JP2003503047A - 後成的遺伝子サイレンシングに関係する遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、遺伝子サイレンシングに関係するタンパク質をコードするＤＮＡに関する。少なくとも１５０アミノ酸残基の構成配列を含み、配列番号３のアラインメントした構成配列に４０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を特徴とするタンパク質をコードする関連する遺伝子は、種々の起源、例えば、哺乳動物または植物細胞から単離することができる。本発明のＤＮＡを単離する方法も記載する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本発明は、遺伝子サイレンシング、特に植物遺伝子のサイレンシングを制御す
るタンパク質をコードしているDNAに関する。 植物の以前、活性のあった遺伝子の発現の喪失は、遺伝子サイレンシングとも
称されるが、発達、環境または未知のシグナルに応答して観察される。それは突
然変異よりも高い頻度で起こるが、体細胞伝達の間には顕著に安定である。遺伝
子サイレンシングは、最初は導入遺伝子発現の不安定さの望ましくない原因とし
て観察されたが、現在は遺伝子発現を意図的に調節するための分子的手段として
みなされている。

【０００２】 影響を受ける遺伝子座のクロモソーム位置または構造は、サイレンシングの頻
度および強度を決定する要因であるようである。不活性化は、複数コピー存在す
る遺伝子に優先的に影響を及ぼすようであり、配列重複の結果であると考えられ
る。相同性依存性遺伝子サイレンシングの多くの例が報告されている。詳しい分
析によって、影響を受けた遺伝子座の相対的な位置(シス、トランス、対立遺伝
子性、異所性)、影響を受けた遺伝子の起源（内生的またはトランスジェニック
）、および相互作用のレベル(転写的または転写後)によって、サイレンシング事
象が分類された。転写後サイレンシングは主に異常なRNA分子の形成に関係する
ようであり、しばしば、しかし常にではないがDNAメチル化をともない、転写開
始を干渉するサイレンシングは、DNAの過剰メチル化とより緊密に関連し、サイ
レント遺伝子座においてクロマチン構造の変化を有する可能性がある。しかし、
これらの分子的事象が遺伝子サイレンシングまたはその結果のサイレンシング状
態に必須であるか否かは明確ではない。

【０００３】 転写的なサイレンシングの場合、サイレンシングされた遺伝子の不活性状態は
、有糸分裂または減数分裂によって安定的に伝達される。他の生物におけるよう
に、トランス作用モディファイアー遺伝子座（trans-acting modifier loci）は
サイレンシングされた遺伝子の不活性状態が安定的であるのに不可欠であると考
えられる。突然変異したタンパク質をもたらすそのような遺伝子座の突然変異は
、遺伝子サイレンシングの減少および先にサイレンシングされた遺伝子座の再活
性化をもたらすことが期待され、それはサイレント状態の維持を干渉することに
より、または配列重複を認識しないことによる。Arabidopsis thalianaのDDM1遺
伝子の突然変異が転写的な遺伝子サイレンシングを解除し、この遺伝子はＳＷＩ
２／ＳＮＦ２に類似するタンパク質をコードし、これはクロマチン再モデル化に
関係することが報告された。しかし、ＤＤＭ１遺伝子の突然変異は非常に多面発
現性の効果を生ずる。したがって、遺伝子工学の使用をもたらすそのような効果
を修飾することを可能とするために、さらなる特異的モディファイアー遺伝子座
を同定し、対応する野生型および突然変異体タンパク質を特性把握することが必
要である。そのようなタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを
含むＤＮＡを提供することが本発明の主な目的である。

【０００４】 本発明のトランス作用モディファイアー遺伝子座は、遺伝的に不活性化され、
メチル化されたハイグロマイシン抵抗性遺伝子を有するアラビドプシス系統につ
いて実施例１に記載したように、Ｔ−ＤＮＡ挿入突然変異誘発によって同定する
ことができる。サイレンシングモディファイアー遺伝子座の突然変異は、ハイグ
ロマイシン抵抗性遺伝子のサイレンシングを解除し、ハイグロマイシン抵抗性を
復帰させる。サイレントな抵抗性遺伝子についてホモ接合である植物を、ハイグ
ロマイシン抵抗性遺伝子と異なる選択マーカー遺伝子であって、Ｔ−ＤＮＡ １
’−２’デュアルプロモーター(dual promoter)の制御下のもので形質転換させ
る。形質転換体を選抜し、その後代をハイグロマイシン抵抗性についてスクリー
ニングする。突然変異体表現型(ハイグロマイシン抵抗性)を特異的Ｔ−ＤＮＡ挿
入との遺伝的共分離（co-segregation）についてスクリーニングする。組変えＤ
ＮＡ技術のルーチンな方法を使用して、標識された遺伝子のクローニングによっ
て、サイレンシングモディファイアー遺伝子座の突然変異体および野生型ＤＮＡ
配列、並びにコードされたタンパク質の特性把握が可能である。

【０００５】 本発明に関する限り、「遺伝子」は、調節配列に関連する配列をコードするＤＮ
Ａをいう(それによってコード配列の、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、
ｔＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、センスＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡへの転写をもた
らす)。調節配列の例は、プロモーター配列、５’および３’非翻訳配列、イン
トロン、およびターミネーション配列である。 「プロモーター」は関連するＤＮＡ配列の転写を開始させるＤＮＡ配列をいい、
遺伝子発現のレギュレーター、例えば、アクチベーター、エンハンサー、または
リプレッサーとして作用するエレメントをも含み得る。 遺伝子の「発現」は、生存細胞内でのＲＮＡへのその転写またはその転写および
その後タンパク質への翻訳をいう。アンチセンス構築物の場合、発現はアンチセ
ンスＤＮＡの転写のみをいう。 細胞の「形質転換」の語は、宿主細胞への核酸の導入をいい、特に、ＤＮＡ分
子の当該細胞のゲノムへの安定的な組みこみをいう。 特定のヌクレオチドまたはアミノ酸配列の任意の部分または断片は「構成配列(
component sequence)」という。

【０００６】 本発明のＤＮＡは、少なくとも１５０アミノ酸残基の構成配列を含み、配列番
号３と４０％またはそれより多い同一性を有するアミノ酸配列を特徴とするタン
パク質をコードするオープンリーディングフレームを含む。特に、このオープン
リーディングフレームによってコードされるタンパク質は式Ｒ_１−Ｒ_２−Ｒ_３に
よって記載できる。 ここで、Ｒ_１、Ｒ_２およびＲ_３は構成配列を構成し、アミノ酸残基Ｇｌｙ、Ａ
ｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｍ
ｅｔ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、お
よびＨｉｓの群より独立的に選択されるアミノ酸残基からなる。 Ｒ_１およびＲ_３は、独立的に０ないし３０００アミノ酸残基からなる。 Ｒ_２は少なくとも１５０アミノ酸残基からなる。 Ｒ_２は配列番号３のアラインメントした構成配列(aligned component sequenc
e)に少なくとも４０％同一である。

【０００７】 殆どの場合、このタンパク質の全長は、１０００ないし３０００の範囲のアミ
ノ酸残基である。本発明の好ましい実施態様では、構成配列Ｒ_２は少なくとも２
００アミノ酸残基からなる。構成配列Ｒ_２の特定の例は、配列番号３の構成配列
であり、以下の範囲のアミノ酸によって表される。 １−４１６(エキソン２に対応) ４１８−５８３(エキソン３ないし５に対応） ５８４−８９０(エキソン６に対応） ８９２−１４７２(エキソン７ないし９に対応） １００７−１４７２(エキソン９に対応） １４７３−１６３１（エキソン１０ないし１２に対応） １６３２−１８２７(エキソン１３ないし１５に対応)および １８２９−２００１(エキソン１６に対応）

【０００８】 本発明の好ましい実施態様では、少なくとも１個の構成配列Ｒ_１またはＲ_３は
１以上のさらなる構成配列を含み、少なくとも５０アミノ酸の長さであり、配列
番号３のアラインメントした構成配列に少なくとも６０％同一である。そのよう
なさらなる構成配列の特定の例は、配列番号３の構成配列であり、以下の範囲の
アミノ酸によって表される。 ４２０−５２５（エキソン３および４２対応) ４４４−５２５（エキソン４に対応） ５２６−５８３（エキソン５に対応） ８９２−９７１（エキソン７に対応） ８９２−１００６（エキソン７および８に対応） １４７３−１５２４（エキソン１０に対応） １５２５−１５７６（エキソン１１に対応） １５７７−１６３１（エキソン１２に対応） １６３２−１６９０（エキソン１３に対応） １６９２−１７５７（エキソン１４に対応）および １７５８−１８２７（エキソン１５に対応）

【０００９】 本発明のＤＮＡの特に好ましい実施態様は、配列番号３のアミノ酸４７８−４
９０、５８４−６００、６１７−６３０、６５４−６６８、６７６−６９０、７
１８−７３４、７７６−７８８、１２２２−１２３３、１７３８−１７４９また
は１７６１−１７７０によって定義される構成配列を有するタンパク質をコード
する。好ましくは、コードされたタンパク質は、当該構成配列の好ましくはコー
ドされたタンパク質は少なくとも、２、３個、またはより多い異なる典型物(rep
resentative)を含む。当該実施態様の特定の例は、配列番号３のアミノ酸配列を
特徴とするタンパク質をコードし、対立遺伝子アミノ酸配列は、配列番号３の７
０５位のアミノ酸残基ＭのかわりにＫ、または配列番号３の１２１９位のアミノ
酸残基ＥのかわりにＤを有する。

【００１０】 ダイナミックプログラミングアルゴリズムは種々の種類のアラインメントをも
たらす。一般に配列アラインメントへの２つのアプローチがある。Needleman &
WunschによっておよびSellersによって提示されたアルゴリズムは、２つの配列
の全長をアラインメントし、配列の全体のアラインメントを提供する。一方、Sm
ith-Watermanアルゴリズムは、遺伝子座アラインメントをもたらす。スコアリン
グマトリクスおよびギャップペナルティーの選択に基づいて、ローカルアライン
メントは、最も類似する配列内の領域の組をアラインメントする。これによって
、配列の最も高度に保存された領域に焦点をおいたデータベースサーチが可能で
ある。配列内の類似するドメインを同定することも可能となる。Smith-Waterman
アルゴリズムを使用するアルゴリズムをスピードアップするために、ＢＬＡＳＴ
(Basic Local Alignment Search Tool)およびＦＡＳＴＡの両者はアラインメン
トにさらなる制限をもたらす。

【００１１】 本発明において、アラインメントは通常はＢＬＡＳＴ、すなわち対象がタンパ
ク質であるかＤＮＡであるか問わずにすべての利用可能な配列データベースを探
索するよう設計された類似性サーチプログラムのセットを使用して実施される。
このサーチツールのバージョンＢＬＡＳＴ２．０(Gapped BLAST)はインターネッ
ト上で(currently http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)公衆に利用可能である
。それは帰納的アルゴリズムを使用し、全体的アラインメントとは対象的なな部
分を検索し、したがって単離された領域のみを共有する配列間の関連性を検出す
ることができる。ＢＬＡＳＴサーチにおいて割り当てられるスコアーはよく特定
された統計的解釈を有する。本発明の範囲で特に有用なのは、ローカル配列アラ
インメントにギャップを導入することのできるblastpプログラムおよびＰＳＩ−
ＢＬＡＳＴプログラムであり、両方のプログラムは、タンパク質配列データーベ
ースに対して、アミノ酸対象配列を比較し、blastpバリアントプログラムは、２
つの配列のローカルアラインメントのみ可能である。当該プログラムは好ましく
はデフォルト値にセットされた任意のパラメーターで稼動される。

【００１２】 ＢＬＡＳＴを使用する配列アラインメントは、あるアミノ酸の他のものとの置
換が、そのタンパク質の構造および機能を維持するために必要である物理的およ
び化学的特性を保存すると考えられるか、あるいはタンパク質の本質的な構造お
よび機能的特性を崩壊させると考えられるかを考慮に入れることもできる。その
ような配列類似性は、同一のアミノ酸のパーセンテージに対して「ポジティブ」
アミノ酸のパーセンテージを比較することによって定量され、ボーダーラインの
ケースであるタンパク質を正確なタンパク質ファミリーに割り当てる助けとする
ことができる。

【００１３】 そのようなコンピュータープログラムを使用する配列アラインメントによって
、ＡＴＰ／ＧＴＰ−結合モチーフＡ（配列番号３のアミノ酸４６０〜４６７）、
すなわち、（Ａｌａ／Ｇｌｙ）ＸａａＸａａＸａａＸａａＧｌｙＬｙｓ（Ｓｅｒ
／Ｔｈｒ）というコンセンサス配列の存在が明らかとなり、ここで（Ａｌａ／Ｇ
ｌｙ）はＡｌａまたはＧｌｙであり、Ｘａａは任意の天然に存在するアミノ酸で
あり、そして（Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）はＳｅｒまたはＴｈｒである。アラインメント
によって、さらに、領域（配列番号３のアミノ酸位置４７９〜７１９）、すなわ
ちＳＷＩ２／ＳＮＦ２ファミリーのタンパク質のＡＴＰアーゼ／ヘリカーゼドメ
インの一部に類似するものも明らかとなり、それはクロマチン再モデリングに関
係するが、既知のタンパク質と有意な全体的配列同一性はない。

【００１４】 本発明のＤＮＡの特定の例は、配列番号１及び配列番号２に記載され、配列番
号３のアラビドプシスタンパク質をコードしている。５０〜５００アミノ酸長を
有する配列番号３のストレッチは、アラインメントにより既知のタンパク質配列
のストレッチと２０〜５０％配列同一性を示すことができる。しかし、配列番号
３のアラインメント全体は３０％より低い配列同一性という結果である。したが
って、本発明は新規なタンパク質ファミリーであって、そのメンバーは配列番号
３のアラインメントした構成配列と４０％またはそれ以上の同一性を有し、少な
くとも１５０アミノ酸残基の構成配列を含むアミノ酸配列によって特徴付けられ
るタンパク質ファミリーを定義する。好ましくは、このアミノ酸配列同一性は、
５０％より高いか、５５％よりも高い。

【００１５】 本発明のこの新規タンパク質ファミリーに属するタンパク質をコードするＤＮ
Ａを、単子葉植物及び双子葉植物から単離することができる。好ましいソースは
トウモロコシ、シュガービート、ヒマワリ、ナタネ（winter oilseed rape）、
ダイズ、ワタ、コムギ、イネ、ジャガイモ、ブロッコリー、カリフラワー、キャ
ベツ、キュウリ、スイートコーン、ダイコン、ガーデンビーン、レタス、メロン
、コショウ（pepper）、カボチャ、トマト、またはスイカ（watermelon）である
。しかし、哺乳動物のソース、例えば、マウスまたはヒト組織から単離されるこ
ともできる。以下の一般的な方法を使用することができ、当業者はこれを特定の
目的に適応させることを知っている。少なくとも１５、好ましくは２０〜３０ま
たは１００より多い連続ヌクレオチドからなる、配列番号１または配列番号２の
一本鎖断片を、当該断片にハイブリダイズするクローンについてＤＮＡライブラ
リーをスクリーニングするプローブとして使用する。ハイブリダイゼーションに
ついて観察されるべきファクターは、Sambrook et al, Molecular cloning: A L
aboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, chapters 9.47-9.5
7 and 11.45-11.49, 1989に記載されている。ハイブリダイズするクローンを配
列決定し、配列番号３に４０％またはより多い配列同一性を有し、少なくとも１
５０アミノ酸残基の構成配列を含むアミノ酸配列によって特徴付けられるタンパ
ク質をコードする完全なコード領域を含むクローンのＤＮＡを精製する。当該Ｄ
ＮＡを次いで、多くのルーチンな組換えＤＮＡ技術、例えば、制限酵素消化、ラ
イゲーション、またはポリメラーゼ連鎖反応分析によってさらに修飾することが
できる。

【００１６】 配列番号１及び配列番号２の記載によって、当業者はポリメラーゼ連鎖反応（
配列番号１または配列番号２の１５および好ましくは２０〜３０またはより多い
塩基対の任意の連続配列によって特徴付けられるヌクレオチドの配列を含むテン
プレートからＤＮＡ断片を増幅することを試みる）のためのオリゴヌクレオチド
を設計することが可能である。少なくとも1つのそのようなオリゴヌクレオチド
を使用して実施されたポリメラーゼ連鎖反応、およびそれらの増幅産物は本発明
の別の実施態様を構成する。

【００１７】 実施例： 実施例１：Ｔ−ＤＮＡ挿入 転写的にサイレンシングされた遺伝子座（複数コピーのキメラハイグロマイシ
ンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｈｐｔ）を有する）を有するAlabidopsis
thalianaエコタイプZuerichのトランスジェニック系統Ａが、Mittelsten Scheid
et al, Mol Gen Genet 228: 104-112, 1991 および Mittelsten Scheid et al,
Proc Natl Acad Sci USA 93: 7114-7119, 1996に記載されている。ホモ接合の
、二倍体の遺伝子型の当該系統を、インプランタバキュームインフィルトレーシ
ョンによるアグロバクテリウム仲介遺伝子移入に付して（Bechtold et al., C R
Acad Sci Paris Life Science 316: 1194-1199, 1993)、４０００より多い独立
的なＴ−ＤＮＡ形質転換体を作成する。１’プロモーター（ｐ１’ｂａｒｂｉ）
に転写的に融合されたｂａｒ遺伝子のコード領域からなるＴ−ＤＮＡを有するバ
イナリーベクター、アグロバクテリウム株（Ｃ５８ＣＩＲｉｆ^Ｒ）および形質転
換プロトコルがMengiste et al, Plant J 12: 945-948, 1997に記載されている
。形質転換体（Ｔ１植物）をＢａｓｔａ溶液（１５０ｍｇ／ｌ）で発芽した実生
を繰り返しスプレーすることによって選択し、成熟させる。

【００１８】 実施例２：突然変異体選抜 自殖による種子（Ｔ２ファミリー）をそれぞれの形質転換体より収集する。サ
イレンシグされた表現型の復帰突然変異体についてスクリーニングする前に、種
子を１週間室温で乾燥し、最低１週間４℃で低温処理する。プールした等分物の
およそ１０００種子（２０のＴ２ファミリーからの５０種子からなる）を、２回
７分間表面殺菌し（０．１％Ｔｗｅｅｎ８０を含む５％次亜塩素酸ソーダ）、滅
菌した二重蒸留水で洗浄する。選抜のために、各等分物を、１０ｍｇ／ｌハイグ
ロマイシンＢ（Calbiochem）を含み０．８％アガーで固めた７５ｍｌの発芽培地
（Masson et al, Plant J 2: 829-933, 1992による）を含む１４ｃｍペトリ皿に
置く。播種時に等しい分布を確保するために、種子を３０ｍｌの同じ０．４％
アガーを含む培地と混合する。ポジティブコントロールとしてハイグロマイシン
抵抗性系統からの２種子を、各プレートのマークされた位置に播種する。プレー
トを４℃で２日間低温処理し、次いで種々の期間、２１℃１６時間明期１６℃８
時間暗期におく。ハイグロマイシン抵抗性を播種後８から１５日の各日に評価す
る。

【００１９】 実施例３：突然変異体の分子的及び遺伝的分析 プールの１つの内の１１のハイグロマイシン抵抗性実生を同定した後、このプ
ールを形成するファミリーをそれぞれ再スクリーニングする。一のファミリーは
およそ２５％のハイグロマイシン抵抗性実生を含む。このファミリーの６の抵抗
性小植物を、ハイグロマイシンを含まない発芽培地を含むより大きい容器に移植
する。ロゼット形成および根系の発達後、植物を土に移植し、さらに成長させ、
種子を形成させる。ポット植えの前に、組織外植体を各植物からとり、１０ｍｇ
／ｌハイグロマイシンＢを含むか含まないＲＣＡ培地（表１）上にカルス培養物
を形成させる。カルス培養物をＤＮＡおよびＲＮＡ分析のため並びにこの組織の
ハイグロマイシン抵抗性のさらなる確認のための材料のソースとして使用する。 ゲノムＤＮＡを、Mittelsten Scheid et al, Mol Gen Genet 244: 325-330, 1
994に記載されたＣＡＴＢに基づく方法を使用して単離し、制限酵素ＢａｍＨＩ
、ＨｐａＩＩ、ＭｓｐＩＩ、ＤｒａＩ、ＥｃｏＲＶ、ＲｃａＩまたはＨｉｎｄＩ
ＩＩとインキュベートする。全ＲＮＡをＲＮＡｅａｓｙキット（Qiagen）を供給
者の指示にしたがって使用して取得する。サザン及びノーザンブロット分析をCh
urch and Gilbert, Proc Natl Acad Sci USA 81: 1991-1995, 1984に記載された
条件で実施し、ここで、ランダムプライミングラベリングによって^３２Ｐで標識
されたＤＮＡ断片を使用する。ｈｐｔ遺伝子のコード領域、またはＰ３５Ｓプロ
モーター、ｈｐｔコード及びターミネーター領域からなるＤＮＡ、または１’プ
ロモーターとともにあるｂａｒ遺伝子のコード領域をプローブとして使用する。

【００２０】 ４のハイグロマイシン抵抗性同胞のノーザンブロット分析は、ｈｐｔ遺伝子の
転写の回復を示す。当該同胞のサザンブロット分析は、複合のｈｐｔ挿入内の検
出可能な再編成がないことを示している。当該突然変異体のｈｐｔ導入遺伝子複
合体は、なお、もとの系統Ａの過剰メチル化様であり、これは、メチル化感受性
制限酵素ＨｐａＩＩおよびＭｓｐＩでのサザンブロット分析によって、並びに重
硫酸塩での処理の後プロモーター領域のゲノム配列決定によって判断される。so
m突然変異で観察されるのとは対照的に、この突然変異が反復ゲノムＤＮＡのメ
チル化に及ぼす影響はない。

【００２１】 このハイグロマイシン抵抗性植物、および同じファミリーから選抜されなかっ
た同胞を成長させ、種子を得て、次世代でＢａｓｔａ抵抗性について確認し、サ
ザン分析によってＴ−ＤＮＡ挿入の数及びサイズについてスコアリングする。結
果は、もとのＴ−ＤＮＡ形質転換体が、当該同胞中で独立的に分離する２のＴ−
ＤＮＡ挿入を含んでいなければならないことを示している。１の挿入のものはハ
イグロマイシン抵抗性突然変異体表現型とともに共分離する。この挿入について
ホモ接合であり、他のＴ−ＤＮＡ挿入を欠いた植物を、対応するＴ−ＤＮＡ挿入
部位をクローニングするために使用する。

【００２２】 突然変異体表現型およびAlabidpsis thalianaエコタイプコロンビアのトラン
スジェニック植物系統ＧＵＳ−ＴＳ（Dr. H.Vaucheret, INRA, Versailles Cede
x, Franceより入手可能）（複数コピーのキメラベータグルクロニダーゼ（ｇｕ
ｓ）遺伝子を有する転写的にサイレンシングされた遺伝子座を含む）の間の交雑
系の組織化学的ＧＵＳ染色によって、ｍｏｍ対立遺伝子についてホモ接合である
Ｆ２後代におけるサイレントＧＵＳ遺伝子の再活性化が明らかとなる。 ｍｏｍ１突然変異体表現型を有する植物の近交によっては、第９世代の近交で
さえ何ら形態学的に異常を生じない。これはｓｏｍ突然変異体と対照的である。 系統Ａ（実施例１参照）によるｍｏｍ１の突然変異体表現型の戻し交雑によっ
て、Ｆ１ハイブリッドにおいて野生型ＭＯＭ対立遺伝子が導入されると、すぐに
再活性化されたｈｐｔ遺伝子の再サイレンシングを生じる。

【００２３】 表１：ＲＣＡ培地の組成ＲＣＡ培地 ＭＳ多量 １０× １００ｍｌ Ｂ５微量 １０００× １ｍｌ クエン酸鉄 ５ｍｌ ＮＴビタミン １００× １０ｍｌ スクロース １０ｇ ＭＥＳ ５ｍｌ アガー １０ｇ ＮＡＡ ０．１ｍｇ ＢＡＰ １ｍｇ ｐＨ５．８（ＫＯＨ） ａｄ １ｌＭＳ多量 １０× 硝酸カリウム １９ｇ 硝酸アンモニウム １６．５ｇ 塩化カルシウム（×２Ｈ_２Ｏ） ４．４ｇ 硫酸マグネシウム（×７Ｈ_２Ｏ） ３．７ｇ リン酸二水素カリウム １．７ｇ ａｄ １ｌＢ５微量 １０００× 硫酸マグネシウム（×Ｈ_２Ｏ） １０００ｍｇ ホウ酸 ３００ｍｇ 硫酸亜鉛（×７Ｈ_２Ｏ） ２００ｍｇ ヨウ化カリウム ７５ｍｇ モリブデン酸ナトリウム（×２Ｈ_２Ｏ） ２５ｍｇ 硫酸銅（×５Ｈ_２Ｏ） ２．５ｍｇ 塩化コバルト（×６Ｈ_２Ｏ） ２．５ｍｇ ａｄ １００ｍｌクエン酸鉄 クエン酸鉄アンモニウム １０ｇ ａｄ １ｌＮＴビタミン１００× ｍｙｏ−イノシトール １０００ｍｇ チアミンＨＣｌ １０ｍｇ ａｄ １ｌＭＥＳ ＭＥＳ １４ｇ ｐＨ６（ＮａＯＨ） ａｄ １００ｍｌ

【００２４】 実施例４：「サイレンシング遺伝子」のクローニング ハイグロマイシン抵抗性突然変異体表現型と共分離しているＴ−ＤＮＡのみを
含む植物からのゲノムＤＮＡを単離する。このＤＮＡについて、Liu et al, Pla
nt J 8: 457-463, 1995によるＴＡＩＬ（termal asymmetric interlaced）ＰＣ
Ｒを実施し、ここで、Ｔ−ＤＮＡのライトボーダーに近い３種の特異的なネステ
ィッドプライマー（５’−ＣＡＴ ＣＴＡ ＣＧＧ ＣＡＡ ＴＧＴ ＡＣＣ
ＡＧＣ−３’（配列番号４）、５’−ＧＡＴ ＧＧＧ ＡＡＴ ＴＧＧ ＣＴＧ
ＡＧＴ ＧＧＣ−３’（配列番号５）、５’−ＣＡＧ ＴＴＣ ＣＡＡ ＡＣ
Ｇ ＴＡＡ ＡＡＣ ＧＧＣ−３’（配列番号６））（外側に方向付けられてい
る）、およびフランキングな植物ＤＮＡにおいて結合し得るいくつかのディジェ
ネレートプライマー（degenerate primers）のうちの１つを使用する。以下の７
つのディジェネレートプライマー；

【化１】 のうちの２つが、実際に特定の断片の増幅を生じる。ＡＤ７を使用して得られた
より大きいものをクローニングし、配列決定する。それは５０ｂｐのＴ−ＤＮＡ
および２７５ｂｐのフランキング植物ＤＮＡを含む。サザンブロット分析におい
て、このＰＣＲ断片はＴ−ＤＮＡにフランキングな植物ＤＮＡを含むことが示さ
れる。このＰＣＲ断片を、野生型Arabidopsis thalianaエコタイプコロンビアの
ゲノムライブラリー（Stratagene）をスクリーニングするために使用する。この
ＰＣＲ断片にハイブリダイズする３つのゲノムクローンを同定する。これらのゲ
ノムクローンを、制限酵素を使用してさらにマッピングし、ＰＣＲ断片にハイブ
リダイズさせ、互いにアラインメントする。得られたゲノムクローンの１つ（ｐ
４Ａ−１１）において、挿入突然変異のＴ−ＤＮＡにフランキングであるとわか
った配列は、近似的にゲノム配列の中央に位置する。およそ８００ｂｐのｐ４Ａ
−１１のＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ断片を使用して、オーバーラッピングゲノムクロ
ーンＰ５−６を得、およそ７００ｂｐのｐ５−６のＥｃｏＲＩ断片を使用して、
ｐ５−６とオーバーラップするゲノムクローンｐ３０−１を得る。およそ７００
ｂｐのｐ３０−１のＨｉｎｄＩＩＩ断片を使用してｐ３０−１とオーバーラップ
するゲノムクローンｐ３３−１９を得る。当該クローンを配列決定し、ＲＴ−Ｐ
ＣＲのためのプライマーを設計する。およそ７００ｂｐのｐ５−６のＥｃｏＲＩ
断片を、Elledge et al, Proc Natl Acad Sci USA 88: 1731-1735, 1991)による
野生型Arabidopsis thalianaエコタイプZurichのｃＤＮＡライブラリーのスクリ
ーニングのために使用する。９つのｃＤＮＡクローンを得て、２．６ｋｂの長さ
を有する最長のクローンｐ１７−８を配列決定する。

【００２５】 実施例５：配列分析及びアラインメント 前記のクローニングされたアラビドプシスサイレンシング遺伝子の大サイズを
考慮すると、遺伝子及びタンパク質のそれぞれ信頼できるヌクレオチド及びアミ
ノ酸配列は、配列番号１、配列番号２、及び配列番号３に示す配列といくつかの
位置で異なっていることを、完全に排除することができない。クローニング工程
から生ずる突然変異または配列決定反応におけるあいまいさのためである。さら
に、異なるエコタイプに由来するＤＮＡの配列決定は対立遺伝子的な相違を明ら
かにすることができる。したがって、配列番号１、配列番号２、及び配列番号３
の配列は、Alabidopsis thalianaエコタイプZurichの対応する遺伝子及びタンパ
ク質を表し、一方、Arabidpsis thalianaエコタイプコロンビアから得られたゲ
ノム配列において、配列番号１のヌクレオチド位置４３３８（Ｔの代わりにＡ）
および６７２１（ＧのかわりにＴ）の２つのミスマッチを明らかとなり、これら
は、配列番号３の７０５位のアミノ酸残基ＭのかわりにＫを、配列番号３の１２
１９位のアミノ酸残基ＥのかわりにＤを生じる。 ２．６ｋｂのｃＤＮＡクローンを次に両方の末端から分析し、大ＯＲＦおよび
３’非翻訳配列を含むことが示される。 ゲノムクローンの分析により、クローンｐ４Ａ−１１およびｐ５−６がｃＤＮ
Ａ配列に相同な配列および７つのイントロン配列を含むことが明らかとなる。Ｔ
−ＤＮＡ挿入にフランキングなＤＮＡ配列とゲノム配列を比較すると、Ｔ−ＤＮ
Ａ挿入によって約２ｋｂのゲノムＤＮＡの欠失が生じていることがわかる。該欠
失の５’末端はあるイントロン（イントロン１２）および該欠失の３’末端はｃ
ＤＮＡの３’末端の下流に位置する。ｃＤＮＡクローンの５’末端の配列はゲノ
ムクローンｐ５−６の配列の中央で終結する。これらの独立的なネスティッドＲ
Ｔ−ＰＣＲ反応を実施してさらに上流のさらなるｃＤＮＡ配列を得る。これらの
ＲＴ−ＰＣＲに使用されるプライマーの配列は以下の通りである。

【化２】

【化３】

【００２６】 ゲノムクローンのいくつかの部分の配列はアラビドプシスデータベースに示さ
れている（アクセッションナンバーＢ６７２８１、Ｂ６２５６３、Ｂ２０４３４
、Ｂ２０４２５、Ｂ２１２７４、Ｂ０８９６７、Ｂ１１９９３、Ｂ２０１１６、
Ｂ１２４９６およびＢ１０８５２、ＢＡＣの末端配列として、並びにＺ１８４９
４およびＡＡ５９７９３０、ｃＤＮＡ配列の一部として、１９９９年４月１３日
）。コードされたタンパク質配列をスイスプロテインデータベース（Swiss Prot
ein Database）と比較すると、ＳＷＩ２／ＳＮＦ２ファミリーのＡＴＰアーゼ／
ヘリカーゼタンパク質と部分的類似性が明らかとなる（配列番号３のアミノ酸位
置４７９〜７１９）。該コードされたタンパク質は２００１アミノ酸からなり、
２１９ｋＤの分子量および５．１のｐＩを有すると算出される。ＡＴＰ／ＧＴＰ
−結合モチーフ（配列番号３のアミノ酸位置４６０〜４６７）および３つの核局
在モチーフ（配列番号３のアミノ酸位置３６２〜３６７、８３２〜８３８および
８５８から８６２）がコードされたタンパク質に見出される。ＨＡ−標識したＭ
ＯＭタンパク質のサブセルラー免疫検出によって、その核局在を確認する。チキ
ンテンシン（chicken tensin）のアクチン結合ドメインへの類似性（配列番号３
のアミノ酸位置１８９９〜１９４１）および予測される膜にわたるドメイン（me
mbrane spanning domein）（配列番号３のアミノ酸位置９９５〜１０１５）をも
検出する。さらに、コードされたタンパク質は３タイプの反復領域または内部反
復を含み、配列番号３のアミノ酸位置１７７〜３５０、１４６２〜１６７２およ
び１８４８〜１８９４に本質的に定義される。

【００２７】 実施例６：他の種における相同遺伝子 Arabidopsis thalianaの推定プロリン／ヒドロキシプロリン−リッチ糖タンパ
ク質は、ＭＯＭタンパク質と部分的類似性を示し、ＧｅｎＢａｎｋアクセッショ
ンナンバーＡＡＤ２９８２９として記載される。その類似性は、その領域に依存
して３４−４７％であり、ＭＯＭタンパク質の第２の半分（すなわちアミノ酸１
３６８〜１９４４）にのみみられる。ＭＯＭ ｃＤＮＡクローンを使用して、サ
ザンブロット分析によって相同的遺伝子の存在について、カブ、トマト、タバコ
、トウモロコシ、マウス、ミバエ（fruit fly）およびヒトからのゲノムＤＮＡ
を探索する。低ストリンジェントな条件でのハイブリダイゼーションはすべての
ケースで見られる。ライブラリーからのクロス−ハイブリダイズするクローンを
同定し、配列決定することができる。

【００２８】 Brassica oleracea var. acephalaのゲノムライブラリー（Dr. Mark Cock, IN
RA, CNRS, Lyon, Franceから得た）をストリンジェントな条件でＭＯＭ ｃＤＮ
Ａでスクリーニングする。２つのポジティブなクローンを取得し、サブクローニ
ングし、部分的に配列決定する。クローン１の配列の一部がＭＯＭ遺伝子におけ
る種々の領域に類似し（ＤＮＡレベルで８０−８６％、アミノ酸レベルで６２−
８０％）、ＭＯＭタンパク質のＮ末端、ＡＴＰアーゼ、およびＣ末端部分をコー
ドする。ＭＯＭタンパク質のすべての３つの推定核局在配列はクローン１に十分
に保存されている。クローン２の配列の一部もＭＯＭ遺伝子の領域と類似性を示
し（ＤＮＡレベルで６４−７６％、アミノ酸レベルで５５−６４％）、ＭＯＭタ
ンパク質のＡＴＰアーゼ、推定膜貫通、およびＣ末端部分をコードする。クロー
ン１および２の配列は同一ではなく、Brassica oleraceaにおける少なくとも２
つの相同な遺伝子の存在を示唆している。クローン１および２から得られる配列
の一部の例を、配列番号２６−３３に示す。 さらに、Brassica rapaのゲノムライブラリー（Dr. Kinya Toriyama, Tohoku
University, Sendai, Japanから得た）をＭＯＭ ｃＤＮＡでストリンジェント
な条件でスクリーニングする。ＭＯＭ ｃＤＮＡの５’および３’部分の両者に
ハイブリダイズするポジティブシグナル取得する。 さらに、Petunia hybridaのゲノムライブラリー（Dr. Jan Kooter, Vrije Uni
versiteit, Amsterdam, The Netherlandから得た）をより低ストリンジェントな
条件でＭＯＭ ｃＤＮＡでスクリーニングする。ＭＯＭ ｃＤＮＡの５’および
３’部分の両者にハイブリダイズするポジティブシグナルを得る。

【００２９】 実施例７：アンチセンス構築物によってマーカー遺伝子発現を操作する ２．６ｋｂ ｃＤＮＡ断片およびネスティッドＲＴ−ＰＣＲによって増幅され
た１．８ｌｂ ＲＴ−ＰＣＲ断片を（第１のＰＣＲのためにプライマーＲＴ１−
１およびＲＴ１−２、第２のＰＣＲのためにプライマーＲＴ１−３およびＲＴ１
−４を使用する）、それそれ逆方向に、バイナリーベクターｐｂａｒｂｉ５３の
複数のクローニング部位にクローニングして、アンチセンスＲＮＡを生成する。
ｐｂａｒｂｉ５３は、ｐ１’ｂａｒｂｉの修飾されたベクターであり、カリフラ
ワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーター、ＸｈｏＩ、ＳｎａＢＩ、ＨｐａＩ
およびＣｌａＩ制限部位を含む複数のクローニング部位、並びにｐ１’ｂａｒｂ
ｉのＨｉｎｄＩＩＩ部位のカリフラワーモザイクウイルスのターミネーターから
なる発現カセットを有する。得られた組換えプラスミドを実施例１に記載したよ
うにアグロバクテリウムに導入する。トランスジェニック植物系統ＧＵＳ−ＴＳ
（Dr. H. Vaucheret, INRA, Versailles Cedex, Franceから入手可能）であって
、複数コピーのキメラベータグルクロニダーゼ（ｇｕｓ）遺伝子を有する、転写
的にサイレンシングされた遺伝子座を有する、Alabidopsis thalianaエコタイプ
コロンビアを、実施例１に記載したような組換えプラスミドで形質転換し、形質
転換体をMengiste et al, Plant J 12: 945-948, 1997の記載のように選抜する
。pbarbi53ベクターDNAをコントロール形質転換において使用する。形質転換体
を組織化学的染色によってｇｕｓ遺伝子の再活性化について試験する。子葉の葉
を、１０分間の真空でｇｕｓ染色溶液に浸せきし（１００ｍＭリン酸ナトリウム
バッファー（ｐＨ７．０）、０．０５％ ５−ブロモ−4−クロロ−３−インド
リル−ベータ−Ｄ−グルクロニダーゼ、０．１％ アジ化ナトリウム）、次いで
３７℃で終夜インキュベートする。２．６ｋｂ ｃＤＮＡを有する組換えプラス
ミドで形質転換された植物において、強いｇｕｓ活性が観察され、一方、１．８
ｋｂ ＲＴ−ＰＣＲ断片またはｐｂａｒｂｉ５３を有する組換えプラスミドで形
質転換された植物は、何らのｇｕｓ活性前記バックグラウンドを示さない。した
がって、２．６ｋｂ ｃＤＮＡのアンチセンスＲＮＡの発現は、突然変異体表現
型に似ており、配列番号１、配列番号２および配列番号３に示す配列が転写的な
遺伝子サイレンシングシステムの構成要素についての遺伝的情報を示しているこ
との確認となっている。

【配列表】

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１３年１０月８日（２００１．１０．８）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 パオロ・アメデオ スイス、ツェーハー−4057バーゼル、アイ メルディンガーヴェーク45番 (72)発明者 イェルツイ・パシュコフスキー スイス、ツェーハー−4224ネンツリンゲ ン、ブラウエンヴェーク10番 Ｆターム(参考） 4B024 AA08 AA20 BA80 DA01 EA04 GA30 4H045 AA10 BA10 CA30 DA89 EA05 EA60 FA74

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 少なくとも１５０アミノ酸残基の構成配列を含み、配列番号
   ３のアラインメントした構成配列と４０％またはそれ以上の同一性を有する、ア
   ミノ酸配列を特徴とするタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム
   を含むＤＮＡ。
2. 【請求項２】 式Ｒ_１−Ｒ_２−Ｒ_３を有するタンパク質をコードするオープ
   ンリーディングフレームを含む請求項１のＤＮＡ； [式中、 --Ｒ_１、Ｒ_２およびＲ_３は構成配列を構成し、アミノ酸残基Ｇｌｙ、Ａｌａ、
   Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、
   Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、およびＨ
   ｉｓの群より独立的に選択されるアミノ酸残基からなる； --Ｒ_１およびＲ_３は、独立的に０ないし３０００アミノ酸残基からなる； --Ｒ_２は少なくとも１５０アミノ酸残基からなる； --Ｒ_２は配列番号３のアラインメントした構成配列に少なくとも４０％同一で
   ある]。
3. 【請求項３】 請求項１のＤＮＡであって、１またはそれ以上の、ＳＷＩ２
   ／ＳＮＦ２に類似のＡＴＰアーゼ／ヘリカーゼモチーフをコードするオープンリ
   ーディングフレームを含むＤＮＡ。
4. 【請求項４】 配列番号３のアミノ酸４７８−４９０、５８４−６００、６
   １７−６３０、６５４−６６８、６７６−６９０、７１８−７３４、７７６−７
   ８８、１２２２−１２３３、１７３８−１７４９または１７６１−１７７０によ
   って定義される構成配列を有するタンパク質をコードするオープンリーディング
   フレームを含む請求項１のＤＮＡ。
5. 【請求項５】 請求項１のＤＮＡであって、当該オープンリーディングフレ
   ームが、配列番号３のアミノ酸配列、配列番号３の７０５位のアミノ酸残基Ｍの
   かわりにＫを有する対立遺伝子アミノ酸配列、または配列番号３の１２１９位の
   アミノ酸残基Ｅの代わりのＤを特徴とするタンパク質をコードしているＤＮＡ。
6. 【請求項６】 請求項１のＤＮＡであって、配列番号１または配列番号２の
   ヌクレオチド配列を特徴とするＤＮＡ。
7. 【請求項７】 請求項１のＤＮＡであって、そこから転写されたｍＲＮＡに
   相補的であるＲＮＡの発現が、トランスジェニックマーカー遺伝子のサイレンシ
   ングを解除するＤＮＡ。
8. 【請求項８】 請求項１ないし７のいずれかのオープンリーディングフレー
   ムによってコードされたタンパク質。
9. 【請求項９】 請求項１のＤＮＡの製造方法であって下記を含む製造方法；
   −配列番号１または配列番号２によって定義されるＤＮＡの断片にハイブリダイ
   ズすることのできるクローンについてＤＮＡライブラリーをスクリーニングする
   こと、ここで、当該断片は少なくとも１５ヌクレオチドの長さである； −ハイブリダイズするクローンを配列決定すること； −少なくとも１５０アミノ酸残基の構成配列を含み、配列番号３に４０％または
   それ以上の配列同一性を有する、アミノ酸配列を特徴とするタンパク質をコード
   するオープンリーディングフレームを含むクローンのベクターＤＮＡを精製する
   こと； −さらに所望により精製したＤＮＡを修飾すること。
10. 【請求項１０】 ポリメラーゼ連鎖反応であって、使用される少なくとも１
    つのオリゴヌクレオチドが、配列番号１または配列番号２の１５またはそれ以上
    の塩基対を表すヌクレオチドの配列を含む、ポリメラーゼ連鎖反応。