JP2003524167A - Ms/nmrを用いた構造に基づく薬物設計の方法 - Google Patents
Ms/nmrを用いた構造に基づく薬物設計の方法Info
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、質量分析法/NMRを用いた構造に基づく薬物設計の方法を提供する。
Description
【0001】
発明の背景
薬物発見の十分に確立されたアプローチは、生物学的アッセイを利用して、特
許化合物(>100,000)の大規模データベースをスクリーニングし、このア
ッセイで標的タンパクの活性をもたらす最初の手掛かりを同定することである(
総説については、ジェイ・ダブリュー・アームストロング(J.W. Armstrong)、ア
メリカン・バイオテクノロジー・ラボラトリー(Am. Biotechnol. Lab.),17,26,2
8(1999);ジェイ・イー・ゴンザレス(J.E. Gonzalez)、ピー・エイ・ネグレスキ
ュー(P.A. Negulescu)、カレント・オピニオン・イン・バイオテクノロジー(Cur
r. Opin. Biotechnol.),9,624-631(1998);ケイ・アール・オルデンバーグ(K.R.
Oldenburg)、アニュアル・レポーツ・イン・メディシナル・ケミストリー(Annu
. Rep. med. Chem.),33,301-311(1998);ピー・ビー・フェルナデス(P.B. Ferna
des)、カレント・オピニオン・イン・ケミカル・バイオロジー(Curr. Opin. Che
m. Biol.),2,597-603(1998);ビー・エイ・ケニー(B.A. Kenny)、エム・ブッシ
ュフィールド(M. Bushfield)、ディー・ジェイ・パリー-スミス(D.J. Parry-Smi
th)、エス・フォガーティ(S. Forgarty)、ジェイ・エム・トリハーン(J.M. Treh
erne)、プログレス・イン・ドラッグ・リサーチ(Prog. Drug Res),51,245-269(1
998);エル・シルバーマン(L. Silverman)、アール・キャンベル(R. Campbell)
、ジェイ・アール・ブローチ(J.R. Broach)、カレント・オピニオン・イン・ケ
ミカル・バイオロジー(Curr. Opin. Chem. Biol.),2,397-403(1998)を参照)。高
速大量処理スクリーニング(HTS)の努力から得られた手掛かり化学化合物の同
定は、構造および生物学的活性データから得られたフィードバックから小さい分
子の活性を最適化する反復アプローチを開始させる。この方法の大きな欠点は、
生物学的アッセイは各々の新しいタンパク標的の同定により完全に再設計する必
要があるという典型的な要件である。このことは、新しい薬物発見のプロジェク
トを開始することができるまでに資源および時間の大きい投資を効果的に必要と
する。所望の活性について化学ライブラリーを適切にスクリーニングするための
生物学的アッセイの設計に関連する困難性に加えて、アッセイの分析および有用
性を妨害しうる数多くの他の制限が存在する。これらは、通常、標的タンパクの
細胞機能を合理的に模倣し、かつその活性の変化をモニターするのに必要なアッ
セイの複雑性の結果である。生物学的アッセイが多数のタンパクを含んでいたり
、膜に依存するアッセイであったり、細胞に依存するアッセイでさえあるのは、
珍しいことではない。標的タンパクと小さい分子との間の化学的な相互作用の詳
細が観察された生物学的応答と容易に相関しないので、複雑なアッセイの結果は
肯定的な的中の不明瞭な性質である。その結果、これらのアッセイは、最初の化
学的な手掛かりから構造-活性関係(SAR)を解読することを極めて困難にする
一方で、薬物の最適化に対する構造に基づくアプローチを非常に制限する。
許化合物(>100,000)の大規模データベースをスクリーニングし、このア
ッセイで標的タンパクの活性をもたらす最初の手掛かりを同定することである(
総説については、ジェイ・ダブリュー・アームストロング(J.W. Armstrong)、ア
メリカン・バイオテクノロジー・ラボラトリー(Am. Biotechnol. Lab.),17,26,2
8(1999);ジェイ・イー・ゴンザレス(J.E. Gonzalez)、ピー・エイ・ネグレスキ
ュー(P.A. Negulescu)、カレント・オピニオン・イン・バイオテクノロジー(Cur
r. Opin. Biotechnol.),9,624-631(1998);ケイ・アール・オルデンバーグ(K.R.
Oldenburg)、アニュアル・レポーツ・イン・メディシナル・ケミストリー(Annu
. Rep. med. Chem.),33,301-311(1998);ピー・ビー・フェルナデス(P.B. Ferna
des)、カレント・オピニオン・イン・ケミカル・バイオロジー(Curr. Opin. Che
m. Biol.),2,597-603(1998);ビー・エイ・ケニー(B.A. Kenny)、エム・ブッシ
ュフィールド(M. Bushfield)、ディー・ジェイ・パリー-スミス(D.J. Parry-Smi
th)、エス・フォガーティ(S. Forgarty)、ジェイ・エム・トリハーン(J.M. Treh
erne)、プログレス・イン・ドラッグ・リサーチ(Prog. Drug Res),51,245-269(1
998);エル・シルバーマン(L. Silverman)、アール・キャンベル(R. Campbell)
、ジェイ・アール・ブローチ(J.R. Broach)、カレント・オピニオン・イン・ケ
ミカル・バイオロジー(Curr. Opin. Chem. Biol.),2,397-403(1998)を参照)。高
速大量処理スクリーニング(HTS)の努力から得られた手掛かり化学化合物の同
定は、構造および生物学的活性データから得られたフィードバックから小さい分
子の活性を最適化する反復アプローチを開始させる。この方法の大きな欠点は、
生物学的アッセイは各々の新しいタンパク標的の同定により完全に再設計する必
要があるという典型的な要件である。このことは、新しい薬物発見のプロジェク
トを開始することができるまでに資源および時間の大きい投資を効果的に必要と
する。所望の活性について化学ライブラリーを適切にスクリーニングするための
生物学的アッセイの設計に関連する困難性に加えて、アッセイの分析および有用
性を妨害しうる数多くの他の制限が存在する。これらは、通常、標的タンパクの
細胞機能を合理的に模倣し、かつその活性の変化をモニターするのに必要なアッ
セイの複雑性の結果である。生物学的アッセイが多数のタンパクを含んでいたり
、膜に依存するアッセイであったり、細胞に依存するアッセイでさえあるのは、
珍しいことではない。標的タンパクと小さい分子との間の化学的な相互作用の詳
細が観察された生物学的応答と容易に相関しないので、複雑なアッセイの結果は
肯定的な的中の不明瞭な性質である。その結果、これらのアッセイは、最初の化
学的な手掛かりから構造-活性関係(SAR)を解読することを極めて困難にする
一方で、薬物の最適化に対する構造に基づくアプローチを非常に制限する。
【0002】
NMRは、構造に基づく薬物設計において自明な有用性を有するリガンド結合
を評価するのに広範囲に用いられている(ケイ・ウスリッチ(K. Wuthrich)、エヌ
・エム・アール・オブ・プロテインズ・アンド・ヌクレイック・アシッズ(NMR o
f Proteins and Nucleic Acids)(ジョン・ワイリー・アンド・サンズ,インク(J
ohn Wiley & Sons, Inc.)、ニューヨーク、1986年);ジー・オッティング(G. Ot
ting)、カレント・オピニオン・イン・ストラクチュラル・バイオロジー(Curr.
Opin. Struct. Biol.),3,760-8(1993);ピー・ジェイ・ホイットル(P.J. Whittl
e)、ティー・エル・ブランデル(T.L. Blundell)、アニュアル・レビュー・オブ
・バイオフィジックス・アンド・バイオモレキュラー・ストラクチャー(Annu. R
ev. Biophys. Biomol. Struct.),23,349-75(1994);ティー・エル・ブランデル(
T.L. Blundell)、ネイチャー(Nature),384,補遺,23-26(1996))。以前ハジュク(H
ajduk)らにより記載された「NMRによるSAR」法は、2D 1H-15N-H
SQCスペクトルにおける観察された化学シフト摂動からタンパクを結合するそ
れらの能力について小さい分子をスクリーニングするためのNMRのこの有用性
を説明している(ピー・ジェイ・ハジュク(P.J. Hajduk)ら、ジャーナル・オブ・
メディシナル・ケミストリー(J. Med. Chem.),40,3144-3150(1997);ピー・ジェ
イ・ハジュク(P.J. Hajduk)ら、ジャーナル・オブ・ジ・アメリカン・ケミカル
・ソサイエティ(J. Am. Chem. Soc.),119,5818-5827(1997);エス・ビー・シュ
ーカー(S.B. Shuker)、ピー・ジェイ・ハジュク(P.J. Hajduk)、アール・ピー・
メドーズ(R.P. Meadows)、エス・ダブリュー・フェーシク(S.W. Fesik)、サイエ
ンス(Science),274,1531-1534(1996))。小さい分子がタンパクに結合するかどう
かを決定することに加えて、観察された化学シフト摂動は、タンパクの結合部位
の同定をも可能にする。1次スクリーンとしてNMRを用いる概念は、高速大量
処理フォーマットにおけるその使用を制限しうるいくつかの重大な障害物を有す
る。主として、NMRの比較的低感度は、かなりの量の同位元素を高めたタンパ
ク(>0.2mM)および試料あたりのデータ取得時間(>10分間)を必要とする
。このことは、スクリーニングすることができる化合物の数に劇的に悪い影響を
与える(エル・イー・ケイ(L.E. Kay)、ピー・ケイファー(P. Keifer)、ティー・
サーリネン(T. Saarinen)、ジャーナル・オブ・ジ・アメリカン・ケミカル・ソ
サイエティ(J. Am. Chem. Soc.),114,10663-5(1992);ジェイ・シュロイヒャー(
J. Schleucher)ら、ジャーナル・オブ・バイオモレキュラー・エヌ・エム・アー
ル(J. Biomol. NMR),4,301-6(1994))。これらの問題に対する回答は、混合物の
利用であったが、これは、次いで、試料の供給および測定器の供給源に関するさ
らなる義務を受ける肯定的な的中のデコンボリューションを必要とする。さらに
また、混合物の利用は、試料間の一貫した緩衝液条件(pH、イオン強度)の必要
性をさらに複雑化する一方、化合物の溶解度をNMRにより必要とされる濃度以
下に制限しうる。さらに、NMRデータの採取処理能力を最適化する必要性は、
通常、データの品質と取得時間との間の妥協をもたらす。
を評価するのに広範囲に用いられている(ケイ・ウスリッチ(K. Wuthrich)、エヌ
・エム・アール・オブ・プロテインズ・アンド・ヌクレイック・アシッズ(NMR o
f Proteins and Nucleic Acids)(ジョン・ワイリー・アンド・サンズ,インク(J
ohn Wiley & Sons, Inc.)、ニューヨーク、1986年);ジー・オッティング(G. Ot
ting)、カレント・オピニオン・イン・ストラクチュラル・バイオロジー(Curr.
Opin. Struct. Biol.),3,760-8(1993);ピー・ジェイ・ホイットル(P.J. Whittl
e)、ティー・エル・ブランデル(T.L. Blundell)、アニュアル・レビュー・オブ
・バイオフィジックス・アンド・バイオモレキュラー・ストラクチャー(Annu. R
ev. Biophys. Biomol. Struct.),23,349-75(1994);ティー・エル・ブランデル(
T.L. Blundell)、ネイチャー(Nature),384,補遺,23-26(1996))。以前ハジュク(H
ajduk)らにより記載された「NMRによるSAR」法は、2D 1H-15N-H
SQCスペクトルにおける観察された化学シフト摂動からタンパクを結合するそ
れらの能力について小さい分子をスクリーニングするためのNMRのこの有用性
を説明している(ピー・ジェイ・ハジュク(P.J. Hajduk)ら、ジャーナル・オブ・
メディシナル・ケミストリー(J. Med. Chem.),40,3144-3150(1997);ピー・ジェ
イ・ハジュク(P.J. Hajduk)ら、ジャーナル・オブ・ジ・アメリカン・ケミカル
・ソサイエティ(J. Am. Chem. Soc.),119,5818-5827(1997);エス・ビー・シュ
ーカー(S.B. Shuker)、ピー・ジェイ・ハジュク(P.J. Hajduk)、アール・ピー・
メドーズ(R.P. Meadows)、エス・ダブリュー・フェーシク(S.W. Fesik)、サイエ
ンス(Science),274,1531-1534(1996))。小さい分子がタンパクに結合するかどう
かを決定することに加えて、観察された化学シフト摂動は、タンパクの結合部位
の同定をも可能にする。1次スクリーンとしてNMRを用いる概念は、高速大量
処理フォーマットにおけるその使用を制限しうるいくつかの重大な障害物を有す
る。主として、NMRの比較的低感度は、かなりの量の同位元素を高めたタンパ
ク(>0.2mM)および試料あたりのデータ取得時間(>10分間)を必要とする
。このことは、スクリーニングすることができる化合物の数に劇的に悪い影響を
与える(エル・イー・ケイ(L.E. Kay)、ピー・ケイファー(P. Keifer)、ティー・
サーリネン(T. Saarinen)、ジャーナル・オブ・ジ・アメリカン・ケミカル・ソ
サイエティ(J. Am. Chem. Soc.),114,10663-5(1992);ジェイ・シュロイヒャー(
J. Schleucher)ら、ジャーナル・オブ・バイオモレキュラー・エヌ・エム・アー
ル(J. Biomol. NMR),4,301-6(1994))。これらの問題に対する回答は、混合物の
利用であったが、これは、次いで、試料の供給および測定器の供給源に関するさ
らなる義務を受ける肯定的な的中のデコンボリューションを必要とする。さらに
また、混合物の利用は、試料間の一貫した緩衝液条件(pH、イオン強度)の必要
性をさらに複雑化する一方、化合物の溶解度をNMRにより必要とされる濃度以
下に制限しうる。さらに、NMRデータの採取処理能力を最適化する必要性は、
通常、データの品質と取得時間との間の妥協をもたらす。
【0003】
供給源および試料に関する要件を最低限にする他の試みは、1D NMR技術
、特に拡散-編集(diffusion-edited)測定およびトランスファーNOEの適用に
注目している(エム・ジェイ・シャピロ(M.J. Shapiro)、ジェイ・アール・ウェ
アイング(J.R. Wareing)、カレント・オピニオン・イン・ドラッグ・ディスカバ
リー・アンド・ディベロップメント(Curr. Opin. Drug Discovery Dev.),2,396-
400(1999);ビー・メイヤー(B. Meyer)、ティー・ワイマール(T. Weimar)、ティ
ー・ピーターズ(T. Peters)、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミス
トリー(Eur. J. Biochem.),246,705-709(1997);エム・リン(M. Lin)、エム・ジ
ェイ・シャピロ(M.J. Shapiro)、ジェイ・アール・ウェアイング(J.R. Wareing)
、ジャーナル・オブ・ジ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティ(J. Am. Chem.
Soc.),119,5249-5250(1970);エム・リン(M. Lin)、エム・ジェイ・シャピロ(M.
J. Shapiro)、ジェイ・アール・ウェアイング(J.R. Wareing)、ジャーナル・オ
ブ・オーガニック・ケミストリー(J. Org. Chem.),62,8930-8931(1997);ピー・
ジェイ・ハジュック(P.J. Hajduk)、イー・ティー・オレジュニクザック(E.T. O
lejniczak)、エス・ダブリュー・フェーシク(S.W. Fesik)、ジャーナル・オブ・
ジ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティ(J. Am. Chem. Soc.),119,12257-1226
1(1997))。1D NMR実験は、試料量およびデータ取得時間を最少限にする一
方、標識されたタンパクの必要性を解消する。残念ながら、1D NMR実験は
、結合部位の位置に関する情報を与えない。また、それらは、自動化されたデー
タ分析により複雑な方法を必要とする一方、2D 1H-15N-HSQC実験に
比べて、弱い結合剤に対する感度が低い。さらに、混合物の利用は、スペクトル
の重複のために、より困難である。最近開発されたNMR低温プローブおよび流
液形プローブは、それぞれ3〜4倍の感度上昇および処理能力を増大させる方法
を与えうるので、これらの問題点に対する解決法を与えうる(エム・ジェイ・シ
ャピロ(M.J. Shapiro)、ジェイ・アール・ウェアイング(J.R. Wareing)、カレン
ト・オピニオン・ドラッグ・ディスカバリー・アンド・ディベロップメント(Cur
r. Opin. Drug Discovery Dev.),2,396-400(1999))。それにもかかわらず、NM
Rは、典型的なNMR実験は時間がかかり、供給源が集中しているので、スクリ
ーニング方法の初期段階には理想的ではないかもしれない。たいていのアッセイ
がおよそ0.1〜1%程度(採取されたデータの>99%が否定的な情報であるこ
とを意味する)の的中率であるとすると、NMR分析の段階の前に化合物の大部
分を排除することがより論理的なアプローチであると思われる。
、特に拡散-編集(diffusion-edited)測定およびトランスファーNOEの適用に
注目している(エム・ジェイ・シャピロ(M.J. Shapiro)、ジェイ・アール・ウェ
アイング(J.R. Wareing)、カレント・オピニオン・イン・ドラッグ・ディスカバ
リー・アンド・ディベロップメント(Curr. Opin. Drug Discovery Dev.),2,396-
400(1999);ビー・メイヤー(B. Meyer)、ティー・ワイマール(T. Weimar)、ティ
ー・ピーターズ(T. Peters)、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミス
トリー(Eur. J. Biochem.),246,705-709(1997);エム・リン(M. Lin)、エム・ジ
ェイ・シャピロ(M.J. Shapiro)、ジェイ・アール・ウェアイング(J.R. Wareing)
、ジャーナル・オブ・ジ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティ(J. Am. Chem.
Soc.),119,5249-5250(1970);エム・リン(M. Lin)、エム・ジェイ・シャピロ(M.
J. Shapiro)、ジェイ・アール・ウェアイング(J.R. Wareing)、ジャーナル・オ
ブ・オーガニック・ケミストリー(J. Org. Chem.),62,8930-8931(1997);ピー・
ジェイ・ハジュック(P.J. Hajduk)、イー・ティー・オレジュニクザック(E.T. O
lejniczak)、エス・ダブリュー・フェーシク(S.W. Fesik)、ジャーナル・オブ・
ジ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティ(J. Am. Chem. Soc.),119,12257-1226
1(1997))。1D NMR実験は、試料量およびデータ取得時間を最少限にする一
方、標識されたタンパクの必要性を解消する。残念ながら、1D NMR実験は
、結合部位の位置に関する情報を与えない。また、それらは、自動化されたデー
タ分析により複雑な方法を必要とする一方、2D 1H-15N-HSQC実験に
比べて、弱い結合剤に対する感度が低い。さらに、混合物の利用は、スペクトル
の重複のために、より困難である。最近開発されたNMR低温プローブおよび流
液形プローブは、それぞれ3〜4倍の感度上昇および処理能力を増大させる方法
を与えうるので、これらの問題点に対する解決法を与えうる(エム・ジェイ・シ
ャピロ(M.J. Shapiro)、ジェイ・アール・ウェアイング(J.R. Wareing)、カレン
ト・オピニオン・ドラッグ・ディスカバリー・アンド・ディベロップメント(Cur
r. Opin. Drug Discovery Dev.),2,396-400(1999))。それにもかかわらず、NM
Rは、典型的なNMR実験は時間がかかり、供給源が集中しているので、スクリ
ーニング方法の初期段階には理想的ではないかもしれない。たいていのアッセイ
がおよそ0.1〜1%程度(採取されたデータの>99%が否定的な情報であるこ
とを意味する)の的中率であるとすると、NMR分析の段階の前に化合物の大部
分を排除することがより論理的なアプローチであると思われる。
【0004】
薬物設計に対する新しい迅速なアプローチは、本発明により提供され、非常に
少量の多数の化合物を迅速かつ正確にスクリーニングする能力と組み合わせて、
構造に基づく薬物設計に有用な詳細を提供する。
少量の多数の化合物を迅速かつ正確にスクリーニングする能力と組み合わせて、
構造に基づく薬物設計に有用な詳細を提供する。
【0005】
発明の要旨
本発明は、化合物(各化合物は既知の分子量を有する)の混合物を調製し、この
混合物を標的分子(結合した化合物-標的複合体の形成を可能にする)とインキュ
ベートすることにより、化合物の混合物をスクリーニングして、標的分子に結合
する化合物を同定する方法を提供する。質量スペクトル分析を行って、分子量に
基づいて、結合した化合物の正体を決定する。標的分子に結合した同定された化
合物の複合体を調製し、標的分子に結合した同定された化合物の複合体のNMR
化学シフト摂動を分析して、標的分子上における化合物の結合部位の位置を同定
する。NMRデータを用いて、分子モデルを調製することができ、コンピュータ
ーを利用した薬物設計を用いて、標的分子に対する高親和性リガンドを設計する
ことができる。
混合物を標的分子(結合した化合物-標的複合体の形成を可能にする)とインキュ
ベートすることにより、化合物の混合物をスクリーニングして、標的分子に結合
する化合物を同定する方法を提供する。質量スペクトル分析を行って、分子量に
基づいて、結合した化合物の正体を決定する。標的分子に結合した同定された化
合物の複合体を調製し、標的分子に結合した同定された化合物の複合体のNMR
化学シフト摂動を分析して、標的分子上における化合物の結合部位の位置を同定
する。NMRデータを用いて、分子モデルを調製することができ、コンピュータ
ーを利用した薬物設計を用いて、標的分子に対する高親和性リガンドを設計する
ことができる。
【0006】
また、本発明は、既知の分子量を有する化合物の混合物を調製し、この混合物
を標的分子とインキュベートして、結合した化合物-標的複合体の形成を可能に
することからなる、標的分子に対する向上した親和性を有するリガンドを設計す
る方法を提供する。化合物-標的複合体を非結合化合物から分離し、化合物-標的
複合体について質量スペクトル分析を行って、分子量に基づいて結合した化合物
の正体を決定する。標的分子に結合した同定された化合物の複合体を調製し、N
MRを行う。標的分子に結合した同定された化合物の複合体のNMRシフト摂動
を分析して、標的分子上における化合物の結合部位を同定し、同定された化合物
の化学構造および標的分子の同定された結合部位に基づいて既知の分子量を有す
る構造類似体のライブラリーを設計する。構造類似体のライブラリーを調製し、
標的分子に対する構造類似体の結合を決定する。
を標的分子とインキュベートして、結合した化合物-標的複合体の形成を可能に
することからなる、標的分子に対する向上した親和性を有するリガンドを設計す
る方法を提供する。化合物-標的複合体を非結合化合物から分離し、化合物-標的
複合体について質量スペクトル分析を行って、分子量に基づいて結合した化合物
の正体を決定する。標的分子に結合した同定された化合物の複合体を調製し、N
MRを行う。標的分子に結合した同定された化合物の複合体のNMRシフト摂動
を分析して、標的分子上における化合物の結合部位を同定し、同定された化合物
の化学構造および標的分子の同定された結合部位に基づいて既知の分子量を有す
る構造類似体のライブラリーを設計する。構造類似体のライブラリーを調製し、
標的分子に対する構造類似体の結合を決定する。
【0007】
さらに、本発明によれば、化合物(各化合物は既知の分子量を有する)の混合物
を調製し、この混合物を標的分子とインキュベートして、結合した化合物-標的
複合体の形成を可能にすることにより、標的分子に対する高親和性リガンドを設
計する方法が提供される。質量スペクトル分析を行って、結合した化合物を同定
する。標的分子に結合した同定された化合物の複合体を調製し、標的分子に結合
した同定された化合物の複合体のNMRシフト摂動を分析して、標的分子上に少
なくとも2つの異なる結合部位を有する少なくとも2つの化合物を同定する。標
的分子上におけるこれら化合物の空間的配向を決定し、少なくとも2つの同定さ
れた化合物の構造情報を用いて、同定された部位で結合し、決定された空間的配
向に最少限の影響しか与えないリガンドを設計する。連結は分子モデリングまた
は化学結合のいずれによるものであってもよい。
を調製し、この混合物を標的分子とインキュベートして、結合した化合物-標的
複合体の形成を可能にすることにより、標的分子に対する高親和性リガンドを設
計する方法が提供される。質量スペクトル分析を行って、結合した化合物を同定
する。標的分子に結合した同定された化合物の複合体を調製し、標的分子に結合
した同定された化合物の複合体のNMRシフト摂動を分析して、標的分子上に少
なくとも2つの異なる結合部位を有する少なくとも2つの化合物を同定する。標
的分子上におけるこれら化合物の空間的配向を決定し、少なくとも2つの同定さ
れた化合物の構造情報を用いて、同定された部位で結合し、決定された空間的配
向に最少限の影響しか与えないリガンドを設計する。連結は分子モデリングまた
は化学結合のいずれによるものであってもよい。
【0008】
発明の詳細な説明
本発明は、化合物をスクリーニングして、標的分子に特異的に結合する化合物
を同定し、かつ結合の部位を同定する方法を提供する。また、本発明は、所定の
標的分子に対するリガンドを設計する迅速で効率的な方法を提供する。
を同定し、かつ結合の部位を同定する方法を提供する。また、本発明は、所定の
標的分子に対するリガンドを設計する迅速で効率的な方法を提供する。
【0009】
本発明の方法によれば、リガンドまたは化合物(例えば、小さい分子)の混合物
が調製される。リガンドは、例えば、商業的な起源に由来するものや、既存の化
学ライブラリーに由来するものであっても、必要に従って、例えば、従来の構造
と活性との関係に関する情報に基づいて調製してもよい。各混合物は、一群のリ
ガンド(各々は既知の分子量を有する)からなる。本発明のいくつかの好ましい具
体例では、各リガンドは、独自の分子量(好ましくは、混合物の他のリガンドと
3Da以上異なり、各成分の明確な同定を可能にする)を有する。本発明のいく
つかの態様では、各リガンドの分子量は、好ましくは2000未満であり、1個
またはそれ以上の化合物の結合が予想される場合には、分子量は約350未満で
あることがより好ましい。分子量に加えて、リガンドは、例えば、化合物の酸性
度、反応性、形状および官能基に基づいて選択してもよい。ライブラリーの多様
性は、一般に好ましい。リガンド濃度は、混合物を形成するリガンドの数に依存
して変化する。一般に、化合物の混合物は、少なくとも約0.1nMのスクリー
ニングすべき各化合物、より好ましくは少なくとも約1nMの各化合物からなる
。
が調製される。リガンドは、例えば、商業的な起源に由来するものや、既存の化
学ライブラリーに由来するものであっても、必要に従って、例えば、従来の構造
と活性との関係に関する情報に基づいて調製してもよい。各混合物は、一群のリ
ガンド(各々は既知の分子量を有する)からなる。本発明のいくつかの好ましい具
体例では、各リガンドは、独自の分子量(好ましくは、混合物の他のリガンドと
3Da以上異なり、各成分の明確な同定を可能にする)を有する。本発明のいく
つかの態様では、各リガンドの分子量は、好ましくは2000未満であり、1個
またはそれ以上の化合物の結合が予想される場合には、分子量は約350未満で
あることがより好ましい。分子量に加えて、リガンドは、例えば、化合物の酸性
度、反応性、形状および官能基に基づいて選択してもよい。ライブラリーの多様
性は、一般に好ましい。リガンド濃度は、混合物を形成するリガンドの数に依存
して変化する。一般に、化合物の混合物は、少なくとも約0.1nMのスクリー
ニングすべき各化合物、より好ましくは少なくとも約1nMの各化合物からなる
。
【0010】
化合物の混合物は、標的分子(例えば、タンパク、核酸など)とインキュベート
される。標的分子は、商業的な起源から得てもよいし、天然の起源から精製して
もよいし、また、組換え的に調製してもよい。一般に、インキュベーション混合
物は、少なくとも約10μMの標的分子を含有し、好ましくは約50μM〜約2
00μM、最も好ましくは約100μMである。
される。標的分子は、商業的な起源から得てもよいし、天然の起源から精製して
もよいし、また、組換え的に調製してもよい。一般に、インキュベーション混合
物は、少なくとも約10μMの標的分子を含有し、好ましくは約50μM〜約2
00μM、最も好ましくは約100μMである。
【0011】
結合した化合物-標的分子の複合体は、混合物を、例えば、吸引濾過または遠
心分離でサイズ排除カラムにかけることにより、非結合化合物から分離される。
ゲル浸透クロマトグラフィー(GPC)スピンカラムなどのかかるクロマトグラフ
ィー技術は、ジャーナル・オブ・マス・スペクトロメトリー(J. Mass. Spect.),
33:264-273(1998)(出典を示すことにより本明細書の一部をなす)に記載されてい
る。サイズ排除クロマトグラフィーは、低分子量の化合物はカラムに保持され、
高分子量の化合物はカラムを通過するという前提に基づいている。かくして、カ
ラムから溶出する化合物は、標的分子に結合されるはずであり、かくして標的を
含む生物学的アッセイにおいて活性である可能性が非常に高い。
心分離でサイズ排除カラムにかけることにより、非結合化合物から分離される。
ゲル浸透クロマトグラフィー(GPC)スピンカラムなどのかかるクロマトグラフ
ィー技術は、ジャーナル・オブ・マス・スペクトロメトリー(J. Mass. Spect.),
33:264-273(1998)(出典を示すことにより本明細書の一部をなす)に記載されてい
る。サイズ排除クロマトグラフィーは、低分子量の化合物はカラムに保持され、
高分子量の化合物はカラムを通過するという前提に基づいている。かくして、カ
ラムから溶出する化合物は、標的分子に結合されるはずであり、かくして標的を
含む生物学的アッセイにおいて活性である可能性が非常に高い。
【0012】
混合物由来の化合物は、いったん標的分子に結合すれば、混合物中の化合物の
分子量範囲で濾液について行われる質量分析法により決定されるその分子量に基
づいて、容易に同定しうる。混合物中の各化合物について、分子量は既知である
ので、質量分析器のイオンピークの観察は、的中物の存在および化合物の正体を
同時に同定する。本発明の好ましい具体例では、混合物の化合物の各々は、独自
の分子量を有する。混合物から候補物を同定する標的特異的なアッセイは回避さ
れ、このことは容易な自動化を可能にする。加えて、デコンボルーションは一般
に回避される。デコンボルーションが必要な場合、例えば、的中物の分子量が混
合物の1個より多くの化合物またはその断片に対応する場合には、それは一般に
限られた範囲内であり、迅速に行うことができる。
分子量範囲で濾液について行われる質量分析法により決定されるその分子量に基
づいて、容易に同定しうる。混合物中の各化合物について、分子量は既知である
ので、質量分析器のイオンピークの観察は、的中物の存在および化合物の正体を
同時に同定する。本発明の好ましい具体例では、混合物の化合物の各々は、独自
の分子量を有する。混合物から候補物を同定する標的特異的なアッセイは回避さ
れ、このことは容易な自動化を可能にする。加えて、デコンボルーションは一般
に回避される。デコンボルーションが必要な場合、例えば、的中物の分子量が混
合物の1個より多くの化合物またはその断片に対応する場合には、それは一般に
限られた範囲内であり、迅速に行うことができる。
【0013】
本発明のいくつかの好ましい具体例では、サイズ排除カラムは、低分子量の化
合物(例えば、2000MW未満のもの)を保持する一方、高分子量の化合物はカ
ラムを通過させる、セファデックス(Sephadex)G25樹脂(ファルマシア(Pharma
cia))などのサイズ排除樹脂を用いて調製することができる。樹脂は、例えば、
使い捨ての注射器または、より好ましくは、低タンパク結合フィルター(例えば
、親水性デュラポア(durapore)フィルターまたはシラン化ガラスウール)を含有
する96ウェル濾過プレートを用いて調製した個々のカラムに詰めることができ
る。96ウェルプレートの小さいカラム長さは、試料の必要量を最少限にし、M
Sの高感度ゆえに、各試料についてピコモルの標的タンパクが必要なだけである
。タンパク-化合物の混合物は、数多くの条件下で(ここで、緩衝液の条件、混合
物における化合物の数、およびタンパク-化合物のモル比は変化しうる)、サイズ
排除カラムにかけることができる。カラムからの濾液は、樹脂を充填した96ウ
ェル濾過プレートの遠心分離または吸引濾過のいずれかにより、標準的な96ウ
ェルプレートに採取する。この技術は、弱いタンパク-薬物の相互作用に敏感で
ある。
合物(例えば、2000MW未満のもの)を保持する一方、高分子量の化合物はカ
ラムを通過させる、セファデックス(Sephadex)G25樹脂(ファルマシア(Pharma
cia))などのサイズ排除樹脂を用いて調製することができる。樹脂は、例えば、
使い捨ての注射器または、より好ましくは、低タンパク結合フィルター(例えば
、親水性デュラポア(durapore)フィルターまたはシラン化ガラスウール)を含有
する96ウェル濾過プレートを用いて調製した個々のカラムに詰めることができ
る。96ウェルプレートの小さいカラム長さは、試料の必要量を最少限にし、M
Sの高感度ゆえに、各試料についてピコモルの標的タンパクが必要なだけである
。タンパク-化合物の混合物は、数多くの条件下で(ここで、緩衝液の条件、混合
物における化合物の数、およびタンパク-化合物のモル比は変化しうる)、サイズ
排除カラムにかけることができる。カラムからの濾液は、樹脂を充填した96ウ
ェル濾過プレートの遠心分離または吸引濾過のいずれかにより、標準的な96ウ
ェルプレートに採取する。この技術は、弱いタンパク-薬物の相互作用に敏感で
ある。
【0014】
質量スペクトル分析は、結合した化合物および非結合化合物を分離することな
く、混合物について行えばよい。質量スペクトル分析は、例えば、正および負の
イオン化モードの両方で、エレクトロスプレーイオン化(ESI)MS法を用いて
行う。バックグラウンドノイズは、独自の分子イオンピークから区別し、結合し
た化合物の正体につながる分子量を、標的分子の重量と、独自の化学物質に対応
するピークに相関する複合体の重量との差に基づいて決定する。あるいは、マト
リックス支援レーザー脱離/イオン化MALDI/MSを用いることができる。
く、混合物について行えばよい。質量スペクトル分析は、例えば、正および負の
イオン化モードの両方で、エレクトロスプレーイオン化(ESI)MS法を用いて
行う。バックグラウンドノイズは、独自の分子イオンピークから区別し、結合し
た化合物の正体につながる分子量を、標的分子の重量と、独自の化学物質に対応
するピークに相関する複合体の重量との差に基づいて決定する。あるいは、マト
リックス支援レーザー脱離/イオン化MALDI/MSを用いることができる。
【0015】
これらの工程は、ロボット工学を用いて、容易に自動化することができる。例
えば、ギルソン(Gilson)215液体ハンドラーを用いて、濾液を96ウェルプレ
ートから質量分析器に移送してもよい。
えば、ギルソン(Gilson)215液体ハンドラーを用いて、濾液を96ウェルプレ
ートから質量分析器に移送してもよい。
【0016】
いったん標的に結合する化合物(リガンド)の正体が分かれば、NMR分光学を
用いて、例えば、標的の構造上にNMR化学シフト摂動をマッピングすることに
より、特異的な結合部位を決定すればよい。標的の3次元構造は、標準的なX線
、NMRまたは相同性モデリング技術、および標準的なNMRプロトコルからの
NMR共鳴の帰属から得ればよい。化学シフト摂動は、遊離の標的のNMRスペ
クトルを、同定されたリガンドと複合体化した標的のNMRスペクトルと比較す
ることにより得ればよい。ここで、NMRスペクトルは、15N-濃縮または1
3C/15N-濃縮したタンパクまたは標的を用いた標準的な2D 1H-15N
HSQC、2D 1H-13C HSQC、2D 1H-15N HMQCまたは2D
1H-13C HMQC実験に対応しうる。リガンドの存在下で化学シフト摂動
を示す標的について観察されたNMR共鳴は、遊離の標的についてのNMR共鳴
の帰属を利用することにより、標的中の残基に帰属される。次いで、リガンドの
存在下で化学シフト摂動を経験する標的中の残基は、標的の構造上にマッピング
され、標的上のリガンドの結合部位を明確にする。濃縮された標的分子を用いて
もよく、好ましくはポリペプチドが標的として役立つ。標的分子は、当該分野で
公知の方法を用いて、13Cまたは15Nで標識することができる。好ましい具
体例では、標的分子は、形質転換された宿主細胞を用いて、組換え体に調製され
る。NMR化学シフト摂動と薬物設計用の分子断片の連結とを利用する「NMR
によるSAR」法は、国際特許出願公開番号第WO 97/18469号および第WO 97/184
71号に開示され、サイエンス(Science),274:1531-1534(1996);JACS 119:5818-5
827(1997)およびジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー(J. Med. Chem
.),40:3144-3150(1997)に公表されている。
用いて、例えば、標的の構造上にNMR化学シフト摂動をマッピングすることに
より、特異的な結合部位を決定すればよい。標的の3次元構造は、標準的なX線
、NMRまたは相同性モデリング技術、および標準的なNMRプロトコルからの
NMR共鳴の帰属から得ればよい。化学シフト摂動は、遊離の標的のNMRスペ
クトルを、同定されたリガンドと複合体化した標的のNMRスペクトルと比較す
ることにより得ればよい。ここで、NMRスペクトルは、15N-濃縮または1
3C/15N-濃縮したタンパクまたは標的を用いた標準的な2D 1H-15N
HSQC、2D 1H-13C HSQC、2D 1H-15N HMQCまたは2D
1H-13C HMQC実験に対応しうる。リガンドの存在下で化学シフト摂動
を示す標的について観察されたNMR共鳴は、遊離の標的についてのNMR共鳴
の帰属を利用することにより、標的中の残基に帰属される。次いで、リガンドの
存在下で化学シフト摂動を経験する標的中の残基は、標的の構造上にマッピング
され、標的上のリガンドの結合部位を明確にする。濃縮された標的分子を用いて
もよく、好ましくはポリペプチドが標的として役立つ。標的分子は、当該分野で
公知の方法を用いて、13Cまたは15Nで標識することができる。好ましい具
体例では、標的分子は、形質転換された宿主細胞を用いて、組換え体に調製され
る。NMR化学シフト摂動と薬物設計用の分子断片の連結とを利用する「NMR
によるSAR」法は、国際特許出願公開番号第WO 97/18469号および第WO 97/184
71号に開示され、サイエンス(Science),274:1531-1534(1996);JACS 119:5818-5
827(1997)およびジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー(J. Med. Chem
.),40:3144-3150(1997)に公表されている。
【0017】
適当量の均一に標識されたポリペプチドを調製する好ましい手段は、宿主細胞
を、このポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターで
形質転換し、形質転換された細胞を、同化可能な起源の放射標識を含有する培地
中で培養することである。かかる起源は、当該分野で公知である。例えば、15 NH4Cl、13Cグルコースまたは(15NH4)2SO4を用いればよい。
を、このポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターで
形質転換し、形質転換された細胞を、同化可能な起源の放射標識を含有する培地
中で培養することである。かかる起源は、当該分野で公知である。例えば、15 NH4Cl、13Cグルコースまたは(15NH4)2SO4を用いればよい。
【0018】
特定のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターを
調製する手段は、宿主細胞をベクターで形質転換し、それらの形質転換された細
胞をポリペプチドが発現されるように培養する手段として、当該分野で公知であ
る。
調製する手段は、宿主細胞をベクターで形質転換し、それらの形質転換された細
胞をポリペプチドが発現されるように培養する手段として、当該分野で公知であ
る。
【0019】
NMR化学シフト摂動からタンパクおよび化合物の構造ならびに化合物の結合
部位の一般的な位置が与えられたなら、標準的なモデリング技術を用いて、複合
体のコンピューターモデルを定義する。得られた複合体のコンピューターモデル
は、予測された短い(<5Å)水素対の距離と複合体のNMRスペクトルおよび/
または複合体のX線構造において観察されたNOEとの間の整合性により確認す
ればよい。
部位の一般的な位置が与えられたなら、標準的なモデリング技術を用いて、複合
体のコンピューターモデルを定義する。得られた複合体のコンピューターモデル
は、予測された短い(<5Å)水素対の距離と複合体のNMRスペクトルおよび/
または複合体のX線構造において観察されたNOEとの間の整合性により確認す
ればよい。
【0020】
タンパクに対する化合物の親和性(Kdおよび/またはIC50)は、様々な許
容された技術から決定することができる。かかる技術としては、NMR拡散係数
の変化または化学シフト摂動からのKd測定、および/または、的中物の生物学
的関連性を決定するタンパク標的に特異的な生物学的アッセイからのIC50決
定が挙げられる。
容された技術から決定することができる。かかる技術としては、NMR拡散係数
の変化または化学シフト摂動からのKd測定、および/または、的中物の生物学
的関連性を決定するタンパク標的に特異的な生物学的アッセイからのIC50決
定が挙げられる。
【0021】
独自の結合部位を有する1個より多くのリガンドが同定されれば、標的に関連
する、ならびに相互に関連するリガンドの3次元構造および空間配向を決定すれ
ばよい。標的分子に対する各リガンドの空間的配向は、標的中の原子に極めて接
近して存在するリガンドの部分、ならびに結合部位中の原子から遠く離れて存在
し、かつ本来の位置で他の分子との相互作用に関係しうる部分の同定を可能にす
る。
する、ならびに相互に関連するリガンドの3次元構造および空間配向を決定すれ
ばよい。標的分子に対する各リガンドの空間的配向は、標的中の原子に極めて接
近して存在するリガンドの部分、ならびに結合部位中の原子から遠く離れて存在
し、かつ本来の位置で他の分子との相互作用に関係しうる部分の同定を可能にす
る。
【0022】
いったん特異的な結合部位が同定されれば、当該分野で公知の数多くの方法の
うちのいずれか1つを用いて、3次元モデルを生成させればよい。かかる方法と
しては、相同性モデリング、ならびに結晶学的または分光学的な技術を用いて生
成された未加工の構造座標データのコンピューター分析が挙げられるが、これら
に限定されない。かかる3次元モデルを生成させるのに、および/または必要な
フィッティング分析を行うのに用いられるコンピュータープログラムとしては、
GRID(オックスフォード大学、オックスフォード、英国)、MCSS(モレキ
ュラー・シミュレーションズ(Molecular Simulations)、サンディエゴ、カリフ
ォルニア州)、AUTODOCK(スクリップス・リサーチ・インスティチュート
(Scripps Research Institute)、ラ・ホーヤ、カリフォルニア州)、DOCK(カ
リフォルニア大学、サンフランシスコ、カリフォルニア州)、Flo99(シスル
ソフト(Thislesoft)、モリス・タウンシップ、ニュージャージー州)、Ludi(
モレキュラー・シュミレーションズ(Molecular Simulations)、サンディエゴ、
カリフォルニア州)、QUANTA(モレキュラー・シュミレーションズ(Molecul
ar Simulations)、サンディエゴ、カリフォルニア州)、Insight(モレキ
ュラー・シュミレーションズ(Molecular Simulations)、サンディエゴ、カリフ
ォルニア州)、SYBYL(トリポス,インク(TRIPOS, Inc.)、セントルイス、ミ
ズーリ州)、およびLEAPFROG(トリポス,インク(TRIPOS, Inc.)、セント
ルイス、ミズーリ州)が挙げられるが、これらに限定されない。
うちのいずれか1つを用いて、3次元モデルを生成させればよい。かかる方法と
しては、相同性モデリング、ならびに結晶学的または分光学的な技術を用いて生
成された未加工の構造座標データのコンピューター分析が挙げられるが、これら
に限定されない。かかる3次元モデルを生成させるのに、および/または必要な
フィッティング分析を行うのに用いられるコンピュータープログラムとしては、
GRID(オックスフォード大学、オックスフォード、英国)、MCSS(モレキ
ュラー・シミュレーションズ(Molecular Simulations)、サンディエゴ、カリフ
ォルニア州)、AUTODOCK(スクリップス・リサーチ・インスティチュート
(Scripps Research Institute)、ラ・ホーヤ、カリフォルニア州)、DOCK(カ
リフォルニア大学、サンフランシスコ、カリフォルニア州)、Flo99(シスル
ソフト(Thislesoft)、モリス・タウンシップ、ニュージャージー州)、Ludi(
モレキュラー・シュミレーションズ(Molecular Simulations)、サンディエゴ、
カリフォルニア州)、QUANTA(モレキュラー・シュミレーションズ(Molecul
ar Simulations)、サンディエゴ、カリフォルニア州)、Insight(モレキ
ュラー・シュミレーションズ(Molecular Simulations)、サンディエゴ、カリフ
ォルニア州)、SYBYL(トリポス,インク(TRIPOS, Inc.)、セントルイス、ミ
ズーリ州)、およびLEAPFROG(トリポス,インク(TRIPOS, Inc.)、セント
ルイス、ミズーリ州)が挙げられるが、これらに限定されない。
【0023】
これらおよび他のコンピュータープログラムは、当業者に公知である。いった
ん関連するデータがかかるプログラムにより分析されれば、候補のリガンドを同
定し、調製し、標的に結合するそれらの能力について、およびその生物学的活性
について試験することができる。
ん関連するデータがかかるプログラムにより分析されれば、候補のリガンドを同
定し、調製し、標的に結合するそれらの能力について、およびその生物学的活性
について試験することができる。
【0024】
次いで、標的分子に結合する同定されたリガンドは、生物学的な系で試験して
、生物学的な活性が観察された結合と相関することを確認すればよい。伝統的な
系では、化学的な手掛かりの有効性に関する最初の順位を与える生物学的アッセ
イから各リガンドについてIC50値が得られる。フォロー・アップとして、N
MR滴定データまたは様々な他の分析技術からKd値を得てもよい。本発明は、
これらの典型的な工程を逆にし、それにより標準的な生物学的アッセイを高速大
量処理フォーマットに変換する必要性が解消される。むしろ、標準的なアッセイ
を変換する必要がないように、手掛かりの数が減少する。
、生物学的な活性が観察された結合と相関することを確認すればよい。伝統的な
系では、化学的な手掛かりの有効性に関する最初の順位を与える生物学的アッセ
イから各リガンドについてIC50値が得られる。フォロー・アップとして、N
MR滴定データまたは様々な他の分析技術からKd値を得てもよい。本発明は、
これらの典型的な工程を逆にし、それにより標準的な生物学的アッセイを高速大
量処理フォーマットに変換する必要性が解消される。むしろ、標準的なアッセイ
を変換する必要がないように、手掛かりの数が減少する。
【0025】
生物学的な活性の確認に続いて、タンパク-リガンド複合体の正確な構造をN
MR、X線および/またはモデリングにより明らかにすればよい。
MR、X線および/またはモデリングにより明らかにすればよい。
【0026】
さらに、最初の手掛かりに基づいて、構造類似体のライブラリーを調製し、本
発明に従って、結合について試験し、それにより、リガンドの親和性および活性
をさらに最適化すればよい。例えば、構造類似体を与える公知の化学的な原理に
従って、結合部位における相互作用の点に基づいて、手掛かりの化合物を分子中
の1またはそれ以上の位置で誘導体化すればよい。これらの目的には、組み合わ
せ合成法が特に有用でありうる。加えて、独自の結合部位を有する1個より多く
のリガンドを同定する場合には、この結合部位を有するリガンドの空間的配向を
用いて、新しい高親和性リガンドを設計することができる。新しいリガンドは、
モデリング技術により、または2つの化合物の化学結合により、設計することが
できる。このようにして、標的に対する所定の親和性を有する2個またはそれ以
上の化合物を連結させて、標的に対する向上した親和性を有する化合物を得れば
よい。リンカーの設計は、リガンドの各々が標的に対して適切な配向を維持する
のに必要な距離および角度の配向に基づいている。適当なリンカーは公知であり
、当業者により容易に同定することができる。ジャーナル・オブ・コンピュータ
ー・エイディッド・モレキュラー・デザイン(J. of Computer Aided Molecular
Design),6:61-78(1992)、パースペクティブズ・イン・ドラッグ・ディスカバリ
ー・アンド・デザイン(Perspectives in Drug Discovery and Design),3:21-33(
1995)、ジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー(J. Med. Chem.),27(5)
,557-563(1984)、サイエンス(Science),263:380-384(1994)。
発明に従って、結合について試験し、それにより、リガンドの親和性および活性
をさらに最適化すればよい。例えば、構造類似体を与える公知の化学的な原理に
従って、結合部位における相互作用の点に基づいて、手掛かりの化合物を分子中
の1またはそれ以上の位置で誘導体化すればよい。これらの目的には、組み合わ
せ合成法が特に有用でありうる。加えて、独自の結合部位を有する1個より多く
のリガンドを同定する場合には、この結合部位を有するリガンドの空間的配向を
用いて、新しい高親和性リガンドを設計することができる。新しいリガンドは、
モデリング技術により、または2つの化合物の化学結合により、設計することが
できる。このようにして、標的に対する所定の親和性を有する2個またはそれ以
上の化合物を連結させて、標的に対する向上した親和性を有する化合物を得れば
よい。リンカーの設計は、リガンドの各々が標的に対して適切な配向を維持する
のに必要な距離および角度の配向に基づいている。適当なリンカーは公知であり
、当業者により容易に同定することができる。ジャーナル・オブ・コンピュータ
ー・エイディッド・モレキュラー・デザイン(J. of Computer Aided Molecular
Design),6:61-78(1992)、パースペクティブズ・イン・ドラッグ・ディスカバリ
ー・アンド・デザイン(Perspectives in Drug Discovery and Design),3:21-33(
1995)、ジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー(J. Med. Chem.),27(5)
,557-563(1984)、サイエンス(Science),263:380-384(1994)。
【0027】
以下の実施例は、所定の標的MMP-1に対してすでに試験された化合物を採
用することにより、本発明の方法の有効性を例示することを意図されている。こ
れらの実施例は、本発明の限定であることを意図されていない。
用することにより、本発明の方法の有効性を例示することを意図されている。こ
れらの実施例は、本発明の限定であることを意図されていない。
【0028】
実施例
実施例1
MMP-1に対して既知の親和性を有する化合物を選択した。これらの化合物
を表1に示す。
を表1に示す。
【0029】
【表1】
【0030】
【表2】
【0031】
実施例2
タンパク-単一化合物インキュベーション
化合物1、2および3(表1)の各1mMをDMSOに溶解し、各々を、20m
Mトリス、100mM NaCl、5mM CaCl2、0.1mM ZnCl2、
2mM NaN3および3.5mM DTTを含有する緩衝液(pH6.5)中、単独
または0.1mMのMMP-1の存在下、室温で30分間インキュベートした。M
MP-1:化合物の混合物中におけるDMSOの最終濃度は5%であった。各試
料の全容量25μlを0.65μm親水性デュラポア(durapore)フィルターから
なるミリポア(Millipore)マルチスクリーン濾過システムのセファデックス(Seph
adex)G25カラムにかけた。遠心分離(15,000×g、3分間)を用いて、こ
れらの試料を溶離させた。試料を採取し、各々ギルソン(Gilson)215液体ハン
ドラーを装備したマイクロマス(Micromass)LCT四重極飛行時間型質量分析計
およびクアトロ(Quattro)I三連四重極質量分析計により、正および負のイオン
化モードの両方で自動化ESI/MS法を用いて、質量分析法で分析した。図1
の結果は、MMP-1に結合した化合物が溶出される一方(図1A(化合物1+M
MP-1)、1C(化合物2+MMP-1)および1E(化合物3+MMP-1))、非
結合化合物が保持されることを示す(図1B(化合物1)、1D(化合物2)および
1F(化合物3))。
Mトリス、100mM NaCl、5mM CaCl2、0.1mM ZnCl2、
2mM NaN3および3.5mM DTTを含有する緩衝液(pH6.5)中、単独
または0.1mMのMMP-1の存在下、室温で30分間インキュベートした。M
MP-1:化合物の混合物中におけるDMSOの最終濃度は5%であった。各試
料の全容量25μlを0.65μm親水性デュラポア(durapore)フィルターから
なるミリポア(Millipore)マルチスクリーン濾過システムのセファデックス(Seph
adex)G25カラムにかけた。遠心分離(15,000×g、3分間)を用いて、こ
れらの試料を溶離させた。試料を採取し、各々ギルソン(Gilson)215液体ハン
ドラーを装備したマイクロマス(Micromass)LCT四重極飛行時間型質量分析計
およびクアトロ(Quattro)I三連四重極質量分析計により、正および負のイオン
化モードの両方で自動化ESI/MS法を用いて、質量分析法で分析した。図1
の結果は、MMP-1に結合した化合物が溶出される一方(図1A(化合物1+M
MP-1)、1C(化合物2+MMP-1)および1E(化合物3+MMP-1))、非
結合化合物が保持されることを示す(図1B(化合物1)、1D(化合物2)および
1F(化合物3))。
【0032】
実施例3
滴定
実施例2に記載したように、増大する量の化合物2を単独または増大する量の
MMP-1とインキュベートした。図2A〜Eは、これら濾液のESI(正イオン
化)質量スペクトル分析を与える。
MMP-1とインキュベートした。図2A〜Eは、これら濾液のESI(正イオン
化)質量スペクトル分析を与える。
【0033】
【表3】
【0034】
図2は、[M+H]1+(m/z)457.9イオンの相対強度がMMP-1濃度の
増大と相関することを示す。
増大と相関することを示す。
【0035】
実施例4
タンパク-混合物のインキュベーション
各々およその濃度1mMで与えられた実施例1に記載した10個の化合物の混
合物をDMSOに溶解した。このリガンド混合物を、20mMトリス、100m
M NaCl、5mM CaCl2、0.1mM ZnCl2、2mM NaN3お
よび3.5mM DTTからなる緩衝液(pH6.5)中、単独または濃度0.1mM
のMMP-1と共に、室温で30分間インキュベートした。MMP-1:化合物の
混合物におけるDMSOの最終濃度は5%であった。
合物をDMSOに溶解した。このリガンド混合物を、20mMトリス、100m
M NaCl、5mM CaCl2、0.1mM ZnCl2、2mM NaN3お
よび3.5mM DTTからなる緩衝液(pH6.5)中、単独または濃度0.1mM
のMMP-1と共に、室温で30分間インキュベートした。MMP-1:化合物の
混合物におけるDMSOの最終濃度は5%であった。
【0036】
実施例5
ゲル濾過/質量分析法・試料の採取
全容量25μlのMMP-1-化合物の混合物を0.65μmの親水性デュラポ
ア(durapore)フィルターからなるミリポア(Millipore)マルチスクリーン濾過シ
ステムのセファデックス(Sephadex)G25カラムにかける。遠心分離(15,00
0×g、3分間)を用いて、試料を溶出させた。試料を採取し、各々ギルソン(Gi
lson)215液体ハンドラーを装備したマイクロマス(Micromass)LCT四重極飛
行時間型質量分析計およびクアトロ(Quattro)I三連四重極質量分析計により、
正および負のイオン化モードの両方で自動化ESI/MS法を用いて、質量分析
法で分析した。結果を図3A(MMP-1を含む)およびB(MMP-1を含まない)
に示す。10個の化合物の質量イオンはスペクトル上で強調表示されている。
ア(durapore)フィルターからなるミリポア(Millipore)マルチスクリーン濾過シ
ステムのセファデックス(Sephadex)G25カラムにかける。遠心分離(15,00
0×g、3分間)を用いて、試料を溶出させた。試料を採取し、各々ギルソン(Gi
lson)215液体ハンドラーを装備したマイクロマス(Micromass)LCT四重極飛
行時間型質量分析計およびクアトロ(Quattro)I三連四重極質量分析計により、
正および負のイオン化モードの両方で自動化ESI/MS法を用いて、質量分析
法で分析した。結果を図3A(MMP-1を含む)およびB(MMP-1を含まない)
に示す。10個の化合物の質量イオンはスペクトル上で強調表示されている。
【0037】
MS的中物のNMR分析
MMP-1をモイ(Moy)、ジャーナル・オブ・バイオモレキュラー・エヌ・エム
・アール(J. Biomol. NMR)、第10巻:9-19(1997)に記載されているように標識し
た。化合物1、2および3を実施例5から選択した。勾配強化2D 1H-15N
HSQCスペクトルを、90%H2Oおよび10%D2O中における20mM
トリス、100mM NaCl、5mM CaCl2、0.1mM ZnCl2、2
mM NaN3および3.5mM DTTからなる緩衝液(pH6.5)中の0.2m
M 15N-MMP-1について、35℃で採取した。化合物は0.2〜4.0mM
の範囲内の化合物1、2および3の濃度を達成するように滴定した。2D 1H- 15 N HSQCスペクトルは、t1に256複素点(complex point)、t2に2
048実点(real point)、および増分あたり192スキャンで記録した。t1お
よびt2のスペクトル・ウィンドウは、それぞれ1723.7および8064.5
Hzであり、キャリアーは、それぞれ4.75および115.2ppmであった。
データは、サン(Sun)のウルトラ(Ultra)10ワークステーション上におけるNM
RPipe、NMRWish[エフ・デラグリオ(F. Delaglio)、エス・グルチェ
シエク(S. Grzesiek)、ジー・ダブリュー・ビュイスター(G.W. Vuister)、ジー
・ジュー(G. Zhu)、ジェイ・ファイファー(J. Pfeifer)およびエイ・バックス(A
. Bax)、ジャーナル・オブ・バイオモレキュラー・エヌ・エム・アール(J. Biom
ol. NMR),6,277(1995)]およびPIPP[ディー・エス・ギャレット(D.S. Garret
t)、アール・パワーズ(R. Powers)、エイ・エム・グローネンボーン(A.M. Grone
nborn)およびジー・エム・クロア(G.M. Clore)、ジャーナル・オブ・マグネティ
ック・レゾナンス(J. Magn. Reson.),95,214-20(1991)]を用いて加工および分析
した。図4は、化合物1(図4A)、化合物2(図4B)および化合物3(図4C)と
複合体化したMMP-1(1〜2の等高線)にオーバレイした遊離のMMP-1(多
数の等高線)のスペクトルを与える。3つの化合物は、いずれもMMP-1活性部
位における触媒的ZnおよびS1'ポケットの近傍における残基の化学シフト摂
動を誘発する。特に、残基80〜83、114〜119および136〜142は
、阻害薬の存在下で最も大きい化学シフト変化を示した。化学シフト摂動の程度
および化学シフト変化を示す残基の数は、化合物の各々について観察されたIC
50に直接関係している。(図4A、4B、4C)、すなわち、強い結合は大きい
摂動に寄与し、弱い結合は小さい摂動に寄与する。
・アール(J. Biomol. NMR)、第10巻:9-19(1997)に記載されているように標識し
た。化合物1、2および3を実施例5から選択した。勾配強化2D 1H-15N
HSQCスペクトルを、90%H2Oおよび10%D2O中における20mM
トリス、100mM NaCl、5mM CaCl2、0.1mM ZnCl2、2
mM NaN3および3.5mM DTTからなる緩衝液(pH6.5)中の0.2m
M 15N-MMP-1について、35℃で採取した。化合物は0.2〜4.0mM
の範囲内の化合物1、2および3の濃度を達成するように滴定した。2D 1H- 15 N HSQCスペクトルは、t1に256複素点(complex point)、t2に2
048実点(real point)、および増分あたり192スキャンで記録した。t1お
よびt2のスペクトル・ウィンドウは、それぞれ1723.7および8064.5
Hzであり、キャリアーは、それぞれ4.75および115.2ppmであった。
データは、サン(Sun)のウルトラ(Ultra)10ワークステーション上におけるNM
RPipe、NMRWish[エフ・デラグリオ(F. Delaglio)、エス・グルチェ
シエク(S. Grzesiek)、ジー・ダブリュー・ビュイスター(G.W. Vuister)、ジー
・ジュー(G. Zhu)、ジェイ・ファイファー(J. Pfeifer)およびエイ・バックス(A
. Bax)、ジャーナル・オブ・バイオモレキュラー・エヌ・エム・アール(J. Biom
ol. NMR),6,277(1995)]およびPIPP[ディー・エス・ギャレット(D.S. Garret
t)、アール・パワーズ(R. Powers)、エイ・エム・グローネンボーン(A.M. Grone
nborn)およびジー・エム・クロア(G.M. Clore)、ジャーナル・オブ・マグネティ
ック・レゾナンス(J. Magn. Reson.),95,214-20(1991)]を用いて加工および分析
した。図4は、化合物1(図4A)、化合物2(図4B)および化合物3(図4C)と
複合体化したMMP-1(1〜2の等高線)にオーバレイした遊離のMMP-1(多
数の等高線)のスペクトルを与える。3つの化合物は、いずれもMMP-1活性部
位における触媒的ZnおよびS1'ポケットの近傍における残基の化学シフト摂
動を誘発する。特に、残基80〜83、114〜119および136〜142は
、阻害薬の存在下で最も大きい化学シフト変化を示した。化学シフト摂動の程度
および化学シフト変化を示す残基の数は、化合物の各々について観察されたIC
50に直接関係している。(図4A、4B、4C)、すなわち、強い結合は大きい
摂動に寄与し、弱い結合は小さい摂動に寄与する。
【0038】
実施例7
モデリング
コンピューターモデリングを用いて、MMP-1のNMR溶液構造のGRAS
P表面を設計した(図5A)。ここで、MMP-1:化合物1の複合体における実
施例7のスペクトルで摂動を受けた残基は青く着色されており、これはタンパク
とのリガンド相互作用の位置を示す。NMR構造は、MMP-1:化合物1の複
合体について設計される。(図5B)。化合物1は太線で示されている。
P表面を設計した(図5A)。ここで、MMP-1:化合物1の複合体における実
施例7のスペクトルで摂動を受けた残基は青く着色されており、これはタンパク
とのリガンド相互作用の位置を示す。NMR構造は、MMP-1:化合物1の複
合体について設計される。(図5B)。化合物1は太線で示されている。
【図1】 図1は、MMP-1の存在下および非存在下でMMP-1阻害薬を
セファデックス(Sephadex)G-25カラムに通して濾過した後の濾液のESI質
量スペクトル分析。(A)45μM化合物1(MW393)および45μM MMP-
1、(B)45μM化合物1単独、(C)250μM化合物2(MW457)および5
0μM MMP-1、(D)250μM化合物2単独、(E)8mM化合物3(MW3
94)および0.4mM MMP-1、(F)8mM化合物3単独。
セファデックス(Sephadex)G-25カラムに通して濾過した後の濾液のESI質
量スペクトル分析。(A)45μM化合物1(MW393)および45μM MMP-
1、(B)45μM化合物1単独、(C)250μM化合物2(MW457)および5
0μM MMP-1、(D)250μM化合物2単独、(E)8mM化合物3(MW3
94)および0.4mM MMP-1、(F)8mM化合物3単独。
【図2】 図2は、MMP-1を用いた化合物2(MW457)のゲル濾過滴
定からの濾液のESI(正イオン化)質量スペクトル分析である。(A)50μMの
MMP-1単独;(B-E)増大する濃度のMMP-1、(B)20μM、(C)30μ
M、(D)40μMおよび(E)50μM、および増大する濃度の化合物2、(B)1
00μM、(C)150μM、(D)200μMおよび(E)250μM;および(F)
250μM化合物2単独。
定からの濾液のESI(正イオン化)質量スペクトル分析である。(A)50μMの
MMP-1単独;(B-E)増大する濃度のMMP-1、(B)20μM、(C)30μ
M、(D)40μMおよび(E)50μM、および増大する濃度の化合物2、(B)1
00μM、(C)150μM、(D)200μMおよび(E)250μM;および(F)
250μM化合物2単独。
【図3】 図3は、(上)0.1mM MMP-1を含む、また、(下)MMP-1
を含まない、10個の既知のMMP-1阻害薬の各1mMを含有する混合物のゲ
ル濾過分析からの濾液のESI(負イオン化)質量スペクトル分析である。10個
の化合物の質量イオンはスペクトル上で強調表示されている。この混合物は表1
に示した化合物4〜13からなる。
を含まない、10個の既知のMMP-1阻害薬の各1mMを含有する混合物のゲ
ル濾過分析からの濾液のESI(負イオン化)質量スペクトル分析である。10個
の化合物の質量イオンはスペクトル上で強調表示されている。この混合物は表1
に示した化合物4〜13からなる。
【図4】 図4A〜Cは、ゲル濾過/質量スペクトル分析(図1)から結合剤
として同定された(A)化合物1、(B)化合物2および(C)化合物3と複合体化し
たMMP-1(1〜2等高線)にオーバーレイした遊離のMMP-1(多数の等高線)
の2D 1H-15N HSQCスペクトルである。
として同定された(A)化合物1、(B)化合物2および(C)化合物3と複合体化し
たMMP-1(1〜2等高線)にオーバーレイした遊離のMMP-1(多数の等高線)
の2D 1H-15N HSQCスペクトルである。
【図5】 図5(A)は、MMP-1:化合物1複合体の1H-15N HSQ
Cスペクトルにおいて摂動を受けた残基を黒く着色した(タンパクとのリガンド
相互作用の位置を示す)MMP-1のNMR溶液構造のGRASP(32)表面であ
る。 図5(B)は、MMP-1:化合物1複合体のNMR構造である。化合物1は太
線で示されている。
Cスペクトルにおいて摂動を受けた残基を黒く着色した(タンパクとのリガンド
相互作用の位置を示す)MMP-1のNMR溶液構造のGRASP(32)表面であ
る。 図5(B)は、MMP-1:化合物1複合体のNMR構造である。化合物1は太
線で示されている。
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フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考)
G01N 33/50 G06F 17/60 126E
G06F 17/60 126 G01N 30/02 J
// G01N 30/02 30/48 N
30/48 30/88 C
30/88 E
J
24/08 510Q
(81)指定国 EP(AT,BE,CH,CY,
DE,DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,I
T,LU,MC,NL,PT,SE,TR),OA(BF
,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GW,
ML,MR,NE,SN,TD,TG),AP(GH,G
M,KE,LS,MW,MZ,SD,SL,SZ,TZ
,UG,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,
MD,RU,TJ,TM),AE,AG,AL,AM,
AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BR,BY,B
Z,CA,CH,CN,CR,CU,CZ,DE,DK
,DM,DZ,EE,ES,FI,GB,GD,GE,
GH,GM,HR,HU,ID,IL,IN,IS,J
P,KE,KG,KP,KR,KZ,LC,LK,LR
,LS,LT,LU,LV,MA,MD,MG,MK,
MN,MW,MX,MZ,NO,NZ,PL,PT,R
O,RU,SD,SE,SG,SI,SK,SL,TJ
,TM,TR,TT,TZ,UA,UG,UZ,VN,
YU,ZA,ZW
(72)発明者 マーシャル・メイヤー・シーゲル
アメリカ合衆国07410ニュージャージー州
フェア・ローン、グラント・ストリート39
−24番
(72)発明者 ドミニク・モビリオ
アメリカ合衆国07059ニュージャージー州
ウォーレン、スナイダー・ロード35番
Fターム(参考) 2G045 AA40 FA40 FB06 JA01
4H006 AA02
【要約の続き】
Claims (25)
- 【請求項1】 標的分子に結合する化合物の結合部位を同定するために化合
物の混合物をスクリーニングする方法であって、 a)既知の分子量を有する化合物の混合物を調製し; b)この混合物を標的分子とインキュベートして、結合した化合物-標的複合
体の形成を可能にし; c)化合物-標的複合体の質量スペクトル分析を行って、分子量に基づいて結
合した化合物の正体を決定し; d)標的分子に結合した同定された化合物の複合体を調製し; e)標的分子に結合した同定された化合物の複合体のNMR化学シフト摂動を
分析して、標的分子上の化合物の結合部位の位置を同定することからなる方法。 - 【請求項2】 さらに、非結合化合物から化合物-標的複合体を分離するこ
とを包含する請求項1記載の方法。 - 【請求項3】 サイズ排除カラムを用いて、非結合化合物から化合物-標的
分子複合体を分離する請求項2記載の方法。 - 【請求項4】 サイズ排除ゲルを充填したマルチスクリーン濾過システムを
用いて、非結合化合物から化合物-標的分子複合体を分離する請求項2記載の方
法。 - 【請求項5】 さらに、同定された化合物を標的分子に対する生物学的活性
について試験することを包含する請求項1〜4のいずれか1項記載の方法。 - 【請求項6】 さらに、複合体の分子モデルを調製することを包含する請求
項1〜5のいずれか1項記載の方法。 - 【請求項7】 分子モデルがNMRおよびX線結晶学的データの一方または
両方を用いて決定される請求項6記載の方法。 - 【請求項8】 さらに、コンピューターを利用した合理的薬物設計を用いて
、標的分子に対して向上した親和性を有するリガンドを設計することを包含する
請求項6または7記載の方法。 - 【請求項9】 各化合物が約2000MW未満の分子量を有する請求項1〜
8のいずれか1項記載の方法。 - 【請求項10】 標的分子に対する向上した親和性を有するリガンドを設計
する方法であって、 a)既知の分子量を有する化合物の混合物を調製し; b)この混合物を標的分子とインキュベートして、結合した化合物-標的複合
体の形成を可能にし; c)化合物-標的複合体の質量スペクトル分析を行って、分子量に基づいて結
合した化合物の正体を決定し; d)標的分子に結合した同定された化合物の複合体を調製し; e)標的分子に結合した同定された化合物の複合体のNMR化学シフト摂動を
分析して、標的分子上の化合物の結合部位の位置を同定し; f)同定された化合物の化学構造および標的分子の同定された結合部位に基づ
いて既知の分子量を有する構造類似体のライブラリーを設計し; g)該構造類似体を合成し; h)これらの構造類似体が標的分子に結合するかどうかを決定することからな
る方法。 - 【請求項11】 さらに、阻害薬に対する生物学的な活性について構造類似
体を試験することを包含する請求項10記載の方法。 - 【請求項12】 構造類似体が、 a)これらの構造類似体を標的分子とインキュベートして、結合した構造類似
体-標的複合体の形成を可能にし; b)構造類似体-標的複合体の質量スペクトル分析を行って、分子量に基づい
て結合した構造類似体の正体を決定し; c)標的分子に結合した同定された構造類似体の複合体を調製し; d)標的分子に結合した構造類似体の複合体のNMR化学シフト摂動を分析し
て、標的分子上の化合物の結合部位の位置を同定することにより、 結合について試験される請求項10または11記載の方法。 - 【請求項13】 さらに、非結合化合物から化合物-標的複合体を分離する
ことを包含する請求項10〜12のいずれかに記載の方法。 - 【請求項14】 サイズ排除カラムを用いて、非結合化合物から化合物-標
的分子複合体を分離する請求項13記載の方法。 - 【請求項15】 サイズ排除ゲルを充填したマルチスクリーン濾過システム
を用いて、非結合化合物から化合物-標的分子複合体を分離する請求項13記載
の方法。 - 【請求項16】 さらに、複合体の分子モデルを調製することを包含する請
求項10〜15のいずれか1項記載の方法。 - 【請求項17】 分子モデルがNMRおよびX線結晶学的データを用いて調
製される請求項16記載の方法。 - 【請求項18】 さらに、コンピューターを利用した合理的薬物設計を用い
て、構造類似体を設計することを包含する請求項10〜17のいずれか1項記載
の方法。 - 【請求項19】 各化合物が約2000MW未満の分子量を有する請求項1
0〜18のいずれか1項記載の方法。 - 【請求項20】 標的分子に対する高親和性リガンドを設計する方法であっ
て、 a)既知の分子量を有する化合物の混合物を調製し; b)この混合物を標的分子とインキュベートして、結合した化合物-標的複合
体の形成を可能にし; c)化合物-標的複合体の質量スペクトル分析を行って、分子量に基づいて結
合した化合物の正体を決定し; d)標的分子に結合した同定された化合物の複合体を調製し; e)標的分子に結合した同定された化合物の複合体のNMR化学シフト摂動を
分析して、標的分子上の少なくとも2つの異なる結合部位を有する少なくとも2
つの化合物を同定し; f)標的分子上のこれら化合物の空間的な配向を決定し; g)決定された空間的な配向に最少限の影響を与えるように、少なくとも2つ
の同定された化合物を連結することからなる方法。 - 【請求項21】 少なくとも2つの同定された化合物が分子モデリングを用
いて連結される請求項20記載の方法。 - 【請求項22】 化合物-標的複合体および非結合化合物が分離される請求
項20または21記載の方法。 - 【請求項23】 サイズ排除カラムクロマトグラフィー用いて、化合物-標
的複合体および非結合化合物が分離される請求項22記載の方法。 - 【請求項24】 サイズ排除ゲルを有するマルチウェル濾過システムを用い
て、非結合化合物から化合物-標的分子複合体を分離する請求項22記載の方法
。 - 【請求項25】 各化合物が約2000MW未満の分子量を有する請求項2
0〜24のいずれか1項記載の方法。
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