JP2003512055A - ヒトｓｉｔ４会合タンパク質様（ｓａｐｌ）タンパク質及びコード遺伝子；それらの使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 SAPLa及びSAPLbと称する少なくとも２種のイソフォームに見出される、SAPL（SIT4−（胞子形成−誘発された転写体４）−様）と称する遺伝子のクローニング及び特徴づけに関連し、そしてそれに基づいての、核酸、ポリペプチド、オリゴヌクレオチドプローブ及びプライマー、診断又は予後方法、及び他の方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本発明は、核酸、ポリペプチド、オリゴヌクレオチドプローブ及びプライマー
、診断又は予後方法、及び本発明者が、少なくとも２種のイソフォーム型SAPLa
及びSAPLbで見出されるSAPLと称する遺伝子のクローニング及び特徴化に関連し
、そしてそれに基づく他の方法に関する。

【０００２】 哺乳類及び酵母は、細胞周期を制御するためにサイクリン及びサイクリン依存
性キナーゼ（CDK）に依存する類似する機構を使用する。酵母においては、この
機構の生成は、サイクリン、CLN1及びCLN2、及び酵母におけるサイクリン−依存
性キナーゼCDC28（細胞分裂制御）を包含する（Dynlacht, 1997, Nature 389, 1
49-152）。CDK1として知られているセリン/トレオニンキナーゼCDC28の活性は、
G₁開始、すなわち酵母細胞周期における制御現象の完結のために必須である。CD
C28活性は、サイクリン、CLN1及びCLN２のレベルにより制御される。CDC28の発
現レベルは、細胞周期を通して、比較的一定して存続する。

【０００３】 対照的に、遺伝子CLN1及びCLN2のmRNA発現レベルは、G₁後期の間、劇的に上昇
する。CLN1及びCLN2のこの発現は、SIT4 Ppase（タンパク質ホスファターゼ）に
依存する（Fernandez-Sarabiaなど., 1992. Genes Dev. 6,2417-2428）。SIT4 P
paseは、sit4（胞子形成−誘発された転写体４）遺伝子によりコードされるタイ
プ2Aホスファターゼである（Suttonなど. 1991. Mol. Cell. Biol. 11, 2133-21
48）。

【０００４】 SIT4タンパク質は、哺乳類タイプ2Aホスファターゼの触媒サブユニットに対し
て55％同一であり、そして哺乳類タイプ１ホスファターゼに対して40％同一であ
る。ヒトcDNAクローン、すなわち酵母において発現される場合、sit4変異体を補
充する能力を有するタンパク質をコードするタンパク質ホスファターゼ６が得ら
れた（Bastians and Ponstingl, 1996, J. Cell Sci. 109, 1865-2874）。従っ
て、たぶん、タンパク質ホスファターゼ６又は関連するホスファターゼは、SIT4
の哺乳類オルト体である。

【０００５】 sit4突然変異の酵母に遺伝子分析は、SIT4 Ppaseが、作用の一時的又は実施点
を伴なって、CDC28のその期に類似する期で、後期G₁からのS期への細胞周期の進
行のために必要であることを示した（Suttonなど., 1991, Mol. Cell. Biol. 11
, 2133-2148）。SIT4タンパク質は、190及び155kDの見掛け分子量を有する２種
のタンパク質に結合されることが見出された。SIT4結合タンパク質、すなわちSA
P155及びSAP190をコードする遺伝子のクローニングは、タンパク質SAP185及びSA
P4をコードする２種の追加の関連する遺伝子の同定をもたらした（Lukeなど., 1
996, Mol. Cell. Biol. 16, 2744-2755）。SAPファミリーのメンバーの一列配列
は、多くの保存された残基を示し（Lukeなど., 1996, Mol. Cell. Biol. 16, 27
44-2755）、それらのいくつかはSAPLにも存在する。

【０００６】 SAPタンパク質は、SIT4ホスファターゼと特異的に相互作用するように見える
（Lukeなど., 1996, Mol. Cell. Biol. 16, 2744-2755）。すべての４個のSAP遺
伝子の欠失は、sit4の欠失に同等である表現型をもたらし、従って、SIT4とのそ
れらの結合は、その機能のために必須である（Lukeなど., 1996, Mol. Cell. Bi
ol. 16, 2744-2755）。SAP遺伝子の過剰発現は一定のsit4感温性変異体を抑制す
ることができるので、SAPタンパク質はSIT4 Ppaseの正のモジュレーターとして
作用すると思われる。SAPタンパク質がSIT活性を制御する機構は未知である。

【０００７】 それまで示唆されて来た１つの可能性は、SAPタンパク質が、タイプ１ホスフ
ァターゼのグリコーゲン標的化サブユニットのために見出される態様に類似する
態様で、SIT4 Ppaseの基質特異性を高めることである（Lukeなど., 1996, Mol.
Cell. Biol. 16, 2744-2755）。この場合、SIT4は、サイクリン−依存性キナー
ゼであるCDC28に類似する態様で、SAP−依存性ホスファターゼであろう（Lukeな
ど., 1996, Mol. Cell. Biol. 16, 2744-2755）。作用の態様にもかかわらず、
決定的酵素、すなわちSIT4 Ppaseの活性の制御における酵素細胞周期のSAPタン
パク質の重要性は十分に確立されている。

【０００８】 本発明者は現在、ヒト染色体11q13上のIDDM4遺伝子座から、高く関連するタン
パク質の他のスプライシング及びコーディングから生じる新規遺伝子の２種のイ
ソフォームを最初に開示している。前記イソフォームは、本発明者により、“SA
PLa”（SAP様）及び“SAPLｂ”と命名された。

【０００９】 PAPL cDNA及びSAPLタンパク質の特徴： 他のスプライシングから生じる２種の十分な長さのcDNA配列が、染色体11q13
上のIDDM4遺伝子座から単離され、そしてSAPLa（SAP様）及びSAPLｂと命名され
た。SAPL遺伝子はまた、本発明によれば、DM4E4としても知られている。4793個
のヌクレオチドの最長のcDNA（図１（a））は、793個のアミノ酸のタンパク質SA
PLa（図１（ｃ））をコードする読み取り枠（図１（ｂ））を含む。ヌクレオチ
ド278での推定上の開始メチオニンコドンAGCATGTは、＋４位置ではなく、−３位
置で（プリン、好ましくはA）、翻訳の効果的な開始のためのKozakコンセンサス
配列に整合する（Kozak, 1996, Mamm. Genom 7, 563-574）。このタンパク質の
予測される分子量は、89kドルトンであり、そしてこのタンパク質は4.31の等電
点を有する。

【００１０】 前記タンパク質は、トランスメンブランに及びドメインとして作用する高い可
能性を有する疎水性アミノ酸のいずれの延長部分も含まず、タンパク質輸送のた
めのシグナルペプチドも含まない。従って、SAPLaは、たぶんほとんど、細胞の
細胞質部分に局在化される。非最適開始が複数の開始部分を誘導することができ
る（Kozak, 1996,Mamm. Genome 7, 563-574）。Kozakコンセンサスに適合する最
初のATGコドンは、ヌクレオチド482、すなわちGACATGGであり、これは725個のア
ミノ酸のタンパク質をもたらす（図１（ｄ））。SAPLa cDNAは、ヌクレオチド35
92−3597及び4115−4120でポリアデニル化のためのコンセンサスシグナルを含む
。

【００１１】 3228個のヌクレオチドの第２cDNA（図２（ａ））、すなわちSAPLbは、791個の
アミノ酸のタンパク質（図２（ｃ））、すなわちSAPLBをコードする読み取り枠
（図２（ｂ））を含む。それらの２種のタンパク質、すなわちSAPLa及びSAPLbは
、第１の776個のアミノ酸と100％同一である。SAPLbは、SAPLaのように、89kド
ルトンの予測される分子量、及び4.3の等電点を有し、それは細胞質において発
現されることが予測される。SAPLa及びSAPLbの両者は、アミノ酸562−573からの
アミノ酸配列Ser−Thr−Asp−Ser−Glu−Glu（STDSEE）のタンデム反復体を含む
。

【００１２】 Smith−Watermanアルゴリズムを用いてのタンパク質データベースとのSAPLの
比較は、それぞれ酵母タンパク質のSAPファミリーの２種のメンバー、すなわちS
AP190及びSAP185に有意な程度の類似性を示す（p＝6.01e−13及びp＝2.02e−12
）。より低い程度の類似性、すなわちp＝2.05e−2は、このファミリーの３番目
のメンバー、SAP155であることが見出される。SAPLのアミノ酸94−724とSAP190
との間のアミノ酸配列同一性は19％である。類似する領域上で、SAPLはSAP185に
対して18％同一である。

【００１３】 SAPLに対する類似性を有する追加の哺乳類遺伝子を調べるためのアルゴリズム
tFASTA（6個の可能的な骨格でのデータベースにおけるすべてのヌクレオチド配
列を翻訳し、そしてFASTAアルゴリズムを用いて、それと、入力タンパク質配列
のアミノ酸配列を比較する）は、EST配列の同定をもたらしたが、しかし十分な
長さのcDNA配列ではなかった。従って、本出願において同定される十分な長さの
SAPL cDNAは、酵母SAPファミリーの哺乳類相同体のアミノ酸配列の最初の決定を
提供する。

【００１４】 10で設定されるGapWeight及び１で設定されるGapLengthWeightと共に、プログ
ラムGCGプログラムを用いての、SAPL、SAP190及びSAP185の複数の配列の整列が
、図３に示される整列（alignment）を生成する。この整列は、いくつかの保存
されたモチーフを示し、それらの多くはSAPファミリーの４種のメンバー内に保
存される（SAP4, SAP155, SAP185及びSAP190）。最も目立って保存されたモチー
フは、残基333−338、WNNFLH、及び残基403−414、R(X)GYMGHLT(XX)AでのSAPLに
位置する。残基102−108、LL(X)(K/R)L（芳香族）S及び残基163−168、MD（疎水
性）LL（K/R）の多くの他の保存された領域がまた存在する。SAPLのSTDSEE反復
体は保存されないが、前記タンパク質のこの部分、すなわち残基539−591に多く
の保存された酸性残基が存在する。

【００１５】 それらの保存されたモチーフのいくつかは、SAPLに最も類似するSAP190及びSA
P18のみを除いて、すべての数のSAPファミリーに見出される（図３）。それらは
、次の前に示されたモチーフの部分を包含する：333−338、WNNF（疎水性）Hの
モチーフ、及び403−414、GYMGのモチーフ。SAPLとSAPファミリーのメンバーと
の間で同一である多くの他の残基が図３に示されている。SAPタンパク質は、お
互い類似するタンパク質ではなく、例えばSAP185はそれぞれ、SAP155及びSAP190
に対してわずか14％及び42％の同一を示す。前記タンパク質がこのファミリー内
に保存されるモチーフを含む発見は、それが酵母SAPファミリーに関連する強い
表示を提供する。

【００１６】 多くの可能性あるタンパク質リン酸化部位が、SAPLタンパク質に見出される（
第４表）。それらは、cAMP依存性タンパク質キナーゼ、タンパク質キナーゼC及
びカゼインキナーゼ２のための部位を包含する。タンパク質リン酸化は、タンパ
ク質の可逆性修飾、及びタンパク質機能を制御するための重要な機構である。さ
らに、酵母においては、sit4遺伝子の欠失は、SAPタンパク質の過リン酸化をも
たらし（Lukeなど., 1996, Mol. Cell. Biol. 16, 2744-2755）、従って、個の
タンパク質のファミリーがタンパク質リン酸化を受けやすい直接的な証拠が存在
する。

【００１７】 従って、たぶん、SAPLは、第４表に列挙される部位の少なくともいくつかの部
位でリン酸化される。さらに、たぶん、SAPL機能はタンパク質リン酸化により制
御される。SAPLのタンパク質リン酸化は、SAPLリン酸化のレベルを制御する化合
物についてのアッセイにおいて使用され得る。それらの化合物は、SAPLに対して
作用するキナーゼ又はホスファターゼのいずれかを示すことができる。そのよう
な態様で単離された化合物は、SAPLの機能を変性することに治療的有用性を有す
ることができる。

【００１８】 SAPL cDNAのクローニングは、SAPLタンパク質及び種々のイソフォームの過剰
発現、及び酵母におけるSAP変異体を補充する能力の試験を可能にする。同様に
、酵母におけるヒトSAPLの発現は、SAPLとSIT4との間の物理的会合の試験を可能
にする。SAPL cDNAのクローニングはまた、相互作用し、そしてヒトタンパク質
ホスファターゼ６及び関連するホスファターゼの活性を制御するSAPLの能力の試
験を可能にする。医薬的可能性の分子のスクリーニングにおけるSAPLの有用性は
、下記にさらに論じられる。

【００１９】 ホスファターゼ、例えばSIT4チオルト体の活性は、細胞周期の進行のために必
要であるので、ホスファターゼの活性を示す化合物が、癌及び他の増殖性疾患の
処理において有用であり得る。SAPLタンパク質は、ホスファターゼを活性化し、
又はその特異性を修飾するために、酵母において、SAPタンパク質に類似する態
様で作用することができる。これはまた、ホスファターゼの活性を制御する、た
とえばそれを阻害する化合物についてのアッセイにおけるSAPLの有用性を示す。

【００２０】 サイクリン/CDKシステムが、細胞分裂のみならず、また最終的に分化された細
胞におけるアポプトシスに影響を及ぼす環境因子をモニターするために使用され
る証拠が存在する（Gao and Zelenka, 1997, BioEssays 19, 307-315）。一定の
サイクリンがT−細胞において発現されるので、この機能はT−細胞アポプトシス
の介在において重要であり得る。選択されたT−細胞集団のアポプトシスは、免
疫系の制御及び自己免疫性の防止において決定的な要素である。

【００２１】 従って、IDDM4遺伝子内のSAPLの位置、及びホスファターゼの活性又は特異性
のいずれかを制御する、その提供された生物学的機能は、このタンパク質が免疫
自己耐性を維持することにおいて重要であることを示す。SAPLの活性を変性する
化合物は、T−細胞増殖又はアポプトシスのアッセイにおいて試験され得る。SAP
L活性を変性できる化合物は、すべての４種の酵母SAP遺伝子を欠失された変異体
酵母におけるSAPL相補性を刺激するか又は阻害する能力により同定され得る（Lu
keなど., 1996, Mol. Cell. Bilo. 16; 2744-2755）。

【００２２】 SAPL遺伝子内の多型現象の存在、及びIDDM遺伝子座内のこの遺伝子の位置は、
診断マーカーとしての多型現象の使用を可能にする。それらの多型現象は、I型
糖尿病に対する感受性を付与する染色体領域の存在についてアッセイするために
使用され得る。この感受性は、ISPL遺伝子自体内の機能的多型現象のためであり
、又はSAPL多型現象と連鎖不均衡で存在する隣接遺伝子内の機能的多型現象のた
めであり得る。

【００２３】 本発明の1つの観点によれば、そのアミノ酸配列が図１（ｃ）及び図（ｄ）に
示されるSAPLaポリペプチドイソフォーム、及びそのアミノ酸配列が図２（ｃ）
に示されるSAPLbポリペプチドイソフォームのいずれかであり得る、SAPLポリペ
プチドをコードする核酸分子が提供される。

【００２４】 従って、本発明の個々の観点は、図１（ｃ）、図１（ｄ）又は図２（ｃ）に示
されるアミノ酸配列を包含するポリペプチドをコードする核酸を提供する。さら
に、本発明の追加の観点は、それぞれのSAPLイソフォームa及びｂに関して同一
である、図１（ｃ）及び図２（ｃ）に示される最初の776個のアミノ酸を包含す
るポリペプチドをコードする核酸を提供する。図１（ａ）、図１（ｂ）、図２（
ａ）又は図２（ｂ）に示される本発明のコード配列が包含され、又はそれらは示
される配列の１つの変異体、変性体、誘導体又は対立遺伝子であり得る。配列は
、示される配列の１又は複数のヌクレオチドの１又は複数の追加、挿入、欠失及
び置換である変更により、前記図に示される配列とは異なることができる。ヌク
レオチド配列の変更は、遺伝子コードにより決定されるように、タンパク質レベ
ルでのアミノ酸変更をもたらすことができる。

【００２５】 従って、本発明の核酸は、本明細書における図に示される配列とは異なる配列
を包含し、さらに同じアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードすることがで
きる。

【００２６】 他方では、前記コードされたポリペプチドは、図１（ｃ）、図１（ｄ）図２（
ｃ）に示されるアミノ酸配列とは、１又は複数のアミノ酸残基により異なるアミ
ン酸配列を含んで成る。それらの図の１つに示される配列のアミノ酸配列変異体
、変性体、誘導体又は対立遺伝子であるポリペプチドをコードする核酸がさらに
、本発明により提供される。そのようなポリペプチドは、下記で論じられる。そ
のようなポリペプチドをコードする核酸は、ヌクレオチド配列及び/又はコード
されたアミノ酸レベルで、適切な図に示されるコード配列及び/又は適切な図に
示されるアミノ酸配列と約60％以上の相同性、約70％以上の相同性、約80％以上
の相同性、約90％以上の相同性又は約95％以上の相同性を示す。

【００２７】 アミノ酸“相同性”に関しては、これは、類似性（例えば、アルゴリズムGAP
（Genetics Computer Group, Madison, WI）を用いて決定されるように、アミノ
酸類似性の確立された原理に従う）又は同一性であることが理解され得る。GAP
は、適合の数を最大にし、ギャップの数を最少にする。２種の完全な配列を整列
のためのNeedleman and Wunschアルゴリズムを使用する。一般的に、12のギャッ
プ創造ペナルティー及び４のギャップ延長ペナルティーを有するデフォールトパ
ラメーターが使用される。

【００２８】 GAPの使用は好ましいが、しかし他のアルゴリズム、例えばBLAST（Altschulな
ど., 1990, J. Mol. Biol. 215: 405-410の方法を使用する）、FASTA（Pearson
and Lipman, 1988, PNAS USA 85: 2444-2448の方法を使用する）、又はSmith−W
atermanアルゴリズム（Smith and Waterman, 1981, J. Mol. Biol. 147: 195-19
7）（それは一般的に、デフォールトパラメーターを使用する）が使用され得る
。本明細書における用語“相同”及び“相同の”の使用は、用語、例えば２種の
ヌクレオチド配列が適切な条件下で組換えするのに十分に類似することを単に必
要とする“相同組換え”の標準の使用を維持することにおいて、比較される配列
間のいずれかの必要な進歩的な関係を包含するものではない。本発明の核酸によ
りコードされ得る、本発明のポリペプチドのさらなる論議が、下記に見られる。

【００２９】 本発明は、緊縮条件下で本明細書に開示される、いずれか１又は複数の特定の
配列とハイブリダイズする核酸に及ぶ。適切な条件は、約80〜90％同一である配
列の検出に関しては、0.25MのNa₂HPO₄, pH7.2, 6.5%のSDS, 10%の硫酸デキスト
ランにおいて42℃での一晩のハイブリダイゼーション、及び0.1×SSC, 0.1%のSD
Sにおいて55℃での最終的洗浄を包含する。約90％以上同一である配列の検出に
関しては、適切な条件は、0.25MのNa₂HPO₄, pH7.2, 6.5%SDS, 10%の硫酸デキス
トランのおいて65℃での一晩のハイブリダイゼーション、及び0.1×SSC、0.1％S
DSにおいて60℃での最終洗浄を包含する。

【００３０】 コード配列は、図１（ａ）又は図２（ａ）に示される配列を有し、そして図１
（ｃ）又は図２（ｃ）の十分なポリペプチドをコードする核酸分子内に包含され
得る。それらの配列の変異体、変性体、誘導体及び対立遺伝子は、前記パラグラ
フ及び次の開示される用語に類似する用語において、本発明の範囲内に包含され
る。同じことが、そのアミノ酸配列が図１（ｄ）に示されるSAPLaの第２イソフ
ォームのために適用できる。

【００３１】 IDDM又は他の疾病に関連する本発明の配列の変更は、本発明の態様によれば、
好ましい。スクリーニングのための、例えば診断又は予後目的のための関係は、
下記に論じられている。本発明の特定のヌクレオチド配列対立遺伝子は、第２表
に示される変動を有する配列を有する。１又は複数のそれらの配列が、IDDM又は
他の疾病への感受性に関連している。

【００３２】 一般的に、本発明の核酸は、天然において関連する材料を有さないか又は実質
的に有さない、例えばたぶん、発現のための１又は複数の制御配列を除いて、ヒ
トゲノムにおける遺伝子を端に有する核酸を有さないか又は実質的に有さない、
単離された及び/又は精製された形で、単離物として提供される。核酸は完全に
又は部分的に合成的であり、そしてゲノムDNA、cDNA又はRNAを包含することがで
きる。本明細書に示されるコード配列は、DNA配列である。本発明の核酸がRNAを
包含する場合、示される配列との関係は、Tに代わってUを有するRNA同等物との
関係を包含するものとして解釈されるべきである。

【００３３】 核酸は、複製可能ベクターの一部として提供され得、そしてまた、上記の示さ
れるような核酸を包含するベクター、特に、コードされるポリペプチドが適切な
条件下で発現され得るいずれかの発現ベクター及びいずれかのそのようなベクタ
ー又は核酸を含む宿主細胞が、本発明により提供される。これに関しての発現ベ
クターは、インビトロ発現システム、例えば網状赤血球溶解物において、又はイ
ンビボでの真核細胞、例えばCOS又はCHO細胞において、又は原核細胞、例えばE.
コリにおいて、ポリペプチドの発現のための興味ある且つ適切な制御配列のポリ
ペプチドをコードする核酸を包含する核酸分子である。これはさらに下記で論じ
られる。

【００３４】 本発明に従って提供される核酸配列は、試験サンプルにおける興味ある（及び
本発明に従って存在することができる）核酸を同定するために有用である。本発
明は、本明細書に示される配列又は相補的配列を有するプローブの標的核酸への
ハイブリダイゼーションを包含する、興味ある核酸を得るための方法を提供する
。ハイブリダイゼーションに続いて一般的に、好結果をもたらすハイブリダイゼ
ーションの同定及び１又は複数のPCR段階を包含することができる、プローブに
ハイブリダイズしている核酸の単離が包含される。それらの図のいずれかに示さ
れる完全な配列を有するプローブを使用することは通常必ずしも必要ではないで
あろう。より短いフラグメント、特に、保存されたモチーフをコードする配列を
有するフラグメントが使用され得る。

【００３５】 本発明の核酸は、図のいずれかに示される核酸配列の１又は複数のフラグメン
ト、特にコドン使用法又は統計学的分析に基づいて、比較的まれな配列のフラグ
メントとハイブリダイズするよう企画された、１又は複数のオリゴヌクレオチド
プローブを用いて得ることができる。図のいずれかに示される核酸配列のフラグ
メントとハイブリダイズするよう企画されたプライマーは、標的核酸がクローン
化されているクローニングベクターにおける、又はライブラリーにおけるcDNAが
オリゴヌクレオチドリンカーに連結され、そしてPCRが、示される配列とハイブ
リダイズするプライマー及びオリゴヌクレオチドにハイブリダイズするプライマ
ーを用いて行われる、いわゆる“RACE”（cDNA末端の急速な増幅）における配列
にハイブリダイズするよう企画された１又は複数のオリゴヌクレオチドと共に使
用され得る。

【００３６】 そのようなオリゴヌクレオチドプローブ又はプライマー、及び十分な長さの配
列（及び変異体、対立遺伝子、変異細胞及び誘導体）はまた、下記に、より詳細
に論じられるような診断及び/又は予後関係により、対立遺伝子、変異体及び変
異細胞の存在について、核酸を含む試験サンプルをスクリーニングすることにお
いても有用である。

【００３７】 １又は複数の細胞（例えば、ヒト）から単離され、そして/又は精製された核
酸、又は細胞から単離され、そして/又は精製された核酸に由来する核酸ライブ
ラリー（例えば、細胞から単離されたmRNAに由来するcDNAライブラリー）は、選
択的ハイブリダイゼーションのための条件下でプローブされ、そして/又は特定
の核酸増幅反応、例えばポリメラーゼ鎖反応（PCR）にゆだねられ得る（例えば
次の文献に再考される: ”PCR Protocols; A Guide to Methods and Applicatio
ns”, Eds. Innisなど., 1990, Academic Press, New York; Mullisなど., Cold
Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 51: 263, (1987), Ehrlich (ed.), PCR T
echnology, Stockton Press, NY, 1989; 及びEhrlichなど., Science, 252: 164
3-1650, 1991）。

【００３８】 PCRは、鋳型核酸の変性（二重鎖の場合）、標的物へのプライマーのアニーリ
ング、及び重合の段階を包含する。増幅反応において鋳型としてプローブされる
か又は使用される核酸は、ゲノムDNA、cDNA又はRNAであり得る。他の特定の核酸
増幅技法は、鎖置換活性化、QBレプリカーゼシステム、修復鎖反応、リガーゼ鎖
反応及び連結活性化転写を包含する。便利には、及び一般的に好ましいので、用
語PCRは、他の核酸増幅技法が当業界により適用され得る場合において、本明細
書に使用される。特にことわらない限り、PCRに関しては、当業界において入手
できるいずれかの適切な核酸増幅反応の使用を包含するよう取られるべきである
。

【００３９】 クローニングの場合、十分な長さのコード配列を生成するために連結されるべ
き１又は複数の遺伝子フラグメントが必要である。また、十分な長さのコード核
酸分子が得られなかった場合、十分な分子の一部を表す小さな分子が、十分な長
さのクローンを得るために使用され得る。挿入体は、部分cDNAクローンから調製
され、そしてcDNAライブラリーをスクリーンするために使用され得る。単離され
た十分な長さのクローンは、発現ベクター中にサブクローン化され得、そして活
性が、例えばレポータープラスミドにより適切な宿主細胞中にトランスフェクト
することによってアッセイされ得る。

【００４０】 １つの方法は、標的核酸への１又は複数の（例えば、２種の）プローブ又はプ
ライマーのハイブリダイゼーションを包含することができる。核酸が二本鎖DNA
である場合、一本鎖DNAを生成するためには、一般的、変性に続いてハイブリダ
イゼーションが行われるであろう。ハイブリダイゼーションは、PCR方法の一部
として、又はPCRを包含しないプローブ方法の一部とし存在することができる。
１つの典型的な方法は、PCR及び低い緊縮性ハイブリダイゼーションの組合わせ
である。当業者に利用できる多くのものから選択されるスクリーニング方法は、
好都合なハイブリダイゼーション現象及び単離された、ハイブリダイズされた核
酸を同定するために使用され得る。

【００４１】 標的核酸（例えば、DNA）へのプローブの結合は、当業者により、種々の技法
のいずれかを用いて測定され得る。例えば、プローブは、放射性的に、蛍光的に
又は酵素的にラベルされ得る。プローブのラベリングを使用しない他の方法は、
制限フラグメントの長さの多型現象の試験、PCRを用いての増幅、RNアーゼ分解
、及び対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプロービングを包含する。プロービ
ングは、標準のサザンブロット技法を用いることができる。例えば、DNAは、細
胞から抽出され、そして種々の制限酵素により消化され得る。次に、制限フラグ
メントは、変性及びニトロセルロースフィルターへの移行の前、アガロースゲル
上での電気泳動により分離され得る。ラベルされたプローブは、フィルター上の
DNAフラグメントにハイブリダイズされ、そして結合が決定される。プロービン
グのためのDNAは、細胞からのRNA調製物から調製され得る。

【００４２】 予備実験は、低い緊縮条件下で、制限酵素により消化されたDNAサザンブロッ
トに種々のプローブをハイブリダイズすることによって行われ得る。適切な条件
は、多数のハイブリダイズするフラグメントが、低いバックグラウンドハイブリ
ダイゼーション下で得られる場合、達成される。それらの条件下で、核酸ライブ
ラリー、例えば発現された配列の代表であるcDNAライブラリーが研究され得る。
当業者は、要因、例えば、オリゴヌクレオチドの長さ及び塩基組成、温度及び同
様のものを考慮して、選択的ハイブリダイゼーションのための所望する緊縮性の
適切な条件を十分に使用することができる。

【００４３】 アミノ酸配列情報に基づいて、オリゴヌクレオチドプローブ又はプライマーは
、遺伝子コードの縮重、及び適切な場合、候補体核酸が由来する生物のコドン使
用法を考慮して、企画され得る。核酸増幅への使用のためのオリゴヌクレオチド
は、約10又はそれ以下のコドン（例えば、6.7又は８）を有することができ、す
なわち約30又はそれ以下の長さ（例えば、18, 21又は24）のヌクレオチドであり
得る。一般的に、14個以上の長さのヌクレオチドであるが、しかし18〜20個であ
る必要はない。当業者は、PCRのような工程に使用するためのプライマーの企画
に十分に精通している。オリゴヌクレオチドプライマーを合成するための種々の
技法、例えばホスホトリエステル及びホスホジエステル合成方法は、当業界にお
いて良く知られている。

【００４４】 プローブ又はPCRプライマーの企画への使用のために適切な、好ましいアミノ
酸配列は、図３に示されるモチーフをコードする、保存された（完全に、実質的
に部分的に）配列を包含することができる。 本発明のさらなる観点は、本発明の核酸又は相補的配列を、核酸の獲得及び/
又はスクリーニング方法への使用のために提供する、本明細書における図のいず
れかに示されるヌクレオチド配列のオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドフ
ラグメントを提供する。いくつかの好ましいオリゴヌクレオチドは、第１表に示
される配列、又は本発明の核酸と選択的にハイブリダイズする能力を失わないで
、すなわち所定の配列の１つの配列とのオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチ
ドの類似性の程度が十分に高い、１又は複数のヌクレオチドの付加、置換、挿入
又は欠失により示される配列のいずれかとは異なる配列を有する。

【００４５】 いくつかの好ましい態様においては、示される配列のいずれかのフラグメント
、又はIDDM又は他の疾病感受性に関連するいずれかの対立遺伝子のフラグメント
である本発明のオリゴヌクレオチドは、少なくとも約10個の長さのヌクレオチド
、より好ましくは少なくとも約15個の長さのヌクレオチド、より好ましくは少な
くとも約20個の長さのヌクレオチドである。それらのフラグメント自体は個々に
、本発明の観点を提供する。フラグメント及び他のオリゴヌクレオチドは、論じ
られるようなプライマー又はプローブとして使用され得るが、しかしまた、IDDM
又は他の疾病感受性を示す配列の試験サンプルにおける存在を決定することに関
する方法においても生成され得る（例えば、PCRによる）。

【００４６】 診断及び/又は予後情報への、例えばIDDM又は他の疾病に対して感受性の決定
への核酸の使用を包含する方法、及びIDDM又は他の疾病感受性を示す配列の存在
の決定に関する他の方法が、下記に論じられる。

【００４７】 本発明のオリゴヌクレオチドのさらなる態様は、本明細書に記載される核酸配
列に基づくアンチセンスオリゴヌクレオチド配列である。アンチセンスオリゴヌ
クレオチドは、核酸、プレ−mRNA又は成熟mRNAの相補的配列に対してハイブリダ
イズするよう企画され得、所定のDNA配列によりコードされるポリペプチド（例
えば、生来のポリペプチド又はその変異体形）の生成を妨害し、その結果、その
発現が全体的に低められ又は妨げられる。

【００４８】 アンチセンス技法は、例えば5’フランギング配列におけるコード配列、すな
わち遺伝子の制御配列を標的化するために使用され得、それにより、アンチセン
スオリゴヌクレオチドは制御配列を妨害することができる。アンチセンスオリゴ
ヌクレオチドは、DNA又はRNAであり得、そして約14−23個の長さのヌクレオチド
、特に約15−18個の長さのヌクレオチドのものであり得る。アンチセンス配列及
びそれらの使用の構成は、Peyman and Ulman, Chemical Reviews, 90: 543-584,
1990, 及びCrooke, Ann. Rev. Pharmacol. Toxical., 32:329-376, 1992に記載
されている。

【００４９】 本発明の核酸は、遺伝子治療方法、例えばIDDM又は他の疾病を妨げ、又は治癒
する（完全に又は部分的に）ための個人の処理に使用され得る。これは、疾病の
１又は複数の徴候を軽減する。これは下記に論じられる。

【００５０】 本発明の核酸、例えば十分な長さのコード配列又はオリゴヌクレオチドプロー
ブ又はプライマーが、例えば、適切な容器、例えばその内容物が外部環境から保
護されているバイアルにおいて、キットの一部として提供され得る。キットは、
RCR、及び/又は試験サンプルにおける興味ある核酸の存在を決定するための方法
への核酸の使用のための説明書を包含することができる。核酸がPCRへの使用の
ために意図されているキットは、反応のために必要とされる１又は複数の試薬、
例えばポリメラーゼ、ヌクレオシド、緩衝溶液、等を包含することができる。

【００５１】 核酸はラベルされ得る。興味ある核酸の存在又は不在の決定への使用のための
キットは、方法の実施のための１又は複数の製品及び/又は試薬、例えば試験サ
ンプルを供給するための手段、例えば頬腔から細胞を除去するためのスワブ、又
は血液サンプルを除去するための注射器（そのような成分は、一般的に滅菌され
ている）を包含することができる。

【００５２】 さらなる観点によれば、本発明は、核酸分子、例えばSAPL遺伝子プロモーター
を提供する。 前記プロモーターは、ヒト染色体におけるSAPL遺伝子の5’側のヌクレオチド
配列、又は他の種、例えばマウスにおける同等の配列を含んで成るか、又はその
配列から実質的に成る。

【００５３】 本明細書における図に開示される配列のいずれかが、ゲノムSAPL遺伝子を含む
ゲノムライブラリーからのプロモーターの同定及び単離への使用のためのプロー
ブを構成するために使用され得る。そのようなプローブのための技法及び条件は
当業界において良く知られており、そして本明細書に論じられている。組織及び
/又は成長制御を担当する最小要素を見出すために、制限酵素又はヌクレアーゼ
が、核酸分子を消化するために使用さえ得、続いて必要とされる配列を決定する
ために適切なアッセイ（例えば、レポーター遺伝子、例えばルシフェラーゼを用
いての）が行われる。本発明の好ましい態様は、SAPLプロモーター活性のために
必要とされる最小ヌクレオチド配列を有する核酸単離物を供給する。

【００５４】 図４は、推定上のSAPLプロモーターについての配列を示す。下線の配列は、合
成マウスDNA配列に対する類似性を示す。太線の配列は、図１（ａ）のSAPL cDNA
配列に見出される。大文字は、Sp1転写因子結合部分のためのパターンと適合す
る塩基を示す。GGGGGTCCは、NFκB転写因子結合部位と適合する。GCCAATは、CAA
T部位と結合する。前記配列は、コンピューターアルゴリズムPROMOTERSCAN（Pre
stridge, 1995, J. Mol. Biol. 249: 923-932）により推定上のプロモーターと
して同定され、そしてGpG島に対応する。

【００５５】 示されるように、プロモーターは、発現の成長及び/又は組織−特異的制御制
御を付与する１又は複数の配列モチーフ又は要素を含んで成る。適切な発現シス
テムにおける突然変異又は消化アッセイにより、又は例えばオンラインデータベ
ースを調べるためのコンピューターを用いて、入手できる情報との配列比較によ
り同定されるような他の制御配列が包含され得る。

【００５６】 “プロモーター”とは、下流で（すなわち、二本鎖DNAのセンス鎖上の3’側方
向に）、作用可能に連結されたDNAの、転写が開始され得るヌクレオチドの配列
を意味する。 “作用可能に連結された”とは、プロモーターから開始されるべき転写のため
に適切に位置し、そして配向される同じ核酸分子の一部として連結されることを
意味する。プロモーターに作用可能に連結されたDNAは、プロモーターの“転写
開始制御”下である。

【００５７】 本発明は、本明細書に提供されるようなプロモーター配列のヌクレオチド付加
、挿入、置換又は欠失により、対立遺伝子、変異体、変異細胞又は誘導体である
ヌクレオチド配列を有するプロモーターに拡張する。提供される配列との好まし
いレベルの配列相同体は、本発明の核酸及びポリペプチドをコードする、上記に
示されるそれらの配列に類似することができる。ヌクレオチド配列に変更を付与
するための核酸の組織的又はランダム突然変異誘発は、当業者に知られているい
ずれかの技法を用いて行われ得る。本発明のプロモーター配列に対する１又は複
数の変更は、プロモーター活性を高めるか又は低めることができ、又はプロモー
ター活性を制御できる物質の効果の大きさを高めるか又は低めることができる。

【００５８】 “プロモーター活性”は、転写を開始する能力を言及するために使用される。
プロモーター活性のレベルは、プロモーターからの転写により生成されるmRNAの
量の評価により、又はプロモーターからの転写により生成されるmRNAの転写によ
り生成されるタンパク質生成物の量の評価により定量化できる。発現システムに
存在する特異的mRNAの量は、mRNAとハイブリダイズでき、そしてラベルされる特
異的オリゴヌクレオチドを用いて決定され得、又は特異的増幅反応、例えばポリ
メラーゼ鎖反応に使用され得る。レポーター遺伝子の使用は、タンパク質生成に
関するプロモーター活性の決定を促進する。

【００５９】 異種遺伝子、例えばコード配列に作用可能に連結される、SAPLプロモーター領
域、又はプロモーター転写できるそのフラグメント、変異体、対立遺伝子、誘導
体又は変異細胞を含んで成る核酸構造体が、さらに本発明により提供される。“
異種”又は“外因性”遺伝子は一般的に、SAPLの修飾された形ではない。一般的
に、遺伝子は、発現に続いて、検出され、そして好ましくは定量化され得るペプ
チド又はポリペプチド生成物に翻訳され得るmRNA中に転写され得る。コードされ
た生成物が発現に続いてアッセイされ得る遺伝子は、“レポーター遺伝子”、す
なわちプロモーター活性に基づいて“報告する”遺伝子と呼ばれる。

【００６０】 レポーター遺伝子は好ましくは、検出できるシグナル、好ましくは可視検出で
きるシグナル、例えば着色された生成物を生成する反応を触媒する酵素をコード
する。多くの例、例えばβガラクトシダーゼ及びルシフェラーゼが知られている
。β−ガラクトシダーゼ活性は、基質上での青色の生成によりアッセイされ、前
記アッセイは眼によるか、又は吸光度を測定するためへの分光計の使用による。
ルシフェラーゼ活性の結果として生成される蛍光は、分光計により定量化され得
る。放射性アッセイは、例えば非放射性アッセイにも使用され得るクロラムフェ
ニコールアセチルトランスフェラーゼを用いて行われ得る。レポーター遺伝子か
らの発現に起因する遺伝子生物の存在及び/又は量は、生成物を結合することが
できる分子、例えば抗体又はそのフラグメントを用いて決定され得る。結合分子
は、いずれかの標準の技法を用いて、直接的に又は間接的にラベルされ得る。

【００６１】 当業者は、多数の可能なレポーター遺伝子、及び遺伝子活性を決定するために
使用され得るアッセイ技法を良く知っている。いずれかの適切なレポーター/ア
ッセイが使用され得、そして特定の選択が本発明に必須でないことが理解される
べきである。

【００６２】 プロモーター（本明細書に開示されるような）及び異種遺伝子（レポーター）
を含んで成る核酸構造体は、プロモーターの活性を調製することができる物質に
ついてのスクリーニングに使用され得る。治療目的は、例えばIDDM又は他の疾病
の処理のためには、プロモーターの発現をアップレギュレートすることができる
物質が調べられ得る。プロモーターの活性を制御する物質の能力についてスクリ
ーニングするための方法は、本明細書に開示されるような核酸構造体を含む発現
システム、例えば宿主細胞と、試験又は候補体物質とを接触せしめ、そして異種
遺伝子の発現を決定することを含んで成る。

【００６３】 試験物質の存在下での発現にレベルが、試験物質の不在下での発現のレベルと
比較され得る。試験物質の存在下での発現の差異は、遺伝子発現を制御する物質
の能力を示す。本明細書に開示されるようなプロモーターに連結されないもう１
つの遺伝子の発現に比較して、異種遺伝子の発現の上昇は、プロモーターの制御
のための物質の特異性を示す。

【００６４】 プロモーター構造体は、ゲノム中に組み込まれるレポーター構造体を含む安定
した細胞系を生成するために、前に記載されたいずれかの技法を用いて細胞系中
に導入され得る。細胞は増殖され、そして種々の時間、試験化合物と共にインキ
ュベートされ得る。細胞は、多数の化合物の分析を促進するために96ウェルプレ
ートにおいて増殖され得る。次に、細胞は洗浄され、そしてレポーター遺伝子発
現が分析され得る。いくつかのレポーター、例えばルシフェラーゼに関しては、
細胞は溶解され、次に分析されるであろう。 プロモーター活性を制御するか又は影響を及ぼす物質の同定に続いて、前記物
質は、さらに調べられる。さらに、それは、組成物、例えば医薬、医薬組成物又
は薬剤の調製、すなわち製造又は配合において製造されそして/又は使用され得
る。

【００６５】 従って、本発明は、本明細書に開示される観点に従って、プロモーター活性の
モジュレーターとして核酸分子を用いて同定される物質のみならず、また、その
ような物質を含んで成る医薬組成物、医薬、薬剤又は他の生成物、IDDM又は他の
疾病の処理（予防処理を包含する）においてSAPL発現を高めるために、そのよう
な組成物を患者に投与することを含んで成る方法、IDDM又は他の疾病の処理にお
いてSAPL発現を高めるための、投与のための組成物の製造へのそのような物質の
使用、及びそのような物質と医薬的に許容できる賦形剤、ビークル又はキャリヤ
ー、及び任意には他の成分とを混合することを含んで成る医薬組成物の製造方法
に及び。

【００６６】 本発明のさらなる観点は、図１（ｃ）、図１（ｄ）又は図２（ｄ）に示される
アミノ酸を有するか、又は天然において関連する材料、例えば他のポリペプチド
、又はそのアミノ酸配列が前記図に示されるか、又は（例えば、原核細胞におけ
る発現により生成される場合）生成のグリコシル化を欠いている、例えばグリコ
シル化されていないそのポリペプチド以外のヒトポリペプチドを有さないか又は
実質的に有さない、単離された及び/又は精製された形で存在することができる
。SAPLaとSAPLbとの間で同一である、図１（ｃ）及び図２（ｃ）の最初の76個の
アミン酸を含むポリペプチドを提供する。

【００６７】 アミノ酸配列変異体、対立遺伝子、誘導体又は変異株であるポリペプチドがま
た、本発明により供給される。変異体、対立遺伝子、誘導体又は変異株であるポ
リペプチドは、１又は複数のアミノ酸の１又は複数の付加、置換、欠失及び挿入
により、本明細書における図に与えられるアミン酸配列とは異なるアミノ酸配列
を有することができる。

【００６８】 好ましいそのようなポリペプチドは、１又は複数の次の性質を有するSAPL機能
を有する：その配列が本明細書における図に与えられているポリペプチドと反応
性の抗体との免疫学的交差反応性；そのアミノ酸配列が本明細書における図に示
されているポリペプチドとのエピトープの共有（２種のポリペプチド間の免疫学
的交差反応性により決定されるような）；その配列が本明細書における図に示さ
れるポリペプチドに対して生ぜしめられた抗体により阻害される生物学的活性；
酵母突然変異を補充する能力；図３において同定される１又は複数の保存された
配列の含有；STDSEE反復体の含有。配列の変更は、SAPLタンパク質の活性及び/
又は安定性の性質及びレベルを変えることができる。

【００６９】 本明細書における図に示されるアミノ酸配列のアミノ酸配列変異体、対立遺伝
子、誘導体又は変異株であるポリペプチドは、示される配列と約35％以上、約40
％以上、約50％以上、約70％以上、約90％以上又は約95％以上同一性を共有する
アミノ酸配列を含むことができる。前記配列は、適切な図に示されるアミノ酸配
列と、約60％以上の類似性、約70％以上の類似性、約80％以上の類似性又は約90
％以上の類似性を共有することができる。アミノ酸類似性は、一般的に、上記に
示されるようなアルゴリズムGAP（Genetic Computer Group, Madison, WI）、又
はTBLASTNプログラム（Altschulなど., 1990, J. Mol. Biol. 215: 403-10）、
又はSmith−Watermanアルゴリズム（Smith and Waterman, 1981, J. Mol. Biol.
147: 195-197）により定義される。

【００７０】 類似性は、“保存性変異”、すなわち疎水性残基、例えばイソロイシン、バリ
ン、ロイシン又はメチオニンの他の残基による置換、又は１つの極性残基のもう
１つの残基による置換、例えばアルギニンのリシンによる置換、グルアミン酸の
アスパラギンサンによる置換、又はグルタミンのアスパラギンによる置換を可能
にする。特定のアミノ酸配列変異体は、１つのアミノ酸、2, 3, 4, 5-10, 10-20
, 20-30, 30-50, 50-100, 100-150又は150以上のアミノ酸の挿入、付加、置換又
は欠失により、本明細書における図に示されるアミノ酸とは異なる。

【００７１】 配列比較が本明細書に示される適切な配列の十分な長さにわたって行われ、又
はより好ましくは、約20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 135, 150, 1
67, 200, 233, 250, 267, 300, 333, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700
, 750, 760, 770, 776, 780又は790以上のアミン酸又はヌクレオチドトリプレッ
トの連続配列にわたって、適切なアミノ酸配列又はヌクレオチド配列と比較され
得る。

【００７２】 本発明はまた、本発明のポリペプチドのフラグメントを包含するか又はそれか
ら成るペプチドも包含する。 当業者は、コードする核酸からの発現により多量のペプチドを生成するために
、本明細書に記載される技法及び当業界において知られている他の技法を使用す
ることができる。

【００７３】 ペプチドはまた、化学的合成により完全に又は部分的に生成され得る。本発明
の化合物は、十分に確立された標準の液体又は好ましくは固相ペプチド合成方法
に従って容易に調製され得、この一般的な記載は広く入手でき（例えば、J. M.
Stewart and J.D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2^nd Edition, Pier
ce Chemical Company, Rockford, illinois (1984); M. Budanzsky and A. Boda
nzsky, The Practice of Peptide Synthesis, Springer Verlag, New York (198
4); 及びApplied Biosystems 430A Users Manual, ABI Inc., Foster City, Cal
ifornia を参照のこと）、又は液相方法により、又は同相、液相及び液体化学の
いずれかの組み合わせにより、例えば最初に、それぞれのペプチド部分を完結し
、そして次に、所望により及び適切な場合、依存するいずれかの保護基の除去の
後、それぞれの炭酸又はスルホン酸又はその反応性誘導体の反応による残基Xの
導入により、溶液において調製され得る。

【００７４】 本発明はまた、本発明のポリペプチドの活性部分、フラグメント、誘導体及び
機能的擬似物を包含する。ポリペプチドの“活性部分”とは、前記十分な長さの
ポリペプチドよりも短いが、しかし本明細書に開示されるような生物学的活性を
保持するペプチドを意味する。

【００７５】 ポリペプチドの“フラグメント”とは一般的に、少なくとも５個の連続したア
ミノ酸、しばしば少なくとも約７個の連続したアミノ酸、典型的には、少なくと
約９個の連続したアミノ酸、より好ましくは少なくとも約13個の連続したアミノ
酸、及びより好ましくは、少なくとも約70〜30個又はそれ以上の連続したアミノ
酸の長さのアミノ酸残基を意味する。SAPLポリペプチド配列のフラグメントは、
アミノ酸配列の一部に対する抗体を生ぜしめるために有用な抗原性決定基又はエ
ピトープを包含することができる。アラニン走査が、アミノ酸アラリンによる個
々の残基の組織的置換、続く生物学的活性の評価を包含する、ポリペプチド内の
ペプチドモチーフを見出し、そして精製するために通常使用される。

【００７６】 SAPLの好ましいフラグメントは、次のアミノ酸配列のいずれかを有するそれら
のフラグメントを包含する： HPSQEEDRHSNASQ, RIQQFDDGGSDEEDT, PESQRRSSSGSTDSE, PSSSPEQRTGQPSAPGDTS （それらは、例えば抗体の生成又は単離において使用され得る）。

【００７７】 変異体及び誘導体ペプチド、すなわち１又は複数のアミノ酸の付加、挿入、欠
失又は置換によりそれらの配列の１つは異なるアミノ酸配列を有するペプチドが
また、本発明により提供され、但し一般的に、前記変異体及び誘導体ペプチドは
、その配列が示されているペプチドの1つの結合する抗体又は他の特異的メンバ
ーにより結合されている。前記1つの示されるペプチドの変異体又は誘導体であ
るペプチドは、特異的結合メンバー、例えば抗体又はその高原―結合フラグメン
トに結合するために前記示されるペプチドと競争することができる。

【００７８】 追加のアミノ酸がペプチドに含まれる場合、それらは本発明のポチペプチドに
対して異種又は外来性であり、そしてそのペプチドは約20, 25, 30又は34個の長
さのアミノ酸であり得る。この観点によるペプチドは、特に前記ペプチドが非SA
PL（すなわち、異種又は外来性）配列、例えばポリペプチド又はタンパク質ドメ
インに融合される場合、大きな融合タンパク質内に包含され得る。

【００７９】 ポリペプチド又はそのフラグメントの“誘導体”は、タンパク質のアミノ酸配
列を変えることにより、例えばタンパク質をコードする核酸の操作により又はタ
ンパク質自体を変更することによって修飾されたポリペプチドを含むことができ
る。天然のアミノ酸配列のそのような誘導体は、野生型ポリペプチドの生物学的
活性の定性的性質を基本的に変更しないで存在することができる、１又は複数の
アミノ酸の１又は複数の挿入、付加、欠失又は置換を包含することができる。提
供されるSAPLポリペプチドの活性フラグメント（対立遺伝子、変異体、誘導体及
び変異株を包含する）の機能的擬似体もまた、本発明の範囲内に包含される。用
語“機能的擬似体”とは、適切なアミノ酸配列の活性部分を含むことができず、
そしてたぶん、完全にペプチドではないが、しかし天然のSAPLポリペプチドの生
物学的活性を定性的に保持する物質を意味する。候補体擬似体の企画及びスクリ
ーニングは、下記に詳細に記載される。

【００８０】 その配列情報が本明細書において提供されているポリペプチドの他のフラグメ
ントは、機能的ドメインに対応する本発明の観点として提供されている。 本発明のポリペプチドは、例えばコード核酸からの発現による生成の後、単離
されるか、そして/又は精製され得る（例えば、抗体を用いて）。従って、ポリ
ペプチドは、天然において関連する汚染物（天然において依存するポリペプチド
である場合）を有さないか又は実質的に有さないで提供される。

【００８１】 ポリペプチドは、他のポリペプチドを有さないか又は実質的に有さないで供給
され得る。本発明のポリペプチドは、化学合成により完全に又は部分的に生成さ
え得る。単離された及び/又は精製されたポリペプチドは、少なくとも１つの追
加の成分を含むことができる組成物、例えば医薬的に許容できる賦形剤、ビーク
ル又はキャリヤーを含む医薬組成物の配合に使用され得る。本発明のポリペプチ
ドを含む組成物は、下記に論じられるように、予防及び/又は治療処理に使用さ
れ得る。

【００８２】 本発明のポリペプチド、ペプチド、対立遺伝子、変異体、誘導体又は変異株は
、免疫原として、又は他方では、特異的抗体の獲得に使用され得る。抗体は、ポ
リペプチド及びペプチドの精製及び他の操作、診断的スクリーニング及び治療法
において有用である。これはさらに下記に論じられる。 本発明のポリペプチドは、その活性又は機能に影響を及ぼすか又は制御し、例
えばタンパク質ホスファターゼの活性、又はSAP変異体酵母を補充する能力に結
合するか又はそれを制御する分子についてスクリーニングに使用され得る。その
ような分子は、SAPL又は１又は複数のアクセサリー分子と相互作用し、そして治
療（たぶん、予防）状況において有用であり得る。

【００８３】 新規薬剤の同定を導く医薬研究は、先導化合物が見出される前及びその後でさ
え、非常に多数の候補体物質のスクリーニングを包含することが良く知られてい
る。これは、医薬研究を非常に高価且つ時間浪費にする１つの要因である。スク
リーニング工程を助けるための手段は、相当の商業的重要性及び利用性を有する
ことができる。IDDM又は他の疾病を処理し、又は予防することにおいて実質的に
有用な物質をスクリーニングするためのそのような手段は、本発明のポリペプチ
ドにより提供される。

【００８４】 ポリペプチドのモジュレーターとして同定される物質は、それらがインビボで
の使用のための治療剤の企画及び調査のための基礎を提供するので、IDDM及び他
の疾病に対する攻撃の増強性を提供する。さらに、それらは多くの疾病、例えば
自己免疫疾患、例えば糸球体腎炎、細胞増殖に関連する疾病及び障害、例えば乾
癬、腫瘍及び癌のいずれかにおいて有用であり、SAPLについての機能的指標を付
与する。他の場所で示されるように、SAPL、そのフラグメント及び本発明の核酸
はまた、それらの疾病及び障害のいずれかを攻撃することにおいても有用である
。

【００８５】 種々のさらなる観点においては、本発明は、スクリーニング及びアッセイ方法
及び手段、並びにそれらにより同定される物質に関する。

【００８６】 従って、本発明の追加の観点は、１つの物質、例えばポリペプチド又はペプチ
ドと相互作用し、そして/又はそれと結合し、そして/又はその機能を妨げるペプ
チド又は化合物、又はもう1つの物質、例えば本発明のポリペプチド又はペプチ
ドと相互作用し、そして/又はそれと結合するポリペプチド又はペプチドのスク
リーニング又は研究、及び/又は獲得/同定へのポリペプチド又はペプチド（特に
、開示されるような本発明のポリペプチドのフラグメント及び/又はそれについ
てのコード核酸）の使用を提供する。例えば、本発明の１つの観点に従っての方
法は、本発明のポリペプチド又はペプチドを提供し、そして１つの物質とそれと
を接触せしめることを包含し、前記接触はポリペプチド又はペプチドと物質との
間の結合をもたらすことができる。結合は、当業界において入手できる多くの技
法のいずれかにより、定性的且つ定量的に決定され得る。

【００８７】 本発明の種々の観点は、本発明のポリペプチドと１又は複数のタンパク質ホス
ファターゼ、特に、SIT4、例えばヒトタンパク質ホスファターゼ６（Bastions a
nd Ponstingle (1996) J. Cell. Sci. 109: 2865-2874）に類似するそれらのも
のとの間の相互作用を阻害する物質についてのアッセイの提供に関する。 さらなるアッセイは、本発明のポリペプチドと相互作用するか又はそれを結合
し、そして/又は１又は複数のその活性を制御する物質についてである。

【００８８】 本発明の１つの観点は、 （ａ）本発明のポリペプチド又はペプチド、及び推定上の結合分子又は他の試
験物質を接触せしめ；そして （ｂ）前記ポリペプチド又はペプチドと前記物質との間の相互作用又は結合を
決定する； ことを含んで成るアッセイを提供する。 本発明のポリペプチド又はペプチドと相互作用する物質は、単離され、そして
/又は精製され、論じられるようなその活性を制御するために製造され、そして/
又は使用され得る。

【００８９】 本発明の追加の観点は、 （ａ）SAPLポリペプチド又はそのフラグメント、変異体、変異株又は誘導体を
包含する物質、第２ポリペプチドのフラグメント又はそのフラグメント、変異体
、変異株又は誘導体を包含する物質（SAPLポリペプチドを結合することができる
）；及び試験化合物を、インヒビターである試験化合物の不在下で、前記２種の
化合物が相互作用する条件下で接触せしめ；そして （ｂ）前記物質間の相互作用を決定する； ことを含んで成るアッセイ方法を提供する。

【００９０】 ２種の分子間の結合について試験する、本発明のアッセイのための完全なタン
パク質を使用する必要はない。フラグメントが、当業者に知られているいずれか
適切な手段で生成され、そして使用され得る。フラグメントを生成する適切な手
段は、コードDNAからのフラグメントの組換え発現を包含するが、但しそれだけ
には限定されない。そのようなフラグメントは、コードDNAを取り、発現される
べき部分のいずれかの側の適切な制限酵素組換え部位を同定し、そして前記DNA
から前記部分を切断することによって生成され得る。

【００９１】 次に、前記部分が、標準の市販の発現システムにより、適切なプロモーターに
、作用可能に連結され得る。もう1つの組換えアプローチは、適切なPCRプライマ
ーによりDNAの適切な部分を増幅することである。小さなフラグメント（例えば
、約20又は30個までのアミノ酸）はまた、当業界において良く知られているペプ
チド合成方法を用いて生成される。

【００９２】 本発明のアッセイの正確な型は、通常の熟練及び知識を用いて、当業者により
変更され得る。例えば、ポリペプチド間の相互作用は、検出できるラベルにより
ポリペプチドをラベリングし、そしてそれと、固体支持体上に固定されている他
のポリペプチドとを接触せしめることによって、インビトロ研究され得る。適切
な検出できるラベルは、組換え的に生成されたペプチド及びポリペプチド中に組
み込まれ得る³⁵S−メチオニンを包含する。組換え的に生成されたペプチド及び
ポリペプチドはまた、抗体によりラベルされ得るエピトープを含む融合タンパク
質として発現され得る。

【００９３】 組換えタンパク質のN−末端又はC−末端のいずれかで６個のヒスチジン残基を
組み込んで成る融合タンパク質が生成され得る。そのようなヒスチジン標識は、
金属イオン、すなわちニッケル又はコバルトを含む市販のカラムを用いることに
よって、タンパク質の精製のために使用され得る（Clontech, palo Alto, CA, U
SA）。それらの標識はまた、６個のヒスチジン残基に対して方向づけられた市販
のモノクローナル抗体を用いてのタンパク質の検出のために作用する（Clontech
, Palo Alto, CA, USA）。

【００９４】 固定支持体上に固定されるタンパク質は、固体支持体に結合されるそのタンパ
ク質に対しての抗体を用いて、又はそれ自体知られている他の技法により固定さ
れ得る。好ましいインビトロ相互作用は、グルアチオン−S−トランスフェラー
ゼ（GST）を包含する融合タンパク質を利用することができる。これは、グルタ
チオンアガロースビーズ上に固定され得る。上記に記載される型のインビトロア
ッセイ型においては、試験化合物は、固定されたGST−融合ポリペプチドに結合
する、ラベルされたペプチド又はポリペプチドの量を低めるその能力を決定する
ことによってアッセイされ得る。

【００９５】 これは、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によりグルタチオン−アガロ
ースビーズを分別することによって決定され得る。他方では、ビーズがすすがれ
、結合されていないタンパク質が除去され、そして結合したタンパク質の量が、
例えば適切なシンチレーションカウンターにより、存在するラベルの量を計数す
ることによって決定され得る。

【００９６】 本発明のアッセイはまた、インビボアッセイの形を取ることもできる。インビ
ボアッセイは、1つの細胞系、例えば適切なポリペプチド又はペプチドが細胞中
に導入される１又は複数のベクターから発現される酵母株において行われ得る。 ポリペプチドの活性を制御する物質についてのスクリーニング方法は、１又は
複数の試験物質とポリペプチドとを、適切な反応培地において触媒せしめ、試験
されるポリペプチドの活性を試験し、そしてその活性と、試験物質により処理さ
れなかった相当する反応培地において前記ポリペプチドの活性とを比較すること
を包含する。処理されたポリペプチドと処理されていないポリペプチドとの間の
活性の差異は、適切な試験物質の効果の制御の表示である。

【００９７】 本発明のさらなる観点においては、 （ａ）第４表に同定されるような推定上のリン酸化部位を包含する本発明のポ
リペプチドのフラグメントを包含する物質、又はその変異体、変異株又は誘導体
、及び試験化合物を、キナーゼが通常前記フラグメント、変異体、変異株又は誘
導体をリン酸化する条件下で、キナーゼの存在下で接触せしめ；そして （ｂ）前記フラグメント、変異体、変異株又は誘導体のリン酸化を決定する；
ことを含んで成るアッセイ方法が提供される。 例えば、キナーゼは、cAMP依存性タンパク質キナーゼ、タンパク質キナーゼC
、又はカゼインキナーゼ２であり得る。

【００９８】 リン酸化は、例えば本発明のポリペプチド、又はそののフラグメント、変異体
、変異株又は誘導体を、ビーズ又はプレート上に固定し、そしてリン酸化の適切
な部位がリン酸化される場合の親和性とリン酸化されない場合の親和性とが異な
ってそのリン酸化の部位を結合する抗体又は他の結合分子を用いて、リン酸化を
検出することによって決定され得る。そのような抗体は、本明細書において論じ
られるようないずれかの標準の技法により、例えばリン酸化されたペプチド（例
えば、SAPLポリペプチドのフラグメント）を用いて得られる。ポリペプチド又は
その適切なフラグメント、変異体、変異株又は誘導体のリン酸化された形とリン
酸化されていない形との間を区別する結合分子の結合は、適切なラベル、例えば
蛍光の存在の決定を包含する、当業者に利用できるいずれかの技法を用いて評価
され得る。

【００９９】 リン酸化は、ポリペプチド又はそのフラグメント、変異体、変異株又は誘導体
の、適切な基質、例えばビーズ又はプレート上への固定により決定され、ここで
前記基質は、シンチレーション剤により、例えば標準のシンチレーション近接ア
ッセイにおいて含浸され、そしてリン酸化は放射性リン酸の組み込みの測定によ
り決定される。ポリペプチド又はそのフラグメント、変異体、変異株又は誘導体
中へのリン酸組み込みは、酸、例えば三クロロ酢酸による沈殿、及び適切な材料
、例えばニトロセルロースフィルター紙上での沈殿物の収集、続いて、放射性ラ
ベルされたリン酸の組み込みの測定により決定され得る。基質のSDS−PAGG分離
、続く放射性ラベルの検出が用いられ得る。

【０１００】 組み合せライブラリー技法（Schultz，JS (1996), Biotechnol. Prog. 12: 72
9-743）は、ポリペプチドの活性を制御する能力について実質的に莫大な数の異
なった物質を試験する効果的な手段を提供する。活性の制御についてスクリーン
される前、又はスクリーンされるのと同様に、試験物質が、例えば酵母２−ハイ
ブリッドシステム（ポリペプチド及び試験物質の両者がコード核酸から酵母にお
いて発現され得ることを必要とする）において、ポリペプチドと相互作用する能
力についてスクリーンされ得る。これは、ポリペプチドの活性を制御する実際の
能力について物質を試験する前、粗スクリーンとして使用され得る。

【０１０１】 本発明のアッセイン添加され得る試験物質又は化合物の量は、使用される化合
物の型に依存して、手探り法により、通常決定されるであろう。典型的には、約
0.01〜100mMの濃度、例えば0.1〜10nMの濃度の推定上のインヒビター化合物が使
用され得る。より高い濃度が、ペプチドが試験物質である場合、使用され得る。

【０１０２】 使用され得る化合物は、薬剤スクリーニングプログラムに使用される、天然又
は合成化合物であり得る。いくつかの特徴づけられた又は特徴づけられていない
成分を含む植物抽出物がまた使用され得る。さらなる種類の推定上のインヒビタ
ー化合物が、結合するSAPLポリペプチド及び/又はリガンドから誘導され得る。
相互作用を担当する適切なポリペプチドの領域からの５〜40個のアミノ酸、例え
ば６〜10個のアミノ酸のペプチドフラグメントが、そのような相互作用を破壊す
るそれらの能力について試験され得る。

【０１０３】 他の候補体インヒビター化合物は、ポリペプチド又はペプチドフラグメントの
立体構造のモデリング、及び特定の分子形状サイズ及び電荷特徴を有する可能性
あるインヒビター化合物を供給する合理的な薬剤企画の使用に基づかれ得る。 ポリペプチド活性を制御し、又は影響を及ぼす物質の同定に続いて、前記物質
がさらに調べられ得る。さらに、それは、調製、すなわち組成物、例えば医薬、
医薬組成物又は薬剤の製造又は配合において製造され、そして/又は使用され得
る。それらは、個人に投与され得る。

【０１０４】 従って、本発明は、本明細書に開示される態様に従って、ポリペプチド活性の
モジュレーターとして同定される物質のみならず、またそのような物質を含む医
薬組成物、医薬、薬剤又は他の組成物、IDDM又は他の疾病処理（予防性処理を包
含する）のために患者にそのような組成物を投与することを含んで成る方法、ID
DM又は他の疾病の処理のための、投与のための組成物の製造へのそのような物質
の使用、及びそのような物質と、医薬的に許容できる賦形剤、ビークル又はキャ
リヤー、及び任意には、他の成分とを混合することを含んで成る医薬組成物の製
造方法に、種々の観点において拡張する。

【０１０５】 ポリペプチド又はプロモーターのモジュレーターとして使用して同定される物
質は、天然においては、ポリペプチド又は非ペプチドであり得る。非ペプチド“
小分子”はしばしば、多くのインビボ医薬使用のために好ましい。従って、物質
（特に、ペプチドの場合）の擬似体又は模倣体は、医薬使用のために企画され得
る。既知の医薬的活性の化合物の擬似体の企画は、“先導”化合物に基づいての
医薬の開発のための既知アプローチである。これは、活性化合物が合成するのに
困難であるか又は高価である場合、所望されず、又はそれが特定の投与方法のた
めに不適切である場合、例えばペプチドは、それらが栄養細管においてプロテア
ーゼによりすばやく分解される傾向があるので、経口投与のための活性剤として
十分には適切でない。擬似体企画、合成及び試験が、標的性質について多数の分
子をランダムにスクリーニングすることを回避するために使用され得る。

【０１０６】 所定の標的性質を有する化合物からの擬似体の企画において通常取られるいく
つかの段階が存在する。最初に、標的性質の決定において決定的であり、及び/
又は重要である化合物の特定部分が決定される。ペプチドの場合、これは、ペプ
チドにおけるアミノ酸残基を組織的に変えることにより、例えば個々の残基を置
換することによって行われ得る。化合物の活性領域を構成するそれらの部分又は
残基は、その“薬物体（Pharmacophore）”として知られている。

【０１０７】 薬物体が見出されるとすぐに、その構造体は、その物性、例えば立体化学、結
合サイズ及び/又は電荷に従って、広範囲の源、例えば分光技法、X−線回析デー
タ及びNMRからのデータを用いてモデリングされる。コンピューター分析、類似
性マッピング（原子間の結合よりもむしろ、薬物体の電荷及び/又は体積をモデ
リングする）、及び他の技法が、このモデリング方法に使用され得る。 このアプローチの変法においては、リガンド及びその結合パートナーの立体構
造がモデリングされる。これは、リガンド及び/又は結合パートナーが結合に基
づいて形状を変える場合、特に有用であり得、モデルの擬似体のこの企画の考慮
を可能にする。

【０１０８】 次に、薬物体を模倣する化学基がグラフトされ得る鋳型分子が選択される。鋳
型分子及びそれに対してグラフトされる化学基が、便利には選択され得、その結
果、擬似体は、容易に合成でき、たぶん薬理学的に許容でき、そしてインビボで
分解せず、同時に先導化合物の生物学的活性を維持する。次に、このアプローチ
により見出される模倣体又は擬似体は、それらが標的性質を有するかどうか、又
はそれらがどの程度、それを示すかを見出すためにスクリーンされ得る。次に、
追加の最適化又は修飾が、インビボ又は臨床学的試薬のための１又は複数の最終
擬似体に達するために行われ得る。

【０１０９】 本明細書に開示されるようなスクリーニング方法を用いて、SAPLポリペプチド
又はプロモーター活性を制御する能力を有するものとして同定された物質の擬似
体は、本発明の範囲内に包含される。本発明のポリペプチドの活性を制御するこ
とができる、ポリペプチド、ペプチド又は物質が、キットに供給され、例えば外
部環境からその内容物を保護する適切な容器において密封され得る。そのような
キットは、使用説明書を包含する。

【０１１０】 本発明のポリペプチドを生成する便利な手段は、発現システムへの核酸の使用
により、それをコードする核酸を発現することである。従って、本発明はまた、
ポリペプチド（開示されるような）の製造方法も包含し、ここで前記方法は、前
記ポリペプチドをコードする核酸（一般的には、本発明の核酸）からの発現を包
含する。これは便利には、そのようなベクターを含む宿主細胞を培養において、
前記ポリペプチドの発現を引き起こすか又は可能にする適切な条件下で増殖する
ことによって達成され得る。ポリペプチドはまた、インビトロシステム、例えば
網状赤血球溶解物においても発現され得る。

【０１１１】 種々の異なった宿主細胞におけるポリペプチドのクローニング及び発現のため
のシステムは良く知られている。適切な宿主細胞は、細菌、真核細胞、例えば哺
乳類細胞及び酵母、及びバキュロウィルス系を包含する。異種ポリペプチドの発
現のための当業界において入手できる哺乳類細胞系は、チャイニーズハムスター
卵巣細胞、HeLa細胞、子供ハムスター腎臓細胞、COS細胞及び多くの他のものを
包含する。通常の好ましい細胞宿主は、E.コリである。適切な制御配列、例えば
プロモーター配列、ターミネーターフラグメント、ポリアデニル化配列、エンハ
ンサー配列、マーカー遺伝子及び適切な他の配列を含む適切なベクターが選択さ
れるか又は構成され得る。

【０１１２】 ベクターは、適切な場合、プラスミド、ウィルス、例えばファージ又はファゲ
ミドであり得る。さらなる詳細のためには、例えばMolecular Cloning: a Labor
atory Manual: 2^nd edition, Sambrookなど., 1989, Cold Spring Harbor Labor
atory Pressを参照のこと。例えば核酸構造体の調製、突然変異誘発、配列決定
、細胞中へのDNAの導入及び遺伝子発現、及びタンパク質の分析における核酸の
操作のための多くの既知技法及びプロトコールは、Current Protocols in Molec
ular Biology, Ausubelなど. eds., John Wiley & Sons, 1992において詳細に記
載されている。

【０１１３】 従って、本発明のさらなる観点は、本明細書に開示されるような核酸を含む宿
主細胞を提供する。本発明の核酸は、宿主細胞のゲノム（例えば、染色体）中に
組み込まれ得る。組み込みは、標準技法に従って、ゲノムとの組換えを促進する
配列の包含により促進され得る。核酸は、細胞内の染色体外ベクター上に存在す
ることができる。

【０１１４】 さらに追加の観点は、宿主細胞中への核酸の導入を包含する方法を提供する。
“形質転換”としての制限を伴なわないで一般的に言及され得る（特に、インビ
トロ導入に関する）導入は、いずれの入手できる技法でも使用することができる
。真核細胞に関しては、適切な技法は、リン酸カルシウムトランスフェクション
、DEAE−デキストラン、エレクトロポレーション、リポソーム介在性トランスフ
ェクション及びレトロウィルス又は他のウィルス、例えばアデノウィルス、ワク
シニア又はバキュロウィルス（昆虫細胞に関しては）を用いてのトランスダクシ
ョンを包含する。細菌細胞のためには、適切な技法は、塩化カルシウム形質転換
、エレクトロポレーション、及びバクテリオファージを用いてのトランスフェク
ションを包含することができる。

【０１１５】 マーカー遺伝子、例えば抗生物質耐性又は感受性遺伝子が、当業界において良
く知られているように、興味ある核酸を含むクローンの同定に使用され得る。 導入に続いて、例えば宿主細胞（たぶん細胞は形質転換された細胞の子孫であ
るが、実際的に形質転換された細胞を包含することができる）を、遺伝子の発現
のための条件下で培養することによって、核酸からの発現を引き起こすか又は可
能にし、その結果、コードされたポリペプチドが生成される。

【０１１６】 適切なシグナルリーダーペプチドに結合されるポリペプチドが発現される場合
、それは細胞から培養培地中に分泌され得る。発現による生成に続いて、ポリペ
プチドは、宿主細胞及び/又は培養培地から単離され、そして/又は精製され得、
そして続いて、例えば１又は複数の追加の成分を含むことができる組成物、例え
ば１または複数の医薬的に許容できる賦形剤、ビークル又はキャリヤー（例えば
下記参照のこと）を含む医薬組成物の配合に、所望により使用され得る。

【０１１７】 核酸の導入は、下記に論じられるように、遺伝子治療によりインビボで起こり
得る。細胞又は細胞の先祖中への核酸の導入、及び/又は細胞又は先祖に対して
内因性の配列の遺伝子変更（導入又は変更はインビボ又はエクスビボで起こるこ
とができる）の結果として、本発明の核酸を含む宿主細胞は、動物である生物、
特にヒト又は非ヒト、例えばウサギ、テンジクネズミ、ラット、マウス又は他の
囓歯動物、ネコ、イヌ、ブタ、羊、ヤギ、ウシ又はウマである哺乳類、又は鳥類
、例えば鶏内に包含され得る（例えば、体細胞において）。そのような細胞を含
む、遺伝子的に修飾されているか又はトランスジェニック動物又は鳥類はまた、
本発明の追加の観点として提供される。

【０１１８】 従って、種類の追加の態様においては、本発明は、そのゲノム内にヒトSAPLト
ランスジーンを有する非ヒト動物を提供する。前記トランスジーンは、本明細書
において同定されたイソフォームのいずれかの配列、又は開示されるようなその
変異体、誘導体、対立遺伝子又は変異株を有することができる。1つの好ましい
態様においては、異種ヒトSAPL配列は、内因性動物配列を置換する。他の好まし
い態様においては、ヒトSAPL配列の１又は複数のコピーが動物ゲノムに添加され
る。好ましくは、動物は、囓歯動物、及び最も好ましくはマウス又はラットであ
る。

【０１１９】 これは治療目的を有する。（遺伝子療法は下記で論じられる。）生物の細胞内
での変異体、対立遺伝子又は変異株配列の存在は、特に相同内因性配列の代わり
である場合、コードされたポリペプチド及び/又はプロモーターの活性をインビ
トロで制御し、又は他方では、治療可能性のものであることが示されているSAPL
遺伝子又は物質の役割の試験及び/又は研究においてモデルとしての生物の使用
を可能にすることができる。

【０１２０】 SAPL欠損についての動物モデルが、動物生殖系中に突然変異を導入するために
標準の技法を用いて構成され得る。マウスを用いてのこのアプローチの１つの例
においては、SAPL遺伝子内に挿入突然変異を担持するベクターが、胎児幹細胞中
にトランスフェクトされ得る。選択マーカー、例えば抗生物質耐性遺伝子、例え
ばneoRが、突然変異遺伝子が内因性野生型相同体を置換しているクローンの選択
を促進するために包含され得る。そのようなクローンはまた、サザンブロットハ
イブリダイゼーションにより同定され、又はさらに調べられ得る。

【０１２１】 次に、クローンは拡張され、そして細胞がマウス胚盤胞段階の胚中に注入され
得る。注入された細胞がマウスの成長に寄与しているマウスは、サザンブロット
により同定され得る。それらのキメラマウスは、生殖系における突然変異の１つ
のコピーを担持するマウスを生成するために交配され得る。それらのヘテロ接合
変異体動物は、前記遺伝子に突然変異を担持するマウスをホモ接合的に生成する
ために交配され得る。SAPL遺伝子にヘテロ接合性突然変異を有するマウスは、ID
DM又は他の疾病の進行の危険性を有する個人の生殖系において突然変異誘発され
た遺伝子の１つのコピーを有するヒト個人のための適切なモデルであり得る。

【０１２２】 動物モデルはまた、本明細書において論じられる種々の疾病のいずれのために
も有用であり得る。

【０１２３】 トランスジーンによりコードされるポリペプチドの生成のために使用される代
わりに、宿主細胞は、それを多量に生成するために、興味ある核酸を複製する核
酸工場として使用され得る。興味ある核酸の複数のコピーが、良く知られている
ように、増幅できる遺伝子、例えばジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）に結合さ
れる場合、細胞内で製造され得る。興味ある核酸により形質転換されているか、
又は核酸が導入されている宿主細胞から由来する宿主細胞が、発酵器において適
切な条件下で培養され、培養物から取られ、そして核酸を精製するためにプロセ
ッシングにゆだねられる。精製に続いて、核酸又はその１又は複数のフラグメン
トが所望により、本明細書に論じられるように、診断又は予後アッセイにおいて
使用され得る。

【０１２４】 新規SAPLポリペプチドイソフォーム、及びその変異体、対立遺伝子、変異株及
び誘導体の供給は、それらの分子を特異的に結合することができる抗体の生成を
、最初に可能にすることができる。 従って、本発明のさらなる観点は、その配列が本明細書における図に与えられ
ているポリペプチドに特異的に結合できる抗体を提供する。そのような抗体は、
それが結合できるポリペプチドと、それが結合親和性（例えば、約1000倍以下の
結合親和性）を有さないか又は実質的に有さない他のヒトポリペプチドとの間を
区別することができる態様で特異的であり得る。

【０１２５】 特異的抗体は、他の分子上に存在しないか、又は接近できない分子上のエピト
ープを結合する。本発明の抗体は、野生型ポリペプチドに対して特異的であり得
る。本発明の抗体は、下記で論じられるように診断及び予後方法において有用で
あるよう、その分子と野生型ポリペプチドとの間で、特定の変異体、変異株、対
立遺伝子又は誘導体ポリペプチドに対して特異的であり得る。抗体はまた、例え
ばコード核酸からの組換え発現による生成に続いて、ポリペプチド又はそれらが
接合するポリペプチドを精製することにおいても有用である。

【０１２６】 本発明の好ましい抗体は、汚染物、例えば他のポリペプチドに結合できる抗体
を有さず、そして/又は血清成分を有さない態様で単離される。モノクローナル
抗体は、それらの本発明の範囲内にあるけれども、いくつかの目的のために好ま
しい。

【０１２７】 抗体は、当業界において標準である技法を用いて得られる。抗体を生成する方
法は、タンパク質又はそのフラグメントにより哺乳類（例えば、マウス、ラット
、ウサギ、ウマ、ヤギ、羊又はモンキー）を免疫化することを包含する。抗体は
、当業界において知られている種々の技法のいずれかを用いて、免疫化された動
物から得られ、そして好ましくは、興味ある抗原への抗体の結合を用いてスクリ
ーンされ得る。例えば、ウェスターンブロット技法、又は免疫沈殿法が使用され
得る（Armitageなど., 1992, Nature 357: 80-82）。動物からの抗体及び/又は
抗体生成細胞の単離は、動物を殺害する段階により達成され得る。

【０１２８】 ペプチドによる哺乳類を免疫化する他の手段又は補充体として、タンパク質に
対して特異的な抗体は、例えばそれらの表面上で機能的免疫グロブリン結合ドメ
インを示すλバクテリオファージ又は糸状バクテリオファージを用いて、発現さ
れた免疫グロブリン可変ドメインの組換え的に生成されたライブラリーから得ら
れる（WO92/01047号を参照のこと）。ライブラリーは、生来のものであり、すな
わちタンパク質（又はフラグメント）のいずれかにより免疫化されていない生物
から得られた配列から構成されるか、又は興味ある抗原に暴露されている生物か
ら得られた配列を用いて構成され得る。

【０１２９】 動物を免疫化し、そして/又は抗−SAPL抗体を単離することに使用するための
適切なペプチドは、次のアミノ酸配列のいずれかを包含する： HPSQEEDRHSNASQ, RIQQFDDGGSDEEDT, PESQRRSSSGSTDSE, PSSSPEQRTGQPSAPGDTS。

【０１３０】 本発明の抗体は、多くの手段で修飾され得る。実際、用語“抗体”は、必要と
される特異性を有する結合ドメインを有するいずれかの結合物質を包含するもの
として構成されるべきである。従って、本発明は、抗体フラグメント、誘導体、
機能的同等物及び抗体の相同体、例えば合成分子、及び抗原又はエピトープの結
合を可能にする抗体の形状を模倣する分子を包含する。

【０１３１】 抗原又は他の結合パートナーを結合することができる典型的な抗体フラグメン
トは、VL, VH, C1及びCH1ドメインから成るFabフラグメント；VH及びCH1ドメイ
ンから成るFdフラグメント；抗体の単一アームのVL及びVHドメインから成るFvフ
ラグメント；VHドメインから成るaAbフラグメント；単離されたCDR領域及びF（a
b’)₂フラグメントであり、ここで二価フラグメントは、ヒンジ部でのジスルフ
ィド架橋により連結される２種のFabフラグメントを包含する。一本鎖Fvフラグ
メントもまた包含される。

【０１３２】 本発明のモノクローナル抗体を生成するハイブリドーマは、遺伝子突然変異又
は他の変更を受けることができる。モノクローナル抗体が、元の抗体の特異性を
保持する他の抗体又はキメラ分子を生成するために組換えDNA技法にゆだねられ
得る。そのような技法は、異なった免疫グロブリンの不変領域又は不変領域及び
骨格領域に、抗体の免疫グロブリン可変領域、又は相補性決定領域（CDR）をコ
ードするDNAを導入することを包含する。例えば、ヨーロッパ特許第184187A号、
イギリス特許第2188638A号は又はヨーロッパ特許出願第0239400号を参照のこと
。キメラ抗体のクローニング及び発現は、ヨーロッパ特許出願0120694号及び第0
125023号に記載される。

【０１３３】 所望する結合特徴を有する抗体を生成できるハイブリドーマは、抗体（例えば
、抗体フラグメントを包含する）をコードする核酸を含み、そしてそれらを発現
できる宿主細胞、すなわち真核又は原核細胞であるので、本発明の範囲内である
。本発明はまた、抗体を生成することができる細胞を、その抗体が生成され、そ
して好ましくは分泌される条件下で増殖することを包含する、抗体の生成方法を
提供する。

【０１３４】 サンプル上での抗体の反応性は、いずれか適切な手段により決定され得る。個
々のレポーター分子による標的化が１つの可能性である。レポーター分子は、検
出でき、そして好ましくは測定できるシグナルを、直接的に又は間接的に生成す
ることができる。レポーター分子の結合は、直接的又は間接的であり、例えばペ
プチド結合を通して共有的に又は非共有的であり得る。ペプチド結合を通しての
連鎖は、抗体及びレポーター分子をコードする遺伝子融合体の組換え発現の結果
として存在することができる。

【０１３５】 １つの好ましい態様は、個々の蛍光色素、蛍光体、又は特別に分離されたマウ
ス又は蛍光特徴を有するレーザー色素との個々の抗体の共有結合によるものであ
る。適切な蛍光色素は、フルオレセイン、ローダミン、フィコエリトロビン及び
テキサスレッドを包含する。適切な色原体色素は、ジアミノベンジジンを包含す
る。

【０１３６】 他のレポーターは、高分子コロイド状粒子又は粒状材料、例えば着色され、磁
気性であり又は常磁性であるラテックスビーズ、及び可視的に観察され、電気的
に検出された、又は他方では、記録される、検出できるシグナルを直接的に又は
間接的に誘発する生物学的又は化学的活性剤を包含する。それらの分子は、色彩
を進行するか又は変更し、又は電気的性質の変化を引き起こす反応を触媒する酵
素であり得る。それらは分子的に励起でき、その結果、エネルギー状態間の電気
的遷移が特徴的なスペクトル吸収又は発光をもたらす。それらは、バイオセンサ
ーに使用される化学的実在物を包含する。ビオチン/アビジン又はビオチン/スト
レプタビジン、及びアルカリホスファターゼ検出システムが使用され得る。

【０１３７】 結合を決定する態様は、本発明の特徴ではなく、そして当業者は、彼らの優先
及び一般的な知識に従って、適切な態様を選択することができる。本発明の抗体
の特定の態様は、次のペプチドの1つに、結合し、そして/又は少なくとも10^-7M
の親和性で特異的に結合できる抗体を包含する： HPSQEEDRHSNASQ, RIQQFDDGGSDEEDT, PESQRRSSSGSTDSE, PSSSPEQRTGQPSAPGDTS。

【０１３８】 本発明の抗体は、例えば論じられるように、細胞又は細胞溶解物を含む試験サ
ンプルにおけるポリペプチドの存在についてのスクリーニングにおいて使用され
得、そして例えば、コードする核酸からの発現によるポリペプチドの生成に続い
て、本発明のポリペプチドを精製し、そして/又は単離することに使用され得る
。抗体は、それらが結合するポリペプチドの活性を制御し、そしてそのポリペプ
チドが個人において有害な効果を有する場合、治療用途（予防を包含する）にお
いて有用であり得る。

【０１３９】 抗体は、例えば試験サンプルにおける特定の物質の存在を決定することへの抗
体の使用についての説明書を包含するキットにおいて提供される。１又は複数の
試薬、例えばラベリング分子、緩衝溶液、溶離剤及び同様のものが、包含され得
る。試薬は、外部環境からそれらを保護する容器、例えば密封されたバイアル内
に供給され得る。

【０１４０】 SAPL遺伝子の同定及びIDDM及び他の疾病との関連性の表示は、遺伝子の変異体
形特にIDDM又は他の疾病に解く特異的に関連する対立遺伝子又は変異体の試験サ
ンプルにおける存在又は不在を確立するために、上記に開示され、そして論じら
れる材料及び方法を使用する本発明の観点を可能にする。それは、SAPL遺伝子と
関連するような疾病を有する患者のIDDMの診断を可能にする。 これは、適切な治療及び/又は予後処理の計画を可能にし、すなわちそれらを
有益にすることによって処理の合理化を可能にする。

【０１４１】 遺伝子の変異体形は、遺伝子機能を破壊することができるか又はできない野生
型配列（例えば、第２表に示される）に比較して、１又は複数のヌクレオチドの
１又は複数の挿入、欠失、置換及び/又は付加を含むことができる。核酸レベル
での差異は、コードされたポリペプチドのアミノ酸配列における差異により必ず
しも影響されない。しかしながら、遺伝子における突然変異又は他の差異は、生
成される（存在するなら）ポリペプチドの性質に重度に影響を及ぼすフレームシ
フト又は停止コドンをもたらし、又はポリペプチドにおける１又は複数のアミノ
酸又は領域の挿入、欠失、置換及び/又は付加を包含する、コードされたポリペ
プチドに対する点突然変異又は全体的に突然変異性変化をもたらすことができる
。

【０１４２】 プロモーター配列又は他の制御領域における突然変異は、遺伝子からの発現を
妨げるか又は低め、又はmRNA転写体のプロセッシング又は安定性に提供を及ぼす
。例えば、配列の変更は、mRNAの他のスプライシングに影響を及ぼすことができ
る。論じられたように、他のスプライシングに起因する種々のSAPLイソフォーム
が、本発明により供給される。 特定の核酸配列、例えば本明細書における図に示される配列、又は例えば、第
２表に示される変更を包含する。その変異体、変異株又は対立遺伝子の試験サン
プルにおける存在又は不在を決定するための種々の方法が存在する。

【０１４３】 試験は、ゲノムDNA、cDNA及び/又はmRNAを含む調製物に対しておこなわれ得る
。試験cDNA又はmRNAは、イントロン配列の存在により低められる。核酸の複雑性
の利点を有するが、しかし余分な時間及び努力の可能性ある決定がその調製物を
製造する際に必要とされる。RNAは、RNアーゼの広範囲の発生のために、DNAより
も、操作するのに困難である。試験サンプルにおける核酸が配列決定され、そし
てその配列が、本明細書におけるいずれかの図に示される配列と比較され、差異
が存在するか、否かが決定され得る。そのような場合、差異が、既知の感受性対
立遺伝子（第２表に示されるような）と比較され、試験核酸が示される１又は複
数の変動を含むかどうかが決定され、又は差異がIDDM又は他の疾病との関連性に
ついて調べられ得る。

【０１４４】 試験サンプルにおけるすべての核酸又は完全なSAPL遺伝子でさえ、配列決定す
ることは一般的に、時間又は労力有効性ではないので、特定の増幅反応、例えば
１又は複数のプライマー対を用いてPCRが、核酸における興味ある領域、例えばS
APL遺伝子、又はIDDM又は他の疾病感受性に関連する多型現象が存在する特定の
領域を増幅するために使用され得る。次に、増幅された核酸が上記のようにして
配列決定され、そして/又は特定の特徴の存在又は不在を決定するためにいずれ
か他の手段により試験され得る。試験のための核酸は、細胞から除去される核酸
から、又は種々の他の技法、例えば制限酵素消化及び電気泳動を用いて、ライブ
ラリーにおいて調製され得る。

【０１４５】 核酸は、変異体−又は対立遺伝子−特異的プローブを用いてスクリーンされ得
る。そのようなプローブは、IDDM又は他の疾病感受性に関連することが知られて
いる配列変更を含む。SAPL遺伝子の領域又はその補体に対して、配列において対
応する。適切な緊縮条件下で、試験核酸に対してのそのようなプローブの特異的
ハイブリダイゼーションは、試験核酸における配列変更の存在の表示である。効
果的スクリーニング目的のためには、１よりも多くのプローブが、同じ試験サン
プルに対して使用され得る。

【０１４６】 対立遺伝子−又は変異体−特異的オリゴヌクレオチドは同様に、試験サンプル
に存在する場合、特定の配列を特異的に増幅するためにPCRにおいて使用され得
る。PCRバンドが遺伝子変異体を含むかどうかの評価は、当業者に知られている
多くの手段で行われ得る。PCR生成物は、例えば、変性ポリアクリルアミドDNA配
列決定ゲル上での多型現象の表示を可能にする手段で試験され、そして遺伝子変
異体SSCPへテロ複合体分析に連結される特異的バンドが、配列変異体/突然変異
についてDNAフラグメントをスクリーニングするために使用され得る。それは一
般的に、遺伝子の放射性ラベルされた100−300bpフラグメントを増幅し、それら
の生成物を希釈し、そして95℃で変性することを包含する。

【０１４７】 前記フラグメントは、氷上ですばやく冷却され、その結果、DNAは一本鎖形で
存続する。それらの一本鎖フラグメントは、アクリルアミド基材のゲル上で試験
される。配列組成の差異は、このゲルマトリックスにおける一本鎖分子の差異配
座の作用を引き起こし、野生型フラグメントとは異なるそれらの移動度を製造し
、従って、X−線フィルムへのゲルの暴露に基づいて、対照フラグメントに対し
て分析されるフラグメントの突然変異の検出を可能にする。変更された移動度/
配座を有するフラグメントが、ゲルから直接的に切除され、そして突然変更につ
いて直接的に配列決定される。

【０１４８】 PCR生成物の配列決定は、イソプロパノールによる沈殿、再建濁、及びTaqFS⁺
色素ターミネーター配列決定キットを用いての配列決定を包含する。延長生成物
は、ABI377 DNA配列決定機上で電気泳動され、そしてSequence Navigator ソフ
トウェアを用いてデータ分析され得る。

【０１４９】 追加の可能なスクリーニングアプローチは、コンセンサスKozak開始配列及びT
7 RNAポリメラーゼプロモーターを含むプライマーにより増幅される。それらの
特別な配列は、5’プライマー中に組み込まれ、その結果、それらは分析される
フラグメントの生来のコード配列と整合して存在する。それらのPCR生成物は、
カップリングされた転写/翻訳システム中に導入される。この反応は、フラグメ
ントからのRNAの生成、及びRNAのタンパク質フラグメントへの翻訳を可能にする
。

【０１５０】 対照からのPCR生成物は、分析されるフラグメントのサイズに比較して野生型
サイズのタンパク質生成物を製造する。分析されるPCR生成物がフレームシフト
又はナンセンス突然変異を有する場合、アッセイは、対照に比較して、切断され
たタンパク質生成物を生成するであろう。その切断された生成物のサイズは、突
然変異の位置に関連し、そしてこの患者からの遺伝子の相対的領域が、その切断
された突然変異を同定するために、配列決定され得る。

【０１５１】 試験サンプルにおける変異体配列の存在を見出すためのもう１つの手段又は補
充は、例えば適切な特異的オリゴヌクレオチドプローブ又はプライマーを用いて
、通常の配列の存在について調べることである。オリゴヌクレオチドプローブ及
びプライマーの使用は、上記でより詳細に論じられている。 本発明の態様の対立遺伝子−又は変異体−特異的オリゴヌクレオチドプローブ
又はプライマーは、第１表及びその修飾されたバージョンに示されるそれらから
選択され得る。

【０１５２】 プローブと試験核酸との間のハイブリダイザーション及び続くミスマッチの検
出に依存するアプローチが使用され得る。適切な条件（温度、pH、等）下で、オ
リゴヌクレオチドプローブは、完全には相補的でない配列とハイブリダイズする
であろう。２種の分子間の塩基対合の程度は、ミスマッチにもかかわらず、それ
らがアニーリングするためには十分であろう。２種のアニーリング核酸分子間の
ミスマッチの存在を検出するための種々のアプローチが、当業界において良く知
られている。

【０１５３】 例えば、RNアーゼAは、ミスマッチの部位で分解する。分解は、適切なプロオ
ー部がアニーリングしている試験核酸を電気泳動し、そして十分な長さのプロー
ブ/試験ハイブリッドよりも小さな分子（すなわち、高い電気泳動移動度を有す
る分子）を調べることによって検出され得る。

【０１５４】 従って、IDDM又は他の疾病感受性に関連する突然変異が存在することが知られ
ている（第２表を参照のこと）通常のSAPL遺伝子（センス又はアンチセンス鎖の
いずれか）の領域の配列を有するオリゴヌクレオチドプローブが、核酸を試験す
るためにアニーリングされ得、そしてミスマッチの存在又は不在が決定され得る
。ミスマッチの存在の検出は、IDDM又は他の疾病感受性に関連する突然変異の試
験核酸における存在を示すことができる。他方では、IDDM又は他の疾病感受性に
関連する突然変異を包含する遺伝子の領域配列を有するオリゴヌクレオチドプロ
ーブが、核酸を試験するためにアニーリングされ得、そしてミスマッチの存在又
は不在が決定され得る。ミスマッチの存在は、試験サンプルにおける核酸が正常
な配列を有することを示すことができる（ミスマッチの不在は、試験核酸が突然
変異を有することを示す）。いずれの場合でも、遺伝子の異なった領域に対する
一連のプローブが使用され得る。

【０１５５】 核酸分子の配列における差異の存在は、制限酵素消化の手段により、例えばDN
Aフィンガープリン方法により検出され得、ここで前記方法においては、１又は
複数の制限酵素が核酸のサンプルを切断するために使用される場合に生成される
制限パターンが、本明細書における図に示される通常の遺伝子、又は第２表に示
される変更を含むような変異体又は対立遺伝子を含むサンプルが同じ酵素により
消化される場合に得られるパターンと比較される。

【０１５６】 プロモーター又は他の制御配列における損傷の存在又は不在はまた、転写によ
るmRNA生成のレベル、又はmRNAからの翻訳によるポリペプチド生成のレベルを決
定することによっても評価され得る。プロモーター活性の決定は、上記で論じら
れている。 核酸の試験サンプルは例えば、細胞又は生物学的組織又は流体、尿、唾液、糞
、頬スワブ、生検又は好ましくは血液から核酸を抽出することによって、又は羊
膜、胎盤又は胎児自体からの出産前試験のために提供され得る。

【０１５７】 試験サンプルにおける１又は複数のアミノ酸配列変異体の存在についてのスク
リーニングは、例えば、IDDM又は他の疾病感受性の決定における診断及び/又は
予後に使用される。 特定のポリペプチド、例えば本明細書におけるいずれかの図に示されるアミノ
酸配列、又はそのアミノ酸配列変異体、変異株又は対立遺伝子を有するポリペプ
チドの試験サンプルにおける存在又は不在を決定するための種々の方法が存在す
る。

【０１５８】 サンプルが、本明細書における図に示されるポリペプチドの１又は複数の特定
の変異体に対して特異的な特異的結合メンバー、例えば抗体（又は抗体混合物）
のための結合パートナーの存在について試験され得る。サンプルは、本明細書に
おける図に示されるポリペプチドに対して特異的な特異的結合メンバー、例えば
抗体（又は、抗体混合物）のための結合パートナーの存在について試験され得る
。そのような場合、サンプルは、特異的結合メンバー、例えば抗体と、論じられ
るようなレポーターシステムを用いて、結合が決定される前、特異的結合のため
の適切な条件下で接触せしめられることによって試験され得る。抗体のパネルが
使用される場合、異なったレポーティングラベルが、個々の結合が決定されるた
めには、個々の抗体のために使用され得る。

【０１５９】 特異的結合メンバー、例えば抗体が、試験サンプルからその結合パートナーポ
リペプチドを単離し、そして/又は精製するために使用され得、それが、その配
列が本明細書に開示されるポリペプチドの配列及び/又は特性を有するかどうか
、又はそれが変異体又は変異株形であるかどうかの、前記ポリペプチドの配列及
び/又は生物学的分析による決定を可能にする。アミノ酸配列は、自動配列決定
機械を用いて通常通りに決定される。 １又は複数のポリペプチドを含む試験サンプルは、組織又は細胞、例えば唾液
、糞、又は好ましくは血液を用いて、粗又は部分的に精製された細胞又は細胞溶
解物調製物として、又は羊膜、胎盤又は胎児自体からの出産前試験のために提供
され得る。

【０１６０】 それがポリペプチド、抗体、ペプチド、核酸分子、小分子、又は個人に与えら
れる本発明の他の医薬的有用な化合物である場合、投与は好ましくは、“予防的
に有効な量”又は“治療的に有効な量”（良くあることが、予後も治療として考
慮される）で行われ、これは個人に有益性を示すのに十分である。投与される実
際の量、及び投与の速度及び時間の経過は、処理されるものの性質及び重症度に
依存するであろう。処理の規定、例えば用量、等の決定は、一般的な実施者及び
他の医者の責任内である。 組成物は、単独で又は他の処理と組み合して、処理されるべき条件に依存して
、同時又は連続的に投与され得る。

【０１６１】 本発明の及び本発明に従って使用するための医薬組成物は、活性成分の他に、
医薬的に許容できる賦形剤、キャリヤー、緩衝液、安定剤又は当業者に良く知ら
れている他の材料を含むことができる。そのような材料は、非毒性であるべきで
あり、そして活性成分の効率を妨げるべきではない。キャリヤー又は他の材料の
正確な性質は、経口、又は注射、例えば皮膚、皮下又は静脈内注射であり得る投
与の経路に依存するであろう。

【０１６２】 経口投与のための医薬組成物は、錠剤、カプセル、粉末又は液体形で存在する
ことができる。錠剤は、固体キャリヤー、例えばゼラチン又はアジュバントを含
むことができる。液体医薬組成物は一般的に、液体キャリヤー、例えば水、石油
、動物又は植物油、鉱油又は合成油を含む。生理食塩水、デキストロース又は他
のサッカリド溶液又はグリセロール、例えばエチレングリコール、プロピレング
リコール又はポリエチレングリコールが含まれ得る。

【０１６３】 静脈内、皮膚又は皮下注射、又は苦痛の部位での注射に関しては、活性成分は
、発熱物質を含まず、そして適切なpH、等張性及び安定性を有する、非経口的に
許容できる水溶液の形で存在するであろう。当業者は、例えば等張ビークル、例
えば塩化ナトリウム注射剤、リンガー注射剤又は乳酸化されたリンガー注射剤を
用いて、適切な溶液を調製することができる。保存剤、安定剤、緩衝剤、酸化防
止剤、及び/又は他の添加剤が、必要に応じて含まれ得る。

【０１６４】 標的化治療は、標的化システム、例えば抗体又は細胞特異的リガンドの使用に
より、活性剤を、一定の型の細胞に、より特異的に供給するために使用され得る
。標的化は、次の種々の理由のために所望される：例えば、剤が許容できない毒
性である場合、又は他方では、それが高過ぎる用量を必要とする場合、又はそれ
が標的細胞中に侵入することができない場合。

【０１６５】 剤を直接的に投与する代わりに、それは細胞中に例えば、ウィルスベクター（
下記参照のこと）に導入されるコード遺伝子からの発現により標的細胞において
生成され得る。前記ベクターは、処理されるべき特異的細胞に標的化され得、又
はそれは、標的細胞により、多かれ少なかれ選択的に転換される制御要素を含む
ことができる。ウィルスベクターは、特異的結合分子、例えば糖、糖脂質、又は
タンパク質、例えば抗体又はその結合フラグメントを用いて標的化され得る。核
酸は、ポリリシンを通して、タンパク質リガンド（例えば、抗体、又はその結合
フラグメント）への結合により標的化され得、ここで前記リガンドは、標的細胞
の表面上に存在する受容体に対して特異的である。

【０１６６】 剤は、処理されるべき細胞において生成されるか又はその細胞に標的化される
活性材による活性形への転換のために、前駆体形で投与され得る。このタイプの
アプローチは時々、ADEPT又はVDEPTとして知られており；前者は、細胞特異的抗
体への接合により細胞に活性剤を標的化することを包含し、そして後者は、ウィ
ルスベクターにおけるコードDNAからの発現によりベクターにおいて、活性剤、
例えば酵素を生成することを包含する（例えば、ヨーロッパ出願第415731号及び
WO90/07936号を参照のこと。

【０１６７】 例えば、生物学的活性SAPLポリペプチド又はその機能的フラグメントをコード
する本発明の核酸は、活性ポリペプチドを合成できないか、又はそれを正常なレ
ベルで合成できない患者を処理するための遺伝子療法に使用され得、それにより
、IDDM及び/又は１又は複数の他の疾病の１又は複数の徴候を処理し、そして/又
は予防するために、野生型により提供される効果を提供する。

【０１６８】 ベクター、例えばウィルスベクターが、広範囲の種類の異なった標的細胞中に
遺伝子を導入するために使用されて来た。典型的には、ベクターが標的細胞に暴
露され、その結果、トランスフェクションが、所望するポリペプチドの発現から
、有用な治療又は予後効果を提供するために十分な割合の細胞において生じるこ
とができる。トランスフェクトされた核酸は、標的化された個々の細胞のゲノム
中に永久的に組み込まれ得、長期間続く効果が提供され、又は他方では、その処
理は定期的に反復されるべきである。

【０１６９】 種々のベクター、すなわちウィルスベクター及びプラスミドベクターの両者が
、当業界において知られており；例えばアメリカ特許第5,252,479号及びWO93/07
282号を参照のこと。特に、多くのウィルス、例えばアデノウィルス、パポーバ
ウィルス、例えばSV40、ワクシニアウィルス、ヘルペスウィルス、例えばHSV及
びEBV、及びレトロウィルス、例えばテナガザル白血病ウィルス、ラウス肉腫ウ
ィルス、ベネズエラウマ脳炎ウィルス、Moloneyネズミ白血球ウィルス及びネズ
ミ乳腫瘍ウィルスが、遺伝子トランスファーベクターとして使用されて来た。従
来技術における多くの遺伝子療法プロトコールは、無能にされたネズミレトロウ
ィルスを使用して来た。

【０１７０】 無能にされたウィルスベクターは、感染性ウィルス粒子の生成のために必要と
される遺伝子が発現されるヘルパー細胞系において生成される。ヘルパー細胞系
は一般的に、ウィルスゲノムをパッケージングする機能により認識される配列を
欠いており、そして核酸を含まないビリオンを生成する。供給されるべき遺伝子
又は他の配列（SALPポリペプチド又はそのフラグメントをコードする）と共に、
損なわれていないパッケージングシグナルを含むウィルスベクターは、感染性ビ
リオン粒子中にヘルパー細胞においてパッケージングされ、これは次に、遺伝子
供給のために使用され得る。

【０１７１】 細胞中に核酸を導入するための他の既知方法は、エレクトロポレーション、リ
ン酸カルシウム同時沈殿、機会的技法、例えばマイクロインジェクション、リポ
ソーム及び直接的なDNA摂取により介在されるトランスファー及び受容体−介在
性DNAトランスファーを包含する。リポソームは、細胞への供給のために、RNA、
DNA及びビリオンを封入する。要因、例えばpH、イオン強度及び存在する二価カ
チオンに依存して、リポソームの組成は、特定の細胞又は組織の標的化のために
調製され得る。リポソームは、リン脂質を包含し、そして脂質及びステロイドを
含むことができ、そして個々のそのような成分の組成が変更され得る。リポソー
ムの標的化はまた、特異的結合対メンバー、例えば抗体又はその結合フラグメン
ト、糖又は糖脂質を用いて達成され得る。

【０１７２】 ポリペプチド又はその活性部分をコードするか核酸を用いての遺伝子治療の目
的は、野生型ポリペプチドのレベルが、不在であるか、又は低められたレベルで
のみ存在する細胞における核酸の発現生成物の量を高めることである。そのよう
な処理は、IDDM4感受性対立遺伝子及び従って、疾病に対する素因を有すること
が、スクリーニング又は試験を通して知られている個人の処理において、治療的
であるか又は予防的であり得る。

【０１７３】 類似する技法が、遺伝子発現のアンチセンス制御のために、例えば遺伝子の変
異体形が発現される細胞にアンチセンス核酸分子を標的化するために使用され得
、ここでこの目的は、変異体遺伝子生成物の生成を低めることである。遺伝子の
特異的ダウン−レギュレーションへの他のアプローチ、例えば特異的核酸配列を
切断するよう企画されたリボザイムの使用は、良く知られている。リボザイムは
、定義された位置で、一本鎖RNA、例えばmRNAを特異的に分解し、そしてそれら
の特異性が構築され得る核酸分子、実際的には、RNAである。

【０１７４】 ハンマーヘッドリボザイムが好ましい。なぜならば、それらが約11−18個の長
さの塩基の塩基配列を認識し、そしてその結果、後者のタイプのリボザイムが一
定の環境下で有用であるが、約４個の長さの塩基の配列を認識するテトラヒメラ
型のリボザイムよりも高い特異性を有するからである。リボザイムの使用に関す
る文献は、Marschallなど., Cellular and Molecular Neurobiology, 1994, 14
(5): 523; Hasselhoff, Nature 334:585 (1988);及びCech, J. Amer. Med. Assn
., 260: 3030 (1988) を包含する。

【０１７５】 本発明の観点は現在、すでに上記で記載された添付図面及び実験的な例示によ
り示されるが、しかしそれらの例示は限定的でない。追加の観点及び態様は、当
業者に明らかであろう。本明細書においても言及されるすべての記録は、引用に
より本明細書に組み込まれる。

【０１７６】 実施例例１．IDDM4 EST4 (SAPL) 同定： ショットガン配列決定のためのライブラリーの作成： DNAを、BAC（細菌人工染色体）クローン14−l−15及び25−e−5から調製した
。いずれかのBACベクターを含む細胞を、適切な抗生物質により補充されたLuria
−Bertani（LB）寒天プレート上に画線培養した。単一のコロニーを用いて、適
切な抗生物質により補充されたLB培地200mlを接種し、そして37℃で一晩、増殖
した。細胞を、遠心分離によりペレット化し、そしてプラスミドDNAを、QIAGEN
（Chatsworth, CA）Tip500 Maxiプラスミド/コスミド精製プロトコールに従って
調製したが、但し次の改良を伴なう：100mlの培養物からの細胞を、個々のTip50
0カラムに、NaCl濃度の溶出緩衝液を、1.25Mから1.7Mに高め、そして溶出緩衝液
を、65℃に加熱した。

【０１７７】 精製されたBAC及びPAC及びPAC DNAを、Not I制限エンドヌクレアーゼにより消
化し、そして次に、BioRad CHEF Mapperシステム（Richmond, CA）を用いて、パ
ルスフィールド電気泳動にゆだねた。消化されたDNAを、0.5×トリスボレートED
TA（10×原液、Fisher, Pittsburgh, PA）により調製された１％低溶融温度のア
ガロース（BioRad, Richmond CA）ゲルにおいて、一晩、電気泳動した。CHEF Ma
pper自動アルゴリズム デフォールト設定を、スイッチ時間及び電圧のために使
用した。

【０１７８】 電気泳動に続いて、ゲルを臭化エチジウム（Sigma, St. Louis, MO）により染
色し、そして紫外線トランスイルミネーターにより可視化した。挿入体バンドを
、ゲルから切除した。DNAをゲルスライスから、β−アガロース（New England B
iolabs, Beverly MA）消化により、製造業者の説明書に従って溶出した。DNA及
び消化されたアガロースを含む溶液を、50mMのトリス、pH8.0、15mMのMgCl₂及び
25％グリセロール溶液に、2mlの体積で添加し、そいてAERO−MISTネブライザー
（CIS−US, Bedford MA）に配置した。ネブライザーを窒素ガス源に結合し、そ
してDNAを、10psiで30秒間、ランダムに剪断した。

【０１７９】 剪断されたDNAをエタノール沈殿し、そしてTE（10mMのトリス、１mMのEDTA）
に再懸濁した。末端を、ヤエナリヌクレアーゼ（Promega, Madison, WI）による
30℃での30分の処理、続いてフェノール/クロロホルム抽出、及び40μMのdNTPの
存在下で、多コアー緩衝液（Promeda, Madison, WI）中、T4 DNAポリメラーゼ（
GIBCO/BRL, Gaithersburg, MD）による16℃での処理によりブラント末端化した
。DNAフラグメントのサブクローニングを促進するために、BstX Iアダプター（I
nvitrogen, Carlsbad, CA）を、T4 DNAリガーゼ（Promega, Madison, WI）によ
り、14℃で一晩、前記フラグメントに連結した。

【０１８０】 アダプター及び500bp以下のDNAフラグメントを、cDNAサイジングカラム（GIBC
O/BRL, Gaithersburg, MD）を用いて、その製造業者により提供される説明書に
従って、カラムクロマトグラフィーにより除去した。１kb以上のDNAを含む画分
をプールし、そしてエタノール沈殿により濃縮した。BstX Iアダプターを含むDN
Aフラグメントを、pcDNA II (Invitrogen, Carlsbad, CA) からのBstX I部位を
、pBlueScript (Stratagene, La Jolla, CA) のBssH II部位中にサブクローニン
グすることによって構成されたpSHOT IIのBstX I部位中に連結した。pSHOT IIを
、BstX I制限エンドヌクレアーゼによる消化により調製し、そしてアガロースゲ
ル電気泳動により精製した。ゲル精製されたベクターDNAを、Prep−A−Gene（Bi
oRad, Richmond, CA）プロトコールに従って、アガロースから抽出した。

【０１８１】 ベクターのそれ自体への連結を低めるために、消化されたベクター、ウシ陽ホ
スファターゼ（GIBCO/BRL, Gaithersburg, MD）により処理した。DNAフラグメン
トとクローニングベクターとの連結反応を用いて、超−成分XL−2ブルー細胞（S
tratagene, La Jolla, CA）を形質転換し、そして100μg/mlのアンピシリンによ
り補充されたLB寒天プレート上にプレートした。個々のコロニーを、アンピシリ
ンにより補充されたLBブイヨン100μlをウェル当たりに含む96ウェルプレート中
に取り、そして37℃で一晩、増殖した。約25μlの80％無菌グリセロールを、個
々のウェルに添加し、そしてその培養物を−80℃で貯蔵した。

【０１８２】 プラスミドDNAの調製： グリセロール原液を用いて、手動的に、又は96ウェルからの5mlブイヨンを含
む96の管を接種するようプログラムされたTecan Genesis RSP150ロボット（Teca
m AG, Hombrechtikon, Switzerland）を用いることによって、100μg/mlのアン
ピシリンにより補充されたLBブイヨン5mlを接種した。培養物を、空気供給する
ために振盪しながら、37℃で一晩、増殖した。細菌細胞を、遠心分離によりペレ
ット化し、上清液をデカントし、そして細胞ペレットを−20℃で貯蔵した。プラ
スミドDNAを、Qiawell Ultraプロトコールに従って、QIAGEN Bio Robot 9600 (Q
IAGEN, Chatsworth, CA) により調製した。挿入体の頻度及びサイズを試験する
ために、プラスミドDNAを、制限エンドヌクレアーゼPvu IIにより消化した。制
限エンドヌクレアーゼ生成物のサイズを、アガロースゲル電気泳動により試験し
、そしてその平均挿入体サイズは１〜２kbであった。

【０１８３】 ショットガンクローンのDNA配列分析： DNA配列分析を、AmpliTaq DNAポリメラーゼ、FSを備えたABI PRISM^TM 色素タ
ーミネーターサイクル配列決定準備反応キット（Perkin Elmer, Norwalk, CT）
を用いて行った。DNA配列分析を、M13前方向及び逆方向プライマーにより行った
。Perkin−Elmer9600での増幅に続いて、延長生成物を、ABI, PRISM 377自動配
列決定機（Perkin Elmer, Norwalk, CT）上で精製し、そして分析した。 約12〜15の配列決定反応を、試験されるべきDNA 1kb当たり行い、例えば1500
の反応を、BAC挿入体100kbのためには行った。

【０１８４】 DNA配列のアセンブリー： Phred/Phrapを、DNA配列アセンブリーのために使用した。このプログラムは、
Dr. Phil Green により開発され、そしてUniversity of Wshington (Seattle, W
A) から許可された。Phred/Phrapは、次のプログラムから成る：基本召集のため
のPhred、 配列アセンブリーのためのPhrap、 配列比較のためのCrossmatch、
データの可視化のためのConsed及びPhrapview、反復配列のスクリーニングのた
めのRepeatmasker. ベクター及びE.コリDNA配列を、Crossmatchにより同定し、
そしてDNA配列アセンブリー工程から除去した。DNA配列アセンブリーは、SUN En
terprise 400サーバーランニングSolaris 2.51操作システム（Sun Microsystems
Inc., Mountain View, CA）上で行われた。配列アセンブリーをさらに、Consed
and Phrapviewを用いて分析した。

【０１８５】 アセンブルされたDNA配列の生物情報化学分析： アセンブリーの種々の段階でのDNA配列を、BLASTアルゴリズム（S.F. Altschu
l, など., (1990) J. Mol. Biol. 215, 403-410）を用いて、GenBankデータベー
ス（対象）におけるDNA配列に質問した（S.F. Altschul, など. (1990) J. Mol.
Biol. 215, 403-410）。試験する場合、DNA反復要素の多数の連続した配列が、
哺乳類反復要素のデータベースにより、Crossmatchによる同定に続いて、マスク
された。BLAST分析に続いて、その結果を、解剖プログラムにより編集した。そ
の解剖は、10^-6以上のP値を伴なって類似性を有する個々のDNA配列についてのデ
ータベースからの次の情報を提供した：配列の注釈された名称、それが由来する
データベース、類似性の領域の長さ及び％同一性、及び質問及び対象の両者にお
ける類似性の位置。

【０１８６】 BAC 14−l−15からのDNA配列の分析は、60個のヌクレオチドにわたって91％同
一であったEST aa194169を示した。いくつかの証拠系は、これが純粋なmRNA転写
体であり、そしてこのESTがそのmRNA転写体の最5’側端部分を表すことを示した
。この証拠の最初の断片は、純粋であるマウスBACクローン53−ｄ−８から得ら
れた配列とBAC 14−l−15とを比較することによって示された（図４）。EST aa1
94169に対応するヒトゲノムDNAは、マウスゲノムDNAと比較して、43bpにわたっ
て88％を保存した。ヒトゲノムDNAのこの領域は、プロモーター予測アルゴリズ
ムPROMOTERSCAN（Prestridge（1995）J. Mol. Biol. 249: 923-932）における比
較的高い評点、及び転写因子結合部位として作用することが予測されるDNA配列
のクラスターの存在を示した（図４）。

【０１８７】 ヒトゲノムDNAのこの領域は、しばしばその5’末端遺伝子と結合されるCpG島
であることが推定された。それらの配列は、前で特徴づけられた、遺伝子LRP5の
3’末端から約11kb下流に存在する。最終的に、BACクローン25−e−5から得られ
たDNA配列は、２腫のエクソン間に位置するイントロンの存在を示すEST aa19416
9により表された追加のゲノム配列を示した。全体的に、それらのデータは、IDD
M4 EST4の5’部分がaa194169に対応し、そしてこのEST配列が純粋なmRNA転写体
に由来することを支持する。この遺伝子のための読み取り枠を単離するために、
RCCA分析を、延長する3’側に集中した。

【０１８８】 RCCAによるIDDM4 EST4の延長： 本発明の１つの観点の十分な長さのcDNAを、Reduced Complexity cDNA Analys
is (RCCA) と呼ばれるcDNAスクリーニング方法により生成した。手短には、部分
cDNA配列の延長を、次の２種の通常使用される方法の１つ又は両者により達成し
た：ラベルされたプローブとのハイブリダイゼーションによるcDNAライブラリー
のフィルタースクリーニング、及びPCRによる全細胞mRNAによる5’−及び3’−R
ACE。

【０１８９】 最初の方法は効果的であるが、しかし面倒であり、そして遅く、そして後者の
方法は、早いが、しかし効率において限定される。このRACEプロトコールは、１
回の反応での完全な細胞mRNA集団の使用のために、延長の制限された長さのより
妨げられる。小さなフラグメントは同じ反応においてのPCRによれば、大きなフ
ラグメントよりもより効果的に増幅されるので、第２方法を用いて得られるPCR
生成物はしばしば非常に小さい。

【０１９０】 RCCA方法は、最初にcDNAライブラリーを構成し、そして再分割し、続いて、PC
Rにより5’−及び3’−フランキングフラグメントを単離することによってcDNA
ライブラリーの既知スクリーニング方法に基づいて改良する。個々のプールは、
低〜中位い発現される所定の遺伝子について１つよりも多くのクローンを含みそ
うではないので、１つのプールにおける大きなPCR生成物と小さなPCR生成物との
間の競争は存在せず、種々のサイズのフラグメントの単離を可能にする。本明細
書に記載されるような方法の１つの明確な利点は、二者択一的にスプライシング
されたcDNA形を単離する効率、処理量及びその可能性である。

【０１９１】 RCCA工程は、一次cDNAライブラリーの再分割、及びポリメラーゼ鎖反応（PCR
）によるDNA増幅に基づいて部分cDNA配列の急速な延長を提供する。cDNAライブ
ラリーを、ランダムプライマー、オリゴdTプライマー又はそれらのプライマーの
両者の組み合わせにより感作されたcDNAにより構成し、そして次に、96−ウェル
プレートに貯蔵される、プール当たり約10,000〜20,000のクローンでプール中に
再分割した。個々のプール（ウェル）を別々に増幅し、そして従って、元のmRNA
源からのcDNA分子の独立した部分を表す。

【０１９２】 RCCA工程の基本的原理は、約10,000〜約20,000クローンのスーパープールに、
複合ライブラリーを再分割することである。２百万個の一次クローン、すなわち
組織において発現されるほとんどのmRNA転写体を包含するのに十分な数のクロー
ンのライブラリーを、188個のプールに再分割し、そして２つの96−ウェルプレ
ートに貯蔵することができる。ほとんどの遺伝子についての転写体の数は全細胞
mRNAにおいて約10,000の転写体当たり１よりも少ないコピーであるので、個々の
プールは、所定のcDNA配列当たり１よりも多くのクローンを含むとは思われない
。そのような低められた複数性は、既知の方法により得られる配列よりも大きな
部分cDNA配列のフランギングフラグメントのPCRの使用による単離を可能にする
。

【０１９３】 本明細書により助けられる当業者は、本明細書に開示されるcDNAクローニング
方法の早い達成を理解するのであろう：フランキングベクタープライマーオリゴ
ヌクレオチドと組合しての、EST又は他の部分cDNA配列からの複数のプライマー
組み合わせは、内部の遺伝子特異的配列及びそれぞれのプライマーから離れて、
両方向に“進行する（Walk）”よう使用され得、その結果、十分な長さのcDNAを
表すコンチグ（contig）が構成され得る。この特定の場合、cDNAの5’末端は、G
enBank受託番号aa194169のESTにより表された。従って、RCCA方法は、EST aa194
169の3’側配列を得るために単に使用された。

【０１９４】 この方法は、全cDNAライブラリーの代表的部分を含んで成る複数のプールをス
クリーンする能力に依存する。この方法は、方向的にクローン化された挿入体を
有するcDNAライブラリーの使用に依存しない。代わりに、5’及び3’側のベクタ
ー及び遺伝子特異的プライマーが付与され、そしてコンチグ地図が、ベクタープ
ライマー及び遺伝子特異的プライマーの両者を用いての陽性プールのさらなるス
クリーニングから構成される。もちろん、それらの遺伝子特異的プライマーは、
既知の核酸フラグメント、例えば発現された配列コンチグからまず構成される。

【０１９５】 しかしながら、前記進行が続く場合、遺伝子特異的プライマーは、cDNAの新た
に同定された領域の5’及び3’境界から利用される。前記進行が続く場合、まだ
同定されていないフラグメントのベクター配向が知られる必要はない。代わりに
、すべての組み合わせが、陽性プールに対して試験され、そして実際のベクター
配向が、予測されるPCRフラグメントを生成する一定のベクター/遺伝子特異的プ
ライマーの能力により決定される。次に、十分な長さのcDNAが、既知のサブクロ
ーニング方法により構成され得る。

【０１９６】 RCCAを用いて、EST aa194169ゲノムDNA配列とBAC 14−l−15ゲノムDNA配列と
の間の類似性により本来同定された部分cDNA配列を延長した。cDNA配列を含む陽
性クローンを、377個のヌクレオチドのPCR生成物を生成する、0.15μMの最終濃
度でのプライマー対、すなわち4dest4 3f及び4dest4 1rを用いてのPCRにより同
定した。この生成物を、94℃で30秒間の変性、60℃で30秒間のプライマーアニー
リング、及び68℃で１分間の生成物延長の40回の増幅サイクルにより得た。PCR
増幅のために使用されるDNAポリメラーゼは、酵素TaqGold (Perkin-Elmer, Norw
alk, CT) であり、そして反応体積は10μlであった。

【０１９７】 PCR鋳型は、前立腺及び精巣からの2.5kb以上のサイズ選択されたライブラリー
からのRCCAプールであった。陽性プールを、アガロース（２％）ゲル電気泳動に
よる377bpの生成物の検出により同定した。ライブラリーにおける個々の陽性プ
ールは、cDNA配列の独立したクローンを含み；部分cDNA配列及びそのフランギン
グフラグメントが個々のクローン内に包埋されている。フランキングフラグメン
トを、既知のベクター及びcDNA配列に対して相補的なプライマーによるPCRによ
り単離し、そして次に、直接的に、配列決定した。

【０１９８】 3’方向にcDNAクローンを延長するために、プライマー4dest4 3f及び4dest4 6
fを、ベクタープライマー543R及び873Fと組合して、Taqura LA (panvera, Madis
on, WI) を用いての一次反応に使用した。増幅条件は、94℃で30秒間の変性、60
℃で30秒間のプライマーアニーリング、及び68℃で4分間の延長の10μlの反応体
積においての20回のサイクルであった。一次反応物を、９部の水を添加すること
によって、希釈し、そしてそのアリコートを、プライマー4dest 7f（4dest4 6f
一次反応）及び4dest 4f (4est4 3f一次反応) を含む第２PCR反応のために除去
した。第２反応を、上記のようなTaqara LAを用いて、25サイクル増幅した。

【０１９９】 それらのフラグメントからのDNA配列を、元の部分cDNA配列によりアセンブリ
ーし、2482個のヌクレオチドの連続cDNAフラグメントを生成した。RCCAにより得
られた最長のクローンは、1.8kbの延長を提供した。2482個のヌクレオチドのcDN
A配列が、BLASTアルゴリズムを用いてGenBankデータベースを調べるために使用
された。これは、GenBank受託番号aa193106により表されるUnigene ESTクラスタ
ーの同定をもたらした。このUnigeneクラスターに依存した多くのEST配列をアセ
ンブリーし、約1.4kbのcDNA配列を生成した。次に、PCRプライマーを、Unigene
クラスターに基づいて企画し、RCCAにより同定されるDNA配列にそれらの配列を
連結した。これは、794個のアミノ酸のタンパク質をコードする、2382個のヌク
レオチドの読み取り枠を含む4.8kbのcDNA配列の同定をもたらした。

【０２００】 RCCRクローンの１つ、すなわちクローン33は、イソフォーム（ｂ）を形成する
ために、ヌクレオチド2608の後の配列から逸脱した。イソフォーム（ｂ）でのそ
の逸脱配列は、ヌクレオチド4172−4682のイソフォーム（ａ）と同一であった。
従って、この配列はたぶん、イソフォーム（ａ）ヌクレオチド1609−4171がミッ
シングする、二者択一的にスプライシングされたmRNA転写体を表す。イソフォー
ム（ｂ）は、最初の776個のアミノ酸がイソフォームと同一である、791個のアミ
ノ酸のタンパク質をコードする読み取り枠を含む。

【０２０１】 SAPLにおける多型現象の同定： RCCAの工程は、起源、すなわちcDNAを合成するために使用されるmRNA、例えば
精巣において異なり、mRNAがSAPL遺伝子座に関してヘテロ接合性である個人から
誘導され、又は異なった個人のプールからであるクローンを生成する。従って、
異なったRCCAクローン間の多型現象は、真の差異を表すことができ、他方では、
それらの差異は、RCR誤り又はE.コリにおけるSAPL挿入体を含むベクターの増幅
の間、DNAポリメラーゼにより行われる誤差から生じる。それらのタイプの誤差
を区別するために、多型現象は、１つよりも多くのクローンに検出される場合、
及び配列の性質が卓越している場合のみ示された。検出されたすべての候補体多
型現象は、cDNAの推定上の3’側未翻訳部分に存在し、そして従って、コードさ
れたタンパク質に対して影響を有さない。

【０２０２】 ノザンブロット分析： プライマー4dest4 2r (第２表)を用いて、胎盤、精巣、胸腺又はリンパ節cDNA
から957bpのPCR生成物を増幅した。この生成物を、アガロースゲル上で精製し、
DNAを抽出し、そしてpCR2.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) 中にサブクローン化
した。957bpのプローブを、50−100μCiの3000Ci/mモル［α³²P］dCTP (Dupont/
NEN, Boston, MA) の存在下で、Amersham Rediprimeキット（Arlington Heights
, IL） によるランダムプライミングラベルした。組み込まれなかったヌクレオ
チドを、ProbeQuant G-50回転カラム（Pharmacia/Biotech, Piscataway, NJ）に
より除去した。

【０２０３】 急速ハイブリダイゼーション緩衝液（Clontech, Palo Alto, CA）中、１×106
cpm/ml以上の濃度での放射性ラベルされたプローブを、65℃で一晩、ヒト多組織
Northern’s I及びII（Clontech, Palo Alto, CA）と共にインキュベートした。
ブロットを、２×SSC、0.1％のSDS（20×SSC及び20％SDS原液から調製された；F
isher, pittsburg, PA）における室温での15分間の２回のインキュベーション、
続いて、１×SSC、0.1％のSDSにおける室温での15分間の２回のインキュベーシ
ョン、及び0.1×SSC、0.1％のSDSにおける60℃での30分間の２回のインキュベー
ションにより洗浄した。ブロットのオートラジオグラフィーを行い、放射性ラベ
ルされたプローブに対して特異的にハイブリダイズするバンドを可視化した。

【０２０４】 多くの組織における発現パターンを、ノザンブロット分析により試験した。２
種の明確なバンドを検出し、１つは約4.9kb及び第２は約4.1kbのバンドであった
。ほとんどの組織において、優性バンドは大きな4.9kbのバンドであるが、しか
しながら、精巣においては、約4.1kbの低いバンドが優性バンドである。この低
いバンドは、精巣において研究され得るSAPLbとは異なる他のスプライシングさ
れた形を示す。第１バンドはたぶん、4792個のヌクレオチドの配列が決定されて
いるSAPLa cDNAに対応する。

【０２０５】 第２バンドは3228個のヌクレオチドの配列が決定されているSAPLbに対応する
。他方では、約4.1kbのバンドが、まだ同定されていない、二者択一的にスプラ
イシングされた形として対応することができ、この場合、SAPLbはまれな、二者
択一的にスプライシングされた転写体であろう。最高レベルのSAPL発現は、筋肉
、胎盤、心臓、膵臓及び精巣に見出される。検出できる発現はまた、脳、肺、肝
臓、腎臓、膵臓、胸腺、前立腺、小腸、結腸及び白血球に見出される。検出でき
る発現は、卵巣には見出されない。

【０２０６】 SAPLのためのイントロン/エキソン境界の同定： Smith−Watermanアルゴリズムを使用するプログラムCrossmatchを用いて、SAP
L cDNA配列とBAC 14−l−15及びBAC 25−e−5ゲノム配列とを比較した。これは
、cDNA配列の最初の865個のヌクレオチドに対応するSAPLの最初の５個のエキソ
ンのための境界を同定する（第３表）。

【０２０７】 SAPL遺伝子の他の種相同体の単離： 異なった種、例えばラット、イヌからのSAPL遺伝子を、ヒト配列から企画され
たPCRプライマーを用いて、興味ある種のcDNAから得られている遺伝子の一部に
よりcDNAライブラリーをスクリーニングすることによって単離する。変性PCRを
、低コドン縮重性を有するアミノ酸、例えばMet及びTrpをコードする領域を選択
することによって、32−128倍の縮重性を有する17−20個のヌクレオチドのプラ
イマーを企画することによって行った。

【０２０８】 それらのプライマーを選択する場合、タンパク質、例えば本明細書に示される
モチーフに保存される領域が選択される。PCR生成物を、DNA配列分析により分析
し、ヒト配列に対するそれらの類似性を確かめる。正しい生成物を用いて、高い
緊縮性でのコロニー又はプラークハイブリダイゼーションによりcDNAライブラリ
ーをスクリーンする。他方では、ヒト遺伝子から直接的に誘導されたプローブを
用いて、低められた緊縮性でのハイブリダイゼーションにより異なった種からの
SAPTのcDNA配列を単離する。

【０２０９】 FASTAアルゴリズムを用いてのGenBankデータベースを調べるためへのSAPL cDN
A配列の使用は、590−1080のSAPL cDNA配列に対して93％同一であるマウスEST A
A684416を表した。これはたぶん、ヒトSAPLのマウスオルト体である。それと共
に、2888−3348の配列に86％同一である他のマウスEST、例えばaa435418が、PCR
に基づく方法又は核酸ハイブリダイゼーションに基づく方法のいずれかによるマ
ウスSAPL cDNAの単離に使用される。

【０２１０】例２．疾病との関連 I型糖尿病は、オリゴ−又は多遺伝子性である遺伝子成分を有する多因性障害
である。２つの遺伝子座が、候補体遺伝子アプローチにより、I型糖尿病に対す
る感受性を付与するものとして同定されている。主要遺伝子座は、染色体6p（ID
DM1）上の主要組織適合性複合体（MHC）によりコードされ（Morton, N., など.
(1983) AM. J. HUM. GENET. 35, 201-213; Todd, J and Farrall, M. (1996) Hu
m. Mol. Genet 5, 1443-1448）、そして第２遺伝子座は、染色体11p（IDDM２）
上のインスリンミニサテライト又は種々の数のタンデム反復体（VNTR）によりコ
ードされる（Bennett, S., など. (1995) Nature Genet 9, 284-292）。

【０２１１】 しかしながら、それらの２種の遺伝子のみは、家族に観察される疾病の観察さ
れる程度の家族郡を説明することができず、ここでλs＝15（子孫危険性/集団有
病率）；IDDM1及びIDDM2は、家族群の50％を考慮して、それぞれλs＝３及び1.2
5を有する（Morton, N., など. (1983) Am. J. Hum. Genet. 35, 201-213; Todd
, J and Farrall, M. (1996) Hum. Mol. Genet. 5, 1443-1448; Bennett, S.,
など. (1995) Nature Genet. 9, 284-292; Risch, N. (1987) Am. J. Hum. Gene
t. 40, 1-14）。

【０２１２】 従って、位置クローニングアプローチが、他の遺伝子座を同定するために取ら
れた：連鎖についてのゲノムの広い走査は、もう１つの18の可能性ある領域（Da
vies, J. など. (1994) Nature 371, 130-136）、例えば染色体11q13上でのIDDM
4（図３でのMLS3.4、p＜0.001）を示した。この遺伝子座は結果的に、ゲノム−
広い有意性のレベル（p＜2×10^-5）で確かめられた（Todd, J and Farrall, M.
(1996) Hum. Mol. Genet. 5, 1443-1448; Luo, D-F., など. (1996) Hum. Mol.
Genet. 5, 693-698）。

【０２１３】 この領域内での連鎖の程度を調べるために、704の多くの家族（426のイギリス
、236のアメリカ、32のノルウェー、39のイタリア）を、25cMの間隔のFGF3にお
いて19のマイクロサテライトマーカーにより分析した。多点連鎖曲線を生成し（
MAPMAKER/SIBS Kruglyak, L and Lander, S. (1995) Am. J. Hum. Genet. 57, 4
39-454）、ピークMLS＝2.8（p＜0.0003）がD11S1889で存在し（図５）、これは
、IDDM4が18cM間隔D11S903〜D11S534内に位置することを示す（Nakagawa, Y.,
など. (1997) Fine mapping of a Type I Diabetes Susceptibility Gene (IDDM
4) on Chromosome 11q 13. Hum. Mol. Genet. Submitted）。

【０２１４】 多点連鎖分析は、小さな領域に遺伝子を局在化できない。代わりに、会合地図
は、2cM又は2Mb以下に間隔を狭めることができるまれな単一の遺伝子形質のため
に使用されて来た。理論的には、創始者突然変異に非常に隣接する特定の対立遺
伝子の会合は、その創始者からの子孫の集団において検出されるであろう。伝達
不均衡試験（TDT−Spielman, R., など. (1993) Am. J. Hum. Genet. 52, 506-5
16） は、パートナーから影響された子供のマーカー遺伝子座からの対立遺伝子
の伝達の50％の偏差を評価する。

【０２１５】 １つの方策は、染色体28q21上の推定上のIDDM6遺伝子座を明確にマッピングす
るためにこれまで使用されて来た、会合の存在下での連鎖を検出するためのTDT
を用いて、IDDM4連鎖領域に着手した（Merriman, T. など. (1997) Hum. Mol. G
enet. 6, 1003-1010）。658のイギリス及びアメリカの家族のTDT分析は、４個の
遺伝子座の対立遺伝子の伝達の偏差を示した。それらのほとんどの通常の対立遺
伝子の分析は次の通りであった：P_uncorrected＜0.05；D11S4205 54％伝達、p=0
.03；D11S1783、58％伝達、p＝0.0005；D11S1189、46％伝達、p＝0.05；H0570PO
LYA、54％伝達、p＝0.01。

【０２１６】 多対立遺伝子I_sp試験を、複数の対立遺伝子と遺伝子座との会合についての試
験であるそれらの遺伝子座に対して開始した（Martin, E. など. (1997) Am. J.
Hum. Genet. 61, 439-448）。これは、D11S4205（Tsp＝17.5、p＝0.01）、D11S
1783（Tsp＝23.6、p＝0.0001）及びH0570POLYA (Tsp＝12.4, p＝0.03)、D11S420
5 (近位) 及びD11S1783（遠位）を伴っての結果が約１Mbづつ離れて存在し、そ
してその結果、単一の遺伝子座との会合性を示すことを確かめた。

【０２１７】 H0570 POLYAは、D11S1783から約3Mb離れて存在し、そして従って、第２の遺伝
子座との会合性を示すことができる。図６は、T_sp分析のLOD評点を示す（p値の-
1log）。I型糖尿病を有する2402の家族におけるH0570POLYAのさらなる分析は、
このマーカー及びI型糖尿病により観察される会合性を確かめた（影響されたvs
影響されていない子孫についての異質性の２×２の試験、P_corrected＜ 4.8×10 ^-5 ）（Nakagawa, Y., など. (1997) Hum. Mol. Genet. Submitted）。

【０２１８】 疾病に対するマーカーの特定の対立遺伝子の会合はたぶん、マーカー及び疾病
突然変異が密接する（2Mb以内）場合に存在するので、この間隔内の２遺伝子は
、候補体である。SAPL遺伝子は、IDDMとの強い会合性を示す領域において、H057
0POLYAの200kb以内に存在し、従って、この遺伝子及びその制御領域内の単一の
ヌクレオチド多型現象が、病因学的突然変異IDDM4のための候補体である。

【０２１９】

【表１】

【０２２０】

【表２】

【０２２１】

【表３】

【０２２２】

【表４】

【０２２３】

【表５】

【図面の簡単な説明】

【図１（ａ）】 図１（ａ）は、SAPLa cDNAのヌクレオチド配列を示す。本明細書におけるヌク
レオチド番号は、この配列に関してである。

【図１（ｂ）】 図１（ｂ）は、SAPLa cDNAの最長の読み取り枠を示す。

【図１（ｃ）】 図１（ｃ）は、SAPLイソフォームaを生成するSAPLa cDNAにおける読み取り枠
のアミノ酸配列翻訳を示す。本明細書におけるアミノ酸残基番号は、この配列に
関してである。

【図１（ｄ）】 図１（ｄ）は、翻訳の効果的な開始のためのKozakコンセンサス配列と適合す
る配列で開始する、SAPLa cDNAにおける他の読み取り枠のアミノ酸配列翻訳を示
す。

【図２（ａ）】 図２（ａ）は、SAPLb cDNAのヌクレオチド配列を示す。

【図２（ｂ）】 図２（ｂ）は、SAPLb cDNAの最長の読み取り枠を示す。

【図２（ｃ）】 図２（ｃ）は、SAPLイソフォームｂを生成するSAPLb cDNAにおける読み取り枠
のアミノ酸配列翻訳を示す。

【図３】 図３は、酵母SAP190、酵母SAP185及びヒトSAPLイソフォームaのアミノ酸配列
の複数の配列の整列を示す。その整列のコンセンサス配列が示され、大文字はそ
の位置での同一性を示す。下線のアミノ酸残基は、酵母SAPファミリー及びSAPL
内に保存される。

【図４】 図４は、ゲノムにおけるSAPLエキソン１にすぐ隣接して見出され、そして推定
上のプロモーターとして同定されるDNAの配列を示す。Sp1及びNFκB転写因子の
ためのコンセンサス結合部位と適合する配列が大文字で示される。マウスゲノム
DNA配列の合成領域に保存される配列は下線が引かれている。

【図５】 図５は、IDDM4領域の多点連鎖曲線を示す。

【図６】 図６は、下記分析において得られたTsp値のLOD評点を示す。x−軸は縮尺すべ
きではない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 48/00 Ａ６１Ｐ 43/00 １１１ ４Ｃ０８５ Ａ６１Ｐ 43/00 １０５ Ｃ０７Ｋ 7/08 ４Ｃ０８７ １１１ 14/47 ４Ｈ０４５ Ｃ０７Ｋ 7/08 Ｃ１２Ｎ 1/15 14/47 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｐ 21/02 5/00 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 トッド，ジョン アンドリュー イギリス国，ケンブリッジ シービー３ ７ピーエックス，コトン，ザ フットパス 13 (72)発明者 トゥウェルズ，レベッカ クリスティーナ ジョーン イギリス国，ケンブリッジ シービー１ ３ディーイー，ベルグレイブ ロード 38 (72)発明者 ヘス，ジョン ウィルフレッド アメリカ合衆国，ペンシルベニア 19446， ランズデイル，コンスティテューション ロード 566 (72)発明者 ヘイ，パトリシア アメリカ合衆国，ペンシルベニア 19446， ランズデイル，ブルームフィールド サー クル 1133 (72)発明者 キャスキー，チャールズ トーマス アメリカ合衆国，テキサス 66005，ヒュ ーストン，ベルモント 6402 (72)発明者 ハモンド，ホリー アメリカ合衆国，ペンシルベニア 18969， テルフォード，メルビンズ ロード 612 (72)発明者 メツカー，マイケル リー アメリカ合衆国，ペンシルベニア 19446， フォート ワシントン，エリガー アベニ ュ 217 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA44 BA80 CA04 EA04 FA02 GA11 HA01 4B063 QA01 QA18 QQ42 QR56 QR62 QS25 QS34 4B064 AG01 CA19 CC24 DA01 4B065 AA93Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA44 CA46 4C084 AA02 AA06 AA07 AA13 BA01 BA02 BA08 BA22 BA23 CA53 CA56 DC50 MA02 NA14 ZB211 ZB212 ZC021 ZC022 4C085 AA13 AA14 BB11 DD62 DD63 EE01 4C087 AA01 AA02 BC83 NA13 NA14 ZB21 ZC02 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 BA17 CA40 DA76 DA86

Claims (30)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 図１（ｃ）及び図２（ｃ）に示される最初の776個のアミノ
   酸を含んで成るポリペプチドをコードする、単離された核酸。
2. 【請求項２】 1つのポリペプチドをコードし、そして請求項１記載の核酸
   に対して、緊縮条件下でハイブリダイズする、単離された核酸分子。
3. 【請求項３】 そのアミノ酸配列が図１（ｃ）及び図１（ｄ）に示されてい
   るSAPLaポリペプチドイソフォーム、並びにそのアミノ酸配列が図２（ｃ）に示
   されているSAPLbポリペプチドイソフォームから成る群から選択されたSAPLポリ
   ペプチドをコードする、単離された核酸。
4. 【請求項４】 図１（ａ）、図１（ｂ）、図２（ａ）又は図２（ｂ）に示さ
   れるコード配列から成る群から選択されたコード配列を含んで成る請求項３記載
   の単離された核酸。
5. 【請求項５】 そのアミノ酸配列が図１（ｃ）及び図１（ｄ）に示されてい
   るSAPLaポリペプチドイソフォーム、並びにそのアミノ酸配列が図２（ｃ）に示
   されているSAPLbポリペプチドイソフォームから成る群から選択された前記SAPL
   ポリペプチドをコードするコード配列を含んで成り、そして前記コード配列が図
   １（ａ）、図（ｂ）、図２（ａ）又は図２（ｂ）に示されるコード配列とは異な
   る請求項４記載の単離された核酸。
6. 【請求項６】 請求項３記載の核酸によりコードされるSAPLポリペプチドと
   少なくとも80％のアミノ酸配列類似性を有するポリペプチドをコードする、単離
   された核酸。
7. 【請求項７】 請求項３記載の核酸によりコードされるSAPLポリペプチドと
   少なくとも90％のアミノ酸配列類似性を有するポリペプチドをコードする請求項
   ６記載の単離された核酸。
8. 【請求項８】 疾病に関連する多型性部位での変更を含む請求項４記載の核
   酸に対応する単離された核酸。
9. 【請求項９】 第２表に示される変更を含む請求項４記載の核酸に対応する
   単離された核酸。
10. 【請求項１０】 請求項１〜９のいずれか１項記載の核酸を含んで成る複製
    可能核酸ベクター。
11. 【請求項１１】 前記核酸が、発現のための制御配列の制御下にある請求項
    10記載の複製可能核酸ベクター。
12. 【請求項１２】 請求項１〜10のいずれか１項記載の核酸、又は請求項９又
    は10記載の複製可能核酸ベクターにより形質転換される宿主細部。
13. 【請求項１３】 少なくとも約14個のヌクレオチドの請求項４記載の核酸分
    子のオリゴヌクレオチドフラグメント。
14. 【請求項１４】 第１表に示されるヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレ
    オチド。
15. 【請求項１５】 その配列が図４内に示されているプロモーターをコードす
    る単離された核酸。
16. 【請求項１６】 異種コード配列に作用可能に連結される請求項15記載の単
    離された核酸。
17. 【請求項１７】 請求項15又は16記載の核酸を含んで成る複製可能核酸ベク
    ター。
18. 【請求項１８】 前記核酸が、発現のための制御配列の制御下にある請求項
    17記載の複製可能核酸ベクター。
19. 【請求項１９】 請求項15もしくは16記載の核酸、又は請求項17もしくは18
    記載の複製可能核酸ベクターにより形質転換された宿主細胞。
20. 【請求項２０】 請求項１〜９のいずれか１項記載の核酸によりコードされ
    るそれらのアミノ酸から成る群から選択されたアミノ酸を含んで成る単離された
    ポリペプチド。
21. 【請求項２１】 図１（ｃ）、図１（ｄ）及び図２（ｃ）に示されるアミノ
    酸配列から成る群から選択されたアミノ酸配列の少なくとも５個の連続したアミ
    ノ酸を包含するポリペプチドのフラグメント。
22. 【請求項２２】 下記配列： HPSQEEDRHSNASQ, RIQQFDDGGSDEEDT, PESQRRSSSGSTDSE及び PSSSPEQRTGQPSAPGDTS から成る群から選択されたアミノ酸配列を有する請求項21記載のフラグメント。
23. 【請求項２３】 ポリペプチドの生成方法であって、請求項19記載の宿主細
    胞を、前記ポリペプチドの生成のための条件下で培養することを含んで成る方法
    。
24. 【請求項２４】 前記ポチペプチドを、単離し、そして/又は精製すること
    をさらに含んで成る請求項23記載の方法。
25. 【請求項２５】 前記ポリペプチドを、少なくとも１つの追加の成分を含ん
    で成る組成物中に配合することをさらに成る請求項24記載の方法。
26. 【請求項２６】 請求項20記載のポリペプチド又は請求項22記載のフラグメ
    ント、又は前記ポリペプチド又はフラグメントをコードする核酸、及び医薬的に
    許容できる賦形剤を含んで成る組成物。
27. 【請求項２７】 請求項20記載のポリペプチドに対して特異的な単離された
    抗体。
28. 【請求項２８】 下記配列： HPSQEEDRHSNASQ, RIQQFDDGGSDEEDT, PESQRRSSSGSTDSE及び PSSSPEQRTGQPSAPGDTS から選択されたアミノ酸配列を結合する請求項27記載の単離された抗体。
29. 【請求項２９】 請求項27又は28記載の抗体、及び医薬的に許容できる賦形
    剤を含んでなる組成物。
30. 【請求項３０】 請求項１〜９のいずれか１項記載の核酸のヌクレオチド配
    列により核酸の、請求項13又は14記載のオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列
    によりオリゴヌクレオチドの、又は請求項20記載のポリペプチドのアミノ酸配列
    によりポリペプチドのサンプルにおける存在又は不在を決定し、又は請求項21又
    は22記載のフラグメントのアミノ酸配列を含んで成る方法。