JP2003506038A - インビボの宿主腫瘍細胞相互作用の分子的基礎を研究するための誘導可能癌モデル - Google Patents

インビボの宿主腫瘍細胞相互作用の分子的基礎を研究するための誘導可能癌モデル

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Abstract

(57)【要約】 癌遺伝子をコードする核酸が誘導可能プロモーターに機能的に連結されている発現構築物がゲノムに組み込まれている非ヒト哺乳動物であり、哺乳動物は、癌に対する感受性の増加を引き起こす遺伝子突然変異をさらに有する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】発明の背景 進行した悪性腫瘍は、癌遺伝子及び腫瘍抑制因子の機能及び制御に影響を与え
る連続的な遺伝子損傷の表現型の終点である1。確立された腫瘍は、血管形成及
び免疫隔離（sequestration）のような過程を導く、複雑な、ほとんど理解され
ていない宿主-腫瘍相互作用により維持される。腫瘍形成に伴う多数の多様な遺
伝子改変は、実験的な癌促進突然変異が、腫瘍の維持にも関連しているか否かと
いう疑問を提起する。
【０００２】発明の概要 新規なドキシサイクリン誘導可能H-RASV12GINK4aヌルマウス黒色腫モデルにお
いて、黒色腫の発生及び維持が、H-RASV12G発現に厳密に依存していることが示
された。ドキシサイクリンの撤去及びH-RASV12Gのダウンレギュレーションは、
原発腫瘍及び移植腫瘍の臨床的及び組織学的な退行を引き起こした。退行の第一
段階においては、腫瘍細胞及び宿主由来内皮細胞における劇的なアポトーシス活
性化が顕著であった。VEGFの制御は、インビトロにおいてRAS依存性であること
が見出されたが、内因的及び強制的な持続的VEGF発現は腫瘍生存を継続させるこ
とができなかったことから、インビボにおいては、活性化型RASの腫瘍維持作用
が、VEGF遺伝子発現の制御よりも大きいことが示された。これらのデータは、総
合的に、H-RASV12Gが、固形腫瘍の形成及び維持の両方において決定的な役割を
果たしていることの遺伝学的な証拠を提供する。
【０００３】 従って、本発明は、誘導可能プロモーターに機能的に連結された癌遺伝子をコ
ードする核酸を含む発現構築物がゲノムに組み込まれており、かつ突然変異を有
しない哺乳動物よりも癌に対するより大きな感受性を付与する遺伝子突然変異を
さらに有する、非ヒト哺乳動物を特徴とする。
【０００４】 好ましい態様において、哺乳動物はマウスであり、癌遺伝子はrasであり、ras
遺伝子は活性化型の突然変異を有し、誘導可能プロモーターはドキシサイクリン
により誘導されうるものであり、突然変異はINK4のような腫瘍抑制因子をコード
するDNAに存在する。
【０００５】 第二の関連する局面において、本発明は、（i）リバーステトラサイクリント
ランスアクチベーターが組織特異的プロモーターに機能的に連結されている第一
の発現構築物と、（ii）癌遺伝子をコードする核酸が、リバーステトラサイクリ
ントランスアクチベーターにより制御されうるプロモーターに機能的に連結され
ている第二の発現構築物とがゲノムに組み込まれており、かつ突然変異を有しな
い哺乳動物よりも癌に対するより大きな感受性を付与する遺伝子突然変異をさら
に有する非ヒト哺乳動物を特徴とする。本発明のこの局面の好ましい態様におい
て、組織特異的プロモーターはチロシンプロモーターであり、癌遺伝子の発現は
、突然変異を有するが癌遺伝子は発現していない哺乳動物よりも癌に対するより
大きな感受性を哺乳動物に付与する。
【０００６】 第三の関連する局面において、本発明は、（i）リバーステトラサイクリント
ランスアクチベーターがチロシナーゼプロモーターに機能的に連結されている第
一の発現構築物と、（ii）rasをコードする核酸が、リバーステトラサイクリン
トランスアクチベーターにより制御されうるプロモーターに機能的に連結されて
いる第二の発現構築物とがゲノムに組み込まれている非ヒト哺乳動物を特徴とす
る。
【０００７】 本発明は、任意の癌、特に黒色腫のような固形腫瘍のモデルとして使用されう
る。誘導可能プロモーターと連結された癌遺伝子及び／又は哺乳動物のゲノム内
の突然変異は、所望の腫瘍型の発症を誘導するように選択される。
【０００８】発明の詳細な説明 優性作用する癌タンパク質が、インビボにおいて体細胞的に制御されている癌
モデルを開発するため、チロシナーゼ遺伝子プロモーター-エンハンサー因子の
調節下のリバーステトラサイクリントランスアクチベーター2を保有するトラン
スジェニックマウス系統（Tyr-rtTAとする）、及び多量体化tet-オペロン2,3を
含有する最小プロモーターにより駆動されるH-RASV12Gオープンリーディングフ
レームを含有するもの（tet-RASとする）を、INK4a+/-マウスと交雑させ、ホモ
接合的にINK4aヌルの単一及び二重のトランスジェニックマウス（Tyr/Tet-RASと
する）の同齢集団を生成させた。離乳後に、単一及び二重のトランスジェニック
INK4a-/-マウスのサブセットに、ドキシサイクリンを含む飲料水を投与した4。
ドキシサイクリン処理群においては、Tyr/Tet-RAS INK4a-/-マウス40匹中10匹が
、平均潜伏期60日で、黒色腫を発症した（図1A）。対照的に、未処理のTyr/Tet-
RAS INK4a-/-マウス（n＝12）又は処理されたTet-RAS INK4a-/-マウス（n＝23）
は、黒色腫を発症しなかった。Tyr/Tet-RAS INK4a-/-黒色腫はいずれも、構成性
Tyr-RAS INK4a-/-黒色腫5の巨視的な特徴を全て有しており、ヒトにおける結節
型黒色腫を暗示する特徴である、メラニン欠乏性の、浸潤性の、高度に血管性の
腫瘍として出現した（例えば、図2A＆B参照）。組織学的検査により、未分化の
多型性の細胞学を有する紡錘型の形態学（図2C）、腫瘍及び腫瘍由来培養細胞系
における、初期メラノサイト特異的マーカーであるチロシナーゼ関連タンパク質
-1（tyrosinase-related protein-1/TRP-1）6に対する強い免疫反応性、並びにH
-RASV12Gの強い発現及び活性（図1B及び図4A）が明らかとなった。
【０００９】 これら及び以前の結果5,7は、黒色腫発症における原因としてのH-RASV12Gの役
割を確証するものであるが、これらの黒色腫においてはH-RASV12G活性を制御す
ることができたため、活性化型RASが腫瘍維持において役割を果たしているとす
れば、それがどのような役割であるかを決定するための先例のない機会が得られ
た。この目的のため、直径0.5〜1.5cmのサイズ範囲の1個又は複数個の独立した
原発黒色腫を保有する、異なるドキシサイクリン処理Tyr/Tet-RAS INK4a-/-マウ
スにおいて、ドキシサイクリン投与を撤去した（図2A及び2B）。初期の腫瘍紅斑
の消失（図2B、bをaと比較せよ）に続き、これらの大きな腫瘍はほぼ又は完全に
検出不可能な量へと退行し、ドキシサイクリン撤去14日目までには、顕微鏡検査
において散在した腫瘍巣が残存するのみとなった（図2C、右パネルを左と比較せ
よ）。残存している顕微鏡的な疾患の存在と一致して、ドキシサイクリンの再投
与により、以前の腫瘍の部位に、急速に腫瘍が再発した（図2A）。従って、この
モデルは、最小の残存疾患に対する抗腫瘍薬の開発において有用であるかもしれ
ない。全ての原発黒色腫（n＝10）が、ドキシサイクリン撤去により退行を示し
たが、ドキシサイクリン非依存的な腫瘍が、特に腫瘍負荷量が大きい場合には、
持続又は再出現しうる（n＝3）（図2の説明を参照のこと）。これらの後者の腫
瘍は、白色であり、未分化の紡錘形の細胞学を比較的示しておらず、ウェスタン
ブロット分析によるとH-RASV12Gトランスジーンを発現しておらず、かつTRP-1陰
性であった（データは示していない）。これらのデータは、これらのドキシサイ
クリン非依存的な腫瘍が、繊維肉腫のような異なる型の癌又はRAS非依存性黒色
腫のいずれかであることを示唆している。
【００１０】 これらの結果及び他の研究者らの結果からは、腫瘍形成におけるRASの役割が
強く示唆されるが、この新規なモデル系によれば、インビボにおける腫瘍退行の
メカニズムを検討することが可能である。この目的のため、本発明者らは、細胞
培養物中の異なるTyr/Tet-RAS INK4a-/-腫瘍由来細胞系におけるドキシサイクリ
ン撤去の影響を調査した。ドキシサイクリン補足培地中で原発腫瘍由来の黒色腫
細胞系を確立したところ、それらは、ドキシサイクリン依存的にH-RASV12GのmRN
A、タンパク質、及び活性を発現していることが示された（図4A、データは示し
ていない）。派生黒色腫細胞系は、SCIDマウスにおける腫瘍形成能に関する厳密
なドキシサイクリン依存性により示されるように、ドキシサイクリン応答性を維
持していた。特に、精製されたTyr/Tet-RAS INK4a-/-黒色腫細胞系の皮下注射は
、100％の効率でドキシサイクリン処理されたSCIDマウスにおいて腫瘍を生じさ
せたが、ドキシサイクリンを受容していないマウスは多くの月数の観察の後も腫
瘍フリーのままであった（図3A）。細胞培養物において、ドキシサイクリンの存
在又は非存在は、複数の独立に由来する系のコンフルエント未満の増殖速度には
有意に影響しなかった（図3B）。同様に、ドキシサイクリンの存在は、低血清条
件（0.5％及び1％ FCS）においては増殖能を増強しなかった（データは示してい
ない）。しかしながら、ドキシサイクリンの存在は、濃密な培養物中では増殖を
適度に増強し、このことから、インビボにおいては、RASが腫瘍増殖にとって有
利な継続的な細胞自律性を提供しているのかもしれないことが示唆される。他方
、データは、ドキシサイクリン撤去後の腫瘍退行が、腫瘍の増殖及び維持にとっ
て必須の非細胞自律性の腫瘍-宿主相互作用の促進及び継続における継続的なRAS
の必要性を反映している可能性とも一致する。
【００１１】 後者の可能性を支持する1つの仮説は、継続的なRASの発現が、腫瘍細胞に、宿
主免疫応答を回避する能力を与え9、従って宿主による免疫拒絶の開始により腫
瘍退行が起こるというものである。完全免疫系の腫瘍退行への寄与を検査するた
め、本発明者らは、SCID腫瘍移植片において、精製されたTyr/Tet-RAS INK4a-/-
黒色腫細胞系に由来する腫瘍の退行動力学を決定した。ドキシサイクリン撤去後
、確立された腫瘍は、急速な腫瘍サイズ減少を示し、それには、免疫能を有する
宿主における原発腫瘍のそれと区別不可能な組織学、増殖、及びアポトーシスの
プロファイルが伴っていた（データは示していない）。SCIDマウスは、機能性の
B及びTリンパ球を欠いているため（ただし、機能的なナチュラルキラー細胞及び
マクロファージは維持している）、これらのデータは、免疫系が、腫瘍負荷量の
大部分が排除される初期において、主要な役割を果たしていないという見解と一
致している。
【００１２】 腫瘍の宿主相互作用への依存のもう1つの重要な局面は、血管形成の維持を含
む。実際、退行する腫瘍の検査は、血管の退行が、明らかな腫瘍消失にさえ先行
しうることを示唆した。ドキシサイクリン撤去後、0時間目、24時間目、48時間
目、及び72時間目に、同一の原発Tyr/Tet-RAS INK4a-/-腫瘍について連続で生体
組織検査を実施した。両方のTet-RAS発端系統＃65及び＃72に由来する腫瘍保有
マウス（例えば、それぞれ系統＃65及び＃72に由来するR348及びR405）を検査し
たところ、同一の表現型が得られた。顕微鏡検査において、重度の未分化の細胞
構築から、より組織化された紡錘形の細胞構築への形態学的な転換が、ドキシサ
イクリン撤去の48時間後までに起こった（図2Cに示されたR348腫瘍）。増殖指数
の穏和な減少及びアポトーシスの劇的な増加（図2Dに示されたR405腫瘍）が、こ
れらの組織学的変化に伴っていた。検査された多くの原発腫瘍において、ドキシ
サイクリン撤去の24時間後に早くもアポトーシス応答が認められた（データは示
していない）。最も顕著なこととして、多くのTUNEL陽性細胞が、小さい腫瘍血
管、特に血管壁を構成する細胞と極めて近接して存在することが見出された（図
2D）。血管関連アポトーシスは、内皮細胞の2つの古典的マーカーである10,11、
CD34及びCD31の免疫反応性の顕著な減少と同時に起こった（図2D、CD31について
は示していない）。
【００１３】 腫瘍血管を裏打ちしている細胞の有意のアポトーシス速度は、安定な腫瘍脈管
構造を継続させる決定的な宿主-腫瘍相利共生相互作用に、活性化型RASの発現の
継続が必要であるのかもしれないことを示唆している。これと一致して、以前の
細胞培養物データにより、癌形成性のK-及びH-RASV12Gが、VEGF遺伝子発現を刺
激しうることが示されている12-14。RAS依存性腫瘍維持においてVEGFが役割を果
たしているとすれば、その役割を決定するため、RAF-GSTプルダウン（pull-down
）アッセイにより測定されるようなRAS活性、及びVEGFタンパク質レベル（方法
参照）を、ドキシサイクリン撤去後、細胞培養物及び腫瘍移植片において連続的
に決定した。細胞培養物においては、H-RASV12G活性レベルの減少は、VEGF発現
のダウンレギュレーションと相関していた（図4A＆B）。腫瘍移植片においては
、RAS活性の減少は、腫瘍退行の後期における最終的なVEGFレベルの減少をもた
らしたが（3日後；図4A及び4B）、初期の退行及び内皮細胞アポトーシスが、VEG
Fレベルが継続しているにも関わらず起こった。これは、おそらくは低酸素／無
酸素刺激のためである15-18。対照的なVEGF動力学から、インビボにおける腫瘍
退行が、RASにより刺激されるVEGF発現の消失により媒介されるのではないこと
、及び高いVEGFレベルは、H-RASV12G発現の非存在下で、腫瘍生存を維持するの
に不十分であることが示唆された。この事象をより直接的に検査するため、ドキ
シサイクリン応答性R545黒色腫細胞系を、GFP（緑色蛍光タンパク質）又はVEGF
＋GFPのいずれかを構成性発現するよう操作した。VEGF形質導入細胞系は、ドキ
シサイクリン非存在下で、GFP形質導入対照よりも、平均して10倍高いレベルのV
EGFを発現した（ELISAにより、10ng/ml対＜1ng/ml）。VEGF形質導入細胞系は、
より急速な腫瘍増殖を示したが、ドキシサイクリン撤去により、高レベルの強制
的なVEGF発現にもかかわらず、これらの腫瘍は退行した（図4C）。さらに、原発
腫瘍及び親非形質導入黒色腫系由来SCID腫瘍の場合と同様に、この腫瘍退行は、
腫瘍細胞及び宿主内皮細胞両方における顕著なアポトーシス活性化と関連してい
た（図4D）。
【００１４】 総合すると、これらのデータは、活性化されたRASは、以前報告されたように
、腫瘍細胞におけるVEGF遺伝子発現を制御するが13,19-21、複雑なほとんど理解
されていないRAS非依存性メカニズムが、ドキシサイクリン撤去による、確立さ
れた腫瘍におけるVEGF制御に有意に寄与している、ということを証明している。
相応じて、内因性、又はレトロウイルスによる強制的な、強いVEGF発現にも関わ
らず、腫瘍退行及び関連する血管虚脱の開始が起こるという事実は、以前の所見 14 と一致して、VEGFが腫瘍維持にとって充分ではないこと、及び腫瘍維持におけ
る活性化型RASの役割が、VEGF遺伝子発現の制御よりも大きいことを示している
。従って、本発明において報告されたインビボモデルは、完全に形成された固形
腫瘍の維持にとって必須の宿主と腫瘍細胞との間の複雑なホモタイプ（homotypi
c）及びヘテロタイプ（heterotypic）な相互作用のさらなる局面を解明するため
に有益であろう。そのような相互作用の理解の改善は、可塑性の低い宿主細胞コ
ンパートメントに対する治療薬の開発を刺激するかもしれず、これらの腫瘍にお
ける多くの遺伝学的変化の発生にも関わらず、有効な抗RAS治療薬が抗癌器具に
おいて非常に有望であると予測されるであろうことは注目に値する。
【００１５】 方法 トランスジェニックマウスの作製 リバーステトラサイクリントランスアクチベーター（rtTA）は、pUHD172-1neo 2 から単離された1050bpのEcoRI/BamHI断片である。Tetプロモーターは、tetオペ
レーター配列2と連結されたCMV最小プロモーターのXhoI/EcoRI断片を含有する。
チロシナーゼエンハンサー／プロモーター及びH-RASVal12トランスジーンは、他
に記載されているようなものであった3,5,22。予想された頻度で、両トランスジ
ーンについて、複数の発端系統が生成した。1つのアクチベーター系統（Tyr/rtT
A、＃37）及び2つの独立のレポーター系統（Tet-RAS、＃65及び＃72）をこれら
の研究に利用した。
【００１６】 原発腫瘍、派生細胞系、及びSCID移植腫瘍 トランスジェニックマウスにドキシサイクリン飲料水（2mg/mlショ糖水）を与
え、自発的腫瘍発症について観察した。滅菌されたカミソリの刃を用いた機械的
破砕及び簡単なトリプシン処理により原発腫瘍を培養物へと順応させ、10％血清
を含有しドキシサイクリン（2μg/ml培地）が補足されているRPMI培地上で維持
した4。SCID移植腫瘍については、2〜5×106個の確立された黒色腫細胞を、ドキ
シサイクリン飲料水又は通常の飲料水で維持された成体SCIDマウスの側腹に皮下
注射した。これらの細胞系は、最初の宿主からの免疫細胞の排除が保証されるよ
う充分に継代した。
【００１７】 RNA及びタンパク質の分析 Trizol試薬（Gibco BRL）を使用して、腫瘍組織及び細胞から全RNAを単離した
。H-RASV12Gについては、pBABE-RAS（Scott Loweより譲り受けた）から単離され
た700bpのSalI cDNA断片をプローブとして使用した。VEGFについては、600bpのS
acI/Kpn1 ORF断片を、mVEGF.KS（P.Maisonpierreより譲り受けた）から単離した
。RNAインサイチューハイブリダイゼーションは、OCT（Lab-Tek）において急速
凍結させた腫瘍試料に対して、他23に記載されたようにして実施した。腫瘍又は
細胞の溶解物（100μlのインプット）のウェスタンブロットを、15％SDS-PAGEゲ
ル上で泳動させ、抗RAS MAB（Oncogene）を用いて検索した。RAS活性は、製造業
者のプロトコルに従い、RAS Activation Assay（Upstate Biotechnology）によ
り決定した。VEGFタンパク質レベルは、100mgというタンパク質インプット（組
織溶解物又は条件培地由来）を使用して、ELISA（R＆D System）によりデュプリ
ケートで決定した。マイクロプレートは、OPTIMax回転可能（turnable）マイク
ロプレートリーダー（Molecular Devices）により準備し、SoftMax Pro.を用い
て分析した。
【００１８】 組織学的分析及び免疫組織化学 組織試料をホルマリン固定しパラフィン包埋した。TA99モノクローナル抗体6
を使用した抗TRP1染色、TUNEL染色、Ki67染色、及び抗CD34染色は、他に記載の
ようにして実施した5,11,24,25。
【００１９】 増殖曲線 各細胞系由来の細胞を、ドキシサイクリンを含む、又は含まない培地中で、12
穴プレートに1ウェル当たり20,000細胞の密度で播いた。培地は、全ての試料に
ついて3日毎に交換した。デュプリケートのウェルをトリプシン処理し、示され
た時点で血球計数器により細胞数を計数し、時間に対してプロットした。研究は
、10％、1％、及び0.5％の血清を含有する培地中で実施した。実験前にドキシサ
イクリンで維持された細胞、及び既に3日間ドキシサイクリンを除去した細胞に
おいて、増殖曲線の決定を実施した。
【００２０】 強制的にVEGFを発現している黒色腫細胞系 R545黒色腫細胞系を、LZRSpBMN-IRES-GFP及びLZRSpBMN-VEGF-IRES-GFPで形質
導入し、FACSソーティング26により精製された集団を確立した。形質導入細胞系
を用いたSCID移植実験は、前記と同一の条件下で実施された。腫瘍サイズを腫瘍
の2次元の内径で測定し、面積を時間（日）に対してプロットした。
【００２１】 謝辞 チロシナーゼプロモーターエンハンサー因子についてはGunther Schutz博士に
、組織試料加工及び免疫組織化学についてはSocorro Jiaoに、RNAインサイチュ
ーハイブリダイゼーションについてはDebra Comptonに感謝する。ATは、MHMI Me
dical Student Fellowである。LCは、NIH Mentored Clinician Scientist Award
及びthe Harvard Skin Disease Center Grantにより支持された。CCC及びRADは
、NIHからのグラントにより支持された。RADは、American Cancer Society Rese
arch Professorである。
【００２２】 引用文献
【図面の簡単な説明】
【図１】 INK4a欠損バックグラウンドの誘導可能Tyr/Tet-RASトランスジェ
ニックマウスは、皮膚黒色腫を発症した。 A．Tyr/Tet-RAS-INK4aヌルコロニーにおける腫瘍発生率、及びドキシサイクリン
処理の影響の要約。 B.左：原発皮膚黒色腫の抗TRP1染色。完全な表皮が重なっている皮膚結節におけ
る強い免疫反応性に注意されたい。e＝表皮；d＝真皮。右：原発黒色腫結節にお
けるH-RASV12G転写物に関するインサイチューハイブリダイゼーション。
【図２Ａから図２Ｄ】 活性化型RASの発現は、インビボにおける確立され
た皮膚黒色腫の増殖を維持するために必要である。 A.R348（Tet-RAS発起系統＃65）由来の腫瘍を間隔を置いて測定し、最も長い寸
法を時間に対してプロットした。0時点は、ドキシサイクリンによる最初の誘導
を表す。赤の括弧は、動物がドキシサイクリン誘導を受けていた期間を示す。青
色の線は、ドキシサイクリンを投与していなかった期間を示す。挿入写真：最初
のドキシサイクリン処理サイクル中のそれぞれの時点（オン及び12日間オフ）に
おいて採取されたR348腫瘍の代表的な写真。全ての原発黒色腫（n＝10）が、ド
キシサイクリン撤去後に強い退行応答を示したが、最大の腫瘍のうち2つは、徐
々に増殖する不確定型の腫瘍として、その部位に再発した（本文参照）。2つの
完全に退行した腫瘍を保持するマウスは、再誘導され大きな腫瘍を形成した。そ
のうちの1つは、ドキシサイクリン撤去により完全に退行したが（図中に図示さ
れている）、もう1つの腫瘍の増殖は屠殺までさらに10日間安定なままであった
。 B.R767における原発黒色腫の退行。(a)＝オン、（b）＝3日間オフ、及び（c）＝
10日間オフ。 C.Aにおいて測定され図示されたR348における腫瘍の１つのH＆E切片の顕微鏡写
真。上パネル200×、下パネル400×倍率。ON＝ドキシサイクリンオン中に生体組
織検査された腫瘍の組織学。未分化の多型性の大きな細胞に注目されたい。48時
間オフ＝ドキシサイクリン撤去の48時間後に生体組織検査された腫瘍の組織学。
より規則的な紡錘形の形態学に注目されたい。12日間オフ＝ドキシサイクリン撤
去の12日後に腫瘍を生体組織検査した部位の組織学。完全な表皮及び分散した形
質転換細胞巣（矢印）に注目されたい。＊は毛包をさす；e＝表皮。 D. ドキシサイクリンオン中（左）及び72時間オフ中（中央）の、マウスR405（T
et-RAS発起系統＃72）由来の腫瘍のTUNEL（上パネル）染色の顕微鏡写真。中央
における囲まれた領域の拡大写真（右）。矢印＝内皮細胞におけるTUNEL陽性。
中央パネルは、S期核の検出のためのKi67免疫染色を示す。下パネルは、同組織
の抗CD34染色パターンを図示している。
【図３】 ドキシサイクリンの存在下及び非存在下における黒色腫細胞のイ
ンビトロ及びインビボにおける挙動 A. R192細胞の皮下注射後、（a）ドキシサイクリンオン及び（b）ドキシサイク
リンオフで維持されたSCIDマウスの顕微鏡写真。複数の独立に由来する黒色腫細
胞系を用いて実施された同様の実験が表に要約されている。「期間」とは、マウ
スの観察期間（月）をさす。 B. 培地中へドキシサイクリンを補足した場合、及び補足しない場合の3つの独立
に由来する黒色腫細胞系の増殖曲線の決定（方法参照）。実線：ドキシサイクリ
ン処理。点線：ドキシサイクリン未処理。培養物は最初の5日間コンフルエント
未満であったことに注意されたい。
【図４Ａから図４Ｄ】 VEGFは、ドキシサイクリン撤去後に腫瘍生存を継続
させるために十分でない。 A. インビボ及びインビトロにおけるドキシサイクリン撤去後のRAS活性レベル。
ドキシサイクリン撤去後の示された時点において、RAS活性のレベルを決定する
ため、培養R545黒色腫細胞又はR545由来SCID腫瘍を、Raf-GSTプルダウンアッセ
イ（方法参照）に供した。インビボアッセイにおいては、0時点を除き、2つの独
立に由来する試料をアッセイした。 B.培養されたR545細胞及びR673細胞（左）、並びにSCID由来R545腫瘍（右）の内
因性VEGFタンパク質レベル。 C.R545黒色腫細胞における強制的なVEGF発現は、ドキシサイクリン撤去後、SCID
マウスにおける腫瘍退行を遮断するために充分でない。-11日目に形質導入細胞
を注射し、0日目に飲料水からドキシサイクリンを撤去した。 D.CのSCID腫瘍のH＆E染色及びTUNEL染色の顕微鏡写真。VEGF形質導入腫瘍におけ
る大きなエクタクティック（ectactic）な血管腔に注意されたい。TUNEL陽性核
（腫瘍細胞及び内皮細胞の両方）の数の増加が、強制的にVEGFを発現している腫
瘍、又は発現していない腫瘍において、ドキシサイクリン撤去の48時間後及び72
時間後の両方で認められた。矢印：血管腔を裏打ちしているTUNEL陽性内皮細胞
。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA12 BA36 CA04 CA09 DA02 FA02 FA06 HA14 HA17 4B065 AA91X AB01 BB37 CA44

Claims (11)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 突然変異を含まない哺乳動物よりも癌に対するより大きな感
    受性を哺乳動物に引き起こす遺伝子突然変異をマウスがさらに含む、誘導可能プ
    ロモーターに機能的に連結された癌遺伝子をコードする核酸を含む発現構築物が
    ゲノムに組み込まれている非ヒト哺乳動物。
  2. 【請求項２】 マウスである、請求項1記載の哺乳動物。
  3. 【請求項３】 癌遺伝子がrasである、請求項1記載の哺乳動物。
  4. 【請求項４】 rasが活性化型の突然変異を有する、請求項3記載の哺乳動物
    。
  5. 【請求項５】 誘導可能プロモーターがドキシサイクリンにより誘導されう
    る、請求項1記載の哺乳動物。
  6. 【請求項６】 突然変異が腫瘍抑制因子をコードするDNAに存在する、請求
    項1記載の哺乳動物。
  7. 【請求項７】 腫瘍抑制因子がINK4である、請求項6記載の哺乳動物。
  8. 【請求項８】 突然変異を含まない哺乳動物よりも癌に対するより大きな感
    受性を該哺乳動物にもたらす遺伝子突然変異をさらに含む、（i）組織特異的プ
    ロモーターに機能的に連結されたリバーステトラサイクリントランスアクチベー
    ターを含む第一の発現構築物及び、（ii）該リバーステトラサイクリントランス
    アクチベーターにより制御されうるプロモーターに機能的に連結された癌遺伝子
    をコードする核酸を含む第二の発現構築物とがゲノムに組み込まれている非ヒト
    哺乳動物。
  9. 【請求項９】 組織特異的プロモーターがチロシナーゼプロモーターである
    、請求項8記載の哺乳動物。
  10. 【請求項１０】 癌遺伝子の発現が、突然変異を含むが癌遺伝子を発現して
    いない哺乳動物よりも癌に対するより大きな感受性を該哺乳動物にもたらす、請
    求項8記載の哺乳動物。
  11. 【請求項１１】 （i）チロシナーゼプロモーターに機能的に連結されたリ
    バーステトラサイクリントランスアクチベーターを含む第一の発現構築物及び、
    （ii）該リバーステトラサイクリントランスアクチベーターにより制御されうる
    プロモーターに機能的に連結されたrasをコードする核酸を含む第二の発現構築
    物とがゲノムに組み込まれている非ヒト哺乳動物。
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