JP2003504644A

JP2003504644A - Ｓｃａｐアンタゴニストである治療剤のスクリーニング

Info

Publication number: JP2003504644A
Application number: JP2001510847A
Authority: JP
Inventors: ティエリー、アンドレ、レジ、グラン‐ペレ; マルク、イサンドゥ
Original assignee: Glaxo Group Ltd
Current assignee: Glaxo Group Ltd
Priority date: 1999-07-17
Filing date: 2000-07-13
Publication date: 2003-02-04
Also published as: US20030224347A1; EP1196783A2; US6673555B1; WO2001006261A3; WO2001006261A2; AU5984700A; GB9916757D0; US20030224348A1

Abstract

(57)【要約】本発明は脂質レベルの上昇に関連する疾病に対抗するのに用いる治療薬（ＳＣＡＰアンタゴニストと呼ぶ）をスクリーニングする方法に関し、該方法は、該薬剤の存在下および不在下で対照ＳＣＡＰとＳＣＡＰ間の転写活性または結合の程度または結果を検出またはアッセイすることを含んでなる。また、かかる方法によって同定されたＳＣＡＰアンタゴニストである治療薬、および脂質レベルの上昇と関連する疾病に対抗する際のそれらの使用も請求される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明はスクリーニング方法、特にＳＣＡＰにおける結合に関して競合する薬
剤のスクリーニング方法におけるＳＲＥＢＰ切断活性タンパク質（ＳＣＡＰ）の
新規な使用、ならびに脂質レベルの上昇に関連する疾病に対抗するのに用いられ
るＳＣＡＰ結合特性を有する薬剤に関する。

【０００２】コレステロールはリポタンパク質と呼ばれるタンパク質／脂質複合体の形態で
血中を輸送される。それぞれのリポタンパク質は末梢組織から肝臓へ、あるいは
その逆の脂質輸送において役割を果たす。これらのクラスのリポタンパク質のい
くつかが長期間上昇すると、動脈中にコレステロールおよびコレステロールエス
テルの沈着が起こり、次には動脈閉塞ならびに心筋梗塞や心不全などの臨床症状
がもたらされる可能性がある。

【０００３】多くの研究がアテローム性動脈硬化症の程度および心不全の徴候と低密度リポ
タンパク質の血漿レベルとの間の相関を示している（Simon A et al., Circulat
ion 96: 2449-2452 (1997)により概説）。１０年来、コレステロール合成の律速
酵素であるＨＭＧＣｏＡレダクターゼ阻害剤を用いたいくつかの臨床試験により
、心血管性の死亡率に対する血漿ＬＤＬレベルの低下の有益な効果が確認されて
きた(Brown A.S. et al., J. Am. Coll. Cardiol. 32:665-672 (1998))。肝細胞
におけるコレステロールの消耗が、ＬＤＬの再取り込みを媒介するＬＤＬ受容体
のダウンレギュレーションを妨げる機構は、Brown and Goldstein（Cell 89:331
-340 (1997)によって概説）により十分特徴づけられている。彼らはステロール
類によるＬＤＬ受容体の調節に関与するＬＤＬ受容体プロモーターの応答エレメ
ントであるSterol Responsive Element (SRE) を同定した(Briggs M.R. et al.,
J. Biol. Chem. 268:14490-14496 (1993)）。彼らは小胞体膜に前駆体として存
在する２つのＳＲＥ結合タンパク質（ＳＲＥＢＰ）を精製およびクローニングし
た(Yokoyama C. et al., Cell 75:187-197 (1993)およびHua X. et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. 90:11603-11607 (1993))。コレステロールが消耗すると、こ
れらの膜結合型は次ぎに、最近クローニングされた２つのプロテアーゼＳ−１−
Ｐ(Sakai J et al. Mol. Cell. 2:505-514 (1998))およびＳ−２−Ｐ(Rawson R.
B. et al. Mol. Cell, 1:47-57 (1997))によって切断され、このようにして遊離
した成熟型が核に移動してＳＲＥと結合する(Sakai J. et al., Cell 85:1037-1
046 (1996))。ＳＲＥＢＰ切断活性タンパク質（ＳＣＡＰ）は同定されており、
ＳＲＥＢＰと物理的に相互作用することが示されている(Sakai J. et al., J. B
iol. Chem. 272:20213-20221 (1997))。さらに、推定されるステロール結合ドメ
インがアミノ酸２８０〜４４４の間のＳＣＡＰ上に存在することから、その役割
が「コレステロールセンサー」としてのものであることが示唆される(Hua X. et
al., Cell 87:415-426 (1996))。細胞内の過剰なコレステロールはおそらくＳ
ＣＡＰ／ＳＲＥＢＰの相互作用を妨げ、従ってＳＲＥＢＰタンパク質分解成熟プ
ロセスを阻害する。コレステロールおよびその代謝物は、細胞のコレステロール
含量を増加させる遺伝子（例えば、新たなコレステロール合成を触媒するか、ま
たはコレステロール豊富なＬＤＬの取り込みを調節する）のレプレッサーとして
働く(Javitt N.B., Faseb 9:1378-1381 (1995))。水溶性コレステロール類似体
２５ＯＨ−コレステロールはステロールにより調節される遺伝子の可能性のある
サプレッサーであり(Brown M.S. and Goldstein J.L., J. Biol. Chem., 249:73
06-7314 (1974))、ＳＣＡＰ機能を研究するために用いられている(Nohturfft A.
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 93:13709-13714 (1996))。

【０００４】発明者らは今般、ＳＣＡＰ／ＳＲＥＢＰ経路の活性化を促進することによって
コレステロールおよびその代謝物に対する逆の効果を有するようにＳＣＡＰと結
合してＬＤＬ受容体遺伝子活性をもたらす薬剤（ＳＣＡＰアンタゴニスト）を発
見した。ＳＣＡＰアンタゴニストはレプレッサー・ステロールの存在下でもＬＤ
Ｌ受容体プロモーターを活性化させるということは、ＨＭＧＣｏ−Ａレダクター
ゼ阻害剤（スタチン）などの細胞のコレステロール含量を消耗させることで作用
する薬剤よりも明らかに有利なものとなる。コレステロールおよびその代謝物に
よるＬＤＬ受容体プロモーターの抑制がＳＣＡＰアンタゴニストの存在下でなお
可能であるということは、ＳＣＡＰアンタゴニストの使用がＬＤＬ受容体の生理
学的調節を損なわないということを示す。

【０００５】このように第１の態様によれば、本発明は、ＬＤＬ−コレステロールの循環レ
ベルの上昇に関連する疾病に対抗するのに用いる、ＳＣＡＰアンタゴニストをス
クリーニングする方法を提供し、該方法は、試験ＳＣＡＰアンタゴニストと対照
ＳＣＡＰアンタゴニスト間、または試験ＳＣＡＰアンタゴニストとコレステロー
ルもしくはその代謝物間のＳＣＡＰに対する転写活性または結合競合の程度また
は結果を検出またはアッセイすることを含んでなる。

【０００６】本発明の結合の検出方法は当技術分野で公知の好適な方法のいずれかを含む。
例えば対照ＳＣＡＰアンタゴニストは標識化合物（すなわち、放射活性または蛍
光）および／または光活性性のものを含んでなる。

【０００７】本発明はＳＣＡＰと結合するＳＣＡＰアンタゴニストがＬＤＬ受容体のような
ＳＲＥＢＰによって調節される遺伝子のコレステロールによる抑制に拮抗し得る
ことを実証する。さらにこの新規な医薬クラスの化合物は過剰なコレステロール
の存在下でも作用でき、薬剤の作用に反する適当な肝細胞応答の機会が減るため
に、スタチンのようなその他の脂質低下剤よりも効果が高い可能性がある。スタ
チンの作用は細胞のコレステロールおよび鍵となる中間体の産生の阻害程度によ
り制限され、そこではプロセスは細胞損傷を引き起こすことなく起こり得る。内
因性のＳＣＡＰリガンドとの競合によって作用する低脂血剤はコレステロール消
耗を必要としない。以下の実施例に示されるように、コレステロールを与えたハ
ムスターで見られるＬＤＬ−コレステロール、トリグリセリドおよびａｐｏＢ１
００の著しい低下はＬＤＬ−コレステロールの循環レベルの上昇に関連する症状
、特に重症性異脂肪症の治療のためのＳＣＡＰリガンドの治療上の関心を確固た
るものとする。これらの薬剤による処理で見られる血漿トリグリセリドレベルの
著しい低下はおそらくＬＤＬ受容体によるトリグリセリド豊富なリポタンパク質
のクリアランスの促進によるものであろう。

【０００８】本明細書において「スクリーニング」とは、対照ＳＣＡＰアンタゴニストとＳ
ＣＡＰもしくは末端切断型ＳＣＡＰ間の結合を調節、作用、影響または阻害し得
る薬剤（試験ＳＣＡＰアンタゴニスト）の作用、あるいはＳＣＡＰと結合したコ
レステロールもしくはその代謝物の１つの転写能を検討する方法またはアッセイ
を含み、また、化合物アレイまたは化合物ライブラリーなどの１を超える化合物
を試験する結合アッセイを含む。１を超える化合物を試験する場合、これらの試
験は同時であっても逐次であってもよい。かかる薬剤はコレステロールまたはそ
の代謝物とＳＣＡＰとの結合を阻害する、すなわちＳＣＡＰに対するコレステロ
ールまたはその代謝物の結合を完全に、または部分的に妨げるよう作用し得る。
かかる薬剤はまた、ＳＣＡＰと結合したコレステロールまたはその代謝物の転写
抑制活性を調節する、すなわちコレステロールまたはその代謝物と結合した場合
にＳＣＡＰにより媒介される転写抑制を阻害するように作用し、それによりＳＲ
ＥＢＰ経路の活性化およびＬＤＬ受容体遺伝子の活性化を促進する。検出および
アッセイの方法は結合が存在するかどうか、または転写活性が存在するかどうか
の、また試験する薬剤の作用の定量的、定性的または半定量的評価を含む。

【０００９】１つの態様では、本発明は、試験ＳＣＡＰアンタゴニストの存在下におけるＳ
ＣＡＰと標識対照ＳＣＡＰアンタゴニスト間の結合を、該試験ＳＣＡＰアンタゴ
ニストの不在下のものと比較する結合アッセイを含む。第２の態様では、本発明は、試験ＳＣＡＰアンタゴニストの存在下でＳＲＥＢ
Ｐ経路の活性化の程度を測定し、次ぎにその作用がＳＣＡＰと結合したコレステ
ロールの作用に拮抗することによって媒介されることを、試験ＳＣＡＰアンタゴ
ニストの存在下における標識対照ＳＣＡＰアンタゴニストとＳＣＡＰアンタゴニ
スト間の結合を、該試験ＳＣＡＰアンタゴニストの不在下のものと比較すること
によって確認する機能アッセイを含む。本発明の好ましい機能アッセイは、Ｈｅ
ｐＧ２細胞におけるＬＤＬ受容体プロモーターの転写活性の程度の測定を含む。

【００１０】本発明のＳＣＡＰアンタゴニストは、アテローム性動脈硬化症、膵炎、非イン
スリン性真性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）、冠動脈性心疾患および肥満症の治療の用い
られるものである。

【００１１】また、本発明のＳＣＡＰアンタゴニストは、血清の脂質レベル、コレステロー
ルおよび／またはトリグリセリドを低下させるのに有用であり、高脂血症(hyper
lipemia, hyperlipidemia)、高リポタンパク血症、高コレステロール血症および
／または高血糖症の治療に用いられるものである。本発明のさらなる態様のＳＣ
ＡＰアンタゴニストは高コレステロール血症および混合型異脂肪症を治療するの
に最も有用である。

【００１２】このようにさらなる態様から、本発明は、本発明の上記スクリーニング方法に
よって同定された治療薬（ＳＣＡＰアンタゴニスト）、またはその生理学上許容
される塩、溶媒和物もしくは誘導体、およびＬＤＬ−コレステロールおよび／ま
たはトリグリセリドの循環レベルの上昇に関連する疾病に対抗するその使用を提
供する。

【００１３】本発明の好適なＳＣＡＰアンタゴニストとしては、４−（４−クロロベンゾイ
ルアミノ）−Ｎ−｛４−［４−（２−エトキシ−４−エチル−フェニル）−ピペ
リジン−１−イル］−ブチル｝−ベンズアミドまたは４−（４−ベンゾイル）−
Ｎ−｛４−［４−（４−イソプロピル−２−メトキシ−フェニル）−ピペリジン
−１−イル］−ブチル｝−ベンズアミド、またはその生理学上許容される塩、溶
媒和物もしくは誘導体が挙げられる。

【００１４】本発明はさらなる態様として、ＬＤＬ−コレステロールおよび／またはトリグ
リセリドの循環レベルの上昇に起因する症状の治療の用いられる薬剤の製造にお
ける、ＳＣＡＰアンタゴニストまたはその生理学上許容される塩、溶媒和物もし
くは誘導体の使用を提供する。

【００１５】もう１つの方法、すなわちさらなる態様では、ヒトをはじめ哺乳類の治療、特
にＬＤＬ−コレステロールおよび／またはトリグリセリドの循環レベルの上昇に
起因する症状の治療方法であって、有効量のＳＣＡＰアンタゴニストまたはその
生理学上許容される塩、溶媒和物もしくは誘導体の投与を含んでなる方法が提供
される。

【００１６】さらにもう１つの方法、すなわちさらにもう１つの態様では、ＬＤＬ−コレス
テロールおよび／またはトリグリセリドの循環レベルの上昇に起因する症状の治
療に有用な化合物を同定する方法であって、化合物がＳＣＡＰと直接相互作用す
るかどうかを調べる工程を含んでなる方法が提供される。

【００１７】さらにもう１つの方法、すなわちさらにもう１つの態様では、ＬＤＬ−コレス
テロールおよび／またはトリグリセリドの循環レベルの上昇に起因する症状の治
療方法であって、上記の方法によって同定され得る化合物の投与を含んでなる方
法が提供される。

【００１８】治療とは予防ならびに確立された症状の緩和を含むものとする。式（Ｉ）の化
合物は原料化学物質として投与してもよいが、有効成分は好ましくは医薬製剤と
して提供される。

【００１９】従って本発明はまた、少なくとも１種のＳＣＡＰアンタゴニストまたはその生
理学上許容される塩、溶媒和物もしくは誘導体を含んでなり、便宜ないずれかの
経路によって投与するために処方された医薬組成物を提供する。かかる組成物は
好ましくは医薬、特にヒト医薬に適合した形態であり、便宜には１以上の医薬上
許容される担体または賦形剤を用いて常法にて処方できる。

【００２０】このように式（Ｉ）の化合物は経口、口内、非経口、経皮、局所（眼用および
鼻用を含む）、デポーもしくは直腸投与用、または吸入もしくは通気（経口もし
くは経鼻のいずれか）による投与に好適な形態に処方すればよい。

【００２１】経口投与では、医薬組成物は、結合剤（例えばアルファー化トウモロコシデン
プン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロモーターピルメチルセルロー
ス）、増量剤（例えば、ラクトース、マイクロクリスタリンセルロースまたはリ
ン酸水素カルシウム）、滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクま
たはシリカ）、崩壊剤（例えば、ジャガイモデンプンまたはグリコール酸ナトリ
ウムデンプン）、または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）などの医薬
上許容される賦形剤を用いて常法にて製造される例えば錠剤またはカプセル剤の
形態をとってもよい。錠剤は当技術分野で十分公知の方法によってコーティング
してもよい。経口投与用の液体製剤は例えば溶液、シロップ、または懸濁液の形
態をとってもよく、あるいはそれらは使用前に水またはその他の好適なビヒクル
で構成する乾燥製剤として提供してもよい。かかる液体製剤は沈殿防止剤（例え
ば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または硬化食用油、乳化剤（例え
ば、レシチンまたはアラビアガム）、非水性ビヒクル（例えば、アーモンド油、
油性エステル、エチルアルコールまたは精留植物油）、および保存剤（例えば、
メチルもしくはプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾエートまたはソルビン酸）など
の医薬上許容される添加剤を用いて常法にて製造すればよい。これらの製剤はま
た要すればバッファー塩、香味剤、着色剤および甘味剤を含んでもよい。

【００２２】経口投与用製剤は有効化合物の徐放性を得るために適宜処方すればよい。口内投与には、組成物は常法にて処方した錠剤またはトローチ剤の形態をとっ
てもよい。

【００２３】経皮投与には、本発明の化合物はクリーム剤、ゲル剤、軟膏、またはローショ
ン剤として、あるいは経皮パッチとして処方してもよい。かかる組成物は例えば
好適な増粘剤、ゲル化剤、乳化剤、安定剤、分散剤、沈殿防止剤および／または
着色剤を添加して水性または油性基剤を用いて処方してもよい。

【００２４】本発明の化合物はボーラス投与または点滴による非経口投与用に処方してもよ
い。注射製剤は単位投与形（例えばアンプル）で、または保存剤を添加して複用
量容器で提供してもよい。これらの組成物は油性または水性ビヒクル中の懸濁液
、溶液またはエマルションのような形をとってもよく、懸濁防止剤、安定剤およ
び／または分散剤のような配合剤を含んでもよい。あるいは、有効成分は使用前
に好適なビヒクル、例えば滅菌パイロジェンフリー水で構成する粉末の形態であ
ってもよい。

【００２５】本発明の化合物は軟膏、クリーム剤、ゲル剤、ローション、ペッサリー、ＥＡ
ゾルまたは滴剤（例えば眼用、耳用もしくは鼻用滴剤）の形態で局所投与用に処
方してもよい。軟膏およびクリーム剤は例えば水性または油性基剤を用い、好適
な増粘剤および／またはゲル化剤を添加して処方してもよい。

【００２６】ローションは水性または油性基剤を用いて処方すればよく、また一般に１以上
の乳化剤、安定剤、分散剤、沈殿防止剤、増粘剤または着色剤を含む。滴剤は水
性または非水性基剤で処方し、また１以上の分散剤、安定剤、可溶化剤または懸
濁防止剤を含んでもよい。それらはまた保存剤を含んでもよい。

【００２７】本発明の化合物はまた、坐剤または滞留型浣腸などの直腸組成物として処方し
、例えばココアバターまたはその他のグリセリドなどの通常の坐剤基剤を含んで
よい。

【００２８】また本発明の化合物はデポー製剤として処方してもよい。かかる長期作用製剤
は埋植（例えば皮下または筋肉内）により、あるいは筋肉内注射により投与すれ
ばよい。このように例えば本発明の化合物は好適なポリマーまたは疎水性材料（
例えば許容される油中のエマルションとして）、またはイオン交換樹脂を用いて
、あるいは難溶性誘導体として（例えば難溶性塩として）処方すればよい。

【００２９】鼻内投与では、本発明の化合物は好適な計量または単位用量装置による投与の
ための溶液として、あるいはまた好適な送達装置を用いて投与するための好適な
担体との粉末混合物として処方すればよい。

【００３０】これらの組成物は投与方法にもよるが、０．１％を超える、例えば０．１％〜
９９％の有効物質を含んでもよい。提案される本発明の化合物量は０．２５ｍｇ
／ｋｇ〜約１２５ｍｇ／ｋｇ体重／日、例えば２０ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋ
ｇ／日である。患者の年齢および症状に応じて、通常用量は変更する必要がある
と考えられ、正確な用量は最終的には主治医または獣医の裁量にある。また用量
は投与経路および選択された特定の化合物によっても異なる。

【００３１】本発明のＳＣＡＰアンタゴニストは所望により１以上の治療薬とともに投与し
てもよく、常法にて便宜ないずれかの経路によって投与するように処方すればよ
い。当業者ならば適当な用量が容易に分かろう。例えば本発明のＳＣＡＰアンタ
ゴニストはコレステロール消耗によって、またはＶＬＤＬ産生を低下させること
によって作用する他の脂質低下薬（例えばＨＭＧＣｏ−Ａレダクターゼ阻害剤な
どのコレステロール生合成に関与する酵素の阻害、またはミクロソームのトリグ
リセリドトランスファータンパク質（ＭＴＰ）阻害剤）および／または胆汁酸金
属イオン封鎖剤または胆汁酸輸送阻害剤と組み合わせて投与してもよい。

【００３２】以下、限定されるものではないが実施例により本発明を説明する。試験および対照ＳＣＡＰアンタゴニストの準備以下の実験詳細に用いられる略号：ＴＨＦ−テトラヒドロフラン；ＤＣＭ−ジクロロメタン；ＴＥＡ−トリエチル
アミン；ＮａＯＨ−水酸化ナトリウム；ＥｔＯＨ−エタノール；ＥｔＯＡｃ−酢
酸エチル；ＩＰｒ_２Ｏ−イソプロパノール；Ｍｅ_２ＮＨ−ジメチルアミン；Ｎａ _２ＳＯ_４−硫酸ナトリウム；Ｐｄ／Ｃ−パラジウム・カーボン；Ｃｓ_２ＣＯ_３−
炭酸セシウム；Ｅｔ_２Ｏ−ジエチルエーテル；ＣＨＣｌ_３−クロロホルム；ＩＰ
ｒＯＨ−イソプロパノール；Ｃｈｅｘ−シクロヘキサン；ＭｅＯＨ−メタノール
；Ｋ_２ＣＯ_３−炭酸カルシウム；ＤＭＦ−ジメチルホルムアミド；ＥＤＣＩ−１
−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミドヒドロクロリド
；ＨＯＢｔ−１−ヒドロキシベンゾトリアゾール；ｐＴＳＡ−パラトルエン硫酸
；ＮａＨＣＯ_３−炭酸水素ナトリウム；ＬｉＡｌＨ_４−水素リチウムアルミニウ
ム；ｒｔ−室温。

【００３３】４−（４−クロロ−ベンゾイルアミノ）−安息香酸エチルエステル中間体１ＴＨＦ／ＤＣＭ（５００ｍＬ／１０００ｍＬ）中、４−アミノ−安息香酸エチ
ルエステル（１２４ｇ、０．７５ｍｏｌ）溶液をＴＥＡ（１２０ｍＬ、１．１５
当量）および４−ジメチルアミノピリジン（１．３ｇ、触媒量）で処理した。−
７℃にてＴＨＦ（１００ｍＬ）中、４−クロロ−ベンゾイルクロリド（１５２．
０ｇ、１．１５当量）を滴下した。得られた混合物を４８時間機械攪拌した。溶
媒を蒸発させ、残渣をＥｔＯＡｃ／ＤＣＭ（３０／７０）に溶解した。濃ＮａＯ
Ｈ溶液をｐＨ＝１２まで加えた。白色固体が沈殿し、これを回収した（１５６．
８ｇ、０．５２ｍｏｌ）。有機層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させた。溶媒を蒸発させ
、ｉＰｒ_２Ｏから結晶化すると、第２のバッチの目的化合物（６３．２ｇ、０．
２１ｍｏｌ）が得られた。全収率は９７．３％である。¹ H NMR (CDCl₃,250 MHz) δ8.1 (s, 1H)、7.9 (d, 2H)、7.7 (d, 2H)、7.6 (d,
2H)、7.3 (d, 2H)、4.3 (q, 2H)、1.3 (t, 3H)。

【００３４】４−（４−クロロ−ベンゾイルアミノ）−安息香酸中間体２４０００ｍＬのＥｔＯＨ中、中間体１（２００ｇ、０．７２ｍｏｌ）の懸濁液
を１ＮＮａＯＨ溶液（１０００ｍＬ）で処理した。得られた懸濁液を一晩還流
下で加熱した。白色固体が沈殿した。還流下、濃ＨＣｌ溶液をｐＨ＝１まで加え
た、激しく機械攪拌しながら、得られた懸濁液を冷却した。白色固体を回収し、
減圧下で乾燥させると、標題の化合物が定量的収率で得られた。融点＞２６０℃
。¹ H NMR (DMSO, 250 MHz) δ10.5 (s, 1H)、7.9 (d, 2H)、7.8 (s, 4H)、7.5 (d,
2H)。Ref:J.Pharm.Sci.(1979)、68(3)、332-5

【００３５】５−エチル−２−（１，２，３，６−テトラヒドロ−ピリジン−４−イル）−フェノール中間体３酢酸（５００ｍＬ）中、３−エチル−フェノール（１２２．２、１ｍｏｌ）お
よび４−ピペリドン水和・塩酸塩（１８４．２ｇ、１．２当量）の溶液をＨＣｌ
ガスで１０分間処理した。混合物を９５℃で３０分間攪拌した。室温まで冷却し
た後、混合物を再びＨＣｌガスで５分間処理した。得られた溶液を室温で４日間
攪拌した。減圧下で溶媒を蒸発させると、無色の油状物質（２００．０ｇ）が得
られた。この生成物をさらに精製せずに用いた。

【００３６】酢酸２−（１−アセチル−１，２，３，６−テトラヒドロ−ピリジン−４−イル）−５−エチル−フェニルエステル中間体４ピリジン（３００ｍＬ）中、中間体３（３３．０ｇ、０．１６２ｍｏｌ）溶液
に、無水酢酸（１００ｍＬ）を加えた。混合物を室温で４時間攪拌した。溶媒を
減圧下で蒸発させた。油状物質をＤＣＭで希釈し、水で洗浄した。有機層をＮａ _２ＳＯ_４で乾燥させ、蒸発乾固すると、収率６０％で黄色の油状物質として標題
の化合物（２８．０ｇ、０．０９７ｍｏｌ）が得られた。¹ H NMR (CDC1₃, 250 MHz) δ7 (m, 2H), 6.7 (m, 1H), 5.65 (m, 1H), 4.05 (m,
2H), 3.55 (dt, 2H), 2.6 (q, 2H), 2.3 (m, 2H), 2.15 (s, 3H), 2.05 (d, 3H
), 1.1 (t, 3H)。

【００３７】１−［４−（４−エチル−２−ヒドロキシ−フェニル）−３，６−ジヒドロ−２Ｈ−ピリジン−１−イル］−エタノン中間体５ＭｅＯＨ（７００ｍＬ）中、中間体４（２８．０ｇ、０．０９８ｍｏｌ）の溶
液に、Ｋ_２ＣＯ_３（４０．０ｇ、３当量）を加え、混合物を還流下で４時間攪拌
した。溶液を濾別し、メタノールを蒸発させた。油状物質をＤＣＭで希釈し、水
で洗浄した。有機層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、蒸発乾固させると、収率８４％
で橙色の油状物質として標題の化合物（２０．０ｇ、０．０８２ｍｏｌ）が得ら
れた。¹ H NMR (CDCl₃, 250 MHz) δ6.7 (m, 2H)、6.6 (m, 1H)、5.8 (m, 1H)、4.1 (m,
2H)、3.65 (m, 2H)、2.7 (m, 5H)、2.4 (q, 2H)、1.2 (t, 3H)。

【００３８】１−［４−（４−エチル−２−ヒドロキシ−フェニル）−ピペリジン−１−イル］−エタノン中間体６ＭｅＯＨ（６００ｍＬ）中、中間体５（２０．０ｇ、０．０８２ｍｏｌ）の溶
液に、Ｐｄ／Ｃ、１０％（１．２ｇ）を加え、反応物を大気圧水素下で２４時間
攪拌した。反応混合物をセライトベッドで濾過した。濾液を減圧下で蒸発させる
と、収率７５％で油状物質として標題の化合物（１５．０ｇ、０．０６ｍｏｌ）
が得られた。¹ H NMR (CDCl₃, 250 MHz) δ6.85 (d, 1H)、6.6 (m, 2H)、4.65 (m, 1H)、3.8 (
m, 1H)、3.2-2.9 (m, 2H)、2.6 (m, 1H)、2.45 (q, 2H)、2.05 (s, 3H)、1.7 (m
, 2H)、1.5 (m, 2H)、1.1 (t, 3H)。

【００３９】１−［４−（２−エトキシ−４−エチル−フェニル）−ピペリジン−１−イル］ −エタノン中間体７乾燥アセトン（１５０ｍＬ）中、中間体６（７．４１ｇ、０．０３ｍｏｌ）の
溶液に、無水Ｃｓ_２ＣＯ_３（１４．７ｇ、１．５当量）およびヨウ化エチル（４
．８ｍＬ、２当量）を加えた。反応物を還流下で５時間攪拌した。冷却した後、
反応物を濾別し、アセトンで洗浄した。濾液を減圧下で蒸発させると、定量的収
率で油状物質として標題の化合物（８．２ｇ、０．０３ｍｏｌ）が得られた。¹ H NMR (CDCl₃, 250 MHz) δ6.9 (d, 1H)、6.6 (m, 2H)、4.7 (m, 1H)、4.0 (q,
2H) 3.8 (m, 1H)、3.1 (m, 2H)、2.5 (m, 3H)、2.05 (s, 3H)、1.7 (m, 2H)、1
.50 (m, 2H), 1.35 (t, 3H)、1.1 (t, 3H)。

【００４０】４−（２−エトキシ−４−エチル−フェニル）−ピペリジン中間体８ＭｅＯＨ（１５０ｍＬ）中、中間体７（８．１７ｇ、０．０３ｍｏｌ）の溶液
にＨ_２Ｏ（３７ｍＬ）中ＮａＯＨ（３７ｍＬ）溶液を加えた。反応物を還流下で
１６時間攪拌した。冷却した後、反応物を減圧下で濃縮し、ＤＣＭで希釈し、水
で洗浄した。有機層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、蒸発乾固させると、収率９４％
で黄色の油状物質として標題の化合物（６．６ｇ、０．０２６ｍｏｌ）が得られ
た。¹ H NMR (CDCl₃, 250 MHz) δ7.1 (d, 1H)、6.7 (d, 1H)、4.7 (d, 1H)、4.05 (q
, 2H) 3.1 (m, 2H)、3.05 (m, 1H)、2.7 (td, 2H)、2.55 (q, 2H)、1.75 (m, 3H
)、1.55 (m, 2H), 1.35 (t, 3H)、1.1 (t, 3H)。

【００４１】２−｛４−［４−（２−エトキシ−４−エチル−フェニル）−ピペリジン−１− イル］−ブチル｝−イソインドール−１，３−ジオン中間体９アセトン（２００ｍＬ）中、中間体８（６．６ｇ、０．０２８ｍｏｌ）の溶液
をＣＳ_２ＣＯ_３（１．１当量）およびＮ−（４−ブロモブチル）−フタルイミド
（１．１当量）で処理した。得られた混合物を還流下で１６時間攪拌した。室温
まで冷却した後、反応混合物を濾別した。ケークをアセトンで洗浄した。濾液を
蒸発させると、収率９７％で黄色の油状物質として標題の化合物（１１．９ｇ、
０．０２７ｍｏｌ）が得られた。¹ H NMR (CDCl₃, 250 MHz) δ7.8 (m, 2H)、7.6 (m, 2H)、7.0(d, 1H)、6.65 (d
d, 1H)、6.55 (sd, 1H)、3.95 (q, 2H)、3.65 (m, 3H)、2.95 (m, 2H)、2.8 (m,
1H)、2.5 (q, 2H)、2.4 (m, 2H)、2 (td, 2H)、1.8-1.4 (m, 8H)、1.3 (t, 3H)
、1.15 (t, 3H)。

【００４２】４−［４−（２−エトキシ−４−エチル−フェニル）−ピペリジン−１−イル］ −ブチルアミン中間体１０ＭｅＯＨ（３００ｍＬ）中、中間体９（１１．９ｇ、０．０２７ｍｏｌ）の溶
液をヒドラジン（４当量）で処理した。得られた混合物を６０℃で１６時間攪拌
した。室温まで冷却した後、１ＮＨＣｌをｐＨ＝４まで加えた。減圧下で蒸発
させた後、残渣を水に溶解した。濾過すると黄色の溶液が得られ、これをＫ_２Ｃ
Ｏ_３水溶液で処理した。ＤＣＭ／ＭｅＯＨ（９０／１０）で抽出し、Ｎａ_２ＳＯ _４で乾燥させ、濾過すると、収率８１．５％で黄色の油状物質として標題の化合
物（６．８ｇ、０．０２２ｍｏｌ）が得られた。¹ H NMR (CDCl₃, 250 MHz) δ7.1 (d, 1H)、6.7 (dd, 1H)、6.6 (s, 1H)、4.0 (q
, 2H)、3.0 (bd, 2H)、2.9 (m, 1H)、2.7 (t, 2H)、2.55 (q, 2H)、2.3 (m, 2H)
、2.0 (td, 2H)、1.7-1.2 (m, 10H)、1.4 (t, 3H)、1.1 (t, 3H)。

【００４３】５−イソプロピル−２−（１，２，３，６−テトラヒドロ−ピリジン−４−イル）−フェノール中間体１１酢酸（３００ｍＬ）中、３−イソプロピル−フェノール（６８．１、０．５ｍ
ｏｌ）および４−ピペリドン水和・塩酸塩（９２．１ｇ、１．２当量）の溶液を
ＨＣｌガスで１０分間処理した。混合物を９５℃で３０分間攪拌した。室温まで
冷却した後、混合物を再びＨＣｌガスで５分間処理した。得られた溶液を室温で
４日間攪拌した。減圧下で溶媒を蒸発させると、無色の油状物質（１１０．０ｇ
）が得られた。この生成物をさらに精製せずに用いた。

【００４４】酢酸２−（１−アセチル−１，２，３，６−テトラヒドロ−ピリジン−４−イル）−５−イソプロピル−フェニルエステル中間体１２ピリジン（１０００ｍＬ）中、中間体１１（１１０．０ｇ、０．５ｍｏｌ）溶
液に、無水酢酸（３００ｍＬ）を加えた。混合物を室温で４時間攪拌した。溶媒
を減圧下で蒸発させた。油状物質をＤＣＭで希釈し、水で洗浄した。有機層をＮ
ａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、蒸発乾固すると、定量的収率で黄色の油状物質として標
題の化合物（１５０．０ｇ、０．５ｍｏｌ）が得られた。ＧＣ／ＭＳ：Ｍ＋Ｃ_１８Ｈ_２３ＮＯ_３３０１

【００４５】１−［４−（２−ヒドロキシ−４−イソプロピル−フェニル）−３，６−ジヒドロ−２Ｈ−ピリジン−１−イル］−エタノン中間体１３ＭｅＯＨ（７００ｍＬ）中、中間体１２（１５０．０ｇ、０．０９８ｍｏｌ）
の溶液に、Ｋ_２ＣＯ_３（４０．０ｇ、３当量）を加え、混合物を還流下で４時間
攪拌した。溶液を濾別し、メタノールを蒸発させた。油状物質をＤＣＭで希釈し
、水で洗浄した。有機層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、蒸発乾固させると、収率５
９％で橙色の油状物質として標題の化合物（７６．０ｇ、０．２９ｍｏｌ）が得
られた。

【００４６】ＧＣ／ＭＳ：Ｍ＋Ｃ_１８Ｈ_２１ＮＯ_２２５９１−［４−（２−ヒドロキシ−４−イソプロピル−フェニル）−ピペリジン−１ −イル］−エタノン中間体１４ＥｔＯＨ（１４００ｍＬ）中、中間体１３（５６．０ｇ、０．２２ｍｏｌ）の
溶液に、Ｐｄ／Ｃ、１０％（５．６ｇ）を加え、反応物を大気圧水素下で２４時
間攪拌した。反応混合物をセライトベッドで濾過した。濾液を減圧下で蒸発させ
ると、定量的収率で油状物質として標題の化合物（５４．５ｇ、０．２１ｍｏｌ
）が得られた。ＧＣ／ＭＳ：Ｍ＋Ｃ_１６Ｈ_２３ＮＯ_２２６１

【００４７】１−［４−（４−イソプロピル−２−メトキシ−フェニル）−ピペリジン−１− イル］−エタノン中間体１５乾燥アセトン（１０００ｍＬ）中、中間体１４（５４．５ｇ、０．２１ｍｏｌ
）の溶液に、無水Ｋ_２ＣＯ_３（４３．０ｇ、１．５当量）およびヨウ化メチル（
１３０ｍＬ、１０当量）を加えた。反応物を６０℃で５時間攪拌した。冷却した
後、反応物を濾別し、減圧下で蒸発させた。油状物質をＤＣＭで希釈し、水で洗
浄した。有機層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、蒸発乾固させると、収率５６％で黄
色の油状物質として標題の化合物（５５．７ｇ、０．２０３ｍｏｌ）が得られた
。ＧＣ／ＭＳ：Ｍ＋Ｃ_１７Ｈ_２５ＮＯ_２２７５

【００４８】４−（４−イソプロピル−２−メトキシ−フェニル）−ピペリジン中間体１６ＥｔＯＨ（５００ｍＬ）中、中間体１５（５５．７ｇ、０．２００ｍｏｌ）の
溶液にＨ_２Ｏ（２７０ｍＬ）中ＮａＯＨ（２７０ｍＬ）溶液を加えた。反応物を
還流下で１６時間攪拌した。冷却した後、反応物を減圧下で濃縮し、ＤＣＭで希
釈し、水で洗浄した。有機層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、蒸発乾固させると、定
量的収率で黄色の油状物質として標題の化合物（４８．８ｇ、０．２０ｍｏｌ）
が得られた。ＧＣ／ＭＳ：Ｍ＋Ｃ_１５Ｈ_２３ＮＯ_２２３３

【００４９】２−｛４−［４−（２−イソプロピル−２−メトキシ−フェニル）−ピペリジン −１−イル］−ブチル｝−イソインドール−１，３−ジオン中間体１７中間体１６から出発したこと以外は中間体９の製造と同じ方法を用い、定量的
収率で黄色の油状物質として標題の化合物を得た。¹ H NMR (CDCl₃, 250 MHz) δ7.8 (m, 2H)、7.65 (m, 2H)、7.05 (d, 1H)、6.7 (
dd, 1H)、6.6 (s, 1H)、3.7 (s, 3H)、3.65 (m, 3H)、2.9 (m, 1H)、3.0 (bd, 2
H)、2.8 (m, 2H)、2.3 (m, 2H)、2.. 0 (m, 2H)、1.70-1.5 (m, 6H)、1.2 (d, 6
H)。

【００５０】４−［４−（４−イソプロピル−２−メトキシ−フェニル）−ピペリジン−１− イル］−ブチルアミン中間体１８中間体１７から出発したこと以外は中間体１０の製造と同じ方法を用い、収率
９３％で油状物質として標題の化合物を得た。¹ H NMR (CDCl₃, 250 MHz) δ7.05 (m, 1H)、6.7 (dd, 1H)、6.6 (d, 1H)、3.8 (
s, 3H)、3.1 (bd, 2H)、2.8 (m, 2H)、2.7 (t, 2H)、2.3 (m, 2H)、2.0-1.3 (m,
12H)、1.15 (d, 6H)。

【００５１】１７α，１７β−（１，３，６，８−テロラオキサスピロ［４．４］ノナン−４ −イル）−３，１１−ジオキソアンドロスト−４−エン中間体１９ＣＨＣｌ_３（１０００ｍＬ）中、コルチゾン（３０．０ｇ、０．０８３ｍｏｌ
）の溶液を濃ＨＣｌ（３００ｍＬ）、次いでホルムアルデヒド（３００ｍＬ）で
処理した。得られた混合物を室温で１６時間攪拌した。有機層を分離し、水、Ｎ
ａＨＣＯ_３飽和溶液およびブラインで洗浄した。有機層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥さ
せ、蒸発させた。アセトンから収率４５％で白色固体として標題の化合物（１５
．０４ｇ、０．０３７ｍｏｌ）が沈殿した。¹ H NMR (CDCl₃,250 MHz) δ5.55 (s, 1H)、5.1 (s, 1H)、4.95 (d, 2H)、4.9 (s
, 1H)、3.7 (s, 2H)、2.7-1.1 (m, 20H)、0.7 (s, 3H)。

【００５２】３−エトキシ−アンドロスト−３，５−ジエン−１７α，１７β−（１，３，６，８−テトラオキサスピロ［４，４］ノナン−４−イル）−１１−オン中間体２０１，４−ジオキサン（１５０ｍＬ）中、中間体１９（６．０ｇ、０．０１５ｍ
ｏｌ）の溶液をオルトギ酸トリエチル（４．９６ｍＬ、２当量）およびｐＴＳＡ
（０．１４２ｇ、０．０５当量）で処理した。ＴＬＣ（シリカゲル：Ｃｈｅｘ／
ＥｔＡｃ：５／５）により追跡しながら反応物を攪拌した。得られた混合物をピ
リジン（０．２１ｍＬ、０．２当量）で１５分間室温で、次いで水（２０ｍＬ）
で処理した。次ぎに反応物をＥｔ_２Ｏで抽出した。有機層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥
させ、蒸発させた。定量的収率で黄色の油状物質として標題の化合物（４８．８
ｇ、０．２０ｍｏｌ）が得られた。アセトンから定量的収率で黄色固体として標
題の化合物（６．４ｇ、０．０１５ｍｏｌ）が沈殿した。ＧＣ／ＭＳ：Ｍ＋Ｃ_２５Ｈ_３４Ｏ_５４３０

【００５３】３−エトキシ−アンドロスト−３，５−ジエン−１７α，１７β−（１，３，６，８−テロラオキサスピロ［４，４］ノナン−４−イル）−１１−オン−６−カルボキシアルデヒド中間体２１ＤＣＭ中、ＤＭＦ（３．９３ｍＬ、３，２当量）に、ホスゲン（トルエン中２
０％溶液、１３．４ｍＬ、２当量）を加えた。反応物を攪拌すると、沈殿が生じ
た。ＤＣＭ（５０ｍＬ）中、中間体２０（６．４ｇ、０．０１５ｍｏｌ）の溶液
を滴下し、反応物を３時間攪拌し、２ＮＮａ_２ＣＯ_３溶液で処理した。反応物
を１５分間攪拌し、生成物をＤＣＭで抽出した。有機層をブラインで洗浄し、Ｎ
ａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、蒸発させると、定量的収率で白色固体として標題の化合
物（６．７５ｇ、０．０１５ｍｏｌ）が得られた。融点：９０〜９１℃ ＧＣ／ＭＳ：Ｍ＋Ｃ_２６Ｈ_３４Ｏ_７４５８

【００５４】３−エトキシ−６−ジメチルアミノメチル−アンドロスト−３，５−ジエン−１７α，１７β−（１，３，６，８−テロラオキサスピロ［４，４］ノナン−４− イル）−１１−オン中間体２２乾燥ＴＨＦ（５０ｍＬ）中、中間体２１（５．０ｇ、０．０１１ｍｏｌ）の溶
液に、Ｍｅ_２ＮＨ（ＴＨＦ中２Ｍ溶液、１６．４ｍＬ、３当量）を加えた。反応
物を室温で１６時間攪拌し、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム（２．５４
ｇ、１．１当量）を加えた。反応物を１時間攪拌し、ＡｃＯＥｔ（５０ｍＬ）を
加えた。有機層を水、ブラインで洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、蒸発させた
。シリカゲルクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ：９／１）により精製する
と、収率６３％で油状物質として標題の化合物（３．３９ｇ、０．００７ｍｏｌ
）が得られた。ＧＣ／ＭＳ：Ｍ＋Ｃ_２８Ｈ_４１ＮＯ_６４８７

【００５５】 ^１４Ｃ標識４−シアノベンゾフェノン中間体２３４−ヨードベンゾフェノン（３．０）（４１０ｍｇ、１．３３ｍｍｏｌ）、細
粉ヨウ化銅（Ｉ）（４０ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ）およびシアン化^１４Ｃ−カリ
ウム（６４ｍｇ、０．９５ｍｍｏｌ、５６．２ｍＣｉ／ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ
（２．５ｍＬ）に溶解し、窒素下で２０時間加熱還流した。反応混合物を室温ま
で冷却した後、酢酸エチル（１５０ｍＬ）で希釈した。この溶液を２重量％塩化
鉄（III）（６０ｍＬ）、水（５０ｍＬ）、メタ二亜硫酸ナトリウム（６０ｍＬ
）、水（５０ｍＬ）、ブライン（５０ｍＬ）、最後に水（５０ｍＬ）で順次抽出
した。有機層を乾燥させ（硫酸ナトリウム）、減圧下で濃縮すると、灰白色の固
体が得られた。この物質をシリカカラムクロマトグラフィー（まずイソヘキサン
−ジクロロメタン（８０：５０）、次いで（５０：１００）に高め、その後４−
イソベンゾフェノン（３．０）で溶出）により精製すると、白色固体として標題
の化合物（３．１）（１９４ｍｇ、９７％）が得られた。標準４−シアノベンゾ
フェノンと同時に溶出。ＴＬＣ（Ｍｅｒｃｋ５７１４）：イソヘキサン−ジクロロメタン（８０：５０）
、Ｒ_ｆ＝０．１^＊ ¹ H NMR スペクトル: (CDCl₃, 400MHz) 7.5 (t, 2H)、7.6 (t, 1H) 7.8 (m, 4H)
、7.9 (d, 2H)^*。^＊非標識化合物に関するデータ

【００５６】 ^１４Ｃ標識４−ベンゾイル安息香酸中間体２４中間体２３（１９４ｍｇ、０．９２ｍｍｏｌ）を２Ｎ水酸化ナトリウム（１０
ｍＬ）およびエタノール（２ｍＬ）に溶解し、得られた混合物を還流下で４時間
加熱した。反応混合物を室温まで冷却した後、２Ｎ塩酸（１５ｍＬ）で酸性化し
た。沈殿を酢酸エチル（１５０ｍＬ）中で抽出した。水層を除去し、酢酸エチル
（５０ｍＬ）で再度洗浄した。合した有機層を乾燥させ（硫酸ナトリウム）、減
圧下で濃縮すると、淡黄色の固体として標題の化合物（３．２）（２１１ｍｇ、
１００％）が得られた。標準４−ベンゾイル安息香酸と同時に溶出。ＴＬＣ（Ｍｅｒｃｋ５７１４）：イソヘキサン−酢酸エチル−酢酸（６０：２０
：１）、Ｒ_ｆ＝０．３^＊ ¹ H NMR スペクトル: (MeOD, 400MHz) 7.4 (t, 2H)、7.6 (t, 1H)、7.7 (m, 4H)
、8.1 (d, 2H)^*。^＊非標識化合物に関するデータ

【００５７】 ^１４Ｃ標識４−ベンゾイル−（５−フルオロフェニル）ベンゾエート（３．３）中間体２５中間体２４（２１１ｍｇ、０．９２ｍｍｏｌ）およびペンタフルオロフェノー
ル（１８５ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）を酢酸エチル（５ｍＬ）に溶解した。この溶
液を窒素下で１０〜１５℃まで冷却した。４−ジメチルアミノピリジン（４ｍｇ
）を加えた後、酢酸エチル中、１，３−ジクロロヘキシルカルボジイミド（２０
６ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）を滴下した。得られた溶液を１０〜１５℃で２時間攪
拌した。もとに戻ると粘稠な白色の沈殿が生じたが、これは１，３−ジクロロヘ
キシル尿素であると推定された。この１，３−ジクロロヘキシル尿素を濾過によ
って取り出し、沈殿を酢酸エチル（５０ｍＬ）で洗浄した。次ぎに有機層を２Ｎ
炭酸ナトリウム（２０ｍＬ）およびブライン（１０ｍＬ）で順次洗浄した。有機
層を乾燥させ（硫酸ナトリウム）、減圧下で濃縮すると、灰白色の固体が得られ
た。粗生成物をイソヘキサン−酢酸エチル（１００：１０）で溶出するシリカカ
ラムクロマトグラフィーにより精製すると、白色固体として標題の化合物（３．
３）（２８８ｍｇ、７９％）が得られた。標準４−ベンゾイル−（５−フルオロ
フェニル）ベンゾエートと同時に溶出。ＴＬＣ（Ｍｅｒｃｋ５７１４）：イソヘキサン−酢酸エチル（４：１）、Ｒ_ｆ＝
０．５^＊ ¹ H NMR: (CDCl₃, 400MHz) 7.5 (t, 2H)、7.6 (t, 1H)、7.8 (d, 2H)、7.9 (d, 2
H)、8.3 (d, 2H)*。^＊非標識化合物に関するデータ

【００５８】実施例１４−（４−クロロ−ベンゾイルアミノ）−Ｎ−｛４−［４−（２−エトキシ−４ −エチル−フェニル）−ピペリジン−１−イル］−ブチル｝−ベンズアミドＤＭＦ中、中間体１０（６．８ｇ、０．０２２、ｍｏｌ）の溶液を中間体２（
１．１当量）、ＥＤＣＩ（１．１当量）、ＨＯＢｔ（１．１当量）およびＴＥＡ
（１．１当量）で処理した。得られた混合物を室温で１６時間攪拌した。溶媒を
蒸発させた。残渣をＤＣＭに溶解し、１ＮＮａＯＨ溶液およびブラインで洗浄
した。有機層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、蒸発させた。残渣を、ＭｅＯＨ／ＤＣ
Ｍ（１０／９０）を用いてフラッシュした。ＤＭＦから再結晶させると、収率５
２％で白色結晶として標題の実施例１が得られた。融点：２５０℃ C₃₃H₄₀ClN₃O₃ (0.3 DMF)についての分析：計算値：C, 69.71; H, 7.26; N, 7.91. 実測値：C, 69.56; H, 7.37; N, 7.7

【００５９】実施例２４−（４−ベンゾイル）−Ｎ−｛４−［４−（４−イソプロピル−２−メトキシ −フェニル）−ピペリジン−１−イル］−ブチル｝−ベンズアミドヒドロクロリドＤＭＦ（５ｍＬ）中、中間体１８（０．２ｇ、０．６６ｍｍｏｌ）の溶液を４
−ベンゾイル安息香酸（０．１５ｇ、１．０当量）、ＥＤＣＩ（１．５当量）、
ＨＯＢｔ（１．５当量）およびＴＥＡ（１．５当量）で処理した。得られた混合
物を室温で１６時間攪拌した。溶媒を蒸発させた。残渣をＤＣＭに溶解し、１Ｎ
ＮａＯＨ溶液およびブラインで洗浄した。有機層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、
蒸発させた。残渣を、最少量の温ＤＭＦに溶解し、１ＮＨＣｌで処理すると、
収率３４％で白色固体として標題の化合物が得られた。融点：１３８℃ C₃₃H₄₀N₂O₃ (2 HCl)についての分析：計算値：C, 67.68; H, 7.23; N, 4.78. 実測値：C, 67.59; H, 7.68; N, 4.94

【００６０】 ^１４Ｃ標識実施例２４−（４−ベンゾイル）−Ｎ−｛４−［４−（４−イソプロピル−２−メトキシ −フェニル）−ピペリジン−１−イル］−ブチル｝−ベンズアミド４−ベンゾイル−（５−フルオロフェニル）−ベンゾエート（３．３）（２８
８ｍｇ、０．７３ｍｍｏｌ）および４−［４−（４−イソプロピル−２−メトキ
シ−フェニル）−ピペリジン−１−イル］−ブチルアミン（３．４）（２４４ｍ
ｇ、０．８ｍｍｏｌ）をクロロホルム（６ｍＬ）に溶解し、５５℃、窒素下で２
時間加温した。次ぎにこの溶液を減圧下で２時間濃縮して反応物中に生じた５−
フルオロフェノールの塊を取り出した。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグ
ラフィー（ジクロロメタン−エタノール（９０：１０）、次ぎにジクロロメタン
−エタノール−アンモニア（１５０：５：０．５）で溶出）により精製した。カ
ラム画分を合した後、それらはそのアンモニウム塩として５−フルオロフェノー
ルを含むことが分かった。この生成物を酢酸エチル（１５０ｍＬ）に溶解し、０
．７５Ｍ水酸化ナトリウム（３×１５ｍＬ）で洗浄した。有機層を乾燥させ（硫
酸ナトリウム）、減圧下で濃縮すると、灰白色固体として標題の化合物（２００
ｍｇ、５３％）が得られた。質量スペクトル：（エレクトロスプレー）ＭＨ^＋５１５ＴＬＣ（Ｍｅｒｃｋ５７１４）：ジクロロメタン−エタノール−アンモニア（１
５０：５：０．５）、Ｒ_ｆ＝０．２¹ H NMR スペクトル: (CDCl₃, 400MHz) 1.2 (d, 6H)、1.7 (m, 8H)、2.1 (br t 2
H)、2.5 (t, 2H)、2.9 (m, 2H)、3.1 (br t, 2H)、3.5 (brq, 2H)、3.8 (s, 3H)
、6.7 (s, 1H)、6.75 (d, 1H)、6.9 (d, 1H)、7.5 (br t, 3H)、7.6 (t, 1H)、7
.7 (d, 2H)、7.85 (d, 2H)、7.95 (d, 2H)。

【００６１】実施例３３−エトキシ−１１−ヒドロキシ−アンドロスト−３，５−ジエン−１７α，１７β−（１，３，６，８−テロラオキサスピロ［４，４］ノナン−４−イル）− ６−メチルジメチルアミン乾燥ＴＨＦ（５０ｍＬ）中、中間体２２（３．３９ｇ、０．００７ｍｏｌ）の
溶液に、ＬｉＡｌＨ_４（Ｅｔ_２Ｏ中１Ｍ溶液、３．４８ｍＬ、０．５当量）を加
え、反応物を室温で１６時間攪拌した。反応物を水でゆっくり処理し、生成物を
ＡｃＯＥｔで抽出した。有機層を水、ブラインで洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥さ
せ、蒸発させた。シリカゲルクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃおよびＭｅＯＨ）
により精製すると、収率１９．５％で固体として標題の化合物（０．６７ｇ、０
．００１４ｍｏｌ）が得られた。融点：９３〜９５℃ C₂₈H₄₃NO₆ (0.8H₂O) についての分析：計算値：C, 66.72; H, 8.92; N, 2.78. 実測値：C, 66.5 ; H, 8.76; N, 2.57

【００６２】生物学的実験法材料ウシ胎児血清およびＣＣＭ−３培地はHycloneから入手し、他の総ての培地お
よび添加物はLife Technologies, Incからのものであった。スーパーコンピテン
トＤＨ５−α細胞、Platinium PfxＤＮＡポリメラーゼ、Gatewayクローニング系
、ｐＤｏｎＲ２０１、ｐＤｅｓｔ１０、コンピテントＤＨ１０ＢａｃＥ．Ｃｏ
ｌｉ細胞、制限酵素およびＴ４リガーゼはLife Technologies, Inc.からのもの
であった。バキュロウイルストランスファーベクターｐＴｅｎ１２はQuantum Bi
otechnologies Inc.からのものであった。Ｔ７タグおよびＨＳＶタグモノクロー
ナル抗体およびＳＴＰ−３in vitro翻訳キットはInvitrogenからのものであった
。ヒトＬＤＬおよびヒトＤｉｌ−ＬＤＬはBiomedical Technologies Inc.からの
ものであった。ＨｅｐＧ２細胞、Ｓｆ−９細胞はAmerican Type Culture Collec
tionからのものであった。ベクターｐＴＫ−ＨＳＶ−ＳＣＡＰ−Ｔ７およびｐＴ
Ｋ−ＨＳＶ−ＢＰ−２はAmerican Type Culture CollectionからそれぞれＥ．Ｃ
ｏｌｉクローン６３３６５および９９５３０として得た。他の試薬は総てSigma
からのものであった。

【００６３】ＳＣＡＰの発現ハムスターＳＣＡＰｃＤＮＡをｐＴＫ−ＨＳＶ−ＳＣＡＰ−Ｔ７から、ＢｇII
IおよびＸｂａｌを用いて切り出し、ｐＴｅｎ１２トランスファーベクターに再
クローニングした。組換えバキュロウイルスクローンはQuantum Biotechnologie
s Inc.により製造され、Ｓｆ−９感染細胞でＴ７タグ抗体を用いるウエスタンブ
ロットによりスクリーニングされたものである。Ｓｆ−９細胞は２８℃にてＣＣ
Ｍ−３培地で増殖させ、７５ｃｍ^２フラスコ当たり８×１０^６細胞を接種した。
４時間後それらに２００×１０^６ｐｆｕのバキュロウイルスを感染させ、３日間
インキュベートした後に回収した。アミノ酸２〜４７３に相当する末端切断型Ｓ
ＣＡＰは、ｐＴＫ−ＨＳＶ−ＳＣＡＰ−Ｔ７を鋳型とし、CCCTGACTGAAAGGCTGCGT
GAGAAが続くａｔｔＢ１およびCATAGCGTGCTGGCCTTCCCACAが続くａｔｔＢ２配列の
相補鎖を含むプライマーを用い、Platinium PfxＤＮＡポリメラーゼによるＰＣ
Ｒ増幅によって作製した。Gatewayクローニング系を用いてｐＤｏｎＲ２０１に
組換えた後、ＬＲリコンビナーゼを用いて挿入配列をｐＤｅｓｔ１０ベクターに
再クローニングした。対応するバクミドおよび組換えバキュロウイルスを製造業
者の説明書に従って作製した。

【００６４】ＳＣＡＰのin vitro翻訳は製造業者の説明書に従い、Ｌ−［^３５Ｓ］−メチオ
ニンとともにｐＴＫ−ＨＳＶ−ＳＣＡＰ−Ｔ７プラスミドおよびＳＴＰ−３キッ
トを用いて行った。

【００６５】ＳＣＡＰ結合の測定アッセイ組換えＳＣＡＰタンパク質を用いる競合結合アッセイはＳｆ−９昆虫細胞にお
いて開発されたものである。全長ハムスターＳＣＡＰをコードする組換えバキュ
ロウイルスを用いてタンパク質を発現させた。あるいは、アミノ酸２〜４７３に
相当する末端切断型ＳＣＡＰをバキュロウイルス系を用いて発現させた。感染Ｓｆ−９細胞を回収し、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、２４
ウェルプレート中、２×１０^５細胞を試験化合物および対照（^１４Ｃ放射性標識
した実施例２）とともに２８℃で３０分間インキュベートした。紫外線照射は６
Ｗ３６５ｎｍＶＬ−６．ＬＰランプ(Vilbert-Lourrnat)を用い、４℃にて１０分
間行った。遠心分離によって細胞をペレットとし、Laemliサンプルバッファーに
溶解した。いくつかの実験では、２０ｋＨｚで２秒間細胞を超音波処理した後に
８０００ｇで１０分間遠心分離することで膜画分を得た。タンパク質１０μｇを
８％アクリルアミドＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、乾燥させた。放射活性はPhospori
magerスクリーン(Molecular Dynamics)を用いて検出した。

【００６６】ＬＤＬ受容体転写の測定アッセイ主要転写部位に対してヌクレオチド−５８８〜＋９１に相当するｐ−５８８と
呼ばれるヒトＬＤＬ受容体プロモーターを、 GAAGATCTCACAAAACAAAAAATATTTTTTTGGCおよび GGCCCCATGGTCGCAGCCTCTGCCCAGGCAGTGTCCプライマーを用い、ヒトゲノムＤＮＡ(Clonetech) からＰＣＲによりクローニングし、ｐＧ
Ｌ３ベーシックベクター(Promega)のＨｉｎｄIIIおよびＮｃｏＩ部位に挿入した
。配列決定は公開されているプロモーター(Genbank L29401)と同一であった。短
いプロモーターはＫｐｎＩおよびＮａｒＩ部位を用いてＰＣＲサブクローニング
によって得た。総ての構築物で、ルシフェラーゼをコードする配列に相当するプ
ライマーCAATTGTTCCAGGAACCAGGをリバースプライマーとして用いた。以下のプラ
イマーを用いてそれぞれｐ−１４９、ｐ−１１８、ｐ−７０、ｐ−５３およびｐ
−３１プロモーターを作製した。 GGGGTACCAATCAGAGCTTCACGGGTTAAAA, GGGGTACCACATCGGCCGTTCGAAACTC, GGGGTACC
TGAAAATCACCCCACTGCAAACT, GGGGTACCAAACTCCTCCCCCTGCTAGAAAおよびGGGGTACCTCA
CATTGAAATGCTGTAAATGA。

【００６７】アデノウイルス主要後期プロモーターの３８ｋｂ最小プロモーターを含むベク
ター(Ham. J. et al., EMBO, 10: 2931-2940 (1991))はｐＧＬ３−ベーシックに
てＢｇｌIIおよびＨｉｎｄIII部位を用いて作製した。ヒトＬＤＬ受容体プロモ
ーターに存在する４反復のＳＲＥ配列は、ＢｇｌII部位、GATCTAAAATCACCCCACTG
CAAAATCACCCCACTGCAおよび相補的オリゴを用いてｐ−ＭＬＰに導入した。

【００６８】２４ウェルプレートのウェル当たり３×１０^５細胞で予め接種しておいたＨｅ
ｐＧ２細胞を、Fugene 6(Boehringer)を用い、ｐ−ＲＬ−ＴＫ対照ベクター(Pro
mega)とともにＬＤＬプロモーター含有ベクター１μｇでトランスフェクトした
。

【００６９】ＨｅｐＧ２細胞をＳＣＡＰアンタゴニストおよび／または２５ＯＨ−コレステ
ロールの存在下で２８時間インキュベートした。ホタル・ルシフェラーゼおよび
ウミシイタケ活性を、デュアル・ルシフェラーゼ・アッセイ・キット(Promega)
およびルミスター(BMG)を用いて測定した。ウミシイタケに対するホタル・ルシ
フェラーゼの比を用い、４反復の平均値とＳＤを算出した。

【００７０】ＳＲＥＢＰ−２のタンパク質分解成熟のウエスタンブロット解析ＳＲＥＢＰ経路の関与は、ヒトＳＲＥＢＰ−２の前駆体および成熟型のウエス
タンブロット免疫検出によって確認した。

【００７１】ＨｅｐＧ２細胞を１５０ｃｍ^２フラスコに８×１０^６細胞で接種し、Ｆｕｇｅ
ｎ６を用い、１０μｇのｐＴＫ−ＨＳＶ−ＢＰ２でトランスフェクトし、２０
時間インキュベートした後に１μＭの実施例１またはビヒクルを添加した。イン
キュベーション１８時間後、Hua, X. et al., J. Biol. Chem. 270: 29433-27 (
1995)によって記載された方法を用い、膜画分および核抽出物を得た。

【００７２】タンパク質（２０μｇ／ロード）を８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ＢＡ８３
ニトロセルロース膜(Schleisher & Schuell)にブロッティングした。ＳＲＥＢＰ
−２のアミノ末端に存在するＨＳＶタグを、１０％脱脂ミルクで飽和させた後に
０．２μｇ／ｍｌの抗ＨＳＶ抗体を用いて検出した。抗マウスペルオキシダーゼ
コンジュゲート(Pierce)とともに２時間インキュベートした後、Supersignalフ
ェムト(Pierce)およびＣＣＤカメラＩＳ４４０ＣＦ(Kodak)でウエスタンブロッ
トを検出した。

【００７３】Ｄｉｌ−ＬＤＬの取り込み測定アッセイＬＤＬ受容体プロモーターの活性化もまた機能的ＬＤＬ受容体の増強に翻訳さ
れたかどうかを調べるため、ＬＤＬの取り込みアッセイを設定した。８ウェルの
バイオコートスライド(Beckton Dickinson)当たり８×１０^４細胞を接種したＨ
ｅｐＧ２細胞をＳＣＡＰアンタゴニストまたは２５ＯＨ−コレステロールで２０
時間処理した後、６μｇ／ｍＬの蛍光Ｄｉｌ−ＬＤＬとともに４時間インキュベ
ートした。リソソームに蓄積された蛍光色素の量はＤＸＣ９５０Ｐビデオカメラ
(Sony)と赤色蛍光フィルターを備えたAxioplan-2 Zeiss顕微鏡を用いる蛍光検鏡
法にて定量した。

【００７４】ハムスターのＳＣＡＰアンタゴニスト処理ＳＣＡＰアンタゴニストのin vivo活性は、従前にコレステロールの豊富な食
餌を与えたゴールデン・シリアンハムスターで測定した。雄シリアン・ゴールデ
ンハムスター(Janvier, France)を１２時間明暗周期で維持した。動物（７週齢
、１５０ｇ）には、０．２％コレステロールおよび１０％ヤシ油を含有する高コ
レステロール食を２週間与えた。次ぎに動物（各群ｎ＝５）に、１日１回、３日
間、ビヒクル（０．５％メチルセルロース、５％Ｔｗｅｅｎ８０）またはビヒク
ル中に１．５もしくは２０ｍｇ／ｋｇの実施例１で経口処理を施した。

【００７５】ハムスター肝臓におけるリアルタイムＰＣＲによるＬＤＬ受容体ｍＲＮＡの定量最後の投与から４時間後、動物を犠牲にし、直ちに肝臓を液体窒素に浸漬した
。製造業者に説明書に従ってＲＮＡｑｏｕｓキット(Ambion)を用いて全ＲＮＡを
抽出した。Ｔａｑｍａｎ逆転写キット(Perkin Elmer)を用いて１μｇのＲＮＡ（
ランダムヘキサマー）からｃＤＮＡを作製した。リアルタイムＰＣＲは、製造業
者に説明書に従い、３００ｎＭのプライマーを含む全量２５μｌにて、Master M
ix SYBRgreenキット(PE Applied Biosytems)を用い、ＡｂｉＰｒｉｓｍ７７０
０(PE Applied Biosytems)にて行った。ハムスターＬＤＬ受容体の発現は以下の
プライマー：AAGACACATGCGACAGGAATGAGおよびGACCCACTTGCTGGCGATACを用いて測
定した。ＴａｑｍａｎリボゾームＲＮＡ（１８Ｓ）制御試薬(Perkin Elmer)を内
部標準遺伝子として用いた。各サンプルを２回定量し、サイクル閾値（Ｃｔ）を
算出した。各動物についてＬＤＬ受容体とリボゾームＲＮＡとのＣｔ値間の差を
算出した。リボゾームＲＮＡ標準に対するＬＤＬ受容体ｍＲＮＡの量を２^−ΔΔ ^Ｃｔとして算出し、任意の単位で示した。

【００７６】ハムスター血清におけるリポタンパク質と脂質の定量最後の投与から４時間後、動物を麻酔し、採血し、遠心分離により血清を調製
した。全コレステロールは酵素アッセイキット(Biomerieux, France)を用いて測
定した。リポタンパク質は単一のＫＢｒ濃縮物（密度１．０６３）を用いて超遠
心分離によって分離した。酵素アッセイキットを用い、上層にあるコレステロー
ルおよびトリグリセリド（ＶＬＤＬ＋ＬＤＬリポタンパク質に相当）および下層
にあるコレステロール（ＨＤＬ画分に相当）を測定した。ＶＬＤＬおよびＬＤＬ
リポタンパク質画分と会合するアポリポタンパク質Ｂ１００は、ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅおよびクーマシールー染色によって分析した。リポタンパク質はまた、オンラ
インコレステロール比色定量を伴う高性能ゲル濾過クロマトグラフィーによって
も分離した。リポタンパク質の分離はｐＨ７．４に調整した１０ｍＭｔｒｉｓ、
１ｍＭＥＤＴＡおよび１５０ｍＭＮａＣｌを含有する溶出バッファーを用い
、単一のｓｕｐｅｒｏｓｅ６ＨＲカラム(Phaemacia)にて行った。コレステロ
ールはＲＴＵ酵素アッセイ(Biomerieux)を用いてオンラインで測定した。カラム
はヒトリポタンパク質を用いて較正し、コレステロールプロフィールの種々のピ
ークを簡便にＶＬＤＬ、ＬＤＬおよびＨＤＬと表した。

【００７７】生物学的結果ＳＣＡＰに対する結合アッセイの証明Ｓｆ−９昆虫細胞に、Ｔ７タグを含む全長ハムスターＳＣＡＰをコードする組
換えバキュロウイルスを感染させた（図１Ａ）。対照細胞（レーンｂ、ｄ）また
は感染細胞（レーンａ、ｃ）からの全タンパク質（１０μｇ）をＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅで分析し、クーマシーブルーで染色するか（レーンａ、ｂ）、またはＴ７タグ
モノクローナル抗体で免疫検出した後にニトロセルロース膜にブロッティングし
た（レーンｃ、ｄ）。感染細胞を５μＭの^１４Ｃ−実施例２の存在下で、２８℃
で３０分間インキュベートした後、１０分間３６５ｎｍの紫外線照射を行った（
レーンｆ〜ｌ）。対照条件（レーンｈ、ｉ）を、^１２Ｃ−実施例２（レーンｆ、
ｇ）で５および１０倍同位元素希釈、または１００、５０、２０μＭの実施例３
が存在する場合（レーンｊ〜ｌ）と比較した。^３５Ｓ−メチオニンを用いるＳＣ
ＡＰのin vitro翻訳をサイズ対照として用いた（レーンｅ）。ゲルを乾燥させ、
Phospor Imagerスクリーンを用いて放射性検出した。

【００７８】図１Ａに示されるように、３６５ｎｍの紫外線照射後、放射性標識光活性実施
例２は特異的にＳＣＡＰ標識された。ステロール様化合物の実施例３の存在下で
は、標識は用量依存的に解離した。このことは、化学的に関連のない２つの化合
物がＳＣＡＰに結合し、同じ部位に対して競合することを明らかに示している。
従って、放射性標識した実施例２との結合競合はＳＣＡＰアンタゴニストのスク
リーニングの基礎として使用できる。Ｓｆ−９細胞に、アミノ酸２〜４７３に相当する末端切断型ＳＣＡＰをコード
する組換えバキュロウイルスを感染させた（図１Ｂ）。５μＭの^１４Ｃ−実施例
でフォトアフィニティー標識した後、上記のようにＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて膜
を分析した。対照条件（レーンｍ）を２００μＭまたは１００μＭの実施例３の
存在下での標識（レーンｎ、ｏ）と比較した。図１Ｂに示されるように、推定ス
テロール感受ドメインを含む末端切断型は実施例３と競合したように、実施例２
により標識することができた。

【００７９】ＳＣＡＰアンタゴニストはＬＤＬ受容体プロモーター活性を誘導するホタル・ルシフェラーゼ・レポーターと連結したヒトＬＤＬ受容体プロモータ
ーを含むベクターを作製した。ＬＤＬ受容体ベクターと対照ｐＲＬ−ＴＫベクタ
ーの混合物を用いてＨｅｐＧ２細胞をトランスフェクトした。細胞を２５ＯＨ−
コレステロール（０．２または１μＭ）単独とともに、あるいは実施例１（１μ
Ｍ）の存在下（黒いバー）もしくは不在下（白いバー）で２８時間インキュベー
トした後、ルシフェラーゼおよびウミシイタケ活性を測定した。ルシフェラーゼ
活性とウミシイタケ活性との比を算出し、３反復の平均値とＳＤを対照％で表し
た。

【００８０】図２に示されたように、２５ＯＨ−コレステロールとのインキュベーションに
よる細胞のコレステロール添加の模倣はＬＤＬ受容体プロモーター活性を抑制す
る。これに対し、実施例１は転写アクチベーターとして作用する。このようにＬ
ＤＬ受容体プロモーター活性は１７倍の範囲で調節できる。実施例１と２５ＯＨ
−コレステロールとの同時処理は、実施例１がＳＣＡＰに対する２５ＯＨ−コレ
ステロールの作用と少なくとも部分的に拮抗し、前駆体ステロールの存在下でも
ＬＤＬ受容体プロモーターを活性化し得ることを明らかに示している。従ってＳ
ＣＡＰアンタゴニストはＬＤＬ受容体の生理学的調節を無効にするのではなく、
むしろ平衡をより高い活性化状態にする。

【００８１】ＬＤＬ受容体プロモーターに対するＳＣＡＰアンタゴニストの作用はＳＲＥにより媒介される同じレポーターベクターのＬＤＬ受容体プロモーターを短縮すると、相対的ル
シフェラーゼ活性が変更される（図３Ａ）。ＨｅｐＧ２トランスフェクト細胞へ
の実施例１の添加（１μＭ）はＳＲＥ配列を有するベクターに対してのみ発現を
誘導する（図３Ｂ、左）。２５ＯＨ−コレステロールによる抑制が測定される場
合には、ＳＲＥおよびＦＰ−１の２つの配列が含まれる（図３Ｂ、右）。３８ｂ
ｐのアデノウイルス主要後期プロモーター（ｐ−ＭＬＰ）を含む最小プロモータ
ーを持つベクターは実施例１（１μＭ）に応答できないが、一方、４コピーのＳ
ＲＥが導入されるとこのＳＣＡＰアンタゴニストに対する応答性を付与するに十
分である（図３Ｃ）。

【００８２】ＳＣＡＰアンタゴニストはＳＲＥＢＰ−２のタンパク質分解成熟を増強するＨｅｐＧ２細胞を、ＨＳＶタグの前にヒトＳＲＥＢＰ−２をコードするｐＴＫ
−ＨＳＶ−ＢＰ２ベクターでトランスフェクトし（図４、レーンｂ〜ｅ）、ある
いはトランスフェクトしなかった（図４、レーンａ）。細胞を実施例１（１μＭ
）（レーンｃ、ｄ）またはビヒクル（レーンａ、ｂ、ｃ）で１８時間処理し、核
抽出物（レーンｄ、ｅ）および膜（レーンａ〜ｃ）を単離し、抗ＨＳＶ抗体を用
いてウエスタンブロッティングにより分析した。図４に示されたように、実施例
１は膜に存在するＳＲＥＢＰ−２前駆体型の量を減少させる（レーンｃ対ｂ）。
同時に、実施例１は核の成熟ＳＲＥＢＰ−２の量を著しく高める（レーンｄ対ｅ
）。グレーのスケールは核抽出物では成熟型を見やすくするために調節してある
が（３０倍）、実施例１はＳＲＥＢＰ−２のタンパク質分解成熟を増強すること
を示している。

【００８３】ＬＤＬの取り込みはＳＣＡＰアンタゴニストによって刺激されるＨｅｐＧ２細胞を０．５μＭ実施例１または１０μＭ２５ＯＨ−コレステロー
ルの存在下で２４時間処理した。Ｄｉｌ−ＬＤＬ（６μｇ／ｍｌ）はインキュベ
ーション終了の４時間前に添加した。細胞を洗浄し、ローダミンフィルターおよ
び固定ビデオカメラを用い、蛍光検鏡法にて観察した。図５に示されたように、実施例１はＨｅｐＧ２細胞によるＬＤＬの取り込みを
著しく高めたが、２５ＯＨ−コレステロールはこれを低下させた。このことは実
施例１がＬＤＬ受容体発現を高めることにより、ＬＤＬ受容体の機能、すなわち
ＬＤＬの取り込みを刺激することができたことを明らかに証明する。

【００８４】ＳＣＡＰアンタゴニストは脂肪を与えたハムスターの肝臓でＬＤＬ受容体ｍＲＮＡを増強するコレステロールを与えたハムスターを実施例１（５ｍｇ／ｋｇ）またはビヒク
ルで３日間処理した。肝臓のＬＤＬ受容体ｍＲＮＡは、リボゾーム１８ＳＲＮ
Ａを内部標準として用い、リアルタイムＰＣＲによって定量した。図６に示され
たように、実施例１で処理した動物（黒いバー）は対照動物（グレーのバー）と
比べてＬＤＬ受容体のｍＲＮＡを増加させた。このことはＳＣＡＰアンタゴニス
トがコレステロールの取り込みが高いにもかかわずin vivoでＬＤＬ受容体の発
現を増強することを証明する。

【００８５】ＳＣＡＰアンタゴニストは脂肪を与えたハムスターでＬＤＬ−コレステロール、トリグリセリドおよびＡｐｏ−Ｂ１００レベルを低下させるコレステロールを与えた動物を１および２０ｍｇ／ｋｇの実施例１で３日間処
理した。表１に示されたように、実施例１はＬＤＬ−コレステロールおよびトリ
グリセリド双方をそれぞれ１ｍｇ／ｋｇでは５０％および６３％まで、２０ｍｇ
／ｋｇでは８３％および７６％まで低下させる。アポリポタンパク質Ｂ１００も
また同程度まで低下するが、ＨＤＬ−コレステロールは影響を受けない。別の実
験では、リポタンパク質はゲル濾過で分離し、コレステロール含量はオンライン
で定量した。図７に示されたように、実施例１は５ｍｇ／ｍｌでアテローム発生
粒子を著しく低下させた：ＶＬＤＬ−コレステロールの７９％低下、およびＬＤ
Ｌ−コレステロールの６０％低下。対照的に、保護ＨＤＬ粒子に含まれるコレス
テロールは若干増加した（２５％）。このことはコレステロールの作用に拮抗す
る実施例１が、食餌によって与えられた過剰なコレステロールが存在していても
ＬＤＬ受容体発現を著しくアップレギュレートし、そうすることで極めて好まし
いリポタンパク質プロフィールを誘導することができたことを示す。

【００８６】

【表１】

【００８７】錠剤組成以下の組成物ＡおよびＢは成分（ａ）〜（ｃ）また（ａ）〜（ｄ）をポビドン
溶液とともに湿式造粒した後、ステアリン酸マグネシウムを添加して打錠するこ
とにより製造することができる。

【００８８】組成物Ａｍｇ／錠剤ｍｇ／錠剤（ａ）有効成分２５０２５０（ｂ）ラクトースＢ．Ｐ．２１０２６（ｃ）グリコール酸ナトリウムデンプン２０１２（ｄ）ポビドンＢ．Ｐ．１５９（ｅ）ステアリン酸マグネシウム５３５００３００

【００８９】組成物Ｂｍｇ／錠剤ｍｇ／錠剤（ａ）有効成分２５０２５０（ｂ）ラクトース１５０ − （ｃ）アビセルＰＨ１０１６０２６（ｄ）グリコール酸ナトリウムデンプン２０１２（ｅ）ポビドンＢ．Ｐ．１５９（ｆ）ステアリン酸マグネシウム５３５００３００

【００９０】組成物Ｃｍｇ／錠剤有効成分１００ラクトース２００デンプン５０ポビドン５ステアリン酸マグネシウム４３５９

【００９１】以下の組成物ＤおよびＥは混合した成分を直接打錠することによって製造する
ことができる。組成物Ｅに用いるラクトースは直接打錠型のものである。

【００９２】組成物Ｄｍｇ／錠剤有効成分２５０ステアリン酸マグネシウム４アルファーデンプンＮＦ１５１４６４００

【００９３】組成物Ｅｍｇ／錠剤有効成分２５０ステアリン酸マグネシウム５ラクトース１４５アビセル１００５００

【００９４】組成物Ｆ（徐放性組成物）ｍｇ／錠剤（ａ）有効成分５００（ｂ）ヒドロキシプロピルメチルセルロース１１２（メトセルＫ４Ｍプレミアム）（ｃ）ラクトースＢ．Ｐ．５３（ｄ）ポビドンＢ．Ｐ．Ｃ．２８（ｅ）ステアリン酸マグネシウム７７００

【００９５】この組成物は成分（ａ）〜（ｃ）をポビドン溶液とともに湿式造粒した後、ス
テアリン酸マグネシウムを加え、さらに打錠することによって製造することがで
きる。

【００９６】組成物Ｇ（腸溶コーティング錠剤）組成物Ｃの腸溶コーティング錠剤は、セルロースアセテートフタレート、ポリ
ビニルアセテートフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート
、またはメタクリル酸およびメタクリル酸メチルエステルの陰イオンポリマー（
ＥｕｄｒａｇｉｔＬ）などの腸溶ポリマー２５ｍｇ／錠剤で錠剤をコーティン
グすることで製造することができる。ＥｕｄｒａｇｉｔＬの他、これらのポリ
マーはまた１０％（用いるポリマー量の重量に対して）の可塑剤を配合して、適
用中、あるいは保存中の膜のクラッキングを防ぐべきである。好適な可塑剤とし
ては、フタル酸ジエチル、クエン酸トリブチルおよびトリアセチンが挙げられる
。

【００９７】組成物Ｈ（腸溶コーティング徐放性錠剤）組成物Ｆの腸溶コーティング錠剤は、セルロースアセテートフタレート、ポリ
ビニルアセテートフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート
、またはメタクリル酸およびメタクリル酸メチルエステルの陰イオンポリマー（
ＥｕｄｒａｇｉｔＬ）などの腸溶ポリマー５０ｍｇ／錠剤で錠剤をコーティン
グすることで製造することができる。ＥｕｄｒａｇｉｔＬの他、これらのポリ
マーはまた１０％（用いるポリマー量の重量に対して）の可塑剤を配合して、適
用中、あるいは保存中の膜のクラッキングを防ぐべきである。好適な可塑剤とし
ては、フタル酸ジエチル、クエン酸トリブチルおよびトリアセチンが挙げられる
。

【００９８】（ii）カプセル組成物組成物Ａカプセル剤は上記の組成物Ｄの成分を混合し、得られた混合物を２ツ割硬カプ
セルに充填することによって製造することができる。組成物Ｂ（上記）も同様に
して製造できる。

【００９９】組成物Ｂｍｇ／カプセル（ａ）有効成分２５０（ｂ）ラクトースＢ．Ｐ．１４３（ｃ）グリコール酸ナトリウムデンプン２５（ｄ）ステアリン酸マグネシウム２４２０

【０１００】組成物Ｃｍｇ／カプセル（ａ）有効成分２５０（ｂ）マクロゴール４０００ＢＰ３５０６００

【０１０１】カプセル剤はマクロゴール４０００ＢＰを融解し、有効成分を融解物に分散さ
せ、それらを２ツ割硬カプセルに充填することによって製造することができる。

【０１０２】組成物Ｄｍｇ／カプセル有効成分２５０レシチン１００落花生油１００４５０

【０１０３】カプセル剤は有効成分をレシチンおよび落花生油に分散させ、分散物を弾性軟
カプセルに充填することによって製造することができる。

【０１０４】組成物Ｅ（徐放性カプセル剤）ｍｇ／カプセル（ａ）有効成分２５０（ｂ）マイクロクリスタリンセルロース１２５（ｃ）ラクトースＢＰ１２５（ｄ）エチルセルロース１３５１３

【０１０５】徐放性カプセル組成物は成分（ａ）〜（ｃ）を押出成形機を用いて押出成形し
た後、押出品を球形化し乾燥することによって製造することができる。この乾燥
ペレットを徐放性膜（ｄ）でコーティングし、２ツ割硬カプセルに充填する。

【０１０６】組成物Ｆ（腸溶カプセル剤）ｍｇ／カプセル（ａ）有効成分２５０（ｂ）マイクロクリスタリンセルロース１２５（ｃ）ラクトースＢＰ１２５（ｄ）セルロールアセテートフタレート５０（ｅ）フタル酸ジエチル５５５５

【０１０７】腸溶カプセル組成物は成分（ａ）〜（ｃ）を押出成形機を用いて押出成形した
後、押出品を球形化し乾燥することによって製造することができる。この乾燥ペ
レットを可塑剤（ｅ）を含む腸溶膜（ｄ）でコーティングし、２ツ割硬カプセル
に充填する。

【０１０８】組成物Ｇ（腸溶コーティング徐放性カプセル剤）組成物Ｅの腸溶コーティングカプセル剤は、セルロースアセテートフタレート
、ポリビニルアセテートフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタ
レート、またはメタクリル酸およびメタクリル酸メチルエステルの陰イオンポリ
マー（ＥｕｄｒａｇｉｔＬ）などの腸溶ポリマー５０ｍｇ／カプセルで徐放性
ペレットをコーティングすることで製造することができる。Ｅｕｄｒａｇｉｔ
Ｌの他、これらのポリマーはまた１０％（用いるポリマー量の重量に対して）の
可塑剤を配合して、適用中、あるいは保存中の膜のクラッキングを防ぐべきであ
る。好適な可塑剤としては、フタル酸ジエチル、クエン酸トリブチルおよびトリ
アセチンが挙げられる。

【０１０９】（iii）静脈注射組成物有効成分０．２００ｇ滅菌パイロジェンフリーリン酸バッファー（ｐＨ９．０）１０ｍｌまで有効成分を３５〜４０℃のリン酸バッファーの大部分に溶解し、一定量にし、
滅菌微孔質フィルターを通して１０ｍｌの滅菌ガラスバイアル（１型）中へ濾過
し、滅菌クロージャーおよびオーバーシールで密閉する。

【０１１０】（iv）筋肉注射組成物有効成分０．２０ｇベンジルアルコール０．１０ｇグルコフロール７５１．４５ｇ注射水３．００ｍｌまで適量

【０１１１】有効成分をグリコフロールに溶解する。次いで、ベンジルアルコールを加えて
溶解し、水を加えて３ｍｌとする。次ぎに、混合物を滅菌微孔質フィルターを通
して濾過し、３ｍｌの滅菌ガラスバイアル（１型）に密閉する。

【０１１２】（ｖ）シロップ組成物有効成分０．２５ｇソルビトール溶液１．５０ｇグリセロール１．００ｇ安息香酸ナトリウム０．００５ｇ香料０．０１２５ｍｌ精製水５．０ｍｌまで適量

【０１１３】精製水の一部に安息香酸ナトリウムを溶解し、ソルビトール溶液を加える。有
効成分を加えて溶解する。得られた溶液にグリセロールを混合した後、精製水で
必要な容量にする。

【０１１４】（vi）坐剤組成物ｍｇ／坐剤有効成分２５０ハードファット、ＢＰ (Witepsol H15-Dynamit Nobel) １７７０２０２０

【０１１５】ＷｉｔｅｐｓｏｌＨ１５の１／５を最高４５℃にて蒸気ジャケット付きパン
で融解する。有効成分を２００μｍ篩を通して篩い分け、滑らかな分散系が得ら
れるまで、カッティングヘッドを取り付けたＳｉｌｖｅｒｓｏｎを用いて混合し
ながら融解した基剤に加えた。この混合物を４５℃で維持し、懸濁液に残りのＷ
ｉｔｅｐｓｏｌＨ１５を加え、攪拌して確実に均質な混合物とする。次ぎに全
懸濁液を２５０ｌｍステンレス鋼製の篩を通し、連続攪拌しながら４５℃まで放
冷する。３８℃〜４０℃の温度で２．０２ｇの混合物アリコートを好適なプラス
チック鋳型に充填し、坐剤を室温まで放冷する。

【０１１６】（vii）ペッサリー組成物ｍｇ／ペッサリー有効成分２５０無水デキストロース３８０ジャガイモデンプン３６３ステアリン酸マグネシウム７１０００

【０１１７】上記成分を直接混合し、得られた混合物を圧縮することでペッサリーを製造す
る。

【０１１８】（viii）経皮組成物有効成分２００ｍｇアルコールＵＳＰ０．１ｍｌヒドロキシエチルセルロース有効成分およびアルコールＵＳＰをヒドロキシエチルセルロースでゲル化し、
表面積が１０ｃｍ^２の経皮ディバイスにパックする。

【図面の簡単な説明】

【図１】ＳＣＡＰのフォト・アフィニティー標識を示す。

【図２】ＬＤＬ受容体プロモーターの活性化およびＳＣＡＰアンタゴニストの２５ＯＨ
−コレステロールとの競合を示す。

【図３】ＬＤＬ受容体プロモーターに存在するＳＲＥがＳＣＡＰアンタゴニストの作用
を担うことを示す。

【図４】ＨｅｐＧ２細胞においてＳＣＡＰアンタゴニストがＳＲＥＢＰ−２のタンパク
質分解成熟を誘導することを示す。

【図５】ＨｅｐＧ２細胞によるＤｉｌ−ＬＤＬの取り込みを示す。

【図６】脂肪を与えたハムスターの肝臓においてＳＣＡＰアンタゴニストがＬＤＬ受容
体のｍＲＮＡを増加させることを示す。

【図７】脂肪を与えたハムスターにおいてＳＣＡＰアンタゴニストが循環ＬＤＬおよび
ＶＬＤＬと会合したコレステロールを低下させることを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 3/10 Ａ６１Ｐ 3/10 9/10 １０１ 9/10 １０１ 43/00 １１１ 43/00 １１１Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ // Ｃ０７Ｄ 211/22 Ｃ０７Ｄ 211/22 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ティエリー、アンドレ、レジ、グラン‐ペレフランス国レ、ジュリ、アブニュ、ド、ケベック、25、ゾーヌ、アンデュストリエル、ド、クルタブフ、サントル、ド、ルシェルシュ、ラボラトワール、グラクソスミスクライン内 (72)発明者マルク、イサンドゥフランス国レ、ジュリ、アブニュ、ド、ケベック、25、ゾーヌ、アンデュストリエル、ド、クルタブフ、サントル、ド、ルシェルシュ、ラボラトワール、グラクソスミスクライン内Ｆターム(参考） 2G045 AA40 BB05 BB14 BB24 BB48 BB50 CB01 DA62 FA16 FB03 FB08 FB12 4B063 QA01 QA08 QA18 QQ05 QQ13 QQ20 QR07 QR33 QR60 QR74 QR80 QS05 QS36 QX02 4C054 AA02 CC03 DD05 DD12 EE01 FF04 FF08 4C084 AA17 MA17 MA31 MA32 MA35 MA37 MA52 MA56 MA63 MA66 NA14 ZA452 ZC332 ZC352 ZC422

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ＬＤＬ−コレステロールおよび／またはトリグリセリドの循環レベルの上昇に
関連する疾病に対抗するのに用いる、ＳＣＡＰ／ＳＲＥＢＰ経路の活性化を促進
することによってコレステロールおよびその代謝物に対する逆の効果を有するよ
うにＳＣＡＰと結合する薬剤（ＳＣＡＰアンタゴニスト）をスクリーニングする
方法であって、試験ＳＣＡＰアンタゴニストと対照ＳＣＡＰアンタゴニスト間、
または試験ＳＣＡＰアンタゴニストとコレステロールもしくはその代謝物間のＳ
ＣＡＰに対する転写活性または結合競合の程度または結果を検出またはアッセイ
することを含んでなる、方法。
【請求項２】試験ＳＣＡＰアンタゴニストの存在下におけるＳＣＡＰと標識対照ＳＣＡＰア
ンタゴニスト間の結合を、該試験ＳＣＡＰアンタゴニストの不在下のものと比較
する結合アッセイを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】試験ＳＣＡＰアンタゴニストの存在下でＳＲＥＢＰ経路の活性化の程度を測定
し、次いでＳＣＡＰと結合したコレステロールの作用に拮抗することによって前
記効果が媒介されることを、試験ＳＣＡＰアンタゴニストの存在下におけるＳＣ
ＡＰと標識対照ＳＣＡＰアンタゴニスト間の結合を、該試験ＳＣＡＰアンタゴニ
ストの不在下のものと比較することによって確認する機能アッセイを含む、請求
項１に記載の方法。
【請求項４】機能アッセイがＨｅｐＧ２細胞におけるＬＤＬ−リポータープロモーターの転
写活性程度の測定を含んでなる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法によって同定されたＳＣＡＰアンタ
ゴニスト、またはその生理学上許容される塩、溶媒和物もしくは誘導体。
【請求項６】医療における請求項５に記載の化合物、またはその生理学上許容される塩、溶
媒和物もしくは誘導体の使用。
【請求項７】請求項５に記載の化合物、またはその生理学上許容される塩、溶媒和物もしく
は誘導体を、１以上の医薬上許容される医薬上許容される担体とともに含んでな
る医薬組成物。
【請求項８】ＬＤＬ−コレステロールおよび／またはトリグリセリドの循環レベルの上昇に
起因する症状の治療に用いられる薬剤の製造における、ＳＣＡＰアンタゴニスト
またはその生理学上許容される塩、溶媒和物もしくは誘導体の使用。
【請求項９】症状がアテローム性動脈硬化症、膵炎、非インスリン性真性糖尿病（ＮＩＤＤ
Ｍ）、冠動脈性心疾患、および肥満症から選択される、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】症状が高脂血症、脂肪過剰血症、高リポタンパク血症、高コレステロール血症
および／または高血糖症から選択される、請求項８に記載の使用。
【請求項１１】症状が高コレステロール血症および混合型異脂肪症（mixed dyslipidemia）か
ら選択される、請求項８に記載の使用。
【請求項１２】ＬＤＬ−コレステロールおよび／またはトリグリセリドの循環レベルの上昇に
起因する症状のヒトを含む哺乳類の治療方法であって、有効量のＳＣＡＰアンタ
ゴニストまたはその生理学上許容される塩、溶媒和物もしくは誘導体の投与を含
んでなる、方法。
【請求項１３】症状がアテローム性動脈硬化症、膵炎、非インスリン性真性糖尿病（ＮＩＤＤ
Ｍ）、冠動脈性心疾患および肥満症から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】ＬＤＬ−コレステロールおよび／またはトリグリセリドの循環レベルの上昇に
起因する症状の治療に有用な化合物を同定する方法であって、化合物がＳＣＡＰ
と直接相互作用するかどうかを決定する工程を含んでなる、方法。
【請求項１５】ＬＤＬ−コレステロールおよび／またはトリグリセリドの循環レベルの上昇に
起因する症状の治療方法であって、上記の方法によって同定され得る化合物の投
与を含んでなる、方法。