JP2003520228A - 眼の成長及びニコチン性アンタゴニスト - Google Patents
眼の成長及びニコチン性アンタゴニストInfo
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Abstract
(57)【要約】
この発明は、出生後の眼の成長を制御し又は近視の発生を阻止するために治療上有効な量のニコチン性アンタゴニストを眼に投与するステップを含む方法に関するものである。
Description
【０００１】
発明の分野
本発明は、眼の成長のニコチン性レセプターアンタゴニストによる制御に関係
し、一層詳細には、ニコチン性レセプターアンタゴニストの眼への投与による、
宿主動物における出生後の眼の成長の阻止及び近視の予防に関係する。
し、一層詳細には、ニコチン性レセプターアンタゴニストの眼への投与による、
宿主動物における出生後の眼の成長の阻止及び近視の予防に関係する。
【０００２】
発明の背景
視覚入力は、出生後の眼の成長の制御及び屈折エラーの発生を左右する。眼の
成長は、網膜全体と同様に、眼において局所的に大いに制御されるようであり；
他の神経系の構成要素例えば脳又は抹消神経系に関する特異的な役割は未知のま
まである(Stone, 1997, Myopia Updates: Proceedings of the 6th Internation
al Conference on Myopia, p.241-254；Wallman, 1993, Progress in Retinal R
esearch, 12:133-153)。かすみなどの視覚イメージの複雑な特質は眼の成長に影
響するので、網膜基部のニューロンは、局所的な調節機構の要素を含みうるとい
うことは合理的にみえる。実際、現在、多くの証拠は、幾つかのクラスの網膜の
無軸索細胞を、視覚入力と眼の成長の制御をリンクさせる経路に関係させる。こ
のデータは、ドーパミン作動性無軸索細胞の役割を強く支持している(Stone, 19
97, Myopia Updates: Proceedings of the 6th International Conference on M
yopia, p.241-254；Stone等、1989, Proc. Natl. Acad. Sic. U.S.A., 86:704-6
)。他の網膜ニューロンを関係させる証拠はあまり十分に発展して議論されてい
ないが、屈折の発生に影響すると仮定される網膜無軸索細胞の他のサブタイプは
、血管作用性小腸ペプチド(Pickett Seltner及びStell, 1995, Vision Res., 35
:1265-1270；Stone等、1988, Proc. Natl. Acad. Sic. U.S.A., 85:257-60)、グ
ルカゴン(Fischer等、1999a, Nature Neuroscience, 2:706-12)、一酸化窒素(Fu
jikado等、1997, Curr. Eye Res., 16:992-6)、エンケファリン(Pickett Seltne
r等、1997, Vis. Neurosci., 14:801-809)及びアセチルコリン(Stone等、1991,
Exp. Eye Res., 52:755-8)を含むものを包含する。
成長は、網膜全体と同様に、眼において局所的に大いに制御されるようであり；
他の神経系の構成要素例えば脳又は抹消神経系に関する特異的な役割は未知のま
まである(Stone, 1997, Myopia Updates: Proceedings of the 6th Internation
al Conference on Myopia, p.241-254；Wallman, 1993, Progress in Retinal R
esearch, 12:133-153)。かすみなどの視覚イメージの複雑な特質は眼の成長に影
響するので、網膜基部のニューロンは、局所的な調節機構の要素を含みうるとい
うことは合理的にみえる。実際、現在、多くの証拠は、幾つかのクラスの網膜の
無軸索細胞を、視覚入力と眼の成長の制御をリンクさせる経路に関係させる。こ
のデータは、ドーパミン作動性無軸索細胞の役割を強く支持している(Stone, 19
97, Myopia Updates: Proceedings of the 6th International Conference on M
yopia, p.241-254；Stone等、1989, Proc. Natl. Acad. Sic. U.S.A., 86:704-6
)。他の網膜ニューロンを関係させる証拠はあまり十分に発展して議論されてい
ないが、屈折の発生に影響すると仮定される網膜無軸索細胞の他のサブタイプは
、血管作用性小腸ペプチド(Pickett Seltner及びStell, 1995, Vision Res., 35
:1265-1270；Stone等、1988, Proc. Natl. Acad. Sic. U.S.A., 85:257-60)、グ
ルカゴン(Fischer等、1999a, Nature Neuroscience, 2:706-12)、一酸化窒素(Fu
jikado等、1997, Curr. Eye Res., 16:992-6)、エンケファリン(Pickett Seltne
r等、1997, Vis. Neurosci., 14:801-809)及びアセチルコリン(Stone等、1991,
Exp. Eye Res., 52:755-8)を含むものを包含する。
【０００３】
ムスカリン性レセプターで作用するコリン作動性機構は、ムスカリン性アンタ
ゴニストのアトロピンが、ニワトリヒナ(Stone等、1991, Exp.Eye Res.,52:755-
8)、トガリネズミ(McKanna及びCasagrande, 1981, Documenta Ophthalmologica
Proceedings Series, 28:187-192)、サル(Raviola及びWiesel, 1985, N.Engl.J.
Med.,312:1609-15；Tigges等、1999, Optometry ＆ Vision Science, 76:397-40
7)及びヒト(Brodstein等、1984, Ophthalmol.,91:1373-1379)における近視の発
生を遅らせるので、眼の成長に関与しているようにみえる。しかしながら、眼の
成長の調節の原因である特異的なコリン作動性ニューロンを同定することは、困
難であることが判明している。
ゴニストのアトロピンが、ニワトリヒナ(Stone等、1991, Exp.Eye Res.,52:755-
8)、トガリネズミ(McKanna及びCasagrande, 1981, Documenta Ophthalmologica
Proceedings Series, 28:187-192)、サル(Raviola及びWiesel, 1985, N.Engl.J.
Med.,312:1609-15；Tigges等、1999, Optometry ＆ Vision Science, 76:397-40
7)及びヒト(Brodstein等、1984, Ophthalmol.,91:1373-1379)における近視の発
生を遅らせるので、眼の成長に関与しているようにみえる。しかしながら、眼の
成長の調節の原因である特異的なコリン作動性ニューロンを同定することは、困
難であることが判明している。
【０００４】
近い仕事による近視の発生の臨床的連想の故に、遠近調節が近視を引き起こす
機構の下にあるということ及び毛様体筋麻痺がアトロピンの抗近視活性を説明す
るということが長らく仮説とされてきており、これは、毛様体神経節のコリン作
動性ニューロン及び毛様体筋のムスカリン性レセプターの役割を示唆している。
しかしながら、この仮説の多くの魅力的な特徴にもかかわらず、僅かの実験的仕
事しか、近視の発生における遠近調節の役割を支持していない。毛様体神経節摘
出術(Lin等、1996, Curr.Eye Res., 15:453-60；Raviola及びWiesel,1985, N.En
gl.J.Med.,312:1609-15)、毛様体神経切出し(Shin等、1994, Invest.Ophthalmol
.Vis.Sci.,35:5691-701)又はエディンガー・ウェストファール核における毛様体
神経節への神経節前入力の障害(Troilo, 1990, Ciba Foundation Symposium, 15
5:89-102；discussion 102-14)は、各々、実験的な近視の発生に主たるインパク
トを有しえない。薬理学的証拠も又、近視の発生における遠近調節の役割に反論
している。最少の毛様体筋麻痺活性を有するＭ１感受性ムスカリン性アンタゴニ
ストは、アカゲザルの実験的近視に対して、少なくとも、アトロピン程度には有
効である(Tigges等、1999, Optometry ＆ Vision Science, 76:397-407)。更に
、ニワトリヒナの毛様体は平滑筋よりも横紋筋を含むこと、鳥類の調節は、ムス
カリン性よりもニコチン性機構により制御されること及びアトロピンはニワトリ
ヒナにおける調節を麻痺させることができないということが認められている(Sto
ne等、1991, Exp.Eye Res.,52:755-8)。アトロピンがニワトリヒナの近視をブロ
ックすることは、更に、調節機構に対する反証である(Stone, 1997, Myopia Upd
ates: Proceedings of the 6th International Conference on Myopia, p.241-2
54)。
機構の下にあるということ及び毛様体筋麻痺がアトロピンの抗近視活性を説明す
るということが長らく仮説とされてきており、これは、毛様体神経節のコリン作
動性ニューロン及び毛様体筋のムスカリン性レセプターの役割を示唆している。
しかしながら、この仮説の多くの魅力的な特徴にもかかわらず、僅かの実験的仕
事しか、近視の発生における遠近調節の役割を支持していない。毛様体神経節摘
出術(Lin等、1996, Curr.Eye Res., 15:453-60；Raviola及びWiesel,1985, N.En
gl.J.Med.,312:1609-15)、毛様体神経切出し(Shin等、1994, Invest.Ophthalmol
.Vis.Sci.,35:5691-701)又はエディンガー・ウェストファール核における毛様体
神経節への神経節前入力の障害(Troilo, 1990, Ciba Foundation Symposium, 15
5:89-102；discussion 102-14)は、各々、実験的な近視の発生に主たるインパク
トを有しえない。薬理学的証拠も又、近視の発生における遠近調節の役割に反論
している。最少の毛様体筋麻痺活性を有するＭ１感受性ムスカリン性アンタゴニ
ストは、アカゲザルの実験的近視に対して、少なくとも、アトロピン程度には有
効である(Tigges等、1999, Optometry ＆ Vision Science, 76:397-407)。更に
、ニワトリヒナの毛様体は平滑筋よりも横紋筋を含むこと、鳥類の調節は、ムス
カリン性よりもニコチン性機構により制御されること及びアトロピンはニワトリ
ヒナにおける調節を麻痺させることができないということが認められている(Sto
ne等、1991, Exp.Eye Res.,52:755-8)。アトロピンがニワトリヒナの近視をブロ
ックすることは、更に、調節機構に対する反証である(Stone, 1997, Myopia Upd
ates: Proceedings of the 6th International Conference on Myopia, p.241-2
54)。
【０００５】
別のコリン作動性機構が、屈折性の発生を説明するために探究されてきた。網
膜のコリン作動性ニューロン及びムスカリン性レセプターが、ヒナの近視におけ
るＭ１選択的な(Ｍ３選択的でない)ムスカリン性サブタイプレセプターアンタゴ
ニストの活性に基づいて提案されてきた(Stone等、1991, Exp.Eye Res.,52:755-
8)。この概念は又、トガリネズミ(Cottriall及びMcBrien, 1996, Invest.Ophtha
lmol.Vis.Sci.,37:1368-79)及びアカゲザル(Tigges等、1999, Optometry & Visi
on Science, 76:397-407)におけるＭ１選択的なムスカリン性アンタゴニストの
抗近視活性によっても支持されている。しかしながら、関与するコリン作動性ニ
ューロンを同定するために行われた研究において、アセチルコリンの生合成のた
めの酵素(コリンアセチルトランスフェラーゼ)の活性が、近視のヒナの眼の網膜
において不変であるが毛様体神経節においては低下されることが見出された(Pen
drak等、1995,Exp.Eye Res.,60:237-43)。培養ヒナ強膜細胞の応答(Lind等、199
8,Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.,39:2217-2231)及びコリン作動性無軸索細胞を障
害する網膜毒素に対するヒナの眼の応答(Fischer等、1998b,Brain Res.,794:48-
60)に基づいて、ムスカリン性アンタゴニストは、強膜又は脈絡膜などの網膜外
部位で作用することによって近視の発生を阻止することができるということが示
唆されてきた。
膜のコリン作動性ニューロン及びムスカリン性レセプターが、ヒナの近視におけ
るＭ１選択的な(Ｍ３選択的でない)ムスカリン性サブタイプレセプターアンタゴ
ニストの活性に基づいて提案されてきた(Stone等、1991, Exp.Eye Res.,52:755-
8)。この概念は又、トガリネズミ(Cottriall及びMcBrien, 1996, Invest.Ophtha
lmol.Vis.Sci.,37:1368-79)及びアカゲザル(Tigges等、1999, Optometry & Visi
on Science, 76:397-407)におけるＭ１選択的なムスカリン性アンタゴニストの
抗近視活性によっても支持されている。しかしながら、関与するコリン作動性ニ
ューロンを同定するために行われた研究において、アセチルコリンの生合成のた
めの酵素(コリンアセチルトランスフェラーゼ)の活性が、近視のヒナの眼の網膜
において不変であるが毛様体神経節においては低下されることが見出された(Pen
drak等、1995,Exp.Eye Res.,60:237-43)。培養ヒナ強膜細胞の応答(Lind等、199
8,Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.,39:2217-2231)及びコリン作動性無軸索細胞を障
害する網膜毒素に対するヒナの眼の応答(Fischer等、1998b,Brain Res.,794:48-
60)に基づいて、ムスカリン性アンタゴニストは、強膜又は脈絡膜などの網膜外
部位で作用することによって近視の発生を阻止することができるということが示
唆されてきた。
【０００６】
眼の成長におけるコリン作動性ニューロンの役割の我々の理解を更に制限する
ものは、コリン作動性ニコチン性機構を扱った研究が少ないことである。硝子体
内及び結膜下の両方のニコチンが、ヒナにおける調節を誘導する(Reiner等、199
5, Vision Res.,35:1227-1245)。２週間にわたる一日二回のニコチンの硝子体内
への注入は、ヒナにおいて、反対側の未注入の眼と比較して、約２ジオプターの
屈折における近視性シフトを誘導するが；硝子体内への生理食塩水の注入も同じ
効果を有した(Reiner等、1995,Vision Res.,35:1227-1245)。日々の結膜下への
ニコチン注入は、ヒナにおいて、未処理の眼と比較して０．７５ジオプターの僅
かな近視性の屈折性シフトを引き起こし、結膜下への生理食塩水の注入では応答
は見られなかった(Reiner等、1995,Vision Res.,35:1227-1245)；しかし、ヒナ
におけるこの程度の屈折は、ヒナの眼の焦点深度に近いので、殆ど生物学的意義
がないであろう(Schmid及びWildsoet,1997,Ophthal.Physiol.Opt.,17:61-7)。ニ
コチンの高い親油性は、眼からの迅速な拡散を可能にし、それで、眼の外部での
潜在的作用がこれらの結果の機械的解釈を更に制限するであろう。ベクロニウム
ブロミド(神経筋ブロッキング剤であり且つニコチン性アンタゴニスト)をヒナの
角膜に投与した場合には、それは、調節を麻痺させたが、眼鏡により遠視的に焦
点をぼかした後の眼球の伸長に影響を及ぼすことはできず、やはり、近視の調節
機構に対する反証となっている(Schwahn及びSchaeffel,1994,Invest.Ophthalmol
.Vis.Sci.,35:3516-24)。神経筋接合部に充填されたアンタゴニスト(ｄ−ツボク
ラリンがプロトタイプのもの)は、典型的には、中枢神経系に僅かに浸透して、
低い親和性ですべてのニコチン性レセプターサブタイプに結合する(Gotti等、19
97,Progress in Neurobiology,53:199-237)。ベクロニウムブロミドも又、大い
に充填され；そうして、それは容易に拡散して眼内筋の神経筋接合部をブロック
するが、神経網膜などの眼の成長の制御に潜在的に関与する親油性組織内のレセ
プター部位に接近できない。
ものは、コリン作動性ニコチン性機構を扱った研究が少ないことである。硝子体
内及び結膜下の両方のニコチンが、ヒナにおける調節を誘導する(Reiner等、199
5, Vision Res.,35:1227-1245)。２週間にわたる一日二回のニコチンの硝子体内
への注入は、ヒナにおいて、反対側の未注入の眼と比較して、約２ジオプターの
屈折における近視性シフトを誘導するが；硝子体内への生理食塩水の注入も同じ
効果を有した(Reiner等、1995,Vision Res.,35:1227-1245)。日々の結膜下への
ニコチン注入は、ヒナにおいて、未処理の眼と比較して０．７５ジオプターの僅
かな近視性の屈折性シフトを引き起こし、結膜下への生理食塩水の注入では応答
は見られなかった(Reiner等、1995,Vision Res.,35:1227-1245)；しかし、ヒナ
におけるこの程度の屈折は、ヒナの眼の焦点深度に近いので、殆ど生物学的意義
がないであろう(Schmid及びWildsoet,1997,Ophthal.Physiol.Opt.,17:61-7)。ニ
コチンの高い親油性は、眼からの迅速な拡散を可能にし、それで、眼の外部での
潜在的作用がこれらの結果の機械的解釈を更に制限するであろう。ベクロニウム
ブロミド(神経筋ブロッキング剤であり且つニコチン性アンタゴニスト)をヒナの
角膜に投与した場合には、それは、調節を麻痺させたが、眼鏡により遠視的に焦
点をぼかした後の眼球の伸長に影響を及ぼすことはできず、やはり、近視の調節
機構に対する反証となっている(Schwahn及びSchaeffel,1994,Invest.Ophthalmol
.Vis.Sci.,35:3516-24)。神経筋接合部に充填されたアンタゴニスト(ｄ−ツボク
ラリンがプロトタイプのもの)は、典型的には、中枢神経系に僅かに浸透して、
低い親和性ですべてのニコチン性レセプターサブタイプに結合する(Gotti等、19
97,Progress in Neurobiology,53:199-237)。ベクロニウムブロミドも又、大い
に充填され；そうして、それは容易に拡散して眼内筋の神経筋接合部をブロック
するが、神経網膜などの眼の成長の制御に潜在的に関与する親油性組織内のレセ
プター部位に接近できない。
【０００７】
眼内筋の神経筋接合部におけるニコチン性レセプターの他に、ヒナの眼は又、
網膜(Hamassaki-Britto等、1994a,Vis.Neurosci.,11:63-70；Hamassaki-Britto
等、1994b,J.Comp.Neurol.,347:161-170；Keyser等、1993,J.Neurosci.,13:442-
454；Vailate等、1999,Mol.Pharmacol.,56:11-19)及び毛様体神経節(Berg等、19
98,Neuronal Nicotinic Receptors: Pharmacology and Therapeutic Opportunit
ies, p.187-196；Conroy及びBerg,1995,J.Biol.Chem.,270:4424-4431；Halvorse
n及びBerg,1990,J.Neurosci.,10:1711-1718；Horch及びSargent,1995,J.Neurosc
i.,15:7778-7795；Pugh等、1995,Mol.Pharmacol.,47:717-725)の両方においてよ
く特性決定されたニコチン性レセプターのサブタイプをも有する。
網膜(Hamassaki-Britto等、1994a,Vis.Neurosci.,11:63-70；Hamassaki-Britto
等、1994b,J.Comp.Neurol.,347:161-170；Keyser等、1993,J.Neurosci.,13:442-
454；Vailate等、1999,Mol.Pharmacol.,56:11-19)及び毛様体神経節(Berg等、19
98,Neuronal Nicotinic Receptors: Pharmacology and Therapeutic Opportunit
ies, p.187-196；Conroy及びBerg,1995,J.Biol.Chem.,270:4424-4431；Halvorse
n及びBerg,1990,J.Neurosci.,10:1711-1718；Horch及びSargent,1995,J.Neurosc
i.,15:7778-7795；Pugh等、1995,Mol.Pharmacol.,47:717-725)の両方においてよ
く特性決定されたニコチン性レセプターのサブタイプをも有する。
【０００８】
発明の要約
この発明は、出生後の眼の成長を制御し並びに出生後の眼の成長及び近視の発
生を阻止する関連標的に浸透するための適当な溶解度のニコチン性アンタゴニス
トの利用に関するものである。
生を阻止する関連標的に浸透するための適当な溶解度のニコチン性アンタゴニス
トの利用に関するものである。
【０００９】
この発明は、出生後の眼の成長の、出生後の眼の成長を制御するための治療上
有効な量のニコチンアンタゴニストの眼への投与による制御方法を提供する。更
に、宿主動物の眼の異常な出生後軸生長を、治療上有効な量のニコチン性アンタ
ゴニストを出生後の発生中に投与することにより阻止する方法をも提供する。こ
の発明は又、宿主動物の眼の異常な赤道伸長を、治療上有効な量のニコチン性ア
ンタゴニストを出生後の発生中に投与することにより阻止する方法をも提供する
。この発明は、更に、宿主動物の眼の異常な硝子体内腔の拡大を、治療上有効な
量のニコチン性アンタゴニストを出生後の発生中に投与することにより阻止する
方法を提供する。この発明の他の面は、近視の発生を、治療上有効な量のニコチ
ン性アンタゴニストの眼への投与により予防し又は阻止する方法を提供する。
有効な量のニコチンアンタゴニストの眼への投与による制御方法を提供する。更
に、宿主動物の眼の異常な出生後軸生長を、治療上有効な量のニコチン性アンタ
ゴニストを出生後の発生中に投与することにより阻止する方法をも提供する。こ
の発明は又、宿主動物の眼の異常な赤道伸長を、治療上有効な量のニコチン性ア
ンタゴニストを出生後の発生中に投与することにより阻止する方法をも提供する
。この発明は、更に、宿主動物の眼の異常な硝子体内腔の拡大を、治療上有効な
量のニコチン性アンタゴニストを出生後の発生中に投与することにより阻止する
方法を提供する。この発明の他の面は、近視の発生を、治療上有効な量のニコチ
ン性アンタゴニストの眼への投与により予防し又は阻止する方法を提供する。
【００１０】
この発明は、出生後の眼の成長の制御のための眼への投与に適合された医薬の
製造のためのニコチン性アンタゴニストの利用を提供する。この発明は、更に、
宿主動物の出生後の発生中の眼の異常な軸生長を阻止し、異常な赤道伸長を阻止
し、異常な硝子体内腔拡大を阻止するなどの利用のための医薬の製造のためのニ
コチン性アンタゴニストの利用を提供する。この発明は又、近視の予防又は治療
のための眼への投与に適合された医薬の製造のためのニコチン性アンタゴニスト
の利用をも提供する。
製造のためのニコチン性アンタゴニストの利用を提供する。この発明は、更に、
宿主動物の出生後の発生中の眼の異常な軸生長を阻止し、異常な赤道伸長を阻止
し、異常な硝子体内腔拡大を阻止するなどの利用のための医薬の製造のためのニ
コチン性アンタゴニストの利用を提供する。この発明は又、近視の予防又は治療
のための眼への投与に適合された医薬の製造のためのニコチン性アンタゴニスト
の利用をも提供する。
【００１１】
この発明の一具体例において、ニコチン性アンタゴニストは、競争的ニコチン
性アンタゴニスト例えばメチルカコニチン又はジヒドロ−β−エリスロイジンで
あってよい。他の具体例において、ニコチン性アンタゴニストは、チャンネルブ
ロッキングニコチン性アンタゴニスト例えばクロルイソンダミン又はメカミラミ
ンであってよい。この発明の更なる具体例において、ニコチン性アンタゴニスト
は、非競争的ニコチン性アンタゴニスト例えばセルトラリン、パロキセチン、ネ
ファクソドン、ベンラファクシン、フルオキセチン、ブプロプリオン、フェンシ
クリジン及びイボガインであってよい。この発明の他の具体例において、ニコチ
ン性アンタゴニストは、ニコチン性レセプター機能を阻止する抗体であってよい
。この発明の尚別の具体例において、ニコチン性アンタゴニストは、ニコチン性
アンタゴニストの様にさようするアゴニストであってよい。
性アンタゴニスト例えばメチルカコニチン又はジヒドロ−β−エリスロイジンで
あってよい。他の具体例において、ニコチン性アンタゴニストは、チャンネルブ
ロッキングニコチン性アンタゴニスト例えばクロルイソンダミン又はメカミラミ
ンであってよい。この発明の更なる具体例において、ニコチン性アンタゴニスト
は、非競争的ニコチン性アンタゴニスト例えばセルトラリン、パロキセチン、ネ
ファクソドン、ベンラファクシン、フルオキセチン、ブプロプリオン、フェンシ
クリジン及びイボガインであってよい。この発明の他の具体例において、ニコチ
ン性アンタゴニストは、ニコチン性レセプター機能を阻止する抗体であってよい
。この発明の尚別の具体例において、ニコチン性アンタゴニストは、ニコチン性
アンタゴニストの様にさようするアゴニストであってよい。
【００１２】
この発明は、宿主動物の眼の出生後成長を制御するニコチン性アンタゴニスト
の能力を、動物の眼を治療上有効な量のニコチン性アンタゴニストに接触させ、
治療上有効な量のニコチン性アンタゴニストにさらした眼の成長の変化を検出し
、その後、公知の制御剤を第二の眼に投与してその第二の眼の成長の変化に対す
る制御剤の結果を観察し、そして治療上有効な量のニコチン性アンタゴニストに
さらした第一の眼の成長の変化を公知の制御剤にさらした第二の眼の成長の変化
と比較し、それにより、出生後の眼の成長を制御する能力を有するニコチン性ア
ンタゴニストを同定することにより検出する方法を提供する。更には、ニコチン
性アンタゴニストを出生後の眼の成長を制御する能力を有する活性な薬剤として
同定し、混合物中の活性な薬剤を医薬用賦形剤と合わせるステップを含む製薬方
法を提供する。
の能力を、動物の眼を治療上有効な量のニコチン性アンタゴニストに接触させ、
治療上有効な量のニコチン性アンタゴニストにさらした眼の成長の変化を検出し
、その後、公知の制御剤を第二の眼に投与してその第二の眼の成長の変化に対す
る制御剤の結果を観察し、そして治療上有効な量のニコチン性アンタゴニストに
さらした第一の眼の成長の変化を公知の制御剤にさらした第二の眼の成長の変化
と比較し、それにより、出生後の眼の成長を制御する能力を有するニコチン性ア
ンタゴニストを同定することにより検出する方法を提供する。更には、ニコチン
性アンタゴニストを出生後の眼の成長を制御する能力を有する活性な薬剤として
同定し、混合物中の活性な薬剤を医薬用賦形剤と合わせるステップを含む製薬方
法を提供する。
【００１３】
この発明は、近視を調節するために用いることのできる化合物を同定する方法
であって、ニコチン性レセプターを発現する細胞を試験化合物の存在下及び非存
在下でインキュベートし、試験化合物が少なくとも一のニコチン性レセプターに
結合するかどうかを測定し、少なくとも一のニコチン性レセプターに結合した試
験化合物を選択し、その選択した化合物を試験動物に投与し、その試験化合物が
試験動物における近視の発生を変えるかどうかを測定し、そして試験動物の近視
の発生を変える化合物を選択するステップを含む当該方法を提供する。
であって、ニコチン性レセプターを発現する細胞を試験化合物の存在下及び非存
在下でインキュベートし、試験化合物が少なくとも一のニコチン性レセプターに
結合するかどうかを測定し、少なくとも一のニコチン性レセプターに結合した試
験化合物を選択し、その選択した化合物を試験動物に投与し、その試験化合物が
試験動物における近視の発生を変えるかどうかを測定し、そして試験動物の近視
の発生を変える化合物を選択するステップを含む当該方法を提供する。
【００１４】
発明の詳細な説明
神経系は、網膜の大部分において、眼の成長を出生後に制御し、屈折エラーの
発生(レンズに必要)は、主として神経機構に依存するようである。最も一般的な
屈折エラーは、臨床的には、近視である。本願の開示は、近視の実験モデルに対
する活性を有する医薬クラス、ニコチン性アンタゴニストを含むが、それは又、
「正常の」眼の成長をも阻害する。
発生(レンズに必要)は、主として神経機構に依存するようである。最も一般的な
屈折エラーは、臨床的には、近視である。本願の開示は、近視の実験モデルに対
する活性を有する医薬クラス、ニコチン性アンタゴニストを含むが、それは又、
「正常の」眼の成長をも阻害する。
【００１５】
本発明において、発明者は、有望な薬理学的特性を有する幾つかのニコチン性
アンタゴニストのヒナの眼の成長に対する効果を、硝子体注入の効率的経路を用
いて試験した。選択した４つのニコチン性アンタゴニストは、クロルイソンダミ
ン(ＣＨＬ)、メカミラミン(ＭＥＣ)、メチルカコニチン(ＭＬＡ)及びジヒドロ−
β−エリスロイジン(ＤＨＢＥ)であった。ヒナを用いる動物モデルは、ヒトの眼
のモデルとして優れた光学的諸特性の利点を提供する。ニューロンのニコチン性
レセプターに対する確立されたプロフィルを有し且つ神経組織への拡散に適合性
の親油性を有するアンタゴニストを用いて、我々は、眼の成長の制御におけるニ
コチン性レセプターの真の役割(おそらく、中心的役割)についての証拠を見出し
た。
アンタゴニストのヒナの眼の成長に対する効果を、硝子体注入の効率的経路を用
いて試験した。選択した４つのニコチン性アンタゴニストは、クロルイソンダミ
ン(ＣＨＬ)、メカミラミン(ＭＥＣ)、メチルカコニチン(ＭＬＡ)及びジヒドロ−
β−エリスロイジン(ＤＨＢＥ)であった。ヒナを用いる動物モデルは、ヒトの眼
のモデルとして優れた光学的諸特性の利点を提供する。ニューロンのニコチン性
レセプターに対する確立されたプロフィルを有し且つ神経組織への拡散に適合性
の親油性を有するアンタゴニストを用いて、我々は、眼の成長の制御におけるニ
コチン性レセプターの真の役割(おそらく、中心的役割)についての証拠を見出し
た。
【００１６】
この発明は、出生後の眼の成長を調節し及び出生後の眼の成長又は近視の発生
を阻止する関連標的部位に浸透するのに適した溶解特性を有するニコチン性アン
タゴニストの利用に向けられている。眼の成長の制御につき以前に同定されたす
べての薬物クラスは、物影喪失による近視モデル(約１週齢から、眼を保護眼鏡
で覆い続けている)に対してのみ活性を示す。本発明は、開いた眼(成熟中、保護
眼鏡によって視覚を奪われていない)に対しても活性な薬物クラスを同定し；そ
れは、この活性を示すことが同定された薬剤の第一のクラスである。開いた眼に
対するこの活性は、ヒトの近視(通常環境では物影喪失によらない)への適用にお
いて有利である。ヒナは瞳孔の大きさ及び調節の制御にニコチン性レセプターを
利用するが、哺乳動物の眼は、ムスカリン性レセプターのサブクラスを利用して
瞳孔の大きさ及び調節を制御し；それ故、ニコチン性アンタゴニストは、ヒトの
眼における局所適用の後に、瞳孔拡大及び子供における調節の麻痺を誘導するこ
となく十分に許容されると予想される。
を阻止する関連標的部位に浸透するのに適した溶解特性を有するニコチン性アン
タゴニストの利用に向けられている。眼の成長の制御につき以前に同定されたす
べての薬物クラスは、物影喪失による近視モデル(約１週齢から、眼を保護眼鏡
で覆い続けている)に対してのみ活性を示す。本発明は、開いた眼(成熟中、保護
眼鏡によって視覚を奪われていない)に対しても活性な薬物クラスを同定し；そ
れは、この活性を示すことが同定された薬剤の第一のクラスである。開いた眼に
対するこの活性は、ヒトの近視(通常環境では物影喪失によらない)への適用にお
いて有利である。ヒナは瞳孔の大きさ及び調節の制御にニコチン性レセプターを
利用するが、哺乳動物の眼は、ムスカリン性レセプターのサブクラスを利用して
瞳孔の大きさ及び調節を制御し；それ故、ニコチン性アンタゴニストは、ヒトの
眼における局所適用の後に、瞳孔拡大及び子供における調節の麻痺を誘導するこ
となく十分に許容されると予想される。
【００１７】
第一節 ニコチン性レセプターのサブタイプ
ニコチン性アセチルコリンレセプターサブタイプは、５つの相同なサブユニッ
トからなり、それらは、アセチルコリンで開閉されるカチオンチャンネルを形成
する(Lindstrom,1997,Mol.Neurobiology,15:193-222)。１７の公知のニコチン性
レセプターサブユニット(α１−１０、β１−４、γ、δ及びε)がある。各サブ
ユニットは、４つの膜貫通ドメインを有する。アセチルコリン結合部位は、αサ
ブニット(主たる構成成分)上の少なくとも３つのペプチドループ及び隣接サブユ
ニット(相補的成分)上の２つのペプチドループにより形成される。すべてのαサ
ブユニットは、２つのタンデムシステイン残基をアセチルコリン結合に関与する
部位の近くに有するが、αと呼ばれないサブユニットは、これらのタンデムシス
テインを欠いている。別のスプラシングを受けた型のα４サブユニット(α４−
１及びα４−２；ラット)及びα１サブユニット(ヒト)が見出されている(Mandel
zys,A.等(1995)J.Neurophysiol.74,1212-1221；Papke,R.L.等(1996)Neurosci.Le
tt.213,201-204；Albuquerque,E.X.等(1997)J.Pharmacol.Exp.Ther.280,1117-11
36；deFiebre,C.M.等(1995)Mol.Pharmacol.47,164-171)。
トからなり、それらは、アセチルコリンで開閉されるカチオンチャンネルを形成
する(Lindstrom,1997,Mol.Neurobiology,15:193-222)。１７の公知のニコチン性
レセプターサブユニット(α１−１０、β１−４、γ、δ及びε)がある。各サブ
ユニットは、４つの膜貫通ドメインを有する。アセチルコリン結合部位は、αサ
ブニット(主たる構成成分)上の少なくとも３つのペプチドループ及び隣接サブユ
ニット(相補的成分)上の２つのペプチドループにより形成される。すべてのαサ
ブユニットは、２つのタンデムシステイン残基をアセチルコリン結合に関与する
部位の近くに有するが、αと呼ばれないサブユニットは、これらのタンデムシス
テインを欠いている。別のスプラシングを受けた型のα４サブユニット(α４−
１及びα４−２；ラット)及びα１サブユニット(ヒト)が見出されている(Mandel
zys,A.等(1995)J.Neurophysiol.74,1212-1221；Papke,R.L.等(1996)Neurosci.Le
tt.213,201-204；Albuquerque,E.X.等(1997)J.Pharmacol.Exp.Ther.280,1117-11
36；deFiebre,C.M.等(1995)Mol.Pharmacol.47,164-171)。
【００１８】
これらのレセプターは、３つの一般的なクラス(１つの筋肉クラスと２つの神
経クラス)に入る。筋肉型は、２つの型(胎児型及び成体型)でのみ存在し、各々
は、α１サブユニットと他の筋肉レセプターに特異的なサブユニットを有する。
一つのクラスの神経レセプターは、α−ブンガロトキシンに結合し、α７、α９
又はα１０サブユニットからなり、しばしば同価同義レセプターである。他のク
ラスの神経レセプターは、α−ブンガロトキシンに結合せず且つα２、α３、α
４又はα６サブユニットをβ２又はβ４サブユニットと組合せることにより形成
される。イン・ビボ研究に適した選択的薬物の迅速な脱感作及び限られた利用可
能性により、これらの生化学的に規定されたレセプターサブタイプの生理学的機
能を規定することが損なわれてきた。ニコチン性レセプターサブタイプの要約を
表Ａに与える。
経クラス)に入る。筋肉型は、２つの型(胎児型及び成体型)でのみ存在し、各々
は、α１サブユニットと他の筋肉レセプターに特異的なサブユニットを有する。
一つのクラスの神経レセプターは、α−ブンガロトキシンに結合し、α７、α９
又はα１０サブユニットからなり、しばしば同価同義レセプターである。他のク
ラスの神経レセプターは、α−ブンガロトキシンに結合せず且つα２、α３、α
４又はα６サブユニットをβ２又はβ４サブユニットと組合せることにより形成
される。イン・ビボ研究に適した選択的薬物の迅速な脱感作及び限られた利用可
能性により、これらの生化学的に規定されたレセプターサブタイプの生理学的機
能を規定することが損なわれてきた。ニコチン性レセプターサブタイプの要約を
表Ａに与える。
【００１９】
ＮＣ−ＩＵＰＨＡＲのニコチン性レセプター分科委員会は、公知の、天然にお
いて発現されるｎＡＣｈレセプターサブタイプのサブユニット組成に基づく及び
／又は異種発現により形成されるサブタイプに基づくニコチン性アセチルコリン
(ｎＡＣｈ)レセプターの命名法及び分類体系を推奨している(Lukas等(1999)IUPH
AR XX. Current status of the nomenclature for nicotinic acetylcholine re
ceptors and their subunits. Pharm.Rev.51,397-401)。表Ａの上部は、ｎＡＣ
ｈレセプターサブタイプに含まれる予め決められたαサブユニットに基づくｎＡ
Ｃｈレセプターサブタイプを示す略号を表している。示されたαサブユニットの
後ろのアスタリスクは、他のサブユニットが、指名されたｎＡＣｈレセプターサ
ブタイプを形成するように、示されたαサブユニットとアセンブルし又はアセン
ブルしうることが知られていることを意味する。アスタリスクのないことは、示
されたサブユニットが、アセンブルして同価同義ｎＡＣｈレセプターサブタイプ
になることが知られていることを示す。サブユニットの化学量論が公知の場合に
は、特異的なｎＡＣｈレセプターサブタイプ中の特定のサブユニットの数は、角
型括弧内のサブユニットに続く下付き文字により示されている。すべてのサブユ
ニットは、哺乳動物起源であるが、α８は例外(鳥類)である。
いて発現されるｎＡＣｈレセプターサブタイプのサブユニット組成に基づく及び
／又は異種発現により形成されるサブタイプに基づくニコチン性アセチルコリン
(ｎＡＣｈ)レセプターの命名法及び分類体系を推奨している(Lukas等(1999)IUPH
AR XX. Current status of the nomenclature for nicotinic acetylcholine re
ceptors and their subunits. Pharm.Rev.51,397-401)。表Ａの上部は、ｎＡＣ
ｈレセプターサブタイプに含まれる予め決められたαサブユニットに基づくｎＡ
Ｃｈレセプターサブタイプを示す略号を表している。示されたαサブユニットの
後ろのアスタリスクは、他のサブユニットが、指名されたｎＡＣｈレセプターサ
ブタイプを形成するように、示されたαサブユニットとアセンブルし又はアセン
ブルしうることが知られていることを意味する。アスタリスクのないことは、示
されたサブユニットが、アセンブルして同価同義ｎＡＣｈレセプターサブタイプ
になることが知られていることを示す。サブユニットの化学量論が公知の場合に
は、特異的なｎＡＣｈレセプターサブタイプ中の特定のサブユニットの数は、角
型括弧内のサブユニットに続く下付き文字により示されている。すべてのサブユ
ニットは、哺乳動物起源であるが、α８は例外(鳥類)である。
【００２０】
第1.1節 ニコチン性レセプターサブタイプ及び眼
ヒナの網膜は、幾つかのクラスのコリン作動性ニューロンを含んでいる(Mille
r等、1987, Neurosci.,21:725-743)。ムスカリン性アセチルコリンレセプターの
幾つかのサブタイプ(Fischer等、1998a, J.Comp.Neurol.,392:273-84)の他に、
ヒナの網膜は、様々なニコチン性アセチルコリンレセプターサブタイプ(α３、
α６、α７、α８及びβ２、β３、β４を含む)を発現している。ヒナの網膜に
おけるニコチン性レセプターの神経局在性の細胞パターンは、複雑である(Hamas
saki-Britto等、1994a, Vis.Neurosci.,11:63-70；Hamassaki-Britto等、1994b,
J.Comp.Neurol.,347:161-170；Keyser等、1993, J.Neurosci.,13:442-454；Vail
ate等、1999, Mol.Pharmacol.,56:11-19)。ヒナの毛様体神経節は、同様に、ニ
コチン性レセプターサブタイプの多様性に富んでおり、それは、αサブユニット
(自律神経節に典型的)、α５、α７、β２又はβ４サブユニット(シナプス及び
シナプス以外に局在化)を含む(Berg等、1998, Neuronal Nicotinic Receptors:
Pharmacology and Therapeutic Opportunities, p.187-196；Conroy及びBerg, 1
995, J.Biol.Chem.,270:4424-4431；Horch及びSargent, 1995, J.Neurosci.,15:
7778-7795；Pugh等、1995, Mol.Pharmacol.,47:717-725)。
r等、1987, Neurosci.,21:725-743)。ムスカリン性アセチルコリンレセプターの
幾つかのサブタイプ(Fischer等、1998a, J.Comp.Neurol.,392:273-84)の他に、
ヒナの網膜は、様々なニコチン性アセチルコリンレセプターサブタイプ(α３、
α６、α７、α８及びβ２、β３、β４を含む)を発現している。ヒナの網膜に
おけるニコチン性レセプターの神経局在性の細胞パターンは、複雑である(Hamas
saki-Britto等、1994a, Vis.Neurosci.,11:63-70；Hamassaki-Britto等、1994b,
J.Comp.Neurol.,347:161-170；Keyser等、1993, J.Neurosci.,13:442-454；Vail
ate等、1999, Mol.Pharmacol.,56:11-19)。ヒナの毛様体神経節は、同様に、ニ
コチン性レセプターサブタイプの多様性に富んでおり、それは、αサブユニット
(自律神経節に典型的)、α５、α７、β２又はβ４サブユニット(シナプス及び
シナプス以外に局在化)を含む(Berg等、1998, Neuronal Nicotinic Receptors:
Pharmacology and Therapeutic Opportunities, p.187-196；Conroy及びBerg, 1
995, J.Biol.Chem.,270:4424-4431；Horch及びSargent, 1995, J.Neurosci.,15:
7778-7795；Pugh等、1995, Mol.Pharmacol.,47:717-725)。
【００２１】
第二節 ニコチン性アンタゴニスト
ニコチン性アセチルコリンレセプター(ニコチン性レセプター又はＮＲ)の機能
は、様々な化合物により拮抗される。ＮＲに対するこれらの化合物の作用は、複
雑であり、２以上のアンタゴニズムを含むことができ、そして未だすべてが完全
に特性決定されてはいない。議論目的のための特定の薬物が、それらの現在最も
よく理解されている作用機構によって分類されている。ニコチン性アンタゴニス
トは、ニコチン性アゴニストの標的に対する如何なる効果をも阻害し、ブロック
し、競争し、妨害し、或は邪魔する化合物として規定される。我々は、この発明
で、競争性ニコチン性アンタゴニストの利用を請求している。競争性ニコチン性
アンタゴニストは、ニコチン性レセプター上のアゴニスト結合部位につき競争す
るようにみえる化合物として定義される(競争性アンタゴニストは、アゴニスト
によるレセプターの活性化を妨害することによりレセプターの機能を阻害するよ
うである)。競争性アンタゴニストの例には、ジヒドロ−β−エリスロイジン、
ブンガロトキシン、ツボクラリン、メチルカコニチン、蛇由来のペプチドコノト
キシン(ＭＩ、ＥＩ、ＧＩ、ＳＩ、ＳＩＡ、ＳＩＩを含む)並びに他の天然ペプチ
ドアンタゴニスト及び合成のペプチドアンタゴニスト(発現ライブラリー由来)(L
indstrom, 1997, Mol.Neurobiology,15:193-222)が含まれるが、これらに限らな
い。
は、様々な化合物により拮抗される。ＮＲに対するこれらの化合物の作用は、複
雑であり、２以上のアンタゴニズムを含むことができ、そして未だすべてが完全
に特性決定されてはいない。議論目的のための特定の薬物が、それらの現在最も
よく理解されている作用機構によって分類されている。ニコチン性アンタゴニス
トは、ニコチン性アゴニストの標的に対する如何なる効果をも阻害し、ブロック
し、競争し、妨害し、或は邪魔する化合物として規定される。我々は、この発明
で、競争性ニコチン性アンタゴニストの利用を請求している。競争性ニコチン性
アンタゴニストは、ニコチン性レセプター上のアゴニスト結合部位につき競争す
るようにみえる化合物として定義される(競争性アンタゴニストは、アゴニスト
によるレセプターの活性化を妨害することによりレセプターの機能を阻害するよ
うである)。競争性アンタゴニストの例には、ジヒドロ−β−エリスロイジン、
ブンガロトキシン、ツボクラリン、メチルカコニチン、蛇由来のペプチドコノト
キシン(ＭＩ、ＥＩ、ＧＩ、ＳＩ、ＳＩＡ、ＳＩＩを含む)並びに他の天然ペプチ
ドアンタゴニスト及び合成のペプチドアンタゴニスト(発現ライブラリー由来)(L
indstrom, 1997, Mol.Neurobiology,15:193-222)が含まれるが、これらに限らな
い。
【００２２】
我々は、この発明において、チャンネルブロッキング性ニコチン性アンタゴニ
ストの利用を請求している。チャンネルブロッキング性ニコチン性アンタゴニス
トは、ニコチン性レセプター(ＮＲ)のイオンチャンネルをブロックし、それによ
り、ニコチン性レセプター機能に必要な膜貫通イオンフラックスを妨害するよう
に見える化合物として定義される。チャンネルブロッキング性ニコチン性アンタ
ゴニストの例には、クロルイソンダミン、メカミラミン、ヘキサメトニウム、ア
マンタジン、メマンチニン、ジゾシルピン[(＋)−ＭＫ−８０１]、８(デシルア
ミノ)オクチル−３，４，５−トリメトキシベンゾエート(ＴＭＢ−８)及び亜鉛
が含まれるが、これらに限られない。(Bencherif等、1995, J.Pharmacol.and Ex
per.Therapeutics,275:1418-1426；Buisson及びBertrand, 1998, Mol.Pharmacol
.,53:555-563)。これらの化合物は、開いたチャンネル上で優先的に作用するよ
うに見える(Peng等、1997, Mol.Pharmacol.,51:776-784；Buisson及びBertrand,
1998, Mol.Pharmacol.,53:555-563)が、閉じたチャンネルをブロックする化合
物も又、この発明における利用に適している。
ストの利用を請求している。チャンネルブロッキング性ニコチン性アンタゴニス
トは、ニコチン性レセプター(ＮＲ)のイオンチャンネルをブロックし、それによ
り、ニコチン性レセプター機能に必要な膜貫通イオンフラックスを妨害するよう
に見える化合物として定義される。チャンネルブロッキング性ニコチン性アンタ
ゴニストの例には、クロルイソンダミン、メカミラミン、ヘキサメトニウム、ア
マンタジン、メマンチニン、ジゾシルピン[(＋)−ＭＫ−８０１]、８(デシルア
ミノ)オクチル−３，４，５−トリメトキシベンゾエート(ＴＭＢ−８)及び亜鉛
が含まれるが、これらに限られない。(Bencherif等、1995, J.Pharmacol.and Ex
per.Therapeutics,275:1418-1426；Buisson及びBertrand, 1998, Mol.Pharmacol
.,53:555-563)。これらの化合物は、開いたチャンネル上で優先的に作用するよ
うに見える(Peng等、1997, Mol.Pharmacol.,51:776-784；Buisson及びBertrand,
1998, Mol.Pharmacol.,53:555-563)が、閉じたチャンネルをブロックする化合
物も又、この発明における利用に適している。
【００２３】
我々は、この発明において、非競争的ニコチン性アンタゴニストの利用を請求
している。非競争的ニコチン性アンタゴニストは、ニコチン性レセプター(ＮＲ)
の機能に拮抗するが、リガンド結合部位はブロックしない(又は、イオンチャン
ネルを直接ブロックする)ように見える化合物として定義される。ニコチン性レ
セプターのイオンチャンネルを通るイオンフラックスの非競争的ニコチン性アン
タゴニストによる機能的遮断は、アゴニスト濃度を増すことによっては打ち勝つ
ことができない(Fryer及びLukas, 1999a, J.Pharmacol.and Exper.Therapeutics
,288:88-92；Fryer及びLukas, 1999b, J.Neurochem.,72:1117-1124)。エタノー
ル及び揮発性麻酔剤(テトラカイン及びプロカインを含む)は、様々なニコチン性
レセプターサブタイプの非競争的機能的ニコチン性アンタゴニストである(Bench
erif等、1995, J.Pharmacol.and Exper.Therapeutics,275:1418-1426；Lindstro
m, 1997, Mol.Neurobiology,15:193-222)。予想外の非競争的ニコチン性アンタ
ゴニストには、精神活性化化合物例えばブプロプリオン、フェンシクリジン、イ
ボガイン、セルトラリン、パロキセチン、ネファクソドン、ベンラファクシン及
びフルオキセチンが含まれる(Fryer及びLukas, 1999a, J.Pharmacol.and Exper.
Therapeutics,288:88-92；Fryer及びLukas, 1999b, J.Neurochem.,72:1117-1124
)。他の非競争的ニコチン性アンタゴニストは、負のアロステリックエフェクタ
ーとして作用することができ、公知の正のアロステリックエフェクター例えばイ
ベルメクチンにより利用されるアロステリック部位を介して作用し、又はレセプ
ター上の別の部位に作用する(Krause等、1998, Mol.Pharmacol.,53:283-294)。
ある電圧依存性の機構も又、非競争的アンタゴニストとして機能することができ
、ニコチン性レセプターイオンチャンネルの電圧感応性Ｍｇ2+ブロック、細胞内
スペルミンによる電圧依存性チャンネル遮断及び膜の脱分極により開始されるニ
コチン性レセプターの不活性化が含まれる。
している。非競争的ニコチン性アンタゴニストは、ニコチン性レセプター(ＮＲ)
の機能に拮抗するが、リガンド結合部位はブロックしない(又は、イオンチャン
ネルを直接ブロックする)ように見える化合物として定義される。ニコチン性レ
セプターのイオンチャンネルを通るイオンフラックスの非競争的ニコチン性アン
タゴニストによる機能的遮断は、アゴニスト濃度を増すことによっては打ち勝つ
ことができない(Fryer及びLukas, 1999a, J.Pharmacol.and Exper.Therapeutics
,288:88-92；Fryer及びLukas, 1999b, J.Neurochem.,72:1117-1124)。エタノー
ル及び揮発性麻酔剤(テトラカイン及びプロカインを含む)は、様々なニコチン性
レセプターサブタイプの非競争的機能的ニコチン性アンタゴニストである(Bench
erif等、1995, J.Pharmacol.and Exper.Therapeutics,275:1418-1426；Lindstro
m, 1997, Mol.Neurobiology,15:193-222)。予想外の非競争的ニコチン性アンタ
ゴニストには、精神活性化化合物例えばブプロプリオン、フェンシクリジン、イ
ボガイン、セルトラリン、パロキセチン、ネファクソドン、ベンラファクシン及
びフルオキセチンが含まれる(Fryer及びLukas, 1999a, J.Pharmacol.and Exper.
Therapeutics,288:88-92；Fryer及びLukas, 1999b, J.Neurochem.,72:1117-1124
)。他の非競争的ニコチン性アンタゴニストは、負のアロステリックエフェクタ
ーとして作用することができ、公知の正のアロステリックエフェクター例えばイ
ベルメクチンにより利用されるアロステリック部位を介して作用し、又はレセプ
ター上の別の部位に作用する(Krause等、1998, Mol.Pharmacol.,53:283-294)。
ある電圧依存性の機構も又、非競争的アンタゴニストとして機能することができ
、ニコチン性レセプターイオンチャンネルの電圧感応性Ｍｇ2+ブロック、細胞内
スペルミンによる電圧依存性チャンネル遮断及び膜の脱分極により開始されるニ
コチン性レセプターの不活性化が含まれる。
【００２４】
我々は、この発明において、ニコチン性アンタゴニストとして作用する抗体の
利用を請求している。抗体は又、ニコチン性アンタゴニストとしても作用するこ
とができ；例えば、モノクローナル抗体ｍＡｂ３１９は、細胞に注入されたとき
に、ニコチン性レセプター(ＮＲ)の機能をブロックする(Cuevas及びBerg, 1998,
J Neurosci.18:10335-10344)。抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル
抗体、ヒト化若しくはキメラ抗体、一本鎖抗体、ＦＡｂ断片 Ｆ(Ａｂ)'2断片、
ＦＡｂ発現ライブラリーにより生成される断片、抗イディオタイプ(抗Ｉｄ)抗体
及び上記の何れかのエピトープ結合性断片が含まれる。
利用を請求している。抗体は又、ニコチン性アンタゴニストとしても作用するこ
とができ；例えば、モノクローナル抗体ｍＡｂ３１９は、細胞に注入されたとき
に、ニコチン性レセプター(ＮＲ)の機能をブロックする(Cuevas及びBerg, 1998,
J Neurosci.18:10335-10344)。抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル
抗体、ヒト化若しくはキメラ抗体、一本鎖抗体、ＦＡｂ断片 Ｆ(Ａｂ)'2断片、
ＦＡｂ発現ライブラリーにより生成される断片、抗イディオタイプ(抗Ｉｄ)抗体
及び上記の何れかのエピトープ結合性断片が含まれる。
【００２５】
我々は、この発明において、ニコチン性アンタゴニストとして機能するアゴニ
ストの利用を請求している。アゴニストは、ある環境下では、例えばそれらの時
間平均化アンタゴニスト効果に基づいて、ニコチン性アンタゴニストとして機能
することもできる。可逆的脱感作が、アセチルコリン、ニコチン、エピバチジン
、シチシン、メチルカルバミルコリン及びＤＭＰＰを含む(これらに限られない)
すべてのアゴニストによる刺激の後に認められる。幾つかの化合物は、二官能性
効果を有し、幾つかのニコチン性レセプターサブタイプに対してはアゴニストと
して作用し、他のものに対してはアンタゴニストとして作用する。ヘテロ環置換
されたピリジン誘導体(＋／−)−２−(−３−ピリジニル)−１−アザビシクロ[
２．２．２]オクタン(ＲＪＲ−２４２９としても知られている)は、ヒトの筋肉
のニコチン性レセプター及び推定のα３β４含有レセプターを選択的に活性化す
るが、ラットの視床調製物においてニコチン性レセプターを阻害する。この化合
物は、ニコチン性レセプターに対する部分的アゴニストであり、ラットのシナプ
トソーム調製物からのドーパミンの放出を媒介する。(Bencherif等、1998, J.Ph
armacol.and Exper.Therapeutics,284:886-894)。十分に高濃度では、如何なる
アゴニストでも、ニコチン性レセプターの可逆的及び不可逆的脱感作及び／又は
不活性化を引き起こすことができる。従って、高いアゴニスト濃度にさらすこと
は、さらされた細胞に対する時間平均化されたアンタゴニスト効果を生じさせる
。例として、この現象は、ヒトの煙草の煙中に見出される循環ニコチンレベルに
匹敵する濃度での慢性的なニコチン曝露の後に認められ、ある種のニコチン性レ
セプターサブタイプの不活性化へと導きうる(Lindstrom, 1997, Mol.Neurobiolo
gy,15:193-222)。
ストの利用を請求している。アゴニストは、ある環境下では、例えばそれらの時
間平均化アンタゴニスト効果に基づいて、ニコチン性アンタゴニストとして機能
することもできる。可逆的脱感作が、アセチルコリン、ニコチン、エピバチジン
、シチシン、メチルカルバミルコリン及びＤＭＰＰを含む(これらに限られない)
すべてのアゴニストによる刺激の後に認められる。幾つかの化合物は、二官能性
効果を有し、幾つかのニコチン性レセプターサブタイプに対してはアゴニストと
して作用し、他のものに対してはアンタゴニストとして作用する。ヘテロ環置換
されたピリジン誘導体(＋／−)−２−(−３−ピリジニル)−１−アザビシクロ[
２．２．２]オクタン(ＲＪＲ−２４２９としても知られている)は、ヒトの筋肉
のニコチン性レセプター及び推定のα３β４含有レセプターを選択的に活性化す
るが、ラットの視床調製物においてニコチン性レセプターを阻害する。この化合
物は、ニコチン性レセプターに対する部分的アゴニストであり、ラットのシナプ
トソーム調製物からのドーパミンの放出を媒介する。(Bencherif等、1998, J.Ph
armacol.and Exper.Therapeutics,284:886-894)。十分に高濃度では、如何なる
アゴニストでも、ニコチン性レセプターの可逆的及び不可逆的脱感作及び／又は
不活性化を引き起こすことができる。従って、高いアゴニスト濃度にさらすこと
は、さらされた細胞に対する時間平均化されたアンタゴニスト効果を生じさせる
。例として、この現象は、ヒトの煙草の煙中に見出される循環ニコチンレベルに
匹敵する濃度での慢性的なニコチン曝露の後に認められ、ある種のニコチン性レ
セプターサブタイプの不活性化へと導きうる(Lindstrom, 1997, Mol.Neurobiolo
gy,15:193-222)。
【００２６】
第三節 ニコチン性レセプターの活性を調節する化合物のスクリーニングアッ セイ
下記のアッセイをデザインして、出生後の眼の成長を制御するニコチン性レセ
プター(ＮＲ)と相互作用する化合物、ＮＲを邪魔する化合物、及びＮＲ遺伝子の
活性を調節し又はＮＲのレベルを調節する化合物を同定する。更に、ＮＲに結合
してＮＲレベルを調節することのできる化合物を同定するアッセイを利用するこ
とができる。
プター(ＮＲ)と相互作用する化合物、ＮＲを邪魔する化合物、及びＮＲ遺伝子の
活性を調節し又はＮＲのレベルを調節する化合物を同定する。更に、ＮＲに結合
してＮＲレベルを調節することのできる化合物を同定するアッセイを利用するこ
とができる。
【００２７】
この発明によってスクリーニングされうる化合物には、ＮＲに結合して、天然
のリガンド(即ち、アゴニスト)により開始される活性を真似し又は天然のリガン
ド(即ち、アンタゴニスト)により開始される活性を阻害するペプチド、抗体及び
その断片及び他の有機化合物(例えば、ペプチド模倣物)、並びにＮＲのドメイン
(又はその部分)を模倣して、天然のリガンドに結合して「中和する」ペプチド、
抗体又はその断片及び他の有機化合物が含まれるが、これらに限られない。
のリガンド(即ち、アゴニスト)により開始される活性を真似し又は天然のリガン
ド(即ち、アンタゴニスト)により開始される活性を阻害するペプチド、抗体及び
その断片及び他の有機化合物(例えば、ペプチド模倣物)、並びにＮＲのドメイン
(又はその部分)を模倣して、天然のリガンドに結合して「中和する」ペプチド、
抗体又はその断片及び他の有機化合物が含まれるが、これらに限られない。
【００２８】
かかる化合物には、天然のペプチド例えばコノトキシン、合成のペプチド例え
ば可溶性ペプチドが含まれるが、これらに限られず、ランダムペプチドライブラ
リー(例えば、Lam等、1991, Nature,354:82-84；Houghten等、1991, Nature,354
:84-86参照)、及びＤ−及び／又はＬ−配置アミノ酸から作られたコンビナトリ
アルケミストリー由来の分子ライブラリー のメンバー、ホスホペプチド(ランダ
ム又は部分的に縮重した、ディレクテッドホスホペプチドライブラリーのメンバ
ーを含むが、これらに限られない；(例えば、Songyang等、1993, Cell,72:767-7
78参照)、抗体(ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、抗イディオタイプ、
キメラ又は一本鎖抗体、及びＦＡｂ、Ｆ(Ａｂ')2及びＦＡｂ発現ライブラリー断
片並びにこれらのエピトープ結合性断片を含むが、これらに限られない)、及び
小さい有機又は無機の分子を含むがこれらに限らない。
ば可溶性ペプチドが含まれるが、これらに限られず、ランダムペプチドライブラ
リー(例えば、Lam等、1991, Nature,354:82-84；Houghten等、1991, Nature,354
:84-86参照)、及びＤ−及び／又はＬ−配置アミノ酸から作られたコンビナトリ
アルケミストリー由来の分子ライブラリー のメンバー、ホスホペプチド(ランダ
ム又は部分的に縮重した、ディレクテッドホスホペプチドライブラリーのメンバ
ーを含むが、これらに限られない；(例えば、Songyang等、1993, Cell,72:767-7
78参照)、抗体(ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、抗イディオタイプ、
キメラ又は一本鎖抗体、及びＦＡｂ、Ｆ(Ａｂ')2及びＦＡｂ発現ライブラリー断
片並びにこれらのエピトープ結合性断片を含むが、これらに限られない)、及び
小さい有機又は無機の分子を含むがこれらに限らない。
【００２９】
この発明によってスクリーニングすることのできる他の化合物には、血液網膜
又は血液体液関門を横切り、適当な細胞に入って、ＮＲ遺伝子又はＮＲシグナル
変換経路に関与する幾つかの他の遺伝子の発現に影響を及ぼす(例えば、遺伝子
発現に関与する調節領域又は転写因子と相補作用することによって)ことのでき
る小さい有機分子；又はＮＲの活性若しくはＮＲシグナル変換経路に関与する幾
つかの他の細胞内因子の活性に影響を及ぼすような化合物が含まれるが、これら
に限られない。
又は血液体液関門を横切り、適当な細胞に入って、ＮＲ遺伝子又はＮＲシグナル
変換経路に関与する幾つかの他の遺伝子の発現に影響を及ぼす(例えば、遺伝子
発現に関与する調節領域又は転写因子と相補作用することによって)ことのでき
る小さい有機分子；又はＮＲの活性若しくはＮＲシグナル変換経路に関与する幾
つかの他の細胞内因子の活性に影響を及ぼすような化合物が含まれるが、これら
に限られない。
【００３０】
コンピューターモデリング及び検索技術は、ＮＲ活性を調節することのできる
化合物の同定、又は既に同定された化合物の改良を可能にする。かかる化合物又
は組成物が同定されている場合には、それらの活性部位又は領域を同定する。か
かる活性部位は、典型的には、リガンド結合部位例えばリガンドとＮＲ自身との
相互作用ドメインであってよい。この活性部位は、当分野で公知の方法を用いて
例えばペプチドのアミノ酸配列から、核酸のヌクレオチド配列から、又は関連化
合物若しくは組成物とその天然のリガンドとの複合体の研究から同定することが
できる。後者の場合、化学又はＸ線結晶学的方法を用いて、因子上のどこに複合
体化リガンドが見出されるかを見出すことによって活性部位を見出すことができ
る。次に、活性部位の三次元的幾何学構造を決定する。これは、完全な分子構造
を決定することのできるＸ線結晶学を含む公知の方法によって行うことができる
。他方において、固相又は液相ＮＭＲを用いて、ある分子内距離を測定すること
ができる。任意の他の構造決定の実験方法を用いて、部分的又は完全な幾何学的
構造を得ることができる。これらの幾何学的構造は、測定される活性部位構造の
精度を上げうる複合体化リガンド(天然又は人工物)を用いて測定することができ
る。
化合物の同定、又は既に同定された化合物の改良を可能にする。かかる化合物又
は組成物が同定されている場合には、それらの活性部位又は領域を同定する。か
かる活性部位は、典型的には、リガンド結合部位例えばリガンドとＮＲ自身との
相互作用ドメインであってよい。この活性部位は、当分野で公知の方法を用いて
例えばペプチドのアミノ酸配列から、核酸のヌクレオチド配列から、又は関連化
合物若しくは組成物とその天然のリガンドとの複合体の研究から同定することが
できる。後者の場合、化学又はＸ線結晶学的方法を用いて、因子上のどこに複合
体化リガンドが見出されるかを見出すことによって活性部位を見出すことができ
る。次に、活性部位の三次元的幾何学構造を決定する。これは、完全な分子構造
を決定することのできるＸ線結晶学を含む公知の方法によって行うことができる
。他方において、固相又は液相ＮＭＲを用いて、ある分子内距離を測定すること
ができる。任意の他の構造決定の実験方法を用いて、部分的又は完全な幾何学的
構造を得ることができる。これらの幾何学的構造は、測定される活性部位構造の
精度を上げうる複合体化リガンド(天然又は人工物)を用いて測定することができ
る。
【００３１】
不完全な又は不十分な精度の構造が決定された場合には、コンピューターベー
スの数値モデリングの方法を用いて、その構造を完全なものにし又はその精度を
改善することができる。任意の認められたモデリング方法を用いることができ、
該方法には、特定の生体高分子例えばタンパク質又は核酸に特異的なパラメータ
ー表示モデル、分子運動の計算に基づく分子動力学モデル、熱的集団に基づく統
計力学的モデル、又は組合せたモデルが含まれる。殆どの型のモデルについて、
標準的分子力場(構成原子及び原子団間の力を表す)が必要であり、物理化学で公
知の力の場から選択することができる。(Bencherif等、1998, J.Pharmacol.and
Exper.Therapeutics,284:886-894) 不完全な又は一層精度の低い実験的構造は、
これらのモデリング法により計算される完全な及び一層正確な構造への束縛とし
て役立ちうる。
スの数値モデリングの方法を用いて、その構造を完全なものにし又はその精度を
改善することができる。任意の認められたモデリング方法を用いることができ、
該方法には、特定の生体高分子例えばタンパク質又は核酸に特異的なパラメータ
ー表示モデル、分子運動の計算に基づく分子動力学モデル、熱的集団に基づく統
計力学的モデル、又は組合せたモデルが含まれる。殆どの型のモデルについて、
標準的分子力場(構成原子及び原子団間の力を表す)が必要であり、物理化学で公
知の力の場から選択することができる。(Bencherif等、1998, J.Pharmacol.and
Exper.Therapeutics,284:886-894) 不完全な又は一層精度の低い実験的構造は、
これらのモデリング法により計算される完全な及び一層正確な構造への束縛とし
て役立ちうる。
【００３２】
最後に、活性部位の構造を決定したならば、実験的に、モデリングにより、又
は組合せによって、候補の調節化合物を、それらの分子構造についての情報に加
えて、化合物を含むデータベースを、検索することによって同定することができ
る。かかる検索は、決定された活性部位構造と一致する構造を有し且つその活性
部位を規定する原子団と相互作用する構造を有する化合物を探し出す。かかる検
索は、手作業でできるが、コンピューターの助けによるのが好ましい。この検索
から見出された化合物は、潜在的なＮＲ調節化合物である。
は組合せによって、候補の調節化合物を、それらの分子構造についての情報に加
えて、化合物を含むデータベースを、検索することによって同定することができ
る。かかる検索は、決定された活性部位構造と一致する構造を有し且つその活性
部位を規定する原子団と相互作用する構造を有する化合物を探し出す。かかる検
索は、手作業でできるが、コンピューターの助けによるのが好ましい。この検索
から見出された化合物は、潜在的なＮＲ調節化合物である。
【００３３】
或は、これらの方法を用いて、改良された調節化合物を既に知られている調節
化合物又はリガンドから同定することができる。公知の化合物の組成物を改変す
ることができ、改変の構造的効果を実験的又はコンピューターモデリング方法例
えば新規な組成物に適用した上記のものを用いて測定することができる。この改
変した構造を、次いで、化合物の活性部位の構造と比較して、改良された適合又
は相互作用が生じるかどうかを測定する。この方法において、側基の変更などに
よる組成物中の系統的変動を迅速に評価して、改良された特異性又は活性を有す
る改変された調節化合物又はリガンドを得ることができる。
化合物又はリガンドから同定することができる。公知の化合物の組成物を改変す
ることができ、改変の構造的効果を実験的又はコンピューターモデリング方法例
えば新規な組成物に適用した上記のものを用いて測定することができる。この改
変した構造を、次いで、化合物の活性部位の構造と比較して、改良された適合又
は相互作用が生じるかどうかを測定する。この方法において、側基の変更などに
よる組成物中の系統的変動を迅速に評価して、改良された特異性又は活性を有す
る改変された調節化合物又はリガンドを得ることができる。
【００３４】
ＮＲの活性部位並びに関連する変換及び転写因子の同定に基づいて調節化合物
を同定するのに有用な更なる実験的及びコンピューターモデリング方法は、当業
者には明らかとなろう。
を同定するのに有用な更なる実験的及びコンピューターモデリング方法は、当業
者には明らかとなろう。
【００３５】
分子モデリングシステムの例は、ＣＨＡＲＭＭ及びＱＵＡＮＴＡプログラム(
マサチューセッツ、Waltham, Polygen Corporation)である。ＣＨＡＲＭＭは、
エネルギー最小化及び分子力学的機能を遂行する。ＱＵＡＮＴＡは、分子構造の
構築、グラフィックモデリング及び分析を遂行する。ＱＵＡＮＴＡは、分子同士
の挙動の相互作用の組立て、改変、可視化及び分析を可能にする。
マサチューセッツ、Waltham, Polygen Corporation)である。ＣＨＡＲＭＭは、
エネルギー最小化及び分子力学的機能を遂行する。ＱＵＡＮＴＡは、分子構造の
構築、グラフィックモデリング及び分析を遂行する。ＱＵＡＮＴＡは、分子同士
の挙動の相互作用の組立て、改変、可視化及び分析を可能にする。
【００３６】
多くの論文が、薬物の特定のタンパク質との相互作用のコンピューターモデリ
ングを総説している、例えば、Rotivinen等、1988, Acta Pharmaceutical Fenni
ca 97:159-166；Ripka, New Scientist 54-57(1988年６月16日)；McKinaly及びR
ossmann, 1989, Annu.Rev.Pharmacol.Toxiciol.29:111-122；Perry及びDavies,
OSAR: Quantitative Structure-Activity Relationships in Drug Design p.189
-193(Alan R.Liss,Inc. 1989)；Lewis及びDean, 1989, Proc.R.Soc.Lond.236:12
5-140及び141-162；及び核酸成分に対するモデルレセプターに関しては、Askew
等、1989, J.Am.Chem.Soc.111:1082-1090がある。他の化学物質をスクリーニン
グし及びグラフィカルに描くコンピュータープログラムは、BioDesign,Inc.(カ
リフォルニア、Pasadena)、Allelix,Inc.(カナダ国、オンタリオ、Mississauga)
及びHypercube,Inc.(オンタリオ、Cambridge)などの会社から入手可能である。
これらは、主として、特定のタンパク質に特異的な薬物に適用するためにデザイ
ンされているが、ＮＲをコードするＤＮＡ及びＲＮＡ領域が一度同定されれば、
該領域に特異的な薬物のデザインのために適合させることができる。
ングを総説している、例えば、Rotivinen等、1988, Acta Pharmaceutical Fenni
ca 97:159-166；Ripka, New Scientist 54-57(1988年６月16日)；McKinaly及びR
ossmann, 1989, Annu.Rev.Pharmacol.Toxiciol.29:111-122；Perry及びDavies,
OSAR: Quantitative Structure-Activity Relationships in Drug Design p.189
-193(Alan R.Liss,Inc. 1989)；Lewis及びDean, 1989, Proc.R.Soc.Lond.236:12
5-140及び141-162；及び核酸成分に対するモデルレセプターに関しては、Askew
等、1989, J.Am.Chem.Soc.111:1082-1090がある。他の化学物質をスクリーニン
グし及びグラフィカルに描くコンピュータープログラムは、BioDesign,Inc.(カ
リフォルニア、Pasadena)、Allelix,Inc.(カナダ国、オンタリオ、Mississauga)
及びHypercube,Inc.(オンタリオ、Cambridge)などの会社から入手可能である。
これらは、主として、特定のタンパク質に特異的な薬物に適用するためにデザイ
ンされているが、ＮＲをコードするＤＮＡ及びＲＮＡ領域が一度同定されれば、
該領域に特異的な薬物のデザインのために適合させることができる。
【００３７】
結合を変えることのできる化合物のデザイン及び生成に関して上記したが、天
然物又は合成化学物質及び生物学的に活性な物質(タンパク質を含む)を含む公知
の化合物のライブラリーを、インヒビター又はアクチベーターである化合物につ
いてスクリーニングすることもできる。
然物又は合成化学物質及び生物学的に活性な物質(タンパク質を含む)を含む公知
の化合物のライブラリーを、インヒビター又はアクチベーターである化合物につ
いてスクリーニングすることもできる。
【００３８】
ここに記載したようなアッセイによって同定された化合物は、例えば、ＮＲの
生物学的機能の評価において及び近視の改善のために有用でありうる。第３．１
〜３．３節に記載されたような技術によって同定された化合物の有効性を試験す
るためのアッセイを、以下の第３．４節で論じる。
生物学的機能の評価において及び近視の改善のために有用でありうる。第３．１
〜３．３節に記載されたような技術によって同定された化合物の有効性を試験す
るためのアッセイを、以下の第３．４節で論じる。
【００３９】
第３．１節 ＮＲに結合する化合物のイン・ビトロスクリーニングアッセイ
イン・ビトロシステムをデザインして、ＮＲと相互作用(例えば、結合)するこ
とのできる化合物を同定することができる。同定された化合物は、例えば、野生
型及び／又は変異型ＮＲ遺伝子産物の活性の調節において有用でありうるし；Ｎ
Ｒの生物学的機能の評価において有用でありうるし；正常なＮＲ相互作用を破壊
する化合物の同定のためのスクリーニングにおいて利用することができ；又はそ
れら自身がかかる相互作用を破壊することができる。
とのできる化合物を同定することができる。同定された化合物は、例えば、野生
型及び／又は変異型ＮＲ遺伝子産物の活性の調節において有用でありうるし；Ｎ
Ｒの生物学的機能の評価において有用でありうるし；正常なＮＲ相互作用を破壊
する化合物の同定のためのスクリーニングにおいて利用することができ；又はそ
れら自身がかかる相互作用を破壊することができる。
【００４０】
ＮＲに結合する化合物の同定に用いられるアッセイの原理は、ＮＲと試験化合
物の反応混合物を、これらの２成分が相互作用して結合し、そうして、複合体を
形成することができるような条件下で且つ十分な時間で調製することを含み、該
複合体は、反応混合物から除去することができ且つ／又は該混合物中で検出する
ことができるものである。これらの用いられるＮＲ種は、スクリーニングアッセ
イのゴールによって変えることができる。例えば、天然リガンドのアゴニストを
探求する場合には、完全長ＮＲ又は切り詰められたＮＲ、細胞外ドメインに対応
するペプチド又は、アッセイシステムにおいて便益(例えば、生成した複合体の
標識、単離など)を提供するタンパク質又はポリペプチドに融合されたＮＲリガ
ンド結合部位を含む融合タンパク質を利用することができる。細胞質ドメイン(
ＣＤ)と相互作用する化合物を同定することが求められる場合には、ＮＲ ＣＤに
対応するペプチド又はＮＲ ＣＤを含む融合タンパク質を用いることができる。
物の反応混合物を、これらの２成分が相互作用して結合し、そうして、複合体を
形成することができるような条件下で且つ十分な時間で調製することを含み、該
複合体は、反応混合物から除去することができ且つ／又は該混合物中で検出する
ことができるものである。これらの用いられるＮＲ種は、スクリーニングアッセ
イのゴールによって変えることができる。例えば、天然リガンドのアゴニストを
探求する場合には、完全長ＮＲ又は切り詰められたＮＲ、細胞外ドメインに対応
するペプチド又は、アッセイシステムにおいて便益(例えば、生成した複合体の
標識、単離など)を提供するタンパク質又はポリペプチドに融合されたＮＲリガ
ンド結合部位を含む融合タンパク質を利用することができる。細胞質ドメイン(
ＣＤ)と相互作用する化合物を同定することが求められる場合には、ＮＲ ＣＤに
対応するペプチド又はＮＲ ＣＤを含む融合タンパク質を用いることができる。
【００４１】
これらのスクリーニングアッセイは、様々な方法で実施することができる。例
えば、かかるアッセイを実施する一つの方法は、ＮＲタンパク質、ポリペプチド
、ペプチド又は融合タンパク質又は試験物質を固相上に繋ぎ留め、反応の最後に
固相上に繋ぎ留められたＮＲ／試験化合物複合体を検出することを包含する。か
かる方法の一具体例においては、ＮＲ反応物を固体表面に繋ぎ留め、繋ぎ留めて
ない試験化合物を直接又は間接的に標識することができる。
えば、かかるアッセイを実施する一つの方法は、ＮＲタンパク質、ポリペプチド
、ペプチド又は融合タンパク質又は試験物質を固相上に繋ぎ留め、反応の最後に
固相上に繋ぎ留められたＮＲ／試験化合物複合体を検出することを包含する。か
かる方法の一具体例においては、ＮＲ反応物を固体表面に繋ぎ留め、繋ぎ留めて
ない試験化合物を直接又は間接的に標識することができる。
【００４２】
実際には、ミクロ滴定プレートを固相として便利に利用することができる。繋
ぎ留められた成分は、非共有結合又は共有結合によって固定化されうる。非共有
結合は、単に固体表面をタンパク質溶液で被覆して乾燥することにより達成され
うる。或は、固定化すべきタンパク質に特異的な固定化抗体好ましくはモノクロ
ーナル抗体を用いて、そのタンパク質を固体表面上に繋ぎ留めることができる。
ぎ留められた成分は、非共有結合又は共有結合によって固定化されうる。非共有
結合は、単に固体表面をタンパク質溶液で被覆して乾燥することにより達成され
うる。或は、固定化すべきタンパク質に特異的な固定化抗体好ましくはモノクロ
ーナル抗体を用いて、そのタンパク質を固体表面上に繋ぎ留めることができる。
【００４３】
このアッセイを実施するためには、非固定化成分を、繋ぎ留められた成分を含
む被覆された表面に加える。反応が完了した後に、未反応成分を、形成された如
何なる複合体も固体表面上に固定されて残るような条件下で除去する(例えば、
洗浄により)。固体表面上に繋ぎ留められた複合体の検出は、多くの方法により
達成することができる。予め固定化してない成分を予備標識してある場合には、
表面上に固定化された標識の検出は、複合体が形成されたことを示す。予め固定
化してない成分を予備標識してない場合には、間接標識を用いて、表面上に繋ぎ
留められた複合体を例えば予め固定化してない成分に特異的な標識抗体を用いて
検出することができる(該抗体は、直接標識することもできるし、標識した抗−
Ｉｇ抗体を用いて間接的に標識することもできる)。
む被覆された表面に加える。反応が完了した後に、未反応成分を、形成された如
何なる複合体も固体表面上に固定されて残るような条件下で除去する(例えば、
洗浄により)。固体表面上に繋ぎ留められた複合体の検出は、多くの方法により
達成することができる。予め固定化してない成分を予備標識してある場合には、
表面上に固定化された標識の検出は、複合体が形成されたことを示す。予め固定
化してない成分を予備標識してない場合には、間接標識を用いて、表面上に繋ぎ
留められた複合体を例えば予め固定化してない成分に特異的な標識抗体を用いて
検出することができる(該抗体は、直接標識することもできるし、標識した抗−
Ｉｇ抗体を用いて間接的に標識することもできる)。
【００４４】
或は、反応を液相で行い、反応生成物を未反応成分から分離して、複合体を検
出することができ；例えばＮＲタンパク質、ポリペプチド、ペプチド又は融合タ
ンパク質又は試験化合物に特異的な固定化抗体を用いて溶液中に形成された任意
の複合体を繋ぎ留め、可能な複合体の他の成分に特異的な標識抗体を用いて繋ぎ
留められた複合体を検出する。
出することができ；例えばＮＲタンパク質、ポリペプチド、ペプチド又は融合タ
ンパク質又は試験化合物に特異的な固定化抗体を用いて溶液中に形成された任意
の複合体を繋ぎ留め、可能な複合体の他の成分に特異的な標識抗体を用いて繋ぎ
留められた複合体を検出する。
【００４５】
或は、細胞ベースのアッセイを用いて、ＮＲと相互作用する化合物を同定する
ことができる。この目的のためには、ＮＲを発現する細胞株又はＮＲを発現する
ように遺伝子工学処理(例えば、ＮＲ ＤＮＡのトランスフェクション又はトラン
スダクション)された細胞株を用いることができる。試験化合物と例えば宿主細
胞により発現された異種性ＮＲとの相互作用を、天然リガンドとの比較又は競争
により測定することができる。
ことができる。この目的のためには、ＮＲを発現する細胞株又はＮＲを発現する
ように遺伝子工学処理(例えば、ＮＲ ＤＮＡのトランスフェクション又はトラン
スダクション)された細胞株を用いることができる。試験化合物と例えば宿主細
胞により発現された異種性ＮＲとの相互作用を、天然リガンドとの比較又は競争
により測定することができる。
【００４６】
第３．２節 ＮＲと相互作用する細胞内タンパク質のアッセイ
タンパク質−タンパク質相互作用を検出するための任意の適当な方法を用いて
、ＮＲと相互作用する膜貫通タンパク質又は細胞内タンパク質を同定することが
できる。用いることのできる伝統的な方法の内には、免疫共沈法、架橋及び、溶
解物中のＮＲと相互作用するタンパク質を同定するための細胞溶解物又は細胞溶
解物及びＮＲから得られるタンパク質の勾配又はクロマトグラフィーカラムによ
る同時精製がある。これらのアッセイのためには、用いるＮＲ成分は、完全長の
ＮＲ、膜に繋ぎ留められる領域の欠けた可溶性誘導体(例えば、膜貫通領域が欠
失して生成した、細胞外ドメインを細胞性ドメインに融合して含む、切り詰めら
れたＮＲ)、細胞性ドメインに対応するペプチド又はＮＲの細胞性ドメインを含
む融合タンパク質であってよい。一度単離すれば、かかる細胞内タンパク質を同
定することができ、更に、標準的技術と共に用いて、それが相互作用するタンパ
ク質を同定することができる。例えば、ＮＲと相互作用する細胞内タンパク質の
アミノ酸配列の少なくとも一部分を、当業者に周知の技術を用いて例えばエドマ
ン分解技術によって確認することができる(例えば、Creighton, 1983, Proteins
: Structure and Molecular Principles, p.34-49参照)。得られたアミノ酸配列
を、かかる細胞内タンパク質をコードする遺伝子配列をスクリーニングするため
に用いることのできるオリゴヌクレオチド混合物の生成のためのガイドとして利
用することができる。スクリーニングは、例えば、標準的ハイブリダイゼーショ
ン又はＰＣＲ技術によって達成することができる。オリゴヌクレオチド混合物を
生成するための技術及びスクリーニング技術は、周知である(例えば、PCR Proto
cols: A Guide to Methods and Applications, 1990参照)。
、ＮＲと相互作用する膜貫通タンパク質又は細胞内タンパク質を同定することが
できる。用いることのできる伝統的な方法の内には、免疫共沈法、架橋及び、溶
解物中のＮＲと相互作用するタンパク質を同定するための細胞溶解物又は細胞溶
解物及びＮＲから得られるタンパク質の勾配又はクロマトグラフィーカラムによ
る同時精製がある。これらのアッセイのためには、用いるＮＲ成分は、完全長の
ＮＲ、膜に繋ぎ留められる領域の欠けた可溶性誘導体(例えば、膜貫通領域が欠
失して生成した、細胞外ドメインを細胞性ドメインに融合して含む、切り詰めら
れたＮＲ)、細胞性ドメインに対応するペプチド又はＮＲの細胞性ドメインを含
む融合タンパク質であってよい。一度単離すれば、かかる細胞内タンパク質を同
定することができ、更に、標準的技術と共に用いて、それが相互作用するタンパ
ク質を同定することができる。例えば、ＮＲと相互作用する細胞内タンパク質の
アミノ酸配列の少なくとも一部分を、当業者に周知の技術を用いて例えばエドマ
ン分解技術によって確認することができる(例えば、Creighton, 1983, Proteins
: Structure and Molecular Principles, p.34-49参照)。得られたアミノ酸配列
を、かかる細胞内タンパク質をコードする遺伝子配列をスクリーニングするため
に用いることのできるオリゴヌクレオチド混合物の生成のためのガイドとして利
用することができる。スクリーニングは、例えば、標準的ハイブリダイゼーショ
ン又はＰＣＲ技術によって達成することができる。オリゴヌクレオチド混合物を
生成するための技術及びスクリーニング技術は、周知である(例えば、PCR Proto
cols: A Guide to Methods and Applications, 1990参照)。
【００４７】
更に、ＮＲと相互作用する膜貫通タンパク質又は細胞内タンパク質をコードす
る遺伝子の同時同定を生じる方法を用いることができる。これらの方法は、例え
ば、発現ライブラリーを、λｇｔ１１ライブラリーの抗体プロービングの周知技
術に似た方法で、標識したＮＲタンパク質、又はＮＲポリペプチド、ペプチド又
は融合タンパク質例えばマーカー(例えば、酵素、蛍光性、発光性タンパク質、
又は染料)若しくはＩｇＧ−Ｆｃドメインに融合させたＮＲポリペプチド若しく
はＮＲドメインを用いてプローブすることを含む。
る遺伝子の同時同定を生じる方法を用いることができる。これらの方法は、例え
ば、発現ライブラリーを、λｇｔ１１ライブラリーの抗体プロービングの周知技
術に似た方法で、標識したＮＲタンパク質、又はＮＲポリペプチド、ペプチド又
は融合タンパク質例えばマーカー(例えば、酵素、蛍光性、発光性タンパク質、
又は染料)若しくはＩｇＧ−Ｆｃドメインに融合させたＮＲポリペプチド若しく
はＮＲドメインを用いてプローブすることを含む。
【００４８】
イン・ビボでのタンパク質相互作用を検出する一つの方法であるツーハイブリ
ッドシステムを、説明のためにのみ詳細に記載する(制限のためではない)。この
システムの１バージョンは、記載されており(Chien等、1991, Proc.Natl.Acad.S
ci.USA,88:9578-9582)、Clontech社(カリフォルニア、Palo Alto)から購入でき
る。
ッドシステムを、説明のためにのみ詳細に記載する(制限のためではない)。この
システムの１バージョンは、記載されており(Chien等、1991, Proc.Natl.Acad.S
ci.USA,88:9578-9582)、Clontech社(カリフォルニア、Palo Alto)から購入でき
る。
【００４９】
簡単にいえば、かかるシステムを利用するには、ツーハイブリッドタンパク質
をコードするプラスミドを構築する。一方のプラスミドは、転写アクチベーター
タンパク質のＤＮＡ結合ドメインをコードするヌクレオチドをＮＲ、ＮＲポリペ
プチド、ペプチド又は融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列に融合して
なり、他方のプラスミドは、転写アクチベータータンパク質の活性化ドメインを
コードするヌクレオチドを未知のタンパク質をコードするｃＤＮＡに融合してな
り、該タンパク質は、ｃＤＮＡライブラリーの部分としてこのプラスミド中に組
み換えられたものである。このＤＮＡ結合ドメイン融合プラスミドとｃＤＮＡラ
イブラリーを、転写調節領域が転写アクチベーター結合部位を含むレポーター遺
伝子(例えば、ＨＢＳ又はｌａｃＺ)を含む酵母サッカロミセス・セレビシエ株に
トランスフォームする。何れのハイブリッドタンパク質も、単独ではレポーター
遺伝子の転写を活性化することができない(ＤＮＡ結合ドメインを含むハイブリ
ッドは、活性化機能を与えないので転写を活性化することができず、活性化ドメ
インを含むハイブリッドは、アクチベーター結合部位に配置されえないので転写
を活性化することができない)。ツーハイブリッドタンパク質の相互作用は、機
能的アクチベータータンパク質を再構成してレポーター遺伝子の発現を生じ、こ
れは、レポーター遺伝子産物のアッセイにより検出される。
をコードするプラスミドを構築する。一方のプラスミドは、転写アクチベーター
タンパク質のＤＮＡ結合ドメインをコードするヌクレオチドをＮＲ、ＮＲポリペ
プチド、ペプチド又は融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列に融合して
なり、他方のプラスミドは、転写アクチベータータンパク質の活性化ドメインを
コードするヌクレオチドを未知のタンパク質をコードするｃＤＮＡに融合してな
り、該タンパク質は、ｃＤＮＡライブラリーの部分としてこのプラスミド中に組
み換えられたものである。このＤＮＡ結合ドメイン融合プラスミドとｃＤＮＡラ
イブラリーを、転写調節領域が転写アクチベーター結合部位を含むレポーター遺
伝子(例えば、ＨＢＳ又はｌａｃＺ)を含む酵母サッカロミセス・セレビシエ株に
トランスフォームする。何れのハイブリッドタンパク質も、単独ではレポーター
遺伝子の転写を活性化することができない(ＤＮＡ結合ドメインを含むハイブリ
ッドは、活性化機能を与えないので転写を活性化することができず、活性化ドメ
インを含むハイブリッドは、アクチベーター結合部位に配置されえないので転写
を活性化することができない)。ツーハイブリッドタンパク質の相互作用は、機
能的アクチベータータンパク質を再構成してレポーター遺伝子の発現を生じ、こ
れは、レポーター遺伝子産物のアッセイにより検出される。
【００５０】
このツーハイブリッドシステム又は関連する方法論を用いて、活性化ドメイン
ライブラリーを、「餌」遺伝子産物と相互作用するタンパク質についてスクリー
ニングすることができる。例として(限定ではない)、ＮＲを餌遺伝子産物として
用いることができる。全ゲノム又はｃＤＮＡ配列を、活性化ドメインをコードす
るＤＮＡと融合させる。このライブラリーと、餌のＮＲ遺伝子産物をＤＮＡ結合
ドメインに融合させたハイブリッドをコードするプラスミドとを、酵母レポータ
ー株に同時トランスフォームし、その結果生成したトランスフォーマントを、レ
ポーター遺伝子を発現するものについてスクリーニングする。例えば(限定では
ない)、餌のＮＲ遺伝子配列(例えば、オープンリーディングフレーム)を、翻訳
時にＧＡＬ４タンパク質のＤＮＡ結合ドメインをコードするＤＮＡと融合される
ようにベクター中にクローン化することができる。これらのクローンを精製し、
レポーター遺伝子発現の確実なライブラリープラスミドを単離する。次いで、そ
のライブラリープラスミドによりコードされるタンパク質をＤＮＡ配列決定を利
用して同定する。
ライブラリーを、「餌」遺伝子産物と相互作用するタンパク質についてスクリー
ニングすることができる。例として(限定ではない)、ＮＲを餌遺伝子産物として
用いることができる。全ゲノム又はｃＤＮＡ配列を、活性化ドメインをコードす
るＤＮＡと融合させる。このライブラリーと、餌のＮＲ遺伝子産物をＤＮＡ結合
ドメインに融合させたハイブリッドをコードするプラスミドとを、酵母レポータ
ー株に同時トランスフォームし、その結果生成したトランスフォーマントを、レ
ポーター遺伝子を発現するものについてスクリーニングする。例えば(限定では
ない)、餌のＮＲ遺伝子配列(例えば、オープンリーディングフレーム)を、翻訳
時にＧＡＬ４タンパク質のＤＮＡ結合ドメインをコードするＤＮＡと融合される
ようにベクター中にクローン化することができる。これらのクローンを精製し、
レポーター遺伝子発現の確実なライブラリープラスミドを単離する。次いで、そ
のライブラリープラスミドによりコードされるタンパク質をＤＮＡ配列決定を利
用して同定する。
【００５１】
餌のＮＲ遺伝子産物と相互作用するタンパク質を検出するのに用いられる細胞
株のｃＤＮＡライブラリーを、当分野で日常的に行われている方法を用いて作成
することができる。例えば、ここに記載の特定のシステムによって、それらのｃ
ＤＮＡ断片をベクター中に、翻訳時ＧＡＬ４の転写活性化ドメインに融合される
ように挿入することができる。このライブラリーを、餌のＮＲ遺伝子−ＧＡＬ４
融合プラスミドと共に、ＧＡＬ４活性化配列を含むプロモーターにより駆動され
るｌａｃＺ遺伝子を含む酵母株に同時トランスフォームすることができる。餌の
ＮＲ遺伝子産物と相互作用するｃＤＮＡにコードされたタンパク質(ＧＡＬ４転
写活性化ドメインに融合されたもの)は、活性なＧＡＬ４タンパク質を再構成し
、それ故、ＨＩＳ３遺伝子の発現を駆動する。ＨＩＳ３を発現するコロニーは、
ヒスチジンを欠く半固体寒天ベースの培地を含むペトリ皿上での成長により検出
することができる。このｃＤＮＡを、次いで、これらの株から精製して、餌のＮ
Ｒ遺伝子産物と相互作用するタンパク質を当分野で日常的に行われている技術を
用いて生成して単離するのに利用することができる。
株のｃＤＮＡライブラリーを、当分野で日常的に行われている方法を用いて作成
することができる。例えば、ここに記載の特定のシステムによって、それらのｃ
ＤＮＡ断片をベクター中に、翻訳時ＧＡＬ４の転写活性化ドメインに融合される
ように挿入することができる。このライブラリーを、餌のＮＲ遺伝子−ＧＡＬ４
融合プラスミドと共に、ＧＡＬ４活性化配列を含むプロモーターにより駆動され
るｌａｃＺ遺伝子を含む酵母株に同時トランスフォームすることができる。餌の
ＮＲ遺伝子産物と相互作用するｃＤＮＡにコードされたタンパク質(ＧＡＬ４転
写活性化ドメインに融合されたもの)は、活性なＧＡＬ４タンパク質を再構成し
、それ故、ＨＩＳ３遺伝子の発現を駆動する。ＨＩＳ３を発現するコロニーは、
ヒスチジンを欠く半固体寒天ベースの培地を含むペトリ皿上での成長により検出
することができる。このｃＤＮＡを、次いで、これらの株から精製して、餌のＮ
Ｒ遺伝子産物と相互作用するタンパク質を当分野で日常的に行われている技術を
用いて生成して単離するのに利用することができる。
【００５２】
第３．３節 ＮＲ／細胞内又はＮＲ／膜貫通巨大分子相互作用を邪魔する化合 物のアッセイ
ＮＲと相互作用する巨大分子を、この議論の目的のために、「結合パートナー
」として言及する。これらの結合パートナーが、ＮＲシグナル変換経路に関与し
、それ故、出生後の眼の成長の制御におけるＮＲの役割に関与していることはあ
りそうなことである。それ故、かかる結合パートナーとＮＲとの相互作用を邪魔
し又は破壊する化合物を同定することは望ましいことであり、それらは、ＮＲの
活性の調節及びＮＲ活性に関連した眼の成長の制御において有用でありうる。
」として言及する。これらの結合パートナーが、ＮＲシグナル変換経路に関与し
、それ故、出生後の眼の成長の制御におけるＮＲの役割に関与していることはあ
りそうなことである。それ故、かかる結合パートナーとＮＲとの相互作用を邪魔
し又は破壊する化合物を同定することは望ましいことであり、それらは、ＮＲの
活性の調節及びＮＲ活性に関連した眼の成長の制御において有用でありうる。
【００５３】
ＮＲとその結合パートナーとの相互作用を邪魔する化合物を同定するために用
いるアッセイシステムの基礎原理は、ＮＲタンパク質、ポリペプチド、ペプチド
又は融合タンパク質(第３．１〜３．２節に記載)と結合パートナーとを含む反応
混合物を、これら２者が相互作用して結合し、そうして、複合体を形成するのに
十分な条件及び時間で調製することを包含する。化合物を阻害活性について試験
するためには、この反応混合物を試験化合物の存在下及び非存在下で調製する。
試験化合物は、最初に反応混合物に含まれていてもよいし、ＮＲ部分及びその結
合パートナーの添加の後に加えてもよい。対照用反応混合物を、試験化合物なし
で又は偽薬と共にインキュベートする。次いで、ＮＲ部分と結合パートナーとの
間の如何なる複合体の形成も検出する。対照用反応における複合体の形成(但し
、試験化合物を含む反応混合物中ではない)は、その化合物がＮＲと相互作用す
る結合パートナーとの相互作用を邪魔することを示す。更に、試験化合物と正常
ＮＲタンパク質を含む反応混合物内での複合体の形成は、試験化合物と変異型Ｎ
Ｒを含む反応混合物内での複合体形成にも比較されうる。この比較は、変異型Ｎ
Ｒの相互作用を破壊するが正常ＮＲの相互作用を破壊しない化合物を同定するの
が望ましい場合には重要でありうる。
いるアッセイシステムの基礎原理は、ＮＲタンパク質、ポリペプチド、ペプチド
又は融合タンパク質(第３．１〜３．２節に記載)と結合パートナーとを含む反応
混合物を、これら２者が相互作用して結合し、そうして、複合体を形成するのに
十分な条件及び時間で調製することを包含する。化合物を阻害活性について試験
するためには、この反応混合物を試験化合物の存在下及び非存在下で調製する。
試験化合物は、最初に反応混合物に含まれていてもよいし、ＮＲ部分及びその結
合パートナーの添加の後に加えてもよい。対照用反応混合物を、試験化合物なし
で又は偽薬と共にインキュベートする。次いで、ＮＲ部分と結合パートナーとの
間の如何なる複合体の形成も検出する。対照用反応における複合体の形成(但し
、試験化合物を含む反応混合物中ではない)は、その化合物がＮＲと相互作用す
る結合パートナーとの相互作用を邪魔することを示す。更に、試験化合物と正常
ＮＲタンパク質を含む反応混合物内での複合体の形成は、試験化合物と変異型Ｎ
Ｒを含む反応混合物内での複合体形成にも比較されうる。この比較は、変異型Ｎ
Ｒの相互作用を破壊するが正常ＮＲの相互作用を破壊しない化合物を同定するの
が望ましい場合には重要でありうる。
【００５４】
ＮＲと結合パートナーとの相互作用を邪魔する化合物のアッセイは、不均質形
式においても均質形式において実施することができる。不均質アッセイは、ＮＲ
部分産物又は結合パートナーを固相上に繋ぎ留め、反応の最後に固相上に繋ぎ留
められた複合体を検出することを含む。均質アッセイでは、全反応を液相中で行
う。何れのアプローチにおいても、反応物の添加の順序は、試験する化合物につ
いて異なる情報を得るために変えることができる。例えば、相互作用を競争によ
り邪魔する試験化合物は、試験物質の存在下で反応を行うことにより同定するこ
とができ；即ち、反応混合物に、ＮＲ部分と相互作用する結合パートナーとを加
える前に又は加えると同時に、試験物質を加えることにより同定することができ
る。或は、予備形成された複合体を破壊する試験化合物(例えば、複合体の構成
成分の一つに取って代わる一層高い結合定数を有する化合物)は、試験化合物を
反応混合物に、複合体が形成された後に加えることにより試験することができる
。様々な形式を、以下に簡単に記載する。
式においても均質形式において実施することができる。不均質アッセイは、ＮＲ
部分産物又は結合パートナーを固相上に繋ぎ留め、反応の最後に固相上に繋ぎ留
められた複合体を検出することを含む。均質アッセイでは、全反応を液相中で行
う。何れのアプローチにおいても、反応物の添加の順序は、試験する化合物につ
いて異なる情報を得るために変えることができる。例えば、相互作用を競争によ
り邪魔する試験化合物は、試験物質の存在下で反応を行うことにより同定するこ
とができ；即ち、反応混合物に、ＮＲ部分と相互作用する結合パートナーとを加
える前に又は加えると同時に、試験物質を加えることにより同定することができ
る。或は、予備形成された複合体を破壊する試験化合物(例えば、複合体の構成
成分の一つに取って代わる一層高い結合定数を有する化合物)は、試験化合物を
反応混合物に、複合体が形成された後に加えることにより試験することができる
。様々な形式を、以下に簡単に記載する。
【００５５】
不均質アッセイシステムにおいては、ＮＲ部分又は相互作用する結合パートナ
ーを固体表面に繋ぎ留め、繋ぎ留めない種を直接又は間接的に標識する。実際に
は、ミクロ滴定プレートを便利に利用する。繋ぎ留められた種は、非共有結合又
は共有結合によって固定化することができる。非共有結合は、単に固体表面をＮ
Ｒ又は結合パートナーの溶液で被覆して乾燥することにより達成することができ
る。或は、繋ぎ留めるべき種に特異的な固定化抗体を用いて、それらの種を固体
表面に繋ぎ留めることができる。これらの表面は、予め調製して貯蔵しておくこ
とができる。
ーを固体表面に繋ぎ留め、繋ぎ留めない種を直接又は間接的に標識する。実際に
は、ミクロ滴定プレートを便利に利用する。繋ぎ留められた種は、非共有結合又
は共有結合によって固定化することができる。非共有結合は、単に固体表面をＮ
Ｒ又は結合パートナーの溶液で被覆して乾燥することにより達成することができ
る。或は、繋ぎ留めるべき種に特異的な固定化抗体を用いて、それらの種を固体
表面に繋ぎ留めることができる。これらの表面は、予め調製して貯蔵しておくこ
とができる。
【００５６】
このアッセイを行うためには、固定化した種のパートナーを、試験化合物を用
いて被覆した表面又は該化合物を有しない表面にさらす。反応が完了した後に、
未反応化合物を除去し(例えば、洗浄により)、形成された如何なる複合体も、固
相表面上に固定化されたままでいる。固体表面上に繋ぎ留められた複合体の検出
は、多くの方法により達成することができる。固定化されてない種を予備標識す
る場合には、表面に固定化された標識の検出は、複合体が形成されたことを示す
。固定化されてない種を予備標識しない場合には、間接標識を用いて、表面上に
繋ぎ留められた複合体を例えば最初に固定化してない種に特異的な標識抗体を用
いて検出することができる(該抗体は、直接標識することもできるし、標識した
抗Ｉｇ抗体を用いて間接的に標識することもできる)。反応成分の添加の順序に
よって、複合体形成を阻害する試験化合物又は予備形成された複合体を破壊する
試験化合物を検出することができる。
いて被覆した表面又は該化合物を有しない表面にさらす。反応が完了した後に、
未反応化合物を除去し(例えば、洗浄により)、形成された如何なる複合体も、固
相表面上に固定化されたままでいる。固体表面上に繋ぎ留められた複合体の検出
は、多くの方法により達成することができる。固定化されてない種を予備標識す
る場合には、表面に固定化された標識の検出は、複合体が形成されたことを示す
。固定化されてない種を予備標識しない場合には、間接標識を用いて、表面上に
繋ぎ留められた複合体を例えば最初に固定化してない種に特異的な標識抗体を用
いて検出することができる(該抗体は、直接標識することもできるし、標識した
抗Ｉｇ抗体を用いて間接的に標識することもできる)。反応成分の添加の順序に
よって、複合体形成を阻害する試験化合物又は予備形成された複合体を破壊する
試験化合物を検出することができる。
【００５７】
或は、液相中で、試験化合物の存在下又は非存在下で反応を行い、反応生成物
を未反応成分から分離し、そして複合体を検出することができる(例えば、結合
性化合物の一つに特異的な固定化抗体を用いて溶液中に形成された任意の複合体
を繋ぎ留め、他のパートナーに特異的な標識抗体を用いて繋ぎ留められた複合体
を検出する)。再び、液相への反応物の添加の順序によって、複合体を阻害する
試験化合物又は予備形成された複合体を破壊する試験化合物を同定することがで
きる。
を未反応成分から分離し、そして複合体を検出することができる(例えば、結合
性化合物の一つに特異的な固定化抗体を用いて溶液中に形成された任意の複合体
を繋ぎ留め、他のパートナーに特異的な標識抗体を用いて繋ぎ留められた複合体
を検出する)。再び、液相への反応物の添加の順序によって、複合体を阻害する
試験化合物又は予備形成された複合体を破壊する試験化合物を同定することがで
きる。
【００５８】
この発明の他の具体例においては、均質アッセイを用いることができる。この
アプローチにおいては、ＮＲ部分と相互作用する結合パートナーとの予備形成さ
れた複合体を調製し、該複合体では、ＮＲ又はその結合パートナーが標識されて
いるが、標識により生成されるシグナルは、複合体の形成により消される(例え
ば、免疫アッセイにこのアプローチを利用しているRubensteinの米国特許第４，
１０９，４９６号参照)。予備形成された複合体からの種の一つと競争して取っ
て代わる試験物質の添加は、バックグラウンドを超えるシグナルの生成を生じる
であろう。この方法において、ＮＲと相互作用する結合パートナーとの間の相互
作用を破壊する試験物質を同定することができる。
アプローチにおいては、ＮＲ部分と相互作用する結合パートナーとの予備形成さ
れた複合体を調製し、該複合体では、ＮＲ又はその結合パートナーが標識されて
いるが、標識により生成されるシグナルは、複合体の形成により消される(例え
ば、免疫アッセイにこのアプローチを利用しているRubensteinの米国特許第４，
１０９，４９６号参照)。予備形成された複合体からの種の一つと競争して取っ
て代わる試験物質の添加は、バックグラウンドを超えるシグナルの生成を生じる
であろう。この方法において、ＮＲと相互作用する結合パートナーとの間の相互
作用を破壊する試験物質を同定することができる。
【００５９】
特別の具体例においては、ＮＲ融合物を、固定化のために調製することができ
る。例えば、ＮＲ又はペプチド断片を、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ
(ＧＳＴ)遺伝子に、融合ベクター例えばｐＧＥＸ−５Ｘ−１を用いて、結合活性
が生成した融合タンパク質においても維持されるような仕方で融合させることが
できる。当分野で日常的に行われている方法を用いて、相互作用する結合パート
ナーを精製し、モノクローナル抗体を高めるために利用することができる。この
抗体を、例えば、放射性同位元素125Ｉを用いて、当分野で日常的に行われてい
る方法によって標識することができる。不均質アッセイにおいては、例えば、Ｇ
ＳＴ−ＮＲ融合タンパク質を、グルタチオン−アガロースビーズに結合させるこ
とができる。次いで、その相互作用する結合パートナーを、試験化合物の存在下
又は非存在下で、相互作用及び結合が起きるような仕方で加えることができる。
反応期間の最後に、未結合物質を洗い去り、標識したモノクローナル抗体をこの
システムに加えて、複合体化した化合物に結合させることができる。ＮＲ(遺伝
子産物)と相互作用する結合パートナーとの間の相互作用を、グルタチオン−ア
ガロースビーズに結合している放射能の量を測定することにより検出することが
できる。試験化合物による上首尾の相互作用の阻害は、測定される放射能の減少
を生じるであろう。
る。例えば、ＮＲ又はペプチド断片を、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ
(ＧＳＴ)遺伝子に、融合ベクター例えばｐＧＥＸ−５Ｘ−１を用いて、結合活性
が生成した融合タンパク質においても維持されるような仕方で融合させることが
できる。当分野で日常的に行われている方法を用いて、相互作用する結合パート
ナーを精製し、モノクローナル抗体を高めるために利用することができる。この
抗体を、例えば、放射性同位元素125Ｉを用いて、当分野で日常的に行われてい
る方法によって標識することができる。不均質アッセイにおいては、例えば、Ｇ
ＳＴ−ＮＲ融合タンパク質を、グルタチオン−アガロースビーズに結合させるこ
とができる。次いで、その相互作用する結合パートナーを、試験化合物の存在下
又は非存在下で、相互作用及び結合が起きるような仕方で加えることができる。
反応期間の最後に、未結合物質を洗い去り、標識したモノクローナル抗体をこの
システムに加えて、複合体化した化合物に結合させることができる。ＮＲ(遺伝
子産物)と相互作用する結合パートナーとの間の相互作用を、グルタチオン−ア
ガロースビーズに結合している放射能の量を測定することにより検出することが
できる。試験化合物による上首尾の相互作用の阻害は、測定される放射能の減少
を生じるであろう。
【００６０】
或は、ＧＳＴ−ＮＲ融合タンパク質と相互作用する結合パートナーとを、固体
グルタチオン−アガロースビーズの非存在下で液体中で一緒に混合することがで
きる。試験化合物は、これらの種の相互作用中に又は相互作用後に加えることが
できる。次いで、この混合物をグルタチオン−アガロースビーズに加えることが
でき、未結合物質を洗い去る。再び、ＮＲ／結合パートナー相互作用の阻害の程
度を、標識した抗体を加えてビーズと結合した放射能を測定することにより検出
することができる。
グルタチオン−アガロースビーズの非存在下で液体中で一緒に混合することがで
きる。試験化合物は、これらの種の相互作用中に又は相互作用後に加えることが
できる。次いで、この混合物をグルタチオン−アガロースビーズに加えることが
でき、未結合物質を洗い去る。再び、ＮＲ／結合パートナー相互作用の阻害の程
度を、標識した抗体を加えてビーズと結合した放射能を測定することにより検出
することができる。
【００６１】
この発明の他の具体例において、これらの同じ技術を、ＮＲ及び／又は相互作
用する若しくは結合するパートナーの結合ドメインに対応するペプチド断片を完
全長タンパク質の一方又は両方の代りに用いて(結合パートナーがタンパク質で
ある場合)利用することができる。当分野で日常的に行われる方法の幾つでも用
いて、結合部位を同定して単離することができる。これらの方法は、これらのタ
ンパク質の一つをコードする遺伝子の突然変異誘発及び免疫共沈アッセイにおけ
る結合の破壊についてのスクリーニングを包含するが、これらに限られない。次
いで、複合体中の第二の種をコードする遺伝子における補償的変異を選択するこ
とができる。各タンパク質をコードする遺伝子の配列分析は、相互作用的結合に
関与するタンパク質の領域に対応する突然変異を示すであろう。或は、一つのタ
ンパク質を上記の方法を用いて固体表面に繋ぎ留め、トリプシンなどのタンパク
質分解酵素で処理した標識したその結合パートナーと相互作用させて結合させる
ことができる。洗浄後、結合ドメインを含む短い標識されたペプチドは、固体材
料と結合したままでいることができ、それを単離してアミノ酸配列決定により同
定することができる。又、一度細胞内結合パートナーをコードする遺伝子が得ら
れれば、短い遺伝子セグメントを工作して、タンパク質のペプチドセグメントを
発現させることができ、次いで、それを結合活性について試験し、精製又は合成
することができる。
用する若しくは結合するパートナーの結合ドメインに対応するペプチド断片を完
全長タンパク質の一方又は両方の代りに用いて(結合パートナーがタンパク質で
ある場合)利用することができる。当分野で日常的に行われる方法の幾つでも用
いて、結合部位を同定して単離することができる。これらの方法は、これらのタ
ンパク質の一つをコードする遺伝子の突然変異誘発及び免疫共沈アッセイにおけ
る結合の破壊についてのスクリーニングを包含するが、これらに限られない。次
いで、複合体中の第二の種をコードする遺伝子における補償的変異を選択するこ
とができる。各タンパク質をコードする遺伝子の配列分析は、相互作用的結合に
関与するタンパク質の領域に対応する突然変異を示すであろう。或は、一つのタ
ンパク質を上記の方法を用いて固体表面に繋ぎ留め、トリプシンなどのタンパク
質分解酵素で処理した標識したその結合パートナーと相互作用させて結合させる
ことができる。洗浄後、結合ドメインを含む短い標識されたペプチドは、固体材
料と結合したままでいることができ、それを単離してアミノ酸配列決定により同
定することができる。又、一度細胞内結合パートナーをコードする遺伝子が得ら
れれば、短い遺伝子セグメントを工作して、タンパク質のペプチドセグメントを
発現させることができ、次いで、それを結合活性について試験し、精製又は合成
することができる。
【００６２】
例えば(限定ではない)、ＧＳＴ−ＮＲ融合タンパク質を調製して上記の固体材
料に繋ぎ留めることができる(例えば、グルタチオンアガロースビーズに結合さ
せることにより)。相互作用する結合パートナーを、放射性同位元素例えば35Ｓ
で標識することができ、タンパク質分解酵素例えばトリプシンを用いて開裂させ
ることができる。開裂生成物を、次いで、繋ぎ留められたＧＳＴ−ＮＲ融合タン
パク質に加えて、結合させることができる。未結合ペプチドを洗い去った後に、
標識された結合物質(細胞内結合パートナー結合ドメインに相当)を、周知の方法
により、溶出させ、精製してアミノ酸配列を分析することができる。そうして同
定されたペプチドを合成により生成し、又は適当な容易なタンパク質に、組換え
ＤＮＡ技術を用いて融合させることができる。
料に繋ぎ留めることができる(例えば、グルタチオンアガロースビーズに結合さ
せることにより)。相互作用する結合パートナーを、放射性同位元素例えば35Ｓ
で標識することができ、タンパク質分解酵素例えばトリプシンを用いて開裂させ
ることができる。開裂生成物を、次いで、繋ぎ留められたＧＳＴ−ＮＲ融合タン
パク質に加えて、結合させることができる。未結合ペプチドを洗い去った後に、
標識された結合物質(細胞内結合パートナー結合ドメインに相当)を、周知の方法
により、溶出させ、精製してアミノ酸配列を分析することができる。そうして同
定されたペプチドを合成により生成し、又は適当な容易なタンパク質に、組換え
ＤＮＡ技術を用いて融合させることができる。
【００６３】
第３．４節 異常な出生後の眼の成長を改善する化合物の同定のためのアッセ イ
第３．１〜３．３節に記載したようなアッセイ技術によって同定された結合性
化合物を含む(限定はしない)化合物を、出生後の異常な眼の成長(近視を含む)を
改善する能力について試験することができる。上記のアッセイは、ＮＲ活性に影
響を及ぼす化合物(例えば、ＮＲに結合し、天然のリガンドの結合を阻害し、そ
してシグナル変換を活性化し(アゴニスト)又は活性化をブロックする(アンタゴ
ニスト)化合物、及びＮＲの天然のリガンドに結合してリガンド活性を中和する
化合物)；又はＮＲ遺伝子活性に影響を及ぼす(ＮＲ遺伝子発現に影響を及ぼすこ
とにより)化合物(分子例えば、スプライシング事象に影響し又は干渉して、完全
長又は切り詰められた形態のＮＲの発現を調節できるようにするタンパク質又は
小さい有機分子を含む)を同定することができる。しかしながら、記載したアッ
セイは、ＮＲシグナル変換を調節する化合物(例えば、下流のシグナリング事象
に影響を及ぼす化合物例えば、チロシンキナーゼ又はホスファターゼ活性のイン
ヒビター又はエンハンサーなどであり、これらは、ＮＲへのリガンド結合により
活性化されたシグナルの変換に関与する)を同定することもできるということに
注意すべきである。ＮＲ遺伝子及び／又はＮＲ遺伝子産物が関与するＮＲシグナ
ル変換経路の他のステップに影響を及ぼし、同経路に影響することにより、異常
な出生後の眼の成長の発生に対するＮＲの効果を調節することのできる化合物の
同定及び利用は、この発明の範囲内にある。かかる化合物は、近視その他の異常
な出生後の眼の成長から生じる病気の治療のための治療方法の部分として利用す
ることができる。
化合物を含む(限定はしない)化合物を、出生後の異常な眼の成長(近視を含む)を
改善する能力について試験することができる。上記のアッセイは、ＮＲ活性に影
響を及ぼす化合物(例えば、ＮＲに結合し、天然のリガンドの結合を阻害し、そ
してシグナル変換を活性化し(アゴニスト)又は活性化をブロックする(アンタゴ
ニスト)化合物、及びＮＲの天然のリガンドに結合してリガンド活性を中和する
化合物)；又はＮＲ遺伝子活性に影響を及ぼす(ＮＲ遺伝子発現に影響を及ぼすこ
とにより)化合物(分子例えば、スプライシング事象に影響し又は干渉して、完全
長又は切り詰められた形態のＮＲの発現を調節できるようにするタンパク質又は
小さい有機分子を含む)を同定することができる。しかしながら、記載したアッ
セイは、ＮＲシグナル変換を調節する化合物(例えば、下流のシグナリング事象
に影響を及ぼす化合物例えば、チロシンキナーゼ又はホスファターゼ活性のイン
ヒビター又はエンハンサーなどであり、これらは、ＮＲへのリガンド結合により
活性化されたシグナルの変換に関与する)を同定することもできるということに
注意すべきである。ＮＲ遺伝子及び／又はＮＲ遺伝子産物が関与するＮＲシグナ
ル変換経路の他のステップに影響を及ぼし、同経路に影響することにより、異常
な出生後の眼の成長の発生に対するＮＲの効果を調節することのできる化合物の
同定及び利用は、この発明の範囲内にある。かかる化合物は、近視その他の異常
な出生後の眼の成長から生じる病気の治療のための治療方法の部分として利用す
ることができる。
【００６４】
この発明は、近視の症状、徴候又は特徴を改善する能力を示す化合物を同定す
るための細胞ベースの及び動物モデルベースのアッセイを包含する。かかる細胞
ベースのアッセイシステムは又、天然リガンド(組換え又は合成により生成され
たリガンドを含む)の純度及び能力についてアッセイするための「ゴールドスタ
ンダード」としても用いることができる。
るための細胞ベースの及び動物モデルベースのアッセイを包含する。かかる細胞
ベースのアッセイシステムは又、天然リガンド(組換え又は合成により生成され
たリガンドを含む)の純度及び能力についてアッセイするための「ゴールドスタ
ンダード」としても用いることができる。
【００６５】
細胞ベースのシステムを用いて、近視の症状、徴候又は特徴を改善するように
作用しうる化合物を同定することができる。かかる細胞システムは、例えば、Ｎ
Ｒを産生する組換え又は非組換え細胞例えば細胞株を含むことができる。例えば
、網膜細胞又は網膜に由来する細胞株を用いることができる。加えて、機能的Ｎ
Ｒを発現し、例えば、化学的又は表現型変化、他の宿主細胞遺伝子の誘導、イオ
ンフラックス(例えば、Ｎａ+、Ｋ+)の変化、宿主細胞タンパク質のチロシンリン
酸化などにより測定して、天然リガンドによる活性化に応答するように遺伝子工
学処理された発現用宿主細胞(例えば、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、繊維芽細胞)を
アッセイの終了点として用いることができる。
作用しうる化合物を同定することができる。かかる細胞システムは、例えば、Ｎ
Ｒを産生する組換え又は非組換え細胞例えば細胞株を含むことができる。例えば
、網膜細胞又は網膜に由来する細胞株を用いることができる。加えて、機能的Ｎ
Ｒを発現し、例えば、化学的又は表現型変化、他の宿主細胞遺伝子の誘導、イオ
ンフラックス(例えば、Ｎａ+、Ｋ+)の変化、宿主細胞タンパク質のチロシンリン
酸化などにより測定して、天然リガンドによる活性化に応答するように遺伝子工
学処理された発現用宿主細胞(例えば、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、繊維芽細胞)を
アッセイの終了点として用いることができる。
【００６６】
かかる細胞システムの利用において、細胞を、完全な眼において近視の症状を
改善する能力を示すと思われる化合物に、さらされた細胞において近視に関連す
る細胞性現象又は細胞機能の改善を誘出するのに十分な濃度及び時間でさらすこ
とができる。さらした後に、それらの細胞をアッセイして、遺伝子発現の変化を
測定することができ(例えば、細胞溶解物をｍＲＮＡ転写物につきアッセイする
ことができ(例えば、ノーザン分析により)、又は細胞内で発現されたＮＲタンパ
ク質につきアッセイすることができる)；ＮＲ遺伝子の発現を調節し又は加減す
る化合物は、治療剤の優れた候補である。或は、これらの細胞を試験して、少な
くとも一つの近視に関連した細胞性現象若しくは細胞機能が、一層正常な若しく
は一層野生型の、近視でない表現型に、又は近視の症状の一層低い発病率を生じ
そうな表現型に似るように変化したかどうかを測定することができる。尚更に、
ＮＲが一部分であるシグナル変換経路の成分の発現及び／若しくは活性、又はＮ
Ｒシグナル変換経路自身の活性をアッセイすることができる。
改善する能力を示すと思われる化合物に、さらされた細胞において近視に関連す
る細胞性現象又は細胞機能の改善を誘出するのに十分な濃度及び時間でさらすこ
とができる。さらした後に、それらの細胞をアッセイして、遺伝子発現の変化を
測定することができ(例えば、細胞溶解物をｍＲＮＡ転写物につきアッセイする
ことができ(例えば、ノーザン分析により)、又は細胞内で発現されたＮＲタンパ
ク質につきアッセイすることができる)；ＮＲ遺伝子の発現を調節し又は加減す
る化合物は、治療剤の優れた候補である。或は、これらの細胞を試験して、少な
くとも一つの近視に関連した細胞性現象若しくは細胞機能が、一層正常な若しく
は一層野生型の、近視でない表現型に、又は近視の症状の一層低い発病率を生じ
そうな表現型に似るように変化したかどうかを測定することができる。尚更に、
ＮＲが一部分であるシグナル変換経路の成分の発現及び／若しくは活性、又はＮ
Ｒシグナル変換経路自身の活性をアッセイすることができる。
【００６７】
例えば、さらした後に、細胞溶解物を、宿主細胞タンパク質のチロシンリン酸
化の存在について、さらされていない対照用細胞に由来する溶解物と比較してア
ッセイすることができる。これらのアッセイシステムにおいて宿主細胞タンパク
質のチロシンリン酸化を阻止する試験化合物の能力は、その試験化合物がＮＲ活
性化により開始されたシグナル変換を阻害することを示す。これらの細胞溶解物
は、ウエスタンブロット形式を用いて、容易にアッセイすることができ；即ち、
これらの宿主細胞タンパク質をゲル電気泳動により分離し、トランスファーして
抗ホスホチロシン検出抗体(例えば、放射能、蛍光、酵素などのシグナルを生成
する化合物を用いて標識された抗ホスホチロシン抗体)を用いてプローブする(例
えば、Glenney等、1988, J.Immunol.Methods,109:277-285；Frackelton等、1983
, Mol.Cell.Biol.,3:1343-1352参照)。或は、ＮＲシグナル変換経路に関与する
特定の宿主細胞タンパク質を、標的宿主細胞タンパク質に特異的な繋ぎ留める抗
体を用いて固定化し、その固定化した宿主細胞タンパク質におけるホスホチロシ
ンの存否を標識した抗ホスホチロシン抗体を用いて検出するＥＬＩＳＡ形式を用
いることができよう(King等、1993, Life Science,53:1465-1472参照)。更に別
のアプローチにおいては、イオンフラックス(例えば、ナトリウム又はカリウム
イオンフラックス)を、ＮＲ刺激されたシグナル変換の終了点として測定するこ
とができる。膜の脱分極も又、ＮＲ刺激された効果の終了点として測定すること
ができる。
化の存在について、さらされていない対照用細胞に由来する溶解物と比較してア
ッセイすることができる。これらのアッセイシステムにおいて宿主細胞タンパク
質のチロシンリン酸化を阻止する試験化合物の能力は、その試験化合物がＮＲ活
性化により開始されたシグナル変換を阻害することを示す。これらの細胞溶解物
は、ウエスタンブロット形式を用いて、容易にアッセイすることができ；即ち、
これらの宿主細胞タンパク質をゲル電気泳動により分離し、トランスファーして
抗ホスホチロシン検出抗体(例えば、放射能、蛍光、酵素などのシグナルを生成
する化合物を用いて標識された抗ホスホチロシン抗体)を用いてプローブする(例
えば、Glenney等、1988, J.Immunol.Methods,109:277-285；Frackelton等、1983
, Mol.Cell.Biol.,3:1343-1352参照)。或は、ＮＲシグナル変換経路に関与する
特定の宿主細胞タンパク質を、標的宿主細胞タンパク質に特異的な繋ぎ留める抗
体を用いて固定化し、その固定化した宿主細胞タンパク質におけるホスホチロシ
ンの存否を標識した抗ホスホチロシン抗体を用いて検出するＥＬＩＳＡ形式を用
いることができよう(King等、1993, Life Science,53:1465-1472参照)。更に別
のアプローチにおいては、イオンフラックス(例えば、ナトリウム又はカリウム
イオンフラックス)を、ＮＲ刺激されたシグナル変換の終了点として測定するこ
とができる。膜の脱分極も又、ＮＲ刺激された効果の終了点として測定すること
ができる。
【００６８】
加えて、動物ベースの近視モデルを用いて、近視様症状を改善することのでき
る化合物を同定することができる。かかる動物モデルを、かかる病気の治療にお
いて有効でありうる薬物、医薬、治療剤及び介入物の同定のための試験基質とし
て用いることができる。例えば、動物モデルを、近視症状を改善する能力を示す
と思われる化合物に、さらされた動物における近視症状のかかる改善を誘出する
のに十分な濃度及び時間でさらすことができる。これらの動物の曝露に対する応
答を、近視と関連する特徴、徴候又は症状の逆転を評価することによりモニター
することができる。介入物に関しては、近視様の特徴、徴候又は症状の如何なる
面でも逆転させる処理剤を、ヒトの近視の治療用介入物の候補と考えるべきであ
る。試験薬剤の投薬量は、投与量応答曲線を得ることにより決定することができ
る。
る化合物を同定することができる。かかる動物モデルを、かかる病気の治療にお
いて有効でありうる薬物、医薬、治療剤及び介入物の同定のための試験基質とし
て用いることができる。例えば、動物モデルを、近視症状を改善する能力を示す
と思われる化合物に、さらされた動物における近視症状のかかる改善を誘出する
のに十分な濃度及び時間でさらすことができる。これらの動物の曝露に対する応
答を、近視と関連する特徴、徴候又は症状の逆転を評価することによりモニター
することができる。介入物に関しては、近視様の特徴、徴候又は症状の如何なる
面でも逆転させる処理剤を、ヒトの近視の治療用介入物の候補と考えるべきであ
る。試験薬剤の投薬量は、投与量応答曲線を得ることにより決定することができ
る。
【００６９】
第四節 治療用組成物
この発明のニコチン性アンタゴニストは、価値ある薬理学的特性を有すること
が見出されている。ニコチン性アンタゴニストは、出生後の眼の成長を、出生後
の眼の成長を阻止して近視の発生を防止する特に望ましい効果により調節する。
例えば、下記の実施例に記載した方法を用いて個の効果を示すことができる。
が見出されている。ニコチン性アンタゴニストは、出生後の眼の成長を、出生後
の眼の成長を阻止して近視の発生を防止する特に望ましい効果により調節する。
例えば、下記の実施例に記載した方法を用いて個の効果を示すことができる。
【００７０】
従って、これらの化合物を用いて、出生後の眼の成長を制御し、出生後の眼の
成長を阻止し、近視を防止し、異常な出生後の眼の成長を制御し、出生後の眼の
異常な軸成長を阻止し、眼の異常な赤道伸長を阻止し、硝子体内腔拡大を阻止し
、近視の進行を阻止し、近視の開始を阻止し、そして近視を逆転させることがで
きる。これらの化合物は、近視の発生の阻止に特に有用である。
成長を阻止し、近視を防止し、異常な出生後の眼の成長を制御し、出生後の眼の
異常な軸成長を阻止し、眼の異常な赤道伸長を阻止し、硝子体内腔拡大を阻止し
、近視の進行を阻止し、近視の開始を阻止し、そして近視を逆転させることがで
きる。これらの化合物は、近視の発生の阻止に特に有用である。
【００７１】
この発明の化合物は、一般に、ヒトを含む哺乳動物を含む(限定はしない)動物
並びに鳥類、単孔類、爬虫類又は魚類に投与される。
並びに鳥類、単孔類、爬虫類又は魚類に投与される。
【００７２】
この発明の薬理学的に活性な化合物を、生薬学の伝統的な方法によって処理し
て患者例えばヒトを含む哺乳動物への投与のための医薬を生成することができる
。この発明の化合物は、活性化合物と有害な反応をしない慣用の賦形剤即ち、非
経口、腸内(経口)又は局所的眼内投与に適した製薬上許容しうる有機又は無機の
キャリアー物質との混合物において用いることができる。適当な製薬上許容しう
るキャリアーには、水、塩溶液、アルコール、植物油、ベンジルアルコール、ポ
リエチレングリコール、ゼラチン、炭水化物例えばラクトース、アミロース又は
澱粉、マグネシウムステアレート、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、脂肪酸モ
ノグリセリド及びジグリセリド、ペンタエリトリトール脂肪酸エステル、ヒドロ
キシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、又は他の任意の適当なキャリア
ーが含まれるが、これらに限られない。これらの医薬組成物は、殺菌し、所望で
あれば、活性化合物と有害に反応しない補助剤例えば潤滑剤、防腐剤、安定剤、
湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響する塩類、緩衝剤などと混合することができる。
それらは又、所望であれば、他の活性剤例えばビタミンと組合せることもできる
。
て患者例えばヒトを含む哺乳動物への投与のための医薬を生成することができる
。この発明の化合物は、活性化合物と有害な反応をしない慣用の賦形剤即ち、非
経口、腸内(経口)又は局所的眼内投与に適した製薬上許容しうる有機又は無機の
キャリアー物質との混合物において用いることができる。適当な製薬上許容しう
るキャリアーには、水、塩溶液、アルコール、植物油、ベンジルアルコール、ポ
リエチレングリコール、ゼラチン、炭水化物例えばラクトース、アミロース又は
澱粉、マグネシウムステアレート、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、脂肪酸モ
ノグリセリド及びジグリセリド、ペンタエリトリトール脂肪酸エステル、ヒドロ
キシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、又は他の任意の適当なキャリア
ーが含まれるが、これらに限られない。これらの医薬組成物は、殺菌し、所望で
あれば、活性化合物と有害に反応しない補助剤例えば潤滑剤、防腐剤、安定剤、
湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響する塩類、緩衝剤などと混合することができる。
それらは又、所望であれば、他の活性剤例えばビタミンと組合せることもできる
。
【００７３】
非経口適用のために、特に適当なのは、注射可能な無菌溶液好ましくは水溶液
又は油性溶液並びに懸濁液、乳濁液又はインプラントである。
又は油性溶液並びに懸濁液、乳濁液又はインプラントである。
【００７４】
腸内適用のために、特に適当なのは、錠剤、糖衣錠、リキッド、ドロップ、座
薬又はカプセルである。甘みをつけたビヒクルを用いる場合には、シロップ、エ
リキシルなどを利用することができる。
薬又はカプセルである。甘みをつけたビヒクルを用いる場合には、シロップ、エ
リキシルなどを利用することができる。
【００７５】
局所適用のためには、局所適用に適合性のキャリアーを含み、好ましくは水よ
り大きい動的粘度を有する液体乃至粘性乃至半固体又は固体形態が用いられる。
適当な配合物には、溶液、懸濁液、乳濁液、クリーム、軟膏、ゲル、粉末、塗布
剤、膏薬、エアゾールなどが含まれ(これらに限らない)、所望であれば、これら
を殺菌し、補助剤例えば防腐剤、安定剤、湿潤剤、緩衝剤、又は浸透圧に影響す
る塩類と混合する。局所適用のために、やはり適当なのは、活性成分を好ましく
は固体又は液体の不活性キャリアー物質と組合せて、スクィーズボトルに納めた
或はこの製剤をエーロゾル化することのできるビヒクルによって推進される噴霧
可能なエアゾール製剤である。
り大きい動的粘度を有する液体乃至粘性乃至半固体又は固体形態が用いられる。
適当な配合物には、溶液、懸濁液、乳濁液、クリーム、軟膏、ゲル、粉末、塗布
剤、膏薬、エアゾールなどが含まれ(これらに限らない)、所望であれば、これら
を殺菌し、補助剤例えば防腐剤、安定剤、湿潤剤、緩衝剤、又は浸透圧に影響す
る塩類と混合する。局所適用のために、やはり適当なのは、活性成分を好ましく
は固体又は液体の不活性キャリアー物質と組合せて、スクィーズボトルに納めた
或はこの製剤をエーロゾル化することのできるビヒクルによって推進される噴霧
可能なエアゾール製剤である。
【００７６】
本発明の化合物は、近視の発生の治療又は予防に有用である。軸伸長又は赤道
伸長を阻止し、眼の出生後成長を制御し、出生後の眼の成長を阻止し、近視を予
防し、異常な出生後の眼の成長を制御し、出生後の眼の軸の異常な成長を阻止し
、眼の異常な赤道伸長を阻止し、硝子体内腔の拡大を阻止し、近視の進行を阻止
し、近視の開始を阻止し、そして近視を逆転させる治療を、該剤を目薬中で用い
ることにより施すことができる。目薬は、典型的には、約０．００５〜１０％(
眼用媒質中)の、有利には約０．０１〜５％の、好ましくは約０．１〜２％の活
性剤濃度で作成する。約３．５〜８．５の、有利には約４．０〜８．０の、好ま
しくは約４．５〜７．５のｐＨは、眼薬として許容されると予想されうる。リン
酸緩衝剤も、目薬には一般的であるが、他の緩衝剤も利用することができる。目
薬の適用の一般的養生法は、起きている時間中等間隔で、１日当たり１〜４回で
ある。有効な薬剤であるほど、一層少量の適用であることを要し又は一層希釈し
た溶液の使用が可能となりうる。
伸長を阻止し、眼の出生後成長を制御し、出生後の眼の成長を阻止し、近視を予
防し、異常な出生後の眼の成長を制御し、出生後の眼の軸の異常な成長を阻止し
、眼の異常な赤道伸長を阻止し、硝子体内腔の拡大を阻止し、近視の進行を阻止
し、近視の開始を阻止し、そして近視を逆転させる治療を、該剤を目薬中で用い
ることにより施すことができる。目薬は、典型的には、約０．００５〜１０％(
眼用媒質中)の、有利には約０．０１〜５％の、好ましくは約０．１〜２％の活
性剤濃度で作成する。約３．５〜８．５の、有利には約４．０〜８．０の、好ま
しくは約４．５〜７．５のｐＨは、眼薬として許容されると予想されうる。リン
酸緩衝剤も、目薬には一般的であるが、他の緩衝剤も利用することができる。目
薬の適用の一般的養生法は、起きている時間中等間隔で、１日当たり１〜４回で
ある。有効な薬剤であるほど、一層少量の適用であることを要し又は一層希釈し
た溶液の使用が可能となりうる。
【００７７】
特定の場合における活性化合物の実際の好適な量は、用いられるその特定の化
合物、配合される特定の組成物、適用の仕方及び処置される特定の場所及び器官
によって変化するということは認められよう。所定の宿主についての投薬量は、
慣用の考察を用いて(例えば、主題の化合物の種々の活性物質の通例の比較によ
り、例えば適当な慣用の薬理学的プロトコールによって)決定することができる
。
合物、配合される特定の組成物、適用の仕方及び処置される特定の場所及び器官
によって変化するということは認められよう。所定の宿主についての投薬量は、
慣用の考察を用いて(例えば、主題の化合物の種々の活性物質の通例の比較によ
り、例えば適当な慣用の薬理学的プロトコールによって)決定することができる
。
【００７８】
実施例
方法。 １日齢のホワイトレグホンヒナ(メリーランド、Chestertown, Truslo
w Farms)を、育雛器内で、１２時間明暗サイクル(General Electric社製のクロ
マ５０蛍光燈使用)で飼育した(ヒナの眼の高さで約５０μＷ／ｃｍ2の照射)。こ
れらのヒナに、Purina Chick Chow(登録商標)食餌及び水を自由に摂取させた。
w Farms)を、育雛器内で、１２時間明暗サイクル(General Electric社製のクロ
マ５０蛍光燈使用)で飼育した(ヒナの眼の高さで約５０μＷ／ｃｍ2の照射)。こ
れらのヒナに、Purina Chick Chow(登録商標)食餌及び水を自由に摂取させた。
【００７９】
１週齢で実験を開始した。数匹のヒナに、片側が半透明の白色の保護眼鏡を眼
窩周囲の羽にシアノアクリレート接着剤で付けて物影喪失による近視を誘導した
が、該近視は、一般に研究されている同側性近視を新生ヒナ及び若鳥に誘導する
実験モデルである(Papastergiou等、1998, Vision Res.,38:1883-8)。無菌条件
下で、保護眼鏡を付けた眼に、その時点で、１０μｌの薬物又は塩溶液ビヒクル
を硝子体内注射した。他のヒナは、保護眼鏡を付けなかったが、同様に一方の眼
に薬物又はビヒクルの硝子体内注射を受けた。殆どの実験グループにおいて、薬
物及びビヒクルを眼内注射により、毎日又は一日おきに、明相に入って凡そ４時
間の時点で投与した。各シリーズにおいて、この実験に使う眼は、左右間で交代
し、すべての反対側の眼には、実験に使う眼に注射をするのと同時に塩溶液ビヒ
クルの注射を受けた。すべての保護眼鏡適用及び薬物注射のために、ヒナを吸入
により麻酔した。
窩周囲の羽にシアノアクリレート接着剤で付けて物影喪失による近視を誘導した
が、該近視は、一般に研究されている同側性近視を新生ヒナ及び若鳥に誘導する
実験モデルである(Papastergiou等、1998, Vision Res.,38:1883-8)。無菌条件
下で、保護眼鏡を付けた眼に、その時点で、１０μｌの薬物又は塩溶液ビヒクル
を硝子体内注射した。他のヒナは、保護眼鏡を付けなかったが、同様に一方の眼
に薬物又はビヒクルの硝子体内注射を受けた。殆どの実験グループにおいて、薬
物及びビヒクルを眼内注射により、毎日又は一日おきに、明相に入って凡そ４時
間の時点で投与した。各シリーズにおいて、この実験に使う眼は、左右間で交代
し、すべての反対側の眼には、実験に使う眼に注射をするのと同時に塩溶液ビヒ
クルの注射を受けた。すべての保護眼鏡適用及び薬物注射のために、ヒナを吸入
により麻酔した。
【００８０】
治療の一週間後及び２週齢の時点で、ヒナを、ケタミン(２０ｍｇ／ｋｇ)とキ
シラジン(５ｍｇ／ｋｇ)の混合物の筋肉内投与により麻酔し、眼の屈折率測定及
びＡ−スキャン超音波検査を記載されたように(Stone等、1995, Vision Res.,35
:1195-202)行った。検査の日には、眼内注射は行わなかった。全身麻酔下にある
内に、これらのヒナを断頭して、摘出した眼の軸及び赤道寸法をデジタルカリパ
スを用いて測定した。このヒナの眼の冠状輪郭は、楕円形であり、赤道直径を眼
の最短及び最長赤道直径の平均値として報告する。
シラジン(５ｍｇ／ｋｇ)の混合物の筋肉内投与により麻酔し、眼の屈折率測定及
びＡ−スキャン超音波検査を記載されたように(Stone等、1995, Vision Res.,35
:1195-202)行った。検査の日には、眼内注射は行わなかった。全身麻酔下にある
内に、これらのヒナを断頭して、摘出した眼の軸及び赤道寸法をデジタルカリパ
スを用いて測定した。このヒナの眼の冠状輪郭は、楕円形であり、赤道直径を眼
の最短及び最長赤道直径の平均値として報告する。
【００８１】
データは、平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．として与え、ＳｉｇｍａＳｔａｔ(イリノイ
、Chicago, SPSS,Inc.)を用いて分析した。これらの眼に対する視覚喪失又は薬
物処理の何れも、レンズの厚みには影響せず、これらのデータは、保護眼鏡を付
けたヒナについては報告されてない。保護眼鏡を付けたヒナにおける視覚を奪わ
れた眼と反対側の眼の間の差異を用いて、分散の一方向分析(ＡＮＯＶＡ)を行っ
て、実験的近視に対する薬物の効力を確認した。保護眼鏡を付けた眼に対するメ
カミラミン処理後の軸長についての超音波データは、正規性の状態と合わなかっ
た(これらのデータは、実験した眼と反対側の眼との間の差異に関するランクに
ついてのＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ一方向ＡＮＯＶＡを用いて評価した)。
同じ薬物を用いて試験したヒナの差異コホートからのデータは、ビヒクルで処理
した各対照と共に、分析のためにプールされた(図１)。保護眼鏡を付けたことの
ないヒナにおける薬物の効果も正規分布しなかったので、薬物処理した保護眼鏡
なしの眼とビヒクル処理した反対側の眼を、ランクに関するＦｒｉｅｄｍａｎ反
復測定ＡＮＯＶＡを用いて比較した。シリーズ中で、ＡＮＯＶＡが治療効果を同
定した場合には、処理グループのｈｏｃ後の複数対比較を、ターキィ試験を用い
て行った(Ｐ値＜０．０５の統計的有意性)。眼球屈折力に対する正確な薬物の効
果及び超音波の評価において、薬物注射の前と後の測定値をスチューデントの対
ｔ検定を用いて比較した。これらの実験は、ＡＲＶＯ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｏ
ｎ ｔｈｅ Ｕｓｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌｓ ｉｎ Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ ａｎｄ Ｖ
ｉｓｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈに従った。
、Chicago, SPSS,Inc.)を用いて分析した。これらの眼に対する視覚喪失又は薬
物処理の何れも、レンズの厚みには影響せず、これらのデータは、保護眼鏡を付
けたヒナについては報告されてない。保護眼鏡を付けたヒナにおける視覚を奪わ
れた眼と反対側の眼の間の差異を用いて、分散の一方向分析(ＡＮＯＶＡ)を行っ
て、実験的近視に対する薬物の効力を確認した。保護眼鏡を付けた眼に対するメ
カミラミン処理後の軸長についての超音波データは、正規性の状態と合わなかっ
た(これらのデータは、実験した眼と反対側の眼との間の差異に関するランクに
ついてのＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ一方向ＡＮＯＶＡを用いて評価した)。
同じ薬物を用いて試験したヒナの差異コホートからのデータは、ビヒクルで処理
した各対照と共に、分析のためにプールされた(図１)。保護眼鏡を付けたことの
ないヒナにおける薬物の効果も正規分布しなかったので、薬物処理した保護眼鏡
なしの眼とビヒクル処理した反対側の眼を、ランクに関するＦｒｉｅｄｍａｎ反
復測定ＡＮＯＶＡを用いて比較した。シリーズ中で、ＡＮＯＶＡが治療効果を同
定した場合には、処理グループのｈｏｃ後の複数対比較を、ターキィ試験を用い
て行った(Ｐ値＜０．０５の統計的有意性)。眼球屈折力に対する正確な薬物の効
果及び超音波の評価において、薬物注射の前と後の測定値をスチューデントの対
ｔ検定を用いて比較した。これらの実験は、ＡＲＶＯ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｏ
ｎ ｔｈｅ Ｕｓｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌｓ ｉｎ Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ ａｎｄ Ｖ
ｉｓｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈに従った。
【００８２】
実施例１
次の薬物を、毎日投与した：ジヒドロ−β−エリスロイジンヒドロブロミド(
マサチューセッツ、Natick, RBI/Sigma)、メカミラミン(RBI/Sigma)及びメチル
カコニチンシトレート(RBI/Sigma)。哺乳動物の脳内で中期間作用するニコチン
性アンタゴニストであるので、一般に、クロルイソンダミンジイオダイド(ミズ
ーリ、Ballwin, Tocris Cookson)を、一日おきに、殆どの実験において、硝子体
内注射により投与した。
マサチューセッツ、Natick, RBI/Sigma)、メカミラミン(RBI/Sigma)及びメチル
カコニチンシトレート(RBI/Sigma)。哺乳動物の脳内で中期間作用するニコチン
性アンタゴニストであるので、一般に、クロルイソンダミンジイオダイド(ミズ
ーリ、Ballwin, Tocris Cookson)を、一日おきに、殆どの実験において、硝子体
内注射により投与した。
【００８３】
保護眼鏡を付けたヒナ 以前の研究から予想されるように、片側のみの保護眼
鏡を付けたビヒクル処理された対照用ヒナのコホートは、反対側の保護眼鏡をし
てない眼と比較して約−７〜−１２ジオプターの同側性の近視を生じた。保護眼
鏡を付けた眼における軸長は、反対側の眼と比較して約０．４〜０．６ｍｍだけ
増大していた。一般に、保護眼鏡を付けた眼と開いた眼との間の軸長の差異は、
内側境界膜まで記録する超音波により測定すると、外側強膜表面まで記録するカ
リパスによる測定よりも一層大きかった。カリパス測定の一層大きい変動性にの
他に、この不一致は、少なくとも部分的には、生理的なものでありうる(若いヒ
ナの脈絡膜と網膜は両方とも保護眼鏡を付けている間に薄くなるので)。保護眼
鏡を付けた眼の硝子体内腔は、軸及び赤道の両方で寸法が大きくなったが、この
硝子体内腔の伸びは、眼の軸長全体の増大を大いに説明している。保護眼鏡を付
けることは、単独では、ビヒクル処理したヒナの殆どのコホートにおいて前眼房
深度に対する有意の効果を誘導しなかった。
鏡を付けたビヒクル処理された対照用ヒナのコホートは、反対側の保護眼鏡をし
てない眼と比較して約−７〜−１２ジオプターの同側性の近視を生じた。保護眼
鏡を付けた眼における軸長は、反対側の眼と比較して約０．４〜０．６ｍｍだけ
増大していた。一般に、保護眼鏡を付けた眼と開いた眼との間の軸長の差異は、
内側境界膜まで記録する超音波により測定すると、外側強膜表面まで記録するカ
リパスによる測定よりも一層大きかった。カリパス測定の一層大きい変動性にの
他に、この不一致は、少なくとも部分的には、生理的なものでありうる(若いヒ
ナの脈絡膜と網膜は両方とも保護眼鏡を付けている間に薄くなるので)。保護眼
鏡を付けた眼の硝子体内腔は、軸及び赤道の両方で寸法が大きくなったが、この
硝子体内腔の伸びは、眼の軸長全体の増大を大いに説明している。保護眼鏡を付
けることは、単独では、ビヒクル処理したヒナの殆どのコホートにおいて前眼房
深度に対する有意の効果を誘導しなかった。
【００８４】
２つの比較的非選択的なニコチン性アンタゴニスト、クロルイソンダミン及び
メカミラミンを試験した。クロルイソンダミンは、近視の屈折エラーを減少させ
(図１；ＡＮＯＶＡ：Ｐ＜０．００１)、保護眼鏡の下で発生する過度の軸伸長を
阻止し(図２Ａ、２Ｂ及び２Ｃ ＡＮＯＶＡ：超音波、Ｐ＜０．００１；カリパス
、Ｐ＝０．００８)そして軸寸法(ＡＮＯＶＡ：Ｐ＜０．００１)及び赤道寸法(Ａ
ＮＯＶＡ：Ｐ＝０．００１)の両方における硝子体内腔の拡大を減少させた。ク
ロルイソンダミンは、前眼房深度に対して統計的に有意の効果を有しなかった。
ターキィ試験によるｈｏｃ後対比較(表１)は、屈折力、軸長及び硝子体内腔深度
の測定値につき及び他の幾つかのグループ内比較について、ビヒクル処理した対
照と比較して有意の薬物の効果を示した。
メカミラミンを試験した。クロルイソンダミンは、近視の屈折エラーを減少させ
(図１；ＡＮＯＶＡ：Ｐ＜０．００１)、保護眼鏡の下で発生する過度の軸伸長を
阻止し(図２Ａ、２Ｂ及び２Ｃ ＡＮＯＶＡ：超音波、Ｐ＜０．００１；カリパス
、Ｐ＝０．００８)そして軸寸法(ＡＮＯＶＡ：Ｐ＜０．００１)及び赤道寸法(Ａ
ＮＯＶＡ：Ｐ＝０．００１)の両方における硝子体内腔の拡大を減少させた。ク
ロルイソンダミンは、前眼房深度に対して統計的に有意の効果を有しなかった。
ターキィ試験によるｈｏｃ後対比較(表１)は、屈折力、軸長及び硝子体内腔深度
の測定値につき及び他の幾つかのグループ内比較について、ビヒクル処理した対
照と比較して有意の薬物の効果を示した。
【００８５】
保護眼鏡を付けた眼に対するメカミラミンの効果は、一層複雑であり、薬物の
低投与量と高投与量との間で異なる多相的応答があった。それは、中位の投与量
で最大の抗近視効果を有し、最も低い投与量では、保護眼鏡を付けた眼の成長及
び近視的屈折力へのシフトを刺激する傾向があった。全体として、メカミラミン
は、保護眼鏡を付けた眼の屈折力を変化させた(図１；ＡＮＯＶＡ：Ｐ＜０．０
０１)。３つの一層高い薬物投与量は、すべて、近視を誘導したが、５０μｇの
投与量だけは、ｈｏｃ後対比較(表１)によって対照と有意に異なり、事実上、誘
導された近視を排除した。１及び１０μｇの投与量での屈折力は、個々に、ｈｏ
ｃ後対比較によって対照と異なったが、有意の差異が、１μｇの投与量と、５０
、１００及び２００μｇの投与量の各々との間並びに１０μｇと５０μｇの投与
量の間に生じた(表１)。保護眼鏡を付けた眼に対するメカミラミンの解剖学的効
果は、次の屈折力の効果を与える傾向がある：近視を減少させなかった投与量で
は一層大きい眼が発生し、近視を減少させた投与量では一層小さい眼が発生する
(図２)。軸長に関して(図２Ａ及び２Ｃ)、超音波による薬物効果に対する傾向だ
けがあった(図２Ａ ＡＮＯＶＡ：Ｐ＝０．０７)；カリパスでの測定によれば軸
長についての統計的効果はないことは明白であった。メカミラミンは、硝子体内
腔長の超音波測定値に影響を与えた(図２Ｂ ＡＮＯＶＡ：Ｐ＝０．００７)；ｈ
ｏｃ後対比較試験は、１μｇの投与量を５０μｇの投与量と異なるが対照とは異
ならないとして同定した(表１)。同様に、保護眼鏡を付けた眼の全体的な赤道直
径は、メカミラミンにより影響を受けた(図２Ｄ ＡＮＯＶＡ：Ｐ＝０．００３)
；ｈｏｃ後対比較試験は、対照と異なる如何なる個別の投与量も同定しなかった
が、１及び５０μｇの投与量が互いに異なること及び１０μｇの投与量が５０μ
ｇ及び２００μｇの投与量の何れともことなることを示した(表１)。
低投与量と高投与量との間で異なる多相的応答があった。それは、中位の投与量
で最大の抗近視効果を有し、最も低い投与量では、保護眼鏡を付けた眼の成長及
び近視的屈折力へのシフトを刺激する傾向があった。全体として、メカミラミン
は、保護眼鏡を付けた眼の屈折力を変化させた(図１；ＡＮＯＶＡ：Ｐ＜０．０
０１)。３つの一層高い薬物投与量は、すべて、近視を誘導したが、５０μｇの
投与量だけは、ｈｏｃ後対比較(表１)によって対照と有意に異なり、事実上、誘
導された近視を排除した。１及び１０μｇの投与量での屈折力は、個々に、ｈｏ
ｃ後対比較によって対照と異なったが、有意の差異が、１μｇの投与量と、５０
、１００及び２００μｇの投与量の各々との間並びに１０μｇと５０μｇの投与
量の間に生じた(表１)。保護眼鏡を付けた眼に対するメカミラミンの解剖学的効
果は、次の屈折力の効果を与える傾向がある：近視を減少させなかった投与量で
は一層大きい眼が発生し、近視を減少させた投与量では一層小さい眼が発生する
(図２)。軸長に関して(図２Ａ及び２Ｃ)、超音波による薬物効果に対する傾向だ
けがあった(図２Ａ ＡＮＯＶＡ：Ｐ＝０．０７)；カリパスでの測定によれば軸
長についての統計的効果はないことは明白であった。メカミラミンは、硝子体内
腔長の超音波測定値に影響を与えた(図２Ｂ ＡＮＯＶＡ：Ｐ＝０．００７)；ｈ
ｏｃ後対比較試験は、１μｇの投与量を５０μｇの投与量と異なるが対照とは異
ならないとして同定した(表１)。同様に、保護眼鏡を付けた眼の全体的な赤道直
径は、メカミラミンにより影響を受けた(図２Ｄ ＡＮＯＶＡ：Ｐ＝０．００３)
；ｈｏｃ後対比較試験は、対照と異なる如何なる個別の投与量も同定しなかった
が、１及び５０μｇの投与量が互いに異なること及び１０μｇの投与量が５０μ
ｇ及び２００μｇの投与量の何れともことなることを示した(表１)。
【００８６】
前眼房もメカミラミンから影響を受けえた(ＡＮＯＶＡ：Ｐ＝０．００９)が、
ｈｏｃ後対比較試験は、如何なる個別の差異も同定しなかった。前眼房深度につ
いてのデータを再検討すると、メカミラミン実験においてビヒクル処理した保護
眼鏡を付けた眼は、反対側の保護眼鏡を付けてない眼よりも僅かに浅い前眼房深
度を有した(保護眼鏡を付けた眼での１．２２±０．０４ｍｍに対して保護眼鏡
を付けてない眼での１．３４±０．０４ｍｍ)。これらの前眼房深度の保護眼鏡
を付けた眼と反対側の眼との間での差異は、低いメカミラミン投与量では類似し
ていたが；１００及び２００μｇの投与量については、薬物処理した保護眼鏡を
付けた眼における前眼房深度は、反対側の対照と比較して、もはや減少されず、
等しかった(データは示してない)。
ｈｏｃ後対比較試験は、如何なる個別の差異も同定しなかった。前眼房深度につ
いてのデータを再検討すると、メカミラミン実験においてビヒクル処理した保護
眼鏡を付けた眼は、反対側の保護眼鏡を付けてない眼よりも僅かに浅い前眼房深
度を有した(保護眼鏡を付けた眼での１．２２±０．０４ｍｍに対して保護眼鏡
を付けてない眼での１．３４±０．０４ｍｍ)。これらの前眼房深度の保護眼鏡
を付けた眼と反対側の眼との間での差異は、低いメカミラミン投与量では類似し
ていたが；１００及び２００μｇの投与量については、薬物処理した保護眼鏡を
付けた眼における前眼房深度は、反対側の対照と比較して、もはや減少されず、
等しかった(データは示してない)。
【００８７】
ある程度サブタイプ選択性を有するアンタゴニストの内で、メチルカコニチン
は、これらの２つの薬物の内で一層大きい効力を示し、最強の効果が中位の薬物
投与量で生じるようである点でメカミラミンに似ていた。メチルカコニチンは、
保護眼鏡を付けた眼において、近視の屈折力(ＡＮＯＶＡ：Ｐ＝０．０４)、軸長
(ＡＮＯＶＡ：超音波、Ｐ＝０．０５(図２Ａ)；カリパス、Ｐ＝０．００２(図２
Ｃ))、及び硝子体内腔の赤道伸長(ＡＮＯＶＡ：Ｐ＝０．０２(図２Ｄ))に影響を
与えた。硝子体内腔長に対して影響する傾向は、この薬物を用いては、有意に達
しなかった(図２Ｂ ＡＮＯＶＡ：Ｐ＝０．０９)。ターキィ試験によるｈｏｃ後
対複数比較を用いて、対照からの有意の差異は、保護眼鏡下での赤道伸長の５μ
ｇの投与量での阻止についてのみ同定された(加えて、５μｇの投与量は、カリ
パスで測定して軸長を、０．０５、０．５及び５０μｇの投与量と比較して減少
させた(表１))。保護眼鏡を付けた眼の前眼房深度に対するメチルカコニチンか
らは、何の効果もなかった。
は、これらの２つの薬物の内で一層大きい効力を示し、最強の効果が中位の薬物
投与量で生じるようである点でメカミラミンに似ていた。メチルカコニチンは、
保護眼鏡を付けた眼において、近視の屈折力(ＡＮＯＶＡ：Ｐ＝０．０４)、軸長
(ＡＮＯＶＡ：超音波、Ｐ＝０．０５(図２Ａ)；カリパス、Ｐ＝０．００２(図２
Ｃ))、及び硝子体内腔の赤道伸長(ＡＮＯＶＡ：Ｐ＝０．０２(図２Ｄ))に影響を
与えた。硝子体内腔長に対して影響する傾向は、この薬物を用いては、有意に達
しなかった(図２Ｂ ＡＮＯＶＡ：Ｐ＝０．０９)。ターキィ試験によるｈｏｃ後
対複数比較を用いて、対照からの有意の差異は、保護眼鏡下での赤道伸長の５μ
ｇの投与量での阻止についてのみ同定された(加えて、５μｇの投与量は、カリ
パスで測定して軸長を、０．０５、０．５及び５０μｇの投与量と比較して減少
させた(表１))。保護眼鏡を付けた眼の前眼房深度に対するメチルカコニチンか
らは、何の効果もなかった。
【００８８】
ジヒドロ−β−エリスロイジンは、実験的近視に対する弱い効果を示しただけ
であった(図１、２)。この薬物は、カリパスにより測定して、軸長においてのみ
有意の減少を誘導した(ＡＮＯＶＡ：Ｐ＝０．０２(図２Ｃ))が、ｈｏｃ後対複数
比較試験によっては、個別的薬物投与量は同定されなかった。他の点では、屈折
力(超音波測定)又は赤道直径のカリパス測定において、如何なる差異も、ＡＮＯ
ＶＡによる統計的有意に達しなかった。
であった(図１、２)。この薬物は、カリパスにより測定して、軸長においてのみ
有意の減少を誘導した(ＡＮＯＶＡ：Ｐ＝０．０２(図２Ｃ))が、ｈｏｃ後対複数
比較試験によっては、個別的薬物投与量は同定されなかった。他の点では、屈折
力(超音波測定)又は赤道直径のカリパス測定において、如何なる差異も、ＡＮＯ
ＶＡによる統計的有意に達しなかった。
【００８９】
保護眼鏡を付けてないヒナ。 ヒナを、上記の方法の節に記載したように飼育
して処置した。無菌条件下で、一匹の保護眼鏡を付けてない即ち「開いた」眼の
ヒナに、１０μｌの薬物又は塩溶液ビヒクルの硝子体内注射を行った。すべての
反対側の眼に、塩溶液ビヒクルの注射を、実験用の眼に注射をするのと同時にし
た。薬物とビヒクルを、眼内注射により、毎日又は一日おきに、明相に入って約
４時間の時点で投与した。
して処置した。無菌条件下で、一匹の保護眼鏡を付けてない即ち「開いた」眼の
ヒナに、１０μｌの薬物又は塩溶液ビヒクルの硝子体内注射を行った。すべての
反対側の眼に、塩溶液ビヒクルの注射を、実験用の眼に注射をするのと同時にし
た。薬物とビヒクルを、眼内注射により、毎日又は一日おきに、明相に入って約
４時間の時点で投与した。
【００９０】
クロルイソンダミンの片側硝子体内投与は、保護眼鏡を付けたことのないヒナ
の薬物処理した眼の軸成長を減少させた(図３；ランク上のＡＮＯＶＡ：超音波
、Ｐ＝０．０３；カリパス、Ｐ＝０．０３)。成長減少が硝子体内腔に限られ(ラ
ンク上のＡＮＯＶＡ：Ｐ＝０．０１)、屈折力における遠視的シフトに反映され
た(ランク上のＡＮＯＶＡ：Ｐ＝０．００４)。硝子体内腔の赤道伸長への効果は
、統計的有意に達しなかった。ターキィ試験を用いる対比較は、２００μｇ及び
１０μｇで処理した眼の屈折力並びに１００μｇ及び５０μｇで処理した眼の硝
子体内腔深度を、互いに異なるとして同定した(表１)。レンズの厚みに対する効
果も示され(ランク上のＡＮＯＶＡ：Ｐ＜０．００１)、これは、１０μｇのグル
ープにおける両眼の約０．１ｍｍの増大(５０、１００又は２００μｇの投与量
を受けたヒナ並びに両眼に塩溶液の注射を受けた他のヒナと比較して)を含むが
；レンズの対比較は、ターキィ試験によって有意と同定されなかった。
の薬物処理した眼の軸成長を減少させた(図３；ランク上のＡＮＯＶＡ：超音波
、Ｐ＝０．０３；カリパス、Ｐ＝０．０３)。成長減少が硝子体内腔に限られ(ラ
ンク上のＡＮＯＶＡ：Ｐ＝０．０１)、屈折力における遠視的シフトに反映され
た(ランク上のＡＮＯＶＡ：Ｐ＝０．００４)。硝子体内腔の赤道伸長への効果は
、統計的有意に達しなかった。ターキィ試験を用いる対比較は、２００μｇ及び
１０μｇで処理した眼の屈折力並びに１００μｇ及び５０μｇで処理した眼の硝
子体内腔深度を、互いに異なるとして同定した(表１)。レンズの厚みに対する効
果も示され(ランク上のＡＮＯＶＡ：Ｐ＜０．００１)、これは、１０μｇのグル
ープにおける両眼の約０．１ｍｍの増大(５０、１００又は２００μｇの投与量
を受けたヒナ並びに両眼に塩溶液の注射を受けた他のヒナと比較して)を含むが
；レンズの対比較は、ターキィ試験によって有意と同定されなかった。
【００９１】
開いた眼に対するクロルイソンダミンの効果と対照的に、メカミラミンの毎日
の硝子体内注射は、５０μｇ(物影喪失による近視に対する最強の効果を有する
投与量)の又は１０若しくは１μｇ(保護眼鏡に応答する近視を刺激する傾向のあ
る投与量)の投与量で、一週間後に、保護眼鏡を付けてない眼の成長又は屈折力
に何らの影響も有しなかった。
の硝子体内注射は、５０μｇ(物影喪失による近視に対する最強の効果を有する
投与量)の又は１０若しくは１μｇ(保護眼鏡に応答する近視を刺激する傾向のあ
る投与量)の投与量で、一週間後に、保護眼鏡を付けてない眼の成長又は屈折力
に何らの影響も有しなかった。
【００９２】
実施例２
急性薬物効果。 急性薬物効果を評価するために、別の２週齢のヒナ(ｎ＝５
／グループ)に、これらのニコチン性アンタゴニストの一方を、保護眼鏡を付け
た眼の成長に対する薬物の効果に基づいて選択した投与量(２００μｇのクロル
イソンダミン、５０μｇ及び１μｇのメカミラミン、５μｇのメチルカコニチン
又は５０μｇのジヒドロ−β−エリスロイジン)で、単一の片側硝子体内注射を
行った。注射の直前及び２時間後及び２４時間後に、両眼を、上記の方法による
屈折率測定及び超音波検査法によって検査した。ヒナは、これらの眼の成長の研
究において、測定の日には薬物を受けなかったので、２４時間の検査ポイントを
特に選択して、眼内筋肉に対する潜在的な残余の薬物の効果を、眼の成長の測定
に関係する時間で同定した。
／グループ)に、これらのニコチン性アンタゴニストの一方を、保護眼鏡を付け
た眼の成長に対する薬物の効果に基づいて選択した投与量(２００μｇのクロル
イソンダミン、５０μｇ及び１μｇのメカミラミン、５μｇのメチルカコニチン
又は５０μｇのジヒドロ−β−エリスロイジン)で、単一の片側硝子体内注射を
行った。注射の直前及び２時間後及び２４時間後に、両眼を、上記の方法による
屈折率測定及び超音波検査法によって検査した。ヒナは、これらの眼の成長の研
究において、測定の日には薬物を受けなかったので、２４時間の検査ポイントを
特に選択して、眼内筋肉に対する潜在的な残余の薬物の効果を、眼の成長の測定
に関係する時間で同定した。
【００９３】
平均基線瞳孔直径は、２．４±０．５ｍｍであった。注射の２時間後に、これ
らの薬物の各々は、幾らかの瞳孔拡張を誘導した(基線からの変化：２００μｇ
のクロルイソンダミン、０．８±０．１ｍｍ、Ｐ＜０．０１；５０μｇのメカミ
ラミン、０．３±０．１ｍｍ、有意に変化しなかった；１μｇのメカミラミン、
０．８±０．２ｍｍ、Ｐ＜０．０５；５μｇのメチルカコニチン０．４±０．２
ｍｍ、有意に変化しなかった；５０μｇのジヒドロ−β−エリスロイジン１．０
±０．１ｍｍ、Ｐ＜０．０１)。拡張されても、各グループ内の瞳孔は、依然と
して、光に応答して収縮するが、のろかった。２４時間までに、この瞳孔は、２
グループを除いてすべて正常に戻った(基線からの変化:クロルイソンダミン、０
．７±０．２ｍｍ、Ｐ＜０．０５；メカミラミン ５０μｇ、０．４±０．１ｍ
ｍ、Ｐ＜０．０５)。何れの薬物適用も、屈折力に対して、２又は２４時間の時
点で、有意の効果を有しなかった。超音波検査によって、クロルイソンダミンは
、後眼房深度において、０．１６±０．０４ｍｍ(Ｐ＜０．０５)の減少を２時間
の時点で誘導したが、その各々は、２４時間の時点で基線に戻った；クロルイソ
ンダミンは又、レンズの厚みも２時間の時点で０．１２±０．０４ｍｍ(Ｐ＜０
．０５)だけ減じ、２４時間の時点で０．１６±０．０５ｍｍ(Ｐ＜０．０５)だ
け減じた。他の何れの薬物も、超音波検査に影響を与えなかった。
らの薬物の各々は、幾らかの瞳孔拡張を誘導した(基線からの変化：２００μｇ
のクロルイソンダミン、０．８±０．１ｍｍ、Ｐ＜０．０１；５０μｇのメカミ
ラミン、０．３±０．１ｍｍ、有意に変化しなかった；１μｇのメカミラミン、
０．８±０．２ｍｍ、Ｐ＜０．０５；５μｇのメチルカコニチン０．４±０．２
ｍｍ、有意に変化しなかった；５０μｇのジヒドロ−β−エリスロイジン１．０
±０．１ｍｍ、Ｐ＜０．０１)。拡張されても、各グループ内の瞳孔は、依然と
して、光に応答して収縮するが、のろかった。２４時間までに、この瞳孔は、２
グループを除いてすべて正常に戻った(基線からの変化:クロルイソンダミン、０
．７±０．２ｍｍ、Ｐ＜０．０５；メカミラミン ５０μｇ、０．４±０．１ｍ
ｍ、Ｐ＜０．０５)。何れの薬物適用も、屈折力に対して、２又は２４時間の時
点で、有意の効果を有しなかった。超音波検査によって、クロルイソンダミンは
、後眼房深度において、０．１６±０．０４ｍｍ(Ｐ＜０．０５)の減少を２時間
の時点で誘導したが、その各々は、２４時間の時点で基線に戻った；クロルイソ
ンダミンは又、レンズの厚みも２時間の時点で０．１２±０．０４ｍｍ(Ｐ＜０
．０５)だけ減じ、２４時間の時点で０．１６±０．０５ｍｍ(Ｐ＜０．０５)だ
け減じた。他の何れの薬物も、超音波検査に影響を与えなかった。
【００９４】
これらの実験において、これらの眼を、眼内筋の状態が急性の影響を受けたか
どうかを知るために、選択した投与量のニコチン性アンタゴニストの投与の２及
び２４時間後に調べた。各薬物は、光に対する可逆の幾らかの瞳孔拡大を誘導し
；おそらく幾らかの毛様体筋麻痺(遠近調節の阻害)効果も部分的であった。これ
らの結果に基づいて、これらのニコチン性アンタゴニスト薬物は、屈折力を急性
にシフトさせず、如何なる基礎的調節状態もこれらの実験条件下では発見しなか
った。クロルイソンダミンだけは、眼の寸法を、超音波によれば、急性に変化さ
せ、軸及び硝子体内腔長を、２時間の時点での読みでは一時的に減少させたが、
２４時間では減少してなかった。更に、クロルイソンダミンだけは、レンズの厚
みに影響を与え、それを減少させて、おそらく焦点距離を増大させ；幾らかでも
レンズの焦点距離が増大すれば、この薬物を毎日受ける開いた眼の発生を調節し
、それは、眼の成長を刺激し(Schaeffel F, Glasser A, Howland HC, 1988, Vis
ion Res.,28:639-657)、それを阻止しなかった(図３)。眼の成長に対する薬物の
影響のすべての測定は最後の投与の２４時間後に行われたので、実施例１及び３
に示した成長及び屈折力の発生についての観察は、筋肉或は屈折力、眼の成分の
測定値に対する急性薬物効果によっては説明することができない；即ち、ニコチ
ン性アンタゴニストの眼の屈折力及び眼の成長に対する効果(実施例１及び３)は
、眼の発生に対する効果であり、眼の屈折力及び／又は寸法の発生的調節を構成
する。
どうかを知るために、選択した投与量のニコチン性アンタゴニストの投与の２及
び２４時間後に調べた。各薬物は、光に対する可逆の幾らかの瞳孔拡大を誘導し
；おそらく幾らかの毛様体筋麻痺(遠近調節の阻害)効果も部分的であった。これ
らの結果に基づいて、これらのニコチン性アンタゴニスト薬物は、屈折力を急性
にシフトさせず、如何なる基礎的調節状態もこれらの実験条件下では発見しなか
った。クロルイソンダミンだけは、眼の寸法を、超音波によれば、急性に変化さ
せ、軸及び硝子体内腔長を、２時間の時点での読みでは一時的に減少させたが、
２４時間では減少してなかった。更に、クロルイソンダミンだけは、レンズの厚
みに影響を与え、それを減少させて、おそらく焦点距離を増大させ；幾らかでも
レンズの焦点距離が増大すれば、この薬物を毎日受ける開いた眼の発生を調節し
、それは、眼の成長を刺激し(Schaeffel F, Glasser A, Howland HC, 1988, Vis
ion Res.,28:639-657)、それを阻止しなかった(図３)。眼の成長に対する薬物の
影響のすべての測定は最後の投与の２４時間後に行われたので、実施例１及び３
に示した成長及び屈折力の発生についての観察は、筋肉或は屈折力、眼の成分の
測定値に対する急性薬物効果によっては説明することができない；即ち、ニコチ
ン性アンタゴニストの眼の屈折力及び眼の成長に対する効果(実施例１及び３)は
、眼の発生に対する効果であり、眼の屈折力及び／又は寸法の発生的調節を構成
する。
【００９５】
実施例３
単一投与量のクロルイソンダミンの一層長期間の効果。 別個の実験において
、保護眼鏡を付けたヒナの他のグループは、物影喪失した眼に対する２００μｇ
のクロルイソンダミンの単一の硝子体内投与を受け、保護眼鏡適用の時点でのみ
反対側の眼に塩溶液を受けた。それらを、片側に保護眼鏡を付けたヒナ(保護眼
鏡適用の時点でのみ両眼に単一塩溶液注射を受けた)と比較した。何れのグルー
プもその後の眼内注射を受けなかった。これらのヒナを、４日後に、屈折率測定
と超音波によって評価した(ケタミン／キシラジン麻酔使用)。保護眼鏡適用及び
単一薬物注射の一週間後に、同じヒナを、屈折率測定、超音波検査及び上記のよ
うに摘出した眼のカリパスによる測定によって再び評価した。
、保護眼鏡を付けたヒナの他のグループは、物影喪失した眼に対する２００μｇ
のクロルイソンダミンの単一の硝子体内投与を受け、保護眼鏡適用の時点でのみ
反対側の眼に塩溶液を受けた。それらを、片側に保護眼鏡を付けたヒナ(保護眼
鏡適用の時点でのみ両眼に単一塩溶液注射を受けた)と比較した。何れのグルー
プもその後の眼内注射を受けなかった。これらのヒナを、４日後に、屈折率測定
と超音波によって評価した(ケタミン／キシラジン麻酔使用)。保護眼鏡適用及び
単一薬物注射の一週間後に、同じヒナを、屈折率測定、超音波検査及び上記のよ
うに摘出した眼のカリパスによる測定によって再び評価した。
【００９６】
保護眼鏡適用時に与えた２００μｇのクロルイソンダミンの単一投与量は、翌
週にわたって物影喪失に対する応答を有意に鈍らせた(表２)。この効果は、４日
目の時点で、屈折力(ｐ＜０．０５)及び軸長(ｐ＜０．０１)の有意の減衰により
明白である(保護眼鏡を付けた眼の超音波検査による)。屈折力の近視的シフトに
対する効力は、一週間の時点で減少しているが、統計的に有意の減衰は、軸長(
ｐ＜０．０５)及び硝子体内腔長(ｐ＝０．０５)の超音波測定において及び軸長(
ｐ＜０．０５)及び赤道直径(ｐ＜０．００５)のカリパスによる測定において、
一週間の時点で明らかである。クロルイソンダミンの単一投与量の近視の眼の成
長に対する作用は、薬物処理した軸及び硝子体内腔長のビヒクル処理した眼に対
する比が４日目と一週間の時点とで等しいので、これらの両時点で等しいようで
ある(表２)。
週にわたって物影喪失に対する応答を有意に鈍らせた(表２)。この効果は、４日
目の時点で、屈折力(ｐ＜０．０５)及び軸長(ｐ＜０．０１)の有意の減衰により
明白である(保護眼鏡を付けた眼の超音波検査による)。屈折力の近視的シフトに
対する効力は、一週間の時点で減少しているが、統計的に有意の減衰は、軸長(
ｐ＜０．０５)及び硝子体内腔長(ｐ＝０．０５)の超音波測定において及び軸長(
ｐ＜０．０５)及び赤道直径(ｐ＜０．００５)のカリパスによる測定において、
一週間の時点で明らかである。クロルイソンダミンの単一投与量の近視の眼の成
長に対する作用は、薬物処理した軸及び硝子体内腔長のビヒクル処理した眼に対
する比が４日目と一週間の時点とで等しいので、これらの両時点で等しいようで
ある(表２)。
【００９７】
実施例４
組織病理学的効果。 片眼を奪われた又は保護眼鏡を付けたことのない１週齢
のヒナの他のグループにおける潜在的な組織病理学的効果を同定するために、ク
ロルイソンダミン(一日おきに２００又は１００μｇ；ｎ＝５−６／グループ)、
メカミラミン(毎日２００又は５０μｇ；ｎ＝５−８／グループ)又は塩溶液ビヒ
クル(ｎ＝３−９／グループ)を、硝子体内注射により、保護眼鏡を付けた眼又は
保護眼鏡を付けたことのないヒナの開いた眼の一方に投与し、反対側の眼には、
ビヒクルを投与した(上記と同じプロトコールを用いた)。処理の一週間後に、上
記のプロトコールは、屈折力を与えた(超音波及びカリパス測定)。これらの眼を
、次いで、３％ グルタルアルデヒド／０．５％ パラホルムアルデヒド(０．１
Ｍ リン酸緩衝液、ｐＨ７．４)中で浸漬固定した。後部切片を、パラフィンに包
埋して、５μｍの厚さに切り、ヘマトキシリン及びエオシンで染色するか、又は
ヒストレジンに包埋して、３μｍ又は５μｍの厚さに切り、０．５％ アズール
ＩＩ／０．５％ メチレンブルー(１％ ボレート中)で染色した。
のヒナの他のグループにおける潜在的な組織病理学的効果を同定するために、ク
ロルイソンダミン(一日おきに２００又は１００μｇ；ｎ＝５−６／グループ)、
メカミラミン(毎日２００又は５０μｇ；ｎ＝５−８／グループ)又は塩溶液ビヒ
クル(ｎ＝３−９／グループ)を、硝子体内注射により、保護眼鏡を付けた眼又は
保護眼鏡を付けたことのないヒナの開いた眼の一方に投与し、反対側の眼には、
ビヒクルを投与した(上記と同じプロトコールを用いた)。処理の一週間後に、上
記のプロトコールは、屈折力を与えた(超音波及びカリパス測定)。これらの眼を
、次いで、３％ グルタルアルデヒド／０．５％ パラホルムアルデヒド(０．１
Ｍ リン酸緩衝液、ｐＨ７．４)中で浸漬固定した。後部切片を、パラフィンに包
埋して、５μｍの厚さに切り、ヘマトキシリン及びエオシンで染色するか、又は
ヒストレジンに包埋して、３μｍ又は５μｍの厚さに切り、０．５％ アズール
ＩＩ／０．５％ メチレンブルー(１％ ボレート中)で染色した。
【００９８】
一日おきに２００μｇのクロルイソンダミンを用いると、保護眼鏡を付けた眼
の眼杯の殆ど(４／５)及び保護眼鏡を付けたことのない眼のすべて(ｎ＝５)の概
略検査は、中−周辺基底部の経度乃至著しいまだら模様及び色素脱失；中央基底
領域では比較的広がって又は正常に見える変わり易い寸法の地理的領域を示した
。これらの組織切片は、周辺色素脱失領域に対応する領域内の網膜色素上皮(Ｒ
ＰＥ)の細胞の著しい破壊及び凝集を示した。色素含有細胞(おそらく、マクロフ
ァージ)が、時折、外側網膜で示され、外側切片は、ときどき、破壊された上皮
に重なって破壊されていた。さもなければ、これらの上皮は、無傷のようであっ
た。炎症細胞と思われる細胞が、ＲＰＥの殆どの関与する領域の下の末梢脈絡毛
細管に侵入していたが、脈絡膜は、影響を受けていなかった。これらの眼の中央
領域は、正常な組織構造又は一層顕著でない変化を示した。２００μｇのクロル
イソンダミンで処理した保護眼鏡を付けた眼(正常な概略検査を有した)も正常な
組織構造を示した。一日おきに１００μｇのクロルイソンダミンで処理した保護
眼鏡を付けた又は付けてない眼の内で、眼杯の概略検査は、正常な基底部又は軽
度な末梢だけの色素変化を示した。幾つかの眼は、正常な組織構造を有し、幾つ
かは、単一の大きな、平滑な過度に着色された含有物を、希薄なＲＰＥ細胞内に
唯一の検出可能な組織学的変化として示し、そして幾つかは、顕著なＲＰＥの小
さい単離された周辺パッチ／脈絡毛細管病理学(上記)を有した。重要なことには
、保護眼鏡を付けた眼又は開いた眼の成長及びクロルイソンダミンに対する屈折
力応答は、網膜の組織変化の程度と明確に関連してはいなかった。
の眼杯の殆ど(４／５)及び保護眼鏡を付けたことのない眼のすべて(ｎ＝５)の概
略検査は、中−周辺基底部の経度乃至著しいまだら模様及び色素脱失；中央基底
領域では比較的広がって又は正常に見える変わり易い寸法の地理的領域を示した
。これらの組織切片は、周辺色素脱失領域に対応する領域内の網膜色素上皮(Ｒ
ＰＥ)の細胞の著しい破壊及び凝集を示した。色素含有細胞(おそらく、マクロフ
ァージ)が、時折、外側網膜で示され、外側切片は、ときどき、破壊された上皮
に重なって破壊されていた。さもなければ、これらの上皮は、無傷のようであっ
た。炎症細胞と思われる細胞が、ＲＰＥの殆どの関与する領域の下の末梢脈絡毛
細管に侵入していたが、脈絡膜は、影響を受けていなかった。これらの眼の中央
領域は、正常な組織構造又は一層顕著でない変化を示した。２００μｇのクロル
イソンダミンで処理した保護眼鏡を付けた眼(正常な概略検査を有した)も正常な
組織構造を示した。一日おきに１００μｇのクロルイソンダミンで処理した保護
眼鏡を付けた又は付けてない眼の内で、眼杯の概略検査は、正常な基底部又は軽
度な末梢だけの色素変化を示した。幾つかの眼は、正常な組織構造を有し、幾つ
かは、単一の大きな、平滑な過度に着色された含有物を、希薄なＲＰＥ細胞内に
唯一の検出可能な組織学的変化として示し、そして幾つかは、顕著なＲＰＥの小
さい単離された周辺パッチ／脈絡毛細管病理学(上記)を有した。重要なことには
、保護眼鏡を付けた眼又は開いた眼の成長及びクロルイソンダミンに対する屈折
力応答は、網膜の組織変化の程度と明確に関連してはいなかった。
【００９９】
保護眼鏡を付けた眼及び付けてない眼の網膜を２００又は５０μｇのメカミラ
ミンで毎日処理することは、肉眼的に又は組織学的には、ビヒクル処理した対照
用の眼と区別できなかった。
ミンで毎日処理することは、肉眼的に又は組織学的には、ビヒクル処理した対照
用の眼と区別できなかった。
【０１００】
ここで引用したすべての参考文献(研究論文、特許文献又はその他の引用文献
の何れであっても)を、全部参考として本明細書中に援用する。多くの様々な改
変が、本願発明の精神から離れることなく為されうるということは、当業者によ
って理解されうる。それ故、本願発明の形態は、単に説明のためのものであり、
本願発明の範囲を限定することを意図するものではないということは明らかに理
解されるべきである。
の何れであっても)を、全部参考として本明細書中に援用する。多くの様々な改
変が、本願発明の精神から離れることなく為されうるということは、当業者によ
って理解されうる。それ故、本願発明の形態は、単に説明のためのものであり、
本願発明の範囲を限定することを意図するものではないということは明らかに理
解されるべきである。
【０１０１】
表Ａは、ニコチン性レセプターのサブタイプの要約を与えるものである。
表１は、ターキィ試験を用いる、薬物の効果のｈｏｃ後対比較を示すものであ
る。 表２は、物影喪失による近視に対するクロルイソンダミン(２００μｇ)の単一
投与量の一層長期間の効果を示すものである。
る。 表２は、物影喪失による近視に対するクロルイソンダミン(２００μｇ)の単一
投与量の一層長期間の効果を示すものである。
【０１０２】
【表１】
【表２】
【０１０３】
【表３】
統計的に有意の(Ｐ＜０．０５として規定される)ターキィ試験によるｈｏｃ後対
比較を、各条件及び薬物について示してあり、これらについて、処理の効果を、
ＡＮＯＶＡで同定した(本文及び図１〜３を参照されたい)。
比較を、各条件及び薬物について示してあり、これらについて、処理の効果を、
ＡＮＯＶＡで同定した(本文及び図１〜３を参照されたい)。
【０１０４】
【表４】
【図１】
保護眼鏡を付けた眼の屈折力に対する薬物の効果を示す図である。クロルイソ
ンダミン(ＣＨＬ；Ｐ＜０．００１)、メカミラミン(ＭＥＣ；Ｐ＜０．００１)及
びメチルカコニチン(ＭＬＡ；Ｐ＝０．０４)は、各々、保護眼鏡下で生じる近視
屈折力に影響を与えた(ＡＮＯＶＡにより評価)が；ジヒドロ−β−エリスロイジ
ン(ＤＨＢＥ)は、視覚を奪われた眼の屈折力に効果を有しなかった。ターキィ試
験による対比較の結果に関しては、表１を参照されたい。各実験グループ内のヒ
ナの数は、ここに示してある。データは、保護眼鏡を付けた眼と反対側の開いた
眼との間の差異として示してある(平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．)。比較を容易にするた
めに、各対照用グループの棒には、交差斜線を施してある。
ンダミン(ＣＨＬ；Ｐ＜０．００１)、メカミラミン(ＭＥＣ；Ｐ＜０．００１)及
びメチルカコニチン(ＭＬＡ；Ｐ＝０．０４)は、各々、保護眼鏡下で生じる近視
屈折力に影響を与えた(ＡＮＯＶＡにより評価)が；ジヒドロ−β−エリスロイジ
ン(ＤＨＢＥ)は、視覚を奪われた眼の屈折力に効果を有しなかった。ターキィ試
験による対比較の結果に関しては、表１を参照されたい。各実験グループ内のヒ
ナの数は、ここに示してある。データは、保護眼鏡を付けた眼と反対側の開いた
眼との間の差異として示してある(平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．)。比較を容易にするた
めに、各対照用グループの棒には、交差斜線を施してある。
【図２】
保護眼鏡を付けた眼の眼球の寸法に対する薬物の効果を示す図である。図２Ａ
は、超音波により測定した軸長に対する薬物の効果を示している。図２Ｂは、超
音波により測定した硝子体内腔長に対する薬物の効果を示している。図２Ｃは、
デジタルカリパスにより測定した軸長に対する薬物の効果を示している。図２Ｄ
は、カリパスにより測定した赤道直径に対する薬物の効果を示している。クロル
イソンダミン(ＣＨＬ)、メカミラミン(ＭＥＣ)及びメチルカコニチン(ＭＬＡ)は
、各々、保護眼鏡下で起きる過度の眼球成長を減少させ；統計的に有意の効果(
Ｐ＜０．０５)及び示唆的傾向が、直接に各データセットにつきＡＮＯＶＡ結果
により同定された。ジヒドロ−β−エリスロイジンの効果(ＤＨＢＥ)は、カリパ
スによる軸測定値だけが統計的に有意の薬物効果を示したほど弱かった。ターキ
ィ試験による対比較の結果については、表１を参照されたい。各実験グループ内
のヒナの数は、図１に与えてある。データは、保護眼鏡を付けた眼と反対側の開
いた眼との間の差異として示してある(平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．)。比較を容易にす
るために、各対照用グループの棒には、交差斜線を付けてある。
は、超音波により測定した軸長に対する薬物の効果を示している。図２Ｂは、超
音波により測定した硝子体内腔長に対する薬物の効果を示している。図２Ｃは、
デジタルカリパスにより測定した軸長に対する薬物の効果を示している。図２Ｄ
は、カリパスにより測定した赤道直径に対する薬物の効果を示している。クロル
イソンダミン(ＣＨＬ)、メカミラミン(ＭＥＣ)及びメチルカコニチン(ＭＬＡ)は
、各々、保護眼鏡下で起きる過度の眼球成長を減少させ；統計的に有意の効果(
Ｐ＜０．０５)及び示唆的傾向が、直接に各データセットにつきＡＮＯＶＡ結果
により同定された。ジヒドロ−β−エリスロイジンの効果(ＤＨＢＥ)は、カリパ
スによる軸測定値だけが統計的に有意の薬物効果を示したほど弱かった。ターキ
ィ試験による対比較の結果については、表１を参照されたい。各実験グループ内
のヒナの数は、図１に与えてある。データは、保護眼鏡を付けた眼と反対側の開
いた眼との間の差異として示してある(平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．)。比較を容易にす
るために、各対照用グループの棒には、交差斜線を付けてある。
【図３】
保護眼鏡を付けてない眼に対するクロルイソンダミンの効果を示す図である。
保護眼鏡を付けたことのないヒナの眼へのクロルイソンダミンの片側投与は、全
体として、屈折力を遠視の方へシフトさせ(ランク上のＡＮＯＶＡ：Ｐ＝０．０
０４)、軸長を減じ(ランク上のＡＮＯＶＡ：超音波、Ｐ＝０．０３；カリパス、
Ｐ＝０．０３)且つ硝子体内腔の軸伸長を阻止した(ランク上のＡＮＯＶＡ：Ｐ＝
０．０１)。ターキィ試験による対比較の結果については、表１を参照されたい
。Ｎ＝９−２０ヒナ／グループ。データは、薬物処理した眼と反対側のビヒクル
処理した眼との間の差異として示してある(平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．)。
保護眼鏡を付けたことのないヒナの眼へのクロルイソンダミンの片側投与は、全
体として、屈折力を遠視の方へシフトさせ(ランク上のＡＮＯＶＡ：Ｐ＝０．０
０４)、軸長を減じ(ランク上のＡＮＯＶＡ：超音波、Ｐ＝０．０３；カリパス、
Ｐ＝０．０３)且つ硝子体内腔の軸伸長を阻止した(ランク上のＡＮＯＶＡ：Ｐ＝
０．０１)。ターキィ試験による対比較の結果については、表１を参照されたい
。Ｎ＝９−２０ヒナ／グループ。データは、薬物処理した眼と反対側のビヒクル
処理した眼との間の差異として示してある(平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．)。
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フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ａ６１Ｋ 31/4453 Ａ６１Ｋ 31/4453
31/4525 31/4525
31/55 31/55
Ａ６１Ｐ 27/02 Ａ６１Ｐ 27/02
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，
ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ
Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ
，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，
ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ
Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ
，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，
ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，
ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ
Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ
，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，
ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ
Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ
，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，
ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ
Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ
，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，
ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ
Ｆターム(参考） 4C084 AA16 BA44 CA59 MA58 NA14
ZA33
4C086 AA01 AA02 BC10 BC21 CB11
CB22 GA02 MA01 MA58 ZA33
4C206 AA01 AA02 FA01 FA07 FA18
FA21 MA01 MA78 NA14 ZA33
Claims (33)
- 【請求項１】 出生後の眼の成長の制御のための、眼への投与のために適合
された医薬の製造のためのニコチン性アンタゴニストの利用。 - 【請求項２】 宿主動物の出生後の発達時の眼の異常な軸生長を阻止するた
めの医薬の製造のためのニコチン性アンタゴニストの利用。 - 【請求項３】 宿主動物の出生後の発達時の眼の異常な赤道伸長を阻止する
ための医薬の製造のためのニコチン性アンタゴニストの利用。 - 【請求項４】 宿主動物の出生後の発達時の眼の異常な硝子体内腔拡大を阻
止するための医薬の製造のためのニコチン性アンタゴニストの利用。 - 【請求項５】 近視の予防又は治療のための、眼への投与に適合された医薬
の製造のためのニコチン性アンタゴニストの利用。 - 【請求項６】 前記のニコチン性アンタゴニストが、競争的ニコチン性アン
タゴニストである、請求項１〜５の何れかに記載の利用。 - 【請求項７】 前記の競争的ニコチン性アンタゴニストが、メチルカコニチ
ンである、請求項６に記載の利用。 - 【請求項８】 前記の競争的ニコチン性アンタゴニストが、ジヒドロ−β−
エリスロイジンである、請求項６に記載の利用。 - 【請求項９】 前記のニコチン性アンタゴニストが、チャンネルブロッキン
グニコチン性アンタゴニストである、請求項１〜５の何れかに記載の利用。 - 【請求項１０】 前記のチャンネルブロッキングニコチン性アンタゴニスト
が、メカミラミンである、請求項９に記載の利用。 - 【請求項１１】 前記のチャンネルブロッキングニコチン性アンタゴニスト
が、クロルイソンダミンである、請求項９に記載の利用。 - 【請求項１２】 前記のニコチン性アンタゴニストが、非競争的ニコチン性
アンタゴニストである、請求項１〜５の何れかに記載の利用。 - 【請求項１３】 前記の非競争的ニコチン性アンタゴニストが、セルトラリ
ン、パロキセチン、ネファクソドン、ベンラファクシン、フルオキセチン、ブプ
ロプリオン、フェンシクリジン及びイボガインよりなる群のメンバーである、請
求項１２に記載の利用。 - 【請求項１４】 前記のニコチン性アンタゴニストが、ニコチン性レセプタ
ー機能を阻害する抗体である、請求項１〜５の何れかに記載の利用。 - 【請求項１５】 前記のニコチン性アンタゴニストが、ニコチン性アンタゴ
ニストの様に作用するアゴニストである、請求項１〜５の何れかに記載の利用。 - 【請求項１６】 治療上有効な量のニコチン性アンタゴニストを眼に投与し
て出生後の眼の成長を制御するステップを含む、出生後の眼の成長を制御する方
法。 - 【請求項１７】 治療上有効な量のニコチン性アンタゴニストを出生後の発
達時に眼に投与して、その眼の異常な出生後軸生長を阻止するステップを含む、
宿主動物の眼の異常な軸生長を阻止する方法。 - 【請求項１８】 治療上有効な量のニコチン性アンタゴニストを出生後の発
達時に眼に投与して、その眼の異常な赤道伸長を阻止するステップを含む、宿主
動物の眼の異常な赤道伸長を阻止する方法。 - 【請求項１９】 治療上有効な量のニコチン性アンタゴニストを出生後の発
達時に眼に投与して、その眼の異常な硝子体内腔拡張を阻止するステップを含む
、宿主動物の眼の異常な硝子体内腔拡張を阻止する方法。 - 【請求項２０】 治療上有効な量のニコチン性アンタゴニストを眼に投与し
て、近視の発生を阻止するステップを含む、近視の発生を阻止する方法。 - 【請求項２１】 前記のニコチン性アンタゴニストが、競争的ニコチン性ア
ンタゴニストである、請求項１６〜２０の何れかに記載の方法。 - 【請求項２２】 前記の競争的ニコチン性アンタゴニストが、メチルカコニ
チンである、請求項２１に記載の方法。 - 【請求項２３】 前記の競争的ニコチン性アンタゴニストが、ジヒドロ−β
−エリスロイジンである、請求項２１に記載の方法。 - 【請求項２４】 前記のニコチン性アンタゴニストが、チャンネルブロッキ
ングニコチン性アンタゴニストである、請求項１６〜２０の何れかに記載の方法
。 - 【請求項２５】 前記のチャンネルブロッキングニコチン性アンタゴニスト
が、メカミラミンである、請求項２４に記載の方法。 - 【請求項２６】 前記のチャンネルブロッキングニコチン性アンタゴニスト
が、クロルイソンダミンである、請求項２４に記載の方法。 - 【請求項２７】 前記のニコチン性アンタゴニストが、非競争的ニコチン性
アンタゴニストである、請求項１６〜２０の何れかに記載の方法。 - 【請求項２８】 前記の非競争的ニコチン性アンタゴニストが、セルトラリ
ン、パロキセチン、ネファクソドン、ベンラファクシン、フルオキセチン、ブプ
ロプリオン、フェンシクリジン及びイボガインよりなる群のメンバーである、請
求項２７に記載の方法。 - 【請求項２９】 前記のニコチン性アンタゴニストが、ニコチン性レセプタ
ー機能を阻害する抗体である、請求項１６〜２０の何れかに記載の方法。 - 【請求項３０】 前記のニコチン性アンタゴニストが、ニコチン性アンタゴ
ニストの様に作用するアゴニストである、請求項１６〜２０の何れかに記載の方
法。 - 【請求項３１】 宿主動物の出生後の眼の成長を制御するニコチン性アンタ
ゴニストの能力を検出する方法であって、下記のステップを含む、当該方法： 第一の動物の眼を、治療上有効な量のニコチン性アンタゴニストと接触させ； 該第一の動物の眼の成長の変化を検出し； 公知の制御剤を第二の動物の眼に適用し； 該第二の眼の成長の変化に対する該制御剤の結果を観察し；そして 該第一の眼の成長の変化を該第二の眼の成長の変化と比較し、それにより、ニ
コチン性アンタゴニストを、出生後の眼の成長を制御する能力を有するとして同
定する。 - 【請求項３２】 ニコチン性アンタゴニストを、出生後の眼の成長を制御す
る能力を有する活性剤として同定し、該活性剤を、混合物にて、製薬用賦形剤と
組み合わせるステップを含む、医薬の製造方法。 - 【請求項３３】 近視を調節するために利用することのできる化合物を同定
する方法であって、下記のステップを含む、当該方法： (ａ)ニコチン性レセプターを発現する細胞を試験化合物の存在下及び非存在下
でインキュベートし； (ｂ)該試験化合物が該ニコチン性レセプターに結合したかどうかを測定し； (ｃ)該ニコチン性レセプターに結合した試験化合物を選択し； (ｄ)該ステップ(ｃ)で選択した試験化合物を試験動物に投与し； (ｅ)該試験化合物が、該試験動物の近視の発生を変化させるかどうかを測定し
；そして (ｆ)該試験動物の近視の発生を変化させた化合物を選択する。
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