JP2003513281A - 治療用化合物を同定するための最後野由来の膜、細胞および組織の使用 - Google Patents

治療用化合物を同定するための最後野由来の膜、細胞および組織の使用

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、生理学的に活性な物質、例えば、食物恒常性に関する活性を有する物質を同定するための最後野および／またはこれらの隣接セクションからの膜、細胞および／または組織の様々な手段による使用に関する。より詳しくは、本発明は、最後野生物学的活性のアゴニストおよびアンタゴニストを同定するための方法に関し、それは、候補化合物が最後野および／または隣接する脳成分を含有するある種の生体調製物に結合する能力を評価することを含む。さらに、本発明は、迷走神経の孤束核および／または背側運動核のいずれの部分からの物質を含む、最後野に隣接する脳組織に由来する物質から生成される調製物に関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 関連出願 本出願は、１９９９年７月１３日に出願された米国仮出願第６０／１４３,８
３０号からの優先権を主張し、これにより、その内容は出典明示して本明細書の
一部とみなされる。
【０００２】 発明の分野 本発明は最後野および／または脳の隣接セクション、すなわち、迷走神経の孤
束核および／または背側運動核からの物質の使用に関する。特に、本発明は、生
理学的に活性な物質、例えば、食物恒常性に関する活性を有する物質を同定する
ための最後野および／またはこれらの隣接セクションからの膜、細胞および／ま
たは組織の様々な手段による使用を含む。そのような物質は、タンパク質および
化学化合物を含む。最後野調製物を用いて、タンパク質または化学物質のごとき
物質が天然に産出するまたは単離したまたはクローン化した受容体部位に結合す
る能力を評価することができる。より詳しくは、本発明は、最後野生物学的活性
のアゴニストおよびアンタゴニストを同定するための方法に関し、それは、候補
化合物が最後野および／または隣接する脳成分を含有するある種の生体調製物に
結合する能力を評価することを含む。さらに、本発明は、迷走神経の孤束核およ
び／または背側運動核のいずれの部分からの物質を含む、最後野に隣接する脳組
織に由来する物質から生成される調製物に関する。本発明により同定された化合
物およびタンパク質は食物恒常性障害の治療に有用であろうし、糖尿病、肥満、
高血圧およびうっ血性心不全を含む他の代謝および心腎疾患にも有用であろう。
【０００３】 発明の背景 以下の説明は本発明を理解するために有用であろう情報を含む。それは、本明
細書に提供されたいずれの情報はここに特許請求された本発明の先行技術である
ということの承認でもないし、または、特別にもしくは暗に引用されたいずれの
刊行物が先行技術であるか、そうでなければ、その発明の特許性に関連するとい
うことの承認でもない。
【０００４】 最後野は後脳中の第４脳質の後縁(posterior margin)に位置する小体積の組織
である。それは、環状脳質器官（ＣＶＯ）のファミリーであり、そこでは有窓毛
細血管が循環性ペプチドの神経細胞上の受容体との直接伝達を許容する。ＣＶＯ
は脳の感覚器官であると説明されてきた。報告によれば、最後野中のペプチドホ
ルモンに対する受容体はＩＧＦ−２、インスリン、グルタミン酸塩、セロトニン
、基質Ｐ（ＮＫ１）、アルギニン−バソプレシン、イミダゾリン、アンジオテン
シン、ＧＬＰ−１、ＮＰＹ４、膵臓ポリペプチド、ＰＡＣＡＰ、ＡＮＰ、ドーパ
ミン３、メラトニン、ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ、ＨＣＧ／ＬＨ、オキシトシン、ＶＩ
Ｐ／セクレチン、ソマトスタチン、ヒスタミン２、ＧＲＰ、カルシトニン、およ
びアミリンのそれらを含む。
【０００５】 最後野の損傷は、アミリンの胃腸排出効果［Edwards, GL, et al., Neurogast
roenterol Motil 1998; 10(4):365］および、その満腹効果［Lutz TA, et al.,
Peptides 1998; 19(2):309-17］を除外すると報告されている。迷走神経と他の
頭部上行性線維、最後野、迷走神経の孤束核および背側運動核との間のニューロ
ン連結は、胃腸機能の制御に関係するループを構築する。報告によれば、最後野
のスライス調製物において、インスリン調節ホルモン、アミリンおよびＧＬＰ−
１に応答する同一のニューロンはグルコース濃度に対して応答性である［Riedig
er T, et al., Pfluegers Archiv 437(5); Suppl R142, March 1999］。ＣＶＯ
中のアミリン応答性ニューロンは、さらに、心腎制御に関係するアンジオテンシ
ンＩＩ［Rausch S, et al., Pfleugers Archiv. 1997; 433 (Suppl): 619］を含
む他のペプチドに応答すると報告されている。アミリン受容体およびアミリンア
ゴニストおよびアンタゴニスト化合物のスクリーニングおよび評価のための様々
な方法におけるその使用は、１９９３年１１月２３日に発行された共有に係る米
国特許第５,２６４,３７２号に記載される。
【０００６】 上記した論文、特許、および／または特許出願、および本明細書で言及された
または引用された全ての他の文書は、出典明示してその全体が本明細書の一部と
みなされる。本出願人は、いずれの全ての物質および本明細書中で言及され引用
されたいずれのそのような論文、特許、特許出願または他の文書からの情報を本
明細書に物理的に包含させる権利を保有する。
【０００７】 発明の概要 本発明は、最後野、迷走神経の孤束核および／または背側運動核からの膜、細
胞および組織を含む物質を用いて、生理学的に活性な物質、例えば、食物恒常性
において活性を有する物質を同定することに関する。より詳しくは、本発明は、
活性を刺激するかまたは阻害するか、あるいは、最後野、迷走神経の孤束核およ
び／または背側運動核から誘導された調製物に結合する物質を同定するための方
法に関する。当該化合物は、糖尿病、肥満、高血圧およびうっ血性心不全を含む
代謝および心腎疾患を治療するのに有用であろう。
【０００８】 本発明は、ある程度、注入されたアミノ酸に対するインスリン応答が最後野に
損傷のある動物において変化するという驚くべき観察に関する。さらに、本発明
は、この器官がインスリン分泌を制御する信号の中央インテグレータであるとい
う発見にある程度基づく。本発明は、さらに、この器官が食物恒常性において重
要なホルモン応答を最終的に動かす食物知覚機能を有するという発見に基づく。
【０００９】 かくして、本発明は、最後野、迷走神経の孤束核、および／または背側運動核
のいずれかから、単独でまたはいずれかの組合せで一緒に（以下、最後野アゴニ
ストおよびアンタゴニストという）、治療利用のために誘導された調製物におけ
る生物学的作用の可能性のあるスチムレータおよびインヒビターを同定し、スク
リーンし、特性決定するための急速、安価な生理学的方法を提供する。この方法
は、そのような候補分子が最後野、迷走神経の孤束核および／または背側運動核
からの調製物に結合するために―あるいは、その内部の生体プロセスを活性化す
るために、ある種の標識ペプチドホルモンおよび断片およびそれらのアナログを
含む、痕跡量のある種の標識ペプチドに対して競合する能力を評価することを特
徴とする。ヒトにおいて、孤束核（ＮＴＳ；孤核）は、味覚部および心呼吸部に
再分される叉骨形状である。最後野はＶ中に位置する。迷走神経の背側核もＶ内
にある［Nieuwenhuys, R; Voogd, J; van Huijzen, C, The human central nerv
ous system (3rd edition Springer-Verlag, Berlin, 1988)］。ラットにおいて
、孤束核は、形状および関係において、最後野および迷走神経の背側核と同様で
あり、共通、中央、 背中線、 膠状、 間質、中間、 内側 および腹外側部分に
再分されている［Paxinos, G; Watson, C., The rat brain in stereotaxic coo
rdinates (Compact 3rd edition, Academic Press, San Diego, 1997)］。
【００１０】 一つの局面において、本発明は最後野アゴニストまたはアンタゴニストにつき
同定またはスクリーニングに使用するアッセイ方法を提供する。そのようなアッ
セイは、試験サンプルと最後野調製物とを接触させ、ここに、該試験サンプルは
１以上の試験化合物を含有し、該最後野調製物は最後野の種々の成分を含有し；
最後野の知られたアゴニストもしくはアンタゴニストの結合またはそれらによる
活性化が、最後野の成分に対して生物学的に機能することを可能にする条件下で
該試験サンプルと該最後野調製物とをインキュベートし；次いで、該最後野調製
物に検出可能に結合するか、またはそれを活性化する１以上の化合物を含有する
それらの試験サンプルを同定することを含む。最後野調製物は、本明細書に示さ
れるごとく、最後野、迷走神経の孤束核、および／または背側運動核のいずれか
を単独でまたはいずれかの組み合わせで一緒に含有する物質、典型的には、膜、
細胞および／または組織である。かくして、例えば、最後野および孤束核からの
膜、細胞および／または組織を含有する調製物は「最後野調製物」である。最後
野調製物は、限定されないが、（１）最後野からの膜、細胞および／または組織
を含有する調製物、（２）最後野および迷走神経の背側運動核からの膜、細胞お
よび／または組織を含有する調製物、（３）孤束核からの膜、細胞および／また
は組織、（４）迷走神経の孤束核および背側運動核からの膜、細胞および／また
は組織などを含む。
【００１１】 もう一つの具体例において、この方法は、最後野介在活性のイン・ビトロまた
はイン・ビボ刺激または阻害につき、最後野調製物に検出可能に結合する試験サ
ンプルをスクリーンし、次いで、最後野生物学的活性のアゴニストまたはアンタ
ゴニストとして作用するそれらの試験サンプルを同定するステップをさらに含む
。最後野調製物に適用可能な活性アッセイの例は、最後野および／または関連す
る隣接組織の脳スライスの電気生理学、ｃＦｏｓ発現の検出による最後野および
関連する隣接組織の活性化の免疫組織化学検出、細胞内ｃＧＭＰ形成およびＮＯ
Ｓ活性の検出、マイクロ生理計(microphysiometer)を用いる最後野および関連す
る隣接組織の活性化の検出、およびイオンフラックスの変化により検出される最
後野および関連する隣接組織の活性化を含む。
【００１２】 好ましい具体例において、最後野調製物に検出可能に結合する試験サンプルは
、該試験サンプルによる最後野調製物から標識された第１のリガンドの置換を測
定し、次いで、該試験サンプルによる最終野調製物から該標識された第１のリガ
ンドの測定された置換と１以上の既知の第２のリガンドによる最後野から該標識
された第１のリガンドの測定された置換とを比較することによって同定する。上
記方法のいずれかに用いられ、１以上の試験化合物を含有し、陽性の結果を示し
た試験サンプルは、次いで、必要とされ、かつ、適当とされるまで何回も分割し
、再試験して、陽性結果を示す原因となる化合物または試験サンプル中の化合物
を同定し得る。
【００１３】 さらにもう一つの局面において、本発明は、アッセイされるべき試験サンプル
中の最後野調製物−結合化合物の存在もしくは量を決定するのに有用なアッセイ
方法を提供する。そのようなアッセイは、該試験サンプルと最後野調製物とを接
触させ；該試験サンプルが該最後野調製物の成分に結合することにつき、標識し
たリガンドに対して競合する能力を測定し；次いで、所望により、該試験サンプ
ル中に存在する最後野調製物の存在または量を決定するために、該試験サンプル
中の最後野調製物−結合化合物の量と陰性対照サンプルにつき測定された最後野
調製物−結合化合物の量とを関連付け、該陰性対照サンプルはいかなる最後野調
製物−結合化合物も含んでいないことが分っており、および／または該試験サン
プル中の最後野調製物−結合化合物の量と既知量の最後野調製物−結合化合物を
含有することが分っている陽性サンプルに付き測定した最後野調製物−結合化合
物の量とを関連付けるステップを有するアッセイを含む。さらに、さらなる具体
例において、このアッセイ方法を使用して、最後野調製物の特徴を評価し得る。
【００１４】 もう一つの局面において、本発明の最後野調製物の成分を固相に結合させ、様
々なアフィニティークロマトグラフィー法に使用し、例えば、最後野調製物の生
物に結合することが可能な化合物の精製または、そのような化合物またはそのよ
うな化合物のアゴニストもしくはアンタゴニストを含有することが知られている
か、あるいは含有すると思われるサンプルの評価に使用することができる。 上記したように、本発明は最後野物質ならびに、最後野に隣接する脳組織に由
来する物質、すなわち、迷走神経の孤束核および背側運動核を用いることができ
る。
【００１５】 発明の詳細な記載 本発明は最後野に結合するか、あるいはその活性を刺激または阻害する可能性
のある化合物、例えば、食物恒常性に活性を有する化合物をスクリーンし、同定
し、特定決定する方法を含み、それは候補アゴニストおよびアンタゴニストが最
後野調製物の成分に結合することにつき関連する化学化合物に対して競合する相
対的な能力を評価することを特徴とする。
【００１６】 本発明は、最後野は、膵島のように、食物知覚器官であること、およびこの組
織と相互作用する剤は食物恒常性の障害の治療に潜在的に有用な反応を引き起こ
すという驚くべき発見に少なくともある程度基づく。食物知覚に関わる同じ構造
も心腎制御に関連し、そこで作用して代謝機能を修復する剤は正常な心腎機能を
修復するのにも有用であろう。 食物知覚において役割を演じる化合物の能力を同定または評価するのに有用な
一つのそのような方法は、試験サンプルと試験系とを接触させることに関わり、
該試験サンプルは１以上の試験化合物を含有し、該試験系は食物知覚を評価する
系を含有する。
【００１７】 本発明の以下の詳細な記載は、膜調製、結合反応、データ検出およびデータ解
析の技術を含む。それは、最後野調製物−結合化合物の活性を評価する技術も含
む。さらに、この記載は試験物質の医薬製剤およびデリバリーの技術を含む。最
後に、本発明の多数の出願が記載され、高スループットアッセイにおけるその実
用性および最後野機能のアゴニストおよびアンタゴニストを特性決定するアッセ
イを含む。
【００１８】 Ｉ．膜調製 この特別な具体例において、最後野調製物は膜を用いて調製する。最後野膜調
製は、氷浴温度にて、ほぼ中性のバッファー化ｐＨにての短い（４〜１０秒間）
の組織均一化により開始する。一つの具体例において、Polytron （Brinkman In
struments, N.Y.）のごとき機器を用いるが、他の同様なホモジナイザーを用い
ることもできる。組織破壊後、膜は、冷温にて、適当な時間、少なくとも約２０
,０００×ｇ、好ましくは少なくとも１０分間４０,００×ｇのｇ力にて単離する
。通常、外来阻害物資を除去するために、膜は、新鮮なバッファー中で再均一化
することによって少なくとも二回洗浄し、次いで、上記のように再単離する。洗
浄した膜は、フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）またはバシトラ
シンのごときタンパク質分解酵素を含有するバッファー中に再懸濁させる。最終
組織濃度を採用する特定のスクリーニング方法の具体例に適したレベルにまで調
節するのに充分な多量のバッファーを添加することができる。
【００１９】 本明細書に示すように、細胞および／または組織サンプルを使用して、最後野
調製物を生成することもできる。細胞および／または組織サンプルは分野公知の
方法で調製する。
【００２０】 ＩＩ．結合反応 一つの具体例において、スクリーニング方法のためのインキュベーション混合
物は以下のように作製する。ガラス製またはポリマー製チューブに、バシトラシ
ンまたはＰＭＳＦのごときプロテアーゼインヒビターを含有するＨＥＰＥＳのご
ときバッファー溶液、プロテアーゼ無しの血清アルブミン（好ましくは、フラク
ションＶ ＢＳＡ、プロテアーゼ無し）および、所望により、Ｍｇ２＋塩からな
る少量のバッファー混合物（ＨＢＢＭ）を添加する。このバッファー混合物に、
アゴニストまたはアンタゴニストアッセイにつき試験すべき非標識分子を約１０ −１１ ないし１０−６Ｍの濃度にて含有する少量のバッファーを添加する。対照
チューブはバッファーを単独で含有する。この混合物に、約１０ないし約１００
ｐＭのバッファー中最終濃度になるような量の標識最後野調製物リガンドを添加
する。化学標識の高特異的活性の入手可能性および容易さのため、１２５Ｉが該
最後野リガンドを標識するのに好ましい。当該ペプチドホルモンをヒト組織、動
物組織から単離するか、あるいは、化学合成または組換え手段により生成するこ
とができる。
【００２１】 標識最後野調製物リガンドをプロテアーゼ無しフラクションＶ ＢＳＡを含有
する滅菌水に溶解し、等分し、次いで使用するまで凍結保存する。 反応は、例えば、膜を各インキュベーションチューブ添加することによって開
始する。チューブあたりに必要とされる組織の量（より簡便には、膜タンパク質
の量）は組織型に従って決定する。典型的に、約２．５ｍｇの組織からの膜（約
１００μｇの膜タンパク）を添加する。 反応混合物は、ある時間、該時間中に定常条件に達するのに充分な温度にてイ
ンキュベートする。本明細書で用いる「定常」なる語は、結合ホルモンの正味量
に影響する全ての反応およびプロセスの総和を包含する意図である。それは、「
平衡」と同義であることもあるし、ないこともある。
【００２２】 ＩＩＩ．検出 膜を用いる場合、それらを結合後に単離して、標識したおよび標識していない
リガンド間の競合後に結合した標識リガンドの量を決定する。非特異的結合（Ｎ
ＳＢ）を減少させるために予め試薬に浸しておいたガラスファイバーフィルター
（例えば、GF/B, Whatman）を通して、真空装備のBrandel Cell Harvester（Bra
ndel Instruments, Gaithersburg, Maryland, Model M-24）で濾過することによ
って膜を収集することが簡便である。フィルターは、予め、約０．３％のポリエ
チレンイミン中に約５時間浸すのが好ましい。当業者は、本発明を実施するのに
使用し得る、Millipore Filtration Assembly (Model 1225)またはSandbeck fil
ter box (Bennett, J.P., in Neurotransmitter Receptor Binding, H.I. Yamam
ura et al., Raven, New York 1978, page 57-90)のごとき他の血漿膜収集装置
、収集フィルター、およびＮＳＢ−減少試薬を知っているであろう。濾過の直前
および直後の両方に、フィルターを大量（ミリリッター）の氷冷バッファーで洗
浄して不純物質、例えば、未結合標識リガンドを除去する。フィルターを取り出
し、血漿膜が結合する標識リガンドの量を定量する。１２５Ｉが標識である場合
、ガンマ線計数管で放射能を評価する。ケミルミネッセントレポータ分子（例え
ば、AMPPD, Tropix, Inc., Bedford, MA）を用いる場合、生じた光は発光光度
計で定量することができる。酵素および蛍光標識も用いる。 濾過による代わりに、血漿膜は、インキュベーション後、遠心（例えば、２１
,０００ｒｐｍにて、Beckman J-2-21-M 冷却遠心またはBeckman 12 またはEppen
dorf microfuge）により単離し、氷冷バッファーで洗浄し、次いで、そのまま、
または界面活性剤もしくはアルカリによる膜の可溶化後に計数する。
【００２３】 ＩＶ．データ解析 結合／遊離（Ｂ／Ｆ）標識リガンドを結合量の関数としてプロットする結合デ
ータのスキャチャードプロット飽和解析を標準方法により行う。［Blecher 1976
, Blecher 1981, Chapter 1, and Boulton et al., 1986, Chapter 1］を参照せ
よ。 結合量がリガンド濃度の対数の関数としてプロットされる競合曲線はコンピュ
ータにより解析することができ、例えば、４パラメータ論理式（Prism program;
GraphPAD Software, San Diego, California）に非線形回帰させることによる
か、またはDeLeanらのALLFITプログラム（ALLFIT, Version 2.7 (NIH, Bethesda
, MD 20892)）により解析する［Munsun, P.U. and Rodbard, D., Anal. Biochem
. 107:220-239 (1980)］。 結合定数を決定するために、スキャチャード飽和曲線を作成し、［Bylund, D.
B., et al., "Methods for Receptor Binding," in H.I. Yamamura et al., ed
s., Methods in Neurotreansmetter Analysis, Raven Press, New York, 1990 p
p.1-35］に記載されるごとく、修正スキャチャード法により解析することができ
る。 実験的に特異的結合値を得るために、広範囲の痕跡濃度の標識リガンド（典型
的に、１〜１５０ｐＭ）を用いて全結合を得、非常に高い濃度、例えば、１００
ｎＭの非標識リガンドの存在下、チューブを繰り返し再評価して非特異的結合（
ＮＳＢ）を得る。後者の値は各全結合から差し引かれて、全ての濃度の標識リガ
ンドにて特異的結合を得る。
【００２４】 Ｖ．最後野調製物−結合化合物の活性 最後野調製物に結合する化合物の活性を検出するのに有用な活性アッセイの例
は、最後野および／または関連する隣接組織の脳スライスにおける電気生理学、
ｃＦｏｓ発現の検出による最後野および関連する隣接組織の活性化の免疫組織化
学、細胞内ｃＧＭＰ−形成およびＮＯＳ活性の検出、マイクロ生理計を用いる最
後野および関連する隣接組織の活性化の検出、およびイオンフラックスの変化に
より検出される最後野および関連する隣接組織の活性化を含む。 最後野および関連する隣接組織の脳スライスにおける電気生理学を実行する方
法において、細胞外記録は約０．５ｍｍ厚の最後野の脳スライスから作成する。
典型的に、スライスは、以下の組成（ｍＭで）：９５％ Ｏ２および５％ ＣＯ２
で、３７℃にて２９０ｍＯｓｍ／ｋｇで平衡化した、ＮａＣｌ １２４；ＫＣｌ
５；ＫＨ２ＰＯ４ １．２；ＭｇＳＯ４ １．３；ＣａＣｌ２ １．２；ＮａＨＣ
Ｏ３ ２６；グルコース １０；ｐＨ：７．４の人工脳脊髄液（ａＣＳＦ）と共に
過冷却する。細胞外電極を用いて、該スライスにおけるニューロンの自発的また
は刺激作動電位を記録する。電極からの信号は適当に増幅し、信号弁別回路およ
び計数器により加工して、ニューロン活性の測定値を導く。試験物質は過冷却で
適用する。さらに、刺激を負荷して、該脳スライスから記録された活性が、周囲
グルコース（例えば、２、４または６ｍＭの段階）または他の食物における変化
に対する応答性のごとき、代謝制御に関係するものであると同定することができ
る。
【００２５】 ｃＦｏｓ発現の検出による最後野および関連する隣接組織の活性化の免疫組織
化学検出を実行する方法において、ニューロン活性はタンパク質、ｃＦｏｓの誘
発に関連付けられる。このタンパク質またはその発現をコードするＲＮＡの出現
を用いて、構造が活性化されたと示し得る。化合物が最後野及び関連する隣接組
織を活性化するかどうかを試験するために、該試験物質（または対照）を生きて
いる動物に投与する。ｃＦｏｓ発現を誘発する適当な期間の後、例えば９０分間
、動物を麻酔し、４％ パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で経心灌流する。脳を
取り出し、１０％ スクロースを含有するリン酸塩バッファー中での２４時間イ
ンキュベーションにより凍結保存し、その後、２０μｍ厚の凍結セクションにカ
ットする。次いで、セクションは、ｃＦｏｓタンパク質に対して指向された抗体
を含有するリン酸塩バッファー化食塩水中でポリ−Ｌ−リジンで被覆したスライ
ド上で４８時間インキュベートする。アビジン−ビオチンペルオキシダーゼ法を
行い、免疫反応性を検出した。試験物質対対照物質で処理した動物からの脳の間
の最後野および関連する隣接組織におけるｃＦｏｓ免疫反応性の差異を用いて、
それらの構造を活性化する物質を同定し得る。
【００２６】 細胞内ｃＧＭＰ−形成およびＮＯＳ活性を検出する方法において、最後野およ
び関連する隣接組織の活性化は細胞外第２のメッセンジャーの変化を測定するこ
とによって検出し得る。例えば、サイクリックＧＭＰが表面受容体を通じて活性
化を媒介する場合、最後野活性化はイン・ビトロまたはイン・ビボのいずれかで
検出し得る。イン・ビボ研究のために、試験物質または食塩水（対照）を、該第
２のメッセンジャーの分解を阻害するために１０ｍｇ／ｋｇの３−イソブチル−
１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）の腹腔内注射により予め処理されたラットに
皮下注射する。試験物質を投与してからある時間後（例えば、２５分間）、ラッ
トを灌流し、脳の凍結セクションをカットした。イン・ビトロ研究のために、電
気生理学記録のためと同様に、最後野のスライス調製物を作製した。スライスは
、２ｍｌの１ｍＭ ＩＢＭＸを含有する酸素化ａＣＳＦ中で３７℃にてインキュ
ベートする。ある濃度範囲の試験物質を１０ないし４０分間の間添加する。次い
で、試験物質のサイクリックＧＭＰの生成に対する影響を免疫組織化化学的に評
価する。最後野および関連する隣接組織にてのＮＡＤＰＨ−ジアフォラーゼ染色
による一酸化窒素シンセターゼ（ＮＯＳ）活性の検出によって、一酸化窒素のご
とき他の第２のメッセンジャーの活性化の検出のために、同様の試験を採用し得
る。
【００２７】 マイクロ生理計を用いて最後野および関連する隣接組織の活性化を検出するこ
とに関して、リガンドでの刺激後のごとき、細胞活性の変化は、典型的に、エネ
ルギー代謝の速度の変化をもたらすことが理解される。組織の培養、分離された
細胞、細胞下成分、またはスライスの全体的活性化は、それらが酸、副産物の代
謝物を生成する速度により検出し得る。活性化を示す酸性化速度における変化は
、生理計を用いて、最後野および関連する隣接組織からの調製物において検出す
ることができる。
【００２８】 イオンフラックスの変化による最後野および関連する隣接組織の活性化に関し
て、神経細胞に影響を与える信号は、典型的に、細胞膜または他の細胞小室を横
切る種々のイオンチャネルを通るコンダクタンスを制御することに関連するプロ
セスに影響することも知られている。ニューロン組織の活性化はイオンフラック
スの変化により検出し得、これらの後者のイベントは、（細胞内、細胞外、パッ
チクランプによる）電気生理学的記録によるもの、および、電荷分布の変化に感
受性のあるダイベース系（例えば、電圧感受性ダイ）でのごとき、電圧または電
流の変化を検出する他の手段によるものを含む様々な手段により検出し得る。他
の検出系は、カルシウム感受性ダイのごとき、特定のイオン種の存在に感受性で
あろう。他の系は、その産物を容易に検出し得るレポーター遺伝子の誘発により
、例えば、色変化により、間接的にイオンイベントをレポートし得る。これらの
ごとき系を単独でまたは組み合わせて用いて、最後野および関連する隣接組織の
活性化を検出する。
【００２９】 ＶＩ．医薬製剤／デリバリー経路 本発明の方法により同定された化合物は最後野機能を調整する剤として有用で
あろう。本明細書に記載されたそのような化合物の製剤および用量はそれらの薬
理特性の観点から有用である。最後野調製物−結合化合物は、（静脈内、筋肉内
および皮下を含む）非経口投与に適した製剤形態で簡便に供給することができる
。経口、経鼻、頬側、舌下および肺内を含む、代替のデリバリー経路に有用な製
剤および用量も本明細書に記載される。
【００３０】 本発明に有用な最後野調製物−結合化合物は注射または注入用の非経口組成物
として供給し得る。例えば、それらを不活性油、適当には、ゴマ、ピーナッツの
ごとき植物油、オリーブ油、または他の許容される担体中に懸濁させ得る。好ま
しくは、それらは、水性担体中、例えば、約５．６ないし７．４のｐＨにての等
張バッファー溶液中に懸濁させる。これらの組成物は従来の滅菌技術により滅菌
するか、あるいは滅菌濾過することができる。該組成物はｐＨ緩衝剤のごとき、
生理状態に近付けるために必要とされる医薬上許容される補助物質を含有するこ
とができる。有用なバッファーは、例えば、酢酸ナトリウム／酢酸バッファーを
含む。レポジトリー(repository)の形態、すなわち「デポ」徐放性調製物を用い
て、治療上有効量の調製物を経皮注射またはデリバリー後、何時間または何日に
もわたり血流中にデリバリーされるようにすることができる。 塩化ナトリウムまたは、デキシトロース、ホウ酸、酒石酸ナトリウム、プロピ
レングリコール、（マンニトールおよびソルビトールのごとき）ポリオール、ま
たは他の無機もしくは有機溶解物のごとき他の医薬上許容される剤を用いて、所
望の等張性を達成することができる。ナトリウムイオンを含有するバッファーに
は、塩化ナトリウムが特に好ましい。
【００３１】 最後野調製物−結合化合物は、医薬上許容される塩（例えば、酸付加塩)およ
び／またはその錯体としても調剤し得る。医薬上許容される塩は、それらが投与
される濃度にて非毒な塩である。そのような塩の調製は、該組成物がその生理学
的効果に影響することを妨害することなく、該組成物の物理−化学特性を変更す
ることによって薬理学的使用を容易にし得る。物理特性の有用な変更の例は、融
点を低下させて経粘膜投与を容易にすることおよび、その溶解性を増大して当該
薬物のより高濃度の投与を容易にすることを含む。
【００３２】 医薬上許容される塩は、硫酸塩、塩化水素塩、リン酸塩、、スルファミン酸塩
、酢酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホ
ン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、シクロヘキシルス
ルファミン酸塩およびキニ酸塩を含有するもののごとき酸付加塩を含む。医薬上
許容される塩は、塩酸、硫酸、リン酸、スルファミン酸、酢酸、クエン酸、乳酸
、酒石酸、マロン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン
酸、ｐ−トルエンスルホン酸、シクロヘキシルスルファミン酸、およびキニ酸か
ら得られる。そのような塩は例えば、遊離した酸または塩基形態の当該生成物と
１等量以上の適当な塩基または酸とを該塩が不溶な溶媒もしくは媒体中で反応さ
せるか、あるいは、水のごとき溶媒中で反応させ、次いで、それを真空または凍
結乾燥または適当なイオン交換樹脂上で存在する塩と別の塩とを交換することに
よって除去することによって調製することができる。 所望すれば、上記組成物の溶液をメチルセルロースのごとき増粘剤で増粘する
ことができる。それらは、油中水または水中油のいずれかの乳化形態に調製する
ことができる。広汎な医薬上許容される乳化剤のいずれも用いることができ、例
えば、アカシア粉末、（ツィーンのごとき）非イオン性界面活性剤、または（ア
ルカリ性ポリエーテルアルコール硫酸塩またはスルホン酸塩、例えば、トリトン
のごとき）イオン性界面活性剤を含む。
【００３３】 本発明に有用な最後野調製物−結合化合物は一般に許容されている手順に従っ
て成分を混合することによって調製する。例えば、選択された成分を単にブレン
ダーまたは他の標準装置で混合して濃縮混合物を生成することができ、次いで、
それを水または増粘剤および、可能であれば、ｐＨを制御するバッファーまたは
等張性を制御するさらなる溶解物の添加によって最終濃度および粘度を調節する
ことができる。本出願に準じて同定された最後野調製物−結合化合物の最適製剤
および患者への投与の態様は、特定の疾患または障害、所望する効果、および患
者のタイプのごとき当該分野で知られている要因に依存する。典型的に、該化合
物はヒト患者を治療するのに用いられるが、それらは、他の霊長類、ブタ、ウシ
および家禽のごとき家畜およびウマ、イヌおよびネコのごとき競技動物およびペ
ットのごとき他の脊椎動物における同様または同一の疾患を治療するのに用いる
こともできる。
【００３４】 ＶＩＩ．実用性 以下の実施例の結果は、最後野調製物の特定の成分に結合することにつき、化
学化合物が標識した既知のリガンドと競合する能力を測定するための本明細書に
記載された方法が、そのような調製物と相互作用するペプチドおよび他の化学化
合物を同定するのに特に有用な手段を代表することを証明する。本明細書に記載
され特許請求された本発明の実用性のいくつかは以下に、さらに強調される。
【００３５】 Ａ．試験化合物の測定 一つの局面において、実施例は、最後野調製物アッセイを用いて未知の溶液ま
たは混合物中の試験化合物の濃度を決定し得ることをさらに実証する。例えば、
試験化合物は、以下の実施例ＩＩに記載されたようにアッセイすることができる
。例えば、最後野成分からの膜または細胞調製物は、１０−６Ｍの濃度にて、放
射標識試験化合物および非標識試験化合物と共にインキュベートすることができ
る。このように、競合曲線を作成して、アッセイチューブ中の試験化合物の量を
生成した放射標識試験化合物結合の阻害と関連付ける。さらなるチューブにおい
て、非標識ペプチドを未知量の定量すべき試験化合物を含有する溶液によって置
換する。この溶液は、血漿、血清または他の液体、またはアッセイバッファーに
溶解した固体混合物であってよい。好ましくは、該未知溶液は、最終アッセイ体
積の約１０％以下の体積で添加して、該溶液のイオン含有量を著しく変えないよ
うにする。大量の未知物質を用いるならば、等量の塩含有量を含有する溶液を変
化したイオン含有量の結合に対する影響についての対照として含ませる。非特異
的結合、すなわち、高濃度（１０−６Ｍ）の非標識試験化合物またはたの既知結
合化合物の存在下、放射標識試験化合物の結合を各サンプルの全結合から差し引
いて特異的結合を導く。該未知物質により生じた放射標識試験化合物の特異的結
合の阻害の量を試験化合物により生じた阻害曲線と比較して、該未知試料中の最
後野成分に結合することができる物質の量を決定する。これらの計算を実行する
方法は、［Neurotransmitter Receptor Binding, eds H. Yamamura, S.J. Enna,
and M.J. Kuhar (Raven Press, New York, 1991)］のごとき、いくつかの典拠
に記載される。 この方法を用いて、既知または未知サンプル中の最後野結合化合物の量を定量
し、それを用いて、試験化合物、アゴニストおよびアンタゴニストの活性代謝物
、薬物動態学、安定性、溶解性または分布の同定に使用するために、血漿または
他の体液および組織中の最後野結合化合物を定量することができる。必要な場合
、試験物質についてのアッセイの特異性を増大させるために、該未知サンプル中
の他の結合物質の量をこれらの物質に対する放射受容体アッセイで決定し得る。
そのような放射受容体アッセイは、放射標識された既知リガンド、最後野膜調製
物および該未知の試験サンプルを用いて行い得る。
【００３６】 Ｂ．高スループットスクリーニング さらにもう一つの局面において、所望により、種々の生体プロセスを活性化す
るか、または、ある時、ある人により「リガンド」と呼ばれる既知化合物をそれ
らの結合サイトから置換する化合物を同定し、かくして、候補最後野アゴニスト
もしくはアンタゴニストを同定するための、当該分野で知られているもののごと
きロボットシステムを利用して、該最後野成分を高スループットスクリーニング
に用いる。該アッセイを用いて、例えば、合成化合物のライブラリー、植物の抽
出物、海洋生物の抽出物、または細菌もしくは真菌の発酵ブロスをスクリーンし
得る。一つの具体例において、最初のステップは、例えば、１０％までのエタノ
ール、または１％ ＤＭＳＯ、または、必要であれば、化合物の溶解を容易にす
るために５％ アセトニトリルを含有するアッセイバッファー中で、約１０ない
し約１５ｐＭの上記標識既知リガンドで予めインキュベートした約５０ｆＬの上
記最後野調製物と約５０ｆＬの試験化合物の溶液とを接触させる。器官抽出物に
関して、溶媒の最終濃度は、一般に、冷化合物による標識リガンドの標準置換曲
線を２５％置換する濃度、すなわち、測定ＩＣ５０を２５％未満だけシフトさせ
る濃度を超えるべきではない。これは各選択された溶媒につき評価し得る。合成
ライブラリーから同定された化合物に関して、該試験化合物は、陽性試験が発生
する頻度に依存して約１００μＭ、１μＭまたは１０μＭであろう。典型的に、
陽性は、標識リガンドの特異的結合の少なくとも約２０％の減少により表される
。ブロスおよび抽出物では、陽性試験は、陽性試験の頻度により、特異的リガン
ド結合において少なくとも約２０％、５０％または８０％減少により表される。
【００３７】 規定された基準に合致する化合物に関して、最後野との相互作用の効力は生体
プロセスの活性化の度合、または、ある濃度範囲の該試験化合物による該膜もし
くは他の調製物からのリガンドの置換を測定することによって決定する。未知化
合物の混合物では、ブロスおよび抽出物におけるごとく、所望の活性はＨＰＬＣ
を含む分野公知の方法により単離し、精製し、その後、分離した物質を試験して
、どれが所望の活性を保有するのかを決定する。純粋または比較的純粋な活性物
質が得られた場合、最後野にてのその効力を決定し得る。ＮＭＲ、質量分光分析
、および元素分析を含む分野公知の方法を用いて、所望の最後野活性および／ま
たは結合活性を有するいずれの単離物質の化学的同定を行う。 リガンドの選択的置換の後のいずれかの所望する段階にて、陽性試験物質は、
最後野アゴニスト活性を評価する機能アッセイにおいて評価し得る。上記したも
ののごとき、活性アッセイを用いることができる。また、これらのアッセイにお
いて様々な濃度の試験化合物を適用することによって、アゴニストまたはアンタ
ゴニスト作用の効力を決定し得る。
【００３８】 Ｃ．アゴニストおよびアンタゴニスト 他の具体例において、最後野結合アッセイにおいてどの陽性試験結果を示す物
質がアゴニストまたはアンタゴニストであるかの評価に関して、該試験物質を、
例えば、既知のリガンドがサイクリックＡＭＰの合成速度を変化させる最後野膜
または細胞系と接触させる。そのような調製物は、豊富な最後野成分で培養した
細胞系統または細胞自体から調製した膜を含む。ｃＡＭＰレベルの変化は、分野
公知の方法に準じてインキュベートした膜または細胞調製物を暴露した後、放射
免疫アッセイにより測定する。もう一つの具体例において、細胞反応の他の指標
を用いることができる。分析物の例は、ＧＭＰ、ＮＯ、細胞内Ｃａ２＋を含む。
細胞反応のより一般的なインジケータは、マイクロ生理計で測定される酸性化速
度の変化、細胞内電極または電圧感受性ダイにより測定される膜電位の変化、お
よび細胞内電極で検出される熱速度(firing rate)の変化により示されるニュー
ロン活性の変化を含む。例えば、種々の機能的またはレポータ生成物の出現によ
り測定される遺伝子転写または発現の変化も細胞内反応に含まれる。既知のリガ
ンドをその受容体から置換することにおいて陽性の試験結果であり、第２のメッ
センジャー生成物に対して影響しない物質が最後野アンタゴニストとして期待し
得る。アンタゴニスト作用は、種々の濃度の該物質アナログを既知リガンドまた
は既知リガンドアゴニストとインキュベートし、次いで、該既知リガンドまたは
既知リガンドアゴニストにより生じたｃＡＭＰの変化の阻害の程度を測定するこ
とによってさらに評価し得る。
【００３９】 もう一つの局面において、本発明を用いて、最後野成分についてスクリーンす
る。そのような物質は、ヒトまたは動物の血液からの細胞系統、組織から解離さ
れた細胞、および細胞を含むであろう。 最後野および隣接組織からの他の調製物は、脳スライス調製物、脳「チャンク
」、過冷却イン・サイチュ調製物、および最後野反応のいくつかの状況が測定さ
れている全動物調製物を含む。これらの最後野調製物を最後野機能のアゴニスト
およびアンタゴニストの開発のための容易に入手可能な源として用いるであろう
。例えば、一つの具体例において、細胞からの膜はPolytron（Brinkman Instrum
ents）のごとき機器での細胞の均一化、その後の遠心によって得る。そのように
得られた膜を実施例ＩＩに記載したごときバッファー系中で標識既知リガンドと
結合させ、次いで、その実施例に記載したようにインキュベートし、収集する。
標識既知リガンドの該細胞膜または用いられた他の物質への特異的結合は、例え
ば、１０−７Ｍの非標識既知リガンドの存在下で得られた結合の減少を測定する
ことによって同定する。Ｐ＜０．０５のレベルで全結合（３本のチューブ）と非
特異的結合（３本のチューブ）との間の有意差のある細胞を最後野成分機能のさ
らなる研究に用いる。
【００４０】 本明細書に記載され特許請求された最後野調製物結合アッセイを用いても、さ
らに最後野成分を精製し得る。膜は、最後野から実施例ＩＩに記載したように得
る。分別または濃度勾配遠心により得られた細胞下膜断片を評者標識既知リガン
ドの特異的結合につき評価して、タンパク質１ミリグラムあたり最高密度の特異
的最後野成分を含有する膜断片を同定する。好ましくは、最高の成分密度を持つ
膜断片をさらなる精製に用いる。 この膜断片を収集し、トリトン、ジギトニン、オクチルグルコシド、デオキシ
コール酸塩、およびコール酸塩を含むいくつかの膜可溶化剤を含むバッファー化
溶液中、０．００１％ないし１％の界面活性剤濃度にて、低下させた温度（４℃
）にて１時間処理する。（フェニルメチルスルホニルフルオリド、ＥＤＴＡ、ア
プロチニンを含む）プロテアーゼインヒビターをバッファー系に含ませて、可溶
化中またはその後で成分が分解するのを防ぐ。界面活性剤で膜を処理した後、可
溶化されない膜を高速遠心（１００,０００×ｇにて１時間）により沈降させ、
可溶化された成分を含有する上清を上記のごとく放射標識メトラゾンの結合につ
いて評価する。可溶化された成分をポリエチレンイミン被覆フィルター上での濾
過によって収集し得る［Bruns, R.F., et al., Anal. Biochem. 132:74-81 (198
3)］。あるいは、ポリエチレングリコールでの沈殿、ゲル濾過、または平衡透析
のごとき方法により収集する。可溶化された成分の結合特性を評価し、それは膜
局在成分の特性と合致するべきである。
【００４１】 最後野成分を可溶化し、可溶化された成分をアッセイするのに適した所望の条
件を決定した後、既知のリガンドが結合されている担体上でのアフィニティーク
ロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、レクチンアガロースクロマ
トグラフィー、ゲル濾過、および疎水性相互作用クロマトグラフィーのごときク
ロマトグラフィー手順により他の可溶化された膜タンパク質からこれらの可溶化
された成分を精製する。クロマトグラフィーカラム溶出物をタンパク質成分への
特異的最後野成分結合につき試験して、化合物を含有するピークおよび精製の程
度を同定する。最終精製プロトコルに入る前に、各クロマトグラフィーステップ
を試験して、タンパク質１ミリグラムあたり特異的放射標識リガンド結合の増加
により測定される、それが成分純度に寄与する程度を決定する。大量の出発物質
を用いて、所望のクロマトグラフィーステップを連続的に組み合わせて、所望す
るように、部分的にまたは完全に精製された成分を得る。 この方法により部分的にまたは完全に精製した成分を用いて、診断（変化した
成分の密度、分布または抗原性を持つ疾患状態）における使用のため、および最
後野成分発現についての組換えライブラリーのスクリーニングにおける使用のた
め最後野特異的抗体を生起し得る。精製成分調製物を用いても、部分的配列情報
を得られ、それは最後野成分−コード遺伝子配列について組換えライブラリーを
スクリーニングするためのオリゴヌクレオチドプローブを調製するのに有用であ
る。
【００４２】 本発明のもう一つの局面において、最後野調製物における細胞反応の変化、ま
たは最後野にての作用に寄与し得る全身反応の変化を用いて、代謝状態に有用で
あろうと予測されるリガンドを同定する。この具体例は、比較または知識として
、内在リガンドは必要でないという点で、上記のものとは異なる。最後野−介在
作用が全動物調製物において見られる場合、最後野への機能帰属は、この組織が
、例えば、お灸、高周波損傷、吸引、または一般的もしくは選択的毒性である神
経毒物質の局所塗布によって破壊されている動物中で確認し得る。
【００４３】 実施例 本発明の理解を助けるために、一連の実験結果を記載する以下の実施例を含ま
せる。もちろん、本発明に関係する実験は、本発明を特別に限定するものとみな
されてはならず、現在知られまたは後に開発される本発明のそのような変形は、
当業者の理解の範囲内であり、本明細書に記載され、本明細書に特許請求された
本発明の範囲にあるものとみなされる。
【００４４】 実施例Ｉ 膜の調製 膜は、オスのウィスターまたはスプラーグ−ドーリーラット（２００〜２５０
グラム）から調製する。断首後、脳領域をリン酸塩−バッファー化食塩水（ＰＢ
Ｓ）、ｐＨ７．４に４ＥＣにて除去する。組織の重さを量り、次いで、５ｍｌ／
ｇ 組織の氷冷２０ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファー、ｐＨ７．４に入れ、設定４に
てPolytronで１０秒間均一化する。さらに３０ｍｌの冷ＨＥＰＥＳを添加し、ホ
モジネートを４８,０００×ｇにて１５分間遠心する。上清液を廃棄した後、膜
ペレットを４０ｍｌの新鮮なＨＥＰＥＳバッファー中で均一化し、前記のように
遠心する。膜は、バッファー中の遠心および遠心により再び洗浄する。 ０．２ｍＭ ＰＭＳＦを含有する多量の２０ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファー中に、
最終膜ペレットを再懸濁させ、母液から使用直前に、エタノール中０．２Ｍ 溶
液を添加する。約０ないし約２０ｍｇの起源組織／ｍｌの濃度を得るのに充分な
多量のバッファーを用いる。
【００４５】 実施例ＩＩ 脳膜の結合アッセイ 最後野は、先ず、髄をかんぬき部で下方切断および第４脳質底がちょうどその
最大幅に達するところで上方切断することによって得る。次いで、薄束核の外側
縁に沿って切除を行い、最後野および下にある組織を深さ１〜２ｍｍまで除去す
る。次いで、実施例Ｉのように膜を調製する。 膜調製物を０．１〜０．３ｎＭの標識リガンド、例えば、［−１２５Ｉ］アン
ジオテンシンＩＩ（１．１〜１．８ｍＣｉ／μｇ）で１０〜１５分間インキュベ
ートすることによって、結合アッセイを行う。インキュベーション後、該サンプ
ルを氷上に置き、１ｍｌの冷バッファー（１５０ｍＭ ＮａＣｌ）、５０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．２）で希釈し、次いで、Whatman GF/C ガラスファイ
バー（直径２．５ｃｍ）を通して濾過する。該フィルターを１０ｍｌの冷バッフ
ァーで洗浄し、次いで、該フィルター上に保持された放射能を決定する。この実
施例の代表的な手順およびデータは［Sirett, N., et al., Distribution of An
giotensin II Receptors in Rat Brain, Brain Research, 122: 299-312 (1977)
］に基づく。
【００４６】
【表１】
【００４７】 実施例ＩＩＩ 代謝に関連する反応が最後野またはそれに連結する構造に 存在することの全動物確認 ８匹のオススプラーグ−ドーリーラットの最後野は、背側延髄の外科的露出後
の局所的吸引により破壊した（ＡＰＸ）。７匹の対照は、最後野を無傷で残す以
外は、同様に外科処置した（ＳＨＡＭ）。外科手術から回復した後、動物をハロ
センで麻酔し、グルコースクランプ法に付し、それによって、頻繁に決定される
グルコース濃度に応答して変化するグルコース注入により血漿中グルコースを一
定に保った。グルコースクランプの６０分後、２ｍｍｏｌのＬ−アルギニンを１
０分間にわたり静脈内注入した。血漿中のグルコース、乳酸塩、およびインスリ
ンをＬ−アルギンの後９０分間測定した。ＡＰＸ動物において、血漿中インスリ
ン濃度に大きな増加があり、それはＳＨＡＭラットには観察されなかった。これ
らの結果は、食物恒常性に関わる重要なホルモンであるインスリン分泌を制御す
る経路は最後野を含むことを論証する。
【００４８】 当業者は、本発明が目的を実行し、言及された目標および利点、ならびにそこ
に本来備わっているものを得るのによく適合していることを容易に理解するであ
ろう。本明細書に記載される分子錯体および方法、手順、処置、分子、特定の化
合物は、すぐに、好ましい具体例は例示であり、本発明の範囲を限定することを
意図しないことを示す。そこにおける変化および他の使用は当業者に思い浮かび
、それは特許請求の範囲に規定された本発明の精神の範疇に含まれる。 本発明の範囲および精神を逸脱することなく、本明細書に開示された発明に様
々な置換および修飾をすることができることは、当業者とって容易に明らかであ
ろう。 本明細書で言及された全ての特許および刊行物は、本発明が属する分野の技術
水準を示す。全ての特許および刊行物は、あたかも各個別の刊行物が詳細に、別
個に、出典明示して一部とみなされていたかのように、その同じ程度にまで出典
明示して本明細書の一部とみなされる。
【００４９】 本明細書に適当に、例示的に示された発明は、本明細書に詳細に開示されてい
ないいずれの要素または複数の要素、限定または複数の限定の不存在下で実施す
ることができる。かくして、例えば、本明細書の各場合において、「含む(compr
ising)」、「から本質的になる(consisting essentially of)」および「からな
る(consisting of)」なる語はのいずれも、他の２つの語のいずれかと置き換え
ることができる。採用された語および表現は、限定するものではなく、説明の語
として用いられ、そのような語および表現の使用には、示された、記載された特
徴のいずれの相当物またはその部分を排除する意図はないが、種々の修飾が特許
請求された本発明の範囲で可能であることが理解されるであろう。かくして、本
発明は好ましい具体例および最適な特徴により明確に開示されているが、本明細
書に開示された概念の修飾および変形は当業者によることができること、および
そのような修飾および変形は付随する特許請求の範囲に規定された本発明の範囲
にあるとみなされる。 さらに、本発明の特徴または局面がマーカッシュ群によって記載されている場
合、本発明は、それによって、該マーカッシュ群のいずれの個別のメンバーまた
はメンバーのサブ群によっても記載されることを当業者は理解するであろう。 本発明は広く包括的に本明細書に記載されている。該包括的な開示の範囲内に
あるより狭い下位概念および準包括的な分類も本発明の部分を形成する。これは
、上位概念からいずれかの内容を除去するただし書きまたは否定的限定のされた
本発明の包括的記載を含み、それは除去される物質が明確に本明細書に説明され
たかどうかによらない。 他の具体例は、特許請求の範囲にある。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ， ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ， ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，Ｋ Ｒ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ， ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，Ｓ Ｉ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ブロニスラバ・ジェドゥリン アメリカ合衆国92130カリフォルニア州サ ンディエゴ、ステビック・コート12825番 Ｆターム(参考） 2G045 AA40 CA26 CB01 CB17 CB26 FB03 FB05 FB07

Claims (20)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 最後野生体機能を刺激するかまたは阻害する化合物を同定す
    るかまたはスクリーンするのに使用するアッセイ法であって、 （ａ）試験サンプルと最後野調製物とを接触させ、該試験サンプルは１以上
    の試験化合物を含有し； （ｂ）該最後野調製物における生体プロセスの該試験サンプルによる活性化
    、または該最後野調製物への該試験化合物の結合を許容する条件下で該試験サン
    プルと該最後野調製物とをインキュベートし；および （ｃ）該最後野調製物を検出可能に活性化するか、またはそれに結合する１
    以上の化合物を含有するそれらの試験サンプルを同定するステップを含む該アッ
    セイ法。
  2. 【請求項２】 さらに、 （ｄ）最後野介在活性のイン・ビボまたはイン・ビトロ刺激または阻害につ
    き該最後野調製物に検出可能に結合する試験サンプルをスクリーンし；次いで （ｅ）該最後野生体機能のアゴニストまたはアンタゴニストとして作用する
    それらの試験サンプルを同定することを含む請求項１記載のアッセイ法。
  3. 【請求項３】 該最後野調製物が単離した細胞を含むことを特徴とする請求
    項１記載のアッセイ法。
  4. 【請求項４】 該最後野調製物が単離した膜を含むことを特徴とする請求項
    １記載のアッセイ法。
  5. 【請求項５】 該最後野調製物が単離した組織を含むことを特徴とする請求
    項１記載のアッセイ法。
  6. 【請求項６】 該最後野調製物に検出可能に結合する試験サンプルを、該試
    験サンプルによる該最後野調製物からの第１の標識リガンドの置換を測定し、次
    いで、該試験サンプルによる該最後野調製物からの第１の標識リガンドの測定さ
    れた置換と、１以上の既知の第２のリガンドによる該最後野調製物からの第１の
    標識リガンドの測定された置換とを比較することによって同定することを特徴と
    する請求項１記載のアッセイ法。
  7. 【請求項７】 該試験サンプルが１以上の試験化合物を含有し、さらに、 （ｄ）該試験サンプルから２以上のさらなる試験サンプルを調製し、該さら
    なる試験サンプルは、それらが調製された試験サンプルよりも少数の試験化合物
    を含有することにより特徴付けられ；および （ｅ）該試験サンプルまたは、該最後野調製物を活性化するか、もしくは、
    それに結合する化合物が同定されるまで必要なだけ何度もステップ（ａ）〜（ｄ
    ）を繰り返すステップを含む請求項１記載のアッセイ法。
  8. 【請求項８】 該最後野調製物に検出可能に結合する試験サンプルを、該試
    験サンプルによる該最後野調製物からの第１の標識リガンドの置換を測定し、次
    いで、該試験サンプルによる該最後野調製物からの第１の標識リガンドの測定さ
    れた置換と、１以上の既知の第２のリガンドによる該最後野調製物からの第１の
    標識リガンドの測定された置換とを比較することによって同定することを特徴と
    する請求項２記載のアッセイ法。
  9. 【請求項９】 該試験サンプルが１以上の試験化合物を含有し、さらに、 （ｆ）該試験サンプルから２以上のさらなる試験サンプルを調製し、該さら
    なる試験サンプルは、それらが調製された試験サンプルよりも少数の試験化合物
    を含有することにより特徴付けられ；および （ｇ）該試験サンプルまたは、該最後野調製物を活性化するか、もしくは、
    それに結合する化合物が同定されるまで必要なだけ何度もステップ（ａ）〜（ｇ
    ）を繰り返すステップを含む請求項８記載のアッセイ法。
  10. 【請求項１０】 既知または候補最後野生体機能アゴニストまたはアンタゴ
    ニスト化合物につき決定することが求められる１以上の受容体結合特性を評価す
    るアッセイ法であって、 （ａ）該化合物が該最後野調製物への結合につき、標識リガンドに対して競
    合する能力を評価するかまたは測定し、 （ｂ）該化合物が該最後野調製物への結合につき、請求項４記載の標識リガ
    ンドに対して競合する能力を評価するかまたは測定するステップを含む該アッセ
    イ法。
  11. 【請求項１１】 最後野結合化合物につきアッセイすべき試験サンプル中の
    該化合物の存在または量を決定するアッセイ法であって、 （ａ）アッセイすべき試験サンプルと最後野調製物とを接触させ； （ｂ）該試験サンプルが該最後野調製物への結合につき標識リガンドに対し
    て競合する能力を測定し；および、所望により （ｃ）該試験サンプル中の最後野結合化合物の量と、ステップ（ａ）および
    （ｂ）に準じて対照サンプルにつき測定された最後野結合化合物の量とを相関付
    け、該対照サンプルはいずれの最後野結合化合物を含まないことが知られており
    、および/または、該試験サンプル中の最後野結合化合物の量と、ステップ（ａ
    ）および（ｂ）に準じて既知量の最後野結合化合物を含有する対照サンプルにつ
    き測定された最後野結合化合物の量とを相関付けて、該試験サンプル中の最後野
    結合化合物の量を決定するするステップを含む該アッセイ法。
  12. 【請求項１２】 サンプルから最後野結合化合物を分離する方法であって、 （ａ）該サンプルと最後野調製物とを接触させ、該最後野調製物は固体担体
    に結合した最後野の成分を含み；および （ｂ）該最後野調製物に結合するいずれの最後野結合化合物を結合していな
    い試験サンプルの残りから分離するステップを含む該方法。
  13. 【請求項１３】 最後野の成分の存在についての生体物質のスクリーニング
    法であって、 （ａ）該生体物質と第１の最後野結合化合物とを接触させ； （ｂ）該生体物質と第２の最後野結合化合物とを接触させ； （ｃ）所望により、該生体物質と１以上のさらなる最後野結合化合物とを接
    触させ；および （ｄ）該生体物質における最後野調製物につき、該最後野結合化合物の相対
    結合親和性を決定するステップを含む該スクリーニング法。
  14. 【請求項１４】 食物恒常性に関連する最後野の生体機能を調節できる化合
    物につきスクリーニングする方法であって、化合物を最後野調製物に添加し、次
    いで、該生体機能への影響を測定することを特徴とする該方法。
  15. 【請求項１５】 該最後野調節物が、最後野、迷走神経の孤束核物質、およ
    び背側運動核よりなる群から選択される１以上の物質を含む請求項１４記載の方
    法。
  16. 【請求項１６】 該物質が膜、細胞および組織よりなる群から選択される請
    求項１４または１５のいずれかに記載の方法。
  17. 【請求項１７】 該生体機能が膵臓エンドクリン分泌の調節である請求項１
    ４記載の方法。
  18. 【請求項１８】 該生体機能が体内エネルギー含有量の調節である請求項１
    ４記載の方法。
  19. 【請求項１９】 該生体機能が代謝疾患に関係する請求項１４記載の方法。
  20. 【請求項２０】 該代謝疾患が糖尿病および肥満からなる群より選択される
    請求項１９記載の方法。
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