JP2003533445A - 熱ショックタンパク質に対するタンパク質抗原のジャベリン化 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、“ジャベリン（javelin）”として言及される分子連結を通して熱ショックタンパク質に非共有結合される多くのエピトープを含むペプチド又はタンパク質を含んで成る抗原複合体に関する。そのような複合体は、個々のエピトープが定義され、そして一定の態様においては、抗体及び細胞介在性免疫反応の両者を誘発することができることを必要としない。本発明の複合体は、感染性疾病及び悪性の疾患の処理又は予防に向けられる治療用免疫応答を誘発するために使用され得る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 序説： 本発明は、“ジャベリン（javelin）”として言及される分子連結を通して熱
ショックタンパク質に非共有結合される多くのエピトープを含むペプチド又はタ
ンパク質を含んで成る抗原複合体に関する。そのような複合体は、個々のエピト
ープが定義され、そして一定の態様においては、抗体及び細胞介在性免疫反応の
両者を誘発することができることを必要としない。本発明の複合体は、感染性疾
病及び悪性の疾患の処理又は予防に向けられる治療用免疫応答を誘発するために
使用され得る。

【０００２】 発明の背景： 熱ショックタンパク質（“hsps”）は、ストレスの多い条件、例えば温度又は
グルコース消耗の突然の上昇下で、細胞において選択的に誘発される、高く保存
される種類のタンパク質を構成する。非天然の態様において広範囲の種類のタン
パク質に結合できる場合、熱ショックタンパク質は、それらの結合されるタンパ
ク質の生成、例えばそれらの合成、折りたたみ、分解及びトランスロケーション
に関与する（Freeman and Morimoto, 1996, EMBO J. 15:2969-2979; Lindquist
and Craig, 1988, Annu. Rev. Genet. 22: 631-677; Hendrick and Hartl, 1993
, Annu. Rev. Biochem. 62: 349-384）。

【０００３】 それらは生合成経路を通して他のタンパク質を案内するので、熱ショックタン
パク質は、“分子シャペロン”（molecular chaperone）として機能すると言わ
れる（Frydmanなど., 1994, Nature 370: 111-117; Hendrick and Hartl, Annu.
Rev. Biochem. 62: 349-384, Hartl, 1996, Nature 381: 571-580）。ストレス
の間の誘発は、それらのシャペロン機能と一致し；例えば、dnaK、すなわちE．
コリksp70相同体は、熱不活性化されたRNAポリメラーゼを再活性化することがで
きる（Ziemienowiczなど., 1993, J. Biol. Chem. 268: 25425-25341）。

【０００４】 熱ショックタンパク質gp96は、アミノ末端シグナル配列によりそこに標的化さ
れ、そしてカルボキシ末端KDELアミノ酸モチーフ（Lys−Asp−Glu−Leu（配列番
号１）；小胞体再捕獲を促進する“KDEL”配列としてこの後、言及される；Sriv
astarvaなど., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3807-3811）により維持
される小胞体に存在する。ショウジョウバエ又は酵母を除く、高等真核生物に見
出される場合、gp96は、それが高度に関連する細胞質ゾル熱ショックタンパク質
hsp90をコードする遺伝子の重複により、比較的最近、開発して来たと思われる
（Li and Srivastava, 1993, EMBOJ. 12: 3143-3151; ヒトhsp90とネズミgp96と
の間の同一性は、約48％である）。

【０００５】 gp96は、小胞体における多サブユニットタンパク質のアセンブリーを助けるこ
とができる（Wiechなど., 1992, Nature 358: 169-170）。実際、gp96は、アセ
ンブリーされていない免疫グロブリン鎖、主要組織適合性クラスII分子及び単純
ヘルペスウィルスからの変異体糖タンパク質Bに関連することが観察されている
（Melnickなど., 1992, J. Biol. Chem. 267: 21303-21306; Melnickなど., 199
4, Nature 370: 373-375; Schaiffなど., 1992, J. Exp. Med. 176: 657-666; R
amakrishnanなど., 1995, DNA and Cell Biol. 14: 373-384）。さらに、gp96の
発現は、小胞体における変性されたタンパク質の蓄積をもたらす条件により誘発
される（Kozutsumiなど., 1988, Nature 332: 462-464）。gp96はATPアーゼ活性
を有するように見えるが（Li and Srivastava, 1993, EM130 j. 12: 143-3151）
、しかしこの観察は疑われている（Wearsch and Nicchitta, 1997, J. Biol. Ch
em. 272: 5152-5156）。

【０００６】 gp96とは異なって、hsp90は、小胞体における局在化に関連するシグナルペプ
チド及びKDEL配列を欠失したおり、代わりに、細胞質ゾルに存在する。hsp90は
翻訳機構の成分として検出されたことはないが（Frydmannなど., 1994, Nature
370: 111-116）、ヌクレオチド、例えばATP又はADPの不在下で、変性されたタン
パク質を、続いて、hsp70, hdj−１及びヌクレオチドの添加に基づいて再生され
得る“折りたたみ成分”に転換することにおいて非常に効果的であることが報告
されている（Freeman and Morimoto, 1996, EMBO J. 15: 2969-2979; Schneider
など., 1996, Natl. Acad. Sci. USA93: 14536-14591）。

【０００７】 hsp90は、多くの生物学的に非常に適切なタンパク質、例えばステロイドアポ
受容体、チューブリン、腫瘍チロシンキナーゼ及び細胞セリン−トレオニンキナ
ーゼにシャペロンとして作用することが観察されている（Roseなど., 1987, Bio
chemistry 26: 6587; Sanchez など., 1988, Mol. Endocrinol. 2:756-760; Miy
ata and Yahara, 1992, J. Biol. Chem. 267: 7042-7047; Doyle and Bishop, 1
993, Genes Dev. 7:633-638; Smith and Toft, 1993, Mol. Endocrinol. 7:4-11
; Xu and Lindquist, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:7074-7078; St
ancatoなど., 1993, J. Biol. Chem. 268: 21711-21716; Cuttforth and Rubin,
1994, Cell 77:1027-1035; Pratt and Welsh, 1994, Semin. Cell Biol. 5:83-
93; Wartmann and Davis, 1994, J. Biol. Chem. 269: 6685-6701; Nathan and
Lindquist, 1995, Mol. Cell Biol. 15: 3917-3925; Redmond など., 1989, Eur
. J. Cell. Biol. 50: 66-75）。

【０００８】 hsp90は、他のタンパク質と協力して機能することが観察されており、それら
のタンパク質のいくつかはシャペロンとして作用することができ、他は単にアク
セサリーとして作用し；例えばプロゲステロン受容体の細胞アセンブリーはhsp9
0及び７種の他のタンパク質を包含するが報告されている（Smithなど., 1995, M
ol. Cell. Biol. 15: 6804-6812）。

【０００９】 実験動物の腫瘍から調製された熱ショックタンパク質による接種は、腫瘍特異
的態様で免疫応答を誘発することが示されており；すなわち、特定の腫瘍から精
製された熱ショックタンパク質gp96は、同一の腫瘍起源からであるが、しかし関
連するにもかかわらず、他の腫瘍からではない細胞の増殖を阻害する免疫応答を
誘発することができた（Srivastava and Maki, 1991, Curr. Topics Microbiol.
167: 109-123)。腫瘍−特異的免疫原性の源は確認されていない。

【００１０】 熱ショックタンパク質をコードするが、腫瘍−特異的多型現象を示すことは見
出されていない（Srivastava and Udono, 1994, Curr. Opin. Immunol. 6: 728-
732）。高−分解ゲル電気泳動は、腫瘍−由来のgp96が分子レベルで不均質であ
ることを示しており；この証拠は、この不均質の源が多数存在する、熱ショック
タンパク質に付着する小ペプチドの集団であり得ることを示唆している（Feldwe
g and Srivastava, 1995, Int. J. Cancer 63: 310-314）。

【００１１】 実際、水疱性口内炎ウィルスの抗原ペプチドは、ウィルス感染された細胞にお
いてgp96と関係していることが示されている（Nielandなど.,1996, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 93: 6135-6139）。ペプチドのこの蓄積は小胞体におけるgp96
の局在化に関連し、ここでそれは、腫瘍組織適合性複合体クラスI分子に対する
ペプチド受容体及びペプチド負荷のアクセサリーとして作用することができるこ
とが示唆されている（Li and Srivastava, 1993, EMBO J. 12: 3143-3151; Suta
and Srivastava, 1995, Science 269: 15850-1588）。

【００１２】 熱ショックタンパク質は、免疫応答を刺激するためのアジュバントとして使用
されて来た（例えば、Edgington, 1995, Bio/Technol. 13: 1442-1444; Whitehe
ad Institute for Biomedical Research, Richard YoungによるPCT国際出願WO94
/29459号、及び下記文献を参照のこと）。最良に知られているアジュバントの１
つであるフロイント完全アジュバントは、ミコバクテリア（結核を引き起こす細
胞の属）に由来する熱ショックタンパク質の混合物を含み；フロイント完全アジ
ュバントは、非ミコバクテリア抗原に対して免疫応答を追加免疫化するために長
年使用されて来た。

【００１３】 多くの文献は、中でも、類似する目的、例えば結核自体に対するワクチン化の
ためへの単離されたマイコバクテリア熱ショックタンパク質の使用を提案してい
る（lukacs など., 1993, J. Exp. Med. 178: 343-348; Lowriteなど., 1994, V
accine 12: 1537-1540; Silva and Lowrite, 1994, Immunology 82: 248; Lowri
eなど., 1995, J. Cell. Biochem. Suppl. 0(19b):220; Refzlaffなど., 1994,
Infect. Immun. 62: 5689-5693; Medical Research Council, Colstonなど., に
よるPCT国際出願番号WO94/11513号；Biocine Sclavo Spa, RappuoliなどによるP
CT国際出願番号WO93/1771号）。

【００１４】 他の文献は、従来のアジュバント活性よりもむしろ、抗原性ペプチドとの会合
を天然において形成する熱ショックタンパク質の能力に集中している（例えば、
Sloan−Kettering Institute for Cancer Research, RothmanなどによるPCT国際
出願番号PCT/US96/13233号；Blachere and Srivastava, 1995, Seminars in Can
cer Biology 6: 349-355; Mount Sinai School of Medicine of the City Unive
rsity of New York, SrivastavaなどによるPCT国際出願番号95/24923号を参照の
こと）。

【００１５】 フェースIヨーロッパ臨床試験においてSrivastavaにより使用される１つのプ
ロトコールにおいては、手術により切断された腫瘍から調製された細胞が、gp96
を調製するために使用され、これは次に、同じ患者中に再接種される（Edgingto
n, 1995, Bio/Technol. 13: 1442-1444）。新規gp96調製物が個々の患者のため
に製造されるべきである事実は、有意な欠点である。PCT国際出願番号95/24923
号（前記）は、熱ショックタンパク質複合体におけるペプチドが単離され、そし
て次に、熱ショックタンパク質複合体中にインビトロで再び導入され得ることを
示唆する。

【００１６】 この時間のかかる方法は、熱ショックタンパク質が由来する患者の処理以上に
好結果をもたらす証拠は存在しない。さらに、有効量の熱ショックタンパク質の
調製は、あらゆる患者が供給することができるとは限らないが、患者からの多量
の組織の収穫を必要とする。さらに、このアプローチは、天然の会合がインビボ
で形成されるそれらのペプチドへのペプチドキャリヤーとしての熱ショックタン
パク質の使用を限定し、そして熱ショックタンパク質に対するそのようなペプチ
ドの親和性は、インビトロで生成される複合体を用いて、所望する免疫応答を生
成するためには不適切である。

【００１７】 熱ショックタンパク質及び分子シャペロンの免疫可能性は明確に示されており
（Schild H. など., Current Pronion in Immunology (1999) 11:109-113により
再考される）、それにより、hspsはMHCクラスI又はクラスII分子上での続く表示
のために、結合された抗原を、抗原提供細胞に供給すると思われるが（それによ
り、T細胞応答を生成する）、多くの抗原は、十分に供給されるそれらのための
熱ショックタンパク質又は分子シャペロンに、十分には結合されない。

【００１８】 この制限を回避する試みにおいては、熱ショックタンパク質が、選択の抗原性
ペプチドに供給されている。例えば、グルタルアルデビ−固定されたマイコバク
テリア熱ショックタンパク質hsp60又はhsp70に化学的に架橋されるNANP（Asn Al
a Asn Pro; 配列番号２）マラリア抗原の複数反復体を含んで成る合成ペプチド
は、追加のアジュバントの不在下でマウスにおける体液性（抗体に基づく）免疫
応答を誘発でき；類似する効果が細菌E．コリからの熱ショックタンパク質を用
いて観察されたことが報告されている（Del Guidice, 1994, Experientia 50: 1
061-1066; Barriosなど., 1994, Clin. Exp. Immunol. 98: 224-228; Barriosな
ど., 1992, Eur. J. Immunol. 22: 1365-1372）。

【００１９】 熱ショックタンパク質への合成ペプチドの架橋及びたぶんグルタルアルデヒド
固定化が抗体誘発のために必要とされ（Barriosなど., 1994, Clin. Exp. Immun
ol. 93: 229-233）、そして細胞免疫性は誘発されるとは思われない。もう1つの
例においては、PCT国際出願番号WO94/29459号（Youngなど）は、抗原性タンパク
質が熱ショックタンパク質に連結される融合タンパク質を開示する。

【００２０】 そのような共有結合アプローチの可能性ある欠点は、それらが細胞性免疫応答
よりもむしろ、抗体に基づく免疫応答を好む傾向があることである。そのような
場合、熱ショックタンパク質は、共有結合されるタンパク質又はペプチドに対す
る抗体応答、すなわち免疫原性タンパク質の良く知られたアジュバント機能を促
進するためにキャリヤーとして作用することができる。さらに、熱ショックタン
パク質及び抗原は付加逆的に連結され；これは、いずれかのタンパク質成分の溶
解性を変更し、又は抗原と決定的主要組織適合性複合体成分との間の会合を妨げ
る構造的ゆがみを創造することができる。

【００２１】 共有結合に関する他のアプローチとして、抗原性タンパク質は、生理学的条件
下で熱ショックタンパク質に結合する分子連結を通して、熱ショックタンパク質
に非共有結合された。この連結は、本明細書において“ジャベリン”と言及され
、そして熱ショックタンパク質と抗原性タンパク質又はペプチドとを複合体化す
る方法が“ジャベリン化”（javelinization）として言及される。

【００２２】 “ジャベリン化”の有用性の例は、次の通りである。熱ショックタンパク質hs
p70は、結合されるペプチド抗原を、MHCクラスI分子上でのそれらの表示のため
に抗原提供細胞に供給することにおいて、効果的であることが示される。hsp70
結合抗原によるマウスの免疫化は、選択された抗原に対する強い細胞免疫応答の
生成をもたらした。しかしながら、インビトロ実験は、多くの最適なMHCクラスI
結合がhsp70に十分に結合しないことを示している。

【００２３】 Hsp70へのそのような抗原性ペプチドの結合を最適化する試みにおいては、最
適化されたhsp70結合ペプチド（配列Hy-x-Hy-x-Hy-x-Hy（ここで、Hyは疎水性ア
ミノ酸に対応し、そしてxはいずれかのアミノ酸、及びより特定には、His Trp A
sp Phe Ala Trp Pro Trpに応答する）を有する“ジャベリン”；配列番号３）、
リンカー（配列GSGを有する）及び選択の抗原性ペプチドを含むよう構築された
ハイブリッドペプチドが合成された。

【００２４】 そのようなペプチドはhsp70に良く結合し、そしてマウスがhsp70に結合される
それらのペプチドにより免疫化される場合、生成される細胞免疫応答は、hsp70
に結合される、非ジャベリン化バージョンの抗原性ペプチドによる免疫から得ら
れたそれらの免疫応答よりも有意に高められた（国際特許出願番号PCT/US96/133
63号及びMori Y.など., (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. 97: 3485-90）。

【００２５】 しかしながら、製品開発観点から、短いペプチド抗原のジャベリン化は、使用
する特定の抗原の知識により制限される。さらに、疾病細胞又は病原体を排除す
るのに十分な強さの免疫性を誘発するために、又は種々の個人は、それらの主要
組織適合性表現型により、特定の抗原に対して、多かれ少なかれ、応答できるの
で、１よりも多くの抗原性ペプチドに対する免疫応答を生成することが、治療目
的のために所望される。

【００２６】 発明の要約： 本発明は、ジャベリン配列を通して熱ショックタンパク質に非共有結合される
多くのエピトープを含んで成る抗原性複合体を提供する。前記多くのエピトープ
は、任意には、リンカー配列を通して、ジャベリンに共有結合される。ある態様
においては、エピトープは、大きなタンパク質に包含され、そして天然において
、前記タンパク質の情況下で存在することができる。タンパク質内の特定のエピ
トープの特徴化は、本発明を実施するためには必要とされない。他の態様におい
ては、天然において一緒に存在しないエピトープは、任意には、リンカー配列を
通して単一のジャベリンに結合され、それにより、抗原性複合体における熱ショ
ックタンパク質により非共有結合される場合、対象において治療免疫応答を生成
するために使用され得る高原カクテルを提供する。

【００２７】 従って、本発明は、従来技術の多くの制限を克服する。例えば、T細胞エピト
ープ（MHCクラスI結合ペプチド）の特定の知識が必要とされ、そして特定の生成
物は、大きなタンパク質が、種々のHLA型に結合できる多くのT細胞エピトープを
含む場合、一定のHLAハプロタイプを有する患者に制限されない。さらに、その
同じタンパク質は、ヘルパーT細胞応答及び抗体応答を生成するために抗原提供
細胞によりプロセッシングされ得るMHCクラスIIエピトープを含むことができる
。本発明のさらにもう１つの利点は、ジャベリンがタンパク質を細胞に供給し、
MHC成分へのペプチドの結合をもたらし、そして結合されるペプチドが溶解され
、そして配列決定され得ることにおいて、MHCクラスI又はクラスIIのいずれかに
制限される抗原を同定するために使用され得ることである。

【００２８】 発明の特定の記載： 本発明は、ジャベリン配列を通して熱ショックタンパク質に非共有結合される
多くのエピトープを含んで成る抗原複合体を提供する。前記多くのエピトープは
、任意には、リンカー配列を通して、ジャベリンに共有結合される。

【００２９】 第１組の態様（図１A及び１B）においては、本発明は、熱ショックタンパク質
のための親和性を有する連結分子（“ジャベリン”）により熱ショックタンパク
質に非共有結合される、多くのエピトープを含んで成る抗原性複合体を供給し、
ここで前記エピトープは、前記連結ペプチドに共有結合され、そして前記エピロ
ープは単一の抗原タンパク質に起因する。前記エピトープは、タンパク質に包含
され（図１A）、又は単離されたペプチドに包含され（図１B）、そして共有結合
であるか又は１又は複数の原子を含んで成る化学的リンカー（例えば、ペプチド
結合又はペプチドリンカー）を通してジャベリンに連結される。

【００３０】 第２組の態様においては、本発明は、熱ショックタンパク質のための親和性を
有する連結分子（“ジャベリン”）により熱ショックタンパク質に非共有結合さ
れる、多くのエピトープを含んで成る抗原性複合体を供給し、ここで前記エピト
ープは、前記連結ペプチドに共有結合され、そして前記エピロープは１よりも多
くの抗原タンパク質に起因する。前記エピトープは、タンパク質に包含され（図
１C）、又は単離されたペプチドに包含され（図１D）、そして共有結合であるか
又は１又は複数の原子を含んで成る化学的リンカー（例えば、ペプチド結合又は
ペプチドリンカー）を通してジャベリンに連結される。

【００３１】 第２組の態様においては、本発明は、生理学的条件下で熱ショックタンパク質
に対する親和性を有する連結分子（“ジャベリン”）により、熱ショックタンパ
ク質に非共有結合される多くのエピトープを含んで成る抗原複合体を提供し、こ
こで前記エピトープが前記連結分子に共有結合され、そして１つのエピトープが
クラスIエピトープであり、そして他のエピトープがクラスIIエピトープである
。例えば、図１A及び１Bにおいては、空白の四角は、クラスIエピトープを表し
、そして空白の丸はクラスIIエピトープであり、そして図１C及び１Dにおいては
、空白の丸はクラスIエピトープを表し、そして斜線のドーナツ形のものはクラ
スIIエピトープを表す（しかしながら、代表的なエピトープのMHC制限はこの第
３組の態様についての説明により単に特定され、そしてすべての態様に必ずしも
適用されないことが理解されるべきである）。

【００３２】 第４組の態様においては、本発明は、多くの連結分子（“ジャベリン”）によ
り熱ショックタンパク質に非共有結合される、抗原ペプチドに含まれるような、
１又は複数のエピトープを含んで成る抗原複合体を提供し、ここで前記エピトー
プ又はエピトープ類は前記連結分子に共有結合。前記ジャベリンは、同じか又は
異なった化学的構造を有することができる（例えば、異なったペプチド配列を有
することができる）。

【００３３】 本明細書において使用される場合、用語“熱ショックタンパク質”又は“hsp
”とは、ペプチド又はタンパク質を結合する能力を有し、そしてその細胞内濃度
は、細胞がストレスを受ける場合、上昇する（すなわち、“誘発性”である）い
ずれかのタンパク質、例えばそのようなタンパク質の非発性相同体を言及する。
熱ショックタンパク質の例は、次のものを包含するが、但しそれらだけには限定
されない：gp96 (grp94), hsp90, BiP, hsp70, hsp60, hsp40, hsc70, カルネキ
シン、カルレチキュリン及びhsp10。本発明への使用のための熱ショックタンパ
ク質は、天然源から調製され、組換え的に発現され、又は化学的に合成される。

【００３４】 用語“ジャベリン”とは、本明細書において使用される場合、生理学的条件下
で熱ショックタンパク質に非共有結合するペプチド又は非ペプチド配列を言及す
る。例えば、生理学的条件は、次のものを包含するが、但しそれらだけには限定
されない：４−55℃の温度及び好ましくは20−40℃；３−12のpH、及び好ましく
は５−８のpH；及び50−300mMのNaClのイオン濃度及び好ましくは100−200mMのN
aClのイオン濃度。生理学的条件の特定の非制限的例は、37℃でのリン酸緩衝溶
液（13mMのNaH₂PO₄, 137m MのNaCl, pH7.4）を包含する。

【００３５】 そのようなジャベリンは、実質的な割合の疎水性アミノ酸、例えばフェニルア
ラニン及びトリプトファン、及び/又は実質的な数のセリン、トレオニン、又は
プロリン残基を含んで成るアミノ酸組成物を有することができる。特に、非制限
的態様においては、本発明のジャベリンは、疎水性−x−疎水性−x−疎水性−x
−疎水性を有するアミノ酸を含んで成り、ここで“疎水性”とは疎水性アミノ酸
を示し、そしてxはいずれかのアミノ酸を示し；より特定には、そのようなジャ
ベリンは、配列疎水性−塩基性−疎水性−疎水性−疎水性；Ser/Thr−疎水性−
疎水性−Ser/Thr; Ser/Thr−Ser/Thr−疎水性−疎水性−Ser/Thr−Ser/Thr; 及
びSer/Thr−Ser/Thr−疎水性−疎水性−疎水性を有することができる。

【００３６】 他方では、ジャベリンは、次のものを含んで成る：Blond−Elguindiなど., 19
93, Cell75: 717-728に記載さえるような熱ショック結合ペプチド、例えばコン
センサス配列、疎水性−（Trp/X）−疎水性−X−疎水性−X−疎水性及び特異的
なペプチド, His Trp Asp Phe Ala Trp Pro Trp (配列番号３) 及びPhe Trp Gly
Leu Trp Pro Trp Glu (配列番号８)；Augerなど., 1996, Nature Med. 2:306-3
10, 例えばGlu Lys Arg Ala Ala (配列番号９)及びArg Arg Arg Ala Ala (配列
番号10)；Flynnなど.,1989, Science 245: 385-390; Gragerovなど., 1994, J.
Mol. Biol. 235: 848-854; Terleckyなど., 1992, J. Biol. Chem. 267: 9202-9
202, Lys Phe Glu Arg Gln (配列番号11)；及びNielandなど., 1996, Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA 93: 6135-6139, VSV8ペプチド、Arg Gly Tyr Val Tyr Gln G
ly Leu (配列番号12)。好ましい態様においては、本発明のジャベリンは、４−5
0固のアミノ酸残基、及びより好ましくは、７−20個のアミノ酸残基を有するこ
とができる。

【００３７】 エピトープは、免疫応答が高められる分子又は分子の領域（細胞性及び/又は
抗体）として定義される。ペプチドエピトープの場合、エピトープは、６〜20個
のアミノ酸の範囲のサイズのMHCクラスI結合ペプチド又はMHCクラスII結合ペプ
チドを構成する。本発明のエピトープは、ウィルスタンパク質、細菌タンパク質
、原生動物タンパク質、菌類タンパク質、寄生体由来のタンパク質、細胞内病原
体由来のタンパク質、及び疾病細胞、例えば悪性組成物由来のそれらの細胞由来
のタンパク質に由来することができる。本発明によれば、エピトープは同定され
るか又は特徴づけられる必要はなく；その機能の存在のみが必要とされる。従っ
て、例えば制限的でないが、エピトープが誘発する免疫応答により多くのエピト
ープを含んでいることが知られているタンパク質は、ペプチド配列又はそれらの
エピトープの他の特徴が知られているかどうかにかかわらず、本発明に従ってジ
ャベリン化され得る。

【００３８】 多くの前記エピトープは、任意にはリンカー配列を通してジャベリンに共有結
合される、より大きなタンパク質に包含され得る。大きな分子（例えば、大きな
ペプチド）に包含され得るエピトープは、連続的にジャベリン化するために共有
結合され得る（すなわち、線状ペプチド分子の一部として）、又はいくつかのエ
ピトープは並行してジャベリングに連結され得る（すなわち、アミノ酸側鎖を通
して）。前記多くのエピトープは、同じタンパク質に天然においては存在するこ
とができ、又は異なったタンパク質に存在することができる。例えば、ウィルス
の多くの遺伝的変異体に由来するタンパク質のエピトープは、ジャベリンに連結
され、そして本発明の熱ショックタンパク質複合体中に組み込まれ得る。

【００３９】 特に、本発明の非制限的態様においては、多くのエピトープを含んで成るタン
パク質抗原は、20個よりも多くのアミノ酸を有することができ、そして１又は複
数の天然又は異常MHCクラスI及び/又はMHCクラスII結合ペプチドを有することが
でき、そして抗体認識部位（但し、それだけには制限されない）を包含するいず
れかの追加の免疫原配列を組み込むことができる。そのようなタンパク質は、天
然に存在するタンパク質を構成することができ、又はそれはMHCクラスI及び/又
はMHCクラスII結合ペプチドの１又は複数のコピーを含むよう生成された合成タ
ンパク質を構成することができた。

【００４０】 エピトープのジャベリン化は、多くの手段により実施され得る。例えば、制限
的ではないが、ジャベリンは、１又は複数のエピトープに化学的に又は光化学的
に架橋され得るか、又は遺伝子工学技法により生成され得る。 １又は複数のエピトープを含んで成る分子は、本明細書においては、ジャベリ
ンに連結される“抗原”として言及される。

【００４１】 ジャベリンと抗原との間に、リンカー分子が使用され得る。このリンカーがペ
プチドである場合、それは１〜10個のアミン酸配列（但し、それだけには限定さ
れない）に対応することができる。そのようなリンカーは、次の配列を有するが
、但し、それらだけには限定されない：GSG、GGSGG（配列番号13）、GGPGG（配
列番号14）、SGPGS（配列番号15）。

【００４２】 抗原は、１又は複数のジャベリンに結合され得る（上記のいずれかの方法によ
り）。ジャベリンは、抗原表面上のいずれかの点で配置され得る。ペプチド抗原
及びペプチドジャベリンの場合、ジャベリンは、タンパク質のアミノ末端又はタ
ンパク質のカルボキシル末端で存在することができ、又は１又は複数のジャベリ
ンは、タンパク質抗原のアミノ酸配列又は上記のもののいずれかの組合せ内のい
ずれかの点で導入され得る。

【００４３】 ジャベリン化された抗原とhsps及び/又は分子シャペロンとの間の複合体は、
多くの方法により生成され得る。ジャベリン化された抗原は、hsps及び/又は分
子シャペロンに、種々のモル比、例えば0.01：１〜100：１、より好ましくは0.1
：１〜10：１のモル比（但し、それらだけには限定されない）で混合され得る。
それらの混合物は、pH4.9〜pH9の範囲、及びより好ましくはpH5.5〜pH8の範囲で
緩衝される水溶液において製造される。

【００４４】 緩衝化合物は、トリス塩基、リン酸基材の緩衝液、炭酸水素塩基材の緩衝液、
琥珀酸塩基材の緩衝液を包含するが、但しそれらだけには限定されない。それら
の緩衝化合物の濃度は、1mM〜500mM、及びより好ましくは10mM〜200mMの範囲で
あるが、但しそれらだけには限定されない。塩はまた、その溶液に添加され得る
。それらの塩は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化アンモニウム、硫酸アン
モニウム、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム、酢酸カルウム、酢酸ナトリウ
ムを包含するが、但しそれらだけには限定されない。それらの塩の濃度は、1mM
〜500mM、より好ましくは20mM〜200mMの範囲であるが、但しそれらだけには限定
されない。

【００４５】 ジャベリン化された抗原とhsps及び/又は分子シャペロンとの間の複合体の形
成はまた、その複合体形成溶液への１又は複数の塩の添加も包含することができ
る。塩として必ずしも言及されないが、他の化合物もまた、複合体形成溶液に包
含される。そのような化合物は、アデノシン5’−ニリン酸（ADP）及びその類似
体、アデノシン5’−三リン酸（ATP）及びその類似体、及びDMSOを包含するが、
但しそれらだけには限定されない。そのような化合物は、0.001mM〜500mM、より
好ましくは0.1mM〜100mMの範囲の濃度で添加され得るが、但しそれらの濃度だけ
には限定されない。

【００４６】 複合体形成溶液の例は次の通りであるが、但しそれらだけには限定されない：
次のものを含んで成る緩衝液中、0.25mg/mlのhsp及び0.25mg/mlでのジャベリン
化された抗原ペプチド：25mMのトリス、pH8.0, 50mMのNaCl, 50mMのMgCl₂、6.7m
Mの酢酸塩、1mMのADP、0.26mMのKCl, 0.518mMのNa₂HPO₄，0.173mMのKH₂PO₄、１
％の濃度の最終DMSO。 次に、複合体形成反応は、４〜65℃、より好ましくは20〜55℃（但し、それら
だけには限定されない）の範囲の温度でインキュベートされるべきである。この
インキュベーションは、１分〜４時間、より好ましくは20分〜１時間の期間（但
し、それらだけには限定されない）、行なわれるであろう。

【００４７】 hspに結合される、ジャベリン化された抗原の免疫化は、種々の手段で行なわ
れ得る。免疫化は、熱ショックタンパク質に結合される単一のジャベリン化され
た抗原を用いて行われ得るか、又は多くのジャベリン化された抗原は熱ショック
タンパク質に結合され得る。他方では、単一のジャベリン化された抗原が多くの
熱ショックタンパク質に結合されるか、又は多くのジャベリン化された抗原が多
くの熱ショックタンパク質に結合され得る。

【００４８】 さらに、１又は複数の抗原が種々にジャベリン化され、そして単一又は多数の
熱ショックタンパク質に結合され得る。免疫化は、経皮内注射、皮下注射、腹膜
内注射及び筋肉内注射を包含する方法により行なわれ得るが、但しそれらだけに
は限定されない。免疫化はまた、熱ショックタンパク質又は分子シャペロンに結
合される、ジャベリン化された抗原による、患者由来の抗原提供細胞のインビト
ロ処理、前記抗原提供細胞の患者中への続く再投与を包含することができる。

【００４９】 熱ショックタンパク質に結合される、ジャベリン化された抗原の投与は、キラ
ーT細胞応答又はヘルパーT細胞応答又は抗体応答のいずれかを誘発することがで
きる。より好ましくは、そのような投与は、ヘルパーT細胞及びキラーT細胞応答
の両者、又はヘルパーT細胞及び抗体応答の両者、又はキラーT細胞応答及び及び
抗体応答の両者を誘発するであろう。さらにより好ましくは、そのような投与は
、キラーT細胞応答、ヘルパーT細胞応答及び抗体応答を誘発するであろう。

【００５０】 ジャベリン化された抗原の例は次のものを包含するが、但しそれらだけには限
定されない： １又は２種のジャベリンを含むオボアルブミン由来のMHCクラスIペプチド抗原
、例えば、

【００５１】

【化１】

【００５２】 １又は２種のジャベリンを含むオボアルブミン由来のMHCクラスIIペプチド抗
原、例えば

【化２】

【００５３】 １又は２種のジャベリンを含む単純ヘルペスウィルス由来のMHCクラスIペプチ
ド抗原、例えば

【化３】 本発明によれば、同じ単純ヘルペスウィルスタンパク質又は異なったタンパク
質に起因する、第２エピトープ−含有ペプチド又は多くのエピトープ−含有ペプ
チドは、配列番号22−24のペプチドにおけるジャベリン分子に結合され得る；

【００５４】 １又は複数のジャベリンを含むgp100由来のMHCクラスI変異体ペプチド抗原、
例えば

【化４】

【００５５】 本発明によれば、同じgp100タンパク質又は異なったタンパク質に起因する、
第２エピトープ−含有ペプチド又は多くのエピトープ−含有ペプチドは、配列番
号25−27のペプチドにおけるジャバリン分子に結合され得；及び リンカーGSGを伴なって、又はそれを伴なわないで、MHCクラスI及びMHCクラス
IIエピトープ及び１つのジャベリンを含む、オボアルブミン由来のタンパク質ド
メイン、例えば、

【００５６】

【化５】

【００５７】 ここでMHCクラスエピトープは一本の下線が引かれ、MHCクラスIIエピトープは
二本の下線が引かれ、ジャベリン配列は太字で書かれ、そしてリンか−はイタリ
ック形で書かれている。

【００５８】実施例１．クラスI及びクラススIIエピトープの両者を含むオボアルブミンのジ
ャベリン化されたタンパク質を用いての保護免疫応答の誘発 良好なCTL応答は、ネズミが、hsp70に結合されるジャベリン化されたバーショ
ンのSIINFEKL (配列番号５；オボアルブミンタンパク質における残基257−264に
位置するペプチド) により免疫化される場合に生成されている（PCT/US96/13363
号、及びMoroi，Y. など., (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. 97: 3485-90を参照
のこと）。従って、本明細書に記載される実験においては、オボアルブミンシス
テムが、大きなタンパク質のジャベリン化を試験するために使用された。オボア
ルブミンは、ジスルフィド結合された分子として分泌される386個のアミノ酸を
有する約42.9kDのタンパク質である。従って、E．コリにおいてのタンパク質を
発現することは非常に便利ではない。

【００５９】 さらに、発現されたオボアルブミンの可溶性ドメイン又はフラグメントの文献
レポートに存在していない。従って、それらの実験においては、本発明者のジャ
ベリン化研究からのSIINFEKL（配列番号５）エピトープ、及び残基265−280に対
応するMHCクラスIIペプチドTEWTSSNVMEERKIKV（配列番号６）を含む、オボアル
ブミンの小さな92個のアミノ酸（アミノ酸200−291）が使用された（Maecker H.
T. など., (1998) J. Immunol. 161: 6532-6）。オボアルブミンのタンパク質
配列は、図２に示されている。

【００６０】 太字のアミノ酸は、ドメイン200−291のそれらのアミノ酸に対応する。MHCク
ラスIエピトープSIINFEKL（配列番号５）は下線が引かれており、そしてMHCクラ
スIIエピトープTEWTSSNVMEERKIKV（配列番号６）は二重下線が引かれている。こ
のドメインは、それがMHCクラスI及びIIエピトープの両者を含む事実に基づいて
選択されるが、しかしまた、構造的に、ドメインは比較的小型であると思われる
。このドメインの比較的小型の性質は、作業を用意にすることができる（すなわ
ち、ドメインは、比較的安定性であり、そして低濃度でさえ、タンパク質加水分
解又は急速な凝集に対してほとんど敏感ではない）。完全なオボアルブミンタン
パク質におけるこのドメインの構造は、図３に示される。

【００６１】 ジャベリン化されたオボアルブミンドメインの構造 オボアルブミンmRNAのヌクレオチド配列は図４に示される。ATG開始コドンは
、終結コドンと同じように、太字で示されている。OVA200−291ドメインをコー
ドする配列の5’及び3’領域は下線が引かれている。配向に関しては、5’配列G
TGACTGAG（配列番号34）の最初の９個の塩基はV−T−Eをコードし、そして3’配
列GAAAAATAC（配列番号35）の最後の９個の塩基はE−K−Yをコードする。

【００６２】 次のオリゴヌクレオチドを合成した： 5’AACCCCATGGTGACTGAGCAAGAAAGC3’（配列番号36）； 5’GCAAGGATCCTTAGTATTTTTCCTCC3’（配列番号37）； 5’GGAATTCCATATGCACTGGGACTTCGCGTGGCCGTGGGTGACTGAGCAAGAAAGCAA3’（配列
番号38）；及び 5’GGAGGATCCTTACCACGGCCACGCGAAGTCCCAGTGGTATTTTTCCTCCATCTTCATGCGA3’（
配列番号39）。

【００６３】 それらのオリゴヌクレオチドは次の特徴を有する： １．NcoI部位（CCATGG；配列番号40）、オボアルブミン配列をまっすぐに読み
取る開始コドン（ATG）をコードする前方向オリゴ（すなわち、塩基は付加され
るジャベリンをコードしない）； ２．BamHI部位（GGATCC；配列番号41）、オボアルブミン配列のすぐ後の停止
コドン（TTA）をコードする逆方向オリゴ（これは、逆相補的オリゴヌクレオチ
ドであることを忘れずに）；

【００６４】 ３．NdeI部位（CATATG；配列番号42）、開始コドン（ATG）、ジャベリンの配
列をコードする24個の塩基（CACTGGGACTTCGCGTGGCCGTGG; 配列番号43）、続くオ
ボアルブミン配列をコードする前方向オリゴ；及び ４．BamHI部位（GGATCC；配列番号44）、ジャベリン配列をコードする配列（C CACGGCCACGCGAAGTCCCAGTG ; 配列番号45）、続いて停止コドン（TTA）をコードす
る逆方向オリゴ、これは、オボアルブミン配列のすぐ後に存在する（これは、逆
相補的オリゴヌクレオチドであることを忘れずに）。

【００６５】 従って、それらのオリゴは、ポリメラーゼ鎖反応を用いて、下記に対応する配
列を生成するために使用された： Ova200−291（ジャベリン化なし）； ジャベリン−Ova200−291（5’末端での１つのジャベリンコード配列）； Ova200−291−ジャベリン（3’末端での１つのジャベリンコード配列）； ジャベリン−Ova200−291−ジャベリン（5’及び3’末端の両端でのジャベリ
ンコード配列）。

【００６６】 続いて、それらの配列を、pETベクター中にクローン化した。Ova200−291及び
Ova200−291−ジャベリンに対応する配列を、制限酵素NcoI及びBamHIにより、そ
れらの酵素製造者（New England Biolabs）の説明書に従って切断し、そしてpET
28（同様に切断されている）中にクローン化した。ジャベリン−Ova及びジャベ
リン−Ova−ジャベリンに対応する配列を、NdeI及びBamHIにより、それらの製造
業者の説明書に従って切断し、そしてpET27（同じ酵素により切断されている）
中にクローン化した。連結されたベクターを用いて、E．コリ細胞系HMS174を形
質転換した。得られるベクターを配列決定し、突然変異が操作の結果として導入
されていないことを確かめた。すべて配列は正しかった。

【００６７】 Ova200−291、ジャベリン−Ova200−291、Ova200−291−ジャベリン及びジャ
ベリン−Ova200−291−ジャベリンの発現及び精製 この方法は、それらのすべてのタンパク質の発現及び精製に関して同一である
。興味あるベクターを含むHMS174のコロニーを採取し、そして30g/mlのカナマイ
シンにより補充されたLB培地において増殖する。一晩の培養の後、細胞を回転沈
降せしめ、そして5mlの新しいLB培地に再懸濁する。次に、その再懸濁された細
胞1mlを用いて、30g/mlのカナマイシンにより補充されたLB培地ILを接種する。
細胞を、600nmでの光学密度が0.4−0.8、好ましくは0.6になるまで、37℃で増殖
する。この点で、培養物を、1mMの最終濃度でIPTGにより補充する。培養物をさ
らに３時間、培養し、そして細胞を回転沈降する。細胞ベレットを、この点で凍
結貯蔵することができる。

【００６８】 タンパク質はすべて、封入体に見出される。従って、封入体調製を行う。Nova
genにより市販されている細胞溶解試薬Bugbuster^TM を、製造業者の推薦に従っ
て使用する。手短には、細胞ペースト（ペレット）1g当たり5mlのBugbuster^TM
試薬を用いて、前記ペレットを再懸濁する。25単位のベンゾナーゼ（Novagen）
を、添加されるBugbuster^TM 1mlごとに添加する。細胞を、軽く回転しながら、
室温で10〜20分間インキュベートする。その懸濁液を、16000xg及び4℃で20分間
、回転せしめ、そしてペレットを維持する。

【００６９】 次に、ペレットを、元の細胞ペレットと同じ体積のBugbuster^TM に再懸濁する
。リゾチームを添加し、200g/mlにし、サンプルをかきまぜ、そしてさらに５分
間インキュベートする。次に、１：10倍に希釈されたBugbuster^TM ６体積を添加
し、そしてその懸濁液をもう１度、再びかき混ぜる。ペレットを、もう１度、遠
心分離により収穫する（上記のようにして）。次に、ペレットを、培養物IL当た
り20〜30mlの１：10倍に希釈されたBugbuster^TM に再懸濁する。

【００７０】 その懸濁液をかきまぜ、回転せしめ、そしてペレット洗浄をさらに２度、反復
する。精製された封入体を含む最終ペレットを、50mMのMops, pH6.5, 8Mのウレ
ア、0.1mMのDTT, 0.1mMのEDTAに溶解する。ペレットは、約１時間にわたってゆ
っくりと溶液になる（室温で回転しながら）。前記体積のウレアを、タンパク質
の最終濃度が20−50mg/mlになるよう添加する。二重にジャベリン化されたOva20
0−291に関しては、タンパク質はpH6.5でほとんど可能ではなく、その結果、KOH
を、タンパク質が溶液に戻るまで添加した。pHは、調節の後、約10であった。

【００７１】 免疫化研究 免疫化研究で、二重にジャベリン化されたOva200−291を用いて開始した。次
の溶液を調製した： 100μlのTiterMex^TM ＋100μlの緩衝液（50mMのNaCl、20mMのトリス、pH8.0,
5mMのMgAc）； 100μlのTiterMax^TM ＋100μgのSIINFEKL（配列番号５）ペプチドを含む100μ
lの緩衝液； 100μgのジャベリン−Ove200−291−ジャベリン、1mMのADPを含む100μlの緩
衝液。 300μgのマウスhsp70, 100μgのジャベリン−Ova200−291−ジャベリン、1mM
のADPを含む100μlの緩衝液。

【００７２】 サンプルC及びDにおいては、列挙される他の化合物を含む緩衝液を、ペプチド
（８Mのウレアである）上に非常に急速に添加した（ピペットにより）。TiterMa
x^TM サンプルを、免疫化の前、30分間かきまぜ、そしてその水性サンプルを、免
疫化の前、30分間インキュベートした（抽出時間は、溶液の配合と免疫化の実際
の投与との間の時間のために、より長い）。 10匹のマウスを、上記混合物の１つによりそれぞれ免疫化した。従って、合計
40匹のマウスが免疫化された。TiterMax^TM サンプルに関しては、マウスを10μl
により経皮内免疫化し、そして水性調製物に関しては、個々のマウスを、50μl
により経皮内免疫化した。

【００７３】 従って、次のグループのマウスは、次のモルの活性成分を受けた： グループA：ペプチドなし、hsp70なし； グループB：5000pモルのSIINFEKL（配列番号５）、hsp70なし； グループC：365pモルのジャベリン−Ova200−291−ジャベリン、hsp70なし； グループD：365pモルのジャベリン−Ova200−291−ジャベリン、214pモルのマ
ウスhsp70。

【００７４】 ７日後、マウスは、１×10⁶個のEG7細胞により、それぞれ経皮内攻撃された。
EG7は、オボアルブミン遺伝子により安定してトランスフェクトされている腫瘍
細胞系（EL4由来の）である。従って、免疫化がオボアルブミンに対する良好な
免疫応答の進行をもたらす場合、マウスは腫瘍をクリアランスすることができる
べきである。次に、腫瘍増殖測定を、規則的な２日間隔で行った。この実験のた
めに観察される応答は図５に見られ得る（注：hsp70：ジャベリン−Ova200−291
−ジャベリングループ（グループD）からの２匹のマウスは、麻酔の間、死亡し
、従って、８匹のマウスのみがグラフに示されている）。

【００７５】 それらのデータは、TiterMax^TM ＋緩衝液（グループA）により免疫化されたす
べてのマウスが腫瘍に対して屈服したが、hsp70により結合されたジャベリン−O
va200−291−ジャベリン（グループD）により免疫化されたマウスは腫瘍を有さ
ず（6/8）、又は疾病の開始まで長時間を要した（2/8）ことを示している。Tite
rMax^TM ＋SIINFEKL（配列番号５）ペプチド（グループB）により免疫化されたマ
ウスはまた、予測されるように、疾病に対して十分に耐性を有し、ところがジャ
ベリン−Ova200−291−ジャベリン（グループC）によってのみ免疫化されたマウ
スはわずかに延長された時間を有したが、しかしその応答はhap70のグループに
おいては有意ではなかった。これは、この治療アプローチの可能性を明確に示す
。

【００７６】実施例２．哺乳類細胞におけるペプチド又はタンパク質の発現 前述の例セクションは、本発明に従っての使用のためのタンパク質を発現する
ために細菌システムを使用した。しかしながら、典型的には、細菌発現システム
における哺乳類タンパク質の発現は、細菌細胞に欠失する種々の修飾システム（
例えば、グリコシル化）の欠失の観点から問題がある。従って、本発明に従って
の使用のためのペプチド又はタンパク質を発現するために哺乳類システムを用い
ることが好ましい。次のものは、哺乳類発現システムがジャベリン化されたオボ
アルブミンタンパク質を生成するためにいかにして使用され得るのか特定の非制
限的例である。

【００７７】 哺乳類細胞において上記ジャベリン化された及びジャベリン化されていないOv
aドメインをコードする発現可能ベクターを創造するために、Hind IIIを、上記
セクションに記載される細菌発現システムからのPCRクローニングにより、Ova20
0−291及びOva200−291−JavをコードするNcoI−BamHIフラグメントのNcoI制限
部位の5’末端で創造することができる。Hind III部位による置換は、Molecular
Biology (Molecular Cloning, Sambrook) での標準技法を用いての、ほとんど
の哺乳類発現ベクターシステム、例えばpCDNA3.1 (Ln-Vitrogen) 中へのクロー
ニングを促進するであろう。同様に、Hind III部位は、Jav−Ova及びJav−Ova−
JavをコードするNdeI−BamHIフラグメントのNde−I制限部位の5’末端に付加さ
れ得る。

【００７８】 使用され得る5’プライマーは、下記の通りである： 5’CCCAAGCTTGGGCCATGGTGACTGAGCAAGAAAGC3’（配列番号46；プライマー１（
前記）のNcoI部位の5’末端でのHind III制限部位の付加）； 5’CCCAAGCTTGGGCATATGCACTGGGACTTCGCGTGGCCGTGGGTGACTGAGCAAGAAAGCAA3’（
配列番号47；プライマー３（前記）のNdeI部位の5’末端でのHind III制限部位
の付加）。

【００７９】 Ova200−291、ジャベリン−Ova200−291、Ova200−291−ジャベリン及びジャ
ベリン−Ova200−291ジャベリンをコードするプラスミドをそれぞれ、哺乳類細
胞系、例えばCHO細胞中にトランスフェクトすることができる。細胞を、当業界
において良く知られている方法、例えばリポフェクタミン（Gibco BRL）を用い
て、製造業者の説明書に従って、Ova200−201、Ova200−291−Jav、Jav−Ova及
びJar−Ova−Javをコードする２μgの哺乳類発現ベクターによりトランスフェク
トすることができる。

【００８０】 簡単には、発現ベクター及び６μlのリポフェクタミンを、100μlの血清フリ
ー培地（OPTI−MEM I Reduced Serum Medium, Gibco BRL）において、別々に希
釈することができる。次に、２種の溶液を混合し、そして室温で45分間インキュ
ベートし、DNA−リポソーム複合体の形成を可能にする。800μlのOPTI−MEMを複
合体に添加し、混合し、そしてすすがれた細胞上に被覆する。37℃での６時間の
インキュベーションの後、20％FCSを含む増殖培地1mlを添加する。新鮮な培地を
、トランスフェクションの24時間後、細胞に添加する。

【００８１】 安定したクローンを、72時間後、細胞に800μg/mlのゲネチシン（Gibco BRL）
を添加することによって選択することができる。選択培地を、３日ごとに変える
ことができる。安定してトランスフェクトされた細胞のコロニーが、10−14日後
に見られることが予測される。所望するジャベリン化されたOvaタンパク質の発
現を、放射性ラベリングによりアッセイすることができる。新しく合成されたOv
aは、免疫沈殿及びゲル電気泳動により検出できる。

【００８２】 他方では、Ova生成クローンの発現を、透過された、固定された細胞の蛍光ラ
ベリングにより確かめ、そして蛍光活性化された細胞センサー（FACS分析）によ
り分析することができる。Ovaタンパク質は選択できるタンパク質であるので、B
refeldin A (BFA) を細胞に添加し、蛍光ラベリングの前、Ovaタンパク質の輸送
及び従って、分泌を妨げることができる。 類似する方法を用いて、本発明に従っての使用のための他のペプチド又はタン
パク質を発現することができる。

【００８３】実施例３．HSP/ジャベリン−タンパク質複合体の免疫原性の決定 次のものは、hap/ジャベリン化されたタンパク質複合体（HSP/Jav−タンパク
質）の免疫原性を決定するために使用され得るプロトコールである。

【００８４】 精製された、ジャベリン化されたタンパク質を、組換えhspにより、10：１〜5
00：１のモル比、及び好ましくは10：１〜100：１のモル比でインビトロで複合
体化することができる。その混合物を、pH4.5〜pH9及びより好ましくはpH6〜pH8
の範囲での塩含有緩衝液においてインキュベートすることができる。緩衝液シス
テムの例は、トリス基材の緩衝液、リン酸基材の緩衝液、クエン酸基材の緩衝液
、琥珀酸基材の緩衝液、炭酸水素基材の緩衝液及びHepes基材の緩衝液を包含す
る。混合物を、25℃で20−120分間インキュベートすることができる。得られるH
SP/Jav−タンパク質複合体を、細胞毒性T細胞アッセイを用いて、免疫原生につ
いてアッセイすることができる。

【００８５】 マウスを、10−50μlのHSP/Jav−タンパク質複合体により１度、経皮内免疫化
することができる。免疫化の10日後、脾臓を除き、そしてリンパ球を、完全なタ
ンパク質、又はジャベリン化されたタンパク質を発現するトランスフェクトされ
た細胞の添加によるインビトロでの再刺激により培養することができる。病原体
タンパク質がジャベリン化される場合、刺激細胞は、不活性化された病原体によ
り感染された細胞であり得る。不活性化は、3000ラドでの照射により、又はマイ
トマイシンCによる処理により達成され得る。

【００８６】 ワクチン接種されたマウスからの脾臓細胞の細胞毒性を、タンパク質−パルス
された細胞又はタンパク質を発現する標的細胞のいずれかによりアッセイするこ
とができる。CTLを、インビボ刺激された脾臓細胞を、10％FCS、ペニシリン−ス
トレプトマイシン及び2mMのグルタミン、並びに１−５×10⁴のγ照射された刺激
体細胞/mlを含むRPMI培地において、１−10×10⁶の細胞/mlの濃度で５−６日間
、培養することによって生成することができる。標的細胞を、トリス−リン酸緩
衝液（pH7.4）において37℃で、200mCiの⁵¹Cr（クロム酸ナトリウム）/ml（NEN
）の存在下で、１時間、細胞を培養することによって調製することができる。

【００８７】 洗浄の後、10⁴の⁵¹Cr−ラベルされた標的細胞を、エフェクターリンパ球と共
に混合し、いくつかの異なったエフェクター/標的物（E/T）比を生成し、そして
４時間インキュベートすることができる。細胞を、200xgでの５分間の遠心分離
によりペレット化し、そして上清液中に放たれる⁵¹Crの量を、γカウンターを用
いて決定することができる。％特異的溶解性を、100％×［（CTLにより開放され
るcpm−自発的開放のcpm）/（最大開放cpm−自発的開放cpm）］として計算する
ことができる。最大の開放性は、１％のTriton X-100の添加により決定され得る
。エフェクター細胞の不在下での標的細胞による自発的開放は、典型的には、最
大開放の25％以下である。 種々の出版物が本明細書において引用されるが、それらの内容は、引用により
本明細書に組み込まれる。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１A−Dは、本発明の種々の態様を示す。A：多くのエピトープを含んで成る
タンパク質（四角、三角及び丸により示される）は、化学的リンカー（L）によ
りジャベリン分子に共有結合される。B：単離されたペプチドに包含される、同
じタンパク質に起因する多くのエピトープは、化学的リンカー（L）によりジャ
ベリンに共有結合される。多くのエピトープ（空白の四角、空白の三角、空白の
丸、斜線のひし形、及び斜線のドーナツ形により示される）を含んで成る多くの
タンパク質（それぞれ、空白形状及び斜線形成として示される）は、化学的リン
カー（L）によりジャベリン分子に共有結合される。単離されたペプチドに包含
される、（C）で示されるような多くのエピトープは、化学的リンカーイよりジ
ャベリンに共有結合される。エピトープが単離されたペプチドに含まれる場合、
そのペプチドは波状線により示される。

【図２】 図２は、オボアルブミンのタンパク質配列（配列番号４）を示す。太字のアミ
ノ酸は、ドメイン200−291のそれらのアミノ酸に対応する。主要組織的適合性複
合体（“MHC”）クラスIエピトープ、SIINFEKL（配列番号５）は下線が引かれ、
そしてMHCクラスIIエピトープ、TEWTSSNVMEERKIKV（配列番号６）は二重線が引
かれている。

【図３】 図３は、オボアルブミンの構造を示す。Ova200−291は、青色で且つほぼ丸印
で示され、そしてSIINFEKL（配列番号５）は、赤色で示され、そしてほぼボック
スにより封入される。

【図４】 図４は、オボアルブミンcDNAのヌクレオチド配列（配列番号７）を示す。ATG
開始コドンは、終結コドンのように、太字で示される。Ova200−291ドメインを
コードする配列の5’及び3’領域は下線で示される。

【図５】 図５A−Dは、TiterMax及び緩衝液（グループA）、TiterMax及びSIINFEKLペプ
チド（配列番号５；グループB）、ジャベリン−Ova200−291−ジャベリンのみ（
グループC）、及びマウスhsp70に結合されるジャベリン−Ova200−291−ジャベ
リンにより免疫化されたマウスについての腫瘍増殖曲線を示す。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 19/00 Ｃ０７Ｋ 19/00 // Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＯ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ， ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，Ｉ Ｓ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ， ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，Ｐ Ｔ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ， ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (71)出願人 ホー，ミー アメリカ合衆国，ニューヨーク 10533， アービントン，サウス コテネット スト リート 10，アパートメント ２エス (72)発明者 ロスマン，ジェイムズ イー． アメリカ合衆国，ニューヨーク 10021， ニューヨーク，イースト シックスティー フォース ストリート 402，アパートメ ント 10ビー (72)発明者 メイヒュー，マーク アメリカ合衆国，ニューヨーク 10029， ニューヨーク，ヨーク アベニュ 150， アパートメント 27シー (72)発明者 ホー，ミー アメリカ合衆国，ニューヨーク 10533， アービントン，サウス コテネット スト リート 10，アパートメント ２エス Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA31 CA04 DA02 EA04 GA11 HA01 HA12 4C085 AA02 BA78 BB11 BB15 CC05 CC08 DD23 DD61 EE03 4H045 AA11 BA10 BA41 CA40 DA86 EA29 EA31 FA74

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 生理学的条件下で熱ショックタンパク質に対する親和性を有
   する連結分子により、熱ショックタンパク質に非共有結合されている多くのエピ
   トープを含んで成る抗原複合体であって、前記エピトープが前記連結分子に共有
   結合されており、そして１つのエピトープがクラスIエピトープであり、そして
   他のエピトープがクラスIIエピトープであることを特徴とする抗原複合体。
2. 【請求項２】 熱ショックタンパク質に対する親和性を有する連結分子によ
   り、熱ショックタンパク質に非共有結合されている多くのエピトープを含んで成
   る抗原複合体であって、前記エピトープが前記連結分子に共有結合されており、
   そして前記エピトープが１つよりも多くの抗原タンパク質に由来することを特徴
   とする抗原複合体。
3. 【請求項３】 多くの連結分子により熱ショックタンパク質に非共有結合さ
   れている、抗原ペプチドに含まれる、１又は複数のエピトープを含んで成る抗原
   複合体であって、前記１又は複数のエピトープが前記連結分子に共有結合される
   ことを特徴とする抗原複合体。