JP2003529561A - 緑内障の治療法 - Google Patents

緑内障の治療法

Info

Publication number
JP2003529561A
JP2003529561A JP2001557577A JP2001557577A JP2003529561A JP 2003529561 A JP2003529561 A JP 2003529561A JP 2001557577 A JP2001557577 A JP 2001557577A JP 2001557577 A JP2001557577 A JP 2001557577A JP 2003529561 A JP2003529561 A JP 2003529561A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
tnf
cells
glaucoma
administration
compound
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2001557577A
Other languages
English (en)
Inventor
ワックス、マーティン、ビー
テゼル、ガルガン
Original Assignee
ワックス、マーティン、ビー
テゼル、ガルガン
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US09/500,023 external-priority patent/US6531128B1/en
Application filed by ワックス、マーティン、ビー, テゼル、ガルガン filed Critical ワックス、マーティン、ビー
Publication of JP2003529561A publication Critical patent/JP2003529561A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/241—Tumor Necrosis Factors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/13—Amines
    • A61K31/15—Oximes (>C=N—O—); Hydrazines (>N—N<); Hydrazones (>N—N=) ; Imines (C—N=C)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/205—Amine addition salts of organic acids; Inner quaternary ammonium salts, e.g. betaine, carnitine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
    • A61K31/403—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil condensed with carbocyclic rings, e.g. carbazole
    • A61K31/404—Indoles, e.g. pindolol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/445—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine
    • A61K31/4523—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine containing further heterocyclic ring systems
    • A61K31/4535—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine containing further heterocyclic ring systems containing a heterocyclic ring having sulfur as a ring hetero atom, e.g. pizotifen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/496—Non-condensed piperazines containing further heterocyclic rings, e.g. rifampin, thiothixene or sparfloxacin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/519—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with heterocyclic rings
    • A61K31/52—Purines, e.g. adenine
    • A61K31/522—Purines, e.g. adenine having oxo groups directly attached to the heterocyclic ring, e.g. hypoxanthine, guanine, acyclovir
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/54—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one sulfur as the ring hetero atoms, e.g. sulthiame
    • A61K31/5415—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one sulfur as the ring hetero atoms, e.g. sulthiame ortho- or peri-condensed with carbocyclic ring systems, e.g. phenothiazine, chlorpromazine, piroxicam
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/655—Azo (—N=N—), diazo (=N2), azoxy (>N—O—N< or N(=O)—N<), azido (—N3) or diazoamino (—N=N—N<) compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7028—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages
    • A61K31/7034—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin
    • A61K31/704—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin attached to a condensed carbocyclic ring system, e.g. sennosides, thiocolchicosides, escin, daunorubicin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/48—Fabaceae or Leguminosae (Pea or Legume family); Caesalpiniaceae; Mimosaceae; Papilionaceae
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A61K38/1793—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A61P27/06—Antiglaucoma agents or miotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Alternative & Traditional Medicine (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ＴＮＦ−αの細胞からの放出、合成または産生を拮抗、阻害、不活性化、低下、抑制、および／または制限する化合物または組成物を投与し、緑内障対象を治療するステップを含む、緑内障対象の治療法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （発明の分野） 本発明は、ＴＮＦ−αの細胞からの放出、合成、または産生を拮抗、阻害、不
活性化、低下、抑制、拮抗、および／または制限する化合物または組成物を投与
し、これにより緑内障の対象を治療するステップを含む、緑内障を患う対象の治
療法を提供する。
【０００２】 （発明の背景） 腫瘍壊死因子（ＴＮＦまたはＴＮＦ−α）として知られるサイトカインは構造
的にリンホトキシンに関連している。これらは約４０％のアミノ酸配列相同性を
有する（Ｏｌｄ、Ｎａｔｕｒｅ ３３０：６０２〜６０３、１９８７）。これら
のサイトカインはマクロファージ、単球およびナチュラルキラー細胞から放出さ
れ、炎症ならびに免疫学的事象に際して機能する。２種のサイトカインはｉｎ
ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方で広範囲の作用スペクトルを示し、以下
のものが含まれる（ｉ）血栓症および腫瘍壊死；（ｉｉ）炎症；（ｉｉｉ）マク
ロファージおよび好中球の活性化；（ｉｖ）白血球増加症；（ｖ）アポトーシス
；（ｖｉ）ショック。ＴＮＦは、種々の癌、動脈炎、乾癬、エンドトキシンショ
ック、敗血症、自己免疫疾患、感染症、肥満および悪液質を含む様々な病状に関
連を有する。ＴＮＦは、出現し、体重のコントロールに寄与する３つのファクタ
ー；食物摂取、消費およびエネルギーの貯蔵；に関して、その役割を果たす（Ｒ
ｏｔｈｗｅｌｌ，Ｉｎｔ．、Ｊ．Ｏｂｅｓｉｔｙ １７；Ｓ９８〜Ｓ１０１、１
９９３）。
【０００３】 原発性開放隅角緑内障（ＰＯＡＧ）における緑内障視神経乳頭の組織病理学研
究により、神経損傷に随伴して起こる大グリア細胞の活性化と組織再構築が明ら
かになった。組織再構築の一環としての、逆方向への湾曲および積層した篩状板
のばらつきは、正常または高い眼内圧を有する緑内障の眼に一般的な特徴である1 。これらの組織学的な変化は、コラーゲンとプロテオグリカンとを含む細胞外
マトリックス成分のアップレギュレーション、および緑内障の眼の視神経乳頭星
状細胞による分子接着を伴う2-6。緑内障視神経乳頭で見られる大グリア細胞活
性化により、おそらく、損傷の広がりの抑制および組織修復過程の促進が図られ
る。しかし、大グリア細胞の活性化にもかかわらず、緑内障による視神経萎縮で
は細胞外マトリックスの沈着が制限され、瘢痕組織形成の特徴が維持されない7, 8 。このことは、最初の事象またはそれに続く組織損傷に対して、優先的に神経
退化をもたらす様々な細胞応答が存在することを示唆している。
【０００４】 さらに、神経細胞損傷後の反応性星状細胞は、ＭＭＰの合成を制御する際に重
要な役割を果たす種々の神経栄養因子およびＴＮＦ−α14を含むサイトカインを
産生する15-17。また、膜結合性前駆体からのＴＮＦ−αの放出は、ＭＭＰ依存
性のプロセスである18。マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）は、細胞
外マトリックスの成分を分解するタンパク分解酵素である。活性化されたグリア
細胞によるＭＭＰの分泌の増加は、正常な発育およびアテローム性動脈硬化症、
関節炎、腫瘍増殖、転移および緑内障を含む種々の病理学において起こる様々な
細胞外マトリックス再構築の事象に密接な関係を有する9-13。
【０００５】 ＴＮＦ−αは潜在的な免疫メディエータでありかつ損傷後に脳を速やかにアッ
プレギュレーションする前炎症性サイトカインである。また、ＴＮＦ−αは、Ｔ
ＮＦ−αレセプター−１の占有を介したアポトーシスによる細胞死のインデュー
サーとしても知られている（Ｈｕｓ Ｈ、Ｘｉｏｎｇ Ｊ、Ｇｏｅｄｄｅｌ Ｄ
Ｖ、Ｔｈｅ ＴＮＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ １−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔ
ｅｉｎ ＴＲＡＤＤ ｓｉｇｎａｌｓ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ａｎｄ ＮＦ−
ｋａｐｐａ Ｂ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ、１９９５；８１：４９５〜
５０４）。
【０００６】 アメリカでの回復不能の失明の第２番目に多い原因である開放隅角緑内障（Ｏ
ＡＧ）には、２つの主要な症候群が含まれる：原発性開放隅角緑内障（ＰＯＡＧ
）および正常眼圧緑内障（ＮＰＧ）。ＰＯＡＧは一般的に、１）高い眼内圧（Ｉ
ＯＰ）；２）高い眼内圧（ＩＯＰ）が原因と考えられる視神経萎縮の出現；３）
最終的に進行して中心視力の低下を招く、疾患初期の周辺視覚感度の進行性の減
退を含む決定的な三主徴によって特徴付けられる（Ｑｕｉｇｌｅｙ、ＨＡ；Ｏｐ
ｅｎ ａｎｇｌｅ ｇｌａｕｃｏｍａ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ １９９
３；３２８：１０９７〜１１０６）。しかし、研究では、意外にもＯＡＧ対象の
大部分で、ただ一点を除いてＰＯＡＧと同一の所見が見られたと述べられている
；すなわちＩＯＰが上昇することは立証されていない。いくつかの大人数での研
究によれば、しばしば「低眼圧緑内障」（より厳密には「正常眼圧緑内障」（Ｎ
ＰＧ）と呼称される）と称されるこの種の緑内障の高い罹患率について詳細して
いる。これらの概算値の大まかな内訳において、「正常な」ＩＯＰの緑内障の割
合は、約２０〜３０％である（Ｓｏｍｍｅｒ Ａ．Ｉｎｔｒａｏｃｕｌａｒ ｐ
ｒｅｓｓｕｒｅ ａｎｄ ｇｌａｕｃｏｍａ、Ａｍ Ｊ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ
１９８９；１０７：１８６〜１８８、ａｎｄ Ｓｏｍｍｅｒ Ａ．Ｄｏｙｎｅ
Ｌｅｃｔｕｒｅ、Ｇｌａｕｃｏｍａ：Ｆａｃｔｓ ａｎｄ Ｆａｎｃｉｅｓ．
Ｅｙｅ １９９６；１０：２９５〜３０１）。
【０００７】 前記した最も一般的な緑内障の形態に加えて、典型的に様々なメカニズムによ
って眼内圧が上昇する、閉塞隅角緑内障が存在する。事実、眼圧の上昇が認めら
れるこれらの別の形態のほぼ全ての緑内障が、ＯＡＧの結果として起こるものと
同様の視神経障害によって特徴付けられる。未治療であれば、これらの緑内障に
おける高眼圧は決まって視力の損失を招き、最終的に失明する。眼圧が正常であ
る緑内障を含む多種類の緑内障の形態において、眼圧を低下させても、多くの場
合、疾患の進行をくい止めることができない（Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｇ
ｌａｕｃｏｍａｔｏｕｓ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｕｎｔｒ
ｅａｔｅｄ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｎｏｒｍａｌ−ｔｅｎｓｉｏｎ ｇ
ｌａｕｃｏｍａ ａｎｄ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉ
ｃａｌｌｙ ｒｅｄｕｃｅｄ ｉｎｔｒａｏｃｕｌａｒ ｐｒｅｓｓｕｒｅｓ．
Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｎｏｒｍａｌ−Ｔｅｎｓｉｏｎ Ｇｌａｕｃｏｍ
ａ Ｓｔｕｄｙ Ｇｒｏｕｐ．Ａｍ Ｊ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ、１９９８ Ｏ
ｃｔ；１２６（４）：４８７〜９７）。
【０００８】 神経系の発達と維持の際に、ニューロンとグリア細胞との間には複雑な相互依
存が見られる。グリア細胞は、細胞外の環境制御ならびに代謝産物および成長因
子の供給の両方により、神経系の正常機能を維持している。中枢神経系が損傷を
受けた後、グリア細胞が、神経の成長と代謝とを支えかつニューロンに対して有
毒な要因を捕捉すると考えられる。しかし、最近の事実から、グリア細胞が単に
神経を保護するという概念に異論が唱えられ、むしろニューロンの損傷に関与す
ることが示唆される。例えば、巣状脳虚血の後または神経変性疾患または外傷時
に、反応性星状細胞ならびに中枢神経系内の小グリア細胞は、組織損傷のメディ
エータとしての関連を有するサイトカイン、反応性の酸素種および酸化窒素（Ｎ
Ｏ）を産生する。
【０００９】 （発明の概要） ここに記載するように、本発明は、ＴＮＦ−αの細胞からの放出、合成または
産生を拮抗、阻害、不活性化、低下、抑制、拮抗、および／または制限する薬剤
または分子を含有する化合物または組成物を提供する。このような組成物は、緑
内障の治療に有効である。
【００１０】 本発明は、ＴＮＦ−αの細胞からの放出、合成または産生を拮抗、阻害、不活
性化、低下、抑制、拮抗および／または制限する類似体、異性体、同族体、フラ
グメントまたはその変性体を含む薬剤、化合物、または分子を含有する化合物、
薬剤または組成物を投与し、緑内障対象を治療するステップを含む、緑内障対象
の治療法を提供する。
【００１１】 ひとつの形態では、薬剤、化合物または分子がＴＮＦ−αのレベルまたは産生
を抑制する。別の形態では、薬剤、化合物または分子はＴＮＦ−αの産生を阻害
する。
【００１２】 別の形態では、薬剤、化合物または分子がＴＮＦ−αの細胞からの合成または
放出を制限する。その他の形態では、化合物はサリドマイドである。別の形態で
は、化合物は選択的なサイトカイン阻害剤である。その他の形態では、阻害剤は
ロリプラム、ホスホジエステラーゼ４阻害剤、またはｐ３８キナーゼである。
【００１３】 別の形態では、薬剤、化合物または分子は循環性ＴＮＦ−αを不活性化する。
その他の形態では、分子は抗ＴＮＦ−α抗体である。別の形態では、分子はイン
フリキシマブ（infliximab）である。その他の形態では、分子は組換えＴＮＦ−
α可溶性レセプターである。別の形態では、分子はエタネルセプト（etanercept
）である。
【００１４】 本発明は、ＴＮＦレデューサーを提供し、これは硫酸ヒドラジン、ペントキシ
フィリン、ケトチフェン、テニダプ、ベスナリノン、シクロスポリン、ペプチド
Ｔ、スルファサラジン、トラジン、抗酸化薬、コルチコステロイド類、マリファ
ナ、グリシルリジン、小柴胡湯、Ｌ−カルニチン、温熱療法または高圧酸素療法
である。
【００１５】 最後に、本発明は、ＴＮＦ阻害剤を用いた治療の指標となる対象の血清ＴＮＦ
レベルをアッセイする方法を提供する。このアッセイでは、対象のインターロイ
キン１０およびインターフェロンガンマ等の血清中の数種のサイトカインのレベ
ルを測定する。
【００１６】 （発明の詳細な説明） 視神経乳頭のグリア細胞は緑内障で活性化過程を経るが網膜神経節細胞の緑内
障性神経変性におけるグリア細胞の役割は知られていない。共生−培養系を利用
し、疑似（simulated）虚血および高静りく圧を特徴とする様々なストレス条件
に曝露した網膜神経節細胞の生存に対するグリア細胞の影響を検討した。これら
のストレス源への曝露後、グリア細胞は、共培養培地中に、ＴＮＦ−αおよび酸
化窒素等の有害な物質を分泌し、形態学、ＴＵＮＥＬおよびカスパーゼ活性によ
り評価される網膜神経節細胞のアポトーシスによる死を促進することが観察され
た。これらの有害作用がグリア由来であることは受動移行試験により確認した。
さらに、網膜神経節細胞のアポトーシスは、ＴＮＦ−αに対する中和抗体により
約６６％、誘導性酸化窒素シンターゼの選択的阻害剤（１４００Ｗ）により５０
％減少した。高眼圧および虚血が緑内障対象の眼に関連する２つの主要なストレ
ス因子であるので、これらの知見は、緑内障での網膜神経節の細胞死に対して新
しい病原性メカニズムを提示する。さらに、これらの研究は、活性グリア細胞か
ら放出されるＴＮＦ−αの阻害または中和が、緑内障の視神経障害の治療におけ
る神経保護の新しい治療標的を提供することを示している。本発明は、流体静力
学的高圧ならびに疑似虚血が、網膜神経節細胞のアポトーシス細胞死カスケード
を開始できるという事実を明らかにしており、この際、これらのストレス源に対
する応答時のグリア細胞の活性化が主要因となっている。ストレス曝露後に活性
グリア細胞により分泌されるＴＮＦ−αを含むアポトーシス−促進物質は、神経
細胞毒性に直接寄与する。さらにここで示すように、緑内障視神経乳頭および網
膜中でのＴＮＦ−αおよびそのレセプターの高い発現は、緑内障の神経変性過程
でのこのサイトカインの役割を実証するものであり、このことは、緑内障の管理
の新規治療標的を提供する。
【００１７】 本発明は、ＴＮＦ−αの細胞からの放出、合成または産生を拮抗、阻害、不活
性化、低下、抑制、拮抗および／または制限する類似体、異性体、同族体、フラ
グメントまたはその変性体を含む薬剤、化合物または分子を含有する薬剤、化合
物、分子または組成物を投与し、緑内障対象を治療するステップを含む、緑内障
対象の治療法を提供する。
【００１８】 ひとつの形態において、薬剤、化合物または分子は、ＴＮＦ−αのレベルまた
は産生を抑制する。他の形態において、薬剤、化合物または分子は、ＴＮＦ−α
の産生を阻害する。
【００１９】 別の形態において、薬剤、化合物または分子は、細胞からのＴＮＦ−αの合成
または放出を制限する。その他の形態において、化合物はサリドマイドである。
別の形態において、化合物は選択的なサイトカイン阻害剤である。その他の形態
において、阻害剤はロリプラムまたはホスホジエステラーゼ４阻害剤である。
【００２０】 他の形態において、薬剤、化合物または分子は、循環性ＴＮＦ−αを不活性化
する。別の形態において、分子は抗ＴＮＦ−α抗体である。他の形態において、
分子はインフリキシマブである。別の形態において、分子は組換えＴＮＦ−α可
溶性レセプターである。その他の形態において、分子はエタネルセプトである。
【００２１】 別の形態において、化合物または組成物には、循環ＴＮＦを不活性化する分子
が含まれる。その他の形態において、分子は抗−ＴＮＦ抗体である。別の形態に
おいて、分子はインフリキシマブである。その他の形態において、分子は組換え
ＴＮＦ可溶性レセプターである。別の形態において、分子はエタネルセプトであ
る。その他の形態において、誘導性酸化窒素シンターゼの選択的阻害剤を、循環
性ＴＮＦまたはＴＮＦ−αレデューサーを不活性化する分子と組み合わせて供給
する。
【００２２】 本発明はＴＮＦ−αレデューサーを提供し、ひとつの形態において、これは硫
酸ヒドラジン、ペントキシフィリン、ケトチフェン、テニダプ、ベスナリノン、
シクロスポリン、ペプチドＴ、スルファサラジン、トラジン、抗酸化薬、コルチ
コステロイド類、マリファナ、グリシルリジン、小柴胡湯、Ｌ−カルニチン、温
熱療法または高圧酸素療法である。
【００２３】 この実験では、グリア細胞の最終的な役割が神経保護または神経毒性のどちら
になるかを決定するのに、環境因子によって決定されるグリア細胞の機能的状態
が重要である可能性があることを明らかにする。高静水圧または疑似虚血などの
ストレス条件に曝露した網膜グリア細胞は網膜神経節細胞に対し神経毒性な影響
を与える。緑内障の過程の間に生じるものと同様のストレス条件に反応して起こ
るグリア細胞の機能的状態の変化は、ＴＮＦ−αを含む死亡促進物質の産生の増
加による網膜神経節細胞死を導く。これらの知見は、緑内障における網膜神経節
細胞死の新規な病原的メカニズムを明らかにし、緑内障性視神経障害の治療にお
ける新規な神経保護の治療上の標的を提供する。
【００２４】 最近の研究では、最初に、網膜神経節細胞とグリア細胞とを含む共培養物を、
長時間（７２時間まで）、流体静力学的高圧に曝露して、細胞の生存率を調べ、
これにより流体静力学的高圧はニューロンの生存を減少させることを立証した。
流体静力学的高圧または疑似虚血に曝露した後の、網膜グリア細胞によるアポト
ーシス促進物質の産生の増加は、共生−培養網膜神経節細胞の細胞死の割合の増
加を、部分的ではあるが、説明するものである。受動移行試験により、網膜神経
節細胞に害を及ぼす有害物質源がストレス条件に曝露された網膜グリア細胞であ
ることが証明された。
【００２５】 ＴＮＦ−αに加えて、ここで記載するように、様々なストレス条件に曝露した
網膜グリア細胞中でのＮＯ製造の増加は、共生−培養網膜神経節細胞の細胞死を
誘導した。ＴＮＦ−αまたはｉＮＯＳの阻害剤を用いたここでの実験では、疑似
虚血または流体静力学的高圧に曝露した共培養物中の網膜神経節細胞のアポトー
シス細胞死が阻害されることが分かった。ｉＮＯＳ阻害は共培養物をアポトーシ
スによる細胞死から部分的に保護するが、ＴＮＦ−αを阻害すると、より強くア
ポトーシスが回避された。これらの結果は、内在ＴＮＦ−αが、培養網膜神経節
細胞の神経毒性の調整に重要な役割を果たすことを立証するものである。ＴＮＦ
−αがＮＯ分泌を誘導するので、その活性を阻害すれば、ＮＯによって引き起こ
される有害な作用も間接的に減少する。この実験と同様に、抗−ＴＮＦ−α抗血
清の中和は、むしろＮＯＳ阻害剤よりも、ヒト胎児大脳に由来するニューロン−
星状細胞培養物中でのサイトカイン誘導性のｉＮＯＳおよびＴＮＦ−α産生によ
る神経毒性を阻害した。
【００２６】 全身性のＴＮＦ−αの中和は、これらの疾患の標的臓器損傷を改善する。リウ
マチ疾患におけるＴＮＦ−αの副作用を効果的に中和する２種類の薬剤は、ＴＮ
Ｆ−αに対するキメラモノクローナル抗体であるレミケード（Remicade）（Ｃｅ
ｎｔｏｃｏｒ、Ｍａｌｖｅｍ、ＰＡ）（ＫｎｉｇｈｔＤＭ、Ｔｒｉｎｈ Ｈ、Ｌ
ｅ Ｊ、Ｓｉｅｇｅｌ Ｓ、Ｓｈｅａｌｙ Ｄ、ＭｃＤｏｎｏｕｇｈ Ｍ、Ｓｃ
ａｌｌｏｎ Ｂ、Ｍｏｏｒｅ ＭＡ、Ｖｉｌｃｅｋ Ｊ、Ｄａｄｄｏｎａ Ｐ、
Ｇｈｒａｙｅｂ Ｊ、Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｉｔｉａｌ ｃ
ｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｍｏｕｓｅ−ｈｕｍａｎ ｃｈｉ
ｍｅｒｉｃ ａｎｔｉ−ＴＮＦ ａｎｔｉｂｏｄｙ．Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．
１９９３；３０：１４４３〜１４５３；Ｅｌｌｉｏｔ ＭＪ、Ｍａｉｎｉ ＲＮ
、Ｆｅｌｄｍａｎｎ Ｍ、Ｋａｌｄｅｎ ＪＲ、Ａｎｔｏｎｉ Ｃ、Ｓｍｏｌｅ
ｎ ＪＳ、Ｌｅｅｂ Ｂ、Ｂｒｅｅｄｖｅｌｄ ＦＣ、Ｍａｃｆａｒｌａｎｅ
ＪＤ、Ｂｉｊｌ Ｈ、Ｗｏｏｄｙ ＪＮ、Ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ ｄｏｕｂｌｅ
−ｂｌｉｎｄ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｍｏｎｏｃｌ
ｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｏ ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔ
ｏｒ α（ｃＡ２）ｖｅｒｓｕｓ ｐｌａｃｅｂｏ ｉｎ ｒｈｅｕｍａｔｏｉ
ｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ、Ｌａｎｃｅｔ．１９９４；３４４：１１０５〜１１１
０；Ｔａｒｇａｎ ＳＲ、Ｈａｎａｕｅｒ ＳＢ、ｖａｎ Ｄｅｖｅｎｔｅｒ
ＳＪ、Ｍａｙｅｒ Ｌ、Ｐｒｅｓｅｎｔ ＤＨ、Ｂｒａａｋｍａｎ Ｔ、ＤｅＷ
ｏｏｄｙ ＫＬ、Ｓｃｈａｉｂｌｅ ＴＦ、Ｒｕｔｇｅｅｒｔｓ ＰＪ．Ａ ｓ
ｈｏｒｔ−ｔｅｒｍ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｍｏｎｏｃｌｏｎ
ａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃＡ２ ｔｏ ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａ
ｃｔｏｒ ａｌｐｈａ ｆｏｒ Ｃｒｏｈｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｃｒｏｈｎ
’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ｃＡ２ Ｓｔｕｄｙ Ｇｒｏｕｐ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ
Ｍｅｄ．１９９７；３３７：１０２９〜１０３５）および生物学的に操作したＴ
ＮＦ−αレセプターｐ７５−Ｆｃ融合タンパク質のコピーであるエンブレル（En
brel）（Ｉｍｍｕｎｅｘ、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）（Ｗｅｉｎｂｌａｔｔ ＭＥ
、Ｋｒｅｍｅｒ ＪＭ、Ｂａｎｋｈｕｒｓｔ ＡＤ、Ｂｕｌｐｉｔｔ ＫＪ、Ｆ
ｌｅｉｓｃｈｍａｎｎ ＲＭ、Ｆｏｘ ＲＩ、Ｊａｃｋｓｏｎ ＣＧ、Ｌａｎｇ
ｅ Ｍ、Ｂｕｒｇｅ ＤＪ．Ａ ｔｒｉａｌ ｏｆ ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ、ａ
ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ｒ
ｅｃｅｐｔｏｒ：Ｆｃ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ，ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔ
ｓ ｗｉｔｈ ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ｒｅｃｅｉｖｉｎ
ｇ ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．１９９９；３４０
：２５３〜２５９）である。
【００２７】 このことは、その機能を阻害する薬剤に対する、緑内障に見られる神経変性過
程でのＴＮＦ−αの重要な役割が、緑内障の細胞死を低下させるための魅力的な
標的であることを示している。さらに、ＴＮＦ−αは酸化窒素合成を刺激するの
で（Ｒｏｍｅｒｏ ＬＩ、Ｔａｔｒｏ ＪＢ、Ｆｉｅｌｄ ＪＡ、Ｒｅｉｃｈｌ
ｉｎ Ｓ．Ｒｏｌｅｓ ｏｆ ＩＬ−１ ａｎｄ ＴＮＦ−ａｌｐｈａ ｉｎ
ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｉｔｒ
ｉｃ ｏｘｉｄｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｒａｔ ｂｒ
ａｉｎ ｃｅｌｌｓ．Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９９６；２７０：Ｒ３２６
〜３３２；Ｇｏｕｒｅａｕ Ｏ、Ａｍｉｏｔ Ｆ、Ｄａｕｔｒｙ Ｆ、Ｃｏｕｒ
ｔｏｉｓ Ｙ、Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｐｒｏｄｕ
ｃｔｉｏｎ ｂｙ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ＴＮＦ−ａｌｐｈａ ｉｎ ｍｏｕ
ｓｅ ｒｅｔｉｎａｌ ｐｉｇｍｅｎｔｅｄ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ａｎｄ
Ｍｕｌｌｅｒ ｇｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒ
ｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．１９９７；２４０：１３２〜１３５；Ｈｅｎｅｋａ ＭＴ
、Ｌｏｓｃｈｍａｎｎ ＰＡ、Ｇｌｅｉｃｈｍａｎｎ Ｍ、Ｗｅｌｌｅｒ Ｍ、
Ｓｃｈｕｌｚ ＪＢ、Ｗｕｌｌｎｅｒ Ｕ、Ｋｌｏｃｋｇｅｔｈｅｒ Ｔ．Ｉｎ
ｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ａｎｄ
ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ
ｎｅｕｒｏｎａｌ ＰＣ１２ ｃｅｌｌｓ ａｆｔｅｒ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏ
ｎ ｗｉｔｈ ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ−ａｌｐｈａ／ｌ
ｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．１９９８；７
１：８８〜９４）、ＴＮＦ−αの拮抗剤、阻害剤、不活化剤、レデューサー、抑
制剤またはＴＮＦ−αの細胞からの放出、合成または産生を拮抗、および／また
は制限する薬剤で処理することにより、酸化窒素シンターゼ−２の発現および活
性が低下する（Ｐｅｒｋｉｎｓ ＤＪ、Ｓｔ Ｃｌａｉｒ ＥＷ、Ｍｉｓｕｋｏ
ｎｉｓ ＭＡ、Ｗｅｉｎｂｅｒｇ ＪＢ．Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＮＯＳ２
ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉ
ｔｉｓ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａｎｔｉ−ｔｕｍｏｒ
ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ
（ｃＡ２）．Ａｒｔｈ Ｒｈｅｕｍ．１９９８；４１：２２０５〜２２１０）。
したがって、さらに、ＴＮＦ−αの遮断、改善、減弱は、神経細胞死の重要なメ
ディエータとして知られかつ緑内障の原因因子であると考えられる酸化窒素−関
連細胞死を、阻害、低下または回避するのに有効である（Ｎｅｕｆｅｌｄ ＡＨ
、Ｓａｗａｄａ Ａ、Ｂｅｃｋｅｒ Ｂ．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｎｉｔ
ｒｉｃ−ｏｘｉｄｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ２ ｂｙ ａｍｉｎｏｇｕａｎｉｄｉｎ
ｅ ｐｒｏｖｉｄｅｓ ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｔｉｎａ
ｌ ｇａｎｇｌｉｏｎ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ａ ｒａｔ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｃ
ｈｒｏｎｉｃ ｇｌａｕｃｏｍａ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ
ＳＡ １９９９ Ａｕｇ １７；９６（１７）：９９４４〜８）。
【００２８】 本発明の適当な緑内障の種類には以下が含まれるが、これに限定するものでは
ない：原発性開放隅角緑内障、正常眼圧緑内障、色素緑内障、偽剥脱性緑内障、
急性隅角閉塞緑内障、絶対緑内障、慢性緑内障、先天性緑内障、若年性緑内障、
狭隅角緑内障、慢性開放隅角緑内障および単性緑内障。
【００２９】 ここで述べるように、サイトカインの腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミ
リーは、細胞活性（免疫応答および炎症反応を含む）、細胞の生存および増殖、
ＮＫ−カッパ−Ｂ活性化、および種々の疾患の病理を制御する、可溶性および膜
結合性タンパク質の両方を含む。ＴＮＦ−αは、炎症および免疫病理学的応答を
仲介するマクロファージおよびリンパ球から産生されるサイトカインである。Ｔ
ＮＦ−αは、免疫調節障害、感染、細胞増殖、血管新生（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓ
ｉｓ、ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｓａｔｉｏｎ）、腫瘍転移、アポトーシス、敗
血症および内毒素症を含む疾患の進行に関連するが、これに限定するものではな
い。ｉｎ ｖｉｖｏでのＴＮＦのネクローシス作用は、毛細血管の損傷と関係が
ある。ＴＮＦは腫瘍組織だけでなく肉芽組織でもネクローシスを引き起こす。こ
れにより、培養血管内皮細胞の成長阻害および細胞毒性に形態学的変化が起こる
（Ｈａｒａｎｋａ ｅｔ ａｌ１９８７ Ｃｉｂａ Ｆｏｕｎｄ Ｓｙｍｐ １
３１：１４０〜１５３）。
【００３０】 リンパ性および非リンパ性の細胞の両方でのＴＮＦレセプターの発現は、種々
の異なる薬剤、例えばバクテリアのリポ多糖（ＬＩＰＳ）、酢酸ミリスチン酸ホ
ルボール（ＰＭＡ；プロテインキナーゼＣアクチベーター）、インターロイキン
−１（ＩＬ−１）、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−ｙ）およびＩＬ−２によ
り、実験的に影響され得る（Ｇａｔａｎａｇａ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ．１３８：１〜１０、１９９１；Ｙｕｉ ｅｔ ａｌ．Ｐｌａｃｅｎｔ
ａ １５：８１９〜８３５、１９９４）。レセプターに結合したヒトＴＮＦ複合
体は、細胞膜から内部へ向い、次いでレセプターは分解または再利用される（Ａ
ｒｍｉｔａｇｅ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：４０７〜４１３、
１９９４）。細胞内部でレセプターと結合する、またはリガンド結合部位に結合
する、またはレセプターの分解に影響するペプチドを使用することにより、ＴＮ
Ｆレセプターの活性を変化できる。例えばＷＯ９５／３１５４４、ＷＯ９５／３
３０５１、ＷＯ９６／０１６４２およびＥＰ５６８９２５を参照のこと。
【００３１】 ＴＮＦ結合タンパク質（ＴＮＦ−ＢＰ）は、発熱対象、腎障害対象、癌対象、
および特定の健常者でも、その血清および尿中で、高レベルで確認される。ヒト
の脳および卵巣の腫瘍は、ＴＮＦ−ＢＰの高い血清レベルを示した。これらの分
子は、精製、特徴付けおよびクローン化された（Ｇａｔａｎａｇａ ｅｔ ａｌ
．、Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ Ｒｅｓ．９：２２５〜２２９、１９９０ａ；Ｇａｔ
ａｎａｇａ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ８
７：８７８１〜８７８４、１９９０ｂ）。ヒトＴＮＦ−ＢＰは、ｐ５５およびｐ
７５ＴＮＦレセプターのＮ−末端細胞外ドメインとそれぞれ相同な、３０ｋＤａ
および４０ｋＤａのタンパク質を含有する（米国特許明細書第５，３９５，７６
０；ＥＰ４１８，０１４）。このようなタンパク質は、エンドトキシンショック
の治療への使用が示唆されてきた（Ｍｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ．１５１：１５４８〜１５６１、１９９３）。膜結合レセプターと類似した
分泌タンパク質の産生を可能にする、いくつかのメカニズムが存在する。その１
つは、膜貫通領域および細胞質領域が欠如している任意にスプライシングされた
ｍＲＮＡからの翻訳である。
【００３２】 「ＴＮＦモジュレーター」は細胞表面にＴＮＦを処理する際に、ＴＮＦ活性を
高めるまたは低める特徴を有する化合物である。
【００３３】 エタネルセプト（登録商標Ｅｍｂｒｅｌ）は当業者に公知である。エタネルセ
プトは、ヒトＩｇＧ１分子のＦｃフラグメントに結合したヒト腫瘍壊死因子レセ
プターの組換え形である。最終形状は、２つの循環腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）分子
と結合できる二量体分子である。この結合は、ＴＮＦと細胞表面ＴＮＦレセプタ
ーとの相互作用を回避し、連結によるその病理学的役割を阻害する。近年、２種
類のＴＮＦレセプターが同定されており（ｐ７５およびｐ５５）、いずれもＴＮ
Ｆに対して同様の親和性を有する。エタネルセプトは、４回量分のトレーを含む
カートンで供給される。各トレーには、２５ｍｇエタネルセプト使い捨てバイア
ルを１つ、シリンジ１つ（滅菌注射用水１ｍＬ、０．９％のベンジルアルコール
を含むＵＳＰ）、プランジャー１つ、およびアルコール脱脂綿２つが含まれる。
成人対象へのエタネルセプトの推奨投与量は２５ｍｇであり、週に２回皮下注射
する。
【００３４】 インフリキシマブ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ）は当業者に公知である。インフリキシ
マブ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ）はクローン病を治療するための、組換え細胞系から産
生される、キメラＩｇＧ１κモノクローナル抗体である。インフリキシマブ（Ｒ
ｅｍｉｃａｄｅ）は、ＴＮＦｐの可溶性膜貫通形と高い親和性で結合することに
より、ＴＮＦｐの生物学的活性を中和し、ＴＮＦｐレセプターとの結合を阻害す
る。
【００３５】 同族体とは、その一次、二次または三次構造の相当の位置に、同一残基または
保存残基を有するポリペプチドを意味する。
【００３６】 「核酸」または「ポリヌクレオチド」は、一本鎖または二本鎖らせん形のリボ
ヌクレオシド（アデノシン、グアノシン、ウリジンまたはシチジン；「ＲＮＡ分
子」）またはデオキシリボヌクレオシド（デオキシアデノシン、デオキシグアノ
シン、デオキシチミジンまたはデオキシシチジン；「ＤＮＡ分子」）のリン酸エ
ステル重合形である。二本鎖ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡおよびＲＮＡ−Ｒ
ＮＡらせんも可能である。用語の核酸分子、および特にＤＮＡまたはＲＮＡ分子
は、分子の一次および二次構造を意味するものであり、任意の特に三次構造を制
限するものではない。したがって、この用語には、特に直線状または環状ＤＮＡ
分子として見出された二本鎖ＤＮＡ（例えば、制限フラグメント）、プラスミド
および染色体が含まれる。特別な二本鎖ＤＮＡ分子の構造を議論するにあたり、
ここでは通常の規則に則って、ＤＮＡ非転写鎖の５’から３’方向での配列のみ
を記載する（すなわち鎖はｍＲＮＡとの配列の相同性を有する）。「組換えＤＮ
Ａ」は分子生物学的に操作されたＤＮＡである。
【００３７】 「実質的な同一性」または「実質的な配列同一性」は、例えばプログラムＧＡ
ＰまたはＢＥＳＴＦＩＴにより、空所を使って視覚的に直線化した場合に、少な
くとも６５〜９９％の配列同一性を示す、少なくとも７５％の配列同一性を示す
、少なくとも８０％の配列同一性を示す、少なくとも９０％の配列同一性を示す
、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を示す、さらに好ましくは少なくと
も９９％以上の配列同一性を示す、２つの配列を意味する。２つ以上の核酸分子
またはポリヌクレオチド間の配列の関係を述べるのに、以下の用語を使用する：
「参照配列」、「比較枠」、「配列同一性」、「配列同一性の割合」、および「
実質的な同一性」。「参照配列」は、配列比較時の基本として使用される配列で
あると定義される；参照配列は、より長い配列の一部、例えば配列を直線化した
際の全長ｃＤＮＡまたは遺伝子配列の切片であってよく、または完全なｃＤＮＡ
または遺伝子配列を含有してもよい。
【００３８】 比較枠を直線化するために、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの局所相同ア
ルゴリズム（１９８１）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２；４８２により、Ｎｅ
ｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈの相同直線化アルゴリズム（１９７０）Ｊ．
Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３により、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎの
同一性の調査法（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ
）８５：２４４４により、またはこれらのアルゴリズムのコンピューターを用い
た実施により（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、ＴＦＡＳＴＡ、Ｗｉｓｃ
ｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ Ｒｅｌｅ
ａｓｅ ７．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、配列を視覚的に線形にする。
【００３９】 用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、任意の長さを
有するアミノ酸のポリマーを意味するために、ここでは、交換可能に使用される
。ポリマーは直鎖または分枝鎖であり、変性アミノ酸を含有してよく、非アミノ
酸で中断されていてよい。この用語には、変性されたアミノ酸ポリマーも包含さ
れる；例えばジスルフィド結合形成、グリコシル化、リピド化、アセチル化、ホ
スホリル化、または任意の他の処理、例えば標識成分との結合等の変性。
【００４０】 「融合ポリペプチド」は、配列の異なる部位に、天然で見られるよりも多くの
領域を含有するポリペプチドである。領域は、通常、別個のタンパク質中に存在
し、融合ポリペプチド中で一緒になっていてもよく；領域は、一般的に同一のタ
ンパク質中に存在し、融合ポリペプチドでは新たな配置で位置していてよく；ま
たは領域は、合成により配置されてもよい。ポリペプチドの「機能的に同等なフ
ラグメント」では、アミノ酸残基の付加、欠損または置換あるいはそれらの組み
合わせにより本来の配列からは変化しているものの、使用されるフラグメントの
機能特性は保存されている。融合ペプチドおよび機能的に同等なフラグメントは
、本明細書で使用するポリペプチドの定義に含まれる。
【００４１】 タンパク質の折りたたみ（folding）および生物学的機能は、アミノ酸配列中
の挿入、欠損および置換に順応できると理解される。あるアミノ酸置換はより容
易に許容される。例えば疎水性側鎖、芳香族側鎖、極性側鎖、プラスまたはマイ
ナスの荷電を有する側鎖、または２個以下の炭素原子を含有する側鎖を有するア
ミノ酸を、２つの配列の本質的な同一性を乱すことなく、同様の特性を持つ別の
側鎖を有するアミノ鎖で置換できる。相同領域を測定する方法および相同率の計
算については、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．Ｂｕｌｌ．Ｍａｔｈ．Ｂｉｏ．
４８：６０３〜６１６、１９８６；およびＨｅｎｉｋｏｆｆ ｅｔ ａｌ．Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５〜１０９１９、
１９９２に記載されている。
【００４２】 ポリペプチドの機能を保存するか、または新規かつ有価な特性を与える置換（
例えば活性、安定性を強化するかまたは免疫原性を低下させる）が特に好ましい
。
【００４３】 「抗体」（複数の形体で交換可能に使用する）は、免疫グロブリン分子の可変
領域に局在する抗原認識部位の少なくとも１つを介して、ポリペプチド等の標的
と特異的に結合することができる免疫グロブリン分子である。ここで使用してい
るように、この用語には、完全な抗体だけでなく、所望の特異性を示す抗原結合
部位を少なくとも１つ有する抗体と同等なものも包括される。そのようなものに
は、酵素産生フラグメント抗体または組換え産生フラグメント抗体、融合タンパ
ク質、ヒト化抗体、一本鎖可変領域、二重特異性抗体、および抗原−誘導性の集
合を経た抗体鎖が含まれるが、これに限定するものではない。１つの形態におい
て、抗体はモノクローナル抗体である。別の形態において、抗体はポリクローナ
ル抗体である。抗体は当業者に公知のキメラ、ヒトまたはマウスあるいはそれら
のハイブリッドであってよい。「抗体への特異的な結合」または「特異的な免疫
反応性」とは、組換え抗体またはタンパク質の場合、ＴＮＦの活性を調節、減少
、抑制、不活性化するための、細胞またはタンパク質のＴＮＦへの結合を意味す
る。
【００４４】 これらのペプチドに対するポリクローナル抗体は、選択されたペプチドを用い
て免疫化した動物によって産生してよい。モノクローナル抗体は、免疫化動物の
Ｂ細胞由来の抗体と骨髄腫細胞とを融合し、所望の抗体を産生するハイブリドー
マ細胞系を選択することから成る、ハイブリドーマ技術を用いて産生される。ま
た、モノクローナル抗体は、当業者に公知のｉｎ ｖｉｔｒｏ技術を用いて産生
してもよい。これらの抗体は、現存の動物、人間、または生物学的組織または動
物や人間から単離した分泌液中の、ＤＮＡウイルスの遊離ＤＮＡ分子をコードす
るポリペプチドの発現を検出するのに有用である。
【００４５】 ポリクローナル抗体は、脊椎動物に本発明のポリペプチドを免疫化した形で注
射することにより産生され得る。ポリペプチドの免疫原性は、ＫＬＨ等のキャリ
アーと結合させることにより、またはフロインドのアジュバント等のアジュバン
トと組み合わせることにより、強められる。典型的には、最初に注射を行い、次
いで約４週間後に補助注射を行い、１週間後に抗血清を回収する。別の抗原との
交差−反応を起こす不所望な活性が存在するのであれば、これを、例えば固相に
結合させた抗原から成る吸着体上で製造を実施し、結合していないフラクション
を回収することにより、除くことができる。所望であれば、特異的抗体活性をさ
らに、プロテインＡクロマトグラフィー、硫酸アンモニウム沈殿、イオン交換ク
ロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、および固体支持体に担持したポリペプチドを用い
たイムノアフィニティークロマトグラフィーを含む、種々の技術を組み合わせて
さらに精製してもよい。抗体フラグメントおよび他の誘導体を、抗体をパパイン
またはペプシン等の酵素で分解するなどの一般的な免疫化学的方法により、製造
してもよい。
【００４６】 抗体は、以下の検出可能なマーカーで標識してよいが、これに限定するもので
はない：放射線標識、または着色、発光、または蛍光マーカー、または金。放射
線標識には以下が含まれるが、これに限定するものではない。3Ｈ、14Ｃ、32Ｐ
、33Ｐ、35Ｓ、36Ｃｌ、51Ｃｒ、57Ｃｏ、59Ｃｏ、59Ｆｅ、90Ｙ、125Ｉ、131Ｉ
、および186Ｒｅ。蛍光マーカーには以下が含まれるが、これに限定するもので
はない：フルオレセイン、ローダミンよびオーラミン。着色マーカーには以下が
含まれるが、これに限定するものではない：ビオチンおよびジゴキシゲニン。本
発明に包括される標識の種類の例には、放射性同位元素標識（例えばｓｕｐ．３
Ｈ、ｓｕｐ．１２５Ｉ、ｓｕｐ．１３１Ｉ、ｓｕｐ．３５Ｓ、ｓｕｐ．１４Ｃ等
）、非−放射性同位体元素標識（例えばｓｕｐ．５５Ｍｎ、ｓｕｐ．５６Ｆｅ等
）、例えばピリジニンクロロフィルタンパク（ＰｅｒＣＰ）中での蛍光標識（例
えばフルオレセイン標識、イソチオシアネート標識、ローダミン標識、フィコエ
リスリン標識、フィコシアニン標識、アロフィコシアニン標識、アートＯ−フタ
ルデヒド標識、フルオレスキャミン標識等）、化学発光標識、酵素標識（例えば
アルカリホスファターゼ、西洋わさびペルオキシダーゼ等）、タンパク標識、ラ
ジオイメージングまたはラジオイムノイメージングに有用な標識が含まれるが、
これに限定するものではない。
【００４７】 ここで使用する用語としての変性体は、参照ポリヌクレオチドまたはポリペプ
チドのそれぞれとは異なるポリヌクレオチドまたはポリペプチドである。この意
味での変性体を以下に記載し、本明細書の別の場所で詳細する。（１）他の参照
ポリヌクレオチドとはヌクレオチド配列が異なるポリヌクレオチド。変性体のヌ
クレオチドの変化はサイレント（silent）なものであってよい、すなわちヌクレ
オチドがコードするアミノ酸を変化させない。変化がこの種のサイレントな変化
に限定される場合、参照ポリペプチドと同一のアミノ酸配列を有するポリペプチ
ドがコードされていることになる。変性体のヌクレオチド配列の変化が、参照ポ
リヌクレオチドがコードするポリペプチドのアミノ酸配列を変化させてもよい。
このようなヌクレオチドの変化は、以下で議論するように、参照配列がコードす
るポリペプチド中でアミノ酸の置換、付加、欠損、融合および截断が起きている
。（２）別の参照ポリペプチドとは異なるアミノ酸配列を有するポリペプチド。
一般的に、相違は制限されているので、参照配列と変性体配列とは全体として非
常に類似しており、多くの領域は同一である。変性体ポリペプチドおよび参照ポ
リペプチドは、１つ以上の置換、付加、欠損、融合および截断が任意に組み合わ
さることにより、アミノ酸配列に変化を生じる。（３）変性体は、末端欠損また
は内部欠損等により参照配列よりも短くなり、参照ポリヌクレオチドまたはポリ
ペプチドとは異なる、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドのフラグメ
ントであってもよい。本発明のポリペプチド変性体には、ポリペプチドと実質的
には同一の生物学的機能または活性を保持するポリペプチドも含まれ、例えばタ
ンパク質の一部の切断により活性化されて活性成熟ポリペプチドを生じる前タン
パク質である。（４）変性体は（ｉ）１つ以上のアミノ酸残基が、保存または非
−保存アミノ酸残基で置換され（好ましくは、保存アミノ酸残基）、このような
置換アミノ酸残基が遺伝暗号でコードされているかまたはいないもの、または（
ｉｉ）１つ以上のアミノ酸残基が置換基を含むもの、または（ｉｉｉ）成熟ポリ
ペプチドが他の化合物、例えばポリペプチドの半減期を延長する化合物（例えば
ポリエチレングリコール）と融合しているもの、または（ｉｖ）付加的なアミノ
酸が成熟ポリペプチドと融合しているもの、例えばリーダー配列またはセクレタ
リー配列あるいは成熟ポリペプチドまたは前タンパク質配列の精製に使用する配
列である。（５）ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの変性体は、自然発生的
な変性体であってよく、例えば自然発生的な相対形質変性体であるか、または自
然発生であることが知られていない変性体であってもよい。このような自然発生
的でないポリヌクレオチドの変性体は、ポリヌクレオチド、細胞または有機体に
適用されるものを含む突然変異技術により、あるいは組換え法により、製造され
得る。ポリヌクレオチドの中でも、ここで変性体とは、ヌクレオチドの置換、欠
損または付加により前記ヌクレオチドとは異なってしまった変性体である。置換
、欠損または付加には１つ以上のヌクレオチドが含まれてよい。変性体は、コー
ド領域または非−コード領域あるいはその両方で変化を起こしていてよい。コー
ド領域の変化は、保存的なまたは非−保存的なアミノ酸置換、欠損または付加を
起こし得る。上記により定義したこれらの全ての変性体は、ここでの供述および
従来技術から、当業者の認識の範囲内であると見なされる。
【００４８】 アンチセンスヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列がＴＮＦの発現を回避
または低下するのに有効であることは、当業者に公知である。また、本発明はＴ
ＮＦαの産生を阻害または抑制するためにＴＮＦαと特異的にハイブリダイズで
きるアンチセンス分子を提供する。本発明は、ＴＮＦの発現を遮断することが可
能な拮抗物質を提供する。１つの形態において、拮抗物質は二本鎖ＤＮＡ分子と
ハイブリダイズできる。別の形態において、拮抗物質はＤＮＡ分子とハイブリダ
イズできるトリプレックスのオリゴヌクレオチドである。別の形態において、ト
リプレックスオリゴヌクレオチドは少なくともＴＮＦの一部と結合することがで
きる。
【００４９】 アンチセンス分子はＤＮＡまたはＲＮＡあるいはそれらの変性体（すなわちタ
ンパク主鎖を有するＤＮＡまたはＲＮＡ）であってよい。本発明は、アンチセン
スヌクレオチドおよびリボザイムの製造にまで拡張され、ｍＲＮＡをアンチセン
ス核酸でマスキングするかまたはリボザイムで切断することにより、特異的ｍＲ
ＮＡの翻訳時にレセプター認識タンパク質の発現を妨害するように使用される。
【００５０】 アンチセンス核酸は、特異的ｍＲＮＡ分子の少なくとも一部と相補的なＤＮＡ
またはＲＮＡ分子である。これらは細胞中でｍＲＮＡとハイブリダイズして、二
本鎖分子を形成する。細胞は二本鎖形ではｍＲＮＡを翻訳しない。したがって、
アンチセンス核酸は、ｍＲＮＡのタンパクへの発現を妨害する。
【００５１】 ＴＮＦに相補的であり、ＴＮＦと結合し、ＴＮＦの産生を阻害するオリゴヌク
レオチドを、以下のようにして取得してよい：次に２種類のプライマーを用いて
ポリメラーゼ連鎖反応を行う。ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ
ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ［７４］参照。ＰＣ
Ｒ増幅の後、ウイルスＤＮＡのＰＣＲ−増幅領域を、前記の３つの特異的核酸プ
ローブとハイブリダイズする能力について、試験してよい。また、ウイルスＤＮ
Ａの前記核酸プローブへのハイブリダイゼーションは、ウイルスＤＮＡの増幅な
しに、ここで記載するストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、サ
ザンブロット法により実施できる。非常にストリンジェントな条件は、定義され
たイオン強度およびｐＨでの特異的配列の熱融点（Ｔｍ）よりも約５℃低く選択
される。Ｔｍは、標的配列の５０％がプローブと完全に合致してハイブリダイズ
する温度（定義したイオン強度およびｐＨ下）である。典型的に、ストリンジェ
ントな条件とは、ｐＨ７での塩濃度が少なくとも約０．０２モルで、温度は少な
くとも約６０℃の条件である。他の因子、中でも塩基の組成、相補鎖の大きさ、
有機溶剤の存在（すなわち塩またはホルムアミド濃度）、および塩基のミスマッ
チ範囲を含む因子がハイブリダイゼーションの厳密さに大きな影響を及ぼし得る
ので、任意の１つが絶対的な値であることよりも、パラメーターの組み合わせが
重要である。例えば高い厳密性は、例えばＳＳＣ溶液中で約６８℃で一晩ハイブ
リダイゼーションし、６×ＳＳＣ溶液を用いて室温で洗浄し、６×ＳＳＣおよび
０．６×ＳＳＸ溶液中で約６８℃で洗浄することにより達成され得る。
【００５２】 中程度の厳密性で行うハイブリダイゼーションは、例えば１）３×塩化ナトリ
ウム溶液、クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）、５０％ホルムアミド、０．１Ｍ Ｔ
ｒｉｓバッファー（ｐＨ７．５）、５×デンハルド溶液Ｕ（Ｄｅｎｈａｒｄｔ’
ｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）から成る溶液を用いて、フィルタープレ−ハイブリダイ
ズおよびハイブリダイズを実施し；２）３７℃で４時間プレハイブリダイズし；
３）３，０００，０００に等しい標識プローブ量で、総計１６時間ハイブリダイ
ズし；４）２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ溶液で洗浄し；５）それぞれ室温で
１分×４、それぞれ６０℃で３０分×４で洗浄し；６）乾燥させ、フィルムへ露
出する。
【００５３】 用語「選択的にハイブリダイズする」は、全細胞ＤＮＡまたはＲＮＡの製造中
に標的配列が存在する場合に、特定のＤＮＡまたはＲＮＡ配列に対してのみハイ
ブリダイズ、重複または結合する核酸プローブを意味する。選択的にハイブリダ
イズするとは、非常にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下に、プ
ローブが、非標的配列とは異なる方法で検出可能な方法で所与の標的と結合する
ことを意味し、「相補的」または「標的」核酸配列とは核酸プローブと選択的に
ハイブリダイズする核酸配列である。好ましいアニーリング条件は、例えば、プ
ローブの長さ、塩基の組成、ミスマッチの数およびそのプローブ上での位置に依
存し、たいていの場合、経験的に決定される。核酸プローブの設計およびアニー
リング条件の議論は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、［８１］または
Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．、ｅｔ ａｌ．、［８］を参照のこと。
【００５４】 ここで「薬剤組成物」とは、前記した本発明の分子と好適な希釈剤、保存剤、
可溶化剤、乳化剤、アジュバントおよび／またはキャリアーとを一緒に含有する
、治療有効量の化合物または組成物を意味する。ここで「治療有効量」とは、一
定の条件および投与レジュメにおいて、治療上の効果をもたらす量を意味する。
このような組成物は、液体あるいは凍結乾燥または別の方法で乾燥させた配合物
であり、様々なバッファー含量、ｐＨおよびイオン強度を示す希釈剤（例えば、
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、アセテート、ホスフェート）、添加剤、例えば表面への吸着
を阻止するためのアルブミンまたはゼラチン、界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ
２０、Ｔｗｅｅｎ８０、ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ６８、胆汁酸塩）、可溶化剤（例え
ば、グリセロール、ポリエチレングリセロール）、抗酸化薬（例えば、アスコル
ビン酸、ナトリウムメタビスルファイト）、保存剤（例えば、Ｔｈｉｍｅｒｏｓ
ａｌ、ベンジルアルコール、パラベン）、嵩を増やすための薬剤または強壮調節
剤（例えば、ラクトースまたはマンニトール）、ポリエチレングリコール等のポ
リマーのタンパク質への共有結合、金属イオンとの錯化、またはポリ酢酸、ポリ
グリコール酸、ハイドロジェル等の重合化合物の特別な製造物中または製造物上
への、あるいはリポソーム、ミクロエマルジョン、ミセル、ユニラメラまたはマ
ルチラメラの小胞、赤血球ゴーストまたはスフェロプラスト上への材料の組み込
みを含む。本発明の組成物の別の形態では、非経口、肺、鼻および経口を含む種
々の投与経路に応じて、特殊な保護コーティング、プロテアーゼ阻害剤または浸
透促進剤が組み込まれている。１つの形態において、薬剤組成物を、非経口投与
、腫瘍内投与、悪性新生物周辺投与（paracancerally）、経粘膜投与、経皮投与
、筋肉内投与、静脈内投与、粘膜内投与、血管内投与、皮下投与、腹腔内投与、
心室内投与、頭蓋骨内投与、局所ドロップまたは軟膏、眼周囲注射、静脈内注射
または経口による全身投与、前眼房または硝子体へのカメラ内投与、外科手術時
に挿入した眼球内水晶体植片に接合させたデポー剤による投与、前眼房または硝
子体に縫合させて眼内に設置したデポー剤による投与によって投与する。
【００５５】 さらに、ここで使用する「製薬学的に使用可能なキャリアー」は当業者に公知
であり、０．０１Ｍ〜０．１Ｍの、好ましくは０．０５Ｍのリン酸バッファーま
たは０．８％の生理食塩水を含有するが、これに限定するものではない。また、
このような製薬学的に使用可能なキャリアーは、水性または非−水性溶液、懸濁
液およびエマルジョンであってよい。非−水性溶剤の例は、プロピレングリコー
ル、ポリエチレングリコール、植物油、例えばオリーブオイル、注射可能な有機
エステル、例えばエチルオレアートである。水性キャリアーには、水、食塩水お
よびバッファー媒体を含有するアルコール性／水性の溶液、エマルジョンまたは
懸濁液が含まれる。非経口用賦形剤には、塩化ナトリウム溶液、リンガーズデキ
ストロース、デキストロースと塩化ナトリウム、乳酸処理したリンガーズまたは
不揮発性油脂が含まれる。静脈内用賦形剤には、例えばリンガーズデキストロー
スをベースにした、液および栄養の補充剤、電解質補充剤、および類似物が含ま
れる。保存剤および他の添加物も存在し、例えば抗微生物薬、抗酸化薬、照合剤
、不活性ガスおよび類似物である。
【００５６】 用語「アジュバント」は、抗原に対する免疫応答を強化する化合物または混合
物を意味する。アジュバントは、抗原をゆっくりと放出する組織デポー剤として
、さらに免疫応答を非−特異的に強化するリンパ系活性化剤としても機能できる
（Ｈｏｏｄ ｅｔ ａｌ．、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄ．、１
９８４、Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ：Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、Ｃａｌ
ｉｆｏｒｎｉａ、ｐ．３８４）。多くの場合、アジュバント不在下に抗原単独で
行う最初の挑戦では、人体または細胞の免疫応答を引き出すことができない。ア
ジュバントには、フロインドの完全アジュバント、フロインドの不完全アジュバ
ント、サポニン、水酸化アルミニウム等のミネラルゲル、リゾレシチン等の表面
活性物質、プルロニックポリオール類（pluronic polyols）、ポリアニオン、ペ
プチド、油脂または炭化水素エマルジョン、スカシガイのヘモシアニン、ジニト
ロフェノールが含まれるが、これに限定するものではない。好ましくは、アジュ
バントは製薬学的に使用可能である。
【００５７】 放出を制御または維持した組成物には、脂肪性デポー剤（例えば脂肪酸、ワッ
クス、油脂）中の配合物が含まれる。本発明に含まれるのは、さらに、ポリマー
（例えば、ポロキサマーまたはポロキサミン）で被覆された特別な組成物および
組織−特異的レセプター、リガンドまたは抗原に対する抗体と結合した化合物、
または組織−特異的レセプターのリガンドと結合した化合物である。本発明の組
成物の他の形態では、非経口、肺、鼻および経口を含む種々の投与経路に応じて
特殊な保護コーティング、プロテアーゼ阻害剤または浸透促進剤が組み込まれて
いる。好適な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロー
ル、エタノールまたはその類似物、およびそれらの組み合わせである。さらに、
所望であれば、組成物は少量の補助物質、例えば湿潤剤または乳化剤、活性成分
の効果を高めるｐＨ平衡化剤を含有してもよい。
【００５８】 活性成分を、中和された製薬学的に使用可能な塩の形として、治療用組成物へ
配合してもよい。製薬学的に使用可能な塩には酸付加塩が含まれ、これは例えば
塩酸またはリン酸等の無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸等の
有機酸、およびその類似物で形成される。遊離カルボキシル基から形成される塩
は、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムまたは鉄水酸化物
等の無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミ
ノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等の有機塩基、および類似物に由来して
もよい。
【００５９】 組成物の製薬学的に使用可能な形体には、製薬学的に使用可能なキャリアーが
含まれる。本発明の治療法および組成物では、活性化合物を治療有効量で供給す
る。施工者は、従来技術でよく知られているように、対象の特徴（年齢、体重、
性別、症状、合併症、他の疾患等）を基本理念とした。さらに、慣例の試験を実
施することにより、各対象のそれぞれの症状を治療するのに適当な投与量につい
て、より特殊な情報が得られ、当業施工者は、受け手側の治療内容、年齢および
全体的な健康状態を考慮して、適切な投与量を確定することができる。一般的に
、静脈内注射または注入では、腹腔内投与、筋肉内投与または他の投与経路より
も投与量が低くなる。投与スケジュールは、循環半減期および使用する配合物に
応じて変化させてよい。組成物は、投与配合物にも適した方法により、治療有効
量で投与される。活性成分の適切な要求投与量は、開業医の診断により、各個人
に特徴的な量である。しかし、好適な投与量は、１日に体重１ｋｇあたり活性成
分約０．１〜２０、好ましくは約０．５〜１０、より好ましくは１〜数ミリグラ
ムの範囲であり、投与経路によって変化する。初期投与および補助投与の好適な
レジュメも可変であるが、一般的には、最初に投与してから１時間以上の間隔を
空けて、引き続き注射または他の投与形態により繰り返して投与する。また、血
液中で１０ナノモル〜１０マイクロモルの濃度を維持できる連続的な静脈内注入
も考えられている。
【００６０】 以下の実施例により本発明の好ましい形態を詳細に説明する。しかし、本発明
の広い見地を制限するものではない。
【００６１】 （実験による詳細な説明） 実施例１： （材料および方法） 対象：ＰＯＡＧと診断された４つの死人の眼とＮＰＧと診断された７つの人の
眼とを得た。対象の年齢は６８〜８４歳の範囲であった。緑内障の臨床所見は、
眼内圧の読み取り、視神経乳頭の評価、および視野試験を行う５〜１３年（平均
７．５年）の徹底した調査により、はっきりと実証された。眼病の罹患歴のない
４人の人間のドナー眼を、年齢−合致コントロールとして使用した（年齢幅６１
〜８１歳）。死からサンプルの固定までの時間は６〜９時間の範囲であった。摘
出後、全ての眼を１０％の中性平衡化ホルマリン中で２４時間固定し、等級アル
コールで脱水し、パラフィンに埋め込んだ。サンプルのいくつかは視神経乳頭と
僅かな乳頭周囲網膜しか含有していなかったので、免疫染色による網膜分布は試
験しなかった。パラフィンから取出し、５μｍ厚の視神経乳頭縦断面をＭＭＰ−
１、ＭＭＰ−２またはＭＭＰ−３に対するモノクローナル抗体（２．５μｇ／ｍ
ｌ）（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ．Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）または
ＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−αレセプターＩに対するポリクローナル抗体（２μｇ
／ｍｌ）（Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）と４
℃で一晩インキュベートし、メタノール中の２％の過酸化水素で内在ペルオキシ
ダーゼを遮断した後、リン酸バッファー生理食塩水溶液で数回洗浄した。３種の
抗−ＭＭＰ抗体は、ＭＭＰの潜伏形ならびに活性形の両方を認識した。第１抗体
でインキュベートする前に、断面を、マウスの皮膚からの抽出物（ＭＭＰ染色時
）または２０％の非−免疫ロバ血清（ＴＮＦおよびそのレセプター染色時）とイ
ンキュベートしてバックグラウンドの染色を遮断する。ビオチン化第２抗体（抗
−マウスまたは抗−ヤギＩｇＧ）（Ｄａｋｏ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｒ
ｐｉｎｔｅｒｉａ、ＣＡ）を用いて断面を室温で３０分処理した。次にスライド
を西洋わさびペルオキシダーゼ−標識ストレプトアビジン溶液（Ｄａｋｏ Ｃｏ
ｒｐｏｒａｔｉｏｎ）で３０分インキュベートし、０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ（ｐＨ７．６）中の０．０２％の３−３’ジアミノベンジジンテトラヒドロク
ロリド（ＤＡＢ）および０．００６％のＨ2Ｏ2溶液でインキュベートすることに
より視覚化した。スライドをメイヤーのヘマトキシリンで速やかに比色染色した
。第１抗体の代わりにマウス血清またはリン酸平衡化生理食塩水溶液でインキュ
ベートした断面を、ネガティブコントロールとして使用した。浸潤性管肺癌（ｉ
ｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ ｄｕｃｔａｌ ｂｒｅａｓｔ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）
の生検サンプル由来の断面を、この実験で使用する全ての抗体のポジティブコン
トロールとして使用した。
【００６２】 各視神経乳頭由来の３〜５断面を、ＭＭＰを含む各タンパク質について、免疫
組織化学により試験した。免疫染色の総合的な半定量的評価を得るために、視神
経乳頭の篩板前、篩板部、篩板後領域のＭＭＰ、ＴＮＦ−αおよびそのレセプタ
ーコピーの免疫染色の強さを、各領域が−から＋＋＋に等級化される、任意のス
コアを用いて等級化した。半定量的スコア（括弧内に示した）を各視神経乳頭に
ついて算出した［−＝不在（０）、±＝不在から弱い範囲（０．５）、＋＝弱い
染色（１）、＋＋＝中程度の染色（２）、＋＋＋＝強い染色（３）］。免疫染色
の等級化は、隠蔽状態で、免疫組織化学染色の等級化に精通するが視神経乳頭の
病理学的変化を熟知していない観察者によって実施された。観察者は、著者の１
人（ＸＹ）から指示された視神経乳頭領域（篩板前、篩板部、篩板後）の免疫染
色強度を等級化した。各郡の典型的な断面のスコア結果と写真との両方を得た。
【００６３】 （結果） 光学顕微鏡によれば、正常の眼では篩板前領域にグリア柱と神経束とが見られ
た。篩板では、コラーゲン状の板ビームに沿ってグリア細胞が存在した。篩板後
領域では、グリア細胞は主に膜中隔に沿って分布し、軸索束にも散在した。
【００６４】 ＰＯＡＧまたはＮＰＧの緑内障の眼では、明らかに軸索萎縮および篩板の逆方
向への湾曲が見られた。板の湾曲の度合いは、ＰＯＡＧまたはＮＰＧの眼で類似
していた。ＰＯＡＧの眼の軸索萎縮の程度は、僅かから中程度であり、特に篩板
後領域で見られた。ＮＰＧの眼において、軸索萎縮はほとんどの眼で中程度であ
り、海面状の変性部での焦点消失によって特徴付けられた。ＮＰＧの眼では、よ
り末梢部での軸索保護を伴う神経円板眼胚から、いくつかの軸索消失が認められ
た。ＰＯＡＧの眼の視神経乳頭の篩板後領域では、組織の崩壊はないが中隔の僅
かな破壊が明らかとなった。これらの変化は、ＰＯＡＧの全ての眼に同様に見ら
れた。これに対して、ＮＰＧ対象の眼は、シュナベルの海面状変性（Schnabels
cavernous degeneration）の様々な過程を示し、これは主に篩板部および篩板後
視神経で明らかであった。軸索の萎縮は、ＮＰＧの眼で見られる海面状変性部内
に、篩板または中隔の多巣性の破壊を伴う。いくつかの眼では、変性部が癒着し
て大きな海面状の空洞を形成する。軸索が維持された部位では、篩板および中隔
の配列は損傷を受けずにそのままであり、グリア細胞の分布も未変化のまま保持
されていた。
【００６５】 免疫組織化学による視神経乳頭の試験により、ＭＭＰ、ＴＮＦ−αまたはＴＮ
Ｆ−αレセプター−１に関して、免疫染色の強度および染色細胞の数が、特にＮ
ＰＧの緑内障視神経乳頭において、年齢−合致コントロールよりも勝っているこ
とが明らかになった。主に形態学的に星状細胞に類似した細胞中で、免疫標識が
見られた。これにより免疫染色強度は変化したが染色細胞の数は変化しなかった
ので、写真も緑内障視神経乳頭中で起きた変化を最適に反映している。視神経乳
頭のＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−αレセプター−１に対する免疫染色パターンも以
下に示す。
【００６６】 ＴＮＦ−α。コントロールの眼において、僅かなグリア細胞の突起部および視
神経乳頭の神経束および血管の周辺では、ＴＮＦ−αおよびそのレセプターであ
るＴＮＦ−αレセプター−１に対する免疫染色は僅かであった。緑内障視神経乳
頭において、ＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−αレセプター−１に対する免疫染色強度
および染色細胞数は、緑内障視神経乳頭のどの領域でも、コントロールと比べて
増加した。免疫染色は、緑内障の眼の、視神経乳頭の篩板前および篩板部領域中
の、軸索および血管の周囲のグリア細胞で陽性であった。篩板後領域では、中隔
に沿って分布しかつ神経束に散在したグリア細胞が、免疫染色を示した。ＴＮＦ
αに対する免疫染色がほとんどグリア細胞に関連しているにもかかわらず、ＴＮ
Ｆ−αレセプター−１に対する免疫染色の増加が神経束でも見られ、これは緑内
障視神経乳頭の篩板前領域で顕著であった。
【００６７】 （ディスカッション） 細胞外マトリックスの完全性および変化は、ＭＭＰを誘導する種々の因子によ
って影響される。マトリックスメタロプロテイナーゼは、グリア細胞から分泌さ
れるタンパク分解酵素のファミリーであり、細胞外マトリックスのほぼ全ての成
分を分解できる。ＭＭＰはそのドメイン構造と基質特異性を基礎として、３種の
広いファミリーに分類される。細胞組織間のコラゲナーゼ（ＭＭＰ−１）および
好中球コラゲナーゼ（ＭＭＰ−８）はコラゲナーゼファミリーに属し、その主な
基質は原繊維コラーゲンタイプＩ、IIおよびIIIである。酵素ＭＭＰ−２および
ＭＭＰ−９はゼラチナーゼファミリーのメンバーであり、その基質はタイプIVお
よびＶコラーゲン、フィブロネクチン、プロテオグリカンおよびゼラチンを含む
。ストロメリシンファミリーのメンバーには、ＭＭＰ−３（ストロメリシン、ト
ラシン）およびＭＭＰ−７（マトリリシン）が含まれ、プロテオグリカン、ラミ
ニン、ゼラチンおよび前コラーゲン前駆体ペプチドを含む広い範囲の基質上で機
能する15,19-23。
【００６８】 これらは中枢神経系の数種の疾患と関連するにもかかわらず11-13、正常また
は緑内障ヒト視神経でのＭＭＰの役割についてはほとんど知られていない。ＭＭ
Ｐ−３およびＭＭＰ−２ならびにメタロプロテイナーゼの組織阻害剤（ＴＩＭＰ
−１）の局在化が、正常な霊長類視神経乳頭および網膜で見られることが示され
た（Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、ＡＲＶＯ ａｂｓｔｒａｃｔ、１９９３）
。さらに、緑内障のサルの眼で、ゼラチナーゼ活性の上昇が見られた（Ｅｍｉ
ｅｔ ａｌ．、ＡＲＶＯ ａｂｓｔｒａｃｔ、１９９３；Ｓａｗａｇｕｃｈｉ
ｅｔ ａｌ．、ＡＲＶＯ ａｂｓｔｒａｃｔ、１９９８）。正常視神経乳頭中で
のグリア細胞の僅かなＭＭＰ免疫標識および緑内障の眼でのＭＭＰの免疫標識の
上昇という結果は、これらの制限された実験で終始一貫している。
【００６９】 これらの結果は、ＭＭＰ、ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−αレセプター−１に対す
る免疫染色強度が、コントロールと比べて緑内障視神経乳頭で強いことを明らか
にした。さらに、視神経乳頭の篩板前、篩板部および篩板後領域で、これらのタ
ンパク質に対して異なる免疫染色パターンが見られた。これらの異なるパターン
には、篩板後領域でのＭＭＰの最も顕著な標識、および緑内障視神経乳頭の篩板
前領域でのＴＮＦ−αおよびそのレセプターの最も顕著な標識が含まれる。これ
らの所見の１つの可能な説明は、最近記載された、視神経乳頭中のグリア細胞の
領域的および機能的な不均一性を基とする。例えば、篩板前および篩板部領域の
タイプ１Ｂ星状細胞の大きさおよび密度、および篩板後領域のタイプ１Ａ星状細
胞の大きさおよび密度は、正常組織よりも緑内障の眼で勝っている24-26。
【００７０】 ＭＭＰの免疫染色の増加は、星状細胞およびその突起の細胞質ならびにＰＯＡ
ＧまたはＮＰＧの眼の視神経乳頭の細胞外マトリックス中で見られた。視神経乳
頭の異なる領域でのＭＭＰに対する免疫染色の増加の分布は、ＰＯＡＧまたはＮ
ＰＧの眼で類似していた。しかし、ＭＭＰ、特にＭＭＰ−２の免疫染色強度は、
ＰＯＡＧの眼と比べて、ＮＰＧの眼で勝っていた。ＮＰＧの眼では、中隔に沿っ
た免疫染色が、海面状変性領域でゆっくりと増加した。
【００７１】 細胞は、ＭＭＰを不活性形で分泌し、前酵素は様々な分子により細胞外空間で
活性化され得る。この試験でＭＭＰの認識のために使用された抗体は、ＭＭＰ前
駆体およびタンパク分解処理活性形の両方と同一である。したがって、免疫組織
化学では、ＭＭＰが組織内に存在すると、機能的状態を識別できない。星状細胞
中の強い免疫活性は、一般的な条件下で細胞外空間において比較的低いレベルで
機能できる細胞内ＭＭＰが多く貯蔵されていることを示唆する。このような貯蔵
は、病理学的条件下に、細胞外マトリックスの基質上で速やかに活性化できる23 。
【００７２】 緑内障視神経乳頭でのＭＭＰの発現の一般的な増加は、様々な結果をもたらす
。ＭＭＰは細胞外マトリックス成分の変性に応答性であるので、緑内障視神経乳
頭での発現の増加は、緑内障視神経乳頭で起こる細胞外マトリックスの沈着の増
加に対抗した生理学的応答であると考えられる27。このことは大グリア細胞の活
性化にもかかわらず、緑内障視神経中にグリア瘢痕組織が存在しないことを説明
する。これにより、ＭＭＰ活性の増加による組織変性が、眼内圧等の他の因子と
は無関係に緑内障視神経障害を併発する神経円板眼胚が出現することの、部分的
な原因であるという推測が導かれる。
【００７３】 マトリックスメタロプロテイナーゼが、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、ニューロン
の再生に必要な栄養物質を障害すると考えられる31瘢痕組織の形成を回避するこ
とにより、軸索成長に重要な役割を果たすことが予測された29,30。したがって
、保存された軸索部でのＭＭＰに対する顕著な免疫染色の結果は、活性化グリア
細胞が、瘢痕組織形成の回避と同時にニューロン成長の促進という２つの目的の
ために、ＭＭＰ分泌を増加することを意味している。
【００７４】 正常な視神経の中隔は、コラーゲンタイプIII、IVおよびフィブロネクチンを
、主に血管の周りに含有する31。これらはＭＭＰ−２およびＭＭＰ−３の主要な
基質である。緑内障視神経乳頭の星状細胞中および中隔に沿って、ＭＭＰ−２お
よびＭＭＰ−３の免疫染色が上昇することは、これらのＭＭＰが海面状変性部位
に見られる中隔の崩壊に重要な役割を果たすであろうことを示唆している。
【００７５】 さらに、ＭＭＰ−２の発現が、特にＮＰＧの眼の、緑内障視神経乳頭中の血管
を包囲する星状細胞突起中で増加した。ＭＭＰ−２は基底板を薄化し、毛細管浸
透性を上昇させるので32、血管周囲部でのＭＭＰ発現の増加は、この部位の血管
脳関門に影響を及ぼし得ると考えられる。
【００７６】 緑内障視神経乳頭中でのＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−αレセプター−１の免疫染
色は、ＰＯＡＧまたはＮＰＧのいずれでも増加した。ＴＮＦ−αは、損傷後に脳
で速やかにアップレギュレーションされる潜在的な免疫メディエータおよび前炎
症サイトカインである33,34。ＴＮＦ−αはまた、ＴＮＦ−αレセプター−１の
占有を介する、アポトーシス細胞死のインデューサーとして知られている35。Ｔ
ＮＦ−αは、多発性硬化症および自己免疫脳脊髄炎等の神経系の疾患の病因に関
係があり、ＡＩＤＳ対象の視神経に見られる軸索変性およびグリア変化を説明す
ると考えられる36。この試験により、ＴＮＦ−α免疫染色が視神経乳頭のグリア
細胞のほとんどで陽性であることが立証されたにもかかわらず、ＴＮＦ−αレセ
プター−１免疫染色は、緑内障の眼で増加する視神経乳頭の篩板前領域に局在し
た神経束で、より顕著に陽性であった。この結果は、神経組織がＴＮＦ−αの作
用できる重要な標的であることを示している。ＴＮＦ−αとＭＭＰの間には、そ
の分泌と機能とを制御するために相互作用が働くことがよく知られているので、
ＴＮＦ−αとＭＭＰの発現の両方が緑内障視神経乳頭で増加することは驚くべき
ことではない14-18。したがって、緑内障視神経乳頭中でのＴＮＦ−αの発現の
増加は、このサイトカインが、組織再構築で大グリア細胞活性化過程の一部とし
て重要な役割を果たしかつ／または組織損傷に関わることを立証している。
【００７７】 （参考文献） 1. Wax MB, Tezel G, Edward DP. Clinical and histopathological findings o
f a patient with normal pressure glaucoma. Arch Ophthalmol. 1998; 116: 9
93-1001. 2. Morrison JC, Dorman-Pease ME, Dunlcelberger GR, Quigley HA. Optic ner
ve head extracellular matrix in primary optic atrophy and experimental g
laucoma. Arch Ophthalmol. 1990; 108 : 1020-1024. 3. Hemandez MR, Andrzejewska WM, Neufeld AH. Changes in the extracellula
r matrix of the human optic nerve head in primary open-angle glaucoma. A
m J Ophthalmol. 1990; 109: 180-188. 4. Quigley HA, Dorman-Pease ME, Brown AE. Quantitative study of collagen
and elastin of the optic nerve head and sclera in human and experimenta
l monkey glaucoma, Curr Eye Res. 1991; 10; 877-888. 5. Hernandez MR. Ultrastructural immunocytochemical analysis of elastin
in the human lamina cribrosa: Changes in elastic fibers in primary open-
angle glaucoma. Invest Ophthalmol Vis Sci. 1992; 33: 2891-2903. 6. Varela HJ, Hernandez MR. Astrocyte responses in human optic nerve hea
d with primary open-angle glaucoma. J. Glaucoma. 1997; 6: 303-313. 7. Minckler DS, Spaeth GL. Optic nerve damage in glaucoma. Surv Ophthalm
ol. 1981; 26: 128-148. 8. Quigley HA, Hohman RM, Addicks EM, Massof RW, Green WR. Morphologic c
hanges in the lamina cribrosa. correlated with neural loss in open angle
glaucoma, Am J Ophthalmol. 1983; 95: 673-691. 9. Okada Y, Gonoji Y, Nakanishi I, Nagase H, Hayakawa T. Immunohistochem
ical demonstration of collagenases and tissue inhibitor of metalloprotei
nases (TIMP) in synovial lining cells of rheumatoid synoivium. Virchows
Archiv B Cell Pathol. 1990; 59: 305-312. 10. Woessner Jr JF. Matrix metalloproteinases and their inhibitors in co
nnective tissue remodeling. FASEB J. 1991; 5: 2145-2154. 11. Backstrom JR, Miller CA, Tokes ZA. Characterization of neural protei
nases from Alzheimer-affected and control brain specimens: Identificatio
n of calcium-dependent metalloproteinases from the hippocampus. J Neuroc
hem. 1992; 58: 983-992. 12. Giraudon P, Buart S, Bernard A, Thomasset N, Belin MF. Extracellular
matrix-remodeling metalloproteinases and infection of the central nervo
us system with retrovirus human T-lymphotropic virus type I (HTLV-I). Pr
og Neurobiol. 1996; 49: 169-184. 13. Rosenberg GA, Navratil M, Barone F, Feuerstein G. Proteolytic cascad
e enzymes increase in focal cerebral ischemia in rat, J Cereb Blood Flow
Metabol. 1996; 16: 360-366. 14, Ridet JL, Malhotra SK, Privat A, Gage FH. Reactive astocytes: cellul
ar and molecular cues to biological function. Trends Neurosci, 1997; 20:
570-577. 15. Gottschall PE, Yu X. Cytokines regulate gelatinase A and B (matrix m
etalloproteinase 2 and 9) activity in cultured rat astrocytes. J Neuroch
em. 1995; 64: 1513-1520. 16. Gottschall PE, Deb S. Regulation of matrix metalloproteinase express
ion in astrocytes, microglia and neurons. Neuroimmunomodulation. 1996; 3
: 69-75. 17. Migita K, Eguchi K, Kawabe Y, et al. TNF-α-mediated expression of membrane-type matrix metalloproteinase in rheumatoid synovial fibroblast
s. Immunology. 1996; 89: 553-557. 18. Chandler S, Miller KM, Clements JM, et al. Matrix metalloproteinases
, tumor necrosis factor and multiple sclerosis: an overview. J Neuroimmu
nol. 1997; 72: 155-161. 19. Apodaca G, Rutka JT, Bouhana K, et al. Expression of metalloproteina
ses and metalloproteinase inhibitors by fetal astrocytes and glioma cell
s. Cancer Res. 1990; 50: 2322-2329. 20. Eddleston M, Mucke L. Commentary: Molecular profile of reactive astr
ocytes-implications for their role in neurologic disease. Neuroscience.
1993; 54: 15-36. 21. Romanic AM, Madri JA. Extracellular matrix-degrading proteinases in
the nervous system.. Brain Pathol. 1994; 4: 145-156. 22. Nakagawa T, Kubota T, Kabuto M et al. Production of matrix metallopr
oteinases and tissue inhibitor of metalloproteinases-1 by human brain tu
mors. J Neurosurg. 1994; 81: 69-77. 23. Maeda A, Sobel RA. Matrix metalloproteinases in the normal human cen
tral nervous system, microglial nodules, and multiple sclerosis lesions.
J Neuropathol Exp Neurol. 1996; 55: 300-309. 24. Raff MC. Glial cell diversification in the rat optic nerve. Science
1989; 243: 1450-1455. 25. Radany EH, Bernner M, Besnard F, Bigornia V, Bishop JM. Directed est
ablishment of rat brain cell lines with the phenotypic characteristics o
f type 1 astrocytes. Proc Natl Acad Sci USA. 1992; 89: 6467-6471. 26. Ye H, Hernandez MR. Heterogeneity of astrocytes in human optic nerve
head. J Comp Neurol. 1995; 362: 441-452. 27. Hernandez MR, Pena JD, The optic nerve head changes in glaucomatous
optic neuropathy, Arch Oyhthalmol. 1997; 115: 389-395. 28. Muir D. Metalloproteinase-dependent neurite outgrowth within a synth
etic extracellular matrix is induced by nerve growth factor. Exp Cell Re
s. 1994; 210: 243-252. 29. Nordstrom LA, Lochner J, Yeung W, Ciment G. The metalloproteinase st
romelysin-1 (transin) mediates PC12 cell growth cone invasiveness throug
h basal laminae. Mol Cell Neurosci. 1995; 6: 56-68. 30. Schwartz M, Cohen A, Stein-Izsak C, Belkin M. Dichotomy of the glial
cell response to axonal injury and regeneration. FASEB J. 1989; 3: 2371
-2378. 31. Hernandez MR, Igoe F, Neufeld AH. Extracellular matrix of the human
optic nerve head. Am J Ophthalmol. 1986; 102: 139-148, 32. Rosenberg GA, Kornfeld M, Estrada E, Kelley RO, Liotta LA, Stetler-S
tevenson WG. TIMP-2 reduces proteolytic opening of blood-brain barrier b
y type IV collagenase. Brain Res. 1992; 576: 203-207. 33. Liu T, Clark RK, McDonnell PC, et al. Tmnor necrosis factor-α expre
ssion in ischemic neurons. Stroke. 1994; 25: 1481-1488. 34. Barone FC, Arvin B, White RF, et al. Tumor necrosis factor-α. A med
iator of focal ischemic brain injury. Stroke. 1997; 28; 1233-1244. 35. Hsu H, Xiong J, Goeddel DV. The TNF receptor 1-associated protein TR
ADD signals cell death and NF-kappa B activation. Cell. 1995; 81: 495-50
4. 36. Lin X, Kashima Y, Khan M, Heller KB, Gu X, Sadun AA, An immunohistoc
hemical study of TNF-α in optic nerves from AIDS patients. Curr Eye Res
. 1997; 16:1064-1068.
【００７８】 実施例２：ＴＮＦ−α阻害剤であるエンブレルおよびレミケードならびに他の
類似化合物の、緑内障の治療への使用の実施 死後の免疫組織化学：免疫組織化学実験では、ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−αレ
セプター−１（ｐ５５）に対する抗体を使用して、原発性開放隅角緑内障対象か
らの４つの死後の眼、正常眼圧緑内障対象からの７つの眼および年齢−合致正常
ドナーからの４つの眼の視神経乳頭を標識した。結果から、緑内障視神経乳頭で
のＴＮＦ−αおよびそのレセプター発現の増加が明らかとなった。試験によりＴ
ＮＦ−α免疫染色（図１）が視神経乳頭のグリア細胞でほぼ陽性であったにもか
かわらず、ＴＮＦ−αレセプター−１免疫染色（図２）は、緑内障の眼で増加す
る、視神経乳頭の篩板前領域に局在する神経束で、より顕著に陽性であった。こ
の結果は、神経組織がＴＮＦ−αの作用できる重要な標的であることを示してい
る。
【００７９】 視神経乳頭での結果と同様に、ＴＮＦ−αおよびそのレセプターの網膜免疫染
色（図３）は、年齢−合致正常ドナーと比べて、原発性開放隅角緑内障または正
常眼圧緑内障のいずれの緑内障の眼の網膜でも優れていた。
【００８０】 緑内障視神経乳頭および網膜で、ＴＮＦ−αおよびそのレセプターの発現が増
加することは、神経変性過程でこのサイトカインが役割を担っていることを立証
するものであり、緑内障を管理するための新規治療標的を提供する。
【００８１】 Ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験：網膜神経節細胞の細胞死の分子メカニズムを試験する
実験の一部として、共生−培養系を使用し、この共生−培養系では、精製された
ヒト網膜神経節細胞が、組織培養挿入物上で増殖させた網膜グリア細胞と共生−
培養されている（Ｔｅｚｅｌ Ｇ．Ｓｅｉｇｅｌ ＧＭ、Ｗａｘ ＭＢ．Ｄｅｎ
ｓｉｔｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ａｐｏｐｔｏｓ
ｉｓ ｉｎ ｒｅｔｉｎａｌ ｃｅｌｌｓ．Ｃｕｒｒ Ｅｙｅ Ｒｅｓ．１９９
９；１９：３７７〜３８８）。この共培養物は、ニューロン−グリア相互作用を
試験するのに適したモデルであり、神経細胞とグリア細胞の細胞生存を調べるた
めに分離できる。培養細胞を、緑内障における神経節細胞死を誘導する２つの主
要なメカニズムと考えられている、疑似虚血または流体静力学的高圧を含む、異
なるアポトーシス誘起刺激へ７２時間まで曝露した。
【００８２】 細胞死のアポトーシス成分を、末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ
−仲介性ｄＵＴＰ末端ラベル法（ＴＵＮＥＬ）技術ならびにカスパーゼ活性実験
により調査した。ストレス条件に曝露した後、ＴＵＮＥＬ陽性細胞の割合は、グ
リア細胞との共培養物中の網膜神経節細胞中で上昇した（図４）。さらに、ウェ
スタンブロット分析により、虚血または流体静力学的高圧に課した網膜神経節細
胞のアポトーシス過程においてカスパーゼ−８が活性化されることが明らかにな
った（図５）。
【００８３】 ウェスタンブロット分析から、グリア細胞中でＴＮＦ−αの発現が増加するこ
とも明らかになった。また、酵素結合抗体アッセイを実施して、調整培地中での
ＴＮＦ−αのレベルを測定した。調整培地中でのＴＮＦ−αのレベルは、正常条
件でインキュベートした共培養物よりも、ストレス条件下にインキュベートした
共培養物の方が高かった（図６）。
【００８４】 この結果は、疑似虚血または流体静力学的高圧に曝露したグリア細胞が、ＴＮ
Ｆ−αを含むアポトーシス促進物質の産生を高めることにより、網膜神経節細胞
に対して神経毒性作用を示すことを証明した。したがって、虚血および／または
高眼内圧等のストレス条件は、網膜（小グリア細胞）および篩板と称される強膜
の特殊構造（小グリア細胞および星状細胞）の両方で（網膜神経節細胞はこれら
を通過して、眼に視神経を形成する）、網膜神経節細胞繊維を包囲している星状
細胞および小グリア細胞のグリア「活性化」を起こす。
【００８５】 Ｉｎ ｖｉｖｏ試験：高眼圧緑内障のラットモデルも使用した（Ｓｈａｒｅｅ
ｆ ＳＲ、Ｇａｒｃｉａ−Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ Ｅ、Ｓａｌｉｅｒｎｏ Ａ、
Ｗａｌｓｈ Ｊ、Ｓｈａｒｍａ ＳＣ．Ｅｘｐ Ｅｙｅ Ｒｅｓ．１９９５；６
１：３７９〜３８２）。３つの上強膜血管の焼灼により、ラットの眼内圧を一方
的に上昇させた後、カスパーゼ−８の網膜での発現が増加した。ｉｎ ｖｉｔｒ
ｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方の実験でカスパーゼ−８が活性化するという結果
は、網膜神経節細胞アポトーシスへのＴＮＦ−αの関与をさらに立証するもので
ある。
【００８６】 実施例３：グリア細胞を疑似虚血または流体静力学的高圧に曝露することによ
るＴＮＦ−α産生の上昇が、共生−培養網膜神経節細胞のアポトーシスを誘導す
る （材料および方法） 網膜神経節細胞培養。網膜神経節細胞の最初の培養物は、近年記載されたもの
と類似のプロトコールを使用して得た、新生ラットの網膜由来のものである70。
全ての実験は、Ｕｓｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌｓ ｉｎ Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ
ａｎｄ Ｖｉｓｉｏｎ ＲｅｓｅａｒｃｈのＡＲＶＯ声明に従って実施され、Ｔ
ｈｅ Ａｎｉｍａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ Ｗａｓｈｉ
ｎｇｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙに是認された。５〜７日齢のＳＤラットを麻
酔し、その眼を摘出した。眼をＣＯ2−独立培地（Ｇｉｂｃｏ、Ｇｒａｎｄ Ｉ
ｓｌａｎｄ、ＮＹ）で洗浄し、網膜を顕微鏡下に機械的に解剖した。網膜細胞懸
濁液を製造するために、組織を、２０Ｕ／ｍｌ パパイン、１ｍＭ Ｌ−システ
イン、０．５ｍＭ ＥＤＴＡおよびＤＮａｓｅ（０．００５％）を含有するイー
グルの最小必須培地（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ、Ｌａｋｅｗｏｏｄ、ＮＪ）中で
３７℃で４０分、解離させた。次いで網膜を、イーグルの最小必須培地、オボム
コイド（０．２％）（ＵＳ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、Ｓｗａｍｐｓｃｏｔｔ、Ｍ
Ａ）、ＤＮＡａｓｅ（０．０４％）およびウシの胎児血清アルブミン（０．１％
）（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を含む阻害剤溶液で洗浄した。処理
期間の最終で、組織を１ｍｌのプラスチックピペットを通して破砕し、単一細胞
の懸濁液を得た。網膜細胞を４００ｇで１０分スピンし、ウシの胎児血清アルブ
ミン（０．０５％）を含むイーグルの最小必須培地に再懸濁し、その後の免疫磁
気選択による分離に使用する直前まで、組織培養インキュベーター中でインキュ
ベートした71,72。
【００８７】 網膜神経節細胞の免疫磁気選択を、直径が２．８±０．２ｕｍである、マウス
ＩｇＧ1に対するビオチニル化ラットモノクローナル抗体（Ｄｙｎａｌ、Ｏｓｌ
ｏ、Ｎｏｒｗａｙ）で被覆した磁気ポリスチレンビーズを用いて、２つのステッ
プから成る方法で実施した。最初のステップにおいて、０．１％ ウシ胎児血清
アルブミンを含むリン酸バッファー生理食塩水溶液で洗浄した後に、１×１０7
ビーズ／ｍｌをマクロファージ表面の抗原に対するモノクローナル抗体（１００
μｇ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ）へ添加した。ローター上で室温で３０分インキュベ
ートした後、特殊設計された磁石（Ｄｙｎａｌ）でビーズを洗浄した。被覆ビー
ズを、ゆっくり回転させながら、網膜細胞懸濁液といっしょに１５分インキュベ
ートし、次いで結合マクロファージを除去するために細胞懸濁液から被覆ビーズ
を除去した。第２ステップでは、新しい磁気ビーズを、Ｔｈｙ１．１に特異的な
モノクローナル抗体（ＩｇＧ1）（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、ＣＡ
）へ添加し、１００μｇ／ｍｌの終濃度を得た。室温での３０分のインキュベー
トと洗浄の後、被覆ビーズを、マクロファージ−不含網膜細胞懸濁液と１５分イ
ンキュベートした。モノクローナル抗体がストレプトアビジンおよびＤＮＡリン
カーを介してビーズと結合するので、ＤＮａｓｅ放出バッファー（５０Ｕ／ｕｌ
）を用いて３７℃で１５分インキュベートすることにより、結合細胞をビーズか
ら分離した。次いで細胞を、細胞外マトリックスで被覆した２４ウェルのプレー
ト（Ｆｉｓｈｅｒ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）上に、密度が４×１０4細胞
／ウェルとなるように播取し、グリア細胞と共生−培養した。培養物を、５％Ｃ
Ｏ2および９５％大気の湿潤雰囲気で、３７℃で、組織培養インキュベーターを
用いてインキュベートした。
【００８８】 網膜グリア細胞系を、前記した磁気選択法に従い、小グリア細胞および神経節
細胞不含の網膜細胞を用いて製造した。２または３回の補充循環により残留神経
細胞がなくなった後に、培養物は実質的に前記のグリア細胞を含有し73、これは
得られた部分に存在する星状細胞およびミュラーのグリア細胞と同じものである
。網膜グリア細胞を、組織培養挿入物（Ｆｉｓｈｅｒ）上に密度が３×１０4細
胞／ウェルとなるように播取し、網膜神経節細胞が播取されたウェル中に導入し
た。これらの挿入物は、１．６×１０6孔／ｃｍ2を有する０．４ｕｍ厚のポリエ
チレンテレフタレート膜であり、細胞の移動を阻害すると同時に分泌分子を輸送
できる。
【００８９】 血清−不含培地を、前記したようにＢ２７−補足Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ（商標
）（Ｇｉｂｃｏ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）を用いて製造した17,74。
培地はまた、ウシ胎児血清アルブミン（１００μｇ／ｍｌ）、プロゲステロン（
６０ｎｇ／ｍｌ）、インシュリン（５μｇ／ｍｌ）、ピルビン酸（１ｍＭ）、グ
ルタミン（１ｍＭ）、プトレサイン（１６μｇ／ｍｌ）、ナトリウムセレナイト
（４０ｎｇ／ｍｌ）、トランスフェリン（１００μｇ／ｍｌ）、トリヨード−チ
ロニン（３０ｎｇ／ｍｌ）、ＢＤＮＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＣＮＴＦ（２０ｎｇ
／ｍｌ）、ｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、フォルスコリン（５μＭ）、イノシン
（１００μＭ）および抗生物質を含有する75。全ての補助物質はＳｉｇｍａから
購入した。
【００９０】 網膜神経節細胞の逆行的標識。ケタミン（８０ｍｇ／ｋｇ）（Ｆｏｒｔ Ｄｏ
ｄｇｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｆｏｒｔ Ｄｏｄｇｅ、ＩＡ）およびキサ
ラジン１２ｍｇ／ｋｇ（Ｂｕｔｌｅｒ、Ｃｏｌｕｍｂｕｓ、ＯＨ）の混合物を腹
腔内投与して通常の麻酔を行い、定位的装置中でラットを固定し、前記した方法
によりＦｌｕｏｒｏ−Ｇｏｌｄ（Ｆｌｕｏｒｏｃｈｒｏｍｅ Ｉｎｃ．、Ｅｎｇ
ｌｅｗｏｏｄ、ＣＯ）（０．９％塩化ナトリウム中の５％Ｆｌｕｏｒｏ−Ｇｏｌ
ｄ溶液１．５μｌ）を上丘へ両側からミクロインジェクトした76。Ｆｌｕｏｒｏ
−Ｇｏｌｄ処理後１週間で、網膜を解剖し、分離した。網膜神経節細胞を、免疫
磁気法により選択した後、選択および非−選択細胞を、Ｆｌｕｏｒｏ−Ｇｏｌｄ
とＴｈｙ１．１で二重免疫標識して調査した。
【００９１】 フローサイトメトリー。網膜細胞を２％パラホルムアルデヒド溶液を用いて室
温で２０分固定した。細胞を遠心および再懸濁した後、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１０
０（リン酸平衡化生理食塩水溶液中０．４％）に３０分透過させた。洗浄した細
胞を、次に、Ｆｌｕｏｒｏ−Ｇｏｌｄ（Ｆｌｕｏｒｏｃｈｒｏｍｅ Ｉｎｃ．）
に対するウサギ抗体とＴｈｙ１．１に対するマウス抗体からなる混合物で、１；
１００の希釈で３０分インキュベートした。洗浄後、細胞を、ＦＩＴＣ−および
Ｃｙ３−結合第２抗体（Ｓｉｇｍａ）と３０分インキュベートした。細胞を洗浄
し、１０6細胞／ｍｌに再懸濁し、ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーター／ＣＥ
ＬＬＱｕｅｓｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉ
ｎｓｏｎ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を用いて計数した。
【００９２】 実験設計：神経突起の接触を示す網膜神経節細胞および成長すると大概集合す
るグリア細胞を、ストレス条件または正常条件下にインキュベートした。疑似虚
血の場合、グルコースを欠如させた培地中で、低下させた酸素圧に、細胞を曝露
した。９５％Ｎ2／５％ＣＯ2の制御した流れを有する公知の培養インキュベータ
ー中に培養物を設置することにより、低酸素状態を維持した。マノメーターを装
備した密閉加圧チャンバーを使用して、細胞を流体静力学的高圧に曝露した。圧
力を５０ｍｍＨｇに上昇させた。チャンバーを３７℃の一般的な組織培養インキ
ュベーター中に設置した。細胞応答の時間経過を調べるために、疑似虚血または
流体静力学的高圧を６、１２、２４、４８または７２時間維持した。細胞の同一
部分に由来するコントロール細胞を、９５％大気／５％ＣＯ2および３７℃で、
一般的な組織培養インキュベーター中で同時にインキュベートした。網膜神経節
細胞に有害な攻撃をしかけるグリア源を調査するために、単独で培養したグリア
細胞から調整培地を回収し、ストレス条件の存在または不在下に７２時間インキ
ュベートした。単独で培養した網膜神経節細胞を、グリア細胞の調整培地と一緒
に２４時間インキュベートした。
【００９３】 さらに、ＴＮＦ−αおよびＮＯの細胞生存に対する役割を調べるために、スト
レス条件でのインキュベーションを、特異的な阻害剤の存在または不在下に実施
した。中和抗体（ＡＦ５１０ＮＡ）を使用して、ＴＮＦ−α活性を阻害した（Ｒ
＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）。アクチノマイシ
ンＤの存在下での、Ｌ−９２９細胞系中の組換えラットＴＮＦ−αの生体活性を
中和するための抗体の活性は、組換えラットＴＮＦ−α０．０２５ｎｇ／ｍｌの
存在下で、中和量50が約０．３〜０．９ｕｇ／ｍｌであった。ＴＮＦ−αの中和
抗体活性は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ実験で、神経保護された77 -79 。さらに、選択的ｉＮＯＳ阻害剤である［Ｎ−（３−（アミノメチル）ベン
ジル）アセタミジン二塩酸塩］（１４００Ｗ）（Ａｌｅｘｉｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅ
ｇｏ、ＣＡ）を使用して、誘導性のＮＯ合成を阻害した80。それぞれＴＮＦ−α
およびｉＮＯＳを阻害する至適条件である、ＴＮＦ−αの中和抗体１０μｇ／ｍ
ｌおよびｉＮＯＳ阻害剤１４００Ｗ ２．５μＭを使用し、共培養物中で、濃度
−応答実験を基礎とした。インキュベーション時間修了時、細胞を直ちに以下の
実験に処し、これを各条件で少なくとも３回繰り返した。
【００９４】 細胞の生存率を、カルセインＡＭおよびエチジウムホモダイマーを含むＬｉｖ
ｅ／Ｄｅａｄ Ｋｉｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、Ｏ
Ｒ）で測定した81。カルセインＡＭは細胞−浸透性蛍光源エステラーゼ基質であ
る。キットは、生細胞中の細胞内エステラーゼ活性がカルセインＡＭを加水分解
して、緑色の蛍光物質カルセインを生じることを期待したものである。死細胞で
は、エチジウムが処理血漿および核膜を容易に通過してＤＮＡと結合し、赤い蛍
光を発する。蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）を用いて
、２００×倍率で、各ウェルの少なくとも１０の任意の場所で、細胞を計数した
（ウェルあたり〜１５０の神経節細胞）。細胞の生存率を、１００倍した細胞の
総数に対するエステラーゼ（＋）細胞の平均割合として表わした。
【００９５】 アポトーシスの形態学的分析。ｉｎ ｓｉｔｕでの細胞死検出キット（Ｂｏｅ
ｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使
用して、末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ−仲介性ｄＵＴＰ末端ラ
ベル（ＴＵＮＥＬ）技術により、アポトーシス細胞を同定した82。簡潔には、固
定、透過および遮断ステップの後、空気乾燥させた細胞を、蛍光標識ヌクレオチ
ドおよび末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼから成る混合物と、１時
間インキュベートした。末端デオキシクレオチドトランスフェラーゼは、ＤＮＡ
フラグメントの空いた３’−ＯＨ末端への、標識ヌクレオチドの重合を触媒する
。末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼの存在下に、蛍光標識ヌクレオ
チド混合物でインキュベートした細胞をネガティブコントロールとした。ＤＮＡ
鎖の分解を導くＤＮａｓｅＩ（１ｍｇ／ｍｌ）で予め処理した細胞をポジティブ
コントロールとした。ＴＵＮＥＬ陽性細胞を、蛍光顕微鏡下に３つのウェルで計
測し、アポトーシスの割合を、ウェル中の全細胞数から算出した。
【００９６】 ウェスタンブロッティング。リン酸平衡化生理食塩溶液で細胞を洗浄した後、
サンプルバッファー（１％ＳＤＳ、１００ｍＭ ｄＴＴ、６０ｍＭ Ｔｒｉｓ、
ｐＨ６．８、０．００１％ブロモフェノールブルー）中に溶解させた。タンパク
質濃度をＢＣＡ法（Ｓｉｇｍａ）で測定した。電気泳動を行う前に、サンプルを
５分沸騰させた。
【００９７】 １０〜１５％ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲルで、１６０Ｖで
、１時間電気泳動することにより、サンプルを分離し、セミ−ドライ移送系（Ｂ
ｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を用いて、ポリビニリデンフルオリド膜
（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｍａｒｌｂｏｒｏ、ＭＡ）へ電気泳動的に移送した。移
送後、膜を、５％の脱脂粉乳を含むバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、
１５４ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．５）で１時間、次
に、第１抗体とナトリウムアジドを希釈して含む同一のバッファーで一晩遮断し
た。第１抗体はＴＮＦ−αに対するモノクローナル抗体（Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔ
ｅｍｓ）、ＮＯＳのイソタイプ（神経ＮＯＳおよびｉＮＯＳ）（Ｔｒａｎｓｄｕ
ｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ、ＫＹ）またはカ
スパーゼ−８、あるいはカスパーゼ−３に対するポリクローナル抗体（Ｐｈａｒ
ｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）であり、１；１０００に希釈して使
用した。数回の洗浄後、２回目の遮断を２０分実施し、西洋わさびペルオキシダ
ーゼで結合した第２抗体の１：２０００の希釈物（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔ
ｉｆｉｃ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）で膜を１時間インキュベートした。免
疫反応バンドを、市販の試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ、
Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ、ＩＬ）を用いて化学蛍光を強化すること
により、視覚化した。
【００９８】 カスパーゼ活性のｉｎ ｓｉｔｕ活性。Ｐｈｉｐｈｉｌｕｘ−Ｇ6Ｄ2（Ａｌｅ
ｘｉｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）で染色した後に、カスパーゼ−３様の活性
を調査した。Ｐｈｉｐｈｉｌｕｘ−Ｇ6Ｄ2は細胞透過性で、ＤＥＶＤ−依存的方
法で分解されてローダミン分子を生じる蛍光源基質であり、生細胞中のカスパー
ゼ−３様の活性を検出するために使用できる83。染色のために、洗浄細胞を１０
μＭの基質溶液を用いて３７℃で２０分インキュベートした。ローダミン蛍光を
、蛍光顕微鏡下に視覚化した。
【００９９】 免疫細胞化学。細胞をリン酸−平衡化生理食塩水溶液中で洗浄し、４％のパラ
ホルムアルデヒド溶液を用いて室温で３０分固定した。洗浄後、氷上で、０．１
％のクエン酸ナトリウム溶液中の０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で４分透過
した。細胞を次に３％ウシ胎児血清アルブミンで３０分処理して、非特異的結合
部位を遮断した。３つのウェルを、ＴＮＦ−αに対するモノクローナル抗体（Ｒ
＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）またはＮＯＳのイソタイプ（神経ＮＯＳおよびｉＮ
ＯＳ）（Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて、３
７℃で２時間インキュベートした。サンプルを次いで洗浄し、Ｃｙ３と結合した
適当な第２抗体（Ｓｉｇｍａ）と一緒にインキュベートした。洗浄後、蛍光顕微
鏡を用いて調べた。
【０１００】 培養物の純度を試験するために、特異的な細胞マーカーを使用して細胞を二重
免疫標識した。二重免疫蛍光標識のためには、固定、透過および遮断ステップ後
に、培養物を、Ｔｈｙ１．１に対する２種類の抗体（１つはウサギ抗体、もう１
つはマウス抗体）、神経フィラメントタンパク質、グリア原繊維酸性タンパク質
、またはＳ−１００タンパク質（Ｓｉｇｍａ）から成る１：１００希釈の混合物
と一緒に３０分インキュベートした。洗浄後、Ｃｙ３およびＦＩＴＣ−結合第２
抗体（Ｓｉｇｍａ）から成る混合物と一緒に細胞を３０分インキュベートした。
ネガティブコントロールは、第１抗体を非−免疫血清で置換することにより、あ
るいは各第２抗体がそれに対する種類のものに特異的であることから、各第１抗
体を有する細胞を不適切な第２抗体とインキュベートすることにより、実施した
。培養物を蛍光顕微鏡で調べた。
【０１０１】 酵素結合抗体アッセイ（ＥＬＩＳＡ）。定量的なサンドイッチＥＬＩＳＡ技術
（Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）により調整培地中のＴＮＦ−αレベルを測定す
るキットを使用した。調整培地を、ラットＴＮＦ−αに特異的なモノクローナル
抗体で被覆したミクロウェル中でインキュベートした。洗浄後、ラットＴＮＦ−
αに特異的な西洋わさびペルオキシダーゼ−結合ポリクローナル抗体をウェルに
添加した。洗浄後、過酸化水素およびテトラメチルベンジジンを含有する基質溶
液を添加した。塩酸溶液を添加して酵素反応を停止させ、４５０ｎｍで吸収を測
定した。７倍希釈したラットＴＮＦ−αから求めた標準曲線を使用して、調整培
地中のＴＮＦ−α濃度を算出した。感度は５ｐｇ／ｍｌよりも低かった。
【０１０２】 着色アッセイ。調整培地中でのＮＯの分解産物を測定するために、着色アッセ
イキット（Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用した。このアッセイは、硝酸塩
レダクターゼにより硝酸塩を亜硝酸塩へ酵素変換することに基づいて、ＮＯを測
定した。グリース反応のアゾ染料産物としての亜硝酸塩の着色検出により、反応
を実施した。付加的なステップとして、色素形成前にラクテートデヒドロゲナー
ゼおよびピルビン酸を使用することにより、過剰のＮＡＤＰＨを酸化した、とい
うのもＮＯＳ酵素を機能させるための本質的な補助因子であるＮＡＤＰＨがグリ
ース試薬の化学的反応を妨害するからである。硝酸塩および亜硝酸塩の相対レベ
ルが、周囲条件および生体流の酸化還元状態に大きく左右されるので、全ＮＯ生
成を最も正確に測定するために、硝酸塩と亜硝酸塩の両方を測定した。吸収は５
４０ｎｍで読み取り、ＮＯの分解産物濃度を標準曲線を用いて算出した。亜硝酸
塩アッセイの感度は０．２２ｕｍｏｌ／Ｌを下回り、硝酸塩アッセイの感度は０
．５４ｕｍｏｌ／Ｌを下回った。
【０１０３】 （結果） 細胞の形体および生存率：網膜神経節細胞を、Ｆｌｕｏｒｏ−Ｇｏｌｄ逆行的
標識、形態学および細胞マーカーの発現に基づいて同定した。Ｆｌｕｏｒｏ−Ｇ
ｏｌｄによる逆行的標識および免疫磁気分離法を用いた網膜神経節細胞の選択の
後に、Ｆｌｕｏｒｏ−ＧｏｌｄおよびＴｈｙ１．１に対する抗体で細胞を免疫標
識した。フローサイトメトリーを用いると、Ｆｌｕｏｒｏ−ＧｏｌｄおよびＴｈ
ｙ１．１抗体による免疫標識は、細胞の９０％以上に同時に局在化し、細胞の９
５％以上がＴｈｙ１．１に陽性であった（図７ａ）。ソーティングで選択されな
かった細胞はＦｌｕｏｒｏ−ＧｏｌｄおよびＴｈｙ１．１の両方に陰性であった
（図１ｂ）。
【０１０４】 培養網膜神経節細胞は、１０〜２０μｍの直径を有する円形または楕円形の細
胞形体であり、前記したように、相の明瞭な外観、および均一な内径と可変の長
さを持つ分枝した軸索を有した（図７ｃ）17。さらに、培養網膜細胞の純度を特
異的なマーカーの免疫標識により調べた。網膜神経節細胞はＴｈｙ１．１および
神経繊維タンパク質に対して同様に陽性であるが、グリアマーカーに対しては陰
性であった。グリア細胞は、グリア原繊維酸性タンパク質で均質に標識され、Ｓ
−１００で選択的に標識されるが、神経マーカーでは標識されなかった（図７）
。
【０１０５】 ストレス条件下での共培養物のインキュベーション開始時に、網膜神経節細胞
およびグリア細胞の生細胞の割合は、それぞれ９６．６９±１．６％および９７
．８４±１．９％であった。疑似虚血または流体静力学的高圧下で７２時間イン
キュベートした後の網膜神経節細胞の細胞生存率は、それぞれ、６９．６９±２
．０％および７６．６４±１．９％に減少した。しかし、グリア細胞の生存率は
、疑似虚血または流体静力学的高圧下でインキュベートした後でも９６．２４±
２．１％であった。
【０１０６】 疑似虚血または流体静力学的高圧に曝露した共培養物中の網膜神経節細胞での
アポトーシスの誘導：７２時間まで疑似虚血または流体静力学的高圧下で共培養
物をインキュベートすると、網膜神経節細胞でアポトーシスが誘導された。アポ
トーシス細胞死の特異的形態変化には、細胞体の縮小および核の凝縮が含まれる
（図８ａ〜ｃ）。さらに、ＴＵＮＥＬ技術を用いてアポトーシス細胞死を試験し
た。アポトーシス網膜神経節細胞は、ＴＵＮＥＬ技術により、断片化核ＤＮＡの
顕著な標識を示した（図８ｄ〜ｆ）。しかし、ストレス条件下でインキュベート
した共培養物中のグリア細胞では、形態学的試験またはＴＵＮＥＬ技術を駆使し
てもアポトーシスの証拠は見つからなかった（図８ｇ〜ｌ）。
【０１０７】 ストレス条件下でインキュベートした共培養物の定量的試験はから、陽性ＴＵ
ＮＥＬの割合が、グリア細胞と共生−培養した網膜神経節細胞では、網膜神経節
細胞単独で培養した場合の約３倍であることが分かった。ストレス条件で７２時
間インキュベートすると、網膜神経節のさらに２０％がＴＵＮＥＬ陽性となった
。しかし、単独で培養した網膜神経節細胞では、陽性ＴＵＮＥＬの割合は７％を
下回った。ストレス条件下でのインキュベートにより、共培養物中の網膜神経節
細胞では時間依存的にアポトーシスが誘導された（図９ａ）。疑似虚血または流
体静力学的高圧に７２時間曝露した共培養物中の網膜神経節細胞では陽性ＴＵＮ
ＥＬの割合がそれぞれ２４．１０±６．０％および１９．９０±５．４％である
反面、正常条件でインキュベートしたコントロール培養物中の網膜神経節細胞で
は、細胞群の２％以下でしかアポトーシスが見られなかった（Ｍａｎｎ―Ｗｈｉ
ｔｎｅｙ Ｕ試験、それぞれｐ＝０．０１７、ｐ＝０．０２３）。しかし、スト
レス条件無しまたは有りでインキュベートしたグリア細胞では、陽性ＴＵＮＥＬ
の割合は実質的に存在しなかった（それぞれ０．９４±０．６％および１．１２
±１．０％）（いずれの条件でもｐ＞０．０５）。
【０１０８】 さらに、網膜神経節細胞への有害作用のグリア源を試験するために、受動移行
試験を実施した。この目的のために、疑似虚血または流体静力学的高圧の存在ま
たは不在下で７２時間インキュベートした後に、グリア細胞を単独で培養した調
整培地を回収した。単独で培養した網膜神経節細胞を、次に、グリア調整培地で
２４時間インキュベートした。ストレスをかけたグリア細胞の調整培地でインキ
ュベートした網膜神経節細胞の約１７％がＴＵＮＥＬに陽性であり、他方で、正
常条件下でインキュベートしたグリア細胞の調整培地と一緒にインキュベートし
た培養物では、網膜神経節細胞の２％以下が陽性ＴＵＮＥＬを示した（Ｍａｎｎ
−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ試験、疑似虚血および流体静力学的高圧、それぞれｐ＝０
．０４、ｐ＝０．２２）（図３ｂ）。
【０１０９】 網膜神経節細胞アポトーシスに伴うカスパーゼ活性：カスパーゼ活性を調べる
ために、網膜細胞の溶解液をウェスタンブロッティングに使用した。ウェスタン
ブロット分析では、共培養物を疑似虚血または流体静力学的高圧に曝露した後、
網膜神経節細胞内で、カスパーゼ−８およびカスパーゼ−３が切断されているこ
とが分かった。ストレス条件でインキュベートした網膜神経節細胞の溶解液を使
用したウェスタンブロットでは、カスパーゼ−８に相当する５５ｋＤの免疫反応
性バンドと、約３０ｋＤと２０ｋＤの切断産物が明らかになった。カスパーゼ−
３の存在は、３２ｋＤの前酵素カスパーゼの切断に由来する１７ｋＤのサブユニ
ットの確認により、評価された。ストレス条件下にインキュベートしたグリア細
胞の溶解液を使用してもカスパーゼ−８およびカスパーゼ−３の切断は検出され
なかった（図１０ａおよびｂ）。
【０１１０】 カスパーゼ活性のｉｎ ｓｉｔｕ試験を実施した：蛍光原基質であるＰｈｉｐ
ｈｉｌｕｘ−Ｇ６Ｄ２を使用して、疑似虚血または流体静力学的高圧に曝露した
網膜神経節細胞の生細胞中にカスパーゼ−３様活性を検出した（図１０ｃ〜ｈ）
。
【０１１１】 ストレス源への応答したグリア細胞によるＴＮＦ−αおよびＮＯ産生の増加：
グリア細胞によるＴＮＦ−αおよびＮＯＳの産生が網膜神経節細胞のアポトーシ
スの促進に直接的に関与する可能性を、ストレス条件に曝露した共培養物中で確
認した。細胞溶解液を使用したウェスタンブロット分析では、ＴＮＦ−αおよび
ｉＮＯＳの発現が、正常またはストレス条件のいずれで培養した網膜神経節細胞
でも検出されなかった。しかし、疑似虚血または流体静力学的高圧に曝露した共
培養物中のグリア細胞ではＴＮＦ−αおよびｉＮＯＳの発現が増加した（図１１
ａおよびｂ）。免疫細胞化学でも同様に、ストレス条件下でインキュベートした
共培養物中のグリア細胞でＴＮＦ−αおよびｉＮＯＳの発現が増加することが明
らかとなった（図１１ｃ〜ｈ）。
【０１１２】 共培養物の調整培地でのＴＮＦ−αおよびＮＯの最終生成物のレベルを測定し
た。ＥＬＩＳＡで測定した、疑似虚血または流体静力学的高圧に曝露した共培養
物の調整培地中のＴＮＦ−αレベルは、正常条件でインキュベートした共培養物
の約８倍であった（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ試験、ｐ＝０．００３）（図
６ａ）。着色アッセイによる測定では、調整培地中のＮＯ分解産物が、ストレス
条件に曝露した共培養物中で、正常条件でインキュベートした共培養物と比べて
、約７倍に増加した（ｐ＝０．００３）（図１２ｂ）。
【０１１３】 さらに、特異的阻害剤ＴＮＦ−αまたはｉＮＯＳの存在下にストレス条件で共
培養物をインキュベートする実験を実施した。この実験により、ＴＮＦ−αまた
はｉＮＯＳの阻害が、疑似虚血または流体静力学的高圧によって誘導された網膜
神経細胞のアポトーシス細胞死を減少し得ることが明らかになった。特異的中和
抗体（ＡＦ５１０ＮＡ、１０μｇ／ｍｌ）によるＴＮＦ−αの生物活性の阻害は
、疑似虚血下にインキュベートした共培養物中で陽性ＴＵＮＥＬの割合を２４％
から８％まで低下させ（６７％）、流体静力学的高圧下にインキュベートした共
培養物では２０％から５％まで低下させた（７５％）（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅ
ｙ Ｕ試験、ｐ＝０．０００２）。ｉＮＯＳの選択的阻害剤（１４００Ｗ）２．
５μＭを共培養物に処理すると、陽性ＴＵＮＥＬの割合が疑似虚血下にインキュ
ベートした共培養物で約５０％低下し、流体静力学的高圧下にインキュベートし
た共培養物で約３５％低下した（ｐ＝０．００３）（図１３）。ＴＮＦ−αに対
する中和抗体によるアポトーシスの阻害は、１４００Ｗよりも顕著であった（ｐ
＝０．００８）。
【０１１４】 （参考文献） 1. Hewett, S. J., Csernansky, CA. & Choi, D. W. Selective potentiation o
f NMDA-induced neuronal injury following induction of astrocytic iNOS. N
euron 13, 487-494 (1994). 2. Dugan, L. L., Bruno, V. M. G., Amagasu, S. M. & Giffard, R. G. Glia m
odulate the response of murine cortical neurons to excitotoxicity: glia
exacerbate AMPA neurotoxicity. J. Neurosei. 15, 4545-4555 (1995). 3. Ridet, J. L., Malhotra, S. K., Privat, A. & Gage, F. H. Reactive astr
ocytes: cellular and molecular cues to biological function. Trends Neuro
sci. 20, 570-577 (1997). 4. Viviani, B., Corsini, E., Galli, C. L. & Marinovich, M. Glia increase
degeneration of hippocampal neurons through release of tumor necrosis f
actor-α. Toxicol. App. Pharmacol. 150, 271-276 (1998). 5. Vandenberghe, W., Bosch, L. V. D. & Robberecht, W. Glial cells, poten
tiate kainate-induced neuronal death in a motoneuron-enriched spinal coc
ulture system. Brain Res. 807, 1-10 (1998). 6. Raivich, G. et al. Neuroglial activation in the injured brain: graded
response, molecular mechanisms and cues to physiological function. Brai
n Res. Review 30, 77-105 (1999). 7. Hernandez, M. R. & Pena, J. D. The optic nerve head in glaucomatous o
ptic neuropathy. Arch. Ophthalmol. 115, 389-395 (1997). 8. Quigley, H. A. et aL Retinal ganglion cell death in experimental glau
coma and after axotomy occurs by apoptosis. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci
. 36, 774-786 (1995). 9. Neufeld, A. H., Hernandez, M. R. & Gonzalez, M. Nitric oxide synthase
in the human glaucomatous optic nerve head. Arch. Ophthalmol. 115, 497-
503 (1997). 10. Yan, X., Tezel, G., Edward, D. P. & Wax, M. B. Matrix metalloprotein
ases and tumor necrosis factor-α in glaucomatous optic nerve head. Arch
. Ophthalmol. (2000) In press. 11. de Kozak, Y., Cotinet, A., Goureau, O., Hicks, D. & Thillaye-Goldenb
erg, B. Tumor necrosis factor and nitric oxide production by resident re
tinal glial cells from rats presenting hereditary retinal degeneration.
Ocul. Immunol. Inflamm. 5, 85-94 (1997). 12. Cotinet, A., Goureau, O., Hicks, D., Thillaye-Goldenberg, B. & de Ko
zak, Y. Tumor necrosis factor and nitric oxide production by retinal Mul
ler glial cells from rats exhibiting inherited retinal dystrophy. Glia 2
0, 59-69 (1997). 13. Goureau 0., Regnier-Ricard, F. & Courtois, Y. Requirement for nitric
oxide in retinal neuronal cell death induced by activated Muller glial
cells. J. Neurochem. 72, 2506-2515 (1999). 14, Hitchings, R.A. & Spaeth. G. L. Fluorescein angiography in chronic s
imple and low-tension glaucoma. By. J Ophthalmol. 61, 126-132 (1977). 15. Drance, S. M., Shulzer, M., Douglas, G. R. & Sweeney, V. P. Use of d
iscriminant analysis. Identification of persons with glaucomatous visual
field defects. Arch. Ophthalmol. 96, 57-73 (1978). 16. Hart, W. M. N., Yablonski, M., Kass, M. A. & Becker, B. Multivariate
analysis of the risk of glaucomatous visual field loss. Arch. Ophthalmo
l. 97, 1455-1458 (1979). 17. Barres, B. A., Silverstein, B. E., Corey, D. P. & Chun, L. L. Y. Imm
unological, morphological and electrophysiological variation among retin
al ganglion cells purified by panning. Neuron 1, 791-803 (1988). 18. Kitano, S., Morgan, J. & Caprioli, J. Hypoxic and excitotoxic damage
to cultured rat retinal ganglion cells. Exp. Eye Res. 63, 105-112 (1996
). 19. Hayreh, S. S. Inter-individual variation in blood supply of the opti
c nerve head. Its importance in various ischemic disorders of the optic
nerve head, and glaucoma, low-tension glaucoma and allied disorders. Doc
. Ophthalmol. 59, 217-46 (1985). 20. Anderson, D. R. & Hendrickson, A. Effect of intraocular pressure on
rapid axoplasmic transport in monkey optic nerve. Invest. Ophthalmol. Vi
s. Sci. 13, 771-783 (1974). 21. Minckler, D. S., Tso, M. O. & Zimmerman, L. E. A light microscopic,
autoradio graphic study of axoplasmic transport in the optic nerve head
during ocular hypotony, increased intraocular pressure, and papilledema.
Am. J. Ophthalmol. 82, 741-757 (1976). 22, Quigley, H. A. & Addicks, E. M. Chronic experimental glaucoma in pri
mates. II. Effect of extended intraocular pressure elevation on optic ne
rve head and axonal transport. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 19, 137-152
(1980). 23. Pease, M. E., McKinnon, S. J., Quigley, H. A., Kerrigan-Baumrind, L.
A. & Zack, D. J. Obstructed axonal transport of BDNF and its receptor Tr
kB in experimental glaucoma. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 41, 764-774 (
2000). 24. Flammer, J. The vascular concept of glaucoma. Surv. Ophthalmol. 38 (
Suppl), S3-S6 (1994). 25. Yamamoto, T. & Kitazawa, Y. Vascular pathogenesis of normal-tension
glaucoma: a possible pathogenetic factor, other than intraocular pressur
e, of glaucomatous optic neuropathy. Prog. Retin. Eye Res. 17, 127-43 (1
998). 26. Chung, H. S. et al. Vascular aspects in the pathophysiology of glauc
omatous optic neuropathy. Surv. Ophthalmol. 43, Suppl 1: S43-50 (1999),
27. Takano, K.J., Takano, T., Yamanouchi, Y. & Satau, T. Pressure-induce
d apoptosis in human lymphoblasts. Exp. CelI Res. 235, 155-160 (1997). 28. Takahashi, K. et al. Hydrostatic pressure induces expression of inte
rleukin 6 and tumor necrosis factor α mRNA in a chondrocyte-like cell l
ine. Ann Rheum. Dis. 57, 231-236 (1998). 29. Wax, M. B., Tezel, G., Kobayashi, S. & Hernandez, M. R. Responses of
different cell lines from ocular tissues to elevated hydrostatic pressu
re. Br. J. Ophthalmol. 84, 423-428 (2000). 30, Liu, T. et al. Tumor necrosis factor-α expression in ischemic neuro
ns. Stroke 25, 1481-1488 (1994). 31. Barone, F. C. et al. Tumor necrosis factor-α. A mediator of focal i
schemic brain injury. Stroke 28, 1233-1244 (1997). 32. Semenzato, G. Tumor necrosis factor: a cytokin with multiple biologi
cal activity. Br. J. Cancer 61, 354-361 (1990). 33. Brenner, T., Yamin, A., Abramsky, 0. & Gallily, R. Stimulation of tu
mor necrosis factor-alpha production by mycoplasma and inhibition by dex
amethasone in cultured astrocytes. Brain Res. 608, 273-279 (1993). 34. Lieberman A. P., Pitha, P. M., Shin, H. S. & Shin, M. L. Production
of tumor necrosis factor and other cytokines by astrocytes stimulated wi
th lipopolysaccharide or a neurotropic virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA
86, 6348-6352 (1989). 35. Meda, L. et al. Activation of microglial cells by β-amyoid protein
and interferon-γ. Nature 374, 647-650 (1995). 36. de Vos, A. F., Klaren, V. N. & Kijlstra, A. Expression of multiple c
ytokines and IL-1RA in the uvea and retina during endotoxin-induced uvei
tis in the rat. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 35, 3873-3883 (1994). 37. Planck, S. R., Huang, X. N., Robertson, J. E. & Rosenbaum, J. T. Cyt
okine mRNA levels in rat ocular tissues after systemic endotoxin treatme
nt. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 35, 924-930 (1994). 38. Drescher, K. M. & Whittum-Hudson, J. A. Modulation of immune-associa
ted surface markers and cytokine production by murine retinal glial cell
s. J. Neuroimmunol. 64, 71-81 (1996). 39. McGeer, P. L. et al, Microglia in degenerative neurological disease.
Glia 7, 84-92 (1993). 40. Rothwell, N. J. & Hopkins, S. J. Cytokines and the nervous system II
: actions and mechanisms of action. Trends Neurosci. 18, 130-136 (1995). 41. Martin-Villalba, A. et al. CD95 ligand (Fas-L/APO-lL) and tumor necr
osis factor-related apoptosis-inducing ligand mediate ischemia-induced a
poptosis in neurons. J Neurosci. 19, 3809-3817 (1999). 42. Ertel, W. et al. Release of anti-inflammatory mediators after mechan
ical trauma correlates with severity of injury and clinical outocme. J.
Trauma 39, 879-885 (1995). 43. Shohami, E., Bass, R., Wallach, D., Yamin, A. & Gallily, R. Inhibiti
on of tumor necrosis alpha (TNF-α) activity in rat brain is associated
with cerebroprotection after closed head injury. J. Cereb. Blood Flow Me
tab. 16, 378-384 (1996). 44. Lin, X. et al. An immunohistochemical study of TNF-α in optic nerve
s from AIDS patients. Curr. Eye Res, 16, 1064-1068 (1997). 45. Madigan, M. C. et al. Tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) induced o
ptic neuropathy in rabbits. Neurol. Res. 18, 176-184 (1996). 46. Hsu, H., Xiong, J. & Goeddel, D. V. The TNF receptor l-associated pr
otein TRADD signals cell death and NF-kappa B activation. Cell 81, 495-5
04 (1995). 47. Dawson, V. L., Brahmbhatt, H. P., Mong, J. A. & Dawson, T. M. Expres
sion of inducible nitric oxide synthase causes delayed neurotoxicity in
primary mixed neuronal-glial cortical cultures. Neuropharmocology 33, 14
25-1430 (1994). 48. Bredt, D. S. & Snyder, S. H. Nitric oxide: a physiologic messenger m
olecule. Annu. Rev. Biochem. 63, 175-195 (1994). 49. ladecola, C., Zhang, F. & Xu, X. Inhibition of inducible nitric oxid
e synthase ameliorates cerebral ischemic damage. Am. J. Physiol. 268, R2
86-R292 (1995). 50. Liu, J., Zhao, M.-L., Brosnan, C. F. & Lee, S. C. Expression of type
II nitric oxide synthase in primary human astrocytes and microglia: rol
e of IL-1 and IL-1 receptor antagonist. J. Immunol. 157, 3569-3576 (1996
). 51. Park, C. S., Pardhasaradhi, K., Gianotti, C., Villegas, E. & Krishna
, G. Human retina expresses both constitutive and inducible isoforms of
nitric oxide synthase mRNA. Biochem. Biophys. Res. Commun. 205, 85-91 (1
994). 52. Perez, M. T., Larsson, B., Alm, P., Anderson, K. E. & Ehinger, B. Lo
calization of neuronal nitric oxide synthase-immunoreactivity in rat and
rabbit retinas. Exp. Brain Res. 104, 207-217 (1995). 53. Shin, D. H. et al. In situ localization of neuronal nitric oxide syn
thase (nNOS) mRNA in the rat retina. Neurosci. Lett. 270, 53-55 (1999). 54. Kim, I.B. et al. Immunocytochiemical localization of nitric oxide sy
nthase in the mammalian retina. Neurosci. Lett. 267, 193-196 (1999). 55. Goureau, O., Hicks, D., Courtois, Y. & De Kozak, Y. Induction and re
gulation of nitric oxidesynthase in retinal Muller glial cells. J. Neuro
chem. 63, 310-317 (1994). 56. Roth, S. Role of nitric oxide in retinal cell death. Clin. Neurosei.
4, 216-223 (1997). 57. Koeberle, P. D. & Ball, A. K. Nitric oxide synthase inhibition delay
s axonal degeneration and promotes the survival of axotomized retinal ga
nglion cells. Exp. Neurol. 158, 366-381 (1999). 58. Kashii, S. et al. Dual actions of nitric oxide in N-methyl-D-asparta
te-mediated neuxotoxicity in cultured retinal neurons. Brain Res. 711, 9
3-101 (1996). 59. Morgan. J., Caprioli, J. & Koseki, Y. Nitric oxide mediates excitoto
xic and anoxic damage in rat retinal ganglion cells cocultured with astr
oglia. Arch. Ophthalmol. 117, 1524-1529 (1999). 60. Lam, T, & Tso, M, Nitric oxide synthase (NOS) inhibitors ameliorate
retinal damage induced by ischemia in rats. Res. Commun. Mol. Pathol. Ph
armol. 92, 329-340 (1996). 61. Shareef, S., Sawada, A. & Neufeld, A. H. Isoforms of nitric oxide sy
nthase in the optic nerves of rat eyes with chronic moderately elevated
intraocular pressure. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 40, 2884-2891 (1999)
. 62. Neufeld, A. H., Sawada, S. & Becker, B. Inhibition of nitric oxide s
ynthase-2 by aminoguanidine provides neuroprotection of retinal ganglion
cells in a rat model of glaucoma. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 9944-9
948 (1999). 63. Shafer, R. A. & Murphy, S. Activated astrocytes induce nitric oxide
synthase-2 in cerebral endothelium via tumor necrosis factor alpha. Glia
21, 370-379 (1997). 64. Goureau, O., Amiot, F., Dautry, F. & Courtois, Y. Control of nitric
oxide production by endogenous TNF-alpha in mouse retinal pigmented epit
helial and Muller glial cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 240, 132-1
35 (1997). 65. Heneka, M. T. et al. Induction of nitric oxide synthase and nitric o
xide-mediated apoptosis in neuronal PC12 cells after stimulation with tu
mor necrosis factor-alpha/lipopolysaccharide. J. Neurochem. 71, 88-94 (1
998). 66. Perkins, D. J. et al. Reduction of NOS2 overexpression in rheumatoid
arthritis patients with anti-tumor necrosis factor a monoclonal antibod
y (cA2). Arthritis Rheum. 41, 2205-2210 (1998). 67. Sartani, G. et al. Anti-tumor necrosis factor alpha therapy suppress
es the induction of experimental autoimmune uveoretinitis in mice by inh
ibiting antigen priming. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 37, 2211-2218 (19
96). 68. Dick, A. D. et al. Inhibition of tumor necrosis factor activity mini
mizes target organ damage in experimental autoimmune uveoretinitis despi
te quantitatively normal activated T cell traffic to the retina. Eur. J.
Immunol. 26, 1018-1025 (1996). 69. Wray, G. M., Millar, C. G., Hinds, C. J. & Thiemermann, C. Selective
inhibition of the activity of inducible nitric oxide synthase prevents
the circulatory failure, but not the organ injury/dysfunction caused by
entotoxin. Shcok 9, 329-335 (1998). 70. Tezel, G., Seigel, G. M. & Wax, M. B. Density-dependent resistance t
o apoptosis in retinal cells. Curr. Eye Res. 19, 377-388 (1999). 71. Metzger, D. W., Metzger, C. A., Ling, L. A., Hurst, J. S. & van Clea
ve, V. H. Preparative isolation of murine CD5 B cells by panning and mag
netic beads. Ann. NY Acad. Sci. 651, 75-77 (1992). 72. Wright, A. P., Fitzgerald, J. J. & Colello, R. J. Rapid purification
of glial cells using immunomagnetic separation. J. Neurosci. Methods 74
, 37-44 (1997). 73. Aotaki-Keen, A. E., Harvey, A. K., de Juan, E. & Hjelmeland, L. M. P
rimary culture of human retinal glia. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 32,
1733-1738 (1991). 74. Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K. & Price, P. J. Optimi
zed survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a ne
w serum-free medium combination. J. Neurosci. Res. 35, 567-576 (1993). 75. Jo, S. A., Wang, E. & Benowitz, L. I. Ciliary neurotrophic factor is
an axogenesis factor for retinal ganglion cells. Neuroscience 89, 579-5
91 (1999). 76. Selles-Navarro, I., Villegas-Perez, M. P., Salvador-Silva, M., Ruiz-
Gomez, J. M. & Vidal-Sanz, M. Retinal ganglion cell death after differen
t transient periods of pressure-induced ischemia and survival intervals.
Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 37, 2002-2014. (1996). 77. Barone, F. C. et aL Tumor Necrosis Factor-α. A Mediator of Focal Is
chemic Brain Injury. Stroke 28, 1233-1244 (1997). 78. Lavine, S. D., Hofman, F. M. & Zlokovic, B. V. Circulating antibody
against tumor necrosis factor-alpha protects rat brain from reperfusion
injury. J. Cereb. Blood Flow Metab. 18, 52-58 (1998). 79. Downen, M., Amaral, T. D., Hua, L. L., Zhao, M.-L. & Lee, S. C. Neur
onal death in cytokine-activated primary human brain cell culture: role
of tumor necrosis factor-α. Glia 28, 114-127 (1999). 80. Garvey, E. P. et al. 1400W is a slow tight binding and highly select
ive inhibitor of inducible nitric-oxide synthase in Vitro and in Vivo. J
. Biol. Chem. 272, 4959-4963 (1997). 81. Haugland, R. P. & Larison, K. D. Handbook of fluorescent probes and
research chemicals. 5th ed. Eugene, Ore: Molecular Probes, 172-180 (1994
). 82. Gavrieli, Y., Sherman, Y. & Ben-Sasson, S. A. Identification of prog
rammed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmenta
tion. J. Cell Biol. 119, 493-501 (1992). 83. Finucane, D. M., Bossy-Wetzel, E., Waterhouse, N. J., Cotter, T. G.
& Green, D. R. Bax-induced caspase activation and apoptosis via cytochro
me c release from mitochondria is inhibitable by Bcl-xL. J. Biol. Chem.
274, 2225-2233 (1999).
【図面の簡単な説明】
【図１】 ヒト視神経乳頭のＴＮＦ−αのイムノペルオキシド染色を示す図である。コン
トロールの視神経乳頭（Ａ）の前板状領域における神経束および血管（ｖ）周囲
の僅かなグリア細胞はぼんやりとしか免疫染色されなかった。しかし、原発性開
放隅角緑内障（Ｂ）または正常眼圧緑内障（Ｃ）を患う対象由来の視神経乳頭中
では、免疫染色の強度はより強く、染色グリア細胞数はより多い（ｇｃ、グリア
柱；ｎｂ、神経束；ｃｓ、空洞）（Ｃｈｒｏｍａｇｅｎ、ＤＡＢ；メイヤーのヘ
マトキシリンによる核対比染色、倍率Ｘ１００）。
【図２】 ヒト視神経乳頭中のＴＮＦ−αレセプター１のイムノペルオキシダーゼ染色を
示す図である。コントロールの視神経乳頭（Ａ）のＴＮＦ−αレセプター−１で
は、視神経乳頭の前板状領域の染色はあいまいであった。免疫染色されたのはほ
とんど血管周囲であった（ｖ）。原発性開放隅角緑内障（Ｂ）または正常眼圧緑
内障（Ｃ）を患う対象由来の視神経乳頭中では、免疫染色の強度はより強く、染
色グリア細胞数はより多い。前板状領域における神経束もある程度免疫染色され
た（ｇｃ、グリア柱；ｎｂ、神経束）（Ｃｈｒｏｍａｇｅｎ、ＤＡＢ；メイヤー
のヘマトキシリンによる核対比染色、倍率Ｘ１００）。
【図３】 正常眼圧緑内障の眼の網膜中のＴＮＦ−αレセプター−１のイムノペルオキシ
ダーゼ染色を示す図である。矢印は、ＴＮＦ−αレセプター−１の顕著な免疫染
色を示す２つの網膜神経節細胞を示す（ｇｃ、神経節細胞層；ｉｎ、内顆粒層、
ｏｎ、外顆粒層）（Ｃｈｒｏｍａｇｅｎ、ＤＡＢ；メイヤーのヘマトキシリンに
よる核対比染色、元の倍率Ｘ２５０）。
【図４】 共培養物をストレス条件に曝露した後、網膜神経節細胞中でアポトーシスの割
合が時間依存的に増加することを示す図である。
【図５】 共培養物である網膜神経節細胞とグリア細胞におけるカスパーゼ−８の活性化
を、ウェスタンブロット分析を用いて行った実験を示す図である。ウェスタンブ
ロットにより、ストレス条件に曝露後、網膜神経節細胞で、カスパーゼ−８に相
当する５５ｋＤの免疫反応バンドが約３０ｋＤと２０ｋＤの生成物に切断される
ことが分かった。カラム１、正常条件でインキュベートした網膜神経節細胞；カ
ラム２、疑似虚血下でインキュベートした網膜神経節細胞；カラム３、高圧下で
インキュベートした網膜神経節細胞；カラム４、正常条件でインキュベートした
グリア細胞；カラム５、疑似虚血下でインキュベートしたグリア細胞；カラム６
、高圧下でインキュベートしたグリア細胞。
【図６】 共培養物をストレス条件に曝露した後、調整培地中でのＴＮＦ−αの時間依存
的増加を示す図である。
【図７】 培養した網膜細胞を示す図である。Ｆｌｕｏｒｏ−Ｇｏｌｄで逆行的に標識し
、免疫磁気分離法により免疫神経節細胞を選択し、選択された細胞をＦｌｕｏｒ
ｏ−ＧｏｌｄおよびＴｈｙ−１．１に対する抗体を用いて免疫標識し、フローサ
イトメトリーで調査した。（ａ）Ｆｌｕｏｒｏ−Ｇｏｌｄ（ＦＬ１−Ｈ）および
Ｔｈｙ１．１（ＦＬ３−Ｈ）抗体を用いた免疫標識は、細胞の９０％以上が同様
に局在化し、同時に細胞の９５％以上がＴｈｙ１．１に陽性であった。（ｂ）非
選択細胞はＦｌｕｏｒｏ−Ｇｏｌｄ（ＦＬ１−Ｈ）およびＴｈｙ１．１（ＦＬ３
−Ｈ）の両方に陰性であった。培養網膜神経節細胞は、直径１０〜２０μｍを有
する円形または楕円形の細胞形であり、相の明瞭な外観、および均一な内径と可
変の長さを持つ分枝した神経炎（neuritis）を有した。（ｃ）新生ラット網膜由
来の網膜神経節細胞である。（ｄ）神経フィラメントタンパクを標識した後の、
パネル（ｃ）で示した網膜神経節細胞の蛍光顕微鏡イメージである。（ｅ）Ｔｈ
ｙ１．１で標識した後の、パネル（ｃ）で示した網膜神経節細胞の蛍光顕微鏡イ
メージである。（ｆ）新生ラット網膜由来のグリア細胞。（ｇ）グリア原繊維酸
性タンパクを標識した後の、パネル（ｉ）で示した網膜グリア細胞の蛍光顕微鏡
イメージである。（ｈ）Ｓ−１００で標識した後の、パネル（ｉ）で示した網膜
グリア細胞の蛍光顕微鏡イメージである。倍率バー；ｃからｅ、２０μｍ；ｆか
らｈ、６０μｍ。
【図８】 共培養物である網膜神経節細胞とグリア細胞中でのアポトーシス細胞死の形態
分析を示す図である。正常条件下（ａ）、疑似虚血下（ｂ）、または流体静力学
的高圧下（ｃ）で７２時間インキュベートした網膜神経節細胞の位相差顕微鏡イ
メージである。パネル（ｄ）、（ｅ）および（ｆ）のＴＵＮＥＬの蛍光顕微鏡イ
メージは、それぞれパネル（ａ）、（ｂ）および（ｃ）で示した網膜神経節細胞
に相当する。正常条件下（ｇ）、疑似虚血下（ｈ）、または流体静力学的高圧下
（ｉ）で７２時間インキュベートしたグリア細胞の位相差顕微鏡イメージである
。パネル（ｊ）、（ｋ）および（ｌ）のＴＵＮＥＬの蛍光顕微鏡イメージは、そ
れぞれパネル（ｇ）、（ｈ）および（ｉ）で示したグリア細胞に相当する。スト
レス条件下での共培養物のインキュベーションの後、網膜神経節細胞ではアポト
ーシスが誘導されるが、グリア細胞ではアポトーシスが見られない。
【図９】 （ａ）疑似虚血または流体静力学的高圧下でインキュベートした共培養物中の
網膜神経節細胞の陽性ＴＵＮＥＬの定量的分析を示す図である。（ｂ）受動移行
試験での網膜神経節細胞の陽性ＴＵＮＥＬの定量的分析を示す図である。グリア
細胞のみの調整培地を回収し、疑似虚血の実在または不在下にあるいは流体静力
学的高圧下に７２時間インキュベートした。単独で培養した網膜神経節細胞を次
にグリア細胞用調整培地で２４時間インキュベートした。
【図１０】 疑似虚血または流体静力学的高圧下にインキュベートした共培養物中のカスパ
ーゼ活性を調査した図である。（ａ）共培養物中でのカスパーゼ−８の発現に関
するウェスタンブロット分析である。（ｂ）カスパーゼ−３発現共培養物のウェ
スタンブロット分析である。カラム１、コントロールの網膜神経節細胞；カラム
２、疑似虚血下に７２時間インキュベートした網膜神経節細胞；カラム３、流体
静力学的高圧下に７２時間インキュベートした網膜神経節細胞、カラム４、コン
トロールのグリア細胞；カラム５、疑似虚血下に７２時間インキュベートしたグ
リア細胞；カラム６、流体静力学的高圧下に７２時間インキュベートしたグリア
細胞。ウェスタンブロットにより、カスパーゼ−８に相当する５５ｋＤの免疫活
性バンドがストレス条件下でインキュベートした網膜神経節細胞で、３０ｋＤと
２０ｋＤの生成物に切断されることが分かった。さらに、網膜神経節細胞におい
て、３２ｋＤの前−酵素カスパーゼ−３が、１７ｋＤの活性サブユニットに切断
された。グリア細胞の抽出物を用いた場合には、カスパーゼ−８またはカスパー
ゼ−３の切断は検出されなかった。カスパーゼ活性を、Ｐｈｉｐｈｉｌｕｘ−Ｇ6 Ｄ2を用いてｉｎ Ｓｉｔｕでも調査した（ｃ）。正常条件（ｄ）、疑似虚血（
ｅ）または流体静力学的高圧（ｆ）下で７２時間インキュベートした網膜神経節
細胞である。パネル（ｆ）、（ｇ）および（ｈ）の蛍光顕微鏡イメージは、それ
ぞれパネル（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）で示した網膜神経節細胞の位相差顕微鏡
イメージに相当する。ローダミンの蛍光（赤）は、ストレス条件下でインキュベ
ートした網膜神経節細胞でのカスパーゼ−３−様活性を示す。
【図１１】 疑似虚血または流体静力学的高圧下でインキュベートした共培養物中でのＴＮ
Ｆ−αおよびｉＮＯＳの発現を調査した図である。ウェスタンブロット分析（ａ
およびｂ）および免疫細胞化学（ｃからｈ）のいずれも、ストレス条件下でイン
キュベートした共培養物中で、グリア細胞ではＴＮＦ−αおよびｉＮＯＳの発現
が増加しているのに対して網膜神経節細胞では増加していないことを明らかにし
た。（ａ）ＴＮＦ−α発現のウェスタンブロット分析である。（ｂ）ｉＮＯＳ発
現のウェスタンブロット分析である。カラム１、コントロールの網膜神経節細胞
；カラム２、疑似虚血下に７２時間インキュベートした網膜神経節細胞；カラム
３、流体静力学的高圧下に７２時間インキュベートした網膜神経節細胞；カラム
４、コントロールのグリア細胞；カラム５、疑似虚血下に７２時間インキュベー
トしたグリア細胞；カラム６、流体静力学的高圧下に７２時間インキュベートし
たグリア細胞。正常条件下（ｃ）、疑似虚血下で７２時間（ｄ）または流体静力
学的高圧下で７２時間（ｅ）インキュベートしたグリア細胞中でのＴＮＦ−αの
発現。正常条件下（ｆ）、疑似虚血下で７２時間（ｇ）または流体静力学的高圧
下で７２時間（ｈ）インキュベートしたグリア細胞中でのｉＮＯＳの発現。
【図１２】 ストレス条件下でインキュベートした共培養物の調整培地中でのＴＮＦ−αお
よびＮＯの最終生成物の測定を示す図である。（ａ）ＥＬＩＳＡで測定した調整
培地中でのＴＮＦ−αの力価。（ｂ）比色アッセイで測定した調整培地中でのＮ
Ｏ最終生成物の力価。
【図１３】 ＴＮＦ−αまたはｉＮＯＳに特異的な阻害剤の存在下に、ストレス条件でイン
キュベートした共培養物中の網膜神経節細胞アポトーシスの阻害を示す図である
。ＴＮＦ−αの活性を特異的抗体（１０μｇ／ｍｌ）で中和し、ｉＮＯＳを選択
的阻害剤１４００Ｗ（２．５μＭ）で阻害した。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 31/454 Ａ６１Ｋ 31/454 31/496 31/496 31/522 31/522 31/573 31/573 31/635 31/635 35/78 35/78 Ｃ 38/00 39/395 Ｄ 39/395 Ｎ Ｖ Ａ６１Ｐ 27/06 Ａ６１Ｐ 27/06 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4C084 AA02 DA11 DC50 MA28 MA52 MA55 MA56 MA58 MA63 MA66 NA10 NA14 ZA331 ZC201 4C085 AA14 BB31 CC23 CC40 4C086 AA01 AA02 BB02 BC07 BC17 BC22 BC50 DA10 GA04 GA07 GA08 GA12 MA01 MA04 MA52 MA55 MA56 MA58 MA63 MA65 MA66 NA10 NA14 ZA33 ZB21 4C088 AB12 AB18 AB38 AB40 AB60 AB80 AB81 MA07 MA28 MA52 MA55 MA56 MA58 MA63 MA65 MA66 NA10 NA14 ZA33 ZB21 ZC20 4C206 AA01 FA44 FA59 MA48 MA72 MA75 MA76 MA78 MA83 MA85 MA86 NA10 NA14 ZA33 ZB21

Claims (17)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 緑内障を患う対象の治療法であって、ＴＮＦ−αの細胞から
    の放出、合成、または産生を拮抗、阻害、不活性化、低下、抑制、拮抗、および
    ／または制限する薬剤または分子を含有する化合物または組成物を投与し、それ
    によって緑内障の対象を治療するステップを含むことを特徴とする上記方法。
  2. 【請求項２】 化合物または組成物がＴＮＦ−αのレベルまたは産生を抑制
    する請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】 分子が組換えＴＮＦ−α可溶性レセプターである請求項１記
    載の方法。
  4. 【請求項４】 分子がエタネルセプトである請求項３記載の方法。
  5. 【請求項５】 化合物または組成物がＴＮＦ−αの産生を阻害する請求項１
    記載の方法。
  6. 【請求項６】 化合物または組成物が、細胞からのＴＮＦ−αの合成または
    放出を制限する請求項１記載の方法。
  7. 【請求項７】 細胞が免疫細胞、リンパ球、グリアおよび神経細胞である請
    求項６に記載の方法。
  8. 【請求項８】 化合物がサリドマイドである請求項６記載の方法。
  9. 【請求項９】 化合物または組成物が選択的なサイトカイン阻害剤である請
    求項６記載の方法。
  10. 【請求項１０】 阻害剤が、ロリプラムまたはホスホジエステラーゼ４阻害
    剤である請求項９記載の方法。
  11. 【請求項１１】 化合物または組成物が循環性ＴＮＦ−αを不活性化する請
    求項１記載の方法。
  12. 【請求項１２】 分子が抗ＴＮＦ−α抗体である請求項１記載の方法。
  13. 【請求項１３】 分子がモノクローナルまたはポリクローナル抗体である請
    求項１２記載の方法。
  14. 【請求項１４】 分子がインフリキシマブである請求項１３記載の方法。
  15. 【請求項１５】 ＴＮＦレデューサーが硫酸ヒドラジン、ペントキシフィリ
    ン、ケトチフェン、テニダプ、ベスナリノン、シクロスポリン、ペプチドＴ、ス
    ルファサラジン、トラジン、抗酸化薬、コルチコステロイド類、マリファナ、グ
    リシルリジン、小柴胡湯、Ｌ−カルニチン、温熱療法または高圧酸素療法である
    請求項１記載の方法。
  16. 【請求項１６】 請求項１の化合物または組成物ならびに希釈剤および好適
    なキャリアーを含有する薬剤組成物。
  17. 【請求項１７】 化合物または組成物を、経口投与、非経口投与、経粘膜投
    与、経皮投与、筋肉内投与、静脈内投与、粘膜内投与、血管内投与、皮下投与、
    腹腔内局所ドロップまたは軟膏での投与、眼周囲注射、静脈内注射または経口に
    よる全身投与、前眼房または硝子体へのカメラ内投与、外科手術時に挿入した眼
    球内水晶体植片に接合させたデポー剤による投与、眼の前眼房または硝子体に縫
    合させて眼内に設置したデポー剤による投与によって投与する請求項１記載の方
    法。
JP2001557577A 2000-02-08 2001-02-08 緑内障の治療法 Pending JP2003529561A (ja)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US09/500,023 2000-02-08
US09/500,023 US6531128B1 (en) 2000-02-08 2000-02-08 Methods for treating glaucoma
US09/591,561 US6814966B1 (en) 2000-02-08 2000-06-13 Methods for treating glaucoma
US09/591,561 2000-06-13
PCT/US2001/000686 WO2001058469A1 (en) 2000-02-08 2001-02-08 Methods for treating glaucoma

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2003529561A true JP2003529561A (ja) 2003-10-07

Family

ID=27053390

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2001557577A Pending JP2003529561A (ja) 2000-02-08 2001-02-08 緑内障の治療法

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20050032691A1 (ja)
EP (1) EP1267903A4 (ja)
JP (1) JP2003529561A (ja)
AU (1) AU2001237939A1 (ja)
WO (1) WO2001058469A1 (ja)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012091093A1 (ja) * 2010-12-28 2012-07-05 参天製薬株式会社 緑内障診断チップと変形プロテオミクスクラスター解析による緑内障統合的判定方法
JP2013220090A (ja) * 2012-04-19 2013-10-28 Tohoku Univ 眼疾患治療に使用する薬剤スクリーニング方法

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6881198B2 (en) * 2001-01-09 2005-04-19 J. David Brown Glaucoma treatment device and method
US6709655B2 (en) 2001-02-28 2004-03-23 Instituto Bioclon, S.A. De C.V. Pharmaceutical composition of F(ab1)2 antibody fragments and a process for the preparation thereof
US6479458B1 (en) * 2001-11-08 2002-11-12 Allergan, Inc. Targeting the reverse mode of the Na+/Ca2+ exchanger for the treatment of optic neuropathy associated with glaucoma and ischemic optic neuropathy
SE0200667D0 (sv) 2002-03-05 2002-03-05 A & Science Invest Ab Novel use of cytokine inhibitors
US7335759B2 (en) 2002-12-02 2008-02-26 Universidad Nacional Autónoma de Méxica (UNAM) Recombinant immunogens for the generation of antivenoms to the venom of scorpions of the genus Centruroides
FR2851247B1 (fr) * 2003-02-19 2007-06-29 Exonhit Therapeutics Sa Methodes et compositions pour le traitement de pathologies degeneratives oculaires
US7381802B2 (en) 2005-04-15 2008-06-03 Universidad Nacional Autónoma De México (UNAM) Human antibodies that specifically recognize the toxin Cn2 from Centruroides noxius scorpion venom
JP2009508584A (ja) * 2005-09-16 2009-03-05 ビージー インプラント インコーポレイテッド 緑内障治療装置および方法
CL2008002277A1 (es) 2007-08-03 2009-07-17 Alcon Res Ltd Metodo para tratar un trastorno ocular relacionado con tnf alfa que comprende una molecula de arn interferente que actua en la expresion del arnm de tnfr1 o tace mediante interferencia de arn; molecula de arn interferente; composicion que comprende dicho interferente.
CL2008002278A1 (es) 2007-08-03 2009-07-17 Alcon Res Ltd Metodo para el tratamiento de una enfermedad ocular relacionada al tnfalfa; metodo para la atenuacion de la expresion del arnm de tace o tnfr1 en el ojo de un paciente.
JP5665739B2 (ja) * 2008-07-14 2015-02-04 ドイチェス クレープスフォルシュングスツェントルムＤｅｕｔｓｃｈｅｓ Ｋｒｅｂｓｆｏｒｓｃｈｕｎｇｓｚｅｎｔｒｕｍ 炎症性疾患を治療するためのｃｄ９５インヒビターの使用
WO2015168786A1 (en) * 2014-05-05 2015-11-12 Val-Chum, Limited Partnership Method for decreasing retinal ganglion cells degeneration
AU2015374033B2 (en) 2014-12-31 2020-07-02 Microoptx Inc. Glaucoma treatment devices and methods
CA3000402A1 (en) 2015-09-30 2017-04-06 Microoptx Inc. Dry eye treatment devices and methods

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2909530A (en) * 1958-09-26 1959-10-20 Grace W R & Co Physostigmine derivatives
US4189491A (en) * 1976-12-16 1980-02-19 Cuendet Jean Francois Tetrahydrocannabinol in a method of treating glaucoma
IT1224795B (it) * 1988-12-01 1990-10-24 Sigma Tau Ind Farmaceuti Uso dell'acetil d-carnitina nel trattamento terapeutico del glaucoma e composizioni farmaceutiche utili in tale trattamento
IE911318A1 (en) * 1990-04-23 1991-10-23 Yeda Res & Dev Use of a tumor necrosis factor for facilitating nerve¹regeneration
US5212168A (en) * 1991-02-26 1993-05-18 New England Medical Center Hospital, Inc. Method of and solution for treating glaucoma
US5443824A (en) * 1994-03-14 1995-08-22 Piacquadio; Daniel J. Topical thalidomide compositions for surface or mucosal wounds, ulcerations, and lesions
US5654312A (en) * 1995-06-07 1997-08-05 Andrulis Pharmaceuticals Treatment of inflammatory and/or autoimmune dermatoses with thalidomide alone or in combination with other agents
IL115245A (en) * 1995-09-11 2002-12-01 Yissum Res Dev Co Tumor necrosis factor inhibiting pharmaceuticals
NZ322197A (en) * 1995-11-21 1999-02-25 Yamanouchi Pharma Co Ltd Pyrido[2,3-d] pyrimidine derivatives and pharmaceutical compositions thereof
TW453995B (en) * 1995-12-15 2001-09-11 Novartis Ag Certain alpha-substituted arylsulfonamido acetohydroxamic acids
FR2757860B1 (fr) * 1996-12-27 1999-04-23 Oxis International Sa Composes organoselenies cycliques, leur preparation et leurs utilisations, notamment therapeutiques
FR2757857B1 (fr) * 1996-12-27 1999-04-23 Oxis International Sa Diselenures et selenosulfures aromatiques, leur preparation et leurs utilisations, notamment therapeutiques
WO1999048495A1 (en) * 1998-03-25 1999-09-30 Biosource Technologies, Inc. Benzoates derivatives for inhibiting angiogenesis
WO1999058531A1 (en) * 1998-05-14 1999-11-18 Du Pont Pharmaceuticals Company Novel substituted aryl hydroxamic acids as metalloproteinase inhibitors
AU760168B2 (en) * 1998-06-12 2003-05-08 Scynexis, Inc. Novel cyclosporins
US6015557A (en) * 1999-02-24 2000-01-18 Tobinick; Edward L. Tumor necrosis factor antagonists for the treatment of neurological disorders
US6177077B1 (en) * 1999-02-24 2001-01-23 Edward L. Tobinick TNT inhibitors for the treatment of neurological disorders
US6204270B1 (en) * 1999-11-12 2001-03-20 Eyal S. Ron Ophthalmic and mucosal preparations
US6531128B1 (en) * 2000-02-08 2003-03-11 Pharmacia Corporation Methods for treating glaucoma

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012091093A1 (ja) * 2010-12-28 2012-07-05 参天製薬株式会社 緑内障診断チップと変形プロテオミクスクラスター解析による緑内障統合的判定方法
JP2013220090A (ja) * 2012-04-19 2013-10-28 Tohoku Univ 眼疾患治療に使用する薬剤スクリーニング方法

Also Published As

Publication number Publication date
AU2001237939A1 (en) 2001-08-20
US20050032691A1 (en) 2005-02-10
EP1267903A4 (en) 2003-08-06
WO2001058469A1 (en) 2001-08-16
EP1267903A1 (en) 2003-01-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6814966B1 (en) Methods for treating glaucoma
Wu et al. Cannabinoid type 2 receptor system modulates paclitaxel-induced microglial dysregulation and central sensitization in rats
JP5022216B2 (ja) 自己炎症性疾患を処置するためのｉｌ−１アンタゴニストを使用する方法
JP2003529561A (ja) 緑内障の治療法
Tezel et al. Increased production of tumor necrosis factor-α by glial cells exposed to simulated ischemia or elevated hydrostatic pressure induces apoptosis in cocultured retinal ganglion cells
Mendiola et al. Fractalkine signaling attenuates perivascular clustering of microglia and fibrinogen leakage during systemic inflammation in mouse models of diabetic retinopathy
Yang et al. Tofacitinib restores the balance of γδTreg/γδT17 cells in rheumatoid arthritis by inhibiting the NLRP3 inflammasome
Biancotti et al. Activation of inflammatory response by a combination of growth factors in cuprizone-induced demyelinated brain leads to myelin repair
JP2011052001A (ja) 神経根障害を処置するための所定薬剤の使用
RU2411042C2 (ru) Композиции и способы для лечения острого респираторного синдрома (sars)
CN107847470A (zh) 用于治疗、预防和诊断癌症与其它增殖性疾病的组合物和方法
JP2006512396A (ja) 免疫寛容を誘導および維持する方法
Bank et al. Triggering endogenous immunosuppressive mechanisms by combined targeting of Dipeptidyl peptidase IV (DPIV/CD26) and Aminopeptidase N (APN/CD13)—A novel approach for the treatment of inflammatory bowel disease
JP2021106625A (ja) Ｉｌ−３４アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびその使用方法
Campos‐Bedolla et al. Factors not considered in the study of drug‐resistant epilepsy: Drug‐resistant epilepsy: Assessment of neuroinflammation
KR20240055038A (ko) 다발성 경화증 치료를 위한 lou064
US20090105281A1 (en) Methods of treating inflammation
Hollborn et al. Osmotic and hypoxic induction of osteopontin in retinal pigment epithelial cells: Involvement of purinergic receptor signaling
US20060009452A1 (en) Therapeutic targeting of PARC/CCL18 and its signaling in pulmonary fibrosis
US6319955B1 (en) Use of MEK1 inhibitors as protective agents against damage due to ischemia
US20230026808A1 (en) Compounds, compositions, and methods for treating ischemia-reperfusion injury and/or lung injury
Zhao et al. Biologics and oral small‐molecule inhibitors for treatment of pediatric atopic dermatitis: Opportunities and challenges
KR20170095512A (ko) Foxp3 및 CD200 수용체 활성화제를 포함하는 발작성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물
US20110287008A1 (en) Inhibition of emmprin to treat multiple sclerosis
US20240050514A1 (en) Use of compound, pharmaceutical composition for the treatment of immune or metabolic disorders, pharmaceutical composition for the treatment of illnesses caused by or associated with viruses