JP2003518932A - Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ抗原組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は抗原組成物を提供し、該組成物は少なくとも1つの組換えタンパク質を含んでなる。該組換えタンパク質は少なくとも1つのエピトープを含んでなる。該エピトープは配列番号３または配列番号５に記述した配列を有するポリペプチドと反応性がある抗体と反応性がある。本発明はまた、前記組換えタンパク質を作製するための方法および組成物も提供する。本発明はまた、P.gingivalis感染症を診断、治療および予防するための方法も提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の分野 本発明は、歯周病に関連した口内細菌ポルフィロモナス・ジンジバリス（Porp
hyromonas gingivalisもしくはP.gingivalis）病原体の影響を抑制するための、
組換えタンパク質および抗体に基づく経口組成物および抗原組成物を提供する。
本発明はまた、歯肉下プラークサンプル中のP.gingivalisおよび血清中の特異的
抗P.gingivalis抗体の存在についての診断試験も提供する。それに関連して、組
換えDNA技術を利用するr-RgpA44およびr-Kgp39ならびにそれらの誘導体を調製す
る方法も開示する。また、組換えタンパク質を発現する能力のある、組換えベク
ターを用いて形質転換した宿主細胞も開示する。組換えタンパク質は、能動免疫
用のワクチン製剤において免疫原として有用であるし、また受動免疫用におよび
試薬として診断アッセイ用に有用なタンパク質特異的抗血清を作製するために利
用することができる。

【０００２】発明の背景 本発明は、一般的にポルフィロモナス・ジンジバリス（Porphyromonas gingiv
alisもしくはP.gingivalis）の組換えタンパク質であるr-RgpA44およびr-Kgp39
に関する。本発明はまた、これらの組換えタンパク質および誘導体に基づいてP.
gingivalisに関連する歯周病を検出、予防および治療するために用いる製薬組成
物ならびに関連する作用薬にも関する。

【０００３】 歯周病は細菌に関連する歯の支持組織の炎症疾患であり、比較的穏やかな形態
の歯肉炎である非特定的かつ可逆的な歯肉組織の炎症から、歯支持構造の破壊に
より特徴づけられるもっと攻撃的な形態の歯周病まである。歯周病は歯根膜の破
壊に導く特定のグラム陰性菌のコンソーシアムの歯肉下感染に関連し、重要な公
衆衛生問題である。大きな関心を呼んでいる1つの細菌はP.gingivalisであり、
その理由は、この微生物の成人歯周病病変部からの回収は歯肉下の嫌気性培養可
能なフローラの50%にまで達しうるが、P.gingivalisは健康部位からは稀にしか
も少数しか回収されないからである。歯肉下プラーク中のP.gingivalisレベルは
歯周病の重症度の増加に関連して比例的に増加し、この疾患が回復すると培養可
能な歯肉下微生物集団からの該微生物は根絶される。P.gingivalisの歯肉下移植
による、非ヒト霊長類の歯周病病変の進行が実証されている。動物およびヒトの
両方に対するこれらの知見は、成人の歯周病発達におけるP.gingivalisの重要な
役割を示唆する。

【０００４】 さらに最近、歯周病と循環器病との連鎖、従ってP.gingivalis感染症と循環器
病との間の連鎖が増加している。この連鎖に関するさらなる情報は、Beck JDら,
Ann Periodontol 3:127-141, 1998およびBeck J,ら, J. Periodontol. 67:1123
-37, 1996に見られる。

【０００５】 P.gingivalisはその細胞表面上に、ワクチンまたは診断を開発するための候補
薬となりうる一連のタンパク質を発現する。P.gingivalisにより発現される細胞
表面タンパク質の主なグループは、プロテイナーゼおよび関連する付着性因子（
adhesin）のグループである。Arg-gingipainと名付けられた1つのプロテイナー
ゼがTravisら（PCT特許番号WO 95/07286）により先に開示されている。この研究
者らはまた、WO 95/07286にも開示された遺伝子rgpによりコードされるArg-ging
ipainの高分子量型を報じている。Arg-gingipainの高分子量型は、プロテイナー
ゼと複数の他タンパク質からなり、他タンパク質は付着因子（adhesin）である
と提案している。Arg-およびLys-特異的プロテイナーゼならびに付着因子からな
るP.gingivalisの細胞表面複合体はまた、Reynoldsら(PCT/AU96/00673)によって
も開示されている。これらの開示はいずれも、組換え体としての特定付着因子の
、P.gingivalis感染症の保護における効用に関する教示を提供していない。

【０００６】発明の概要 第1の態様においては、本発明は抗原組成物であって、該組成物は少なくとも1
つの組換えタンパク質を含んでなり、該組換えタンパク質は少なくとも1つのエ
ピトープを含んでなり、該エピトープは抗体と反応性があり、該抗体は配列番号
３または配列番号５に記述した配列を有するポリペプチドと反応性がある、前記
抗原組成物である。

【０００７】 さらなる好ましい実施形態においては、本発明の抗原組成物は、配列番号３、
配列番号３の残基1-184、、配列番号３の残基1-290、配列番号３の残基65-184、
配列番号３の残基65-290、配列番号３の残基65-419、配列番号３の残基192-290
、配列番号３の残基192-419、配列番号３の残基147-419、配列番号５および配列
番号６からなる群から選択される配列を有する組換えタンパク質を含んでなる。

【０００８】 配列番号３と配列番号５を比較すると認められるように、これらのポリペプチ
ドはそれらの配列のある実質的な部分の全てにわたって同一である。

【０００９】 他の好ましい実施形態においては、本発明の抗原組成物はさらにアジュバント
を含んでなる。

【００１０】 さらに他の好ましい実施形態においては、本発明の組換えタンパク質はキメラ
または融合タンパク質である。組換えタンパク質がキメラまたは融合タンパク質
である場合、タンパク質は配列番号３、配列番号３の残基1-184、配列番号３の
残基1-290、配列番号３の残基65-184、配列番号３の残基65-290、配列番号３の
残基65-419、配列番号３の残基192-290、配列番号３の残基192-419、配列番号３
の残基147-419、配列番号５および配列番号６からなる群から選択される配列を
含むことが好ましい。そのようなキメラまたは融合タンパク質の一例を配列番号
４に記述する。

【００１１】 第2の態様においては、本発明は、本発明の第1の態様の抗原組成物に対して産
生される抗体を少なくとも1つ含んでなる組成物である。

【００１２】 第3の態様においては、本発明は組換え原核生物または真核生物細胞であって
、配列番号１、配列番号１のヌクレオチド1-1257、配列番号１のヌクレオチド1-
552、配列番号１のヌクレオチド1-870、配列番号１のヌクレオチド193-552、配
列番号１のヌクレオチド193-870、配列番号１のヌクレオチド193-1257、配列番
号１のヌクレオチド574-870、配列番号１のヌクレオチド574-1257、配列番号１
のヌクレオチド439-1257、配列番号７、配列番号８およびそれらとストリンジェ
ントな条件下でハイブリダイズする配列からなる群から選択され少なくとも1つ
の調節エレメントと機能しうる形で連結されたDNA配列を含んでなる、前記組換
え細胞である。

【００１３】 本明細書に使用されるストリンジェントな条件は次の通りである；(1)低イオ
ン強度および高温を洗浄に用い、例えば、0.015 M NaCl/0.0015 M クエン酸ナト
リウム/0.1% NaDodSO₄、50℃；(2)ハイブリダイゼーションにおいては、ホルム
アミドなどの変性剤を用い、例えば0.1%ウシ血清アルブミンを含む50%(vol/vol)
ホルムアミド、0.1%フィコール、0.1%ポリビニルピロリドン、750mM NaCl を含
む50mMリン酸ナトリウムバッファー、pH 6.5、75mMクエン酸ナトリウム、42℃、
；または(3)50%ホルムアミドを用い、5 x SSC(0.75M NaCl、0.075M クエン酸ナ
トリウム)、50mMリン酸ナトリウム(pH 6.8)、0.1%ピロリン酸ナトリウム、5 x
デンハルト（Denhardt's）液、音波処理済みサケ精子DNA(50g/ml)、0.1% SDSお
よび10%硫酸デキストラン、42℃、0.2 x SSC中でおよび0.1% SDS。

【００１４】 さらなる態様においては、本発明は、被験者におけるP.gingivalis感染症の発
生数または重症度を予防または軽減する方法であって、被験者に本発明の第1の
態様の抗原組成物を投与することを含んでなる前記方法である。

【００１５】 歯周病と循環器病（CVD）との連鎖が高く、従ってP.gingivalis感染症とCVDと
の連鎖がありうるので、本発明の第1の態様の抗原組成物はまた、CVDの発生数ま
たは重症度を軽減する予防治療にまたはCVDを治療する補助剤としても使用しう
る。

【００１６】 本発明の1つの重要な形態は、r-RgpA44および/もしくはr-Kgp39タンパク質ま
たはペプチドおよび適当なアジュバントに基づくワクチンであって、鼻スプレー
、経口または注射により送達してr-RgpA44および/もしくはr-Kgp39タンパク質に
対する特異的免疫応答を産生させる前記ワクチンである。ワクチンはまた、適当
なベクター中に組込んだRgpA44および/もしくはKgp39遺伝子セグメントの組換え
成分に基づき、ベクターを含有する適当な形質転換された宿主（例えば大腸菌（
E.coli)、枯草菌（Bacillus subtilis）、酵母（Saccharomyces cerevisiae）、
COS細胞、CHO細胞、およびHeLa細胞）内で発現させてもよい。RgpA44および/も
しくはKgp39タンパク質由来の免疫原性エピトープをもつ成分タンパク質、ペプ
チド、およびオリゴペプチドは、歯周病の予防における様々なワクチン製剤の免
疫原として利用することができる。さらに、本発明によれば、産生したRgpA44お
よび/もしくはKgp39タンパク質ならびに関連するペプチドまたはキメラを使用し
て、歯周病およびP.gingivalisが原因である感染症に対する受動免疫感作に有用
なP.gingivalis抗血清を作製することができる。

【００１７】 本発明の一実施形態においては、組換えDNA技術を用いて、RgpA44および/もし
くはKgp39をコードする遺伝子セグメント、または免疫原性エピトープを有する1
以上のペプチドもしくはキメラをコードする遺伝子断片を発現ベクター中に組込
み、その組換えベクターを適当な宿主細胞中に導入し、それにより特定の宿主細
胞におけるこれらの配列を発現させる。発現系は、宿主細胞中に導入された組換
えベクターを含んでなり、それを用いて、(a)r-RgpA44および/もしくはr-Kgp39
タンパク質、関連するペプチド、オリゴペプチドまたはキメラを産生し、精製し
てワクチン製剤の免疫原として利用すること；(b)RgpA44および/もしくはKgp39
タンパク質、関連するペプチド、オリゴペプチドまたはキメラを産生し、診断イ
ムノアッセイ用の抗原としてまたは治療および/もしくは診断用に価値のあるP.g
ingivalis特異的抗血清を作製するために利用すること；(c)またはもし組換え発
現ベクターがワクシニアウイルスなどの生ウイルスであれば、ベクター自身を生
もしくは不活性化ワクチン調製物として使用し、宿主細胞中に導入してRgpA44お
よび/もしくはKgp39または免疫原性ペプチドまたはオリゴペプチドまたはキメラ
ペプチドを発現させること；(d)生弱毒細菌細胞または遺伝子工学的に操作した
共生口内細菌中へ導入し、これらを使用してRgpA44および/もしくはKgp39タンパ
ク質、関連するペプチドまたはオリゴペプチドまたはキメラを発現させて個体を
ワクチン接種すること；または、(e)個体中に直接導入し、コードされかつ発現
されたRgpA44タンパク質、関連するペプチドまたはオリゴペプチドまたはキメラ
に対して免疫感作することができる。特に、組換え細菌ワクチンはヒト口腔の、
または、ワクチンが動物の歯周病予防用であれば、動物の共生生息菌に基づくも
のであってもよい。P.gingivalisのRgpA44および/もしくはKgp39を発現する組換
え細菌ワクチンを使って口腔、歯肉上または歯肉下プラークにコロニーを形成さ
せることができる。口内細菌を歯周病の患者から単離し、遺伝子工学的に操作し
てr-RgpA44および/もしくはr-Kgp39、成分、ペプチドまたはキメラを発現させて
もよい。r-RgpA44および/もしくはr-Kgp39タンパク質は、粘膜に関連するリンパ
組織（MALT）を刺激してP.gingivalisに対する特異的抗体を産生する。

【００１８】 RgpA44および/もしくはKgp39タンパク質、ペプチド、オリゴペプチド、キメラ
ペプチドならびにエピトープを含有する構築物は、P.gingivalisの病原株に対す
る予防および/または治療ワクチンの免疫原として利用してもよく、この免疫原
は化学的に合成しても、P.gingivalisから精製しても、または組替え発現ベクタ
ー系から精製してもよい。あるいは、RgpA44および/もしくはKgp39をコードする
遺伝子セグメントまたはペプチドもしくはオリゴペプチドもしくはキメラペプチ
ドをコードする1以上の遺伝子断片を細菌もしくはウイルスのワクチン中に組込
み、前記ワクチンが1以上のRgpA44および/もしくはKgp39の特異的免疫原性エピ
トープを、または他の病原性微生物の免疫原性エピトープと一緒に産生するよう
に遺伝子操作された組換え細菌もしくはウイルスを含有してもよい。さらに、1
以上の調節エレメントと機能しうる形で連結された、RgpA44および/もしくはKgp
39をコードする遺伝子またはRgpA44および/もしくはKgp39ペプチドもしくはオリ
ゴペプチドもしくはキメラペプチドをコードする1以上の遺伝子断片を、直接ヒ
トに導入し、RgpA44および/もしくはKgp39に関係するタンパク質、ペプチド、オ
リゴペプチドもしくはキメラペプチドを発現させて保護免疫応答を誘発してもよ
い。ワクチンはまた、適当なベクター中に組込んだ正常または突然変異RgpA44お
よび/もしくはKgp39の組換え成分に基づいて、そのベクターを含有する適当な形
質転換宿主（例えば大腸菌（E.coli)、枯草菌（Bacillus subtilis）、酵母（Sa
ccharomyces cerevisiae）、COS細胞、CHO細胞、およびHeLa細胞）に発現させて
もよい。ワクチンは、P.gingivalisのRgpA44および/もしくはKgp39を発現する組
換え細菌が口腔の共生生息菌であることを特徴とする、口内組換え細菌ワクチン
に基づいてもよい。

【００１９】 他の態様においては、本発明は、組換えタンパク質をコードするヌクレオチド
配列および前記ヌクレオチド配列の機能的同一物および前記ヌクレオチド配列に
対する核酸プローブを提供する。

【００２０】 本発明はまた、その範囲内に上記のヌクレオチドおよびキメラ組換えポリペプ
チドを含む組換え産物の様々な応用および利用も包含する。特に、本発明は、本
明細書においてそれぞれ抗r-RgpA44抗体および抗r-Kgp39抗体と呼ぶ、r-RgpA44
またはr-Kgp39に対して産生される抗体；ならびにそのポリペプチド、オリゴペ
プチドおよびキメラペプチドに対する抗体を提供する。抗体はポリクローナルで
あってもモノクローナルであってもよい。抗体を、歯磨ペースト、口洗浄液、歯
磨粉および液状歯磨剤、口洗浄液、トローチ、チューインガム、歯磨ペースト、
歯肉マッサージクリーム、うがい錠、乳製品ならびに他の食料品などの経口組成
物にブレンドしてもよい。組換えポリペプチド、オリゴペプチドおよびキメラポ
リペプチドはまた、予防および/または治療ワクチン製剤に利用することもでき
る。

【００２１】 他の態様においては、本発明は、本明細書に定義された抗体、抗原または核酸
プローブの1以上の組合せの使用により特徴づけられるP.gingivalisの存在を診
断する方法を提供し、例えば、固相酵素免疫検定法（ELISA）を含む公知の技術
の応用を含んでなる。

【００２２】 本発明はまた、本明細書にこれまで定義した抗体、抗原および/または核酸プ
ローブを含んでなる診断キットも提供する。

【００２３】 本発明はまた、P.gingivalis感染症を患う患者を治療する方法であって、本明
細書にこれまで定義したワクチンによる前記患者の能動ワクチン接種および/ま
たは本明細書にこれまで定義した抗体による前記患者の受動ワクチン接種を含ん
でなる前記方法も提供する。

【００２４】 本発明の性質がさらに明白に理解されるように、本発明の好ましい形態を、以
下の実施例を参照して説明する。

【００２５】 口内細菌ポルフィロモナス・ジンジバリスはその表面上に、遺伝子rgpAおよび
kgpによりコードされるプロテイナーゼ付着因子複合体を含有する。このプロテ
イナーゼ付着因子複合体の組換え44kDa付着因子（r-RgpA44）は、マウス膿瘍モ
デルにおいてP.gingivalis抗原投与に対して保護するが、rgpA遺伝子由来の他の
組換えタンパク質は保護しない。44kDa付着因子ドメインRgpA44またはKgp39をコ
ードする遺伝子発現セグメントを適当な発現系中にクローニングして、組換えタ
ンパク質r-RgpA44またはr-Kgp39を産生させることができる。次に、精製したr-R
gpA44またはr-Kgp39タンパク質を使って標準技術を用いて抗体を作製することが
できる。抗体作製に利用する動物は、ウサギ、ヤギ、ニワトリ、ヒツジ、ウマ、
ウシなどであってもよい。イムノアッセイによりr-RgpA44またはr-Kgp39タンパ
ク質に対する高い抗体力価が検出されると、動物から採血するかまたは卵もしく
は乳を採集し、標準技術を用いて血清を調製しおよび/または抗体を精製するか
、または標準技術を用いて脾細胞と骨髄腫細胞とを融合することによりモノクロ
ーナル抗体を産生する。抗体（免疫グロブリン画分）は、培養物または腹水、血
清、乳または卵から塩析、ゲル濾過、イオン交換および/またはアフィニティク
ロマトグラフィなどにより分離することができ、塩析が好ましい。塩析法では、
抗血清もしくは乳を硫酸アンモニウムにより飽和して沈澱物を作り、次いで沈澱
物を生理食塩水に対し透析して特異的抗r-RgpA44もしくは抗r-Kgp39抗体を含む
精製免疫グロブリン画分を得られる。好ましい抗体はウマの抗血清ならびにウシ
の抗血清および乳から得る。本発明においては、r-RgpA44もしくはr-Kgp39のタ
ンパク質又はペプチドを用いて動物を免疫感作することによって得た抗血清およ
び乳に含有される抗体を経口組成物中にブレンドする。この場合、抗血清および
乳、ならびに抗血清および乳から分離し精製した抗体を使用することができる。
これらの物質はそれぞれ単独でまたは2以上を組み合わせて使用してもよい。r-R
gpA44もしくはr-Kgp39に対する抗体を、歯磨ペーストおよび洗口液などの経口組
成物に利用してもよい。抗r-RgpA44もしくは抗r-Kgp39抗体はまた、歯肉下プラ
ークサンプル中のP.gingivalisを早期検出するため、手元の固相酵素免疫検定法
（ELISA）により使用してもよい。

【００２６】 経口組成物としては、投与される上記抗体の量は0.0001-50g/kg/dayであり、
上記抗体の含量は組成物の0.0002-10重量%、好ましくは0.002-5重量%であること
が好ましい。上記の血清または乳抗体を含有する本発明の経口組成物は、歯磨ペ
ースト、歯磨粉および液状歯磨剤を含む歯磨剤、洗口液、トローチ、歯周ポケッ
ト洗浄デバイス、チューインガム、歯科用ペースト、歯肉マッサージクリーム、
うがい錠、乳製品ならびに他の食料品などの口に入れるのに適した様々な形態に
調製して使うことができる。本発明による経口組成物はさらに、特定の経口組成
物のタイプと形態に応じて、追加の周知の成分を含んでもよい。

【００２７】 本発明のある特定の特に好ましい形態では、経口組成物は洗口液またはリンス
液のように実質的に性状が液体であってよい。このような調製物では、ビヒクル
は典型的には水-アルコール混合物であり、望ましくは以下に記載の湿潤剤（hum
ectant）を含む。一般的に、水対アルコールの重量比は約1:1〜約20:1の範囲に
ある。このタイプの調製物中の水-アルコール混合物の総量は典型的には調製物
の約70〜約99.9重量%の範囲にある。アルコールは典型的にはエタノールまたは
イソプロパノールである。エタノールが好ましい。

【００２８】 本発明のこのような液および他の調製物のpHは一般的に約4.5〜約9の範囲であ
り、典型的には約5.5〜8である。pHは好ましくは約6〜約8.0の範囲にあり、好ま
しくは7.4である。pHは酸（例えば、クエン酸または安息香酸）もしくは塩基（
例えば水酸化ナトリウム）を用いて調節するか、または緩衝化（クエン酸ナトリ
ウム、安息香酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、もしくは重炭酸ナトリウム、リン
酸水素二ナトリウム、リン酸二水素ナトリウムなど）することができる。

【００２９】 本発明の他の望ましい形態である経口組成物は、歯磨粉、歯科錠または歯磨ペ
ースト（歯科クリーム）もしくはゲル歯磨剤である歯磨剤のような実質的に固体
またはペーストの性状であってもよい。このような固体またはペーストの経口調
製物は一般的に歯科用に許容しうる研磨材を含有する。研磨材の例は、水不溶メ
タリン酸ナトリウム、メタリン酸カリウム、リン酸三カルシウム、二水和リン酸
カルシウム、無水リン酸二カルシウム、ピロリン酸カルシウム、オルトリン酸マ
グネシウム、リン酸三マグネシウム、炭酸カルシウム、水和アルミナ、か焼アル
ミナ、珪酸アルミニウム、珪酸ジルコニウム、シリカ、ベントナイト、およびこ
れらの混合物である。他の適当な研磨材は、メラミンホルムアルデヒド、フェノ
ールホルムアルデヒド、および尿素-ホルムアルデヒドなどの特定の熱硬化性樹
脂、ならびに架橋ポリエポキシドおよびポリエステルが挙げられる。好ましい研
磨材は、約5ミクロン以下の粒径、約1.1ミクロン以下の平均粒径、および約50,0
00cm²/g以下の表面積を有する結晶シリカ、シリカゲルもしくはコロイダルシリ
カ、および複合無定形アルカリ金属アルミノ珪酸塩が挙げられる。

【００３０】 視覚的に透明なゲルを用いる場合、Syloid 72およびSyloid 74などの登録商標
SYLOID、またはSantocel 100などの登録商標SANTOCELで販売されるコロイドシリ
カ、アルカリ金属アルミノ珪酸塩複合体の研磨剤は、通常の歯磨剤に使われるゲ
ル化剤-液系（水および/または湿潤剤を含む）の屈折率に近い屈折率を有するの
で、特に有用である。

【００３１】 いわゆる「水不溶」研磨材の多くは性状が陰イオン性であり、小量の可溶物質
も含む。そして、不溶メタリン酸ナトリウムは「ソープ（Thorpe）の応用化学辞
書（Thorpe's Dictionary of Applied Chemistry）」, [Volume 9, 4th Edition
, pp.510-511]に説明されたいずれかの適当な方法で作ることができる。マドレ
ル（Madrell）の塩およびクロール（Kurrol）の塩として知られる不溶メタリン
酸ナトリウムの形態は適当な材料のさらなる例である。これらのメタリン酸塩は
水中で僅かな溶解度しか示さず、従って通常不溶メタリン酸塩（IMP）と呼ばれ
ている。これらには小量の可溶リン酸塩材料が不純物として通常4重量%以下の数
パーセントで存在する。不溶メタリン酸塩の場合には、可溶性三メタリン酸ナト
リウムを含有すると考えられる可溶性リン酸塩材料の量は、もし所望であれば水
洗により低減または消去することができる。不溶アルカリ金属メタリン酸塩は、
典型的には、37ミクロンより大きい材料が1％を越えない粒子サイズの粉末形状
で使用される。

【００３２】 研磨材は一般的に固体またはペースト状組成物中に約10%〜約99%の重量濃度で
存在する。好ましくは、研磨材は歯磨ペースト中には約10%〜約75%、そして歯磨
粉中には約70%〜約99%の量で存在する。歯磨ペーストでは、研磨材が珪酸質であ
れば、一般的に約10-30重量%で存在する。他の研磨材は典型的には約30-75重量%
で存在する。

【００３３】 歯磨ペーストでは、液ビヒクルは、水および湿潤剤を典型的には調製物の約10
%〜約80重量%の範囲の量で含有する。グリセリン、プロピレングリコール、ソル
ビトールおよびポリプロピレングリコールが適当な湿潤剤／担体の例である。ま
た、水、グリセリンおよびソルビトールの液混合物も有利である。屈折率の考慮
が重要である透明ゲルにおいては、約2.5-30%w/wの水、0-約70%w/wのグリセリン
および約20-80%w/wのソルビトールを使用するのが好ましい。

【００３４】 歯磨ペースト、クリームおよびゲルは、典型的には天然または合成の増粘剤ま
たはゲル化剤を、約0.1〜約10、好ましくは約0.5〜約5%w/wの比率で含有する。
適当な増粘剤は合成ヘクトライト、すなわち合成コロイド状マグネシウムアルカ
リ金属珪酸塩複合体粘土であり、これは例えばラポナイト社（Laponite Industr
ies Limited）から市販されるLaponite（例えば、CP、SP 2002、D）として入手
可能である。ラポナイト Dの組成は、近似的に重量で58.00% SiO₂、25.40% MgO
、3.05% Na₂O、0.98% Li₂O、ならびに若干の水および微量金属である。その真比
重は2.53であり、8%湿分にて見かけ嵩密度1.0g/mlを有する。

【００３５】 他の適当な増粘剤としては、アイリッシュ・モス（Irish moss）、イオタ・カ
ラギーナン（iota carrageenan）、トラガカントガム、デンプン、ポリビニルピ
ロリドン、ヒドロキシエチルプロピルセルロース、ヒドロキシブチルメチルセル
ロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース（
例えばNatrosolとして市販される）、カルボキシメチルセルロースナトリウム、
およびこまかく粉砕されたサイロイド（Syloid）（例えば、244）などのコロイ
ド状珪酸が挙げられる。また可溶化剤は、ポリプロピレングリコール、ジプロピ
レングリコールおよびヘキシレングリコールなどの湿潤剤ポリオール、メチルセ
ロソルブおよびエチルセロソルブなどのセロソルブ、オリーブ油、ヒマシ油およ
びワセリンなどの少なくとも約12個の炭素を直鎖に含有する植物油およびワック
ス、ならびに酢酸アミル、酢酸エチル、安息香酸ベンジルなどのエステルを含ん
でもよい。

【００３６】 通常そうであるように、経口調製物は適当なラベルを付した包装で販売される
かさもなくば流通されることは理解されるであろう。従って、口リンスの壜は、
内容物が口リンスまたは洗口液であることを記載するラベルが付いて、その使用
に関する指示書を有するであろう；そして歯磨ペースト、クリームまたはゲルは
、通常、押出しチューブ、典型的にはアルミニウム、ライニングした鉛もしくは
プラスチック、または他の内容物を計り出す押出器、ポンプもしくは加圧ディス
ペンサーに入っていて、歯磨ペースト、ゲルもしくは歯科用クリームのような物
質を記載するラベルが付いている。

【００３７】 有機界面活性剤を本発明の組成物に使用して、予防作用を増強し、口腔全体に
活性薬の十分で完全な分散の達成を助け、本発明の組成物をさらに化粧用として
（cosmetically）許容され得るものにする。有機界面活性物質は、好ましくは陰
イオン性、非イオン性、または両性電解質であって本発明の抗体を変性しない性
質であり、そして、界面活性剤として、抗体を変性することなく洗浄および発泡
物性を組成物に付与する洗浄材料を使用することが好ましい。陰イオン性界面活
性剤の適当な例は、水素化ココナッツオイル脂肪酸のモノ硫酸エステル化モノグ
リセライドのナトリウム塩などの高級脂肪酸モノグリセライドモノ硫酸エステル
の水溶性塩、ラウリル硫酸ナトリウムなどの高級アルキル硫酸塩、ドデシルベン
ゼン硫酸ナトリウムなどのアルキルアリールスルホン酸塩、高級アルキルスルホ
酢酸エステル、1,2-ジヒドロキシプロパンスルホン酸の高級脂肪酸エステル、お
よび低級脂肪族アミノカルボン酸化合物の実質的に飽和した高級脂肪族アシルア
ミド（例えば脂肪酸、アルキルもしくはアシル基に12〜16個の炭素を有する）、
その他である。最後に記述したアミドの例は、N-ラウロイルサルコシン、および
N-ラウロイル、N-ミリストイル、またはN-パルミトイルサルコシンのナトリウム
、カリウム、およびエタノールアミン塩であり、実質的に石鹸または同様な高級
脂肪酸物質を含有しない。本発明の経口組成物におけるこれらのサルコナイト化
合物の使用は、これらの物質が、炭水化物分解による口腔内の酸形成阻害に持続
性の顕著な効果をあらわすのに加えて、酸性溶液中の歯エナメル質の溶解度低下
に作用するので特に有利である。抗体との使用に適当な水溶性非イオン界面活性
剤の例は、エチレンオキサイドと各種反応性水素を含有し長い疎水鎖(例えば、
約12〜20個の炭素原子の脂肪族鎖)を有することにより反応性がある化合物との
縮合生成物であって、その縮合生成物（「エトキサマー（ethoxamer）」）は、
ポリ（エチレンオキサイド）と脂肪酸、脂肪族アルコール、脂肪族アミド、ポリ
ヒドリックアルコール(例えば、ソルビタンモノステアレート)およびポリプロピ
レンオキサイド（例えばプルロニック剤（Pluronic materials））との縮合生成
物のような親水性ポリオキシエチレン部分を含有する。

【００３８】 界面活性剤は、典型的には、約0.1-5重量%の量で存在する。注目すべきは、界
面活性剤は本発明の抗体の溶解を助け、それにより必要な可溶化湿潤剤の量を削
減できることである。

【００３９】 本発明の経口調製物には、増白剤、保存剤、シリコーン、クロロフィル化合物
および／または尿素、リン酸二アンモニウムのようなアンモニア化物、ならびに
それらの混合物のような様々な他の材料を混合することができる。これらのアジ
ュバントは、存在する場合には、所望の物性および特性に実質的に悪影響をあた
えない量で調製物に混合する。

【００４０】 適当な風味剤または甘味剤を使用してもよい。適当な風味剤成分の例は、着香
りオイル、例えば、スパーミント（spermint）、ペパーミント（peppermint）、
ヒメコウジ（wintergreen）、ササフラス（sssafras）、チョウジ(clove)、セー
ジ(sage)、ユーカリノキ(eucalyptus)、マヨラナ(marjoram)、シナモン、レモン
、およびオレンジ、ならびにサリチル酸メチルのオイルである。適当な甘味剤は
、ショ糖、ラクトース、マルトース、ソルビトール、キシリトール、サイクラミ
ン酸ナトリウム、ペリラルチン（perillartine）、AMP（アスパルチルフェニル
アラニン、メチルエステル）、サッカリン等が挙げられる。風味剤および甘味剤
はそれぞれまたは一緒に調製物の約0.1%〜5%以上を含有するのが適当である。

【００４１】 本発明の好ましい実施方法においては、本発明の組成物を含有する洗口液また
は歯磨剤などの本発明による経口組成物を、歯ぐきおよび歯に、例えば毎日また
は1日おきにまたは2日おきにまたは好ましくは毎日1〜3回のように規則的に、約
4.5〜約9、一般的に約5.5〜約8、好ましくは約6〜8のpHで、少なくとも2週間か
ら8週間またはそれ以上生涯にわたって応用するのが好ましい。

【００４２】 本発明の組成物は、望ましくは通常の可塑剤または軟化剤、糖類または他の甘
味剤またはグルコース、ソルビトール等と一緒に、トローチまたはチューインガ
ムまたは他の製品に、例えば、暖かいガムベース中に攪拌するかまたはガムベー
スの外面をコーティングすることによって混合することができ、ガムベースの例
としてはジェルトン（jelutong）、ゴムラテックス、ビニライト樹脂などが挙げ
られる。

【００４３】 本発明の組成物としてはまた、歯周ポケット洗浄デバイス、コラーゲン、エラ
スチンもしくは合成スポンジ、膜または繊維などの標的を定めた送達ビヒクルが
挙げられ、これらは歯周ポケット内に置かれるかまたはバリヤー膜として使われ
るかまたは歯根に直接塗布される。

【００４４】 次の実施例は本発明の性質をさらに説明するものであるが、本発明はこれらに
限定されないことは明らかである。本明細書および添付の請求の範囲において言
及する全ての量および比率は、特に断りのない限り、重量による。

【００４５】

【実施例】実施例１ 大腸菌（E.coli)における、P.gingivalisプロテイナーゼと付着因子ドメインR
gpA45、RgpA44、RgpA27およびRgpA15のクローニングおよび発現、ならびにマウ
ス膿瘍モデルにおける組換えタンパク質のワクチンとしての試験。

【００４６】

【表１】

【００４７】 遺伝子rgpAのプロテイナーゼと付着因子ドメインのそれぞれを、表１に掲げた
プライマー、P.gingivalis W50ゲノムDNA、Elongase（登録商標）（Gibco BRI）
DNAポリメラーゼ、およびPC-960サーマルサイクラー(Corbett Research Technol
ogies)を用いて増幅した。PCRは、オリゴヌクレオチドプライマーを使用して、
本質的にElongase指示プロトコルに記載の通り、次の条件を用いて実施した：変
性(94℃、30秒)、アニーリング(50℃、45秒)、および伸長(70℃、1.5分間)の25
サイクル。PCR産物は、製造業者のプロトコルに従って、PCR Spinclean(登録商
標)(Progen)を使って精製し、プラスミドベクターpGEMT-easy(Promega)にライゲ
ートし、コンピテント大腸菌JM109(Promega)を形質転換した。4種の組換え体の
調製に対する全ての操作は同様であったので、RgpA44についてのみ詳細な方法を
記載する。組換えプラスミドpGEMT-easy-RgpA44 DNAをNdeIおよびXhoIを用いて
消化し、挿入DNAを遊離した。挿入DNAをアガロースゲル電気泳動により単離し(0
.8%)、Qiafilterゲル抽出キット(Qiagen)を使って精製した。予めNdeIとXhoIを
用いて消化しておき、Qiafilterで精製したプラスミド発現ベクターpET28a (Nov
agen)中に精製挿入DNAをライゲートし、このライゲーション産物により非発現宿
主大腸菌JM109を形質転換した。次いで組換えpET28-RgpA44プラスミドにより大
腸菌発現宿主HMS174(DE3)を形質転換し、50μgカナマイシンを含有するLB上で選
択した。pET28aから発現されるr-RgpA44は、発現される組換えタンパク質のN末
端と連結したヘキサヒスチジン・タグを含有する。IPTGを添加してr-RgpA44発現
を誘導し、ニッケルアフィニティクロマトグラフィによって精製した。pET28-Rg
pA44の挿入断片の完全性をDNA配列分析により確認した。

【００４８】組換え大腸菌の発現 単一コロニー形質転換体を使って、50μg/mlカナマイシンを含有するルリア-
ベルターニ（Luria-Bertani）ブロス10mlに吸光度（OD₆₀₀）1.0まで37℃にて接
種した。次いでこの種菌を用いてテリフィック（Terrific）ブロス（リン酸カリ
ウムおよび50μg/mlカナマイシンを含有する）500mlに接種した。この培養物のO
D₆₀₀が2.0に達した後、0.1mM IPTGを用いて誘導した。37℃にて4.5時間の誘導期
間後に、4000rpmで20分間、4℃にて遠心分離して培養物を回収し、ペレットを-7
0℃で貯蔵して封入体の抽出に備えた。

【００４９】封入体の単離と可溶化 細菌ペレットを氷上にて解凍し、結合バッファー(5mMイミダゾール、500nM Na
Cl、20mM Tris-HCl、pH7.9)に再懸濁し、次いで音波処理し、20,000 x gにて遠
心分離して封入体を回収した。ペレットを結合バッファー中に再懸濁し、音波処
理および遠心分離のプロセスを2回以上繰り返してタンパク質をさらに遊離させ
た。次いで、ペレットを6M 尿素を含有する結合バッファー中に再懸濁し、氷上
で2〜3時間インキュベートし、攪拌してタンパク質を完全に溶解した。残留する
不溶物質は39,000 x gで20分間遠心分離して除去した。上清を0.45μm膜を通し
て濾過した後、カラムで精製した。

【００５０】ニッケル-ニトリロ三酢酸（Ni-NTA）精製と可溶化封入物のリフォールディング Ni-NTA金属アフィニティクロマトグラフィを使用し、H₆タグを介して組換えタ
ンパク質を精製した。簡単に説明すると、タンパク質を平衡化Ni-NTA樹脂(Qiage
n)にバッチで結合させ、これを小カラム中に流し込み、そして非結合タンパク質
を重力で溶出させた。次に、カラムを10容積の結合バッファー、続いて5カラム
容積の洗浄バッファー（60mM イミダゾール、500mM NaCl、20mM Tris-HCl、6M
尿素、pH 7.9）を用いて洗浄した。次いで結合したタンパク質を、1M イミダゾ
ール、500mM NaCl、20mM Tris-HCl、6M 尿素、pH 7. 9を含有するバッファーで
溶出した。

【００５１】組換えタンパク質の再生 NI-NTA樹脂から溶出した画分をプールして、バッファー（0.5M Tris-HCl、50m
M NaClおよび8% グリセロール）の尿素含量を6Mから3M、1.5M、0Mへと段階的に
変える透析によってリフォールディングした。

【００５２】ポリアクリルアミドゲル電気泳動とウェスタンブロット SDS-PAGEをLaemmliによる記載のように実施した。サンプルを等容積の2 x サ
ンプル還元バッファーと混合し、10分間95℃にて煮沸し、Tris-グリシン12%ゲル
(Novex)上を泳動させた。分子量標準(SeeBlue^TM)もNovexから購入した。ウェス
タンブロットは、タンパク質をニトロセルロース上に1時間、100ボルトで電気ブ
ロットして調製した。膜を1%カゼイン溶液を用いてブロックした後、1/1000に希
釈した一次抗体を用いてインキュベートし、洗浄し、そしてヤギ抗ウサギHRPコ
ンジュゲート（KPL）を用いてインキュベートし、洗浄し、そしてTMB膜ペルオキ
シダーゼ基質（KPL）を用いて発色させた。

【００５３】抗血清 ポリクローナル抗血清は、BALB/cマウスに2 X 20μgの組換えタンパク質を含
むフロイント（Freund's）不完全アジュバント(Sigma)を3週間隔てて投与するこ
とにより、精製組換えタンパク質に対して産生させた。2回目の投与後1週間にマ
ウスから採血し、そして、産生した抗血清を使い、変性、還元条件下で泳動した
全細胞P.gingivalis W50のウェスタンブロットをスクリーニングした。

【００５４】 組換えタンパク質の純度を、MALDI-TOF質量分析計とN末端配列分析を使って確
認した。

【００５５】マウス病変モデル 10匹の雌性BALB/cマウス（6〜8週齢）の各群に、組換えタンパク質r-RgpA45、
r-RgpA44、r-RgpA27およびr-RgpAl5、ならびにホルマリン死滅P.gingivalis細胞
および大腸菌（全て不完全フロイントアジュバント中に乳化した）を各々皮下注
射して免疫感作した（20μg）。免疫感作は尾の基部に与え、P.gingivalisを用
いて抗原投与する4週および1週前に行った。投与の2日前にマウスの球後神経叢
（retrobulbar plexus）から採血した。BALB/cマウスの腹部にP.gingivalis 332
77の7.5 x 10⁹生細胞を皮下注射して投与した。投与後7日間にわたって、マウス
の病変部の数とサイズを毎日試験した。マウス腹部に病変が発生し、mm²で表し
た最大病変サイズを図１に示した。病変サイズの有意な低下は、ホルマリン死滅
全P.gingivalis細胞および組換え付着因子r-RgpA44を用いたワクチン接種につい
てのみ得られた。rgpA遺伝子由来の他の組換えタンパク質は病変サイズを有意に
低下しなかった。

【００５６】 この実施例は、P.gingivalis投与に対する保護において、r-RgpA44がRgpA由来
の他の組換えタンパク質より優れることを実証する。

【００５７】実施例２ 先の実施例において、組換え44kDa付着因子がマウス病変モデルにおいてP.gin
givalisによる抗原投与から保護することを実証した。しかし、全長44kDa付着因
子は、大腸菌で発現した場合、変性溶媒中でのみ可溶性である封入体であること
がわかった。このタンパク質の溶解性を改善し、かつ組換えタンパク質の正しい
フォールディングを増強する目的で、44kDa付着因子から一連の断片を作製した
。44kDa付着因子組換えタンパク質の断片を構築するために使ったオリゴヌクレ
オチドプライマーを表２に示した。

【００５８】

【表２】

【００５９】 実施例１に記載したのと類似した方法を使い、44kDa付着因子の断片をpET24b
プラスミド（Novagen）中にクローニングし、大腸菌（E.coli)BL21(DE3)株(Nova
gen)に発現させた。産生した可溶性r-44kDaタンパク質の発現レベルと量を様々
な断片に対して評価した。この評価はIPTG誘導後に実施し、その際、組換え大腸
菌（E.coli)細胞の培養物の細胞培養物1.5mlを遠心分離によりペレット化して結
合バッファー150ulに再懸濁した。次いで細胞を、マイクロプローブ(Virosonic
デジタル475超音波細胞破砕器(disruptor)、The Virtis Company, NY)を使い設
定5にて10秒間、超音波処理した。3分間の遠心分離（10,000rpm）後に上清を回
収し、可溶性画分とした。次いでペレットを洗浄し、結合バッファーに再懸濁し
、これを不溶性画分とした。様々な画分の分析を、ウェスタンブロット分析とSD
S-PAGEを使って実施した。これらの実験結果を表3に示す。r-44kDaタンパク質ま
たはその断片の安定性はまた、全てまたは選択したシステイン残基のセリンもし
くはアラニン残基への部位特異的突然変異誘発によってさらに増強することもで
きる。

【００６０】 44kDa付着因子は6個のCys残基を含有し、これらの残基は酸化されるとジスル
フィドを生成して不正確なフォールディングを生じ、恐らく不溶性タンパク質を
生成するであろう。従って、r-44kDaタンパク質またはr-44kDaタンパク質の断片
の安定性は、全てまたは選択したシステイン残基のセリンもしくはアラニン残基
への部位特異的突然変異誘発によって増強することができる。

【００６１】

【表３】

【００６２】 図２は、実施例１に記載したマウス膿瘍モデルにおける、全長組換え44kDタン
パク質、該44kDタンパク質の2つの断片（断片4；残基65〜290および断片6；残基
192〜290）および対照組換えタンパク質R2の結果を示す。マウスに、実施例１の
ようにr-タンパク質20μgを3週間隔てて2回投与した。44kDタンパク質の全長と
断片型の両方は、対照組換えタンパク質(R2)と比較して、統計的に有意な保護(p
<0.05)を示した。ホルマリン死滅全ポルフィロモナス・ジンジバリス(P.gingiva
lis)(FK-33277)はチャレンジから完全に保護した。

【００６３】実施例３ 44kDa付着因子の断片を使うだけでなく、1以上の44kDa付着因子の断片を使い
、他のP.gingivalisタンパク質由来の他のタンパク質またはタンパク質断片との
キメラタンパク質を構築することができる。配列番号２および４はそのようなキ
メラ組換えタンパク質の一例であって、44kDa付着因子の断片（断片６、残基192
〜290）を、PG33(Genbank登録番号AF175715)由来の別のポルフィロモナス・ジン
ジバリスタンパク質断片である95残基C末端断片(残基286〜380)と連結して誘導
したものである。このキメラタンパク質は、全体で全194残基を有する。

【００６４】 この44kDaとPG33タンパク質由来の断片のキメラ組換え融合タンパク質は、PG3
3 C末端断片を実施例１に記載したようにPCRにより以下のプライマーを用いて増
幅することによって生産した： 正：5' GGCCCATGGTCGACAATAGTGCAAAGATTGAT 3' 逆：5' CTATCCGGCCGCTTCCGCTGCAGTCATTACTACAA 3' このPCR産物をpET24bのSalIとNotIの部位中にサブクローニングしてpET24b::P
G33Cを作製した。次いで44kDa断片６のPCR産物（プライマーは実施例２を参照）
をpET24b::PG33CプラスミドのEcoRIとSalI中にサブクローニングして44kDa/PG33
の融合構築物、すなわちpET24b::PG44f6-PG33Cを作製した。このプラスミドを大
腸菌（E.coli)BL21(DE3)株に形質転換して実施例１および２に概説したように発
現研究を実施すると、高レベルのキメラ44kDa/PG33組換えタンパク質を得て、こ
れを実施例２のように試験すると可溶性であった。

【００６５】実施例４ 組換え44kDaもしくは組換え44kDaタンパク質断片に対して産生したマウス抗血
清はパラホルムアルデヒドで固定した全ポルフィロモナス・ジンジバリス細胞と
反応することで、免疫反応性エピトープが組換えタンパク質に保存されているこ
とが示される。

【００６６】 BALB/cマウスを、実施例１および２に記載した組換え全長44kDaタンパク質ま
たは組換え44kDaタンパク質断片を用いて免疫感作することによって、マウス抗
血清を取得した。ポルフィロモナス・ジンジバリス（W50株）を、5μg/mlヘミン
および1μg/mlビタミンKおよび0.5mg/mlシステインを補足した脳心注入ブロス（
brain heart infusion broth）（Oxoid）中において嫌気性のもとで対数期まで
増殖した。細胞を15分間、10,000rpm、4℃にて遠心分離により沈殿させ、1%(wt/
vol)のパラホルムアルデヒドを含有するリン酸緩衝生理食塩水（PBS）に再懸濁
した。細菌を4℃にて一夜置いて、次いで洗浄し、PBS中に再懸濁してOD₆₀₀で0.2
5（1 x 10⁹細胞/ml）の光学密度とした。次に死滅細菌を、アリコート10μlで、
0.22μmで濾過したPBS+10%のFBS+0.01%のアジド(PBS/FA)中に1:100で希釈したプ
ールしたマウスポリクローナル血清と15分間室温にて混合した。細胞をPBS/FAを
用いて洗浄し、次いで15分間、PBS/FA中に1:100で希釈したFITC標識抗マウス免
疫グロブリン(Silenus)1μlとともにインキュベートした。次いで細胞を洗浄し
、PBS/FA 1ml中に再懸濁した。

【００６７】 染色したポルフィロモナス・ジンジバリス細胞の蛍光強度を、FACS Calibur-
活性化蛍光細胞ソーター(Becton Dickinson)を使い、15mWアルゴンイオンレーザ
ーから発生した488nm波長バンドを用いて定量化した。濾過したPBS/FAをシース
液として使った。CELLQuestソフトウエア(Becton Dickinson)を使いサイズと粒
状度に基づいて集められた20,000のゲーティングした（gated）事象からなるそ
れぞれの分析に対して、FITC発光シグナルを収集した。

【００６８】 結果を図３に示す。各パネル上に示した%は正に染色した、すなわち、非抗血
清もしくは正常マウス由来の血清で見られるバックグラウンドレベルを超える蛍
光強度を有するポルフィロモナス・ジンジバリス細胞のパーセントを示す。全て
の組換えタンパク質が大多数のポルフィロモナス・ジンジバリス細胞と反応する
抗血清を産生したが、断片４に対する抗血清は他のr-44kDa抗血清と比較して低
い反応性を示した。

【００６９】実施例５ 大腸菌（E.coli)における、ポルフィロモナス・ジンジバリスKgp39（Kgp39）お
よびKgp39断片（Kgp39frag）付着因子ドメインのクローニングおよび発現ならび
にELISAによる組換えタンパク質の試験

【表４】

【００７０】 Kgp39およびKgp39断片付着因子ドメインを、表４に挙げたプライマーを使って
増幅した。プライマーは6個のヌクレオチドバッファーとそれに続く制限酵素部
位（SalIまたはXhoI）およびKgp39に特異的な配列からなる。PCRは、Taq DNAポ
リメラーゼ(Promega)を用いて次の条件下で実施した：変性(94℃、45秒)、アニ
ーリング(52℃、30秒)、および伸長(72℃、60秒)の25サイクル。PCR産物をプラ
スミドベクターpGEMT-easy(Promega)中に連結し、コンピテント大腸菌（E.coli)
JM109(Promega)に先に記載のように形質転換した。Kgp39およびKgp39断片組換え
体の両方の調製に対する全ての手順は同一であって、本質的に組換えRgp44断片
に対して先に記載した通りである。組換えプラスミドpGEMT-easy-Kgp39 DNAをSa
lIおよびXhoIを用いて消化し、精製したインサートDNAを、予めSalIおよびXhoI
を用いて消化しておき、精製したプラスミド発現ベクターpET28b (Novagen)中に
連結した。連結産物を非発現宿主、大腸菌（E.coli)JM109に形質転換し、次いで
先に記載したように大腸菌（E.coli)発現宿主、HMS174（DE3）に形質転換した。
r-Kgp39発現をIPTGを添加して誘導し、ニッケルアフィニティークロマトグラフ
ィーにより精製した。pET28b-Kgp39のインサートの完全な状態をDNA配列決定分
析により確認した。

【００７１】組換え大腸菌（E.coli)の発現 組換えKgp39およびKgp39断片タンパク質を、rRgp44断片について記載したのと
類似した方法論を使い、IPTGを用いた誘導により発現した。簡単に説明すると、
単一コロニー形質転換体を使って50μg/mlのカナマイシンを含有するLB5mlに接
種し37℃にて軌道式シェーカー上で一夜、インキュベートした。次に、この培養
物を使って新しい培地100mlに接種し、中間対数増殖期（OD₆₀₀=0.6〜1.0）まで
増殖させ、0.5mMのIPTGを用いて6時間誘導した。次いで細胞を、6500 x gで遠心
分離して回収し、封入体抽出のため、-20℃にて一夜、保存した。

【００７２】封入体の単離と可溶化 細菌ペレットを氷上で解凍し、バッファーB（20mM Na₂HPO₄、0.5M NaCl, 8M
尿素）10mlに再懸濁した。再溶解した細胞ペレットを、Branson Sonifier（登録
商標）250細胞破砕器(Branson Ultrasonics Corporation, Danbury, CT)を使い
、マイクロチップを用いて設定3で、氷上において30秒間隔の3 x 30秒間バース
トで超音波処理した。不溶性細胞デブリを39000 x gで30分間、4℃で遠心分離し
て除去し、上清を回収した。不溶性細胞画分をバッファーB 10mlに再懸濁した。
アジ化ナトリウム（0.001% v/v）を全サンプルに加えた後、4℃にて保存した。
次にサンプルをSDS-PAGEにより分析した。

【００７３】ニッケル-ニトリロ三酢酸（Ni-NTA）精製および可溶化封入体のリフォールディ
ング タンパク質を、Pharmacia中圧タンパク質液体クロマトグラフィ(Fast Protein
Liquid Chromatography；FPLC)計器に接続したPharmacia Biotech HiTrapアフ
ィニティーカラム(1ml)(Amersham Pharmacia Biotech)を使って精製した。カラ
ムは、5カラム体積の0.1M NiS0₄を用いてコーティングし、次に、10カラム体積
のスタートバッファー(20mM Na₂HPO₄、0.5M NaCl、20mMイミダゾール、8M尿素)
を用いて流速1 ml/分で平衡化した。サンプルをカラムに0.5 ml/分の流速でロー
ディングし、次いで10体積のスタートバッファーを用いて1ml/分の速度で洗浄し
た。タンパク質を、10体積の溶出バッファー（20mM Na₂HPO₄、0.5M NaCl、200mM
イミダゾール、8M尿素）の直線勾配にわたって流速1 ml/分にて溶出した。溶出
画分を回収し、各画分のサンプルをSDS-PAGEゲル上で先に記載の通りに分析した
。

【００７４】組換えタンパク質の再生 組換えタンパク質からの8M尿素の除去は、Spectrum-Por（登録商標） Float-A
-Lyzer(Alltech、Australia)を使って実施した。サンプル中の尿素のモル濃度は
、最初の8Mから4日間にわたって0Mになるよう設定した。rKgp39タンパク質を、
バッファー（20mM Na₂HPO₄、0.5M NaCl）中の尿素含量を8Mから7M、6M、5M、4M
、3M、2M、1M、0.5M、0Mへと段階的に変えた透析によりリフォールディングした
。

【００７５】固相酵素免疫検定法（ELISA） ELISAを実施して、RgpA-Kgp特異的抗血清とrKgp39およびrKgp39断片との結合
ならびにrKgp39およびrKgp39断片と歯周マトリックスおよび宿主タンパク質との
結合を研究した。

【００７６】 平底ポリビニルマイクロタイタープレート(Microtitre, Dynatech Laboratori
es, VA, USA)のウエルを、5 μg/mlのrKgp39またはrKgp39断片のいずれかを含む
0.1MPBS(0.01M Na₂HPO₄、0.15M NaCl、1.5mM KH₂PO₄、3.0mM KCl、pH 7.4)を用
いて一夜、室温（RT）にてコーティングした。コーティング溶液を除去し、ウエ
ルを1%(w/v)のBSAを含む0.1M PBST（0.1%(v/v)のTween20を含有するPBS）を用い
て1時間、RTにてブロッキングし、プレートを0.1M PBSTを用いて4回洗浄した。
ポルフィロモナス・ジンジバリスW50 RgpA-Kgpプロテイナーゼ-付着因子複合体
に対するウサギ抗血清（Bhogalら, 1997）の連続希釈物を各ウエルに加え、一夜
、RTにてインキュベートし、次いで6 x PBSTを用いて洗浄した。結合した抗体を
、0.5%(w/v)のBSAを含むO.1MのPBS中のマウス免疫グロブリンに対する西洋ワサ
ビペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ免疫グロブリン(1:4000希釈)(Sigma, NS
W, Australia)とともに、1.5時間、RTでインキュベーションして検出した。次に
、プレートを洗浄し（6x PBST）、そして基質(0.9mM ABTS(2,2'-アジノ-ビス(3-
エチルベンズ-チアゾリン-6-)スルホン酸)、および0.005%(v/v)のH₂0₂を含むABT
Sバッファー(0.1M Na₂HPO₄、0.08M クエン酸一水和物)(lOOμl/ウエル)を加えた
。415nmにおける光学密度(O.D₄₁₅)を、Bio-Radマイクロプレートリーダー(model 450, Bio Rad, NSW, Australia)を使って測定した。

【００７７】 結果を図４に示す。

【００７８】rKgp39およびrKgp39断片と歯周マトリックスおよび宿主タンパク質との結合 ELISAはまた、rKgp39およびrKgp39断片タンパク質と宿主マトリックスタンパ
ク質フィブリノーゲンおよびコラーゲンV型ならびにヘモグロビンとの結合を調
査するためにも実施した。マイクロタイタープレートを、10μg/mlのフィブリノ
ーゲン、コラーゲンV型ならびにヘモグロビンのいずれかを含む0.1M PBSを用い
て一夜、RTにてコーティングした。コーティング溶液を除去し、残る未コーティ
ングプラスチックを2%(w/v)のスキムミルクを含む0.1M PBSTを用いて1時間、RT
にてブロッキングした。ブロッキング溶液を除去し、5μg/mlのrKgp39またはrKg
p39断片タンパク質のいずれかを含む0.1M PBSをウエルに加え、2時間、RTにてイ
ンキュベートした。ウエルを0.1M PBSTを用いて4回洗浄し、次いで、1%(w/v)の
スキムミルクを含む0.1M PBST中のウサギ抗RgpA-Kgp複合体抗血清の連続希釈物
を各ウエルに加え、一夜、RTにてインキュベートした。結合した抗体を、6 x PB
ST洗浄の後に、1%(w/v)のスキムミルクを含む0.1M PBST中のウサギ免疫グロブリ
ンに対する西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ免疫グロブリン(1:4
000希釈)(Sigma, NSW, Australia)とともに、1時間、RTにてインキュベートして
検出した。プレートを先に記載のように染色した。

【００７９】 結果を図５および図６に示す。

【００８０】実施例６ 本実施例は、RgpA44またはKgp39またはそれらの部分をコードするヌクレオチ
ド配列は、ファージベクターおよびプラスミドを含む様々なベクター中に挿入し
て発現できることを説明する。タンパク質およびペプチドの発現を成功するには
、遺伝子もしくは遺伝子断片を含むインサート、またはベクター自身が転写およ
び翻訳に必要なエレメントを含有し、そのエレメントが発現に使われる特定の宿
主系と共存可能でありかつ前記宿主系により認識されることが必要である。RgpA
44もしくはKgp39またはそれらの断片をコードするDNA（例えば、実施例２）、あ
るいは関連するペプチドもしくはオリゴペプチドまたはキメラタンパク質は、合
成または単離して本明細書で説明した方法と配列を使って配列決定分析をするこ
とができる。様々な宿主系を利用してRgpA44もしくはKgp39またはそれらの断片
、関連するペプチドもしくはオリゴペプチドまたはキメラを発現することができ
、限定されるものでないが、バクテリオファージベクター、プラスミドベクター
、またはコスミドDNAを用いて形質転換した細菌；酵母ベクターを含有する酵母
；真菌ベクターを含有する真菌；ウイルス（例えばバキュロウイルス）を用いて
感染した昆虫細胞系；ならびにプラスミドもしくはウイルス発現ベクターを用い
て形質転換した、または組換えウイルス（例えば、ワクシニアウイルス、アデノ
ウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルスなど）を用いて感染した哺乳類
動物細胞系が挙げられる。

【００８１】 上記の方法を含む分子生物学の分野で公知の方法を利用して、様々なプロモー
ターおよびエンハンサーを、RgpA44もしくはKgp39アミノ酸配列、すなわち関連
するペプチドもしくはオリゴペプチドまたはキメラをコードするベクターまたは
DNA配列中に組込んで、RgpA44もしくはKgp39アミノ酸配列の発現を増加すること
ができるが、ただしそのアミノ酸配列の発現の増加が使用する特定の宿主細胞系
と共存しうる（例えば、該宿主細胞系に対して非毒性である）ことが条件となる
。従って、重要なことは、本発明のDNA配列は、RgpA44もしくはKgp39またはそれ
らの断片をコードする遺伝子セグメント、またはタンパク質の機能的および特異
的エピトープをコードするドメインの任意の他のセグメント、または組合せたセ
グメントから成ってもよい。さらに、本発明のDNAを、他の細菌外膜タンパク質
、または他の細菌、真菌、寄生、またはウイルス抗原などの他の抗原をコードす
るDNAと融合して、遺伝子的に融合した（共通のペプチド主鎖を共有する）多価
抗原を作製して改良されたワクチン組成物として使用してもよい。

【００８２】 プロモーターの選択は、使用する発現系に依存するであろう。プロモーターは
強度、すなわち、転写を促進する能力が様々である。一般的に、クローニングし
た遺伝子を発現するのが目的であれば、強力なプロモーターを使用して高レベル
の遺伝子転写および遺伝子産物への発現を得ることが所望される。例えば、大腸
菌(E.coli)を含む宿主細胞系において高レベルの転写が観察されることが当業界
で公知である、細菌、ファージ、またはプラスミドプロモーターとしては、lac
プロモーター、trpプロモーター、recAプロモーター、リボソームRNAプロモータ
ー、P_RおよびP_Lプロモーター、lacUV5、ompF、bla、lpp等が挙げられ、これらの
プロモーターを使用してアミノ酸配列をコードする挿入されたDNA配列の転写を
実施することができる。

【００８３】 さらに、タンパク質、関連するペプチドもしくはオリゴペプチドまたはキメラ
が宿主細胞にとって致死性もしくは有害である場合、宿主細胞株／系統および発
現ベクターを、特異的に誘導するまでプロモーターの作用を抑制するように選択
することができる。例えば、ある特定のオペロンにおいては、挿入されたDNAの
効率的な転写には特定のインデューサーの添加が必要である（例えば、lacオペ
ロンはラクトースまたはイソプロピルチオ-β-D-ガラクトシドの添加によって誘
導される）。trpオペロンなどの様々なオペロンは異なる制御機構のもとにある
。trpオペロンは、増殖培地中にトリプトファンが不在であると誘導される。P_L
プロモーターは温度感受性λリプレッサーを含有する宿主細胞の温度上昇によっ
て誘導できる。この方法で、95%を上回るプロモーターが指令する転写を、未誘
導細胞において抑制することができる。従って、組換えRgpA44タンパク質、関連
するペプチドもしくはオリゴペプチドまたはキメラの発現を、最初はRgpA44アミ
ノ酸配列をコードする挿入されたDNAからの発現を制御するプロモーターを誘導
しないが、細胞が増殖培地中で適当な密度に到達すると前記プロモーターを誘導
して挿入されたDNAからの発現をさせることができる条件のもとで、形質転換ま
たはトランスフェクトした細胞を培養することによって制御してもよい。

【００８４】 効率的な遺伝子転写またはメッセージ翻訳のための他の制御エレメントとして
は、エンハンサー、および調節シグナルが挙げられる。エンハンサー配列は、近
傍遺伝子に対するそれらの位置および方向に比較的非依存的に転写効率を増加す
ると思われるDNAエレメントである。従って、使用する宿主細胞発現ベクター系
に依って、エンハンサーは、RgpA44またはKgp39アミノ酸配列をコードする挿入D
NA配列の上流または下流のいずれに配置しても、転写効率を増加することができ
る。本実施例において先に説明したように、RgpA44またはKgp39および関連する
ペプチドまたはキメラをコードする遺伝子セグメントからの発現に影響を与え得
る他の特異的調節配列が同定されている。これらの調節部位または転写もしくは
翻訳開始シグナルなどの他の調節部位を使用して、RgpA44もしくはKgp39をコー
ドする遺伝子、またはそれらの遺伝子断片の発現を調節することができる。その
ような調節エレメントを、本明細書に記載したDNA配列を挿入するための組換えD
NA法を用いて、RgpA44またはKgp39アミノ酸配列をコードするDNA配列または近傍
ベクターDNA配列中に挿入してもよい。

【００８５】 従って、RgpA44もしくはKgp39、関連するペプチドもしくはオリゴペプチドま
たはキメラをコードする領域を含有するポルフィロモナス・ジンジバリスヌクレ
オチド配列を、発現ベクターのプロモーター、制御および調節エレメントに関連
した特定の部位において発現ベクターに連結し、この組換えベクターを宿主細胞
中に導入すると、ポルフィロモナス・ジンジバリス特異的DNA配列を宿主細胞に
おいて発現させることができる。例えば、それ自身の調節エレメントを含有する
RgpA44またはKgp39特異的DNA配列を、RgpA44もしくはKgp39または誘導体の発現
を可能にするベクタープロモーターおよび制御エレメントに関連してまたは方向
で、発現ベクターに連結してもよい。次いで組換えベクターを適当な宿主細胞中
に導入し、宿主細胞を組換えベクターを含有する細胞について選択しかつスクリ
ーニングする。選択とスクリーニングは当業界で公知の方法により達成すること
ができ、その方法としては、プラスミド中に存在するマーカー遺伝子（例えば、
薬剤耐性マーカー）の発現の検出、RgpA44もしくはKgp39特異的エピトープに対
して産生される抗血清を使ったRgpA44もしくはKgp39特異的エピトープの産生に
ついての免疫スクリーニング、そして本明細書に記載の1以上のオリゴヌクレオ
チド配列と方法を用いたRgpA44もしくはKgp39特異的ヌクレオチド配列について
宿主細胞のDNAのプロービングが挙げられる。

【００８６】 また遺伝子工学技術を使用して、コードされたRgpA44もしくはKgp39組換え体
またはタンパク質を特性決定し、改変および／または適応することもできる。例
えば、RgpA44もしくはKgp39またはそれらの断片の1個もしくは全てのCys残基をS
erもしくはAla残基に改変する部位特異的突然変異誘発は、組換えタンパク質の
安定性と可溶性を増加して精製とフォールディングを容易にすることを可能にす
るために望まれ得る。さらに、遺伝子工学技術を使ってRgpA44もしくはKgp39の
アミノ酸配列の一部、特に保護エピトープに対応する可溶性,親水性配列をコー
ドするDNA配列を作製することができる。制限酵素選択は、得られるペプチドも
しくはオリゴペプチドまたはキメラの免疫能(immunopotency)を破壊しないよう
に実施してもよい。タンパク質の抗原部位のサイズは様々であるが、約7〜約14
個のアミノ酸からなりうる。このように、RgpA44もしくはKgp39は多くの別々の
抗原部位を含有しており；従って、多くの部分的遺伝子配列がRgpA44もしくはKg
p39の抗原エピトープをコードし得る。これらの配列を構築し、発現系に使用し
て、高度に抗原性のキメラペプチドまたはオリゴペプチドまたはタンパク質を作
製することができる。2以上のペプチドを組合せると免疫原性が増加し得る。抗
原の組合せを使うとき、これらの抗原は関連していてもよい（すなわち、同じ遺
伝子からまたは同じ生物由来の密接に関連する遺伝子から）。抗原は関連する生
物（すなわち、歯肉下プラークに存在する他の口内細菌）から、またはさらに離
れた関係の生物から作製してもよい。特に、RgpA44もしくはKgp39に関連する遺
伝子および構築物を含有するベクターに対する宿主生物は、口腔の共生生息生物
；例えば歯肉下プラーク、歯肉縁上(supragingival)プラークの生息生物または
口内粘膜に関連する細菌であってもよい。共生口内菌の例としては、ストレプト
コッカス（Streptococcus）種およびアクチノマイセス（Actinomyces）種、例え
ば、ストレプトコッカス・サリバリウス(Streptococcus salivarius)、ストレプ
トコッカス・サングイス(Streptococcus sanguis)、アクチノマイセス・ネスラ
ンディ(Actinomyces naeslundii)が挙げられるだろう。これらの生物を歯周炎患
者から単離し、次に遺伝子工学的に操作してRgpA44もしくはKgp39または成分、
ペプチドまたはキメラを発現させることができる。RgpA44もしくはKgp39、ペプ
チドまたはキメラをコードするDNAをこれらの共生口内細菌の細胞外タンパク質
のリーダー配列をコードするDNAと連結してもよい。またRgpA44もしくはKgp39ま
たは誘導体をコードするDNAは、細胞外タンパク質をコードするDNAと連結するか
挿入して分泌融合タンパク質を産生させてもよい。RgpA44もしくはKgp39、成分
、ペプチドまたはキメラとの融合タンパク質を産生するために使用しうる細胞外
タンパク質の例としては、グルコシルトランスフェラーゼ（GTF）またはフルク
トシルトランスフェラーゼ（FTF）が挙げられるだろう。次いで組換え生物を患
者口腔中に再導入し、一旦コロニーが形成されると、口内粘膜または歯は、RgpA
44もしくはKgp39、成分、ペプチド、キメラまたは融合物を発現し、粘膜に関連
するリンパ組織を刺激して中和抗体を産生するであろう。

【００８７】 抗原をコードするDNA断片を他のDNA配列と融合して発現および／または精製手
順を改善することできる（すなわち、ベクターpTrxFus中にクローニングしたDNA
配列を大腸菌(E.coli)タンパク質チオレドキシンとの融合物として発現させる）
。この連結は,チオレドキシンの特性を融合タンパク質に与え、通常不溶性かま
たは発現が困難なタンパク質の可溶性発現を提供する。精製後、エンテロキナー
ゼを用いて消化して全チオレドキシンを除去すると元来のタンパク質が遊離され
る。さらに発現されたタンパク質またはペプチドに免疫原性がない場合に、抗原
をハプテンとして使用して他の配列と融合して免疫原性を増強することができる
。

【００８８】 他のプラスミド発現系には、InvitrogenからのpUCから誘導されたpTrcHis発現
ベクターが含まれる。このベクターは、Trcプロモーター（-35領域のTrpプロモ
ーターと一緒に-10領域のlacプロモーターを含有する）およびrrnB抗ターミネー
ターエレメントの存在によってDNA配列の高レベル発現を可能にする。pTrcHisベ
クターはまた、lacリプレッサータンパク質をコードする1コピーのlacl^q遺伝子
も含有する。従って、組換えタンパク質／ペプチドの発現は、中間対数期まで増
殖した大腸菌(E.coli)への1mM IPTG（脱抑制）の添加によって誘導される。DNA
断片を、N末端融合タンパク質をコードする配列の下流にかつフレーム内に位置
するマルチクローニングサイト中に挿入する。N末端融合ペプチドは、（5'から3
'に向けて）ATG翻訳開始コドン、翻訳されたタンパク質中の金属結合部位として
機能する一続きの6個のヒスチジン残基、ファージT7の遺伝子10由来の配列を安
定化する転写産物、およびエンテロキナーゼ切断認識配列をコードする。組換え
プラスミドを宿す細胞の細胞培養溶解物を、Probond^TM樹脂(Invitrogen)に対す
る高親和性結合によって精製する。Probond^TMはニッケル充填セファロース樹脂
であって、ポリヒスチジン結合ドメインを含有する組換えタンパク質を精製する
ために使われる。結合したタンパク質は、Probond^TM樹脂から、低pHバッファー
によるかまたはイミダゾールもしくはヒスチジンとの競合によって溶出させる。
次に、ポリヒスチジンリーダーペプチドは、エンテロキナーゼを用いて組換え発
現タンパク質を消化して除去することができる。エンテロキナーゼは、ベクター
中のポリhis親和性タグとマルチクローニングサイトの間に遺伝子操作されたエ
ンドペプチダーゼ認識配列を認識して、目的のタンパク質からポリHisテール（t
ail）の切断除去を可能にする。その後、精製した組換えタンパク質は、考察し
たように、抗体、ワクチン、および診断アッセイの製剤の作製に使用することが
できる。

【００８９】実施例７ RgpA44またはKgp39特異的ヌクレオチド配列を分子診断アッセイに利用してP.g
ingivalisを検出する方法。本発明の核酸配列は、P.gingivalisの遺伝物質を検
出するための分子診断アッセイに利用することができる。特に、RgpA44またはKg
p39配列特異的オリゴヌクレオチドを合成し、P.gingivalis由来の核酸を増幅す
るためのプライマーおよび／または増幅した核酸を検出するためのプローブとし
て、使用することができる。最近の分子生物学の進歩により、核酸配列を酵素的
に増幅する複数の方法が提供されている。現在最も一般的に使用される方法、PC
R^TM（ポリメラーゼ連鎖反応、Cetus社）は、Taqポリメラーゼ、プライマーとし
ての既知配列、および加熱サイクルを使用して、複製デオキシリボ核酸（DNA）
鎖を分離しさらに目的の遺伝子を指数関数的に増幅する。現在開発中の他の増幅
法としては、DNAリガーゼおよび増幅すべきDNAの配列と相補的であるDNAセグメ
ントの２つの片鎖から構成されるプローブを利用するLCR^TM（リガーゼ連鎖反応
、BioTechnica International）；相補的RNAを指数関数的に生成するためのDNA
テンプレートを作るのに使用される、酵素QBレプリカーゼ（Gene-Trak Systems
）およびコピーすべきDNAに相補的なプローブと結合したリボ核酸（RNA）配列テ
ンプレート；ならびに増幅すべき核酸配列としてのRNAまたはDNAについて実施し
うるNASBA^TM（核酸配列に基づく増幅、Cangene Corporation）が挙げられる。

【００９０】 特定の遺伝子配列とハイブリダイズできる核酸プローブを使って、1検体当た
り10³〜10⁴生物に迫る感度レベルで生物検体中の特定の病原体を検出することに
成功している[1990, 「細菌に対する遺伝子プローブ（Gene Probes for Bacteri
a）」,MacarioおよびdeMacario編, Academic Press]。特定の標的DNA配列の増幅
を可能にする方法と組み合せて、種特異的核酸プローブは臨床検体中の生物を検
出する感度レベルを大きく増加させることができる。これらのプローブを用いる
と、前培養および／または通常の生化学的同定技術を用いることなく、直接検出
が可能になる。本発明のこの実施形態は、P.gingivalisのRgpA44またはKgp39を
コードする遺伝子の種特異的配列を増幅するプライマー、およびこれらの増幅し
たDNA断片と特異的にハイブリダイズするプローブに適用される。本発明の核酸
配列を用い、かつ本発明の方法に従うことにより、10μg/mlの無関係なDNAの存
在下で、僅か1個のP.gingivalis生物を検出することができる。

【００９１】 この実施形態は、歯肉縁下プラーク、痰、血液、膿瘍および他の体液などの臨
床検体から抽出したDNAから、P.gingivalisのDNA配列（もし存在すれば）を増幅
して、続いて増幅が起こったかどうかを判定する上で使用し得る種特異的オリゴ
ヌクレオチドに適用される。本発明の一実施形態においては、1対のP.gingivali
s特異的DNAオリゴヌクレオチドプライマーを用いて臨床検体より抽出したDNA中
に存在しうるP.gingivalisゲノムDNAとハイブリダイズさせ、そして酵素合成お
よび温度サイクリングを用い、2つのフランキングプライマー間のゲノムDNAの特
定セグメントを増幅する。それぞれのプライマー対は、本発明のP.gingivalisヌ
クレオチド配列とのみハイブリダイズするように設計し、かつそれらがその二本
鎖DNAの各鎖に対して１つずつ相補的になるように合成しておく。従って、反応
はマイクログラム量の異種DNAが存在しても特異的である。この説明にあたって
、DNAのポジティブ（遺伝子）鎖の配列から作製したプライマーを「ポジティブ
プライマー」、そしてネガティブ（相補的）鎖の配列から作製したプライマーを
「ネガティブプライマー」と呼ぶことにする。

【００９２】 DNAの増幅は、市販のいずれの手段によって実施してもよい。例えば、ポリメ
ラーゼ連鎖反応を用いてDNAを増幅してもよい。いったんプライマーが標的DNAの
向かい合った鎖とハイブリダイズすれば、温度を上げて、熱安定DNAポリメラー
ゼによる2つのプライマー間の領域にわたる特定のセグメントの複製が可能にな
る。次いで反応物を熱サイクリングに供すると、各サイクルで2つのプライマー
間の配列に相当するDNAの量が倍増し、P.gingivalis DNA配列について、もし存
在すれば、特異的増幅が起こる。P.gingivalis DNAから誘導される、増幅DNA断
片のさらなる同定は、液系ハイブリダイゼーションにより実施できる。この試験
は、P.gingivalis DNAの増幅セグメントと特異的にハイブリダイズするプローブ
として、1以上の標識をしたオリゴヌクレオチドを利用する。配列特異的に増幅
したDNAの存在の検出は、オートラジオグラフィーによるゲル遅延アッセイ（gel
retardation assay）などの当業界で周知の複数の方法のいずれを利用して実施
してもよい。従って、本発明のヌクレオチド配列は、P.gingivalis検出のための
診断用キットに商業的に応用されるオリゴヌクレオチド合成の基礎を提供する。
関連する実施形態においては、プライマーとして使用するオリゴヌクレオチドは
、直接標識しても、または標識を組み込むように合成してもよい。次いで、使用
する標識に基づいて、増幅産物はアフィニティマトリクス上に結合後、同位体検
出または比色検出を用いて検出することができる。

【００９３】 DNAは、P.gingivalisを含有しうる臨床検体から、当業界で周知の方法を用い
て抽出することができる。例えば、検体に含有される細胞をTEバッファーで洗浄
し、遠心分離によってペレット化する。次いで細胞を、界面活性剤とプロテイナ
ーゼKを含有する100μlの増幅反応バッファーに再懸濁する。ポリメラーゼ連鎖
反応を利用する場合、得るサンプルは、細胞を含有するlOmM Tris pH8.3、50mM
KCl、1.5mM MgCl₂、0.01%ゼラチン、0.45% NP40^TM、0.045% Tween 20^TM、および
60ug/mlプロテイナーゼKから構成される。サンプルを55℃水浴で1時間インキュ
ベートする。インキュベーション後に、サンプルを95℃で10分間インキュベート
してプロテイナーゼKを熱不活性化する。次いで、サンプルを、以下に記述した
ポリメラーゼ連鎖反応のプロトコルに従って増幅する。

【００９４】 P.gingivalis DNAは、ポリメラーゼ連鎖反応により核酸を増幅するための種々
のプロトコルのいずれを用いて増幅してもよい。この実施形態の1つの様式にお
いては、RgpA44またはKgp39をコードする遺伝子を、P.gingivalisの臨床分離株
から次の条件を用いて増幅する。増幅すべきDNA(1 mgのゲノムDNA)を0.5 ml微量
遠心チューブに分配し、0.2mM dNTPs(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)、ポジティブお
よびネガティブオリゴヌクレオチドプライマーを各0.25ug、TaqIポリメラーゼの
1ユニット、TaqI 1O×バッファー(5ul)、1mM MgCl₂(最終濃度)、および全容量と
なるだけの量の無菌蒸留水、を含有する反応混合物を加えて容量を50ulに調整す
る。TaqIポリメラーゼは使用直前に反応混合物に加え、ボルテックスを行わずに
穏やかに混合する。およそ２滴のミネラルオイル層を各チューブに加え、次いで
チューブをサーマルサイクラー中に配置する。細菌DNAの増幅には、30〜35サイ
クルで一般的に十分である。1サイクルは、95℃で1分間、37℃で1分間、および7
2℃で1分間からなる。最初のサイクルは、完全な変性を保証するため、95℃で1.
5分間のインキュベーションを含む。

【００９５】 P.gingivalisのRgpA44またはKgp39をコードする遺伝子と特異的にハイブリダ
イズして、DNA増幅および／または検出に使われるプライマーまたはプローブと
して有用なオリゴヌクレオチドは、本明細書の配列表のヌクレオチド配列から、
当業界で公知の方法を利用して生化学的に合成することができる。検出の目的で
、本発明のオリゴヌクレオチドは放射性同位体を用いて末端標識してもよい。遺
伝子配列の増幅に用いる2つのプライマーの内部のプローブ配列は、T4ポリヌク
レオチドキナーゼおよびγ³²P ATPを用いて末端標識してもよい。20pMolのプロ
ーブDNAを含むキナーゼバッファー（50mM Tris、pH7.6、1OmM MgCl₂、5mMジチオ
トレイトール、O.lmM スペルミジン-HCl、0.lmM EDTA、pH8.0）を、120 uCiのγ ³² P ATPと混合し、37℃にて1時間インキュベートする。標識されたプローブを組
み込まれなかった標識から分離するには、Trisホウ酸EDTA（TBE）バッファー中
、8%アクリルアミドゲル上で1時間にわたり200ボルトにて室温で泳動させる。標
識されたプローブは、アクリルアミドゲルをx線フィルムに3分間曝露すると初め
て位置が定められる。次に、得たオートラジオグラムをゲルの下に置いて、標識
したプローブを含有するバンドをゲルから切り出した。このゲル切片を1ミリリ
ットルの無菌蒸留水中で粉砕し、一夜、37℃での振とうインキュベーションによ
りプローブを溶出する。溶出したプローブを、クロマトグラフィプレップカラム
を用いて遠心分離によりゲル断片から分離する。プローブの放射活性は、グラス
ファイバーフィルター上で1マイクロリットルの標識プローブを液体シンチレー
ションにより計測して、測定する。使用するプローブ配列は、そのプローブ配列
が本発明において開示された所望のヌクレオチド配列の増幅に使う2つのプライ
マーの内側にあれば、本明細書に開示した配列のいずれから選んでもよい。

【００９６】 当業界で周知の代替的方法を使って、本発明の組成物および方法により増幅さ
れた標的配列の検出を改善することができる。増幅されたDNA配列の検出の感度
は、配列を液ハイブリダイゼーションにかけることによって改善することができ
る。当業界で公知の代替的検出方法であってかつ本発明の組成物および方法に利
用しうる検出方法は、ゲル電気泳動ならびにサザンハイブリダイゼーションおよ
びオートラジオグラフィーとともに用いるゲル電気泳動に加えて、以下のものが
挙げられる：ゲル電気泳動とともに用いる制限酵素消化；標識オリゴヌクレオチ
ドプローブを用いるスロット-ブロットハイブリダイゼーション；放射標識オリ
ゴヌクレオチドプローブを用いる増幅；ゲル電気泳動、サザンブロットハイブリ
ダイゼーションおよびオートラジオグラフィーとともに用いる放射標識プライマ
ーによる増幅；ドットブロットおよびオートラジオグラフィーとともに用いる放
射標識プライマーによる増幅；アフィニティタグ（例えば、ビオチン、またはビ
オチンを組込んだ1つのプライマーおよびDNA結合タンパク質に特異的な配列を用
いる他のプライマー）を含有するオリゴヌクレオチドによる増幅と続いてのアフ
ィニティに基づくアッセイ（例えばELISA）における検出；および蛍光団を含有
するオリゴヌクレオチドによる増幅と続く蛍光検出。

【００９７】 非同位体検出の一実施形態は、ビオチンを本発明のオリゴヌクレオチドプライ
マー中に組込むことを含む。プライマーの5'-アミノ基をスルホ-NHS-ビオチンを
用いてビオチン化してもよいし、またはビオチン標識したdNTPsの存在のもとで
プライマーを合成して、ビオチンをプライマー中に直接組込んでもよい。次いで
非同位体標識プライマーを、臨床検体由来のDNAを増幅するのに使用する。増幅
標的配列の存在または非存在の検出は次のように実施することができる；増幅標
的配列を、アビジンを結合したアフィニティマトリックスを用いて捕捉し、続い
て酵素を含有するアビジンコンジュゲートとともにインキュベーションし、これ
を利用して基質の染色により複合体を視覚化することができる。あるいは、増幅
された標的配列を、標的配列に対応するプローブであってかつマトリックス上に
固定されているプローブに対し、ハイブリダイゼーションにより固定してもよい
。検出は、酵素を含有するアビジンコンジュゲートを用い、これを使って続く基
質染色により複合体を視覚化することができる。

【００９８】実施例８ 診断用イムノアッセイにおいてRgpA44もしくはKgp39、ペプチドまたはキメラペ
プチドを使用する方法。

【００９９】 RgpA44もしくはKgp39タンパク質、関連ペプチド、オリゴペプチドまたはキメ
ラを精製して、ワクチン製剤の免疫原として；および診断アッセイ用抗原として
使用すること、または治療用および／もしくは診断用に価値のあるP.gingivalis
特異的抗血清を作製することができる。P.gingivalis由来のRgpA44もしくはKgp3
9またはそれらのオリゴペプチドもしくはペプチドまたはキメラ、あるいは発現
ベクター系から産生された組換えタンパク質、組換えペプチド、または組換えオ
リゴペプチドは、当業界で周知の方法により精製することができ、その方法とし
ては界面活性剤抽出、クロマトグラフィ（例えば、イオン交換、アフィニティ、
免疫アフィニティ、または限外濾過およびサイズカラム）、分画遠心分離、示差
溶解度、またはその他のタンパク質精製用の標準技術が挙げられる。

【０１００】 本明細書全体にわたって使用されるRgpA44もしくはKgp39オリゴペプチドは、
本明細書においては、添付の配列にそれぞれ開示されるRgpA44もしくはKgp39の
アミノ酸配列の一部にそれぞれ対応する一連のペプチドとして定義され、独立し
てまたは化学的に連結して合成される。そのようなペプチドまたはオリゴペプチ
ドは当業界で公知の多くのペプチド合成方法の1つを用いて合成することができ
るが、その方法としてはtert-ブチルオキシカルボニルアミノ酸[Mitchellら, 19
78, J Org Chem 43:2845-2852]を用いるか、ポリアミド支持体上で9-フルオレニ
ルメチルオキシカルボニルアミノ酸[Drylandら, 1986, J Chem So Perkin Trans
I, 125-137]を用いるか、標準的固相ペプチド合成；ペプスカン合成[Geysenら,
1987, J Immunol Methods 03:259; 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:399
8]；標準的液相ペプチド合成；または組換え発現ベクター系を用いた合成が挙げ
られる。アミノ酸の欠失および置換（およびアミノ酸の伸長および付加を含む）
による方法および他の方法などでのペプチドまたはオリゴペプチドの改変は、ペ
プチドもしくはオリゴペプチドの免疫学的性質を実質的に損わないように行う。
特に、RgpA44もしくはKgp39、またはそれらのペプチドもしくはオリゴペプチド
またはキメラのアミノ酸配列を、1以上のアミノ酸を機能的に等価のアミノ酸と
置換することにより改変して、タンパク質、ペプチドもしくはオリゴペプチドま
たはキメラの物理化学的挙動に観察される差異に関してサイレントな改変体を得
ることができる。機能的に等価なアミノ酸は、当業界において公知であり、関連
および／または類似の極性もしくは電荷を有するアミノ酸である。従って、本明
細書の配列表に記述したアミノ酸配列と実質的に同じであるアミノ酸配列とは、
タンパク質、ペプチドもしくはオリゴペプチド、またはキメラの主要な生物学的
機能を変化させることなく、機能的に等価なアミノ酸による置換を含有するアミ
ノ酸配列を意味する。

【０１０１】 精製したRgpA44もしくはKgp39タンパク質、ペプチド、オリゴペプチドおよび
キメラは、P.gingivalisによって引き起こされる感染症が疑われる個人の体液に
存在するP.gingivalis特異的抗血清を検出するイムノアッセイにおいて抗原とし
て使用することができる。イムノアッセイの抗原としてのRgpA44または関連ペプ
チドの検出は、当業界で周知のいずれのイムノアッセイでもよく、限定されるも
のでないが、ラジオイムノアッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、「サ
ンドイッチ」アッセイ、沈降反応、凝集アッセイ、蛍光イムノアッセイ、および
化学発光に基づくイムノアッセイが挙げられる。

【０１０２】実施例９ RgpA44もしくはKgp39および関連ペプチドならびにキメラに関連するワクチン製
剤用の方法と化合物 本発明のこの実施形態は、P.gingivalisが原因である感染症に対する防御また
は治療するための能動免疫感作用の予防および／または治療用ワクチン中の免疫
原として使用する組換えRgpA44もしくはKgp39タンパク質および／またはそれら
のペプチドまたはオリゴペプチドまたはキメラを提供する。ワクチンを目的とす
る場合、細菌タンパク質を含むP.gingivalisの抗原は、免疫原性であり、かつ無
傷の細菌上の表面に露出される1以上の、P.gingivalisの株間に保存されるエピ
トープに対する機能的抗体を誘導しなければならない。

【０１０３】 ワクチンを開発するため、RgpA44またはKgp39特異的アミノ酸配列を、RgpA44
もしくはKgp39または関連ペプチドまたはキメラを発現する組換えベクターを含
有する宿主から精製することができる。そのような宿主は、限定されるものでな
いが、RgpA44またはKgp39アミノ酸配列をコードするベクターを用いて感染また
は形質転換した細菌形質転換体、酵母形質転換体、糸状真菌形質転換体、および
培養細胞が挙げられる。ワクチン製剤には、組換えタンパク質、ペプチドもしく
はオリゴペプチドまたはキメラ免疫原が、関連の免疫原性物質として免疫応答を
誘導するのに治療上有効な量だけ含まれる。ヒトまたは動物にワクチン製剤を導
入してワクチン接種をするための多数の方法が公知である。これらは、限定され
るものでないが、皮内、筋内、腹腔内、静脈内、皮下、眼、鼻内、および経口投
与が挙げられる。ワクチンはさらに、溶液、ポリマーもしくはリポソーム；およ
びアジュバント、またはそれらの組合せなどの生理学的担体を含有してもよい。

【０１０４】 様々なアジュバントがワクチン製剤と一緒に使われる。アジュバントは、免疫
応答を調節しかつワクチン抗原を単独で投与する場合より少ない量のワクチン抗
原または少ない投与量を用いてより持続的でかつより高いレベルの免疫を獲得す
ることを助ける。アジュバントの例は、不完全フロイントアジュバント（IFA）
、アジュバント65（ピーナッツオイル、モノオレイン酸マンナイド（mannide mo
nooleate）およびモノステアリン酸アルミナを含有する）、乳化油、リビ（Ribi
）アジュバント、プルロニックポリオール、ポリアミン、アブリジン（Avridine
）、クイル（Quil）A、サポニン、MPL、QS-21、およびアルミニウム塩などの無
機質ゲルが挙げられる。他の例は、SAF-1, SAF-0, MF59などの水中油滴型エマル
ジョン、セピック（Seppic）ISA720、およびISCOMs^TMおよびISCOMマトリックス^{T M} などの他の微粒子アジュバントが挙げられる。広範であって徹底したものでは
ないが他のアジュバント例の表が、CoxおよびCoulter 1992 [Wong WK(編) 「動
物寄生虫コントロール利用技術（Animals parasite control utilising technon
olgy）」 Bocca Raton; CRC press, 1992; 49-112に収載]に掲げられている。ワ
クチンは、アジュバントの他に、通常の製薬上許容される担体、賦形剤、フィラ
ー、バッファーまたは希釈剤を適当に含有してもよい。アジュバントを含有する
ワクチンの1以上の用量を、予防として歯周病を防止するため、または治療とし
て既存の歯周病を処置するために投与してもよい。

【０１０５】 他の好ましい組成物では、調製物を粘膜アジュバントと組合せて経口投与する
。粘膜アジュバントの例は、コレラ毒素および熱易分解性大腸菌(E.coli)毒素、
これらの毒素の無毒性Bサブユニット、これらの毒素の低毒性遺伝突然変異体で
ある。RgpA44を経口で送達するために利用する他の方法は、タンパク質の生物分
解性ポリマー（アクリレートまたはポリエステルなどの）粒子中へのマイクロカ
プセル化による組込みであって、微小球の胃腸管からの取込みを助けかつタンパ
ク質の分解を保護する。他の可能な方法の例は、リポソーム、ISCOMs^TM、ヒドロ
ゲルであって、これらの方法はLTB、CTBもしくはレクチンなどのターゲッティン
グ分子を組込むことによって、RgpA44タンパク質またはペプチドの粘膜免疫系へ
の送達をさらに促進しうる。ワクチンは、ワクチンおよび粘膜アジュバントまた
は送達系の他に、通常の製薬上許容される担体、賦形剤、フィラー、コーティン
グ、分散媒体、抗細菌剤および抗真菌剤、バッファーまたは希釈剤を適当に含有
してもよい。

【０１０６】 本発明のこの様式の他の実施形態は、ハプテン、すなわちそれ自身で免疫応答
を誘発し得ない分子としての組換えRgpA44またはKgp39特異的アミノ酸配列の産
生を包含する。このような場合、ハプテンを、免疫系に曝されると結合したハプ
テンに免疫原性を与えうる担体または他の免疫原性分子と共有結合させればよい
。従って、担体分子と連結したそのようなRgpA44またはKgp39特異的ハプテンは
、ワクチン製剤の免疫原でありうる。

【０１０７】 この実施形態の他の様式は、P.gingivalisにより引き起こされる感染症から保
護するために使用する組換え生ウイルスワクチン、組換え細菌ワクチン、組換え
弱毒化細菌ワクチン、または不活性化組換えウイルスワクチンを提供する。ワク
シニアウイルスは、他生物由来のワクチン抗原を発現するように遺伝子操作した
感染性ウイルスとしては当業界において最もよく知られる例である。弱毒化また
はその他の方法でそれ自体は疾患を引き起こさないように処理した組換え生ワク
シニアウイルスを用いて宿主を免疫感作する。次いで宿主内で組換えウイルスを
複製することによって、組換えRgpA44またはKgp39タンパク質、関連ペプチドま
たはキメラなどのワクチン抗原により免疫系の連続刺激を与え、それにより長期
持続性免疫をもたらす。

【０１０８】 他の生ワクチンベクターとしては、アデノウイルス、サイトメガロウイルス、
および、好ましくはワクシニア[PaolettiおよびPanicali、米国特許第4,603,112
号]および弱毒化サルモネラ株[Stockerら、米国特許第5,210,035号；第4,837,15
1号；および第4,735,801号；ならびにCurtissら, 1988, Vaccine 6:155-160]な
どのポックスウイルスが挙げられる。生ワクチンは、免疫系を連続刺激すること
により実質的に長期持続性免疫をもたらすため、特に有利である。免疫応答がそ
の後のP.gingivalis感染に対し防御的に働くときは、生ワクチン自体をP.gingiv
alisに対する予防ワクチンに使用してもよい。特に、生ワクチンは口腔の共生生
息菌である細菌に基づくものでもよい。この細菌を組換えRgpA44またはKgp39、
ペプチド、オリゴペプチドまたはキメラペプチドを担持するベクターを用いて形
質転換して、次いでこれらを使って口腔、特に口内粘膜にコロニー形成させても
よい。口内粘膜にコロニーが形成されると、組換えタンパク質、ペプチドまたは
キメラの発現が粘膜に関連するリンパ組織を刺激して中和抗体を産生させるであ
ろう。さらにこの実施形態の様式を説明するため、実施例８に説明した分子生物
学技術を用いて、RgpA44もしくはKgp39をコードする遺伝子または1以上のペプチ
ドまたはキメラをコードする遺伝子断片を、ワクシニアウイルスゲノムDNA中の
エピトープの発現を可能にするがワクシニアウイルスベクターの増殖または複製
には悪影響を与えない部位に挿入することができる。得られる組換えウイルスを
ワクチン製剤の免疫原として使用することができる。同じ方法を用いて、不活性
化組換えウイルスワクチン製剤を構築することができるが、その場合、組換えウ
イルスは、当業界で周知の化学的方法により、免疫原として使用する前に発現さ
れる免疫原の免疫原性に実質的に影響を与えないように不活性化される。様々な
エピトープを発現する不活性化ウイルスの混合物を、多価不活性化ワクチンの製
剤に使用してもよい。どちらの事例でも、不活性化組換えワクチンまたは不活性
化ウイルスの混合物は、ワクチン抗原への免疫学的応答を増強するために適当な
アジュバントを用いて製剤化することができる。

【０１０９】 この実施形態の他の変法においては、遺伝物質を直接、ワクチン製剤として使
用する。1以上の調節エレメントと機能しうる形で連結された、RgpA44もしくはK
gp39タンパク質、関連ペプチドまたはオリゴペプチドまたはキメラをコードする
配列を含有する核酸（DNAまたはRNA）を直接導入して（「直接遺伝子導入」）、
個体にP.gingivalisの病原株に対するワクチン接種をしてもよい。ワクチン接種
個体中への直接遺伝子導入が血管内皮細胞ならびに主要器官の組織などのワクチ
ン接種個体の細胞による遺伝物質の発現をもたらすことは、発現プラスミド：陽
イオンリポソーム複合体の静脈注射によるなどの当業界の技術により実証されて
いる[Zhuら, 1993, Science 261:209-211]。ベクターDNAを標的細胞中に送達す
るための他の効果的な方法が当業界で公知である。一例を挙げれば、ウイルス遺
伝子を含有する精製組換えプラスミドDNAを使ってワクチン接種し（非経口、粘
膜、または遺伝子銃経由の免疫感作）、防御的免疫応答が誘導された[Fynanら,
1993, Proc Natl Acad Sci USA 90:11478-11482]。他の例においては、個体から
採取した細胞を、当業界で周知の標準の方法によってトランスフェクトまたはエ
レクトロポレーションして、標的細胞中に組換えベクターDNAを導入することが
できる。次に、組換えベクターDNAを含有する細胞を、ベクター中の発現される
選択マーカーによるなどの当業界で周知の方法を使って選択し、次いで選択した
細胞を個体に再導入してRgpA44もしくはKgp39タンパク質、関連ペプチドまたは
オリゴペプチドまたはキメラを発現させることができる。

【０１１０】 遺伝物質を用いてワクチン接種する好ましい方法の1つは、RgpA44もしくはKgp
39タンパク質、関連ペプチド、またはオリゴペプチドまたはキメラをコードする
核酸配列を含有する核酸分子であって、1以上の発現に必要な調節配列と機能し
うる形で連結されていることを特徴とする前記核酸分子を、個体に投与する工程
を含んでなる。核酸分子は、直接に投与するか、または最初ウイルスベクター中
に導入した後にベクターを用いて投与することができる。核酸分子は、製薬上許
容される担体または希釈剤に含めて投与してもよいしワクチンの有効性を増強し
得る化合物を含有してもよい。これらの追加の化合物は、限定されるものでない
が、免疫応答を増強するアジュバント、および集合的に「免疫モジュレーター」
と呼ばれ免疫応答のモジュレートに関わる化合物、例えばサイトカイン；または
「核酸取込みエンハンサー」と呼ばれ細胞による核酸の取込みを増加する他の化
合物が挙げられる。核酸分子を用いる免疫感作は、いずれの非経口経路（静脈、
腹腔内、皮内、皮下、または筋内）を通じて、または上咽頭、気管、もしくは胃
腸管の粘膜表面と接触させることにより、行うことができる。

【０１１１】 能動免疫感作に代わる方法として、免疫感作は受動であってもよく、すなわち
RgpA44もしくはKgp39エピトープに対する抗体を含有する精製免疫グロブリンの
投与を含む免疫感作であってもよい。

【０１１２】実施例１０ 以下は、抗RgpA44または抗Kgp39抗体を含有する歯磨ペースト製剤の提示例で
ある。

【０１１３】成分 %w/w リン酸二カルシウム二水和物 50.0 グリセロール 20.0 カルボキシメチルセルロースナトリウム 1.0 ラウリル硫酸ナトリウム 1.5 ラウロイルサルコニサートナトリウム 0.5 香味剤 1.0 ナトリウムサッカリン 0.1 グルコン酸クロルヘキシジン 0.01 デキストラナーゼ 0.01 抗RgpA44または抗Kgp39抗体を含有するヤギ血清 0.2 水 差引残量実施例１１ 以下は、歯磨ペースト製剤の別の提示例である。

【０１１４】成分 %w/w リン酸二カルシウム二水和物 50.0 ソルビトール 10.0 グリセロール 10.0 カルボキシメチルセルロースナトリウム 1.0 ラウリル硫酸ナトリウム 1.5 ラウロイルサルコニサートナトリウム 0.5 香味剤 1.0 ナトリウムサッカリン 0.1 モノフルオロリン酸ナトリウム 0.3 グルコン酸クロルヘキシジン 0.01 デキストラナーゼ 0.01 抗RgpA(788-1004)を含有するウシ血清 0.2 水 差引残量実施例１２ 以下は、歯磨ペースト製剤の別の提示例である。

【０１１５】成分 %w/w リン酸二カルシウム二水和物 50.0 ソルビトール 10.0 グリセロール 10.0 カルボキシメチルセルロースナトリウム 1.0 ラウロイルジエタノールアミド 1.0 スクロースモノラウレート 2.0 香味剤 1.0 ナトリウムサッカリン 0.1 モノフルオロリン酸ナトリウム 0.3 グルコン酸クロルヘキシジン 0.01 デキストラナーゼ 0.01 抗RgpA44抗体を含有する牛乳Ig 0.1 水 差引残量実施例１３ 以下は、歯磨ペースト製剤の別の提示例である。

【０１１６】成分 %w/w ソルビトール 22.0 アイリッシュモス 1.0 水酸化ナトリウム(50%) 1.0 ガントレズ（Gantrez） 19.0 水（脱イオン） 2.69 モノフルオロリン酸ナトリウム 0.76 ナトリウムサッカリン 0.3 ピロリン酸 2.0 水和アルミナ 48.0 芳香油 0.95 抗RgpA44モノクローナル抗体 0.3 ラウリル硫酸ナトリウム 2.00 実施例１４ 以下は、歯磨ペースト製剤の別の提示例である。

【０１１７】成分 %w/w ポリアクリル酸ナトリウム 50.0 ソルビトール 10.0 グリセロール 20.0 香味剤 1.0 ナトリウムサッカリン 0.1 モノフルオロリン酸ナトリウム 0.3 グルコン酸クロルヘキシジン 0.01 エタノール 3.0 抗RgpA(788-1004)を含有するウマIg 0.2 リノール酸 0.05 水 差引残量実施例１５ 以下は口洗浄液製剤の提示例である。

【０１１８】成分 %w/w エタノール 20.0 香味剤 1.0 ナトリウムサッカリン 0.1 モノフルオロリン酸ナトリウム 0.3 グルコン酸クロルヘキシジン 0.01 ラウロイルジエタノールアミド 0.3 抗RgpA44抗体を含有するウサギIg 0.2 水 差引残量実施例１６ 以下は口洗浄液製剤の提示例である。

【０１１９】成分 %w/w ガントレズS-97 2.5 グリセリン 10.0 芳香油 0.4 モノフルオロリン酸ナトリウム 0.05 グルコン酸クロルヘキシジン 0.01 ラウロイルジエタノールアミド 0.2 抗RgpA44マウスモノクローナル抗体 0.3 水 差引残量実施例１７ 以下はトローチ製剤の提示例である。

【０１２０】成分 %w/w 砂糖 75〜80 コーンシロップ 1〜20 芳香油 1〜2 NaF 0.01〜0.05 抗RgpA44マウスモノクローナル抗体 0.3 ステアリン酸Mg 1〜5 水 差引残量実施例１８ 以下は歯肉マッサージクリーム製剤の提示例である。

【０１２１】成分 %w/w 白色ワセリン 8.0 プロピレングリコール 4.0 ステアリルアルコール 8.0 ポリエチレングリコール4000 25.0 ポリエチレングリコール400 37.0 モノステアリン酸スクロース 0.5 グルコン酸クロルヘキシジン 0.1 抗RgpA44マウスモノクローナル抗体 0.3 水 差引残量実施例１９ 以下はチューインガム製剤の提示例である。

【０１２２】成分 %w/w ガムベース 30.0 炭酸カルシウム 2.0 結晶ソルビトール 53.0 グリセリン 0.5 芳香油 0.1 抗RgpA(788-1004)ウサギモノクローナル抗体 0.3 水 差引残量 本明細書を通じて、単語「含んでなる（comprise）」、またはその変化形であ
る「含む（comprises）」もしくは「含んでいる（comprising）」などは、記載
した要素、整数もしくは工程、または要素、整数もしくは工程の群を包含するこ
とを意味するが、他の任意の要素、整数もしくは工程、または要素、整数もしく
は工程の群を排除することを意味するものではないと理解される。

【０１２３】 当業者であれば、広範に記載した本発明の精神と範囲から逸脱することなく、
特定の実施形態に示した本発明に対して様々な変形および／または改変が行われ
得ることを認識するであろう。従って、本明細書の実施形態は、全ての点につい
て説明するものであって限定するものではないとして考えられねばならない。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は実施例１の結果を示す。

【図２】 図２は、マウス膿瘍モデルにおける、全長組換え44kDタンパク質、44kDタンパ
ク質の2断片（断片4；残基65-290および断片6；残基192-290）、対照組換えタン
パク質R2およびホルマリン死滅全P.gingivalis(FK-33277)の結果を示す。

【図３】 図３は、以下と反応させたP.gingivalis細胞のフローサイトメトリー分析を示
す：(A)PBS/FA、(B)正常マウス血清、(C)P.gingivalis全細胞抗血清、(D)組換え
Pg44抗血清、(E)断片4抗血清(r-44kDa残基、65-290)、(F)断片6抗血清(r-44kDa
残基、192-290)、(G)キメラr-44-Pg33タンパク質抗血清。

【図４】 図４はRgpA-Kgp特異的抗血清と組換えタンパク質との結合を示す。組換えタン
パク質を5μg/mlにてコートし、抗RgpA-Kgp特異的抗血清をプローブとして用い
て：組換えKgp39タンパク質(-◆-)、組換えKgp39断片(-▲-)、RgpA-Kgp複合体(-
●-)、および対照(-X-)。結合した抗体をヤギ抗ウサギHRPの1:4000希釈物を用い
て検出し、ELISAプレートをLabsystems iEMSマイクロプレートリーダーを用いて
415nmにて読み取った。

【図５】 図５は組換えKgp39タンパク質と様々なマトリックスタンパク質との結合を示
す。マトリックスタンパク質を5μg/mlにてコートし、組換えタンパク質をプロ
ーブとして用いて、次いで抗RgpA-Kgp複合体特異的抗血清をプローブとして用い
た：コラーゲンV型(-◆-)、フィブリノーゲン（-■-）、ヘモグロビン（-▲-）
、および対照（-X-）。結合した抗体をヤギ抗ウサギHRPコンジュゲートの1:4000
希釈物を用いて検出し、ELISAプレートをLabsystems iEMSリーダーを用いて415n
mにて読み取った。

【図６】 図６は組換えKgp39タンパク質断片と様々なマトリックスタンパク質との結合
を示す。マトリックスタンパク質を5μg/mlにてコートし、組換えタンパク質を
プローブとして用いて、次いで抗RgpA-Kgp複合体特異的抗血清をプローブとして
用いた：コラーゲンV型(-◆-)、フィブリノーゲン（-■-）、ヘモグロビン（-▲
-）、および対照（-X-）。結合した抗体をヤギ抗ウサギHRPコンジュゲートの1:4
000希釈物を用いて検出し、ELISAプレートをLabsystems iEMSリーダーを用いて4
15nmにて読み取った。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 31/04 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 Ｃ０７Ｋ 14/195 5/10 16/12 // Ｃ０７Ｋ 14/195 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 16/12 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，Ｓ Ｄ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ， ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 チェン，チャオ，グァン オーストラリア国 3057 ヴィクトリア州 ブルンスウィック イースト，エーセル ストリート １ (72)発明者 バー，イアン，ジョージ オーストラリア国 3106 ヴィクトリア州 テンプルストウ，シェイクスピア ドラ イブ 13 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA14 BA31 BA80 CA03 CA07 CA20 DA06 EA04 GA11 HA03 4B065 AA01Y AA26X AA58X AA72X AA87X AB01 AC14 BA02 BB01 BC03 BD01 BD14 CA45 CA46 4C085 AA03 AA13 AA14 BA07 CC07 DD62 EE01 EE06 GG01 GG08 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 BA41 CA11 DA75 DA86 DA89 EA22 EA52 FA71 FA74 GA01 GA15 GA26

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 抗原組成物であって、該組成物は少なくとも1つの組換えタ
   ンパク質を含んでなり、該組換えタンパク質は少なくとも1つのエピトープを含
   んでなり、該エピトープは抗体と反応性があり、該抗体は配列番号３または配列
   番号５の配列を有するポリペプチドと反応性がある、前記抗原組成物。
2. 【請求項２】 抗原組成物が配列番号３、配列番号３の残基1-184、配列番
   号３の残基1-290、配列番号３の残基65-184、配列番号３の残基65-290、配列番
   号３の残基65-419、配列番号３の残基192-290、配列番号３の残基192-419、配列
   番号３の残基147-419、配列番号５および配列番号６からなる群から選択される
   配列を有する組換えタンパク質を含んでなる、請求項１に記載の抗原組成物。
3. 【請求項３】 抗原組成物がさらにアジュバントを含んでなる、請求項１ま
   たは請求項２に記載の抗原組成物。
4. 【請求項４】 組換えタンパク質がキメラまたは融合タンパク質である、請
   求項１に記載の抗原組成物。
5. 【請求項５】 キメラまたは融合タンパク質が配列番号３、配列番号３の残
   基1-184、配列番号３の残基1-290、配列番号３の残基65-184、配列番号３の残基
   65-290、配列番号３の残基65-419、配列番号３の残基192-290、配列番号３の残
   基192-419、配列番号３の残基147-419、配列番号５および配列番号６からなる群
   から選択される配列を含んでなる、請求項４に記載の抗原組成物。
6. 【請求項６】 キメラまたは融合タンパク質が配列番号４の配列を有する、
   請求項４または請求項５に記載の抗原組成物。
7. 【請求項７】 抗体組成物であって、該組成物は少なくとも1つの抗体を含
   んでなり、該抗体は請求項１〜６のいずれかに記載の抗原組成物に対して産生し
   たことを特徴とする、前記抗体組成物。
8. 【請求項８】 抗体がポリペプチドと結合し、該ポリペプチドは配列番号３
   、配列番号３の残基1-184、配列番号３の残基1-290、配列番号３の残基65-184、
   配列番号３の残基65-290、配列番号３の残基65-419、配列番号３の残基192-290
   、配列番号３の残基192-419、配列番号３の残基147-419、配列番号５および配列
   番号６からなる群から選択される配列を有することを特徴とする、請求項７に記
   載の抗体組成物。
9. 【請求項９】 組換え原核生物または真核生物細胞であって、組換え細胞は
   、配列番号１、配列番号１のヌクレオチド1-1257、配列番号１のヌクレオチド1-
   552、配列番号１のヌクレオチド1-870 of SEQ、配列番号１のヌクレオチド193-5
   52、配列番号１のヌクレオチド193-870、配列番号１のヌクレオチド193-1257、
   配列番号１のヌクレオチド574-870、配列番号１のヌクレオチド574-1257、配列
   番号１のヌクレオチド439-1257、配列番号７、配列番号８およびそれらとストリ
   ンジェントな条件下でハイブリダイズする配列からなる群から選択され少なくと
   も1つの調節エレメントと機能しうる形で連結されたDNA配列を含んでなる、前記
   組換え原核生物または真核生物細胞。
10. 【請求項１０】 被験者におけるP.gingivalis感染症の発生数または重症度
    を予防または軽減する方法であって、被験者に対して請求項１〜６のいずれかに
    記載の抗原組成物を投与することを含んでなる、前記方法。
11. 【請求項１１】 被験者におけるP.gingivalis感染症の発生数または重症度
    を予防または軽減する方法であって、被験者に対して請求項７または８に記載の
    抗体組成物を投与することを含んでなる、前記方法。