能を有するエノールピルビルトランスフェラーゼである。いずれの酵素も潜在
的な抗細菌標的である。Streptococcus pneumoniaeのEPSPSの阻害剤を検索
した後、我々は、カルボキシル化されたトリフェニルメタンのコア構造を有する
一連のツール化合物を同定した。これらの化合物の1つは、基質シキマート−3
−ホスファート(本明細書において「S3P」という)の競争的阻害剤であるこ
とがわかった。その商業的カウンターパートであるアウリンカルボン酸(本明細
書において「ATA」という)ならびにそのナトリウムおよびアンモニウム塩も
またS3Pに対する競争的阻害剤である(Ki=2.8〜4.5マイクロモラー
)。しかしながら、ロゾール酸(本明細書において「RA」という)は、そのト
リフェニルメタン構造がカルボキシラートを欠いており、EPSPSを阻害しな
い。かくして、ATAによるEPSPSの阻害は、S3PとEPSPSとの間の
相互作用と類似の、ATAのポリアニオン性カルボキシラートとEPSPS活性
部位の正に帯電したアミノ酸残基との間の相互作用による可能性が最も高い。A
TAおよびRAはEscherichia coli由来のMurAも阻害したが(UDPAGと
競争的に)、ATAはRAよりもほぼ200倍強力である。EPSPSおよびM
urAに対するRAの異なった阻害パターンは、MurAへの基質UDPAGの
結合が、EPSPSへのS3Pへの結合よりもイオン性相互作用に依存しないこ
とを示唆する。これらの化合物に関する抗細作用様式も研究中である。
)エノールピルビルトランスフェラーゼ(MurA)および5−エノールピルビ
ルシキマート−3−ホスファートシンターゼ(本明細書において「EPSPS」
という)は、それぞれ、細菌細胞壁生合成およびアミノ酸生合成において重要な
機能を有するエノールピルビルトランスフェラーゼである。いずれの酵素も潜在
的な抗細菌標的である。Streptococcus pneumoniaeのEPSPSの阻害剤を検索
した後、我々は、カルボキシル化されたトリフェニルメタンのコア構造を有する
一連のツール化合物を同定した。これらの化合物の1つは、基質シキマート−3
−ホスファート(本明細書において「S3P」という)の競争的阻害剤であるこ
とがわかった。その商業的カウンターパートであるアウリンカルボン酸(本明細
書において「ATA」という)ならびにそのナトリウムおよびアンモニウム塩も
またS3Pに対する競争的阻害剤である(Ki=2.8〜4.5マイクロモラー
)。しかしながら、ロゾール酸(本明細書において「RA」という)は、そのト
リフェニルメタン構造がカルボキシラートを欠いており、EPSPSを阻害しな
い。かくして、ATAによるEPSPSの阻害は、S3PとEPSPSとの間の
相互作用と類似の、ATAのポリアニオン性カルボキシラートとEPSPS活性
部位の正に帯電したアミノ酸残基との間の相互作用による可能性が最も高い。A
TAおよびRAはEscherichia coli由来のMurAも阻害したが(UDPAGと
競争的に)、ATAはRAよりもほぼ200倍強力である。EPSPSおよびM
urAに対するRAの異なった阻害パターンは、MurAへの基質UDPAGの
結合が、EPSPSへのS3Pへの結合よりもイオン性相互作用に依存しないこ
とを示唆する。これらの化合物に関する抗細作用様式も研究中である。
【0024】
EPSPSおよびMurAは、それぞれホスホ(エノール)ピルバート(本発
明において「PEP」という)からS3PおよびUDPAGにエノールピルビル
基を転移する反応を触媒する2種の酵素である。EPSPSは芳香族アミノ酸生
合成における6番目の酵素であり、除草剤グリホサート(本明細書において「G
LP」という)により容易に阻害される(Haslam, E., Shikimic Acid: Metabol
ism and Metabolites, John Wiley, Cickester)。MurAは細菌細胞壁生合成
の第1工程を触媒し、抗生物質ホスホマイシンにより阻害される(Rogers, et a
l., Microbial Cell Walls and Membranes, Chapman & Hall, London)。いずれ
の酵素もリガンドがない場合にはツー−ドメイン構造を有し、基質結合部位は2
つのドメイン間に埋もれている(Stallings, et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, Vol. 88: 5046-5050 (1991))(Schoenbrunn, et al., Structure 4, 1065-1
075 (1996))。しかしながら、UDPAGおよびホスホマイシンと複合体化した
MurAは「閉じた」コンホーメーションを有すると仮定される(Skarzynski,
et al., Structure 4, 1465-1474 (1996))。EPSPSとMurAとの間の機
能および構造類似性から、我々は、これら両方の抗細菌標的に関する共通の阻害
剤の検索を急いで行ない、その検索は部分的に本発明の基礎となった。
明において「PEP」という)からS3PおよびUDPAGにエノールピルビル
基を転移する反応を触媒する2種の酵素である。EPSPSは芳香族アミノ酸生
合成における6番目の酵素であり、除草剤グリホサート(本明細書において「G
LP」という)により容易に阻害される(Haslam, E., Shikimic Acid: Metabol
ism and Metabolites, John Wiley, Cickester)。MurAは細菌細胞壁生合成
の第1工程を触媒し、抗生物質ホスホマイシンにより阻害される(Rogers, et a
l., Microbial Cell Walls and Membranes, Chapman & Hall, London)。いずれ
の酵素もリガンドがない場合にはツー−ドメイン構造を有し、基質結合部位は2
つのドメイン間に埋もれている(Stallings, et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, Vol. 88: 5046-5050 (1991))(Schoenbrunn, et al., Structure 4, 1065-1
075 (1996))。しかしながら、UDPAGおよびホスホマイシンと複合体化した
MurAは「閉じた」コンホーメーションを有すると仮定される(Skarzynski,
et al., Structure 4, 1465-1474 (1996))。EPSPSとMurAとの間の機
能および構造類似性から、我々は、これら両方の抗細菌標的に関する共通の阻害
剤の検索を急いで行ない、その検索は部分的に本発明の基礎となった。
【0025】
EPSPSの高処理量スクリーニングにより化合物SKB−26488−W3
(アウリンカルボン酸,ATA)を単離し、それはμM範囲のIC50を有する
。この化合物とEPSPSとの反応論的研究により、それがS3Pに対する競争
的阻害剤である(Ki=9.1μM)が、PEPに対する非表層的阻害剤である
こと(Ki=24.3μM)が示された。ATAのナトリウムおよびアンモニウ
ム塩(アルミノン)もまた、EPSPSの特異的阻害剤であることがわかった。
S3Pに対する競争的阻害は、同じ結合部位を求めてATAがS3Pと競争する
ことを示すが、PEPに対する非競争的性質の阻害は、ATA結合部位がPEP
結合部位と部分的に重なっていることを示す。
(アウリンカルボン酸,ATA)を単離し、それはμM範囲のIC50を有する
。この化合物とEPSPSとの反応論的研究により、それがS3Pに対する競争
的阻害剤である(Ki=9.1μM)が、PEPに対する非表層的阻害剤である
こと(Ki=24.3μM)が示された。ATAのナトリウムおよびアンモニウ
ム塩(アルミノン)もまた、EPSPSの特異的阻害剤であることがわかった。
S3Pに対する競争的阻害は、同じ結合部位を求めてATAがS3Pと競争する
ことを示すが、PEPに対する非競争的性質の阻害は、ATA結合部位がPEP
結合部位と部分的に重なっていることを示す。
【0026】
しかしながら、ロゾール酸は2mMまではEPSPSを阻害しない。これらの
結果は、ATAのフェニル環上のカルボキシラート基が阻害機構において重要な
役割を果たすことを示す。EPSPSの活性部位は数個の正に帯電したアミノ酸
残基からなっており、それらはポリアニオン正基質S3Pとともに安定化塩橋を
形成する。同じ残基が同様の様式で、すなわち、本発明の方法において有用なこ
の化合物および他の化合物のトリカルボキシラートとの塩橋形成により、ATA
の結合も安定化させることが本明細書において示される。このことは、なぜトリ
カルボキシラートを欠くRAが阻害剤でないのかを説明するモデルとして役立つ
。しかしながら、このモデルあるいは本明細書に示された他の機構モデルは本発
明を限定するものでなく、限定するものと解すべきでない。
結果は、ATAのフェニル環上のカルボキシラート基が阻害機構において重要な
役割を果たすことを示す。EPSPSの活性部位は数個の正に帯電したアミノ酸
残基からなっており、それらはポリアニオン正基質S3Pとともに安定化塩橋を
形成する。同じ残基が同様の様式で、すなわち、本発明の方法において有用なこ
の化合物および他の化合物のトリカルボキシラートとの塩橋形成により、ATA
の結合も安定化させることが本明細書において示される。このことは、なぜトリ
カルボキシラートを欠くRAが阻害剤でないのかを説明するモデルとして役立つ
。しかしながら、このモデルあるいは本明細書に示された他の機構モデルは本発
明を限定するものでなく、限定するものと解すべきでない。
【0027】
【表1】
【0028】
MurAの阻害に関するモデルはより複雑である(表1)。そのモデルにおい
て、ATAは両方の基質に対して特異的阻害パターンを示すが、RAは弱いなが
らもUDPAGに対する競争的阻害剤としても検知される。このことは、より大
きな基質にも対応することでMurAがEPSPSよりも柔軟性があるというモ
デルを支持する。さらにそのうえ、そのモデルにおけるMurAにおける基質/
阻害剤結合がEPSPSよりも対イオンに依存しないことも説明される。
て、ATAは両方の基質に対して特異的阻害パターンを示すが、RAは弱いなが
らもUDPAGに対する競争的阻害剤としても検知される。このことは、より大
きな基質にも対応することでMurAがEPSPSよりも柔軟性があるというモ
デルを支持する。さらにそのうえ、そのモデルにおけるMurAにおける基質/
阻害剤結合がEPSPSよりも対イオンに依存しないことも説明される。
【0029】
S. pneumoniae 100993に対するシプロフロキサシンおよびクロラムフェニコー
ルの抗細菌活性は、添加物質ありおよびなしの場合のTH培地および最少培地の
両方において実質的に同じであった。グリホサートはTH培地において抗細菌活
性を有しておらず、最少培地におけるその抗細菌活性は、芳香族アミノ酸および
PABAの添加で逆転された。この挙動は、コリスマート経路の抗細菌標的化と
矛盾しない。ATAはTH培地中よりも最少培地中で64倍以上高い活性を示し
、その作用機構はEPSPSの阻害を介するコリスマート生合成の阻害であるこ
とが示された。この活性は芳香族アミノ酸およびPABAの添加で逆転されず、
MurAおよびEPSPSがいずれも作用モデルの機構に関与していることが示
される(表2)。
ルの抗細菌活性は、添加物質ありおよびなしの場合のTH培地および最少培地の
両方において実質的に同じであった。グリホサートはTH培地において抗細菌活
性を有しておらず、最少培地におけるその抗細菌活性は、芳香族アミノ酸および
PABAの添加で逆転された。この挙動は、コリスマート経路の抗細菌標的化と
矛盾しない。ATAはTH培地中よりも最少培地中で64倍以上高い活性を示し
、その作用機構はEPSPSの阻害を介するコリスマート生合成の阻害であるこ
とが示された。この活性は芳香族アミノ酸およびPABAの添加で逆転されず、
MurAおよびEPSPSがいずれも作用モデルの機構に関与していることが示
される(表2)。
【0030】
【表2】
*Todd Hewitt ブロス♯
A群のストレプトコッカス用の化学的に規定された培地, JRH BioSciences (
芳香族アミノ酸およびPABA不含)ω 芳香族アミノ酸およびPABAを含有するJRH Strep 培地
芳香族アミノ酸およびPABA不含)ω 芳香族アミノ酸およびPABAを含有するJRH Strep 培地
【0031】
表3
Murポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列
(A)Streptococcus pneumoniae MurA ポリヌクレオチド配列 [配列番号:1]
5'-ATGAGAAAAATTGTTATCAATGGTGGATTACCACTGCAAGGTGAAATCACTATTAGTGGT
GCTAAAAATAGTGTCGTTGCCTTAATTCCAGCTATTATCTTGGCTGATGATGTGGTGACT
TTGGATTGCGTTCCAGATATTTCGGATGTAGCCAGTCTTGTCGAAATCATGGAATTGATG
GGAGCTACTGTTAAGCGTTATGACGATGTATTGGAGATTGACCCAAGAGGTGTTCAAAAT
ATTCCAATGCCTTATGGTAAAATTAACAGTCTTCGTGCATCTTACTATTTTTATGGGAGC
CTCTTAGGCCGTTTTGGTGAAGCGACAGTTGGTCTACCGGGAGGATGTGATCTTGGTCCT
CGTCCGATTGACTTACACCTTAAGGCGTTTGAAGCTATGGGTGCCACTGCTAGCTACGAG
GGAGATAACATGAAGTTATCTGCTAAAGATACAGGACTTCATGGTGCAAGTATTTACATG
GATACGGTTAGTGTGGGAGCAACGATTAATACGATGATTGCTGCGGTTAAAGCAAATGGT
CGTACTATTATTGAAAATGCAGCCCGTGAACCTGAGATTATTGATGTAGCTACTCTCTTG
AATAATATGGGCGCCCATATCCGTGGGGCAGGAACTAATATCATCATTATTGATGGTGTT
GAAAGATTACATGGGACACGTCATCAGGTGATTCCAGACCGCATTGAAGCTGGAACATAT
ATATCTTTAGCTGCTGCAGTTGGTAAAGGAATTCGTATAAATAATGTTCTTTACGAACAC
CTGGAAGGGTTTATTGCTAAGTTGGAAGAAATGGGAGTGAGAATGACTGTATCTGAAGAC
AGCATTTTTGTCGAGGAACAGTCTAATTTGAAAGCAATCAATATTAAGACAGCTCCTTAC
CCAGGCTTTGCAACTGATTTGCAACAACCGCTTACCCCTCTTTTACTAAGAGCGAATGGT
CGTGGTACAATTGTCGATACGATTTACGAAAAACGTGTAAATCATGTTTTTGAACTAGCA
AAGATGGATGCGGATATTTCGACAACAAATGGTCATATTTTGTACACGGGTGGACGTGAT
TTACGTGGGGCCAGTGTTAAAGCGACCGACTTAAGAGCTGGGGCTGCACTAGTCATTGCT
GGGCTTATGGCTGAAGGTAAAACTGAAATTACCAATATCGAGTTTATCTTACGTGGTTAT
TCTGATATTATCGAAAAATTACGTAATTTAGGAGCGGATATTAGACTTGTTGAGGATTAA-3'
(B)この表中のポリヌクレオチド配列から推定されたStreptococcus pneumoniae
MurA ポリペプチド配列 [配列番号:2] NH2-MRKIVINGGLPLQGEITISGAKNSVVALIPAIILADDVVTLDCVPDISDVASLVEIMELM GATVKRYDDVLEIDPRGVQNIPMPYGKINSLRASYYFYGSLLGRFGEATVGLPGGCDLGP RPIDLHLKAFEAMGATASYEGDNMKLSAKDTGLHGASIYMDTVSVGATINTMIAAVKANG RTIIENAAREPEIIDVATLLNNMGAHIRGAGTNIIIIDGVERLHGTRHQVIPDRIEAGTY ISLAAAVGKGIRINNVLYEHLEGFIAKLEEMGVRMTVSEDSIFVEEQSNLKAINIKTAPY PGFATDLQQPLTPLLLRANGRGTIVDTIYEKRVNHVFELAKMDADISTTNGHILYTGGRD LRGASVKATDLRAGAALVIAGLMAEGKTEITNIEFILRGYSDIIEKLRNLGADIRLVED-COOH
MurA ポリペプチド配列 [配列番号:2] NH2-MRKIVINGGLPLQGEITISGAKNSVVALIPAIILADDVVTLDCVPDISDVASLVEIMELM GATVKRYDDVLEIDPRGVQNIPMPYGKINSLRASYYFYGSLLGRFGEATVGLPGGCDLGP RPIDLHLKAFEAMGATASYEGDNMKLSAKDTGLHGASIYMDTVSVGATINTMIAAVKANG RTIIENAAREPEIIDVATLLNNMGAHIRGAGTNIIIIDGVERLHGTRHQVIPDRIEAGTY ISLAAAVGKGIRINNVLYEHLEGFIAKLEEMGVRMTVSEDSIFVEEQSNLKAINIKTAPY PGFATDLQQPLTPLLLRANGRGTIVDTIYEKRVNHVFELAKMDADISTTNGHILYTGGRD LRGASVKATDLRAGAALVIAGLMAEGKTEITNIEFILRGYSDIIEKLRNLGADIRLVED-COOH
【0032】
寄託物質
ストレプトコッカス・ニューモニアエ0100993株を含む寄託株を、19
96年4月11日に、スコットランド、AB2 1RY、アバディーン、マチャ
ードライブ23St.のナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・ア
ンド・マリーン・バクテリア・リミテッド(本明細書にて「NCIMB」という
)に、NCIMB受託番号40794の下で寄託した。その寄託株は寄託の際に
ストレプトコッカス・ニューモニアエ0100993と命名された。ストレプト
コッカス・ニューモニアエ寄託株を、本明細書では「寄託株」または「寄託株の
DNA」と称する。
96年4月11日に、スコットランド、AB2 1RY、アバディーン、マチャ
ードライブ23St.のナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・ア
ンド・マリーン・バクテリア・リミテッド(本明細書にて「NCIMB」という
)に、NCIMB受託番号40794の下で寄託した。その寄託株は寄託の際に
ストレプトコッカス・ニューモニアエ0100993と命名された。ストレプト
コッカス・ニューモニアエ寄託株を、本明細書では「寄託株」または「寄託株の
DNA」と称する。
【0033】
寄託株は全長のMurA遺伝子を含んでいる。寄託株に含まれるポリヌクレオ
チドの配列ならびにそれによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は、本
明細書における配列の記載とのいずれの不一致においても支配的である。 寄託株の寄託は、特許手続き上の微生物寄託の国際承認に関するブタペスト条
約の条件下で行われている。特許が発行されると何ら制限または条件もなく、最
終的に株は分譲される。寄託株は当業者の便宜のためにのみ提供され、35U.
S.C.112条の下に要求されるような、寄託が実施可能要件であることを承認
するものではない。寄託株、それに由来の化合物を製造、使用または販売するに
は、ライセンスが必要であるが、そのようなライセンスはここで付与されるもの
ではない。
チドの配列ならびにそれによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は、本
明細書における配列の記載とのいずれの不一致においても支配的である。 寄託株の寄託は、特許手続き上の微生物寄託の国際承認に関するブタペスト条
約の条件下で行われている。特許が発行されると何ら制限または条件もなく、最
終的に株は分譲される。寄託株は当業者の便宜のためにのみ提供され、35U.
S.C.112条の下に要求されるような、寄託が実施可能要件であることを承認
するものではない。寄託株、それに由来の化合物を製造、使用または販売するに
は、ライセンスが必要であるが、そのようなライセンスはここで付与されるもの
ではない。
【0034】
本発明の1の態様において、Streptococcus pneumoniae 0100993により発現さ
れうる成熟ポリペプチドをコードする単離核酸が提供され、該ポリペプチドは寄
託株中に含まれている。さらに、寄託株中のMurAポリヌクレオチド配列、例
えばDNAおよびRNA、ならびにそれらによりコードされるポリペプチドが本
発明により提供される。寄託株から単離されたMurAポリヌクレオチドおよび
ポリペプチド配列も本発明により提供される。
れうる成熟ポリペプチドをコードする単離核酸が提供され、該ポリペプチドは寄
託株中に含まれている。さらに、寄託株中のMurAポリヌクレオチド配列、例
えばDNAおよびRNA、ならびにそれらによりコードされるポリペプチドが本
発明により提供される。寄託株から単離されたMurAポリヌクレオチドおよび
ポリペプチド配列も本発明により提供される。
【0035】
ポリペプチド
本発明MurAポリペプチドは、系統発生論的に他のUDP−N−アセチルグ
ルコサミンエノールピルビルトランスフェラーゼ(MurA)ファミリーの蛋白
に実質的に関連している。 本発明の1の態様において、ストレプトコッカス・ニューモニアエのポリペプ
チド(本明細書では「MurA」および「MurAポリペプチド」という)、な
らびに生物学的、診断上、予防上、臨床的または治療上有用なその変種、ならび
にそれを含む組成物が提供される。 本発明のとりわけ好ましい具体例は、MurA遺伝子の自然発生対立遺伝子に
よりコードされるMurAポリペプチドの変種である。
ルコサミンエノールピルビルトランスフェラーゼ(MurA)ファミリーの蛋白
に実質的に関連している。 本発明の1の態様において、ストレプトコッカス・ニューモニアエのポリペプ
チド(本明細書では「MurA」および「MurAポリペプチド」という)、な
らびに生物学的、診断上、予防上、臨床的または治療上有用なその変種、ならび
にそれを含む組成物が提供される。 本発明のとりわけ好ましい具体例は、MurA遺伝子の自然発生対立遺伝子に
よりコードされるMurAポリペプチドの変種である。
【0036】
さらに本発明は下記のものである単離ポリペプチド:(a)配列番号:2の全
長にわたって配列番号:2のアミノ酸配列に対して少なくとも95%の同一性、
最も好ましくは少なくとも97〜99%の同一性を有するかまたは全く同一であ
るアミノ酸配列を含むかまたはそれよりなるポリペプチド;(b)配列番号:1
の全長にわたって配列番号:1に対して少なくとも95%の同一性、最も好まし
くは少なくとも97〜99%の同一性を有するかまたは全く同一であるポリヌク
レオチド配列を含むかまたはそれよりなる単離ポリヌクレオチドによりコードさ
れるポリペプチド;(c)配列番号:2の全長にわたって配列番号:2のアミノ
酸配列に対して少なくとも95%の同一性、最も好ましくは少なくとも97〜9
9%の同一性を有するかまたは全く同一であるポリペプチドをコードしているポ
リヌクレオチド配列を含むかまたはそれよりなる単離ポリヌクレオチドによりコ
ードされるポリペプチドを提供する。
長にわたって配列番号:2のアミノ酸配列に対して少なくとも95%の同一性、
最も好ましくは少なくとも97〜99%の同一性を有するかまたは全く同一であ
るアミノ酸配列を含むかまたはそれよりなるポリペプチド;(b)配列番号:1
の全長にわたって配列番号:1に対して少なくとも95%の同一性、最も好まし
くは少なくとも97〜99%の同一性を有するかまたは全く同一であるポリヌク
レオチド配列を含むかまたはそれよりなる単離ポリヌクレオチドによりコードさ
れるポリペプチド;(c)配列番号:2の全長にわたって配列番号:2のアミノ
酸配列に対して少なくとも95%の同一性、最も好ましくは少なくとも97〜9
9%の同一性を有するかまたは全く同一であるポリペプチドをコードしているポ
リヌクレオチド配列を含むかまたはそれよりなる単離ポリヌクレオチドによりコ
ードされるポリペプチドを提供する。
【0037】
本発明のポリペプチドは、表3[配列番号2]のポリペプチド(とりわけ成熟
ポリペプチド)ならびにポリペプチドおよびフラグメント、詳細には、MurA
の生物活性を有し、表3[配列番号2]のポリペプチドまたはその該当部分と少
なくとも95%の同一性を有するポリペプチドおよびフラグメントを包含し、さ
らにかかるポリペプチドの部分も包含し、一般に、ポリペプチドのかかる部分は
少なくとも30個のアミノ酸、より好ましくは、少なくとも50個のアミノ酸を
含む。
ポリペプチド)ならびにポリペプチドおよびフラグメント、詳細には、MurA
の生物活性を有し、表3[配列番号2]のポリペプチドまたはその該当部分と少
なくとも95%の同一性を有するポリペプチドおよびフラグメントを包含し、さ
らにかかるポリペプチドの部分も包含し、一般に、ポリペプチドのかかる部分は
少なくとも30個のアミノ酸、より好ましくは、少なくとも50個のアミノ酸を
含む。
【0038】
本発明はまた、
X−(R1)m−(R2)−(R3)n−Y
【0039】
[式中、アミノ末端のXは水素または金属、または本明細書において修飾ポリペ
プチドについて説明された他の残基であり、カルボキシル末端のYは水素または
金属、または本明細書において修飾ポリペプチドについて説明された他の残基で
あり、R1およびR3はいずれかのアミノ酸残基または修飾アミノ酸残基であり、
mは1〜1000の整数または0であり、nは1〜1000の整数または0であ
り、R2は本発明のアミノ酸配列、特に表1のアミノ酸配列またはそれらの修飾形
態を意味する]で示されるポリペプチドを包含する。上記の式中、R2はアミノ末
端残基がその左側でR1に結合し、そのカルボキシ末端残基がその右側でR3に結合
するように方向づけられる。mおよび/またはnが1より大きい場合、R1また
はR3のいずれかでで表されるアミノ酸残基の鎖は、ヘテロポリマーまたはホモ
ポリマーのいずれであってもよく、ヘテロポリマーが好ましい。本発明の他の好
ましい具体例は、mが1ないし50、100または500の間の整数であり、n
が1ないし50、100または500の間の整数のものである。 本発明ポリペプチドがストレプトコッカス・ニューモニアエ由来のものである
のが最も好ましいが、同じ分類学上の属の他の生物由来のものであっても好まし
い。また本発明ポリペプチドは、例えば、同じ科または目から得られるものであ
ってもよい。
プチドについて説明された他の残基であり、カルボキシル末端のYは水素または
金属、または本明細書において修飾ポリペプチドについて説明された他の残基で
あり、R1およびR3はいずれかのアミノ酸残基または修飾アミノ酸残基であり、
mは1〜1000の整数または0であり、nは1〜1000の整数または0であ
り、R2は本発明のアミノ酸配列、特に表1のアミノ酸配列またはそれらの修飾形
態を意味する]で示されるポリペプチドを包含する。上記の式中、R2はアミノ末
端残基がその左側でR1に結合し、そのカルボキシ末端残基がその右側でR3に結合
するように方向づけられる。mおよび/またはnが1より大きい場合、R1また
はR3のいずれかでで表されるアミノ酸残基の鎖は、ヘテロポリマーまたはホモ
ポリマーのいずれであってもよく、ヘテロポリマーが好ましい。本発明の他の好
ましい具体例は、mが1ないし50、100または500の間の整数であり、n
が1ないし50、100または500の間の整数のものである。 本発明ポリペプチドがストレプトコッカス・ニューモニアエ由来のものである
のが最も好ましいが、同じ分類学上の属の他の生物由来のものであっても好まし
い。また本発明ポリペプチドは、例えば、同じ科または目から得られるものであ
ってもよい。
【0040】
フラグメントは、その全体が上記したポリペプチドのアミノ酸配列の全部では
ないが、一部と同じであるアミノ酸配列を有する変種ポリペプチドである。Mu
rAポリペプチドと同様、フラグメントは「独立している(free-standing)」
であるか、またはそれらが一の部分または領域、最も好ましくは単一の連続した
領域、単一のより大きなポリペプチドを形成するより大きなポリペプチドの中に
含まれていてもよい。
ないが、一部と同じであるアミノ酸配列を有する変種ポリペプチドである。Mu
rAポリペプチドと同様、フラグメントは「独立している(free-standing)」
であるか、またはそれらが一の部分または領域、最も好ましくは単一の連続した
領域、単一のより大きなポリペプチドを形成するより大きなポリペプチドの中に
含まれていてもよい。
【0041】
好ましいフラグメントは、例えば、表1[配列番号2]のアミノ酸配列または
、アミノ末端を含む連続した一連の残基またはカルボキシル末端を含む連続した
一連の残基のような、その変種の一部を有する末端切断ポリペプチドを包含する
。宿主細胞、特に、ストレプトコッカス・ニューモニアエ中の本発明のポリペプ
チドの分解型も好ましい。さらに、アルファヘリックスおよびアルファヘリック
ス形成領域、ベータシートおよびベータシート形成領域、ターンおよびターン形
成領域、コイルおよびコイル形成領域、親水領域、疎水領域、アルファ両親媒性
領域、ベータ両親媒性領域、フレキシブル領域、表面形成領域、基質結合領域、
および高抗原指数領域を含むフラグメントのような、構造的または機能的属性に
よって特徴づけられるフラグメントもまた好ましいフラグメントである。
、アミノ末端を含む連続した一連の残基またはカルボキシル末端を含む連続した
一連の残基のような、その変種の一部を有する末端切断ポリペプチドを包含する
。宿主細胞、特に、ストレプトコッカス・ニューモニアエ中の本発明のポリペプ
チドの分解型も好ましい。さらに、アルファヘリックスおよびアルファヘリック
ス形成領域、ベータシートおよびベータシート形成領域、ターンおよびターン形
成領域、コイルおよびコイル形成領域、親水領域、疎水領域、アルファ両親媒性
領域、ベータ両親媒性領域、フレキシブル領域、表面形成領域、基質結合領域、
および高抗原指数領域を含むフラグメントのような、構造的または機能的属性に
よって特徴づけられるフラグメントもまた好ましいフラグメントである。
【0042】
さらなる好ましいフラグメントは、配列番号:2のアミノ酸配列由来の少なく
とも15、20、30、40、50または100個の連続したアミノ酸を有する
アミノ酸配列を含む単離ポリペプチド、あるいは配列番号:2のアミノ酸配列の
末端切断または欠失体であり、配列番号:2のアミノ酸配列由来の少なくとも1
5、20、30、40、50または100個の連続したアミノ酸を有するアミノ
酸配列を含む単離ポリペプチドを包含する。 本発明のポリペプチドのフラグメントを用いて、ペプチド合成により対応全長
ポリペプチドを製造してもよく、それゆえ、これらの変種を本発明の全長ポリペ
プチド製造のための中間体として使用してもよい。
とも15、20、30、40、50または100個の連続したアミノ酸を有する
アミノ酸配列を含む単離ポリペプチド、あるいは配列番号:2のアミノ酸配列の
末端切断または欠失体であり、配列番号:2のアミノ酸配列由来の少なくとも1
5、20、30、40、50または100個の連続したアミノ酸を有するアミノ
酸配列を含む単離ポリペプチドを包含する。 本発明のポリペプチドのフラグメントを用いて、ペプチド合成により対応全長
ポリペプチドを製造してもよく、それゆえ、これらの変種を本発明の全長ポリペ
プチド製造のための中間体として使用してもよい。
【0043】
ポリヌクレオチド
MurAポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド、詳細には、本明細
書でMurAと命名されるポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを提
供することが本発明の1の目的である。 本発明の特に好ましい具体例において、ポリヌクレオチドは、全長の遺伝子を
含む、表3(配列番号:1)に示す配列を含むMurAポリペプチド、またはそ
の変種をコードしている領域を含む。出願人らは、この全長の遺伝子は当該ポリ
ペプチドを有する生物(例えば、ストレプトコッカス・ニューモニアエ)の増殖
および/または生存に必須であると考える。 本発明のさらなる態様として、MurAポリペプチドおよびポリヌクレオチド
、詳細には、ストレプトコッカス・ニューモニアエのMurAポリペプチドおよ
びポリヌクレオチドをコードおよび/または発現する単離核酸分子が提供され、
核酸分子としては、例えば、未プロセッシングRNA、リボザイムRNA、mR
NA、cDNA、ゲノムDNA、B−およびZ−DNAが挙げられる。本発明の
さらなる具体例は、生物学的、診断上、予防上、臨床的または治療上有用なポリ
ヌクレオチドおよびポリペプチド、ならびにその変種、ならびにそれらを含む組
成物を包含する。
書でMurAと命名されるポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを提
供することが本発明の1の目的である。 本発明の特に好ましい具体例において、ポリヌクレオチドは、全長の遺伝子を
含む、表3(配列番号:1)に示す配列を含むMurAポリペプチド、またはそ
の変種をコードしている領域を含む。出願人らは、この全長の遺伝子は当該ポリ
ペプチドを有する生物(例えば、ストレプトコッカス・ニューモニアエ)の増殖
および/または生存に必須であると考える。 本発明のさらなる態様として、MurAポリペプチドおよびポリヌクレオチド
、詳細には、ストレプトコッカス・ニューモニアエのMurAポリペプチドおよ
びポリヌクレオチドをコードおよび/または発現する単離核酸分子が提供され、
核酸分子としては、例えば、未プロセッシングRNA、リボザイムRNA、mR
NA、cDNA、ゲノムDNA、B−およびZ−DNAが挙げられる。本発明の
さらなる具体例は、生物学的、診断上、予防上、臨床的または治療上有用なポリ
ヌクレオチドおよびポリペプチド、ならびにその変種、ならびにそれらを含む組
成物を包含する。
【0044】
本発明のもう一つの態様は、表3[配列番号2]の推定アミノ酸配列を有する
MurAポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド、それに密接に関連す
るポリヌクレオチドおよびそれらの変種に関する。
MurAポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド、それに密接に関連す
るポリヌクレオチドおよびそれらの変種に関する。
【0045】
もう1つの特に好ましい本発明具体例において、表3(配列番号:2)のアミ
ノ酸配列を含むかまたはそれよりなる、ストレプトコッカス・ニューモニアエ由
来のMurAポリペプチドが提供される。 表3[配列番号1]に示すポリヌクレオチド配列のような本明細書の情報を使
用し、出発材料としてストレプトコッカス・ニューモニアエ0100993を使
用し、細菌からの染色体DNAフラグメントをクローニングし、配列決定し、つ
づいて全長クローンを得る標準的クローニングおよびスクリーニング法を使用し
て、MurAポリペプチドをコードする本発明のポリヌクレオチドを得ることが
できる。例えば、表3[配列番号1]に示す配列のような本発明のポリヌクレオ
チド配列を得るには、典型的には、エシェリシア・コリまたは他の適当な宿主中
のストレプトコッカス・ニューモニアエ0100993の染色体DNAのクロー
ンのライブラリーを、部分配列から由来する放射標識したオリゴヌクレオチド、
好ましくは17量体またはそれより長いオリゴヌクレオチドでプローブする。つ
いで、該プローブと同じDNAを有するクローンを厳密な条件を使用して区別で
きる。該オリジナル配列から設計された配列決定プライマーで同定された個々の
クローンを配列決定することにより、該配列を両方の方向に伸長し、全長を決定
することが可能である。都合よくは、プラスミド・クローンから調製された変性
二本鎖DNAを用いてかかる配列決定を行う。適当な技法は、Maniatis,T.,Fri
tsch,E.F.およびSambrookら、MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,2nd E
d.;Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York(1
989)(特に、ハイブリダイゼーションによるスクリーニング1.90および変性
二本鎖DNA鋳型の配列決定13.70を参照のこと)により記載されている。
直接ゲノムDNA配列決定を行って全長の遺伝子配列を得てもよい。例えば、表
3[配列番号1]に示すポリヌクレオチドは、ストレプトコッカス・ニューモニ
アエ0100993から由来するDNAライブラリー中に見いだされたものであ
る。
ノ酸配列を含むかまたはそれよりなる、ストレプトコッカス・ニューモニアエ由
来のMurAポリペプチドが提供される。 表3[配列番号1]に示すポリヌクレオチド配列のような本明細書の情報を使
用し、出発材料としてストレプトコッカス・ニューモニアエ0100993を使
用し、細菌からの染色体DNAフラグメントをクローニングし、配列決定し、つ
づいて全長クローンを得る標準的クローニングおよびスクリーニング法を使用し
て、MurAポリペプチドをコードする本発明のポリヌクレオチドを得ることが
できる。例えば、表3[配列番号1]に示す配列のような本発明のポリヌクレオ
チド配列を得るには、典型的には、エシェリシア・コリまたは他の適当な宿主中
のストレプトコッカス・ニューモニアエ0100993の染色体DNAのクロー
ンのライブラリーを、部分配列から由来する放射標識したオリゴヌクレオチド、
好ましくは17量体またはそれより長いオリゴヌクレオチドでプローブする。つ
いで、該プローブと同じDNAを有するクローンを厳密な条件を使用して区別で
きる。該オリジナル配列から設計された配列決定プライマーで同定された個々の
クローンを配列決定することにより、該配列を両方の方向に伸長し、全長を決定
することが可能である。都合よくは、プラスミド・クローンから調製された変性
二本鎖DNAを用いてかかる配列決定を行う。適当な技法は、Maniatis,T.,Fri
tsch,E.F.およびSambrookら、MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,2nd E
d.;Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York(1
989)(特に、ハイブリダイゼーションによるスクリーニング1.90および変性
二本鎖DNA鋳型の配列決定13.70を参照のこと)により記載されている。
直接ゲノムDNA配列決定を行って全長の遺伝子配列を得てもよい。例えば、表
3[配列番号1]に示すポリヌクレオチドは、ストレプトコッカス・ニューモニ
アエ0100993から由来するDNAライブラリー中に見いだされたものであ
る。
【0046】
そのうえ、表3[配列番号1]のDNA配列は、表3[配列番号2]に示すの
とほぼ同数のアミノ酸残基を有し、公知のアミノ酸残基の分子量から計算できる
推定分子量を有する蛋白をコードするオープンリーディングフレームを有する。
配列番号1のヌクレオチド番号1と、ヌクレオチド番号1258で始まる停止コ
ドンとの間の配列番号1のポリヌクレオチドが、配列番号2のポリペプチドをコ
ードする。
とほぼ同数のアミノ酸残基を有し、公知のアミノ酸残基の分子量から計算できる
推定分子量を有する蛋白をコードするオープンリーディングフレームを有する。
配列番号1のヌクレオチド番号1と、ヌクレオチド番号1258で始まる停止コ
ドンとの間の配列番号1のポリヌクレオチドが、配列番号2のポリペプチドをコ
ードする。
【0047】
さらなる態様において、本発明は、下記のポリヌクレオチドを含むかまたはそ
れらよりなる単離ポリヌクレオチドを提供する:(a)配列番号:1の全長にわ
たって、あるいは配列番号:2をコードする配列番号:1の部分の全長にわたっ
て、配列番号:1に対して少なくとも95%の同一性、さらにより好ましくは少
なくとも97〜99%の同一性を有するかまたは完全に100%同一であるポリ
ヌクレオチド配列;(b)配列番号:2の全長にわたって配列番号:2のアミノ
酸配列に対して少なくとも95%の同一性、さらにより好ましくは少なくとも9
7〜99%またはちょうど100%の同一性を有するポリペプチドをコードして
いるポリヌクレオチド配列。 本発明ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド(ストレプトコッカス
・ニューモニアエ以外の種由来のホモログおよびオーソログを包含)を、厳密な
ハイブリダイゼーション条件において、配列番号:1の配列またはそれらのフラ
グメントを含むかまたはそれらよりなる標識または検出可能プローブを用いて適
当なライブラリーをスクリーニングし、次いで、該ポリヌクレオチド配列を含む
全長遺伝子および/またはゲノムクローンを単離する工程を含む方法により得て
もよい。。
れらよりなる単離ポリヌクレオチドを提供する:(a)配列番号:1の全長にわ
たって、あるいは配列番号:2をコードする配列番号:1の部分の全長にわたっ
て、配列番号:1に対して少なくとも95%の同一性、さらにより好ましくは少
なくとも97〜99%の同一性を有するかまたは完全に100%同一であるポリ
ヌクレオチド配列;(b)配列番号:2の全長にわたって配列番号:2のアミノ
酸配列に対して少なくとも95%の同一性、さらにより好ましくは少なくとも9
7〜99%またはちょうど100%の同一性を有するポリペプチドをコードして
いるポリヌクレオチド配列。 本発明ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド(ストレプトコッカス
・ニューモニアエ以外の種由来のホモログおよびオーソログを包含)を、厳密な
ハイブリダイゼーション条件において、配列番号:1の配列またはそれらのフラ
グメントを含むかまたはそれらよりなる標識または検出可能プローブを用いて適
当なライブラリーをスクリーニングし、次いで、該ポリヌクレオチド配列を含む
全長遺伝子および/またはゲノムクローンを単離する工程を含む方法により得て
もよい。。
【0048】
本発明は、表3[配列番号1]のコーディング配列と、その全長にわたって同
一であるポリヌクレオチド配列を提供する。また、本発明は、成熟ポリペプチド
またはそのフラグメント用のコーディング配列自体ならびにリーダーまたは分泌
配列、プレ、プロまたはプレプロ蛋白配列をコードするコーディング配列のよう
な他のコーディング配列を有するリーディング・フレーム中の成熟ポリペプチド
またはフラグメントのコーディング配列を提供する。ポリヌクレオチドはまた、
例えば、転写されるが翻訳されない配列、終止シグナル(例えば、rho−依存
的およびrho−非依存的終止シグナル)、リボソーム結合部位、Kozak配列、
mRNAを安定化する配列、イントロン、ポリアデニル化シグナルのごとき少な
くとも1つの非コーディング5’および3’配列を包含する非コーディング配列
を含むが、これらに限定するものではない。また、ポリヌクレオチド配列はさら
なるアミノ酸をコードしているさらなるコーディング配列を含んでいてもよい。
例えば、融合ポリペプチドの精製を促進するマーカー配列をコードすることがで
きる。本発明のある種の具体例において、マーカー配列は、pQEベクター(Qi
agen,Inc.)において提供され、Gentzら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1989)86:
821-824に記載されるような、ヘキサ−ヒスチジンペプチドであるか、またはH
Aタグ(Wilsonら、Cell,37:767(1984))であり、ともにそれらに融合したポリ
ペプチド配列の精製において有用である。本発明ポリヌクレオチドは、限定する
ものではないが、構造遺伝子および遺伝子の発現を調節する、本来的に結合して
いる配列からなるポリヌクレオチドを包含する。
一であるポリヌクレオチド配列を提供する。また、本発明は、成熟ポリペプチド
またはそのフラグメント用のコーディング配列自体ならびにリーダーまたは分泌
配列、プレ、プロまたはプレプロ蛋白配列をコードするコーディング配列のよう
な他のコーディング配列を有するリーディング・フレーム中の成熟ポリペプチド
またはフラグメントのコーディング配列を提供する。ポリヌクレオチドはまた、
例えば、転写されるが翻訳されない配列、終止シグナル(例えば、rho−依存
的およびrho−非依存的終止シグナル)、リボソーム結合部位、Kozak配列、
mRNAを安定化する配列、イントロン、ポリアデニル化シグナルのごとき少な
くとも1つの非コーディング5’および3’配列を包含する非コーディング配列
を含むが、これらに限定するものではない。また、ポリヌクレオチド配列はさら
なるアミノ酸をコードしているさらなるコーディング配列を含んでいてもよい。
例えば、融合ポリペプチドの精製を促進するマーカー配列をコードすることがで
きる。本発明のある種の具体例において、マーカー配列は、pQEベクター(Qi
agen,Inc.)において提供され、Gentzら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1989)86:
821-824に記載されるような、ヘキサ−ヒスチジンペプチドであるか、またはH
Aタグ(Wilsonら、Cell,37:767(1984))であり、ともにそれらに融合したポリ
ペプチド配列の精製において有用である。本発明ポリヌクレオチドは、限定する
ものではないが、構造遺伝子および遺伝子の発現を調節する、本来的に結合して
いる配列からなるポリヌクレオチドを包含する。
【0049】
本発明の好ましい具体例は、表1の配列番号1に示されるヌクレオチド1から
ヌクレオチド1258のすぐ上流にあるヌクレオチドまたはそのヌクレオチドを
含むヌクレオチドまでを有するポリヌクレオチドであり、それは共にMurAポ
リペプチドをコードする。
ヌクレオチド1258のすぐ上流にあるヌクレオチドまたはそのヌクレオチドを
含むヌクレオチドまでを有するポリヌクレオチドであり、それは共にMurAポ
リペプチドをコードする。
【0050】
本発明はまた、式:
X−(R1)m−(R2)−(R3)n−Y
[式中、分子の5’末端のXは水素または金属、または修飾ヌクレオチド残基で
あるか、あるいはYと一緒になって共有結合を形成し、分子の3’末端のYは水
素または金属、または修飾ヌクレオチド残基であるか、あるいはXと一緒になっ
て共有結合を形成し、R1およびR3は、各々、独立していずれかの核酸残基また
は修飾核酸残基であり、mは1〜3000の整数または0であり、nは1〜30
00の整数または0であり、R2は本発明の核酸配列または修飾核酸配列、特に表
1より選択される核酸配列またはその修飾核酸配列を意味する]で示されるポリ
ヌクレオチドを包含する。上記した式のポリヌクレオチド中、R2は5’末端残基
がその左側でR1に結合し、その3’末端残基がその右側でR3に結合するように方
向付けられる。mおよび/またはnが1より大きい場合、R1および/またはR2 のいずれかで表される核酸残基の鎖は、ヘテロポリマーまたはホモポリマーの
いずれであってもよく、ヘテロポリマーが好ましい。好ましい具体例において、
XおよびYが一緒になって共有結合を形成する場合、前記した式のポリヌクレオ
チドは閉じた環状ポリヌクレオチドであり、それはその式が第2の鎖が相補性を
有する第1の鎖を示す二本鎖ポリヌクレオチドであり得る。もう一つ別の具体例
において、mおよび/またはnは1と1000の間の整数である。他の好ましい
本発明の具体例は、mが1ないし50、100または500の間の整数であり、
nが1ないし50、100または500の間の整数である。
あるか、あるいはYと一緒になって共有結合を形成し、分子の3’末端のYは水
素または金属、または修飾ヌクレオチド残基であるか、あるいはXと一緒になっ
て共有結合を形成し、R1およびR3は、各々、独立していずれかの核酸残基また
は修飾核酸残基であり、mは1〜3000の整数または0であり、nは1〜30
00の整数または0であり、R2は本発明の核酸配列または修飾核酸配列、特に表
1より選択される核酸配列またはその修飾核酸配列を意味する]で示されるポリ
ヌクレオチドを包含する。上記した式のポリヌクレオチド中、R2は5’末端残基
がその左側でR1に結合し、その3’末端残基がその右側でR3に結合するように方
向付けられる。mおよび/またはnが1より大きい場合、R1および/またはR2 のいずれかで表される核酸残基の鎖は、ヘテロポリマーまたはホモポリマーの
いずれであってもよく、ヘテロポリマーが好ましい。好ましい具体例において、
XおよびYが一緒になって共有結合を形成する場合、前記した式のポリヌクレオ
チドは閉じた環状ポリヌクレオチドであり、それはその式が第2の鎖が相補性を
有する第1の鎖を示す二本鎖ポリヌクレオチドであり得る。もう一つ別の具体例
において、mおよび/またはnは1と1000の間の整数である。他の好ましい
本発明の具体例は、mが1ないし50、100または500の間の整数であり、
nが1ないし50、100または500の間の整数である。
【0051】
本発明のポリヌクレオチドはストレプトコッカス・ニューモニアエ由来である
のが最も好ましいが、分類学上同じ属の生物より得ることも好ましい。また、例
えば、分類学上同じ科または目から得てもよい。 本明細書で使用する「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」なる用語
は、本発明のポリペプチド、特に、細菌性ポリペプチド、より詳細には、表3[
配列番号2]に示すアミノ酸配列を有するストレプトコッカス・ニューモニアエ
・MurAのポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチドを包含する
。この用語はコードおよび/非コーディング配列を含んでもよいさらなる領域と
共に、該ポリペプチドをコードする単一の連続または非連続領域(例えば、組み
込まれたファージ、挿入された配列、組み込まれたベクター配列、組み込まれた
トランスポゾン配列、またはRNAエデティング(editing)もしくはゲノムD
NA再組織化により中断されている)を含むポリヌクレオチドを包含する。 本発明はさらに、表3[配列番号2]の推定アミノ酸配列を有するポリペプチ
ドの変種をコードする、本明細書に記載したポリヌクレオチドの変種に関する。
本発明のポリヌクレオチドのフラグメントである変種は本発明の全長ポリヌクレ
オチドの合成に使用できる。
のが最も好ましいが、分類学上同じ属の生物より得ることも好ましい。また、例
えば、分類学上同じ科または目から得てもよい。 本明細書で使用する「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」なる用語
は、本発明のポリペプチド、特に、細菌性ポリペプチド、より詳細には、表3[
配列番号2]に示すアミノ酸配列を有するストレプトコッカス・ニューモニアエ
・MurAのポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチドを包含する
。この用語はコードおよび/非コーディング配列を含んでもよいさらなる領域と
共に、該ポリペプチドをコードする単一の連続または非連続領域(例えば、組み
込まれたファージ、挿入された配列、組み込まれたベクター配列、組み込まれた
トランスポゾン配列、またはRNAエデティング(editing)もしくはゲノムD
NA再組織化により中断されている)を含むポリヌクレオチドを包含する。 本発明はさらに、表3[配列番号2]の推定アミノ酸配列を有するポリペプチ
ドの変種をコードする、本明細書に記載したポリヌクレオチドの変種に関する。
本発明のポリヌクレオチドのフラグメントである変種は本発明の全長ポリヌクレ
オチドの合成に使用できる。
【0052】
さらに好ましい具体例は、数個、わずかな、5〜10、1〜5、1〜3、2ま
たは1個あるいは0個のアミノ酸残基が、いずれかの組み合わせで置換、欠失ま
たは付加された表3[配列番号2]のMurAポリペプチドのアミノ酸配列を有
する、MurA変種をコードするポリヌクレオチドである。特に好ましくは、M
urAポリペプチドの特性、活性を変化させないサイレント置換、付加および欠
失である。
たは1個あるいは0個のアミノ酸残基が、いずれかの組み合わせで置換、欠失ま
たは付加された表3[配列番号2]のMurAポリペプチドのアミノ酸配列を有
する、MurA変種をコードするポリヌクレオチドである。特に好ましくは、M
urAポリペプチドの特性、活性を変化させないサイレント置換、付加および欠
失である。
【0053】
好ましい単離ポリヌクレオチドの具体例は、配列番号:1の核酸配列由来の少
なくとも15、20、30、40、50または100個の連続した核酸を有する
核酸配列を含む単離ポリヌクレオチド、あるいは配列番号:1の核酸配列の末端
切断または欠失体であり、配列番号:1の核酸配列由来の少なくとも15、20
、30、40、50または100個の連続した核酸を有する核酸配列を含む単離
ポリヌクレオチドを包含する。
なくとも15、20、30、40、50または100個の連続した核酸を有する
核酸配列を含む単離ポリヌクレオチド、あるいは配列番号:1の核酸配列の末端
切断または欠失体であり、配列番号:1の核酸配列由来の少なくとも15、20
、30、40、50または100個の連続した核酸を有する核酸配列を含む単離
ポリヌクレオチドを包含する。
【0054】
本発明のさらに好ましい具体例は、表3[配列番号2]に示すアミノ酸配列を
を有するMurAポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの全長にわたって
少なくとも95%の同一性を有するポリヌクレオチドおよびそのようなポリヌク
レオチドに相補的なポリヌクレオチドである。さらには、少なくとも95%の同
一性を有するものの中で少なくとも97%の同一性を有するものがより好ましく
、中でも少なくとも98%および少なくとも99%の同一性を有するものが特に
好ましい。少なくとも99%の同一性を有するものがより好ましい。 好ましい具体例は、表3[配列番号1]のDNAによってコードされている成
熟ポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能または活性を保持するポリペプチド
をコードするポリヌクレオチドである。 本発明のある好ましい具体例によれば、特に厳密な条件下で、例えば表3のポ
リヌクレオチドのごときMurAポリヌクレオチド配列にハイブリダイゼーショ
ンするポリヌクレオチドが提供される。
を有するMurAポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの全長にわたって
少なくとも95%の同一性を有するポリヌクレオチドおよびそのようなポリヌク
レオチドに相補的なポリヌクレオチドである。さらには、少なくとも95%の同
一性を有するものの中で少なくとも97%の同一性を有するものがより好ましく
、中でも少なくとも98%および少なくとも99%の同一性を有するものが特に
好ましい。少なくとも99%の同一性を有するものがより好ましい。 好ましい具体例は、表3[配列番号1]のDNAによってコードされている成
熟ポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能または活性を保持するポリペプチド
をコードするポリヌクレオチドである。 本発明のある好ましい具体例によれば、特に厳密な条件下で、例えば表3のポ
リヌクレオチドのごときMurAポリヌクレオチド配列にハイブリダイゼーショ
ンするポリヌクレオチドが提供される。
【0055】
さらに本発明は、本明細書にて上記した配列にハイブリダイゼーションするポ
リヌクレオチドに関する。この点において、本発明は特に、本明細書にて上記し
たポリヌクレオチドに厳密な条件下でハイブリダイゼーションするポリヌクレオ
チドに関する。本明細書で用いる場合、「厳密な条件」および「厳密なハイブリ
ダイゼーション条件」という語は、ハイブリダイゼーションが、配列間に少なく
とも95%、好ましくは少なくとも97%の同一性がある場合にのみ起こること
を意味する。厳密なハイブリダイゼーション条件の一例として、50%ホルムア
ルデヒド、5xSSC(150mM NaCl、15mM クエン酸三ナトリウム)
、50mMリン酸ナトリウム(pH7.6)、5xデンハート(Denhardt’s)溶
液、10%硫酸デキストランおよび20μg/ml変性切断サケ精子DNAを含
む溶液中、42℃で一夜インキュベーションし、ついでハイブリダイゼーション
支持体を0.1xSSC(約65℃)で洗浄することが挙げられる。ハイブリダ
イゼーションおよび洗浄条件は公知であり、Sambrookら、MOLECULAR CLONING:A
LABORATORY MANUAL,Second Edition,Cold Spring Harbor, N.Y.(1989)、特
に、第11章に例示されている。本発明により提供されるポリヌクレオチド配列に
関して溶液ハイブリダイゼーションを用いてもよい。
リヌクレオチドに関する。この点において、本発明は特に、本明細書にて上記し
たポリヌクレオチドに厳密な条件下でハイブリダイゼーションするポリヌクレオ
チドに関する。本明細書で用いる場合、「厳密な条件」および「厳密なハイブリ
ダイゼーション条件」という語は、ハイブリダイゼーションが、配列間に少なく
とも95%、好ましくは少なくとも97%の同一性がある場合にのみ起こること
を意味する。厳密なハイブリダイゼーション条件の一例として、50%ホルムア
ルデヒド、5xSSC(150mM NaCl、15mM クエン酸三ナトリウム)
、50mMリン酸ナトリウム(pH7.6)、5xデンハート(Denhardt’s)溶
液、10%硫酸デキストランおよび20μg/ml変性切断サケ精子DNAを含
む溶液中、42℃で一夜インキュベーションし、ついでハイブリダイゼーション
支持体を0.1xSSC(約65℃)で洗浄することが挙げられる。ハイブリダ
イゼーションおよび洗浄条件は公知であり、Sambrookら、MOLECULAR CLONING:A
LABORATORY MANUAL,Second Edition,Cold Spring Harbor, N.Y.(1989)、特
に、第11章に例示されている。本発明により提供されるポリヌクレオチド配列に
関して溶液ハイブリダイゼーションを用いてもよい。
【0056】
本発明は、配列番号1に示したポリヌクレオチド配列の完全遺伝子を含む適当
なライブラリーを、厳密なハイブリダイゼーション条件下、配列番号1に示す該
ポリヌクレオチド配列の配列を有するプローブまたはそのフラグメントでスクリ
ーニングし、該DNA配列を単離することにより得ることができるポリヌクレオ
チド配列を含むかまたはそれよりなるポリヌクレオチドを提供する。そのような
ポリヌクレオチドを得るのに有用なフラグメントには、例えば、本明細書のいず
れかの場所で十分に説明するプローブおよびプライマーが包含される。
なライブラリーを、厳密なハイブリダイゼーション条件下、配列番号1に示す該
ポリヌクレオチド配列の配列を有するプローブまたはそのフラグメントでスクリ
ーニングし、該DNA配列を単離することにより得ることができるポリヌクレオ
チド配列を含むかまたはそれよりなるポリヌクレオチドを提供する。そのような
ポリヌクレオチドを得るのに有用なフラグメントには、例えば、本明細書のいず
れかの場所で十分に説明するプローブおよびプライマーが包含される。
【0057】
本明細書において本発明のポリヌクレオチドの分析についてさらに説明するよ
うに、例えば、上記したような本発明のポリヌクレオチドを、RNA、cDNA
およびゲノムDNAに対するハイブリダイゼーションプローブとして使用し、M
urAをコードする全長cDNAおよびゲノムクローンを単離し、MurA遺伝
子に対して高い配列類似性を有する他の遺伝子のcDNAおよびゲノムクローン
を単離することができる。そのようなプローブは、一般に、少なくとも15塩基
を含むであろう。好ましくは、そのようなプローブは少なくとも30塩基からな
り、少なくとも50塩基を有してもよい。特に好ましいプローブは、少なくとも
20塩基を有し、30以下の塩基を有する。 例えば、MurA遺伝子のコード領域は、表3(配列番号1)のDNA配列を
使用してスクリーニングしてオリゴヌクレオチド・プローブを合成することによ
り単離できる。ついで、本発明の遺伝子の配列と相補性の配列を有する標識した
オリゴヌクレオチドを用いてcDNA、ゲノムDNAまたはmRNAのライブラ
リーをスクリーニングし、ライブラリーのどのメンバーがプローブとハイブリダ
イゼーションするか決定する。
うに、例えば、上記したような本発明のポリヌクレオチドを、RNA、cDNA
およびゲノムDNAに対するハイブリダイゼーションプローブとして使用し、M
urAをコードする全長cDNAおよびゲノムクローンを単離し、MurA遺伝
子に対して高い配列類似性を有する他の遺伝子のcDNAおよびゲノムクローン
を単離することができる。そのようなプローブは、一般に、少なくとも15塩基
を含むであろう。好ましくは、そのようなプローブは少なくとも30塩基からな
り、少なくとも50塩基を有してもよい。特に好ましいプローブは、少なくとも
20塩基を有し、30以下の塩基を有する。 例えば、MurA遺伝子のコード領域は、表3(配列番号1)のDNA配列を
使用してスクリーニングしてオリゴヌクレオチド・プローブを合成することによ
り単離できる。ついで、本発明の遺伝子の配列と相補性の配列を有する標識した
オリゴヌクレオチドを用いてcDNA、ゲノムDNAまたはmRNAのライブラ
リーをスクリーニングし、ライブラリーのどのメンバーがプローブとハイブリダ
イゼーションするか決定する。
【0058】
全長のDNAを得るための、あるいは短いDNAを伸長させるための利用可能
で当業者によく知られたいくつかの方法があり、例えば、cDNA末端の迅速増
幅(RACE)(例えば、Frohman, et al., PNAS USA 85,8998-9002, 1988参照
)に基づく方法がある。marathonTM法(Clontech Laboratories Inc.)に例示さ
れる当該方法の最近の変法は、例えば、より長いcDNAの検索を有意に簡単に
している。MarathonTM法において、cDNAは選択組織から抽出されたmRNA
から調製され、各末端に「アダプター」配列が連結される。次いで、遺伝子特異
的かつアダプター特異的オリゴヌクレオチドプライマーを用いて核酸増幅(PC
R)を行ってDNAの「失われた」5’末端を増幅する。次いで、「ネステッド
」プライマー、すなわち、増幅生成物の範囲ににアニールするように設計された
プライマー(典型的には、アダプター配列中のさらなる3’にアニールするアダ
プター特異的プライマーならびに選択遺伝子配列中のさらなる5’にアニールす
る遺伝子特異的プライマー)を用いてPCR反応を繰り返す。次いで、この反応
の生成物をDNA配列決定により分析し、次いで、存在しているDNAに生成物
を直接結合して完全配列を得ること、あるいは5’プライマーの設計に関する新
たな配列の情報を用いて別個の全長PCRを行うことにより、全長のDNAを構
築する。
で当業者によく知られたいくつかの方法があり、例えば、cDNA末端の迅速増
幅(RACE)(例えば、Frohman, et al., PNAS USA 85,8998-9002, 1988参照
)に基づく方法がある。marathonTM法(Clontech Laboratories Inc.)に例示さ
れる当該方法の最近の変法は、例えば、より長いcDNAの検索を有意に簡単に
している。MarathonTM法において、cDNAは選択組織から抽出されたmRNA
から調製され、各末端に「アダプター」配列が連結される。次いで、遺伝子特異
的かつアダプター特異的オリゴヌクレオチドプライマーを用いて核酸増幅(PC
R)を行ってDNAの「失われた」5’末端を増幅する。次いで、「ネステッド
」プライマー、すなわち、増幅生成物の範囲ににアニールするように設計された
プライマー(典型的には、アダプター配列中のさらなる3’にアニールするアダ
プター特異的プライマーならびに選択遺伝子配列中のさらなる5’にアニールす
る遺伝子特異的プライマー)を用いてPCR反応を繰り返す。次いで、この反応
の生成物をDNA配列決定により分析し、次いで、存在しているDNAに生成物
を直接結合して完全配列を得ること、あるいは5’プライマーの設計に関する新
たな配列の情報を用いて別個の全長PCRを行うことにより、全長のDNAを構
築する。
【0059】
本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、本明細書においてポリヌク
レオチド分析に関してさらに説明するように、例えば、疾患、特にヒトの疾患に
対する治療および診断の発見のための研究試薬および研究材料として用いること
ができる。 表3(配列番号1または2)の配列に由来するオリゴヌクレオチドである本発
明のポリヌクレオチドは、本明細書に記載の方法に使用できるが、好ましくはP
CRに使用し、本明細書で同定したポリヌクレオチドが全体として、または部分
的に感染組織において細菌中で転写されるか否か測定する。そのような配列はま
た、病原体が達した感染の段階およびタイプの診断においても有用性がある。
レオチド分析に関してさらに説明するように、例えば、疾患、特にヒトの疾患に
対する治療および診断の発見のための研究試薬および研究材料として用いること
ができる。 表3(配列番号1または2)の配列に由来するオリゴヌクレオチドである本発
明のポリヌクレオチドは、本明細書に記載の方法に使用できるが、好ましくはP
CRに使用し、本明細書で同定したポリヌクレオチドが全体として、または部分
的に感染組織において細菌中で転写されるか否か測定する。そのような配列はま
た、病原体が達した感染の段階およびタイプの診断においても有用性がある。
【0060】
また、本発明は、成熟蛋白に、さらなるアミノまたはカルボキシ末端アミノ酸
が加わるか、成熟ポリペプチドの内部にアミノ酸が加わった(例えば、成熟形態
が一つ以上のポリペプチド鎖を有する場合)ポリペプチドをコードするポリヌク
レオチドを提供する。このような配列は、とりわけ、前駆体から成熟形態への蛋
白のプロセッシングにおいて役割を果たし、蛋白を運び、蛋白の半減期を長くし
たり、短くしたり、あるいは分析または生産のための蛋白の取り扱いを容易にす
ることができる。インビボで一般的なように、該付加アミノ酸は細胞酵素により
成熟蛋白からプロセッシングにより除かれる。 本発明の各ポリヌクレオチドおよび全ポリヌクレオチドについて、それに相捕
的なポリヌクレオチドが提供される。これらの相捕的ポリヌクレオチドが、相捕
的である各ポリヌクレオチドに対して十分に相捕的であることが好ましい。 一またはそれ以上のプロ配列に融合したポリペプチドの成熟形態を有する前駆
体蛋白は該ポリペプチドの不活性形でもよい。プロ配列がそのような不活性前駆
体から除かれると、一般に活性化される。プロ配列のいくらかまたは全体を、活
性化の前に除去できる。一般に、そのような前駆体はプロ蛋白と称される。
が加わるか、成熟ポリペプチドの内部にアミノ酸が加わった(例えば、成熟形態
が一つ以上のポリペプチド鎖を有する場合)ポリペプチドをコードするポリヌク
レオチドを提供する。このような配列は、とりわけ、前駆体から成熟形態への蛋
白のプロセッシングにおいて役割を果たし、蛋白を運び、蛋白の半減期を長くし
たり、短くしたり、あるいは分析または生産のための蛋白の取り扱いを容易にす
ることができる。インビボで一般的なように、該付加アミノ酸は細胞酵素により
成熟蛋白からプロセッシングにより除かれる。 本発明の各ポリヌクレオチドおよび全ポリヌクレオチドについて、それに相捕
的なポリヌクレオチドが提供される。これらの相捕的ポリヌクレオチドが、相捕
的である各ポリヌクレオチドに対して十分に相捕的であることが好ましい。 一またはそれ以上のプロ配列に融合したポリペプチドの成熟形態を有する前駆
体蛋白は該ポリペプチドの不活性形でもよい。プロ配列がそのような不活性前駆
体から除かれると、一般に活性化される。プロ配列のいくらかまたは全体を、活
性化の前に除去できる。一般に、そのような前駆体はプロ蛋白と称される。
【0061】
認識されるであろうが、読み取り枠によりコードされるポリペプチド全体はし
ばしば活性に必要ではない。したがって、N末端およびC末端欠失実験を用いて
活性に必要な一次構造の境界をマッピングすることが分子生物学における常識と
なっている。これらの実験にはエキソヌクレアーゼ消化またはコーディング核酸
配列を開裂させるに都合の良い制限部位を用いる。例えば、欠失プロトコルの分
析を容易にするように設計されたエキソヌクレアーゼIIIを用いるErase-a-ba
seTMシステムがPromega(Madison, WI)から市販されている(www.promega.comに
おいてプロトコル利用可能)。読み取り枠を保存するのに必要な程度まで、消化
された末端を修復することができる(例えば、合成リンカーとの連結により)。
このようにして、配列番号:1の核酸により配列番号:2の連続したフラグメン
トが提供され、酵素活性、結合または抗体誘導活性のごとき活性が生じる。本明
細書記載の配列番号:2のかかるフラグメントおよびその変種をコードする核酸
配列は本発明の範囲内であり、そのようにコードされたポリペプチドも同様であ
る。
ばしば活性に必要ではない。したがって、N末端およびC末端欠失実験を用いて
活性に必要な一次構造の境界をマッピングすることが分子生物学における常識と
なっている。これらの実験にはエキソヌクレアーゼ消化またはコーディング核酸
配列を開裂させるに都合の良い制限部位を用いる。例えば、欠失プロトコルの分
析を容易にするように設計されたエキソヌクレアーゼIIIを用いるErase-a-ba
seTMシステムがPromega(Madison, WI)から市販されている(www.promega.comに
おいてプロトコル利用可能)。読み取り枠を保存するのに必要な程度まで、消化
された末端を修復することができる(例えば、合成リンカーとの連結により)。
このようにして、配列番号:1の核酸により配列番号:2の連続したフラグメン
トが提供され、酵素活性、結合または抗体誘導活性のごとき活性が生じる。本明
細書記載の配列番号:2のかかるフラグメントおよびその変種をコードする核酸
配列は本発明の範囲内であり、そのようにコードされたポリペプチドも同様であ
る。
【0062】
要するに、本発明のポリヌクレオチドは成熟蛋白、リーダー配列の加わった成
熟蛋白(プレ蛋白とも称される)、プレ蛋白のリーダー配列ではない1またはそ
れ以上のプロ配列を有する成熟蛋白の前駆体、またはリーダー配列と、一般に、
ポリペプチドの活性な成熟形態を生成するプロセッシング工程の間に除去される
1またはそれ以上のプロ配列を有するプロ蛋白の前駆体であるプレプロ蛋白をコ
ードする。
熟蛋白(プレ蛋白とも称される)、プレ蛋白のリーダー配列ではない1またはそ
れ以上のプロ配列を有する成熟蛋白の前駆体、またはリーダー配列と、一般に、
ポリペプチドの活性な成熟形態を生成するプロセッシング工程の間に除去される
1またはそれ以上のプロ配列を有するプロ蛋白の前駆体であるプレプロ蛋白をコ
ードする。
【0063】
ベクター、宿主細胞、発現系
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを含むベク
ター、本発明のベクターで遺伝子操作される宿主細胞および組換え技術による本
発明のポリペプチドの製造に関する。さらに無細胞翻訳系を用い、本発明のDN
A構築物由来のRNAを使用してかかる蛋白を製造することができる。 本発明の組み換えポリペプチドを、発現系を含む遺伝子操作された宿主細胞か
ら、当業者によく知られた方法により製造してもよい。したがって、さらなる態
様において、本発明は、本発明ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを含む発現
系、かかる発現系で遺伝子操作された宿主細胞、ならびに組み換え法による本発
明ポリペプチドの製造に関する。 組換え体産生のために、宿主細胞を遺伝子操作し、発現系もしくはそれらの一
部、または本発明のポリヌクレオチドを取り込むことができる。ポリヌクレオチ
ドの宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE−
デキストラン媒介トランスフェクション、トランスベクション、マイクロインジ
ェクション、陽イオン脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション
、トランスダクション、スクレープ・ローディング、弾道導入および感染のよう
な、Davisら、BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY(1986)およびSambrookら
、MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,2nd Ed. Cold Spring Harbor Lab
oratory Press,Cold Spring Harbor, N.Y.(1989)のごとき複数の標準的研究室
マニュアルに記載されている方法によって行うことができる。
ター、本発明のベクターで遺伝子操作される宿主細胞および組換え技術による本
発明のポリペプチドの製造に関する。さらに無細胞翻訳系を用い、本発明のDN
A構築物由来のRNAを使用してかかる蛋白を製造することができる。 本発明の組み換えポリペプチドを、発現系を含む遺伝子操作された宿主細胞か
ら、当業者によく知られた方法により製造してもよい。したがって、さらなる態
様において、本発明は、本発明ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを含む発現
系、かかる発現系で遺伝子操作された宿主細胞、ならびに組み換え法による本発
明ポリペプチドの製造に関する。 組換え体産生のために、宿主細胞を遺伝子操作し、発現系もしくはそれらの一
部、または本発明のポリヌクレオチドを取り込むことができる。ポリヌクレオチ
ドの宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE−
デキストラン媒介トランスフェクション、トランスベクション、マイクロインジ
ェクション、陽イオン脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション
、トランスダクション、スクレープ・ローディング、弾道導入および感染のよう
な、Davisら、BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY(1986)およびSambrookら
、MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,2nd Ed. Cold Spring Harbor Lab
oratory Press,Cold Spring Harbor, N.Y.(1989)のごとき複数の標準的研究室
マニュアルに記載されている方法によって行うことができる。
【0064】
適当な宿主の代表例は、レンサ球菌(streptococcus)、ブドウ球菌(staphyl
ococcus)、腸球菌(enterococcus)、大腸菌(E.coli)、ストレプトミセス(s
treptomyces)、シアノバクテリア(cyanpobacteria)、枯草菌(Bacillus subt
ilis)およびストレプトコッカス・ニューモニアエ(Streptococcus pneumoniae
)のごとき細菌細胞;クルベロミセス(Kluveromyces)、サッカロミセス(Sacc
haromyces)のごとき酵母細胞、担子菌、カンジダ・アルビカンス(Candida alb
icans)およびアスペルギルス(Aspergillus);ドロソフィラ(Drosophila)S2
およびスポドプテラ(Spodoptera)Sf9細胞のごとき昆虫細胞;CHO、COS、HeLa
、C127、3T3、BHK、293、CV-1およびボーウェス(Bowes)メラノーマ細胞のごと
き動物細胞;および裸子植物または被子植物のごとき植物細胞を包含する。
ococcus)、腸球菌(enterococcus)、大腸菌(E.coli)、ストレプトミセス(s
treptomyces)、シアノバクテリア(cyanpobacteria)、枯草菌(Bacillus subt
ilis)およびストレプトコッカス・ニューモニアエ(Streptococcus pneumoniae
)のごとき細菌細胞;クルベロミセス(Kluveromyces)、サッカロミセス(Sacc
haromyces)のごとき酵母細胞、担子菌、カンジダ・アルビカンス(Candida alb
icans)およびアスペルギルス(Aspergillus);ドロソフィラ(Drosophila)S2
およびスポドプテラ(Spodoptera)Sf9細胞のごとき昆虫細胞;CHO、COS、HeLa
、C127、3T3、BHK、293、CV-1およびボーウェス(Bowes)メラノーマ細胞のごと
き動物細胞;および裸子植物または被子植物のごとき植物細胞を包含する。
【0065】
本発明のポリペプチドを製造するために非常に多様な発現系を使用することが
できる。かかる系は、とりわけ、染色体、エピソームおよびウイルス由来の系、
例えば、細菌プラスミド由来、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由来、
酵母エピソーム由来、挿入エレメント由来、酵母染色体エレメント由来、バキュ
ロウイルス、SV40のごときパポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウ
イルス、ニワトリポックスウイルス、偽狂犬病ウイルスおよびレトロウイルスの
ようなウイルス由来のベクター、およびコスミドおよびファージミドなどのプラ
スミドおよびバクテリオファージの遺伝因子由来のベクターのごとき、それらの
組み合わせに由来するベクターを包含する。発現系構築物は、発現を制御ならび
に引き起こす調節領域を有していてもよい。一般に、宿主においてポリヌクレオ
チドを維持、増幅または発現し、および/またはポリペプチドを発現するのに適
した系またはベクターを、この点にて発現に使用してもよい。適当なDNA配列
を、例えば、Sambrookら、MOLECULAR CLONING,A LABORATORY MANUAL(前掲)に
示されている技術のごとき、種々のよく知られた慣用的技術のいずれかによって
、発現系に挿入してもよい。
できる。かかる系は、とりわけ、染色体、エピソームおよびウイルス由来の系、
例えば、細菌プラスミド由来、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由来、
酵母エピソーム由来、挿入エレメント由来、酵母染色体エレメント由来、バキュ
ロウイルス、SV40のごときパポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウ
イルス、ニワトリポックスウイルス、偽狂犬病ウイルスおよびレトロウイルスの
ようなウイルス由来のベクター、およびコスミドおよびファージミドなどのプラ
スミドおよびバクテリオファージの遺伝因子由来のベクターのごとき、それらの
組み合わせに由来するベクターを包含する。発現系構築物は、発現を制御ならび
に引き起こす調節領域を有していてもよい。一般に、宿主においてポリヌクレオ
チドを維持、増幅または発現し、および/またはポリペプチドを発現するのに適
した系またはベクターを、この点にて発現に使用してもよい。適当なDNA配列
を、例えば、Sambrookら、MOLECULAR CLONING,A LABORATORY MANUAL(前掲)に
示されている技術のごとき、種々のよく知られた慣用的技術のいずれかによって
、発現系に挿入してもよい。
【0066】
真核細胞の組み換え発現系において、翻訳された蛋白を小胞体内腔、周辺腔ま
たは細胞外環境に分泌するために、適当な分泌シグナルを発現されるポリペプチ
ドに挿入してもよい。これらのシグナルは、ポリペプチドに固有のものであって
もよく、または異種のシグナルであってもよい。 本発明のポリペプチドは、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈澱、酸抽出、
アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグ
ラフィー、疎水相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィ
ー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフ
ィーを包含する、よく知られた方法によって組換え細胞培養物から回収および精
製できる。最も好ましくは、高品質液体クロマトグラフィーが精製に使用される
。ポリペプチドが単離および/または精製の間に変性する場合、蛋白を再生する
ための周知方法を用いて、再び活性なコンホーメーションとすることができる。
たは細胞外環境に分泌するために、適当な分泌シグナルを発現されるポリペプチ
ドに挿入してもよい。これらのシグナルは、ポリペプチドに固有のものであって
もよく、または異種のシグナルであってもよい。 本発明のポリペプチドは、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈澱、酸抽出、
アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグ
ラフィー、疎水相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィ
ー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフ
ィーを包含する、よく知られた方法によって組換え細胞培養物から回収および精
製できる。最も好ましくは、高品質液体クロマトグラフィーが精製に使用される
。ポリペプチドが単離および/または精製の間に変性する場合、蛋白を再生する
ための周知方法を用いて、再び活性なコンホーメーションとすることができる。
【0067】
診断、予後、セロタイピングおよび変異アッセイ
また本発明は、診断試薬として使用するための本発明のMurAポリヌクレオ
チドの使用にも関する。真核生物、とりわけ哺乳動物、特にヒトにおけるMur
Aポリヌクレオチドおよび/またはポリペプチドの検出は、疾患の診断、疾病の
段階の決定、または薬剤に対する感染生物の応答に関する診断方法を提供するで
あろう。MurA遺伝子または蛋白を含む生物に感染、または感染の可能性があ
る真核生物、とりわけ哺乳動物、特にヒトを、種々のよく知られた方法ならびに
本明細書記載の方法により核酸レベルまたはアミノ酸レベルで検出できる。
チドの使用にも関する。真核生物、とりわけ哺乳動物、特にヒトにおけるMur
Aポリヌクレオチドおよび/またはポリペプチドの検出は、疾患の診断、疾病の
段階の決定、または薬剤に対する感染生物の応答に関する診断方法を提供するで
あろう。MurA遺伝子または蛋白を含む生物に感染、または感染の可能性があ
る真核生物、とりわけ哺乳動物、特にヒトを、種々のよく知られた方法ならびに
本明細書記載の方法により核酸レベルまたはアミノ酸レベルで検出できる。
【0068】
予後、診断または他の分析に供するポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、
感染していると思われる個体および/または感染した個体の身体材料から得られ
る。これらの源由来のポリヌクレオチド、特にDNAまたはRNAを検出に直接
用いてもよく、あるいは分析に付す前にPCRもしくはその他の増幅法を用いる
ことにより酵素的に増幅できる。RNA(詳細にはmRNA)、cDNAおよび
ゲノムDNAも同じようして使用できる。増幅を用いると、個体に存在する原核
生物の種および株を原核生物遺伝子の遺伝子型の分析により特徴づけすることが
できる。対照配列の遺伝子型と比較した増幅生成物の大きさの変化により、欠失
および挿入を検出できる。点突然変異は、増幅DNAを標識したMurAポリヌ
クレオチド配列にハイブリダイゼーションさせることにより同定できる。完全に
対合した配列は、RNase消化により、または融解温度の差により、誤対合二重
らせんと区別できる。DNA配列の差はまた、変性剤を伴ったまたは変性剤を含
まないゲル中のDNAフラグメントの電気泳動の移動度の変化により、または直
接的なDNAの配列決定により検出できる。例えば、Myersら、Science,230:12
42(1985)を参照のこと。特異的な位置での配列の変化はまた、ヌクレアーゼ保
護アッセイ、例えば、RNaseおよびS1保護または化学的切断法によっても明
らかにすることができる。例えば、Cottonら、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,85:43
97-4401(1985)を参照のこと。ヌクレアーゼ保護アッセイ、例えば、RNas
e、V1およびS2保護アッセイまたは化学的開裂法により、特定位置における
配列の変化を明らかにすることができる。例えば、Cotton et al., Proc. Natl.
Acad. Sci., USA, 85:4397-4401 (1985)参照。
感染していると思われる個体および/または感染した個体の身体材料から得られ
る。これらの源由来のポリヌクレオチド、特にDNAまたはRNAを検出に直接
用いてもよく、あるいは分析に付す前にPCRもしくはその他の増幅法を用いる
ことにより酵素的に増幅できる。RNA(詳細にはmRNA)、cDNAおよび
ゲノムDNAも同じようして使用できる。増幅を用いると、個体に存在する原核
生物の種および株を原核生物遺伝子の遺伝子型の分析により特徴づけすることが
できる。対照配列の遺伝子型と比較した増幅生成物の大きさの変化により、欠失
および挿入を検出できる。点突然変異は、増幅DNAを標識したMurAポリヌ
クレオチド配列にハイブリダイゼーションさせることにより同定できる。完全に
対合した配列は、RNase消化により、または融解温度の差により、誤対合二重
らせんと区別できる。DNA配列の差はまた、変性剤を伴ったまたは変性剤を含
まないゲル中のDNAフラグメントの電気泳動の移動度の変化により、または直
接的なDNAの配列決定により検出できる。例えば、Myersら、Science,230:12
42(1985)を参照のこと。特異的な位置での配列の変化はまた、ヌクレアーゼ保
護アッセイ、例えば、RNaseおよびS1保護または化学的切断法によっても明
らかにすることができる。例えば、Cottonら、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,85:43
97-4401(1985)を参照のこと。ヌクレアーゼ保護アッセイ、例えば、RNas
e、V1およびS2保護アッセイまたは化学的開裂法により、特定位置における
配列の変化を明らかにすることができる。例えば、Cotton et al., Proc. Natl.
Acad. Sci., USA, 85:4397-4401 (1985)参照。
【0069】
もう1つの具体例において、MurAヌクレオチド配列またはそのフラグメン
トを含むオリゴヌクレオチドプローブの一群を構築して、例えば遺伝学的変異、
セロタイプ、分類学的分類または同定のための効果的なスクリーニングを行うこ
とができる。アレイ法は適応範囲が広く、遺伝子発現、遺伝学的連関、および遺
伝学的変化を包含する分子遺伝学における種々の問題を解決するために用いられ
る(例えば、Chee et al., Science,274:610 (1996)参照)。
トを含むオリゴヌクレオチドプローブの一群を構築して、例えば遺伝学的変異、
セロタイプ、分類学的分類または同定のための効果的なスクリーニングを行うこ
とができる。アレイ法は適応範囲が広く、遺伝子発現、遺伝学的連関、および遺
伝学的変化を包含する分子遺伝学における種々の問題を解決するために用いられ
る(例えば、Chee et al., Science,274:610 (1996)参照)。
【0070】
よって、もう1つの態様において、本発明は(a)本発明ポリヌクレオチド、
好ましくは配列番号:1のヌクレオチド配列、またはそのフラグメント;(b)
(a)のヌクレオチド配列に対して相捕的なヌクレオチド配列;(c)本発明ポ
リペプチド、好ましくは配列番号:2のポリペプチド、またはそのフラグメント
;あるいは(d)本発明ポリペプチドに対する抗体、好ましくは配列番号:2ま
たは4のポリペプチドに対する抗体を含む診断キットに関する。かかるキットに
おいて、(a)、(b)、(c)または(d)が重要な成分を含んでいてもよい
ことが理解されよう。かかるキットは、とりわけ疾病または疾病に対する感受性
についての診断において有用である。
好ましくは配列番号:1のヌクレオチド配列、またはそのフラグメント;(b)
(a)のヌクレオチド配列に対して相捕的なヌクレオチド配列;(c)本発明ポ
リペプチド、好ましくは配列番号:2のポリペプチド、またはそのフラグメント
;あるいは(d)本発明ポリペプチドに対する抗体、好ましくは配列番号:2ま
たは4のポリペプチドに対する抗体を含む診断キットに関する。かかるキットに
おいて、(a)、(b)、(c)または(d)が重要な成分を含んでいてもよい
ことが理解されよう。かかるキットは、とりわけ疾病または疾病に対する感受性
についての診断において有用である。
【0071】
また本発明は、診断試薬としての本発明ポリヌクレオチドの使用にも関する。
疾病または発病に関連した本発明ポリヌクレオチド、好ましくは配列番号:1の
ポリヌクレオチドの変異形態の検出は、ポリヌクレオチドの発現低下、発現過剰
または発現の変化により生じる疾病の診断、疾病経過の予後、疾病段階の決定、
または疾病に対する感受性の決定に加えて用いる診断用道具、またはかかる診断
等の決定のための道具を提供するであろう。かかるポリヌクレオチドにおける変
異を有する生物、特に感染生物を、本明細書記載のいずれかの場所で説明するよ
うな種々の方法によりポリヌクレオチドレベルで検出してもよい。
疾病または発病に関連した本発明ポリヌクレオチド、好ましくは配列番号:1の
ポリヌクレオチドの変異形態の検出は、ポリヌクレオチドの発現低下、発現過剰
または発現の変化により生じる疾病の診断、疾病経過の予後、疾病段階の決定、
または疾病に対する感受性の決定に加えて用いる診断用道具、またはかかる診断
等の決定のための道具を提供するであろう。かかるポリヌクレオチドにおける変
異を有する生物、特に感染生物を、本明細書記載のいずれかの場所で説明するよ
うな種々の方法によりポリヌクレオチドレベルで検出してもよい。
【0072】
第1の表現型を有する生物と異なる第2の表現型を有する生物との間のポリヌ
クレオチドおよび/またはポリペプチド配列の相違を調べることもできる。第1
の表現型を有するいくつかまたはすべての生物において変異が観察されるが、第
2の表現型を有する生物においては観察されない場合には、その変異は第1の表
現型の原因である可能性が高い。
クレオチドおよび/またはポリペプチド配列の相違を調べることもできる。第1
の表現型を有するいくつかまたはすべての生物において変異が観察されるが、第
2の表現型を有する生物においては観察されない場合には、その変異は第1の表
現型の原因である可能性が高い。
【0073】
本発明のポリヌクレオチドおよび/またはポリペプチド中に変異または多型性
(対立遺伝子変異)を担持する生物由来の細胞を、例えばセロタイピングを可能
にするような種々の技術によりDNAレベルで検出できる。例えば、RT−PC
Rを用いてRNAにおける変異を検出することができる。RT−PCRを自動検
出系、例えばGeneScan等と組み合わせて用いるのが特に好ましい。RNA、c
DNAまたはゲノムDNAもまた同じ目的でPCRまたはRT−PCRに用いる
ことができる。一例として、MurAポリペプチドをコードする核酸に相補的な
PCRプライマーを用いて変異を同定および分析することができる。さらに本発
明は、5’および/または3’末端から1、2、3または4個のヌクレオチドが
除去されたプライマーを提供する。特に、これらのプライマーを、個体由来の試
料、例えば身体材料から単離されたMurADNAおよび/またはRNAの増幅
に用いることができる。プライマーを用いて感染個体から単離されたポリヌクレ
オチドを増幅して、ポリヌクレオチド配列研究のための種々の方法に供してもよ
い。このようにして、ポリヌクレオチド配列中の変異を検出し、変異を用いて感
染または感染段階もしくは経路を診断および/または予後を行い、あるいは感染
体のセロタイプおよび/または分類を行ってもよい。
(対立遺伝子変異)を担持する生物由来の細胞を、例えばセロタイピングを可能
にするような種々の技術によりDNAレベルで検出できる。例えば、RT−PC
Rを用いてRNAにおける変異を検出することができる。RT−PCRを自動検
出系、例えばGeneScan等と組み合わせて用いるのが特に好ましい。RNA、c
DNAまたはゲノムDNAもまた同じ目的でPCRまたはRT−PCRに用いる
ことができる。一例として、MurAポリペプチドをコードする核酸に相補的な
PCRプライマーを用いて変異を同定および分析することができる。さらに本発
明は、5’および/または3’末端から1、2、3または4個のヌクレオチドが
除去されたプライマーを提供する。特に、これらのプライマーを、個体由来の試
料、例えば身体材料から単離されたMurADNAおよび/またはRNAの増幅
に用いることができる。プライマーを用いて感染個体から単離されたポリヌクレ
オチドを増幅して、ポリヌクレオチド配列研究のための種々の方法に供してもよ
い。このようにして、ポリヌクレオチド配列中の変異を検出し、変異を用いて感
染または感染段階もしくは経路を診断および/または予後を行い、あるいは感染
体のセロタイプおよび/または分類を行ってもよい。
【0074】
本発明はさらに、疾患、好ましくは細菌感染、さらに好ましくはストレプトコ
ッカス・ニューモニアエによる感染の診断方法であって、表3[配列番号1]の
配列を有するポリヌクレオチドの発現レベルの上昇を、個体由来のサンプルから
決定することを特徴とする方法を提供する。MurAポリヌクレオチドの発現の
増加または低下は、ポリヌクレオチドの定量法として当該分野で周知の方法であ
る任意の方法、例えば増幅、PCR、RT−PCR、RNase保護、ノーザンブ
ロッティング、スペクトロメトリーおよびその他のハイブリダイゼーション法を
用いて測定できる。
ッカス・ニューモニアエによる感染の診断方法であって、表3[配列番号1]の
配列を有するポリヌクレオチドの発現レベルの上昇を、個体由来のサンプルから
決定することを特徴とする方法を提供する。MurAポリヌクレオチドの発現の
増加または低下は、ポリヌクレオチドの定量法として当該分野で周知の方法であ
る任意の方法、例えば増幅、PCR、RT−PCR、RNase保護、ノーザンブ
ロッティング、スペクトロメトリーおよびその他のハイブリダイゼーション法を
用いて測定できる。
【0075】
加えて、正常対照組織サンプルと比較してMurAポリペプチドの過剰発現を
検出するための本発明による診断アッセイを用いて、例えば感染の存在を検出す
ることができる。宿主由来のサンプル中のMurAポリペプチドのレベルを決定
するために用いることができるアッセイ技法は、当業者に周知である。このよう
なアッセイ法は、ラジオイムノアッセイ、競合的結合アッセイ、ウェスタンブロ
ット分析、抗体サンドイッチアッセイ、抗体検出およびELISAアッセイを包
含する。
検出するための本発明による診断アッセイを用いて、例えば感染の存在を検出す
ることができる。宿主由来のサンプル中のMurAポリペプチドのレベルを決定
するために用いることができるアッセイ技法は、当業者に周知である。このよう
なアッセイ法は、ラジオイムノアッセイ、競合的結合アッセイ、ウェスタンブロ
ット分析、抗体サンドイッチアッセイ、抗体検出およびELISAアッセイを包
含する。
【0076】
アンタゴニストおよびアゴニスト−アッセイおよび分子
さらに、本発明ポリペプチドおよびポリヌクレオチドを用いて、例えば、細胞
、無細胞調製物、化学的ライブラリー、および天然産物の混合物中の、小分子基
質とリガンドとの結合を評価することもできる。これらの基質およびリガンドは
天然の基質およびリガンドでよく、または構造上もしくは機能上の模倣物でもよ
い。例えば、Coliganら、Current Protocols in Immunology 1(2):第5章(19
91)を参照のこと。
、無細胞調製物、化学的ライブラリー、および天然産物の混合物中の、小分子基
質とリガンドとの結合を評価することもできる。これらの基質およびリガンドは
天然の基質およびリガンドでよく、または構造上もしくは機能上の模倣物でもよ
い。例えば、Coliganら、Current Protocols in Immunology 1(2):第5章(19
91)を参照のこと。
【0077】
本発明ポリペプチドおよびポリヌクレオチドは多くの生物学的機能の原因であ
り、該機能には多くの疾病状態、詳細には上記疾病が包含される。それゆえ、ポ
リペプチドまたはポリヌクレオチドの機能を刺激または阻害する化合物を同定す
るためのスクリーニング法を工夫することが望ましい。したがって、さらなる態
様において、本発明は、本発明ポリペプチドまたはポリヌクレオチドならびに関
連ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの機能を刺激または阻害する化合物を同
定するためのスクリーニング方法を提供する。一般的には、アゴニストまたはア
ンタゴニストを上記疾病の治療および予防のために用いてもよい。種々の源、例
えば、細胞、無細胞調製物、化学ライブラリーおよび天然産物の混合物から化合
物を同定できる。そのようにして同定されたかかるアゴニスト、アンタゴニスト
または阻害剤は、天然または修飾基質、リガンド、受容体、酵素等であってもよ
く、場合によってはMurAポリペプチドおよびポリヌクレオチド、あるいはそ
れらの構造上または機能上の模倣物であってもよい(Coligan et al., Current
Protocols in Immunology 1(2): Chapter 5 (1991)参照)。
り、該機能には多くの疾病状態、詳細には上記疾病が包含される。それゆえ、ポ
リペプチドまたはポリヌクレオチドの機能を刺激または阻害する化合物を同定す
るためのスクリーニング法を工夫することが望ましい。したがって、さらなる態
様において、本発明は、本発明ポリペプチドまたはポリヌクレオチドならびに関
連ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの機能を刺激または阻害する化合物を同
定するためのスクリーニング方法を提供する。一般的には、アゴニストまたはア
ンタゴニストを上記疾病の治療および予防のために用いてもよい。種々の源、例
えば、細胞、無細胞調製物、化学ライブラリーおよび天然産物の混合物から化合
物を同定できる。そのようにして同定されたかかるアゴニスト、アンタゴニスト
または阻害剤は、天然または修飾基質、リガンド、受容体、酵素等であってもよ
く、場合によってはMurAポリペプチドおよびポリヌクレオチド、あるいはそ
れらの構造上または機能上の模倣物であってもよい(Coligan et al., Current
Protocols in Immunology 1(2): Chapter 5 (1991)参照)。
【0078】
スクリーニング法は、単に化合物のポリペプチドまたはポリヌクレオチドへの
、あるいはポリペプチドまたはポリヌクレオチドを有する細胞もしくは膜への、
あるいはポリペプチド含む融合蛋白への結合を、直接的または間接的に候補化合
物に結合した標識により測定するものであってもよい。別法として、スクリーニ
ング法は標識競争物質との競争を用いるものであってもよい。さらに、これらの
スクリーニング法は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを含む細胞に適した
検出系を用いて、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの活性化または阻害によ
り生じるシグナルを化合物が発生させるかどうかを試験するものであってもよい
。一般的には、既知アゴニスト存在下で活性化の阻害剤をアッセイし、次いで、
候補化合物存在下でのアゴニストによる活性化の効果を観察する。構成的に活性
のあるポリペプチドおよび/または構成的に発現されるポリペプチドおよびポリ
ヌクレオチドを、アゴニストまたは阻害剤の効果を逆転させる物質を探すスクリ
ーニング法に用いてもよく、候補化合物がポリペプチドまたはポリヌクレオチド
の活性化を阻害するかどうかを試験することによる。さらに、スクリーニング法
は、単に、候補化合物を本発明ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを含有する
溶液と混合して混合物を作成し、混合物中のMurAポリペプチドおよび/また
はポリヌクレオチド活性を測定し、次いで、混合物中のMurAポリペプチドお
よび/またはポリヌクレオチド活性を標準に対して比較することを特徴とする。
Fc部分および上記MurAポリペプチドから作成されるような融合蛋白を用い
て高処理量アッセイを行って本発明ポリペプチドのアンタゴニストならびに系統
分類的および/または機能的に関連したポリペプチドを同定することもできる(
D.Bennett et al., J. Mol. Recognition, 8:52-58 (1955);およびK.Johanson e
t al., J. Biol. Chem., 270(16):9549-9471 (1955)参照)。
、あるいはポリペプチドまたはポリヌクレオチドを有する細胞もしくは膜への、
あるいはポリペプチド含む融合蛋白への結合を、直接的または間接的に候補化合
物に結合した標識により測定するものであってもよい。別法として、スクリーニ
ング法は標識競争物質との競争を用いるものであってもよい。さらに、これらの
スクリーニング法は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを含む細胞に適した
検出系を用いて、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの活性化または阻害によ
り生じるシグナルを化合物が発生させるかどうかを試験するものであってもよい
。一般的には、既知アゴニスト存在下で活性化の阻害剤をアッセイし、次いで、
候補化合物存在下でのアゴニストによる活性化の効果を観察する。構成的に活性
のあるポリペプチドおよび/または構成的に発現されるポリペプチドおよびポリ
ヌクレオチドを、アゴニストまたは阻害剤の効果を逆転させる物質を探すスクリ
ーニング法に用いてもよく、候補化合物がポリペプチドまたはポリヌクレオチド
の活性化を阻害するかどうかを試験することによる。さらに、スクリーニング法
は、単に、候補化合物を本発明ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを含有する
溶液と混合して混合物を作成し、混合物中のMurAポリペプチドおよび/また
はポリヌクレオチド活性を測定し、次いで、混合物中のMurAポリペプチドお
よび/またはポリヌクレオチド活性を標準に対して比較することを特徴とする。
Fc部分および上記MurAポリペプチドから作成されるような融合蛋白を用い
て高処理量アッセイを行って本発明ポリペプチドのアンタゴニストならびに系統
分類的および/または機能的に関連したポリペプチドを同定することもできる(
D.Bennett et al., J. Mol. Recognition, 8:52-58 (1955);およびK.Johanson e
t al., J. Biol. Chem., 270(16):9549-9471 (1955)参照)。
【0079】
本発明ポリペプチドと結合および/または相互作用するポリヌクレオチド、ポ
リペプチドおよび抗体を用いて、細胞中のmRNAおよび/またはポリペプチド
の精製に対する添加化合物の影響を検出するためのスクリーニング方法を組み立
ててもよい。例えば、ELISAアッセイを構築して、モノクローナルおよびポ
リクローナル抗体を用いてポリペプチドの分泌または細胞結合レベルを、当該分
野において標準的な方法により測定してもよい。これにより、適当に操作された
細胞または組織からのポリペプチドの生成を阻害または促進しうる作用剤(それ
ぞれ、アンタゴニストまたはアゴニストという)を見いだすことができる。
リペプチドおよび抗体を用いて、細胞中のmRNAおよび/またはポリペプチド
の精製に対する添加化合物の影響を検出するためのスクリーニング方法を組み立
ててもよい。例えば、ELISAアッセイを構築して、モノクローナルおよびポ
リクローナル抗体を用いてポリペプチドの分泌または細胞結合レベルを、当該分
野において標準的な方法により測定してもよい。これにより、適当に操作された
細胞または組織からのポリペプチドの生成を阻害または促進しうる作用剤(それ
ぞれ、アンタゴニストまたはアゴニストという)を見いだすことができる。
【0080】
本発明はまた、MurAポリペプチドまたはポリヌクレオチドの作用、特に静
菌および/または殺菌性である化合物の作用を亢進(アゴニスト)または遮断(
アンタゴニスト)する化合物を同定するための化合物のスクリーニング方法を提
供する。スクリーニング方法には高処理量(high−throughput)技術が包含され
る。例えば、アゴニストまたはアンタゴニストをスクリーニングするために、M
urAポリペプチドおよびかかるポリペプチドの標識基質またはリガンドを含む
合成反応混合物、膜、細胞エンベロープもしくは細胞壁のごとき細胞コンパート
メント、またはそれらのいずれかの調製物を、MurAアゴニストまたはアンタ
ゴニストであるかもしれない候補分子の存在下または不在下でインキュベートす
る。候補分子がMurAポリペプチドに作動または拮抗する能力は、標識リガン
ドの結合の低下またはかかる基質からの生成物の生成低下に反映される。結合し
ても影響を及ぼさない分子、すなわちMurAポリペプチドの効果を誘起しない
分子は、ほとんどの場合、良好なアンタゴニストであろう。よく結合し、基質か
らの生成物の生成速度を高め、シグナルトランスダクションを増大させ、あるい
は化学チャンネル活性を増大させる分子はアゴニストである。基質からの生成物
の生成速度、シグナルトランスダクション、あるいは化学チャンネル活性のレベ
ルの検出はリポーターシステムを用いることにより強調できる。この点に関して
有用なリポーターシステムは、生成物に転換される比色標識基質、MurAポリ
ヌクレオチドまたはポリペプチド活性の変化に応答するリポーター遺伝子、およ
び当該分野で公知の結合アッセイを包含するが、これらに限定するものではない
。
菌および/または殺菌性である化合物の作用を亢進(アゴニスト)または遮断(
アンタゴニスト)する化合物を同定するための化合物のスクリーニング方法を提
供する。スクリーニング方法には高処理量(high−throughput)技術が包含され
る。例えば、アゴニストまたはアンタゴニストをスクリーニングするために、M
urAポリペプチドおよびかかるポリペプチドの標識基質またはリガンドを含む
合成反応混合物、膜、細胞エンベロープもしくは細胞壁のごとき細胞コンパート
メント、またはそれらのいずれかの調製物を、MurAアゴニストまたはアンタ
ゴニストであるかもしれない候補分子の存在下または不在下でインキュベートす
る。候補分子がMurAポリペプチドに作動または拮抗する能力は、標識リガン
ドの結合の低下またはかかる基質からの生成物の生成低下に反映される。結合し
ても影響を及ぼさない分子、すなわちMurAポリペプチドの効果を誘起しない
分子は、ほとんどの場合、良好なアンタゴニストであろう。よく結合し、基質か
らの生成物の生成速度を高め、シグナルトランスダクションを増大させ、あるい
は化学チャンネル活性を増大させる分子はアゴニストである。基質からの生成物
の生成速度、シグナルトランスダクション、あるいは化学チャンネル活性のレベ
ルの検出はリポーターシステムを用いることにより強調できる。この点に関して
有用なリポーターシステムは、生成物に転換される比色標識基質、MurAポリ
ヌクレオチドまたはポリペプチド活性の変化に応答するリポーター遺伝子、およ
び当該分野で公知の結合アッセイを包含するが、これらに限定するものではない
。
【0081】
本発明ポリペプチドを用いて膜結合または可溶性受容体を同定してもよく、か
かるポリペプチドは当該分野において標準的な受容体結合法により同定される。
これらの方法、リガンド結合およびクロスリンキングアッセイを包含するが、こ
れらに限らない。これらの方法において、ポリペプチドを放射性標識(例えば1 25 I)、化学修飾(例えばビオチン化)または検出および精製に適したペプチ
ド配列に融合され、推定上の受容体(例えば細胞、細胞膜、細胞上清、組織抽出
物、身体材料)の源とともにインキュベーションする。他の方法は表面プラスモ
ン共鳴および分光学的法法を包含する。これらのスクリーニング方法を用いて、
ポリペプチドのその受容体(存在すれば)への結合と競争するポリペプチドのア
ゴニストおよびアンタゴニストを同定してもよい。かかるアッセイを行うための
標準的方法は当該分野においてよく知られている。
かるポリペプチドは当該分野において標準的な受容体結合法により同定される。
これらの方法、リガンド結合およびクロスリンキングアッセイを包含するが、こ
れらに限らない。これらの方法において、ポリペプチドを放射性標識(例えば1 25 I)、化学修飾(例えばビオチン化)または検出および精製に適したペプチ
ド配列に融合され、推定上の受容体(例えば細胞、細胞膜、細胞上清、組織抽出
物、身体材料)の源とともにインキュベーションする。他の方法は表面プラスモ
ン共鳴および分光学的法法を包含する。これらのスクリーニング方法を用いて、
ポリペプチドのその受容体(存在すれば)への結合と競争するポリペプチドのア
ゴニストおよびアンタゴニストを同定してもよい。かかるアッセイを行うための
標準的方法は当該分野においてよく知られている。
【0082】
蛍光タグを付した分子に関する蛍光分極値は回転相関時間(rotational corre
lation time)または回転速度(tumbling rate)に依存する。別の応答レギュレ
ーターポリペプチドもしくは他のポリペプチドと結合した応答レギュレーターポ
リペプチドのごとき蛋白複合体であって蛍光標識分子を含むように標識されてい
るものは、蛍光標識されたモノマー蛋白よりも高い分極値を有するであろう。こ
の方法を用いて、ポリペプチド複合体を分裂させる小型分子を特徴づけるのが好
ましい。
lation time)または回転速度(tumbling rate)に依存する。別の応答レギュレ
ーターポリペプチドもしくは他のポリペプチドと結合した応答レギュレーターポ
リペプチドのごとき蛋白複合体であって蛍光標識分子を含むように標識されてい
るものは、蛍光標識されたモノマー蛋白よりも高い分極値を有するであろう。こ
の方法を用いて、ポリペプチド複合体を分裂させる小型分子を特徴づけるのが好
ましい。
【0083】
蛍光エネルギー転移を用いて、応答レギュレーターポリペプチドダイマー、ト
リマー、テトラマー、または高次構造、あるいは別のポリペプチドに結合した応
答レギュレーターポリペプチドにより形成される構造の形成を妨害する小型分子
を特徴づけてもよい。応答レギュレーターポリペプチドをドナーおよびアクセプ
ター両方の蛍光発色団で標識することができる。2種の標識種を混合し、ドナー
蛍光発色団を励起したならば、アクセプターの蛍光を観察することにより蛍光エ
ネルギー転移を検出することができる。ダイマー化をブロックする化合物は蛍光
エネルギー転移を阻害するであろう。
リマー、テトラマー、または高次構造、あるいは別のポリペプチドに結合した応
答レギュレーターポリペプチドにより形成される構造の形成を妨害する小型分子
を特徴づけてもよい。応答レギュレーターポリペプチドをドナーおよびアクセプ
ター両方の蛍光発色団で標識することができる。2種の標識種を混合し、ドナー
蛍光発色団を励起したならば、アクセプターの蛍光を観察することにより蛍光エ
ネルギー転移を検出することができる。ダイマー化をブロックする化合物は蛍光
エネルギー転移を阻害するであろう。
【0084】
表面プラスモン共鳴を用いて、応答レギュレーターポリペプチドの自己結合な
らびに応答レギュレーターポリペプチドと別のポリペプチドもしくは小型分子と
の結合に対する小型分子の影響をモニターすることができる。低いサイト密度(
site density)において応答レギュレーターポリペプチドをセンサーチップにカ
ップリングさせて、共有結合分子がモノマー性となるようにすることができる。
次いで、溶液蛋白を応答レギュレーターポリペプチド被覆表面上に通し、局所屈
折率の変化により生じる共鳴角の変化をモニターすることにより特異的結合をリ
アルタイムで検出することができる。この方法を用いて、応答レギュレーターポ
リペプチドの自己結合ならびに応答レギュレーターポリペプチドと別のポリペプ
チドもしくは小型分子との結合に関する反応速度および平衡結合定数に対する小
型分子の影響を特徴づけることができる。
らびに応答レギュレーターポリペプチドと別のポリペプチドもしくは小型分子と
の結合に対する小型分子の影響をモニターすることができる。低いサイト密度(
site density)において応答レギュレーターポリペプチドをセンサーチップにカ
ップリングさせて、共有結合分子がモノマー性となるようにすることができる。
次いで、溶液蛋白を応答レギュレーターポリペプチド被覆表面上に通し、局所屈
折率の変化により生じる共鳴角の変化をモニターすることにより特異的結合をリ
アルタイムで検出することができる。この方法を用いて、応答レギュレーターポ
リペプチドの自己結合ならびに応答レギュレーターポリペプチドと別のポリペプ
チドもしくは小型分子との結合に関する反応速度および平衡結合定数に対する小
型分子の影響を特徴づけることができる。
【0085】
シンチレーション近接アッセイを用いて、MurAポリペプチドと別のMur
Aポリペプチドもしくは別の分子との結合の間の相互作用を特徴づけることがで
きる。MurAポリペプチドをシンチレーション充填ビーズにカップリングさせ
ることができる。放射性標識MurAポリペプチドの添加は結合を生じ、放射性
源分子はシンチレーション液に極めて近接した状態となる。よって、MurAポ
リペプチドの結合によりシグナルが放出され、MurAポリペプチドの自己結合
またはMurAポリペプチドと別のポリペプチドもしくは小型分子との結合を妨
害する化合物はシグナルを減少させるであろう。
Aポリペプチドもしくは別の分子との結合の間の相互作用を特徴づけることがで
きる。MurAポリペプチドをシンチレーション充填ビーズにカップリングさせ
ることができる。放射性標識MurAポリペプチドの添加は結合を生じ、放射性
源分子はシンチレーション液に極めて近接した状態となる。よって、MurAポ
リペプチドの結合によりシグナルが放出され、MurAポリペプチドの自己結合
またはMurAポリペプチドと別のポリペプチドもしくは小型分子との結合を妨
害する化合物はシグナルを減少させるであろう。
【0086】
本発明の他の具体例において、本発明ポリペプチドおよびまたはポリヌクレオ
チドと結合あるいは相互作用して、その活性または発現を阻害または活性化する
化合物を同定する方法であって、ポリペプチドおよび/またはポリヌクレオチド
への結合、あるいはポリペプチドおよび/またはポリヌクレオチドと化合物との
他の相互作用を可能にする条件下で本発明ポリペプチドおよび/またはポリヌク
レオチドをスクリーニングすべき化合物と接触させて、アゴニストとの結合ある
いは他の相互作用を評価し(該方法において、好ましくは、かかる結合または相
互作用はポリペプチドおよび/またはポリヌクレオチドと化合物との結合あるい
は相互作用に応答した検出可能シグナルを提供しうる第2の化合物に関連したも
のである)、次いで、ポリペプチドおよび/またはポリヌクレオチドと化合物と
の結合あるいは相互作用から生じるシグナルの存在または不存在を検出すること
により、化合物がポリペプチドおよび/またはポリヌクレオチドと結合あるいは
相互作用し、その活性または発現を活性化または阻害するかどうかを決定する方
法が提供される。
チドと結合あるいは相互作用して、その活性または発現を阻害または活性化する
化合物を同定する方法であって、ポリペプチドおよび/またはポリヌクレオチド
への結合、あるいはポリペプチドおよび/またはポリヌクレオチドと化合物との
他の相互作用を可能にする条件下で本発明ポリペプチドおよび/またはポリヌク
レオチドをスクリーニングすべき化合物と接触させて、アゴニストとの結合ある
いは他の相互作用を評価し(該方法において、好ましくは、かかる結合または相
互作用はポリペプチドおよび/またはポリヌクレオチドと化合物との結合あるい
は相互作用に応答した検出可能シグナルを提供しうる第2の化合物に関連したも
のである)、次いで、ポリペプチドおよび/またはポリヌクレオチドと化合物と
の結合あるいは相互作用から生じるシグナルの存在または不存在を検出すること
により、化合物がポリペプチドおよび/またはポリヌクレオチドと結合あるいは
相互作用し、その活性または発現を活性化または阻害するかどうかを決定する方
法が提供される。
【0087】
MurAアンタゴニストのアッセイのもう1つの例は、競争阻害アッセイに適
した条件下で、MurAおよび潜在的なアンタゴニストを、MurA結合分子、
組換えMurA結合分子、天然基質もしくはリガンド、または基質もしくはリガ
ンド模倣物と混合する、競合アッセイである。MurA分子を例えば放射活性ま
たは比色化合物により標識し、結合分子に結合した、あるいは生成物に変換した
MurA分子の数を正確に決定して、潜在的なアンタゴニストの効果を評価でき
る。
した条件下で、MurAおよび潜在的なアンタゴニストを、MurA結合分子、
組換えMurA結合分子、天然基質もしくはリガンド、または基質もしくはリガ
ンド模倣物と混合する、競合アッセイである。MurA分子を例えば放射活性ま
たは比色化合物により標識し、結合分子に結合した、あるいは生成物に変換した
MurA分子の数を正確に決定して、潜在的なアンタゴニストの効果を評価でき
る。
【0088】
本発明ポリペプチドおよび/またはポリヌクレオチドを、ポリペプチドおよび
/またはポリヌクレオチドのアゴニスト、アンタゴニストまたは阻害剤の構造に
基づく設計方法に用いてもよいことが、当業者に容易に理解されよう。該方法は
:(a)最初にポリペプチドおよび/またはポリヌクレオチド、またはそれらの
複合体の3次元構造を決定し、(b)アゴニスト、アンタゴニストまたは阻害剤
の反応部位、結合部位またはモチーフである可能性のある部位の3次元構造を推
定し、(c)推定された反応部位、結合部位および/またはモチーフと結合また
は反応すると予想される候補化合物を合成し、次いで(d)候補化合物が実際に
アゴニスト、アンタゴニストまたは阻害剤であるかどうかを試験することを含む
。 これが繰り返しプロセスであり、自動およびコンピューター制御工程を用いて
この繰り返しプロセスを行ってもよいことが、さらに理解されよう。
/またはポリヌクレオチドのアゴニスト、アンタゴニストまたは阻害剤の構造に
基づく設計方法に用いてもよいことが、当業者に容易に理解されよう。該方法は
:(a)最初にポリペプチドおよび/またはポリヌクレオチド、またはそれらの
複合体の3次元構造を決定し、(b)アゴニスト、アンタゴニストまたは阻害剤
の反応部位、結合部位またはモチーフである可能性のある部位の3次元構造を推
定し、(c)推定された反応部位、結合部位および/またはモチーフと結合また
は反応すると予想される候補化合物を合成し、次いで(d)候補化合物が実際に
アゴニスト、アンタゴニストまたは阻害剤であるかどうかを試験することを含む
。 これが繰り返しプロセスであり、自動およびコンピューター制御工程を用いて
この繰り返しプロセスを行ってもよいことが、さらに理解されよう。
【0089】
さらなる態様において、本発明は、例えばMurAポリペプチドおよび/また
はポリヌクレオチドの過剰発現、発現不足、上昇した活性、または低下した活性
に関連した疾病のごとき異常な状態の治療方法を提供する。 ポリペプチドおよび/またはポリヌクレオチドの発現および/または活性が過
剰な場合、いくつかの方法を用いることができる。1の方法は、ポリペプチドお
よび/またはポリヌクレオチドの機能および/または発現を阻害(例えば、リガ
ンド、基質、受容体、酵素等の結合をブロックすることにより、あるいは2次的
シグナルを阻害することにより)するに有効な量の上記阻害化合物(アンタゴニ
スト)を医薬上許容される担体とともに対象に投与し、そのことにより異常なな
症状を改善することを含む。もう1つの方法において、やはり内在性ポリペプチ
ドおよび/またはポリヌクレオチドと競争してリガンド、基質、受容体、酵素等
に結合することができる可溶性形態のポリペプチドを投与してもよい。かかる競
争物質の典型例はMurAポリペプチドおよび/またはポリヌクレオチドのフラ
グメントを包含する。
はポリヌクレオチドの過剰発現、発現不足、上昇した活性、または低下した活性
に関連した疾病のごとき異常な状態の治療方法を提供する。 ポリペプチドおよび/またはポリヌクレオチドの発現および/または活性が過
剰な場合、いくつかの方法を用いることができる。1の方法は、ポリペプチドお
よび/またはポリヌクレオチドの機能および/または発現を阻害(例えば、リガ
ンド、基質、受容体、酵素等の結合をブロックすることにより、あるいは2次的
シグナルを阻害することにより)するに有効な量の上記阻害化合物(アンタゴニ
スト)を医薬上許容される担体とともに対象に投与し、そのことにより異常なな
症状を改善することを含む。もう1つの方法において、やはり内在性ポリペプチ
ドおよび/またはポリヌクレオチドと競争してリガンド、基質、受容体、酵素等
に結合することができる可溶性形態のポリペプチドを投与してもよい。かかる競
争物質の典型例はMurAポリペプチドおよび/またはポリヌクレオチドのフラ
グメントを包含する。
【0090】
さらにもう1つのアプローチにおいて、発現ブロッキング法を用いて内在性M
urAポリペプチドをコードしている遺伝子の発現を阻害することができる。こ
のブロッキングは遺伝子発現のいずれの工程を標的としてもよいが、好ましくは
、転写および/または翻訳を標的とする。この種の既知方法の例は、体内で生じ
るかまたは別個に投与されるアンチセンス配列の使用を包含する(例えば、Olig
odeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press,
Bocca Raton, FL (1988)中O'Connor, J. Neurochem (1991) 56:560参照)。別
法として、遺伝子とともに三重らせんを形成するオリゴヌクレオチドを提供して
もよい。例えば、Lee et al., Nucleic Acids Res (1979) 6:3073; Cooney et a
l., Science (1988) 241:456; Dervan et al., Science (1991) 251:1360参照。
これらのオリゴヌクレオチドはそれ自体投与することができ、あるいは重要部分
のオリゴマーをインビボで発現させることもできる。
urAポリペプチドをコードしている遺伝子の発現を阻害することができる。こ
のブロッキングは遺伝子発現のいずれの工程を標的としてもよいが、好ましくは
、転写および/または翻訳を標的とする。この種の既知方法の例は、体内で生じ
るかまたは別個に投与されるアンチセンス配列の使用を包含する(例えば、Olig
odeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press,
Bocca Raton, FL (1988)中O'Connor, J. Neurochem (1991) 56:560参照)。別
法として、遺伝子とともに三重らせんを形成するオリゴヌクレオチドを提供して
もよい。例えば、Lee et al., Nucleic Acids Res (1979) 6:3073; Cooney et a
l., Science (1988) 241:456; Dervan et al., Science (1991) 251:1360参照。
これらのオリゴヌクレオチドはそれ自体投与することができ、あるいは重要部分
のオリゴマーをインビボで発現させることもできる。
【0091】
本明細書で得られるDNA配列は、各々、抗菌化合物の発見および開発に用い
ることができる。発現でコードされた蛋白は、抗菌薬物をスクリーニングするた
めの標的として用いることができる。加えて、コードされた蛋白のアミノ末端領
域をコードするDNA配列あるいはシャイン・ダルガノまたは他の個々のmRN
Aの翻訳容易化配列を用いて、目的とするコーディング配列の発現を調節するア
ンチセンス配列を構築することができる。
ることができる。発現でコードされた蛋白は、抗菌薬物をスクリーニングするた
めの標的として用いることができる。加えて、コードされた蛋白のアミノ末端領
域をコードするDNA配列あるいはシャイン・ダルガノまたは他の個々のmRN
Aの翻訳容易化配列を用いて、目的とするコーディング配列の発現を調節するア
ンチセンス配列を構築することができる。
【0092】
本発明はまた、感染の続発症に関与する、病原体および哺乳動物宿主間の最初
の物理的相互作用を妨害するための、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド
または阻害物質の使用を提供する。特に本発明の分子は、細菌、特にグラム陽性
菌が内在装置上の哺乳動物細胞外マトリックス蛋白、または創傷部の細胞外マト
リックス蛋白に付着することを防御するために;真核生物、好ましくは哺乳動物
の細胞外マトリックス蛋白と組織損傷を媒介する細菌性MurA蛋白との間の細
菌付着を遮断するために;内在装置の埋め込みまたは他の外科的手技以外により
開始した感染における病因の通常の進行を遮断するために使用することができる
。
の物理的相互作用を妨害するための、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド
または阻害物質の使用を提供する。特に本発明の分子は、細菌、特にグラム陽性
菌が内在装置上の哺乳動物細胞外マトリックス蛋白、または創傷部の細胞外マト
リックス蛋白に付着することを防御するために;真核生物、好ましくは哺乳動物
の細胞外マトリックス蛋白と組織損傷を媒介する細菌性MurA蛋白との間の細
菌付着を遮断するために;内在装置の埋め込みまたは他の外科的手技以外により
開始した感染における病因の通常の進行を遮断するために使用することができる
。
【0093】
本発明のさらに別の態様によれば、MurAのアゴニストおよびアンタゴニス
ト、好ましくは静菌性または殺菌性アゴニストおよびアンタゴニストが提供され
る。 本発明のアンタゴニストおよびアゴニストを用いて、例えば、疾患を阻害し、
治療することができる。
ト、好ましくは静菌性または殺菌性アゴニストおよびアンタゴニストが提供され
る。 本発明のアンタゴニストおよびアゴニストを用いて、例えば、疾患を阻害し、
治療することができる。
【0094】
ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)(本明細書中、エッチ・ピ
ロリともいう)菌は、胃癌、潰瘍、胃炎を発病している世界中の人々の3分の1
以上の胃に感染している(国際癌研究機関(International Agency for Researc
h on Cancer)(1994)Schistomoses,Liver Flukes and Helicobacter Pylori
(International Agency for Research on Cancer,Lyon,France;http://w
ww.uicc.ch/ecp/ecp2904.htm))。さらに、この国際癌研究機関は、最近
になって、ヘリコバクター・ピロリと胃腺癌の間の因果関係を認識し、その細菌
をグループI(限定的)発癌物質と分類した。本発明により提供されるスクリー
ニング法を用いて見出される本発明の好ましい抗菌化合物(MurAポリペプチ
ドおよび/またはポリヌクレオチドのアゴニストおよびアンタゴニスト)、特に
広スペクトルの抗生物質は、ヘリコバクター・ピロリ感染の治療に有用である。
このような治療はヘリコバクター・ピロリ誘発性癌、例えば胃腸癌の出現を減少
させる。かかる治療はまた胃潰瘍および胃炎も治癒する。
ロリともいう)菌は、胃癌、潰瘍、胃炎を発病している世界中の人々の3分の1
以上の胃に感染している(国際癌研究機関(International Agency for Researc
h on Cancer)(1994)Schistomoses,Liver Flukes and Helicobacter Pylori
(International Agency for Research on Cancer,Lyon,France;http://w
ww.uicc.ch/ecp/ecp2904.htm))。さらに、この国際癌研究機関は、最近
になって、ヘリコバクター・ピロリと胃腺癌の間の因果関係を認識し、その細菌
をグループI(限定的)発癌物質と分類した。本発明により提供されるスクリー
ニング法を用いて見出される本発明の好ましい抗菌化合物(MurAポリペプチ
ドおよび/またはポリヌクレオチドのアゴニストおよびアンタゴニスト)、特に
広スペクトルの抗生物質は、ヘリコバクター・ピロリ感染の治療に有用である。
このような治療はヘリコバクター・ピロリ誘発性癌、例えば胃腸癌の出現を減少
させる。かかる治療はまた胃潰瘍および胃炎も治癒する。
【0095】
本明細書において引用したすべての文献(特許および特許出願に限らない)は
出典明示によりその内容を本明細書の一部とする。本願が優先権を主張するいず
れの特許出願もまた出典明示により本明細書の一部とする。
出典明示によりその内容を本明細書の一部とする。本願が優先権を主張するいず
れの特許出願もまた出典明示により本明細書の一部とする。
【0096】
用語
本明細書中で頻繁に使用される特定の用語を、その理解を容易にするために以
下に定義する。 「身体材料(複数でも可)」とは、個体または生物由来の材料を意味し、骨、
血液、血清、脳脊髄液、精液、唾液、筋肉、軟骨、器官組織、皮膚、尿、糞便ま
たは生検材料のごとき細胞、組織および排泄物または剖検材料等が挙げられるが
、これらに限らない。該生物は、個体に感染、侵入、または棲息するものである
。 「疾病(複数でも可)」は、細菌感染により引き起こされる、あるいは細菌感
染に関連した疾病を意味し、例えば、中耳炎、結膜炎、肺炎、菌血症、脳髄膜炎
、副鼻腔炎、膿胸、および心内膜炎、そして最も詳細には脳髄膜炎、例えば脳脊
髄液の感染を包含する。 「宿主細胞(複数でも可)」は外来性ポリヌクレオチド配列を導入(形質転換
またはトランスフェクション)された、あるいは導入(形質転換またはトランス
フェクション)されうる細胞である。
下に定義する。 「身体材料(複数でも可)」とは、個体または生物由来の材料を意味し、骨、
血液、血清、脳脊髄液、精液、唾液、筋肉、軟骨、器官組織、皮膚、尿、糞便ま
たは生検材料のごとき細胞、組織および排泄物または剖検材料等が挙げられるが
、これらに限らない。該生物は、個体に感染、侵入、または棲息するものである
。 「疾病(複数でも可)」は、細菌感染により引き起こされる、あるいは細菌感
染に関連した疾病を意味し、例えば、中耳炎、結膜炎、肺炎、菌血症、脳髄膜炎
、副鼻腔炎、膿胸、および心内膜炎、そして最も詳細には脳髄膜炎、例えば脳脊
髄液の感染を包含する。 「宿主細胞(複数でも可)」は外来性ポリヌクレオチド配列を導入(形質転換
またはトランスフェクション)された、あるいは導入(形質転換またはトランス
フェクション)されうる細胞である。
【0097】
「同一性」は、当該分野で公知であり、配列の比較で決定されるような、2ま
たはそれ以上のポリペプチド配列あるいは2またはそれ以上のポリヌクレオチド
配列の間の関係である。また、当該分野では、「同一性」は、場合によっては、
配列の鎖間の対合によって決定されるような、ポリペプチドまたはポリヌクレオ
チド配列間の配列の関連性の度合を意味する。「同一性」は、Computational Mo
lecular Biology,Lesk,A.M.編,Oxford University Press,New York,1988;
Biocomputing:Informatics and Genome Projects, Smith, D.W.編,Academic P
ress,New York,1993;Computer Analysis of Sequence Data,Part I,Griffi
n, A.M.およびGriffin, H.G.編,Humana Press,New Jersey,1994;Sequence A
nalysis in Molecular Biology,Von Heinje,G.Academic Press,1987;および
Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.およびDevereux, J.編,M Stockton Pr
ess,New York,1991;およびCarllio,HおよびLipman,D.,SIAM J.Applied Math
., 48:1073(1988)に記載されている方法(これらに限らない)を含め、公知方
法により容易に決定することができる。同一性を決定する好ましい方法は、テス
トする配列間に最大の対合を与えるように設計されている。そのうえ、同一性を
測定する方法は公に入手できるコンピュータ・プログラムに集成されている。2
つの配列の間の同一性を測定する好ましいコンピュータ・プログラム方法は、例
えば、GCSプログラムパッケージ(Devereux,J.ら,Nucleic Acids Research
(1984)12(1):387)、BLASTP、BLASTNおよびFASTA(Atschul,S. F.ら, J.Mo
lec.Biol.(1990)215:403−410)を包含するが、これに限らない。BLAST Xプ
ログラムはNCBIおよび他の源(BLAST Manual,Altshul, S.ら,NCBI NLM NIH B
ethesda,MD20894;Altschul,S.ら,J.Mol.Biol.,215:403−410(1990))か
ら公に入手できる。また、周知のスミス・ウォーターマン(Smith Waterman)ア
ルゴリズムを用いて同一性を決定することもできる。
たはそれ以上のポリペプチド配列あるいは2またはそれ以上のポリヌクレオチド
配列の間の関係である。また、当該分野では、「同一性」は、場合によっては、
配列の鎖間の対合によって決定されるような、ポリペプチドまたはポリヌクレオ
チド配列間の配列の関連性の度合を意味する。「同一性」は、Computational Mo
lecular Biology,Lesk,A.M.編,Oxford University Press,New York,1988;
Biocomputing:Informatics and Genome Projects, Smith, D.W.編,Academic P
ress,New York,1993;Computer Analysis of Sequence Data,Part I,Griffi
n, A.M.およびGriffin, H.G.編,Humana Press,New Jersey,1994;Sequence A
nalysis in Molecular Biology,Von Heinje,G.Academic Press,1987;および
Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.およびDevereux, J.編,M Stockton Pr
ess,New York,1991;およびCarllio,HおよびLipman,D.,SIAM J.Applied Math
., 48:1073(1988)に記載されている方法(これらに限らない)を含め、公知方
法により容易に決定することができる。同一性を決定する好ましい方法は、テス
トする配列間に最大の対合を与えるように設計されている。そのうえ、同一性を
測定する方法は公に入手できるコンピュータ・プログラムに集成されている。2
つの配列の間の同一性を測定する好ましいコンピュータ・プログラム方法は、例
えば、GCSプログラムパッケージ(Devereux,J.ら,Nucleic Acids Research
(1984)12(1):387)、BLASTP、BLASTNおよびFASTA(Atschul,S. F.ら, J.Mo
lec.Biol.(1990)215:403−410)を包含するが、これに限らない。BLAST Xプ
ログラムはNCBIおよび他の源(BLAST Manual,Altshul, S.ら,NCBI NLM NIH B
ethesda,MD20894;Altschul,S.ら,J.Mol.Biol.,215:403−410(1990))か
ら公に入手できる。また、周知のスミス・ウォーターマン(Smith Waterman)ア
ルゴリズムを用いて同一性を決定することもできる。
【0098】
ポリペプチド配列の比較のためのパラメーターは以下のものを包含する:
1)アルゴリズム:Needleman and Wunsch, J.Mol.Biol. 48:443-453 (1970)
比較マトリックス:Hentikoff and Hentikoff, Proc.Natl.Acad.Sci.USA.89:109
15-10919 (1992)からのBLOSSUM62 ギャップペナルティー:12 ギャップ長ペナルティー:4 これらのパラメーターに関して有用なプログラムは、Genetics Computer Grou
p, Madison WI.から「ギャップ」プログラムとして公に利用できる。上記パラメ
ーターはポリペプチド比較のための省略時パラメーターである(エンドギャップ
についてペナルティーを伴わない)。 ポリヌクレオチド比較のための好ましいパラメーターは下記のものを包含する
: 1)アルゴリズム:Needleman and Wunsch, J.Mol.Biol. 48:443-453 (1970) 比較マトリックス:マッチ=+10、ミスマッチ=0 ギャップペナルティー:50 ギャップ長ペナルティー:3 これらのパラメーターはGenetics Computer Group, Madison WI.から「ギャッ
プ」プログラムとして利用できる。これらはポリヌクレオチド比較のための省略
時パラメーターである。
15-10919 (1992)からのBLOSSUM62 ギャップペナルティー:12 ギャップ長ペナルティー:4 これらのパラメーターに関して有用なプログラムは、Genetics Computer Grou
p, Madison WI.から「ギャップ」プログラムとして公に利用できる。上記パラメ
ーターはポリペプチド比較のための省略時パラメーターである(エンドギャップ
についてペナルティーを伴わない)。 ポリヌクレオチド比較のための好ましいパラメーターは下記のものを包含する
: 1)アルゴリズム:Needleman and Wunsch, J.Mol.Biol. 48:443-453 (1970) 比較マトリックス:マッチ=+10、ミスマッチ=0 ギャップペナルティー:50 ギャップ長ペナルティー:3 これらのパラメーターはGenetics Computer Group, Madison WI.から「ギャッ
プ」プログラムとして利用できる。これらはポリヌクレオチド比較のための省略
時パラメーターである。
【0099】
ポリヌクレオチドおよびポリペプチドについての「同一性」に関する好ましい
意味は、下記(1)および(2)に示される。 (1)さらにポリヌクレオチドの具体例は、配列番号:1の対照配列に対して
少なくとも50、60、70、80、85、90、95、97または100%の
同一性を有する単離ポリヌクレオチド配列を包含し、本発明ポリヌクレオチド配
列は配列番号:1の対照配列と同一であってもよく、あるいは対照配列と比較し
てある程度の数までのヌクレオチドの変化を有していてもよい。かかる変化は、
少なくとも1個のヌクレオチドの欠失、置換(トランジションおよびトランスバ
ージョンを包含)または挿入からなる群より選択され、該変化は対照ヌクレオチ
ド配列の5’または3’末端の位置あるいはそれらの末端位置の間の位置におい
て、対照配列中のヌクレオチドにおいて個々にまたは散在して、あるいは対照配
列中の1またはそれ以上の連続した群として生じてもよい。配列番号:1中の全
ヌクレオチド数と個々の同一性パーセント値(100で割ったもの)とをかけて
、その積を配列番号:1中の全ヌクレオチド数から差し引くことによりヌクレオ
チド変化の数を決定する。これを下式により説明する: nn≦xn−(xn・y) 式中、nnはヌクレオチド変化の数であり、xnは配列番号:1中の全ヌクレ
オチド数であり、yは、95%なら0.95、97%なら0.97、100%な
ら1.00であり、・は積の演算子であり、xnとyとの整数でない積は切り捨
てにより最も近い整数とした後、xnから差し引く。配列番号:2のポリペプチ
ドをコードしているポリヌクレオチド配列の変化は、好ましくはコーディング配
列中のナンセンス、ミスセンスまたはフレームシフト変異を引き起こす可能性が
あり、それゆえ、かかる変化に随伴してポリヌクレオチドによりコードされてい
るポリペプチドが変化する。
意味は、下記(1)および(2)に示される。 (1)さらにポリヌクレオチドの具体例は、配列番号:1の対照配列に対して
少なくとも50、60、70、80、85、90、95、97または100%の
同一性を有する単離ポリヌクレオチド配列を包含し、本発明ポリヌクレオチド配
列は配列番号:1の対照配列と同一であってもよく、あるいは対照配列と比較し
てある程度の数までのヌクレオチドの変化を有していてもよい。かかる変化は、
少なくとも1個のヌクレオチドの欠失、置換(トランジションおよびトランスバ
ージョンを包含)または挿入からなる群より選択され、該変化は対照ヌクレオチ
ド配列の5’または3’末端の位置あるいはそれらの末端位置の間の位置におい
て、対照配列中のヌクレオチドにおいて個々にまたは散在して、あるいは対照配
列中の1またはそれ以上の連続した群として生じてもよい。配列番号:1中の全
ヌクレオチド数と個々の同一性パーセント値(100で割ったもの)とをかけて
、その積を配列番号:1中の全ヌクレオチド数から差し引くことによりヌクレオ
チド変化の数を決定する。これを下式により説明する: nn≦xn−(xn・y) 式中、nnはヌクレオチド変化の数であり、xnは配列番号:1中の全ヌクレ
オチド数であり、yは、95%なら0.95、97%なら0.97、100%な
ら1.00であり、・は積の演算子であり、xnとyとの整数でない積は切り捨
てにより最も近い整数とした後、xnから差し引く。配列番号:2のポリペプチ
ドをコードしているポリヌクレオチド配列の変化は、好ましくはコーディング配
列中のナンセンス、ミスセンスまたはフレームシフト変異を引き起こす可能性が
あり、それゆえ、かかる変化に随伴してポリヌクレオチドによりコードされてい
るポリペプチドが変化する。
【0100】
(2)さらにポリペプチドの具体例は、配列番号:2のポリペプチド対照配列
に対して少なくとも95、97または100%の同一性を有するポリペプチドを
含む単離ポリペプチドを包含し、該ポリペプチド配列は配列番号:2の対照配列
と同一であってもよく、あるいは対照配列と比較してある程度の数までのアミノ
酸の変化を有していてもよい。かかる変化は、少なくとも1個のアミノ酸の欠失
、置換(保存的および非保存的置換を包含)または挿入からなる群より選択され
、該変化は対照ポリペプチド配列のアミノまたはカルボキシ末端の位置あるいは
それらの末端位置の間の位置において、対照配列中のアミノ酸において個々にま
たは散在して、あるいは対照配列中の1またはそれ以上の連続した群として生じ
てもよい。配列番号:2中の全アミノ酸数と同一性を示す整数を100で割った
値とをかけて、その積を配列番号:2中の全アミノ酸数から差し引くことにより
アミノ酸変化の数を決定する。これを下式により説明する: na≦xa−(xa・y) 式中、naはアミノ酸変化数であり、xaは配列番号:2中の全アミノ酸数で
あり、yは、95%なら0.95、97%なら0.97、100%なら1.00
であり、・は積の演算子であり、xaとyとの整数でない積は切り捨てにより最
も近い整数とした後、xaから差し引く。
に対して少なくとも95、97または100%の同一性を有するポリペプチドを
含む単離ポリペプチドを包含し、該ポリペプチド配列は配列番号:2の対照配列
と同一であってもよく、あるいは対照配列と比較してある程度の数までのアミノ
酸の変化を有していてもよい。かかる変化は、少なくとも1個のアミノ酸の欠失
、置換(保存的および非保存的置換を包含)または挿入からなる群より選択され
、該変化は対照ポリペプチド配列のアミノまたはカルボキシ末端の位置あるいは
それらの末端位置の間の位置において、対照配列中のアミノ酸において個々にま
たは散在して、あるいは対照配列中の1またはそれ以上の連続した群として生じ
てもよい。配列番号:2中の全アミノ酸数と同一性を示す整数を100で割った
値とをかけて、その積を配列番号:2中の全アミノ酸数から差し引くことにより
アミノ酸変化の数を決定する。これを下式により説明する: na≦xa−(xa・y) 式中、naはアミノ酸変化数であり、xaは配列番号:2中の全アミノ酸数で
あり、yは、95%なら0.95、97%なら0.97、100%なら1.00
であり、・は積の演算子であり、xaとyとの整数でない積は切り捨てにより最
も近い整数とした後、xaから差し引く。
【0101】
「個体(複数でも可)」とは多細胞真核生物を意味し、後生動物類、哺乳動物
、ヤギ類、ウシ類、類人猿、霊長類およびヒトを包含するが、これらに限らない
。
、ヤギ類、ウシ類、類人猿、霊長類およびヒトを包含するが、これらに限らない
。
【0102】
「単離された」とは、「ヒトの手により」、その天然の状態から変えられるこ
と、すなわち、天然物の場合、その本来的な環境から変化または除去あるいは両
方されたことを意味する。例えば、生体に天然に存在するポリヌクレオチドまた
はポリペプチドは「単離された」ものではないが、その天然状態で共存する物質
から分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、本明細書で用いる
用語としての「単離された」ものである。さらには、形質転換、遺伝的操作によ
り、または他のいずれかの方法により生物に導入されているポリヌクレオチドま
たはポリペプチドは、まだ生物内にあり、その生物が生きているまたは死んでい
るとしても、「単離された」ものである。
と、すなわち、天然物の場合、その本来的な環境から変化または除去あるいは両
方されたことを意味する。例えば、生体に天然に存在するポリヌクレオチドまた
はポリペプチドは「単離された」ものではないが、その天然状態で共存する物質
から分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、本明細書で用いる
用語としての「単離された」ものである。さらには、形質転換、遺伝的操作によ
り、または他のいずれかの方法により生物に導入されているポリヌクレオチドま
たはポリペプチドは、まだ生物内にあり、その生物が生きているまたは死んでい
るとしても、「単離された」ものである。
【0103】
「生物(複数でも可)」は、(i)Streptococcus、Staphylococcus、Bordete
lla、Corynebacterium、Mycobacterium、Neisseia、Haemophilus、Actinomyces
、Streptomyces、Nocardia、Enterobacter、Yersinia、Fancisella、Pasturella
、Moraxella、Acinetobacter、Erysipelothrix、Branhamella、Actinobacillus
、Streptobacillus、Listeria、Calymmatobacterium、Brucella、Bacillus、Clo
sterdium、Treponema、Escherichia、Salmonella、Kleibsiella、Vibrio、Prote
us、Erwinia、Borrelia、Leptospira、Spirillum、Campylobacter、Shigella、L
egionella、Pseudomonas、Aeromonas、Rickettsia、Chlamydia、Borreliaおよび
Mycoplasmaである属(これらに限らない)のメンバー、ならびにグループAのSt
reptococcus、グループBのStreptococcus、グループCのStreptococcus、グル
ープDのStreptococcus、グループGのStreptococcus、Streptococcus pneumoni
ae、Streptococcus pyrogenes、Streptococcus agalactiae、Streptococcus fae
calis、Streptococcus faecium、Streptococcus durans、Neisseria gonorrheae
、Neisseria meningitidis、Staphylococcus aureus、Staphylococcus epidermi
dis、Corynebacterium diptheriae、Garnella vaginalis、Mycobacterium tuber
culosis、Mycobacterium bovis、Mycobacterium ulcerans、Mycobacterium lepr
ae、Actinomyces israelli、Listeria monocytogenes、Bordetella pretusis、B
ordetella parapretusis、Bordetella bronchiseptica、Esherichia coli、Shig
ella dysenteriae、Haemophilus influenzae、Haemophilus aegyptius、Haemoph
ilus parainfluenzae、Haemophilus ducreyi、Bordetella、Salmonella typhi、
Citrobacter freundii、Proteus mirabilis、Proteus vulgaris、Yersinia pest
is、Klebsiella pneumoniae、Serratia marcessens、Vibrio cholera、Shigella
dysenterii、Shigella flexneri、Pseudomonas aeruginosa、Franscisella tul
arensis、Brucella abortis、Bacillus anthracis、Bacillus cereus、Clostrid
ium perfringens、Clostridium tetani、Clostridium butulinum、Treponema pa
llidum、Rickettsia rickettsiiおよびChlamydia trachomitisである種またはグ
ループ(これらに限らない)のメンバーを包含する原核生物、(ii)Archaeba
cter(これに限らない)を包含する古細菌、および(iii)原生動物、真菌類
、Saccharomyces、KluveromycesまたはCandida属(これらに限らない)のメンバ
ー、およびSaccharomyces cerevisiae、Kluveromyces lactisまたはCandida alb
icans種のメンバー(これらに限らない)を包含する単細胞または糸状真核生物
を意味する。
lla、Corynebacterium、Mycobacterium、Neisseia、Haemophilus、Actinomyces
、Streptomyces、Nocardia、Enterobacter、Yersinia、Fancisella、Pasturella
、Moraxella、Acinetobacter、Erysipelothrix、Branhamella、Actinobacillus
、Streptobacillus、Listeria、Calymmatobacterium、Brucella、Bacillus、Clo
sterdium、Treponema、Escherichia、Salmonella、Kleibsiella、Vibrio、Prote
us、Erwinia、Borrelia、Leptospira、Spirillum、Campylobacter、Shigella、L
egionella、Pseudomonas、Aeromonas、Rickettsia、Chlamydia、Borreliaおよび
Mycoplasmaである属(これらに限らない)のメンバー、ならびにグループAのSt
reptococcus、グループBのStreptococcus、グループCのStreptococcus、グル
ープDのStreptococcus、グループGのStreptococcus、Streptococcus pneumoni
ae、Streptococcus pyrogenes、Streptococcus agalactiae、Streptococcus fae
calis、Streptococcus faecium、Streptococcus durans、Neisseria gonorrheae
、Neisseria meningitidis、Staphylococcus aureus、Staphylococcus epidermi
dis、Corynebacterium diptheriae、Garnella vaginalis、Mycobacterium tuber
culosis、Mycobacterium bovis、Mycobacterium ulcerans、Mycobacterium lepr
ae、Actinomyces israelli、Listeria monocytogenes、Bordetella pretusis、B
ordetella parapretusis、Bordetella bronchiseptica、Esherichia coli、Shig
ella dysenteriae、Haemophilus influenzae、Haemophilus aegyptius、Haemoph
ilus parainfluenzae、Haemophilus ducreyi、Bordetella、Salmonella typhi、
Citrobacter freundii、Proteus mirabilis、Proteus vulgaris、Yersinia pest
is、Klebsiella pneumoniae、Serratia marcessens、Vibrio cholera、Shigella
dysenterii、Shigella flexneri、Pseudomonas aeruginosa、Franscisella tul
arensis、Brucella abortis、Bacillus anthracis、Bacillus cereus、Clostrid
ium perfringens、Clostridium tetani、Clostridium butulinum、Treponema pa
llidum、Rickettsia rickettsiiおよびChlamydia trachomitisである種またはグ
ループ(これらに限らない)のメンバーを包含する原核生物、(ii)Archaeba
cter(これに限らない)を包含する古細菌、および(iii)原生動物、真菌類
、Saccharomyces、KluveromycesまたはCandida属(これらに限らない)のメンバ
ー、およびSaccharomyces cerevisiae、Kluveromyces lactisまたはCandida alb
icans種のメンバー(これらに限らない)を包含する単細胞または糸状真核生物
を意味する。
【0104】
「ポリヌクレオチド(複数でも可)」は、一般に、ポリリボヌクレオチドまた
はポリデオキシリボヌクレオチドのいずれをもいい、それらは非修飾RNAまた
はDNA、あるいは修飾RNAまたはDNAであってもよい。「ポリヌクレオチ
ド」は、単鎖および二本鎖DNA、単鎖および二本鎖領域または単鎖、二本鎖お
よび三本鎖領域の混合物であるDNA、単鎖および二本鎖RNA、単鎖および二
本鎖領域の混合物であるRNA、および単鎖またはより典型的には二本鎖または
三本鎖領域または一本鎖および二本鎖領域の混合物であってもよいDNAおよび
RNAを含むハイブリッド分子を包含するが、これに限定されない。さらに、本
明細書において用いる「ポリヌクレオチド」は、RNAまたはDNA、あるいは
RNAおよびDNAの両方からなる三本鎖領域をいう。これらの領域の鎖は同じ
分子からのものでも、異なる分子からのものでもよい。該領域は、これら分子の
一またはそれ以上のすべてを含んでもよいが、より典型的には、分子のいくつか
の領域のみを含む。三本螺旋領域の分子の一つは、しばしば、オリゴヌクレオチ
ドである。本明細書において用いる場合、「ポリヌクレオチド(複数でも可)」
なる用語はまた、一つまたはそれ以上の修飾された塩基を含有する上記DNAま
たはRNAを包含する。すなわち、安定性または他の理由で修飾された骨格を有
するDNAまたはRNAも、該用語が本明細書で意図するところの「ポリヌクレ
オチド(複数でも可)」である。さらに、イノシンなどの通常でない塩基、また
はトリチル化された塩基などの修飾塩基を含むDNAまたはRNA(2つの例だ
けを示す)も、その用語を本明細書で用いる場合のポリヌクレオチドである。多
種の修飾がDNAおよびRNAになされており、当業者に公知のように多くの有
用な目的に使用されていることが理解されよう。本明細書で用いる「ポリヌクレ
オチド」なる語は、ポリヌクレオチドのこのような化学的、酵素的または代謝的
に修飾された形態、ならびにウイルスおよび、例えば、単純型細胞および複雑型
細胞などの細胞に特徴的なDNAおよびRNAの化学的形態を包含する。「ポリ
ヌクレオチド(複数でも可)」はまた、しばしばオリゴヌクレオチド(複数でも
可)と称される比較的短いポリヌクレオチドも包含する。
はポリデオキシリボヌクレオチドのいずれをもいい、それらは非修飾RNAまた
はDNA、あるいは修飾RNAまたはDNAであってもよい。「ポリヌクレオチ
ド」は、単鎖および二本鎖DNA、単鎖および二本鎖領域または単鎖、二本鎖お
よび三本鎖領域の混合物であるDNA、単鎖および二本鎖RNA、単鎖および二
本鎖領域の混合物であるRNA、および単鎖またはより典型的には二本鎖または
三本鎖領域または一本鎖および二本鎖領域の混合物であってもよいDNAおよび
RNAを含むハイブリッド分子を包含するが、これに限定されない。さらに、本
明細書において用いる「ポリヌクレオチド」は、RNAまたはDNA、あるいは
RNAおよびDNAの両方からなる三本鎖領域をいう。これらの領域の鎖は同じ
分子からのものでも、異なる分子からのものでもよい。該領域は、これら分子の
一またはそれ以上のすべてを含んでもよいが、より典型的には、分子のいくつか
の領域のみを含む。三本螺旋領域の分子の一つは、しばしば、オリゴヌクレオチ
ドである。本明細書において用いる場合、「ポリヌクレオチド(複数でも可)」
なる用語はまた、一つまたはそれ以上の修飾された塩基を含有する上記DNAま
たはRNAを包含する。すなわち、安定性または他の理由で修飾された骨格を有
するDNAまたはRNAも、該用語が本明細書で意図するところの「ポリヌクレ
オチド(複数でも可)」である。さらに、イノシンなどの通常でない塩基、また
はトリチル化された塩基などの修飾塩基を含むDNAまたはRNA(2つの例だ
けを示す)も、その用語を本明細書で用いる場合のポリヌクレオチドである。多
種の修飾がDNAおよびRNAになされており、当業者に公知のように多くの有
用な目的に使用されていることが理解されよう。本明細書で用いる「ポリヌクレ
オチド」なる語は、ポリヌクレオチドのこのような化学的、酵素的または代謝的
に修飾された形態、ならびにウイルスおよび、例えば、単純型細胞および複雑型
細胞などの細胞に特徴的なDNAおよびRNAの化学的形態を包含する。「ポリ
ヌクレオチド(複数でも可)」はまた、しばしばオリゴヌクレオチド(複数でも
可)と称される比較的短いポリヌクレオチドも包含する。
【0105】
「ポリペプチド(複数でも可)」は、ペプチド結合または修飾ペプチド結合で
互いに結合した2つまたはそれ以上のアミノ酸を含含むいずれのペプチドまたは
蛋白をもいう。「ポリペプチド(複数でも可)」は、通常、ペプチド、オリゴペ
プチドまたはオリゴマーと称される短い鎖、および一般に蛋白と称される長い鎖
の両方をいう。ポリペプチドは、遺伝子によりコードされている20個のアミノ
酸以外のアミノ酸を含有してもよい。「ポリペプチド(複数でも可)」は、プロ
セッシングおよび他の翻訳後の修飾のごとき自然の工程、または化学修飾技法の
いずれかによって修飾されたものを有する。かかる修飾は、基本テキストにて、
およびより詳細な研究論文にて、ならびに膨大な研究文献にて詳しく記載されて
おり、それらは当業者に周知である。同じ型の修飾が、所定のポリペプチド中、
いくつかの部位で、同じまたは異なる程度にて存在してもよいことは明らかであ
ろう。また、所定のペプチドは多くの型の修飾を有していてもよい。修飾は、ペ
プチド骨格、アミノ酸側鎖、アミノまたはカルボキシル末端を含め、ポリペプチ
ドのどこででも起こりうる。修飾は、例えば、アセチル化、アシル化、ADP−
リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチ
ドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホ
スホチジルイノシトールの共有結合、交差結合、環化、ジスルフィド結合形成、
脱メチル化、共有交差結合の形成、シスチンの形成、ピログルタメートの形成、
ホルミル化、ガンマーカルボキシル化、糖鎖形成、GPIアンカー形成、ヒドロ
キシル化、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、蛋白分解的プロセッシ
ング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、糖鎖形成、脂質付加、硫酸化、グルタ
ミン酸残基のガンマーカルボキシル化、ヒドロキシル化およびADP−リボシル
化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化のごとき転移RNAにより媒介される
蛋白へのアミノ酸付加、およびユビキチネーションを包含する。例えば、PROTEI
NS−STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, 第2版,T.E.Creighton,W.H.
Freeman and Company,New York(1993)およびWold,F.,POSTTRANSLATIONA
L COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS,Posttranslational Protein Modificat
ions:Perspectives and Prospects,pgs. 1-12,B.C.Johnson編,Academic Pres
s,New York(1983);Seifterら,Meth Enzymol.(1990)182:626−646、およ
びRattanら, Protein Synthesis:Posttranslational Modifications and Aging
,Ann N.Y. Acad Sci(1992)663:48-62を参照のこと。ポリペプチドは、分枝
してもよく、分枝を伴ったまたは伴わない環状であってもよい。環状、分枝およ
び分枝環状ポリペプチドは、翻訳後の天然のプロセッシングの結果であり、同様
に全く合成的な方法で合成できる。
互いに結合した2つまたはそれ以上のアミノ酸を含含むいずれのペプチドまたは
蛋白をもいう。「ポリペプチド(複数でも可)」は、通常、ペプチド、オリゴペ
プチドまたはオリゴマーと称される短い鎖、および一般に蛋白と称される長い鎖
の両方をいう。ポリペプチドは、遺伝子によりコードされている20個のアミノ
酸以外のアミノ酸を含有してもよい。「ポリペプチド(複数でも可)」は、プロ
セッシングおよび他の翻訳後の修飾のごとき自然の工程、または化学修飾技法の
いずれかによって修飾されたものを有する。かかる修飾は、基本テキストにて、
およびより詳細な研究論文にて、ならびに膨大な研究文献にて詳しく記載されて
おり、それらは当業者に周知である。同じ型の修飾が、所定のポリペプチド中、
いくつかの部位で、同じまたは異なる程度にて存在してもよいことは明らかであ
ろう。また、所定のペプチドは多くの型の修飾を有していてもよい。修飾は、ペ
プチド骨格、アミノ酸側鎖、アミノまたはカルボキシル末端を含め、ポリペプチ
ドのどこででも起こりうる。修飾は、例えば、アセチル化、アシル化、ADP−
リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチ
ドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホ
スホチジルイノシトールの共有結合、交差結合、環化、ジスルフィド結合形成、
脱メチル化、共有交差結合の形成、シスチンの形成、ピログルタメートの形成、
ホルミル化、ガンマーカルボキシル化、糖鎖形成、GPIアンカー形成、ヒドロ
キシル化、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、蛋白分解的プロセッシ
ング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、糖鎖形成、脂質付加、硫酸化、グルタ
ミン酸残基のガンマーカルボキシル化、ヒドロキシル化およびADP−リボシル
化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化のごとき転移RNAにより媒介される
蛋白へのアミノ酸付加、およびユビキチネーションを包含する。例えば、PROTEI
NS−STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, 第2版,T.E.Creighton,W.H.
Freeman and Company,New York(1993)およびWold,F.,POSTTRANSLATIONA
L COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS,Posttranslational Protein Modificat
ions:Perspectives and Prospects,pgs. 1-12,B.C.Johnson編,Academic Pres
s,New York(1983);Seifterら,Meth Enzymol.(1990)182:626−646、およ
びRattanら, Protein Synthesis:Posttranslational Modifications and Aging
,Ann N.Y. Acad Sci(1992)663:48-62を参照のこと。ポリペプチドは、分枝
してもよく、分枝を伴ったまたは伴わない環状であってもよい。環状、分枝およ
び分枝環状ポリペプチドは、翻訳後の天然のプロセッシングの結果であり、同様
に全く合成的な方法で合成できる。
【0106】
「組み換え発現系(複数でも可)」は、本発明ポリヌクレオチドおよびポリペ
プチドの製造のために宿主細胞または宿主細胞溶解物中に導入または形質転換さ
れた発現系またはその部分または本発明ポリヌクレオチドをいう。
プチドの製造のために宿主細胞または宿主細胞溶解物中に導入または形質転換さ
れた発現系またはその部分または本発明ポリヌクレオチドをいう。
【0107】
本明細書中で使用される「変種(複数でも可)」なる語は、各々、対照標準の
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドと異なるが、本質的な特性を保持している
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドである。ポリヌクレオチドの典型的な変種
は、別の対照標準のポリヌクレオチドとヌクレオチド配列において異なっている
。変種のヌクレオチド配列における変化は、対照標準のポリヌクレオチドによっ
てコードされたポリペプチドのアミノ酸配列と変わっていてもよいし、または変
わっていなくてもよい。ヌクレオチドの変化は、後述するように、対照標準の配
列によってコードされたポリペプチドにおいて、アミノ酸置換、付加、欠失、融
合および切断をもたらしうる。ポリペプチドの典型的な変種は、別の対照標準の
ポリペプチドとはアミノ酸配列において異なっている。一般に、差異は、対照標
準のポリペプチドとその変種の配列が全体的に非常に類似しており、多くの領域
においては同一であるように限定される。変種および対照標準のポリペプチドは
、一またはそれ以上の置換、付加、欠失のいずれかの組み合わせによって、アミ
ノ酸配列において異なってもよい。置換または挿入されたアミノ酸残基は、遺伝
コードによってコードされたものであってもなくてもよい。また本発明は、本発
明の各ポリペプチドの変種、すなわち保存的アミノ酸置換により対照標準とは異
なっており、そのことにより残基が同様の特性を有する別の残基に置換されてい
るものを包含する。典型的なかかる置換は、Ala、Val、LeuおよびIl
e間;SerおよびThr間;酸性残基AspおよびGlu間;AsnおよびG
ln間;塩基性残基LysおよびArg間;あるいは芳香族残基PheおよびT
yr間のものである。数個、5〜10個、1〜5個、1〜3個、1〜2個または
1個のアミノ酸がいずれかの組み合わせで置換、欠失、または付加されている変
種が特に好ましい。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの変種は、対立遺伝子
変種のような天然に存在するものであってもよく、または天然に存在することが
知られていない変種であってもよい。ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの天
然に存在しない変種は、変異誘発法または直接合成あるいは当業者に公知の他の
組換え法によって作られてもよい。
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドと異なるが、本質的な特性を保持している
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドである。ポリヌクレオチドの典型的な変種
は、別の対照標準のポリヌクレオチドとヌクレオチド配列において異なっている
。変種のヌクレオチド配列における変化は、対照標準のポリヌクレオチドによっ
てコードされたポリペプチドのアミノ酸配列と変わっていてもよいし、または変
わっていなくてもよい。ヌクレオチドの変化は、後述するように、対照標準の配
列によってコードされたポリペプチドにおいて、アミノ酸置換、付加、欠失、融
合および切断をもたらしうる。ポリペプチドの典型的な変種は、別の対照標準の
ポリペプチドとはアミノ酸配列において異なっている。一般に、差異は、対照標
準のポリペプチドとその変種の配列が全体的に非常に類似しており、多くの領域
においては同一であるように限定される。変種および対照標準のポリペプチドは
、一またはそれ以上の置換、付加、欠失のいずれかの組み合わせによって、アミ
ノ酸配列において異なってもよい。置換または挿入されたアミノ酸残基は、遺伝
コードによってコードされたものであってもなくてもよい。また本発明は、本発
明の各ポリペプチドの変種、すなわち保存的アミノ酸置換により対照標準とは異
なっており、そのことにより残基が同様の特性を有する別の残基に置換されてい
るものを包含する。典型的なかかる置換は、Ala、Val、LeuおよびIl
e間;SerおよびThr間;酸性残基AspおよびGlu間;AsnおよびG
ln間;塩基性残基LysおよびArg間;あるいは芳香族残基PheおよびT
yr間のものである。数個、5〜10個、1〜5個、1〜3個、1〜2個または
1個のアミノ酸がいずれかの組み合わせで置換、欠失、または付加されている変
種が特に好ましい。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの変種は、対立遺伝子
変種のような天然に存在するものであってもよく、または天然に存在することが
知られていない変種であってもよい。ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの天
然に存在しない変種は、変異誘発法または直接合成あるいは当業者に公知の他の
組換え法によって作られてもよい。
【0108】
以下の実施例は、別に詳細に記載したこと以外は、当業者に周知で慣用的な標
準的な技法を用いて実施する。実施例は例示であって、本発明を限定するもので
はない。
準的な技法を用いて実施する。実施例は例示であって、本発明を限定するもので
はない。
【0109】
実施例1 株の選択、ライブラリーの製造および配列決定
表1(配列番号1または3)に示すDNA配列を有するポリヌクレオチドは、
エシェリシア・コリ中のストレプトコッカス・ニューモニアエの染色体DNAの
クローンライブラリーより得た。重複するストレプトコッカス・ニューモニアエ
DNAを含有する2個またはそれ以上のクローンからの配列データを用いて、配
列番号1の連続したDNA配列を構築した。ライブラリーは常套手段、例えば以
下の方法1および2により製造してもよい。 全細胞DNAをストレプトコッカス・ニューモニアエ0100993より、標
準法に従って単離し、以下に示す二つの方法のいずれかによりサイズ分画する。
エシェリシア・コリ中のストレプトコッカス・ニューモニアエの染色体DNAの
クローンライブラリーより得た。重複するストレプトコッカス・ニューモニアエ
DNAを含有する2個またはそれ以上のクローンからの配列データを用いて、配
列番号1の連続したDNA配列を構築した。ライブラリーは常套手段、例えば以
下の方法1および2により製造してもよい。 全細胞DNAをストレプトコッカス・ニューモニアエ0100993より、標
準法に従って単離し、以下に示す二つの方法のいずれかによりサイズ分画する。
【0110】
方法1
標準的方法に従ってサイズ分画するために、全細胞DNAをニードル(needle
)に通して機械的に剪断する。11kbpまでの大きさのDNAフラグメントを
エキソヌクレアーゼおよびDNAポリメラーゼで処理することによって末端切断
し、EcoRIリンカーを付加する。フラグメントを、EcoRIで切断したベ
クター、ラムダZapIIに連結し、標準的方法によりライブラリーをパッケー
ジングし、次いでパッケージングしたライブラリーでエシェリシア・コリを感染
させる。ライブラリーを標準方法により増幅する。
)に通して機械的に剪断する。11kbpまでの大きさのDNAフラグメントを
エキソヌクレアーゼおよびDNAポリメラーゼで処理することによって末端切断
し、EcoRIリンカーを付加する。フラグメントを、EcoRIで切断したベ
クター、ラムダZapIIに連結し、標準的方法によりライブラリーをパッケー
ジングし、次いでパッケージングしたライブラリーでエシェリシア・コリを感染
させる。ライブラリーを標準方法により増幅する。
【0111】
方法2
全細胞DNAをライブラリーベクターにクローニングするための一連のフラグ
メントを得るのに適当な1つの制限酵素(例えば、RsaI、PalI、Alu
I、Bshl235I)またはその組み合わせで部分的に加水分解し、かかるフ
ラグメントを標準的方法に従ってサイズ分画する。EcoRIリンカーをDNA
に連結し、次いでそのフラグメントをEcoRIで切断したベクター、ラムダZ
apIIに連結し、標準的方法によりライブラリーをパッケージングし、パッケ
ージングしたライブラリーでエシェリシア・コリを感染させる。ライブラリーを
標準方法により増幅する。
メントを得るのに適当な1つの制限酵素(例えば、RsaI、PalI、Alu
I、Bshl235I)またはその組み合わせで部分的に加水分解し、かかるフ
ラグメントを標準的方法に従ってサイズ分画する。EcoRIリンカーをDNA
に連結し、次いでそのフラグメントをEcoRIで切断したベクター、ラムダZ
apIIに連結し、標準的方法によりライブラリーをパッケージングし、パッケ
ージングしたライブラリーでエシェリシア・コリを感染させる。ライブラリーを
標準方法により増幅する。
【0112】
実施例2 試薬および酵素
ATAおよびその塩の形態を含むすべての試薬はAldrichから購入する。SK
F−26488−W3はEPSPSに対する高処理量スクリーニングのヒット物
として単離された。Escherichia coliのMurA (Marquardt, et al., J. Bact
eriol., Vol. 174: 5748-5752 (1992))およびStreptococcus pneumoniaeのEP
SPS (Du, et al., Eur. J. Biochem., Vol. 267: 222-227 (2000))はすでに
説明したようにして発現され精製された。
F−26488−W3はEPSPSに対する高処理量スクリーニングのヒット物
として単離された。Escherichia coliのMurA (Marquardt, et al., J. Bact
eriol., Vol. 174: 5748-5752 (1992))およびStreptococcus pneumoniaeのEP
SPS (Du, et al., Eur. J. Biochem., Vol. 267: 222-227 (2000))はすでに
説明したようにして発現され精製された。
【0113】
実施例3 反応論的アッセイ
EPSPSおよびMurAの両方に関するアッセイは無機ホスファート遊離の
検出に基づくものである。蛍光にカップリングしたアッセイをEPSPSに使用
し、それは100 mM HEPES, pH 7.0, 1 mM NH4Cl, 100 mM KCl中で行なわれた (Du
, et al., Eur. J. Biochem., Vol. 267: 222-227 (2000))。MurAは、マラ
カイトグリーン試薬を用いて50 mM HEPES, pH 7.5, 1 mM DTT中でアッセイされ
た(Lanzetta, et al., Anal. Biochem., Vol. 100: 95-97 (1979))。一方の基
質濃度を固定し、他方の基質および阻害剤の濃度を変化させてKi値を決定した
。GraFit v4.09 (Erithacus Software Ltd.)用いてデータを分析した。
検出に基づくものである。蛍光にカップリングしたアッセイをEPSPSに使用
し、それは100 mM HEPES, pH 7.0, 1 mM NH4Cl, 100 mM KCl中で行なわれた (Du
, et al., Eur. J. Biochem., Vol. 267: 222-227 (2000))。MurAは、マラ
カイトグリーン試薬を用いて50 mM HEPES, pH 7.5, 1 mM DTT中でアッセイされ
た(Lanzetta, et al., Anal. Biochem., Vol. 100: 95-97 (1979))。一方の基
質濃度を固定し、他方の基質および阻害剤の濃度を変化させてKi値を決定した
。GraFit v4.09 (Erithacus Software Ltd.)用いてデータを分析した。
【0114】
実施例4 抗細菌活性
S. pneumoniae 100993に対するATAの抗細菌活性を、Todd Hewitt培地、最
少培地、ならびに最少培地+芳香族アミノ酸(100mg/mL)およびp−安
息香酸(PABA)(0.2mg/mL)中で測定した。グリホサート、クロラ
ムフェニコールおよびシプロフロキサシンは対照であった。
少培地、ならびに最少培地+芳香族アミノ酸(100mg/mL)およびp−安
息香酸(PABA)(0.2mg/mL)中で測定した。グリホサート、クロラ
ムフェニコールおよびシプロフロキサシンは対照であった。
【配列表】
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フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考)
A61P 31/04 A61K 37/02
// C12N 15/09 C12N 15/00 A
(71)出願人 スミスクライン ビーチャム パブリック
リミテッド カンパニー
SmithKline Beecham
p.l.c.
イギリス国 ティダブリュ8 9ジーエ
ス,ミドルセックス,ブレントフォード,
グレート ウェスト ロード 980
(72)発明者 ドゥ・ウェンシェン
アメリカ合衆国06705コネチカット州ウォ
ーターベリー、ヒッチコック・ロード380
番
(72)発明者 ジャンジョン・フアン
アメリカ合衆国19473ペンシルベニア州シ
ュウェンクスビル、ベルジアン・ロード
402番
(72)発明者 ジャン・シンヘ
アメリカ合衆国19468ペンシルベニア州ロ
イヤーズフォード、パトリック・ウェイ
335番
(72)発明者 ハワード・カレンダー
アメリカ合衆国19087ペンシルベニア州ウ
ェイン、イーグル・ロード409番
(72)発明者 リン・マリー・マックロスキー
アメリカ合衆国19426ペンシルベニア州カ
レッジビル、ジャーマンタウン・パイク
3868番
(72)発明者 デイビッド・ペイン
アメリカ合衆国19460ペンシルベニア州フ
ェニックスビル、ウォーターフォール・ウ
ェイ618番
(72)発明者 シャノン・エル・リード
アメリカ合衆国19403ペンシルベニア州ノ
リスタウン、ウッドランド・アベニュー
1003番
(72)発明者 スティーブン・エフ・リッテンハウス
アメリカ合衆国19426ペンシルベニア州カ
レッジビル、シェイクスピア・ドライブ
487番
(72)発明者 ステファニー・バン・ホーン
アメリカ合衆国19464ペンシルベニア州ポ
ッツタウン、バターナット・ドライブ129
番
(72)発明者 ニコラ・ジー・ウォリス
アメリカ合衆国19087ペンシルベニア州ウ
ェイン、シュガータウン・ロード219番
Fターム(参考) 4B024 AA01 BA07 CA04 DA06 EA04
HA11
4C084 AA16 NA14 ZB352
4C206 AA01 DA19 NA14 ZB35
4H011 AA02 BA01 BB05 BB06
Claims (6)
- 【請求項1】 MurAポリペプチドを阻害する必要のある個体の治療方法
であって、(i)アウリントリカルボン酸によるEPSPSまたはMurAの阻
害、(ii)正に帯電した活性部位残基とアニオン性トリカルボキシラートとの
間の相互作用、あるいは(iii)ロゾール酸によるMurAの阻害を阻害また
は活性化する抗細菌的に有効量の化合物または組成物を個体に投与する工程を特
徴とする方法。 - 【請求項2】 細菌に感染した個体の治療方法であって、(i)アウリント
リカルボン酸によるEPSPSまたはMurAの阻害、(ii)正に帯電した活
性部位残基とアニオン性トリカルボキシラートとの間の相互作用、あるいは(i
ii)ロゾール酸によるMurAの阻害を阻害または活性化する抗細菌的に有効
量の化合物または組成物を個体に投与する工程を特徴とする方法。 - 【請求項3】 MurAポリペプチドを阻害する必要のある個体の治療方法
であって、配列番号:2または4のアミノ酸配列に対して少なくとも40%、5
0%、60%、70%、80%または90%同一であるアミノ酸配列を含むポリ
ペプチド、および配列番号:2または4に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド
からなる群より選択されるポリペプチドの活性を阻害する抗細菌的に有効量の化
合物または組成物を個体に投与する工程を特徴とし、該活性が(i)アウリント
リカルボン酸によるEPSPSまたはMurAの阻害、(ii)正に帯電した活
性部位残基とアニオン性トリカルボキシラートとの間の相互作用、あるいは(i
ii)ロゾール酸によるMurAの阻害である方法。 - 【請求項4】 細菌に感染した個体の治療方法であって、配列番号:2また
は4のアミノ酸配列に対して少なくとも40%、50%、60%、70%、80
%または90%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、および配列番号:
2または4に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドからなる群より選択されるポ
リペプチドの活性を阻害する抗細菌的に有効量の化合物または組成物を個体に投
与する工程を特徴とし、該活性が(i)アウリントリカルボン酸によるEPSP
SまたはMurAの阻害、(ii)正に帯電した活性部位残基とアニオン性トリ
カルボキシラートとの間の相互作用、あるいは(iii)ロゾール酸によるMu
rAの阻害である方法。 - 【請求項5】 MurAポリペプチドを阻害する方法であって、該ポリペプ
チドを含む化合物または組成物を、(i)アウリントリカルボン酸によるEPS
PSまたはMurAの阻害、(ii)正に帯電した活性部位残基とアニオン性ト
リカルボキシラートとの間の相互作用、あるいは(iii)ロゾール酸によるM
urAの阻害を阻害または活性化する抗細菌的に有効量の化合物または組成物と
接触させる工程を特徴とする方法。 - 【請求項6】 (i)アウリントリカルボン酸によるEPSPSまたはMu
rAの阻害、(ii)正に帯電した活性部位残基とアニオン性トリカルボキシラ
ートとの間の相互作用、あるいは(iii)ロゾール酸によるMurAの阻害を
阻害または活性化させる方法であって、細菌を含む化合物または組成物を、上記
(i)、(ii)、(iii)または(iv)の活性を阻害または活性化させる
化合物または組成物と十分な時間接触させて該細菌を殺しあるいはその増殖を遅
延させる工程を特徴とする方法。
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
PCT/US2000/014079 WO2001089303A1 (en) | 2000-05-22 | 2000-05-22 | Methods of modulating the activity of mura |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2003533546A true JP2003533546A (ja) | 2003-11-11 |
Family
ID=21741410
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Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2001585557A Withdrawn JP2003533546A (ja) | 2000-05-22 | 2000-05-22 | Mura活性をモジュレーションする方法 |
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Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP1283675A4 (ja) |
JP (1) | JP2003533546A (ja) |
WO (1) | WO2001089303A1 (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2009227952A (ja) * | 2007-07-10 | 2009-10-08 | Toray Ind Inc | 環式ポリアリーレンスルフィドの製造方法 |
JP2013518897A (ja) * | 2010-02-03 | 2013-05-23 | エムイーエイチ アソシエイツ,インコーポレイテッド | 選択的および生体活性的等配電子体としての多重置換フルオロメタン |
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---|---|---|---|---|
US5691161A (en) * | 1996-08-01 | 1997-11-25 | Eli Lilly And Company | Peptidoglycan biosynthetic mura protein from Streptococcus pneumoniae |
EP0890644A3 (en) * | 1997-07-10 | 1999-09-29 | Smithkline Beecham Corporation | MurA gene from Staphylococcus aureus encoding DP-N-Acetylglucosamine enolpyruvyl transferase |
US20050020501A1 (en) * | 2002-11-19 | 2005-01-27 | Smithkline Beecham Corporation And Smithkline Beechm P.L.C. | Methods of modulating the activity of mura |
-
2000
- 2000-05-22 WO PCT/US2000/014079 patent/WO2001089303A1/en active Application Filing
- 2000-05-22 JP JP2001585557A patent/JP2003533546A/ja not_active Withdrawn
- 2000-05-22 EP EP00936185A patent/EP1283675A4/en not_active Withdrawn
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2009227952A (ja) * | 2007-07-10 | 2009-10-08 | Toray Ind Inc | 環式ポリアリーレンスルフィドの製造方法 |
JP2013518897A (ja) * | 2010-02-03 | 2013-05-23 | エムイーエイチ アソシエイツ,インコーポレイテッド | 選択的および生体活性的等配電子体としての多重置換フルオロメタン |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2001089303A1 (en) | 2001-11-29 |
EP1283675A4 (en) | 2009-08-26 |
EP1283675A1 (en) | 2003-02-19 |
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