JP2003530835A - 高トリグリセリド血症を誘発することなくコレステロールレベルを低下するための化合物と方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、哺乳類において高トリグリセリド血症を誘発することなく、コレステロールを低下し、アテローム性動脈硬化症の発症を遅延またはアテローム性動脈硬化症を治療する方法を提供する。これらの方法は、哺乳動物に投与または哺乳動物において発現させると、高トリグリセリド血症を誘発することなく血清の総コレステロールレベルを低下するアポＥポリペプチドまたは核酸を哺乳動物に投与または哺乳動物において発現させる段階を含む。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】連邦政府資金援助による研究についての言明 本発明は、国立衛生研究所助成金AG12717により一部分資金を供給された。政
府は本発明において一定の権利を有することができる。

【０００２】発明の背景 アポリポタンパク質E(アポE（apoE)）含有リポタンパク質の細胞受容体による
認識および異化を促進するリガンドとして、アポEはコレステロール輸送系の重
要な成分である(InnerarityおよびMahley、Biochemistry 17:1440-1447、1978;
HerzおよびWillnow、Curr. Opin. Lipidol. 6:97-103、1995; Wolfら、Am. J. P
athol. 141:37-42、1992; Kimら、J. Biol. Chem. 271:8373-8380、1996; Takah
ashiら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:9252-9256、1992; Mahleyら、Curr. O
pin. Lipidol. 10:207-217、1999; Wardellら、J. Clin. Invest. 80:483-490、
1987; Cohnら、Vas. Biol. 16:149-159、1996; Chaitら、Metabolism 27:1055-1
066、1978; Huangら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:1834-1838、1994; Huang
ら、Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 17:2010-2019、1997)。ヘパリン硫酸
プロテオグリカンもまたこの過程に含まれうる(Cullenら、J. Clin. Invest. 10
1:1670-1677、1998; Lintonら、Science 267:1034-1037、1995; Fazioら、Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 95:4647-4652、1997; Huangら、J. Biol. Chem. 273:26
388-26393、1998; van Dijkら、J. Lipid Res. 40:336-344、1999; Huangら、Ar
terioscler. Thromb. Vasc. Biol. 19:2952-2959、1999; Salahら、J. Lipid Re
s. 38:904-912、1997; Jiら、J. Biol. Chem. 268:10180-10187、1993; Jiら、J
. Biol. Chem. 269:13421-13428、1994; Jiら、J. Lipid Res. 36:583-592、199
5; Jiら、J. Biol. Chem. 269:2764-2772、1994)。アポEのLDL受容体およびおそ
らく他の受容体およびヘパリン硫酸プロテオグリカンへの結合を妨げるアポEに
おける突然変異は、III型高リポタンパク血症および早期アテローム性動脈硬化
症に関連している(Mahleyら、Curr. Opin. Lipidol. 10:207-217、1999; Dongら
、Nature Struc. Biol. 3:718-722、1996; Wardellら、J. Clin. Invest. 80:48
3-490、1987; Rallら、J. Clin. Invest. 83:1095-1101、1989; Mannら、Biochi
m. Biophys. Acta 1005:239-244、1989; Wardellら、J. Biol. Chem. 264:21205
-21210、1989; van den Maagdenbergら、Biochem. Biophys. Res. Commun. 165:
851-857、1989; Smitら、J. Lipid Res. 31:45-53、1990; Ghiselliら、Science
214:1239-124、198; Lalazarら、J. Biol. Chem. 263:3542-3545、1988; Weisg
raberら、J. Biol. Chem. 258:12348-12354、1983; Innerarityら、J. Biol. Ch
em. 258:12341-12347、1983)。

【０００３】 アポEは腎臓、副腎、星状細胞および網内皮細胞を含む、肝臓および様々な末
梢組織により合成される34.2 kDAのタンパク質である。アポEは18個のアミノ酸
シグナルペプチドを有する前駆体として合成される。アポEは、シグナルペプチ
ドの細胞内での切断後、シアル酸を含む炭水化物鎖でグリコシル化され、シアロ
アポEとして分泌される。それは続いて、血漿中で脱シアル化される(Zannisら、
Adv. Hum. Genet. 21:145-319、1993; Zannisら、J. Biol. Chem. 259:5495-549
9、1984; およびZannisら、J. Biol. Chem. 261:13415-13421、1986参照)。

【０００４】 当業者にとって容易に明白であるように、本明細書で使用されるアポEタンパ
ク質についてのアミノ酸の番号付けは、シグナルペプチド切断後の成熟したタン
パク質を指している。シグナルペプチドのアミノ酸は番号付けされた-18位から-
1位までで、タンパク質前駆体のアミノ末端残基を指す-18を有する(Karathansis
ら、「ヒトアポA-1、アポA-11、アポC1、アポC11、アポC111およびアポEのcDNA
クローンのヌクレオチドおよび対応するアミノ酸配列(Nucleotide and Correspo
nding Amino Acid Sequences of Human apoA-1, apoA-11, apoC1, apoC11, apoC
111 and apoE cDNA clones)」、血漿タンパク質の生化学と生物学(Biochemistry
and Biology of Plasma Proteins)、ScanuおよびSpector編、Marcel Dekker、N
ew York、11巻、475-493ページ、1985)。

【０００５】 アポEのいくつかのドメインが記載されてきたが、受容体結合(Heら、Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA 95:2509-2514、1998; Lalazar、前記; Weisgraber、前記(1
983); Innerarityら、J. Biol. Chem. 258:12341-12347、1983; Jiら、J. Lipid
Res. 36:583-592、1995; Rallら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:4696-4703
、1982; Westerlundら、J. Biol. Chem. 268:15745-15750、1993; Wilsonら、St
ructure 2:713-718、1994; Wilsonら、Science 252:1817-1822、1991; Mahley、
Biochim. Biophys. Acta 575:81-91、1979)、ヘパリン結合(Lalazar、前記; Fan
、前記; Salah、前記; Ji、前記(1993))、脂質結合およびリポタンパク質結合(C
ohn、前記; Huangら、J. Biol. Chem. 273:26388-26393、1998; Salah、前記; J
i、前記(J. Biol. Chem. 269、1994); Ji、前記(1995); Ji、前記(J. Biol. Che
m. 289、1994))におそらく関係しているものと思われる(図7C)。受容体結合ドメ
インは残基136〜152位の間に見出されるが、隣接する残基もまた間接的に受容体
結合に作用する。

【０００６】 ヘパリン結合ドメインの1つは残基140〜150位の間で受容体結合ドメインと部
分的に重複し、一方、2つの他のヘパリン結合ドメインは残基211〜218位および2
43〜272位の間であると報告された(Weisgraberら、J. Biol. Chem. 261:2068-20
76、1986; Cardin、前記)。以前の研究より、140〜150ドメインはアポEを含むリ
ポタンパク質のヘパリン硫酸プロテオグリカンへの結合、およびLRP(LDL受容体
関連タンパク質)の関与の有りまたは無しにおいて続いて起こるそれらの内部移
行に直接的に関係していることが示されている(Herz、前記; Mahley、前記; Faz
io、前記; van Dijk、前記; Huang、前記(1999); Ji、前記(J. Biol. Chem. 289
、1995); Cardin、前記; Dongら、J. Biol. Chem. 269:22358-22365、1994)。脂
質およびリポタンパク質結合に関する有力な考えとして、アポEのアミノ末端領
域がリポタンパク質との結合に必要とされる決定子を欠損していることに対して
、アポEの残基244〜266の間の領域がアポEの脂質およびリポタンパク質への結合
に寄与しているというものである(He、前記; Dong、前記(1994))。

【０００７】 ヒトにおいてアポEをコードする3つの共通の対立遺伝子がある。ε4、ε3およ
びε2と呼ばれる3つの対立遺伝子は3つのホモ接合表現型(すなわち、E4/E4、E3/
E3、およびE2/E2)および3つのヘテロ接合表現型(すなわち、E4/E3、E3/E2、およ
びE4/E2)を生じさせる(ZannisおよびBreslow、Biochemistry 20:1033-1041、198
2; Zannisら、Am. J. Hum. Genet. 33:11-24、1981)。3つの異なるヒトアポEイ
ソプロテイン、アポE4、アポE3、およびアポE2はアミノ酸残基112および158での
突然変異から生じる。アポE4は112位にアルギニンおよび158位にアルギニンを含
む。アポE3は112位にシステイン、および158位にアルギニンを含む。アポE2は11
2位および158位にシステインを含む。

【０００８】 通常のアポE対立遺伝子に加えて、3つのまれなアポE対立遺伝子(アポE1、アポ
E2^*、およびアポE2^**)がある。他のアポEタンパク質と比較して、アポE1は127位
にグリシンの代わりにアスパラギン酸、および158位にアルギニンの代わりにシ
ステインを有する。アポE2^*は145位にアルギニンの代わりにシステイン、および
アポE2^**は146位にリジンの代わりにグルタミンを有する(Karathanasisら、前記
)。

【０００９】 アポE4欠損症または欠陥のあるアポE型を有するヒトの患者および動物モデル
の研究により、コレステロールの恒常性におけるアポEの役割について信じざる
を得ない証拠が明確に立証された(Schaeferら、J. Clin. Invest. 78:1206-1219
、1986; Cladarasら、J. Biol. Chem. 262:2310-2315、1987; Plumpら、Cell 71
:343-353、1992; Zhangら、Science 2588:468-471、1992; Reddickら、Arterios
cler. Thromb. 14:141-147、1994; Vanden Maagdenbergら、J. Biol. Chem. 268
:10540-10545、1993; Fazioら、J. Clin. Invest. 92:1497-1503、1993; Fazio
ら、J. Lipid Res. 35:408-416、1994; Fazioら、Arterioscler. Thromb. 14:18
73-1879、1994; Vlismenら、J. Biol. Chem. 271:30595、1996)。これらの研究
より、VLDLおよびIDL領域に浮かぶコレステロールエステルに富むリポタンパク
質残存物を取り除くためにアポEが必要とされることが示されている(Plumpら、C
ell 71:343-353、1992; Zhanら、Science 2588:468-471、1992; Reddickら、Art
erioscler. Thromb. 14:141-147、1994; Vanden Maagdenbergら、J. Biol. Chem
. 268:10540-10545、1993; Fazioら、J. Clin. Invest. 92:1497-1503、1993; F
azioら、J. Lipid Res. 35:408-416、1994; Fazioら、Arterioscler. Thromb. 1
4:1873-1879、1994; van Vlijmenら、J. Biol. Chem. 271:30595-3062、1994; C
ohnら、Arterioscler. Thromb. Vas. Biol. 16:149-159、1996; Chaitら、Metab
olism 27:1055-1066、1978)。血漿におけるそのような残存物の蓄積は早発性ア
テローム性動脈硬化症と関連している(Schaeferら、J. Clin. Invest. 78:1206-
1219、1986; Plumpら、Cell 71:343-353、1992; Zhangら、Science 2588:468-47
1、1992; Reddickら、Arterioscler. Thromb. 14:141-147、1994)。

【００１０】 他の研究により、コレステロール流出におけるアポEの重要性が強調され、γ
電気泳動移動度(γLp-E)をもつアポE含有リポタンパク質粒子は、コレステロー
ルを詰め込んだマクロファージから過剰なコレステロールを除去する際にかなり
有効であり、このようにして細胞および組織のコレステロール恒常性に寄与して
いることが示されている(Huangら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:1834-1838
、1994; Huangら、Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 17:2010-2019、1997; Z
huら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:7585-7590、1998; Cullenら、J. Clin.
Invest. 101:1670-1677、1988)。 コレステロール流出におけるアポEの関係から
、マクロファージまたは内皮細胞に局所的に発現させた場合、なぜアポEがアテ
ローム性動脈硬化症を防ぐのかを説明できる可能性がある(Lintonら、Science 2
67:1034-1037、1995; Fazioら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:4647-4652、19
97; Shimanoら、J. Clin. Invest. 95:469-476、1995)。

【００１１】 ヒトおよびトランスジェニック動物モデルにおいての最近の研究により、アポ
Eが血漿トリグリセリド恒常性に関連する他の機能をもつ可能性が示された。そ
のような研究により、アポEレベルの増加がトリグリセリドに富むリポタンパク
質の脂肪分解を阻害し、結果として高トリグリセリド血症を引き起こすことが示
されている(Cohnら、Arterioscler. Thromb. Vas. Biol. 16:149-159、1996; Ch
aitら、Metabolism 27:1055-1066、1978; Huangら、J. Biol. Chem. 273:26388-
26393、1998; Ehnholmら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:5566-5570、1984; H
uangら、J. Biol. Chem. 273:17483-17490、1998; Rensenら、J. Biol. Chem. 2
71:14791-14799、1996; Jongら、Biochem. J. 328:745-750、1997; van Dijkら
、JLR、40:336-344、1999; Salahら、J. Lipid Res. 38:904-912、1997; Jiら、
J. Lipid Res. 36:583-592、1995; Jiら、J. Biol. Chem. 289:2784-2772、1994
; Rallら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:4696-4700、1992; Weisgraber、前
記(1983); Cardinら、Biochem. Biophys. Res. Commun. 134:783-789、1986; Do
ng、前記(1994); Westerlund、前記; Wilsonら、Structure 2:713-718、1994)。
インビトロでのVLDLの脂肪分解はアポCIIの添加により部分的に復活させること
ができた(Huangら、J. Biol. Chem. 273:26388-26393、1998; Huangら、J. Biol
. Chem. 273:17483-17490、1998)。このアポEの機能によりヒト個体群において
高トリグリセリドレベルを引き起こす可能性がある(Cohn、前記; Chait、前記;
Salah、前記; Ji、前記(1995))。アポEの過剰発現はまた、インビボにおいて(Hu
ang、前記(1999))および細胞培養において(Huangら、J. Biol. Chem. 273:26388
-26393、1998)肝臓のVLDLトリグリセリドの生成を刺激するが、アポB含有リポタ
ンパク質の集合および/または分泌を促進することによるものと思われる。VLDL
の集合および分泌におけるこの可能性あるアポEの関与は、膜脂質の流動化を通
して行われる可能性がある(Huangら、J. Biol. Chem. 273:26388-26393 40、199
8; Huangら、Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. (印刷中)、1999; Fanら、J.
Clin. Invest. 101:2151-2164、1998; Kulpersら、J. Clin. Invest. 100:2915-
2922.893. 1993; Rallら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:4696-4700、1982)。
対照的に、アポEの欠損はVLDLトリグリセリド分泌の減少と関連がある(Kulpers
ら、J. Clin. Invest. 100:2915-2922、1997)。残基1〜191位および残基1〜244
位にわたる¹²⁵I標識の切断された2つのアポE型のそれぞれの注入により、それら
の迅速かつ効率的な血漿からの除去を引き起こした(Westerlund、前記)。

【００１２】 コレステロール恒常性におけるアポEの有益な効果にもかかわらず、遺伝子治
療的アプローチにおいてのアポEの治療的価値は、動物研究でアポEの過剰発現に
より誘発されるものと思われる重篤な高トリグリセリド血症およびVLDL蓄積のた
め、非常に限られたままである。高トリグリセリド血症を引き起こすことなくコ
レステロールレベルを下げることができる治療が必要とされている。

【００１３】発明の概要 第一局面において、本発明は、哺乳動物に投与または発現させた場合高トリグ
リセリド血症を引き起こすことなく血漿の総コレステロールレベルを下げる、成
熟した天然のヒトアポEポリペプチドのアミノ酸1-299位の対応する領域に少なく
とも50%、60%、70%、80%、90%、または100%一致するアミノ酸配列を有するポリ
ペプチドをコードする核酸を特徴とする。好ましくは、コードされたポリペプチ
ドのアミノ酸配列は、アミノ酸残基1から始まって、成熟したヒトアポEポリペプ
チドの対応する領域に少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、または100%一致す
る。「高トリグリセリド血症」とはトリグリセリド濃度において15%を超える増
加を意味する。コレステロールおよびトリグリセリドレベルは本明細書に記載さ
れた標準的なアッセイ法を使用して測定される。

【００１４】 本発明の核酸は、好ましくは、天然のヒトアポE核酸の部分に少なくとも50%、
60%、70%、80%、90%、または100%一致する。一つの好ましい態様において、核酸
は、アポE4(配列番号：7)、アポE3(配列番号：8)、アポE2(配列番号：9)、アポE
1(配列番号：10)、アポE2^*(配列番号：11)、アポE2^**(配列番号：12)、または任
意の他の天然に生じるヒトアポE核酸(Karathanasisら、前記)のセグメントに少
なくとも50%、60%、70%、80%、90%、または100%一致する配列を有する。

【００１５】 本発明のもう一つの好ましい態様は、成熟したヒトアポEポリペプチドの残基1
〜185、1〜202、1〜229、または1〜259、好ましくは、成熟したアポE4(配列番号
：1)、アポE3(配列番号：2)、アポE2(配列番号：3)、アポE1(配列番号：4)、ア
ポE2^*(配列番号：5)、またはアポE2^**(配列番号：6)の残基1〜185、1〜202、1〜
229、または1〜259をコードする配列を有する核酸である。さらにもう一つの好
ましい態様において、核酸は、アポEタンパク質前駆体(配列番号：13)のシグナ
ルペプチドの-18位から-1位までの残基のような、N末端シグナルペプチドをさら
にコードする。好ましい核酸は、天然のヒトアポEポリペプチドの-18位から185
位、-18位から202位、-18位から229位、または-18位から259位のアミノ酸をコー
ドするが、それぞれ、アポEタンパク質前駆体の最初の203個、220個、247個、ま
たは277個の残基に相当している。好ましいタンパク質前駆体は、成熟したアポE
タンパク質の配列に加えて18アミノ酸のN末端シグナル配列を含む、アポE4(配列
番号：14)、アポE3(配列番号：15)、アポE2(配列番号：16)、アポE1(配列番号：
17)、アポE2^*(配列番号：18)、またはアポE2^**(配列番号：19)を含む。

【００１６】 様々な好ましい態様において、本発明の核酸によってコードされるポリペプチ
ドは少なくとも150個のアミノ酸、好ましくは少なくとも160個、180個、200個、
220個、または250個のアミノ酸を含む。好ましくは、コードされるポリペプチド
は150個〜299個のアミノ酸を含む。他の好ましい態様において、コードされるポ
リペプチドは、150個〜215個のアミノ酸のような、216個より少ないアミノ酸を
有する。さらに他の好ましい態様において、コードされるポリペプチドは202個
、203個、220個、247個、または277個のアミノ酸から成る。好ましくは、コード
されるポリペプチドはポリペプチドの分泌を促進するシグナル配列を機能的に連
結されている。好ましくは、該シグナル配列はシグナルペプチダーゼによって切
断される。

【００１７】 本発明はまた、本発明の任意の核酸によりコードされるポリペプチドを特徴と
する。

【００１８】 関連した局面において、本発明は、成熟した天然のヒトアポEポリペプチドの
対応する領域に少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、または100%一致するアミ
ノ酸配列を有し、かつ哺乳動物に投与または発現させた場合、高トリグリセリド
血症を引き起こすことなく血漿の総コレステロールレベルを下げるポリぺプチド
を提供する。好ましくは、ポリペプチドのアミノ酸配列は、アミノ酸残基1から
始まって、天然のヒトアポEポリペプチドの対応する領域に少なくとも50%、60%
、70%、80%、90%、または100%一致する。他の好ましい態様において、ポリペプ
チドのアミノ酸配列は、天然ヒトアポEポリペプチドのアミノ酸1〜215、1〜240
、または1〜270の対応する領域に少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、または1
00%一致する。

【００１９】 様々な好ましい態様において、本発明のポリペプチドは、少なくとも150個の
アミノ酸、好ましくは、少なくとも160個、180個、200個、220個、または250個
のアミノ酸を含む。好ましくは、コードされるポリペプチドは、150個〜299個の
アミノ酸を含む。他の好ましい態様において、コードされるポリペプチドは、15
0個〜215個のアミノ酸のような、216個より少ないアミノ酸を有する。さらに他
の好ましい態様において、コードされるポリペプチドは、202個、229個、または
259個のアミノ酸から成る。まださらに他の好ましい態様において、ポリペプチ
ドは、成熟した天然アポEポリペプチドの残基1〜185、1〜202、1〜229、または1
〜259、好ましくは天然アポE4(配列番号：1)、アポE3(配列番号：2)、アポE2(配
列番号：3)、アポE1(配列番号：4)、アポE2^*(配列番号：5)、またはアポE2^**(配
列番号：6)の残基1〜185、1〜202、1〜229、または1〜259に一致する配列を有す
る。他の態様において、ポリペプチドは、アポEタンパク質前駆体(配列番号：13
)のシグナルペプチドの残基-18〜-1のような、シグナル配列を機能的に連結され
ている。

【００２０】 本発明のポリペプチドおよび核酸は、哺乳動物に、好ましくはヒトの患者に、
高トリグリセリド血症を引き起こすことなく、コレステロールを下げる、アテロ
ーム性動脈硬化症の発病を遅らせる、またはアテローム性動脈硬化症を治療する
ために、投与または発現させることができる。好ましくは、適する患者は、内因
的な正常に機能するアポE遺伝子を欠損する、または血流にリポタンパク質残存
物の蓄積を引き起こす残存物の除去における欠陥によりアテローム性動脈硬化症
を発生させる危険性のある者である。他の特に適する患者はLDL受容体タンパク
質のレベルが正常より低い。例えば、患者は、内因的な完全長LDL受容体の発現
を低下させるまたは妨げる、LDL受容体についての調節配列、プロモーター配列
、またはコード配列に突然変異をもっている可能性がある。または、患者は、LD
L受容体のアポEへの結合のような、コードされたLDL受容体の活性を低下させる
ミスセンス変異をもっている可能性がある。好ましくは、ポリペプチドは、薬学
的に許容される担体物質と共に、筋内へ、静脈へ、または皮下へ投与される。好
ましくは、ポリペプチドは、動脈のアテローム性動脈硬化斑および/または周辺
組織へ直接的に送達される。他の好ましい態様において、ポリペプチドは、ヒト
胎児の遺伝子操作のような遺伝子治療の結果として、または骨髄移植の結果とし
て、供給される。好ましくは、本発明の核酸は、リポソームおよびプロタミンと
組み合わせて静脈へ投与される。好ましい態様において、核酸は哺乳動物の肝臓
、管壁、またはアテローム性動脈硬化斑へ投与または発現させる。他の好ましい
態様において、核酸は組換え体ウイルスを使用してアテローム性動脈硬化病変部
位へ直接的に送達される。他の好ましい態様において、核酸はヒト胎児の遺伝子
操作または骨髄移植の結果として供給される。他の好ましい態様において、核酸
は、利用可能にプロモーターに連結され、かつ例えば、プラスミドまたはアデノ
ウイルス、アデノ関連ウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウ
イルスのベクターもしくはバキュロウイルスを用いる系のような組換え体ウイル
スベクターの発現ベクターに含まれる。

【００２１】 もう一つの局面において、本発明は、薬学的に許容される担体物質と混ぜられ
た本発明のポリペプチドを含む薬学的組成物を特徴とする。

【００２２】 さらにもう一つの局面において、本発明は、利用可能にプロモーターに連結さ
れた本発明の核酸を含む組換え体DNA分子を提供する。

【００２３】 本発明は、アポEのコレステロールを下げる性質を利用し、同時にその高トリ
グリセリド血症の誘発を避ける。

【００２４】 本発明の他の特徴および利点は、それらの好ましい態様の以下の記述から、お
よび特許請求の範囲から明らかであると思われる。

【００２５】詳細な説明 アポEは、別個の領域または重複領域のどちらかがコレステロールおよびトリ
グリセリド恒常性における役割を媒介するという仮説に基づいて、本発明者らは
、インビボにおけるコレステロールおよびトリグリセリド除去に必要なアポEの
ドメインを詳細に検討するために、アポE欠損マウスにアデノウィルス媒介性遺
伝子導入を使用した。アポEのアミノ末端の1〜202位の領域はインビボにおいて
細胞受容体を介してアポEがリポタンパク質と結合し、その後除去されるために
必要なドメインを含有することを本発明者らは以前に報告した。さらに、アポE
のカルボキシ末端の203〜299残基はインビボにおいてアポE誘導型の高トリグリ
セリド血症に寄与する。さらに、アミノ末端のアミノ酸1〜185位、1〜229位また
は1〜259位を含有するアポE断片も、高トリグリセリド血症を誘発することなく
、コレステロールを大幅に低下することを本発明者らは最近見出した。従って、
アポEのカルボキシ末端の186〜299残基、230〜299残基または260〜299残基の除
去もまた、インビボにおいてアポE誘導型高トリグリセリド血症を防止する。

【００２６】 野生型アポE4を発現するアデノウィルスの2×10⁹ pfuをアポE欠損マウスに感
染させても、リポタンパク質を含有するコレステロールはあまり除去されない。
一方、アポE4のアミノ末端の202残基を含有する切断型のアポE4(アポE4-202)を2
×10⁹ pfuまたは1×10⁹ pfuを投与すると、血漿中のトリグリセリドレベルをあ
まり増加させないで、アポE欠損マウスのコレステロールを90%低下した。感染後
のマウス肝臓の全RNAのノーザンブロット解析は、同等のレベルのアポE4および
アポE4-202mRNAを示した。その所見は、アポE4のアミノ末端の1〜202領域は、イ
ンビボにおいてアポE認識受容体を介してアポEがリポタンパク質と結合し、その
後除去されるために必要なドメインを含有することを示唆している。さらに、ア
ポEのカルボキシ末端の203〜299残基はインビボにおけるアポE誘導型高トリグリ
セリド血症に寄与する。本発明の検討では、142〜147ヘパリン結合ドメインを含
有し、211〜218または243〜272ヘパリン結合ドメインを含有しないアポE4-202に
よるリポタンパク質残存物の除去が極めて効率的である。

【００２７】 全RNAのノーザンブロット解析は、同様の定常状態のmRNAレベル条件下では、
野生型アポE-4を発現するマウスは高トリグリセリド血症を発症するが、アポE-2
02を発現するマウスは発症しないことを立証した（図4Aおよび4B）。この解析は
、アポE合成の低下がこの作用の一因を担っている可能性がないことを示してい
る。さらに、組織培養実験は、アポE4またはアポE4-202を発現する永久的な細胞
系統または組換えアデノウィルスを感染させた細胞はほぼ同じレベルのアポE4お
よびアポE4-202を分泌することを示し、これは、切断型のアポE4-202型は安定で
あり、野生型アポE4対応物と同じくらい効率的に分泌されることを示した。

【００２８】 正常なC57BL6マウスの肝臓における全長のアポE3またはアポE4の過剰発現は、
血漿中の高いコレステロールおよびトリグリセリドレベルを特徴とする複合高脂
血症を誘発した。一方、アポE4-202は過剰発現されても高トリグリセリドレベル
を誘発しなかった。この結果は、複合高脂血症の誘発はアポEの過剰発現の結果
であり、アポE表現型に無関係であることを示している。さらに、複合高脂血症
を誘発するには、アポEのカルボキシ末端領域（アミノ酸203〜299位）を必要と
する。

【００２９】 X線結晶解析法およびコンピュータモデリング法は、アポEのアミノ末端ドメイ
ンは逆平行ヘリックスを含有することを示している(Wilsonら、Structure 2: 71
3-718、1994; Wilsonら、Science 252: 1817-1822、1991; Shimano、前記; Sala
h、前記)。残基23〜155位にわたるこれらのアミノ末端ヘリックスは、他のタン
パク質粒子と共に特定の構造を形成してリポタンパク質表面に結合する可能性が
あると本発明者らは考えている。臨界アポE濃度では、アポE部位は飽和され、ア
ポE含有リポタンパク質の除去が最適化されると考えられる。血漿アポE濃度がさ
らに増加すると、トリグリセリドに富むリポタンパク質の他の重要なタンパク質
成分は、アポEのカルボキシ末端の203〜299領域を介して特異的に置換される可
能性がある。これにより、これらの粒子は脂肪加水分解速度が低下し、血漿トリ
グリセリドレベルが増加する可能性がある（図7B）。従って、アポE4-202を感染
させた後にトリグリセリドレベルの大きな増加が生じないのは、アポE4-202がVL
DL粒子由来のタンパク質を置換する能力が大幅に低下したことによると思われる
。例えば、トリグリセリドに富むVLDLに存在するタンパク質のなかには（例えば
、apoA-IVおよびapoA-I）全長のアポEによって置換されるものもあるが、アポE4
-202では置換されない（図7A）。さらに、アポE4-202はトリグリセリドに富むリ
ポタンパク質の分泌を低下する可能性がある。しかし、この領域（203〜299位）
が欠損しても、切断型タンパク質がリポタンパク質残存物を効率的に除去する能
力を大きく損なわない。

【００３０】 アポE4-202に見られる結果と同様に、アポE4-229またはアポE4-259を発現する
アデノウィルス4×10⁹ pfuまたはアポE4-185を発現するアデノウィルス1×10⁹ p
fuをアポE欠損マウスに投与すると、血清トリグリセリドレベルを増加すること
なく、血清コレステロールレベルをかなり低下した（図8A、8B、9A〜9D、10A〜1
0D、11C、11D、16Aおよび16B）。ノーザンブロット解析により、アポE4-229およ
びアポE4-259 mRNAは野生型アポE4 mRNAと同じレベルで発現することが示され、
これはアポE4-229およびアポE4-259が高トリグリセリド血症を誘発しないのはこ
れらのアポE型の発現レベルが低いことによらないことを示唆した（図11Aおよび
11B）。さらに、アポE4-185を発現するアデノウィルス1×10⁹ pfuを感染させた
アポE欠損マウスの肝臓におけるアポE-185 mRNAのレベルは、アポE4を発現する
アデノウィルス2×10⁹ pfuを感染させたマウスのアポE4 mRNAレベルより高かっ
た。VLDLトリグリセリドの生成速度は、アポE-259は野生型アポEよりかなり低く
、これはVLDLトリグリセリド生成のこのような低下は、アポE切断型変異体は高
トリグリセリド血症を誘発できない一因となりうることを示唆している（図12）
。これらの結果は、インビボにおいてアポE誘導型高トリグリセリド血症にはア
ポEのカルボキシ末端の260-299残基が必要であることを示している。同様に、ア
ポEを発現するアデノウィルスを感染させたアポE-/-マウスにおける肝臓のVLDL-
トリグリセリド分泌速度は、感染5日後には、アポE4-185を発現するアデノウィ
ルスを感染させたマウスにおける肝臓のVLDL-トリグリセリド分泌速度より8倍高
かった。切断型アポE4-185を感染させたマウスにおけるVLDL-トリグリセリド分
泌速度は、対照のAdGFPアデノウィルスを感染させたマウスにおける対応する速
度より50%も低かった。

【００３１】 本発明を特定の理論に制限するつもりはないが、切断型アポE-185、アポE4-20
2、アポE4-229またはアポE4-259を発現するマウスにおいてカイロミクロンおよ
びVLDLが形成され、正常に代謝されること、および全長のアポE4を過剰発現する
マウスにおいてトリグリセリドに富むリポタンパク質が除去されないことを説明
するモデルが提唱されている（図14）。アポEの過剰発現が、細胞受容体によっ
て除去されえないトリグリセリドに富むリポタンパク質の形成に関連しているこ
とをこのモデルは示している。一方、アポE-185、アポE4-202、アポE4-229また
はアポE4-259を過剰発現するマウスにおいて形成される正常なカイロミクロンお
よびVLDL粒子は細胞受容体によって効率的に除去され、その結果これらのマウス
において血漿コレステロールおよびトリグリセリドレベルが低くなる。

【００３２】 切断型アポE4を含有する残存物の除去にLRPおよびLDL受容体がおそらく関与す
ることにより、VLDLの取り込みおよびその後のコレステロール除去がより効率的
になり、リポタンパク質除去において観察される切断型アポE4の特性を説明して
いる。リポタンパク質残存物が効率的に除去されるとアポE分子も同時に除去さ
れ、定常状態の血漿アポEレベルが低下される。本発明の検討において観察され
る全長のアポEの定常状態の血漿アポEレベルは60〜70 mg/dlの範囲内であり、切
断型アポE型の定常状態のレベルは1〜5 mg/dlの範囲内である。

【００３３】 または、リポタンパク質は、LDL受容体およびLRP経路に代わる、またはこれに
加えたヘパリン硫酸プロテオグリカン経路により除去されうる。切断型アポE4タ
ンパク質の142〜147位のヘパリン結合領域も受容体結合ドメインを含有するので
、ヘパリン硫酸プロテオグリカンへのアポEの結合は受容体結合ドメインを遮蔽
し、細胞受容体により認識されなくすることができる。得られたヘパリン硫酸プ
ロテオグリカンが結合した残存物は直接的なエンドサイトーシスにより除去され
うる。

【００３４】アポE4および切断型アポE4を発現する組換えアデノウィルスの構築 以前に記載されているpUC-アポE4(Aleshokovら、Biochemistry 36: 10571-105
80、1997)を鋳型とし、表1に示す4セットのオリゴヌクレオチドをプライマーと
して使用して、コドン203(GTA)から停止コドン(TGA)までのPCRによる突然変異に
よってpUC-アポE4-202を作製した。外側のプライマーOUTPR1-センスおよびOUTPR
2-アンチセンスセットは、アポEのそれぞれアミノ酸103〜111位および208〜215
位をコードするヌクレオチドに相当し、それぞれ制限酵素部位NgoMIおよびBstEI
Iを含有する。コドン203の5'側9残基と3'側9残基に及ぶ突然変異オリゴヌクレオ
チドセットは、その配列が停止コドンに改変されている（表1、インターナル-セ
ンス-203およびインターナル-アンチセンス-203）。

【表１】 重複伸長PCRに使用したオリゴヌクレオチド ＊下線の太字の塩基は突然変異したコドンを示す。

【００３５】 コドン203のPCRによる突然変異が2つの別個の増幅反応に関与した。第1の反応
は、コドン203に及ぶ5'側の外側のプライマーおよびアンチセンス突然変異プラ
イマーを使用した。第2の反応は、コドン203に及ぶ3'側の外側のプライマーおよ
びセンス突然変異プライマーを使用した。各PCR反応の4%のアリコートを混合し
、5'側および3'側外側のプライマーによって試料を増幅した。次いで、増幅した
断片をNgoMIおよびBstEIIで消化し、pUC-E4プラスミドの野生型配列と交換する
ために使用した。同様に、それぞれコドン186、230または260を停止コドンに変
換するために、対応する突然変異プライマーを使用して、pUC-アポE4-185、pUC-
アポE4-229およびpUC-アポE4-259を構築した。

【００３６】 アポE遺伝子のエキソンIVにPCRで作製した突然変異を組み込むために、2段階
の工程を実施した。エキソンIV配列全体を含むヒトアポE4遺伝子のEcoRI断片をp
BSベクターのEcoRI部位にクローニングしてpBlue-E4-exIVを作製した。同様に、
ヒトアポE3遺伝子のEcoRI断片を使用してベクターpBlue-E3-exIVを構築した。pU
C-アポE4-185、pUC-アポE4-202、pUC-アポE4-229およびpUC-アポE4-259プラスミ
ドをStyI/BbsIで消化し、突然変異させた配列をpBlue-E4-exIVプラスミドの野生
型配列と交換して、プラスミドpBlue-E4-185-exIV、pBlue-E4-202-exIV、pBlue-
E4-229-exIVおよびpBlue-E4-259-exIVを作製した（図1）。

【００３７】 組換えアデノウィルスが細菌BJ-5183細胞において作製されるAd-Easy-1系を使
用して組換えウィルスを構築した(Heら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 2509
-2514、1998)。エキソン2および3を含有するアポEゲノムDNAの1507 bpのMscI-Ec
oRI断片（ヌクレオチド1853〜3360位）をpGEM7ベクターのSmaI-EcoRI部位にクロ
ーニングし、その結果pGEM7 アポE-ExII-IIIベクターを構築した。次いで、アポ
E3、アポE4、アポE4-185（コドン186に停止突然変異を含有する）、アポE4-202
（コドン203に停止突然変異を含有する）、アポE4-229（コドン230に停止コドン
を含有する）、およびアポE4-259(コドン230に停止突然変異を含有する)の1,911
bpのEcoRI断片を、それぞれpBlue-E3-Ex IV、pBlue-E4-Ex IV、pBlue-E4-185 E
x IV、pBlue-E4-202-Ex IV、pBlue-E4-229-Ex IVおよびpBlue-E4-259 Ex IVベク
ターから切り出し、pGEM7-ExII,IIIベクターのEcoRI部位にクローニングした。
これは、アポE遺伝子のエキソンII、IIIおよびIVを含有する、それぞれpGEM7-ア
ポE3g、pGEM7-アポE4g、pGEM7-アポEg-185、pGEM7-アポE4g-202、pGEM7-アポE4-
229およびpGEM7-アポE4g-259ベクターを作製した。1,911 bpのEcoRI挿入断片の
適切な方向は、NotIおよびXbaIによる制限消化によって調べた。pGEM7-アポE3g
、pGEM7-アポE4g、pGEM7-アポEg-185、pGEM7-アポE4g-202、pGEM7-アポE4-229お
よびpGEM7-アポE4g-259ベクターのHindIII-XbaI断片全体をpAd Track-CMVアデノ
ウィルスシャトルプラスミドの対応する部位にクローニングした。

【００３８】 各組換えベクターは、pAd Easy-1ヘルパーベクターと共にBJ 5183大腸菌(E. c
oli)細胞をエレクトロポレーションするために使用した。pAdEasy-1はアデノウ
ィルスのウィルスゲノムおよび長い末端反復を含有し、関心対象の遺伝子を含有
する組換えウィルスの相同組換えによる形成を可能にする。ベクターは、緑色の
蛍光により細胞および組織の感染を検出することができる緑色蛍光タンパク質遺
伝子も含有する。カナマイシンに抵抗性の組換え細菌クローンを選択し、制限エ
ンドヌクレアーゼ解析およびDNA配列決定によって関心対象の遺伝子の存在につ
いてスクリーニングした。野生型アポE3、アポE4、アポE4-185、アポE4-202、ア
ポE4-229またはアポE4-259を発現するウィルスは、それぞれAdGFP-E3、AdGFP-E4
、AdGFP-E4-185、AdGFP-E4-202、AdGFP-E4-229またはAdGFP-E4-259と命名する。
RecA欠損DH5α細胞において適切なクローンを増殖した。組換えベクターはPacI
で直線化し、911細胞に感染させるために使用した。組換えアデノウィルスの作
製および増殖に関与するその後の段階はプラークの同定/単離およびその後の911
細胞における感染および増殖であった（van Dijk、前記）。これらの段階の次に
、CsCl超遠心を2回実施する精製過程を実施し、その次にウィルスを分離し、滴
定した。通常、約5×10¹⁰ pfu/mlの力価が得られた。

【００３９】細胞培養の検討 10%ウシ胎児血清を含有する培地において集密状態まで増殖させたヒトHTB13細
胞（SW1783、ヒト神経膠星状細胞腫）に、感染効率20でAdGFP-E4、AdGFP-E4-202
、AdGFP-E4-229またはAdGFP-E4-259を感染させた。感染24時間後、細胞をリン酸
緩衝生理食塩液(PBS)で2回洗浄し、無血清培地で2時間あらかじめインキュベー
ションした。PBSでさらに洗浄した後、新鮮な無血清培地を添加した。24時間の
インキュベーション後、培地を回収し、アポE発現について酵素結合免疫吸着測
定法(ELISA)およびSDS-PAGEによって解析した。いくつかの実験では、直径60 mm
の培養物に0.5μCiの³⁵Sメチオニンで2時間代謝することにより標識し、この場
合には放射標識アミノ酸を添加してから2時間後に培地を回収してさらに解析し
た。

【００４０】細胞の培地に分泌されたアポE含有リポタンパク質の分離 細胞を³⁵Sメチオニンで標識した後、直径100 mmの培養皿から2 mlの培地を取
り、KBrで密度1.35g/mlに調整し、密度1.25g/ml、1.115g/ml、1.06g/mlのKBr溶
液各2 mlおよび通常の生理食塩液2 mlを重層した。混合物をSW-41ローターで30,
000 rpmにおいて24時間遠心分離した。いくつかの試験管において、密度勾配超
遠心によって事前に血漿から分離しておいた密度1.006〜1.21 g/mlのリポタンパ
ク質画分0.8mlを培地に混合した。超遠心後、1 mlの12個の画分を回収し、SDS-P
AGEおよびオートラジオグラフィーによって解析した。アポE4およびアポE4-202
は共に、LDLからHDL領域に浮遊する外因性リポタンパク質に結合することができ
ることをこの解析は示した。

【００４１】アポE欠損マウスにおける動物の検討 20〜25週齢の雌アポE欠損マウス(van Ree et al、Atherosclerosis 111:25、1
994)をこれらの検討に使用した。各群の平均コレステロールおよびトリグリセリ
ドレベルを同じにするために、実験開始前に、血漿コレステロールおよびトリグ
リセリドレベルに基づいて、マウス群を形成した。5×10⁸〜1×10¹⁰ pfuの用量
範囲のAdGFP（対照アデノウィルス）、AdGFP-E4もしくはAdGFP-E4-202ウイルス
、または4×10⁹ pfuのAdGFP-E4-229もしくはAdGFP-E4-259を尾静脈を介してマウ
スに静脈内注射した。各群は8〜10匹のマウスを含んだ。アデノウィルス注射の
前に、4時間の絶食後に尾静脈または後方眼窩叢から採血した。注射後示した日
数経過時に、CB300またはCB1000採血管（Sarstedt）に血液を収集した。血漿ア
リコートを4℃および-20℃において保存した。マウス肝臓のmRNA発現を解析でき
るように、各群の1匹またはそれ以上の動物を示した経過日数の各時点において
屠殺した。

【００４２】血清試料のFPLC分析 AdGFP、AdGFP-E4、AdGFP-E4-185またはAdGFP-E4-202処理マウスの血清試料のF
PLC分析では、12μlの血清をPBSで1:5希釈した。次いで、試料をスマートマイク
ロFPLCシステム（SMART micro FPLC system）(Pharmacia)のセファロース（Seph
arose）6カラムにのせ、PBSで溶出した。さらに分析するために各々50μl容量の
合計25画分を回収した。AdGFP-E4-229またはAdGFP-E4-259処理マウスの試料では
、100μlの血清をPBSで1:1希釈し、マイクロFPLCシステムの代わりに通常のFPLC
システムを使用して同様に分析を実施した。各々250μlの合計60画分を回収した
。

【００４３】トリグリセリドおよびコレステロール分析 10μlの血清試料を40μlのリン酸緩衝生理食塩液(PBS)で希釈し、製造業者の
指示により、GPO-トリンダーキット（GPO-Trinder Kit）（Sigma）およびCHOL-M
PR3キット（Boehringer-Mannheim）を使用してトリグリセリドおよびコレステロ
ールについて分析した。トリグリセリドおよびコレステロール濃度は、それぞれ
、540 nmおよび492 nmにおいて分光光度計により測定した。FPLC画分のトリグリ
セリド分析は、TGバッファー（TG-Buffer）(Sigma)を使用して実施し、製造業者
の指示により、492 nmにおいて分光光度計で濃度を測定した。FPLC画分のコレス
テロール分析は、上記のように実施した。

【００４４】ヒトアポEタンパク質レベルの定量 血清ヒトアポE4濃度は、サンドイッチELISAを使用して測定した（Kimら、J. B
iol. Chem. 271:8373-8380、1996）。親和性精製したポリクローナルヤギ抗ヒト
アポE抗体をコーティングに使用し、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合したポ
リクローナルヤギ抗ヒトアポEを二次抗体として使用した。西洋ワサビペルオキ
シダーゼに結合したヤギ抗ヒトアポEを含む培養皿をインキュベーションした後
、テトラメチルベンジジンを基質として用いた免疫ペルオキシダーゼ手法を使用
して検出を実施した。アポEレベルが既知の健康なヒト被験者からプールした血
漿を標準として使用した。

【００４５】密度勾配超遠心によるVLDLの単離 アデノウィルス感染マウスおよびアポE欠損マウスから採取した500μlの血清
試料を、1.21 g/ml KBr 2 ml、1.063 g/ml KBr 2.5 ml、1.019 g/ml KBr 2.5 ml
およびddH2O 2 mlを含むKBr溶液に重層した。試料を40,000 rpmにおいて16時間
超遠心し、VLDL画分を含有する濃度勾配の最上層の1 mlを単離した。

【００４６】 VLDL粒子のアポE濃縮 アポE欠損マウスの血漿から単離した500μlのVLDLに、それぞれ、AdGFP-E4、A
dGFP-E4-202、AdGFP-E4-229またはAdGFP-E4-259を感染させたHTB細胞が分泌した
250μgのアポE4、アポE4-202、アポE4-229またはアポE4-259を含有する培地を混
合し、最終容量1 mlとした。混合物は、37℃において1時間振とう器上でインキ
ュベーションし、次いで密度勾配遠心分離を実施してVLDL結合アポEから遊離の
アポEを分離した。次いで、アポEに富むVLDLおよび遊離のアポE画分を単離し、S
DS-PAGEおよびELISAによってアポE濃度を解析した。

【００４７】SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびウェスタンブロット解析 各リポタンパク質画分から、7.5μgのタンパク質の試料を、12%ゲルのSDS-ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)によってアポリポタンパク質について
解析した。銀染色またはクーマシーブリリアントブルー染色によってタンパク質
を検出した。

【００４８】RNAの単離とハイブリダイゼーション解析 製造業者の指示により、RNAイージー液（RNA Easy Solution)（RNA Insta-Pur
e、Eurogentec Belgium）を使用して感染マウスの肝臓試料から全RNAを単離した
。ノーザンブロット解析では、RNA試料(15μg)を変性させ、1.0%ホルムアルデヒ
ド-アガロースゲルの電気泳動によって分離した。完全性とローディング作業の
均等性を立証するためにRNAを臭化エチジウムで染色し、次いでジーンスクリー
ンプラス（GeneScreen Plus）(DuPont NEN)に移した。RNAは、0.12ジュール/cm² のUVを30秒照射することによって（Stratalinker、Stratagene）膜に架橋した。
ランダムプライミングによって調製したプローブを、2.0×10⁶ cpm/ml[³²P]-標
識DNAと共に以前に記載したように使用した（Kypreosら、J. Cell. Biochem. 68
:247-258、1998）。モレキュラー ダイナミクス ホスホリメージャー（Molecula
r Dynamics phosphorimager）(400B型)を使用して、スキャニング濃度測定によ
る定量を実施した。アポE mRNA発現はGAPDH mRNAレベルについて標準化し、棒グ
ラフの形態で報告した。実験は3通り実施し、平均値としてデータを報告してあ
る（図4A、4B、11Aおよび11B）。

【００４９】アデノウィルスが感染したHTB-13細胞培養物が分泌したリポタンパク質とアポE4 -202の結合 内因性アポEを合成しないHTB-13細胞に、それぞれAdGFP-E4およびAdGFP-E4-20
2と命名した、アポE4またはアポE4-202発現する組換えアデノウィルスを感染効
率20で感染させた。SDS-PAGEおよびサンドイッチELISAによる培地の解析は、ア
ポE4およびアポE4-202は共に、AdGFP-E4またはAdGFP-E4-202の感染から24時間後
に、1 mlあたり60〜80μgの範囲のかなりのレベルが効率的に分泌されることを
示した。大多数のアポEは低脂質または無脂質画分に存在したが、アポE4および
アポE4-202は、密度1.04〜1.21g/ml画分において外因的に添加したリポタンパク
質と結合することができることを密度勾配超遠心により示された（図2Aおよび2B
）。切断型アポE形態のアポE4-202は、受容体媒介性リポタンパク質除去に必要
とされる過程である、事前に存在するリポタンパク質粒子と結合する能力を有す
ることをデータは示している。アポE4およびアポE4-202がリポタンパク質残存物
と結合する能力をさらに立証するために、等量のアポE4およびアポE4-202を、ア
ポE欠損マウスの血漿から単離した血清と混合し、37℃において1時間インキュベ
ーションした。次いで、混合物に密度勾配超遠心を実施した。次いで、遊離およ
びリポタンパク質結合アポEの量はELISAによって定量的に評価され、SDS-PAGEで
分画し、次にゲルをクーマシーブリリアントブルー染色し、アポEバンドの強度
をウシ血清アルブミン(BSA)標準と比較することによって定性的に評価した。図2
Cおよび2Dに示すように、全長のアポE4および切断型アポE4-202は共にVLDLと結
合する。

【００５０】HTB-13細胞によるアポE4-185の同様のレベルの発現および分泌 HTB-13細胞によって分泌されるアポE4-185の量を、これらの細胞によって分泌
されるアポE3、アポE4およびアポE-202の量と比較した。このアッセイ法では、
上記のように、アポE3、アポE4、アポE4-202またはアポE4-185を発現する組換え
アデノウィルスを感染効率20でHTB-13細胞に感染させた。全長および切断型アポ
Eは、感染から24時間後には1 mlあたり約60〜70μgの範囲のアポEのかなりのレ
ベルが培地に分泌されることをサンドイッチELISAによる培地の解析は示した。
この結果は、アポE4およびアポE4-202について上記の実験から得られる1mlあた
り60〜80μgの範囲のアポEとほぼ同じである。既知のBSA標準を使用した分泌タ
ンパク質のSDS-PAGE解析によって同様の定量的評価が得られた（図15）。

【００５１】アポE欠損マウスにおけるアポEのカルボキシ末端186〜299、203〜299、230〜299 および260〜299セグメントの高トリグリセリド血症への寄与 インビボにおいてアポE4およびアポE4-202が高脂血症に及ぼす影響を評価する
ために、アポE欠損マウス（アポE-/-）に、それぞれ組換えアデノウィルスAdGFP
-E4またはAdGFP-E4-202を感染させた。ウィルス感染の非特異的と思われる影響
を評価するために、一部のマウスには対照AdGFPウィルスを感染させた。アポE4
アデノウィルス2×10⁹ pfuをマウスに感染させても対照の感染と比較してマウス
においてコレステロールレベルをあまり低下させず、重症の高トリグリセリド血
症を誘発することを解析は示した（図3Aおよび3B）。高トリグリセリド血症はア
ポE4の過剰発現の結果である。感染後8日目にアポE4の発現が低下する場合また
は感染に使用した用量が低い場合には、高トリグリセリド血症も低下するかまた
は排除される（図3A）。マウスに2×10⁹または10¹⁰ pfuさえのAdGFP-E4-202アデ
ノウィルスを感染させた場合に、高トリグリセリド血症は誘発されなかった（図
3A）。対照ウィルスAdGFPは、アポE欠損マウスのコレステロールおよびトリグリ
セリドレベルに大きな影響を与えるとは思われず、感染過程の非特異的な影響の
可能性を除外していた。

【００５２】 アポE4-202を使用した場合に観察された結果と同様に、アポE欠損マウスに4×
10⁹ pfuのAdGFP-E4-229またはAdGFP-E4-259を感染させると、高トリグリセリド
血症を誘発することなく、コレステロールレベルを低下した（図8Aおよび8B）。
さらに、アポE欠損マウスに1×10¹⁰ pfuのアポE4-185発現ウィルスを感染させる
と、高トリグリセリド血症を誘発することなく、コレステロールレベルを正常化
した（図16Aおよび16B）。アポEのアミノ末端残基1〜185は、アポE-/-マウスの
血漿中に蓄積するリポタンパク質残存物の除去に必要な決定因子全てを含有する
ことをこの所見は示している。

【００５３】正常なC57BL6マウスにおける高コレステロール血症および高トリグリセリド血症 へのカルボキシ末端203〜299の寄与 ヒトアポEのマウスの過剰発現によってアポE-/-マウスに誘発した高トリグリ
セリド血症は、アポE-/-マウスにおける基礎的な高コレステロール血症の結果と
思われる。または、全長のアポEはそれ自体血漿高脂質レベルを誘発すると思わ
れる。これら2つの可能性を見分けるために、正常なC57BL6マウス（アポE+/+）
に、アポE3、アポE4またはアポE4-202を発現する1〜2×10⁹ pfuのアデノウィル
スを感染させた。アポE3またはアポE4のどちらかの過剰発現は正常なC57BL6にお
いて複合高脂血症（高コレステロールおよびトリグリセリドレベル）を誘発する
ために十分であることをこの解析は示した。一方、アポE4-202の過剰発現はC57B
L6マウスのトリグリセリドレベルに検出できるほどの影響を与えなかった（図16
Aおよび16B）。この結果は、全長のアポEの過剰発現は正常なC57BL6マウスまた
はアポE-/-マウスにおいて複合高脂血症を生じるために十分であることを示して
いる。さらに、高脂血症の誘発には、アポEのカルボキシ末端領域が必要である
。本発明を特定の理論に制限するつもりはないが、カルボキシ末端203〜299領域
内のアポEのドメインは、肝臓で効率的に除去されないリポタンパク質粒子の分
泌の直接的な一因となり、血漿コレステロールおよびトリグリセリドレベルが高
くなる可能性がある。

【００５４】インビボにおけるアポE4、アポE4-185、アポE4-202、アポE4-229およびアポE4-2 59 mRNAの同様な発現 それぞれ、AdGFP-E4、AdGFP-E4-202、AdGFP-E4-229またはAdGFP-E4-259を感染
させたアポE欠損マウスにおいてアポE4、アポE4-202、アポE4-229およびアポE4-
259 mRNAの発現を評価するために、各群の少なくとも3匹の感染マウスを感染後5
日目に屠殺し、肝臓を採取した（図8Aおよび8B）。全RNAをこれらの肝臓から単
離し、ノーザンブロット解析によってアポE mRNA発現について解析した。図4A、
4B、11Aおよび11Bに示すように、2×10⁹ pfu用量のAdGFP-E4を感染させたマウス
におけるアポE mRNAレベルは、1×10¹⁰ pfuのAdGFP-E4-202または4×10⁹ pfuのA
dGFP-E4-229もしくはAdGFP-E4-259を感染させたマウスにおけるものとほぼ同じ
である。しかし、アポE4-202、アポE4-229およびアポE4-259は、全長のアポE4と
異なり、高トリグリセリド血症を生じないが、高コレステロール血症（血中高コ
レステロールレベル）を効果的に矯正する。従って、高トリグリセリド血症に対
するアポE4とアポE4-202、アポE4-229またはアポE4-259の影響の差は、これらの
アポE型間の発現レベルの差によるのもではない。

【００５５】 さらに、AdGFP-E4-185を感染させたアポE欠損マウスにおける定常状態のアポE
4-185 mRNAレベルを、AdGFP-E4を感染させたマウスの全長のアポE4 mRNAの対応
するレベルと比較した。この比較のために、各群の少なくとも2〜3匹の感染マウ
スを感染後5日目に屠殺し、上記のように肝臓を採取した。全RNAをこれらの肝臓
から単離し、ノーザンブロット法によってアポE mRNAについて解析した。18Sリ
ボソームRNAのゲルの臭化エチジウム染色をRNAが等しくのせられ、完全である指
標として使用した（図17A）。1×10¹⁰ pfuのAdGFP-E4-185を感染させたアポE-/-
マウスのアポE mRNAレベルは、2×10⁹ pfuのAdGFP-E4を作用させたマウスのmRNA
レベルより大きい（図17A）。しかし、アポE4-185は、高コレステロールおよび
トリグリセリドレベルを生じる全長のアポEとは異なり、高脂血症を生じない（
図17Bおよび17C）。従って、アポE4-185が高脂血症を誘発しないのは、これら2
つのアポE型間の発現の差によらない可能性が高い（図17A-C）。

【００５６】 対応するアデノウィルスを感染させた正常なC57BL6マウスにおけるアポE3、ア
ポE4またはアポE4-202のmRNAレベルを比較した。図15の細胞培養データと一致し
て、アポE3、アポE4またはアポE4-202（アポE3およびアポE4-202は2×10⁹用量で
、アポE4は1×10¹⁰ pfuの用量）を発現するアデノウィルスを感染させたC57BL6
マウスにおけるアポE mRNAレベルは同等である（図17A）。

【００５７】AdGFP-E4、AdGFP-E4-202、AdGFP-E4-229、AdGFP-E4-259または対照ウィルスAdGF Pを感染させたマウスから単離した血漿のコレステロール、トリグリセリドおよ
びアポEFPLC特性 アデノウィルスを感染させたアポE欠損マウスの血漿のFPLC分析は、アポE4を
発現するマウスでは、感染後5日目には、コレステロールの72%はVLDL画分に分布
し、約18%はHDL画分に分布することを示した（図5A）。感染後8日目には、AdGFP
-E4を感染させたマウスでは、VLDL/HDLコレステロールの比は約1:1であった（図
5C）。AdGFP-E4-202を感染させたマウスでは、2×10⁹または10¹⁰ pfuのアデノウ
ィルスを使用した場合、コレステロールはVLDLおよびHDL3画分に分布し、HDLコ
レステロールに対するVLDLコレステロールの比は感染後5日目および8日目に約3:
2であった（図5Bおよび5D）。予測されるように、2×10⁹ pfuの対照ウィルスAdG
FPの感染は、アポE欠損マウスのコレステロールおよびトリグリセリド特性にい
かなる変化も生じなかった（データは示していない）。

【００５８】 AdGFP-E4の感染後5日目および8日目にはマウスにおいてVLDL-トリグリセリド
レベルが増加することもFPLC分析は示した（図5E、5F、10Aおよび10B）。一方、
VLDL-トリグリセリドレベルは、AdGFP-E4-202、AdGFP-E4-229、AdGFP-E4-259ま
たはAdGFPを感染させたマウスでは増加しなかった（図5E、5F、10Cおよび10D）
。

【００５９】 サンドイッチELISAによるFPLC画分の分析は、2×10⁹ pfuのAdGFP-E4を感染さ
せたマウスでは、感染後5日目に、総アポEの約50%がHDL画分に分布し、25%がVLD
L画分に分布し、残りのアポEは他のFPLC画分に分布することを示した（図6）。
一方、10¹⁰ pfuのAdGFP-E4-202を感染させたマウスでは、タンパク質は全てのリ
ポタンパク質画分に均一に分布した。リポタンパク質を含有する画分のアポE4-2
02濃度が明らかに低いのは、アポE4-202を含有するリポタンパク質の効率的な異
化作用を反映している。アポE4およびアポE4-202のレベルは、無脂質アポEを含
有するFPLC画分22〜25においてほぼ同じであり、これは、それぞれ2×10¹⁰ pfu
のAdGFP-E4または10¹⁰ pfuAdGFP-E4-202を感染させたマウスの血漿における無脂
質アポE4およびアポE4-202は同様の定常状態レベルであることを示唆している。

【００６０】 AdGFP-E4-185を感染させたアポE-/-マウスの血漿のFPLC分析は、コレステロー
ルは低いレベルで存在し、VLDL、LDLおよびHDLに約2:1:1の比で分布することを
示した（図18A）。これらのマウスにおけるトリグリセリドレベルはVLDL画分に
おいて低く、リポタンパク質画分の残りではほとんど検出されなかった（図18C
）。一方、アポE4を発現するマウスは、感染の5日後にコレステロールレベルが
高かった。コレステロールの約80%がVLDLに分布し、約20%がHDLに分布した（図1
8B）。予測されるように、トリグリセリドレベルはVLDL画分では非常に高く、リ
ポタンパク質画分の残りではほとんど検出されなかった（図18D）。追加の対照
として、2×10⁹ pfuの対照ウィルスAdGFPの感染は、アポE欠損マウスのコレステ
ロールおよびトリグリセリド特性にいかなる検出可能な変化も生じなかった。

【００６１】 血漿総アポEの平均レベルを、同一のアデノウィルスを感染させた3匹のマウス
の血漿のプールについてサンドイッチELISAによって測定した。血漿アポEタンパ
ク質の量は、アポE3およびアポE4では60〜70μg/dlであり、アポE4-202およびア
ポE4-185では1〜5μg/dlであった。

【００６２】対照およびアポE発現アデノウィルスを感染させたマウスにおけるVLDLのアポタ
ンパク質組成 密度勾配超遠心によって単離したVLDLの分析は、対照アポE-/-マウスでは、VL
DLはapoB-48、apoA-IおよびapoA-IVを含有することを示した。低い分子量領域の
拡散染色も低分子量ペプチドの存在を示した。同様に、アポE4-202を発現するマ
ウスでは、VLDLはapoB-48、apoA-I、apoA-IVおよび低分子量ペプチドを含有した
（図7A）。一方、アポE4を発現する高トリグリセリド血症マウスでは、apoB-48
およびアポE4だけが存在した。この定量的な描写は、過剰発現されているアポE
がリポタンパク質粒子のapoCIIおよび他のタンパク質と交換することを示す以前
の検討に一致している。

【００６３】VLDLトリグリセリド生成速度 異なるアポE型を感染させたマウスにおいてVLDLトリグリセリドの生成速度を
測定した。アポE切断がVLDLトリグリセリド合成に及ぼす影響を求めるために、
アポE欠損マウスに2×10⁹ pfuのAdGFP-E4、4×10⁹ pfuのAdGFP-E4-259または4×
10⁹ pfuの対照AdGFPウィルスを感染させた。感染後5日目に、アポE外来遺伝子の
発現が最大になった場合に、マウスを4時間絶食させ、VLDL異化作用を完全に阻
止することが示されているトライトン-WR1339の500 mg/kg体重量の用量で0.9%Na
Clの15%溶液(w/v)を使用して（トライトン-WR 1339)注射した(Aalto-Setalaら、
J. Clin. Invest.90: 1889-1900、1992)。次いで、トライトン-WR 1339注射後5
分、10分、20分、30分、40分、50分および60分経過時に血清試料を単離した。対
照として、洗剤を注射した直後の1分経過時に血清試料を単離した。上記のよう
に血清トリグリセリドレベルを測定し、血清トリグリセリド対時間の線グラフを
作成した。mg/dl/分単位で表されるVLDL-トリグリセリド分泌速度は、個々のマ
ウス各々の線グラフの傾きから算出した。次いで、傾きを分類し、平均±標準偏
差として棒グラフで報告した。野生型アポEは、アポE4-259または対照ウィルス
によって誘発されるものと比較して、VLDLトリグリセリド生成の劇的な増加を誘
発した（図12）。

【００６４】 VLDLトリグリセリド合成および分泌に対するアポE-185の影響を求めるために
、アポE欠損マウスに、2×10⁶ pfu用量のAdGFP-E4、2×10⁹ pfu用量のAdGFPまた
は1×10¹⁰ pfu用量のAdGFP-E4-185を感染させた。アデノウィルス感染後5日目に
、上記のように、マウスにトライトン WR 1339を注射した。トライトン WR 1339
注射後20分、40分および60分経過時に血清試料を単離した。全長のアポEを発現
するアデノウィルスを感染させたマウスにおけるトリグリセリド分泌速度は、1
×10¹⁰ pfuのAdGFP-E4-185を感染させたマウスにおけるトリグリセリド分泌速度
の8倍高かった（図19）。2×10⁹ pfuの対照AdGFPウィルスを感染させたマウスで
も、VLDLトリグリセリド分泌速度は、AdGFP-E4-185を感染させたマウスより2倍
高かった。

【００６５】 アポE4-185またはアポE4-259を発現するマウスのVLDLトリグリセリド生成速度
が、アポE4を発現するマウスの対応する速度と比較して低いことは、アポE4のカ
ルボキシ末端領域がVLDLトリグリセリド分泌速度に影響していることを示唆して
いる。VLDLトリグリセリド生成速度がこのように低下することが、切断型アポE
突然変異体は高トリグリセリド血症を誘発できないことに寄与している可能性が
ある。

【００６６】アポEポリペプチドの精製 標準的な分子生物学的技術を使用して、好適な発現系（例えば、原核細胞発現
系、真核細胞、遺伝子組換え動物または無細胞系）において使用する天然型ヒト
アポE核酸の断片または突然変異体を作製することができる（Ausubelら編、「分
子生物学の最新プロトコール（Current Protocols in Molecular Biology）」、
Vol. 1-3、1994、John Wiley and Sons, Inc.）。例えば、米国菌培養収集所（A
merican Type Culture Collection）(ATCC)、Rockville、MDから入手可能なハム
スター腎臓細胞を含む、組換え哺乳類タンパク質発現に一般的に使用される種々
の細胞において組換えアポEを発現することができる。特に、アポE2、アポE3お
よびアポE4は、ATCC製のベビーハムスター腎臓(BHK-21)細胞(CRL 6282)、Cos-1
細胞およびバキュロウィルス発現系(Aleshkovら、Biochemistry 36: 10571-1058
0)において発現されている。ゲルろ過クロマトグラフィー、硫酸アンモニウム沈
殿、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、免疫
親和性クロマトグラフィーまたはポリエチレングリコール分離などの標準的な技
術を使用して、アポEポリペプチドをこれらの系から回収し、精製することがで
きる。さらに、アポEポリペプチドは、好ましくはアルブミンの存在下において
保存前に凍結乾燥して、保存寿命を延長することができる。

【００６７】 エピトープマッピングのローラー（Lollar）らの方法を使用して、免疫原性で
ある可能性のある（すなわち、アポEポリペプチドに対する抗体を産生させる）
アポEポリペプチド中のアミノ酸を決定することができる。これらのアミノ酸は
、ポリペプチドの免疫原性を低下するために、アラニンに変更することができる
（米国特許第5,888,974号）。

【００６８】 Leu261、Thr264、Phe265、Leu268、Val269、Trp276、Leu279、Val280およびVa
l282を含むアポEの疎水性残基がリポタンパク質粒子との疎水性相互作用に関与
して、その結果リポタンパク質リパーゼを阻害する可能性がある。従って、アポ
Eのこれらの残基を極性または荷電アミノ酸に突然変異させて、アポEポリペプチ
ドによる高トリグリセリド血症の誘発を阻止することができる。

【００６９】アポEポリペプチドの投与 本発明を特定の投与様式、投与量または投与頻度に限定する意図はなく、本発
明の形態は、筋肉内、静脈内、血管内、皮下および経口を含む全ての投与形態を
考慮している。用量に応じて、投与容量を約0.2〜2.0ml/kg体重の間で変更する
ことができる。アポEポリペプチドの好ましい投与量は5〜50 mg/kg体重で、必要
に応じて、8〜24時間ごと（重症の症例の場合）から2週間ごとに少なくとも6ヶ
月間投与される。任意の特定の被験者には、個体の必要性および組成物の投与を
実施または監督する人物の専門的な判断により、特定の投与療法を経時的に調節
すべきであることが理解されるべきである。

【００７０】 マーティン（E. W. Martin）による「レミントンの製薬科学（Remington's Ph
armaceutical Sciences）」に以前に記載されているように、1種または以上のア
ポEポリペプチドを含有する薬学的組成物を調製することができる。薬学的な安
定化化合物、送達賦形剤および/または担体賦形剤を使用することができる。例
えば、第VIII因子調製物を安定化することが見出されているヒト血清アルブミン
または他のヒトもしくは動物タンパク質を使用することができる。リン脂質小胞
またはリポソーム懸濁液は、薬学的に許容される好ましい担体または送達賦形剤
である。これらは、当業者に既知の方法により調製することができる。

【００７１】 アポEポリペプチドは、第VIII因子について以前に記載されている（米国特許
第5,925,739号）、オイルが分散相である水中油型エマルジョン、オイルが連続
相である油水型エマルジョンまたは極性脂質の分散物などの添加剤と共に投与す
ることができる。デキストラン、ヒアルロン酸、加水分解コラーゲン、加水分解
ゼラチン、ポリ(0-2-ヒドロキシエチル)デンプンまたは大豆エマルジョンも生物
学的利用能を増加するために添加することができる（米国特許第5,925,739号）
。アポE調製物は、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、ポリエチレングリコール
、少なくとも0.01 mg/mlのポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルまたは
1 mMより多い量のアミノ酸をさらに含有することができる（米国特許第5,925,73
9号）。

【００７２】アポEポリペプチドの遺伝子治療送達 アポEポリペプチドを、ウィルスベクターなどの手段を使用して遺伝子治療に
より送達することができる。本発明の好ましい方法において、上記のように、ア
ポE核酸は、アデノウィルス、アデノ関連ウィルス、レトロウィルス、レンチウ
ィルス、バキュロウィルスまたはヘルペスウィルスベクターなどの組換えウィル
スのゲノムにクローニングされる。遺伝子は、細胞によって発現させられるウィ
ルス機構によって宿主細胞のゲノムに挿入される。ウィルスベクターは、複製が
欠損し、ウィルスを生成せず、宿主をウィルス感染させないように改変されてい
る。この種の治療の一般的な原理は当業者に既知であり、文献に概説されている
（Kohnら、Transfusion 29: 812-820、1989）。他の可能な送達方法には骨髄移
植、アテローム硬化型病変部位の動脈の直接感染および胎児の遺伝子操作が含ま
れる。アポE核酸を組み込んだ細胞は直接哺乳類に移植しても、またはコードさ
れるアポEポリペプチドに透過性であるが、細胞に不透過性である植え込み可能
な装置に入れ、次いで移植してもよい。

【００７３】 骨髄移植を使用した遺伝子送達のためには、内因性アポE産生骨髄細胞を破壊
するための放射線に被験者を暴露する。ドナー骨髄細胞に、インビトロにおいて
、切断型アポEを発現するレトロウィルスを感染効率約20〜50(骨髄細胞1つあた
り20〜50個のウィルス粒子)で感染させ、次いで被験者の内因性骨髄細胞を切断
型アポE産生細胞とインビボにおいて交換するために被験者に移植する。この手
法は、国立衛生研究所（the National Institutes of Health）が癌患者の骨髄
移植のために確立したプロトコールに基づいて、当業者によって実施されうる。
被験者の内因性アポEが、アポEを含有するVLDL粒子を異化作用抵抗性にし、血清
コレステロールレベルが高くなるIII型高リポタンパク質血症に関連する突然変
異を含有する被験者に対しては、この手法は血清コレステロールレベルを低下す
ることができる。組換え骨髄細胞は、アテローム性動脈硬化部位に蓄積し、治療
用の切断型アポEタンパク質を発現して、その結果アテローム性動脈硬化症を局
所的に退行させる循環性マクロファージを生成することもできる。

【００７４】 胎児の遺伝子操作では、1〜8細胞段階の胎児、卵母細胞または卵子の核を取り
出し、切断型アポEをコードする核と交換することができる。この手法は、ウシ
、ヒツジ、ウサギ、ブタおよびマウスなどの種々の哺乳類をクローニングするた
めに使用されているプロトコールに基づいて当業者によって実施されうる（例え
ば、Pratherら、Biol. Repord. 37: 859-866、1987: Willadsen、Nature 320: 6
3-65、1986; SticeおよびRobl、Biol Reprod. 39: 657-664、1989; Pratherら、
Biol. Reprod. 41: 414-418、1989; Tsunodaら、J. Exp. Zool. 242: 147-151、
1987参照）。

【００７５】アポE核酸の投与 本発明のアポE核酸は、静脈内または血管内にも投与することができる。他の
可能な送達方法には、骨髄移植、アテローム硬化型病変部位の動脈への直接感染
および/またはトランスフェクション、胎児の遺伝子操作が含まれる。好ましく
は、核酸はリポソームおよびプロタミンと組み合わせて投与される。任意の特定
の被験者には、個体の必要性および組成物の投与を実施または監督する人物の専
門的な判断により、特定の投与療法を経時的に調節するべきである。好ましい用
量は、血清1 dlあたり3 mgのアポE核酸である。

【００７６】他の態様 本出願に記載されている文献および特許出願は全て、個々の文献または特許出
願各々が参照として組み入れられていることが詳細に且つ個別に示されている場
合と同じ程度に、参照として本明細書に組み入れられている。

【００７７】 本発明は、本発明の具体的な態様に関連して記載されているが、本発明はさら
に改良することができ、本出願は、一般に、本発明の原則に準じ、本発明が属す
る技術分野において既知または習慣的な実施の範囲内にあり、本明細書に以前に
記載した本質的な特徴に適用でき、添付の請求の範囲内で追従される、本発明の
開示からのこのような逸脱を含む、本発明の任意の変更、用途または適応を含む
意図があることが理解されると思われる。

【００７８】 他の態様は本発明の特許請求の範囲内である。

【図面の簡単な説明】

【図１】 本発明のアポE4-202プラスミドの作製へ導く段階の概要を図示し
たものである。対応するアポE4-185、アポE4-229、およびアポE4-259プラスミド
の作製について、同じ方法が使用された。

【図２】 図2Aおよび図2Bは、1.04 g/ml〜1.21 g/mlの密度画分において、
アポE4および切断型アポE4-202のリポタンパク質と結合する能力を示すタンパク
質ゲルの図である。図2Cおよび図2Dは、アポE4およびアポE4-202のVLDL粒子と結
合する能力を示すタンパク質ゲルの図である。

【図３】 図3Aは、アポE4を発現する組換え体アデノウイルスがアポE欠損
マウスにおいてトリグリセリドレベルを増加させることを示す棒グラフである。
対照的に、アポE4-202を発現する組換え体アデノウイルスはこの増加を引き起こ
さない。図3Bは、アポE4-202を発現する組換え体アデノウイルスが、完全長アポ
Eを発現する対応するウイルスより、アポE欠損マウスにおいてコレステロールレ
ベルに大幅な減少を生じることを示す棒グラフである。

【図４】 アポE4またはアポE4-202を発現する組換え体アデノウイルスがmR
NAの比較できる量を合成することを示す、図4Aが棒グラフであり、かつ図4Bがゲ
ルの図である。

【図５】 図5A〜図5Dは、AdGFP-E4-202で感染させたアポE欠損マウスはAdG
FP-E4またはAdGFP対照で感染させたものより感染後5日および8日においてコレス
テロールレベルが低く、コレステロールの大部分がVLDL領域に見出されたことを
示すグラフである。図5Eおよび図5Fは、AdGFP-E4で感染後5日および8日において
マウスにおけるVLDL-トリグリセリドレベルの増加を示すグラフである。対照的
に、AdGFP-E4-202での感染ではトリグリセリドレベルを増加させなかった。

【図６】 AdGFP-E4またはAdGFP-E4-202で感染させたアポE欠損マウスの血
漿は、脂質を含まないアポEタンパク質(画分22〜25)についてはほぼ同じレベル
であることを示すグラフである。AdGFP-E4で感染させたマウスの血漿において、
ELISAによる測定では、総アポEの約50%がHDL画分に、25%がVLDL画分に分布し、
残りのタンパク質が他のFPLC画分にわたって分布している。AdGFP-E4-202で感染
させたアポE欠損マウスにおいて、切断型アポEタンパク質はAdGFP-E4で感染させ
たマウスにおいての完全長アポEより低いレベルで存在し、かつすべてのリポタ
ンパク質画分において一様に分布している。

【図７】 図7Aは、アポE4を発現する組換え体アデノウイルスで感染させた
アポE欠損マウスにおいて、アポE4がVLDL密度粒子から他のタンパク質を置換す
ることを示すタンパク質ゲルの図である。アポE4-202を発現する組換え体アデノ
ウイルスで感染させたマウスにおいては、VLDL密度粒子から他のタンパク質の置
換は検出されない。図7Bは、アポE4によるVLDL密度粒子から他のタンパク質の置
換がどのようにして高トリグリセリド血症の原因となりうるかを示す概要図であ
る。図7Cは、アポEの推定されるドメインの概要図である。

【図８】 AdGFP対照(アポEなし)、AdGFP-E4、AdGFP-E4-229、またはAdGFP-
E4-259で感染させたアポE欠損マウスにおいて、血清のトリグリセリドレベル(図
8A)およびコレステロールレベル(図8B)のインビボの時間経過解析を示す棒グラ
フである。切断されたE4-229型またはE4-259型を発現するアデノウイルスの4×1
0⁹ pfu投与量でのアポE欠損マウスの感染により、血清トリグリセリドのレベル
を増加させることなく、コレステロールのレベルを著しく低下させた。対照的に
、野生型E4を発現するアデノウイルスの2×10⁹ pfu投与量での感染では、コレ
ステロールの低下は見られず、かつ血清トリグリセリドレベルにおいて劇的な増
加を引き起こす。対照ウイルスAdGFPはアポE欠損マウスの基礎的(日数0)なコレ
ステロールおよびトリグリセリドレベルに少しも影響が見られない。

【図９】 2×10⁹ pfuのAdGFP-E4もしくは4×10⁹ pfuのAdGFP対照ウイルス(
図9Aおよび図9B)または4×10⁹ pfuのAdGFP-E4-229もしくは4×10⁹ pfuのAdGFP-E
4-259(図9Cおよび図9D)で感染させたアポE欠損マウスからの血清試料のコレステ
ロールFPLCリポタンパク質特性を示すグラフである。感染後5日および8日におい
て、血清試料を採取し、かつセファロース6のカラムでFPLCにより分画した。そ
れから画分をコレステロール含有量について分析した。

【図１０】 2×10⁹ pfuのAdGFP-E4もしくは4×10⁹ pfuのAdGFP対照ウイル
ス(図10Aおよび図10B)または4×10⁹ pfuのAdGFP-E4-229もしくは4×10⁹ pfuのAd
GFP-E4-259(図10Cおよび図10D)で感染させたアポE欠損マウスからの血清試料の
トリグリセリドFPLCリポタンパク質特性を示すグラフである。感染後5日および8
日において、血清試料を採取し、かつセファロース6のカラムでFPLCにより分画
した。それから画分をトリグリセリド含有量について分析した。

【図１１】 図11Aおよび図11Bは、野生型アポE4、アポE4-229およびアポE4
-259のインビボでのmRNA発現を示すノーザンブロットおよび棒グラフである。Ad
GFP-E4、AdGFP-E4-229またはAdGFP-E4-259ウイルスの示された投与量で感染させ
たアポE欠損マウスを感染後5日に屠殺し、肝臓試料を採取した。それから、肝臓
試料から全RNAを単離し、アポEおよびGAPDHの発現についてノーザンブロット解
析法により解析した；代表的なオートラジオグラムは図11Aに示す。GAPDHのmRNA
レベルに対して標準化されたアポEのmRNAレベルは図11Bにグラフ化され、すべて
の3つのアポEのmRNAは同じようなレベルで発現している。アポE4は高トリグリセ
リド血症を引き起こし、コレステロールを除去することができず；対照的に、ア
ポE4-229およびアポE4-259は高トリグリセリド血症という望まれない副作用なし
に劇的にコレステロールを下げる(図11Cおよび図11D)。

【図１２】 AdGFP-E4-259、AdGFP-E4、または対照AdGFPウイルスで感染さ
せたアポE欠損マウスについてインビボでのVLDLトリグリセリド生成の平均速度
の棒グラフである。野生型アポE4は、VLDLトリグリセリド生成において、アポE4
-259または対照ウイルスによって引き起こされるそれに比べて劇的な増加を引き
起こす。このアポE4-259がVLDLトリグリセリド生成を引き起こせないことは切断
型アポE変異体の高トリグリセリド血症を誘発できないことの一因と思われる。

【図１３】 アポE4-229およびアポE4-259は大きい(最低密度)アポE欠損VLD
L粒子との結合に加えて、より小さい(より高密度)アポE欠損VLDL粒子と結合する
ことができることを示すゲル図である。ゲルの各レーンの下の数は、ELISAによ
り測定した時の、各レーンに存在するアポE4のmg/dlでの量を表す。アポEのアポ
E欠損VLDLへの結合度は野生型アポE4およびアポE4-229ならびにアポE4-259の切
断型については類似している。アポE4の切断型は、大きさがより小さくかつトリ
グリセリドの組成がより低いより高密度VLDL粒子に対して、野生型アポEより大
量に結合する。

【図１４】 野生型アポE、アポE-229、またはアポE-259の過剰発現のVLDL
およびカイロミクロンのインビボでの異化における影響のモデル概要図である。

【図１５】 アポE3、アポE4、アポE4-202またはアポE4-185を発現するアデ
ノウイルスで感染させたHTB-13細胞の培地のSDS-PAGE解析図である。培地の15
μlを解析した。「マーカー」は異なる分子量のタンパク質マーカーを指す。

【図１６】 対照のアデノウイルスAdGFP、野生型アポEを発現する組換え体
アデノウイルス、または切断型アポEを発現する組換え体アデノウイルスのいず
れかで感染させたアポE欠損マウスおよびC57BL6マウスのコレステロールおよび
トリグリセリドレベルのそれぞれの棒グラフである。マウスは示された組換え体
アデノウイルスの示された投与量で3通り感染させ、血清試料を単離し、本明細
書に記載のように、感染後の示された日数においてコレステロールおよびトリグ
リセリドレベルについて分析した。

【図１７】 図17Aは、対照のアデノウイルスAdGFP、野生型アポEを発現す
る組換え体アデノウイルス、または切断型アポEを発現する組換え体アデノウイ
ルスの示された投与量で感染させたマウスのノーザンブロット解析の代表的なオ
ートラジオグラムの図である。全RNAを感染後示された日数において感染したマ
ウスの肝臓から単離し、かつアポE mRNAの発現についてノーザンブロット法によ
り解析した。図17Aはまた、完全なものをのせているRNAの対照として18Sリボソ
ームRNAについてのゲルのエチジウムブロミド染色を示す。図17Bは、発現された
個々のマウスのmg/dlでのトリグリセリドレベルを示す棒グラフである。図17Cは
、発現された個々のマウスのmg/dlでのコレステロールレベルを示す棒グラフで
ある。

【図１８】 アポE4-185(それぞれ図18Aおよび図18C)またはアポE4(それぞ
れ図18Bおよび図18D)を発現するアデノウイルスで感染させたマウスのコレステ
ロールおよびトリグリセリドのFPLC特性のグラフである。AdGFP-E4を発現する組
換え体アデノウイルスの2×10⁹ pfuまたはAdGFP-E4-185を発現する組換え体アデ
ノウイルスの1×10¹⁰ pfuのいずれかでのマウスの感染後5日において、血清試料
を得た。これらの血清試料をFPLCにより分画し、各FPLC画分のコレステロールお
よびトリグリセリドレベルを本明細書に記載のように測定した。

【図１９】 AdGFP、AdGFP-E4、またはAdGFP-E4-185で感染させたマウスに
おいて肝臓のVLDL-トリグリセリド生成解析の平均速度の棒グラフである。棒グ
ラフはウイルス群につきVLDL-トリグリセリド生成の個々の速度の平均の+/-標準
偏差を表す。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 9/10 １０１ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ０７Ｋ 14/775 Ａ６１Ｋ 37/02 (31)優先権主張番号 ０９／８２７，８５４ (32)優先日 平成13年４月５日(2001．4．5) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＯ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ， ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，Ｉ Ｓ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ， ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，Ｐ Ｔ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ザニス バシリス アイ． アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 ニ ュートン ハートマン ロード 150 (72)発明者 キプリオス キリアコス イー． ギリシア共和国 ロードス イアリソス− ロードス テミストクリ ４ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA65 CA04 CA05 DA02 DA03 EA02 EA04 FA02 GA11 GA18 HA03 HA17 4C084 AA01 AA02 AA07 AA13 BA01 BA02 BA08 BA21 CA18 CA53 DC50 MA66 NA14 ZA452 ZC332 ZC422 4C087 AA01 AA02 BC83 MA66 NA14 ZA45 ZC33 ZC42 4H045 AA10 AA30 BA10 CA40 EA27 FA74 GA05 GA22 GA23 GA25 GA26

Claims (49)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 成熟した天然型ヒトアポE（apoE）ポリペプチドのアミノ酸1
   〜299位の対応領域のアミノ酸配列と少なくとも50%同一のアミノ酸配列を有し、
   哺乳類に投与または哺乳類において発現させる場合、高トリグリセリド血症を誘
   発することなく血清の総コレステロールレベルを低下する、アミノ酸150〜299位
   のポリペプチドをコードする核酸。
2. 【請求項２】 成熟した天然型ヒトアポEの対応する領域と少なくとも80%同
   一なアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、請求項1に記載の核酸。
3. 【請求項３】 成熟した天然型ヒトアポEの対応する領域と100%同一のアミ
   ノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、請求項2に記載の核酸。
4. 【請求項４】 コードされるポリペプチドのアミノ酸配列が、成熟した天然
   型ヒトアポEポリペプチドのアミノ酸残基1位からはじまる対応する領域と少なく
   とも80%同一である、請求項1に記載の核酸。
5. 【請求項５】 コードされるポリペプチドが、成熟したアポEの領域に機能
   的に結合したシグナルペプチドを有する、請求項1に記載の核酸。
6. 【請求項６】 コードされるポリペプチドがアミノ酸150〜215個を含む、請
   求項1に記載の核酸。
7. 【請求項７】 コードされるポリペプチドがアミノ酸203個を含む、請求項1
   に記載の核酸。
8. 【請求項８】 配列番号：14〜配列番号：19のいずれか1つのアポEタンパク
   質前駆体の残基1〜203をコードする、請求項1に記載の核酸。
9. 【請求項９】 コードされるポリペプチドがアミノ酸220個を含む、請求項1
   に記載の核酸。
10. 【請求項１０】 配列番号：14〜配列番号：19のいずれか1つのアポEタンパ
    ク質前駆体の残基1〜220位をコードする、請求項1に記載の核酸。
11. 【請求項１１】 コードされるポリペプチドがアミノ酸247個を含む、請求
    項1に記載の核酸。
12. 【請求項１２】 配列番号：14〜配列番号：19のいずれか1つのアポEタンパ
    ク質前駆体の残基1〜247位をコードする、請求項1に記載の核酸。
13. 【請求項１３】 コードされるポリペプチドがアミノ酸227個を含む、請求
    項1に記載の核酸。
14. 【請求項１４】 配列番号：14〜配列番号：19のいずれか1つのアポEタンパ
    ク質前駆体の残基1〜227位をコードする、請求項1に記載の核酸。
15. 【請求項１５】 成熟した天然型ヒトアポEのアミノ酸1〜299位の対応領域
    と少なくとも50%同一のアミノ酸配列を有し、哺乳類に投与または哺乳類におい
    て発現させる場合、高トリグリセリド血症を誘発することなく血清の総コレステ
    ロールレベルを低下することができる、アミノ酸150〜299個のポリペプチド。
16. 【請求項１６】 成熟した天然型ヒトアポEの対応する領域と少なくとも80%
    同一なアミノ酸配列を有する、請求項15に記載のポリペプチド。
17. 【請求項１７】 成熟した天然型ヒトアポEの対応する領域と100%同一のア
    ミノ酸配列を有する、請求項16に記載のポリペプチド。
18. 【請求項１８】 成熟した天然型ヒトアポEポリペプチドのアミノ酸残基1位
    から始まる対応する領域と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を有する、請
    求項15に記載のポリペプチド。
19. 【請求項１９】 アミノ酸配列150〜215個を含む、請求項15に記載のポリペ
    プチド。
20. 【請求項２０】 配列番号：1〜配列番号：6のいずれか1つの成熟した未変
    性ヒトアポEのアミノ酸1〜185位と同一のアミノ酸配列を有する、請求項15に記
    載のポリペプチド。
21. 【請求項２１】 配列番号：1〜配列番号：6のいずれか1つの成熟した未変
    性ヒトアポEのアミノ酸1〜202位と同一のアミノ酸配列を有する、請求項15に記
    載のポリペプチド。
22. 【請求項２２】 配列番号：1〜配列番号：6のいずれか1つの成熟した未変
    性ヒトアポEのアミノ酸1〜229と同一のアミノ酸配列を有する、請求項15に記載
    のポリペプチド。
23. 【請求項２３】 配列番号：1〜配列番号：6のいずれか1つの成熟した未変
    性ヒトアポEのアミノ酸1〜259位と同一のアミノ酸配列を有する、請求項15に記
    載のポリペプチド。
24. 【請求項２４】 哺乳類において高トリグリセリド血症を誘発することなく
    、コレステロールを低下し、アテローム性動脈硬化症の発症を遅延するまたはア
    テローム性動脈硬化症を治療する方法であって、成熟した天然型ヒトアポEのア
    ミノ酸1〜299位の対応領域と少なくとも80%同一のアミノ酸配列を有し、哺乳類
    に投与または哺乳類において発現させる場合、高トリグリセリド血症を誘発する
    ことなく血清の総コレステロールレベルを低下することができる、アミノ酸150
    〜299個のポリペプチドを哺乳類に投与する段階を含む、方法。
25. 【請求項２５】 哺乳類が、正常に機能する内因性のアポE遺伝子を欠損し
    ている、請求項24に記載の方法。
26. 【請求項２６】 哺乳類が、リポタンパク質残存物が血流中に蓄積すること
    によりアテローム性動脈硬化症を発症する危険性がある、請求項24に記載の法王
    。
27. 【請求項２７】 哺乳類が、残存物除去不能である、請求項26に記載の方法
    。
28. 【請求項２８】 哺乳類が、正常に機能する内因性のLDL受容体を欠損して
    いる、請求項24に記載の方法。
29. 【請求項２９】 ポリペプチドが、哺乳類の筋肉内、静脈内または皮下に投
    与される、請求項24に記載の方法。
30. 【請求項３０】 哺乳類において高トリグリセリド血症を誘発することなく
    、コレステロールを低下し、アテローム性動脈硬化症の発症を遅延またはアテロ
    ーム性動脈硬化症を退行させる方法であって、成熟した天然型ヒトアポEポリペ
    プチドのアミノ酸1〜299位の対応領域のアミノ酸配列と少なくとも80%同一のア
    ミノ酸配列を有し、哺乳類に投与または哺乳類において発現させる場合、高トリ
    グリセリド血症を誘発することなく血清の総コレステロールレベルを低下する、
    アミノ酸150〜299個のポリペプチドをコードする核酸を前記哺乳類に投与するか
    、または該哺乳類において発現させる段階を含む、方法。
31. 【請求項３１】 核酸がプロモーターに機能的に結合し、発現ベクター内に
    含有される、請求項30に記載の方法。
32. 【請求項３２】 核酸が、リポソームおよびプロタミンと組み合わされて哺
    乳類に静脈内投与される、請求項30に記載の方法。
33. 【請求項３３】 核酸が組換えウィルスベクター内に含有される、請求項30
    に記載の方法。
34. 【請求項３４】 ベクターが静脈内投与される、請求項33に記載の方法。
35. 【請求項３５】 ベクターが骨髄移植によって投与される、請求項33に記載
    の方法。
36. 【請求項３６】 ベクターが病変部位の動脈に投与される、請求項33に記載
    の方法。
37. 【請求項３７】 ベクターがアデノウィルスベクターである、請求項33に記
    載の方法。
38. 【請求項３８】 ベクターがアデノ関連ウィルスベクターである、請求項33
    に記載の方法。
39. 【請求項３９】 ベクターがレンチウィルスベクターである、請求項33に記
    載の方法。
40. 【請求項４０】 ベクターがヘルペスウィルスベクターである、請求項33に
    記載の方法。
41. 【請求項４１】 ベクターがレトロウィルスベクターである、請求項33に記
    載の方法。
42. 【請求項４２】 ベクターがバキュロウィルスベクターである、請求項33に
    記載の方法。
43. 【請求項４３】 哺乳類が、正常に機能する内因性のアポE遺伝子を欠損し
    ている、請求項30に記載の方法。
44. 【請求項４４】 哺乳類が、リポタンパク質残存物が血流中に蓄積すること
    によりアテローム性動脈硬化症を発症する危険性がある、請求項30に記載の方法
    。
45. 【請求項４５】 哺乳類が、残存物除去不能である、請求項40に記載の方法
    。
46. 【請求項４６】 哺乳類が、正常に機能する内因性のLDL受容体を欠損して
    いる、請求項30に記載の方法。
47. 【請求項４７】 核酸が、哺乳類の肝臓に投与されるか、または哺乳類の肝
    臓において発現させる、請求項30に記載の方法。
48. 【請求項４８】 アミノ酸150〜299個を含み、成熟した天然型ヒトアポEの
    アミノ酸1〜299位の対応領域と少なくとも80%同一のアミノ酸配列を有し、哺乳
    類に投与または哺乳類において発現させる場合、高トリグリセリド血症を誘発す
    ることなく血清の総コレステロールレベルを低下することができるポリペプチド
    と、これと混合される薬学的に許容される担体物質とを含む薬学的組成物。
49. 【請求項４９】 成熟した天然型ヒトアポEポリペプチドのアミノ酸1〜299
    位の対応領域のアミノ酸配列と少なくとも80%同一のアミノ酸配列を有し、哺乳
    類に投与または哺乳類において発現させる場合、高トリグリセリド血症を誘発す
    ることなく血清の総コレステロールレベルを低下するアミノ酸150〜299個のポリ
    ペプチドをコードする核酸がプロモーターに機能的に結合されたものを含む組換
    えDNA分子。