JP2003509063A - ヒトｃｙｐ３ａ４遺伝子およびヒトｃｙｐ３ａ７遺伝子における多型および、診断的および治療的適用におけるその使用 - Google Patents

ヒトｃｙｐ３ａ４遺伝子およびヒトｃｙｐ３ａ７遺伝子における多型および、診断的および治療的適用におけるその使用

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Abstract

(57)【要約】 表現型スペクトル、ならびにCYP3A4遺伝子およびCYP3A7遺伝子の遺伝する異常発現および/または機能の様々な形態を伴う重複する臨床特性を診断および治療する一般的な手段および方法が述べられる。特に、例えば薬物の不十分な代謝および/または感受性に関連する分子変異型CYP3A4遺伝子および分子変異型CYP3A7遺伝子のポリヌクレオチド、ならびにそのようなポリヌクレオチドを含むベクターが提供される。さらに、そのようなポリヌクレオチドまたはベクターを含む宿主細胞、および変異型CYP3A4タンパク質および変異型CYP3A7タンパク質の生産のためのその使用が述べられる。加えて、変異型CYP3A4タンパク質および変異型CYP3A7タンパク質、ならびにそのようなタンパク質を特異的に認識する抗体、さらに上述のポリヌクレオチドまたはベクターを含むトランスジェニック非ヒト動物個体が提供される。また、CYP3A4遺伝子およびCYP3A7遺伝子の多機能性に関連する障害の治療のための阻害剤を同定および獲得する方法、ならびにそのような障害の状態を診断する方法が述べられる。上述のポリヌクレオチド、ベクター、タンパク質、抗体および上述の方法による阻害剤を含む、薬学的組成物および診断用組成物が提供される。CYP3A4遺伝子産物の基質もしくはCYP3A7遺伝子産物の基質、阻害剤または調節剤である薬物を用いる様々な疾患の診断および治療に、この組成物は特に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】発明の分野 本発明は、表現型スペクトル、およびチトクロームP450（CYP）3A4遺伝子およ
びCYP3A7遺伝子の遺伝する異常発現および/または機能の幾つかの形態を伴う重
複する臨床特性を、診断および治療する手段および方法に広く関連する。特に、
本発明は、例えば異常な薬物応答または環境発癌物質に引き起こされる幾つか共
通の癌の個々の素因に関係する、分子変異型CYP3A4遺伝子および分子変異型CYP3
A7遺伝子のポリヌクレオチド、ならびにそのようなポリヌクレオチドを含有する
ベクターに関連する。さらに、本発明はそのようなポリヌクレオチドまたはベク
ターを含有する宿主細胞、ならびに変異型CYP3A4タンパク質および変異型CYP3A7
タンパク質を産生するためのその使用に関連する。さらに、本発明は変異型CYP3
A4タンパク質および変異型CYP3A7タンパク質および特異的にそのようなタンパク
質を認識する抗体に関連する。本発明はまた、上述のポリヌクレオチドまたはベ
クターを含有するトランスジェニック非ヒト動物に関連する。加えて、本発明は
、CYP3A4遺伝子およびCYP3A7遺伝子の多機能に関する疾病の治療のための薬物候
補および阻害剤を同定および獲得するための方法、ならびにそのような疾病の状
態の診断方法に関連する。本発明はさらに、上述の方法によって得られる、上述
のポリヌクレオチド、ベクター、タンパク質、抗体および薬物および阻害剤を含
む薬学的組成物および診断用組成物を提供する。組成物は特に、CYP3A4遺伝子お
よびCYP3A7遺伝子またはその産物の基質、阻害剤または調節剤である薬物を用い
た、様々な疾患の診断および治療に有用である。
【０００２】 本明細書の本文を通して幾つかの文書が引用されている。本明細書で引用され
る各文書（任意の製造者の仕様書、指示書等を含む）は本明細書において参照と
して組み入れられるが、引用される任意の文書が実際に本発明に関する先行技術
であるということを認めたわけではない。
【０００３】発明の背景 血液蛋白のチトクロームP450（CYP）ファミリーのメンバーは、広い種類の、
ステロイドホルモンのような内因性基質や、発癌物質、トキシンおよび薬物を含
む生体異物を代謝する（1、2）。ヒトCYPタンパク質のうち、集合的に、全ての
ヒトCYPアイソフォームのうち飛びぬけて最も量が多いため、CYP3Aサブファミリ
ーのものが主な重要性をもつものである。さらに、それらの基質特異性は著しく
広い；したがって、多くの構造的に異なる化合物は、独占的に、またはある程度
までは、CYP3Aタンパク質の基質である。得られるデータに基づき、一般に、全
てのCYP3Aアイソフォームは同様の基質スペクトルをもつと仮定される；しかし
、限られた研究では、相違の可能性が示唆される（3）。全てのCYP3Aアイソフォ
ームは、薬物の処理に特定的な重要性がある器官（胃腸管、腎臓および肝臓）に
局在している。
【０００４】 少なくとも3つの機能的CYP3Aタンパク質が、ヒトにおいて存在する。CYP3A4モ
ノオキシゲナーゼは、ヒトの肝臓および小腸における支配的なチトクロームP450
である。このタンパク質は広い基質特異性を示し、避妊ステロイド、抗うつ薬、
ベンゾジアゼピン、免疫抑制薬、イミダゾール抗有糸分裂薬、およびマクロライ
ド系抗生物質を含む、現在使用される全ての薬物の60％以上を代謝する（4、5）
。さらに、CYP3A4は、環境トキシンからの防護において主要な役割を担う。例え
ば、このタンパク質は、アフリカおよびアジアの多くの地域における早死の主な
原因である、肝臓癌の病因に関係があるとされるアフラトキシンB1を代謝する。
アフラトキシンB1はアスペルギルス種により産生されるマイコトキシンであり、
ヒトへの曝露は主にカビに汚染された貯蔵食品の摂取の結果起こる。発癌性は肝
チトクロームP450依存のモノオキシゲナーゼ系による8,9-酸化物へのその変換に
関連している。フォレスター（Forrester）ら（6）は、アフラトキシンB1の代謝
活性率はミクロソーム中のCYP3A遺伝子ファミリーのタンパク質レベルと高い相
関があることを見出した。さらに、パオリーニ（Paolini）ら（7）は、β-カロ
チンの高用量で処理したラットの肺におけるCYP3Aの著しい増加を見出した。そ
の結果、ヒトにおける、同様に高レベルのCYP3A4が、生物活性化されたタバコ喫
煙の前発癌物質からの癌のリスクの素因を個体に与え、ゆえに、喫煙者における
β-カロチンの発癌補助効果が説明されることが提案された。これら全ては、CYP
3A4活性における個体差が様々な薬物治療の有効性、および、環境発癌物質に引
き起こされる幾つかの主要な癌への個々の素因に影響する可能性があることを意
味する。
【０００５】 CYP3A4の含有量および触媒活性におけるかなりの変異が、実際に一般集団で述
べられてきた。例えば、遺伝子基質の代謝クリアランスは20倍までの個体相互の
可変性で単様式の分布を表す。肝臓生検におけるCYP3A4タンパク質の活性は、30
倍まで変動する（8）。さらに、多くの一般的薬物は遺伝子の発現レベル（誘導
または抑制）を変化させ、この現象の程度は各々変化する。CYP3A4発現の誘導物
質は、糖質コルチコイドデキサメタゾン、抗生物質リファンピシン、および抗有
糸分裂性クロトリマゾールのような、一般に使用される薬物を含む。CYP3A4発現
の誘導能は、基質の多様な範囲と組み合って、多剤療法を行う患者においては、
このアイソザイムに関わる潜在的に有害な薬物相互作用の可能性を生じる。
【０００６】 CYP3AはCYP3A4に密接に関連したアイソフォームである（＞98％のcDNA配列類
似性）が、これが別々の遺伝子産物を反映するのか、または対立遺伝子の変異を
反映するのかは知られていない。対照的に、CYP3A5はCYP3A4とは別個の遺伝子で
あり、成人および胎児の肝臓および腎臓および腸管において多型的に発現する。
成人の白人においては、試料の10〜30％の肝臓においてmRNAおよびタンパク質が
検出され、一方、被験者の70％の腎臓および腸管においてタンパク質が検出され
た（(9)およびその文献を参照のこと）。おそらく不安定なタンパク質を合成さ
せる、CYP3A5遺伝子で述べられた点突然変異は、この酵素の多型的発現を説明す
る可能性がある（9）。CYP3A7は第3の機能的CYP3Aアイソフォームである。CYP3A
7は当初、胎児の肝臓から単離されたが、後に成人の肝臓の54％において発見さ
れた（10）。
【０００７】 個々の患者におけるCYP3Aアイソザイムの誘導能および活性を評価する試験は
、それらの基質である薬物を用いた治療の最大限の利用、および関連する副作用
の防止と明らかな関係があると考えられる。肝臓生検におけるCYP3Aアイソザイ
ム活性の直接評価は可能であるが、倫理的および費用上の理由から実用に適さな
い。エリスロマイシン呼気分析試験または6-β-ヒドロキシコルチゾール試験等
のCYP3A4活性の間接的インビボ試験は、望ましくないプローブ物質の侵襲的投与
等の倫理的な問題を引き起こし、またそれらは明らかに定常的な試験には適して
いない。加えて、これらの試験間の相関欠如は、CYP3A4活性に関するそれらの有
益な価値を疑問視する（11）。
【０００８】 個体相互間CYP3A4可変性の大部分（83％）は、遺伝子的要因によるものであっ
た（12）。それらの要因の事前同定を想定し、CYP3A4および他のCYP3Aアイソザ
イムの活性についての遺伝子的試験を確立することが可能である。CYP3Aアイソ
ザイムの活性および発現に影響を及ぼす遺伝分散は遺伝子そのものに、または一
つもしくはそれ以上のそれらの制御因子に局限できる。最も良く特徴付けられた
CYP3A遺伝子、CYP3A4の、最初に公表された3つの配列の比較により、CYP3A4タン
パク質のアミノ酸配列に影響する多型の存在が示唆された（13）。あいにく、本
発明者らの知る限り、この知見は、一般集団においては確証されなかった。より
最近には、CYP3A4プロモーターのニフェジピン特異的な反応因子における多型（
CYP3A4-W）が述べられた（14）。その存在は、より進行した前立腺腫瘍の病期と
関連している（14）。フェリックス（Felix）ら（15）は、新規の99例、および
治療関連白血病の30例において、この多型を調べた。全ての治療関連例において
、一つまたはそれ以上の、CYP3A により代謝される、エピポドフィロトキシン（
epipodophyllotoxin）のような抗癌剤への事前曝露があった。これらのデータは
、CYP3A-W多型をもつ個体では、治療に関連した白血病への危険性が増加する可
能性があり、CYP3A4によるエピポドフィロトキシン（epipodophyllotoxin）代謝
は二次的な癌の危険性に寄与する可能性があることを示唆する。現在のところ、
多型がCYP3A4タンパク質の発現性または誘導能に影響するかどうかは不明である
。最初に公表された分析により、CYP3A4の基礎発現レベルには影響がないことが
示唆される（8）。CYP3A5において点突然変異が述べられたが（9）一方、CYP3A7
においては突然変異は報告されなかった。
【０００９】 人工的にCYP3A4遺伝子に導入したアミノ酸置換を用いた実験により、ファミリ
ーのメンバーの機能がアミノ酸置換に対して非常に感受性が高いことが示される
（16〜21）。アミノ酸置換に加え、サイレント多型および、非翻訳配列またはイ
ントロン配列に局在するものもまた、これらの遺伝子の発現レベルに影響を及ぼ
す可能性がある。または、そのような多型は周辺の、同定されていない多型のマ
ーカーとしての役割を担う可能性がある。この効果は連鎖として知られており、
即ち、定義された多型は、それらが原因とならない表現型のマーカーとしての役
割を担う。
【００１０】 1998年、CYP3A4の発現がPXR（プレグナンX受容体）またはPARと呼ばれるオー
ファン核受容体ファミリーのメンバーにより制御されることを3つの研究グルー
プが独立して示し、CYP3A発現および誘導性を理解する上での重大な躍進が起こ
った（22〜24）。CYP3A4の誘導物質を用いた処理により、PXRは9-シスレチノイ
ン酸受容体（RXR）をもつヘテロ二量体として、CYP3A4プロモーターのリファン
ピシン/デキサメタゾン反応要素に結合する。ノーザンブロット解析により、肝
臓、結腸、および小腸、即ちCYP3A4を発現する主要な器官において、hPXRの最も
多量の発現が検出された。利用可能な証拠により、ヒトPXRは、CYP3A4遺伝子の
主要な転写制御因子としての役割を担うことが示唆される。近年の報告により、
PXRに仲介されるCYP3A7の誘導が記述され、ファミリーの全てのメンバーがこの
共通の転写活性化因子により制御される可能性があることが示唆されている（25
）。
【００１１】 自然に生じた突然変異が存在する場合、それらは、特に癌治療において、薬物
の代謝および薬物治療の有効性に影響を及ぼす可能性があることは明らかである
。しかし、ヒトCYP3A4遺伝子およびヒトCYP3A7遺伝子において、そのような変異
がどれほど、またどの程度の頻度でどの位置に存在するのかは知られていない。
【００１２】 したがって、CYP3A4遺伝子多型および/またはCYP3A7遺伝子多型に起因し、例
えば疾患、特に癌の化学療法を妨げる個々の薬物不耐性および薬物治療の無効性
の多様な形態を診断および治療する手段および方法は、従来利用可能ではなかっ
たが、やはり非常に望ましい。
【００１３】 ゆえに、本発明の技術的な課題は上述の要求に応じることである。
【００１４】 この技術的課題の解決は添付の特許請求の範囲において特徴付けられる態様の
提供により達成される。
【００１５】発明の概要 本発明はCYP3A4遺伝子およびCYP3A7遺伝子のヌクレオチド配列における、新規
かつこれまで未知の変異および、これらの対立遺伝子の集団分布の知見に基づい
ている。これらの新規の配列に基づき、診断試験およびそのような試験のための
試薬は、CYP3A4遺伝子およびCYP3A7遺伝子のホモ接合体およびヘテロ接合体、高
頻度対立遺伝子および低頻度対立遺伝子を含む、ヒトにおけるCYP3A4対立遺伝子
およびCYP3A7対立遺伝子の特異的な検出および遺伝形質決定のために設計された
。そのような試験法を用いたヒトのCYP3A4対立遺伝子および/またはCYP3A7対立
遺伝子の状態の決定は、CYP3A4およびCYP3A7の多くの基質を用いた治療の最適化
に有用である。環境発癌物質によって引き起こされる幾つかの共通の癌の個々の
素因を試験するのにも有用であり得る。
【００１６】 第一の態様において、本発明は分子変異型CYP3A4遺伝子および分子変異型CYP3
A7遺伝子のポリヌクレオチド、ならびにそれに関連する態様、例えばベクター、
宿主細胞、変異型CYP3A4タンパク質および変異型CYP3A7タンパク質ならびにそれ
らの産生方法等を提供する。
【００１７】 その他の態様において、本発明は、後天性の薬物感受性低下または薬物過感受
性に関連する疾病の治療のため、薬物候補ならびにCYP3A4およびCYP3A7の阻害剤
を同定および獲得する方法、またそのような疾病の状態を診断する方法を提供す
る。
【００１８】 さらなる態様において、本発明は、上述のポリヌクレオチド、それらを含むベ
クター、タンパク質、それに対する抗体、ならびに上述の方法により得られる薬
物および阻害剤を含む、薬学的組成物および診断用組成物を提供する。
【００１９】 本発明の薬学的組成物および診断用組成物、方法および利用は、治療が薬物治
療および薬物耐性に依存している癌および他の疾患の診断および治療に有用であ
る。本発明によるCYP3A4遺伝子およびCYP3A7遺伝子の新規の変異形態は、一定の
患者に対する薬物の薬力学的プロフィールの開発の可能性を提供する。
【００２０】発明の説明 CYP3A4遺伝子およびCYP3A7遺伝子における変異の知見および特徴付け、ならび
にヒト個体における異なるCYP3A4対立遺伝子および異なるCYP3A7対立遺伝子の区
別についての診断試験は、CYP3A4遺伝子産物またはCYP3A7遺伝子産物の標的であ
り、ゆえにその代謝がCYP3A4またはCYP3A7に依存するような薬物を用いた疾患の
治療法を改善するために、非常に有力な手段を提供する。個々の対立遺伝子CYP3
A7およびCYP3A7の状態の診断により、例えば、薬物の個別の用法の適用の可能性
を開くことにより、焦点を絞った治療が可能となる。それはまた、治療の結果に
ついての予後を知る手段としても有用である。さらに、CYP3A4およびCYP3A7、お
よび新規CYP3A4変異および新規CYP3A7変異を遺伝形質決定するための診断試験は
、確立した薬物で治療法を改善し、遺伝子型を薬物活性または副作用と関連付け
るのに役立つのみではない。これらの試験および配列はまた、個々の型のCYP3A4
およびCYP3A7の活性を特異的に調節する新規阻害剤の開発のための試薬を提供す
る。例えば、ヒト肝臓CYP3A4をコードする３つの対立遺伝子cDNAの酵母における
発現、ならびにそれらの遺伝子産物の結合特性および触媒活性を試験する方法は
（13）に記載されている。
【００２１】 ゆえに、本発明は分子生物学および薬物療法についての薬学的研究を開発する
新規の方法を提供する一方、変異型CYP3A4遺伝子および変異型CYP3A7遺伝子の発
現に起因する、それらの潜在的な有害効果については回避している。
【００２２】 したがって、本発明は以下からなる群より選択されるポリヌクレオチドに関連
する： (a)配列番号： に記載の核酸配列を有するポリヌクレオチド； (b)配列番号：129、135、139、145、147、155、158、160または172の任意の一つ
のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド； (c)CYP3A4遺伝子（アクセッション番号：AF280107、CYP3A4タンパク質をコード
する最初のATGにおけるヌクレオチドAを1位とする）の6004位、13908位、14292
位、14304位、14323位、14329位、14357位、15753位、20230位、21867位、21868
位、21896位、22026位、22041位、23081位、23172位、25925位または25958位の
いずれか一つに対応する位置に、またはCYP3A7遺伝子（アクセッション番号：gi
4503232）の1229位に対応する位置に、ヌクレオチド置換、ヌクレオチド欠失、
付加的なヌクレオチドまたは、付加的なヌクレオチドおよびヌクレオチド置換を
有するポリペプチドであり、23172位に対応する位置におけるヌクレオチド欠失
がMからTへのアミノ酸置換を生じないか、またはTからCへのヌクレオチド置換で
ない、CYP3A4ポリペプチドまたはCYP3A7ポリペプチドをコードするポリヌクレオ
チド； (d)CYP3A4遺伝子（アクセッション番号：AF280107、CYP3A4タンパク質をコード
する最初のATGにおけるヌクレオチドAを1位とする）の6004位、13908位、14292
位、20230位、または21868位のいずれか一つに対応する位置に一つのAを有し、C
YP3A4遺伝子（アクセッション番号：AF280107、CYP3A4タンパク質をコードする
最初のATGにおけるヌクレオチドAを1位とする）の14323位、14329位、21867位、
21896位、22026位、22041位、23081位または25925位のいずれか一つに対応する
位置に一つのTを有し、CYP3A4遺伝子（アクセッション番号：AF280107、CYP3A4
タンパク質をコードする最初のATGにおけるヌクレオチドAを1位とする）の14357
位、15753位または25958位のいずれか一つに対応する位置に一つのGを有し、CYP
3A4遺伝子（アクセッション番号：AF280107、CYP3A4タンパク質をコードする最
初のATGにおけるヌクレオチドAを1位とする）の14304位のいずれか一つに対応す
る位置に一つのCを有するポリペプチド、またはCYP3A7遺伝子（アクセッション
番号：gi4503232）の1229位に対応する位置に一つのGを有するポリペプチドであ
り、CYP3A4ポリペプチドまたはCYP3A7ポリペプチドをコードするポリヌクレオチ
ド； (e)CYP3A4ポリペプチド（アクセッション番号：AF280107）の56位、130位、170
位、174位、363位、373位、416位または445位のいずれか一つにおけるアミノ酸
置換を含むポリペプチドであり、445位に対応する位置における置換がMからTへ
のものではない、CYP3A4ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；および (f)CYP3A4ポリペプチド（アクセッション番号：AF280107）の56位におけるGから
Dへの、130位におけるRからQへの、170位におけるVからIへの、174位におけるD
からHへの、363位におけるTからMへの、373位におけるLからFへの、もしくは416
位におけるPからLへのアミノ酸置換を含むか、またはCYP3A7ポリペプチド（アク
セッション番号：gi4503232）の409位におけるTからRへの、アミノ酸置換を含む
、CYP3A4ポリペプチドまたはCYP3A7ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
。
【００２３】 本発明の状況においては、本明細書にて使用されるような「分子変異」CYP3A4ま
たはCYP3A7の遺伝子またはタンパク質という用語は、CYP3A4またはCYP3A7の遺伝
子またはタンパク質が、ヌクレオチドの置換、付加および/または欠失により、
野生型のCYP3A4またはCYP3A7の遺伝子またはタンパク質とは異なることを意味す
る（CYP3A4、CYP3A7遺伝子のゲノム配列は、例えばBork, J Biol Chem 264(1989
), 910〜9；Hashimoto, Eur J Biochem 218(1993), 585〜95；Beaune, Proc Nat
l Acad. Sci USA 83(1986), 8064〜8；Malowa, Proc Natl Acad Sci USA 83(198
6), 5311〜5に記載されている；アクセッション番号：M14096、J04449、X12387
、M18907。多型の番号付けは配列M14096に委託される；CYP3A7については：参照
配列はKomori, J Biochem(Tokyo) 105(1989), 161〜3に記載されている；アクセ
ッション番号：gi4503232。）。好ましくは、このヌクレオチド置換は、CYP3A4
タンパク質またはCYP3A7タンパク質のアミノ酸配列において、対応する変化をも
たらす。
【００２４】 本明細書にて使用される「対応する」という用語は、ある位置は先行するヌク
レオチドおよびアミノ酸の数のみによってそれぞれ決定されるのではないことを
意味する。欠失、置換の可能性のある、または一つもしくはそれ以上の付加的な
ヌクレオチドを含む可能性のある、本発明による一定のヌクレオチドまたはアミ
ノ酸の位置は、遺伝子またはポリペプチドにおけるどこか他の欠失または付加的
なヌクレオチドもしくはアミノ酸によって変化する可能性がある。ゆえに、本発
明による「対応する位置」のもとでは、ヌクレオチドまたはアミノ酸は示された
数において異なる可能性があるが、なおも同様の近傍ヌクレオチドまたはアミノ
酸を有する可能性があることが理解されるべきである。置換、欠失される、また
は付加的なヌクレオチドまたはアミノ酸を含む可能性のあるヌクレオチドまたは
アミノ酸は、「対応する位置」という用語にも含有される。ヌクレオチドまたは
アミノ酸は、例えばそれらの近傍のヌクレオチドまたはアミノ酸と共に、遺伝子
発現の制御、対応するRNAまたはRNAエディティングの安定性に関係する可能性の
ある配列、加えて本発明のタンパク質の機能的ドメインまたはモチーフをコード
する可能性のある配列を形成し得る。
【００２５】 本発明に従い、CYP3A4遺伝子およびCYP3A7遺伝子における新規のこれまで未同
定の遺伝子変異の様式および集団分布は、多くの異なる個体から得たヒトCYP3A4
遺伝子およびCYP3A7遺伝子の関連領域の配列解析により解析された。CYP3A4およ
びCYP3A7を含む全ての遺伝子の各々の遺伝子的性質をもつ、個体のゲノムDNAが
、個々の血液試料から容易に精製できることは既知の事実である。これらの個々
のDNA試料はその後、血液試料を提供した個体に存在するCYP3A4対立遺伝子およ
びCYP3A7対立遺伝子の配列組成の解析に使用される。配列解析はCYP3A4遺伝子お
よびCYP3A7遺伝子の関連領域のPCR増幅、それに続くPCR産物の精製、その後の、
確立された方法（ABI ダイターミネーターサイクルシークエンシング）を用いた
自動DNAシークエンシングにより実施した。
【００２６】 ヒト血液ゲノムDNAのPCR産物の直接DNA配列決定法によって個々のCYP3A4遺伝
子および/またはCYP3A7遺伝子型を決定し、新規CYP3A4変異または新規CYP3A7変
異を同定する試みにおいて、考慮しなければならなかったある重要なパラメータ
は、各ヒトは各々の常染色体上の遺伝子（二倍性）の2つの遺伝子コピーを有す
る（通常、異常な例外は非常に少ない）という事実である。それにより、ホモ接
合配列変異のみならず、ヘテロ接合変異をも明瞭に同定できるようにするため、
配列の評価には非常に慎重を要した。新規CYP3A4遺伝子およびCYP3A7遺伝子多型
（ホモ接合およびヘテロ接合）の同定および特徴付けにおける異なる段階の詳細
は、下記の実施例に記載される。
【００２７】 本発明に従って検出されるCYP3A4遺伝子およびCYP3A7遺伝子における突然変異
のいくつかの配列データは図4にて示される（矢印により示される）。突然変異
解析の方法は標準プロトコールに従い、実施例にて詳細に記載される。一般に、
表現型スペクトルおよび、CYP3A4遺伝子またはCYP3A7遺伝子において突然変異を
もつ患者における薬物代謝および変化した薬物耐性という、他の形態と重複する
臨床的特徴の評価のため、本発明に従って使用されるそのような方法は、例えば
ハプロタイプ解析、単鎖コンフォメーション多型解析（SSCA）、PCR法および直
接配列決定法を含む。多くの患者の徹底的な臨床的特徴付けに基づいて、表現型
は後にこれらの突然変異、また以前に述べられた突然変異と関連付けることがで
きる。
【００２８】 当業者には明白であるように、この新しい分子遺伝学的知識は現在、投与され
た薬物が異常な効果をもたらすような、指標となる患者およびその家族の遺伝子
型を正確に特徴付けるために使用することができる。
【００２９】 過去20年間にわたって、遺伝子の異質性は薬物への反応にみられる変異の重要
な原因としてますます認識されるようになった。多くの科学発表論文（Meyer, A
nn.Rev.Pharmacol.Toxicol. 37(1997), 269〜296およびWest, J.Clin.Pharmacol
. 37(1997), 635〜648）は、ある種の薬物は、ある患者においては他の患者にお
いてよりも、より良く作用する、または非常に毒性が高いことすらあること、ま
た薬物に対する患者の反応におけるこれらの変異は分子的基盤に関連する可能性
があることを明らかに示している。この「ゲノム薬理学」の概念は、患者の薬物
への反応と遺伝子のプロフィールとの間の相関に焦点を向けている（Marshall,
Nature Biotechnology, 15(1997), 954〜957；Marshall, Nature Biotechnology
, 15(1997), 1249〜1252）。
【００３０】 薬物療法に関連する集団変異性のこのような状況において、ゲノム薬理学は、
特定の薬物に対して副作用なく反応できる患者の同定および選択に有用な手段と
して提案されてきた。この同定/選択は、例えば患者の血中の白血球からのDNAを
遺伝形質決定することによる、遺伝子多型の分子診断および疾患の特徴付けに基
づくことができる（Bertz, Clin.Pharmacokinet. 32(1997), 210〜256；Engel,
J.Chromatogra.B.Biomed.Appl.678(1996), 93〜103）。米国の民間健康保険医療
団体、および多くの欧州諸国の政府公衆衛生局のような健康管理提供者のために
は、このゲノム薬理学的アプローチにより健康管理を改善すること、ならびに不
必要な治療、有効性のない薬物、および副作用のある薬物に対してかかる巨額な
費用を削減することの双方の改善を示すことが可能である。
【００３１】 変異型CYP3A4遺伝子および変異型CYP3A7遺伝子における突然変異は時には、単
独または複合の、アミノ酸の欠失、挿入、および特に置換を生じる。野生型遺伝
子または他の突然変異形態におけるそのような突然変異を遺伝子的に操作するこ
とは当然ながら可能である。CYP3A4遺伝子またはCYP3A7遺伝子のDNA配列におけ
るそのような改変の導入法は、当業者にはよく知られている；例えばサムブルッ
ク（Sambrook）、「分子クローニング実験マニュアル,（Molecular Cloning A L
aboratory Manual）」、コールドスプリングハーバー研究所（Cold Spring Harb
or Laboratory）(1989) N.Y.を参照のこと。
【００３２】 本発明の好ましい態様において、上述のポリヌクレオチドは、例えば、配列番
号：129、135、139、145、147、149、155、158、または160によりコードされる
アミノ酸配列の一つ又は複数のエピトープを含む、変異型CYP3A4タンパク質もし
くは変異型CYP3A7タンパク質またはその断片をコードする。
【００３３】 CYP3A4タンパク質およびCYP3A7タンパク質のアミノ酸配列における変化の性質
の研究のために、インターネットから得られるBRASMOLのようなコンピューター
プログラムが使用できる。さらに、他の適切なコンピュータープログラムを用い
て、構造モチーフの折りたたまれ方のシミュレーションおよびコンピューターに
よる再設計を行うことができる（Olszewski, Proteins 25(1996), 286〜299；Ho
ffman, Comput.Appl.Biosci. 11(1995), 675〜679）。コンピューターは詳細な
タンパク質モデルの構造解析およびエネルギー解析に使用できる（Monge, J.Mol
.Biol. 247(1995), 995〜1012；Renouf, Adv.Exp.Med.Biol. 376(1995), 37〜45
）。これらの解析は、薬物の結合および/または代謝に対する、特定の突然変異
の影響の決定に使用できる。
【００３４】 一般に、本発明のポリヌクレオチドにコードされるタンパク質のアミノ酸配列
におけるアミノ酸の欠失、付加または置換は、一つ又は複数のヌクレオチドの置
換、挿入または欠失、またはそれらの任意の組み合わせによるものである。好ま
しくは、ヌクレオチド置換、挿入または欠失は、CYP3A4遺伝子におけるGly56か
らAsp、Arg130からGln、Val170からIle、Asp174からHis、Thr363からMet、Leu37
3からPhe、もしくはPro416からLeu、および/またはCYP3A7遺伝子のエキソン11に
おけるThr409からArgというアミノ酸の置換を生じる。
【００３５】 本発明のポリヌクレオチドは、本明細書の上記にて特定される他に、例えば先
行技術；例えば（13）に記述された、少なくとも一つのヌクレオチドおよび任意
にアミノ酸の欠失、付加および/または置換をさらに含み得る。本発明のこの態
様は、遺伝子のそのような突然変異形態、または上述のタンパク質により模倣さ
れ得る同様の突然変異形態をもつ患者における、薬物の薬理学的プロフィールに
対する、CYP3A4遺伝子またはCYP3A7遺伝子における突然変異の相乗効果の研究を
可能にする。相乗効果の解析により、癌およびその他の疾患のある形態の薬物耐
性表現型または薬物感受性表現型の発現についてより深い洞察が提供されること
が期待される。より深い洞察から、癌に関連する診断用組成物および薬学的組成
物の開発は大いに恩恵を受けると考えられる。
【００３６】 ゆえに、好ましい態様において、本発明は、ヌクレオチドの欠失、付加および
/または置換が、対応する野生型遺伝子と比較して、変異型CYP3A4遺伝子または
変異型CYP3A7遺伝子の変化した発現をもたらすような、分子変異型CYP3A4遺伝子
および変異型CYP3A7遺伝子のポリヌクレオチドに関連する。
【００３７】 本発明のポリヌクレオチドは、例えばDNA、cDNA、ゲノムDNA、RNA、または合
成によって産生されたDNAもしくはRNA、またはこれらのうち任意のポリヌクレオ
チドを単独でもしくは組合せで含む、組換えにより産生したキメラ核酸分子が可
能である。好ましくはポリヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチドを含む、
遺伝子的な操作に従来使用されるベクター、特にプラスミド、コスミド、ウイル
スおよびバクテリオファージの一部である。そのようなベクターはさらに、適し
た宿主細胞および適切な条件下においてベクターを選択させるマーカー遺伝子の
ような遺伝子を含む可能性がある。
【００３８】 本発明のベクターのさらに好ましい態様において、本発明のポリヌクレオチド
は、原核細胞または真核細胞における発現をさせる発現制御配列に、有効に連結
される。ポリヌクレオチドの発現はポリヌクレオチドの転写、好ましくは翻訳可
能なmRNAへの転写を含む。真核細胞、好ましくは哺乳動物細胞における発現を保
証する制御要素は、当業者によく知られている。それらは通常、転写開始を保証
する制御配列、および任意に、転写終結および転写の安定化を保証するポリAシ
グナルを含む。付加的な制御要素は転写エンハンサーおよび翻訳エンハンサーを
含み得る。原核宿主細胞における発現を許容する可能な制御要素は、例えば、大
腸菌におけるlac、trpまたはtacプロモーターを含み、真核宿主細胞における発
現を許容する制御要素の例は、酵母におけるAOX1またはGAL1プロモーター、また
はCMV、SV40、RSVプロモーター（ラウス肉腫ウイルス）、CMVエンハンサー、SV4
0エンハンサー、または哺乳動物細胞および他の動物細胞におけるグロビンイン
トロンである。転写開始を担う因子に加えて、そのような制御要素は、ポリヌク
レオチドの下流に、SV40ポリA部位またはtkポリA部位のような転写終結シグナル
をも含み得る。この状況において、Okayama-Berg cDNA発現ベクターpcDV1（Phar
macia）、pCDM8、pRc/CMV、pcDNA1、pcDNA3（In-vitrogene）、pSPORT1（GIBCO
BRL）のような、適切な発現ベクターが、当技術分野において既知である。好ま
しくは、ベクターは発現ベクターおよび/または遺伝子転移ベクターもしくはタ
ーゲティングベクターである。レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノ関
連ウイルス、ヘルペスウイルス、またはウシパピローマウイルスのようなウイル
スに由来する発現ベクターは、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターの標的
細胞集団への導入に使用できる。組換えウイルスベクターを構築するため、当業
者に既知の方法が使用できる；例えば、サムブルック、「分子クローニング実験
マニュアル」コールドスプリングハーバー研究所 N.Y.および、オースベル（Aus
ubel）、「分子生物学における最新プロトコール（Current Protocols in Molec
ular Biology）」Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y.
(1994)に記載の技術を参照のこと。または、本発明のポリヌクレオチドおよびベ
クターは、標的細胞への運搬のためリポソームへ再構成することができる。
【００３９】 本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターを用いて形質転換
した宿主細胞に関連する。宿主細胞は原核細胞または真核細胞が可能である；上
記を参照のこと。宿主細胞において存在する本発明のポリヌクレオチドまたはベ
クターを、宿主細胞のゲノムへ組み込むか、または染色体外に維持することがで
きる。この点において、本発明の組換えDNA分子を「遺伝子ターゲティング」お
よび/または「遺伝子置換」のために、突然変異遺伝子の回復または、相同組換
えを介した突然変異遺伝子の作製のために使用できることもまた理解される；例
えばモウリック（Mouellic, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 87(1990), 4712〜4716）
；ジョイナー（Joyner）、「遺伝子ターゲティング、実践アプローチ（Gene Tar
geting, A Practical Approach）」Oxford University Pressを参照のこと。
【００４０】 宿主細胞としては、バクテリア、昆虫、真菌類、植物、動物またはヒトの細胞
のような、任意の原核細胞または真核細胞が可能である。好ましい真菌類細胞は
、例えば、サッカロミセス属の細胞、特にサッカロミセス・セレヴィシエ（S.ce
revisiae）種の細胞である。「原核」という用語は、変異型CYP3A4タンパク質ま
たは変異型CYP3A7タンパク質またはその断片の発現のために、ポリヌクレオチド
を用いて形質転換またはトランスフェクションできる全てのバクテリアを含むこ
とを意味する。原核宿主はグラム陰性バクテリアおよびグラム陽性バクテリア、
例えば大腸菌、チフス菌（S.typhimurium）、セラチアマルセッセンス（Serrati
a marcescens）および枯草菌（Bacillus subtilis）等を含み得る。CYP3A4変異
タンパク質およびCYP3A7変異タンパク質の突然変異形態をコードするポリヌクレ
オチドを、当業者に一般に知られた任意の技術を用いた宿主の形質転換またはト
ランスフェクションに使用できる。融合した、使用可能なように連結した遺伝子
を調製する方法、およびそれらをバクテリア細胞または動物細胞において発現す
る方法は当技術分野にて既知である（サムブルック、上記）。そこで記述される
遺伝子構築物および方法は、例えば原核細胞宿主における変異型CYP3A4タンパク
質および変異型CYP3A7タンパク質の発現に利用できる。一般に、挿入されたポリ
ヌクレオチドの十分な転写を容易にする、プロモーター配列を含む発現ベクター
が、宿主に関連して使用される。発現ベクターは概して、複製起点、プロモータ
ーおよびターミネーター、および形質転換した細胞の表現型による選抜を提供で
きる特定の遺伝子を含む。最適な細胞成長を達成するため、形質転換した原核宿
主は発酵槽において増殖でき、当技術分野にて既知の技術に従って培養できる。
本発明のタンパク質はその後、成長培地、細胞抽出物、または細胞膜分画から単
離できる。微生物を用いてまたは別の方法で発現した本発明のポリペプチドの単
離および精製は、例えば、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の使用
に関わるもののような、分離用クロマトグラフィーおよび免疫学的分離等の、任
意の従来法によって行うことが可能である。
【００４１】 ゆえに、さらなる態様において本発明は、上記に定義されるような、タンパク
質を発現させるような条件下での宿主細胞の培養、および産生されたタンパク質
または断片の培養からの回収を含む、変異型CYP3A4タンパク質および変異型CYP3
A7タンパク質およびその断片を産生する方法に関連する。
【００４２】 もう一つの態様において、本発明は、本発明のポリペプチドまたはベクターを
用いて遺伝子的に操作した細胞を含む、変異型CYP3A4遺伝子および/または変異
型CYP3A7遺伝子を発現できる細胞を産生する方法に関連する。本発明の方法によ
って得られる細胞は、例えば、サムブルック、フリッヒ（Fritsch）、マニアテ
ィス（Maniatis）(1989)「分子クローニング：実験マニュアル（Molecular clon
ing: a laboratory manual）」、コールドスプリングハーバー研究所出版、コー
ルドスプリングハーバー；ペイロニュー（Peyronneau）、Eur J Biochem 218(19
93)、355-61；ヤマザキ（Yamazaki）、Carcinogenesis 16(1995)、2167〜2170に
記載の方法に従い、薬物を試験するために使用できる。さらに、既知の薬物およ
びその未知の誘導体を、CYP3A4遺伝子またはCYP3A7遺伝子の突然変異によって生
じる薬物効力の損失を相補する能力について研究するために、この細胞を使用で
きる。これらの態様については、宿主細胞は好ましくは野生型対立遺伝子を、好
ましくはCYP3A4遺伝子および/またはCYP3A7遺伝子の両方の対立遺伝子を欠いて
おり、および/または、少なくとも一つのその突然変異したものを有している。
または、正常な対立遺伝子を超えた突然変異対立遺伝子の強度の過剰発現、およ
び正常な対立遺伝子を同様のレベルで過剰発現する組換え細胞系列との比較は、
スクリーニング系および解析系として使用できる。上記に説明する方法によって
得られる細胞は、本明細書の以下に言及するスクリーニング法のために使用する
こともできる。
【００４３】 さらに、本発明は本発明によるポリヌクレオチドにコードされる、または上述
の方法により得られる、または上述の方法によって産生される細胞からの、変異
型CYP3A4タンパク質および変異型CYP3A7タンパク質ならびにその断片に関連する
。この状況において、本発明による変異型CYP3A4タンパク質および変異型CYP3A7
タンパク質はまた、当技術分野において既知の従来法によってさらに改変され得
ることもまた理解される。本発明による変異型CYP3A4タンパク質および変異型CY
P3A7タンパク質の提供により、それらの生物学的活性またはその阻害に関連する
部分を決定することもまた可能である。
【００４４】 本発明はさらに、本発明による変異型CYP3A4タンパク質または変異型CYP3A7タ
ンパク質を特異的に認識する抗体に関連する。好都合にも、この抗体は上記に定
義される一つ又は複数のアミノ酸置換を含むエピトープを特異的に認識する。
【００４５】 本発明の変異型CYP3A4タンパク質または変異型CYP3A7タンパク質に対する抗体
は、精製した本発明によるタンパク質またはそれに由来する（合成による）断片
を抗原として用いた既知の方法により調製できる。例えば、コフラー（Kohler）
およびミルシュタイン（Milstein）、Nature 256(1975), 495にて、またガルフ
ル（Galfre）、Meth.Enzymol. 73(1981), 3にて最初に記述された、免疫化した
哺乳動物に由来する脾臓細胞とマウス骨髄腫細胞との融合を含む技術により、モ
ノクローナル抗体が調製できる。抗体はモノクローナル抗体、ポリクローナル抗
体または合成抗体、またFab、Fv、またはscFv断片等のような抗体断片が可能で
ある。さらに、前記のポリペプチドに対する抗体またはその断片は、例えば、ハ
ーロウ（Harlow）およびレーン（Lane）の「抗体、実験マニュアル（Antibodies
, A Laboratory Manual）」,CHS Press, Cold Spring Harbor, 1988に記載の方
法を使用することにより得られる。これらの抗体は例えば、本発明の変異型CYP3
A4タンパク質および変異型CYP3A7タンパク質の免疫沈降法および免疫学的局在決
定に、または例えばトランスジェニック生物における、そのような変異型CYP3A4
タンパク質および変異型CYP3A7タンパク質の存在のモニタリングに、および本発
明によるタンパク質と相互作用する化合物の同定に使用できる。例えば、BIAコ
アシステムにて利用されるような表面プラズモン共鳴は、本発明のタンパク質の
エピトープに結合するファージ抗体の効率を増加するために用いることができる
（Schier, Human Antibodies Hybridomas 7(1996), 97〜105；Malmborg, J.Immu
nol.Methods 183(1995), 7〜13）。
【００４６】 さらに、本発明は、上述の任意のポリヌクレオチドまたはその一部の相補鎖を
表すまたは含むゆえに、上述のヌクレオチド置換、欠失および付加により特定さ
れる、対応する野生型CYP3A4遺伝子およびCYP3A7遺伝子のヌクレオチド配列と比
較して、少なくとも一つのヌクレオチドの相違を含む核酸分子に関連する。デオ
キシリボ核酸またはリボ核酸のいずれかがそのような分子でありうる。そのよう
な分子は例えば、アンチセンスRNAを含む。これらの分子はさらに、転写された
ときに、本発明によるポリヌクレオチドの転写産物を特異的に切断するリボザイ
ムを産生するような、リボザイムをコードする配列に連結することが可能である
。
【００４７】 さらに、本発明は、本発明による核酸分子を含むベクターに関連する。そのよ
うなベクターの例は上記に記載される。好ましくは、ベクター中に存在する核酸
分子は、原核宿主細胞または真核宿主細胞において発現させる制御要素に機能的
に連結される；上記を参照のこと。
【００４８】 本発明はまた、生殖細胞、胚細胞、幹細胞または卵、またはそこから由来する
細胞への本発明のポリヌクレオチドまたはベクターの導入を含む、トランスジェ
ニック非ヒト動物、好ましくはトランスジェニックマウスの産生方法に関連する
。非ヒト動物は以下に記載の本発明の方法に従って使用でき、非トランスジェニ
ック健常動物であること、または疾病、好ましくはCYP3A4遺伝子および/またはC
YP3A7遺伝子における少なくとも一つの突然変異によって生じる疾病を有するこ
とが可能である。そのようなトランスジェニック動物は、それらのタンパク質ま
たは少なくともそれらの機能的ドメインは高等真核生物種間、特に哺乳動物間に
おいては保存されているため、例えば上述の変異型CYP3A4タンパク質および変異
型CYP3A7タンパク質の変異形態に関連する、薬物の薬理学的研究に非常に適して
いる。トランスジェニック胚の産生およびそれらのスクリーニングは、例えばA.
L.ジョイナー（Joyner）編、「遺伝子ターゲティング、実践アプローチ（Gene T
argeting, A Practical Approach）」(1993), オックスフォード大学出版（Oxfo
rd University Press）で記載の通りに実施できる。胚のDNAは例えば適切なプロ
ーブを用いたサザンブロット法を使用して解析できる。
【００４９】 本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターを含む、または上述
の方法により得られる、好ましくはポリヌクレオチドまたはベクターが安定して
非ヒト動物のゲノムに組み込まれる、好ましくは該ポリヌクレオチドまたはベク
ターの存在が本発明の変異型CYP3A4遺伝子および/または変異型CYP3A7遺伝子の
発現を導くような、トランスジェニックマウス、ラット、ハムスター、イヌ、サ
ル、ウサギ、ブタ、線虫（C.elegans）およびシビレエイ等の魚類のようなトラ
ンスジェニック非ヒト動物にも関連する。この動物は、変異型CYP3A4遺伝子また
はCYP3A7遺伝子の同じまたは異なるポリヌクレオチドの一つまたはそれ以上のコ
ピーをもち得る。この動物は、薬物耐容性用の研究モデルとしての有益性を含む
、多大な有益性をもち、ゆえに、細胞内の薬物代謝の欠損または不全によって生
じる疾患の療法、治療等の開発において新規の、かつ価値のある動物を与える。
したがって、この場合は、哺乳動物は好ましくはマウスまたはラットのような実
験動物である。
【００５０】 好ましくは、本発明のトランスジェニック非ヒト動物はさらに、少なくとも一
つのCYP3A4遺伝子および/またはCYP3A7遺伝子の不活性化野生型対立遺伝子を含
む。この態様は、例えばCYP3A4タンパク質およびCYP3A7タンパク質の様々な変異
形態の相互作用の研究を可能にする。トランスジェニック動物の成長および/ま
たは一生のある段階において、CYP3A4遺伝子および/またはCYP3A7遺伝子の発現
または機能を不活性化することが望ましい可能性もある。例えば、CYP3A4遺伝子
またはCYP3A7遺伝子のRNA転写産物に対する例えばアンチセンスまたはリボザイ
ムの発現を促進させる、組織特異的な、発生上の、および/または細胞制御され
た、および/または誘導可能なプロモーターの使用により、これが達成されうる
。同様に上記も参照のこと。適切な誘導可能な系は、例えば、ゴッセン（Gossen
）およびビュヤード（Bujard）（Proc.Natl.Acad.Sci. 89 USA(1992), 5547〜55
51）、およびゴッセン（Gossen）ら、（Trends Biotech. 12(1994), 58〜62）に
記載のテトラサイクリン制御の遺伝子発現である。同様に、変異型CYP3A4遺伝子
および変異型CYP3A7遺伝子の発現は、そのような制御要素により制御できる。
【００５１】 本発明の変異型CYP3A4および変異型CYP3A7のポリヌクレオチドおよびタンパク
質およびベクターを用い、インビボまたはインビトロにおいて、患者のCYP3A4遺
伝子またはCYP3A7遺伝子における特定の突然変異および影響を受けた表現型に関
して、薬物の効能についての研究を行うことが現在可能である。さらに、本発明
の変異型CYP3A4タンパク質および変異型CYP3A7タンパク質は、薬物の薬理学的プ
ロフィールの決定に、および、例えば癌の治療についてより有効性の高い可能性
のあるさらなる薬物の同定および調製に、特に上述のもののような、各々の突然
変異によって生じるある種の表現型の改善に使用できる。
【００５２】 ゆえに、本発明の特別な目的は、治療を受けるべき患者の、影響を受けた表現
型と共分離するCYP3A4遺伝子およびCYP3A7遺伝子の変異形態の多型を考慮した、
化学療法が効果的な疾患の治療のための、薬物/プロドラッグの選択および薬学
的組成物の製剤に関わる。これにより、例えば、患者の一部におけるそれらの副
作用および/または、疾患の同じまたは異なる表現型に関するそれらの不確実な
薬理学的プロフィールによって、例えば癌には適当ではないと従来考えられてい
た安全かつ安価な薬物の適用がなされる。本明細書に記載の方法および手段は、
例えば推奨用量の改善に使用でき、また考慮される患者群に依存する必要投与量
の調整を処方者に予想させる。
【００５３】 さらなる態様において、本発明は、以下の段階を含む、CYP3A4遺伝子またはCY
P3A7遺伝子またはその遺伝子産物の分子変異の活性を調節できるCYP3A4阻害剤ま
たはCYP3A7阻害剤を同定および獲得する方法に関連する： （a）変異型CYP3A4タンパク質もしくは変異型CYP3A7タンパク質または本発明の
ポリヌクレオチドを含む分子変異型遺伝子を発現する細胞を、薬物代謝に応答し
て検出可能なシグナルを提供できる成分の存在下において、CYP3A4媒介性または
CYP3A7媒介性の薬物代謝を可能にする条件下でスクリーニングされる化合物と接
触させる段階；および （b）シグナルの存在または増加が推定上の阻害剤について示唆するような、シ
グナルの有無、または代謝薬物により生み出されたシグナルの増加を検出する段
階。
【００５４】 本発明の方法における「化合物」という用語は、単独の物質、または同一とな
り得るまたはなり得ない、複数の物質を含む。
【００５５】 化合物は、化学的に合成されうる、または微生物発酵を介して産生されうるが
、また、例えば植物、動物または微生物由来の、例えば細胞抽出物のような試料
にも含まれ得る。さらに、化合物は当技術分野において既知の可能性があるが、
各々阻害剤として有用であることは従来知られていない可能性がある。複数の化
合物を、例えば培養培地に加えることができ、または本発明の細胞もしくは非ヒ
ト動物に注射することができる。
【００５６】 化合物を含む試料が本発明の方法において同定される場合、その後、化合物を
含むと同定された元の当該試料から化合物を単離すること、または、例えば複数
の異なる化合物を含む場合、試料当たりの異なる物質数を減少するために、元の
試料をさらに小分別し、元の試料の小分別を用いた方法を繰り返すことのいずれ
かが可能である。その後、例えば本明細書または文献（例えば、（13）およびレ
ーマン（Lehmann）、J Clin Invest 102(1998), 1016〜23）に記載の方法により
、この試料または化合物が望ましい特性を示すかどうかを決定することができる
。試料の複雑性によって、上述の段階を数回、好ましくは本発明の方法に従って
同定された試料が限られた数のまたは唯一の物質のみを含むまで、実施すること
ができる。好ましくは上記試料は、同様の化学的および/または物理的特性の物
質を含み、最も好ましくは該物質は同一である。本発明の方法は、例えば先行技
術に記載の他の細胞に基づいた試験法に従って、または本明細書に記載の方法を
使用および改変することにより、当業者により容易に実施および設計できる。さ
らに、本発明の方法を実施するために、例えば必要に応じてある種の化合物をCY
P3A4タンパク質またはCYP3A7タンパク質の基質となる前駆体に引き続き転換する
酵素のように、さらなるどの化合物および/またはどの酵素が使用できるかとい
うことを、当業者は容易に認識すると考えられる。本発明の方法のそのような適
用は十分当業者の技術内にあり、不適当な実験を用いずに実施できるものである
。
【００５７】 本発明に従って使用できる適した試験法は、例えば、HepG2細胞におけるキメ
ラCYP3A4遺伝子を用いたトランスフェクションアッセイを説明する、ハシモト（
Hashimoto）、Eur J Biochem 218(1993), 585〜95に記載されている。同様に、
変異型CYP3A4遺伝子および/または変異型CYP3A7遺伝子は、HepG2細胞において発
現または共発現することができ、それらの転写活性、およびCYP3A4またはCYP3A7
の触媒特性について分析できる。そのような試験法はまた、ステロイド（テスト
ステロン、プロゲステロン、アンドロステンジオン、コルチソル、17β-エスト
ラジオール、17α-エチニルエストラジオール）、抗生物質（エリスロマイシン
）、免疫抑制剤（シクロスポリンA）、ベンゾジアゼピン（ミダゾラム）、ベン
ゾチアゼピン誘導体（ジルチアゼム、トリアゾラム）、およびニフェジピンのよ
うなその基質に対する、CYP3A4およびCYP3A7の触媒特性の研究にも使用できる。
特に、そのような試験は、各々の変異型CYP3A4遺伝子および/または変異型CYP3A
7遺伝子をもつ個体において、与えられた薬剤が相互作用するかどうかの予測を
加えるのに有用である。上記に記載の本発明の方法に従って使用できる、適した
発現系は、（22）においてもまた記述されている。さらに、相当する野生型遺伝
子産物と比較した、変異型CYP3A4遺伝子および変異型CYP3A7遺伝子の遺伝子産物
の安定性、結合特性および触媒活性の研究のため、酵母菌のようなヘテロ接合体
発現系が使用できる。前述のように、分子変異型CYP3A4遺伝子および分子変異型
CYP3A7遺伝子およびそれらの遺伝子産物は、特に上記に記載の方法において使用
される場合、薬剤代謝の薬理学的研究および毒物学的研究に使用できる。本発明
の方法に従って試験されるべき好ましい薬剤は、上記に記載の薬剤を含み、ニフ
ェジピン、エリスロマイシン、トロレアンドマイシン、キニジン、シクロスポリ
ンA、17α-エチニルエストラジオール、リドカイン、ジルチアゼム、デキサメタ
ゾン、RU486を含むが限定はしない。上記も参照のこと。
【００５８】 本発明に従って使用されうる化合物はペプチド、タンパク質、核酸、抗体、小
有機化合物、リガンド、ペプチド模倣物、PNAなどを含む。化合物は、上記記載
物からの既知薬物の機能的誘導体または類似体であることも可能である。化学的
誘導体および類似体の調製方法は当業者には既知であり、例えばベイルステイン
（Beilstein）、「有機化学ハンドブック（Handbook of Organic Chemistry）」
スプリンガーエディションニューヨーク社（Springer edition New York Inc.）
、5番街175、New York, N.Y. 10010 U.S.A.、および「有機合成（Organic Synth
esis）」ウィリー（Wiley）New York, USAに記載されている。さらに、誘導体お
よび類似体を、当技術分野において既知の、または記載の方法に従い、その効果
について試験することができる。さらに、例えば、以下に記載の方法に従い、ペ
プチド模倣物および/または適切な薬物誘導体および類似体のコンピューター支
援の設計が使用できる。そのような類似体は、基礎として既知のCYP3A4およびCY
P3A7の基質ならびに/または阻害剤ならびに/または調節剤の構造を有する分子を
含む；以下を参照のこと。
【００５９】 相補的な構造モチーフのコンピューター支援探索による、推定上の阻害剤と本
発明のCYP3A4タンパク質またはCYP3A7タンパク質との相互作用部位の同定のため
に、適切なコンピュータープログラムを使用できる（Fassina, Immunomethods 5
(1994), 114〜120）。タンパク質およびペプチドのコンピューター支援の設計
のための、さらなる適切なコンピューターシステムは、例えばベリー（Berry）
、Biochem.Soc.Trans. 22(1994), 1033〜1036；ウォダック（Wodak）、Ann.N.Y.
Acad.Sci. 501(1987), 1〜13）；パド（Pado）、Biochemistry 25(1986), 5987
〜5991のような、先行技術に記載されている。上述のコンピューター解析から得
られる結果は、例えば既知の阻害剤の最適化のために、本発明の方法と組合わせ
て使用できる。適切なペプチド模倣物および他の阻害剤もまた、例えば本明細書
に記載の方法に従う、連続した化学的改変およびその結果生じた化合物の試験に
よって、ペプチド模倣物コンビナトリアルライブラリを合成することにより同定
できる。ペプチド模倣物コンビナトリアルライブラリの作製および使用の方法は
、例えばオストレシュ（Ostresh）、Methods in Enzymology 267(1996), 220〜2
34、およびドーナー（Dorner）、Bioorg.Med.Chem.4(1996), 709〜715のような
先行技術に記載されている。さらに、本発明の阻害剤およびCYP3A4タンパク質ま
たはCYP3A7タンパク質の三次元および/または結晶構造は、ペプチド模倣物薬物
の設計に使用できる（Rose, Biochemistry 35(1996), 12933〜12944；Rutenberg
, Bioorg.Med.Chem. 4(1996), 1545〜1558）。
【００６０】 要約すると、本発明は、例えば、しばしば改変活性または薬物代謝レベルまた
は感受性のある表現型を生じる、CYP3A4遺伝子またはCYP3A7遺伝子の多機能によ
り化学療法が複雑化する癌のような、疾患の特殊な形態の治療のために、特定の
投与量において使用できる化合物を同定および獲得する方法を提供する。
【００６１】 本発明の方法の好ましい態様において、上記の細胞は本発明の細胞、または本
発明の方法によって得られる細胞、または上述のトランスジェニック非ヒト動物
に含まれる細胞である。
【００６２】 さらなる態様において本発明は、以下の段階を含む、CYP3A4遺伝子またはCYP3
A7遺伝子またはその遺伝子産物の分子変異の活性を調節できるCYP3A4阻害剤また
はCYP3A7阻害剤の同定および獲得の方法に関する： （a）本発明の変異型CYP3A4タンパク質または変異型CYP3A7タンパク質を、CYP3A
4タンパク質またはCYP3A7タンパク質により結合されることが知られる第一の分
子に接触させ、タンパク質および第一の分子の第一の複合体を形成する段階； （b）第一の複合体をスクリーニングされる化合物と接触させる段階；および （c）化合物が第一の分子を第一の化合物から置換するかどうかを測定する段階
。
【００６３】 好都合なことに、この方法における測定段階は、タンパク質および阻害剤候補
との第二の複合体の形成の測定を含む。好ましくは、この測定段階は該タンパク
質に結合しない第一の分子の量の測定を含む。
【００６４】 上述の方法の特に好ましい態様において、第一の分子は、ニフェジピン、リフ
ァンピシンまたはコルチコステロンである。さらに、本発明の方法において第一
の分子は、例えば放射線標識または蛍光標識を用いて標識されることが好ましい
。
【００６５】 よりさらなる態様において本発明は、以下の段階を含む、分子変異型CYP3A4遺
伝子もしくは分子変異型CYP3A7遺伝子の存在に関連する疾病、またはそのような
疾病への感受性の診断方法に関連する： （a）被験者からの試料における本発明のポリヌクレオチドの存在を決定する段
階；および/または （b）例えば本発明の抗体を用いて、CYP3A4タンパク質またはCYP3A7タンパク質
の変異形態の存在を決定する段階。
【００６６】 本発明のこの態様に従い、疾病またはそのような疾病への感受性の状態を試験
する方法は、例えばサザンブロット法またはノーザンブロット法またはインサイ
チュー解析の形態において、本発明のポリヌクレオチドまたは核酸分子の使用に
より達成され得る。核酸配列はいずれかの遺伝子のコード領域または非コード領
域、例えばイントロンにハイブリダイズできる。本発明の方法において相補的配
列が使用される場合、核酸分子はノーザンブロット法において再度使用できる。
さらにこの試験は、例えば遺伝子の転写の実際の遮断と共に行うことができ、ゆ
えに治療上の関連性をもつことが期待される。さらに、プライマーまたはオリゴ
ヌクレオチドも上述のCYP3A4遺伝子またはCYP3A7遺伝子または対応するmRNAの一
つへのハイブリダイゼーションに使用できる。ハイブリダイゼーションに使用さ
れる核酸は、当然、例えば放射性マーカーまたは他のマーカーを取りこむまたは
付着することにより好都合に標識され得る。そのようなマーカーは当技術分野に
おいて既知である。核酸分子の標識は従来法により達成できる。
【００６７】 さらに、変異型CYP3A4遺伝子および変異型CYP3A7遺伝子の存在または発現は、
対応する核酸配列のいずれかに特異的にハイブリダイズするプライマー対の使用
により、および標準的な手順に従ったPCR反応の実行により試験できる。上述の
プローブまたはプライマーの特異的なハイブリダイゼーションは、好ましくはス
トリンジェントなハイブリダイゼーション条件にて生じる。「ストリンジェント
なハイブリダイゼーション条件」という用語は当技術分野にてよく知られている
；例えばサムブルックら、「分子クローニング、実験マニュアル（Molecular Cl
oning, A Laboratory Manual）」第2版、CHS出版コールドスプリングハーバー
、1989；「核酸ハイブリダイゼーション、実践アプローチ（Nucleic Acid Hybri
disation, A Practical Approach）」ハムス（Hames）およびヒギンズ（Higgins
）編, IRL出版, Oxford, 1985を参照のこと。さらに、被験者から得られたmRNA
、cRNA、cDNAまたはゲノムDNAは、CYP3A4遺伝子およびCYP3A7遺伝子の突然変異
特有のフィンガープリントとなり得る突然変異を同定するために配列決定できる
。本発明はさらに、被験者から得られたDNAまたはRNAのRFLPによってそのような
フィンガープリントを検出できる可能性があり、当技術分野において既知の方法
を用いる分析に先立って、DNAまたはRNAを任意に増幅できるような方法を含む。
RNAフィンガープリントは、例えば、適切なRNA酵素、例えばリボヌクレアーゼT1 、またはリボヌクレアーゼT2などまたはリボザイムを用いて被験者から得られた
RNA試料を切断すること、および、例えば上述のように、RNA断片の電気泳動によ
る分離および検出を行うことにより実行できる。
【００６８】 本発明の上述の態様のさらなる改変は、この開示から、いかなる不適当な実験
もなく、当業者により容易に工夫することができる；例えば実施例を参照のこと
。本発明の付加的な態様は、本発明の抗体またはその断片の使用により、決定が
達成されるような方法に関連する。本発明の方法にて使用される抗体は、ヒスチ
ジンフラッグまたはビオチン分子のような、検出可能なタグを用いて標識するこ
とができる。
【００６９】 本発明の好ましい態様において、上記に説明した方法はPCR法、リガーゼ連鎖
反応法、制限酵素切断法、直接配列決定法、核酸増幅技術、ハイブリダイゼーシ
ョン技術または免疫測定法（Sambrookら、上記引用文中「CSHクローニング（CSH
cloning）」、HarlowおよびLane 上記引用文中「CSH抗体（CSH antibodies）」
）を含む。
【００７０】 本発明の方法の好ましい態様において、上記疾病は癌である。
【００７１】 上述の方法のさらなる態様において、本発明の方法の全ての適用に一致して、
CYP3A4遺伝子またはCYP3A7遺伝子における変異をなくすため、または軽減するた
めの被験者への薬物の投与を含むさらなる段階は、CYP3A4遺伝子またはCYP3A7遺
伝子により生じる表現型反応による臨床徴候の発症以前に、所定の疾患の治療を
許容する。
【００７２】 本発明の方法の好ましい態様において、本薬物はCYP3A4の基質のような化学療
法薬：パクリタキセル（Eur J Drug Metab Pharmacokinet 23(1998), 417〜24）
、タモキシフェンおよびトレミフェン（Drug Metab Dispos 27(1999), 681〜8;
Clin Pharmacol Ther 64(1998), 648〜54; Clin Pharmacol Ther 57(1995), 628
〜35）、トロホスファミド（trofosfamide）(Cancer Chemother Pharmacol 44(1
999), 327〜334)、シクロホスファミドおよびイフォスファミド（Drug Metab Di
spos 27(1999), 655〜66; Cancer Res 58(1998), 4391〜401; Br J Clin Pharma
col 40(1995), 523〜30）、タキソテール（Pharmacogenetics 8(1998), 391〜40
1; Clarke, Clin Pharmacokinet 36(1999), 99〜114）である。
【００７３】 上述の方法のもう一つの好ましい態様において、本方法はさらに以下を細胞内
へ導入する段階を含む （i）機能的および発現可能な野生型CYP3A4遺伝子あるいは野生型CYP3A7遺伝子
、または （ii）本発明の核酸分子またはベクター。
【００７４】 本状況において、および本明細書を通して使用されるように、「機能的」CYP3
A4遺伝子および「機能的」CYP3A7遺伝子とは、コードされるタンパク質が野生型
CYP3A4タンパク質および野生型CYP3A7タンパク質の一次構造コンフォメーション
の一部または全部を有する、即ち、薬物を代謝し、かつCYP3A4遺伝子、CYP3A7遺
伝子をそれぞれ制御する生物学的特性を所有する遺伝子を意味する。本発明のこ
の態様は、特にヒトにおける癌の治療に適している。変異型CYP3A4遺伝子および
/または変異型CYP3A7遺伝子の発現の検出は、発現が疾患の対応する表現型の発
生または維持と相関するという結論を成立させると考えられる。したがって、発
現レベルを低レベルにまで下げるため、またはそれをなくすため、ある段階が適
用される。これは、例えば、リボザイム、アンチセンス核酸分子、細胞内抗体ま
たは上述のこれらのCYP3A4タンパク質および/またはCYP3A7タンパク質の変異形
態に対する阻害剤の使用によるような、生物学的方法による、突然変異遺伝子の
発現の少なくとも部分的な除去により行うことができる。さらに、対応する突然
変異タンパク質および遺伝子の発現レベルを下げる製剤が開発できる。
【００７５】 さらなる態様において本発明は、上述の方法の任意の一つの段階を含み、段階
（b）において同定される化合物またはその誘導体またはその類似体を、薬学的
に許容される形態に合成および/または製剤化するような、薬学的組成物を産生
する方法に関連する。本発明の方法に従って同定される治療に有用な化合物は、
上記にて議論されるように製剤、および患者への投与をすることができる。当業
者により適切であると決定される使用および治療用量については以下を参照のこ
と。
【００７６】 さらに、本発明は上述の方法の段階を含む、薬学的組成物の調製方法、および
薬物またはプロドラッグの治療的適用に適した形態での製剤方法、および本発明
の方法において診断された被験者における疾病の予防または改善の方法に関連す
る。
【００７７】 薬物またはプロドラッグはそれらのインビボにおける投与後、排出または代謝
のいずれかにより排除されるために、一つまたは複数の活性または不活性代謝産
物へ代謝される（Meyer, J. Pharmacokinet.Biopharm. 24(1996), 449〜459）。
ゆえに、本発明の方法に従って同定および獲得された実際の化合物または阻害剤
を使用する以外に、患者において活性型に転換される、プロドラッグとしての対
応する製剤を用いることができる。プロドラッグおよび薬物の投与についてとら
れる可能性のある予防手段は、文献に記載されている；概説については、オザマ
（Ozama）、J.Toxicol.Sci. 21(1996), 323〜329)を参照のこと。
【００７８】 本発明の方法の好ましい態様において、薬物またはプロドラッグは、本明細書
前述にて定義されるような薬物の誘導体である。
【００７９】 なおさらなる態様において、本発明は、本明細書前述に記載の方法により同定
または獲得される阻害剤に関連する。好ましくは、阻害剤は本発明の変異型CYP3
A4タンパク質または変異型CYP3A7タンパク質に特異的に結合する。本発明の抗体
、核酸分子および阻害剤は好ましくは、天然のリガンドまたは本発明のCYP3A4タ
ンパク質またはCYP3A7タンパク質の結合パートナーの結合特異性と少なくとも実
質的に同一の特異性を有する。抗体または阻害剤は、本発明のCYP3A4タンパク質
またはCYP3A7タンパク質に対し、少なくとも105 M-1の、好ましくは107 M-1より
高い、および有利には、CYP3A4活性またはCYP3A7活性が抑制されるべき場合に10 10 M-1までの結合親和性をもち得る。したがって、好ましい態様においては、本
発明の抑制抗体または阻害剤は、少なくとも約10-7 Mの、好ましくは少なくとも
約10-9 Mの、および最も好ましくは少なくとも約10-11 Mの親和性をもつ。
【００８０】 さらに、本発明は、本発明のポリヌクレオチドの検出のための、および/また
は対応する個々のCYP3A4対立遺伝子またはCYP3A7対立遺伝子の遺伝形質決定のた
めの、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの使用に関連する。好ましく
は、このオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、先に記載の本発明のポ
リヌクレオチドまたは核酸分子である。
【００８１】 特定の好ましい態様において、オリゴヌクレオチドは、約15ヌクレオチド長〜
50ヌクレオチド長、好ましくは20ヌクレオチド長〜40ヌクレオチド長、より好ま
しくは20ヌクレオチド長〜30ヌクレオチド長であり、配列番号：1〜127、140、1
41もしくは142の、またはこれらの任意の一つの相補的配列の、任意の一つのヌ
クレオチド配列を含む。
【００８２】 したがって、なおさらなる態様において、本発明は上記に定義されるようなオ
リゴヌクレオチドからなるプライマーまたはプローブに関連する。この状況にお
いて、「〜からなる」という用語は、上述のヌクレオチド配列、および本発明の
プライマーまたはプローブのために使用されるヌクレオチド配列が、その5'末端
および/または3'末端にすぐ隣接したCYP3A4遺伝子もしくはCYP3A7遺伝子のさら
なるヌクレオチド配列を全くもたないことを意味する。しかし、標識のような他
の成分、例えばビオチン分子、ヒスチジンフラッグ、抗体断片、金コロイド等、
CYP3A4遺伝子またはCYP3A7遺伝子に対応しないヌクレオチド配列は、本発明のプ
ライマーおよびプローブ中に存在できる。さらに、上述の特定のヌクレオチド配
列を使用すること、およびそれらを、これらの付加的なヌクレオチド配列が核酸
以外の成分と共に散在させられるような、または核酸がCYP3A4遺伝子またはCYP3
A7遺伝子のヌクレオチド配列に対応しないような、CYP3A4遺伝子またはCYP3A7遺
伝子に由来する他のヌクレオチド配列と組合せることも、また可能である。その
上さらに、例えば、当技術分野で周知のチオリン酸バックボーン（thio-phospha
te-backbone）および/または塩基類似体によってオリゴヌクレオチドの改変が可
能であることは当業者には明らかである（Flanagan, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9
6(1999), 3513〜8; Witters, Breast Cancer Res.Treat. 53(1999), 41〜50; Ha
wley, Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 9(1999), 61〜9; Peng Ho, Brain Re
s.Mol.Brain Res. 62(1998), 1〜11; Spiller, Antisense Nucleic Acid Drug D
ev. 8(1998), 281〜93; Zhang, J.Pharmacol.Exp.Ther. 278(1996), 971〜9; Sh
oji, Antimicrob.Agents Chemother. 40(1996), 1670〜5; Crooke, J.Phamacol.
Exp.Ther. 277(1996), 923〜37）。
【００８３】 さらに、本発明は、本発明の変異型CYP3A4タンパク質または変異型CYP3A7タン
パク質の検出、本発明のポリヌクレオチドを含む分子変異型CYP3A4遺伝子または
分子変異型CYP3A7遺伝子の発現、および/または本発明のポリヌクレオチドを含
むCYP3A4対立遺伝子およびCYP3A7対立遺伝子の識別のため、CYP3A4遺伝子または
CYP3A7遺伝子の遺伝子産物に特異的に結合できる抗体または物質の使用に関連す
る。
【００８４】 さらに、本発明は、組成物、好ましくは本発明の抗体、核酸分子、ベクターま
たは阻害剤、および薬学的に許容される担体を任意に含む薬学的組成物に関連す
る。例えば、阻害剤または薬学的に許容されるそれらの塩類を含む、これらの薬
学的組成物は、薬物投与に従来使用される任意の経路、例えば経口、局所的、腸
管外、または吸入により、好都合に投与できる。許容できる塩類はアセテート、
メチルエステル、HCl、スルフェート、および塩化物などを含む。化合物は、従
来の手順に従い、薬物を標準の薬学的担体と組合せることにより調製される従来
的な剤形にて投与できる。これらの手順は、望ましい調製物に適切な、成分の混
合、顆粒化および圧縮または溶解に関わり得る。薬学的に許容される担体または
希釈剤の形態および特性は、組合せられる活性成分の量、投与経路、および他の
既知の変数により決定されることは理解されると考えられる。担体は製剤の他の
成分と適合性があるという意味で、「許容される」ものでなければならず、その
レシピエントに対し有害であってはならない。使用される薬学的担体は、例えば
、固体または液体のいずれかが可能である。固体担体の例は、ラクトース、カオ
リン（terra alba）、ショ糖、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アカシア、
ステアリン酸マグネシウム、およびステアリン酸などが可能である。液体担体の
例は、生理的リン酸緩衝液、シロップ、ピーナッツオイルおよびオリーブオイル
のようなオイル、水、乳剤、様々な種類の湿潤剤、および滅菌溶液などである。
同様に、担体または希釈剤は、モノステアリン酸グリセリンまたはジステアリン
酸グリセリンのような、当技術分野において既知の遅効性物質を、単独で、また
はワックスと共に含み得る。
【００８５】 用法は、主治医および他の臨床因子により決定され、好ましくは上述のいずれ
か一つの方法に従う。医学分野においてよく知られるように、ある患者のための
用量は、患者の大きさ、体表面積、年齢、投与される特定の化合物、性別、投与
の時間および経路、一般健康状態、ならびに同時に投与される他の薬物を含む、
多くの因子に依存する。進行を定常的な評価によりモニタリングできる。
【００８６】 さらに、本発明によるCYP3A4遺伝子またはCYP3A7遺伝子の突然変異型をコード
するRNAに特異的にハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む
、または突然変異型CYP3A4タンパク質または突然変異型CYP3A7タンパク質を特異
的に認識するが、機能的な野生型は認識しないもしくは実質的に認識しない抗体
を含む薬学的組成物の使用は、細胞における突然変異型の濃度を減少させるべき
である場合に考えられる。
【００８７】 本発明により、本発明に従い、特定の薬物の選択、投与計画および対応する治
療されるべき患者を決定することができる。誤った薬物が誤った患者に対して誤
った投与量で処方されることを回避するような情報と共に、考慮される患者群に
依存する投与量の調整を処方者に予想させるように、推奨用量は製品のラベルに
て示される。
【００８８】 さらに本発明は、先に記載の本発明のポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞
、変異型CYP3A4タンパク質および変異型CYP3A7タンパク質、抗体、阻害剤、核酸
分子または対応するベクターのうちいずれか一つ、および適した検出方法を随意
に含む、診断用組成物または診断キットに関連する。
【００８９】 本発明のキットは、選択マーカーならびに、トランスジェニック細胞およびト
ランスジェニック動物の作製に適した選択培地の構成成分のような材料を更に含
み得る。本発明のキットを本発明の方法の実施のために好都合に使用でき、特に
、例えば診断分野のような様々な適用において、または研究手段として、使用で
きる。本発明のキットの一部はバイアルに個包装でき、または容器もしくは複数
容器ユニット中にて組合せることができる。キットの製造は好ましくは、当業者
に既知の標準の手順に従う。キットまたは診断用組成物は、例えば放射性免疫測
定法もしくは酵素免疫測定法のような免疫測定法、または好ましくは、本明細書
上記および実施例に記載の核酸ハイブリダイゼーションおよび/または核酸増幅
技術を使用する、上述の本発明の方法のいずれか一つに従い、CYP3A4遺伝子また
はCYP3A7遺伝子の突然変異形態の発現の検出法に使用できる。
【００９０】 いくつかの遺伝子変化は、変化したタンパク質のコンフォメーション状態を変
化させる。例えば、ある変異型CYP3A4タンパク質または変異型CYP3A7タンパク質
は、薬物代謝および転写開始の促進能力を大きく低下させる三次構造をそれぞれ
有していてもよい。突然変異タンパク質の正常な、または制御されたコンフォメ
ーションを回復することは、困難ではあるが、これらの分子欠損を修正するのに
非常に的確かつ特異的な方法である。ゆえに薬理学的操作においては、タンパク
質の野生型のコンフォメーションの回復を目指すことができる。そのため、本発
明のポリヌクレオチドおよびコードされたタンパク質は、CYP3A4またはCYP3A7の
遺伝子またはタンパク質の野生型の機能を活性化できる分子を設計および/また
は同定するために使用することもできる。
【００９１】 その他の態様において、本発明は本明細書で前述した方法により診断される疾
病の治療または予防のための、薬学的組成物の調製のための薬物またはプロドラ
ッグの使用に関連する。
【００９２】 さらに、本発明は、本発明の方法により診断される疾病を治療、予防および/
または遅延する薬学的組成物を調製するための、機能的および発現可能な野生型
CYP3A4タンパク質または野生型CYP3A7タンパク質をコードする核酸配列の有効用
量の使用に関連する。機能的および発現可能なCYP3A4タンパク質またはCYP3A7タ
ンパク質をコードする遺伝子は細胞に導入され、関心対象のタンパク質が産生さ
れうる。エクスビボ法またはインビボ法における治療遺伝子の細胞への導入に基
づく遺伝子治療は、遺伝子転移の最も重要な適用の一つである。インビトロまた
はインビボの遺伝子治療に適したベクターおよび方法は、文献に記載されており
、当業者には既知である；例えば、ジョルダーノ（Giordano）, Nature Medicin
e 2(1996), 534〜539；シェイパー（Schaper）, Circ.Res.79(1996), 911〜919
；アンダーソン（Anderson）, Science 256(1992), 808〜813；イスナー（Isner
）, Lancet 348(1996), 370〜374；ムルホーサー（Muhlhauser）, Circ.Res.77(
1995), 1077〜1086；ワン（Wang）, Nature Medicine 2(1996), 714〜716；国際
公開公報第94/29469号； 国際公開公報第97/00957号またはシェイパー（Schaper
）, Current Opinion in Biotechnology 7(1996), 635〜640、およびそこに引用
される文献を参照のこと。遺伝子は細胞への直接導入、またはリポソームもしく
はウイルスベクター（例えばアデノウイルス、レトロウイルス）を介した細胞へ
の導入のために設計できる。好ましくは、この細胞は生殖系列細胞、胚細胞、も
しくは卵細胞またはそれらに由来するものであり、最も好ましくは、この細胞は
幹細胞である。
【００９３】 上記から明らかなように、本発明の使用において、特定の細胞に対しCYP3A4タ
ンパク質またはCYP3A7タンパク質を発現および/またはターゲティングさせる制
御要素に核酸配列が機能的に連結されることが好ましい。本発明に従って使用で
きる、適した遺伝子導入系は、リポソーム、受容体介在の導入系、裸のDNA、な
らびにヘルペスウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ関連
ウイルス、その他のウイルスベクターを含み得る。遺伝子治療のための、身体の
特定部位への核酸の導入は、ウイリアムス（Williams）（Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA 88(1991), 2726〜2729）に記載のバイオリスティック導入系を使用して達成
することもできる。組換えDNAにより細胞をトランスフェクションする標準法は
、分子生物学の当業者には既知である。例えば、国際公開公報第94/29469号；上
記も参照のこと。遺伝子治療は、本発明の組換えDNA分子もしくはベクターの患
者への直接投与により、または本発明のポリヌクレオチドもしくはベクターによ
りエクスビボで細胞をトランスフェクションすることにより、およびトランスフ
ェクションされた細胞を患者に注入することにより実施できる。
【００９４】 本発明の使用および方法の好ましい態様において、上記疾病は癌である。
【００９５】 これらのおよび他の態様は、本発明の説明および実施例により開示され、また
は明らかであり、含まれる。本発明に従って使用される方法、用途および化合物
のいずれか一つに関わるさらなる文献は、例えば電子デバイスを用いて公共のラ
イブラリから検索できる。例えば、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medli
ne.html.のような、インターネット上で利用可能な公共データベース「メドライ
ン（Medline）」が使用できる。さらなるデータベースおよびアドレス、例えばh
ttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/、http://www.infobiogen.fr/、http://www.fmi.c
h/biology/research_tools.html、http://www.tigr.org./が当業者に知られてお
り、また例えばhttp://www.lycos.com.を使用して得ることもできる。バイオテ
クノロジーにおける特許情報の概説ならびに、遡及的探索および最新の知見の認
識に有用な特許の関連情報源の通覧は、バークス（Berks）, TIBTECH 12(1994),
352〜364により与えられている。
【００９６】 本発明の薬学的組成物および診断用組成物、使用、方法は、これまで変異型CY
P3A4遺伝子および変異型CYP3A7遺伝子に関連するまたは依存することが知られて
いない、あらゆる種類の疾患の診断および治療に使用できる。本発明の組成物、
方法および使用は、ヒトにおいて望ましく使用することができるが一方、本明細
書に記載の方法および使用には動物の治療もまた含まれる。
【００９７】 単なる説明のために役立ちかつ本発明の特許請求の範囲を制限すると解釈され
ない、以下の実施例に関して、本発明を説明する。
【００９８】実施例 実施例1：CYP3A4およびCYP3A7のコード領域の増幅のためのゲノム構成およびオ
リゴヌクレオチド CYP3A4のゲノム構造は以前の研究（Hashimoto, Eur.J.Biochem. 218(1993), 5
85〜95）で記述された；しかし、公表されたエキソン近傍の配列はエキソン増幅
のためのオリゴヌクレオチドを設計するには短すぎた。本発明に従い、CYP3A4エ
キソン5、7、9、12および13周辺の配列は、PCR（ポリメラーゼ連鎖反応）増幅し
た、2つの近傍エキソンおよび挿入されたイントロン部分を含む断片の配列決定
法により、解明された。CYP3A4エキソン6、8、10および11周辺の配列は、PCR増
幅した、2つの近傍エキソンおよび挿入されたイントロン部分を含む断片の配列
決定法により、また3A4を含有する細菌人工染色体（BAC）（ゲンバンク（GenBan
k）アクセッション番号AF280107）の配列決定法により、解明された。CYP3A4エ
キソン1、3および4の周辺の配列は、CYP3A4を含有する細菌人工染色体（BAC）（
ゲンバンクアクセッション番号AF280107）に由来した。これらの断片の増幅に、
およびBACの配列決定法に使用されたオリゴヌクレオチドは、遺伝子のエキソン/
イントロン構成（Hashimoto, Eur.J.Biochem 218(1993), 585〜95）を考慮して
、CYP3A4 cDNA配列（ゲンバンクアクセッション番号M14096）に由来した。ゆえ
に得られた配列は、エキソン1および3〜13の増幅のためのオリゴヌクレオチドを
設計するために使用された。エキソン2の増幅のためのオリゴヌクレオチドは、
近年決定されたCYP3A4を含有する細菌人工染色体（BAC）（ゲンバンクアクセッ
ション番号AF280107）の配列を用いて設計された。
【００９９】 ゆえに得られた配列は、遺伝子エキソンの増幅のためのオリゴヌクレオチドの
設計に使用された。それらの組成および結果的に生じるDNA断片の大きさは表2に
て与えられる。エキソン配列に加え、増幅された断片は、スプライス部位を含む
、幾つかの近傍イントロン配列、および遺伝子の幾つかの5'-および3'-UTR（非
翻訳領域）配列をも含有する。
【０１００】 実施例2：ゲノムDNAの単離、CYP3A4遺伝子断片およびCYP3A7遺伝子断片の増幅、
精製および配列決定 キアゲン（Qiagen）血液および組織DNA単離キットを用い、白人の血液または
肝臓試料からゲノムDNAを単離した。ドイツ、ベルリンのフンボルト大学、シャ
リテ（Charite）大学医学センター臨床薬理学研究所、ドイツ、シュトゥットゥ
ガルトのマルガリート・フィッシャー‐ボッシュ博士臨床薬理学研究所（Dr. Ma
rgarete Fischer-Bosch-Institute of Clinical Pharmacology）、スイス、バー
ゼル大学、バイオゼントラム（Biozentrum）薬理学部、およびドイツ、ベルリン
のパレクセルインターナショナル（Parexel International）によって、試料を
、あらゆる倫理的および法的要件を考慮して収集した。CYP3A4遺伝子断片および
CYP3A7遺伝子断片のPCR法による増幅条件は、表2に各々示される。単位複製配列
（amplicon）の完全な配列は、図6にて示される。単位複製配列の質は定常的に
、アガロースゲル電気泳動により検査を行った。断片はその後、引き続き行う配
列決定反応を阻害する可能性のある、PCRの全ての成分を除去する、PCR精製カラ
ム（キアゲン）を通して精製された。
【０１０１】 配列決定反応はダイターミネーター法を用いて実施し、試料をその後ポリアク
リルアミドゲル（パーキンエルマー377および3700配列決定機）上にて分離した
。結果およびヘテロ接合体の検出の高い正確性を確証するため、両鎖を常法によ
り配列決定した。配列をその質について視覚的に検査し、その後PHRED/PHRAP/PO
LYPHRED/CONSEDソフトウェアパッケージ（ワシントン大学、シアトル、USA）を
用いて、多型の存在について分析した。
【０１０２】 実施例3：CYP3A4遺伝子およびCYP3A7遺伝子における多型 本発明に従い、白人のDNA試料の一部をCYP3A4遺伝子のエキソン1〜13における
突然変異、およびCYP3A7遺伝子のエキソン11における突然変異についてスクリー
ニングした。CYP3A4についての結果は、一つのPCR断片につき、296〜426個の染
色体が得られた（表3）。最初に発表されている3つのCYP3A4 cDNA（Beaune, Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA 83(1986), 8064〜8；Gonzalez, Dna 7(1988), 79〜86；Bo
rk, J.Biol.Chem. 264(1989), 910〜9）と、生じた配列の比較により、ゲンバン
クアクセッション番号M18907をもつcDNA（Gonzalez, Dna 7(1988), 79〜86）の
みが、多くの白人によって発現されるようなCYP3A4タンパク質をコードすること
が示唆される。発見された変異の概要は表3に示してある。CYP3A4遺伝子におい
ては、本発明者らは総計18個の変異位置を同定し、それら全ては単一ヌクレオチ
ド多型（SNP）であった。10個の変異はCYP3A4のタンパク質コード領域内に位置
し、一つはエキソン13の非翻訳領域（3'UTR）内に、および7つはエキソン近傍イ
ントロン配列内にある。遺伝子のエキソンのスプライス部位内には変異は認めら
れなかった。18個のうち15個の変異は1％より低い、および一つのミスセンス突
然変異（M1）を含む3個は1％より高い対立遺伝子頻度であった。最も高い対立遺
伝子頻度（9.5％）は、イントロン10に位置するM14変異を表している（表3）。
【０１０３】 遺伝子のタンパク質コード領域における10個の変異のうち、2つはサイレント
である一方、8つはCYP3A4タンパク質のアミノ酸置換を生じる。8つのミスセンス
変異のうち、7つは新規のものである一方、M8変異（M445T）は、近年中国人被験
者で述べられたCYP3A4＊3対立遺伝子（Sata, Clin.Pharmacol.Ther. 67(2000),
48〜56）に一致する。最も頻度の高いミスセンス突然変異（G56D）は、試験され
た被験者の2.82％において認められた（表3）。総括すると、スクリーニングに
おいて試験された白人の7.5％は、変異型CYP3A4タンパク質についてヘテロ接合
体であった。
【０１０４】 CYP3A7については、スクリーニングされた染色体232個のうち17個で、エキソ
ン11におけるC1229G SNPが認められた。SNPは、CYP3A7タンパク質の位置409にお
ける非保存的アミノ酸置換（Thr→Arg）を生じる。
【０１０５】 実施例4：CYP3A7エキソン11 C1229G多型についての酵素試験 CYP3A7のエキソン11において検出されるC1229G多型は、Alwnl 制限酵素部位を
消失する（図5A）。本発明に従い、C1229G対立遺伝子の遺伝子型決定のため、Al
wnlに基づく試験法が開発された。実施例が図5Bにて示される。野生型試料（wt/
wt）からプライマー3A742Fおよび3A738R（表2）を用いて増幅した404 bpゲノム
断片の切断により、各々316 bpおよび88 bpの2つの断片を生じる。ヘテロ接合体
試料（wt/C1229G）において、DNAの約半分は、突然変異対立遺伝子における制限
酵素部位の消失により、切断されないままである。
【０１０６】 集団遺伝学は、定義された遺伝子のホモ接合体対立遺伝子対ヘテロ接合体対立
遺伝子の、予測される頻度の計測を可能にする（ハーディ・ワインベルグの式、 pe2 + 2pq + qe2 =1）ため、実験から得られる知見を用いて、ホモ接合体対立
遺伝子対ヘテロ接合体対立遺伝子の、（その式を用いて）予測される分布、およ
び偏差を確証することもまた可能である。これは、内部対照および、検出される
配列偏差が実際に新規の対立遺伝子を表すということの確証としての役割を担い
得る。
【０１０７】 実施例5：CYP3A4突然変異発現、精製およびウェスタンブロット法 突然変異は大腸菌TOPP3細胞において発現させた。各株の培養は、アンピシリ
ン（50μg/ml）およびテトラサイクリン（15μg/ml）を含む2mlのLB培地におけ
る単一コロニーから開始し、37℃にて一晩振とう培養した。より大きい、各試料
の20ml培養は、2ml培養に記述の通りに播種し、培養した。開始培養（15ml）を
、アンピシリン（50μg/ml）を含む250mlのTB培地に植付け、37℃、250rpmにて2
〜3時間培養した。δ-アミノレブリン酸（80mg/L）およびIPTG（1mM）を付加し
、培養は30℃、190rpmにて72時間培養した。細胞を収集し、超音波処理し、CHAP
Sに可溶化し、クロンテック（Clontech）社（Palo Alto, CA）のタロン（Talon
）金属アフィニティー樹脂上でタンパク質を精製した。最終のP450含有量を還元
CO差違スペクトル（Omura, J.Biol.Chem. 239(1964), 2370〜2378）によって測
定し、各タンパク質をクーマシーブルーによって染色した8.5％のSDS PAGEゲル
上で可視化した。3A4野生型およびM5の1pmol、およびM2およびM7の総タンパク質
試料の8μlを、8.5％のSDS PAGEゲル上で分離することにより、CYP3A4野生型、M
2、M5およびM7のウェスタンブロット法による分析を行った。その後試料をニト
ロセルロースに移行させ、CYP3A4と交差反応することが知られる抗3A12ポリクロ
ーナル抗体（Ciaccio, Arch Biochem Biophys 271(1989), 284〜99）で探索した
。
【０１０８】 実施例6：CYP3A4タンパク質変異の機能的特徴付け 細菌CYP3A4発現系を用い、タンパク質変異のCYP3A4の発現レベルおよび触媒活
性に対する影響を調べた。配列変異は、多くの白人において認められるものと一
致するCYP3A4タンパク質をコードするpSE3A4H発現ベクター（Harlow, J Biol Ch
em 272(1997), 5396〜402）に導入した。他の望ましくない突然変異は、CYP3A4
挿入または配列決定により確証されるようなその発現を促進するプロモーターに
導入されなかった。実施例5に記載の通り、突然変異M1〜M8は大腸菌において発
現させ、CYP3A4ホロ酵素の発現を還元CO相違スペクトルの測定により評価し、タ
ンパク質を精製した。M2、M5およびM7突然変異以外の全てはCYP3A4と同様なレベ
ルで検出可能であった。M5はCYP3A4の10％未満のレベルで発現され、複数回の測
定におけるP450測定の不一致により示されるように、ある程度の不安定性を示し
た。M2およびM7では、4回の試行の結果、検出可能なP450ホロタンパク質は認め
られなかった。実施例5に記載の通り、CYP3A4と交差反応をすることが知られる
抗CYP3A12ポリクローナル抗体（Ciaccio, Arch Biochem Biophys 271(1989), 28
4〜99）を用いたウェスタンブロット法により、M2、M5およびM7の発現をさらに
調べた。予測される大きさ（約54 kDA）のバンドをCYP3A4野生型およびM2突然変
異タンパク質を含むレーンにおいて可視化した（図7）。M7を含むレーンにおい
ては非常に薄いバンドのみが認められ、このバンドはバックグラウンドよりも有
意に濃くなかった。これらの結果は、M2およびM7突然変異はCYP3A4ホロ酵素の発
現を消失させる一方、M5はその発現を減少させることを示す。
【０１０９】 NADPH-チトクロームP450還元酵素およびチトクロームb5を用いた再構築に続き
、M1、M4、M5およびM6変異の触媒活性を、テストステロン、プロゲステロンおよ
び7-BFCを基質として用いて測定した（表5〜7）。突然変異M1およびM4は、CYP3A
4とは異なるステロイドヒドロキシラーゼ活性および7-BFCデベンジラーゼ活性を
示した（表5〜7）。ステロイドの低濃度においては、M4は野生型CYP3A4 の＜50
％のステロイドヒドロキシラーゼ活性を示し（表5および6）、および、＜50％の
CYP3A4 7-BFCデベンジラーゼ活性を示した（表7）。25μMのテストステロン濃度
において、M1は137％のCYP3A4 7-BFCデベンジラーゼ活性を示したが（表7）、CY
P3A4 テストステロンヒドロキシラーゼ活性は53％しか示さなかった（表5）。野
生型CYP3A4と比較した場合、M1突然変異およびM4突然変異のいずれも、そのステ
ロイドヒドロキシラーゼ代謝プロフィールにおいて変化を示さなかった。この知
見はM5の明らかに減少した安定性をある程度しか反映し得なかったが、M5突然変
異の活性は野生型タンパク質のおよそ半分であった（表5〜7）。一方、突然変異
M6は著しく変化したテストステロンヒドロキシラーゼ代謝プロフィールを示した
（表5）。
【０１１０】
【表１】 CYP3A4遺伝子およびCYP3A7のエキソン11（太字）のエキソン/イント
ロン境界を決定するために使用されたオリゴヌクレオチド
【０１１１】 50ngのゲノムDNAを、1×PCR緩衝液（Q=キアゲン社、 カタログ番号1005479ま
たはB2=ベーリンガー社（現ロシュ社）伸長テンプレート(Expand Long Template
)PCR緩衝液ナンバー2, カタログ番号1742655）、0.25μMの各オリゴヌクレオチ
ド（メタビオン（Metabion）社）、200μMのdNTP、および1UのTaqポリメラーゼ
（キアゲン社）を含む反応混合物（総量30または50μl）に加えた。ロボサイク
ラーグラジエント96（RoboCycler Gradient 96）（ストラタジーン（Stratagene
）社）において増幅を実施し、94℃で2分間の最初の変性段階を行い、続けて、
変性（40秒、94℃）、アニーリング（45秒、56〜60℃）、および伸長（60〜150
秒、72℃）の増幅サイクルを32サイクル行った。これに続き、72℃にて5分間の
最終伸長段階を行った。PCR断片およびBACクローンの配列決定は、製造者の使用
説明書に従い、ダイターミネーターDNAシークエンシングキット（パーキンエル
マー社、カタログ番号4303154）を用い、GeneAmp PCRシステム9700（パーキンエ
ルマー社）において実施した。
【０１１２】
【表２】 CYP3A4（エキソン1〜13）およびCYP3A7（エキソン11、太字）多型ス
クリーニング：オリゴヌクレオチド配列、増幅条件および断片サイズ a プライマー3A4-101Fおよび3A4-103Rは1231 bp断片の増幅のために使用される
；プライマー3A4-68Fおよび3A4-103Rは配列決定法のために使用される。b プライマー3A4-52Fおよび3A4-37Rは、58℃のアニーリング温度にて、結果的
に293 bpの断片を得る増幅のために組合わせて使用でき、プライマー3A4-52Fお
よび3A4-100Rは、63℃のアニーリング温度にて、結果的に304 bpの断片を得る増
幅のために組合わせて使用できる。
【０１１３】 50ngのゲノムDNAを、1×PCR緩衝液（キアゲン社）、0.5μMのオリゴヌクレオ
チド、200μMのdNTP、および1UのTaqポリメラーゼ（キアゲン社）を含む反応混
合物に加えた。ロボサイクラーグラジエント96（RoboCycler Gradient 96）（ス
トラタジーン社）において増幅を実施し、94℃で2分間の最初の変性段階を行い
、続けて変性（40秒、94℃）、アニーリング（45秒、上記にて与えられた温度）
、および伸長（60秒、72℃）の増幅サイクルを32サイクル行った。これに続き、
72℃にて5分間の最終伸長段階を行った。全ての配列決定反応は、製造者の使用
説明書に従い、ダイターミネーターDNAシークエンシングキット（パーキンエル
マー社、カタログ番号4303154）を用い、GeneAmp PCRシステム9700（パーキンエ
ルマー社）において実施した。
【０１１４】
【表３】 CYP3A4変異aの位置、配列および頻度 a CYP3A4遺伝子上の位置に従って一覧にされた変異b 参照配列ゲンバンクアクセッション番号AF280107。CYP3A4タンパク質の最初
のATGにおけるヌクレオチドAを1位とした。c スクリーニングされた染色体番号。
【０１１５】
【表４】 CYP3A4およびCYP3A7の遺伝子変異
【０１１６】
【表５】 野生型および突然変異型CYP3A4タンパク質のテストステロンヒドロキ
シラーゼ活性 a 単一の値は、一つの調製物のみで実施された試験から得られた複数の平均で
ある。b 2つの値は別々のタンパク質調製物を表す。各値は複数回実施された試験の平
均である。c M5の一つの調製物のみを精製した。
【０１１７】
【表６】 野生型および突然変異型CYP3A4タンパク質のプロゲステロンヒドロキ
シラーゼ活性
【０１１８】
【表７】 野生型および突然変異型CYP3A4タンパク質の7-ベンジロキシ-4-(トリ
フルオロメチル)クマリン(7-BFC) デベンジラーゼ活性 a 単一の値は、一つの調製物のみで実施された試験から得られた複数の平均で
ある。b 2つの値は別々のタンパク質調製物を表す。各値は複数回実施された試験の平
均である。c M5の一つの調製物のみを精製した。
【０１１９】 参考文献
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 遺伝子構成における差異は、薬物治療の有効性および安全性に影
響を与える。
【図２】 hPXRによるCYP3A4の最新の制御モデル。
【図３】 (Ａ) ハシモト（Hashimoto）、Eur Biochem 218(1993) 585〜95
による参考文献に記述され、本研究によって確証される、CYP3A4遺伝子の構造。
コード領域は黒い長方形として、非コード5'非翻訳領域は斜線を施した長方形と
して示される。矢先は遺伝子のコード領域のスクリーニングに使用されたオリゴ
ヌクレオチドの位置を表す（オリゴヌクレオチド配列については表2を参照のこ
と）。(B)エキソンに近接する配列の決定。両側矢印は、PCR法により増幅された
ゲノム領域を表す。片側矢印はBACクローンの直接配列決定法により得られた配
列を示す。(B)において示されるオリゴヌクレオチドの配列は、表1にて与えられ
る。
【図４】 CYP3A4遺伝子およびCYP3A7遺伝子における多型の例。CYP3A4のエ
キソン内の多型部位の番号付けは、ゲンバンク配列M14096に基づく。CYP3A7のエ
キソン内の多型部位の番号付けは、ゲンバンク配列gi4503232に基づく。
【図５】 CYP3A7エキソン11 C1229G（Thr409Arg）多型についての酵素試験
。(A) 突然変異は、オリゴヌクレオチド3A442Fおよび3A438R（矢先）を用いて増
幅されたエキソン11を含有する断片から、独自のAlwnl制限酵素部位を除去する
。(B) Alwnl制限酵素切断による、野生型（wt/wt）およびヘテロ接合体（wt/C12
29G）DNA試料の遺伝子型決定。
【図６】 CYP3A4遺伝子およびCYP3A7遺伝子における、ゲノム配列および多
型。増幅および配列決定法に使用されたプライマー（表1）、およびスプライス
部位には下線を引いてある。太下線は多型部位であり、矢印により分けられた、
野生型および変異塩基として示される。
【図７】 野生型CYP3A4(3A4)、R130Q(M2)、T363M(M5)、およびP416L(M7)の
免疫ブロット法。材料および方法に記載の通り、P450（1pmol）を各レーンに添
加し、ニトロセルロースに移行させ、抗3A12 IgGで探索した。
【手続補正書】
【提出日】平成１４年７月３１日（２００２．７．３１）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１９】 参考文献
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Epidauros Biotechnologie AG <120> Polymorphisms in the human CYP3A4 and CYP3A7 genes and their use in diagnostic and therapeutic applications <140> JP 2001-523796 <141> 2000-09-01 <150> EP 991 18 120.7 <151> 1999-09-10 <160> 172 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificial <400> 1 taatacgact cactataggg 20 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificial <400> 2 gaacccattc acatggac 18 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificial <400> 3 tgatcatgtc aggatctg 18 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificial <400> 4 ggtcaacagc ctgtgctg 18 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificial <400> 5 tccactggtg aaggttgg 18 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificial <400> 6 gtgccatctc tatagctg 18 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificial <400> 7 cttcccgcct cagatttc 18 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificial <400> 8 gaaatctgag gcgggaag 18 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificial <400> 9 gggtcttgtg gattgttg 18 <210> 10 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificial <400> 10 caacaatcca caagaccc 18 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificial <400> 11 gtgtatcttc gaggcgac 18 <210> 12 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificial <400> 12 ctttccattc 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<400> 19 ggtgccatcc cttgactc 18 <210> 20 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificial <400> 20 gcagaggtgt gggccctg 18 <210> 21 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificial <400> 21 ggagatcaag gaccacgctt gtg 23 <210> 22 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificial <400> 22 cttacgcttc tgccagtagc aacc 24 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificial <400> 23 aacaggcgtg gaaacacaat 20 <210> 24 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificial <400> 24 ctttcctgcc ctgcacag 18 <210> 25 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificial <400> 25 aactgcaggc agagcacagg t 21 <210> 26 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificial <400> 26 ccacgcccgg cctgaacatc t 21 <210> 27 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificial <400> 27 taggatccaa tcatctccta c 21 <210> 28 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificial <400> 28 ggtgtctcat ggtggagg 18 <210> 29 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificial <400> 29 agagttagca agagagccct t 21 <210> 30 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificial <400> 30 cctctaactg ccagcaagtc tg 22 <210> 31 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificial <400> 31 gcgctgagac tgtcctctgt g 21 <210> 32 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificial <400> 32 agtctggctt cctgggttgg gctc 24 <210> 33 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificial <400> 33 ggggacagga tgaagtggac g 21 <210> 34 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificial <400> 34 tacaaccatg gagacctcc 19 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificial <400> 35 tacctgtccc caccagattc 20 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificial <400> 36 ccctttccaa ggggtagtcc 20 <210> 37 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificial <400> 37 gtctggtcac tggaataacc caacagcagg 30 <210> 38 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificial <400> 38 gtctgtcttg actggacatg tgg 23 <210> 39 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificial <400> 39 gatgatggtc 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Artificial Sequence: artificial <400> 46 cagtatgagt tagtctctgg 20 <210> 47 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificial <400> 47 cataactgat gaccttcatc g 21 <210> 48 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificial <400> 48 cctgtgtact gctagtagag gg 22 <210> 49 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificial <400> 49 cacagatggg cctaattg 18 <210> 50 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificial <400> 50 ggagtgtctc actcactttg atgc 24 <210> 51 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificial <400> 51 tggatgaagc ccatcttc 18 <210> 52 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificial <400> 52 tcccagggct tttgt 15 <210> 53 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificial <400> 53 acaaaagccc tggga 15 <210> 54 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificial <400> 54 tcccaggact tttgt 15 <210> 55 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificial <400> 55 acaaaagtcc tggga 15 <210> 56 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificial <400> 56 tatctttctc tctt 14 <210> 57 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificial <400> 57 aagagagaaa gata 14 <210> 58 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificial <400> 58 tatcttgctc tctt 14 <210> 59 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificial <400> 59 aagagagcaa gata 14 <210> 60 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence 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Artificial Sequence: artificial <400> 67 ggtgataggc t 11 <210> 68 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificial <400> 68 tgaaagagta a 11 <210> 69 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificial <400> 69 ttactctttc a 11 <210> 70 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificial <400> 70 tgaaacagta a 11 <210> 71 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificial <400> 71 ttactgtttc a 11 <210> 72 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificial <400> 72 gcagccatgg g 11 <210> 73 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificial <400> 73 cccatggctg c 11 <210> 74 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificial 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Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificial <400> 89 tgagcgtttc a 11 <210> 90 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificial <400> 90 tgaaatgctc a 11 <210> 91 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificial <400> 91 tgagcatttc a 11 <210> 92 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificial <400> 92 gaaacgctca g 11 <210> 93 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificial <400> 93 ctgagcgttt c 11 <210> 94 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificial <400> 94 gaaacactca g 11 <210> 95 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificial <400> 95 ctgagtgttt c 11 <210> 96 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificial <400> 96 tgagacttga g 11 <210> 97 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificial <400> 97 ctcaagtctc a 11 <210> 98 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificial <400> 98 tgagatttga g 11 <210> 99 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificial <400> 99 ctcaaatctc a 11 <210> 100 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificial <400> 100 cctccctgaa a 11 <210> 101 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificial <400> 101 tttcagggag g 11 <210> 102 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificial <400> 102 cctccttgaa a 11 <210> 103 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificial <400> 103 tttcaaggag g 11 <210> 104 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificial <400> 104 caaggcccct g 11 <210> 105 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificial <400> 105 caggggcctt g 11 <210> 106 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificial <400> 106 caaggtccct g 11 <210> 107 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificial <400> 107 cagggacctt g 11 <210> 108 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificial <400> 108 accaacgtgg a 11 <210> 109 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificial <400> 109 tccacgttgg t 11 <210> 110 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificial <400> 110 accaatgtgg a 11 <210> 111 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificial <400> 111 tccacattgg t 11 <210> 112 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificial <400> 112 tggcatgagg t 11 <210> 113 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificial <400> 113 acctcatgcc a 11 <210> 114 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificial <400> 114 tggcacgagg t 11 <210> 115 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificial <400> 115 acctcgtgcc a 11 <210> 116 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificial <400> 116 ggcaccgtaa g 11 <210> 117 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificial <400> 117 cttacggtgc c 11 <210> 118 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificial <400> 118 ggcactgtaa g 11 <210> 119 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificial <400> 119 cttacagtgc c 11 <210> 120 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificial <400> 120 acttctgctt t 11 <210> 121 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificial <400> 121 aaagcagaag t 11 <210> 122 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificial <400> 122 acttcggctt t 11 <210> 123 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificial <400> 123 aaagccgaag t 11 <210> 124 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificial <400> 124 tactggacag agc 13 <210> 125 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificial <400> 125 gctctgtcca gta 13 <210> 126 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificial <400> 126 tactggagag agc 13 <210> 127 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificial <400> 127 gctctctcca gta 13 <210> 128 <211> 249 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> intron <222> (1)..(115) <220> <221> exon <222> (116)..(168) <220> <221> intron <222> (169)..(249) <220> <221> CDS <222> (116)..(166) <400> 128 cctctaactg ccagcaagtc tgatttcatt ggcttcgact gttttcaycc caattagagg 60 cagggttaag tacattaaaa ataataatca aatattattt tgtttctcct cccag grc 118 Xaa 1 ttt tgt atg ttt gac atg gaa tgt cat aaa aag tat gga aaa gtg tgg 166 Phe Cys Met Phe Asp Met Glu Cys His Lys Lys Tyr Gly Lys Val Trp 5 10 15 gggtgagtat tctggaaact tccattggat agacttgttt ctatgatgag tttaccccac 226 tgcacagagg acagtctcag ccc 249 <210> 129 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 129 Xaa Phe Cys Met Phe Asp Met Glu Cys His Lys Lys Tyr Gly Lys Val 1 5 10 15 Trp <210> 130 <211> 293 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> intron <222> (1)..(77) <220> <221> exon <222> (78)..(177) <220> <221> intron <222> (178)..(293) <220> <221> CDS <222> (79)..(177) <400> 130 agtctggctt cctgggttgg gctccagctg tagaataagg ctgttgatgt ttaatcaact 60 ctgttttttt cacacagc ttt tat gat ggt caa cag cct gtg ctg gct atc 111 Phe Tyr Asp Gly Gln Gln Pro Val Leu Ala Ile 1 5 10 aca gat cct gac atg atc aaa aca gtg cta gtg aaa gaa tgt tat tct 159 Thr Asp Pro Asp Met Ile Lys Thr Val Leu Val Lys Glu Cys Tyr Ser 15 20 25 gtc ttc aca aac cgg agg gtaagcattc atgtgttgaa attaaaatac 207 Val Phe Thr Asn Arg Arg 30 tgattgatta aatttatatt ttgaaattct tatatattca tagacagttg cctaaaaaat 267 gtccaggaag gttccacgtc cacttc 293 <210> 131 <211> 33 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 131 Phe Tyr Asp Gly Gln Gln Pro Val Leu Ala Ile Thr Asp Pro Asp Met 1 5 10 15 Ile Lys Thr Val Leu Val Lys Glu Cys Tyr Ser Val Phe Thr Asn Arg 20 25 30 Arg <210> 132 <211> 236 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> intron <222> (1)..(61) <220> <221> exon <222> (62)..(175) <220> <221> intron <222> (176)..(236) <220> <221> CDS <222> (62)..(175) <400> 132 ctacaaccat ggagacctcc acaactgatg taggacaaaa tgtttctgct ttgaactcta 60 g cct ttt ggt cca gtg gga ttt atg aaa agt gcc atc tct ata gct gag 109 Pro Phe Gly Pro Val Gly Phe Met Lys Ser Ala Ile Ser Ile Ala Glu 1 5 10 15 gat gaa gaa tgg aag aga tta cga tca ttg ctg tct cca acc ttc acc 157 Asp Glu Glu Trp Lys Arg Leu Arg Ser Leu Leu Ser Pro Thr Phe Thr 20 25 30 agt gga aaa ctc aag gag gtatgaaaat aacatgagtt ttaataagaa 205 Ser Gly Lys Leu Lys Glu 35 acttaaagaa tgaatctggt ggggacaggt a 236 <210> 133 <211> 38 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 133 Pro Phe Gly Pro Val Gly Phe Met Lys Ser Ala Ile Ser Ile Ala Glu 1 5 10 15 Asp Glu Glu Trp Lys Arg Leu Arg Ser Leu Leu Ser Pro Thr Phe Thr 20 25 30 Ser Gly Lys Leu Lys Glu 35 <210> 134 <211> 393 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> intron <222> (1)..(98) <220> <221> exon <222> (99)..(247) <220> <221> intron <222> (248)..(393) <220> <221> CDS <222> (100)..(246) <400> 134 gtctgtcttg actggacatg tggctttcct gatgcacgca tagaggaagg atggtaaaaa 60 ggtgctgatt ttaattttcc acatctttct ccactcagc gtc ttt ggg gcc tac 114 Val Phe Gly Ala Tyr 1 5 agc atg gat gtg atc act agc aca tca ttt gga gtg aac atc gac tct 162 Ser Met Asp Val Ile Thr Ser Thr Ser Phe Gly Val Asn Ile Asp Ser 10 15 20 ctc aac aat cca caa gac ccc ttt gtg gaa aac acc aag aag ctt tta 210 Leu Asn Asn Pro Gln Asp Pro Phe Val Glu Asn Thr Lys Lys Leu Leu 25 30 35 aga ttt gat ttt ttg gat cca ttc ttt ctc tca ata agtatgtgga 256 Arg Phe Asp Phe Leu Asp Pro Phe Phe Leu Ser Ile 40 45 ctactatttc cttttattta tcttkctctc ttaaaaataa ctgctttatt gagatataaa 316 tcaccatgta attcatccac ttaaaatata cagttcagtg atttgtagta catttgaaga 376 tatgtgtgac catcatc 393 <210> 135 <211> 49 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 135 Val Phe Gly Ala Tyr Ser Met Asp Val Ile Thr Ser Thr Ser Phe Gly 1 5 10 15 Val Asn Ile Asp Ser Leu Asn Asn Pro Gln Asp Pro Phe Val Glu Asn 20 25 30 Thr Lys Lys Leu Leu Arg Phe Asp Phe Leu Asp Pro Phe Phe Leu Ser 35 40 45 Ile <210> 136 <211> 240 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> intron <222> (1)..(82) <220> <221> exon <222> (83)..(149) <220> <221> intron <222> (150)..(240) <220> <221> CDS <222> (83)..(148) <400> 136 ggagatcaag gaccacgctt gtgatttact tctgacttca ggagccactt tctgtcagtg 60 aaatttctct ttttgcttct ag cac cga gtg gat ttc ctt cag ctg atg att 112 His Arg Val Asp Phe Leu Gln Leu Met Ile 1 5 10 gac tct cag aat tca aaa gaa act gag tcc cac aaa ggtaaccaga 158 Asp Ser Gln Asn Ser Lys Glu Thr Glu Ser His Lys 15 20 gtgtttctga gggctacttg tggggcactc agagggaagg ccttgttctg aaaatgtgca 218 ggaagtattc caggatgatg ag 240 <210> 137 <211> 22 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 137 His Arg Val Asp Phe Leu Gln Leu Met Ile Asp Ser Gln Asn Ser Lys 1 5 10 15 Glu Thr Glu Ser His Lys 20 <210> 138 <211> 399 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> intron <222> (1)..(111) <220> <221> exon <222> (112)..(338) <220> <221> intron <222> (339)..(399) <220> <221> CDS <222> (112)..(336) <400> 138 ccagtatgag ttgttctctg gaacttctaa cagttcaaca gtactacatg gactgagtta 60 aaagttaatt caaaaatctc aatttatcca aatctgtttc tttcttttca g gca cca 117 Ala Pro 1 ccc acc tat gat act gtg cta cag atg gag tat ctt gac atg gtg gtg 165 Pro Thr Tyr Asp Thr Val Leu Gln Met Glu Tyr Leu Asp Met Val Val 5 10 15 aat gaa acg ctc aga tta ttc cca att gct atg aga ctt gag agg gtc 213 Asn Glu Thr Leu Arg Leu Phe Pro Ile Ala Met Arg Leu Glu Arg Val 20 25 30 tgc aaa aaa gat gtt gag atc aat ggg atg ttc att ccc aaa ggg tgg 261 Cys Lys Lys Asp Val Glu Ile Asn Gly Met Phe Ile Pro Lys Gly Trp 35 40 45 50 gtg gtg atg att cca agc tat gct ctt cac cgt gac cca aag tac tgg 309 Val Val Met Ile Pro Ser Tyr Ala Leu His Arg Asp Pro Lys Tyr Trp 55 60 65 asa gag cct gag aag ttc ctc cct gaa aggtaggagg cccctgggaa 356 Xaa Glu Pro Glu Lys Phe Leu Pro Glu 70 75 gggagccctc cctgaaccag cctggttcaa gcatattctg cct 399 <210> 139 <211> 75 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 139 Ala Pro Pro Thr Tyr Asp Thr Val Leu Gln Met Glu Tyr Leu Asp Met 1 5 10 15 Val Val Asn Glu Thr Leu Arg Leu Phe Pro Ile Ala Met Arg Leu Glu 20 25 30 Arg Val Cys Lys Lys Asp Val Glu Ile Asn Gly Met Phe Ile Pro Lys 35 40 45 Gly Trp Val Val Met Ile Pro Ser Tyr Ala Leu His Arg Asp Pro Lys 50 55 60 Tyr Trp Xaa Glu Pro Glu Lys Phe Leu Pro Glu 65 70 75 <210> 140 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificial <400> 140 ccagtatgag ttgttctctg g 21 <210> 141 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificial <400> 141 aggcagaata tgcttgaacc aggc 24 <210> 142 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificial sequence <400> 142 gaagtggacg tggaaccttc ctggac 26 <210> 143 <211> 304 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 143 agtctggctt cctgggttgg gctccagctg tagaataagg ctgttgatgt ttaatcaact 60 ctgttttttt cacacagctt ttatgatggt caacagcctg tgctggctat cacagatcct 120 gacatgatca aaacagtgct agtgaaagaa tgttattctg tcttcacaaa ccggagggta 180 agcattcatg tgttgaaatt aaaatactga ttgattaaat ttatattttg aaattcttat 240 atattcatag acagttgcct aaaaaatgtc caggaaggtt ccacgtccac ttcatcctgt 300 cccc 304 <210> 144 <211> 236 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (62)..(175) <220> <221> intron <222> (1)..(61) <220> <221> intron <222> (176)..(236) <220> <221> exon <222> (62)..(175) <400> 144 ctacaaccat ggagacctcc acaactgatg taggacaaaa tgtttctgct ttgaactcta 60 g cct ttt ggt cca gtg gga ttt atg aaa agt gcc atc tct ata gct gag 109 Pro Phe Gly Pro Val Gly Phe Met Lys Ser Ala Ile Ser Ile Ala Glu 1 5 10 15 gat gaa gaa tgg aag aga tta caa tca ttg ctg tct cca acc ttc acc 157 Asp Glu Glu Trp Lys Arg Leu Gln Ser Leu Leu Ser Pro Thr Phe Thr 20 25 30 agt gga aaa ctc aag gag gtatgaaaat aacatgagtt ttaataagaa 205 Ser Gly Lys Leu Lys Glu 35 acttaaagaa tgaatctggt ggggacaggt a 236 <210> 145 <211> 38 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 145 Pro Phe Gly Pro Val Gly Phe Met Lys Ser Ala Ile Ser Ile Ala Glu 1 5 10 15 Asp Glu Glu Trp Lys Arg Leu Gln Ser Leu Leu Ser Pro Thr Phe Thr 20 25 30 Ser Gly Lys Leu Lys Glu 35 <210> 146 <211> 379 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (188)..(274) <400> 146 ccctttccaa ggggtagtcc actgaatttg agctgcctaa aaatggtctt ttatctttat 60 gtacagaaaa cacatcacaa aattcattat aaaatgtcac ttactgctcc atgctgggga 120 aagccatgtc cttctgggac tagagtctgc acatttaact atgggtggtg ttgtgttttg 180 tgcttag atg gtc cct atc att gcc cag tat gga gat gtg ttg gtg aga 229 Met Val Pro Ile Ile Ala Gln Tyr Gly Asp Val Leu Val Arg 1 5 10 aat ctg agg cgg gaa gca gag aca ggc aag cct atc acc ttg aaa 274 Asn Leu Arg Arg Glu Ala Glu Thr Gly Lys Pro Ile Thr Leu Lys 15 20 25 gagtaagtag aagcgcagcc atggggttct gagctgtcat gaacccctcc agctgcctgc 334 catggagctg atattcctgc tgttgggtta ttccagtgac cagac 379 <210> 147 <211> 29 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 147 Met Val Pro Ile Ile Ala Gln Tyr Gly Asp Val Leu Val Arg Asn Leu 1 5 10 15 Arg Arg Glu Ala Glu Thr Gly Lys Pro Ile Thr Leu Lys 20 25 <210> 148 <211> 379 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (188)..(274) <400> 148 ccctttccaa ggggtagtcc actgaatttg agctgcctaa aaatggtctt ttatctttat 60 gtacagaaaa cacatcacaa aattcattat aaaatgtcac ttactgctcc atgctgggga 120 aagccatgtc cttctgggac tagagtctgc acatttaact atgggtggtg ttgtgttttg 180 tgcttag atg gtc cct atc att gcc cag tat gga gat gtg ttg gtg aga 229 Met Val Pro Ile Ile Ala Gln Tyr Gly Asp Val Leu Val Arg 1 5 10 aat ctg agg cgg gaa gca gag aca ggc aag cct gtc acc ttg aaa 274 Asn Leu Arg Arg Glu Ala Glu Thr Gly Lys Pro Val Thr Leu Lys 15 20 25 cagtaagtag aagcgcagcc atggggttct gagctgtcat gaacccctcc agctgcctgc 334 catggagctg atattcctgc tgttgggtta ttccagtgac cagac 379 <210> 149 <211> 29 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 149 Met Val Pro Ile Ile Ala Gln Tyr Gly Asp Val Leu Val Arg Asn Leu 1 5 10 15 Arg Arg Glu Ala Glu Thr Gly Lys Pro Val Thr Leu Lys 20 25 <210> 150 <211> 379 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 150 ccctttccaa ggggtagtcc actgaatttg agctgcctaa aaatggtctt ttatctttat 60 gtacagaaaa cacatcacaa aattcattat aaaatgtcac ttactgctcc atgctgggga 120 aagccatgtc cttctgggac tagagtctgc acatttaact atgggtggtg ttgtgttttg 180 tgcttagatg gtccctatca ttgcccagta tggagatgtg ttggtgagaa atctgaggcg 240 ggaagcagag acaggcaagc ctgtcacctt gaaagagtaa gtagaagcgc agctatgggg 300 ttctgagctg tcatgaaccc ctccagctgc ctgccatgga gctgatattc ctgctgttgg 360 gttattccag tgaccagac 379 <210> 151 <211> 379 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 151 ccctttccaa ggggtagtcc actgaatttg agctgcctaa aaatggtctt ttatctttat 60 gtacagaaaa cacatcacaa aattcattat aaaatgtcac ttactgctcc atgctgggga 120 aagccatgtc cttctgggac tagagtctgc acatttaact atgggtggtg ttgtgttttg 180 tgcttagatg gtccctatca ttgcccagta tggagatgtg ttggtgagaa atctgaggcg 240 ggaagcagag acaggcaagc ctgtcacctt gaaagagtaa gtagaagcgc agccatgggt 300 ttctgagctg tcatgaaccc ctccagctgc ctgccatgga gctgatattc ctgctgttgg 360 gttattccag tgaccagac 379 <210> 152 <211> 379 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 152 ccctttccaa ggggtagtcc actgaatttg agctgcctaa aaatggtctt ttatctttat 60 gtacagaaaa cacatcacaa aattcattat aaaatgtcac ttactgctcc atgctgggga 120 aagccatgtc cttctgggac tagagtctgc acatttaact atgggtggtg ttgtgttttg 180 tgcttagatg gtccctatca ttgcccagta tggagatgtg ttggtgagaa atctgaggcg 240 ggaagcagag acaggcaagc ctgtcacctt gaaagagtaa gtagaagcgc agccatgggg 300 ttctgagctg tcatgaaccc ctccagcggc ctgccatgga gctgatattc ctgctgttgg 360 gttattccag tgaccagac 379 <210> 153 <211> 431 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 153 cccagtgtac ctctgaattg cttttctatt cttttccctt agggatttga gggcttcact 60 tagatttctc ttcatctaaa ctgtgatgcc ctacattgat ctgatttacc taaaatgtct 120 ttcctctcct ttcagctctg tccgatctgg agctcgtggc ccaatcaatt atctttattt 180 ttgctggcta tgaaaccacg agcagtgttc tctccttcat tatgtatgaa ctggccactc 240 accctgatgt ccagcagaaa ctgcaggagg aaattgatgc agttttaccc aataaggtga 300 gtggatgata catggagaag gagggaggag gtgaaacctt agcaaaaatg cctcctcacc 360 acttcccagg agaattttta taaaaagcat aatcactgat tctttcactg actctatgta 420 ggaaggctct g 431 <210> 154 <211> 574 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (110)..(334) <400> 154 cagtatgagt tagtctctgg agctcctaat acttcattag tactgcatgg actgagttaa 60 aagttaattc aaaatctcaa tttatccaaa tctgtttcgt tctttccag gca cca ccc 118 Ala Pro Pro 1 acc tat gat act gtg cta cag atg gag tat ctt gac atg gtg gtg aat 166 Thr Tyr Asp Thr Val Leu Gln Met Glu Tyr Leu Asp Met Val Val Asn 5 10 15 gaa atg ctc aga tta ttc cca att gct atg aga ctt gag agg gtc tgc 214 Glu Met Leu Arg Leu Phe Pro Ile Ala Met Arg Leu Glu Arg Val Cys 20 25 30 35 aaa aaa gat gtt gag atc aat ggg atg ttc att ccc aaa ggg gtg gtg 262 Lys Lys Asp Val Glu Ile Asn Gly Met Phe Ile Pro Lys Gly Val Val 40 45 50 gtg atg att cca agc tat gct ctt cac cgt gac cca aag tac tgg aca 310 Val Met Ile Pro Ser Tyr Ala Leu His Arg Asp Pro Lys Tyr Trp Thr 55 60 65 gag cct gag aag ttc ctc cct gaa aggtacaagg cccctgggaa gggagccctc 364 Glu Pro Glu Lys Phe Leu Pro Glu 70 75 cctgaaccag cctggttcaa gcatattctg cctctcttaa tctacaggac agtcatgtgg 424 ttgtataatt atttgcttgt atttttatat ttagagattt ttttaatcat caaattgatt 484 attgtcacac tttacaaacc atagactaga aaaaagaaaa ctacagtcat ccacaattcc 544 aacaacttac gatgaaggtc atcagttatg 574 <210> 155 <211> 75 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 155 Ala Pro Pro Thr Tyr Asp Thr Val Leu Gln Met Glu Tyr Leu Asp Met 1 5 10 15 Val Val Asn Glu Met Leu Arg Leu Phe Pro Ile Ala Met Arg Leu Glu 20 25 30 Arg Val Cys Lys Lys Asp Val Glu Ile Asn Gly Met Phe Ile Pro Lys 35 40 45 Gly Val Val Val Met Ile Pro Ser Tyr Ala Leu His Arg Asp Pro Lys 50 55 60 Tyr Trp Thr Glu Pro Glu Lys Phe Leu Pro Glu 65 70 75 <210> 156 <211> 574 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 156 cagtatgagt tagtctctgg agctcctaat acttcattag tactgcatgg actgagttaa 60 aagttaattc aaaatctcaa tttatccaaa tctgtttcgt tctttccagg caccacccac 120 ctatgatact gtgctacaga tggagtatct tgacatggtg gtgaatgaaa cactcagatt 180 attcccaatt gctatgagac ttgagagggt ctgcaaaaaa gatgttgaga tcaatgggat 240 gttcattccc aaaggggtgg tggtgatgat tccaagctat gctcttcacc gtgacccaaa 300 gtactggaca gagcctgaga agttcctccc tgaaaggtac aaggcccctg ggaagggagc 360 cctccctgaa ccagcctggt tcaagcatat tctgcctctc ttaatctaca ggacagtcat 420 gtggttgtat aattatttgc ttgtattttt atatttagag atttttttaa tcatcaaatt 480 gattattgtc acactttaca aaccatagac tagaaaaaag aaaactacag tcatccacaa 540 ttccaacaac ttacgatgaa ggtcatcagt tatg 574 <210> 157 <211> 574 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (110)..(334) <400> 157 cagtatgagt tagtctctgg agctcctaat acttcattag tactgcatgg actgagttaa 60 aagttaattc aaaatctcaa tttatccaaa tctgtttcgt tctttccag gca cca ccc 118 Ala Pro Pro 1 acc tat gat act gtg cta cag atg gag tat ctt gac atg gtg gtg aat 166 Thr Tyr Asp Thr Val Leu Gln Met Glu Tyr Leu Asp Met Val Val Asn 5 10 15 gaa acg ctc aga tta ttc cca att gct atg aga ttt gag agg gtc tgc 214 Glu Thr Leu Arg Leu Phe Pro Ile Ala Met Arg Phe Glu Arg Val Cys 20 25 30 35 aaa aaa gat gtt gag atc aat ggg atg ttc att ccc aaa ggg gtg gtg 262 Lys Lys Asp Val Glu Ile Asn Gly Met Phe Ile Pro Lys Gly Val Val 40 45 50 gtg atg att cca agc tat gct ctt cac cgt gac cca aag tac tgg aca 310 Val Met Ile Pro Ser Tyr Ala Leu His Arg Asp Pro Lys Tyr Trp Thr 55 60 65 gag cct gag aag ttc ctc cct gaa aggtacaagg cccctgggaa gggagccctc 364 Glu Pro Glu Lys Phe Leu Pro Glu 70 75 cctgaaccag cctggttcaa gcatattctg cctctcttaa tctacaggac agtcatgtgg 424 ttgtataatt atttgcttgt atttttatat ttagagattt ttttaatcat caaattgatt 484 attgtcacac tttacaaacc atagactaga aaaaagaaaa ctacagtcat ccacaattcc 544 aacaacttac gatgaaggtc atcagttatg 574 <210> 158 <211> 75 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 158 Ala Pro Pro Thr Tyr Asp Thr Val Leu Gln Met Glu Tyr Leu Asp Met 1 5 10 15 Val Val Asn Glu Thr Leu Arg Leu Phe Pro Ile Ala Met Arg Phe Glu 20 25 30 Arg Val Cys Lys Lys Asp Val Glu Ile Asn Gly Met Phe Ile Pro Lys 35 40 45 Gly Val Val Val Met Ile Pro Ser Tyr Ala Leu His Arg Asp Pro Lys 50 55 60 Tyr Trp Thr Glu Pro Glu Lys Phe Leu Pro Glu 65 70 75 <210> 159 <211> 574 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (110)..(334) <400> 159 cagtatgagt tagtctctgg agctcctaat acttcattag tactgcatgg actgagttaa 60 aagttaattc aaaatctcaa tttatccaaa tctgtttcgt tctttccag gca cca ccc 118 Ala Pro Pro 1 acc tat gat act gtg cta cag atg gag tat ctt gac atg gtg gtg aat 166 Thr Tyr Asp Thr Val Leu Gln Met Glu Tyr Leu Asp Met Val Val Asn 5 10 15 gaa acg ctc aga tta ttc cca att gct atg aga ctt gag agg gtc tgc 214 Glu Thr Leu Arg Leu Phe Pro Ile Ala Met Arg Leu Glu Arg Val Cys 20 25 30 35 aaa aaa gat gtt gag atc aat ggg atg ttc att ccc aaa ggg gtg gtg 262 Lys Lys Asp Val Glu Ile Asn Gly Met Phe Ile Pro Lys Gly Val Val 40 45 50 gtg atg att cca agc tat gct ctt cac cgt gac cca aag tac tgg aca 310 Val Met Ile Pro Ser Tyr Ala Leu His Arg Asp Pro Lys Tyr Trp Thr 55 60 65 gag cct gag aag ttc ctc ctt gaa aggtacaagg cccctgggaa gggagccctc 364 Glu Pro Glu Lys Phe Leu Leu Glu 70 75 cctgaaccag cctggttcaa gcatattctg cctctcttaa tctacaggac agtcatgtgg 424 ttgtataatt atttgcttgt atttttatat ttagagattt ttttaatcat caaattgatt 484 attgtcacac tttacaaacc atagactaga aaaaagaaaa ctacagtcat ccacaattcc 544 aacaacttac gatgaaggtc atcagttatg 574 <210> 160 <211> 75 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 160 Ala Pro Pro Thr Tyr Asp Thr Val Leu Gln Met Glu Tyr Leu Asp Met 1 5 10 15 Val Val Asn Glu Thr Leu Arg Leu Phe Pro Ile Ala Met Arg Leu Glu 20 25 30 Arg Val Cys Lys Lys Asp Val Glu Ile Asn Gly Met Phe Ile Pro Lys 35 40 45 Gly Val Val Val Met Ile Pro Ser Tyr Ala Leu His Arg Asp Pro Lys 50 55 60 Tyr Trp Thr Glu Pro Glu Lys Phe Leu Leu Glu 65 70 75 <210> 161 <211> 574 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 161 cagtatgagt tagtctctgg agctcctaat acttcattag tactgcatgg actgagttaa 60 aagttaattc aaaatctcaa tttatccaaa tctgtttcgt tctttccagg caccacccac 120 ctatgatact gtgctacaga tggagtatct tgacatggtg gtgaatgaaa cgctcagatt 180 attcccaatt gctatgagac ttgagagggt ctgcaaaaaa gatgttgaga tcaatgggat 240 gttcattccc aaaggggtgg tggtgatgat tccaagctat gctcttcacc gtgacccaaa 300 gtactggaca gagcctgaga agttcctccc tgaaaggtac aaggtccctg ggaagggagc 360 cctccctgaa ccagcctggt tcaagcatat tctgcctctc ttaatctaca ggacagtcat 420 gtggttgtat aattatttgc ttgtattttt atatttagag atttttttaa tcatcaaatt 480 gattattgtc acactttaca aaccatagac tagaaaaaag aaaactacag tcatccacaa 540 ttccaacaac ttacgatgaa ggtcatcagt tatg 574 <210> 162 <211> 411 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 162 cctgtgtact actagttgag gggtggcccc taagtaagaa accctaacat gtaactctta 60 ggggtattat gtcattaact ttttaaaaat ctaccaatgt ggaaccagat tcagcaagaa 120 gaacaaggac aacatagatc cttacatata cacacccttt ggaagtggac ccagaaactg 180 cattggcatg aggtttgctc tcatgaacat gaaacttgct ctaatcagag tccttcagaa 240 cttctccttc aaaccttgta aagaaacaca ggttagtcaa ttttctataa aaataatgtt 300 gtattaataa ttcttttaac tgagtggtct gtatttttta aaaagaatat gcttgtttaa 360 tcttttacta atttgttctc tgggccaaag aatcaattag gcccatctgt g 411 <210> 163 <211> 288 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 163 ggagtgtctc actcactttg atgctatact ttctactttt gtttatttaa tgcttctcaa 60 tatgcttgtt taactgttgc agatccccct gaaattaagc ttaggaggac ttcttcaacc 120 agaaaaaccc gttgttctaa aggttgagtc aagggatggc actgtaagtg gagcctgaat 180 tttcctaagg acttctgctt tgctcttcaa gaaatctgtg cctgagaaca ccagagacct 240 caaattactt tgtgaataga actctgaaat gaagatgggc ttcatcca 288 <210> 164 <211> 288 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 164 ggagtgtctc actcactttg atgctatact ttctactttt gtttatttaa tgcttctcaa 60 tatgcttgtt taactgttgc agatccccct gaaattaagc ttaggaggac ttcttcaacc 120 agaaaaaccc gttgttctaa aggttgagtc aagggatggc accgtaagtg gagcctgaat 180 tttcctaagg acttcggctt tgctcttcaa gaaatctgtg cctgagaaca ccagagacct 240 caaattactt tgtgaataga actctgaaat gaagatgggc ttcatcca 288 <210> 165 <211> 236 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> r=g or a <400> 165 ctacaaccat ggagacctcc acaactgatg taggacaaaa tgtttctgct ttgaactcta 60 gccttttggt ccagtgggat ttatgaaaag tgccatctct atagctgagg atgaagaatg 120 gaagagatta cratcattgc tgtctccaac cttcaccagt ggaaaactca aggaggtatg 180 aaaataacat gagttttaat aagaaactta aagaatgaat ctggtgggga caggta 236 <210> 166 <211> 379 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> r=g or a, y=t or c, s=g or c, k=g or t <400> 166 ccctttccaa ggggtagtcc actgaatttg agctgcctaa aaatggtctt ttatctttat 60 gtacagaaaa cacatcacaa aattcattat aaaatgtcac ttactgctcc atgctgggga 120 aagccatgtc cttctgggac tagagtctgc acatttaact atgggtggtg ttgtgttttg 180 tgcttagatg gtccctatca ttgcccagta tggagatgtg ttggtgagaa atctgaggcg 240 ggaagcagag acaggcaagc ctrtcacctt gaaasagtaa gtagaagcgc agcyatgggk 300 ttctgagctg tcatgaaccc ctccagckgc ctgccatgga gctgatattc ctgctgttgg 360 gttattccag tgaccagac 379 <210> 167 <211> 431 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> r=g or a <400> 167 cccagtgtac ctctgaattg cttttctatt cttttccctt agggatttga gggcttcact 60 tagatttctc ttcatctaaa ctgtgatgcc ctacattgat ctgatttacc taaaatgtct 120 ttcctctcct ttcagctctg tccgatctgg agctcgtggc ccaatcaatt atctttattt 180 ttgctggcta tgaaaccacg agcagtgttc tctccttcat tatgtatgaa ctggccactc 240 accctgatgt ccagcagaaa ctgcaggagg aaattgatgc agttttaccc aataaggtga 300 gtggatgrta catggagaag gagggaggag gtgaaacctt agcaaaaatg cctcctcacc 360 acttcccagg agaattttta taaaaagcat aatcactgat tctttcactg actctatgta 420 ggaaggctct g 431 <210> 168 <211> 574 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> y=t or c, r=g or a <400> 168 cagtatgagt tagtctctgg agctcctaat acttcattag tactgcatgg actgagttaa 60 aagttaattc aaaatctcaa tttatccaaa tctgtttcgt tctttccagg caccacccac 120 ctatgatact gtgctacaga tggagtatct tgacatggtg gtgaatgaaa yrctcagatt 180 attcccaatt gctatgagay ttgagagggt ctgcaaaaaa gatgttgaga tcaatgggat 240 gttcattccc aaaggggtgg tggtgatgat tccaagctat gctcttcacc gtgacccaaa 300 gtactggaca gagcctgaga agttcctccy tgaaaggtac aaggyccctg ggaagggagc 360 cctccctgaa ccagcctggt tcaagcatat tctgcctctc ttaatctaca ggacagtcat 420 gtggttgtat aattatttgc ttgtattttt atatttagag atttttttaa tcatcaaatt 480 gattattgtc acactttaca aaccatagac tagaaaaaag aaaactacag tcatccacaa 540 ttccaacaac ttacgatgaa ggtcatcagt tatg 574 <210> 169 <211> 411 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> y=t or c <400> 169 cctgtgtact actagttgag gggtggcccc taagtaagaa accctaacat gtaactctta 60 ggggtattat gtcattaact ttttaaaaat ctaccaaygt ggaaccagat tcagcaagaa 120 gaacaaggac aacatagatc cttacatata cacacccttt ggaagtggac ccagaaactg 180 cattggcatg aggtttgctc tcatgaacat gaaacttgct ctaatcagag tccttcagaa 240 cttctccttc aaaccttgta aagaaacaca ggttagtcaa ttttctataa aaataatgtt 300 gtattaataa ttcttttaac tgagtggtct gtatttttta aaaagaatat gcttgtttaa 360 tcttttacta atttgttctc tgggccaaag aatcaattag gcccatctgt g 411 <210> 170 <211> 288 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> y=t or c, k=g or t <400> 170 ggagtgtctc actcactttg atgctatact ttctactttt gtttatttaa tgcttctcaa 60 tatgcttgtt taactgttgc agatccccct gaaattaagc ttaggaggac ttcttcaacc 120 agaaaaaccc gttgttctaa aggttgagtc aagggatggc acygtaagtg gagcctgaat 180 tttcctaagg acttckgctt tgctcttcaa gaaatctgtg cctgagaaca ccagagacct 240 caaattactt tgtgaataga actctgaaat gaagatgggc ttcatcca 288 <210> 171 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(30) <400> 171 cct gtc acc ttg aaa cac gtc ttt ggg gcc 30 Pro Val Thr Leu Lys His Val Phe Gly Ala 1 5 10 <210> 172 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 172 Pro Val Thr Leu Lys His Val Phe Gly Ala 1 5 10
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 48/00 Ａ６１Ｐ 35/00 ４Ｃ０８４ Ａ６１Ｐ 35/00 43/00 １１１ ４Ｃ０８６ 43/00 １１１ Ｃ０７Ｋ 16/40 ４Ｃ０８７ Ｃ０７Ｋ 16/40 Ｃ１２Ｎ 1/15 ４Ｈ０４５ Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 9/02 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 9/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/68 33/50 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/53 Ｄ 33/50 Ｍ 33/53 33/566 33/574 Ａ 33/566 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/574 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 2G045 AA25 AA40 BA11 BB50 CB01 DA12 DA13 DA14 DA36 FB02 FB03 4B024 AA01 AA11 AA12 BA08 CA04 CA06 CA09 DA02 DA05 DA06 DA11 DA12 EA04 GA11 HA12 HA15 HA17 4B050 CC03 CC04 DD07 LL01 LL03 4B063 QA17 QA19 QA20 QQ08 QQ44 QR08 QR32 QR42 QR56 QS25 QS34 QX02 4B065 AA01X AA57X AA72X AA90X AA93Y AB01 BA02 CA28 CA44 CA46 4C084 AA02 AA03 AA07 AA13 AA17 BA44 CA62 MA13 MA17 MA21 MA34 MA52 MA59 MA63 MA66 NA14 ZB262 ZC412 4C086 AA01 AA02 AA03 EA16 MA01 MA04 MA13 MA17 MA22 MA23 MA28 MA34 MA52 MA59 MA63 MA66 NA14 ZB26 ZC41 4C087 AA01 AA02 BC83 CA09 CA12 CA20 MA13 MA17 MA22 MA23 MA28 MA34 MA52 MA59 MA63 MA66 NA14 ZB26 ZC41 4H045 AA11 CA40 CA42 DA75 EA28 EA51 FA72

Claims (43)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 以下からなる群より選択されるポリヌクレオチド： (a)配列番号： に記載の核酸配列をもつポリヌクレオチド； (b)配列番号：129、135、139、145、147、155、158、160または172の任意の一つ
    のアミノ酸配列をもつポリペプチド； (c)CYP3A4遺伝子（アクセッション番号：AF280107、CYP3A4タンパク質をコード
    する最初のATGにおけるヌクレオチドAを1位とする）の6004位、13908位、14292
    位、14304位、14323位、14329位、14357位、15753位、20230位、21867位、21868
    位、21896位、22026位、22041位、23081位、23172位、25925位または25958位の
    いずれか一つに対応する位置、またはCYP3A7遺伝子（アクセッション番号：gi45
    03232）の1229位に対応する位置で、ヌクレオチド置換、ヌクレオチド欠失、付
    加的なヌクレオチドまたは、付加的なヌクレオチドおよびヌクレオチド置換をも
    つポリペプチドであって、23172位に対応する位置におけるヌクレオチド欠失がM
    からTへのアミノ酸置換を生じないように、またはTからCへのヌクレオチド置換
    でないような、CYP3A4ポリペプチドまたはCYP3A7ポリペプチドをコードするポリ
    ヌクレオチド； (d)CYP3A4ポリペプチドまたはCYP3A7ポリペプチドをコードするポリヌクレオチ
    ドであって、CYP3A4遺伝子（アクセッション番号：AF280107、CYP3A4タンパク質
    をコードする最初のATGにおけるヌクレオチドAを1位とする）の6004位、13908位
    、14292位、20230位、または21868位のいずれか一つに対応する位置に一つのAを
    もち、CYP3A4遺伝子（アクセッション番号：AF280107、CYP3A4タンパク質をコー
    ドする最初のATGにおけるヌクレオチドAを1位とする）の14323位、14329位、218
    67位、21896位、22026位、22041位、23081位または25925位のいずれか一つに対
    応する位置に一つのTをもち、CYP3A4遺伝子（アクセッション番号：AF280107、C
    YP3A4タンパク質をコードする最初のATGにおけるヌクレオチドAを1位とする）の
    14357位、15753位、または25958位のいずれか一つに対応する位置に一つのGをも
    ち、CYP3A4遺伝子（アクセッション番号：AF280107、CYP3A4タンパク質をコード
    する最初のATGにおけるヌクレオチドAを1位とする）の14304位のいずれか一つに
    対応する位置に一つのCをもち、またはCYP3A7遺伝子（アクセッション番号：gi4
    503232）の1229位に対応する位置に一つのGをもつポリヌクレオチド； (e)CYP3A4ポリペプチド（アクセッション番号：AF280107）の56位、130位、170
    位、174位、363位、373位、416位または445位のいずれか一つにおけるアミノ酸
    置換を含み、445位に対応する位置における置換がMからTへのものではないCYP3A
    4ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；および (f)CYP3A4ポリペプチド（アクセッション番号：AF280107）の56位におけるGから
    Dへの、130位におけるRからQへの、170位におけるVからIへの、174位におけるD
    からHへの、363位におけるTからMへの、373位におけるLからFへの、もしくは416
    位におけるPからLへのアミノ酸置換、またはCYP3A7ポリペプチド（アクセッショ
    ン番号：gi4503232）の409位におけるTからRへの、アミノ酸置換を含む、CYP3A4
    ポリペプチドまたはCYP3A7ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
  2. 【請求項２】 ポリヌクレオチドが変異型CYP3A4タンパク質もしくは変異型
    CYP3A7タンパク質またはその断片をコードする、請求項1記載のポリヌクレオチ
    ド。
  3. 【請求項３】 ヌクレオチドの欠失、付加および/または置換により、対応
    する野生型遺伝子と比較して、変異型CYP3A4遺伝子または変異型CYP3A7遺伝子の
    発現が変化する、請求項1または2記載のポリヌクレオチド。
  4. 【請求項４】 請求項1から3のいずれか一項記載のポリヌクレオチドを含む
    ベクター。
  5. 【請求項５】 ポリヌクレオチドが、原核細胞または真核細胞で発現を誘導
    する発現制御配列に機能的に連結される、請求項4記載のベクター。
  6. 【請求項６】 請求項1から3のいずれか一項記載のポリヌクレオチド、また
    は請求項4もしくは5記載のベクターを用いて、遺伝子に操作された宿主細胞。
  7. 【請求項７】 以下の段階を含む、分子変異型CYP3A4タンパク質もしくは分
    子変異型CYP3A7タンパク質、またはその断片を生産する方法： (a)請求項6記載の宿主細胞を培養する段階；および (b)該タンパク質または断片を培養物から回収する段階。
  8. 【請求項８】 請求項1から3のいずれか一項記載のポリヌクレオチド、また
    は請求項4もしくは5記載のベクターを用いて細胞を遺伝子操作する段階を含む、
    分子変異型CYP3A4遺伝子または分子変異型CYP3A7遺伝子を発現することが可能な
    細胞を生産する方法。
  9. 【請求項９】 請求項1から3のいずれか一項記載のポリヌクレオチドにコー
    ドされる、または請求項7記載の方法により得られる、または請求項8記載の方法
    により生産される細胞から得られる、CYP3A4タンパク質もしくはCYP3A7タンパク
    質、またはその断片。
  10. 【請求項１０】 請求項9記載のタンパク質に特異的に結合する抗体。
  11. 【請求項１１】 請求項1から3のいずれか1項において定義されるような、
    一つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含むエピトープを特異的に認識する、請求
    項10記載の抗体。
  12. 【請求項１２】 請求項1から3のいずれか一つのポリヌクレオチドに相補的
    な核酸分子。
  13. 【請求項１３】 請求項1から3のいずれか一つのポリヌクレオチドを特異的
    に認識および切断することが可能な核酸分子。
  14. 【請求項１４】 請求項12または13記載の核酸分子を含むベクター。
  15. 【請求項１５】 請求項1から3のいずれか一項記載の少なくとも一つのポリ
    ヌクレオチド、または請求項4もしくは5記載のベクターを含む、トランスジェニ
    ック非ヒト動物。
  16. 【請求項１６】 少なくとも一つの、CYP3A4遺伝子またはCYP3A7遺伝子の不
    活性化された野生型対立遺伝子をさらに含む、請求項15記載のトランスジェニッ
    ク非ヒト動物。
  17. 【請求項１７】 マウスまたはラットである、請求項15もしくは16記載のト
    ランスジェニック非ヒト動物。
  18. 【請求項１８】 以下の段階を含む、CYP3A4遺伝子もしくはCYP3A7遺伝子ま
    たはその遺伝子産物の分子変異の活性を調節することが可能な、CYP3A4阻害剤ま
    たはCYP3A7阻害剤を同定および獲得する方法： (a)請求項9記載のタンパク質、または請求項1から3のいずれか一項記載のポリヌ
    クレオチドを含む分子変異型CYP3A4遺伝子もしくは分子変異型CYP3A7遺伝子を発
    現する細胞を、薬物代謝に応答して検出可能なシグナルを提供することが可能な
    成分の存在下において、CYP3A4またはCYP3A7を介する薬物代謝をさせるような条
    件下で、スクリーニングされる化合物と接触させる段階、および (b)推定上の阻害剤を示唆する、シグナルの存在もしくは不在、または薬物代謝
    によって生じるシグナルの増加を検出する段階。
  19. 【請求項１９】 細胞が、請求項8記載の方法によって得られる、または請
    求項15から17のいずれか一項記載のトランスジェニック非ヒト動物に含まれる、
    請求項6記載の細胞である、請求項18記載の方法。
  20. 【請求項２０】 以下の段階を含む、CYP3A4遺伝子もしくはCYP3A7遺伝子ま
    たはその遺伝子産物の分子変異の活性を調節することが可能な、CYP3A4阻害剤ま
    たはCYP3A7阻害剤を同定および獲得する方法： (a)CYP3A4タンパク質またはCYP3A7タンパク質と結合し、該タンパク質と第一分
    子の第一の複合体が形成されることが知られている第一の分子と、請求項9記載
    のタンパク質とを接触させる段階； (b)該第一の複合体とスクリーニングされる化合物とを接触させる段階；および
    (c)該化合物が、該第一の分子を該第一の複合体から置換するかどうかを測定す
    る段階。
  21. 【請求項２１】 測定段階が、タンパク質および化合物の第二の複合体の形
    成を測定する段階を含む、請求項20記載の方法。
  22. 【請求項２２】 測定段階が、タンパク質に結合しない第一の分子の量を測
    定する段階を含む、請求項20または21記載の方法。
  23. 【請求項２３】 第一の分子がニフェジピン、リファンピシン、またはコル
    チコステロンである、請求項20から22のいずれか一項記載の方法。
  24. 【請求項２４】 第一の分子が標識される、請求項20から23のいずれか一項
    記載の方法。
  25. 【請求項２５】 以下の段階を含む、CYP3A4遺伝子もしくはCYP3A7遺伝子の
    分子変異の存在に関連する障害、またはそのような障害への感受性を診断する方
    法： (a)被験者からの試料における請求項1から3のいずれか一項記載のポリヌクレオ
    チドの存在を決定する段階；および/または (b)請求項9記載のタンパク質の存在を決定する段階。
  26. 【請求項２６】 障害が癌である、請求項25記載の方法。
  27. 【請求項２７】 PCR法、リガーゼ連鎖反応法、制限酵素切断法、直接配列
    決定法、核酸増幅技術、ハイブリダイゼーション技術または免疫学的検定法を含
    む、請求項25または26記載の方法。
  28. 【請求項２８】 障害をなくすまたは軽減するため、被験者に薬物を投与す
    る段階をさらに含む、請求項25から27のいずれか一項記載の方法。
  29. 【請求項２９】 (i)機能的および発現可能な野生型CYP3A4遺伝子もしくは
    野生型CYP3A7遺伝子、または (ii)請求項12もしくは13記載の核酸分子、または請求項14記載のベクターを細胞
    に導入する段階をさらに含む、請求項25から28のいずれか一項記載の方法。
  30. 【請求項３０】 請求項18から24のいずれか一項記載の方法の段階および以
    下の段階を含む薬学的組成物を生産する方法： (c)段階(b)において同定および獲得される化合物もしくはその誘導体を、薬学的
    に許容される形態に合成および/または製剤化する段階。
  31. 【請求項３１】 薬物またはプロドラッグを治療的適用に適した形態に製剤
    化する段階、および請求項25または26記載の方法において診断された被験者の障
    害を予防または改善する段階を含む、薬学的組成物を調製する方法。
  32. 【請求項３２】 化合物の薬物またはプロドラッグが、請求項28において定
    義されるような薬物の誘導体である、請求項30または31記載の方法。
  33. 【請求項３３】 請求項18から24のいずれか一項記載の方法により同定され
    る、または獲得が可能な阻害剤。
  34. 【請求項３４】 請求項9記載のタンパク質に特異的に結合する請求項33記
    載の阻害剤。
  35. 【請求項３５】 請求項1から3のいずれか一項記載のポリヌクレオチドの検
    出のための、および/または、個々のCYP3A4対立遺伝子またはCYP3A7対立遺伝子
    の遺伝子型決定のための、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの使用。
  36. 【請求項３６】 ポリヌクレオチドが請求項1から3のいずれか一項記載のポ
    リヌクレオチド、または請求項12もしくは13記載の核酸分子である、請求項35記
    載の使用。
  37. 【請求項３７】 オリゴヌクレオチドが約15〜50ヌクレオチド長であり、配
    列番号：1〜127、140もしくは141のいずれか一つのヌクレオチド配列、または相
    補的配列を含む、請求項35記載の使用。
  38. 【請求項３８】 請求項37において定義されるようなオリゴヌクレオチドを
    含むプライマーまたはプローブ。
  39. 【請求項３９】 請求項9記載のタンパク質、請求項1から3のいずれか一項
    記載のポリヌクレオチドを含む分子変異型CYP3A4遺伝子または分子変異型CYP3A7
    遺伝子の発現を検出するための、および/または、請求項1から3のいずれか一項
    記載のポリヌクレオチドを含むCYP3A4対立遺伝子を識別するための、CYP3A4遺伝
    子またはCYP3A7遺伝子の遺伝子産物に特異的に結合することが可能な抗体または
    物質の使用。
  40. 【請求項４０】 請求項1から3のいずれか一項記載のポリヌクレオチドを含
    む組成物、請求項4もしくは5記載のベクター、請求項6記載の宿主細胞もしくは
    請求項8記載の方法により得られる宿主細胞、請求項9記載のタンパク質、請求項
    10または11記載の抗体、請求項12または13記載の核酸分子、請求項14記載のベク
    ター、請求項33記載の阻害剤、または請求項38記載のプライマーもしくはプロー
    ブ。
  41. 【請求項４１】 診断用組成物または薬学的組成物である、請求項40記載の
    組成物。
  42. 【請求項４２】 請求項1から3のいずれか一項記載のポリヌクレオチドをゲ
    ノム内に含む被験者の障害を治療または予防するための、薬学的組成物の調製の
    ための、有効用量の薬物またはプロドラッグの使用。
  43. 【請求項４３】 障害が癌である、請求項42記載の使用。
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