JP2003516712A - Ｔ細胞およびｂ細胞の活性化モジュレーターについての新しい組成物およびスクリーニング方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 Ｔ細胞およびＢ細胞の活性化に有用なタンパク質について記載する。特に、Ｔ細胞中のヒトＳＷＡＰ７０同族体およびヒトＲａｓＧＲＰ同族体について記載する。また、ＲａｓＧＲＰのＳＷＡＰ７０およびヒト同族体（ＪＥＳＴと言う）との結合を記載する。これらのタンパク質のモジュレーターを同定する方法およびモジュレーターの妨害も記載する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （発明の分野） 本発明は、Ｔ細胞およびＢ細胞の活性化に有用なタンパク質に関する。より具
体的には、本発明は、Ｔ細胞ライブラリィ中のヒトＳＷＡＰ７０同族体およびＲ
ａｓＧＲＰ同族体、およびこれらの活性を調節する候補物質を同定する方法にお
けるこれらの同族体の使用に関する。

【０００２】 リンパ球は、免疫応答を担う白血球である。その特徴は、多様性、特異性、記
憶、自己／非自己認識についての免疫系の特性を説明する。リンパ球は、全白血
球の２０−４０％を占め、血液およびリンパを循環して、組織空間およびリンパ
様器官中に移行し得る。リンパ球は、機能および細胞膜成分を基にして大きくは
３つに分類できる。Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞である。特に関心が高いのはＢ細
胞とＴ細胞であり、さらに関心の高いのはリンパ球の活性化である。本明細書で
は、リンパ球はＢ細胞およびＴ細胞を意味する。

【０００３】 Ｂ細胞のアクチベーターは同定されている。例えば、ＳＷＡＰ７０は、Ｂ細胞
イソ型切り替えに関与するＢ細胞特異的タンパク質として元々同定された（Borg
grefe et al., J. Biol., Chem., 17025-17035 (1998)、出典明示により本明細
書の一部とする)。

【０００４】 リンパ球における特異的情報伝達経路の活性化が免疫応答の質、量、期間を決
定するので、活性化の強いタンパク質およびそのモジュレーターを同定すること
が望まれる。これらのタンパク質およびモジュレーターは、移植、急性および慢
性の炎症疾患、自己免疫の治療において用途がある。

【０００５】 （発明の要旨） 本発明は、Ｔ細胞およびＢ細胞の活性化に関与するタンパク質を提供する。よ
り具体的には、ＪＥＳＴ（Ｔ−ＳＷＡＰと言うこともある）を同定する。ＪＥＳ
Ｔは、Ｂ細胞特異的タンパク質として本来同定されたＳＷＡＰ７０に相同性を有
する。しかし、本発明は、ＪＥＳＴがＴ細胞情報伝達に関与することを提供する
。さらに、ＲａｓＧＲＰがＪＥＳＴおよびＳＷＡＰ７０（ＳＷＡＰと言うことも
ある）に結合することを提供する。提供されたＲａｓＧＲＰはＢ細胞およびＴ細
胞の活性化情報伝達に関与する。また、本発明は、Ｔ細胞およびＢ細胞の活性化
のモジュレーターのスクリーニング方法を提供する。

【０００６】 ひとつの態様において、図２に表示するアミノ酸配列に少なくとも約８５％同
一であるＪＥＳＴタンパク質をコードする組換え核酸を提供する。また、図２に
表示するアミノ酸配列をコードする組換え核酸を提供する。さらに、図２に表示
する核酸配列またはその補体に高ストリンジェント条件でハイブリダイズする組
換え核酸を提供する。さらに、図２に表示する核酸配列に少なくとも約９０％同
一である組換え核酸を提供する。また、図２に表示する核酸配列を有する組換え
核酸を提供する。

【０００７】 別の態様において、本発明は、図２に表示するアミノ酸配列に少なくとも約８
５％同一である組換えＪＥＳＴタンパク質を提供する。また、図２に表示するア
ミノ酸配列を含むＪＥＳＴタンパク質を提供する。さらに、図２に表示する核酸
配列に少なくとも約８５％同一である核酸によりコードされたＪＥＳＴタンパク
質を提供する。さらに、図２に表示する核酸配列またはその補体に高ストリンジ
ェント条件でハイブリダイズする核酸によりコードされるＪＥＳＴタンパク質を
提供する。

【０００８】 さらに、別の態様において、本発明は、ＪＥＳＴタンパク質に特異的に結合す
る単離のポリペプチドを提供する。ポリペプチドは、好ましくは抗体であり、さ
らに好ましくはモノクローナル抗体である。ある実施態様において、提供される
抗体は、図２に表示する核酸配列またはその補体に高ストリンジェント条件で融
合する核酸によりコードされるＪＥＳＴタンパク質の生物機能を減少または消失
せしめる抗体である。

【０００９】 本発明はさらに、図７Ｂに表示するアミノ酸配列に少なくとも約８５％同一で
あるヒトＲａｓＧＲＰタンパク質をコードする組換え核酸を提供する。また、図
７Ｂに表示するアミノ酸配列をコードする組換え核酸を提供する。さらに、図７
Ａに表示する核酸配列またはその補体に高ストリンジェント条件でハイブリダイ
ズする組換え核酸を提供する。さらに、図７Ａに表示する核酸配列に少なくとも
約９０％同一である組換え核酸を提供する。別の実施態様において、図７Ａに表
示する核酸配列を有する組換え核酸を提供する。また、図６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、６
Ｄに表示する配列を提供する。これらはＳＷＡＰ７０にそれぞれ結合する。ある
実施態様において、図６Ａ−６Ｄの配列はＪＥＳＴに結合する。

【００１０】 本発明はさらに、図７Ｂに表示するアミノ酸配列に少なくとも約９５％同一で
ある組換えヒトＲａｓＧＲＰタンパク質を提供する。ある実施態様において、図
７Ｂに表示するアミノ酸配列を含むヒトＲａｓＧＲＰタンパク質を提供する。別
の実施態様において、図７Ａに表示する核酸配列に少なくとも約８５％同一であ
る核酸によりコードされたヒトＲａｓＧＲＰタンパク質を提供する。さらに、図
７Ａに表示する核酸配列またはその補体に高ストリンジェント条件でハイブリダ
イズする核酸によりコードされるヒトＲａｓＧＲＰタンパク質を提供する。

【００１１】 さらに、別の態様において、本発明は、ヒトＲａｓＧＲＰタンパク質に特異的
に結合する単離のポリペプチドを提供する。ある実施態様において、このポリペ
プチドは、好ましくは抗体であり、さらに好ましくはモノクローナル抗体である
。好ましい実施態様において、提供される抗体は、図７Ａに表示する核酸配列ま
たはその補体に高ストリンジェント条件でハイブリダイズする核酸によりコード
されるＲａｓＧＲＰタンパク質の生物機能を減少または消失せしめるモノクロー
ナル抗体である。

【００１２】 本発明はまた、本明細書記載の核酸を含む発現ベクターを提供する。さらに、
本明細書記載の核酸および／またはベクターを含む宿主細胞を提供する。

【００１３】 別の態様において、本発明は、ＲａｓＧＲＰタンパク質またはＪＥＳＴをつく
る方法を提供する。この方法は、ヒトＲａｓＧＲＰタンパク質またはＪＥＳＴの
発現に適した条件で、本発明が提供する宿主細胞を培養することを含む。

【００１４】 さらに別の態様において、本発明は、ＪＥＳＴタンパク質に結合し得るバイオ
活性物質をスクリーニングする方法を提供する。ある実施態様において、該方法
は、ＪＥＳＴタンパク質と候補バイオ活性物質とを組み合すこと、および該候補
バイオ活性物質の該ＪＥＳＴタンパク質との結合を測定することを含む。

【００１５】 また、本発明は、ＲａｓＧＲＰタンパク質に結合し得るバイオ活性物質をスク
リーニングする方法を提供する。ある実施態様において、該方法は、ヒトＲａｓ
ＧＲＰタンパク質と候補バイオ活性物質とを組み合すこと、および該候補バイオ
活性物質の該ヒトＲａｓＧＲＰタンパク質との結合を測定することを含む。

【００１６】 別の態様において、本発明は、ＳＷＡＰ７０タンパク質とＲａｓＧＲＰとの結
合を妨害し得る物質のスクリーニング方法を提供する。ある実施態様において、
該方法は、ＳＷＡＰ７０タンパク質、候補バイオ活性物質、ＲａｓＧＲＰタンパ
ク質を組み合すこと、および該ＳＷＡＰ７０タンパク質と該ＲａｓＧＲＰタンパ
ク質との結合を測定することを含む。

【００１７】 本発明はまた、ＪＥＳＴタンパク質とＲａｓＧＲＰとの結合を妨害し得る物質
のスクリーニング方法を提供する。ある実施態様において、該方法は、ＪＥＳＴ
タンパク質、候補バイオ活性物質、ＲａｓＧＲＰタンパク質を組み合すこと、お
よび該ＪＥＳＴタンパク質と該ＲａｓＧＲＰタンパク質との結合を測定すること
を含む。

【００１８】 別の態様において、本発明は、ＪＥＳＴタンパク質の活性を調節し得るバイオ
活性物質のスクリーニング方法を提供する。ある実施態様において、該方法は、
候補バイオ活性物質を、ＪＥＳＴタンパク質をコードする組換え核酸を含有する
細胞に加えること、およびリンパ球活性化を含むＪＥＳＴバイオ活性に対する候
補バイオ活性物質の作用を測定することを含む。

【００１９】 本発明はまた、ヒトＲａｓＧＲＰタンパク質の活性を調節し得るバイオ活性物
質のスクリーニング方法を提供する。該方法は、候補バイオ活性物質を、ヒトＲ
ａｓＧＲＰタンパク質をコードする組換え核酸を含有する細胞に加えること、お
よびＴ細胞およびＢ細胞の活性化を含むＲａｓＧＲＰバイオ活性に対する候補バ
イオ活性物質の作用を測定することを含む。提供する方法は、候補バイオ活性物
質のライブラリィを、該組換え核酸を含む複数の細胞に加えることで実施できる
。

【００２０】 さらに別の実施態様において、本発明は、ＳＷＡＰ７０、ＪＥＳＴまたはＲａ
ｓＧＲＰに結合し得る候補タンパク質のスクリーニング方法を提供する。これら
のタンパク質のいずれをも使用できると考えられる。該方法は、ＳＷＡＰ７０、
ＪＥＳＴまたはＲａｓＧＲＰをコードする核酸と候補タンパク質をコードする核
酸とを組み合すことを含む。そこでは、同定可能マーカーが発現され、該候補タ
ンパク質が該ＳＷＡＰ７０、ＪＥＳＴまたはＲａｓＧＲＰに結合する。

【００２１】 本発明はまた、ＳＷＡＰ７０またはＪＥＳＴとＲａｓＧＲＰとから基本的にな
る複合体を提供する。他の態様は下記により明かになる。

【００２２】 （図面の簡単な説明） 図１は、ヒトＪＥＳＴのコード配列の実施態様を含む核酸配列（ｃＤＮＡ）を
表示する。開始コドンはヌクレオチド５４１で始まり、停止コドンはヌクレオチ
ド２４３４で始まる。開始および停止コドンは循環する。

【００２３】 図２Ａおよび２Ｂは、ヒトＪＥＳＴのコード配列の実施態様を表示する。アミ
ノ酸配列の翻訳をコード配列の下に示す。

【００２４】 図３は、提供するヒトＥＳＴおよびヒトＲａｓＧＲＰ断片をラットＲａｓＧＲ
Ｐに並べた模式図を表示する。

【００２５】 図４Ａおよび４Ｂは、ＳＷＡＰ７０について核酸配列およびアミノ酸配列をそ
れぞれ表示する。

【００２６】 図５Ａおよび５Ｂは、ＳＷＡＰ７０およびＪＥＳＴのアミノ酸平衡整列を表示
する。ＳＷＡＰ７０をＪＥＳＴの上に示す。ＳＷＡＰ７０がケリー（照合）でＪ
ＥＳＴがサブジェクト（主体）である。平衡整列の生成に使用する特殊なパラメ
ーターも示す。

【００２７】 図６Ａ−６Ｄは、ヒトＲａｓＧＲＰの核酸配列を表示する。これらの核酸の各
々がＳＷＡＰ７０と結合する産物をコードした。図６Ａは、図３における「ＳＷ
ＡＰ７０.１４」を示す。図６Ｂは、図３における「ＳＷＡＰ７０.３６」を示す
。図６Ｃは、図３における「ＳＷＡＰ７０.５２」を示す。図６Ｄは、図３にお
ける「ＳＷＡＰ７０.５５」を示す。

【００２８】 図７Ａおよび７Ｂは、ＳＷＡＰ７０に結合するヒトＲａｓＧＲＰについての共
通の核酸配列およびアミノ酸配列をそれぞれ表示する。

【００２９】 （発明の詳細な記述） 本発明は、新規なリンパ球活性化のタンパク質および核酸を提供する。好まし
い実施態様において、リンパ球活性化タンパク質は、脊椎動物に由来し、さらに
好ましくは、げっし類（ラット、マウス、ハムスター、モルモットなど）、霊長
類、家畜（ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマなど）を含む哺乳動物に由来し、最
も好ましくはヒトに由来する。

【００３０】 本発明のリンパ球活性化タンパク質は、いくつかの方法で同定できる。この意
味において「タンパク質」は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチドを含む。リ
ンパ球活性化タンパク質は、Ｔ細胞およびＢ細胞の活性化に関与することが知ら
れているタンパク質とのその会合により最初に同定できる。ある実施態様におい
て、リンパ球活性化タンパク質はＳＷＡＰまたはＪＥＳＴと結合する。

【００３１】 リンパ球活性化タンパク質は、新規なものまたは存在の知られているものであ
るが、ＳＷＡＰまたはＪＥＳＴと結合すること、またはリンパ球活性化やリンパ
球活性化タンパク質に関連することは、知られていない。

【００３２】 新規のリンパ球活性化核酸またはリンパ球活性化タンパク質は、図に示す核酸
および／またはアミノ酸の配列に対するそれぞれの配列の同一性または類似性に
よって最初に同定する。この配列の同一性または類似性は、全体の核酸またはア
ミノ酸の配列に基づき得る。

【００３３】 追加の態様において、本発明は、リンパ球活性化タンパク質をコードする核酸
、すなわち、図に示すもの、およびその同族体を提供する。好ましい実施態様は
ＪＥＳＴおよびＲａｓＧＲＰのヒト同族体を含む。

【００３４】 ＲａｓＧＲＰ、小さいグアノシン・トリホスフェートＲａｓについてのグアニ
ルヌクレオチド放出タンパク質は、Ｒａｓを活性にし、線維芽細胞で形質転換を
起こすことが報告されている（Ebinu et al., Science, 280: 1082-1086 (1998)
、出典明示により本明細書の一部とする)。ＲａｓＧＲＰの情報伝達は膜フラク
ションにおけるその分配に関連していた。神経節における発現およびＲａｓを活
性する能力に基づき、ＲａｓＧＲＰが機能して、神経節分化、軸索増殖、シナプ
ス可塑性を促進する。今回示すように、ＲａｓＧＲＰ伝達が活性Ｔ細胞およびＢ
細胞において誘導される。さらに、本明細書に示すＳＷＡＰとＲａｓＧＲＰとの
関係は、種々の細胞系における多数の同族体を有する新規の活性化経路を証明す
る。

【００３５】 ＪＥＳＴは、JurkatＴ細胞ライブラリィ由来のヒトＥＳＴ（AA306449）に対す
る配列相同性を有する。完全長配列が活性ヒト末梢血Ｔ−Ｂ細胞取り替えライブ
ラリィ、およびJunkat cＤＮＡライブラリィから誘導された。ＪＥＳＴは、ＳＷ
ＡＰと異なる発現パターンをノーザンで有し、胸腺、リンパ様器官、末梢血白血
球、精巣に最も多い。本発明で提供するように、ＪＥＳＴは、ＲａｓＧＲＰとの
結合によりＴ細胞情報伝達およびその情報伝達の調節に部分的に関与する。

【００３６】 上記のように、リンパ球活性化タンパク質はＳＷＡＰまたはＪＥＳＴ（それ自
体リンパ球活性化タンパク質と考えられる）に結合するタンパク質を含む。本発
明は、リンパ球活性化タンパク質としてＲａｓＧＲＰを提供する。好ましい実施
態様において、ヒトＲａｓＧＲＰを提供する。

【００３７】 好ましい実施態様において、タンパク質は、図に示すアミノ酸配列のいすれか
ひとつに対するタンパク質の全配列同一性が約７５％以上であれば、「リンパ球
活性化タンパク質」である。同一性は、好ましくは８０％以上、さらに好ましく
は８５％以上、最も好ましくは９０％以上である。ある実施態様において、配列
同一性は約９３から９５または９８％の高さである。各配列同定数は、個々に選
択されるか、または群メンバーとの組合せで個々の実施態様を提供する。配列同
一性の決定は、既知の標準的方法を用いて行う。その方法には、限定でないが、
Smith & Waterman の局所配列同定算法（Adv. Appln. Math. 2:482 (1981))、Ne
edleman & Wunch の配列同定平衡整列算法（J. Mol. Biol. 48:443 (1970))、Pe
arson & Lipman の類似性方法の研究（PNAS USA 85:2444 (1988))、これらの算
法のコンピュータ化実施（GAP, BESTFIT, FASTA, TFASTA in the Wisconsin Gen
etics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madi
son, WI)、ベストフィット配列プログラム（Devereux et al., Nucl. Acid Res.
12:387-395 (1984))がある。好ましくは、デフォルト・セティングを用いるか
、検査による。

【００３８】 有用な算法の１例はＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、進行的対型の平衡
整列を用いて関連配列の群から多数の配列平衡整列をつくる。平衡整列をつくる
のに使用する群生関係を表すツリーを描くことができる。ＰＩＬＥＵＰは、Feng
& Doolittle の進行的平衡整列法（J. Mol. Evol. 35:351-360 (1987))の簡易
化を利用する。この方法は Higgins & Sharp の方法（CABIOS 5:151-153 (1989)
)に類似している。有用なＰＩＬＥＵＰパラメーターは、デフォルト・ギャップ
重量３.００、デフォルト・ギャップ長重量０.１０、加重終末ギャップを含む。

【００３９】 有用な算法の他の例は、ＢＬＡＳＴ算法である（Altschul et al., J. Mol. B
iol. 215, 403-410 (1990)、Karlin et al., PNAS USA 90:5873-5787 (1993))。
特に有用なＢＬＡＳＴプログラムは、Alschul et al.(Methods in Enzymology,
266:460-480 (1996); http://blast.wust/edu/blast/ README.html）から得たＷ
Ｕ−ＢＬＡＳＴ−２プログラムである。ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２は、いくつかの研
究パラメーターを利用する。その大部分はデフォルト値をセットする。調節可能
パラメーターは次の値をセットする。オーバラップ・スパン＝１、オバーラップ
・フラクション＝０.１２５、ワード域（Ｔ）＝１１。ＨＳＰ ＳおよびＨＳＰ
Ｓ２パラメーターは、ダイナミック値であり、特定の配列の組成、および所望配
列の検索についての特定のデータベースの組成に依存するプログラム自体によっ
て確立する。しかし、値を調整して感度を上げ得る。アミノ酸配列の同一性％は
、対になっている同一の残基の数を、平衡領域の「より長い」配列の残基の全数
で除すことにより求められる。「より長い」配列は平衡領域の最も実在の残基を
有するものである（平衡整列スコアーを最大にするためにＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２
により導入されたギャップは無視する）。

【００４０】 同様に、本発明で同定されたポリペプチドのコード配列に関する「核酸配列の
同一性％」を、リンパ球活性化タンパク質のコード配列におけるヌクレオチド残
基に同一の、候補配列におけるヌクレオチド残基の％と定義する。好ましい方法
で、デフォルト・パラメーターにセットされたＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２のＢＬＡＳ
ＴＮモデルを利用する。オーバラップ・スパン＝１、オバーラップ・フラクショ
ン＝０.１２５にセットする。

【００４１】 平衡整列は、平衡にする配列でのギャップの導入を含み得る。さらに、図に示
すタンパク質よりも多いかまたは少ないアミノ酸を含有する配列については、配
列同一性％は、アミノ酸の全数に対する同一アミノ酸の数を基に求める。このよ
うに、ある実施態様において、図に示す配列よりも短い配列の同一性は、下記す
るように、短い配列におけるアミノ酸の数を用いて求める。

【００４２】 本発明のリンパ球活性化タンパク質は、図に示すアミノ酸配列よりも短いこと
もあり、長いこともある。従って、好ましい実施態様において、本発明により提
供される配列の部分または断片が、リンパ球活性化タンパク質の定義に含まれる
。ある実施態様において、リンパ球活性化タンパク質の断片は、ａ）少なくとも
１つの抗原エピトープを共有し、ｂ）少なくとも指示の配列同一性を有し、ｃ）
ＳＷＡＰとの結合を含む活性化バイオ活性を好ましくは有している場合に、リン
パ球活性化タンパク質と考える。ある場合において、配列が診断的に使用される
とき、すなわち、リンパ球活性化タンパク質・核酸の有無を調べるときは、指示
した配列同一性のみを必要とする。本発明の核酸も、図に示す配列よりも短いこ
ともあり、長いこともある。核酸の断片は、厳密には上記で同定されていない配
列を有し、本発明で提供される核酸の部分を含む。上記で同定されていない配列
部分に指示の同一性を有する配列断片を、本発明の実施態様で提供する。

【００４３】 さらに、下記に詳細に説明するように、図に示すものより長いリンパ球活性化
タンパク質をつくるには、例えば、エピトープまたは精製タグを付加、または他
の融合配列を付加する。

【００４４】 リンパ球活性化タンパク質は、リンパ球活性化核酸によりコードされて、同定
できる。つまり、ある実施態様において、リンパ球活性化タンパク質は、図に表
示の配列に相補的な配列のひとつにハイブリダイズする核酸によりコードされる
。別の実施態様において、図中の核酸配列のいずれかを使用できる。ハイブリダ
イゼーションの条件は下記する。

【００４５】 さらに好ましい態様において、リンパ球タンパク質が抗体産生に使用されると
き、リンパ球活性化タンパク質は、図に示された完全長タンパク質と少なくとも
１個のエピトープまたは決定基を共有していなければならない。ここで「エピト
ープ」または「決定基」とは、抗体を産生および／または結合するタンパク質の
一部分を意味する。すなわち、大部分の場合、小さいリンパ球活性化タンパク質
に対して産生された抗体は、完全長タンパク質と結合することができる。好まし
い態様において、エピトープは唯一であり、すなわち唯一のエピトープに対して
産生した抗体は交差反応性を殆どまたは全く示さない。「抗体」なる用語は、当
分野において公知の、Ｆａｂ、Ｆａｂ_２、単鎖抗体（例えばＦｖ）、キメラ抗体
などを含み、抗体全体の修飾かまたは組換えＤＮＡ技術を用いる新たな合成によ
る抗体断片を含む。

【００４６】 好ましい態様において、リンパ球活性化物質に対する抗体は、下記に記載され
ている通り、リンパ球活性タンパク質の生物学的機能を減少または消失すること
ができる。すなわち、リンパ球活性化物質（またはこれらタンパク質を含む細胞
）に抗リンパ球活性化抗体（ポリクローナルまたは好ましくはモノクローナル）
を加えると、リンパ球活性化受容体活性は減少または消失され得る。一般に、少
なくとも活性の２５％の減少が好ましく、少なくとも約５０％が特に好ましく、
約９５−１００％の減少がさらに好ましい。

【００４７】 本発明のリンパ球活性化抗体は、リンパ球活性化タンパク質に結合する。好ま
しい態様において、当該抗体は、特異的にリンパ球活性化タンパク質に特異的に
結合する。ここで「特異的に結合する」とは、少なくとも１０^−４から１０^−８ Ｍ^−１の範囲、好ましくは１０^−７から１０^−９Ｍ^−１の範囲の結合定数で抗体
がタンパク質に結合することを意味する。抗体は、下記に記載される。

【００４８】 核酸の場合、核酸配列の全体的同一性は、アミノ酸同一性と釣り合っているが
、異なる生物体の遺伝コードの縮重およびコドン偏寄も考慮される。従って、核
酸配列相同性は、タンパク質配列の場合より低いかまたは高度であり得る。すな
わち、図の核酸配列と比べて核酸配列の同一性は、好ましくは６５％よりおおき
く、さらに好ましくは７５％よりおおきく、特に約８０％より大きく、および最
も好ましくは９０％より大きい。場合によっては、相同性は約９３〜９５または
９８％ぐらいに高い。

【００４９】 好ましい態様において、リンパ球活性化核酸はリンパ球活性化タンパク質をコ
ードする。当業界で認められているように、遺伝コードの縮重により、非常に多
数の核酸が製造され得、それらは全て本発明のリンパ球活性化タンパク質をコー
ドする。すなわち、特定アミノ酸配列が同定されると、当分野に精通している者
であれば、リンパ球活性化のアミノ酸配列を変えない方法で１個またはそれ以上
のコドンの配列を単に修飾することにより、異なる核酸を幾つでも製造すること
ができる。

【００５０】 ある態様において、上記核酸は、ハイブリダイゼーション実験によって決定さ
れる。すなわち、例えば、高ストリンジェント条件下で各図に示された核酸配列
の補体とハイブリダイズする核酸は、リンパ球活性化遺伝子であると考えられる
。高ストリンジェント条件は当業界では公知である。例えば、Maniatisら、Mole
cular Cloning: A Laboratory Manual、第２版（１９８９）、およびShort Prot
ocols in Molecular Biology、Ausubelら編集（両方とも出典明示により本明細
書の一部とする）を参照。ストリンジェント条件には配列依存性であり、それぞ
れの環境で異なるであろう。長い配列は、特に温度を上げてハイブリダイズされ
る。核酸ハイブリダイズに関する広範な指針は、Tijssen, Techniques in Bioch
emistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes, 「Overv
iew of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assa
ys」(1993)で理解される。一般的に、ストリンジェント条件には、定義されたイ
オン強度ｐＨでの特定配列に対する熱溶融点（Ｔｍ）よりも低い約５−１０℃で
の条件が選択される。かかるＴｍは、平衡時（標的配列がＴｍ、５０％を超える
プローブが平衡時で占める場合）標的にプローブの５０％が相補的に標的配列と
ハイブリダイズする温度（規定したイオン強度、ｐＨおよび核酸条件下で）であ
る。ストリンジェント条件は、ｐＨ７.０〜８.３、塩濃度が約１．０Ｍより低い
ナトリウムイオン濃度、通常、約０.０１〜１.０Ｍのナトリウムイオン濃度（ま
たは他の塩）であって、温度が短いプローブ（例えば、１０〜５０個の核酸）に
対して約３０℃、少なくとも長いプローブ（約５０個以上の核酸）に対して約６
０℃である。また、ストリンジェント条件は、ホルムアミドのような不安定化剤
の添加によっても達成される。

【００５１】 別の態様では、ストリンジェントの低いハイブリダイゼーション条件が使用さ
れ、例えば、当業界で知られているように、中程度または低いストリンジェント
条件が使用され得る。Maniatis、AusubelおよびTijssen前出参照。

【００５２】 本発明のリンパ球活性化タンパク質および核酸は、好ましくは組換え体である
。ここで使用されている「核酸」は、ＤＮＡまたはＲＮＡ、またはデオキシ−お
よびリボヌクレオチドの両方を含む分子を包含し得る。核酸は、センスおよびア
ンチセンス核酸を含むゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡおよびオリゴヌクレオチドを含む
。上記核酸はまた、リボース‐燐酸バックボーンにおける修飾を含むため、生理
学的環境における上記分子の安定性および半減期が増加され得る。

【００５３】 核酸は、２本鎖、１本鎖であり得、または２本鎖または１本鎖配列の両方の一
部を含む。当分野で認められているように、また１本鎖（「ワトソン」）を描く
ことにより、他方の鎖（「クリック」）の配列が定義される。すなわち、各図に
描かれた配列はまた、配列の補体を含む。ここで「組換え核酸」なる用語は、一
般にはエンドヌクレアーゼによる核酸の遺伝子操作により、事実上普通には見出
されない形態で、もともとインビトロ形成された核酸を意味する。すなわち、線
形で分離されたリンパ球活性化核酸、または通常では結合されていないＤＮＡ分
子を連結することによりインビトロ形成された発現ベクターは、両方とも本発明
の目的に適した組換え体であると考えられる。一旦組換え核酸が製造され、宿主
細胞または生物体に再導入されると、非組換え的に、すなわちインビトロ操作で
はなく宿主細胞のインビボ細胞機構を用いて複製することがわかる。しかしなが
ら、上記核酸は、一旦組換え的に製造されると、その後は非組換え的に複製され
るが、依然として本発明の目的に適った組換え体であると考えられる。

【００５４】 同様に、「組換えタンパク質」は、組換え技術を用いて、すなわち上記組換え
核酸の発現により製造されるタンパク質である。組換えタンパク質は、少なくと
も１以上の特徴により天然タンパク質とは区別される。例えば、このタンパク質
は、普通その野生型宿主においての随伴のタンパク質および化合物の一部または
全体から分離または精製され得るため、実質的に純粋であり得る。例えば、分離
されたタンパク質は、自然状態では通常随伴している物質の少なくとも一部を伴
っておらず、好ましくは与えられた試料における全タンパク質の重量にして少な
くとも約０.５％、さらに好ましくは少なくとも約５％を構成している。実質的
に純粋なタンパク質は、総タンパク質の少なくとも約７５重量％を構成し、少な
くとも約８０％が好ましく、さらに少なくとも約９０％が特に好ましい。この定
義には、異なる生物体または宿主細胞における一生物体からのリンパ球活性化タ
ンパク質の製造が含まれる。別法として、このタンパク質は、タンパク質が高い
濃度レベルで製造されるような誘導可能プロモーターまたは高度発現プロモータ
ーの使用により、普通に見られる濃度より著しく高い濃度で製造され得る。別法
として、タンパク質は、下記で説明するように、エピトープ標識の付加またはア
ミノ酸の置換、挿入および欠失といった状態で、事実上普通には見出されない形
態であり得る。

【００５５】 また、アミノ酸配列変異型も本発明のリンパ球活性化タンパク質の定義内に含
まれる。これらの変異型は、３種類、すなわち置換、挿入または欠失変異型の１
以上に分類される。通常これらの変異型は、変異型をコードするＤＮＡを製造す
るため、当業界で公知のカセットまたはＰＣＲ突然変異誘発法または他の技術を
用いて、上記で説明された組換え細胞培養物においてＤＮＡを発現させることに
よる、リンパ球活性化タンパク質をコードするＤＮＡにおけるヌクレオチドの部
位特異的突然変異導入法により製造される。しかしながら、約１００−１５０ま
での残基を有する変異型リンパ球活性化タンパク質断片は、確立された技術を用
いるインビトロ合成により製造され得る。アミノ酸配列変異型は、予め定められ
た変異の性質を特徴とし、すなわちリンパ球活性化タンパク質アミノ酸配列の天
然対立遺伝子または種間変異から区別される特徴である。変異型は、典型的には
天然類似体と同じ質的バイオ活性を呈するが、下記でより詳細に説明されている
ように修飾された特徴を有する変異型も選択され得る。

【００５６】 アミノ酸配列変異を導入する部位または領域が予め決定されても、突然変異自
体は予め決定される必要はない。例えば、所定の部位における突然変異誘発の性
能を最適化するため、ランダム突然変異誘発が標的コドンまたは領域で誘導され
、発現されたリンパ球活性化変異型は所望の活性の最適な組み合わせについてス
クリーニングされ得る。既知配列を有するＤＮＡにおいて予め決定された部位で
置換突然変異を誘発する技術はよく知られており、例えば、Ｍ１３プライマー突
然変異誘発法およびＰＣＲ突然変異誘発法がある。突然変異体のスクリーニング
は、リンパ球活性化タンパク質活性のアッセイ法を用いて行われる。

【００５７】 アミノ酸置換は典型的には単一残基によるものであり、挿入は通常約１ないし
２０アミノ酸程度で行われるが、かなり大規模な挿入も認容され得る。欠失は約
１ないし約２０残基の範囲であるが、場合によってはかなり大規模な欠失もあり
得る。

【００５８】 置換、欠失、挿入またはそれらの組み合わせを用いることにより、最終誘導体
に到達し得る。一般に、これらの変化は、分子の改変を最小限にとどめるため数
個のアミノ酸に対して行われる。しかしながら、大規模な変化もある種の環境で
は認容され得る。リンパ球活性化タンパク質の特性の小規模な改変が望まれる場
合、置換は一般に下記チャートに従って行われる。 チャートＩ

【表１】

【表２】

【００５９】 機能または免疫学的同一性の実質的変化は、チャートＩに示されたものより保
存性が低い置換を選択することにより行われる。例えば、改変領域におけるポリ
ペプチドバックボーンの構造、例えば、αらせんまたはβシート構造、標的部位
における分子の荷電または疎水性、または側鎖のバルクに顕著な影響を及ぼす置
換が行われ得る。一般にポリペプチドの特性に最大の変化をもたらすことが予測
される置換は、（ａ）親水性残基、例えば、セリンまたはトレオニンが疎水性残
基、例えば、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、バリンまたはアラニ
ンの代わりに（または、により）置換されている場合、（ｂ）システインまたは
プロリンが他のいずれかの残基の代わりとして（または、により）置換されてい
る場合、（ｃ）電気陽性側鎖を有する残基、例えば、リジン、アルギニンまたは
ヒスチジンが、電気陰性残基、例えば、グルタミンまたはアスパルテン酸の代わ
りとして（または、により）置換されている場合、または（ｄ）巨大側鎖を有す
る残基、例えば、フェニルアラニンが側鎖をもたない残基、例えば、グリシンの
代わりとして（または、により）置換されている場合である。

【００６０】 変異型は、典型的には天然類似体と同じ質的バイオ活性を呈し、同じ免疫応答
を発するが、必要に応じてリンパ球活性化タンパク質の特徴を修飾する変異型も
選択される。別法として、変異型は、リンパ球活性化タンパク質のバイオ活性が
改変されるように設計され得る。例えば、グリコシル化部位が改変または除去さ
れ得る。本発明の実施態様では、ＪＥＳＴ結合ドメインにおける変異型は、結合
特性を修飾するように製造される。

【００６１】 リンパ球活性化ポリペプチドの共有結合修飾も本発明の範囲内に含まれる。共
有結合修飾の１タイプには、リンパ球活性化ポリペプチドの標的とされるアミノ
酸残基と、リンパ球活性化ポリペプチドの選択された側鎖またはＮまたはＣ末端
残基と反応し得る有機誘導体化剤との反応が含まれる。下記でさらに詳述されて
いる通り、例えば、抗リンパ球活性化抗体の精製方法またはスクリーニングアッ
セイ法で使用される水不溶性支持体マトリックスまたは表面にリンパ球活性化を
架橋させるには、二官能薬剤による誘導体化が有用である。常用架橋剤には、例
えば、１,１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデ
ヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル類、例えば、４−アジドサリチル
酸とのエステル類、ホモ二官能性イミドエステル類、例えば、ジスクシンイミジ
ルエステル類、例えば、３,３'‐ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート
）、二官能性マレイミド類、例えば、ビス−Ｎ−マレイミド−１,８−オクタン
およびメチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）ジチオ］プロピオイミデート試薬
がある。

【００６２】 他の修飾には、グルタミニルおよびアスパラギニル残基から各々対応するグル
タミルおよびアスパルチル残基への脱アミド化、プロリンおよびリシンのヒドロ
キシル化、セリルまたはトレオニル残基のヒドロキシル基の燐酸化、リシン、ア
ルギニンおよびヒスチジン側鎖の「‐アミノ基のメチル化」［T.E.Creighton、P
roteins:Structure and Molecular Properties、W.H.Freeman & Co.、サンフラ
ンシスコ、７９−８６頁（１９８３）］、Ｎ末端アミンのアセチル化、およびＣ
末端カルボキシル基のアミド化がある。

【００６３】 ポリペプチドの天然グリコシル化パターンの改変を含むリンパ球活性化ポリペ
プチドの共有結合修飾の別のタイプも本発明の範囲内に含まれる。「天然グリコ
シル化パターンの改変」とは、本発明の目的において、天然配列（起源配列）リ
ンパ球活性化ポリペプチドに見出される１以上の炭水化物部分の欠失、および／
または天然配列リンパ球活性化ポリペプチドには存在しない１以上のグリコシル
化部位の付加を意味する。

【００６４】 リンパ球活性化ポリペプチドへのグリコシル化部位の付加は、そのアミノ酸配
列の改変により達成され得る。この改変は、例えば１個以上のセリンまたはトレ
オニン残基を天然配列リンパ球活性化ポリペプチドに付加するか、またはこれに
より置換することによって行われ得る（Ｏ−結合グリコシル化部位の場合）。リ
ンパ球活性化アミノ酸配列は、所望によりＤＮＡレベルでの変化を通して、特に
所望のアミノ酸へ翻訳するコドンが生成されるように予め選択された塩基でリン
パ球活性化ポリペプチドをコードするＤＮＡを変異させることにより改変され得
る。

【００６５】 リンパ球活性化ポリペプチドにおける炭水化物部分の数を増やす別の手段は、
ポリペプチドに対するグリコシドの化学的または酵素的結合によるものである。
上記方法は、文献、例えば１９８７年９月１１日公開のＷＯ８７／０５３３０、
および Aplin および Wriston、CRC Crit. Rev. Biochem.、259-306頁（1981）
で報告されている。

【００６６】 リンパ球活性化ポリペプチドに存在する炭水化物部分の除去は、化学的または
酵素的方法またはグリコシル化の標的として用いられるアミノ酸残基をコードす
るコドンの変異的置換により達成され得る。化学的脱グリコシル化技術は当業界
では公知であり、例えば、Hakimuddinら、Arch. Biochem. Biophys.、259：52（
1987）および Edgeら、Anal. Biochem.、118：131（1981）により報告されてい
る。ポリペプチドにおける炭水化物部分の酵素的開裂は、Thotakuraら、Meth. E
nzymol., 138：350（1987）で報告されているように様々なエンド−およびエキ
ソ−グリコシダーゼの使用により達成され得る。

【００６７】 リンパ球活性化共有結合修飾の別のタイプは、米国特許第４,６４０,８３５、
４,４９６,６８９、４,３０１,１４４、４,６７０,４１７、４,７９１,１９２ま
たは４,１７９,３３７号に示された方法による、様々な非タンパク質性ポリマー
、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールまたはポリオキ
シアルキレンの一つへのリンパ球活性化ポリペプチドの結合を含む。

【００６８】 本発明のリンパ球活性化ポリペプチドはまた、別の異種ポリペプチドまたはア
ミノ酸配列に融合させたリンパ球活性化ポリペプチドを含むキメラ分子を形成す
る方法で修飾され得る。ある態様において、かかるキメラ分子は、抗標識抗体が
選択的に結合され得るエピトープを提供する標識ポリペプチドを伴ったリンパ球
活性化ポリペプチドの融合体を含む。エピトープ標識は、一般にリンパ球活性化
ポリペプチドのアミノ−またはカルボキシル−末端に位置する。リンパ球活性化
ポリペプチドの上記エピトープ標識形態の存在は、標識ポリペプチドに対する抗
体を用いて検出され得る。また、エピトープ標識の提供によって、リンパ球活性
化ポリペプチドは、抗標識抗体またはエピトープ標識に結合する別のタイプのア
フィニティーマトリックスを用いるアフィニティー精製により容易に精製され得
る。別の態様において、キメラ分子は、免疫グロブリンまたは免疫グロブリンの
特定領域を伴うリンパ球活性化ポリペプチドの融合体を含み得る。キメラ分子の
２価形態の場合、以下に完全に説明するように、かかる融合は、ＩｇＧ分子のＦ
ｃ領域に対するものであり得る。

【００６９】 様々な標識ポリペプチドおよびそれらの各抗体は当業界ではよく知られている
。例としては、ポリ−ヒスチジン（ポリ−his）またはポリ−ヒスチジン−グリ
シン（ポリ−his−gly）標識、flu ＨＡ標識ポリペプチドおよびその抗体１２Ｃ
Ａ５［Fieldら、Mol. Cell Biol.、8：2159-2165（1988）］、ｃ−myc標識およ
びそれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７および９Ｅ１０抗体［Ev
anら、Molecular and Cellular Biology、5：3610-3616（1985）］、および単純
ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）標識およびその抗体［Paborskyら、Pr
otein Engineering、3（６)：547-553（1990）］がある。他の標識ポリペプチド
には、フラッグ‐ペプチド［Hoppら、Bio Technology、6：1204-1210（1988）］
、ＫＴ３エピトープペプチド［Martinら、Science、255：192-194（1992）］、
チューブリンエピトープペプチド［Skinnerら、J.Biol.Chem.、266：15163-1516
6（1991）］、およびＴ７遺伝子１０タンパク質ペプチド標識［Lutz-Freyermuth
ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、87：6393-6397（1990）］がある。

【００７０】 また、リンパ球活性化ファミリーに属する他のリンパ球活性化タンパク質、お
よび他の生物体由来のリンパ球活性化タンパク質も下記に概説された要領でクロ
ーン化および発現される。

【００７１】 すなわち、プローブまたは縮重ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマー配
列を用いることにより、ヒトまたは他の生物体に由来する他の関連リンパ球活性
化タンパク質が見出され得る。当業界で認められているところによると、特に有
用なプローブおよび／またはＰＣＲプライマー配列は、リンパ球活性化核酸配列
の特有領域を含む。当業界で一般に知られているように、好ましいＰＣＲプライ
マーは、約１５ないし約３５ヌクレオチド長であって、約２０ないし約３０が好
ましく、必要に応じてイノシンを含み得る。ＰＣＲ反応の条件は当業界ではよく
知られている。ＰＣＲ反応の条件は当業界では公知である。そのため、ここで列
挙された配列と共に提供されるものは、それらの配列の一部であると理解され、
本明細書中では１５個以上の特定の核酸が特に好まれる。当分野で熟練の研究者
であれば、常套的に所望の長さに核酸配列を合成または切断することができる。

【００７２】 一旦リンパ球活性化核酸が同定されると、リンパ球活性化はクローン化され、
さらに必要ならば、その構成部分は完全長または成熟したリンパ球活性化核酸全
体を形成すべく組換えられ得る。ここで、完全長の核酸は、シグナルペプチドお
よび／または膜内外領域の有し、その成熟溶性形態にあるペプチドをコードする
ように１以上のこれらの領域を削除するように修飾される。一旦その天然供給源
から単離されると、例えば、プラスミドまたは他のベクター内に封入されるかま
たはそこから線形核酸セグメントとして切除されると、組換えリンパ球活性化核
酸はプローブとしてさらに用いられることにより、他のリンパ球活性化核酸が同
定および単離され得る。それはまた、修飾または変異型リンパ球活性化核酸およ
びタンパク質を製造するための「前駆体」核酸として使用され得る。この分野に
精通している技術者には理解されるであろうが、２個以上の核酸がオーバーラッ
プしていると、１つのオーバーラップ核酸のオーバーラップ部分（領域）が欠失
され、かかる核酸は、例えば、完全長または成熟ペプチドをコードするように長
めの線状リンパ球活性化核酸を形成するためにライゲーションによって結合され
る。同様のことを、リンパ球活性化ポリペプチドのアミノ酸配列に適用し、１つ
の隣接するペプチドを形成するように結合させ得る。

【００７３】 リンパ球活性化タンパク質をコードする本発明の核酸を用いると、様々な発現
ベクターが製造される。発現ベクターは、自己複製する染色体外ベクターまたは
宿主ゲノムに組み込まれるベクターであり得る。一般に、これらの発現ベクター
は、リンパ球活性化タンパク質をコードする核酸に機能し得るように結合された
転写および翻訳調節核酸を含む。「コントロール配列」なる用語は、特定宿主生
物体において機能し得るように結合されたコード配列の発現に必要なＤＮＡ配列
を包含する。原核生物に適したコントロール配列は、例えば、プロモーター、所
望によりオペレーター配列、およびリボソーム結合部位含む。真核生物細胞は、
プロモーター、ポリアデニル化シグナルおよびエンハンサーを利用することが知
られている。

【００７４】 核酸が別の核酸配列と機能的関係にある状況に置かれたとき、それは「機能し
得るように結合」されている。例えば、前駆配列または分泌リーダーに関するＤ
ＮＡはポリペプチドに関するＤＮＡに、ポリペプチドの分泌に関与する前タンパ
ク質として発現される場合、機能し得るように結合されている。プロモーターま
たはエンハンサーは、それが配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に機能
し得るように結合されている。リボソーム結合部位はコード配列に、翻訳を容易
にするような位置にある場合、機能し得るように結合されている。一般に、「機
能し得るように結合されている」は、結合されているＤＮＡ配列が隣接しており
、分泌リーダーの場合、隣接し、読み取り段階にある。しかしながら、エンハン
サーは隣接している必要はない。結合は、好都合な制限部位でのライゲーション
反応により達成される。上記部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドア
ダプターまたはリンカーは、慣例に従い使用される。転写および翻訳調節核酸は
、一般にリンパ球活性化タンパク質の発現に使用される宿主細胞に適合する。例
えば、バチルス（Bacillus）由来の転写および翻訳調節核酸配列は、好ましくは
バチルス（Bacillus）でのリンパ球活性化タンパク質の発現に使用される。多様
なタイプの適当な発現ベクターおよび適当な調節配列が、様々な宿主細胞に関す
る当技術分野では知られている。

【００７５】 一般に、転写および翻訳調節配列は、プロモーター配列、リボソーム結合部位
、転写開始および停止配列、翻訳開始および停止配列、およびエンハンサーまた
はアクチベーター配列を含み得るが、これらに限定はされない。好ましい態様に
おいて、調節配列は、プロモーターおよび転写開始および停止配列を含む。

【００７６】 プロモーター配列は、構成的または誘導プロモーターをコードする。プロモー
ターは、天然プロモーターまたはハイブリッドプロモーターであり得る。複数の
プロモーターの要素をあわせもつハイブリッドプロモーターはまた、当業界でも
知られており、本発明において有用である。

【００７７】 さらに、発現ベクターは追加要素を含み得る。例えば、発現ベクターは２つの
複製系を有し得るため、２生物体、例えば、発現用の哺乳類または昆虫細胞およ
びクローニングおよび増幅用の原核生物宿主において維持され得る。さらに、組
込み発現ベクターの場合、発現ベクターは、宿主細胞ゲノムに相同的な少なくと
も１つの配列、および好ましくは発現構築物の両端に隣接する２つの相同性配列
を含む。組込みベクターは、ベクターでの封入に適した相同性配列を選択するこ
とにより宿主細胞における特異的座に指向され得る。組込みベクター用構築物は
当業界ではよく知られている。好ましい有効な相同性組換法は、例えば、ＰＣＴ
/ＵＳ９３/０３８６８およびＰＣＴ／ＵＳ９８／０５２２３２記載されたもので
あり、これら両方の引例を出典明示により本明細書の一部とする。

【００７８】 さらに、好ましい態様において、発現ベクターは、形質転換された宿主細胞の
選択を可能にする選択可能なマーカー遺伝子を含む。選択遺伝子は当業界では周
知であり、使用される宿主細胞により異なる。

【００７９】 好ましい発現ベクター系は、レトロウイルスベクター系、例えばＰＣＴ／ＵＳ
９７／０１０１９およびＰＣＴ／ＵＳ９７／０１０４８で全般的に記載されたも
のであり、これら両方を特に引用して説明の一部とする。

【００８０】 本発明のリンパ球活性化タンパク質は、リンパ球活性化タンパク質発現の誘導
または誘発に適した条件下、リンパ球活性化タンパク質をコードする核酸を含む
発現ベクターにより形質転換された宿主細胞を培養することにより製造される。
リンパ球活性化タンパク質発現に適した条件は、発現ベクターおよび宿主細胞の
選択により変動し、通常の実験を通じて当技術分野の技術者により容易に確認さ
れる。例えば、発現ベクターにおいて構成的プロモーターを使用する場合、宿主
細胞の増殖および増幅の最適化が必要とされ、誘導プロモーターを使用する場合
、誘導に適した成長条件が必要とされる。さらに、具体例によっては、採取の時
期が重要な場合もある。例えば、昆虫細胞発現で使用されるバクロウイルス系は
溶菌ウイルスであるため、採取時間の選択が生成物収率にとって重大となること
がある。

【００８１】 適当な宿主細胞には、酵母、細菌、古細菌、真菌および昆虫および動物細胞、
例えば哺乳類細胞を包含する。特に興味深いのは、ドロソフィラ・メランガスタ
ー（Drosophila melangaster）細胞、サッカロマイシス・セレヴィシアエ（Sacc
haromyses cerevisiae）および他の酵母、大腸菌、枯草菌、ＳＦ９細胞、Ｃ１２
９細胞、２９３細胞、ニューロスポラ（アカパンカビ、Neurospora）、ＢＨＫ、
ＣＨＯ、ＣＯＳおよびヒーラ細胞、線維芽細胞、神経鞘腫セルライン、不死化哺
乳類骨髄様およびリンパ様セルライン、ジャカット（Jurkat）細胞、神経細胞、
胸腺細胞、卵巣細胞、精巣細胞、子宮細胞、小腸細胞、ＰＢＬ細胞、リンパ様細
胞、骨髄細胞および肝臓細胞、そして免疫系を包含する全ての細胞である。

【００８２】 好ましい態様では、リンパ球活性化タンパク質は哺乳類細胞で発現される。哺
乳類発現系もまた当業界では公知であり、レトロウイルス系を含む。哺乳類プロ
モーターは、哺乳類ＲＮＡポリメラーゼに結合し、ｍＲＮＡへのリンパ球活性化
タンパク質に関するコード配列の下流（３'）転写を開始させ得るものであれば
いかなるＤＮＡ配列でもよい。プロモーターは、通常コード配列の５'末端近位
に配置されている転写開始領域、および転写開始部位上流に位置する２５−３０
塩基対を用いたＴＡＴＡボックスを有する。ＴＡＴＡボックスは、ＲＮＡポリメ
ラーゼIIに指令して正確な部位でのＲＮＡ合成を開始させると考えられている。
哺乳類プロモーターはまた、典型的にはＴＡＴＡボックスの上流１００ないし２
００塩基対内に位置する、上流プロモーター要素（エンハンサー要素）を含む。
上流プロモーター要素は、転写開始速度を決定し、いずれかの配向で作用し得る
。ウイルス遺伝子は高度に発現されることが多く広い宿主範囲を有するため、哺
乳類プロモーターとして特に使用されるものは、哺乳類ウイルス遺伝子由来のプ
ロモーターである。例としては、ＳＶ４０初期プロモーター、マウス乳癌ウイル
スＬＴＲプロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター、単純ヘルペスウ
イルスプロモーター、ＣＭＶプロモーターがある。

【００８３】 典型的には、哺乳類細胞により認識される転写終結およびポリアデニル化配列
は、転写停止コドンに対し３'に配置された調節領域であるため、プロモーター
要素と共存してコード配列の両端に隣接する。成熟ｍＲＮＡの３'末端は、部位
特異的翻訳後の開裂およびポリアデニル化により形成される。転写ターミネータ
ーおよびポリアデニル化シグナルの例としては、ＳＶ４０から誘導されたものが
ある。

【００８４】 外来核酸を哺乳類宿主および他の宿主に導入する方法は、当業界ではよく知ら
れており、使用される宿主により変化する。技術としては、デキストラン介在ト
ランスフェクション、燐酸カルシウム沈殿、ポリブレン介在トランスフェクショ
ン、プロトプラスト融合、電気穿孔法、ウイルス感染、リポソームにおけるポリ
ヌクレオチド（複数も可）封入、および核へのＤＮＡの直接顕微注入がある。

【００８５】 好ましい態様では、リンパ球活性化タンパク質は細菌系で発現される。細菌発
現系は当業界ではよく知られている。

【００８６】 適当な細菌性プロモーターは、細菌性ＲＮＡポリメラーゼに結合し、ｍＲＮＡ
へのリンパ球活性化タンパク質コード配列の下流（３'）転写を開始させ得る核
酸配列であればよい。細菌性プロモーターは、通常コード配列の５'末端近位に
配置された転写開始領域を有する。この転写開始領域は典型的にはＲＮＡポリメ
ラーゼ結合部位および転写開始部位を含む。代謝経路酵素をコードする配列から
は、特に有用なプロモーター配列が提供される。例としては、糖代謝性酵素、例
えば、ガラクトース、ラクトースおよびマルトースから誘導されたプロモーター
配列、および生合成酵素、例えば、トリプトファンから誘導された配列がある。
バクテリオファージからのプロモーターもまた使用され得、当業界では公知であ
る。さらに、合成プロモーターおよびハイブリッドプロモーターもまた有用であ
る。例えば、tacプロモーターは、trpおよびlacプロモーター配列のハイブリッ
ドである。さらに、細菌性プロモーターは、細菌性ＲＮＡポリメラーゼと結合し
、転写を開始させる能力を有する非細菌起源の天然プロモーターを含み得る。

【００８７】 機能性プロモーター配列に加えて、有効なリボソーム結合部位が望ましい。大
腸菌の場合、リボソーム結合部位は、シャイン‐デルガルノ（ＳＤ）配列と呼ば
れ、開始コドンおよび開始コドン上流３‐１１ヌクレオチドに位置する配列３−
９ヌクレオチド長を有する。

【００８８】 発現ベクターはまた、細菌においてリンパ球活性化タンパク質の分泌をもたら
すシグナルペプチド配列を含み得る。シグナル配列は、当業界でよく知られてい
るように、典型的には細胞からのタンパク質分泌を指令する疎水性アミノ酸によ
り構成されるシグナルペプチドをコードする。タンパク質は、成長培地（グラム
陽性菌）または細胞（グラム陰性菌）の内膜および外膜間にある周辺腔に分泌さ
れる。

【００８９】 細菌性発現ベクターはまた、形質転換された細菌株の選択を可能にする選択可
能マーカー遺伝子を含み得る。適当な選択遺伝子には、薬剤、例えば、アンピシ
リン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、カナマイシン、ネオマイシン
およびテトラサイクリンに対する耐性を細菌に付与する遺伝子がある。選択可能
マーカーはまた、生合成遺伝子、例えば、ヒスチジン、トリプトファンおよびロ
イシン生合成経路にあるものを含む。

【００９０】 これらの成分は発現ベクターへと構築される。細菌に関する発現ベクターは当
業界ではよく知られており、特に、そのなかでは枯草菌、大腸菌、ストレプトコ
ッカス・クレモリス（Streptococcus cremoris）およびストレプトコッカス・リ
ビダンス（Streptococcus lividans）に関するベクターを含む。

【００９１】 細菌性発現ベクターは、当業界でよく知られた技術、例えば、塩化カルシウム
処理、電気穿孔法などを用いて細菌宿主細胞に形質転換される。

【００９２】 ある態様において、リンパ球活性化タンパク質は昆虫細胞で製造される。昆虫
細胞の形質転換用発現ベクターおよび特にバキュロウイルス由来の発現ベクター
は、当業界でもよく知られている。

【００９３】 好ましい態様では、リンパ球活性化タンパク質は酵母細胞で製造される。酵母
発現系は当業界では十分知られており、サッカロマイシイス・セレヴィシアエ（
Saccharomyces cerevisiae）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）お
よびカンジダ・マルトーサ（C. maltosa)、ハンセヌラ・ポリモルファ(Hansenul
a polymorpha)、クルイヴェロマイシス・フラギリス（Kluyveromyces fragilis
）およびクルイヴェロマイシス・ラクティス（K. lactis）、ピキア・ギレリモ
ンディ（Pichia guillerimondii）およびピキア・パストリス（P. Pastoris）、
シゾサッカロマイシス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）およびヤロウィ
ア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）に関する発現ベクターがある。酵母
における発現に好ましいプロモーターには、誘導性ＧＡＬ１,１０プロモーター
、アルコールデヒドロゲナーゼ、エノラーゼ、グルコキナーゼ、グルコース−６
−燐酸イソメラーゼ、グリセルアルデヒド−３−燐酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソ
キナーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビ
ン酸キナーゼおよび酸性ホスファターゼ遺伝子由来のプロモーターがある。酵母
選択可能マーカーには、ＡＤＥ２、ＨＩＳ４、ＬＥＵ２、ＴＲＰ１およびＡＬＧ
７（これはツニカマイシンに対する耐性を付与する）、Ｇ４１８に対する耐性を
付与するネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、および銅イオンの存在
下で酵母を成長させ得るＣＵＰ１遺伝子がある。

【００９４】 リンパ球活性化タンパク質はまた、当業界で十分知られている技術を用い、融
合タンパク質として製造され得る。すなわち、例えば、モノクローナル抗体を作
製するためには、所望のエピトープが小さい場合、リンパ球活性化タンパク質を
担体タンパク質と融合させて免疫原を形成することもできる。別法として、リン
パ球活性化タンパク質は、発現増強または他の理由のために融合タンパク質とし
て製造され得る。例えば、リンパ球活性化タンパク質がリンパ球活性化ペプチド
であるとき、ペプチドをコードする核酸は、発現を目的として他の核酸に連結さ
れ得る。同様にして、本発明のリンパ球活性化タンパク質は、タンパク質標識物
、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、黄色
蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）などに結合される。

【００９５】 ある態様では、本発明のリンパ球活性化核酸、タンパク質および抗体を標識さ
化する。ここで「標識化した」とは、化合物に少なくとも１つの成分、同位体ま
たは化学的化合物を結合させて化合物の検出を可能にすることを意味する。一般
に、標識は３種類、すなわちａ）放射性または重同位元素であり得る同位元素標
識、ｂ）抗体または抗原であり得る免疫標識、およびｃ）着色または蛍光染料、
に分類される。標識は化合物のいずれかの位置に組込まれ得る。

【００９６】 好ましい態様では、リンパ球活性化タンパク質は発現後に精製または単離され
る。リンパ球活性化タンパク質は、別のどんな成分が試料中に存在するかによっ
て、当業界の技術者に周知の様々な方法で単離または精製され得る。標準的な精
製方法には、電気泳動、分子、免疫学的およびクロマトグラフィー技術があり、
例えば、イオン交換、疎水性、アフィニティーおよび逆相ＨＰＬＣクロマトグラ
フィーおよびクロマトフォーカシングが含まれる。例えば、リンパ球活性化タン
パク質は、標準抗リンパ球活性化抗体カラムを用いて精製され得る。タンパク質
濃度との関連で限外濾過およびダイアフィルトレーション技術を用いても有用で
ある。適当な精製技術における一般的ガイダンスについては、Scopes,R.、Prote
in Purification、Springer-Verlag、ニューヨーク（1982）参照。必要な精製度
合いは、リンパ球活性化タンパク質の用途により異なる。精製が必要ではない場
合もある。

【００９７】 発現させて、必要であれば精製して、リンパ球活性化タンパク質および核酸は
、様々な用途に適用し得る。

【００９８】 リンパ球活性化タンパク質をコードする核酸配列（または、その相補配列）は
、分子生物学の分野で多様な用途を持ち、またハイブリダイゼーションプローブ
としての使用を含む、アンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡの生成において、および
染色体ならびに遺伝子地図において多様な用途がある。リンパ球活性化タンパク
質核酸はまた、本明細書中に記載の組換え技術によるリンパ球活性化タンパク質
ポリペプチドを調製するのに有用である。

【００９９】 完全長の天然配列リンパ球活性化タンパク質遺伝子またはその断片を、完全長
のリンパ球活性化タンパク質遺伝子を単離するための、またはリンパ球活性化タ
ンパク質コード配列と同一の所望の配列を有する別の遺伝子（例えば、天然に存
在するリンパ球活性化タンパク質または別の種由来のリンパ球活性化タンパク質
をコードするもの）を単離するための、ｃＤＮＡライブラリー用のハイブリダイ
ゼーションプローブとして使用してもよい。任意には、プローブの長さは、約２
０〜約５０塩基である。ハイブリダイゼーションプローブは、明細書中の核酸配
列から、またはプローモーター、エンハンサー配列およびここで提供される本来
の配列をもつイントロンを含む遺伝子配列から誘導され得る。実施態様方法によ
ると、スクリーニング方法は、約４０塩基程度の選択されたプローブを合成する
ために既知のＤＮＡ配列を用いるリンパ球活性化タンパク質遺伝子のコード領域
の単離を含む。ハイブリダイゼーションプローブは、様々な標識物、例えば、^{３ ２} Ｐまたは^３５Ｓのような同位元素またはアビジン／ビオチンカップリング系に
よるプローブとカップリングしたアルカリホスファターゼなどの酵素標識物によ
って標識化され得る。本発明のリンパ球活性化タンパク質遺伝子の配列と相補的
な配列を持つ標識プローブを用いて、ヒトｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮ
Ａのライブラリーをスクリーンし、かかるライブラリーのどのメンバーにプロー
ブがハイブリダイズするかを決定し得る。

【０１００】 該プローブは、密接に関連したリンパ球活性化タンパク質コード配列の同定用
の配列のプールを発生させるために、ＰＣＲ技術においても使用され得る。

【０１０１】 また、リンパ球活性化タンパク質をコードする核酸配列を用いて、リンパ球活
性化タンパク質をコードする遺伝地図用および遺伝子異常を持つ個人の遺伝子診
断用のハイブリダイゼーションプローブを構築することも可能である。ここで、
提供された核酸配列は、従来技術、例えば、細胞内ハイブリダイゼーション、公
知の染色体マーカーに対する結合分析およびライブラリーを使用したハイブリダ
イゼーションスクリーニングを用いて、染色体および染色体の特定領域の地図を
作成することも可能である。

【０１０２】 また、リンパ球活性化タンパク質または該修飾形態をコードする核酸は、形質
転換動物または「ノック・アウト」動物を作るのに使用することもでき、言い換
えると、治療的有用な薬剤の開発およびスクリーニングにおいても有用である。
非ヒト形質転換動物（例えば、マウスまたはラットなど）は、形質転換遺伝子を
含む細胞を有する動物であり、その形質転換遺伝子は、動物または出生前の（例
えば胚の段階）動物の胎児に導入される。形質転換遺伝子は、形質転換動物が発
生する細胞のゲノムに組み込まれたＤＮＡである。ある態様では、リンパ球活性
化タンパク質をコードするｃＤＮＡは、確立された技術に従って、リンパ球活性
化タンパク質をコードするゲノムＤＮＡをクローン化するために使用され、その
遺伝子配列は所望のＤＮＡを発現する細胞を含有する形質転換遺伝子動物に用い
られる。形質転換動物、特にマウスまたはラットのような動物を製造するための
方法は、通常の技術となり、例えば、米国特許番号４,７３６,３８６６および４
,８７０,００９２記載されている。通常、特定細胞は、組織特異的エンハンサー
とリンパ球活性化タンパク質形質転換遺伝子のとりこみについて標的とされる。
胚段階で動物の胚系に導入されたリンパ球活性化タンパク質をコードする形質転
換遺伝子のコピーを含む形質転換動物は、所望の核酸の発現増加効果を検査する
ために使用できる。かかる動物は、その過剰発現と関連した病理学的条件などか
らの防御を付与すると考えられる薬剤について、試験用動物として使用し得る。
本発明のこの点に関して、動物を該薬剤で処置したときに、病理学的条件の発生
が形質転換遺伝子をもつ非処置動物と比べて低下すると、病理学的条件に対する
潜在的な治療学効果が関与したことを示す。

【０１０３】 あるいは、リンパ球活性化タンパク質の非ヒト相同体は、リンパ球活性化タン
パク質をコードする内在性遺伝子と動物の胚細胞中に導入されるリンパ球活性化
タンパク質をコードする改変ゲノムＤＮＡとの相同性のある組換えの結果として
リンパ球活性化タンパク質をコードする不完全または改変遺伝子を持つリンパ球
活性化タンパク質「ノック・アウト」動物を構築するために使用し得る。例えば
、リンパ球活性化タンパク質をコードするｃＤＮＡは、確立された技術に従って
リンパ球活性化タンパク質をコードするゲノムＤＮＡをクローン化するために使
用し得る。リンパ球活性化タンパク質をコードするゲノムＤＮＡの一部分は、モ
ニターインテグレーションを用い得る選択マーカーをコードする遺伝子などの別
の遺伝子を用いて削除または置換し得る。通常、改変されない両端のＤＮＡ（５
'および３'の両末端）の数キロの塩基配列は、ベクターに含まれる[参照：Thoma
s and Capecchi, Cell, 51:503(1987)、相同性組換えベクターの説明]。ベクタ
ーは、胚軸細胞系に導入され（例えば、エレクトロポーレーション）、内在性Ｄ
ＮＡと相同的に再結合した導入されたＤＮＡをもつ細胞が選択される[参照：例
えば、Li et al. Cell,69:915(1992)]。次いで、選択された細胞は、動物（参照
：例えば、マウスまたはラット）の胚盤胞内に注入され、キメラ集合体を形成す
る[(参照：Bradley, in Treratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Prac
tical Approach, E. J. Robertson編(IRL, Oxford, 1987), pp.113-152]。次い
で、キメラ胚は、適当なメスの飼育動物に移植され、該胚は、「ノック・アウト
」動物を構築するような期間を経過させる。その細菌細胞で相同的に組替えたＤ
ＮＡを運ぶ子孫は、標準的技術によって同定され、該動物細胞の全てが、相同的
に組換えたＤＮＡを含む動物を繁殖するために使用され得る。ノック・アウト動
物は、リンパ球活性化タンパク質ポリペプチドが存在しないため、例えば、ある
病理学的条件に対して防御能力に関して、および病理学的条件のその開発に関し
て特性を付与され得る。

【０１０４】 リンパ球活性化タンパク質をコードする核酸、アンタゴニストまたはアゴニス
トもまた、遺伝子治療に使用され得る。遺伝子治療の用途において、遺伝子は、
治療学的に有効な遺伝子産物（例えば、置換または欠失遺伝子）の合成をインビ
ボで達成するように細胞に導入される。「遺伝子治療」とは、持続効果が単一処
置によって達成される場合の従来の遺伝子治療、および治療学的に有効なＤＮＡ
またはｍＲＮＡを一回投与または反復投与を含む遺伝子治療剤の投与、双方を含
む。アンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡは、インビボでの特定遺伝子の発現を防止
するための処置剤として使用され得る。短いアンチセンスオリゴヌクレオチドは
、阻害剤として作用する細胞に送達され得るが、その細胞内の低い濃度が細胞膜
によって制限された取り込みによって生じることは既に示されている[Zamecnik
ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83,4143-4146(1996)]。オリゴヌクレオチドは
、取り込みを増強するように修飾され得る（例えば、その負電荷ホスホジエステ
ル基を非電荷で置換する）。

【０１０５】 生存細胞中に核酸を導入するために利用できる多様な技術がある。該技術は、
核酸が意図された宿主細胞においてインビトロまたはインビボの培養細胞中に送
達されるかどうかによって異なる。哺乳動物細胞への核酸送達のために適当な技
術は、リポソーム、エレクトロポーレーション、マイクロ注入、細胞融合、ＤＥ
ＡＥデキストリン、リン酸カルシウム沈殿法などである。近年好まれるインビボ
遺伝子組換え技術は、ウイルス（通常、レトロウイルス）ベクターを用いるトラ
ンスフェクションおよびトランスフェクションを介在するベクター被覆タンパク
質リポソームを含む[Dzauら、Trends in Biotechnology 11,205-210(1993)]。あ
る状況下では、細胞表面の膜タンパク質または標的細胞に特異的な抗体などの標
的細胞を標的とする物質、即ち、標的細胞上の受容体に対するリガンドを核酸源
に提供することが望ましい。リポソームを用いる場合、エンドサイトーシスと関
連のある細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質は、標的化および／または
取込み（例えば、キャップシドタンパク質または特別な細胞型にたいするその屈
性断片、サイクル中に内部取り込みをうけるタンパク質に対する抗体、細胞内局
在化を標的し、細胞内半減期を強めるタンパク質）を容易にするために利用され
得る。受容体介在エンドサイトーシスの技術は、例えばWuら、J.Biol.Chem262,
4429-4432 (1987）およびWaggenrら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3410-34
14(1990) によって記載されている。遺伝子標識および遺伝子治療プロトコール
の概要については、Andersonら、Science 256,808-813(1992)を参照する。

【０１０６】 好ましい態様では、リンパ球活性化タンパク質、核酸、修飾タンパク質および
本来のまたは修飾されたリンパ球活性化タンパク質を含む細胞は、スクリーニン
グアッセイで使用され得る。この重要なＴ細胞およびＢ細胞活性化タンパク質の
同定によって、リンパ球活性化活性を調節する化合物に対する薬物スクリーニン
グの設計が可能になる。

【０１０７】 スクリーンは、最初にリンパ球活性化タンパク質に結合し得る候補物質を見出
すように設計され、次いで、その物質が、リンパ球活性化活性を調節するための
候補物質の能力を評価するアッセイで使用され得る。このため、当業者には公知
のように、極めて多様な実施し得るアッセイ法、結合アッセイおよび活性アッセ
イが存在する。

【０１０８】 このようにして、好ましい態様では、該方法はリンパ球活性化タンパク質と候
補バイオ活性物質とを組み合わすこと、および候補物質とリンパ球活性化タンパ
ク質との結合を測定することを含む。好ましい態様は、ヒトのリンパ球活性化タ
ンパク質を利用するが、他の哺乳動物、例えば、げっし類（マスウ、ラット、ハ
ムスター、モルモット、馬など）および霊長類のタンパク質もまた使用し得る。
ヒトの疾病に関する動物モデルの開発には、これら後者の態様が好まれる。ある
態様では、本明細書で説明するように、上記のような欠失リンパ球活性化タンパ
ク質を含む変異体または誘導体リンパ球活性化タンパク質が使用され得る。

【０１０９】 「候補バイオ活性物質」および「外因性化合物」なる用語は、本明細書中で使
用するとき、直接または間接的にリンパ球活性化タンパク質のバイオ活性を変化
させる能力を有する、すべての分子、例えば、タンパク質、オリゴペプチド、有
機小分子、多糖類、ポリヌクレオチド、その他を意味する。一般に、各種濃度に
対応して示差応答が得られるように、複数のアッセイ混合物を異なる物質濃度で
並行して進める。典型的には、これらの濃度の１つをネガティブコントロール、
即ち、ゼロ濃度または検出限度以下のものとする。

【０１１０】 候補物質は、多種類の化学物質を包含するが、典型的には、有機分子、好まし
くは分子量が１００以上で約２５００ダルトン以下の分子量を持つ小型の有機化
合物である。候補物質は、タンパク質との構造的相互作用、特に水素結合に必要
な各官能性基、そして典型的には少なくとも１種のアミン、カルボニル、ヒドロ
キシルまたはカルボキシル基、好ましくは少なくとも２種の化学的官能性基を含
む。候補物質はしばしば上記官能性基の１種またはそれ以上で置換されている環
状の炭素またはヘテロ環式構造、および／または芳香性またはポリ芳香性構造を
含む。候補物質は、ペプチド、サッカライド、脂肪酸、ステロイド、プリン類、
ピリミジン類、を含むバイオ分子、それらの誘導体、構造類似体またはそれらの
組合わせ中にも見出される。特に好ましいのはペプチドである。

【０１１１】 候補物質は、合成または天然化合物のライブラリーを含む広範囲のソースから
得られる。例えば、ランダム化オリゴヌクレオチド発現を含め、広範な有機化合
物およびバイオ分子の無差別なまたは指向性の合成に多様な手段を利用できる。
あるいは、細菌、真菌、植物および動物抽出物の形態で、天然化合物のライブラ
リーを入手または容易に生産できる。加えて、天然にまたは合成的に得たライブ
ラリーや化合物を、通常の化学的、物理的および生化学的手段を通じて容易に修
飾できる。既知の薬理学的物質も、指向性またはランダムな化学修飾に供し、例
えばアシル化、アルキル化、エステル化、アミド化して構造類似体を生成させる
ことができる。

【０１１２】 好ましい実施態様では、候補バイオ活性物質はタンパク質である。本明細書中
で「タンパク質」とは、少なくとも２つの共有結合しているアミノ酸を意味し、
タンパク、ポリペプチド、オリゴペプチドおよびペプチドを含むものである。タ
ンパク質は、天然に存在するアミノ酸やペプチド結合、あるいは合成的な偽ペプ
チド構造状のものなどから構成されているものであってもよい。従って、「アミ
ノ酸」あるいは「ペプチド残基」とは、本明細書中で用いるとき、天然に存在す
るアミノ酸および合成アミノ酸の両方を意味している。例えば、ホモ−フェニル
アラニン、シトルリンおよびノルロイシンは、本発明の目的に沿うアミノ酸と考
えられる。「アミノ酸」またはイミノ酸残基、例えば、プロリンおよびヒドロキ
シプロリンをも含む。側鎖は（Ｒ）または（Ｓ）配置であり得る。好ましい実施
態様では、アミノ酸は（Ｓ）またはＬ配置である。天然には存在しない側鎖を用
いる場合、非アミノ酸置換基を、例えば、インビボでの分解の防止または遅延の
ために使用し得る

【０１１３】 好ましい実施態様では、候補バイオ活性物質は、天然に存在するタンパク質ま
たは天然に存在するタンパク質の断片である。従って、例えば、タンパク質を含
有する細胞抽出物、あるいはタンパク質生細胞抽出物の無差別または指向性消化
物を使用できる。このようにして、原核性および真核性タンパク質のライブラリ
ーを、リンパ球活性化に対するスクリーニングのために調製することができる。
この実施態様で特に好ましいのは、細菌、真菌、ウイルス、および哺乳類のタン
パク質のライブラリーであり、後者が好ましく、ヒトタンパク質が特に好ましい
ものである。

【０１１４】 好ましい実施態様では、候補バイオ活性物質は、約５ないし約３０アミノ酸の
ペプチドであり、約５ないし約２０アミノ酸のものが好ましく、そして約７ない
し約１５のものが特に好ましいものである。該ペプチドは、上述のように、天然
に存在するタンパク質の消化物である、ランダムペプチドまたは「偏らせた」ラ
ンダムペプチドであり得る。「ランダム化した」あるいはその同義語は、本明細
書中で使用するとき、各核酸及びペプチドが、ランダムなヌクレオチド群及びア
ミノ酸群からそれぞれ主に構成されていることを意味する。一般に、これらのラ
ンダムなペプチド類（または以下で述べる核酸類）は、化学的に合成されたもの
であるため、それらは任意のヌクレオチドやアミノ酸を任意の位置に導入するこ
ととなる。合成プロセスは、ランダム化したタンパク質や核酸を生成するように
設計でき、配列の全長に亘って可能性のある組合わせのすべてあるいは大部分を
形成させ、このようにして、ランダム化した候補バイオ活性物質のライブラリー
を形成させることができる。

【０１１５】 ある実施態様では、このライブラリーは、完全にランダム化しており、いかな
るなる位置においても全く配列選好や定数をもたない。好ましい実施態様では、
ライブラリーは偏らせたものである。それは、配列中の数カ所が、一定化されて
いるかまたは限られた種類の可能性から選択されているかである。例えば、好ま
しい実施態様では、これらのヌクレオチドまたはアミノ酸残基は、システインの
創製に対して、架橋結合のために、ＳＨ−３ドメインに対するプロリン、リン酸
化部位に対するセリン、スレオニン、チロシンまたはヒスチジン等、またはプリ
ン類などのために、例えば、疎水性アミノ酸、親水性残基、立体的に偏らせた（
小さくまたは大きく）残基などの、決まった種類内でランダム化されている。

【０１１６】 好ましい実施態様では、候補バイオ活性物質は、核酸である。「核酸」または
「オリゴヌクレオチド」またはそれらの同義語は、本明細書で用いるとき、少な
くとも２つの互いに共有結合しているものを意味する。本発明の核酸は、一般に
リン酸ジエステル結合を含有するが、ある場合には、以下に述べるように、核酸
類似体を含む。それらは、例えば、下記の別の骨格を有するものを含む；ホスホ
アミド(phosphoramide)(Beaucage, et.al., Tetrahedron, 49, (10) ; 1925 (19
93) およびその参照文献； Letsinger, J. Org. Chem. 35:3800(1970); Sprinzl
, et. al., Eur. J. Biochem.81:579(1977);Letsinger, et. al., Nucl. Acids
Res., 14: 3487 (1986); Sawai, et. al., Chem. Lett. 805 (1984), Letsinger
, et. al., J. Am. Chem. Soc., 110: 4470 (1988); and Pauwels et. al., Che
mica Scripta, 26: 141 (1986))、ホスホロチオエート（Mag, et. al., Nucl. A
cids Res.,19: 1437 (1991); and U.S. Patent No. 5644048）、ホスホロジチオ
エート（Briu, et. al., J. Am. Chem. Soc., 111: 2321 (1989))、Ｏ−メチル
ホスホロアミダイト結合（Eckstein, Oligonucleotides and Analogues: A Prac
tical Approach, Oxford University Press 参照）、並びに、ペプチド核酸骨格
および結合（Egholm, J. Am. Chem. Soc., 114: 1895 (1992); Meier, et. al.,
Chem. Int. Engl., 31: 1008 (1992); Nielsen, Nature, 365: 566 (1993); Ca
rlsson, et. al., Nature, 380:207(1996)参照）、これらは全て参照して本書記
載の一部とする）。その他の類似核酸にはポジティブ骨格を有するもの（Denpcy
, et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 6097 (1995)); 非イオン性骨格
（U.S. Patent Nos. 5,386,023; 5,637,684; 5,602,240; 5,216,141;および4,46
9,863; Kiedrowshi, et. al., Angew. Chem. Intl. Ed. English, 30: 423(1991
); Letsinger, et. al., J. Am. Chem. Soc.,110: 4470 (1988); Letsinger, et
. al.,Nucleotide&Nucleotide, 13: 1597 (1994); Chapters 2 and 3, ASC Symp
osium Series 580,"Carbohydrate Modificationsin Antisense Research" Ed. Y
. S. Sanghui and P. Dan Cook; Mesmaeker, et. al., Bioorganic & Medical C
hem Lett., 4: 395 (1994); Jeffs, et. al., J. Biomolecular NMR, 34: 17 (1
994); Tetrahedron Lett., 37: 743 (1996)）、および、以下に記載のものを含
む非リボース骨格（U.S. Patent Nos.5,235,033 and 5,034,506 and Chapters 6
and 7, ASC Symposium Series 580, "Carbohydrate Modification Antisense R
esearch" Ed. Y. S. Sanghui and P. Dan Cook）が含まれる。１以上の炭素環糖
類を含有する核酸類もまた、核酸の定義に含まれる（Jenkins, et. al., Chem.
Soc. Rev., (1995) pp. 169-176 参照）。数種の核酸類似体が（Rawls, C & E N
ews, June 2, 1997, page 35）に記載されている。これらの引用文献は出典明示
により本明細書中の一部とする。これらのリボース−フォスフェート骨格の修飾
を行うと、付加成分、例えば標識の付加を容易にし、また、物理的環境における
それら分子の安定性及び半減期を増加させることができる。さらに、天然に存在
する核酸類とその類似体との混合物を調製することもできる。あるいは、異なる
核酸類似体の混合物と、天然に存在する核酸類と類似体との混合物、との混合物
を調製することもできる。これらの核酸は、一本鎖または二本鎖であっても、ま
た二本鎖または一本鎖配列両方の部分を含有していてもよい。核酸は、ゲノムＤ
ＮＡおよびｃＤＮＡの両方のＤＮＡであってもよく、ＲＮＡまたはハイブリッド
でもよく、それらにおいて核酸は、デオキシリボ−およびリボ−ヌクレオチド類
の任意の組合わせ、および、ウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン
、イノシン、キサンチン（xathanine）、ヒポキサンチン(hypoxathanine)、イソ
シトシン、イソグアニンなどを含む塩基の任意の組合わせを含む。

【０１１７】 タンパク質について一般的に上述したように、核酸候補バイオ活性物質は天然
に存在する核酸、ランダム核酸，または「偏らせた」ランダム核酸であり得る。
例えば、原核生物のまたは真核生物の染色体の消化物が、タンパク質について上
述したように使用できる。

【０１１８】 好ましい実施態様では、候補バイオ活性物質は、文献的に入手可能な多様な種
類の有機化学成分である。

【０１１９】 本明細書中の「アッセイ」は、明細書中で定義したようなリンパ球活性化タン
パク質を利用し、好ましい実施態様では、リンパ球活性化タンパク質活性を有す
る部分が用いられる。さらに、明細書中に記載されたアッセイは、単離したリン
パ球活性化タンパク質またはリンパ球活性化タンパク質を含む細胞のいずれかを
利用することが可能である。

【０１２０】 一般的に、本明細書中の好ましい態様では、リンパ球活性化細胞表面受容体ま
たは候補物質は、単離した試料の受容面積を有する不溶性支持体（例えば、マイ
クロタイタープレート、アレイなど）に非拡散的に結合している。溶性アッセイ
、例えば、結合などによって検出され得るアッセイもまた使用され得ると解され
る。不溶性支持体は、それに組成物が結合でき、容易に可溶性物質から分離でき
、スクリーニング方法の全工程で他と適合性のある任意の組成物から製造され得
る。それらの支持体の表面は、任意の都合のよい形状の固体または多孔性であり
得る。好適な不溶性支持体の例は、マイクロタイタープレート、アレイ、膜およ
びビーズなどである。これらは、通常、ガラス、プラスチック（例えばポリスチ
レン）、多糖類、ナイロンまたはニトロセルロース、テフロン^ＴＭ製などである
。マイクロタイタープレートおよびアレイは、同時に多数のアッセイを少量の試
薬および試料を用いて実施できるので特に便利である。組成物を結合する特定の
方法は、試薬や本発明の全工程に適合し、組成物の活性を維持しかつ非拡散的で
ある限り限定的なものではない。好ましい結合方法には、抗体（それらは、リン
パ球活性化タンパク質が該支持体に結合してもリガンド結合部位または活性化配
列を立体的にブロックしないものである）、「粘着性」またはイオン性支持体へ
の直接結合、化学的架橋結合、表面上でのリンパ球活性化タンパク質または物質
の合成、などの使用が含まれる。いくつかの態様では、ＳＷＡＰまたはＪＥＳＴ
を用い得る。当該タンパク質または物質の結合につづいて、過剰の非結合物質を
洗浄により除去する。次いで、試料受容面積は、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、
カゼインまたは他の無害タンパク質または他の成分とインキュベートして遮断す
る。

【０１２１】 好ましい態様では、リンパ球活性化タンパク質は、支持体に結合され、候補バ
イオ活性剤がこのアッセイに添加される。または、候補物質が支持体と結合され
、リンパ球活性化タンパク質が添加される。新規な結合物質は、特異的抗体、化
学的ライブラリーのスクリーニングで同定された非天然結合物質、ペプチド類似
体、などを含む。特に有利なのは、ヒト細胞への低い毒性を示す物質に関するス
クリーニングアッセイである。非常に広範なアッセイは、当該目的のために使用
し得る。電気泳動易動度シフトアッセイ、タンパク質結合の免疫アッセイ、機能
性アッセイ[リン酸化（ホスホリレーション）アッセイなど]および類似法を含む
、広範な種類のアッセイをこの目的のために使用できる。

【０１２２】 候補バイオ活性物質のリンパ球活性化受容体への結合のアッセイは、多種類の
方法で実施できる。好ましい実施態様では、候補バイオ活性物質を標識し、結合
を直接測定する。例えば、これは、リンパ球活性化タンパク質の全部または一部
を固体支持体に結合させ、標識化した候補物質を加え（例えば、蛍光標識）、過
剰の試薬を洗い落とし、個体支持体上に標識が存在するかどうか測定することに
より実施できる。当業界で知られているように、多様なブロッキングおよび洗浄
工程を使用できる。

【０１２３】 本明細書中で使用し得る「標識化」とは、その化合物が直接または間接的に、
検出可能なシグナル、例えば、放射能、蛍光、酵素、抗体、磁性粒子のような粒
子、化学発光剤、または特異的結合分子、などを提供する標識で標識化されてい
ることを意味する。特異的結合分子には、ビオチンとストレプタビジン、ジゴキ
シンとアンチジゴキシン、等の対が含まれる。特異的結合メンバーでは、上記し
たように、既知操作に従って、相補的メンバーを検出付与分子で標識する。標識
は直接または間接的に検出可能なシグナルを提供する。

【０１２４】 多くの実施態様では、成分中の１種だけを標識する。例えば、タンパク質（ま
たはタンパク質性候補物質）をチロシン位で¹²⁵Ｉまたはフルオロフォアで標識
することができる。あるいは、１種以上の成分を異なる標識で、例えば、タンパ
ク質に対しては¹²⁵Ｉを使用し、候補物質に対してはフルオロフォアを使用して
標識することができる。

【０１２５】 あるいは、１より多い成分を異なる標識により標識し得る; 例えば、タンパク
質について^１２５Ｉ、および候補物質について蛍光団を使用する。

【０１２６】 好ましい実施態様において、候補バイオ活性物質の結合を競合的結合アッセイ
の使用によって測定する。この実施態様において、競合成分は、標的分子(リン
パ球活性化分子)へ結合することが知られている結合部分である。それは例えば
、抗体、ペプチド、結合パートナー、リガンドなどである。好ましい実施態様に
おいて、競合成分はＳＷＡＰまたはＪＥＳＴである。ある状況下で、バイオ活性
物質と結合部分の間のような競合的結合が存在し、結合部分が、バイオ活性物質
を置換している。このアッセイを、候補物質を定量するために使用することがで
きる。候補物質は、リンパ球活性化タンパク質とＳＷＡＰまたはＪＥＳＴの間の
結合を妨げるものである。

【０１２７】 ある実施態様において、候補バイオ活性物質を標識する。候補バイオ活性物質
または競合成分のいずれか、または両方を、結合が生じる場合それに十分なだけ
の時間、タンパク質にまず加える。最適活性を促進する任意の温度、典型的には
４ないし４０℃でインキュベーションを実施し得る。インキュベーション時間を
最適活性のために選択する。しかし、迅速高度スクリーニングを容易にするため
に最適化してもよい。典型的には、０.１ないし１時間で十分である。過剰の試
薬を一般的には除去しまたは洗い落とす。次いで、第２成分を加えると標識成分
の存否が起こり、結合を指標する。

【０１２８】 好ましい実施態様において、先ず競合成分を加え、次いで候補バイオ活性物質
を加える。競合成分の置換は、候補バイオ活性物質がリンパ球活性化タンパク質
と結合していること、および結合してリンパ球活性化タンパク質の活性を調節し
得ることの指標である。この実施態様において、いずれかの成分を標識できる。
従って、例えば、競合成分を標識する場合、洗浄液中の標識存在がバイオ活性物
質による置換を示す。あるいは、候補バイオ活性物質を標識する場合、支持体上
の標識の存在が置換を示す。

【０１２９】 別の実施態様においては、まず候補バイオ活性物質を加え、インキュベーショ
ンし、洗浄した後、競合成分を加える。競合成分による結合の不存在は、バイオ
活性物質が高い親和性でリンパ球活性化タンパク質に結合していることを示す。
従って、候補バイオ活性物質を標識する場合、支持体上の標識の存在は、競合成
分結合の欠如と相俟って、候補物質がリンパ球活性化タンパク質と結合し得るこ
とを示す。

【０１３０】 好ましい実施態様において、これらの方法は、リンパ球活性化タンパク質の活
性を調節する能力のあるバイオ活性物質を同定するための示差スクリーニングを
含む。この実施態様において、これらの方法は、リンパ球活性化タンパク質と競
合成分とを第１試料中で合わせることを含む。第２試料は、候補バイオ活性物質
、リンパ球活性化タンパク質および競合成分を含む。競合成分の結合を両試料に
ついて測定すると、２試料間の結合の変化または差異により、リンパ球活性化タ
ンパク質への結合能力があり活性を調節する可能性のある物質の存在がわかる。
即ち、競合成分の結合が第１試料に比べて第２試料中で異なっているならば、バ
イオ活性物質はリンパ球活性化タンパク質と結合する能力がある。

【０１３１】 あるいは、好ましい実施態様において、天然リンパ球活性化タンパク質には結
合するが、修飾リンパ球活性化タンパク質には結合することのできない医薬候補
を同定するために示差スクリーニングを利用する。リンパ球活性化タンパク質の
構造をモデル化し、その部位と相互作用する物質を合成するための理論的医薬設
計に使用し得る。リンパ球活性化生物活性に影響を及ぼす医薬候補を、タンパク
質の活性を増強または減少させる能力についての医薬のスクリーニングによって
も同定する。

【０１３２】 これらのアッセイでは、ポジティブコントロールおよびネガティブコントロー
ルを使用し得る。好ましくは、全てのコントロールおよび試験検体を少なくとも
各３反復で処理し、統計的に有意な結果を得る。全試料のインキュベーションを
バイオ活性物質のタンパク質への結合に十分な時間行う。インキュベーションに
つづいて全試料を非特異的結合材がなくなるまで洗浄し、結合物質、一般的には
標識物質の量を測定する。例えば、放射性標識を採用する場合、試料をシンチレ
ーションカウンターで計量して、結合化合物の量を決定する。

【０１３３】 スクリーニングアッセイは、他の多種類の試薬も含み得る。それらには、塩類
、中性タンパク質、例えば、アルブミン、洗浄剤などの試薬があり、最適のタン
パク質−タンパク質結合を容易化し、および／または、非特異的またはバックグ
ラウンド相互作用を減少させ得る。あるいは、アッセイの効率を改善する試薬を
使用してもよい。それらは、例えば、プロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤
、抗微生物剤などである。これらの成分の混合は、必要な結合を生じる任意の順
序で加えてもよい。

【０１３４】 本発明で提供されるアッセイについての成分を合わせて、キットをつくり得る
。そのキットは、タンパク質および／またはリンパ球活性化タンパク質をコード
する核酸の使用に基づくことができる。核酸の使用に関するアッセイを以下にさ
らに記載する。

【０１３５】 リンパ球活性化の活性を調節する物質のスクリーニングもなし得る。ある好ま
しい実施態様において、リンパ球活性化の活性を調節することのできるバイオ活
性物質についてのスクリーニングの方法は、以下の工程を含む。それは、前記の
ように、候補バイオ活性物質をリンパ球活性化タンパク質の試料へ添加すること
、およびリンパ球活性化タンパク質の生物学的活性における変化を測定すること
である。「リンパ球活性化タンパク質の活性を調節すること」は、活性の増加、活
性の減少、または存在する活性の型もしくは種類の変化を含む。故に、この実施
態様において、候補物質は、リンパ球活性化(これは必須ではなくてよいが)に結
合し、かつ本発明で特定されるような生物学的または生化学的活性を変化させて
いる。その方法は、インビトロ・スクリーニング法(前記で概説)、および細胞の
インビボ・スクリーニングの双方を含み、リンパ球活性化タンパク質の存在、分
布、活性または量における変化に関する。

【０１３６】 そして、この実施態様において、その方法は、リンパ球活性化試料および候補
バイオ活性物質を合わせること、並びにＴ細胞およびＢ細胞活性化への影響を定
量することを含む。ここで、「リンパ球活性化活性」または文法的に等価な記載は
、リンパ球活性化タンパク質の生物学的活性の１つを意味する。それはＴ細胞お
よびＢ細胞活性化に影響を及ぼす能力を含むが、これに限定されない。ここで、
１つの活性は、ＳＷＡＰまたはＪＥＳＴへ結合する能力である。

【０１３７】 好ましい実施態様において、リンパ球活性化タンパク質の活性は増大する; も
う１つの好ましい実施態様において、リンパ球活性化タンパク質の能力は減少す
る。故に、アンタゴニストであるバイオ活性物質は、ある実施態様において好ま
しい。そしてアゴニストであるバイオ活性物質は、他の実施態様において好まし
い。

【０１３８】 好ましい実施態様において、本発明は、リンパ球活性化タンパク質の活性を調
節し得るバイオ活性物質をスクリーニングするための方法を提供する。その方法
は、前記で特定されたような候補バイオ活性物質を、リンパ球活性化タンパク質
を含む細胞に添加することを含む。好ましい細胞型は、ほとんどの任意の細胞を
含む。細胞は、リンパ球活性化タンパク質をコードする組換え核酸を含む。好ま
しい実施態様において、候補物質のライブラリィを大多数の細胞について試験す
る。

【０１３９】 ある実施態様において、アッセイは、細胞をコントロール細胞においてＴ細胞
およびＢ細胞活性化を誘導するＴ細胞およびＢ細胞活性化物質へ曝露することを
含む。コントロール細胞は、同型であるが活性化タンパク質をコードする外因性
核酸を含まないものである。あるいは、細胞を、通常、Ｔ細胞およびＢ細胞活性
化という結果となる条件で曝露する。そして、通常のＴ細胞およびＢ細胞活性化
進行における変化を測定する。あるいは、通常、Ｔ細胞およびＢ細胞活性化の下
で、リンパ球活性化核酸が導入される細胞、およびその変化 (例えば、Ｔ細胞お
よびＢ細胞活性化の阻害)を測定する。所望に応じて、細胞は、通常、Ｔ細胞お
よびＢ細胞活性化を受けないで、候補物質の導入がＴ細胞およびＢ細胞の活性化
を引き起こす。 こうして、Ｔ細胞およびＢ細胞活性化への候補物質の作用を評価する。

【０１４０】 Ｔ細胞およびＢ細胞活性化の検出を、当業者に明かな方法で行うことができる
。ある実施態様において、Ｔ細胞およびＢ細胞活性化の指示薬を使用する。従っ
て、これらの物質を、親和性リガンドとして使用することができ、ビーズ、表面
、その他のような固体支持体に結合させて、Ｔ細胞およびＢ細胞活性化を受ける
細胞を抜き出すために、使用することができる。同様にして、これらの物質は、
ＰｅｒＣＰのような蛍光染色剤に結合することができ、蛍光活性化細胞選別(Ｆ
ＡＣＳ)分離のベースとしても使用することができる。

【０１４１】 このようにしてバイオ活性物質を同定する。薬理学的活性を有する化合物は、
リンパ球活性化タンパク質の活性を増強または妨害することができる。所望の薬
理学的活性を有する化合物を、前述したように、生理学的に許容し得る担体中に
入れて宿主に投与し得る。これらの物質を、経口的に、非経口的に、例えば、皮
下に、腹腔内に，血管内に、などの各種の方法で投与し得る。投与方法の種類に
応じて、化合物を各種の形態に製剤化し得る。製剤中の治療的有効成分の濃度を
約０.１−１００重量％で変え得る。

【０１４２】 各種の形態、例えば、顆粒剤、錠剤、丸剤、座剤、カプセル剤、分散剤、軟膏
剤、ローションなどの形態で、医薬組成物を調製することができる。医薬用グレ
ードの有機または無機担体、および／または、経口的または局所的使用に適した
希釈剤を使用して、治療的に有効な化合物を含有する組成物を調製することがで
きる。当業界で既知の希釈剤には、水性媒体、植物性または動物性の油脂類が含
まれる。安定化剤、湿潤剤および乳化剤、浸透圧を変化させるための塩類または
好適なｐＨ値を保持するための緩衝剤、並びに皮膚浸透促進剤を、助剤として使
用できる。

【０１４３】 理論に縛られることなく、リンパ球活性化タンパク質は、Ｔ細胞およびＢ細胞
活性化における重要なタンパク質であると思われる。従って、変異または変種の
リンパ球活性化遺伝子に基づく疾患を調べることができる。ある実施態様におい
て、本発明は、変種リンパ球活性化遺伝子含有細胞の同定方法を提供する方法は
、ある細胞中における少なくとも１種の内因性リンパ球活性化遺伝子の配列の全
部または一部を決定することを含む。当業界で明らかなように、この方法を任意
の配列決定技術を使用して実施できる。好ましい実施態様において、本発明は、
個体のリンパ球活性化遺伝子型を同定する方法を提供する。この方法は、該個体
の少なくとも１種のリンパ球活性化遺伝子配列の全部または一部を決定すること
を含む。この方法は、一般に、該個体の少なくとも１種の組織中で実施すること
ができ、多数の組織または同じ組織の異なる試料についての評価を含み得る。こ
の方法は、既知リンパ球活性化遺伝子、例えば、野生型遺伝子と配列決定された
リンパ球活性化遺伝子について配列を比較することを含み得る。

【０１４４】 そして、リンパ球活性化遺伝子のすべてまたは一部の配列を既知のリンパ球活
性化遺伝子の配列と比較し、何らかの相違が存在するかどうかを決定できる。こ
の実施には、多くの既知の配列同定プログラムを使用できる。例えば、Ｂｅｓｔ
ｆｉｔなど、および他のここで概説されたプログラムを使用する。ある好ましい
実施態様において、患者のリンパ球活性化遺伝子と既知のリンパ球活性化遺伝子
との配列の相違の存在が、疾患状態または疾患状態に関する性質を示している。

【０１４５】 そして、Ｔ細胞およびＢ細胞活性化におけるリンパ球活性化の役割に関する本
発見は、細胞におけるＴ細胞およびＢ細胞活性化を誘導または予防するための方
法を提供する。好ましい実施態様において、リンパ球活性化タンパク質および特
にリンパ球活性化断片は、Ｔ細胞およびＢ細胞活性化によって仲介される病状の
研究および処置、すなわちＴ細胞およびＢ細胞活性化仲介疾患の診断、治療また
は予防に有用である。そして、「Ｔ細胞およびＢ細胞活性化仲介疾患」または「疾
患状態」は、不十分なまたは過剰なＴ細胞およびＢ細胞活性化の双方に関する病
状を含む。免疫学的疾患は数多く、当業界で既知である。

【０１４６】 そして、ある実施態様において、細胞または生物におけるＴ細胞およびＢ細胞
活性化を調節する方法を提供する。ある実施態様において、方法は、細胞に抗リ
ンパ球活性化抗体などの本発明で同定される物質を投与することを含み、または
、それは、ここで提供される方法によって、内因性リンパ球活性化タンパク質の
生物学的活性を減少もしくは除去する。あるいは、その方法は、細胞または生物
に、リンパ球活性化タンパク質またはアンチセンス核酸を含むモジュレーターを
コードする組換え核酸を投与することを含む。当業者にとって明らかなように、
これを任意の多くの方法によって実施し得る。好ましい実施態様において、リン
パ球活性化の活性の増加は、細胞内リンパ球活性化の量の増加による。例えば、
内因性リンパ球活性化の過剰発現により、またはリンパ球活性化タンパク質をコ
ードしている遺伝子の投与による。それは、例えば、既知の遺伝子療法技術を使
用する。好ましい実施態様において、遺伝子療法技術は、外因性遺伝子の組みこ
みを含む。例えば、ＰＣＴ／ＵＳ／９３／０３８６８(出典明示により本明細書
の一部とする)において記載されたような、増強された相同組換え(enhanced hom
ologous recombination)を使用する。

【０１４７】 ある実施態様において、本発明は、個体におけるＴ細胞またはＢ細胞活性化が
関係する病態を診断するための方法を提供する。その方法は、個体または患者か
らの組織におけるリンパ球の活性化の活性を測定することを含む。それは、リン
パ球活性化タンパク質の量または特異的活性の測定を含み得る。この活性を、病
態のない第二の個体から、または第一の個体の病態に関係しない組織からのいず
れかのリンパ球活性化の活性と比較する。これらの活性が相違するとき、第一の
個体は、Ｔ細胞およびＢ細胞仲介疾患のおそれがある。

【０１４８】 ここで提供されるタンパク質および核酸を、スクリーニング目的のために使用
することができ、リンパ球活性化タンパク質のタンパク質−タンパク質相互作用
を同定することができる。遺伝子系について記載され、タンパク質−タンパク質
相互作用が検出されている。酵母系において最初の研究が実施された。すなわち
「酵母２−ハイブリッド」系である。基本系は、レポーター遺伝子の転写を指向す
るために、タンパク質−タンパク質相互作用を必要とする。次いで、研究は哺乳
類細胞において実施された。Fields et al., Nature 340: 245(1989); Vasavada
et al., PNAS USA 88: 10686(1991); Fearon et al., PNAS USA 89: 7958(1992
); Dang et al., Mol. Cell. Biol. 11: 954(1991); Chien et al., PNAS USA 8
8: 9578(1991); 並びに米国特許番号５,２８３,１７３、５,６６７,９７３、５,
４６８,６１４、５,５２５,４９０、および５,６３７,４６３を参照されたい。
好ましい系は、出願番号０９／０５０８６３、１９９８年３月３０日出願、表題
「Mammalian Protein Interaction Cloning System」に記載されている。これらの
系の結合された使用について、特に有用なシャトルベクターが、出願番号０９／
１３３９４４、１９９８年８月１４日出願、表題「Shuttle Vectors」に記載され
ている。

【０１４９】 一般に、２つの核酸を１細胞に形質転換する。１つの核酸はＳＷＡＰ、ＪＥＳ
Ｔまたはその一部をコードする遺伝子のような「ベイト(bait: えさ)」であり、今
１つの核酸は試験候補をコードしている。２つの発現産物が互いに結合する場合
のみ、蛍光タンパク質などの指示薬は発現する。その指示薬の発現は、いつ試験
候補がＳＷＡＰまたはＪＥＳＴに結合するかを示し、試験候補をリンパ球活性化
タンパク質として同定することができる。同じ系および同定されるリンパ球活化
タンパク質を使用して、逆のことを実施することができる。すなわち、本発明で
提供されるリンパ球活性化タンパク質を、新規なベイト、またはリンパ球活性化
タンパク質と相互作用する物質を同定するために、使用することができる。さら
に、２−ハイブリッド系を使用することができ、ＳＷＡＰまたはＪＥＳＴおよび
核酸をコードするリンパ球活性化タンパク質に加えて試験候補を添加し、ＳＷＡ
ＰまたはＪＥＳＴなどのベイト、およびリンパ球活性化タンパク質を妨害する物
質を調べる。ＲａｓＧＲＰも使用することができる。

【０１５０】 ある実施態様において、哺乳類２−ハイブリッド系が好ましい。哺乳類系は、
有意にその相互作用する能力に関与し得るタンパク質のポスト翻訳修飾を提供す
る。さらに、哺乳類２−ハイブリッド系を広範な哺乳類の細胞型において使用し
、特定の細胞型内の特異的タンパク質の調節、誘導、プロセッシングなどを模倣
することができる。例えば、前記で記載されたような疾患状態に関連するタンパ
ク質を、関連する疾患細胞において試験し得る。同様に、ランダムタンパク質の
試験のために、関連する細胞内条件の下でアッセイすることは、最高の肯定的な
結果を与える。さらに、哺乳類細胞を、細胞間タンパク質−タンパク質相互作用
に影響を及ぼし得る広範な実験的条件下(例えば、ホルモン、薬剤、成長因子お
よびサイトカイン、細胞内および化学的刺激などの存在)およびタンパク質−タ
ンパク質相互作用に影響を及ぼすことのできる条件(特にＴ細胞およびＢ細胞活
性化に関連する条件)に関与し得る広範な実験条件下で試験することができる。

【０１５１】 様々な細胞型における発現、およびリンパ球活性化活性のアッセイを、前記し
た。Ｔ細胞およびＢ細胞活性化への影響を有するような活性アッセイを実施し、
ＳＷＡＰ、ＪＥＳＴまたはＲａｓＧＲＰとの配列同一性／類似性またはこれらと
の結合によって、同定することができたリンパ球活性化タンパク質の活性を確認
することができる。さらに、Ｔ細胞およびＢ細胞活性化のモジュレーターとして
同定されるリード化合物の活性をさらに確認することができる。 ２−ハイブリッド系などの結合に関連するアッセイは、非特異的結合タンパク
質(ＮＳＢ)を考慮に入れ得る。

【０１５２】 ある実施態様において、本発明のリンパ球活性化タンパク質を使用し得る。そ
してリンパ球活性化タンパク質に対するポリクローナルおよびモノクローナル抗
体を生成する。それらの抗体は、ここで記載されるように有用である。同様に、
リンパ球活性化タンパク質を、標準的な技術を使用してアフィニティ・クロマト
グラフィ・カラムに結合することができる。そして、カラムをリンパ球活性化抗
体を精製するために使用し得る。好ましい実施態様において、抗体をリンパ球活
性化タンパク質に対してエピトープ特異的に生成する; すなわち、抗体は、他の
タンパク質とほとんどまたは全く交差反応性を示さない。これらの抗体について
、多くの応用における使用が見出される。例えば、リンパ球活性化抗体を標準的
なアフィニティ・クロマトグラフィ・カラムに結合し得る。そして、以下にさら
に記載するように、リンパ球活性化タンパク質を精製するために使用し得る。抗
体を、前記で概説したように、ブロッキングポリペプチドとしても使用し得る。
というのは、これらは、リンパ球活性化タンパク質と特異的に結合するからであ
る。

【０１５３】 抗リンパ球活性化タンパク質抗体は、ポリクローナル抗体を含み得る。ポリク
ローナル抗体を調製する方法は、当業者にとって既知である。ポリクローナル抗
体を哺乳類中で産生し得る。例えば、１以上の免疫化物質および所望によりアジ
ュバントの注射による。典型的には、免疫化物質および／またはアジュバントを
、複数の皮下または腹膜内への注射によって哺乳類に注射する。免疫化物質は、
リンパ球活性化タンパク質ポリペプチドまたはその融合タンパク質を含み得る。
免疫化物質と、免疫化される哺乳類において免疫原であることが既知であるタン
パク質とを結合することは、有用である。そのような免疫原タンパク質の例は、
キーホール・リンペット・ヘモシアニン、血清アルブミン、ウシ・チログロブリ
ンおよびダイズ・トリプシン阻害剤を含むが、これらに限定されない。使用され
得るアジュバントの例は、フロイントの完全アジュバントおよびＭＰＬ−ＴＤＭ
アジュバント(モノフォスフィリル・リピッドＡ、合成トレハロース・ジコリノ
ミコレート)を含む。免疫化プロトコルを当業者は過度な実験なくして選択し得
る。

【０１５４】 あるいは、抗リンパ球活性化タンパク質抗体はモノクローナル抗体であってよ
い。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法を使用して調製し得る。その方法
は、Kohler and Milstein, Nature, 256: 495(1975)に記載されている。ハイブ
リドーマ法では、マウス、ハムスターなどの適当な宿主動物を典型的には免疫化
物質で免疫化する。そして、抗体を産生または産生し得るリンパ球を誘発する。
抗体は免疫化物質に特異的に結合する。あるいはリンパ球をインビトロで免疫化
し得る。

【０１５５】 免疫化物質は、典型的には、リンパ球活性化タンパク質ポリペプチドまたはそ
の融合タンパク質を含む。一般的には、ヒト起源の細胞が望まれるならば、末梢
血液リンパ球(「ＰＢＬ」)を使用し、または、非ヒト哺乳類ソースが望まれるなら
、脾臓細胞またはリンパ節細胞を使用する。そして、リンパ球を不死化細胞系統
と融合化する。その際に、ポリエチレン・グリコールのような適当な融合化物質
を使用してハイブリドーマ細胞を形成させる[Goding, Monoclonal Antibodies:
Pronciples and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103]。不死化細胞
系統として、通常、形質転換の哺乳類細胞、特にげっ歯類、ウシおよびヒト起源
のミエローマ細胞を使用する。通常、ラットまたはマウス・ミエローマ細胞系統
を使用する。ハイブリドーマ細胞を適当な培地中で培養し得る。それは、好まし
くは、融合されず不死化細胞の成長または生存を阻害する１以上の物質を含む。
例えば、親細胞が酵素ヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシル・トランスフ
ェラーゼ(ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ)を欠くならば、ハイブリドーマのための培
地(「ＨＡＴ培地」)は、典型的には、ＨＧＰＲＴ欠失細胞の成長を妨げるヒポキサ
ンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含む。

【０１５６】 好ましい不死化細胞系統は効率的に融合し、選択された抗体生産細胞によって
抗体の安定的高水準の発現を支持し、そしてＨＡＴ培地のような培地に感受性で
ある。さらに好ましい不死化細胞系統は、ネズミ・ミエローマ系統であり、例え
ば、Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California and t
he American Type Culture Collection, Rockville, Marylandから得ることがで
きる。ヒト・ミエローマおよびマウス−ヒト・へテロミエローマ細胞系統は、ヒ
ト・モノクローナル抗体の生産に関して記載されている[Kozbor, J. Immunol.,
133:3001(1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Technique
s and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63]。

【０１５７】 そして、ハイブリドーマ細胞を培養する培地を、リンパ球活性化タンパク質に
対するモノクローナル抗体の存在についてアッセイすることができる。好ましく
は、ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の結合特異性を
、免疫沈降によってまたは放射性免疫測定法(ＲＩＡ)もしくは酵素結合免疫吸着
アッセイ(ＥＬＩＳＡ)などのインビトロ結合アッセイによって測定する。これら
の技術およびアッセイは当技術分野で既知である。例えば、モノクローナル抗体
の結合親和性をMunson and Pollard, Anal. Biochem., 107:220(1980)のScatcha
rd分析によって測定することができる。

【０１５８】 所望のハイブリドーマ細胞の分析の後、クローンを限界希釈法によってサブク
ローン化し、標準的な方法によって成長させ得る[Goding、前掲]。この目的のた
めの適当な培地は、例えば、Dulbecco修正Eagle培地およびＰＰＭＩ−１６４０
培地を含む。あるいは、ハイブリドーマ細胞を哺乳類内の腹水のようなインビボ
で成長させ得る。

【０１５９】 サブクローン化によって分泌されたモノクローナル抗体を、通常の免疫グロブ
リン精製方法により培地または腹水液から単離し精製し得る。この精製方法には
、例えば、タンパク質Ａ−セファロース、ヒドロキシラパタイト・クロマトグラ
フィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティー・クロマトグラフィーがあ
る。

【０１６０】 モノクローナル抗体を組み換えＤＮＡ法によってもつくり得る。例えば、米国
特許番号４,８１６,５６７に記載されている。本発明のモノクローナル抗体をコ
ードするＤＮＡを通常の方法を使用して容易に単離し、配列決定することができ
る(例えば、ネズミ抗体の重鎖および軽鎖をコードしている遺伝子に特異的に結
合することのできるオリゴヌクレオチドプローブを使用して)。本発明のハイブ
リドーマ細胞を、そのようなＤＮＡの好ましいソースとして使用することができ
る。単離すると、ＤＮＡを発現ベクター内に入れ、宿主細胞にトランスフェクト
し得る。そのような細胞には、トランスフェクトされなければ免疫グロブリンタ
ンパク質を産生しないシミアンＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨ
Ｏ)細胞、またはミエローマ細胞がある。次いで組換え宿主細胞においてモノク
ローナル抗体が合成される。例えば、ヒトの重鎖および軽鎖の定常ドメインのコ
ード配列を、相同的なネズミ配列の場所に置換することにより[米国特許番号４,
８１６,５６７; Morrison et al., 前掲]、または免疫グロブリン・コード配列
と、非免疫グロブリン・ポリペプチドのコード配列のすべてまたは一部とを共有
結合させることなどによりＤＮＡもまた修飾し得る。そのような非免疫グロブリ
ン・ポリペプチドを、本発明の抗体の定常ドメインと、置換することができる。
あるいは、本発明の抗体のある抗原結合部位の可変ドメインと置換し、キメラ二
価抗体を生成することができる。

【０１６１】 抗体は一価の抗体であってよい。一価の抗体を調製する方法は、当技術分野で
周知である。例えば、ある方法は、免疫グロブリンの軽鎖および修飾重鎖の組換
え発現を含む。重鎖は、Ｆｃ領域における任意の点において末端切除し、重鎖の
交差結合(cross linking)を防止する。あるいは、関連するシステイン残基を、
別のアミノ酸残基で置換するか削除して、交差結合を防ぐ。

【０１６２】 インビトロ法は、一価抗体を調製するためにも適当である。抗体の消化によっ
て、その断片、特にＦａｂ断片を生成することは、当分野で既知の日常的な技術
を使用し実施することができる。

【０１６３】 本発明の抗リンパ球活性化タンパク質抗体は、ヒト化抗体またはヒト抗体をさ
らに含み得る。ヒト化型の非ヒト(例えばネズミ)抗体は、キメラ免疫グロブリン
、免疫グロブリン鎖またはその断片(Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ’)_２ま
たは抗体の他の抗原結合サブシーケンスなど)である。これらは、非ヒト免疫グ
ロブリンに由来する最小配列を含む。ヒト化抗体はヒト免疫グロブリン(レシピ
エント抗体)を含み、レシピエントの相補性決定領域(ＣＤＲ)からの残基が、マ
ウス、ラットまたはウサギなどの所望の特異性、親和性および能力を有する非ヒ
ト種(ドナー抗体)のＣＤＲからの残基で置換されている。いくつかの例では、ヒ
ト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基が、対応する非ヒト残基で置換され
ている。ヒト化抗体は、レシピエント抗体および導入されたＣＤＲまたはフレー
ムワーク配列のいずれにも見出されない残基も含む。一般に、ヒト化抗体は、実
質的に少なくとも１の、そして典型的には２の可変ドメインを含む。このドメイ
ンでは、すべてまたは実質的にすべてのＦＲ領域が、非ヒト免疫グロブリンのＣ
ＤＲ領域に一致し、すべてまたは実質的にすべてのＦＲ領域が、ヒト免疫グロブ
リン・共通配列のＦＲ領域である。ヒト化抗体は、所望により、免疫グロブリン
定常領域(Ｆｃ)、典型的にはヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部も
含む[Jones et al., Nature, 321: 522-525(1986); Riechmann et al., Nature,
332: 323-329(1988); and Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596(199
2)]。

【０１６４】 非ヒト抗体をヒト化する方法は当技術分野で周知である。一般に、ヒト化抗体
は、非ヒトのソースから抗体に導入された１以上のアミノ酸残基を有している。
非ヒトアミノ酸残基をしばしば「導入」残基と称する。それは、典型的には「導入」
可変ドメインに由来する。ヒト化をWinterおよびその共同研究者の方法[Jones e
t al., Nature, 321: 522-525(1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323-32
7(1988); Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536(1988)]に従って、げっ
歯類ＣＤＲ配列と、ヒト抗体の対応する配列を置換することによって、基本的に
実施することができる。従って、該「ヒト化」抗体は、キメラ抗体であり(米国特
許番号４８１６５６７)、無処置のヒト可変ドメインより実質的に小さいドメイ
ンが非ヒト種からの対応する配列によって置換されている。実際、ヒト化抗体は
、典型的にはいくつかのＣＤＲ残基およびあるいはいくつかのＦＲ残基が、げっ
歯類抗体の同種の部位からの残基によって置換されているヒト抗体である。

【０１６５】 ヒト抗体は、当技術分野で既知の様々な技術を使用して産生することができる
。この技術はファージ・ディスプレイ・ライブラリィを含む[Hoogenboom and Wi
nter, J. Mol. Biol., 227: 381(1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 5
81(1991)]。Cole et al.およびBoerner et al. の技術は、ヒトモノクローナル
抗体の調製のためにも利用可能である(Cole et al., Monoclonal Antibodies an
d Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77(1985) and Boerner et al., J. Immun
ol., 147(1):86-95(1991)]。同様に、ヒト抗体は、内因性免疫グロブリン遺伝子
を部分的にまたは完全に不活性化したマウスなどのトランスジェニック動物への
、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の導入によってつくることができる。チャレンジ
したとき、ヒト抗体生産が観察され、それはすべての点でヒトに見出されるもの
とよく類似し、遺伝子の再編成、集合、および抗体蓄積を含む。この方法は、例
えば、米国特許番号５,５４５,８０７; ５,５４５,８０６; ５,５６９,８２５;
５,６２５,１２６; ５,６３３,４２５; ５,６６１,０１６、および以下の科学的
出版物: Marks et al., Bio/Technology 10, 779-783(1992); Lonberg et al.,
Nature 368 856-859(1994); Morrison, Nature 368, 812-13(1994); Fishwild e
t al., Nature Biotechnology 14, 845-51(1996); Neuberger, Nature Biotechn
ology 14, 826(1996); Lonberg and Huszar, Intern Rsv. Immunol. 13 65-93(1
995)に記載されている。

【０１６６】 二重特異的抗体は、少なくとも２の異なる抗原に結合特異性を有するモノクロ
ーナル抗体、好ましくはヒトまたはヒト化抗体である。今回の場合において、結
合特異性の１つはリンパ球活性化タンパク質について、他方は任意の他の抗原に
ついて、そして好ましくは細胞表面タンパク質または受容体もしくは受容体サブ
ユニットについての抗体である。

【０１６７】 二重特異的抗体を生成するための方法は、当技術分野で既知である。通常、二
重特異的抗体の組換え産物は、２の免疫グロブリン重鎖／軽鎖組の共発現に基づ
き、この場合２の重鎖が異なる特異性を有する。[Milstein and Cuello, Nature
, 305: 537-539(1983)]。免疫グロブリン重鎖および軽鎖のランダム組み合わせ
のために、これらのハイブリドーマ(クアドローマ)は、１０の異なる抗体分子の
可能な混合を産生する。このうち１のみが適当な二重特異的構造を有する。適当
な分子の精製を通常アフィニティ・クロマトグラフィ法によって実施する。類似
方法は、ＷＯ９３／０８８２９、１９９３年５月１３日公開、およびTraunecker
et al., EMBO J., 10: 3655-3659(1991)に記載されている。

【０１６８】 所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン(抗体抗原結合部位)を、免疫グロ
ブリン定常ドメイン配列に融合することができる。その融合は、好ましくは免疫
グロブリン重鎖定常ドメインとのものである。そしてヒンジ、ＣＨ２、およびＣ
Ｈ３領域の少なくとも一部を含む。第一の重鎖定常領域(ＣＨ１)を有するのが好
ましい。それは、融合の少なくとも１に存在する軽鎖結合に必要である部位を含
む。免疫グロブリン重鎖融合、および所望により免疫グロブリン軽鎖をコードす
るＤＮＡを別の発現ベクターに挿入し、適当な宿主生物に共トランスフェクトさ
せる。二重特異的抗体の生成のさらなる詳細について、例えば、Suresh et al.,
Methods in Enzymology, 121: 210(1986)を参照されたい。

【０１６９】 ヘテロ結合抗体もまた、本発明の範囲内である。ヘテロ結合抗体は、２の共有
結合抗体を含む。そのような抗体は、例えば、免疫系細胞を好ましくない細胞へ
標的化させるために[米国特許番号４,６７６,９８０]、ＨＩＶ感染の処置のため
に[ＷＯ９１／００３６０; ＷＯ９２／２００３７３; ＥＰ０３０８９]提案され
ている。抗体は、合成タンパク質化学(関連交差結合物質を含む)における既知の
方法を使用して、インビトロで調製し得る。例えば、免疫毒素を、ジスルフィド
置換反応を使用して、またはチオエーテル結合の形成によって構築し得る。この
目的のために適当な物質の例は、イミノチオレートおよびメチル−４−メルカプ
トブチルイミデートを含み、例えば、米国特許番号４６７６９８０に記載されて
いる。

【０１７０】 本発明の抗リンパ球活性化タンパク質抗体は、多様な有用性を有する。例えば
、抗リンパ球活性化タンパク質抗体は、リンパ球活性化タンパク質についての診
断アッセイに使用しうる。例えば、特定の細胞、組織、または血清におけるその
発現の検出である。当技術分野で既知の多様な診断アッセイ技術を使用し得る。
例えば、競合的結合アッセイ、直接的または間接的サンドイッチアッセイ、およ
び異種性または同種性の相のいずれかにおいて実施される免疫沈降法である[Zol
a, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc.(1987)p
p. 147-158]。診断アッセイに使用される抗体を、検出可能部分で標識化するこ
とができる。検出可能部分は、直接的にまたは間接的に検出可能なシグナルを生
産するものである。例えば、検出可能部分は、^３Ｈ、^１４Ｃ、^３２Ｐ、^３５Ｓ、
もしくは^１２５Ｉのような放射性同位体、フルオレセイン・イソチオシアネート
、ローダミン、もしくはルシフェリンのような蛍光もしくは化学発光化合物、ま
たはアルカリ・ホスファターゼ、ベータ・ガラクトシダーゼもしくはホースラデ
ィッシュ・ペルオキシダーゼなどの酵素であってよい。抗体の検出可能部分への
結合について、当技術分野で既知の任意の方法を使用し得る。それらの方法は、
Hunter et al., Nature, 144: 945(1962); David et al., Biochemistry, 13: 1
014(1974); Pain et al., J. Immunol. Meth., 40: 219(1981); およびNygren,
J. Histochem. and Cytochem., 30: 407(1982)に記載された方法を含む。

【０１７１】 抗リンパ球活性化タンパク質抗体は、組換え細胞培養または天然起源からのリ
ンパ球活性化タンパク質の親和性精製にとっても有用である。この方法では、リ
ンパ球活性活性化タンパク質に対する抗体を、例えば、Sephadfex樹脂または濾
紙などの適当な支持体上で当技術分野で周知の方法を使用して免疫する。次いで
、免疫抗体を、リンパ球活性化タンパク質を含む試料と接触させ、精製する。そ
の後、支持体を適当な溶剤で洗浄し、試料中のリンパ球活性化タンパク質以外の
実質的にすべての物質を除去する。リンパ球活性化タンパク質は、免疫抗体に結
合している。最終的に、支持体をさらなる適当な溶剤で洗浄し、リンパ球活性化
タンパク質を抗体から遊離する。

【０１７２】 抗リンパ球活性化タンパク質抗体を医療処置にも使用し得る。ある実施態様に
おいて、抗体をコードしている遺伝子を提供する。抗体は細胞内のリンパ球活性
化タンパク質に結合し、それを調節する。

【０１７３】 ある実施態様において、リンパ球活性化タンパク質、アゴニストまたはアンタ
ゴニストの治療有効量を患者に投与する。ここで「治療有効量」は、投与の目的で
ある効果を生じる用量を意味する。正確な用量は処置目的により異なり、公知技
術を用いて当業者は確認し得る。当業界で既知の通り、リンパ球活性化分解、全
身的対局所的送達、および新規プロテアーゼ合成速度、並びに年齢、体重、全般
的な健康状態、性別、食事、投与時間、薬剤相互作用および病状の重篤度による
調整が必要であり、当業者は常用の試行で確認し得る。

【０１７４】 本発明の目的における「患者」は、ヒトおよび他の動物の両方、特に哺乳類およ
び生物を包含する。すなわち、本発明の方法は、ヒトの医療行為および獣医学的
利用の両方に適用され得る。好ましい態様において、患者は哺乳類であり、最も
好ましい態様において患者はヒトである。

【０１７５】 本発明のリンパ球活性化タンパク質、アゴニストまたはアンタゴニストの投与
を、様々な経路、例えば、経口、皮下、静脈内、鼻腔内、経皮、腹腔内、筋肉内
、肺内、膣、直腸または眼内経路で行い得るがこれらに限定されない。場合によ
っては、例えば、損傷および炎症の処置において、リンパ球活性化を溶液または
スプレーとして直接適用し得る。

【０１７６】 本発明の医薬組成物は、患者への投与に適した形態のリンパ球活性化タンパク
質、アゴニストまたはアンタゴニストを含む。好ましい実施態様において、この
医薬組成物は、水溶性形態、例えば、医薬的に許容し得る塩類として存在してお
り、これらは酸および塩基の両付加塩類を包含するものとする。「医薬的に許容
し得る酸付加塩類」は、遊離塩基の生物学的有効性を保持し、かつ生物学上また
はその他の点で許容できるものであり、無機酸、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫
酸、硝酸、燐酸など、および有機酸、例えば、酢酸、プロピオン酸、グリコール
酸、ピルビン酸、蓚酸、マレイン酸、マロン酸、こはく酸、フマル酸、酒石酸、
クエン酸、安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン
酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸などと形成する。「医薬的に許容し得
る塩基付加塩類」は、無機塩基、例えば、ナトリウム、カリウム、リチウム、ア
ンモニウム、カルシウム、マグネシウム、鉄、亜鉛、銅、マンガン、アルミニウ
ム塩類などから誘導されたものを含む。特に好ましいのは、アンモニウム、カリ
ウム、ナトリウム、カルシウムおよびマグネシウム塩類などである。医薬的に許
容し得る有機非毒性塩基から誘導される塩類は、第１級、第２級および第３級ア
ミン類、置換アミン類、例えば、天然置換アミン類、環状アミン類および塩基性
イオン交換樹脂、例えば、イロプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルア
ミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミンおよびエタノールアミンの塩類が
ある。

【０１７７】 これらの医薬組成物はまた次の物質: すなわち担体タンパク質、例えば,
血清アルブミン; 緩衝液; 充填剤、例えば、微晶性セルロース、ラクトース、ト
ウモロコシおよび他の澱粉類; 結合剤; 甘味料および他の着香剤; 着色剤; およ
びポリエチレングリコールのうちの１種以上を含み得る。添加物は当業界ではよ
く知られており、様々な処方で使用される。

【０１７８】 本明細書に挙げるアクセッションナンバーのすべての引用および配列を、出典
明示により本明細書の一部とする。

【図面の簡単な説明】

【図１】 ヒトＪＥＳＴのコード配列を含む核酸配列（ｃＤＮＡ）。

【図２】 ヒトＪＥＳＴのコード配列。アミノ酸配列の翻訳をコード配列の
下に示す。

【図３】 ヒトＥＳＴおよびヒトＲａｓＧＲＰ断片をラットＲａｓＧＲＰに
並べた模式図。

【図４】 ＳＷＡＰ７０についての核酸配列およびアミノ酸配列。

【図５】 ＳＷＡＰ７０およびＪＥＳＴのアミノ酸平衡整列。ＳＷＡＰ７０
をＪＥＳＴの上に示す。ＳＷＡＰ７０が照合でＪＥＳＴが主体である。平衡整列
の生成に使用する特殊なパラメーターも示す。

【図６】 ヒトＲａｓＧＲＰの核酸配列。図６Ａは、図３における「ＳＷＡ
Ｐ７０.１４」、図６Ｂは、図３における「ＳＷＡＰ７０.３６」、図６Ｃは、図
３における「ＳＷＡＰ７０.５２」、図６Ｄは、図３における「ＳＷＡＰ７０.５
５」を示す。

【図７】 ＳＷＡＰ７０に結合するヒトＲａｓＧＲＰについての共通の核酸
配列およびアミノ酸配列。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/21 ４Ｈ０４５ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｑ 1/02 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/02 33/50 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/566 33/50 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/566 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｕ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ， ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，Ｌ Ｋ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ， ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，Ｔ Ｍ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 2G045 AA34 AA35 BB20 DA13 DA36 FB02 FB03 4B024 AA01 AA11 BA44 BA80 CA01 CA04 CA07 CA11 DA01 DA02 DA05 DA11 EA01 EA02 EA03 EA04 FA02 GA03 GA11 HA01 HA12 HA15 4B063 QA01 QA08 QA18 QQ05 QQ08 QQ13 QQ79 QR08 QR33 QR42 QR59 QR62 QR74 QR80 QS05 QS25 QS36 QX02 4B064 AG01 AG27 CA01 CA19 CA20 CC24 DA01 DA13 4B065 AA01X AA57X AA87X AA93Y AB01 AB02 BA01 BA08 CA24 CA25 CA44 CA46 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 BA41 CA40 DA00 DA76 EA22 EA50 FA72 FA74

Claims (45)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 図２に表示するアミノ酸配列に少なくとも約８５％の同一性
   であるＪＥＳＴタンパク質をコードする組換え核酸。
2. 【請求項２】 図２に表示するアミノ酸配列をコードする、請求項１の組換
   え核酸。
3. 【請求項３】 図２に表示する核酸配列またはその補体に高ストリンジェン
   ト条件でハイブリダイズする組換え核酸。
4. 【請求項４】 図２に表示する核酸配列に少なくとも約９０％の同一性であ
   る組換え核酸。
5. 【請求項５】 図２に表示する核酸配列を有する組換え核酸。
6. 【請求項６】 請求項２の核酸を含む発現ベクター。
7. 【請求項７】 請求項２の核酸を含む宿主細胞。
8. 【請求項８】 請求項６のベクターを含む宿主細胞。
9. 【請求項９】 請求項８の宿主細胞をＪＥＳＴタンパク質の発現に適した条
   件で培養することを含む、ＪＥＳＴタンパク質をつくるための方法。
10. 【請求項１０】 該ＪＥＳＴタンパク質を回収することをさらに含む、請求
    項９の方法。
11. 【請求項１１】 図２に表示するアミノ酸配列に少なくとも約８５％の同一
    性である組換えＪＥＳＴタンパク質。
12. 【請求項１２】 図２のアミノ酸配列を含む、請求項１１のＪＥＳＴタンパ
    ク質。
13. 【請求項１３】 図２に表示する核酸配列に少なくとも約８５％同一性の核
    酸によりコードされる、請求項１１のＪＥＳＴタンパク質。
14. 【請求項１４】 図２に表示する核酸配列またはその補体に高ストリンジェ
    ント条件でハイブリダイズする核酸によりコードされたＪＥＳＴタンパク質。
15. 【請求項１５】 ＪＥＳＴタンパク質に特異的に結合する単離のポリペプチ
    ド。
16. 【請求項１６】 抗体である、請求項１５のポリペプチド。
17. 【請求項１７】 該抗体がモノクローナル抗体である、請求項１６のポリペ
    プチド。
18. 【請求項１８】 図２に表示する核酸配列またはその補体に高ストリンジェ
    ント条件でハイブリダイズする核酸によりコードされたＪＥＳＴタンパク質の生
    物機能を減少または消失せしめるモノクローナル抗体。
19. 【請求項１９】 図７Ｂに表示するアミノ酸配列に少なくとも約８５％同一
    性のヒトＲａｓＧＲＰタンパク質をコードする組換え核酸。
20. 【請求項２０】 図７Ｂに表示するアミノ酸配列をコードする、請求項１９
    の組換え核酸。
21. 【請求項２１】 図７Ａに表示する核酸配列またはその補体に高ストリンジ
    ェント条件でハイブリダイズする組換え核酸。
22. 【請求項２２】 図７Ａに表示する核酸配列に少なくとも約９０％の同一性
    である組換え核酸。
23. 【請求項２３】 図７Ａに表示する核酸配列を有する組換え核酸。
24. 【請求項２４】 請求項２０の核酸を含む発現ベクター。
25. 【請求項２５】 請求項２０の核酸を含む宿主細胞。
26. 【請求項２６】 請求項２４のベクターを含む宿主細胞。
27. 【請求項２７】 請求項２６の宿主細胞をヒトＲａｓＧＲＰタンパク質の発
    現に適した条件で培養することを含む、ヒトＲａｓＧＲＰタンパク質をつくるた
    めの方法。
28. 【請求項２８】 該ヒトＲａｓＧＲＰタンパク質を回収することをさらに含
    む、請求項２７の方法。
29. 【請求項２９】 図７Ｂに表示するアミノ酸配列に少なくとも約９５％の同
    一性である組換えヒトＲａｓＧＲＰタンパク質。
30. 【請求項３０】 図７Ｂのアミノ酸配列を含む、請求項２９のヒトＲａｓＧ
    ＲＰタンパク質。
31. 【請求項３１】 図７Ａに表示する核酸配列に少なくとも約８５％同一性の
    核酸によりコードされる、請求項２９のヒトＲａｓＧＲＰタンパク質。
32. 【請求項３２】 図７Ａに表示する核酸配列またはその補体に高ストリンジ
    ェント条件でハイブリダイズする核酸によりコードされたヒトＲａｓＧＲＰタン
    パク質。
33. 【請求項３３】 ヒトＲａｓＧＲＰタンパク質に特異的に結合する単離のポ
    リペプチド。
34. 【請求項３４】 抗体である、請求項３３のポリペプチド。
35. 【請求項３５】 該抗体がモノクローナル抗体である、請求項３４のポリペ
    プチド。
36. 【請求項３６】 図７Ａに表示する核酸配列またはその補体に高ストリンジ
    ェント条件でハイブリダイズする核酸によりコードされたＲａｓＧＲＰタンパク
    質の生物機能を減少または消失せしめるモノクローナル抗体。
37. 【請求項３７】 ＪＥＳＴタンパク質に結合し得るバイオ活性物質をスクリ
    ーニングする方法であって、ＪＥＳＴタンパク質と候補バイオ活性物質とを組み
    合すこと、および該候補バイオ活性物質の該ＪＥＳＴタンパク質との結合を測定
    することを含む方法。
38. 【請求項３８】 ヒトＲａｓＧＲＰタンパク質に結合し得るバイオ活性物質
    をスクリーニングする方法であって、ヒトＲａｓＧＲＰタンパク質と候補バイオ
    活性物質とを組み合すこと、および該候補バイオ活性物質の該ヒトＲａｓＧＲＰ
    タンパク質との結合を測定することを含む方法。
39. 【請求項３９】 ＳＷＡＰ７０タンパク質とＲａｓＧＲＰとの結合を妨害し
    得る物質をスクリーニングする方法であって、 ａ）ＳＷＡＰ７０タンパク質、候補バイオ活性物質、ＲａｓＧＲＰを組み合すこ
    と ｂ）該ＳＷＡＰ７０タンパク質と該ＲａｓＧＲＰタンパク質との結合を測定する
    こと、 を含む方法。
40. 【請求項４０】 ＪＥＳＴタンパク質とＲａｓＧＲＰとの結合を妨害し得る
    物質をスクリーニングする方法であって、 ａ）ＪＥＳＴタンパク質、候補バイオ活性物質、ＲａｓＧＲＰを組み合すこと ｂ）該ＪＥＳＴタンパク質と該ＲａｓＧＲＰタンパク質との結合を測定すること
    、 を含む方法。
41. 【請求項４１】 ＪＥＳＴタンパク質の活性を調節し得るバイオ活性物質を
    スクリーニングする方法であって、 ａ）候補バイオ活性物質を、ＪＥＳＴタンパク質をコードする組換え核酸を含む
    細胞に加える工程 ｂ）リンパ球活性化を含むＪＥＳＴバイオ活性に対する候補バイオ活性物質の作
    用を測定する工程、 を含む方法。
42. 【請求項４２】 ヒトＲａｓＧＲＰタンパク質の活性を調節し得るバイオ活
    性物質をスクリーニングする方法であって、 ａ）候補バイオ活性物質を、ヒトＲａｓＧＲＰタンパク質をコードする組換え核
    酸を含む細胞に加える工程、 ｂ）Ｔ細胞およびＢ細胞の活性化を含むＲａｓＧＲＰバイオ活性に対する候補バ
    イオ活性物質の作用を測定する工程、 を含む方法。
43. 【請求項４３】候補バイオ活性物質のライブラリィを、該組換え核酸を含む
    多数の細胞に加える、請求項４１または４２の方法。
44. 【請求項４４】ＪＥＳＴ、ＳＷＡＰ７０、ＲａｓＧＲＰより基本的になる複
    合体。
45. 【請求項４５】 ＳＷＡＰ７０、ＪＥＳＴまたはＲａｓＧＲＰに結合し得る
    候補タンパク質をスクリーニングする方法であって、ＳＷＡＰ７０、ＪＥＳＴま
    たはＲａｓＧＲＰをコードする核酸と候補タンパク質をコードする核酸を組み合
    わせること（同定可能なマーカーが発現され、概候補タンパク質がＳＷＡＰ７０
    、ＪＥＳＴまたはＲａｓＧＲＰに結合する）を含む方法。