JP2003524167A - Ｍｓ／ｎｍｒを用いた構造に基づく薬物設計の方法 - Google Patents
Ｍｓ／ｎｍｒを用いた構造に基づく薬物設計の方法Info
- Publication number
- JP2003524167A JP2003524167A JP2001561699A JP2001561699A JP2003524167A JP 2003524167 A JP2003524167 A JP 2003524167A JP 2001561699 A JP2001561699 A JP 2001561699A JP 2001561699 A JP2001561699 A JP 2001561699A JP 2003524167 A JP2003524167 A JP 2003524167A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- compound
- target molecule
- complex
- target
- bound
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/536—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
- G01N33/537—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with separation of immune complex from unbound antigen or antibody
- G01N33/538—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with separation of immune complex from unbound antigen or antibody by sorbent column, particles or resin strip, i.e. sorbent materials
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/536—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
- G01N33/542—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with steric inhibition or signal modification, e.g. fluorescent quenching
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/81—Protease inhibitors
- G01N2333/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
- G01N2333/8146—Metalloprotease (E.C. 3.4.24) inhibitors, e.g. tissue inhibitor of metallo proteinase, TIMP
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
- G01N2333/914—Hydrolases (3)
- G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- G01N2333/95—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99)
- G01N2333/964—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue
- G01N2333/96425—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals
- G01N2333/96427—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general
- G01N2333/9643—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general with EC number
- G01N2333/96486—Metalloendopeptidases (3.4.24)
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
- G01N2500/20—Screening for compounds of potential therapeutic value cell-free systems
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
Abstract
(57)【要約】
本発明は、質量分析法/ＮＭＲを用いた構造に基づく薬物設計の方法を提供する。
Description
【０００１】
発明の背景
薬物発見の十分に確立されたアプローチは、生物学的アッセイを利用して、特
許化合物(＞１００,０００)の大規模データベースをスクリーニングし、このア
ッセイで標的タンパクの活性をもたらす最初の手掛かりを同定することである(
総説については、ジェイ・ダブリュー・アームストロング(J.W. Armstrong)、ア
メリカン・バイオテクノロジー・ラボラトリー(Am. Biotechnol. Lab.),17,26,2
8(1999)；ジェイ・イー・ゴンザレス(J.E. Gonzalez)、ピー・エイ・ネグレスキ
ュー(P.A. Negulescu)、カレント・オピニオン・イン・バイオテクノロジー(Cur
r. Opin. Biotechnol.),9,624-631(1998)；ケイ・アール・オルデンバーグ(K.R.
Oldenburg)、アニュアル・レポーツ・イン・メディシナル・ケミストリー(Annu
. Rep. med. Chem.),33,301-311(1998)；ピー・ビー・フェルナデス(P.B. Ferna
des)、カレント・オピニオン・イン・ケミカル・バイオロジー(Curr. Opin. Che
m. Biol.),2,597-603(1998)；ビー・エイ・ケニー(B.A. Kenny)、エム・ブッシ
ュフィールド(M. Bushfield)、ディー・ジェイ・パリー-スミス(D.J. Parry-Smi
th)、エス・フォガーティ(S. Forgarty)、ジェイ・エム・トリハーン(J.M. Treh
erne)、プログレス・イン・ドラッグ・リサーチ(Prog. Drug Res),51,245-269(1
998)；エル・シルバーマン(L. Silverman)、アール・キャンベル(R. Campbell)
、ジェイ・アール・ブローチ(J.R. Broach)、カレント・オピニオン・イン・ケ
ミカル・バイオロジー(Curr. Opin. Chem. Biol.),2,397-403(1998)を参照)。高
速大量処理スクリーニング(ＨＴＳ)の努力から得られた手掛かり化学化合物の同
定は、構造および生物学的活性データから得られたフィードバックから小さい分
子の活性を最適化する反復アプローチを開始させる。この方法の大きな欠点は、
生物学的アッセイは各々の新しいタンパク標的の同定により完全に再設計する必
要があるという典型的な要件である。このことは、新しい薬物発見のプロジェク
トを開始することができるまでに資源および時間の大きい投資を効果的に必要と
する。所望の活性について化学ライブラリーを適切にスクリーニングするための
生物学的アッセイの設計に関連する困難性に加えて、アッセイの分析および有用
性を妨害しうる数多くの他の制限が存在する。これらは、通常、標的タンパクの
細胞機能を合理的に模倣し、かつその活性の変化をモニターするのに必要なアッ
セイの複雑性の結果である。生物学的アッセイが多数のタンパクを含んでいたり
、膜に依存するアッセイであったり、細胞に依存するアッセイでさえあるのは、
珍しいことではない。標的タンパクと小さい分子との間の化学的な相互作用の詳
細が観察された生物学的応答と容易に相関しないので、複雑なアッセイの結果は
肯定的な的中の不明瞭な性質である。その結果、これらのアッセイは、最初の化
学的な手掛かりから構造-活性関係(ＳＡＲ)を解読することを極めて困難にする
一方で、薬物の最適化に対する構造に基づくアプローチを非常に制限する。
許化合物(＞１００,０００)の大規模データベースをスクリーニングし、このア
ッセイで標的タンパクの活性をもたらす最初の手掛かりを同定することである(
総説については、ジェイ・ダブリュー・アームストロング(J.W. Armstrong)、ア
メリカン・バイオテクノロジー・ラボラトリー(Am. Biotechnol. Lab.),17,26,2
8(1999)；ジェイ・イー・ゴンザレス(J.E. Gonzalez)、ピー・エイ・ネグレスキ
ュー(P.A. Negulescu)、カレント・オピニオン・イン・バイオテクノロジー(Cur
r. Opin. Biotechnol.),9,624-631(1998)；ケイ・アール・オルデンバーグ(K.R.
Oldenburg)、アニュアル・レポーツ・イン・メディシナル・ケミストリー(Annu
. Rep. med. Chem.),33,301-311(1998)；ピー・ビー・フェルナデス(P.B. Ferna
des)、カレント・オピニオン・イン・ケミカル・バイオロジー(Curr. Opin. Che
m. Biol.),2,597-603(1998)；ビー・エイ・ケニー(B.A. Kenny)、エム・ブッシ
ュフィールド(M. Bushfield)、ディー・ジェイ・パリー-スミス(D.J. Parry-Smi
th)、エス・フォガーティ(S. Forgarty)、ジェイ・エム・トリハーン(J.M. Treh
erne)、プログレス・イン・ドラッグ・リサーチ(Prog. Drug Res),51,245-269(1
998)；エル・シルバーマン(L. Silverman)、アール・キャンベル(R. Campbell)
、ジェイ・アール・ブローチ(J.R. Broach)、カレント・オピニオン・イン・ケ
ミカル・バイオロジー(Curr. Opin. Chem. Biol.),2,397-403(1998)を参照)。高
速大量処理スクリーニング(ＨＴＳ)の努力から得られた手掛かり化学化合物の同
定は、構造および生物学的活性データから得られたフィードバックから小さい分
子の活性を最適化する反復アプローチを開始させる。この方法の大きな欠点は、
生物学的アッセイは各々の新しいタンパク標的の同定により完全に再設計する必
要があるという典型的な要件である。このことは、新しい薬物発見のプロジェク
トを開始することができるまでに資源および時間の大きい投資を効果的に必要と
する。所望の活性について化学ライブラリーを適切にスクリーニングするための
生物学的アッセイの設計に関連する困難性に加えて、アッセイの分析および有用
性を妨害しうる数多くの他の制限が存在する。これらは、通常、標的タンパクの
細胞機能を合理的に模倣し、かつその活性の変化をモニターするのに必要なアッ
セイの複雑性の結果である。生物学的アッセイが多数のタンパクを含んでいたり
、膜に依存するアッセイであったり、細胞に依存するアッセイでさえあるのは、
珍しいことではない。標的タンパクと小さい分子との間の化学的な相互作用の詳
細が観察された生物学的応答と容易に相関しないので、複雑なアッセイの結果は
肯定的な的中の不明瞭な性質である。その結果、これらのアッセイは、最初の化
学的な手掛かりから構造-活性関係(ＳＡＲ)を解読することを極めて困難にする
一方で、薬物の最適化に対する構造に基づくアプローチを非常に制限する。
【０００２】
ＮＭＲは、構造に基づく薬物設計において自明な有用性を有するリガンド結合
を評価するのに広範囲に用いられている(ケイ・ウスリッチ(K. Wuthrich)、エヌ
・エム・アール・オブ・プロテインズ・アンド・ヌクレイック・アシッズ(NMR o
f Proteins and Nucleic Acids)(ジョン・ワイリー・アンド・サンズ，インク(J
ohn Wiley & Sons, Inc.)、ニューヨーク、1986年)；ジー・オッティング(G. Ot
ting)、カレント・オピニオン・イン・ストラクチュラル・バイオロジー(Curr.
Opin. Struct. Biol.),3,760-8(1993)；ピー・ジェイ・ホイットル(P.J. Whittl
e)、ティー・エル・ブランデル(T.L. Blundell)、アニュアル・レビュー・オブ
・バイオフィジックス・アンド・バイオモレキュラー・ストラクチャー(Annu. R
ev. Biophys. Biomol. Struct.),23,349-75(1994)；ティー・エル・ブランデル(
T.L. Blundell)、ネイチャー(Nature),384,補遺,23-26(1996))。以前ハジュク(H
ajduk)らにより記載された「ＮＭＲによるＳＡＲ」法は、２Ｄ １Ｈ-１５Ｎ-Ｈ
ＳＱＣスペクトルにおける観察された化学シフト摂動からタンパクを結合するそ
れらの能力について小さい分子をスクリーニングするためのＮＭＲのこの有用性
を説明している(ピー・ジェイ・ハジュク(P.J. Hajduk)ら、ジャーナル・オブ・
メディシナル・ケミストリー(J. Med. Chem.),40,3144-3150(1997)；ピー・ジェ
イ・ハジュク(P.J. Hajduk)ら、ジャーナル・オブ・ジ・アメリカン・ケミカル
・ソサイエティ(J. Am. Chem. Soc.),119,5818-5827(1997)；エス・ビー・シュ
ーカー(S.B. Shuker)、ピー・ジェイ・ハジュク(P.J. Hajduk)、アール・ピー・
メドーズ(R.P. Meadows)、エス・ダブリュー・フェーシク(S.W. Fesik)、サイエ
ンス(Science),274,1531-1534(1996))。小さい分子がタンパクに結合するかどう
かを決定することに加えて、観察された化学シフト摂動は、タンパクの結合部位
の同定をも可能にする。１次スクリーンとしてＮＭＲを用いる概念は、高速大量
処理フォーマットにおけるその使用を制限しうるいくつかの重大な障害物を有す
る。主として、ＮＭＲの比較的低感度は、かなりの量の同位元素を高めたタンパ
ク(＞０.２ｍＭ)および試料あたりのデータ取得時間(＞１０分間)を必要とする
。このことは、スクリーニングすることができる化合物の数に劇的に悪い影響を
与える(エル・イー・ケイ(L.E. Kay)、ピー・ケイファー(P. Keifer)、ティー・
サーリネン(T. Saarinen)、ジャーナル・オブ・ジ・アメリカン・ケミカル・ソ
サイエティ(J. Am. Chem. Soc.),114,10663-5(1992)；ジェイ・シュロイヒャー(
J. Schleucher)ら、ジャーナル・オブ・バイオモレキュラー・エヌ・エム・アー
ル(J. Biomol. NMR),4,301-6(1994))。これらの問題に対する回答は、混合物の
利用であったが、これは、次いで、試料の供給および測定器の供給源に関するさ
らなる義務を受ける肯定的な的中のデコンボリューションを必要とする。さらに
また、混合物の利用は、試料間の一貫した緩衝液条件(ｐＨ、イオン強度)の必要
性をさらに複雑化する一方、化合物の溶解度をＮＭＲにより必要とされる濃度以
下に制限しうる。さらに、ＮＭＲデータの採取処理能力を最適化する必要性は、
通常、データの品質と取得時間との間の妥協をもたらす。
を評価するのに広範囲に用いられている(ケイ・ウスリッチ(K. Wuthrich)、エヌ
・エム・アール・オブ・プロテインズ・アンド・ヌクレイック・アシッズ(NMR o
f Proteins and Nucleic Acids)(ジョン・ワイリー・アンド・サンズ，インク(J
ohn Wiley & Sons, Inc.)、ニューヨーク、1986年)；ジー・オッティング(G. Ot
ting)、カレント・オピニオン・イン・ストラクチュラル・バイオロジー(Curr.
Opin. Struct. Biol.),3,760-8(1993)；ピー・ジェイ・ホイットル(P.J. Whittl
e)、ティー・エル・ブランデル(T.L. Blundell)、アニュアル・レビュー・オブ
・バイオフィジックス・アンド・バイオモレキュラー・ストラクチャー(Annu. R
ev. Biophys. Biomol. Struct.),23,349-75(1994)；ティー・エル・ブランデル(
T.L. Blundell)、ネイチャー(Nature),384,補遺,23-26(1996))。以前ハジュク(H
ajduk)らにより記載された「ＮＭＲによるＳＡＲ」法は、２Ｄ １Ｈ-１５Ｎ-Ｈ
ＳＱＣスペクトルにおける観察された化学シフト摂動からタンパクを結合するそ
れらの能力について小さい分子をスクリーニングするためのＮＭＲのこの有用性
を説明している(ピー・ジェイ・ハジュク(P.J. Hajduk)ら、ジャーナル・オブ・
メディシナル・ケミストリー(J. Med. Chem.),40,3144-3150(1997)；ピー・ジェ
イ・ハジュク(P.J. Hajduk)ら、ジャーナル・オブ・ジ・アメリカン・ケミカル
・ソサイエティ(J. Am. Chem. Soc.),119,5818-5827(1997)；エス・ビー・シュ
ーカー(S.B. Shuker)、ピー・ジェイ・ハジュク(P.J. Hajduk)、アール・ピー・
メドーズ(R.P. Meadows)、エス・ダブリュー・フェーシク(S.W. Fesik)、サイエ
ンス(Science),274,1531-1534(1996))。小さい分子がタンパクに結合するかどう
かを決定することに加えて、観察された化学シフト摂動は、タンパクの結合部位
の同定をも可能にする。１次スクリーンとしてＮＭＲを用いる概念は、高速大量
処理フォーマットにおけるその使用を制限しうるいくつかの重大な障害物を有す
る。主として、ＮＭＲの比較的低感度は、かなりの量の同位元素を高めたタンパ
ク(＞０.２ｍＭ)および試料あたりのデータ取得時間(＞１０分間)を必要とする
。このことは、スクリーニングすることができる化合物の数に劇的に悪い影響を
与える(エル・イー・ケイ(L.E. Kay)、ピー・ケイファー(P. Keifer)、ティー・
サーリネン(T. Saarinen)、ジャーナル・オブ・ジ・アメリカン・ケミカル・ソ
サイエティ(J. Am. Chem. Soc.),114,10663-5(1992)；ジェイ・シュロイヒャー(
J. Schleucher)ら、ジャーナル・オブ・バイオモレキュラー・エヌ・エム・アー
ル(J. Biomol. NMR),4,301-6(1994))。これらの問題に対する回答は、混合物の
利用であったが、これは、次いで、試料の供給および測定器の供給源に関するさ
らなる義務を受ける肯定的な的中のデコンボリューションを必要とする。さらに
また、混合物の利用は、試料間の一貫した緩衝液条件(ｐＨ、イオン強度)の必要
性をさらに複雑化する一方、化合物の溶解度をＮＭＲにより必要とされる濃度以
下に制限しうる。さらに、ＮＭＲデータの採取処理能力を最適化する必要性は、
通常、データの品質と取得時間との間の妥協をもたらす。
【０００３】
供給源および試料に関する要件を最低限にする他の試みは、１Ｄ ＮＭＲ技術
、特に拡散-編集(diffusion-edited)測定およびトランスファーＮＯＥの適用に
注目している(エム・ジェイ・シャピロ(M.J. Shapiro)、ジェイ・アール・ウェ
アイング(J.R. Wareing)、カレント・オピニオン・イン・ドラッグ・ディスカバ
リー・アンド・ディベロップメント(Curr. Opin. Drug Discovery Dev.),2,396-
400(1999)；ビー・メイヤー(B. Meyer)、ティー・ワイマール(T. Weimar)、ティ
ー・ピーターズ(T. Peters)、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミス
トリー(Eur. J. Biochem.),246,705-709(1997)；エム・リン(M. Lin)、エム・ジ
ェイ・シャピロ(M.J. Shapiro)、ジェイ・アール・ウェアイング(J.R. Wareing)
、ジャーナル・オブ・ジ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティ(J. Am. Chem.
Soc.),119,5249-5250(1970)；エム・リン(M. Lin)、エム・ジェイ・シャピロ(M.
J. Shapiro)、ジェイ・アール・ウェアイング(J.R. Wareing)、ジャーナル・オ
ブ・オーガニック・ケミストリー(J. Org. Chem.),62,8930-8931(1997)；ピー・
ジェイ・ハジュック(P.J. Hajduk)、イー・ティー・オレジュニクザック(E.T. O
lejniczak)、エス・ダブリュー・フェーシク(S.W. Fesik)、ジャーナル・オブ・
ジ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティ(J. Am. Chem. Soc.),119,12257-1226
1(1997))。１Ｄ ＮＭＲ実験は、試料量およびデータ取得時間を最少限にする一
方、標識されたタンパクの必要性を解消する。残念ながら、１Ｄ ＮＭＲ実験は
、結合部位の位置に関する情報を与えない。また、それらは、自動化されたデー
タ分析により複雑な方法を必要とする一方、２Ｄ １Ｈ-１５Ｎ-ＨＳＱＣ実験に
比べて、弱い結合剤に対する感度が低い。さらに、混合物の利用は、スペクトル
の重複のために、より困難である。最近開発されたＮＭＲ低温プローブおよび流
液形プローブは、それぞれ３〜４倍の感度上昇および処理能力を増大させる方法
を与えうるので、これらの問題点に対する解決法を与えうる(エム・ジェイ・シ
ャピロ(M.J. Shapiro)、ジェイ・アール・ウェアイング(J.R. Wareing)、カレン
ト・オピニオン・ドラッグ・ディスカバリー・アンド・ディベロップメント(Cur
r. Opin. Drug Discovery Dev.),2,396-400(1999))。それにもかかわらず、ＮＭ
Ｒは、典型的なＮＭＲ実験は時間がかかり、供給源が集中しているので、スクリ
ーニング方法の初期段階には理想的ではないかもしれない。たいていのアッセイ
がおよそ０.１〜１％程度(採取されたデータの＞９９％が否定的な情報であるこ
とを意味する)の的中率であるとすると、ＮＭＲ分析の段階の前に化合物の大部
分を排除することがより論理的なアプローチであると思われる。
、特に拡散-編集(diffusion-edited)測定およびトランスファーＮＯＥの適用に
注目している(エム・ジェイ・シャピロ(M.J. Shapiro)、ジェイ・アール・ウェ
アイング(J.R. Wareing)、カレント・オピニオン・イン・ドラッグ・ディスカバ
リー・アンド・ディベロップメント(Curr. Opin. Drug Discovery Dev.),2,396-
400(1999)；ビー・メイヤー(B. Meyer)、ティー・ワイマール(T. Weimar)、ティ
ー・ピーターズ(T. Peters)、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミス
トリー(Eur. J. Biochem.),246,705-709(1997)；エム・リン(M. Lin)、エム・ジ
ェイ・シャピロ(M.J. Shapiro)、ジェイ・アール・ウェアイング(J.R. Wareing)
、ジャーナル・オブ・ジ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティ(J. Am. Chem.
Soc.),119,5249-5250(1970)；エム・リン(M. Lin)、エム・ジェイ・シャピロ(M.
J. Shapiro)、ジェイ・アール・ウェアイング(J.R. Wareing)、ジャーナル・オ
ブ・オーガニック・ケミストリー(J. Org. Chem.),62,8930-8931(1997)；ピー・
ジェイ・ハジュック(P.J. Hajduk)、イー・ティー・オレジュニクザック(E.T. O
lejniczak)、エス・ダブリュー・フェーシク(S.W. Fesik)、ジャーナル・オブ・
ジ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティ(J. Am. Chem. Soc.),119,12257-1226
1(1997))。１Ｄ ＮＭＲ実験は、試料量およびデータ取得時間を最少限にする一
方、標識されたタンパクの必要性を解消する。残念ながら、１Ｄ ＮＭＲ実験は
、結合部位の位置に関する情報を与えない。また、それらは、自動化されたデー
タ分析により複雑な方法を必要とする一方、２Ｄ １Ｈ-１５Ｎ-ＨＳＱＣ実験に
比べて、弱い結合剤に対する感度が低い。さらに、混合物の利用は、スペクトル
の重複のために、より困難である。最近開発されたＮＭＲ低温プローブおよび流
液形プローブは、それぞれ３〜４倍の感度上昇および処理能力を増大させる方法
を与えうるので、これらの問題点に対する解決法を与えうる(エム・ジェイ・シ
ャピロ(M.J. Shapiro)、ジェイ・アール・ウェアイング(J.R. Wareing)、カレン
ト・オピニオン・ドラッグ・ディスカバリー・アンド・ディベロップメント(Cur
r. Opin. Drug Discovery Dev.),2,396-400(1999))。それにもかかわらず、ＮＭ
Ｒは、典型的なＮＭＲ実験は時間がかかり、供給源が集中しているので、スクリ
ーニング方法の初期段階には理想的ではないかもしれない。たいていのアッセイ
がおよそ０.１〜１％程度(採取されたデータの＞９９％が否定的な情報であるこ
とを意味する)の的中率であるとすると、ＮＭＲ分析の段階の前に化合物の大部
分を排除することがより論理的なアプローチであると思われる。
【０００４】
薬物設計に対する新しい迅速なアプローチは、本発明により提供され、非常に
少量の多数の化合物を迅速かつ正確にスクリーニングする能力と組み合わせて、
構造に基づく薬物設計に有用な詳細を提供する。
少量の多数の化合物を迅速かつ正確にスクリーニングする能力と組み合わせて、
構造に基づく薬物設計に有用な詳細を提供する。
【０００５】
発明の要旨
本発明は、化合物(各化合物は既知の分子量を有する)の混合物を調製し、この
混合物を標的分子(結合した化合物-標的複合体の形成を可能にする)とインキュ
ベートすることにより、化合物の混合物をスクリーニングして、標的分子に結合
する化合物を同定する方法を提供する。質量スペクトル分析を行って、分子量に
基づいて、結合した化合物の正体を決定する。標的分子に結合した同定された化
合物の複合体を調製し、標的分子に結合した同定された化合物の複合体のＮＭＲ
化学シフト摂動を分析して、標的分子上における化合物の結合部位の位置を同定
する。ＮＭＲデータを用いて、分子モデルを調製することができ、コンピュータ
ーを利用した薬物設計を用いて、標的分子に対する高親和性リガンドを設計する
ことができる。
混合物を標的分子(結合した化合物-標的複合体の形成を可能にする)とインキュ
ベートすることにより、化合物の混合物をスクリーニングして、標的分子に結合
する化合物を同定する方法を提供する。質量スペクトル分析を行って、分子量に
基づいて、結合した化合物の正体を決定する。標的分子に結合した同定された化
合物の複合体を調製し、標的分子に結合した同定された化合物の複合体のＮＭＲ
化学シフト摂動を分析して、標的分子上における化合物の結合部位の位置を同定
する。ＮＭＲデータを用いて、分子モデルを調製することができ、コンピュータ
ーを利用した薬物設計を用いて、標的分子に対する高親和性リガンドを設計する
ことができる。
【０００６】
また、本発明は、既知の分子量を有する化合物の混合物を調製し、この混合物
を標的分子とインキュベートして、結合した化合物-標的複合体の形成を可能に
することからなる、標的分子に対する向上した親和性を有するリガンドを設計す
る方法を提供する。化合物-標的複合体を非結合化合物から分離し、化合物-標的
複合体について質量スペクトル分析を行って、分子量に基づいて結合した化合物
の正体を決定する。標的分子に結合した同定された化合物の複合体を調製し、Ｎ
ＭＲを行う。標的分子に結合した同定された化合物の複合体のＮＭＲシフト摂動
を分析して、標的分子上における化合物の結合部位を同定し、同定された化合物
の化学構造および標的分子の同定された結合部位に基づいて既知の分子量を有す
る構造類似体のライブラリーを設計する。構造類似体のライブラリーを調製し、
標的分子に対する構造類似体の結合を決定する。
を標的分子とインキュベートして、結合した化合物-標的複合体の形成を可能に
することからなる、標的分子に対する向上した親和性を有するリガンドを設計す
る方法を提供する。化合物-標的複合体を非結合化合物から分離し、化合物-標的
複合体について質量スペクトル分析を行って、分子量に基づいて結合した化合物
の正体を決定する。標的分子に結合した同定された化合物の複合体を調製し、Ｎ
ＭＲを行う。標的分子に結合した同定された化合物の複合体のＮＭＲシフト摂動
を分析して、標的分子上における化合物の結合部位を同定し、同定された化合物
の化学構造および標的分子の同定された結合部位に基づいて既知の分子量を有す
る構造類似体のライブラリーを設計する。構造類似体のライブラリーを調製し、
標的分子に対する構造類似体の結合を決定する。
【０００７】
さらに、本発明によれば、化合物(各化合物は既知の分子量を有する)の混合物
を調製し、この混合物を標的分子とインキュベートして、結合した化合物-標的
複合体の形成を可能にすることにより、標的分子に対する高親和性リガンドを設
計する方法が提供される。質量スペクトル分析を行って、結合した化合物を同定
する。標的分子に結合した同定された化合物の複合体を調製し、標的分子に結合
した同定された化合物の複合体のＮＭＲシフト摂動を分析して、標的分子上に少
なくとも２つの異なる結合部位を有する少なくとも２つの化合物を同定する。標
的分子上におけるこれら化合物の空間的配向を決定し、少なくとも２つの同定さ
れた化合物の構造情報を用いて、同定された部位で結合し、決定された空間的配
向に最少限の影響しか与えないリガンドを設計する。連結は分子モデリングまた
は化学結合のいずれによるものであってもよい。
を調製し、この混合物を標的分子とインキュベートして、結合した化合物-標的
複合体の形成を可能にすることにより、標的分子に対する高親和性リガンドを設
計する方法が提供される。質量スペクトル分析を行って、結合した化合物を同定
する。標的分子に結合した同定された化合物の複合体を調製し、標的分子に結合
した同定された化合物の複合体のＮＭＲシフト摂動を分析して、標的分子上に少
なくとも２つの異なる結合部位を有する少なくとも２つの化合物を同定する。標
的分子上におけるこれら化合物の空間的配向を決定し、少なくとも２つの同定さ
れた化合物の構造情報を用いて、同定された部位で結合し、決定された空間的配
向に最少限の影響しか与えないリガンドを設計する。連結は分子モデリングまた
は化学結合のいずれによるものであってもよい。
【０００８】
発明の詳細な説明
本発明は、化合物をスクリーニングして、標的分子に特異的に結合する化合物
を同定し、かつ結合の部位を同定する方法を提供する。また、本発明は、所定の
標的分子に対するリガンドを設計する迅速で効率的な方法を提供する。
を同定し、かつ結合の部位を同定する方法を提供する。また、本発明は、所定の
標的分子に対するリガンドを設計する迅速で効率的な方法を提供する。
【０００９】
本発明の方法によれば、リガンドまたは化合物(例えば、小さい分子)の混合物
が調製される。リガンドは、例えば、商業的な起源に由来するものや、既存の化
学ライブラリーに由来するものであっても、必要に従って、例えば、従来の構造
と活性との関係に関する情報に基づいて調製してもよい。各混合物は、一群のリ
ガンド(各々は既知の分子量を有する)からなる。本発明のいくつかの好ましい具
体例では、各リガンドは、独自の分子量(好ましくは、混合物の他のリガンドと
３Ｄａ以上異なり、各成分の明確な同定を可能にする)を有する。本発明のいく
つかの態様では、各リガンドの分子量は、好ましくは２０００未満であり、１個
またはそれ以上の化合物の結合が予想される場合には、分子量は約３５０未満で
あることがより好ましい。分子量に加えて、リガンドは、例えば、化合物の酸性
度、反応性、形状および官能基に基づいて選択してもよい。ライブラリーの多様
性は、一般に好ましい。リガンド濃度は、混合物を形成するリガンドの数に依存
して変化する。一般に、化合物の混合物は、少なくとも約０.１ｎＭのスクリー
ニングすべき各化合物、より好ましくは少なくとも約１ｎＭの各化合物からなる
。
が調製される。リガンドは、例えば、商業的な起源に由来するものや、既存の化
学ライブラリーに由来するものであっても、必要に従って、例えば、従来の構造
と活性との関係に関する情報に基づいて調製してもよい。各混合物は、一群のリ
ガンド(各々は既知の分子量を有する)からなる。本発明のいくつかの好ましい具
体例では、各リガンドは、独自の分子量(好ましくは、混合物の他のリガンドと
３Ｄａ以上異なり、各成分の明確な同定を可能にする)を有する。本発明のいく
つかの態様では、各リガンドの分子量は、好ましくは２０００未満であり、１個
またはそれ以上の化合物の結合が予想される場合には、分子量は約３５０未満で
あることがより好ましい。分子量に加えて、リガンドは、例えば、化合物の酸性
度、反応性、形状および官能基に基づいて選択してもよい。ライブラリーの多様
性は、一般に好ましい。リガンド濃度は、混合物を形成するリガンドの数に依存
して変化する。一般に、化合物の混合物は、少なくとも約０.１ｎＭのスクリー
ニングすべき各化合物、より好ましくは少なくとも約１ｎＭの各化合物からなる
。
【００１０】
化合物の混合物は、標的分子(例えば、タンパク、核酸など)とインキュベート
される。標的分子は、商業的な起源から得てもよいし、天然の起源から精製して
もよいし、また、組換え的に調製してもよい。一般に、インキュベーション混合
物は、少なくとも約１０μＭの標的分子を含有し、好ましくは約５０μＭ〜約２
００μＭ、最も好ましくは約１００μＭである。
される。標的分子は、商業的な起源から得てもよいし、天然の起源から精製して
もよいし、また、組換え的に調製してもよい。一般に、インキュベーション混合
物は、少なくとも約１０μＭの標的分子を含有し、好ましくは約５０μＭ〜約２
００μＭ、最も好ましくは約１００μＭである。
【００１１】
結合した化合物-標的分子の複合体は、混合物を、例えば、吸引濾過または遠
心分離でサイズ排除カラムにかけることにより、非結合化合物から分離される。
ゲル浸透クロマトグラフィー(ＧＰＣ)スピンカラムなどのかかるクロマトグラフ
ィー技術は、ジャーナル・オブ・マス・スペクトロメトリー(J. Mass. Spect.),
33:264-273(1998)(出典を示すことにより本明細書の一部をなす)に記載されてい
る。サイズ排除クロマトグラフィーは、低分子量の化合物はカラムに保持され、
高分子量の化合物はカラムを通過するという前提に基づいている。かくして、カ
ラムから溶出する化合物は、標的分子に結合されるはずであり、かくして標的を
含む生物学的アッセイにおいて活性である可能性が非常に高い。
心分離でサイズ排除カラムにかけることにより、非結合化合物から分離される。
ゲル浸透クロマトグラフィー(ＧＰＣ)スピンカラムなどのかかるクロマトグラフ
ィー技術は、ジャーナル・オブ・マス・スペクトロメトリー(J. Mass. Spect.),
33:264-273(1998)(出典を示すことにより本明細書の一部をなす)に記載されてい
る。サイズ排除クロマトグラフィーは、低分子量の化合物はカラムに保持され、
高分子量の化合物はカラムを通過するという前提に基づいている。かくして、カ
ラムから溶出する化合物は、標的分子に結合されるはずであり、かくして標的を
含む生物学的アッセイにおいて活性である可能性が非常に高い。
【００１２】
混合物由来の化合物は、いったん標的分子に結合すれば、混合物中の化合物の
分子量範囲で濾液について行われる質量分析法により決定されるその分子量に基
づいて、容易に同定しうる。混合物中の各化合物について、分子量は既知である
ので、質量分析器のイオンピークの観察は、的中物の存在および化合物の正体を
同時に同定する。本発明の好ましい具体例では、混合物の化合物の各々は、独自
の分子量を有する。混合物から候補物を同定する標的特異的なアッセイは回避さ
れ、このことは容易な自動化を可能にする。加えて、デコンボルーションは一般
に回避される。デコンボルーションが必要な場合、例えば、的中物の分子量が混
合物の１個より多くの化合物またはその断片に対応する場合には、それは一般に
限られた範囲内であり、迅速に行うことができる。
分子量範囲で濾液について行われる質量分析法により決定されるその分子量に基
づいて、容易に同定しうる。混合物中の各化合物について、分子量は既知である
ので、質量分析器のイオンピークの観察は、的中物の存在および化合物の正体を
同時に同定する。本発明の好ましい具体例では、混合物の化合物の各々は、独自
の分子量を有する。混合物から候補物を同定する標的特異的なアッセイは回避さ
れ、このことは容易な自動化を可能にする。加えて、デコンボルーションは一般
に回避される。デコンボルーションが必要な場合、例えば、的中物の分子量が混
合物の１個より多くの化合物またはその断片に対応する場合には、それは一般に
限られた範囲内であり、迅速に行うことができる。
【００１３】
本発明のいくつかの好ましい具体例では、サイズ排除カラムは、低分子量の化
合物(例えば、２０００ＭＷ未満のもの)を保持する一方、高分子量の化合物はカ
ラムを通過させる、セファデックス(Sephadex)Ｇ２５樹脂(ファルマシア(Pharma
cia))などのサイズ排除樹脂を用いて調製することができる。樹脂は、例えば、
使い捨ての注射器または、より好ましくは、低タンパク結合フィルター(例えば
、親水性デュラポア(durapore)フィルターまたはシラン化ガラスウール)を含有
する９６ウェル濾過プレートを用いて調製した個々のカラムに詰めることができ
る。９６ウェルプレートの小さいカラム長さは、試料の必要量を最少限にし、Ｍ
Ｓの高感度ゆえに、各試料についてピコモルの標的タンパクが必要なだけである
。タンパク-化合物の混合物は、数多くの条件下で(ここで、緩衝液の条件、混合
物における化合物の数、およびタンパク-化合物のモル比は変化しうる)、サイズ
排除カラムにかけることができる。カラムからの濾液は、樹脂を充填した９６ウ
ェル濾過プレートの遠心分離または吸引濾過のいずれかにより、標準的な９６ウ
ェルプレートに採取する。この技術は、弱いタンパク-薬物の相互作用に敏感で
ある。
合物(例えば、２０００ＭＷ未満のもの)を保持する一方、高分子量の化合物はカ
ラムを通過させる、セファデックス(Sephadex)Ｇ２５樹脂(ファルマシア(Pharma
cia))などのサイズ排除樹脂を用いて調製することができる。樹脂は、例えば、
使い捨ての注射器または、より好ましくは、低タンパク結合フィルター(例えば
、親水性デュラポア(durapore)フィルターまたはシラン化ガラスウール)を含有
する９６ウェル濾過プレートを用いて調製した個々のカラムに詰めることができ
る。９６ウェルプレートの小さいカラム長さは、試料の必要量を最少限にし、Ｍ
Ｓの高感度ゆえに、各試料についてピコモルの標的タンパクが必要なだけである
。タンパク-化合物の混合物は、数多くの条件下で(ここで、緩衝液の条件、混合
物における化合物の数、およびタンパク-化合物のモル比は変化しうる)、サイズ
排除カラムにかけることができる。カラムからの濾液は、樹脂を充填した９６ウ
ェル濾過プレートの遠心分離または吸引濾過のいずれかにより、標準的な９６ウ
ェルプレートに採取する。この技術は、弱いタンパク-薬物の相互作用に敏感で
ある。
【００１４】
質量スペクトル分析は、結合した化合物および非結合化合物を分離することな
く、混合物について行えばよい。質量スペクトル分析は、例えば、正および負の
イオン化モードの両方で、エレクトロスプレーイオン化(ＥＳＩ)ＭＳ法を用いて
行う。バックグラウンドノイズは、独自の分子イオンピークから区別し、結合し
た化合物の正体につながる分子量を、標的分子の重量と、独自の化学物質に対応
するピークに相関する複合体の重量との差に基づいて決定する。あるいは、マト
リックス支援レーザー脱離/イオン化ＭＡＬＤＩ/ＭＳを用いることができる。
く、混合物について行えばよい。質量スペクトル分析は、例えば、正および負の
イオン化モードの両方で、エレクトロスプレーイオン化(ＥＳＩ)ＭＳ法を用いて
行う。バックグラウンドノイズは、独自の分子イオンピークから区別し、結合し
た化合物の正体につながる分子量を、標的分子の重量と、独自の化学物質に対応
するピークに相関する複合体の重量との差に基づいて決定する。あるいは、マト
リックス支援レーザー脱離/イオン化ＭＡＬＤＩ/ＭＳを用いることができる。
【００１５】
これらの工程は、ロボット工学を用いて、容易に自動化することができる。例
えば、ギルソン(Gilson)２１５液体ハンドラーを用いて、濾液を９６ウェルプレ
ートから質量分析器に移送してもよい。
えば、ギルソン(Gilson)２１５液体ハンドラーを用いて、濾液を９６ウェルプレ
ートから質量分析器に移送してもよい。
【００１６】
いったん標的に結合する化合物(リガンド)の正体が分かれば、ＮＭＲ分光学を
用いて、例えば、標的の構造上にＮＭＲ化学シフト摂動をマッピングすることに
より、特異的な結合部位を決定すればよい。標的の３次元構造は、標準的なＸ線
、ＮＭＲまたは相同性モデリング技術、および標準的なＮＭＲプロトコルからの
ＮＭＲ共鳴の帰属から得ればよい。化学シフト摂動は、遊離の標的のＮＭＲスペ
クトルを、同定されたリガンドと複合体化した標的のＮＭＲスペクトルと比較す
ることにより得ればよい。ここで、ＮＭＲスペクトルは、１５Ｎ-濃縮または１
３Ｃ/１５Ｎ-濃縮したタンパクまたは標的を用いた標準的な２Ｄ １Ｈ-１５Ｎ
ＨＳＱＣ、２Ｄ １Ｈ-１３Ｃ ＨＳＱＣ、２Ｄ １Ｈ-１５Ｎ ＨＭＱＣまたは２Ｄ
１Ｈ-１３Ｃ ＨＭＱＣ実験に対応しうる。リガンドの存在下で化学シフト摂動
を示す標的について観察されたＮＭＲ共鳴は、遊離の標的についてのＮＭＲ共鳴
の帰属を利用することにより、標的中の残基に帰属される。次いで、リガンドの
存在下で化学シフト摂動を経験する標的中の残基は、標的の構造上にマッピング
され、標的上のリガンドの結合部位を明確にする。濃縮された標的分子を用いて
もよく、好ましくはポリペプチドが標的として役立つ。標的分子は、当該分野で
公知の方法を用いて、１３Ｃまたは１５Ｎで標識することができる。好ましい具
体例では、標的分子は、形質転換された宿主細胞を用いて、組換え体に調製され
る。ＮＭＲ化学シフト摂動と薬物設計用の分子断片の連結とを利用する「ＮＭＲ
によるＳＡＲ」法は、国際特許出願公開番号第WO 97/18469号および第WO 97/184
71号に開示され、サイエンス(Science),274:1531-1534(1996)；JACS 119:5818-5
827(1997)およびジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー(J. Med. Chem
.),40:3144-3150(1997)に公表されている。
用いて、例えば、標的の構造上にＮＭＲ化学シフト摂動をマッピングすることに
より、特異的な結合部位を決定すればよい。標的の３次元構造は、標準的なＸ線
、ＮＭＲまたは相同性モデリング技術、および標準的なＮＭＲプロトコルからの
ＮＭＲ共鳴の帰属から得ればよい。化学シフト摂動は、遊離の標的のＮＭＲスペ
クトルを、同定されたリガンドと複合体化した標的のＮＭＲスペクトルと比較す
ることにより得ればよい。ここで、ＮＭＲスペクトルは、１５Ｎ-濃縮または１
３Ｃ/１５Ｎ-濃縮したタンパクまたは標的を用いた標準的な２Ｄ １Ｈ-１５Ｎ
ＨＳＱＣ、２Ｄ １Ｈ-１３Ｃ ＨＳＱＣ、２Ｄ １Ｈ-１５Ｎ ＨＭＱＣまたは２Ｄ
１Ｈ-１３Ｃ ＨＭＱＣ実験に対応しうる。リガンドの存在下で化学シフト摂動
を示す標的について観察されたＮＭＲ共鳴は、遊離の標的についてのＮＭＲ共鳴
の帰属を利用することにより、標的中の残基に帰属される。次いで、リガンドの
存在下で化学シフト摂動を経験する標的中の残基は、標的の構造上にマッピング
され、標的上のリガンドの結合部位を明確にする。濃縮された標的分子を用いて
もよく、好ましくはポリペプチドが標的として役立つ。標的分子は、当該分野で
公知の方法を用いて、１３Ｃまたは１５Ｎで標識することができる。好ましい具
体例では、標的分子は、形質転換された宿主細胞を用いて、組換え体に調製され
る。ＮＭＲ化学シフト摂動と薬物設計用の分子断片の連結とを利用する「ＮＭＲ
によるＳＡＲ」法は、国際特許出願公開番号第WO 97/18469号および第WO 97/184
71号に開示され、サイエンス(Science),274:1531-1534(1996)；JACS 119:5818-5
827(1997)およびジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー(J. Med. Chem
.),40:3144-3150(1997)に公表されている。
【００１７】
適当量の均一に標識されたポリペプチドを調製する好ましい手段は、宿主細胞
を、このポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターで
形質転換し、形質転換された細胞を、同化可能な起源の放射標識を含有する培地
中で培養することである。かかる起源は、当該分野で公知である。例えば、１５ ＮＨ４Ｃｌ、１３Ｃグルコースまたは(１５ＮＨ４)２ＳＯ４を用いればよい。
を、このポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターで
形質転換し、形質転換された細胞を、同化可能な起源の放射標識を含有する培地
中で培養することである。かかる起源は、当該分野で公知である。例えば、１５ ＮＨ４Ｃｌ、１３Ｃグルコースまたは(１５ＮＨ４)２ＳＯ４を用いればよい。
【００１８】
特定のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターを
調製する手段は、宿主細胞をベクターで形質転換し、それらの形質転換された細
胞をポリペプチドが発現されるように培養する手段として、当該分野で公知であ
る。
調製する手段は、宿主細胞をベクターで形質転換し、それらの形質転換された細
胞をポリペプチドが発現されるように培養する手段として、当該分野で公知であ
る。
【００１９】
ＮＭＲ化学シフト摂動からタンパクおよび化合物の構造ならびに化合物の結合
部位の一般的な位置が与えられたなら、標準的なモデリング技術を用いて、複合
体のコンピューターモデルを定義する。得られた複合体のコンピューターモデル
は、予測された短い(＜５Å)水素対の距離と複合体のＮＭＲスペクトルおよび/
または複合体のＸ線構造において観察されたＮＯＥとの間の整合性により確認す
ればよい。
部位の一般的な位置が与えられたなら、標準的なモデリング技術を用いて、複合
体のコンピューターモデルを定義する。得られた複合体のコンピューターモデル
は、予測された短い(＜５Å)水素対の距離と複合体のＮＭＲスペクトルおよび/
または複合体のＸ線構造において観察されたＮＯＥとの間の整合性により確認す
ればよい。
【００２０】
タンパクに対する化合物の親和性(Ｋｄおよび/またはＩＣ５０)は、様々な許
容された技術から決定することができる。かかる技術としては、ＮＭＲ拡散係数
の変化または化学シフト摂動からのＫｄ測定、および/または、的中物の生物学
的関連性を決定するタンパク標的に特異的な生物学的アッセイからのＩＣ５０決
定が挙げられる。
容された技術から決定することができる。かかる技術としては、ＮＭＲ拡散係数
の変化または化学シフト摂動からのＫｄ測定、および/または、的中物の生物学
的関連性を決定するタンパク標的に特異的な生物学的アッセイからのＩＣ５０決
定が挙げられる。
【００２１】
独自の結合部位を有する１個より多くのリガンドが同定されれば、標的に関連
する、ならびに相互に関連するリガンドの３次元構造および空間配向を決定すれ
ばよい。標的分子に対する各リガンドの空間的配向は、標的中の原子に極めて接
近して存在するリガンドの部分、ならびに結合部位中の原子から遠く離れて存在
し、かつ本来の位置で他の分子との相互作用に関係しうる部分の同定を可能にす
る。
する、ならびに相互に関連するリガンドの３次元構造および空間配向を決定すれ
ばよい。標的分子に対する各リガンドの空間的配向は、標的中の原子に極めて接
近して存在するリガンドの部分、ならびに結合部位中の原子から遠く離れて存在
し、かつ本来の位置で他の分子との相互作用に関係しうる部分の同定を可能にす
る。
【００２２】
いったん特異的な結合部位が同定されれば、当該分野で公知の数多くの方法の
うちのいずれか１つを用いて、３次元モデルを生成させればよい。かかる方法と
しては、相同性モデリング、ならびに結晶学的または分光学的な技術を用いて生
成された未加工の構造座標データのコンピューター分析が挙げられるが、これら
に限定されない。かかる３次元モデルを生成させるのに、および/または必要な
フィッティング分析を行うのに用いられるコンピュータープログラムとしては、
ＧＲＩＤ(オックスフォード大学、オックスフォード、英国)、ＭＣＳＳ(モレキ
ュラー・シミュレーションズ(Molecular Simulations)、サンディエゴ、カリフ
ォルニア州)、ＡＵＴＯＤＯＣＫ(スクリップス・リサーチ・インスティチュート
(Scripps Research Institute)、ラ・ホーヤ、カリフォルニア州)、ＤＯＣＫ(カ
リフォルニア大学、サンフランシスコ、カリフォルニア州)、Ｆｌｏ９９(シスル
ソフト(Thislesoft)、モリス・タウンシップ、ニュージャージー州)、Ｌｕｄｉ(
モレキュラー・シュミレーションズ(Molecular Simulations)、サンディエゴ、
カリフォルニア州)、ＱＵＡＮＴＡ(モレキュラー・シュミレーションズ(Molecul
ar Simulations)、サンディエゴ、カリフォルニア州)、Ｉｎｓｉｇｈｔ(モレキ
ュラー・シュミレーションズ(Molecular Simulations)、サンディエゴ、カリフ
ォルニア州)、ＳＹＢＹＬ(トリポス，インク(TRIPOS, Inc.)、セントルイス、ミ
ズーリ州)、およびＬＥＡＰＦＲＯＧ(トリポス，インク(TRIPOS, Inc.)、セント
ルイス、ミズーリ州)が挙げられるが、これらに限定されない。
うちのいずれか１つを用いて、３次元モデルを生成させればよい。かかる方法と
しては、相同性モデリング、ならびに結晶学的または分光学的な技術を用いて生
成された未加工の構造座標データのコンピューター分析が挙げられるが、これら
に限定されない。かかる３次元モデルを生成させるのに、および/または必要な
フィッティング分析を行うのに用いられるコンピュータープログラムとしては、
ＧＲＩＤ(オックスフォード大学、オックスフォード、英国)、ＭＣＳＳ(モレキ
ュラー・シミュレーションズ(Molecular Simulations)、サンディエゴ、カリフ
ォルニア州)、ＡＵＴＯＤＯＣＫ(スクリップス・リサーチ・インスティチュート
(Scripps Research Institute)、ラ・ホーヤ、カリフォルニア州)、ＤＯＣＫ(カ
リフォルニア大学、サンフランシスコ、カリフォルニア州)、Ｆｌｏ９９(シスル
ソフト(Thislesoft)、モリス・タウンシップ、ニュージャージー州)、Ｌｕｄｉ(
モレキュラー・シュミレーションズ(Molecular Simulations)、サンディエゴ、
カリフォルニア州)、ＱＵＡＮＴＡ(モレキュラー・シュミレーションズ(Molecul
ar Simulations)、サンディエゴ、カリフォルニア州)、Ｉｎｓｉｇｈｔ(モレキ
ュラー・シュミレーションズ(Molecular Simulations)、サンディエゴ、カリフ
ォルニア州)、ＳＹＢＹＬ(トリポス，インク(TRIPOS, Inc.)、セントルイス、ミ
ズーリ州)、およびＬＥＡＰＦＲＯＧ(トリポス，インク(TRIPOS, Inc.)、セント
ルイス、ミズーリ州)が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２３】
これらおよび他のコンピュータープログラムは、当業者に公知である。いった
ん関連するデータがかかるプログラムにより分析されれば、候補のリガンドを同
定し、調製し、標的に結合するそれらの能力について、およびその生物学的活性
について試験することができる。
ん関連するデータがかかるプログラムにより分析されれば、候補のリガンドを同
定し、調製し、標的に結合するそれらの能力について、およびその生物学的活性
について試験することができる。
【００２４】
次いで、標的分子に結合する同定されたリガンドは、生物学的な系で試験して
、生物学的な活性が観察された結合と相関することを確認すればよい。伝統的な
系では、化学的な手掛かりの有効性に関する最初の順位を与える生物学的アッセ
イから各リガンドについてＩＣ５０値が得られる。フォロー・アップとして、Ｎ
ＭＲ滴定データまたは様々な他の分析技術からＫｄ値を得てもよい。本発明は、
これらの典型的な工程を逆にし、それにより標準的な生物学的アッセイを高速大
量処理フォーマットに変換する必要性が解消される。むしろ、標準的なアッセイ
を変換する必要がないように、手掛かりの数が減少する。
、生物学的な活性が観察された結合と相関することを確認すればよい。伝統的な
系では、化学的な手掛かりの有効性に関する最初の順位を与える生物学的アッセ
イから各リガンドについてＩＣ５０値が得られる。フォロー・アップとして、Ｎ
ＭＲ滴定データまたは様々な他の分析技術からＫｄ値を得てもよい。本発明は、
これらの典型的な工程を逆にし、それにより標準的な生物学的アッセイを高速大
量処理フォーマットに変換する必要性が解消される。むしろ、標準的なアッセイ
を変換する必要がないように、手掛かりの数が減少する。
【００２５】
生物学的な活性の確認に続いて、タンパク-リガンド複合体の正確な構造をＮ
ＭＲ、Ｘ線および/またはモデリングにより明らかにすればよい。
ＭＲ、Ｘ線および/またはモデリングにより明らかにすればよい。
【００２６】
さらに、最初の手掛かりに基づいて、構造類似体のライブラリーを調製し、本
発明に従って、結合について試験し、それにより、リガンドの親和性および活性
をさらに最適化すればよい。例えば、構造類似体を与える公知の化学的な原理に
従って、結合部位における相互作用の点に基づいて、手掛かりの化合物を分子中
の１またはそれ以上の位置で誘導体化すればよい。これらの目的には、組み合わ
せ合成法が特に有用でありうる。加えて、独自の結合部位を有する１個より多く
のリガンドを同定する場合には、この結合部位を有するリガンドの空間的配向を
用いて、新しい高親和性リガンドを設計することができる。新しいリガンドは、
モデリング技術により、または２つの化合物の化学結合により、設計することが
できる。このようにして、標的に対する所定の親和性を有する２個またはそれ以
上の化合物を連結させて、標的に対する向上した親和性を有する化合物を得れば
よい。リンカーの設計は、リガンドの各々が標的に対して適切な配向を維持する
のに必要な距離および角度の配向に基づいている。適当なリンカーは公知であり
、当業者により容易に同定することができる。ジャーナル・オブ・コンピュータ
ー・エイディッド・モレキュラー・デザイン(J. of Computer Aided Molecular
Design),6:61-78(1992)、パースペクティブズ・イン・ドラッグ・ディスカバリ
ー・アンド・デザイン(Perspectives in Drug Discovery and Design),3:21-33(
1995)、ジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー(J. Med. Chem.),27(5)
,557-563(1984)、サイエンス(Science),263:380-384(1994)。
発明に従って、結合について試験し、それにより、リガンドの親和性および活性
をさらに最適化すればよい。例えば、構造類似体を与える公知の化学的な原理に
従って、結合部位における相互作用の点に基づいて、手掛かりの化合物を分子中
の１またはそれ以上の位置で誘導体化すればよい。これらの目的には、組み合わ
せ合成法が特に有用でありうる。加えて、独自の結合部位を有する１個より多く
のリガンドを同定する場合には、この結合部位を有するリガンドの空間的配向を
用いて、新しい高親和性リガンドを設計することができる。新しいリガンドは、
モデリング技術により、または２つの化合物の化学結合により、設計することが
できる。このようにして、標的に対する所定の親和性を有する２個またはそれ以
上の化合物を連結させて、標的に対する向上した親和性を有する化合物を得れば
よい。リンカーの設計は、リガンドの各々が標的に対して適切な配向を維持する
のに必要な距離および角度の配向に基づいている。適当なリンカーは公知であり
、当業者により容易に同定することができる。ジャーナル・オブ・コンピュータ
ー・エイディッド・モレキュラー・デザイン(J. of Computer Aided Molecular
Design),6:61-78(1992)、パースペクティブズ・イン・ドラッグ・ディスカバリ
ー・アンド・デザイン(Perspectives in Drug Discovery and Design),3:21-33(
1995)、ジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー(J. Med. Chem.),27(5)
,557-563(1984)、サイエンス(Science),263:380-384(1994)。
【００２７】
以下の実施例は、所定の標的ＭＭＰ-１に対してすでに試験された化合物を採
用することにより、本発明の方法の有効性を例示することを意図されている。こ
れらの実施例は、本発明の限定であることを意図されていない。
用することにより、本発明の方法の有効性を例示することを意図されている。こ
れらの実施例は、本発明の限定であることを意図されていない。
【００２８】
実施例
実施例１
ＭＭＰ-１に対して既知の親和性を有する化合物を選択した。これらの化合物
を表１に示す。
を表１に示す。
【００２９】
【表１】
【００３０】
【表２】
【００３１】
実施例２
タンパク-単一化合物インキュベーション
化合物１、２および３(表１)の各１ｍＭをＤＭＳＯに溶解し、各々を、２０ｍ
Ｍトリス、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ２、０.１ｍＭ ＺｎＣｌ２、
２ｍＭ ＮａＮ３および３.５ｍＭ ＤＴＴを含有する緩衝液(ｐＨ６.５)中、単独
または０.１ｍＭのＭＭＰ-１の存在下、室温で３０分間インキュベートした。Ｍ
ＭＰ-１：化合物の混合物中におけるＤＭＳＯの最終濃度は５％であった。各試
料の全容量２５μｌを０.６５μｍ親水性デュラポア(durapore)フィルターから
なるミリポア(Millipore)マルチスクリーン濾過システムのセファデックス(Seph
adex)Ｇ２５カラムにかけた。遠心分離(１５,０００×ｇ、３分間)を用いて、こ
れらの試料を溶離させた。試料を採取し、各々ギルソン(Gilson)２１５液体ハン
ドラーを装備したマイクロマス(Micromass)ＬＣＴ四重極飛行時間型質量分析計
およびクアトロ(Quattro)Ｉ三連四重極質量分析計により、正および負のイオン
化モードの両方で自動化ＥＳＩ/ＭＳ法を用いて、質量分析法で分析した。図１
の結果は、ＭＭＰ-１に結合した化合物が溶出される一方(図１Ａ(化合物１＋Ｍ
ＭＰ-１)、１Ｃ(化合物２＋ＭＭＰ-１)および１Ｅ(化合物３＋ＭＭＰ-１))、非
結合化合物が保持されることを示す(図１Ｂ(化合物１)、１Ｄ(化合物２)および
１Ｆ(化合物３))。
Ｍトリス、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ２、０.１ｍＭ ＺｎＣｌ２、
２ｍＭ ＮａＮ３および３.５ｍＭ ＤＴＴを含有する緩衝液(ｐＨ６.５)中、単独
または０.１ｍＭのＭＭＰ-１の存在下、室温で３０分間インキュベートした。Ｍ
ＭＰ-１：化合物の混合物中におけるＤＭＳＯの最終濃度は５％であった。各試
料の全容量２５μｌを０.６５μｍ親水性デュラポア(durapore)フィルターから
なるミリポア(Millipore)マルチスクリーン濾過システムのセファデックス(Seph
adex)Ｇ２５カラムにかけた。遠心分離(１５,０００×ｇ、３分間)を用いて、こ
れらの試料を溶離させた。試料を採取し、各々ギルソン(Gilson)２１５液体ハン
ドラーを装備したマイクロマス(Micromass)ＬＣＴ四重極飛行時間型質量分析計
およびクアトロ(Quattro)Ｉ三連四重極質量分析計により、正および負のイオン
化モードの両方で自動化ＥＳＩ/ＭＳ法を用いて、質量分析法で分析した。図１
の結果は、ＭＭＰ-１に結合した化合物が溶出される一方(図１Ａ(化合物１＋Ｍ
ＭＰ-１)、１Ｃ(化合物２＋ＭＭＰ-１)および１Ｅ(化合物３＋ＭＭＰ-１))、非
結合化合物が保持されることを示す(図１Ｂ(化合物１)、１Ｄ(化合物２)および
１Ｆ(化合物３))。
【００３２】
実施例３
滴定
実施例２に記載したように、増大する量の化合物２を単独または増大する量の
ＭＭＰ-１とインキュベートした。図２Ａ〜Ｅは、これら濾液のＥＳＩ(正イオン
化)質量スペクトル分析を与える。
ＭＭＰ-１とインキュベートした。図２Ａ〜Ｅは、これら濾液のＥＳＩ(正イオン
化)質量スペクトル分析を与える。
【００３３】
【表３】
【００３４】
図２は、[Ｍ＋Ｈ]１＋(ｍ/ｚ)４５７.９イオンの相対強度がＭＭＰ-１濃度の
増大と相関することを示す。
増大と相関することを示す。
【００３５】
実施例４
タンパク-混合物のインキュベーション
各々およその濃度１ｍＭで与えられた実施例１に記載した１０個の化合物の混
合物をＤＭＳＯに溶解した。このリガンド混合物を、２０ｍＭトリス、１００ｍ
Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ２、０.１ｍＭ ＺｎＣｌ２、２ｍＭ ＮａＮ３お
よび３.５ｍＭ ＤＴＴからなる緩衝液(ｐＨ６.５)中、単独または濃度０.１ｍＭ
のＭＭＰ-１と共に、室温で３０分間インキュベートした。ＭＭＰ-１：化合物の
混合物におけるＤＭＳＯの最終濃度は５％であった。
合物をＤＭＳＯに溶解した。このリガンド混合物を、２０ｍＭトリス、１００ｍ
Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ２、０.１ｍＭ ＺｎＣｌ２、２ｍＭ ＮａＮ３お
よび３.５ｍＭ ＤＴＴからなる緩衝液(ｐＨ６.５)中、単独または濃度０.１ｍＭ
のＭＭＰ-１と共に、室温で３０分間インキュベートした。ＭＭＰ-１：化合物の
混合物におけるＤＭＳＯの最終濃度は５％であった。
【００３６】
実施例５
ゲル濾過/質量分析法・試料の採取
全容量２５μｌのＭＭＰ-１-化合物の混合物を０.６５μｍの親水性デュラポ
ア(durapore)フィルターからなるミリポア(Millipore)マルチスクリーン濾過シ
ステムのセファデックス(Sephadex)Ｇ２５カラムにかける。遠心分離(１５,００
０×ｇ、３分間)を用いて、試料を溶出させた。試料を採取し、各々ギルソン(Gi
lson)２１５液体ハンドラーを装備したマイクロマス(Micromass)ＬＣＴ四重極飛
行時間型質量分析計およびクアトロ(Quattro)Ｉ三連四重極質量分析計により、
正および負のイオン化モードの両方で自動化ＥＳＩ/ＭＳ法を用いて、質量分析
法で分析した。結果を図３Ａ(ＭＭＰ-１を含む)およびＢ(ＭＭＰ-１を含まない)
に示す。１０個の化合物の質量イオンはスペクトル上で強調表示されている。
ア(durapore)フィルターからなるミリポア(Millipore)マルチスクリーン濾過シ
ステムのセファデックス(Sephadex)Ｇ２５カラムにかける。遠心分離(１５,００
０×ｇ、３分間)を用いて、試料を溶出させた。試料を採取し、各々ギルソン(Gi
lson)２１５液体ハンドラーを装備したマイクロマス(Micromass)ＬＣＴ四重極飛
行時間型質量分析計およびクアトロ(Quattro)Ｉ三連四重極質量分析計により、
正および負のイオン化モードの両方で自動化ＥＳＩ/ＭＳ法を用いて、質量分析
法で分析した。結果を図３Ａ(ＭＭＰ-１を含む)およびＢ(ＭＭＰ-１を含まない)
に示す。１０個の化合物の質量イオンはスペクトル上で強調表示されている。
【００３７】
ＭＳ的中物のＮＭＲ分析
ＭＭＰ-１をモイ(Moy)、ジャーナル・オブ・バイオモレキュラー・エヌ・エム
・アール(J. Biomol. NMR)、第10巻：9-19(1997)に記載されているように標識し
た。化合物１、２および３を実施例５から選択した。勾配強化２Ｄ １Ｈ-１５Ｎ
ＨＳＱＣスペクトルを、９０％Ｈ２Ｏおよび１０％Ｄ２Ｏ中における２０ｍＭ
トリス、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ２、０.１ｍＭ ＺｎＣｌ２、２
ｍＭ ＮａＮ３および３.５ｍＭ ＤＴＴからなる緩衝液(ｐＨ６.５)中の０.２ｍ
Ｍ １５Ｎ-ＭＭＰ-１について、３５℃で採取した。化合物は０.２〜４.０ｍＭ
の範囲内の化合物１、２および３の濃度を達成するように滴定した。２Ｄ １Ｈ- １５ Ｎ ＨＳＱＣスペクトルは、ｔ１に２５６複素点(complex point)、ｔ２に２
０４８実点(real point)、および増分あたり１９２スキャンで記録した。ｔ１お
よびｔ２のスペクトル・ウィンドウは、それぞれ１７２３.７および８０６４.５
Ｈｚであり、キャリアーは、それぞれ４.７５および１１５.２ｐｐｍであった。
データは、サン(Sun)のウルトラ(Ultra)１０ワークステーション上におけるＮＭ
ＲＰｉｐｅ、ＮＭＲＷｉｓｈ[エフ・デラグリオ(F. Delaglio)、エス・グルチェ
シエク(S. Grzesiek)、ジー・ダブリュー・ビュイスター(G.W. Vuister)、ジー
・ジュー(G. Zhu)、ジェイ・ファイファー(J. Pfeifer)およびエイ・バックス(A
. Bax)、ジャーナル・オブ・バイオモレキュラー・エヌ・エム・アール(J. Biom
ol. NMR),6,277(1995)]およびＰＩＰＰ[ディー・エス・ギャレット(D.S. Garret
t)、アール・パワーズ(R. Powers)、エイ・エム・グローネンボーン(A.M. Grone
nborn)およびジー・エム・クロア(G.M. Clore)、ジャーナル・オブ・マグネティ
ック・レゾナンス(J. Magn. Reson.),95,214-20(1991)]を用いて加工および分析
した。図４は、化合物１(図４Ａ)、化合物２(図４Ｂ)および化合物３(図４Ｃ)と
複合体化したＭＭＰ-１(１〜２の等高線)にオーバレイした遊離のＭＭＰ-１(多
数の等高線)のスペクトルを与える。３つの化合物は、いずれもＭＭＰ-１活性部
位における触媒的ＺｎおよびＳ１'ポケットの近傍における残基の化学シフト摂
動を誘発する。特に、残基８０〜８３、１１４〜１１９および１３６〜１４２は
、阻害薬の存在下で最も大きい化学シフト変化を示した。化学シフト摂動の程度
および化学シフト変化を示す残基の数は、化合物の各々について観察されたＩＣ
５０に直接関係している。(図４Ａ、４Ｂ、４Ｃ)、すなわち、強い結合は大きい
摂動に寄与し、弱い結合は小さい摂動に寄与する。
・アール(J. Biomol. NMR)、第10巻：9-19(1997)に記載されているように標識し
た。化合物１、２および３を実施例５から選択した。勾配強化２Ｄ １Ｈ-１５Ｎ
ＨＳＱＣスペクトルを、９０％Ｈ２Ｏおよび１０％Ｄ２Ｏ中における２０ｍＭ
トリス、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ２、０.１ｍＭ ＺｎＣｌ２、２
ｍＭ ＮａＮ３および３.５ｍＭ ＤＴＴからなる緩衝液(ｐＨ６.５)中の０.２ｍ
Ｍ １５Ｎ-ＭＭＰ-１について、３５℃で採取した。化合物は０.２〜４.０ｍＭ
の範囲内の化合物１、２および３の濃度を達成するように滴定した。２Ｄ １Ｈ- １５ Ｎ ＨＳＱＣスペクトルは、ｔ１に２５６複素点(complex point)、ｔ２に２
０４８実点(real point)、および増分あたり１９２スキャンで記録した。ｔ１お
よびｔ２のスペクトル・ウィンドウは、それぞれ１７２３.７および８０６４.５
Ｈｚであり、キャリアーは、それぞれ４.７５および１１５.２ｐｐｍであった。
データは、サン(Sun)のウルトラ(Ultra)１０ワークステーション上におけるＮＭ
ＲＰｉｐｅ、ＮＭＲＷｉｓｈ[エフ・デラグリオ(F. Delaglio)、エス・グルチェ
シエク(S. Grzesiek)、ジー・ダブリュー・ビュイスター(G.W. Vuister)、ジー
・ジュー(G. Zhu)、ジェイ・ファイファー(J. Pfeifer)およびエイ・バックス(A
. Bax)、ジャーナル・オブ・バイオモレキュラー・エヌ・エム・アール(J. Biom
ol. NMR),6,277(1995)]およびＰＩＰＰ[ディー・エス・ギャレット(D.S. Garret
t)、アール・パワーズ(R. Powers)、エイ・エム・グローネンボーン(A.M. Grone
nborn)およびジー・エム・クロア(G.M. Clore)、ジャーナル・オブ・マグネティ
ック・レゾナンス(J. Magn. Reson.),95,214-20(1991)]を用いて加工および分析
した。図４は、化合物１(図４Ａ)、化合物２(図４Ｂ)および化合物３(図４Ｃ)と
複合体化したＭＭＰ-１(１〜２の等高線)にオーバレイした遊離のＭＭＰ-１(多
数の等高線)のスペクトルを与える。３つの化合物は、いずれもＭＭＰ-１活性部
位における触媒的ＺｎおよびＳ１'ポケットの近傍における残基の化学シフト摂
動を誘発する。特に、残基８０〜８３、１１４〜１１９および１３６〜１４２は
、阻害薬の存在下で最も大きい化学シフト変化を示した。化学シフト摂動の程度
および化学シフト変化を示す残基の数は、化合物の各々について観察されたＩＣ
５０に直接関係している。(図４Ａ、４Ｂ、４Ｃ)、すなわち、強い結合は大きい
摂動に寄与し、弱い結合は小さい摂動に寄与する。
【００３８】
実施例７
モデリング
コンピューターモデリングを用いて、ＭＭＰ-１のＮＭＲ溶液構造のＧＲＡＳ
Ｐ表面を設計した(図５Ａ)。ここで、ＭＭＰ-１：化合物１の複合体における実
施例７のスペクトルで摂動を受けた残基は青く着色されており、これはタンパク
とのリガンド相互作用の位置を示す。ＮＭＲ構造は、ＭＭＰ-１：化合物１の複
合体について設計される。(図５Ｂ)。化合物１は太線で示されている。
Ｐ表面を設計した(図５Ａ)。ここで、ＭＭＰ-１：化合物１の複合体における実
施例７のスペクトルで摂動を受けた残基は青く着色されており、これはタンパク
とのリガンド相互作用の位置を示す。ＮＭＲ構造は、ＭＭＰ-１：化合物１の複
合体について設計される。(図５Ｂ)。化合物１は太線で示されている。
【図１】 図１は、ＭＭＰ-１の存在下および非存在下でＭＭＰ-１阻害薬を
セファデックス(Sephadex)Ｇ-２５カラムに通して濾過した後の濾液のＥＳＩ質
量スペクトル分析。(Ａ)４５μＭ化合物１(ＭＷ３９３)および４５μＭ ＭＭＰ-
１、(Ｂ)４５μＭ化合物１単独、(Ｃ)２５０μＭ化合物２(ＭＷ４５７)および５
０μＭ ＭＭＰ-１、(Ｄ)２５０μＭ化合物２単独、(Ｅ)８ｍＭ化合物３(ＭＷ３
９４)および０.４ｍＭ ＭＭＰ-１、(Ｆ)８ｍＭ化合物３単独。
セファデックス(Sephadex)Ｇ-２５カラムに通して濾過した後の濾液のＥＳＩ質
量スペクトル分析。(Ａ)４５μＭ化合物１(ＭＷ３９３)および４５μＭ ＭＭＰ-
１、(Ｂ)４５μＭ化合物１単独、(Ｃ)２５０μＭ化合物２(ＭＷ４５７)および５
０μＭ ＭＭＰ-１、(Ｄ)２５０μＭ化合物２単独、(Ｅ)８ｍＭ化合物３(ＭＷ３
９４)および０.４ｍＭ ＭＭＰ-１、(Ｆ)８ｍＭ化合物３単独。
【図２】 図２は、ＭＭＰ-１を用いた化合物２(ＭＷ４５７)のゲル濾過滴
定からの濾液のＥＳＩ(正イオン化)質量スペクトル分析である。(Ａ)５０μＭの
ＭＭＰ-１単独；(Ｂ-Ｅ)増大する濃度のＭＭＰ-１、(Ｂ)２０μＭ、(Ｃ)３０μ
Ｍ、(Ｄ)４０μＭおよび(Ｅ)５０μＭ、および増大する濃度の化合物２、(Ｂ)１
００μＭ、(Ｃ)１５０μＭ、(Ｄ)２００μＭおよび(Ｅ)２５０μＭ；および(Ｆ)
２５０μＭ化合物２単独。
定からの濾液のＥＳＩ(正イオン化)質量スペクトル分析である。(Ａ)５０μＭの
ＭＭＰ-１単独；(Ｂ-Ｅ)増大する濃度のＭＭＰ-１、(Ｂ)２０μＭ、(Ｃ)３０μ
Ｍ、(Ｄ)４０μＭおよび(Ｅ)５０μＭ、および増大する濃度の化合物２、(Ｂ)１
００μＭ、(Ｃ)１５０μＭ、(Ｄ)２００μＭおよび(Ｅ)２５０μＭ；および(Ｆ)
２５０μＭ化合物２単独。
【図３】 図３は、(上)０.１ｍＭ ＭＭＰ-１を含む、また、(下)ＭＭＰ-１
を含まない、１０個の既知のＭＭＰ-１阻害薬の各１ｍＭを含有する混合物のゲ
ル濾過分析からの濾液のＥＳＩ(負イオン化)質量スペクトル分析である。１０個
の化合物の質量イオンはスペクトル上で強調表示されている。この混合物は表１
に示した化合物４〜１３からなる。
を含まない、１０個の既知のＭＭＰ-１阻害薬の各１ｍＭを含有する混合物のゲ
ル濾過分析からの濾液のＥＳＩ(負イオン化)質量スペクトル分析である。１０個
の化合物の質量イオンはスペクトル上で強調表示されている。この混合物は表１
に示した化合物４〜１３からなる。
【図４】 図４Ａ〜Ｃは、ゲル濾過/質量スペクトル分析(図１)から結合剤
として同定された(Ａ)化合物１、(Ｂ)化合物２および(Ｃ)化合物３と複合体化し
たＭＭＰ-１(１〜２等高線)にオーバーレイした遊離のＭＭＰ-１(多数の等高線)
の２Ｄ １Ｈ-１５Ｎ ＨＳＱＣスペクトルである。
として同定された(Ａ)化合物１、(Ｂ)化合物２および(Ｃ)化合物３と複合体化し
たＭＭＰ-１(１〜２等高線)にオーバーレイした遊離のＭＭＰ-１(多数の等高線)
の２Ｄ １Ｈ-１５Ｎ ＨＳＱＣスペクトルである。
【図５】 図５(Ａ)は、ＭＭＰ-１：化合物１複合体の１Ｈ-１５Ｎ ＨＳＱ
Ｃスペクトルにおいて摂動を受けた残基を黒く着色した(タンパクとのリガンド
相互作用の位置を示す)ＭＭＰ-１のＮＭＲ溶液構造のＧＲＡＳＰ(３２)表面であ
る。 図５(Ｂ)は、ＭＭＰ-１：化合物１複合体のＮＭＲ構造である。化合物１は太
線で示されている。
Ｃスペクトルにおいて摂動を受けた残基を黒く着色した(タンパクとのリガンド
相互作用の位置を示す)ＭＭＰ-１のＮＭＲ溶液構造のＧＲＡＳＰ(３２)表面であ
る。 図５(Ｂ)は、ＭＭＰ-１：化合物１複合体のＮＭＲ構造である。化合物１は太
線で示されている。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｇ０６Ｆ 17/60 １２６Ｅ
Ｇ０６Ｆ 17/60 １２６ Ｇ０１Ｎ 30/02 Ｊ
// Ｇ０１Ｎ 30/02 30/48 Ｎ
30/48 30/88 Ｃ
30/88 Ｅ
Ｊ
24/08 ５１０Ｑ
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，
ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ
Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ
，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，
ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ
Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ
，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，
ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，
ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ
Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ
，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，
ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ
Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ
，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，
ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ
Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ
，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，
ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ
(72)発明者 マーシャル・メイヤー・シーゲル
アメリカ合衆国07410ニュージャージー州
フェア・ローン、グラント・ストリート39
−24番
(72)発明者 ドミニク・モビリオ
アメリカ合衆国07059ニュージャージー州
ウォーレン、スナイダー・ロード35番
Ｆターム(参考） 2G045 AA40 FA40 FB06 JA01
4H006 AA02
【要約の続き】
Claims (25)
- 【請求項１】 標的分子に結合する化合物の結合部位を同定するために化合
物の混合物をスクリーニングする方法であって、 ａ）既知の分子量を有する化合物の混合物を調製し； ｂ）この混合物を標的分子とインキュベートして、結合した化合物-標的複合
体の形成を可能にし； ｃ）化合物-標的複合体の質量スペクトル分析を行って、分子量に基づいて結
合した化合物の正体を決定し； ｄ）標的分子に結合した同定された化合物の複合体を調製し； ｅ）標的分子に結合した同定された化合物の複合体のＮＭＲ化学シフト摂動を
分析して、標的分子上の化合物の結合部位の位置を同定することからなる方法。 - 【請求項２】 さらに、非結合化合物から化合物-標的複合体を分離するこ
とを包含する請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 サイズ排除カラムを用いて、非結合化合物から化合物-標的
分子複合体を分離する請求項２記載の方法。 - 【請求項４】 サイズ排除ゲルを充填したマルチスクリーン濾過システムを
用いて、非結合化合物から化合物-標的分子複合体を分離する請求項２記載の方
法。 - 【請求項５】 さらに、同定された化合物を標的分子に対する生物学的活性
について試験することを包含する請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。 - 【請求項６】 さらに、複合体の分子モデルを調製することを包含する請求
項１〜５のいずれか１項記載の方法。 - 【請求項７】 分子モデルがＮＭＲおよびＸ線結晶学的データの一方または
両方を用いて決定される請求項６記載の方法。 - 【請求項８】 さらに、コンピューターを利用した合理的薬物設計を用いて
、標的分子に対して向上した親和性を有するリガンドを設計することを包含する
請求項６または７記載の方法。 - 【請求項９】 各化合物が約２０００ＭＷ未満の分子量を有する請求項１〜
８のいずれか１項記載の方法。 - 【請求項１０】 標的分子に対する向上した親和性を有するリガンドを設計
する方法であって、 ａ）既知の分子量を有する化合物の混合物を調製し； ｂ）この混合物を標的分子とインキュベートして、結合した化合物-標的複合
体の形成を可能にし； ｃ）化合物-標的複合体の質量スペクトル分析を行って、分子量に基づいて結
合した化合物の正体を決定し； ｄ）標的分子に結合した同定された化合物の複合体を調製し； ｅ）標的分子に結合した同定された化合物の複合体のＮＭＲ化学シフト摂動を
分析して、標的分子上の化合物の結合部位の位置を同定し； ｆ）同定された化合物の化学構造および標的分子の同定された結合部位に基づ
いて既知の分子量を有する構造類似体のライブラリーを設計し； ｇ）該構造類似体を合成し； ｈ）これらの構造類似体が標的分子に結合するかどうかを決定することからな
る方法。 - 【請求項１１】 さらに、阻害薬に対する生物学的な活性について構造類似
体を試験することを包含する請求項１０記載の方法。 - 【請求項１２】 構造類似体が、 ａ）これらの構造類似体を標的分子とインキュベートして、結合した構造類似
体-標的複合体の形成を可能にし； ｂ）構造類似体-標的複合体の質量スペクトル分析を行って、分子量に基づい
て結合した構造類似体の正体を決定し； ｃ）標的分子に結合した同定された構造類似体の複合体を調製し； ｄ）標的分子に結合した構造類似体の複合体のＮＭＲ化学シフト摂動を分析し
て、標的分子上の化合物の結合部位の位置を同定することにより、 結合について試験される請求項１０または１１記載の方法。 - 【請求項１３】 さらに、非結合化合物から化合物-標的複合体を分離する
ことを包含する請求項１０〜１２のいずれかに記載の方法。 - 【請求項１４】 サイズ排除カラムを用いて、非結合化合物から化合物-標
的分子複合体を分離する請求項１３記載の方法。 - 【請求項１５】 サイズ排除ゲルを充填したマルチスクリーン濾過システム
を用いて、非結合化合物から化合物-標的分子複合体を分離する請求項１３記載
の方法。 - 【請求項１６】 さらに、複合体の分子モデルを調製することを包含する請
求項１０〜１５のいずれか１項記載の方法。 - 【請求項１７】 分子モデルがＮＭＲおよびＸ線結晶学的データを用いて調
製される請求項１６記載の方法。 - 【請求項１８】 さらに、コンピューターを利用した合理的薬物設計を用い
て、構造類似体を設計することを包含する請求項１０〜１７のいずれか１項記載
の方法。 - 【請求項１９】 各化合物が約２０００ＭＷ未満の分子量を有する請求項１
０〜１８のいずれか１項記載の方法。 - 【請求項２０】 標的分子に対する高親和性リガンドを設計する方法であっ
て、 ａ）既知の分子量を有する化合物の混合物を調製し； ｂ）この混合物を標的分子とインキュベートして、結合した化合物-標的複合
体の形成を可能にし； ｃ）化合物-標的複合体の質量スペクトル分析を行って、分子量に基づいて結
合した化合物の正体を決定し； ｄ）標的分子に結合した同定された化合物の複合体を調製し； ｅ）標的分子に結合した同定された化合物の複合体のＮＭＲ化学シフト摂動を
分析して、標的分子上の少なくとも２つの異なる結合部位を有する少なくとも２
つの化合物を同定し； ｆ）標的分子上のこれら化合物の空間的な配向を決定し； ｇ）決定された空間的な配向に最少限の影響を与えるように、少なくとも２つ
の同定された化合物を連結することからなる方法。 - 【請求項２１】 少なくとも２つの同定された化合物が分子モデリングを用
いて連結される請求項２０記載の方法。 - 【請求項２２】 化合物-標的複合体および非結合化合物が分離される請求
項２０または２１記載の方法。 - 【請求項２３】 サイズ排除カラムクロマトグラフィー用いて、化合物-標
的複合体および非結合化合物が分離される請求項２２記載の方法。 - 【請求項２４】 サイズ排除ゲルを有するマルチウェル濾過システムを用い
て、非結合化合物から化合物-標的分子複合体を分離する請求項２２記載の方法
。 - 【請求項２５】 各化合物が約２０００ＭＷ未満の分子量を有する請求項２
０〜２４のいずれか１項記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US51380600A | 2000-02-25 | 2000-02-25 | |
| US09/513,806 | 2000-02-25 | ||
| PCT/US2001/005495 WO2001062688A2 (en) | 2000-02-25 | 2001-02-21 | Methods of structure-based drug design using ms/nmr |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003524167A true JP2003524167A (ja) | 2003-08-12 |
Family
ID=24044740
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001561699A Pending JP2003524167A (ja) | 2000-02-25 | 2001-02-21 | Ｍｓ／ｎｍｒを用いた構造に基づく薬物設計の方法 |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1259469A2 (ja) |
| JP (1) | JP2003524167A (ja) |
| CN (1) | CN1411554A (ja) |
| AR (1) | AR027955A1 (ja) |
| AU (1) | AU2001238584A1 (ja) |
| BR (1) | BR0108606A (ja) |
| CA (1) | CA2401014A1 (ja) |
| MX (1) | MXPA02008253A (ja) |
| WO (1) | WO2001062688A2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2002364783A1 (en) * | 2001-11-21 | 2003-06-10 | Affinium Pharmaceuticals, Inc. | Purified polypeptides involved in general metabolism |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5891742A (en) * | 1995-01-19 | 1999-04-06 | Chiron Corporation | Affinity selection of ligands by mass spectroscopy |
| AU711092B2 (en) * | 1995-11-14 | 1999-10-07 | Abbvie Inc. | Use of nuclear magnetic resonance to design ligands to target biomolecules |
| US5698401A (en) * | 1995-11-14 | 1997-12-16 | Abbott Laboratories | Use of nuclear magnetic resonance to identify ligands to target biomolecules |
| US6475807B1 (en) * | 1996-04-08 | 2002-11-05 | Smithkline Beecham Corporation | Mass-based encoding and qualitative analysis of combinatorial libraries |
| JP3788909B2 (ja) * | 1999-02-12 | 2006-06-21 | セテク コーポレイション | 親和力配位子について複合生理学的材料をスクリーニングする高処理量のサイズ排除法 |
-
2001
- 2001-02-21 WO PCT/US2001/005495 patent/WO2001062688A2/en not_active Application Discontinuation
- 2001-02-21 CA CA002401014A patent/CA2401014A1/en not_active Abandoned
- 2001-02-21 BR BR0108606-5A patent/BR0108606A/pt not_active Application Discontinuation
- 2001-02-21 CN CN 01805626 patent/CN1411554A/zh active Pending
- 2001-02-21 EP EP01911041A patent/EP1259469A2/en not_active Withdrawn
- 2001-02-21 JP JP2001561699A patent/JP2003524167A/ja active Pending
- 2001-02-21 MX MXPA02008253A patent/MXPA02008253A/es unknown
- 2001-02-21 AU AU2001238584A patent/AU2001238584A1/en not_active Abandoned
- 2001-02-23 AR ARP010100832A patent/AR027955A1/es unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP1259469A2 (en) | 2002-11-27 |
| MXPA02008253A (es) | 2002-11-29 |
| AR027955A1 (es) | 2003-04-16 |
| BR0108606A (pt) | 2003-01-07 |
| WO2001062688A2 (en) | 2001-08-30 |
| WO2001062688A3 (en) | 2002-03-14 |
| AU2001238584A1 (en) | 2001-09-03 |
| CA2401014A1 (en) | 2001-08-30 |
| CN1411554A (zh) | 2003-04-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Wales et al. | Hydrogen exchange mass spectrometry for the analysis of protein dynamics | |
| Hüttenhain et al. | Perspectives of targeted mass spectrometry for protein biomarker verification | |
| US10352942B2 (en) | Correlated peptides for quantitative mass spectrometry | |
| Rodríguez‐Suárez et al. | The application of quantification techniques in proteomics for biomedical research | |
| EP1472539B1 (en) | Absolute quantification of proteins and modified forms thereof by multistage mass spectrometry | |
| US7501286B2 (en) | Absolute quantification of proteins and modified forms thereof by multistage mass spectrometry | |
| JP4672615B2 (ja) | 迅速かつ定量的なプロテオーム解析および関連した方法 | |
| Schneider et al. | Stable isotope methods for high-precision proteomics | |
| US20060004525A1 (en) | System and method of determining proteomic differences | |
| CN107709980A (zh) | 单克隆抗体的定量方法 | |
| Jethva et al. | Hydrogen deuterium exchange and other mass spectrometry-based approaches for epitope mapping | |
| EP1384082A2 (en) | Diagnosis of physiological conditions by proteomic characterization | |
| US6602855B2 (en) | Biopolymer marker indicative of disease state having a molecular weight of 1449 daltons | |
| US6627606B2 (en) | Biopolymer marker indicative of disease state having a molecular weight of 1465 daltons | |
| JP2003524167A (ja) | Ｍｓ／ｎｍｒを用いた構造に基づく薬物設計の方法 | |
| US6593298B2 (en) | Biopolymer marker indicative of disease state having a molecular weight of 1690 daltons | |
| US6620787B2 (en) | Biopolymer marker indicative of disease state having a molecular weight of 2267 daltons | |
| Wang et al. | Quantitative proteomics in development of disease protein biomarkers | |
| US20010046684A1 (en) | Methods of structure-based drug design using MS/MNR | |
| US20080096286A1 (en) | Biopolymer marker indicative of disease state having a molecular weight of 1348 daltons | |
| US7049397B2 (en) | Biopolymer marker indicative of disease state having a molecular weight of 1211 daltons | |
| JP2005510731A (ja) | Ｉｉ型糖尿病のスクリーニングのためのフィブリノゲンバイオポリマーマーカーおよびその使用 | |
| JP2005510718A (ja) | Ｉｉ型糖尿病を予測する補体ｃ３前駆体バイオポリマーマーカー | |
| JP2005523420A (ja) | アルツハイマー病を示す補体ｃ３前駆体バイオポリマーマーカー | |
| Hipparagi et al. | Proteomics: Present and future prospective |