JP2003502620A - ポリイオンを含む蛍光分極アッセイ - Google Patents

ポリイオンを含む蛍光分極アッセイ

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Abstract

(57)【要約】 蛍光標識を付けた第一試薬を含む第一試薬混合物を供給する工程を含む、各種の異なるアッセイを実施する方法、システムおよびキット。該第一試薬混合物に第二試薬を導入して、第二試薬混合物を作製する。ここで該第二試薬は第一試薬と反応して、第一試薬とは異なる電荷を有する蛍光標識生成物を生じる。該第一試薬混合物および第二試薬混合物の少なくとも一種にポリイオンを導入し、第二試薬混合物の蛍光分極量を第一試薬混合物に対し測定する。これにより反応の速度または程度が示される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】関連出願 本発明は１９９９年５月２１日に出願された米国特許出願Ｎｏ．０９／３１６
，４４７の部分継続出願であり、また１９９９年６月１６日に出願された仮特許
出願Ｎｏ．６０／１３９，５６２および１９９９年９月２８日に出願された仮特
許出願Ｎｏ．６０／１５６，３６６に対する優先権を主張する。これら関連出願
の各開示をあらゆる目的のため参考として全て取り入れた。
【０００２】発明の背景 反応混合物内の特定の化学種の存在または不存在について反応混合物をアッセ
イすることにより研究の方向性を決定する場合、事実上全ての化学的、生物学的
、生化学的研究は研究者の能力に依存している。簡単な例として、反応の速度ま
たは効率は、反応生成物の製造速度または反応基質の減少量を測定することによ
りアッセイされる。同様に、相互作用、例えば結合または解離反応は、得られる
反応混合物中の結合またはフリー物質の量を測定することによりアッセイされる
。 ある種の反応では、関心のある化学種または適切な代用品は、残存する試薬か
ら容易に検出可能且つ区別可能である。したがって、このような化学種（ｓｐｅ
ｃｉｅｓ）を検出するには、これを探し出すだけでよい。多くの場合、これは、
生成物または基質上にただ存在するかまたは活性である光信号発生エレメントま
たは部分（ｍｏｉｅｔｙ）を用いて、反応生成物を任意にこれらの試薬とは検出
可能且つ区別可能にすることにより達成される。この光信号量を測定することに
より、生成物または残存基質の量を直接確認できる。
【０００３】 遺憾ながら特に関心のある多くの反応では、反応させた時にだけ信号を生じる
ような代用試薬が容易に入手可能であるという利点がなかった。例えば、生物学
の研究分野で極めて関心のある多くの反応では、これらの試薬は実質的に光特性
を変化し得る改質型にならない。研究者は、光特性の変化をもたらす基質をうま
く処理するようにしている。例えば、２つの分子間の一般的な結合反応では、こ
れら分子が結合した錯体が得られる。しかし、結合性対の一方の部材を標識した
場合でさえ、一般に錯体の形成によっても光検出が可能な、錯体と標識した分子
との差は生じない。その結果、殆どの結合アッセイ（ｂｉｎｄｉｎｇ ａｓｓａ
ｙ）は、結合対の一方の部材、即ち分子の不動化（ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏ
ｎ）に頼っている。次に、この標識分子は不動化した分子と接触し、さらにこの
不動化性基質を洗浄する。次に、洗浄後の基質を標識分子の存在について検査し
、標識成分と標識しない不動化成分との結合性を得る。アッセイフォーマットの
処理量を増進するため、各種結合性部材の対を調製することが多い。例えばＰｉ
ｒｒｕｎｇ等のＵＳＰ５，１４３，８５４参照。 或いは、核酸の混成アッセイの場合、研究者は、結合したエレメントの近接性
を利用して結合状態または非結合状態で蛍光信号を生じる補足的な標識用システ
ムを開発している。例えばＦＲＥＴ染料の記載については、Ｍａｔｈｉｅｓ等の
ＵＳＰ５，６６８，６４８、同５，７０７，８０４、同５，８５３，９９２、同
５，８６９，２５５参照、また分子ビーコンの記載についてはＴｙａｇｉ等、Ｎ
ａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：３０３−８（１９９６）参照。
【０００４】 前述のように、結合反応は、一般に光検出が可能な信号を生じないアッセイの
一範疇に過ぎない。同様に、光検出が可能なエレメントを導入しても試薬および
／または生成物が互いに容易に区別できないアッセイ方法が他にも多数ある。例
えばホスフェート基をホスホリル化可能な基質上に導入するキナーゼアッセイで
は、一般にホスホリル化反応の終了時に検出可能な信号を生じる代用基質を用い
ている。その代わり、これらの反応は一般に生成物の構造変化に頼っている。こ
のような構造変化を用いて反応剤を生成物から分離する。次いで分離された生成
物が検出される。さらに分離工程を必要とするアッセイ方法は、各種アッセイ工
程間での損失の結果、非常に時間がかかるし、非効率的となる。 一般に固体基質、別途の分離工程等を必要としないで、上記種類のアッセイを
達成できることが望ましい。本発明は、これらの要件および他の各種の重要な要
件を満足するものである。
【０００５】発明の概要 本発明は広範な各種のアッセイを実施するための方法、システム、キット等を
提供する。これらのアッセイ方法は、一般に、蛍光標識を付けた第一試薬を含む
第一試薬混合物を供給する工程を含む。該第一試薬混合物に第二試薬を導入して
、第二試薬混合物を作製する。ここで該第二試薬は第一試薬と反応して、第一試
薬とは異なる電荷を有する蛍光標識生成物を生じる。該第一試薬混合物および第
二試薬混合物の少なくとも一種にポリイオンを導入し、次いで第一試薬混合物に
対する第二試薬混合物の蛍光分極量を測定する。この蛍光分極量は反応の速度ま
たは程度を示すものである。 本発明の他の面は反応の検出方法である。この方法は、蛍光標識を付けた第一
試薬を含む第一試薬混合物を供給する工程を含む。該第一試薬混合物に第二試薬
を導入して、第二試薬混合物を作製する。該第二試薬は第一試薬と反応して、第
一試薬とは異なる電荷を有する蛍光標識生成物を生成する。該第一試薬混合物お
よび第二試薬混合物の少なくとも一種にポリイオンを導入し、第二試薬混合物の
蛍光分極量を第一試薬混合物と比較する。
【０００６】 本発明の更なる面は、標的の核酸におけるヌクレオチドの部分列の存在を同定
する方法である。この方法は、該標的核酸配列を第一反応混合物中で、正帯電し
ているかまたは実質的に帯電していない蛍光標識の核酸類似体と接触させる工程
を含む。該核酸類似体は前記部分列に補足的であり、これにより該核酸類似体は
特に該部分列に混成して第一混成物を形成し得るものである。前記第一反応混合
物は、ポリイオンと接触させ、次に該ポリイオンの存在下での前記第一反応混合
物の蛍光分極量を前記標的核酸配列の不存在下での前記核酸類似体の蛍光分極量
と比較する。蛍光分極量の増加は、前記第一混成物の存在を示すものである。 本発明の他の面は、ホスホリリル化可能な化合物のホスホリル化検出方法であ
る。この方法は、蛍光標識を付けたホスホリル化可能な化合物を供給する工程を
含む。該ホスホリル化可能な化合物を第一混合物中でホスフェート基の存在下に
キナーゼ酵素と接触させ、次いで該第一混合物をポリイオンと接触させる。該ポ
リイオンの存在下での第一混合物からの蛍光分極量を、前記キナーゼ酵素の不存
在下での前記蛍光標識付きホスホリル化可能な化合物からの蛍光分極量と比較す
る。
【０００７】 本発明の更なる面はホスホリリル化可能な化合物のホスホリル化検出方法であ
る。この方法は、蛍光標識を付けたホスホリル化可能な化合物を供給する工程を
含む。該ホスホリル化可能な化合物を第一混合物中でホスフェート基の存在下に
キナーゼ酵素と接触させる。該第一混合物を、蛋白質と会合したキレート基を有
する該蛋白質とＦｅ3+、Ｃａ2+、Ｎｉ2+およびＺｎ2+から選ばれた金属イオンと
を含む第二試薬混合物と接触させる。該第二混合物の存在下での第一混合物から
の蛍光分極量を、前記キナーゼ酵素の不存在下での前記蛍光標識付きホスホリル
化可能な化合物からの蛍光分極量と比較する。 本発明の更なる面は流体容器からなるアッセイシステムである。このシステム
は、蛍光標識を付けた第一試薬を含む第一試薬混合物を含有する第一反応帯と、
該第一試薬と反応して第一試薬とは実質的に異なる電荷を有する蛍光標識生成物
を生じる第二試薬と、ポリイオンとを含んでいる。また、このシステムは検出帯
と、該検出帯と感知可能に連絡配置された検出器とを含んでいる。該検出器は、
検出帯中で試薬の蛍光分極量を検出するように構成されている。 本発明の他の面は、本体構造内に配置された第一チャンネルを有するアッセイ
システムである。この第一チャンネルは、蛍光標識を付けた第一試薬を含む第一
試薬混合物源と、該第一試薬と反応して第一試薬とは実質的に異なる電荷を有す
る蛍光標識生成物を生じる第二試薬源と、ポリイオン源とに流動可能に接続され
ている。また、このシステムは前記第一試薬、第二試薬およびポリイオンを前記
第一チャンネル内に導入する材料搬送システムと、前記第一チャンネルと感知可
能に連絡配置された検出器とを有する。この検出器は、前記検出帯中で試薬の蛍
光分極量を検出するように構成されている。
【０００８】 本発明の他の面はキットである。このキットは、蛍光標識を付けた、第一試薬
の容積部分と；該第一試薬と反応して、第一試薬とは異なる電荷を有する蛍光生
成物を生じる第二試薬の容積部分と；ポリイオンの容積部分とを含んでいる。ま
た、このキットは、前記第一試薬の蛍光分極量を測定し、該第一試薬、第二試薬
およびポリイオンを第一混合物中で混合し、該第一混合物の蛍光分極量を測定し
、次いで前記第一試薬の蛍光分極量を前記第一混合物の蛍光分極量と比較すると
いう内容の使用説明書を含んでいる。 本発明の他の面は、反応パラメーターの定量用アッセイシステムで、このシス
テムは第一試薬混合物を供給する工程を含んでいる。該第一試薬混合物は、蛍光
標識を付けた第一試薬を含んでいる。該第一試薬混合物に第二試薬を導入して第
二試薬混合物を作製する。ここで該第二試薬は、前記第一試薬と反応して該第一
試薬とは異なる電荷を有する蛍光標識生成物を生じる。前記第一試薬混合物およ
び第二試薬混合物の少なくとも一種にポリイオンを導入する。また、このシステ
ムは、前記第一試薬混合物の蛍光分極の第一の量を測定する工程、前記第二試薬
混合物の蛍光分極の第二の量を測定する工程、および前記蛍光分極の第一量と第
二量とを比較する工程、および反応パラメーターを計算する工程からなるコンピ
ューターによる実施方法を含んでいる。
【０００９】図面の簡単な説明 図１は、本発明に従って実施される一般的アッセイ方法の一態様の概略説明図
である。 図２は、本発明に従って実施される結合アッセイ、例えば核酸混成アッセイの
概略説明図である。 図３は、本発明に従って実施される酵素アッセイ、例えばキナーゼアッセイの
概略説明図である。 図４は、本発明に従って実施されるホスファターゼアッセイの概略説明図であ
る。 図５は、本発明のアッセイ方法を実施するために使用される全体のシステムの
一般的な概略説明図である。 図６は、本発明において反応／アッセイ容器として任意に使用される多層微小
流体（ｍｉｃｒｏｆｕｌｕｉｄｉｃ）デバイスの概略説明図である。 図７は、本発明において反応／アッセイ容器として外部サンプリングピペット
器（ｐｉｐｅｔｔｏｒ）を組み入れた微小流体デバイスの概略説明図である。 図８は、本発明と併用される光検出システムの一例の概略説明図である。 図９は、本発明のアッセイを行う際、アッセイシステムによって実施されるソ
フトウエアプログラムまたはコンピューターによる実施方法のフローチャートで
ある。 図１０は、本発明と併用される好例のコンピューターシステムを示す。 図１１は、材料の移動を制御し、微小流体システムからのアッセイ結果を検出
し、次いでこれらの結果を分析するシステムの他のエレメントを備えた微小流体
デバイスのインターフェースを示す。 図１２Ａ〜Ｅは、ポリカチオン量を増加させた際の各種蛍光ホスホリル化化合
物の蛍光分極量をプロットしたものである。 図１３は、ポリカチオンの存在下で基質と生成物との相対濃度を変化させた場
合のホスホリル化可能な蛍光基質とホスホリル化生成物との混合物の蛍光分極量
をプロットしたものである。 図１４は、異なるホスホリル化可能な基質とホスホリル化生成物を用いた他は
図１３と同様な混合物の蛍光分極量をプロットしたものである。 図１５は、毛細管電気泳動分離／検出（縦軸）および蛍光分極検出（横軸）を
用いて検出した際の蛋白質キナーゼＢ（ＰＫＢ）の活性間の相関関係をプロット
したものである。 図１６は、反応混合物中のＡＴＰを幾つかの異なる濃度で存在させてＰＫＡア
ッセイを行った際の蛍光分極量対反応時間をプロットしたものである。 図１７は、図１６に示すデータから誘導した初期反応速度対ＡＴＰ濃度をプロ
ットしたものである。 図１８は、図１６および１７に示すアッセイデータから誘導したラインウエー
バー−バーク（Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋｅ）プロットである。 図１９は、対照混合物および酵素アッセイ混合物について経時によるホスファ
ターゼ活性をプロットしたものである。 図２０は、３つの異なるプロテアーゼアッセイ試験（ｒｕｎ）（負対照および
２つの異なる濃度の酵素）の各々について蛍光分極量対時間をプロットしたもの
である。 図２１は、非補足的標的ＤＮＡ配列および補足的標的ＤＮＡ配列を調査するた
めに使用した蛍光ＰＮＡプローブの蛍光分極量についてポリカチオンの不存在下
および変化した量で存在させた際の棒グラフである。 図２２は、標的核酸配列と完全補足的蛍光ＰＮＡプローブとの混合物（上の線
、菱形点）および単独塩基以外は補足的な標的配列と蛍光ＰＮＡプローブとの混
合物（下の線、正方形点）の蛍光分極量をプロットしたものである。 図２３Ａ、２３Ｂおよび２３Ｃは、標的配列およびプローブが３つの異なる構
造（ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）を有するＤＮＡ／ＰＮＡ混成物についての溶
融曲線をプロットしたものである。標的に対し完全に適正するもの、および２つ
の適正しないもの（それぞれ、図２３Ａ、２３Ｂおよび２３Ｃ）、並びに各プロ
ットの３つの線で表わすように、３つの異なるプローブ長（９−ｍｅｒ、１１−
−ｍｅｒおよび１３−ｍｅｒ) が示されている。 図２４は、本発明方法を用いたＳＮＰ検出、蛍光分極検出およびこの検出法と
単独の蛍光強度測定値とを比較してプロットしたものである。
【００１０】発明の詳細な説明 Ｉ．序論 本発明は一般には、他の通常のアッセイフォーマットが使用できない種々の異
なる状況（ｃｏｎｔｅｘｔ）で広範に有用なアッセイ方法およびシステムを提供
する。反応生成物は反応基質、例えば蛍光標識基と分け合う特性により検出され
るという事実にも拘わらず、本発明方法およびシステムは、反応基質の存在下で
反応生成物を検出できる。 一般に本発明方法およびシステムは、反応の結果として生じた反応生成物と反
応基質との電荷量の差により反応生成物を反応基質と区別する。これら反応成分
の一方の電荷は、基質上にあっても生成物上にあっても、該成分を比較的大きい
ポリイオン化合物と会合させるのに使用される。この大きなポリイオン化合物が
基質または生成物のいずれかに優先的に会合することにより、分極光を用いて励
起させた時、該成分からの蛍光放射の分極量に実質的な差が生じる。この大きい
化合物は、基質または生成物のいずれか１つだけと優先的に会合するので、関心
のある反応による電荷を利用または除去する結果、この会合およびそれによる蛍
光分極量の変化は、該反応の進行を示す指示薬となる。
【００１１】 ＩＩ．アッセイ方法 少なくとも１つの面では、本発明は化学的、生化学的または生物学的反応を検
出する方法を提供する。この方法は、蛍光標識を付けた第一試薬を含む第一混合
物を供給する工程を有する。該第一試薬混合物に第二試薬を導入して、第二試薬
混合物を作製する。該第二試薬は一般に第一試薬と反応するか、さもなければ相
互作用して、第一試薬とは実質的に異なる電荷を有する蛍光標識した生成物を生
じ得る。ここで使用した語句“異なる電荷”または“実質的に異なる電荷”とは
、基質および生成物とここに記載したようなポリイオン化合物との示差的な会合
を起こすのに充分な量により、生成物上の正味電荷が第一試薬の電荷とは異なる
ことを意味する。この示差的な電荷は、全試薬分子上の平均の電荷の断片であっ
てよい。しかし、好ましい面では、基質および生成物は、アッセイを行う部分の
ｐＨでは少なくとも１つの電荷単位だけ異なる。例えば正味単独の正または負の
電荷を持つ生成物は、正味中性の電荷を有する第一試薬とは、実質的に異なる（
この語句はここで使用した）電荷を有する。同様に２つの正の電荷を有する生成
物は、単独の正の電荷を有する第一試薬とは実質的に異なる電荷を有する。第一
試薬とは実質的に異なる電荷を有する生成物は正味電荷が少なくとも２つの電荷
単位だけ異なり、またある面、例えば以下に詳細に説明した核酸を用いた場合は
、２つよりも多い多数の電荷単位差があることが好ましい。
【００１２】 ポリイオンは、実施するアッセイの種類や関心のある反応で作製する生成物の
性質によって第一試薬混合物および第二試薬混合物のいずれかまたは両方と接触
させる。この反応は、基質とは実質的に異なる電荷を有する生成物を生じるので
、ポリイオンと、基質とは全く異なる相互作用（例えば会合／相互作用の増大ま
たは減少）する。会合の有無は、放射された蛍光を脱分極する（ｄｅｐｏｌａｒ
ｉｚｅ）生成物の能力に対し意味深い効果を有する。具体的には、以下に詳細に
説明するように、比較的小さい第一試薬は、比較的速い回転拡散速度を有する。
この回転拡散速度は、分極光で励起した時、脱分極された蛍光を放つ蛍光化合物
の能力によるものである。しかし、小さい蛍光分子を有する大きいポリイオン化
合物の会合は、該分子の回転拡散速度を非常に遅くし、脱分極された蛍光を放射
する能力を低下させる。 次に、第二試薬混合物の蛍光分極量を第一試薬混合物からの蛍光分極量と比較
する。これらの値を比較することにより、ポリイオンに結合した材料から放射さ
れる蛍光量を定量できる。以下に詳細に説明するように、このアッセイは、例え
ばｐＨ、イオン強度等を調整することにより調整され、その結果、第一試薬また
は生成物の１つだけがポリイオンと会合可能となる。こうして、蛍光分極量の変
化を用いて、得られた生成物または消費した第一試薬の量の定量程度を計算し、
反応の尺度とする。
【００１３】 異なる分子間の結合を測定する方法として蛍光分極測定を用いることを背景と
する原理は、比較的判りやすい。要するに、蛍光分子を分極光源で励起すると、
この分子は、固定面中で蛍光を放ち、例えば分子が空間中で固定されていれば、
放射光も分極するというものである。しかし、上記分子は通常空間中で回転し、
また転回しているので、蛍光の放射面は、分子の回転に従って変化する（分子の
回転拡散ともいわれる）。繰り返しいえば、放射された蛍光は一般に脱分極され
ている。溶液中での分子の回転が速いほど、ますます脱分極される。逆に、溶液
中での分子の回転が遅いほど、脱分極が少ないか、或いはますます分極される。
所定の分子についての分極値（Ｐ）は、分子の“回転相関時間”に比例するか、
或いは分子を５７．３°（１ラジアン）回転させる時間を要する。回転相関時間
が短いほど、分子の回転は速く、また分極が少ないことが観察される。回転相関
時間が長いほど、分子の回転は遅く、また分極が多いことが観察される。回転緩
和時間は、粘度（η）、絶対温度（Ｔ）、モル容積（Ｖ）およびガスコンスタン
ト（Ｒ）に関係する。この回転緩和時間は、一般に下記式に従って計算される。 回転緩和時間＝３ηＶ／ＲＴ （１） 上記式から判るように、温度および粘度を一定に維持すれば、回転緩和時間、
したがって分極値は、分子の容積に直接関係する。即ち、分子が大きいほど、そ
の蛍光分極値は高く、逆に分子が小さいほど、その蛍光分極値は低い。
【００１４】 蛍光結合アッセイを行う場合、比較的速い回転相関時間を有する、蛍光標識を
付けた小さい分子、例えば配位子、抗原等が非常に大きい分子、例えば回転相関
時間が非常に遅い受容体蛋白質、抗体等に結合させるために使用される。この小
さい標識分子を上記大分子に結合させると、結合していないフリーの標識分子に
比べて前記標識化学種、即ち、標識錯体の回転相関時間が著しく増大する（回転
量が減少する）。これは検出可能な分極量に対応する効果である。具体的には、
標識錯体は、結合していない標識分子よりも遥かに多い蛍光分極量を与える。 一般に、蛍光分極量は、下記式を用いて計算される。
【数１】 Ｐ＝［Ｉ（‖）−Ｉ（⊥）］／［Ｉ（‖）＋Ｉ（⊥）］ （２） 式中、Ｉ（‖）は励起光に平行な面中で検出された蛍光であり、Ｉ（⊥）は励起
光に垂直な面中で検出された蛍光である。
【００１５】 例えば問題の結合機能の潜在的な抑制剤、増進剤、非拮抗剤（ａｇｏｎｉｓｔ
）、拮抗剤についてスクリーニングアッセイを行う場合は、異なる化合物の存在
下または不存在下で反応混合物の蛍光分極量を比較し、これらの異なる化合物が
前記の結合機能に何らの効果を示さないかどうか決める。特に、結合機能の抑制
剤の存在下では、アッセイ時にさらに多くのフリーの標識配位子が存在するよう
に、蛍光分極量は減少する。逆に、結合機能の増進剤が存在すると、アッセイ時
にさらに多くの錯体およびさらに少ないフリーの標識配位子が存在するように、
蛍光分極量は増大する。 本発明の好ましい方法は、通常、蛍光分極の検出、例えば所定の反応後の反応
混合物から放射された脱分極蛍光量の変化を検出することを含む。しかし、本発
明では、他の蛍光検出計画も有用である。例えば、反応混合物から放射された脱
分極蛍光量を変える他、該混合物中のポリイオンの会合も反応混合物から放射さ
れた全蛍光量、即ち蛍光強度に対し効果を示し得ることが発見された。こうして
本発明の広範な面では、反応後の種々の蛍光特性の変化を検出するだけでよい。
【００１６】 上記のように、本発明のアッセイ方法は通常、蛍光標識基を有する第一試薬を
用いる。この第一試薬の性質は、実施されているアッセイの種類に依存する。通
常、本発明を用いて行い得るアッセイは、酵素アッセイは勿論、広範囲な結合ま
たは他の会合式アッセイ等、無数にある。したがって、ここで説明した第一試薬
としては、一般に例えば特定の結合対、即ち抗体／抗原対、受容体／配位子対、
補足的核酸またはそれらの類似体、結合性蛋白質およびそれらの結合性部位の一
方の部材が挙げらる。或いはさらに、第一試薬は、関心のある反応、例えばその
他、第一試薬の化学構造の減成または変化により変性される基質であってもよい
。これら基質の幾つかの特定例としては、例えばホスホリル化可能な部分、例え
ばセリン−、スレオニン−およびチロシン−ホスホリル化部位等を有するキナー
ゼ基質、ホスファターゼ酵素用のホスホリル化基質、アミノトランスフェラーゼ
を必要とするアミノ−またはケト−含有基質、カルボキシルに転化されるアルコ
ール（例えばグルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼにより）、同様に
スルファターゼ、ホスホリラーゼ、エステラーゼ、ハイドロリラーゼ（例えばプ
ロテアーゼ）、オキシダーゼ等用の基質が挙げられる。 第一試薬は、実施すべきアッセイの性質によって、正または負のいずれかに帯
電していてもよいし、或いは中性であってもよい。第一試薬に付ける蛍光標識は
、各種の異なる蛍光標識用化合物のいずれからも選択できる。一般に、これらの
蛍光標識用材料は例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏ
Ｒ）から市販品として入手できる。通常、ここで説明したアッセイ方法にはフル
オレッセンまたはローダミン誘導体が好適である。これらの蛍光標識は、第一試
薬に例えば周知のカップリング化学により共有的に結合している。標識基および
化学については、例えば参考のためここに取り入れた国際特許出願公開Ｎｏ．Ｗ
Ｏ ９８／００２３１参照。
【００１７】 また前述のように、第二試薬は一般に第一試薬と反応または相互作用するか、
さもなければ会合または結合して、第一試薬とは実質的に異なる電荷を有する蛍
光生成物を生じる。第一試薬と同様、第二試薬も任意に、特定の結合対の一方の
部材、例えば、結合対の両部材、または第一試薬および第二試薬の両部材の混成
物、結合対の第一試薬部材の電荷とは実質的に異なる電荷を有するならば、第一
試薬に補足的な部材からなる。多くの場合、第二試薬は帯電しているが、第一試
薬は中性であるか、或いは第二試薬は、単に適度に帯電した第一試薬に比べて高
度に帯電したものである。さもなければ、第一試薬および第二試薬の会合によっ
て帯電生成物を生じるか、或いは第一試薬上の帯電残査に結合するかマスクする
構造的な変化を与えるものである。 第一試薬と第二試薬との相互作用によって作製された生成物は、第一試薬単独
とは異なる電荷を持つので、他の帯電分子と別々に相互作用する。特に、かなり
の数の電荷を持つポリイオン化合物は、電荷に依存して、帯電した材料と相互作
用する。本発明の場合は、生成物の脱分極蛍光放射能力に影響を与える比較的大
きい化合物を生成物（場合によっては、第一試薬）に“付ける（ｔａｇ）“ため
、大きなポリイオン化合物が使用される。
【００１８】 本発明で使用される好ましいポリイオンとしては、ポリアミノ酸、例えば蛋白
質、ポリペプチド、例えばポリリシン、ポリヒスチジンおよびポリアルギニンが
挙げられる。本発明に有用な他のポリイオンとしては、有機ポリイオン、即ちポ
リアクリル酸、ポリカルボン酸、ポリアミン（例えばポリエチルアミン）、ポリ
スルホン酸（例えばポリスチレンスルホン酸）、ポリ燐酸（例えばポリビニル燐
酸）、またはこれらのいずれかもしくはすべてのコポリマー、例えばこれらポリ
アミノ酸の混合ポリマー等が挙げられる。これらポリイオンは、通常この関心の
あるアッセイに使用される第一試薬および／または第二試薬および／または生成
物に比べて比較的大きい。このように、ポリイオンの大きさは第一試薬および／
または第二試薬および／または生成物の大きさにより変化し得る。通常、ポリイ
オンの大きさは、約５ｋＤ〜約１０００ｋＤ、好ましくは約１０ｋＤ〜約２００
ｋＤ、さらに好ましくは約１０ｋＤ〜約１００ｋＤの範囲である。ポリアミノ酸
の場合、長さが通常、約５０〜約１０，０００個、好ましくは約１００〜１００
０個のモノマーのポリマーで構成される。 本発明で使用されるポリイオンは、一般に不特定の電荷に依存して（ｉｎ ａ
ｎｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｄｅｐｅｎｄｉｎｇ ｍａｎｎｅｒ）、反応混合
物の他の成分と相互作用できる。不特定の相互作用として、本発明で使用できる
ポリイオンは、生成物（または基質）中の特定の認識部位（ｒｅｃｏｇｎｉｔｉ
ｏｎ ｓｉｔｅ）の存在を必要としないことが理解されよう。したがって、不特
定の相互作用は、電荷に依存して生成物（または基質）と相互作用する。その結
果、適定可能なポリイオンの場合、この相互作用で使用される電荷の存在を可能
にする緩衝条件を必要とし得る。通常、ポリイオン材料は、アッセイ条件に関係
するｐＨ値で顕著な電荷量を与える等電点（ｐＩ）を有するこが好ましい。通常
、本発明のアッセイが行われる緩衝液は、ポリイオン化合物が帯電した試薬と相
互作用するのに充分な電荷量を有する生理的に関係する範囲、例えばｐＨ約６〜
約８である。しかし、理解されるように、一般に電荷量に従ってポリイオンおよ
び生成物（または基質）が配置される緩衝液を調節することにより、これらのエ
レメント間の相互作用の程度（ｌｅｖｅｌ）を調節でき、こうしてポリイオンま
たは生成物の一方または両方の電荷量に作用する。ポリイオン成分と生成物（ま
たは基質）との相互作用は勿論、最適な反応速度を生じる所定のいかなるアッセ
イも最適化するために、決まりの反応チューニングを用いることができる。
【００１９】 次に、蛍光第一試薬との相互作用に対するポリイオンと蛍光生成物との示差的
相互作用は、得られた生成物の量を比較する手段として使用される。具体的には
、比較的小さい蛍光化合物、例えば第一試薬は、分極した励起光により励起され
ると、比較的分極した蛍光を放射しやすい。生成物にポリイオンの状態で大きい
“標識”を付けることにより、生成物の脱分極した蛍光を放射する能力を変化さ
せる。次に、この特性を第一試薬と第二試薬との反応の尺度として検出、定量す
る。分析結果も前（ｐｒｅ−）反応蛍光分極量と後（ｐｏｓｔ−）反応蛍光分極
量との差として検出でき、この差は反応速度および／または反応の完成度を示す
が、通常、前述のようにして検出された蛍光分極量またはＰ値は、結合した標識
とフリーの標識との比率の尺度となる。 図１は、本発明のアッセイ方法を概略的且つ一般的に図示するものである。こ
れらの図示は、例示の目的のみであり、本発明の限定を意味するものではない。
要するに、図１２に示すように、蛍光標識した第一試薬１０２が供給される。こ
の第一試薬は、比較的速い回転拡散速度を有する。第一試薬１０２は、第二試薬
、例えば酵素Ｉと接触する。酵素Ｉは、第一試薬１０２と会合して、帯電化合物
１０６を作る帯電量１０４の付加を仲介するか、或いはそれ自体で基１０４を構
成する。得られた帯電生成物は、通常、第一試薬とは実質的に変らない回転拡散
速度を有する。
【００２０】 次に、生成物は比較的大きいポリイオン１０８と接触し、ポリイオンは帯電蛍
光生成物１０６と会合する。得られたポリイオン／帯電蛍光生成物１１０の回転
拡散速度は、元の第一試薬に比べて実質的に低下する。前述のように、このよう
な回転拡散速度の差は、例えば蛍光分極検出法を用いて定量的に測定可能である
。 関心のある反応生成物と会合するポリイオンについて一般的に説明したが、こ
こに説明する方法も逆方向に操作する。具体的には、第一試薬は任意に、必要と
する特性を全て備えたポリイオンと会合させる。次に、この反応は、生成物を作
製時に第一試薬の電荷を変える。次に、生成物は、第一試薬に比べてポリイオン
との相互作用性が低下するか除去される。次いで、この低下した相互作用は、第
一試薬に対し生成物の分極蛍光を放射する能力の変化を生じさせる。幾つかの場
合は、関心のある反応に対するポリイオンの潜在的な妨害作用の結果として、ア
ッセイに異質のフォーマット、例えば、この反応を行った後に、ポリイオンを導
入することを用いる必要があるかもしれない。本発明のアッセイ方法を均質なフ
ォーマットおよび異質のフォーマットに従って行う方法で以下に説明する。
【００２１】 次に、生成物の蛍光分極量は、例えば結合した標識とフリーの標識との比とし
て、ポリイオンに結合した標識の量の指標となる。通常、蛍光分極データは、一
般に平行な蛍光放射量および垂直の蛍光放射量の差と、これら蛍光放射量の合計
との比として報告されている。したがって、これらの蛍光放射量の差が小さいほ
ど、例えば蛍光放射の脱分極量が多いほど、分極量は小さい。逆に、蛍光放射の
分極量が多いほど、この数値は大きくなる。前述のように、アッセイ結果を比較
する際、反応混合物についての分極値（Ｐ）が決定される。結合した蛍光画分（
ｆｒａｃｔｉｏｎ）、例えばポリイオンと会合した蛍光画分は、次のように決定
される。 Ｆb ＝（Ｐ−Ｐf ）／（Ｐb −Ｐf ） （３） 式中、Ｐb は、結合した化学種のＰ値であり、Ｐf はフリーの化学種のＰ値であ
る。したがって、この分極値は、生成物と基質との比の絶対的な定量尺度として
使用できる。但し、一方は測定済みであるか、或いは完全結合の標識および完全
フリーの標識についてのＰ値が既知であると仮定する。或いは、前述のように、
得られた生成物量の指標として、反応前蛍光分極量と反応後蛍光分極量との差を
用いて、両分極量を測定できる。前述のように、このアッセイ方法は、例えばポ
リイオンが第一試薬と会合しているが、蛍光生成物とは会合していない逆のフォ
ーマットに対しても働く。この場合は、第一試薬の蛍光分極量と生成物の蛍光分
極量との差が測定される。
【００２２】 Ｐ値は、例えば得られた生成物の量を示すことにより、関心のある反応の指示
薬として役立つ。以下に詳細に説明するように、いったんアッセイ反応が定量可
能になると、このアッセイを多くの異なる利用、例えば特に反応の潜在的な抑制
剤または増進剤をスクリーニングするための診断等の利用に利用できる。これは
、通常、ここで説明した反応の１つ以上を利用する薬理学的な関係の標的、例え
ば結合性、酵素的変性等に対して化合物の蔵書（ｌｉｂr ａｒｉｅｓ）をスクリ
ーニングするのに有用である。 一般に蛍光分極の検出について説明したが、分子の回転速度または分子の大き
さに関係する分子の変形（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）または横方向の拡散を検出
する各種の検出計画が使用できることは容易に理解されよう。分子の回転を検出
する方法としては、例えば核磁気共鳴分光分析、電子スピン共鳴分光分析および
三重状態吸収異方性（ｔｒｉｐｌｅｔ ｓｔａｔｅ ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ ａ
ｎｉｓｏｔｒｏｐｙ）が挙げられる。分子の変形速度検出方法としては、例えば
蛍光相関分光分析、光漂白後の蛍光回復および磁気共鳴スピン交換分光分析が挙
げられる。
【００２３】 繰り返し前述したように、本発明の一般的な方法およびシステムは、酵素媒介
反応、結合反応および混成反応等の各種の異なる種類の生物学的または生化学的
に関係する反応に使用できる。 結合反応の場合、蛍光標識を付けた第一試薬は、第一試薬に結合して蛍光標識
生成物を生じる第二試薬と接触する。第二試薬は、通常、第二試薬の第一試薬へ
の結合によって生じる生成物が第一試薬単独とは実質的に異なる電荷を持つよう
な電荷量を有する。 このような結合アッセイの簡単な例は、核酸混成アッセイである。具体的には
、サンプルまたは標的の核酸中の特定の核酸配列または部分列の存在を測定する
際、標的核酸を短い核酸プローブで情報調査することが多い。このようなプロー
ブは、標的中の関心のある配列または部分列に補足的であり、したがって混成可
能である。もしプローブが標的配列に混成すれば、関心のある部分列の存在が示
される。先に説明した高処理量方法は、一般にプローブまたは標的配列の少なく
とも１つは、例えば固体支持体上またはオリゴヌクレオチド配列に不動化する必
要があった（例えばＵＳＰ Ｎｏ．５、１４３、８５４およびＮｏ．５，７４４
，３０５参照）。ある種の溶液をベースとする混成検出方法が記載されているが
、これらの方法は、情報調査すべき配列用に特別に合成した試薬、例えばＦＲＥ
Ｔ染料対、分子ビーコン等を必要とする。
【００２４】 本発明の場合は、第一試薬は通常、蛍光標識を付けた実質的に帯電していない
か或いは正帯電の核酸類似体である。好適な核酸類似体は、一般に公知であり、
例えばペプチド核酸（ＰＮＡ）、メチルホスフェートポリマー、およびカチオン
性核酸類似体である。一例として、ＰＮＡは、核酸分子の高度に帯電したグリコ
ホスフェート主鎖とは対照的に、一般に、主鎖（ｂａｃｋｂｏｎｅ）上に核塩基
（ｎｕｃｌｅｏｂａｓｅ）が配列された非帯電のペプチド主鎖を有する。ＰＮＡ
は、補足的な核酸ストランドに対し有利な混成特性、例えば高融点を示すことは
勿論、市販品として広く入手できるので好ましい。これらの核酸類似体は中性か
或いは幾つかの場合は正帯電しているので、このアッセイのポリカチオンとは電
荷ベースの会合を形成しない。本発明の核酸アッセイの場合は正帯電のポリイオ
ンである。本発明の目的には、核酸類似体の１つの重要な特徴は、別々にポリイ
オン成分と相互作用する能力がないことが理解されよう。通常、これは、核酸類
似体が実質的に帯電していない、例えばポリイオンと相互作用するのに十分な電
荷を持っていないことを意味する。勿論、多くの場合、核酸類似体は、ある量の
電荷、例えば蛍光標識と会合した電荷を持っているし、或いは正味電荷が正であ
っても負であっても、相互作用を防止するようにポリイオンと同じ種類の電荷を
持っている。例えば、核酸アッセイの場合は、核酸類似体は、正帯電していても
或いは実質的に帯電していなくてもよい。
【００２５】 核酸は高度に帯電した化学種なので、実質的に帯電していないか或いは正帯電
した核酸類似体は、第一試薬として使用される。これは、フリーのプローブと、
標的配列の存在による混成物上の電荷により標的配列と混成するプローブとに差
を生じさせる。ポリイオンは、プローブと混成しないものを含む全ての標的配列
と会合するが、この相互作用が蛍光標識を付けていない結果として、調査者は相
互作用を見ることができない。この核酸混成アッセイを図２に図示する。 図示したように、標的核酸２０２は、通常、正帯電しているか或いは実質的に
帯電していない核酸類似体、例えばＰＮＡプローブからなる蛍光プローブ２０４
（蛍光標識は* として示す）で情報調査される。このプローブは、標的核酸２０
２中に特別なヌクレオチド配列、例えば関心のある配列に対し補足的なものが存
在すれば、この配列と選択的に混成するように選択される。個々のプローブは、
矢印２０６で図示したように、その最小の大きさにより比較的高い回転拡散速度
を有し、これにより高度に分極した蛍光を放射する。
【００２６】 パネルＩで図示した反応は、標的配列２０２が関心のある配列を含むので、プ
ローブ２０４は標的配列２０２と混成して第一混成物２０８を形成する場合を示
している。プローブに比べて混成物は長いので、この混成反応により、矢印２１
０で示したように、蛍光標識した化合物（この場合は、混成物）の拡散の回転速
度は低下する。しかし、標的物を超える混成物の大きさ増大ばかりでなく核酸の
可とう性により、この低下は重大にはなり得ないし、また容易に検出可能になり
得ない。しかし、本発明の方法によれば、この信号（P ）は、混成物にポリイオ
ン化合物２１２を添加することにより、効果的に増幅される。具体的には、核酸
、即ち標的配列は、その負帯電のホスフェート／糖主鎖により高度に帯電した化
学種である。したがって、この電荷は、核酸が２重のストランド状態で存在して
いても、存在する。 混成物２０８にポリイオン化合物、例えばポリカチオン２１２、即ちポリリシ
ンを添加すると、ポリカチオンは、混成物２０８と会合錯体２１４状に会合し、
これにより矢印２２２で図示したように、全錯体２１４の回転拡散を実質的に増
大させる。この差はいっそう容易に検出される。
【００２７】 これに対し、パネルＩＩに図示した反応は、標的配列２０２が蛍光プローブ２
０４の配列に補足的な関心のある配列を含まない例を示す。この場合、プローブ
および標的の配列は、混成できず、また蛍光成分（混成していないプローブ）の
回転拡散は矢印２１６で示すように、元のままである。さらに、この反応にポリ
カチオン性ポリイオンを添加しても、ポリイオンは高度に帯電した標的配列と会
合錯体２１８として再び会合する。しかし、このポリカチオンはプローブの帯電
していないかまたは帯電したような性質のため蛍光プローブ２０４とは会合しな
い。このように、蛍光化合物（再び、混成していないプローブ２０４）の回転拡
散は、矢印２２０に示すように、元のままである。その結果、混成が生じる場合
、即ち関心のある配列が標的中に存在する場合、分極した励起光で励起した時、
反応からの蛍光放射は、混成していないプローブに比べて実質的に分極される。
逆に、混成が起きない場合、即ち関心のある配列が存在しない場合、蛍光分極量
に変化はない。したがって、蛍光分極の変化は、この配列の存在の指示薬となる
。 本発明の方法およびシステムは、得られる錯体が結合対の中の蛍光標識した部
材とは実質的に異なる電荷を有する場合、他の各種結合アッセイを実施するのに
も有用である。例えば、蛍光配位子が標識のない帯電受容体に結合する受容体結
合アッセイでは、本発明方法は、大きいポリイオン化合物を錯体と会合させるこ
とにより、錯体からの蛍光分極信号を増幅するのに役立つ。理解されるように、
本発明にしたがって広範な各種の結合アッセイを行うことができる。多数のアッ
セイでさえ、例えば結合した錯体が最終錯体の蛍光標識したフリーの部材とは実
質的に異なる電荷を有する場合、これらの方法に従って機能するように構成する
ことができる。
【００２８】 本発明の方法およびシステムはまた、酵素活性によって、酵素が作用した基質
とは実質的に異なる電荷を有する生成物を作製する酵素活性のアッセイに特に有
用であることが判る。本発明の方法およびシステムに好適な各種酵素アッセイの
一例は、適当な基質へまたは該基質からホスフェート基を添加または移動する方
法、例えばキナーゼアッセイおよびホスファターゼアッセイである。これらの活
性に対する関心は、生体中の各種の生理学的に関係する応答反応を媒介する際、
実質的にそれらの役割によるものである。特に、キナーゼおよびホスファターゼ
反応は前駆体となることが多く、或いは生存および増殖のような錯体細胞の働き
において信号用イベント（ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｅｖｅｎｔｓ）を媒介する。こ
のように、錯体細胞の活性は、その働きが機能していない疾病、例えば癌等を伝
える（ａｄｄｒｅｓｓ）点で特に関心がある。 前述のように、本発明はキナーゼ酵素の活性のアッセイに特に有用である。キ
ナーゼ酵素は通常、ホスホリル化可能な基質、例えば蛋白質、ペプチド、ヌクレ
オチド、炭水化物等にホスフェート基を添加することにより機能する。ホスファ
ターゼ基は高度に帯電しているので、これらを特定の基質に添加すると、通常、
基質に対する（ｏｖｅｒ）生成物の電荷に相当な変化が起こる。前述のアッセイ
方法のように、このような基質に対する生成物の電荷の変化は、基質に対する生
成物の蛍光分極量に顕著な差を与えるポリイオン化合物を添加することにより利
用できる。
【００２９】 要するに、ホスホリル化可能な基質に前述のように、蛍光標識用の基を付与す
る。このホスホリル化可能な基質は、中性であっても帯電していてもよい。好ま
しい基質は、関連のアッセイ条件下で中性である。各種のホスホリル化可能な基
質が市販品として入手できる。例えば蛋白質キナーゼ用のローダミン標識した基
質は、一般にＰｒｏｍｅｇａ Ｉｎｃ．から市販されているし、他のホスホリル
化可能な基質はＲｅｓｅｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｉｎｃ．から得られる。 蛍光ホスホリル化可能な基質は、通常、比較的小さく、例えば約２ｋＤ未満な
ので、比較的高い回転拡散速度を有し、またこれにより分極光で励起すると、脱
分極した蛍光を放射する。ホスフェートドナー、例えばＡＴＰの存在下にキナー
ゼ酵素を接触させると、基質はホスホリル化され、導入された各ホスフェートに
対し、２つの更なる負電荷を与える。特に、予め除電した基質の場合は、この正
味２つの電荷は、生成物と、ポリイオン化合物、例えばポリリシンまたはポリヒ
スチジンのようなポリイオン化合物との相互作用の基礎となる。いったんこのポ
リイオンがホスホリル化した基質と会合すると、ポリイオンは顕著な回転拡散速
度を示し、これにより蛍光脱分極の速度は低下し、例えば蛍光分極を増大させる
。次に、この分極変化を検出し、キナーゼ反応の定量に用いる。
【００３０】 この反応の概略を図３に示す。図示したように、蛍光標識したホスホリル化基
質３０２は、例えばＡＴＰ状のホスフェート３０４の存在下にキナーゼ酵素３０
６と接触させる。この反応は、ホスホリル化した生成物３０８を生じる。蛍光基
質３０２およびホスホリル化蛍光生成物３０８の両方とも小さいため、比較的高
い回転拡散速度を有する。次に、この蛍光ホスホリル化生成物をポリカチオンと
接触させる。好ましいポリカチオンとしては、ポリリシン、ポリヒスチジン等の
ポリアミノ酸が挙げられるが、ポリヒスチジンが最も好ましい。次に、ポリカチ
オンは負帯電の蛍光生成物と会合し、これによりその大きさおよび回転拡散速度
に劇的な影響を与える。次に、この会合物を前記繰り返し説明したように検出す
る。理解されるように、ポリイオン成分は或いは例えばＦｅ3+、Ｃａ2+、Ｎｉ2+ およびＺｎ2+から選ばれた多価金属カチオンと会合させた大分子、例えば蛋白質
等で構成されてもよい。このような分子の例としては、これらのイオンをキレー
トする金属キレート性蛋白質等が挙げられる。具体的には、これら金属イオンは
、酸素、窒素および硫黄基に対し比較的高い親和性を有する。その結果、金属イ
オンは、例えば核酸またはホスホリル化基質中のホスフェート基や、酸素、窒素
または硫黄基を有する他の基に対し、大分子（ポリイオンとして）との顕著な結
合親和性を与え、ここに説明したように、顕著な蛍光化学種の回転拡散速度を与
えるのに使用される相互作用を生じる。
【００３１】 本発明はまた逆反応をアッセイするのに好適である。具体的には、ホスホリル
化基質からホスフェート基を除去するホスファターゼ反応である。この反応は、
図３に示した反応とはほぼ逆の経路をたどり、図４に図示した。要するに、本例
では基質であるホスホリル化した蛍光化合物３０８は、ポリカチオン化合物３１
０と接触させ、ポリカチオンがホスフェート基により付与された電荷と会合した
会合錯体３１２を生じる。上記図３についても述べたように、この錯体は、回転
拡散速度の遅いものである。この錯体をホスファターゼ酵素４１４上で作用させ
ると、本例では生成物である蛍光成分３０２から帯電ホスフェート基およびその
会合したポリカチオン４０４の開裂が起きる。大きいポリカチオン化合物がない
と、蛍光生成物の回転拡散速度は非常に増大し、例えば脱分極した蛍光を放射す
る。この蛍光分極量の変化は、前述のように再び検出される。前述のように、幾
つかの場合には、このアッセイは、例えばポリイオンの存在による関心のある反
応への悪影響を避けるため、反応後にポリイオン成分を添加する異質のフォーマ
ットで行ってもよい。
【００３２】 各種のアッセイを達成する能力はそれ自体有用であるが、これらアッセイを用
いる特定の利用は通常、最大の価値がある。特別な関心は、前述の各種活性に対
する潜在的な薬学的候補の化合物の効果をテストする能力である。具体的には、
薬学的な発見プロセスでは一般に薬理学的関係の標的に対し化学的化合物の大き
な蔵書がスクリーニングされる。これらの標的としては、受容体、酵素、輸送体
等が挙げられる。各種スクリーニングアッセイおよびシステムについて記載され
ている。例えば、参考のためここに取り入れた国際特許出願公開Ｎｏ．ＷＯ ９
８／００２３１参照。 要するに、生物学または生化学的に関係する特定の反応は、スクリーニングす
べき化合物の存在下または不存在下に行われ、該化合物の効果が測定される。具
体的には、反応がテスト化合物の存在によって低下するか、阻止されるならば、
該化合物は反応の抑制剤として同定される。逆に、反応がテスト化合物の存在下
で急速にまたはかなりの程度まで進行する場合、該化合物は反応の増進剤として
同定される。次に、これらのスクリーニングアッセイは、関心のある反応につい
ての散在的な効果剤（ｅｆｆｅｃｔｏｒ）を手早く発見するために、多数の異な
る化合物について直列または並列に行われる。
【００３３】 ＩＩＩ．アッセイシステム 本発明は、また前記方法を実施する際に使用されるアッセイシステムを提供す
る。通常、ここで説明するアッセイシステムは、該アッセイを行うために内部に
試薬を入れた流体容器を含む。この流体容器は、通常、内部に第一試薬混合物を
配置した第一反応帯を有する。該第一試薬混合物は、蛍光標識を付けた第一試薬
と、該第一試薬と反応して第一試薬とは実質的に異なる電荷を有する蛍光標識生
成物を生じる第二試薬と、ポリイオン化合物とからなる。 図５は、本発明を実施する際に使用される全体のアッセイシステムの概略図で
ある。要するに、全体システム５００は、前述のような反応容器５０２を有する
。この反応容器に近接し且つ反応容器の感知連絡内に検出器または検出システム
５０４が配置されている。ここで“感知連絡内”という語句は、容器からの特定
の信号を受信することができるように容器に対して位置する検出器をいう。光検
出器、例えば蛍光検出器または蛍光分極検出器の場合、感知連絡は通常、検出器
が光信号、例えば蛍光信号がこれら信号を充分検出する検出器に搬送される容器
に充分に近接して検出器が配置されていることを意味する。通常、レンズ、光学
トレーン（ｏｐｔｉｃａｌ ｔｒａｉｎ）または他の検出エレメント、例えば容
器の関係部分に収束して効果的にこれらの光信号を集め記録するＣＣＤが使用さ
れる。
【００３４】 検出器５０４は、通常、容器から得られたデータを保存し、分析し、ユーザー
が理解可能な方式、例えばディスプレー５０８で表示できる適当なデータ保存部
および／または分析ユニット、例えばコンピューターまたは他のプロセッサーに
接続している。ある態様、例えば微小流体容器を用いる態様では、コンピュータ
ー５０６は任意に適当なコントローラーユニット５１０に接続している。コント
ローラーユニットは微小流体デバイス容器のチャンネル内の流体材料の動きをコ
ントロールし、および／または例えばｘ−ｙ−ｚ解釈段階（ｔｒａｎｓｌａｔｉ
ｏｎ ｓｔａｇｅ）を経て容器５０２と検出器５０４との相対位置をコントロー
ルするものである。 この容器はまた、検出帯および該検出帯と感知連絡可能に配置された検出器を
有する。本発明に従って使用される検出器は、通常、検出帯中で試薬の蛍光分極
量を検出するように構成されている。 ここで使用されるように、容器は各種の形状を取ってよい。例えば、単独の反
応容器、ウエル（ｗｅｌｌ）、チューブ、キュベット（ｃｕｖｅｔｔｅ）等であ
ってよい。或いは、容器は、毛細管またはチャンネルを単独で、或いは１つ以上
の流体チャンネル、流体チェンバー等を有する集積流体システムの前後関係（ｃ
ｏｎｔｅｘｔ）で備えていてもよい。 単独の反応容器、ウエル、チューブ、キュベット等の場合、反応帯および検出
帯は通常、容器の同じ流体含有部分をいう。例えばキュベットの液体含有部分内
で試薬を混合し、反応させ、次いで検出する。通常、アッセイ、例えばスクリー
ニングアッセイ方法を利用するには、複合容器が使用できる。このような容器の
例としては、多数のウエルを有する板（ｍｕｌｔｉｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）、即
ち９６ウエル、３８４ウエルまたは１５３６ウエル板が挙げられる。
【００３５】 毛細管またはチャンネルをベースとする場合は、反応帯および検出帯は、容器
の同じ流体含有部分からなる。しかし、多くの場合、反応帯および検出帯は、容
器の別々の流体含有部分である。具体的には、試薬は容器の一部で混合、反応さ
せ、次いで別途の検出帯に移し、そこで生成物等を検出する。 特に好ましい面では、容器は微小流体デバイスからなる。ここで使用する用語
“微小流体デバイス”は、少なくとも１つの流体成分、例えばチャンネル、チェ
ンバー、ウエル等を有するデバイスまたは本体構造をいい、少なくとも１つの横
断面寸法が約０．１〜約５００μｍで、これらチャンネルおよびチェンバーの多
くは少なくとも１つの横断面寸法が、約０．１〜約２００μｍ、幾つかの場合、
約０．１〜約１００μｍ、多くの場合、約０．１〜約２０μｍのものである。こ
のような横断面寸法としては、例えば幅、深さ、高さ、直径等が挙げられる。通
常、これらの寸法を有する構造は、“微小規模”として説明する。本発明による
微小流体デバイスとしては、単独の本体構造中に配置された少なくとも１つ、好
ましくは１つ以上の、チャンネルおよび／またはチェンバーが挙げられる。これ
らチャンネル／チェンバーは、別々に離れていても、或いは流動可能に接続され
ていてもよい。このような流体接続はチャンネル、チャンネル交差、バルブ等に
よって得られる。チャンネル交差は多数のフォーマットに存在させてよく、十字
交差、“Ｔ”交差、幾つかの他の構造によって２つのチャンネルが流動可能に連
絡するもの等がある。
【００３６】 本発明の微小流体デバイスの態様は、その制御性のため、ここで説明したアッ
セイの異質形態を実施するのに特に有用である。特に、反応は微小規模のチャン
ネルネットワークの第一領域で行われる。次に、反応の生成物はこのチャンネル
ネットワークの他の部分に移行されるか、或いは追加成分をチャンネルネットワ
ークの元の部分に導入し、反応生成物と混合する。例えば、関心のある反応後に
、ここで説明したアッセイ方法のポリイオン成分を添加して、該成分が反応を妨
害しないことを保証することができる。微小流体システムは、各種試薬がデバイ
スの各種チャンネルを正確に通過して試薬の正確な測定および適時添加を可能に
する能力を提供する。一例として、微小流体デバイスの第一チャンネル領域中の
ホスホリル化基質上でホスファターゼ反応を行って、ホスホリル基、例えばＡＴ
Ｐ、および未反応基質共に未ホスホリル化生成物を生じることができる。次に、
反応混合物をポリイオンを含有する別のチャンネルに移すか、或いは元のチャン
ネル断片中の反応混合物にポリイオンを導入することにより、反応混合物をポリ
イオン成分、例えばポリヒスチジンと混合する。次いで得られた混合物を、蛍光
分極を検出する検出点を超えて移動させる。 ここで説明した微小流体デバイスの本体構造は、通常、適切に合体または結合
した時、例えばここで説明したチャンネルおよび／またはチェンバーを含む本発
明の微小流体デバイスを形成するような２つ以上の個別成分を集合したものであ
る。ここで説明した微小流体デバイスは、通常、基質層の集合体として組み立て
られる。特に、この種の好ましいデバイスは、頂部、底部、および内部からなり
、該内部が実質的にデバイスのチャンネルおよびチェンバーを形成するものであ
る。
【００３７】 図６は、微小流体デバイス用の２層本体構造６１０を図示するものである。好
ましい面では、デバイスの底部６１２は、構造が実質的に平坦な固体基質からな
り、少なくとも１つの実質的に平坦な上表面６１４を有する。底部としては、各
種の基質材料が使用できる。通常、デバイスは微小の組み立て品なので、基質材
料は公知の微小組み立て技術、例えばホトリソグラフィ、ウエット化学エッチン
グ、レーザーアブレーション（ａｂｌａｔｉｏｎ）、エアー摩耗技術、射出成形
、エンボス法、その他の技術との両立性に基づいて選択される。基質材料は一般
に、各々極限のｐＨ、温度、塩濃度、電場の適用等、微小流体デバイスを暴露し
得る充分な範囲の条件との両立性についても選択される。したがって、幾つかの
好ましい面では、基質材料としては、これらの微小組み立て技術が正規に使用さ
れている半導体業界と普通に組み合わせた材料で、例えばガラス、石英、シリコ
ンまたはポリシリコン等、その他、ヒ化ガリウム等の他の基質材料が挙げられる
。半導体材料の場合、特にデバイスまたはその内容物に電場が適用されるような
利用において、絶縁性のコーティングまたは層、例えば基質材料上の酸化シリコ
ンを付与するのが望ましいことが多い。
【００３８】 さらに好ましい面では、基質材料はポリマー材料、例えばポリメチルメタクリ
レート（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート、ポリテトラフルオロエチレン〔ＴＥＦ
ＬＯＮ（商標）〕、ポリ塩化ビニル、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポ
リスルホン、ポリメチルペンテン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ弗化ビ
ニリデン、ＡＢＳ（アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン共重合体）等のプ
ラスチックからなる。これらのポリマー基質は前述のような利用可能な微小組み
立て技術を用いるか、或いは微小組み立てマスターから周知の技術、例えば射出
成形、エンボス、スタンピング等を用いて容易に製造できる。このようなポリマ
ー基質材料は、最も極限の反応条件に対し一般に不活性である他、製造の容易さ
、低価格、処分性等のため好ましい。また、これらポリマー材料としては、例え
ば、ＵＳＰ Ｎｏ．５，８８５，４７０に記載されるように、微小流体システム
での有用性を増進する、例えば流体の方向を増進する処理表面、例えば誘導化し
た（ｄｅｒｉｖａｔｉｚｅｄ）表面またはコーティング表面が挙げられる。前記
文献は、あらゆる目的で参考のため全体をここに取り入れた。 微小流体デバイスのチャンネルおよび／またはチェンバーは、通常、前述の微
小組み立て技術を用いて底部基質または底部６１２の上表面のいずれかまたは両
方の中に微小規模の溝または刻み目として組み込まれる（任意に、底部基質の上
表面または上部基質の下表面のいずれか、または両方に組み込まれるが）。頂部
または基質６１８も第一平坦表面６２０および第一平坦表面の対面の第二表面６
２２からなる。ここで説明した方法に従って製造した微小流体デバイスにおいて
、頂部も、例えば第一平坦表面６２０から第一平坦表面の対面の第二表面６２２
まで貫通配置された、各々複数の開口、孔または入口（ｐｏｒｔ）を有する。
【００３９】 次に、頂部基質６１８の第一平坦表面６２０は合体され（ｍａｔｅ）、例えば
底部基質６１２の平坦表面６１４と接触して置かれるか、或いはこれと結合し、
底部基質の表面中の溝および／または刻み目６１６を覆うと共にシールして、こ
れら２つの成分の界面にデバイスのチャンネルおよび／またはチェンバー（即ち
、内部）を形成する。デバイス頂部の孔６２４は、底部基質の溝および／または
刻み目からデバイスの内部に形成されたチャンネルおよび／またはチェンバーの
少なくとも１つと連絡するように配向されている。完成したデバイスでは、これ
らの孔は、電極をデバイス内の流体と接触して置くことが可能な入口を供給する
他、デバイス内部のチャンネルおよび／またはチェンバーへの流体の導入を容易
にするリザーバーとして機能し、デバイス内の流体の搬送を制御、管理するデバ
イスのチャンネルに沿って電場の適用を可能にする。 多くの態様では、微小流体デバイスは、デバイスのチャンネルおよび／または
チェンバーの少なくとも１つを横断して配置された光検出窓を有する。光検出窓
は、これらの設置箇所上のチャンネルおよび／またはチェンバーから光信号を送
ることができるように、通常、透明である。光検出窓は、ガラスまたは石英、或
いは透明なポリマー材料、例えばＰＭＭＡ、ポリカーボネート等である。或いは
、デバイスの製造に不透明な材料を用いた場合は、上記材料から作った透明検出
窓を別途にデバイス中に入れて製造してもよい。
【００４０】 以下に詳細に説明するように、これらのデバイスは、各種の利用、例えば薬の
発見、免疫アッセイ、診断、遺伝子分析等において、高処理量スクリーニングア
ッセイを実施するのに使用できる。このように、ここで説明したデバイスは、多
数（ｍｕｌｔｉｐｌｅ）のサンプルを並列にまたは直列に導入するための多数サ
ンプル導入口またはリザーバーを有することが多い。或いは、これらのデバイス
は、サンプル導入口、例えば多数のサンプルを分析用のデバイスに直列に導入す
るピペット器に結合させてもよい。このようなサンプル導入システムの例は、Ｕ
ＳＰ Ｎｏ．５，７７９，８６８、国際特許出願公開Ｎｏ．ＷＯ９８／００７０
５およびＮｏ．ＷＯ９８／００２３１に記載されている。これらの各文献は、あ
らゆる目的で参考のため全体をここに取り入れた。外部サンプルピペット器を入
れた微小流体デバイスの概略を下記図７に図示する。 幾つかの基質、例えばガラス、石英またはシリカの場合、微小流体デバイスの
チャンネル中にコーティング材料を含むのことが時には好ましい。これは主とし
てポリイオン成分と基質の帯電表面間の相互作用の程度を減じるためである。こ
の点、公知の各種コーティング材料のずれも有用であり、通常電気泳動的利用に
使用されるポリマーコーティング、例えば直鎖状ポリアクリルアミド、例えばポ
リジメチルアクリルアミド（ＰＤＭＡ）等（例えば、ＵＳＰ Ｎｏ．５，９４８
，２２７、同５，５６７，２９２、同５，２６４，１０１参照。各々参考のため
取り入れた）が挙げられる。これらのポリマーは、シリカ吸収性であってもよく
、或いは反応混合物中のポリイオン化学種と相互作用可能な基質上の表面電荷を
マスクするために、基質の表面に、例えばポリマー鎖上に含まれるエポキシド基
により共有的に結着していてもよい（例えば、Ｃｈｉａｒｉ等、ＨＰＣＥ Ｃｏ
ｎｆｅｒｅｎｃｅ，Ｍａｒｃｈ，２０００参照）。
【００４１】 要するに、微小流体デバイス７００、例えば図６について説明したのと同様の
ものを供給する。このデバイスは本体構造７０２を有し、この本体構造は内部チ
ャンネルのネットワーク７０４を含む。これらのチャンネルは、本体構造７０２
中に配置された一連のリザーバー７０６に接続している。デバイスのチャンネル
７０４に各種試薬を導入するため、各種のリザーバーが使用される。本体構造７
０２には毛細管エレメント７０８が結合し、こうしてエレメント７０８の長さ内
に配置され、走行するチャンネル７１０が本体構造中のチャンネルネットワーク
７０４と流動可能に接続される。次に、毛細管エレメント７０８は、デバイス内
で分析するため、各種の異なるサンプルまたはテスト材料を直列に引き上げるの
に使用される。 前述のように、本発明補方法およびシステムは、通常、関心のある反応の結果
としての反応混合物の蛍光分極量の変化に応答する。このように、適切な検出シ
ステムは、通常、分極した放射蛍光を脱分極した放射蛍光から識別するために利
用される。一般的にいえば、このような検出システムは、通常、分極した励起光
の同じ平面で放射した蛍光、およびこの励起光の平面とは異なる平面で放射した
蛍光を別々に検出する。
【００４２】 検出システムの一例を図８に示す。図示するように、蛍光分極検出器は、アッ
セイシステム中に存在する蛍光物質に対し適切な励起波長の光を発生する光源８
０４を含む。通常、レーザー、レーザーダイオード等の干渉光源は、生じる光が
高度に分極した性質を有するので好ましい。この励起光を、一平面中の光、例え
ば分極光だけを通す光分極化フィルター８０６に向けて通す。次に、この分極励
起光を光学トレーン、例えば２色（ｄｉｃｈｒｏｍｉｃ）ミラー８１０および顕
微鏡対物レンズ８１２（および任意に、基準ビームスプリッター８０８）に向け
て通す。光学トレーンは、アッセイすべきサンプルを入れたサンプル容器（微小
流体デバイス８０２中のチャンネルとして示す）上に分極光を収束する。 次に、サンプルから放射した蛍光を例えば対物レンズ８１２により収集し、２
色ミラー８１０により戻す。２色ミラーは、放射した蛍光を通し、反射した励起
光を反射し、２つの光に分離する。次に、この放射蛍光をビームスプリッター８
１４に向けて通す。ここで蛍光の一部はフィルター８１４に向かってここを通る
。フィルター８１４は、励起光の平面に平行な平面に存在する蛍光をろ過すると
共に、垂直の蛍光を第一光検出器８１８上に向ける。蛍光の他の部分は、フィル
ター８２０を通過する。フィルター８２０は励起光の平面に垂直の蛍光をろ過す
ると共に、平行な蛍光を第二光検出器８２２に向ける。代わりの面では、ビーム
スプリッター８１４は、分極性ビームスプリッター、例えばグラン（Ｇｌａｎ）
プリズムと置換し、フィルター８１６および８２０の必要性をなくす。次に、こ
れらの検出器８１８および８２２は、適切なレコーダーまたはプロセッサー（図
８には図示せず）に結合させ、ここで、以下に詳細に説明するように、光信号を
記録し、およびまたは処理する。光増幅管（ＰＭＴ）は、一般に光量の定量用光
検出器として好ましいが、他の光検出器、例えばホトダイオード等も任意に使用
される。
【００４３】 検出器は通常、コンピューターまたは他のプロセッサーに結合している。これ
は、光検出器からのデータを受信し、また各検出器からの値を比較してサンプル
からの分極量を測定するために、適切なプログラミングを含んでいる。特にコン
ピューターは、通常、各異なる検出器からの蛍光強度、例えば平行な蛍光および
垂直の蛍光を入力として受信するソフトウエアプログラミングを含んでいる。次
に、蛍光強度を各検出器について比較し、蛍光分極値を得る。このような比較の
一例は、式：
【数２】 Ｐ＝［Ｉ（‖）−Ｉ（⊥）］／［Ｉ（‖）＋Ｉ（⊥）］Ｃ （４） 式中の記号は、検出機器の分極バイアスを修正する修正ファクター（Ｃ）以外は
、前述の通りである。コンピューターは関心のある反応についての蛍光分極値を
決定する。この分極値から、およびフリーの蛍光および結合した蛍光についての
蛍光値に基づいて、コンピューターは結合した蛍光とフリーの蛍光との比を計算
する。或いは、反応前の分極値と反応後の分極値とを比較し、分極差（ΔＰ）を
決定する。次に、計算した分極差は、例えば特定の反応の潜在的エフェクター（
ｅｆｆｅｃｔｏｒ）を同定するための絶対値として使用してもよいし、或いは特
定化合物による、関心のある反応の抑制または増進の程度を定量するために、該
反応の公知の抑制剤または増進剤の存在下に得られた分極差と比較してもよい。
【００４４】 図９は、前述のソフトウエアプログラミングを用いたコンピューターで行った
プロセスのフローチャートを示す。図示するように、プログラムのプロセスは、
工程９０２で始まる。ここで、コンピューターは２つの検出器、例えば図８の検
出器８１８および８２０から、反応帯（例えば、図５の容器５０２）中の未反応
試薬についての蛍光強度データを受信する。次に、工程９０４では、例えばここ
で説明した式に従って蛍光分極値（Ｐ）が計算される。工程９０６では、コンピ
ューターは上記２つの検出器から、反応した試薬についての蛍光強度データを受
信する。工程９１０では、反応した試薬および未反応の試薬のＰ値が比較され、
一方の値を他方の値から引いて反応についてのΔＰ値を得る。この点において、
ΔＰ値は反応の尺度、例えば反応の速度または完成度として表示できる。しかし
、任意にこのΔＰ値を標準のΔＰ値、即ち、例えば工程９１２で既知の速度、抑
制または増進の程度を有する反応から得られたΔＰ値と比較してもよい。この比
較により、次にコンピューターは反応の定量尺度を内挿または外挿する。この定
量測定は、例えば工程９１４で反応の抑制または増進の程度を調査者に表示する
ことができる。前述のように、コンピューターは、完全にフリーのまたは完全に
結合した蛍光について測定した分極値を任意に含むことができる。この場合、蛍
光差の測定は必要としないので、プログラムの中の数工程を除くことができる。
この場合、コンピューターは、反応混合物について検出器から蛍光データを受信
する。次いで、コンピューターは単に反応混合物についてのＰ値を計算し、結合
した蛍光とフリーの蛍光との比を測定する（例えば上記式（３）に従って測定す
る）。次に、この比は反応を定量するのに使用される。 高処理量スクリーニングアッセイシステムの場合、コンピューターのソフトウ
エアは、特定のサンプルまたはサンプル獲得（ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ）位置に
対する特定のスクリーニング結果の相関関係を指示する。これにより、調査者は
いずれか１つのアッセイで使用した特定の試薬を同定できる。
【００４５】 図１０は、本発明で通常使用されるコンピューターおよび構成の概略を示す。
特に、図１０Ａは、本発明方法を実施する際または本発明のデバイスおよび／ま
たはシステムと協同で使用されるソフトウエアを実行するために使用できるコン
ピューターシステムの一例を示す。コンピューターシステム１０００は、通常、
ディスプレー１００２、スクリーン１００４、キャビネット１００６、キーボー
ド１００８およびマウス１０１０を有する。マウス１０１０は、クラフィックユ
ーザーインターフェース（ＧＵＩ）と相互作用するボタンを１つ以上有する。キ
ャビネット１００６は通常、ＣＤ−ＲＯＭドライブ１０１２、システムメモリー
およびハードドライブ（図１０Ｂ参照）を収容している。これらは、本発明方法
を行い、および／または本発明のデバイスおよびシステムの操作、本発明と併用
するデータ等をコントロールするコンピューターコードを取り入れたソフトウエ
アプログラムを保存し、検索するのに使用できる。保存媒体の読み出し可能な好
例のコンピューターとして、ＣＤ−ＲＯＭ１０１４を示したが、フロピーディス
ク、テープ、フラッシュメモリー、システムメモリーおよびハードドライブを含
む他の保存媒体読み出し可能なコンピューターも使用できる。さらに、キャリア
ウエーブ（例えばインターネット、イントラネット等のネットワーク）中に含ま
れるデータ信号は、保存媒体読み出し可能なコンピューターとなり得る。 図１０Ｂは、前述のコンピューターシステム１０００のブロックダイアグラム
の概略を示す。図１０Ａの場合のように、コンピューターシステム１０００は、
モニターまたはディスプレー１００２、キーボード１００８およびマウス１０１
０を有する。コンピューターシステム１０００は通常、中央プロセッサー１０１
６、システムメモリー１０１８、固定保存部１０２０（例えばハードドライブ）
、除去可能な保存部１０２２（例えばＣＤ−ＲＯＭドライブ）、ディスプレーア
ダプター１０２４、音声カード１０２６、スピーカー１０２８およびネットワー
クインターフェース１０３０等の副システムも含んでいる。本発明を使用するの
に利用可能な他のコンピューターシステムは、もっと少ないか多い副システムを
含んでいてもよい。例えば他のコンピューターシステムは、任意にプロセッサー
１０１４を２つ以上含む。
【００４６】 コンピューターシステム１０００のシステムバス構成（ｂｕｓ ａｒｃｈｉｔ
ｅｃｔｕｒｅ）を矢印１０３２で示す。しかし、これらの矢印は、副システムの
接続に役立つ相互連絡計画（ｓｃｈｅｍｅ）を示すものであればよい。例えばロ
ーカルバスを利用して、中央プロセッサーをシステムメモリーおよびディスプレ
ーアダプターに接続することができる。図１０Ａに示したコンピューターシステ
ム１０００は、本発明と併用するのに好適なコンピューターシステムの一例にす
ぎない。コントローラー検出器設備（ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ）上に設
けた内蔵（ｏｎ−ｂｏａｄ）プロセッサーや“インターネット器具”構成のよう
な埋め込みシステムを含む異なる構成の副システムを有する他のコンピューター
構成も利用できる。なお、前記システムはインターネット接続により主プロセッ
サーに接続している。 コンピューターシステムは通常、設定したパラメーターフィールド中に、例え
ばＧＵＩにユーザーが入力する形態で、或いは予めプログラムした指示、例えば
各種の異なる特定の操作に対して予めプログラムした指示の形態で、ユーザーの
指示を受けるための適切なソフトウエアを含んでいる。次に、ソフトウエアは、
これらの指示を、任意の材料搬送システムの操作を指示するため、および／また
は検出システムから受信したデータをコントロールする、保存する等のために、
適切な言語に変換する。特に、コンピューターは通常、検出器からデータを受信
し、このデータを解釈し、次いでこれをユーザーが理解したか或いは便利なフォ
ーマット、例えば生のデータのプロット、計算服用量の応答カーブ、酵素の運動
定数等の１つ以上を提供するか、或いはこのデータを用いてプログラミングに従
って更なるコントローラの指示、例えば流速、適用温度、試薬濃度等の制御を開
始する。
【００４７】 前述のように、本発明は任意に微小流体デバイスまたはシステム中で行われる
。このように、一般に材料を、これらのデバイスに含まれる各種のチャンネル、
チェンバーおよび帯域の中および間を移動させる手段またはシステムを提供する
ことが望ましい。このような微小流体デバイスに従って、任意に各種の材料搬送
方法が使用される。例えば、１つの好ましい面では、デバイスのチャンネルを通
る材料の移動は、材料流の通過が望ましいチャンネルを横断する圧力差の適用に
よって生じる。これは、チャンネルの一端に正圧を適用するか或いは他端に負圧
を適用するすることにより達成される。複雑なチャンネルネットワークでは、各
種の相互接続した全てのチャンネルにおける制御された流速は、デバイス構造中
に例えば所定チャンネルを通る流れを停止させ、また開始させるバルブ等を入れ
ることにより制御できる。或いは、チャンネルの抵抗を調節して、単独の適用圧
力差、例えば単独のチャンネル入口に真空を適用した場合でさえも、異なるチャ
ンネルを通る材料の移動する速度、タイミングおよび／または量を指示してもよ
い。このようなチャンネルネットワークの例は、１９９９年１月２８日出願の米
国特許出願Ｎｏ．０９／２３８，４６７；１９９９年１月１９日出願の同Ｎｏ．
０９／２３３，７００；および１９９９年３月２６日出願の同Ｎｏ．０９／２７
７，３６７に図示されている。これらの文献は、あらゆる目的で参考のため全体
をここに取り入れた。
【００４８】 或いは、本発明の微小流体の利用に、制御された動電（ｅｌｅｃｔｒｏｋｉｎ
ｅｔｉｃ）搬送システムを使用することができる。この種の動電搬送については
、ＲａｍｓｅｙのＵＳＰ５，８５８，１９５に詳しく記載されている。この文献
は、あらゆる目的で参考のためここに取り入れた。このような動電材料搬送・配
向システムとしては、前記構造に適用される電場内での帯電した化学種の電気泳
動移動性に応答するシステムがある。このようなシステムは、電気泳動材料搬送
システムとしてさらに詳しく言及されている。他の動電材料搬送・配向システム
は、チャンネルまたはチェンバー構造を横断する電場の適用で生じる該構造内の
流体および材料の電気浸透（ｅｌｅｃｔｒｏｏｓｍｏｔｉｃ）流に応答するもの
である。要するに、表面に帯電した官能基を有するチャンネル、例えば表面にヒ
ドロキシル基を有する、エッチングしたガラス製チャンネルまたはガラス製微小
毛細管に流体を入れると、ヒドロキシル基はイオン化可能である。ヒドロキシル
官能基の場合、例えば中性のｐＨでイオン化すると、表面からプロトンが遊離し
て流体中に入り、流体／表面の界面近くにある濃度のプロトンを作るか、或いは
チャンネル中の大きな流体の周囲に正帯電のさやを作る。チャンネルの長さに亘
って（ａｃｒｏｓｓ）電圧勾配を適用すると、プロトンのさやは電圧降下の方向
、例えば負電極に向かって移動する。
【００４９】 ここで使用した“制御された動電材料の搬送・配向”とは、多数、即ち２つよ
りも多い電極に適用された電圧を積極的に制御するのに使用する動電システムを
いう。換言すれば、このような制御された動電システムは、少なくとも２つの交
差するチャンネルを横断して適用される電圧勾配を付随的に調節する。特に、こ
こで説明した好ましい微小流体デバイスおよびシステムは、少なくとも２つの交
差するチャンネルまたは流体導管、例えば相互接続する囲まれたチェンバーを有
し、またこれらのチャンネルは少なくとも３つの交差していない末端を有する。
２つのチャンネルの交差とは、２つ以上のチャンネルが互いに流動可能に連絡し
ている点をいい、多数チャンネルの“Ｔ”交差、十字交差、“荷馬車の車輪（ｗ
ａｇｏｎ ｗｈｅｅｌ）”交差、または２つ以上のチャンネルがこのような流動
可能に連絡している他の何らかの幾何学的交差を包含する。チャンネルの交差し
ていない末端は、１つのチャンネルが他の１つのチャンネルと例えば“Ｔ”交差
のように、交差して終点となっていない点である。好ましい面では、このデバイ
スは、少なくとも４つの交差していないチャンネルを有する少なくとも３つの交
差するチャンネルを含む。単独の水平なチャンネルが単独の垂直のチャンネルと
交差し、横断する基本的な十字チャンネル構造では、制御された動電材料搬送は
、他のチャンネルから交差点に抑制的な（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｉｎｇ）流れを供
給することにより、材料流を制御可能に交差点に向けて通すように作用する。例
えば第一材料を水平チャンネル中を例えば左から右に搬送したいと仮定すれば、
垂直チャンネルとの交差点を横断させる。この交差点を横断する材料の簡単な動
電材料流は、水平チャンネルの長さに亘って電圧勾配を適用する、即ち該チャン
ネルの左末端に第一電圧を適用すると共に、該チャンネルの右末端に前記電圧よ
りも低い第二電圧を適用するか、或いは右末端を浮かせる（電圧を適用しない）
ことにより達成できる。しかし、この種の交差点を通る材料流は、交差点での対
流効果の他、材料が使用媒体中で搬送される際の自然の拡散特性から、交差点で
かなりの量の拡散を生じる。
【００５０】 制御された動電材料搬送において、交差点を横断して搬送される材料は、側方
のチャンネル、例えば頂部および底部のチャンネルからの低レベルの流れにより
抑制（ｃｏｎｓｔｒａｉｎ）される。これは僅かな電圧勾配を材料流の通路に沿
って、例えば垂直チャンネルの頂部末端または底部末端から右末端に向けて適用
することにより達成される。この結果、交差点で材料流が“狭窄（ｐｉｎｃｈｉ
ｎｇ）”し、材料の垂直チャンネルへの拡散が防止される。次に、交差点で狭窄
した容量分は、垂直チャンネルの長さに亘って、例えば頂部末端から底部末端ま
で、電圧勾配を適用することにより、垂直チャンネル内に注入することができる
。この注入中、水平チャンネルからの材料のいかなる溢出（ｂｌｅｅｄｉｎｇ
ｏｖｅｒ）も避けるため、低レベルの流れを側方のチャンネルに向けて戻し、こ
れにより材料の交差点からの“引き戻し”が起こる。 制御された動電材料搬送は、狭窄注入計画（ｓｃｈｅｍｅ）の他、機械的また
は作動性部品を含まない仮想バルブを作るのに容易に利用される。具体的には、
前述の十字交差の場合、１つのチャンネル断片から他の１つのチャンネル断片、
例えば水平チャンネルの左アームから右アームへの材料流は、垂直チャンネルの
制御された流れ、例えば垂直チャンネルの底部アームから頂部アームまでの流れ
により、効果的に調節し、停止し、また再開することができる。具体的には、‘
オフ’モードでは左末端および頂部末端を横断して電圧勾配を適用することによ
り、材料は左アームから交差点を通って頂部アーム中に搬送される。抑制流は、
底部末端から頂部末端までの通路に沿って同様な電圧勾配を適用することにより
、底部アームから頂部アームに向けられる。次に、左アームから頂部アームまで
の適用電圧勾配を、左アームから右アームまでに切り替えることにより、測定量
の材料を水平チャンネルの左アームから右アームの中に分配する（ｄｉｓｐｅｎ
ｓｅ）。適用される時間および電圧勾配は、この方法で分配される材料の量を指
示する。４方向十字交差について例示の目的で説明したが、これらの制御された
動電材料搬送システムは、さらに複雑に相互接続したチャンネルネットワーク、
例えば相互接続した平行チャンネルの配列に容易に適用できる。
【００５１】 この種の動電材料搬送システムを、例えば図７に示すような微小流体デバイス
に用いたシステムの一例を図１１に示す。図示するように、このシステム１１０
０は、集積ピペット器／毛細管エレメント７０８を組み込んだ微小流体デバイス
７００を有する。電気アクセスリザーバー７０６の各々は、例えばリザーバー中
の流体に接触して内部に配置された別々の電極１１２８〜１１３６を持っている
。電極１１２８〜１１３６の各々は、操作可能に電気コントローラー５０８に結
合している。このコントローラーは、多数の異なる電圧および／または電流を各
種電極に送達することができる。別の電極１１３８も操作可能にコントローラー
１１０８に結合し、毛細管エレメント７０８をサンプル材料中に浸漬した時、該
材料と電気的に接触する位置にあるように、例えば多数ウエル板５０２中に配置
されている。電極１１３８は、例えば毛細管７０８上に塗布され、コントローラ
ー５０８に操作可能に結合した電気リード線に接続された電気伝導性コーティン
グであってよい。或いは、電極１１３８は、毛細管エレメント７０８の端部と一
緒に沿ってサンプル材料中に浸漬されるか、或いは該材料と接触するように毛細
管に近接して配置された電極ワイヤーを含むだけでもよい。或いは、この電極は
、材料源ウエル上の導電性コーティングとして、または材料源ウエルの組み立て
用導電性材料として材料源と組み合わせ（ａｓｓｏｃｉａｔｅ）てもよい。次に
、電場を形成するには、前記電気リードを単に源ウエル材料またはコーティング
と接触させるだけでよい。追加（ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ）材料は、ピペット器１
１３８をウエル中に浸漬する前にウエル板５０２および／またはデバイス７００
の一つ以上を互いに対し移動することにより、多数ウエル板５０２上の異なるウ
エルからサンプリングされる（ｓａｍｐｌｅｄ）。このような移動は、通常、デ
バイス７００または多数ウエル板５０２の１つ以上を解釈段階、例えば概略的に
図示したx −y −z 解釈段階１１４２上に置くことにより達成される。
【００５２】 さらに他の任意の利用においては、混成材料搬送方法およびシステムが使用で
きる。要するに、このような混成システムは、一態様は、微小流体システム内で
圧力差を生じさせるための動電力の使用例である。この混成システムは、動電シ
ステムの制御性を、例えば電気泳動のバイアス効果のない、圧力をベースとする
システムの長所と組み合わせたものである。このような混成システムは、例えば
国際特許出願公開Ｎｏ．ＷＯ ９９／１６１６２に記載されている。この文献は
、あらゆる目的で参考のため全体をここに取り入れた。他の混成システムは任意
に、材料をチャンネルネットワークの一部で移動させるため、動電力を使用し、
一方、チャンネルネットワークの他の部分には圧力をベースとした力を使用して
いる。本発明を実施する際、他の各種システム、例えばローターシステム、計量
棒システム、スポット配列システム等を限定することなく使用することができる
。
【００５３】 ＩＶ．キットおよび試薬 本発明の方法およびアッセイを行うための試薬は、使用者がこれらアッセイの
利用を容易にするためにキットの形態で任意に提供される。このようなキットも
通常、該アッセイを行うための指示を含み、また任意に、本発明を行うための流
体容器、例えばキュベット、多数ウエル板、微小流体デバイス等を含んでいてよ
い。 通常、キットに含まれる試薬は、蛍光標識を付けた第一試薬やポリイオン化合
物を含んでいる。これらの試薬は、ユーザーの測定用小瓶または目盛付きの小瓶
またはアンプルに供給することができ、これらは単に組み合わせるだけで適切な
反応混合物を生じる。これらの試薬は、液体および／または親油化した状態で供
給してもよいし、また試薬の希釈および／または再水和用に適切な緩衝溶液を任
意に含んでいてもよい。通常、全ての試薬および指示は、直ぐ使用できるように
、単独の箱、ポーチ等に一緒に梱包されている。
【００５４】
【実施例】
Ｖ．実施例 例１：蛍光分極によるホスホリル化生成物の検出 中性帯電のホスホリル化可能な基質（フルオレッセン−ＱＳＰＫＫＧ−ＣＯＮ
Ｈ2 ）のアリコートを一夜、ＡＴＰおよびＣＤＫ２（サイクリン依存キナーゼ）
で培養した。この混合物を標準毛細管電気泳動法で分析し、基質の生成物への完
全転化を示した。負の対照（酵素を含まず）も製造した。これら２つの反応生成
物を５０ｍＭ ＴＡＰＳ ｐＨ９．０緩衝液（１：４０）中に希釈した。これら
サンプルを４９０ｎｍで励起し、次いで蛍光分極量の測定用に備えた蛍光計のキ
ュベット中、５２０ｎｍで放射された蛍光を測定することにより、蛍光分極値を
測定した。ポリ−Ｄ−リシンおよび水の複数のアリコートを加えた（添加した各
アリコートは、ポリ−Ｄ−リシンの濃度を６μｍ上げた）。アッセイの結果を、
サンプルの蛍光分極量対ポリ−Ｄ−リシンの添加量をプロットした図１２Ａに図
示する。 図示したように、ポリリシン不存在下の基質（正方形点）および生成物（菱形
点）の両方の蛍光分極量は、約３８ミリ分極単位（ｍＰ）であった。ポリリシン
を添加すると、生成物の蛍光分極量は顕著に増大した（７２ｍＰに増大、また次
に過剰量のポリリシンを添加すると、この値から１００ｍＰに増大）。基質だけ
の蛍光分極量は約４２ｍＰに増大した。
【００５５】 図１２Ｂ〜１２Ｅは、ポリアルギニンの濃度を増加させた際の異なる蛋白質キ
ナーゼＡ（ＰＫＡ）基質および蛋白質キナーゼＣ（ＰＫＣ）基質の蛍光分極量を
プロットしたものである。具体的には、多数のＰＫＣ基質およびこれらのホスホ
リル化誘導体について、ポリアルギニンの濃度を増加させた際の蛍光分極量を分
析した。以下の基質およびこれらのホスホリル化誘導体は、１２５ｎＭの濃度で
使用した。ホスホリル化しないペプチドは図１２Ｂ〜１２Ｅの各々に正方形点で
示し、一方、ホスホリル化ペプチドは菱形点で示す。いずれの場合も、ホスホリ
ル化基質は高度の分極を生じる。使用したペプチドは、次の通りである。
【表１】 基質 酵素 電荷 図 （下線はＰｈｏｓ．Ｒｅｓ．） （ｐＨ７．５） Ｆｌ−ＬＲＲＡＳＬＧ−ＣＯＮＨ2 ＰＫＡ ０ １２Ｂ Ｆｌ−ＬＲＲＡＳＬＧ−ＣＯＯ- ＰＫＡ −１ １２Ｃ Ｆｌ−ＫＲＰＳＫＲＡＫＡ−ＣＯＯ- ＰＫＣ ２ １２Ｄ Ｆｌ−ＫＲＴＬＲＲ−ＣＯＯ- ＰＫＣ １ １２Ｅ
【００５６】例２：蛍光分極量による生成物濃度の区別 ポリリシンの代わりにポリヒスチジンを用いて更に実験を行った。この場合、
使用した緩衝液は５０ｍＭ Ｂｉｓ Ｔｒｉｓ ｐＨ６．５であり、使用したポ
リヒスチジンの分子量は、１５８００ダルトン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ
，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから入手可能）である。 ２つのセリン／スレオニンキナーゼの基質と生成物との比を種々変えた混合物
を製造した。ＣＤＫ２および蛋白質キナーゼＡ（ＰＫＡ）。このＣＤＫ基質は上
記例１に記載したものと同じである。ＰＫＡ基質は、Ｃ−末端がカルボキシル基
またはカルボキシアミド基のいずれかであるＦｌｕｏｒ−ＬＲＲＡＳＬＧである
。これらの混合物を基質の転化程度を種々変えたキナーゼ反応用のモデルとして
用いた。これら基質と生成物との混合物にポリヒスチジン溶液および水の複数の
アリコートを加えた。この水性原料の濃度は約１．３ｍＭで、また最終濃度は１
０〜２５ｍＭであった。 再び、４９０ｎｍで励起し、次いで５２０ｎｍで放射された蛍光を測定するこ
とにより、蛍光分極値の読みを得た（両基質はフルオレッセンで標識した）。こ
れらの実験結果を図１３および図１４に示す。要するに、図１３および図１４は
、ホスホリル化生成物の濃度を増加させた際の蛍光分極量を基質と比較してプロ
ットしたものである（％転化率で示す）。図１３の場合、基質および生成物は、
ＣＤＫ２のモデル基質／生成物であり、一方、図１４は、ＰＫＡ基質／生成物混
合物（例えば、前述のような混合物）についての同様なデータを示す。図に見ら
れるように、蛍光分極信号と基質の生成物への転化率との間に非常に良好な直線
依存性が観察された。したがって、この方法はキナーゼ反応の進行の追跡やキナ
ーゼ抑制剤についての化学蔵書のスクリーニングによく適正している。
【００５７】 各キナーゼに合わせて作った基質を用い、またポリイオン成分としてポリアル
ギニンを用いた他は、蛋白質キナーゼＡ（ＰＫＡ）およびその他の蛋白質キナー
ゼについて同様なアッセイ方法でテストした。特に、３種の異なるセリンキナー
ゼ酵素またはチロシンキナーゼ酵素用の基質認識配列を有する５種の異なるフル
オレッセン標識ベプチドを製造した。ホスホリル化していない状態の異なる基質
は、ｐＨ７．５で正味＋２〜−１の電荷を持っていた。したがって、これらの電
荷は、それぞれ０〜−３の電荷を有するホスホリル化化合物を生じる。 各種ペプチドをＡＴＰの存在下にそれぞれのキナーゼで処理し、基質および生
成物の毛細管電気泳動分離を用いると共に、蛍光分極量により転化量を測定した
。全てのサンプルは、ＣＥ検出法とＦＰ検出法との相関関係が良好であった。一
例として、P ＫＢαに対するＣＥ検出とＦＰ検出との相関関係を図１５に示す。
【００５８】例３：蛍光分極量による酵素反応の経時監視 ５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2 、５００ｍＭポリ
アルギニン、１８４ｎＭ ＰＫＡおよび１２５ｎＭ Ｋｅｍｐｔｉｄｅ基質（Ｆ
ｌ−ＬＲＲＡＳＬＧ−ＣＯＯ- ）中でＡＴＰ濃度（０μＭ、０．５μＭ、１μＭ
、２μＭ、４μＭ、８μＭ、１６μＭ、３２μＭ）を変化させて他のＰＫＡアッ
セイを行った。本発明の蛍光分極量検出方法が反応の経時監視に及ぼす効力を測
定するため、得られたアッセイを経時的に監視した。図１６は、反応混合物中の
各々異なる濃度のＡＴＰに対する蛍光分極量対反応時間をプロットしたものであ
る。この図から判るように、一般にＡＴＰの濃度が増加すると、反応速度は速く
なる。対照を除く全ての場合、蛍光分極の測定値は、時間と共に増加する。特に
、反応が進行するにつれて、蛍光基質は、添加したホスフェート基により、いっ
そう多く帯電し、こうしてポリアルギニンの結合力を増大させ、また蛍光分極量
と組み合わさった（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）変化を生じる（例えば分極が多いほ
ど、脱分極は少なくなる）。図１７は、初期速度対ＡＴＰ濃度をプロットしたも
ので、アッセイした反応についての特徴的な運動プロットを生じる。次にこの運
動プロットをＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋｅプロット（図１８）に使用して
特定のキナーゼ酵素のＫｍを測定した。
【００５９】例４：蛍光分極量によるホスファターゼ活性のアッセイ 本発明の蛍光分極量検出法をホスファターゼアッセイの経時監視に適用した。
要するに、公知のホスファターゼ酵素用基質を５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．
５、５ｍＭ ＤＴＴ、２００ｍＭ ＮａＣｌおよび３００ｎＭポリアルギニンの
アッセイ緩衝液中に入れた。対照反応混合物（酵素を含まず）および各種濃度の
ホスファターゼ酵素を含む反応混合物について、相対蛍光分極量を監視した。図
１９は、対照混合物および酵素アッセイ混合物についてプロットしたものである
。この図から判るように、相対蛍光分極測定値は、ホスファターゼの存在下では
経時と共に減少する。特に、この混合物は、ポリアルギニンの結合を容易にする
基質上の帯電ホスフェート基が除去されるため、ポリアルギニンと蛍光基質との
相互作用が低下する結果、経時と共に蛍光分極量が少なくなる。
【００６０】例５：蛍光分極量によるプロテアーゼ活性のアッセイ 本発明の蛍光分極量検出法をプロテアーゼアッセイでも行った。特に、これら
の方法を用い、また一端に蛍光基を有し、他端にポリリシン端部を有する中性帯
電キモトリプシン特定蛍光基質（Ｆｌ−ＥＧＩＹＧＶＬＦＫＫＫ−ＣＯＮＨ2 ）
を用いてキモトリプシンアッセイを行った。 具体的には、キモトリプシンによる上記基質の開裂により正味電荷が−４のＦ
ｌ−ＥＧＩＹおよび正味電荷が＋４のＧＶＬＦＫＫＫを生じる。ここで説明した
ように、ポリカチオンは優先的に反応生成物の高度に負帯電した蛍光部分を会合
し、標識部分の蛍光分極シフトを生じる。要するに、このアッセイでは、ｐＨ７
．５、５ｍＭ ＣａＣｌ2 、５００ｍＭキモトリプシン基質の３つの別々のラン
、即ち酵素を含まない対照ラン、および異なる濃度の酵素（０．１２５μｇ／ｍ
ｌおよび１．２５μｇ／ｍｌのキモトリプシン）について２つのアッセイランを
行った。図２０は、異なるアッセイランの各々についての蛍光分極量対時間をプ
ロットしたものである。図示したように、対照ラン（菱形点）は、経時による蛍
光分極量の増加がなかったのに対し、低濃度のキモトリプシン（０．１２５μｇ
／ｍｌ、大きい正方形点、中央の線）および高濃度のキモトリプシン（１．２５
μｇ／ｍｌ、小さい正方形点、上の線）は、経時による分極量の増加を示し、酵
素濃度が高いほど、初期増加が速かった。いったん正帯電末端がキモトリプシン
の開裂により除去されると、分極蛍光量の増加は、ポリアルギニンと基質の負帯
電蛍光部との相互作用量を高めることを示している。
【００６１】例６：蛍光分極量検出を用いた核酸の混成アッセイ 本アッセイ方法を核酸の混成反応の検出にも使用した。このアッセイは、探査
すべき不動化標的配列の欠如のため、特に関心がある。特に、全体のアッセイは
溶液中で行った。 ＤＮＡ標的１９２および１８２との混成実験にフルオレッセンで標識したペプ
チド核酸分子２０２を使用した。ＰＮＡは一般にＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃ
ｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）のＡｐｐｌｉｅｄ Ｂ
ｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎから市販品として入手できる。これら分
子の配列を下記に示す。ＰＮＡ分子の場合、所定の配列は、ＤＮＡ分子の類似体
配列を示す。これら３つの分子の配列は以下の通りである。
【化１】 ＤＮＡ配列１９２は、ＰＮＡプローブ２０２に完全に補足的な１３個の塩基（
太字で示す）を含むが、１８２は非補足的なオリゴヌクレオチドである。
【００６２】 ５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５中にＰＮＡを１μＭ含む溶液を５μＭの１
９２または５μＭの１８２のいずれかと混合した。これらの混合物を室温で約１
０分間放置し、次いで蛍光分極量を測定するために備えた蛍光計のキュベットに
入れた。励起用の４９０ｎＭおよび蛍光放射検出用の５２０ｎＭを用いて測定を
行った。蛍光分極値は、まず分子量約７０〜１００ｋＤのポリ−Ｌ−リシン臭酸
塩（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）の不存在下、続いて存在下に記録した。
このポリ−Ｌ−リシンを原料溶液から水（約４４０μＭ）に加えた。このポリ−
Ｌ−リシンの最終濃度は、４．４μＭおよび８μＭであった。得られた蛍光分極
値を図２１に示す。 図から判るように、２０２および非補足的１８２を含む混合物については、８
６ｍＰの分極値が得られた。この値は、ポリ−Ｌ−リシンの存在下では１４０ｍ
Ｐに増加した。これに対し２０２と補足的１９２配列との混成物をは、ポリ−Ｌ
−リシンの不存在下では約１００ｍＰ（図２１に示さず）、また存在下では２２
９ｍＰの分極値を示した。これらの結果は、ポリ−Ｌ−リシンの存在下の蛍光分
極量は、溶液中の特定のＰＮＡ／ＤＮＡ混成物の形成の検出に使用できることを
示している。これらのアッセイは、例えば混成による配列化（ｓｅｑｕｅｎｃｉ
ｎｇ）、配列のチェック、配列変体（ｖａｒｉａｎｔ）、例えば多形現象、即ち
ＳＮＰ，ＳＴＲ等についてのスクリーニングの際、サンプル内の特定配列の存在
または不存在の検出に容易に使用される。
【００６３】例７：単独ヌクレオチド置換の検出 核酸プローブと完全補足的標的配列と、単独塩基変化、例えば単独ヌクレオチ
ド多形現象を取り入れた標的配列との示差混成（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｈ
ｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）を検出するため、これらのアッセイ方法を使用した
。部分列および異なる塩基を部分列の内部塩基に置換した標的を含む標的を探査
するため、特に、標的配列の部分列に補足的な配列を有するフルオレッセン化Ｐ
ＮＡプローブを用いた。 ＰＮＡプローブ（ＰＮＡ７６３７）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ）の５’〜３
’の配列、標的ＤＮＡ配列（ＤＮＡ２４４）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ）およ
び単独塩基不適切標的ＤＮＡ表面（ＤＮＡ２４５）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ）は、次の通りである。
【化２】 太字はＤＮＡプローブに補足的なＤＮＡ標的の配列である。ＳＮＰの位置は下線
で示した。
【００６４】 ＰＮＡプローブ７６３７は、４００μｌの反応容積中、最終濃度２５０ｎＭで
使用した。使用した緩衝液は、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、１００ｍＭ
ＮａＣｌである。１μｌアリコートのＤＮＡ標的２４４および２４５をこのＰ
ＮＡ溶液に繰り返し加え、各アリコート添加後の蛍光分極量（励起４９０ｎｍ、
放射５２０ｎｍ）を記録した。図２２に、この実験で得られたデータを示す。完
全に補足的な標的／プローブ混成物（菱形点）は、単独塩基不適切混合物（正方
形点）よりもかなり高いレベルの傾向分極を示した。これは高レベルの混成が起
こったことを示している。図から判るように、混成は、完全補足的な例では約１
Ｍ過剰の標的配列で高かった（ｐｌａｔｅａｕｅｄ）。
【００６５】 反応混合物中の蛍光分極量の変化を監視しながら、ポリリシンの存在下で熱変
性実験を行った。特に、下記配列を有する３つの異なる標的ＤＮＡ分子を使用し
た。
【化３】 各標的について、下記配列（９−ｍｅｒ、１１−ｍｅｒ、１３−ｍｅｒ）を有す
る３つの異なるフルオレッセン化ＰＮＡの各々で調べ、混合物の蛍光分極値を監
視しながら、温度を上昇させた。
【化４】 次に、蛍光分極量を監視しながら、反応混合物の各温度を上昇させた。図２３Ａ
、２３Ｂおよび２３Ｃは、それぞれ３つの異なるプローブの各々で調べた各標的
を示す。データ点は、３つの別々の実験の平均データである。溶融曲線は全て標
準に合わせたが、ＰＮＡプローブの溶融曲線だけはＤＮＡ標的配列の存在下で得
られた溶融カーブから差し引いた。
【００６６】 予期されるように、使用したＰＮＡプローブが長いほど、溶融カーブは更に遠
くへ押出される。特に、図２３Ａ（９−ｍｅｒ）は、標的およびプローブに対し
図２３Ｂ（１１−ｍｅｒ）および図２３Ｃ（１３−ｍｅｒ）よりも遥かに低い融
点を示している。さらに各標的配列について、完全適正混成物（菱形点）と単独
塩基不適正混成物（正方形点および三角形点）との間に明確な区別が見られ、表
示した２つのうちC ／T 不適正物は最も脱安定化（ｄｅｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ
）、即ち溶融曲線に最もシフトを生じている。この例は、明らかに現在説明して
いる方法が標的配列、例えば複数のＳＮＰ間の単独ヌクレオチド差を区別するの
に使用できることを示している。 前記アッセイを蛍光分極量検出に用いたが、これらのアッセイ方法は、混成す
ると、蛍光強度に変化することも発見された。特に、単独ヌクレオチド置換アッ
セイを前述の置換アッセイと同様に、２つの別々の核酸配列上で操作（ラン）し
た。各実験では、自然（ｗｉｌｄ）のタイプに補足的なＰＮＡプローブ（２５０
ｎＭ）および単独塩基置換を有するものを用いて、標的配列（５０ｍＭ ＨＥＰ
ＥＳ、ｐＨ７．５、１００ｍＭ ＮａＣｌ中）を探査し、次いでポリ−Ｌ−リシ
ン（３．３μＭ）で処理した。混合物を、増加する濃度の標的配列に曝し、蛍光
分極量および全体の蛍光強度を測定した。図２４は、テストした完全混成物およ
び単独塩基不適正物の各々について蛍光強度および蛍光分極量をプロットしたも
のである。図から判るように、蛍光強度および傾向分極量の両方法とも、完全適
正反応と単独塩基不適正反応とを区別する基礎となる。
【００６７】 特に注記しない限り、ここで述べた濃度値は全て、混合物または溶液に加えた
時、所定の成分を変えたり、或いは他の１つの異なる化学種に変性するいかなる
転化、解離、反応に関係なく、混合物または溶液に加えた時の所定成分の濃度を
いう。ここで説明した方法工程は、ある順序が特に与えられるか、或いは所要の
順序が、列挙した工程の前後関係から明白である限り、一般に以下なる順序でも
達成できる。 個々の刊行物または特許出願が、ここに参考のため取り入れるように指示され
るならば、刊行物および特許出願は全て、参考のためここに同じ程度に取りえれ
られる。以上、本発明を明確化および理解の目的で図示および例により若干詳し
く説明したが、ある種の変化および変形を付属の請求の範囲内で実施することが
できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に従って実施される一般的アッセイ方法の一態様の概略説明
図。
【図２】本発明に従って実施される結合アッセイ、例えば核酸混成アッセイ
の概略説明図。
【図３】本発明に従って実施される酵素アッセイ、例えばキナーゼアッセイ
の概略説明図。
【図４】本発明に従って実施されるホスファターゼアッセイの概略説明図。
【図５】本発明のアッセイ方法を実施するために使用される全体のシステム
の一般的な概略説明図。
【図６】本発明において反応／アッセイ容器として任意に使用される多層微
小流体デバイスの概略説明図。
【図７】本発明において反応／アッセイ容器として外部サンプリングピペッ
ト器を組み入れた微小流体デバイスの概略説明図。
【図８】本発明と併用される光検出システムの一例の概略説明図。
【図９】本発明のアッセイを行う際、アッセイシステムによって実施される
ソフトウエアプログラムまたはコンピューターによる実施方法のフローチャート
。
【図１０】本発明と併用される好例のコンピューターシステム。
【図１１】材料の移動を制御し、微小流体システムからのアッセイ結果を検
出し、次いでこれらの結果を分析するシステムの他のエレメントを備えた微小流
体デバイスのインターフェース。
【図１２Ａ】ポリカチオン量を増加させた際の各種蛍光ホスホリル化化合物
の蛍光分極量をプロットした図。
【図１２Ｂ】ポリカチオン量を増加させた際の各種蛍光ホスホリル化化合物
の蛍光分極量をプロットした図。
【図１２Ｃ】ポリカチオン量を増加させた際の各種蛍光ホスホリル化化合物
の蛍光分極量をプロットした図。
【図１２Ｄ】ポリカチオン量を増加させた際の各種蛍光ホスホリル化化合物
の蛍光分極量をプロットした図。
【図１２Ｅ】ポリカチオン量を増加させた際の各種蛍光ホスホリル化化合物
の蛍光分極量をプロットした図。
【図１３】ポリカチオンの存在下で基質と生成物との相対濃度を変化させた
場合のホスホリル化可能な蛍光基質とホスホリル化生成物との混合物の蛍光分極
量をプロットした図。
【図１４】異なるホスホリル化可能な基質とホスホリル化生成物を用いた他
は図１３と同様な混合物の蛍光分極量をプロットした図。
【図１５】毛細管電気泳動分離／検出（縦軸）および蛍光分極検出（横軸）
を用いて検出した際の蛋白質キナーゼＢ（ＰＫＢ）の活性間の相関関係をプロッ
トした図。
【図１６】反応混合物中のＡＴＰを幾つかの異なる濃度で存在させてＰＫＡ
アッセイを行った際の蛍光分極量対反応時間をプロットしたものである。
【図１７】図１６に示すデータから誘導した初期反応速度対ＡＴＰ濃度をプ
ロットした図。
【図１８】図１６および１７に示すアッセイデータから誘導したラインウエ
ーバー−バークプロット。
【図１９】対照混合物および酵素アッセイ混合物について経時によるホスフ
ァターゼ活性をプロットした図。
【図２０】３つの異なるプロテアーゼアッセイ試験（負対照および２つの異
なる濃度の酵素）の各々について蛍光分極量対時間をプロットした図。
【図２１】非補足的標的ＤＮＡ配列および補足的標的ＤＮＡ配列を調査する
ために使用した蛍光ＰＮＡプローブの蛍光分極量についてポリカチオンの不存在
下および変化した量で存在させた際の棒グラフ。
【図２２】標的核酸配列と完全補足的蛍光ＰＮＡプローブとの混合物（上の
線、菱形点）および単独塩基以外は補足的な標的配列と蛍光ＰＮＡプローブとの
不適正混合物（下の線、正方形点）の蛍光分極量をプロットした図。
【図２３Ａ】標的配列およびプローブが異なる構造を有するＤＮＡ／ＰＮＡ
混成物についての溶融曲線をプロットした図。
【図２３Ｂ】標的配列およびプローブが異なる構造を有するＤＮＡ／ＰＮＡ
混成物についての溶融曲線をプロットした図。
【図２３Ｃ】標的配列およびプローブが異なる構造を有するＤＮＡ／ＰＮＡ
混成物についての溶融曲線をプロットした図。
【図２４】本発明の蛍光分極検出方法を用いたＳＮＰ検出、およびこの検出
法を単独の蛍光強度測定値と比較してプロットした図。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｇ０１Ｎ 21/64 Ｆ Ｇ０１Ｎ 21/64 21/78 Ｃ 21/78 33/53 Ｍ 33/53 33/566 33/566 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (31)優先権主張番号 ６０／１５６，３６６ (32)優先日 平成11年９月28日(1999．9．28) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ， ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ， ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，Ｋ Ｐ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ， ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，Ｓ Ｇ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 2G043 AA03 BA16 CA03 DA02 EA01 GA07 GB21 HA01 HA09 KA02 KA05 LA01 2G054 CA21 CA22 CE02 EA03 GA04 4B024 AA11 CA04 CA09 HA19 4B063 QA01 QA13 QQ27 QQ33 QQ42 QR07 QR13 QR32 QR56 QS03 QS25 QS34

Claims (62)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】蛍光標識を付けた第一試薬を含む第一試薬混合物を供給する工
    程；該第一試薬混合物に第二試薬を導入して、第二試薬混合物を作製する工程、
    ここで該第二試薬は第一試薬と反応して、第一試薬とは異なる電荷を有する蛍光
    標識生成物を生じる；該第一試薬混合物および第二試薬混合物の少なくとも一種
    にポリイオンを導入する工程；および第二試薬混合物の蛍光分極量を第一試薬混
    合物と比較する工程を含む反応検出方法。
  2. 【請求項２】前記ポリイオンが前記生成物と会合する請求項１に記載の方法
    。
  3. 【請求項３】前記ポリイオンが前記第一試薬と会合する請求項１に記載の方
    法。
  4. 【請求項４】前記ポリイオンが前記生成物の電荷とは反対の電荷を有する請
    求項１に記載の方法。
  5. 【請求項５】前記ポリイオンがポリカチオンである請求項１に記載の方法。
  6. 【請求項６】前記ポリカチオンがポリアミノ酸である請求項５に記載の方法
    。
  7. 【請求項７】前記ポリアミノ酸が、電荷に依存して前記蛍光第一試薬または
    生成物の中の一種と会合する蛋白質からなる請求項６に記載の方法。
  8. 【請求項８】前記ポリアミノ酸がポリリシン、ポリヒスチジン、ポリアルギ
    ニンまたはそれらのコポリマーから選ばれる請求項６に記載の方法。
  9. 【請求項９】前記第一試薬が、実質的に帯電していないかまたは正帯電の核
    酸類似体からなり、前記第二試薬が一連のヌクレオチド類似体に補足的なヌクレ
    オチド配列を有する核酸からなり、前記生成物が核酸類似体と核酸との混成物か
    らなる請求項１に記載の方法。
  10. 【請求項１０】前記核酸類似体がペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスホン酸メチ
    ルポリマーおよびカチオン性核酸から選ばれる請求項９に記載の方法。
  11. 【請求項１１】前記第一試薬がホスホリル化可能な化合物からなり、前記生
    成物がホスホリル化した第一試薬からなる
  12. 【請求項１２】前記第二試薬がキナーゼ酵素からなる請求項１に記載の方法
    。
  13. 【請求項１３】前記ホスホリル化可能な化合物がホスホリル化部位を有する
    ペプチドからなる請求項１１に記載の方法。
  14. 【請求項１４】前記第一試薬がホスホリル化した化合物からなり、前記生成
    物が脱ホスホリル化した第一試薬からなる請求項１に記載の方法。
  15. 【請求項１５】前記第二試薬がホスファターゼ酵素からなる請求項１４に記
    載の方法。
  16. 【請求項１６】前記第一試薬が蛍光標識したホスホリル化ペプチドからなる
    請求項１４に記載の方法。
  17. 【請求項１７】前記第一試薬が第一ポリペプチド配列からなり、前記生成物
    がポリペプチド配列の断片からなり、前記断片は前記第一ポリペプチド配列とは
    異なる電荷を有する請求項１に記載の方法。
  18. 【請求項１８】前記第二試薬が蛋白質分解試薬からなる請求項１７に記載の
    方法。
  19. 【請求項１９】前記蛋白質分解試薬がプロテアーゼ酵素からなる請求項１８
    に記載の方法。
  20. 【請求項２０】前記第一試薬が第一チャンネルに沿って搬送され、前記第二
    試薬が該第一チャンネルに導入されて第一試薬と混合する請求項１に記載の方法
    。
  21. 【請求項２１】前記第一試薬および第二試薬がそれぞれ第二チャンネルおよ
    び第三チャンネルを経由して前記第一チャンネルに導入され、該第二チャンネル
    および第三チャンネルはそれぞれ第一端部および第二端部を有し、且つそれらの
    第二端部で第一チャンネルと交差している請求項２０に記載の方法。
  22. 【請求項２２】前記第二チャンネルおよび第三チャンネルの第一端部が流動
    可能にそれぞれ第一容器および第二容器に接続され、該第一容器および第二容器
    はそれぞれ前記第一試薬および第二試薬を収容している請求項２１に記載の方法
    。
  23. 【請求項２３】さらに、前記第一試薬に励起光を向けて該第一試薬中の蛍光
    分極量を測定する工程；前記第二試薬混合物に励起光を向けて該第二試薬混合物
    からの蛍光分極量を測定する工程を含むと共に、前記比較工程が該第一試薬から
    の蛍光分極量と該第二試薬混合物の蛍光分極量との第一の差を測定する工程であ
    る請求項１に記載の方法。
  24. 【請求項２４】さらに、前記第一試薬混合物および第二試薬混合物の少なく
    とも一種中にテスト化合物を導入する工程を含むと共に、前記比較工程を該テス
    ト化合物の存在下または不存在下に行って、テスト化合物の存在下での蛍光分極
    量の前記第一差の減少または増加を、前記第一試薬と第二試薬との反応の抑制剤
    か促進剤かを示すテスト化合物の不存在下の場合の差と比較する請求項２３に記
    載の方法。
  25. 【請求項２５】前記第二混合物が第一チャンネルに沿って搬送され、一方、
    前記テスト化合物が該第一チャンネルに導入される請求項２４に記載の方法。
  26. 【請求項２６】前記第一チャンネルが、毛細管エレメントの集積部分に流動
    可能に接続しているかまたは該集積部分であり、前記テスト化合物がそのテスト
    化合物源から該毛細管部分に引き入れられる請求項２５に記載の方法。
  27. 【請求項２７】複数の異なるテスト化合物が、別個の容積部分に分けた、前
    記第一試薬混合物および第二試薬混合物の少なくとも一種に別々に導入される請
    求項２４に記載の方法。
  28. 【請求項２８】前記第二試薬混合物が、第一チャンネルに沿って搬送され、
    一方、前記複数のテスト化合物が別個の流体領域として該第一チャンネルに導入
    される請求項２４に記載の方法。
  29. 【請求項２９】標的の核酸におけるヌクレオチドの部分列の存在を同定する
    方法において、該標的核酸配列を第一反応混合物中で、実質的に帯電していない
    かまたは正帯電した蛍光標識の核酸類似体と接触させる工程、ここで、該核酸類
    似体は前記部分列に補足的であり、これにより該核酸類似体は特に該部分列に混
    成して第一混成物を形成し得るものである；前記第一反応混合物をポリイオンと
    接触させる工程、および該ポリイオンの存在下での前記第一反応混合物の蛍光分
    極量を前記標的核酸配列の不存在下での前記核酸類似体の蛍光分極量と比較する
    工程、ここで、蛍光分極量の増加は、前記第一混成物の存在を示すものである；
    を含む前記方法。
  30. 【請求項３０】前記核酸類似体がペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスホン酸メチ
    ルポリマーおよびカチオン性核酸から選ばれる請求項２９に記載の方法。
  31. 【請求項３１】前記ポリイオンがポリカチオンである請求項２９に記載の方
    法。
  32. 【請求項３２】前記ポリカチオンがポリアミノ酸である請求項３１に記載の
    方法。
  33. 【請求項３３】前記ポリアミノ酸が、電荷に依存して前記蛍光第一試薬また
    は生成物の中の一種と会合する蛋白質からなる請求項３２に記載の方法。
  34. 【請求項３４】前記ポリアミノ酸がポリリシン、ポリヒスチジン、ポリアル
    ギニンまたはそれらのコポリマーから選ばれる請求項３２に記載の方法。
  35. 【請求項３５】前記標的核酸配列が単独ヌクレオチド多形用の少なくとも一
    種の軌跡からなる請求項２９に記載の方法。
  36. 【請求項３６】前記核酸類似体が、前記標的核酸配列における単独ヌクレオ
    チド多形の１つの対立遺伝子に補足的である請求項２９に記載の方法。
  37. 【請求項３７】蛍光標識を付けたホスホリル化可能な化合物を供給する工程
    ；該ホスホリル化可能な化合物を第一混合物中でホスフェートドナーの存在下に
    キナーゼ酵素と接触させる工程；該第一混合物をポリイオンと接触させる工程；
    該ポリイオンの存在下での第一混合物からの蛍光分極量を、前記キナーゼ酵素の
    不存在下での前記蛍光標識付きホスホリル化可能な化合物からの蛍光分極量と比
    較する工程を含むホスホリリル化可能な化合物のホスホリル化検出方法。
  38. 【請求項３８】前記ポリイオンが前記生成物と会合する請求項３７に記載の
    方法。
  39. 【請求項３９】前記ポリイオンが前記第一試薬と会合する請求項３７に記載
    の方法。
  40. 【請求項４０】前記ポリイオンが前記帯電した生成物の電荷とは反対の電荷
    を有する請求項３７に記載の方法。
  41. 【請求項４１】前記ポリイオンがポリカチオンである請求項３７に記載の方
    法。
  42. 【請求項４２】前記ポリカチオンがポリアミノ酸である請求項４１に記載の
    方法。
  43. 【請求項４３】前記ポリアミノ酸が、電荷に依存して前記蛍光第一試薬また
    は生成物の中の一種と会合する蛋白質からなる請求項４２に記載の方法。
  44. 【請求項４４】前記ポリアミノ酸がポリリシン、ポリヒスチジン、ポリアル
    ギニンまたはそれらのコポリマーから選ばれる請求項４２に記載の方法。
  45. 【請求項４５】蛍光標識を付けたホスホリル化可能な化合物を供給する工程
    ；該ホスホリル化可能な化合物を第一混合物中でホスフェート基の存在下にキナ
    ーゼ酵素と接触させる工程；該第一混合物を、蛋白質と会合したキレート基を有
    する該蛋白質とＦｅ3+、Ｃａ2+、Ｎｉ2+およびＺｎ2+から選ばれた金属イオンと
    を含む第二試薬混合物と接触させる工程；該第二混合物の存在下での第一混合物
    からの蛍光分極量を、前記キナーゼ酵素の不存在下での蛍光標識付きホスホリル
    化可能な化合物からの蛍光分極量と比較する工程を含むホスホリリル化可能な化
    合物のホスホリル化検出方法。
  46. 【請求項４６】流体容器内に設けた第一反応帯と、蛍光標識を付けた第一試
    薬を含む第一試薬混合物と、該第一試薬と反応して第一試薬とは実質的に異なる
    電荷を有する蛍光標識生成物を生じる第二試薬と、ポリイオンと、検出帯と、該
    検出帯と感知可能に連絡配置され、検出帯中で試薬の蛍光分極量を検出するよう
    に構成された検出器とを含む流体容器からなるアッセイシステム。
  47. 【請求項４７】前記流体容器が少なくとも第一チャンネルを内部に設けた本
    体構造からなり、該第一チャンネルの一部は前記反応帯を構成し、また該第一チ
    ャンネルの一部は前記検出帯を構成する請求項４６に記載のアッセイシステム。
  48. 【請求項４８】さらに、前記第一試薬、第二試薬およびポリイオンを前記第
    一チャンネルの反応帯部から該第一チャンネルの検出帯部に搬送する材料搬送シ
    ステムを有する請求項４７に記載のアッセイシステム。
  49. 【請求項４９】前記材料搬送システムが、前記第一チャンネルの一端に圧力
    または真空を適用して流体を反応帯から検出帯まで押出すか引き入れる圧力源ま
    たは真空源からなる請求項４８に記載のアッセイシステム。
  50. 【請求項５０】前記材料搬送システムが、前記第一チャンネルの異なる点に
    操作可能に結合して、該第一チャンネルの長さの少なくとも一部に亘って電場を
    形成する電力源からなり、該電場によって材料を反応帯から検出帯に移動させる
    請求項４８に記載のアッセイシステム。
  51. 【請求項５１】前記反応容器が多数ウエル板のウエルからなる請求項４６に
    記載のアッセイシステム。
  52. 【請求項５２】前記反応容器が試験管からなる請求項４６に記載のアッセイ
    システム。
  53. 【請求項５３】本体構造内に配置され、下記各源に流動可能に接続された第
    一チャンネルと、蛍光標識を付けた第一試薬を含む第一試薬混合物源と、該第一
    試薬と反応して第一試薬とは実質的に異なる電荷を有する蛍光標識生成物を生じ
    る第二試薬源と、ポリイオン源と、前記第一試薬、第二試薬およびポリイオンを
    前記第一チャンネル内に導入する材料搬送システムと、前記第一チャンネルと感
    知可能に連絡配置され、前記検出帯中で試薬の蛍光分極量を検出するように構成
    された検出器とを有するアッセイシステム。
  54. 【請求項５４】前記第一試薬源、第二試薬源およびポリイオン源がそれぞれ
    前記本体構造中に設けた第一容器、第二容器および第三容器からなり、該第一容
    器、第二容器および第三容器は前記第一チャンネルに流動可能に接続している請
    求項５３に記載のアッセイシステム。
  55. 【請求項５５】さらに、内部を通って毛細管チャンネルを設けた外部サンプ
    リング毛細管を有し、該毛細管チャンネルは第一端部および第二端部を有し、該
    第一端部は前記第一チャンネルに流動可能に接続し、該第二端部は開いている請
    求項５４に記載のアッセイシステム。
  56. 【請求項５６】さらに、前記検出器に操作可能に結合したコンピューターを
    有し、該コンピューターは、該検出器からの蛍光分極データを受信して前記第一
    試薬混合物の蛍光分極量を前記第一試薬、第二試薬およびポリイオンを含む第二
    試薬混合物の蛍光分極量と比較するようにプログラムされている請求項５３に記
    載のアッセイシステム。
  57. 【請求項５７】蛍光標識を付けた、第一試薬の容積部分と；該第一試薬と反
    応して、第一試薬とは実質的に異なる電荷を有する蛍光生成物を生じる第二試薬
    の容積部分と；ポリイオンの容積部分と；前記第一試薬の蛍光分極量を測定し、
    該第一試薬、第二試薬およびポリイオンを第一混合物中で混合し、該第一混合物
    の蛍光分極量を測定し、次いで前記第一試薬の蛍光分極量を前記第一混合物の蛍
    光分極量と比較するという内容の使用説明書とを含むキット。
  58. 【請求項５８】さらに、流体容器を含む請求項５７に記載のキット。
  59. 【請求項５９】前記流体容器が多数ウエル板の少なくとも第一ウエルからな
    る請求項５８に記載のキット。
  60. 【請求項６０】前記流体容器が、内部に設けた少なくとも第一チャンネルを
    有する本体構造からなる請求項５７に記載のキット。
  61. 【請求項６１】前記流体容器が、内部に設けた複数の交差チャンネルを有す
    る本体構造からなる請求項６０に記載のキット。
  62. 【請求項６２】蛍光標識を付けた第一試薬を含む第一試薬混合物を供給する
    工程、該第一試薬混合物に第二試薬を導入して第二試薬混合物を作製する工程、
    ここで第二試薬は前記第一試薬と反応して該第一試薬とは実質的に異なる電荷を
    有する蛍光標識生成物を生じる、および前記第一試薬混合物および第二試薬混合
    物の少なくとも一種にポリイオンを導入する工程を含む反応パラメーターの定量
    用アッセイシステムにおいて、前記第一試薬混合物の蛍光分極の第一の量を測定
    する工程、前記第二試薬混合物の蛍光分極の第二の量を測定する工程、および前
    記蛍光分極の第一量と第二量とを比較して、前記反応パラメーターを計算する工
    程からなるコンピューターでの実施方法を含む前記システム。
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