JP2003502365A - Ｒａｓアンタゴニストによる非悪性疾患処置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 非悪性疾患、障害または異常状態と連係する細胞のＲａｓ誘発または仲介増殖を抑制する方法が開示されている。この方法は、増殖を抑制するのに有効な量のＲａｓアンタゴニストを患者に投与する工程を備えている。本発明は、自己疾患、例えば、タイプＩの糖尿病、狼瘡及び多発性硬化症のようなＴ細胞の増殖を特徴とする疾患、並びに、疾患状態（例えば、腎不全）に応答して移植片のような異種抗体の存在により誘発される移植拒否反応のような異常状態に特に適用される。細胞の増殖を特徴とする他の非悪性疾患には、肝硬変及び再狭窄が含まれる。好ましいＲａｓアンタゴニストは、Ｓ−トランス−トランスファルネシルチオサリチル酸（ＦＴＳ）及びその構造的に関連する化合物（または類似体）である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （関連する出願の相互参照） 本願は、１９９９年６月１８日付け出願の米国特許出願第６０／１４０，１９
２号からの３５ＵＳＣ§１１９（ｅ）の規定に基づく優先権を主張するものであ
る。

【０００２】 （技術分野） 本発明は、非悪性腫瘍の発病の抑制または処置、より特定すると、Ｒａｓ誘発
増殖に関連する異常を有する疾患の抑制に関する。

【０００３】 （背景） 自己免疫疾患には、組織の損傷を仲介する、免疫系の機能不全に関連する疾患
が含まれるが。器官は、免疫複合体の沈降、細胞免疫、またはサイトカインのよ
うな免疫ホルモンの不適正な発生もしくは作用を介してかかるプロセスの影響を
受ける。疫学的には、自己免疫疾患は、かかる疾患が影響を及ぼす患者の数並び
にかかる疾患がもたらす深刻な罹患率及び死亡率を考えると、重要である。この
グループの一般的な慢性全身疾患には、糖尿病、甲状腺疾患、リューマチ性関節
炎、全身性狼瘡紅斑（ＳＬＥ）、一時的な抗リン脂質症候群（ＡＰＳ）及び中枢
神経系に影響を及ぼす種々の疾患が含まれる。神経学的な自己免疫疾患には、重
症筋無力症、ランバートイートン筋無力症候群、ギャンバレー症候群、多節炎及
び多発性硬化症が含まれる。更に、全身性自己免疫疾患の神経系合併症がある。
自己免疫疾患に素因を与えるファクタには、遺伝子的素因と、ある種の感染症及
び薬剤品のような環境的な素因がある。かかる因子により、一般にＴリンパ球（
Ｔ細胞）により制御される、罹りやすい個体の免疫応答は、病理学的に活性化さ
れる。Ｔ細胞及びＢ亜型の活性化は、細胞表面のレセプタの複雑な相互作用が関
連し、遺伝子の規制に最終的に影響を及ぼす同等に複雑な信号変換経路をもたら
す。リンパ球を完全に活性化させるには、幾つかの信号変換経路を並列に刺激す
る必要がある。Biochim. Biophys. Acta.、第１３１０巻、第２２３−２３２頁
（１９９６年）に掲載のオーツカ(Ohtsuka)等の論文を参照されたい。

【０００４】 免疫応答におけるＴ細胞についての理解が高まっているが、ほとんどの自己免
疫疾患の本質は、説明されていない。正常な個体における自己に対するトレラン
スがどのように保持されているのか、トレランスが自己免疫においてどのように
壊されるのか、及びどの自己抗原が免疫系をトリガして特定の疾患を形成するの
かといったような、解決されるべき問題が依然としてある。Clin. Invest.、第
１０１巻、第９２１−９２６頁（１９９８年）に掲載の）ブイ・タネジャ(V. Ta
neja)及びシー・エス・デイビッド(C.S. David)の論文においては、本技術分野
における重要な問題が総括されているとともに、機能性ＨＬＡ分子を発現する遺
伝形質転換マウスの発生が自己免疫疾患の誘発におけるある分子の機能、更には
外因性バリヤの包囲を理解するうえで如何に重要であるかということが強調され
ている。自己免疫疾患の誘発または移植の拒否に関連する機構とは関係なく、こ
れらの事態に共通の経路には、比較的少数のＴリンパ球の活性化が含まれる。

【０００５】 幾つかの免疫抑制及び免疫調節処置が、自己免疫疾患の治療おいて試験され、
その後適用されてきた。Biochem. Biophys. Res. Commun.、第２３９巻、第９０
０−９０４頁（１９９７年）に掲載のガナ−ワイツ・エム(Gana-Weisz, M)、ハ
マイ・アール(HaMai, R)、マルシアノ・ディ(Marciano D)、エゴジ・ワイ(Egozi
Y)、ベン・バルチ・ジー(Ben-Baruch G)及びクルーグ・ワイ(Kloog Y)の「Ｒａ
ｓアンタゴニストＳ−ファルネシルチオサリチル酸はＭＡＰＫ活性化の抑制を誘
発する(The Ras antagonist S-farnesylthiosalicylic acid induces inhibitio
n of MAPK activation)」と題する論文、Bioerg. Med. Chem. Lett.、第７巻、
第１７０９−１７１４頁（１９９７年）に掲載のマルシアノ・ディー(Marciano
D)、アハロンソン(Aharonson)、バルサノ・ティー(Varsano T)、ハクライ・アー
ル(Haklai R)及びコ・ワイ(KO Y.)の「プレニル化タンパク質メチルトランスフ
ェラーゼの新規なインヒビタは、顕著な構造的要件を明らかにしている(Novel i
nhibitors of the prenylated protein methyltransferase reveal distinctive
structural requirements)」と題する論文。ボストンに所在するリトル・ブラ
ウン・アンド・カンパニ(Little, Brown and Company)発行の、「免疫学的疾患
（Immunological Deseases）」、第３版、［エム・スマータ(M. Smater)、エヌ
・アレキサンダ(N.Alexander)、ビー・ローズ(B.Rose)、ダブリュビー・シャー
マン(W.B.Sherman)ディーダブリュ・タルメージ(D.W. Talmage)及びジェイエイ
チ・ボーン(J.H.Vaughn)編］第１４００頁（１９７８年）に掲載のパターソン・
ピー・ワイ(Paterson P.Y.)の「脱離疾患：動物及び人間における臨床的及び実
験的研究」と題する論文。

【０００６】 免疫抑制理学療法の主な欠点として、全てのＴ細胞及び免疫機能の一般化抑制
の誘発は、長期の累積副作用と関連しているという点がある。更に、免疫細胞の
広範囲の抑制はまた、自己免疫リンパ球に及ぼす抑圧遺伝子及び抑圧遺伝子誘発
因子のような低下調節細胞またはＩＬ−１０のようなサイトカインの有利な作用
をなくし、または中和することが考えられている。上記したカルシス(Karussis)
等の論文、上記したガナ−ワイツ等の文献、Science、第２３９巻、第１８１頁
に掲載のリーダー・オウ(Lieder O)、ティー・レシェフ(T. Reshef)、イー・ベ
ラウード(E. Berauud)、エイ・ベン−ナン(A. Ben-Nun)及びアイアール・コーエ
ン(I.R. Cohen)の「実験的自己免疫脳脊随炎に対するＴ細胞接種により誘発され
る抗イディオタイプネットワーク(Anti-idiotypic network induced by T cell
vaccination against experimental autoimmune encephalomyelitis)」と題する
論文、Immuno. Today、バレラ・エフジェイ(Varela F.J.)及びエイ・クーチンホ
(A. Coutinho)の「第二世代免疫ネットワーク(Second generation immune netwo
rks)」と題する論文、Immunol. Today、第１２巻、第１０５頁（１９９１年）に
掲載のコーエン・アイアール(Cohen I.R.)及びディービー・ヤング(D.B. Young)
の「自己免疫、微生物免疫及び免疫ホマンキュラス(Autoimmunity, microbial i
mmunity and the immunological homunculus)」と題する論文、Clin Immunopath
ol、第８５巻、第２０２頁（１９９７年）に掲載のレーマン・ディー(Lehmann D
)、ディー・カルシス(D. Karussis)、アール・ミツラチ−コール(R. Mizrachi-K
oll)、エイエスリンデ(A.S Linde)及びオウ・アブラムスキー(O. Abramsky)の「
リノミドによる多発性硬化症の進行の抑制はＣＤ４＋／ＣＤ４５ＲＡ＋細胞の上
昇調節及びＣＤ４＋／ＣＤ４５ＲＯ＋細胞の低下調節と関連する(Inhibition of
the progression of multiple sclerosis by linomide is associated with up
regulation of CD4+/CD45RO+ cells)」と題する論文。

【０００７】 従って、自己免疫疾患の処置に関する現在の方法は、免疫調節剤または特異免
疫抑制薬剤の使用を示している。かかる研究の目的は、自己免疫能力を有するリ
ンパ球だけの特異抑制である。このような特異的な抑圧遺伝子に関する研究は、
恐るべき挑戦であり、特に、リンパ球の成長と分化に関連する信号変換経路の複
雑なネットワークを検討しなければならない。この場合、かかる経路の多くは、
全てのリンパ球の系統及び他の細胞に共通している。

【０００８】 自己免疫疾患のほかに、Ｔ細胞以外の正常細胞の増殖が病理学の一部を構成す
る幾つかの他の疾患がある。

【０００９】 （発明の概要） 本発明の一の観点によれば、非悪性(non-malignant)疾患、障害または病的状
態と関連する細胞のＲａｓ誘発増殖(Ras-induced proliferation)を抑制する方
法が提供されている。この方法は、増殖を抑制するのに有効な量のＲａｓアンタ
ゴニスト(antagonist)を患者（人間その他の哺乳類）に投与する工程を含む。本
発明は、特に、タイプＩの糖尿病、狼瘡及び多発性硬化症のようなＴ細胞（例え
ば、正常(normal)Ｔ細胞）の増殖に特徴がある自己免疫疾患に関する。Ｔ細胞の
増殖に関連する非自己免疫疾患に、移植拒否反応がある。他の疾患には、肝硬変
、血管形成術後の再狭窄及び移植拒否反応がある。

【００１０】 本発明の別の観点によれば、非悪性疾患、病的状態または障害（総称して、「
疾患」("disease")という）に関連する細胞のＲａｓ仲介増殖を抑制する方法が
提供されていて、この方法は、細胞を増殖を抑制するのに有効な量のＲａｓアン
タゴニストと接触させる工程を備えている。

【００１１】 これらの疾患に共通する細胞の増殖、過栄養または過成長は、Ｒａｓによって
仲介される。このタンパク質は、細胞膜の内面の特定のサイトに結合し、または
ドッキングした後に、一連の生化学的な事象により活性化される。次いで、Ｒａ
ｓの活性化により、細胞の成長と分化を最終的にもたらす別の一連の、相互に関
連する生化学反応または信号変換(signal transduction)カスケードがもたらさ
れる。本発明のＲａｓアンタゴニストは、細胞膜に対するＲａｓの結合に影響を
及ぼし（例えば、抑制し）、次いで、所望しない細胞の増殖を低下させまたは抑
制する。

【００１２】 好ましいＲａｓアンタゴニストには、ファルネシルチオサリチル酸（ＦＴＳ）
及びその構造的に関連する化合物または類似体が含まれるが、これらは、Ｒａｓ
を、Ｒａｓが固定されている膜から排除しまたは除去することにより機能を行う
ものと考えられる。これらの有機化合物は、非経口投与または経口投与すること
ができる。特に好ましい実施の形態においては、Ｒａｓアンタゴニストは、シク
ロデキストリンとの錯化により、経口または非経口投与用に配合することができ
る。

【００１３】 ＦＴＳは、黒色腫、並びに、肺、結腸、膵臓、子宮及びメルケル細胞の癌を含
む、Ｒａｓの癌遺伝子形態物により仲介される、動物における癌の成長に影響を
及ぼすことが示されている。これらの実験の結果により、ＦＴＳは、標準的な癌
の化学療法と関連する有意の毒性作用を引き起こすことなく、幾つかの場合には
、癌細胞の成長を９０％を越えるレベルまで低減させることがわかった。この結
果からはまた、癌治療において使用されるＦＴＳの同様の用量によっては、正常
細胞はほとんど影響を受けないことがわかった。Biochim. Biophys. Acta、第１
４０６巻、第４０−５０頁（１９９８年）に掲載のアハロンソン(Aharonson)等
の論文を参照されたい。種々の非悪性疾患と関連する正常細胞（例えば、種々の
自己免疫疾患に関連するＴ細胞、硬化症と関連する星状細胞及び血管形成術後の
再狭窄と関連する平滑筋細胞）の増殖は、正常のまたは非発癌性のＲａｓにより
、少なくとも一部が仲介されることが知られている。更に、ＦＴＳ及び同様に活
性な化合物は、正常細胞の増殖を特徴とする疾患に罹っている患者を治療するの
に使用することは考えられていなかった。

【００１４】 本発明の方法は、現在の免疫抑制及び免疫調節治療の理学療法では得られない
幾つかの利点を提供することができる。本発明の方法は、全ての分化細胞に非毒
性であり、治療有効用量で非毒性であり、しかも全身免疫抑制を引き起こすこと
がない。

【００１５】 （発明を実施するための最良の形態） 本発明の方法は、細胞のＲａｓ誘起増殖を特徴としあるいは含む非悪性疾患、
病的状態その他の疾患の治療に関する。１つのかかるカテゴリの疾患の病因学は
、１つ以上の成長因子の解放を誘発し、次いで、正常細胞のＲａｓ仲介肥大また
は過成長を誘発する組織の損傷またはダメージにより開始される。これには、例
えば、正常な肝細胞の増殖と関連がある肝硬変、星状細胞及び結合組織細胞があ
る。他の例として、血管形成術後の再狭窄がある。この場合、動脈内ステントの
挿入は、正常な平滑筋細胞の損傷、成長因子の放出及び増殖を引き起こす。Ｔ細
胞レセプタを介しての自己抗原の提示に応答する正常なＴ細胞の過成長を特徴と
する自己免疫疾患は、第２のカテゴリの疾患を構成する。このカテゴリの疾患に
は、全身狼瘡紅斑（ＳＬＥ）、多発性硬化症（ＭＳ）、抗リン脂質症候群（ＡＰ
Ｓ）、乾癬、タイプ１（即ち自己免疫）糖尿病及びリューマチ様関節炎が含まれ
る。移植拒否反応は、異種抗原（即ち移植片）の提示に応答するＴ細胞の増殖に
関連する自己免疫疾患である。従って、ターゲットとされる細胞は、非悪性であ
り、かつ、正常であるが、影響全体が疾患病理学に寄与するように刺激に応答し
て機能する意味において正常である。

【００１６】 Ｔリンパ球の活性化は、最終的に遺伝子規制に影響を及ぼす同等に複雑な信号
変換経路の活性化を引き起こす細胞表面のレセプタの複雑な相互作用を必要とす
る。J. Biol. Chem.、第２６８巻、第２６９３頁（１９９３年）に掲載のバルダ
リ(Baldari)等の論文及びSemin Immunol.、第３巻、第３２５頁（１９９１年）
に掲載のシーゲル（Siegel）等の論文を参照されたい。リンパ球を完全に活性化
させるには、２つの顕著な経路、即ち、ｓｒｃ様のチロシンキナーゼ１ｃｋ、Ｇ
ＴＰ結合タンパク質Ｒａｓ及びＭＡＰＫカスケードを含む経路と、ＺＡＰ−７０
チロシンキナーゼ、ＰＬＣγ及びカルシウム流入を含む経路とを含む異なる信号
変換経路（上記シーゲルの論文）の刺激を並列に必要とする（Biochim. Biophys
. Acta、第１３１０巻、第２２３頁（１９９６年）に掲載のオーツカ(Ohtsuka)
等の論文）。Ｒａｓ経路のレセプタ仲介活性化は、細胞膜の特殊のドメインに対
するアダプタタンパク質及びグァニンヌクレオチド交換因子（ＧＥＦ）のリクル
ートメントを必要とし、ＲａｓＧＥＦ（ＳＯＳ）は、ＧＤＰとＲａｓのＧＴＰと
の交換を誘起することにより、このＧＴＰ結合タンパク質を活性化する。Nature
、第３６６巻、第６４３頁（１９９３年）に掲載のボグスキ(Boguski)等の論文
、Biochim. Biophys. Acta、第１３３３巻、第Ｆ５１頁（１９９７年）に掲載の
コックス(Cox)等の論文、Curr. Opin. Cell Biol.、第８巻、第１９７頁に掲載
のマーシャル(Marshall)の論文及びScience、第２７７巻、第３３３頁（１９９
７年）に掲載のシェフゼク(Scheffzek)等の論文を参照されたい。Ｒａｓの活性
化及びその依存経路のＭＡＰＲカスケードは、リンパ球の活性及び増殖の際の主
要の完全に必要な生化学事象であり、ＩＬ−２レセプタ遺伝子のような即時の早
期遺伝子を誘起させる。

【００１７】 Ｒａｓタンパク質は、細胞分裂をもたらす調節カスケーディングとホルモン／
成長因子レセプタとの間のオン／オフスイッチである。調節カスケードに刺激を
与えるようにＲａｓを活性化させる（即ち、オンにする）には、先づ、Ｒａｓを
細胞膜の内側に取り付けなければならない。調節カスケードに対するＲａｓの作
用をブロックすることを目的とするＲａｓアンタゴニスト薬剤の開発が、Ｒａｓ
の細胞膜との連係を遮断し、Ｒａｓの活性化をブロックし、あるいは活性化され
たＲａｓを抑制することに向けて行われた。Ｒａｓアンタゴニストの開発の方法
の詳細が、Exp. Opin. Invest. Drugs、第８（１２）巻、第２１２１−２１４０
頁（１９９９年）に掲載のクルーグ（Kloog）等の論文に記載されている。かく
して、「Ｒａｓアンタゴニスト」("Ras antagonist")とは、細胞の増殖を抑制す
るようにこれらの現象の１つ以上をターゲットとする化合物または試薬を意味す
るものである。

【００１８】 一の実施の形態においては、Ｒａｓアンタゴニストは、下記の式１により表さ
れ、

【化１】 上記式において、 Ｒ^１は、ファルネシル、ゲラニルまたはゲラニル−ゲラニルを示し、 Ｚは、Ｃ−Ｒ^６またはＮを示し、 Ｒ^２は、Ｈ、ＣＮ、ＣＯＯＲ^７基、ＳＯ_３Ｒ^７基、ＣＯＮＲ^７Ｒ^８基、ＣＯＯＭ
基、ＳＯ_３Ｍ基またはＳＯ_２ＮＲ^７Ｒ^８基を示し、Ｒ^７及びＲ^８はそれぞれ独立
して水素、アルキルまたはアルケニルであり、Ｍは陽イオンであり、 Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５及びＲ^６は、それぞれ独立して、水素、カルボキシル、アルキ
ル、アルケニル、アミノアルキル、ニトロアルキル、ニトロ、ハロ、アミノ、モ
ノもしくはジアルキルアミノ、メルカプト、メルカプトアルキル、アキシド(axi
do)またはチオシアナート(thiocyanato)であり、 Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ_２、ＮＨまたはＳｅであり、 式１の化合物の第四アンモニウム塩及びＮ酸化物であり、ＺはＮである。

【００１９】 これらの化合物は、ファルネシル−チオサリチル酸（ＦＴＳ）（例えば、Ｓ−
トランス、トランス−ＦＴＳ）及びその類似体を表す。Ｒ^２がＨを表す実施の形
態においては、Ｒ^３はカルボキシル基であるのが好ましい。ＦＴＳ及び２つの好
ましい類似体の構造は、次の通りである。 （ｉ）ＦＴＳ

【化２】 （ｉｉ）２−クロロ−５−ファルネシルアミノ安息香酸（ＮＦＣＢ）

【化３】 （ｉｉｉ）ファルネシルチオニコチン酸（ＦＴＮ）

【化４】

【００２０】 これらの化合物は、米国特許第５，７０５，５２８号の要旨である。この化合
物を合成する方法も同様に、記載されている。

【００２１】 式Ｉにより包含される更に別のＦＴＳ類似体には、５−フルオロ−ＦＴＳ、５
−クロロ−ＦＴＳ、４−クロロ−ＦＴＳ及びＳ−ファルネシル−メチルチオサリ
チル酸（ＦＭＴＳ）が含まれる。これらの化合物の構造は次の通りである。

【化５】

【化６】

【化７】

【化８】

【００２２】 これらの化合物を合成する方法は、実施例７に記載されている。本発明におい
て有用な化合物は、更に、J. Med. Chem.、第３８巻、第１２６７頁（１９９５
年）に掲載のマルシアーノ（Marciano）等の論文、Biochemistry、第３７巻、第
１３０６頁（１９９８年）に掲載のハクライ（Haklai）等の論文、Proc. Natl.
Acad. Sci. USA、第８６巻、第８３２３頁に掲載のケーシー（Casey）等の論文
、Cell、第５７巻、第１１６７頁（１９８９年）に掲載のハンコック（Hancock
）等の論文及びBiochim. Biophys. Acta、第１４０６巻、第４０頁（１９９８年
）に掲載のアハロンソン（Aharonson）等の論文に記載されている。

【００２３】 特に好ましい試薬は、ＦＴＳである。この化合物は、Ｒａｓの信号化に必要な
Ｒａｓカルボキシファルネシルシステインにより促進される、Ｒａｓの細胞膜に
対する適正な取着を不安定にする。本発明の中で、偽のＲａｓ固定成分がＦＴＳ
に与える化合物の中で特にＦＴＳの独特の特性は、Ｒａｓの、生きている細胞に
おける細胞膜との相互作用を細胞毒性なしに途絶させる能力である。動作に関す
る特定の理論により拘束されるものではないが、作用の機構は、膜Ｒａｓに対す
る二重の影響を必要とし、最初（３０分以内）は、ＦＴＳが側方の移動性(later
al mobility)に対する拘束からＲａｓを解放し、続いて、Ｒａｓを細胞形質の中
に放出し、その後、Ｒａｓの分解が行われる。次に、Ｒａｓの減少量と、ＦＴＳ
処理された線維芽細胞と、ヒト腫瘍細胞の変化した膜移動性とが、ミトゲン活性
化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）Ｅｒｋに対するＲａｓ仲介信号化の抑制にお
いて示される。これもまた、ＦＴＳがＲａｓ形質転換細胞の増殖を抑制するとと
もに、Ｔ細胞抗原のミトゲン刺激及びトロンビン並びにＥＧＦ、ＰＤＧＦ及びＦ
ＧＦのような成長因子のミトゲン刺激を抑制する。

【００２４】 本発明において有用な他のアンタゴニストは、ＷＯ９８／３８５０９号に記載
の無細胞の膜(cell free membrane)検定及び細胞検定を使用して、識別すること
ができる。この特許公報には、候補となる試薬の能力を測定して、活性化された
Ｒａｓをその膜から除去するように構成された幾つかの検定系が記載されている
。一般に、既知のかつ検出することができる量のＲａｓが固定された特定の膜を
含む検定材料を、候補の試薬に曝す。次に、検定材料を、膜を含む膜フラクショ
ンと、特定の膜が除去された後に残る材料の残りの部分のサイトソルフラクショ
ン(cytosolic fraction)とに分離される。膜とサイトソルフラクションに含まれ
る既知の量の、標識が付されたＲａｓのフラクションは、候補試薬がＲａｓの膜
連合を壊す能力の目安として測定される。活性化されたＲａｓ固定膜の特に好都
合な源は、Ｐａｎｃ−１細胞のようなＲａｓ形質転換癌細胞から単離した膜であ
る。候補試薬に曝した後に膜に残っているＲａｓは、抗Ｒａｓ抗体を使用して標
準的な免疫検定により測定することができる。

【００２５】 一般に、本発明のＲａｓアンタゴニスト即ち試薬は、水及びＰＢＳのような生
理食塩水に実質上不溶性である。かくして、一の実施の形態においては、試薬は
、塩化され（例えば、ＮＡ^＋、Ｋ^＋またはＮＨ^＋の形態）、没食子酸アルキル並
びにレシチン及び／またはクエン酸あるいは燐酸を含むブチル化ヒドロキシアニ
ソールのような有機溶媒と配合される。これらの配合物においては、没食子酸ア
ルキルなどは、約０．０２％乃至約０．０５％の量が存在し、クエン酸あるいは
燐酸は、約０．０１％の量が存在する。これらの配合物は、非経口投与に適して
いる。

【００２６】 ＦＴＳ及びその類似体のような種々のＲａｓは、水に不溶性であることにに加
えて、経口投与されるときには活性ではない。本発明の一の実施の形態において
は、かかる欠点の双方は、試薬をシクロデキストリンに配合することにより解消
される。これらの技術は、米国特許第５，６８１，８２８及び５，９３５，９４
１号の要旨となっている。シクロデキストリンは、３つの親のシクロデキストリ
ン、即ち、アルファ、ベータ及びガンマシクロデキストリンからなり、あるいは
これらのシクロデキストリンから誘導される化合物の群である。アルファ、ベー
タ及びガンマシクロデキストリンは、アルファ（１乃至４）グリコシド結合によ
り大環状体にそれぞれ結合された６、７または８つのアンヒドログルコース残留
物からなる単純なオリゴ糖である。シクロデキストリンの各グルコース残留物は
、置換することができ、例えば、メチル化することができる１つの一次ヒドロキ
シル（Ｏ６）と２つの二次ヒドロキシル（Ｏ２及びＯ３）とを含む。多くのシク
ロデキストリンは、実際に使用される場合には、ヒドロキシ基の一部だけが置換
され、かつ、これらの置換基の数及び位置が異なる化学的に個別の誘導体の混合
物である。

【００２７】 シクロデキストリンは、シクロデキストリンと不溶性化合物との間で、包接錯
体として知られている物質を形成することにより不溶性化合物を極性媒体に安定
化させるが、シクロデキストリンの安定化力は、錯体の安定性と直接比例する。
包接錯体は、分子の非共有結合会合体であり、ホストと呼ばれる１つの化合物の
分子は、ゲストと呼ばれる他の化合物の分子が含まれるキャビティを有している
。シクロデキストリンの誘導体は、ホストとして使用され、不溶性化合物はゲス
トである。

【００２８】 本発明においては、数多くの異なるシクロデキストリン誘導体を使用すること
ができる。これらの誘導体には、部分メチル化されたデキストリンの幾つかのタ
イプの混合物が含まれる。一のタイプは、メチル基がグルコピラノース残留物の
一次及び二次ヒドロキシル間に略均等に分布している商業的な製剤（ワッカーケ
ミー(Wacker Chemie)、ベータ(Beta)Ｗ７Ｍ１．８）であり、ＲＡＭＥＢと略記
されている。第２のタイプは、主として二次ヒドロキシルにメチルを有している
。これらの誘導体は、米国特許第５，６８１，８２８号に記載されている。メチ
ル化シクロデキストリンの第３のタイプは、二次ヒドロキシ基（即ち、Ｏ２及び
Ｏ３）の半分を超える部分がメチル化されたシクロデキストリンまたはその混合
物により形成される。シクロデキストリン誘導体の他の混合物は、部分２−ヒド
ロキシプロピルエーテルがあり、アルファ、ベータ及びガンマシクロデキストリ
ンの誘導体について、それぞれＨＰＡＣＤ、ＨＰＢＣＤ及びＨＰＧＣＤと略記さ
れている。

【００２９】 シクロデキストリンとＲａｓアンタゴニストとの包接錯体の形成を促進するた
めに、高度にメチル化されたシクロデキストリンを、置換の少ないシクロデキス
トリンと共有または非共有的に錯体化させることができる。

【００３０】 簡単に説明すると、Ｒａｓは、塩化されかつ適宜の溶媒に溶解され、次いで、
メチル化されたシクロヘキサンのＰＢＳ溶液に加える。溶液を殺菌し、次いで、
溶媒を除去する。経口投与に適した配合物を調製するために、得られたシクロデ
キストリン／ＦＴＳ錯体を、適宜のバインダと混合し、次いで、圧力をかけてバ
ッカル(buccal)錠剤にした。これらの錠剤は、口内で粘膜に対して保持すると溶
解する。錠剤が溶解すると、シクロデキストリン粒子が膜と接触し、薬剤が放出
されるとともに口の膜を通って血流に入ると考えられている。あるいは、シクロ
デキストリン／Ｒａｓアンタゴニスト錯体は、非経口（例えば、静脈または皮下
）投与に適した適宜の溶液に再構成することができる。一般に、本発明の目的を
達成するのに有効なＲａｓの量は、隔日に５ｍｇ／ｋｇ乃至１日当たり５ｍｇ／
ｋｇの範囲にある。応答は、１回の処理で投与量を１日当たり約２０ｍｇ／ｋｇ
以下まで増加させるとともに、処理の頻度を多くすることにより、増幅させるこ
とができる。

【００３１】 Ｒａｓアンタゴニストの投与のタイミングは、Ｒａｓアンタゴニストが増殖前
または増殖の際に細胞と接触するように血行中にあるという点で重要である。例
えば、再狭窄の場合には、アンタゴニストは、ほぼ血管形成術の際に静脈内注入
(i.v.infusion)によるように予防的に投与するのが好ましい。投与は、約１４日
継続される。ｉｖ投与のほかに、試薬は、クリーム、ゲルまたはパッチのような
経皮製剤に配合することができ、あるいはシクロデキストリンと任意に錯体化ま
たは複合体化されるプロドラッグ(prodrug)の形態とすることができる。別の実
施の形態においては、試薬は、疾患で苦しんでいる患者に投与される。

【００３２】 以下、本発明を実施例に関して説明する。これらの実施例は、幾つかの自己免
疫疾患、肝硬変症及び再狭窄の動物モデルを含む種々の疾患状態と関連する正常
細胞の増殖を抑制しまたは低下させる本発明のＲａｓアンタゴニストの効能を示
すものである。これらの実施例は、単に例示のためにのみ提供されているのであ
って、本発明を限定するものではない。理解を容易にするために、引用された科
学刊行物を、各実施例の最後に掲げる。

【００３３】 実施例１ Ｒａｓ経路インヒビタ、Ｓ−トランス−トランスファルネシル チオサリチル酸（ＦＴＳ）が実験的なアレルギ性脳脊随炎を抑制 本実施例は、急性及び慢性の実験的な自己免疫脳髄炎（ＥＡＥ及びＣＲ−ＥＡ
Ｅ）に及ぼすＦＴＳの抑止効果を示す。

【００３４】 実験的アレルギ性脳脊随炎（ＥＡＥ）は、多発性硬化症（ＭＳ）の急性期のモ
デルとして作用するＴ細胞仲介疾患である（１−３）。慢性再発性ＥＡＥは、Ｍ
Ｓにより近い臨床的及び組織病理学的類似性を有するＥＡＥのモデルである（４
−５）。臨床学的には、ＥＡＥの双方のモデルにおいては、疾患は、急性または
再発性の麻痺の徴候が与えられ、中枢神経系（ＣＮＳ）の白質へのリンパ球の浸
潤と、その結果であるミエリンの破壊とにより組織病理学的に提示される。Ｔ細
胞が活性化され、続いてマクロファージによるミエリン抗原の提示が行われると
ともに、Ｔ細胞は、血液−脳バリヤを介してＣＮＳに侵入しかつミエリンを攻撃
する能力を獲得する。従って、ＥＡＥ及びＭＳの処置は、増殖するミエリン−反
応性Ｔリンパ球の低下調節を目的とする免疫抑制に基づく（６−１０）。

【００３５】 結果は、ＦＴＳが、ミエリン反応性の(myelin-reactive)活性化されたＴリン
パ球の低下調節によりＥＡＥを抑制したことを示している。更に、ＦＴＳは、一
般化された(generalized)免疫抑制作用は誘起しなかった。かくして、広範囲に
亘る免疫抑制理学療法に対して有意の利点を提供する。

【００３６】 材料及び方法 マウス （アメリカ合衆国に所在するジャクソン・ラボラトリ(Jackson Laboratory)か
ら購入した）８週齢の雌のＳＪＬ／Ｊマウスを、上部にフィルタを備えたケージ
において標準的な条件において飼った。マウスには、規則的に餌を与えるととも
に、抗生物質を含まない酸性水を与えた。

【００３７】 抗原 種々の遺伝的傾向(strain)の３乃至１０月齢のマウスから、脊髄ホモジェネー
ト（ＭＳＣＨ）を、ガス注入法により得た。ＭＳＣＨは、脊髄をＰＢＳ（１：１
ｖ／ｖ）において均質化することによりつくった。ホモジェネートを、凍結乾燥
し、ＰＢＳにおいて１００ｍｇ／ｍｌの濃度に再生し、使用するまで−２０℃で
保存した。ツベルクリン精製したタンパク質誘導体（ＰＰＤ）を、デンマーク国
、コペンハーゲンに所在するスタテンス・セラミンスチチュート(Statens Serum
institut)から得た。テンジクネズミのミエリン塩基性タンパク質（ＧＭＢＰ）
を、テンジクネズミの脊髄から上記のようにして得た（１１）。プロテオリピッ
ドタンパク質（ＰＬＰ）ペプチド１３９−１５１を、（イスラエル国、エルサレ
ムに所在する）ヘブリュー・ユニバーシティ、メディカル・スクール(Hebrew Un
iversity, Medical School)のインターデパートメント・イクイップメント・ユ
ニット(Interdepartment Equipment Unit)において自動固相ペプチドシンセサイ
ザを使用して合成した（１２）。

【００３８】 ＥＡＥの誘発及び評価 急性ＥＡＥの誘発を、ベルナルドのプロトコール(Bernard's protocol)の修正
手順に基づいて行った（１３）。簡単に述べると、等量のＭＳＣＨ（ＰＢＳにお
ける１０ｍｇ／ｍｌ）と、結核菌(Mycobacterium tuberculosis)Ｈ３７Ｒａ（６
ｍｇ／ｍｌ）（ミシガン州、デトロイトに所在するディフコ・ラボラトリーズ(D
ifco Laboratories)）で富化した完全フロイントアジュバント(complete Freud'
s adjuvant)とを、ブレンダにおいて均質化した。各マウスに対して、このエマ
ルジョン０．１ｍｌ（０．５ｍｇ）を４つのフットパッド(footpad)に皮下（ｓ
．ｃ．）注射した。その後直ちに及び２日後に、マウスに百日咳菌(Bordetella
pertussis)（マウス当たり２．７ｘ１０^９）（イスラエル国、エルサレムに所在
するラファ・ラボラトリーズ(Rafa Laboratories））を静脈内（ｉ．ｖ．）注射
した。動物を、疾患の徴候に関して毎日試験した。最初の臨床的な徴候は、免疫
化後１０−１２日で現れ、６つのポイントスケール、即ち、０：異常なし、１：
穏やかな尾の弱化（フロッピーテイル(floppy tail)）、２：尾の麻痺、３：尾
の麻痺及び後ろ足の進行麻痺、４：後ろ足の麻痺または穏やかな前肢の弱化、５
：四肢麻痺または瀕死状態、６：死亡に従って評価を行った。

【００３９】 ＣＲ−ＥＡＥは、上記のように、ＰＬＰ感作リンパ球の移動とともに誘起され
た（５）。簡単に説明すると、未実験(naive)のＳＪＬ／Ｊマウス（８−１２週
齢）を、結核菌４００μｇ含むＣＦＡにおいてＰＬＰの１３９−１５１ペプチド
（１５０μｇ／マウス）を脇腹に皮下注射して（ｓｃ）免疫化を行った。免疫化
後１０日後に、流出リンパ節を除去し、１つの細胞懸濁液をつくった。リンパ球
を完全ＲＰＭＩ培地（５）においてＰＬＰペプチド４００μｇを用いてインビト
ロで４日間培養した。その後、リンパ球を、未実験のＳＪＬ／Ｊ宿主（８−１２
週齢）に静脈内（ｉｖ）注射した。各宿主動物は、６０ｘ１０^６の細胞を受けた
。最初の麻痺の徴候は、７−８日で現れ、疾患は慢性及び再発性の軽減コースを
たどった。全ての動物を毎日検査し、疾患の重さを上記した０−６のスケールに
従って等級づけを行った。

【００４０】 ＦＴＳ処置 （粉末としての）ＦＴＳを、クロロホルムに希釈（ＦＴＳ＝０．１Ｍの３５．
８ｍｇ／ｍｌ）し、アリコートに保持した。一のアリコートの内容物（２５μｌ
）を窒素雰囲気の下で蒸発させ、次いで、絶対エタノール６μｌと１ＮのＮａＯ
Ｈ７μｌに溶解し、次いで、ＰＢＳを８９０μｌ加えた。各マウスは、この溶液
０．１ｍｌ（０．１ｍｇ／マウスまたは５ｍｇ／ｋｇ）を毎日、腹腔内で（ｉｐ
）受けた。

【００４１】 リンパ球の増殖応答 リンパ節細胞のプールされた（グループ当たり２−３匹の動物）単細胞懸濁液
を、ＥＡＥ誘発後１０日目に得て、抗原及びミトゲン（結核菌精製タンパク質誘
導体（ＰＰＤ））、テンジクネズミのミエリン塩基性タンパク質（ＧＭＢＰ）、
ＰＬＰ１３９−１５１ペプチド、リポ多糖（ＬＰＳ）並びにコンカナバリン（Ｃ
ｏｎＡ）に対する応答性に関して、標準的な増殖検定によりインビトロ検定を行
った。検定は、最適濃度の以下の抗原、即ち、ＧＭＢＰ５０μｇ、ＰＰＤ５０μ
ｇ、ＰＬＰペプチド２０μｇ／ｍｌ及びＣｏｎＡ１μｇ／ｍｌを含む増殖媒質０
．２ｍｌにおける４ｘ１０^５の細胞を各ミクロ培養溜めに播種することにより行
った。培養を、９６の溜めを有する平底のマイクロタイタプレート（アメリカ合
衆国、ケンブリッジに所在するコスタ(Costar)）において３回反復して行ったが
、この培養基を、空気９５％とＣＯ２５％からなる３７℃の加湿雰囲気におて７
２時間培養に供し、次いで、^３Ｈ−チミジン（ニュー・イングランド・ニューク
リア(New England Nuclear)）の１．０マイクロＣｉを用いて１８時間パルス処
理した。各ミクロ培養基からの細胞を、マルチハーベスタ（アメリカ合衆国、バ
ージニア州、アレキサンダに所在するダイナテック・ラボラトリーズ(Dynatech
Laboratories)）を用いてガラス繊維フィルタに取り、標準的なシンチレーショ
ン技術を使用して放射能を測定した。刺激指数（ＳＩ）は、抗原の存在下で培養
された細胞の平均ｃｐｍを、抗原が存在しない状態で培養した細胞の平均ｃｐｍ
で除することにより算出した。

【００４２】 リンパ球におけるＲａｓの測定 未実験のＳＪＬマウスに、ビヒクルまたはＦＴＳ（１０ｍｇ／ｋｇ、ｉｐ、１
日に２回）を２日間受けさせた。次に、Ｒａｓの全量を、（１４）において詳述
されているようにしてつくった細胞溶解産物おいて測定した。簡単に説明すると
、対照とＦＴＳ処理したマウスの脾臓のリンパ球を従来詳述されている（１４−
１５）ようにして、均質化緩衝液において均質化させた。全細胞タンパク質は、
１２．５％のドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ
−ＰＡＧＥ）により分離し、ニトロセルロース膜にブロットされた状態で、１．
２ｘ１０^６個の細胞に対応していた。パン−Ｒａｓ Ａｂ（パン−Ｒａｓ Ａｂ−
３、カルビオケム(Calbiochem)）を用いた免疫ブロット法、高機能化学発光検定
（ＥＣＬ）及びデンシトメトリ分析を、従来詳述されている（１４−１５）よう
にして行った。

【００４３】 ＦＡＣＳ分析 単細胞懸濁液を、ＥＡＥ誘発のための免疫処理後１０日目にＥＡＥが誘発され
たマウスの流出リンパ節からつくった。細胞を、単クローンＦＩＴＣ共役抗−Ｃ
Ｄ６２Ｌ、抗−ＩＡ−ｋ（ＭＨＣクラスＩ）及び抗−Ｖｂ１７抗体（アメリカ合
衆国に所在するベクトン・アンド・ディキンソン(Becton and Dickinson)）２０
μｌを用いて３０分間氷上で培養した。これらの表面マーカを表す細胞の割合を
、蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）により試験し、計数した１０，０００の細
胞の中で確実に染色された細胞の割合として計算した。

【００４４】 結果 ＦＴＳは、リンパ球のインビトロ増殖を抑制する： 第１組の実験は、ＦＴＳがリンパ球のインビトロミトゲン応答を抑制するかど
うかを試験するように構成した。リンパ球を、未実験のＳＪＬマウスから得て、
３Ｈ−チミジン増殖検定に供した。細胞に、種々の濃度のＦＴＳの存在下でまた
は存在なしに４８時間、ＬＰＳまたはＣｏｎＡで刺激を与えた。これらの実験の
結果は、ＣｏｎＡ及びＬＰＳ誘発リンパ球増殖の量依存(dose-dependent)抑制を
示していて、１２．５μＭ、２５μＭ及び５０μＭのＦＴＳは、それぞれ、２２
−５０％、６６−７１％及び９５−９８％の抑制を示した。

【００４５】 第２組の実験においては、ＥＡＥマウスのリンパ球におけるインビトロミトゲ
ン応答を抑制するかどうかを試験した。リンパ球は、ＥＡＥの誘発に関してＭＳ
ＣＨで免疫処理した動物のリンパ節から免疫化の１０日後に得た。次に、細胞を
種々の濃度のＦＴＳの存在下であるいは不存在下で培養し、ＬＰＳまたは特定の
ミエリン関連抗原であるＰＬＰ１３９−１５１ペプチドで刺激を与えた。典型的
な実験の結果によれば、ＬＰＳ及びＰＬＰの双方に対する応答は、ＦＴＳにより
量依存態様で抑制された。２５マイクロＭのＦＴＳは、ＬＰＳ及びＰＬＰミトゲ
ン応答の９１％及び６２％をそれぞれ抑制するのに十分であった。

【００４６】 ＦＴＳインビボ処理は、リンパ球のＲａｓの量を減少させる： ビヒクル及びＦＴＳ処理（５ｍｇ／ｋｇ／日）のＳＪＬマウスのリンパ球を、
処理後４８時間でマウスの脾臓から得た。次に、細胞を均質化し、Ｒａｓの全量
をパンＲａｓ抗体を用いてウエスタン免疫ブロットにより測定した（１４）。Ｆ
ＴＳ処理のマウスのリンパ球におけるＲａｓの見かけの量は、対照リンパ球のも
のよりも低かった。ＦＴＳ処理によりＲａｓの量が３６±７％減少したことが、
データのデンシトメトリ分析によりわかった。

【００４７】 ＥＡＥマウスにおけるＦＴＳ処理によるミエリン抗原に対するリンパ球増殖応答 の特異抑制： ＥＡＥを、ＭＳＣＨを用いてＳＪＬマウスにおいて誘発させた。動物を２つの
グループに分けた。一方のグループは、ビヒクルで腹腔内（ｉｐ）処理し、もう
一方のグループは、ＦＴＳ（５ｍｇ／ｋｇ、ｉｐ、毎日）を与えたが、これはＥ
ＡＥ誘発の日から始めた。リンパ球を、（疾患の臨床立上り前に）ＭＳＣＨでの
免疫化の１０日後の流出リンパ節から得て、インビトロ３Ｈ−チミジン摂取増殖
検定に供した。対照またはＦＴＳ処理動物とから得た細胞に、４８時間インビト
ロでミトゲンを用いて刺激を与えた。これらの実験の結果を表１に示すが、対照
と比較して、ＦＴＳ処理のマウスのリンパ球のミエリン抗原であるＰＬＰペプチ
ド（７２％）及びＧＭＢＰ（８３％）に対する反応性が著しく低下していること
がわかる。

【００４８】

【表１】 ＊ｐ＜０．０１（２つの尾ｔ−テスト） ３つの繰り返し実験のうちの１つからの結果が示されている。

【００４９】 （免疫接種源の一部である）ＰＰＤとＬＰＳ（５０−５７％）に対する反応性
の比較的穏やかな減少もまた認められたが、ＣｏｎＡに対する反応性の変化は検
出することができなかった。以上のように、これらの結果から、ＦＴＳはミエリ
ン関連抗原に対するリンパ球の感作を抑制するが、一般化された免疫抑制効果は
示していないことがわかる。

【００５０】 ＦＴＳによる免疫活性化の膜細胞表面マーカの発現の抑制： 表２に示すように、ＦＴＳで処理した動物からのリンパ球に関する表面マーカ
の蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）の分析により、ＣＤ６２１、ＩＡ−ｋ（Ｍ
ＨＣクラスＩ）及びＶｂ１７Ｔ細胞レセプタ（ＴＣＲ）を発現するリンパ球の割
合が減少していることがわかる。

【００５１】

【表２】 ＊Ｐ＜０．０５、２つの尾ｔ−テスト

【００５２】 後者は、ＥＡＥのこのモデル（１６−１７）における浸潤するＣＮＳ損傷に応
答するリンパ球において発現される主要ＴＣＲの１つであると考えられる。これ
らのデータ、更には（表１に示す）増殖検定のデータから、ＦＴＳによる処理は
、ミエリン（ＰＬＰ）反応リンパ球の発生及びリンパ球の活性化を低下調節して
いる（ＣＤ６２Ｌ発現の低下）ことがわかる。

【００５３】 ＦＴＳ処理マウスにおけるＥＡＥの臨床徴候の抑制： ６つの別個の実験において、３８匹のビヒクル処理動物のうち３２匹（７１．
７％）が、ＦＴＳ処理マウスの１６／３８（４４．７％）と比較して、ＥＡＥの
臨床徴候を発現した。表３参照。対照グループにおける最大の平均スコアは、２
．９４±２．２であり、一方、ＦＴＳグループにおいては、これは有意に低かっ
た（１．６３±２．２、ｐ＝０．０１）。死亡率は、２つのグループで、それぞ
れ２６．３％及び１０．５％であった（ｐ＝０．０３）。

【００５４】

【表３】 ＊：ｐ＜０．０５、２つの尾ｔ−試験

【００５５】 ＦＴＳ処理のマウスと対照グループとにおけるＥＡＥの臨床過程(clinical co
urse)を図１に示す。図１は、ＦＴＳ処理されたマウスにおけるＥＡＥの経過が
、対照と比較して有意に改善されたことを示している。

【００５６】 ＦＴＳ処理マウスにおけるＣＲ−ＥＡＥの臨床徴候の抑制 ＣＲ−ＥＡＥが、１３９−１５１ＰＬＰペプチド活性化リンパ球の受動転移に
より誘発された。（ＰＬＰで活性化されたリンパ球の）宿主マウスを、ＦＴＳ（
５ｍｇ／ｋｇ／日）で処理したが、細胞転移の日から開始した。図２に示すよう
に、処理されたマウスは、ＣＲ−ＥＡＥの一層穏やかな形態（ビヒクル処理の対
象と比較して、ｐ＝０．０２、２つの尾ｔ−試験）を示し、ビヒクル処理のグル
ープにおける３０％（３／１０）の死亡率と比較して、死亡したものはなかった
。第２の実験においては、ＰＬＰ感作化リンパ球を注入したマウスを、（３日を
越える期間の疾患スコアの増加として定義される）麻痺疾患の再発に、２−３ヶ
月の期間供した。対照のグループ（ｎ＝７）においては、全部で９つの再発が観
察されたが、ＦＴＳ処理のマウスでは５つ（ｎ＝７）であった。この傾向は、統
計学的な有意性に達していなかった。

【００５７】 結論 実験の結果から、急性及び慢性再発ＥＡＥのマウスモデルにおいては、ＦＴＳ
は、Ｒａｓ経路を抑制することにより、リンパ球の活性化を低下させるとともに
、ミエリン抗原に対するリンパ球の増殖を低下調節し、かつ、疾患の臨床麻痺徴
候を抑制していることがわかる。ＦＴＳにより、リンパ球のＲａｓの量を有意に
減少させるとともに、これらの細胞におけるミトゲンの応答を抑制した。

【００５８】 反応性リンパ球の特異集団の発生を抑制するという事実の判明は、重要である
。データは、ＦＴＳが、エクスビボ(ex vivo)実験の証拠としてミエリン反応性
リンパ球の発生を抑制していることを示している。ＦＴＳのインビボ臨床効果が
、明白になるとともに、インビトロにおいて明らかに示されている。即ち、ミエ
リン特異抗原に対する応答の大きな低下（＞７８％の低下）と、非特異抗原に対
するごく穏やかな低下が、観察された。かくして、ＦＴＳは、一般化された免疫
抑制を引き起こすのではなく、ミエリン反応性リンパ球を特異的に低下調節して
いる。ＦＴＳで処理した動物の細胞における表面リンパ球マーカのＦＡＣＳ分析
によると、この薬剤が、ミエリン反応リンパ球の発生を抑制していることが更に
わかった（これらは、Ｖｂ１７ＴＣＲ、ＥＡＥリンパ球における主要でかつ特異
のＴＣＲを発現している（１６−１７））。ＦＴＳはまた、ＣＤ６２Ｌポジティ
ブ細胞（活性化リンパ球のマーカ）の割合と、ＩＡ−ｋの誘発された増加とを抑
制している。他のリンパ球細胞表面マーカ（ＣＤ３、ＣＤ４及びＣＤ８）の発現
は、ＥＡＥマウスにおけるＦＴＳによる影響を受けなかった。

【００５９】 更に、ＦＴＳは、Ｒａｓ−ＧＴＰレベルが低い細胞においてよりも、Ｒａｓ−
ＧＴＰレベルが高い細胞において一層有効である。これにより、ＦＴＳの観察さ
れた選択性が明らかとなり、ＥＡＥの誘発の際にミエリン抗原により感作され（
かくして高進されたＲａｓ活性を示す）リンパ球は、その時点で活性化されてい
ないリンパ球の残りの部分よりも、ＦＴＳに対して一層受攻性を有する。かくし
て、ＥＡＥにおいてＦＴＳの選択性を提供するのは、Ｒａｓ活性化である。従っ
て、ＦＴＳに対する一般化免疫抑制応答の欠如は、刺激を受けないリンパ球の非
選択性によるものとすることができる。

【００６０】 これらのインビトロ効果により、急性疾患のモデルと慢性再発性ＥＡＥとの双
方におけるＥＡＥに対するＦＴＳの臨床効果が明らかとなる。（ＦＴＳが急性だ
けでなく慢性再発性ＥＡＥを抑制することができるという）後の事実は、ＣＲ−
ＥＡＥが、多発性硬化症の臨床経過に一層の信頼性を持って刺激を与えるので、
臨床上大きな重要性を有している。ＦＴＳにより得られる選択的な非一般化免疫
抑制は、ＭＳ及び他の自己免疫疾患において新たな治療方法を提供することがで
きる。

【００６１】 文献 １．Crit Rev Clin Lab Sci、第３２巻、第１２１頁（１９９５年）に掲載の
マーチン・アール(Martin, R.)及びエイチ・エフ・マックファーランド(H.F. Mc
Farland)の「実験的アレルギ脳脊随炎及び多発性硬化症の免疫学的観点(Immunol
ogical aspects of experimental allergic encephalomyelitis and multiple s
clerosis)」と題する論文。

【００６２】 ２．Ann Neurol、第３６巻（増補）、第Ｓ６１頁（１９９４年）に掲載のレイ
ン・シー・エス(Raine, C.S.)の「デイル・イー・マックファーリン記念講演：
多発性硬化症病巣の免疫学(The Dale E. McFarlin Memorial Lecture: the immu
nology of the multiple sclerosis lesion)」と題する論文。

【００６３】 ３．Immunol Today、第１０巻、第１０４頁（１９８９年）に掲載のハフラー
・ディーエイ(Hafler, D.A.)及びエイチ・エル・ウエイナー(H.L. Weiner)の「
ＭＳ：ＣＮＳ及び全身自己免疫疾患(MS: a CNS and systemic autoimmune disea
se)」と題する論文。

【００６４】 ４．Springer Semin Immunopathol、第８巻、第１９７頁（１９８５年）に掲
載のルブリン・エフ・ディ(Lublin, F.D.)の「再発性実験的アレルギ脳脊随炎。
多発性硬化症の自己免疫モデル(Relapsing experimental allergic encephalomy
elitis. An autoimmune model of multiple sclerosis.)」と題する論文。

【００６５】 ５．J Neuroimmunol、第２１巻、第１８３頁（１９８９年）に掲載のファンデ
ル・ビーン・アール・シー(van den Veen R.C.)、ジェイ・エル・トロッタ(J.L. Trotter)、エイチ・ビー・クラーク(H.B.Clark)及びジェイ・エイ・カップ(J.A
.Kapp)の「ミエリンプロテオリッピドタンパク質に対して感作されたリンパ節細
胞を有する慢性再発性実験的アレルギ脳髄炎の養子転移(The adoptive transfer
of chronic relapsing experimental allergic encephalomyelitis with lymph
node cells sensitized to myelin proteolipid protein)」と題する論文。

【００６６】 ６．J Neurol Sci、第１５３巻、第２３９頁（１９９８年）に掲載のカルシス
・ディー・エム(Karussis, D.M.)及びオウ・アブラムスキー(O. Abramsky)の「
多発性硬化症の免疫調節治療方法(Immunomodulating therapeutic approaches f
or multiple sclerosis)」と題する論文。

【００６７】 ７．Ann Neurol、第３７（増補１）巻、第Ｓ２頁（１９９５年）に掲載のダラ
カス・エム・シー(Dalakas, M.C.)の「免疫治療ターゲットに関する神経免疫学
の基本的観点：現在及び将来の展望(Basic aspects of neuroimmunology as the
y relate to immunotherapeutic targets: present and future prospects)」と
題する論文。

【００６８】 ８．Neurology（１９８８年）に掲載のリサック・アール・ピー(Lisak, R.P.)
の「多発性硬化症における免疫調節治療の原理の概要(Overview of the rationa
le for iimunomodulating therapies in multiple sclerosis)」と題する論文。

【００６９】 ９．J. Immunol.、第１４８巻、第１６９３頁（１９９２年）に掲載のカルシ
ス・ディー・エム(Karussis, D.M.)、エス・スラビン(S.Slavin)、ディー・レー
マン(D.Lehmann)、アール・ミズラッチ−コル(R.Mizrachi-Kol)、オウ・アブラ
ムスキー(O.Abramsky)及びエイ・ベン−ナン(A.Ben-Nun)の「実験的自己免疫脳
髄膜炎の予防及び急性免疫抑制による寛容免疫の誘発その後の有性生殖骨髄移植
(Prevention of experimental autoimmune encephalomyelitis and induction o
f tolerance with acute immunosuppression followed by syngeneic bone marr
ow transplaantation)」と題する論文。

【００７０】 １０．J. Neutoimmunol.、第３９巻、第２０１頁（１９９２年）に掲載のカル
シス・ディー・エム(Karussis, D.M.)、エス・スラビン(S. Slavin)、エイ・ベ
ン−ナン(A. Ben-Nun)、エイチ・オバディア(H.Ovadia)、ユー・ボルカ−カルシ
ス(U. Vourka-Karussis)、ディー・レーマン(D. Lehmann)、アール・ミズラッチ
−コル(R. Mizrachi-Koll)及びエイ・アブラムスキー(O. Abramsky)の「慢性再
発性実験的自己免疫脳髄炎（ＣＲ−ＥＡＥ）：高用量シクロホスファミドを用い
た寛容免疫の処理及び誘発とその後の有性生殖骨髄移植(Chrone-relapsing expe
rimental autoimmune encephalomyelitis(CR-EAE): treatment and induction o
f tolerance with high dose cyclophosphamide followed by syngeneic bone m
arrow transplantation)」と題する論文。

【００７１】 １１．Prep. Biochem.、第２巻、第１３９頁（１９７２年）に掲載のディーブ
ラ・ジー・イー(Diebler, G.E.)、アール・イー・マーテンソン(R.E. Martenson
)、エム・ダブリュ・キース(M.W. Kies)の「幾つかの哺乳類種の中枢神経組織か
らのＭＢＰの大規模調製(Large scale preparation of MBP from central nervo
us tissue of several mammalian species)」と題する論文。

【００７２】 １２．ニューヨーク州に所在するアカデミー・プレス(Academic Press)発行、
イー・グロス(E.Gross)及びジェイ・メイエンホファー(J. Meienhofer)編のIn T
he Peptide、第２巻（１９８０年）に掲載のバラニー・ジー(Barany, G.)及びア
ール・ビー・メリフィールド(R.B. Merrifield)の「ザ・ペプチド(The peptide)
」と題する論文。

【００７３】 １３．J Immunol、第１１４巻、第１５３７頁（１９７５年）に掲載のバーナ
ード・シー・シー・エイ(Bernard, C.C.A.)及びピー・アール・カーネギー(P.R.
Carnegie)の「マウスの実験的自己免疫脳脊随炎：マウスの脊髄及びミエリン塩
基性タンパク質に対する免疫学的応答(Experimental autoimmune encephalomyel
itis in mice: immunological response to mouse spinal cord and myelin bas
ic protein)」と題する論文。

【００７４】 １４．Biochemistry、第３７巻、第１３０６頁（１９９８年）に掲載のハクラ
イ・アール(Haklai, R.)、エム・ジー・ワイツ(M.G. Weisz)、ジー・エラッド(G
. Elad)、エイ・パズ(A. Paz)、ディー・マルシアノ(D. Marciano)、ワイ・エゴ
ジ(Y. Egozi)、ジー・ベン−バルチ(G. Ben-Baruch)及びワイ・クルーグ(Y. Klo
og)の「Ｒａｓの除去と加速分解(Dislodgment and accelerated degradation of
Ras)」と題する論文。

【００７５】 １５．J Biol Chem、第２７４巻、第１６０６頁（１９９９年）に掲載のニブ
・エイチ(Niv, H.)、オウ・ガットマン(O.Gutman)、ワイ・アイ・ヘニス(Y.I. H
enis)及びワイ・クルーグ(Y. Kloog)の「構造活性ＧＦＰ−Ｋｉ−Ｒａｓ４Ｂの
膜相互作用及び信号化におけるその役割。側方移動性の研究からの証明(Membran
e interactions of a constitutively active GFP-Ki-Ras 4B and their role i
n signaling. Evidence from lateral mobility studies)」と題する論文。

【００７６】 １６．J Immunol、第１４６巻、第８７９頁（１９９１年）に掲載のパドゥラ
・エス・ジェイ(Padula, S.J.)、イー・ジー・リンゲンヘルド(E.G. Lingenheld
)、ピー・アール・スタバッチ(P.R. Stabach)、シー・エイチ・チョウ(C.H. Cho
u)、ディー・エイチ・コノ(D.H.Kono)及びアール・ビー・クラーク(R.B. Clark)
の「ＳＪＬマウスにおける脳炎誘発性Ｖベータ−４−担持Ｔ細胞の識別。Ｖ領域
疾患の仮説の更なる証明？(Identification of encephalitogenic V beta-4-bea
ring T cells in SJL mice. Further evidence for the V region disease hypo
thesis?)」と題する論文。

【００７７】 １７．J Immunol、第１４８巻、第３７７６頁（１９９２年）に掲載のクチュ
ルー・ブイ・ケイ(Kuchroo, V.K.)、アール・エイ・ソベル(R.A. Sobel)、ジェ
イ・シー・ラニング(J.C.Laning)、シー・エイ・マーチン(C.A. Martin)、イー
・グリーンフィールド(E.Greenfield)、エム・イー・ドルフ(M.E. Dorf)及びエ
ム・ビー・リーズ(M.B. Lees)の「ミエリンプロテオリピッドタンパク質の合成
ペプチドに特異のクローン化Ｔ細胞により仲介される実験的アレルギ性脳脊随炎
。ファイン特異性及びＴ細胞レセプタＶベータの用途。(Experimental allergic
encephalomyelitis mediated by cloned T cells specific for a synthetic p
eptide of myelin proteolipd protein. Fine specificity and T cell recepto
r V beta usage)」と題する論文。

【００７８】 実施例２ Ｒａｓインヒビタ、Ｓ−ファルネシルチオサリチル酸 （ＦＴＳ）による実験的自己免疫神経炎（ＥＡＮ）の処置 この実験は、ＥＡＮに関してリンパ球の増殖に対するＦＴＳの抑制作用を示す
ものである。

【００７９】 ギャンバレー症候群（ＧＢＳ）は、急性の一般化弛緩性麻痺の最も一般的な原
因であり、人口１００,０００人当たり年間０．７５乃至２症例の発生率である
。イスラエルだけにおいては、年間１００件以下の新しい症例があり、その多く
は、呼吸サポートと、長期間に亘る集中治療入院と、その後のリハビリテーショ
ンを必要とする。最適の治療にも拘わらず、有意の死亡率と罹患率がある。

【００８０】 ＧＢＳの病理学は、十分に特徴づけられていて、ほとんどの場合に自己免疫感
染後応答に関する。疾患の理解の進歩とは逆に、ＧＢＳに関して有効な処置が見
つかったのは、ほんのここ１０年である。かかる治療には、血漿交換及び静脈内
免疫グロブリンがあるが、これらはいずれも費用がかかり、最終結果を代えず、
しかも有意の副作用を引き起こす。

【００８１】 ＥＡＮは、人間におけるギャンバレー症候群に関する優れたモデルである。動
物モデルの臨床的な特徴は、人間の疾患に著しく類似しており、上行性の弱化と
脱髄神経障害の電気生理学的な証拠を伴う一相性の疾患である。この疾患は、コ
ルチコステロイドのような従来の免疫抑制治療には応答しないので、ＦＴＳの使
用に特に関連する。ＧＢＳにおける立証された効能の治療は、血漿交換療法と静
脈内免疫グロブリンである。

【００８２】 この結果から、ＦＴＳは、リンパ球増殖に対してインビトロで抑制効果を発揮
していることがわかる。更に、種々の臨床的及び電気生理学的データは、モデル
の生活能力と、早期のまたは後期の治療の有利な効果とを示している。

【００８３】 方法 ＥＡＮモデル モデルは、６週齢で購入し、研究に供する前に２００ｇの体重に到達させた雌
のルイスラットを使用した。疾患の誘発は、ウシの脊髄根と神経から抽出した抹
消性ミエリンタンパク質で免疫化することにより行った（１）。５−１０ｍｇの
調剤を、２ｍｇの結核菌（菌株Ｈ３７ＲＡ：ディフコ(Difco)）を添加した完全
フロイントアジュバントと混合して、各動物に注入した。このプロトコールのほ
かに、抹消性ミエリン（２）に特異のＰ２タンパク質からの合成ペプチド５３−
７８も使用した。これにより、一層均質な臨床応答が得られ、末梢神経の脱髄疾
患に一層特異的であった。各治療と対照グループは、５−１０匹のラットを含ん
でいた。

【００８４】 処置プロトコール ＦＴＳを、クロロホルムに保管し、クロロホルムを、窒素流の下で蒸発させた
。次に、粉末をエタノールに溶解し、ＮａＯＨで塩基性にした燐酸塩緩衝生理食
塩水において所望の濃度に希釈した。１−２ｍｇのＦＴＳ（５ｍｇ／ｋｇ）を含
むキャリヤ溶液１０００μｌ以下を、各ラットに腹腔内注射した。クロロホルム
溶液を用いて、対照溶液を同時につくった。投与を疾患の開始と平行して始め、
日に２−３回毎日、３日ごとにまたは週１回継続するとともに、遅延処置プロト
コールを開始後５及び１０日に始めた。

【００８５】 免疫試験 細胞免疫機能を、種々の刺激に応答して標識チミジンの取込を利用する増殖検
定により測定した。これらの刺激には、Ｔ細胞を活性化するＣｏｎＡまたは抗−
ＣＤ３、Ｂ細胞及びマクロファージを活性化するＬＰＳ並びにミエリンのような
モデルに関連する特異抗原のような一般的なミトゲンが含まれる。これらの細胞
は、脾臓から集めるとともに、刺激薬の存在下で、７２時間、９６個の溜めのプ
レートにおいて成長させた。［^３Ｈ］チミジンを加え、更に１６−１８時間後に
、細胞をフィルタに取り出し、フィルタを洗浄し、シンチレーションカウンタに
おいて計数した。全ての検定を、３回行った。

【００８６】 Ｒａｓタンパク質に対するＦＴＳ処置の生化学的評価 膜及びＦＴＳ処置（時間経過、量依存性）後のシトゾルに存在するＲａｓの量
を、パン抗Ｒａｓ抗体（３、４、５）を用いたウエスタン免疫ブロットにより測
定した。これらの実験では、インビトロ薬剤処置を受けた未実験のラットのリン
パ球と、対照及びＦＴＳ処理されたラットのリンパ球とを使用した。

【００８７】 この方法の利点は、Ｒａｓタンパク質の膜会合と、同じ実験条件（即ち、成長
条件、薬剤処理の期間、薬剤濃度）の下でＲａｓ依存信号経路とに対する薬剤の
影響を試験することができるという点にある。これはまた、成長抑制活性を欠如
するイソプレノイド類似体を用いた適宜の制御を可能にする（６）。従って、リ
ンパ球の膜に対する種々のＲａｓイソ形態の見かけの親和性とＲａｓ依存信号と
の明確な相互関係が得られた。

【００８８】 神経系試験 ラットは尾の進行性弱化が、開始後１０乃至１２日発現し始め、その後、下肢
及び上肢の弱化が進行した。この進行を、０−９の標準スケールで評価した（７
）。所定の時点で、動物を犠牲にし、その脊髄及び座骨神経を組織学のために固
定し、あるいは生化学検定のために凍結した。運動機能を、ロタロッド(Rotarod
)試験により評価した。この試験においては、ラットを、一定の速度で回転する
水平棒で走行するように予め訓練した。動物を、各試行において最大１分間走行
させるとともに、６０”のスコアを得るようにさせた。動物を装置から取り出し
た場合、この状況の秒単位の潜伏を、この試行のスコアとして記録した。かかる
試行の３回の平均を、検定を行った各日に記録した。

【００８９】 電気生理学的試験 動物を、フェノバルビトールで麻酔処理した。十分な麻酔薬を与えて、処置に
より苦痛を与えないようにした。これまでの経験では、死亡率を避けるために、
急性ＥＡＥ疾患段階においては一層少量が必要であることがわかっている。単極
針電極を使用して座骨神経を刺激するとともに、表面リング電極により足底筋に
おける応答を測定した（８）。あるいは、尾の神経に刺激を与え、尾の筋肉の応
答を同じ電極で測定した。予備実験から、尾の応答は、疾患の早期の段階に対し
て一層感受性があることが判明したが、足底筋の応答は、下肢の注射ブイの膨潤
により影響を同時に受けた。従って、尾の応答を、疾患の早期の段階（１８−２
２日）において使用した。遠位及び近位刺激に対する応答の刺激潜伏性(latency
)を使用して、神経伝達速度を計算した。応答の大きさは、伝導遮断の評価を行
うのに使用した。

【００９０】 インビトロリンパ球増殖のＦＴＳ抑制 Ｒａｓレベルに対するＦＴＳの影響が、２ＩＣＲマウスから得た脾細胞におい
て機能上重要であるかどうかに関して試験を行った。ＤＮＡへの^３Ｈチミジンの
取込の刺激を、リポ多糖（ＬＰＳ）またはコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）の存在
下で、かつ、０、１０及び５０μＭのＦＴＳの存在下での脾細胞増殖の測定とし
て使用した。使用したこの方法を、以下において詳述する。図３に示すように、
ＦＴＳにより、ＬＰＳ及びＣｏｎＡ誘発増殖は有意に低下したが、この増殖は、
使用されたＦＴＳの濃度範囲においてＬＰＳに関しては用量依存性であった。Ｆ
ＴＳは、これらの条件下ではリンパ球細胞の死亡は誘発しなかったが、トリパン
ブルー除去染色により明らかであった。更に、ＦＴＳは、ＤＮＡへの基本的な^３ Ｈチミジン取込に対しては影響を及ぼさなかった。リンパ球細胞の成長が観察さ
れたＦＴＳの濃度は、動物に、５−１０ｍｇ／ｋｇの用量で与えられたときに、
薬剤の予測レベルを反映している。

【００９１】 ルイスラットにおけるＥＡＮの誘発 疾患を、ウシの脊髄根から得た抹消ミエリンで免疫化することにより誘発させ
た。正常な応答は、足底筋から座骨神経の刺激までであった。遠位及び近位刺激
は、明確な単波を生じ、その後、Ｈ波と並列する遅い応答があった。病理学上の
最も早い徴候は、尾の神経の刺激に対する尾の筋肉の応答において見受けられた
。応答の大きさは、近位刺激において低く、遠位刺激では消失したが、これは、
ＧＢＳを持つ人間において広く見受けられる伝導ブロックに対応する。Ｈ応答は
、もはや見られなかった。疾患のピークにおいて、足底筋の応答は、遠位刺激に
おいて消失した。動物は臨床的に改善されたとき、筋肉応答の一時的な分散があ
り、続いて、誘発の後４ヶ月で完全な回復となった。

【００９２】 ＥＡＮラットに対する早期のＦＴＳ処理の臨床的効果 予備実験においては、ＥＡＮが、実験の０日に１５匹のルイスラットにおいて
誘発された。これらのラットのうち、５匹を０−２８日にかけて毎日５ｍｇ／ｋ
ｇ／日のＦＴＳを腹腔内投与して処理した。別の５匹のラットは、０−１０日に
かけて同じ処理を受けるとともに、５匹はキャリヤ溶液で偽性処理した。図４Ａ
及び４Ｂは、臨床スコアデータとロタロッドでの性能とを概略示する。ＦＴＳで
の処理は、ＦＴＳで連続して処理したラットにおける疾患のピークを有意に改善
した。処理を１０日目で停止したラットは、対照と同等の重度を有する疾患に罹
ったが、他のグループよりも早く回復した。このグループの５匹のラットのうち
３匹は、回復段階で臨床徴候の簡単な再発があった。

【００９３】 ＦＴＳ処理のラット及び対照ラットからの電気生理学的データ 電気生理学的検定を、前項に記載の３グループのラットに２０日目で行った。
尾の神経の刺激と尾の筋肉測定から得た結果を、図５に示す。偽性処理したＥＡ
Ｎラットは、未実験のラットと比較して、有意に低下した複合筋動作ポテンシャ
ル（ＣＭＰＡ）を示した。ＦＴＳでの処理は、この作用を有意に改善し、わずか
１０日間処理したラットにおいてより良好な結果が得られる傾向を示した。

【００９４】 別の実験においては、１０日目からのＥＡＮラットの処理は、未処理の対照よ
りも臨床上の徴候は有意に小さかった（図６参照）。１５−１９日の平均臨床ス
コアは、ＦＴＳ処理グループでは２．７４±０．６６（±ＳＥ）であったのに対
し、両方のグループでは（ｎ＝１０、ｔ−試験によりｐ＜０．０５）４．１２±
０．６１であった。更にまた、ＦＴＳ処理のＥＡＮグループにおける動物は、対
照ＥＡＮグループにおける動物よりも有意に早く回復した。この実験はまた、０
−２８日及び０−１５日にＦＴＳで処理したグループ（ｎ＝１０）を含んでいた
。これらにより、図４に示す結果が確認された（ｐ＜０．００１、２０日でＡＮ
ＯＶＡを繰り返し測定）。アジュバント調剤だけで免疫化したグループは、臨床
疾患が見られなかったが、座骨神経の電気生理学検査により非特異的な変化（２
１日）が明らかになった（２１日）。

【００９５】 文献 １．Brain Res、第１８４巻、第４３９−４５４頁（１９８０年）に掲載のカ
ラドルボウスキ・エム(Kaladlubwski M)、ヒューエス・アールエイシー(Hughes
RAC)及びグレグソン・エヌエイ(Gregson NA)の「ルイスラットにおける実験的ア
レルギ性神経炎：抹消ミエリンとその主要塩基性タンパク質の活性の特徴(Exper
imental allergic neuritis in the lewis rat: characterization of the acti
vity of peripheral myelin and its major basic protein P2)」と題する論文
。

【００９６】 ２．Biochim.Biophys.Res.Commun.、第２２４巻、第５−９頁（１９９６年）
に掲載のシン・エイチシー(Shin HC)、スチュアート・ビー(Stuart B)及びマク
ファーレン・イーエフ(Mcfarlane EF)の「実験的アレルギ性神経炎の抗原の決定
基の構造(Conformation of antigenic determinant for experimental autoimmu
ne neuritis)」と題する論文。

【００９７】 ３．J.Biol.Chem.第２７０巻、第２２２６３−２２２７０頁（１９９５年）に
掲載のマロム・エム(Marom M)、ハクライ・アール(Haklai R)、ベン−バルチ・
ジー(Ben-Baruch G)、エゴジ・ワイ(Egozi Y)及びクルーグ・ワイ(Kloog Y)の「
ファルネシルチオサリチル酸によるＲａｓ依存細胞成長の選択的抑制(Selective
inhibition of Ras-dependent cell growth by farnesylthiosalisylic acid)
」と題する論文。

【００９８】 ４．Biochemistry、第３７巻、第１３０６−１３１４頁に掲載のハクライ・ア
ール(Haklai R)、ワイツ・エムジー(Weisz MG)、エラッド・ジー(Elad G)、パズ
・エイ(Paz A)、マルシアノ・ディー(Marciano D)、エゴジ・ワイ(Egozi Y)ベン
−バルチ・ジー(Ben-Baruch G)及びクルーグ・ワイ(Kloog Y)の「Ｒａｓの除去
及び加速分解(Dislodgement and accelerated degradation of Ras)」と題する
論文。

【００９９】 ５．J Biol Chem、第２７４巻、第１６０６−１６１３頁（１９９９年）に掲
載のニブ・エイチ(Niv H)、ガットマン・オウ(Gutman O)、ヘニス・ワイアイ(He
nis YI)及びクルーグ・ワイ(Kloog Y)の「構造的に活性のＧＦＰ−Ｋｉ−Ｒａｓ
４Ｂの膜相互作用及び信号化におけるその役割。側方運動性の研究からの証明(M
embrane interactions of a constitutively active GFP-Ki-Ras 4B and their
role in signaling. Evidence from lateral mobility studies)」と題する論文
。

【０１００】 ６．Biochim Biophys Acta、第１４０６巻、第４０−５０頁（１９９８年）に
掲載のアハロンソン・ズィー(Aharonson Z)、ガナ−ワイツ・エム(Gana-Weisz M
)、バルサノ・ティー(Varsano T)、ハクライ・アール(Haklai R)、マルシアノ・
ディー(Marciano D)及びクルーグ・ワイ(Kloog Y)の「Ｓ−プレニル類似体の抗
Ｒａｓ活性の緊縮構造要件(Stringent structural requirements for anti-Ras
activity of Sprenyl analogues)」と題する論文。

【０１０１】 ７．Lab Invetst、第５９巻、第１１５−１２５頁（１９８８年）に掲載のハ
ン・エイエフ(Hann AF)、フィースビー・ティーイー(Feasby TE)、ステレ・エイ
(Stelle A)、ロブグレン・ディーエス(Lovgren DS)及びベリー・ジェイ(Berry J
)の「ルイスラットの実験的アレルギ性神経炎における脱髄及び軸索はミエリン
用量に依存する(Demyelination and axonal degeration in Lewis rat experime
ntal allergic neuritis depends on the myelinn dosage)」と題する論文。

【０１０２】 ８．Muscle Nerve、第２１巻、第１４０５−１４１３頁（１９９８年）のクリ
フ・ケイディー(Cliff KD)、トンラ・ジェイアール(Tonra JR)、カーソン・エス
アール(Carson SR)、ラドリー・エイチイー(Radley HE)、カブナー・シー(Cavno
r C)、リンゼイ・アールエム(Lindsay RM)、ボディン・エスシー(Bodine SC)及
びディステファノ・ピーエス(Distefano PS)の「ラットの後肢におけるばらつき
のない繰り返しＭ−及びＨ−波記録(Consistent repeated M- and H-wave recor
ding in the hind limb of rats)」と題する論文。

【０１０３】 実施例３ ＭＲＬ／ｌｐｒマウスの処置、全身性狼瘡の動物モデル及び 二次抗リン脂質症候群（ＡＰＳ）、並びに、 Ｒａｓ抑制剤ファルネシルチオサリチル酸（ＦＴＳ） この実験は、ＭＲＬ／ｌｐｒマウスにおける実験室及び臨床パラメータに及ぼ
すＦＴＳの影響をみるために行った。ＭＲＬ／ｌｐｒマウスは、免疫系の病理学
及び疾患の全身症状発現における全身性狼瘡紅斑（ＳＬＥ）及び抗リン脂質症候
群（ＡＰＳ）に類似する一般化自己免疫疾患の遺伝モデルである。

【０１０４】 ＳＬＥ及びＡＰＳは、複数の器官に影響を及ぼす比較的一般的な慢性疾患であ
る。病因は、知られておらず、乾癬剤のような環境因子と相互に作用する遺伝処
置に関連する可能性がある（１、２）。ＳＬＥとＡＰＳの有効な処置には、コル
チコステロイド及び抗腫瘍性／化学療法剤が含まれる（３）。これらの薬剤の使
用は、自己免疫疾患の慢性的な特徴、従って、長期間の投与を必要とする点を特
に考慮して、副作用により制限される。ＳＬＥとＡＰＳの実験モデルは、疾患の
病因論と実験治療の効能の研究に有用な手段として作用する。遺伝学的に定めら
れたＭＲＬ／ｌｐｒ及びＮＺＢ／Ｗマウスは、循環自己抗体、トロンボン血球減
少症、腎機能不全、自然流産、運動欠乏、神経筋不全、認識欠損及び行動変化（
４、５、６）並びに高レベルのＲａｓ（７）を含むＳＬＥ及びＡＰＳの全身性及
び神経系の症状発現の双方に関してモデルとして作用する。ＳＬＥ及びＡＰＳの
誘発モデルには、モノクローン抗体を含む病原性イディオタイプでの免疫化（８
、９）またはβ２−グリコプロテイン−１（β２−ＧＰＩ、アポリポタンパクＨ
としても知られる）のような自己抗原での免疫化（１０、１１、１２）が含まれ
る。遺伝子モデル及び誘発モデルの双方とも、慢性かつ持続性であり、ＳＬＥ及
びＡＰＳの経過に大きく刺激する。これらは、種々の可能な症状発現に対するＦ
ＴＳの慢性的な使用を評価する機会を提供する。

【０１０５】 材料及び方法 マウス 雌のＭＲＬ／Ｍｐｊ／ｌｐｒ／ｌｐｒ（ＭＲＬ／ｌｐｒ）マウスと、年齢がマ
ッチしたＭＲＬ／Ｍｐｌ／＋／＋（ＭＲＬ／＋＋）マウスをジャクソン・ラボラ
トリーズ(Jackson Laboratories)（メイン州、バー・ハーバーに所在）から４週
齢で購入するとともに、３月齢のＩＣＲマウスを、テルアビブ大学、サクラー・
メディカル・スクール、アニマル・リソーシーズ(Animal Resources, Sackler M
edical School, Tel-Aviv University)。マウスを、テルアビブ大学、メディカ
ルスクールのラボラトリーズ・アニマル・ハウジング(Laboratory Animal Housi
ng) において飼育した。この施設は、標準的な条件、即ち、２３±１℃、１２時
間光サイクル（午前７時−午後７時）、任意量の餌及び飲料にアクセスすること
ができる条件に保持されている。マウスの体重を実験の開始前及びその後毎週、
測定した。アニマル・ウエルフェア・コミッティー(Animal Welfare Committee)
が、全ての手順を承認した。

【０１０６】 薬剤 ＦＴＳを、従来説明されている（１３）ようにして合成した。ＦＴＳをクロロ
ホルムに保存し、クロロホルム使用の直前に窒素流の下で蒸発させた。得られた
粉末を絶対エタノールに溶解し、ＮａＯＨで塩基性にした無菌生理食塩水におい
て所望の濃度に希釈した。ＦＴＳ１００μｇ（５ｍｇ／ｋｇ）を含むキャリヤ溶
液２００μｌの腹腔内注射を各マウスに行った。対照溶液を、同時に、クロロホ
ルム溶液を用いてつくった。

【０１０７】 マウスの処置を、６または１０週齢から１８週齢まで、１日に１回、週に３−
５回行った。

【０１０８】 脾臓リンパ球増殖 マウスを、頸部脱臼により犠牲にし、脾臓を無菌処置により取り出し、ダルベ
ッコの(Dulbecco's)燐酸塩緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）を含む使い捨てのプラス
チックペトリ皿に入れた。注射器と１９ゲージの針を使用して、ＤＰＢＳを脾臓
を介して発現させることにより、単細胞懸濁体を得た。細胞を、ＤＰＢＳに懸濁
させ、１１００ｒｐｍで７分間遠心分離に供した。赤血球を、０．８３％（重量
／容量）塩化アンモニウムにおける７分温育により溶解し、細胞をＤＰＢＳを用
いて３回直ちに洗浄した。脾臓細胞を、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を５％、１００
ユニット／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、２ｍｌ
のＬ−グルタミン、０．１ｍＭの非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウムを１ｍ
Ｍ及び２−メルカプトエタノールを５０μＭ含むＲＰＭＩ−１６４０媒質におい
て３ｘ１０^６細胞／ｍｌの濃度に懸濁させた。細胞を、９６個の溜めを有する平
底のミクロ培養プレートにおいて６ｘ１０^５細胞／２００μｌ培地の濃度で培養
し、空気９５％及びＣＯ_２５％からなる３７℃の加湿雰囲気において７２時間温
育した。この時間の最後に、１μＣｉトリチウムチミジン（３Ｈ−ＴｄＲ）１０
μｌを各溜めに加え、培養体を更に１８時間温育した。各ミクロ培養からの細胞
を、マルチハーベスタを用いてガラス繊維(fibroglass)フィルタの上に取り出し
、液体シンチレーションβカウンタにおいて計数を行った。

【０１０９】 ミトゲン及び抗原を、温育培地において適宜の濃度に希釈し、温育期間の開始
時に溜めに加え、１．０μｇ／ｍｌリポ多糖（ＬＰＳ）、１．０μｇ／ｍｌコン
カナバリンＡ（ＣｏｎＡ）または１０μｇ／ｍｌβ２−グリコプロテインＩ（β
２−ＧＰＩ）の最終濃度を得た。（ミトゲンまたは抗原を含まない）自然増殖も
評価を行った。

【０１１０】 インビトロ脾細胞増殖に対するＦＴＳの影響をみるため、脾臓細胞懸濁体を２
匹の未実験ＩＣＲマウスからつくった。脾細胞増殖の評価を、ＬＰＳまたはＣｏ
ｎＡの存在下で、かつ、０、１０及び５０μＭのＦＴＳの存在下で行った。

【０１１１】 ＭＲＬ／ｌｐｒ及びＭＲＬ／＋＋マウス脾細胞のエクスビボ増殖に対するＦＴ
Ｓの影響をみるために、脾細胞懸濁体を、グループ当たり３つの別個の脾臓から
得るとともに、培地において（３回）別々に分析した。脾細胞増殖の評価を、Ｌ
ＰＳ、ＣｏｎＡまたはβ２ーＧＰＩの存在下で行った。

【０１１２】 結果を、グループ当たりの刺激インデックスの平均値として示す。刺激インデ
ックスは、ミトゲン／抗原の存在下で培養した細胞の平均ｄｐｍを、ミトゲン／
抗原の不存在下で培養した細胞の平均ｄｐｍにより除することにより算出した。

【０１１３】 脾臓リンパ球におけるＲａｓの測定 上記のようにして６匹のマウスから得た脾臓細胞リンパ球を、プールし、プレ
ート当たり２．３ｘ１０^７個の細胞の密度を有するＲＰＭＩ／５％ＦＣＳを含む
１０ｃｍの皿において平板培養した。培養体を、加湿した温育器（５％ＣＯ_２／
９５％空気）において３７℃に保持し、ＦＴＳ（１２．５及び２５μＭ）または
ビヒクル（０．１％ＤＭＳＯ）を平板培養１時間後に加えた。２４時間後に、細
胞を集め（各処置について２枚のプレートのプール）、ＰＢＳにおいて洗浄した
。次に、細胞を、プロテアーゼインヒビタを含む均質化緩衝液において均質化し
た。Ｒａｓを、遠心分離（１００，０００ｇ、３０分、４℃）により得た全細胞
膜（Ｐ１００）及びサイトソル（Ｓ１００）において測定した。簡単に説明する
と、全細胞タンパク質２５μｇを、１２．５％ドデシル硫酸ナトリウムポリアク
リルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分離し、ニトロセルロース
膜にブロットした。次に、パン−Ｒａｓを用いた免疫ブロット法、強化化学発光
検定（ＥＣＬ）及び比重分析を、従来詳述されている（１４）ようにして行った
。

【０１１４】 血清学評価 マウスを逆眼窩空洞穿刺(retro-orbital sinus puncture)により１６週齢で殺
し、血清を遠心分離により分離するとともに、検定まで−７０℃に保存した。血
清は、従来説明されている（１５、１６）ように、異なる自己抗体の存在に関し
てＥＬＩＳＡにより試験に供した。これは、カルジオリピンに対する血清依存（
β２−ＧＰＩ依存）及び非依存抗体と、１本鎖及び２本鎖ＤＮＡ（抗−ｓｓＤＮ
Ａ、抗−ｄｓＤＮＡ）に対する抗体とを含んでいた。

【０１１５】 リンパ節炎及び脾腫 （生理食塩水及びＦＴＳ処理した）ＭＲＬ／ｌｐｒマウスにおける一般化リン
パ節炎の発現の評価を、腋及び鼠径部リンパ節の触診により行った。（両側の）
腋及び鼠径部のリンパ節が触診可能であったときに、各マウスにおける最大のリ
ンパ節のスコアは４とした。マウスは、１８週齢で犠牲にし、脾臓とリンパ節（
腋、鼠径部及び頸部）を取り出し、秤量した。

【０１１６】 腎機能 タンパク尿の存在を、週間隔で、新しく発現した尿サンプルに関して測定した
。タンパク含量を、商業的なディップスティック法（ドイツ国に所在するマケレ
イ−ナーゲル）を使用して半定量的に測定した。この比色検定は、アルブミンに
特異的であり、おおよそのタンパク濃度は０、３０、１００及び５００ｍｇ／ｄ
ｌ（ｍｇ％）である。

【０１１７】 げっ歯類神経系検査 マウスの４つのグループを、グリップ強度試験を使用して毎週検査した。筋肉
の強さを、マウスが固定バーにぶら下がることができる秒数により測定した。神
経学的に正常なマウスは、３０秒以上（ぶら下がり時間）ぶら下がったままでい
ることができる（１７）。

【０１１８】 オープンフィールド 生理食塩水処理及びＦＴＳ処理を行ったＭＲＬ／ｌｐｒマウスと、生理食塩水
処理したＭＲＬ／＋＋マウス（ｎ＝５）を、オープンフィールドにおける新たな
環境で空間挙動に関して試験に供した。円形プール（直径１２０ｃｍｘ高さ５０
ｃｍ）からなる装置を、照明を付けた部屋に配置した。試験を、昼／夜サイクル
の明るい段階において行った。マウスを、試験の１時間前に実験室に入れた。各
マウスを、かごから穏やかに取り出し、フィールドの中央に個別に置き、３０分
間、カムコーダを用いてビデオテープ処理(videotaped)に供した。各活動の終わ
りに、プールを、アンモニウムガラスクリーナで湿らせたペーパタオルで掃除し
て、尿の跡を除去した。オープンフィールドにおける前進と停止の頻度及び持続
時間を、デイビッド・エイラム博士（テルアビブ大学、ライフ・サイエンシーズ
・デパートメント(Life Sciences Department)）により作成されたソフトウエア
により、ビデオ記録の再生の際に分析した。全走行距離、運動時間、運動の速度
、診査の空間的分布及びホームベースを形成する潜在性並びに、そこに滞在する
時間を引き出した。

【０１１９】 リンパ球のインビトロＲａｓ抑制 可溶性（Ｓ１００）及び不溶性（Ｐ１００）Ｒａｓのレベルを、上記した方法
において説明したように、パンＲａｓ抗体を用いてウエスタン免疫ブロット法に
より測定した。１２．５及び２５μＭのＦＴＳの存在下でリンパ球を培養したと
ころ、不溶性Ｒａｓ（ＦＴＳ・０μＭ−１００±８％、ＦＴＳ・１２．５μＭ−
８４±９．８％、ＦＴＳ・５０μＭ−５２±１６％）の量の有意の用量依存減少
がみられ、可溶性Ｒａｓ（ゲルの写真は図示せず）のレベルでは、これに伴う観
察可能な変化はなかった。

【０１２０】 リンパ球増殖のインビトロＦＴＳ抑制 Ｒａｓのレベルに対するＦＴＳの影響が脾臓リンパ球において機能的に重要で
あるかどうかに関して試験を行った。^３Ｈ−ＴｄＲのＤＮＡへの取込の刺激を、
リンパ球の増殖の手段として使用した。１０及び５０μＭのＦＴＳの存在下で、
ＬＰＳ及びＣｏｎＡに関して刺激インデックスを測定した。図７に示すように、
ＦＴＳは、使用されるＦＴＳの濃度範囲においてＬＰＳに関して用量依存である
ＬＰＳ及びＣｏｎＡ誘発増殖を有意に低減させた。ＦＴＳは、これらの条件の下
ではリンパ球細胞の死亡は誘発しなかったが、これは、トリパンブルー除去染色
により明らかにされた。更に、ＦＴＳは、ＤＮＡへの基底^３Ｈ−ＴｄＲの取込に
影響を与えなかった。リンパ球細胞成長の抑制が観察されるＦＴＳの濃度は、５
−１０ｍｇ／ｋｇの用量が動物に与えられるときに、薬剤の予測レベルを反映し
ている。これらの用量レベルは、狼瘡のＭＲＬ／ｌｐｒマウス／モデルのその後
の実験において使用された。

【０１２１】 ＭＲＬ／ｌｐｒマウスと対照ＭＲＬ／＋＋におけるリンパ球のインビボ増殖に
及ぼすＦＴＳの影響をエクスビボ実験により測定した。マウスに、５ｍｇ／ｋｇ
のＦＴＳ（週に５日）を３ヶ月に亘って与え、その後、脾臓リンパ球増殖検定を
、ＦＴＳを加えることなくインビトロで行った。結果を、図８Ａ及び８Ｂに示す
。ベースライン３Ｈ−ＴｄＲの取込は、ＦＴＳで処理されたＭＲＬ／＋＋マウス
において一層高い値を示す傾向があった点を除き、試験された４つ全てのグルー
プにおいて同様であった。刺激インデックスは、ＦＴＳ処理のマウスにおけるＬ
ＰＳに対する応答と比べて、２倍減少していることを示している。従来説明され
ている（１８、１９）ように、ＣｏｎＡに対するＭＲＬ／ｌｐｒマウスの応答は
、ＭＲＬ／＋＋対照マウスにおけるよりも著しく低かった。この応答では、ＦＴ
Ｓ処理のＭＲＬ／ｌｐｒマウスのリンパ球が更に減少していたが、ＦＴＳ処理の
ＭＲＬ／＋＋のリンパ球ではみられなかった。β２−ＧＰＩに対する抗原特異増
殖応答を測定し、ＦＴＳ処理マウスのリンパ球の応答における有意の５０％減少
が、ＭＲＬ／ｌｐｒ及びＭＲＬ／＋＋マウスの双方において測定された。

【０１２２】 ＭＲＬ／ｌｐｒ及びＭＲＬ／＋＋マウスにおける免疫系のパラメータに対するＦ ＴＳの影響 リンパ球の増殖に及ぼすＦＴＳの影響を考慮して、β２−ＧＰＩ依存ａＣＬ、
ａＣＬ、抗−ｓｓＤＮＡ及び抗−ｄｓＤＮＡを含む関連の自己抗原に対するマウ
スの自己抗体も測定した。図９に示すように、ＭＲＬ／＋＋対照と比較して、Ｍ
ＲＬ／ｌｐｒグループにおいてはこれら、全ての抗体のレベルが有意に一層高か
った（ｐ＜０．０１４ワンウエイ(one way)ＡＮＯＶＡ）。ＦＴＳ処理は、ＭＲ
Ｌ／ｌｐｒマウスにおいてβ２−ＧＰＩ依存ａＣＬ（β２−ＧＰＩ）抗体と抗−
ｄｓＤＮＡ抗体のレベルを有意に低下させた（ｐ＜０．０４９、ワンウエイＡＮ
ＯＶＡ）が、このグループにおける非血清依存ａＣＬ及び抗−ｓｓＤＮＡのレベ
ルには影響を及ぼさなかった。未処理のＭＲＬ／＋＋マウスに比較して、ＦＴＳ
処理マウスにおいては抗体がより高いレベルになる有意の傾向はみられなかった
。

【０１２３】 ＭＲＬ／ｌｐｒマウスにおける疾患進行の重要な臨床測定は、リンパ節炎であ
る。これは、ＭＲＬ／ｌｐｒグループにおける実験（図１０）の途中において測
定した。ＦＴＳ処理のマウスにおいては有意に遅延したが、全てのマウスは、１
７週齢で測定可能なリンパ節炎を発現した。この段階で、動物を犠牲にし、切除
したリンパ節を秤量したところ、ＦＴＳの有意の効果が明らかとなった（ｐ＜０
．０１７、ワンウエイＡＮＯＶＡ、図１０Ｂ）。１７週齢の脾臓を同様に測定し
たところ、未処理のマウス（０．５４±０．０４ｇ、ｐ＜０．０２３、ワンウエ
イＡＮＯＶＡ）と比較して、ＦＴＳ処理のＭＲＬ／ｌｐｒマウス（０．４１±０
．０４ｇ、平均±ＳＥ）は、体重が減少していることがわかった。ＭＲＬ／＋＋
マウスは、より小さい脾臓（０．１３±０．０１ｇ）を有しており、これは、Ｆ
ＴＳによる有意の影響は受けなかった（０．１９±０．０３ｇ）。

【０１２４】 ＭＲＬ／ｌｐｒマウスにおける自己免疫誘発損傷のパラメータに対するＦＴＳの 影響 タンパク尿は、このモデルの一貫した特徴である（２０）。図１１に示すよう
に、１５週齢のはじめにおいて、ＭＲＬ／ｌｐｒマウスは、有意のタンパク尿を
発現した。これに対して、ＦＴＳで処理したＭＲＬ／ｌｐｒマウスは、ｍｒｌ／
＋＋グループと同様にタンパク尿のレベルは著しく低かった（繰り返し測定によ
りｐ＝０．００７、ＡＮＯＶＡ）。得られた結果は、６週齢から週５日処理した
マウス（各グループ１０匹）からのものである。１０週齢から週３回だけ処理し
たマウスからの結果は、同様であったが、明白性は低かった（図示せず）。

【０１２５】 運動機能を、水平バーでのぶら下がり時間により測定した。図１２Ａは、ＭＲ
Ｌ／ｌｐｒマウス及びＦＴＳ処理ＭＲＬ／ｌｐｒマウスが、１２乃至１７週齢か
らの週ごとの試験においてバーにぶら下がることができた時間を比較して示す。
ＭＲＬ／ｌｐｒマウスは、ＦＴＳ処理グループと比較して、１４週からこの試験
において有意に損傷を受けたが、ＦＴＳ処理グループは、観察期間を通じて機能
にある程度の減退を示した（繰り返し測定によりｐ＜０．００１、ＡＮＯＶＡ）
。図１２Ｂは、１５−１７週齢のマウスの全部で４つのグループの機能を総括す
るものである。ＭＲＬ／ｌｐｒグループは、互いに異ならない他のグループと比
較して、有意に損傷を受けた（ｐ＜０．００１、ワンウエイＡＮＯＶＡ、ポスト
ホック試験(post hoc test)においてｐ＜０．０１）。ＦＴＳはＭＲＬ／＋＋グ
ループにおける機能を損なう傾向があった。

【０１２６】 行動のオープンフィールド試験においては、ＦＴＳ処理したＭＲＬ／ｌｐｒマ
ウスと未処理のＭＲＬ／ｌｐｒマウスは、ＭＲＬ／＋＋対照と比較して有意に低
下した運動を示した（ｐ＜０．００１ワンウエイＡＮＯＶＡ、図１３Ａ）。これ
に対して、運動の純粋な挙動の観点においては、フィールドの中央で費やす時間
は、未処理のＭＲＬ／ｌｐｒマウスとＦＴＳ処理ＭＲＬ／ｌｐｒマウスとの間に
は有意な差があり（ｐ＜０．０４８ワンウエイＡＮＯＶＡ）、後者は、ＭＲＬ／
＋＋対照と行動パターンが同様であった（図１３Ｂ）。かくして、ＦＴＳ処理は
、カバーされる全距離に影響を及ぼさなかったが、オープンフィールドの中央に
おいて費やされる時間には有意の影響を及ぼした。オープンフィールドにおける
行動の他の測定は、ＦＴＳの有利な効果は示さなかった。

【０１２７】 この結果は、６乃至１８週間に亘るＦＴＳ処理（５ｍｇ／ｋｇ／日）が、疾患
のあるＭＲＬ／ｌｐｒマウスに有意に有利な影響を及ぼし、有意の毒性は、これ
らのマウスまたは疾患のないＭＲＬ／＋＋対照マウスにはなかったことを示して
いる。この処理により、ＣｏｎＡ、ＬＰＳ、疾患特異抗原に対する脾細胞増殖が
５０％減少するとともに、カルジオリピンに対する血清依存抗体及びｄｓＤＮＡ
に対する抗体の有意の減少がみられた。タンパク尿は、グリップ強度及びオープ
ンフィールドにおける行動のある観点に関して、ＦＴＳ処理ＭＲＬ／ｌｐｒマウ
スにおいて正規化された。リンパ節炎及び死後のリンパ節並びに脾臓の重量は、
ＦＴＳ処理のＭＲＬ／ｌｐｒマウスにおいて有意に少なくなっていた。

【０１２８】 Ｒａｓ機能に直接影響を及ぼすインヒビタは、ＳＬＥ及びＡＰＳのモデルにお
ける潜在的選択性免疫系モジュレータとしては試験しなかった。ＭＲＬ／ｌｐｒ
の処理の他の研究には、コルチコステロイド（２１）、シクロホスファミドのよ
うなアポプトシス誘発細胞毒性剤（２１、２２）並びにシクロスポリンＡ（２３
）、ＦＫ５０６（２２）、ラパマイシン（２３）、抗−ＩＣＡＭ抗体（１７）及
び抗リンパ球マーカ抗体（２４、２５）のような免疫抑制剤が含まれる。タンパ
ク尿、グリップ強度、抗体生産及びリンパ球刺激に及ぼすＦＴＳの影響は、免疫
抑制薬剤を用いて得られる結果に十分匹敵している。これに対して、リンパ節炎
のようなパラメータに及ぼすＦＴＳの影響は、顕著性が低かった。

【０１２９】 文献 １．N Engl J Med、第３１１巻、第１０１９−２９頁（１９８４年）に掲載の
シューンフェルド・ワイ(Shoenfeld Y)及びシュワルツ・アールエス(Schwartz R
S)の「自己免疫疾患における免疫及び遺伝子因子(Immunologic and genetic fac
tors in autoimmune disease)」と題する論文。

【０１３０】 ２．Immunol Today、第１０巻、第１２３−６頁（１９８９年）に掲載のシュ
ーンフェルド・ワイ(Shoenfeld Y)及びアイゼンバーグ・ディーエイ(Isenberg D
A)の「自己免疫のモザイク(The mosaic of autoimmunity)」と題する論文。

【０１３１】 ３．JAMA、第２７８巻、第２００８−１７頁（１９９７念）に掲載のバロウ・
エム(Ballow M)及びネルソン・アール(Nelson R)の「免疫薬理学：免疫抑制及び
免疫治療(Immunopharmacology: immunomodulation and immunotherapy)」と題す
る論文。

【０１３２】 ４．Haemostasis、第２４巻、第２０４−７頁（１９９４年）に掲載のガラビ
・エイイー(Gharavi AE)及びアロン・エイエル(Aron AL)の「抗リン脂質研究の
実験的モデル(Experimental models for antiphospholipid studies)」と題する
論文。

【０１３３】 ５．Curr Opin Rheumatol、第１巻、第３６０−８頁（１９８９年）に掲載の
シューンフェルド・ワイ(Shoenfeld Y)の「全身狼瘡紅斑及び紅蓮症候群の実験
的及び誘発動物モデル(Experimental and induced animal models of systemic
lupus erythematosus and Sjö gren's syndrome)」と題する論文。

【０１３４】 ６．Ann NY Acd Sci、第８２３巻、第９７−１０６頁（１９９７年）に掲載の
ブレイ・アール・エル(Brey RL)、サキック・ビー(Sakic B)、ツエフトマン・エ
イチ(Szechtman H)及びデンバーグ・ジェイ・エイ(Denburg JA)の「全身狼瘡紅
斑における神経系疾患の動物モデル(Animal models for nervous system diseas
e in systemic lupu erythematosus)」と題する論文。

【０１３５】 ７．Proc Ntl Acad Sci USA、第８５巻、第２２６０−４頁（１９８８年）に
掲載のメンドロヴィッチ・エム(Mendlovic S)、ブロック・エス(Brocke S)、シ
ューンフェルド・ワイ(Shoenfeld Y)、ベン−バサット・エム(Ben-Bassat M)、
メショーラ・エイ(Meshorer A)及びバキマー・アール(Bakimer R)の「共通のヒ
ト抗ＤＮＡイディオタイプによるマウスにおける全身狼瘡紅斑の誘発(Induction
of a systemic lupus erythematosus-like disease in mice by a common huma
n anti-DNA idiotype)」と題する論文。

【０１３６】 ８．Isr J Med Sci、第３０巻、第１０−８頁（１９９４年）に掲載のシュー
ンフェルド・ワイ(Shoenfeld Y)の「イディオタイプ操作により誘発される抗リ
ン脂質症候群と全身狼瘡紅斑の実験的モデルの有意性(The significance of exp
erimental models of systemic lupus eruthematosus and antiphospholipid sy
ndrome induced by idiotype manipulation)」と題する論文。

【０１３７】 ９．Int Arch Allergy Immunol、第１１１巻、第３５５−６１頁（１９９６年
）に掲載のクラウス・アイ(Krause I)、ブランク・エム(Blank M)及びシューン
フェルド・ワイ(Shoenfled Y)等の「全身性狼瘡紅斑と抗リン脂質の治療：実験
的モデルから患者の枕元へ(Treatment of systemic lupus erythematosus and a
ntiphospholipid syndrome: from experimental models to patients' bedside)
」と題する論文。

【０１３８】 １０．J Autoimmun、第７巻、第４４１−５５頁（１９９４年）に掲載のブラ
ンク・エム(Blank M)、ファーデン・エイ(Faden D)、チンカニ・エイ(Tincani A
)コポロビッチ・ジェイ(Kopolovic J)、ゴールドバーグ・アイ(Goldberg I)及び
ギルバード・ビー(Gilburd B)等の「抗カルジオリピン補因子（β−２−グリコ
プロテインＩ）による免疫化は未実験マウスにおける実験的抗リン脂質を誘発す
る(Immunization with anticardiolipin cofactor (beta-2-glycoprotein I) in
duces experimental antiphospholipid syndrome in naive mice)」と題する論
文。

【０１３９】 １１．J Clin Invest、第９０巻、第１１０５−９頁（１９９２年）に掲載の
ガラビ・エイイー(Gharavi AE)等の「ベータ２糖タンパク質（アポリポプロテイ
ンＨ）での免疫化による抗リン脂質の誘発(Induction of antiphospholipid aut
oantibodies by immunization with beta 2 glycoprotein I)(apolipoprotein H
)」と題する論文」と題する論文。

【０１４０】 １２．Am J Reprod Immunoal、第３７巻、第１１８−２４頁（１９９７年）に
掲載のガルシア・シーオウ(Garcia CO)等の「ベータ２ＧＰＩを用いた免疫化後
のＰＬ／Ｊマウスにおける実験的抗リン脂質抗体症候群の誘発(Induction of ex
perimental antiphospholipid antibody syndrome in PL/J mice following imm
unization with beta 2 GPI)」と題する論文。

【０１４１】 １３．J Med Chem、第３８巻、第１２６７−７２頁（１９９５年）に掲載のマ
ルシアノ・ディー(Marciano D)等の「Ｒａｓ依存細胞成長の固定カルボン酸抑制
剤のファルネシル誘導体(Farnesyl derivatives of rigid carboxylic acids-in
hibotos of ras-dependent cell growth)」と題する論文。

【０１４２】 １４．Biochemistry、第３７巻、第１３０６−１４頁（１９９８年）に掲載の
ハクライ・アール(Haklai R)等の「Ｒａｓの除去と加速分解(Dislodgement and
accelerated degradation of Ras)」と題する論文。

【０１４３】 １５．Clin Immunol Immunopathol、第５４巻、第８７−９７頁（１９９０年
）に掲載のブランク・エム(Blank M)等の「ブドウ膜炎をもつ患者におけるシク
ロスポリン及びブロモクリプチン治療の抗体レベルの低下調節(Down-regulation
of autoantibody levels of cyclosporine and bromocriptine treatment in p
atients with uveitis)」と題する論文。

【０１４４】 １６．Circulation、第９７巻、第９００−６頁（１９９８年）に掲載のジョ
ージ・ジェイ(George J)等の「内皮細胞及び実験的抗リン脂質症候群の発現に及
ぼす抗ベータ２糖タンパク質Ｉ抗体の差動効果(Differential effects of anti-
beta2-glycoprotein I antibodies on endothelial cells and on the manifest
ations of experimental antiphospholipid syndrome)」と題する論文。

【０１４５】 １７．Lupus、第６巻、第６４５−５１頁（１９９７年）に掲載のブレイ・ア
ールエル(Brey RL)等の「抗細胞間接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）抗体治療は自
己免疫感受性マウスにおける中枢及び抹消神経系疾患を防止する(Anti-intercel
lular adhesion molecule-1(ICAM-) antibody treatment prevents central and
peripheral nervous system disease in autoimmune-prone mice)」と題する論
文。

【０１４６】 １８．Immunology、第５９巻、第第１８７−９３頁（１９８６年）に掲載のカ
メロン・アール(Cameron R)等の「ＭＲＬ類遺伝子性マウスにおけるコンカナバ
リンＡに対するＴ細胞応答低下の原因となる２つの異常の概要(Delineation of
two defects responsible for T-cell hyporesponsiveness to concanavalin A
in MRL congenic mice)」と題する論文。

【０１４７】 １９．J Clin Lab Immunol、第１６巻、第９３−１０９頁（１９８５年）に掲
載のドジアルスキー・アール(Dziarski R)の「正常及び自己免疫マウスにおける
ペプチドグリカン、ＬＰＳ、タンパク質Ａ、ＰＷＮ、ＰＨＡ及びＣｏｎＡに対す
るインビトロ及びインビボミトゲン及び多クローン抗体並びに自己抗体応答の比
較(Comparison of in vitro and in vivo mitogenic and polyclonal antibody
and autoantibody responses to peptidoglycan, LPS, protein A, PWN, PHA an
d ConA in norrnal and autoimmune mice)」と題する論文。

【０１４８】 ２０．Clin Exp Immunol、第９３巻、第４１８−２３頁（１９９３年）に掲載
のバーンステイン・ケイエイ(Bernstein KA)等の「血清糸球体結合活性は、ＭＲ
Ｌ／ｌｐｒマウスの腎臓疾患と著しい相互関係がある(Serum glomerular bindin
g activity is highly correlated with renal disease in MRL/lpr mice)」と
題する論文。

【０１４９】 ２１．J Lab Clin Med、第１２４巻、第４９６−５０６頁（１９９４年）に掲
載のキバード・ビーエイ(Kiberd BA)等の「メチルプレドニソロン及びシクロホ
スファミドによるネズミの狼瘡腎炎における糸球体構造及び機能の調節(Modulat
ion of glomerular structure and function in murine lupus nephritis by me
thylprednisolone and cyclophosphamide)」と題する論文。

【０１５０】 ２２．Clin Exp Immunol、第１００巻、第１１８−２５頁（１９９５年）に掲
載のウー・ジェイ(Woo J)等の「ＭＲＬ／Ｍｐｊ−ｌｐｒマウスにおける異型Ｂ
２００^＋Ｔ細胞、サイトカイン遺伝子発現及び疾患活性に及ぼすＦＫ５０６（タ
クロリムス）並びにシクロホスファミドの組合せ効果(Combined effects of FK5
06 (tacrolimus) and cyclophosphamide on atypical B200+T cells, cytokine
gene expression and disease activity in MRL/MpJ-lpr/lpr mice)」と題する
論文。

【０１５１】 ２３．Arthritis Rheum、第３７巻、第２８９−９７頁（１９９４年）に掲載
のワーナー・エルエム(Warner LM)等の「ラパマイシンは生存を長くし、ネズミ
の全身狼瘡紅斑における病態生理学的変化を止める(Rapamycin prolongs surviv
al and arrsts pathophysiologic changes in murine systemic lupus erythema
tosus)」と題する論文。

【０１５２】 ２４．Arthritis Rheum、第３７巻、第５８７−９４頁（１９９４年）に掲載
のヘンリクソン・エム(Henrickson M)等の「非ミトゲン抗ＣＤ３タンクローン抗
体で処理したＭＲＬ−ｌｐｒ／ｌｐｒマウスにおける死亡率とリンパ節炎の減少
(Reduction of mortality and lymphadenopathy in MRL-lpr/lpr mice treated
with nonmitogenic anti-CD3 monoclonal antibody)」と題する論文。

【０１５３】 ２５．J Autoimmun、第８巻、第３３−４５頁（１９９５年）に掲載のメリオ
・アール(Merino R)等の「ＭＲＬ−ｌｐｒ／ｌｐｒマウスにおけるｌｐｒＣＤ４ ⁻ ＣＤ８⁻二重陰性Ｔ細胞と自己免疫症候群の発現に及ぼす長期抗ＣＤ４または
抗ＣＤ８処置の影響(Effect of long-term anti-CD4 or anti-CD8 treatment on
the cevelopment of lpr CD4- CD8- double negative T cells and of the aut
oimmune syndrome in MRL-lpr/lpr mice)」と題する論文。

【０１５４】 実施例４ ＲａｓアンタゴニストＳ−トランス、トランスファルネシル チオサリチル酸（ＦＴＳ）は、ＭＲＬ／ｌｐｒマウス及び ＡｐｏＨグルコタンパクで誘発された抗リン脂質症候群（ＡＰＳ） のモデルにおける遺伝学的に定められたＡＰＳを抑制する。 抗リン脂質症候群の２つのモデルを比較した。Ｆａｓ遺伝子における突然変異
による遺伝子モデルであるＭＲＬ／ｌｐｒマウスと、誘発モデルである、Ａｐｏ
Ｈ（β２グルコタンパク１）で免疫化したバルブ−Ｃマウスである。ＭＲＬマウ
ス（１０乃至１８週）における自己抗体に及ぼす２ヶ月のＦＴＳ（週当たり５日
、５ｍｇ／ｋｇ）処理の影響を、図１４に示す。自己抗体のレベルを、通常のＥ
ＬＩＳＡ検定により１９週齢で測定した（繰り返し測定ｐ＝０．０１６）。抗Ａ
ｐｏＨと抗２本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の有意に低いレベルが、ＦＴＳ処理され
たＭＲＬ／ｌｐｒマウスにおいて見受けられた。抗ＡｐｏＨ及び抗ｄｓＤＮＡは
、見受けられた主要抗体グループであった。リン脂質及び１本鎖ＤＮＡに対する
自己抗体の有意であるが、より低いレベルが、ＭＬＲ／＋＋対照と比較して、Ｍ
ＲＬ／ｌｐｒマウスにおいて見受けられた。ＦＴＳは、対照におけるこれらの非
主要(minor)抗体のレベルを有意に低下させなかった。ＦＴＳは、ＭＲＬ／ｌｐ
ｒグループにおいて自然にみられるよりもはるかに低いレベルではあるが、対照
グループにおける幾つかの自己抗体のレベルを実際に高めた。

【０１５５】 同様の抗体検定を、完全フロイントアジュバントにおいてＡｐｏＨ１０μｇで
免疫化したＢａｌｂ−Ｃマウスの血清を用いて行ない、ブースト(boost)が不完
全アジュバントにおいて２及び６週後に与えられた。抗ＡｐｏＨ及び抗ｄｓＤＮ
Ａレベル、更には抗ホスファチジル−エタノールアミンに対するＦＴＳ処理の有
意の影響があった（図示せず）。この場合にも、アジュバント単独で免疫化した
対照グループにおける自己抗体のレベルは、ＦＴＳ処理したマウスよりも高かっ
たが、これらのレベルは、ＡｐｏＨ免疫化グループよりも依然として低かった。

【０１５６】 ＭＲＬ／ｌｐｒマウスにおける疾患活性の重要な測定の１つとして、タンパク
尿がある。タンパク尿のレベルは、ＦＴＳまたはビヒクル単独で毎日処理したＭ
ＲＬ／ｌｐｒ及びＭＲＬ／＋＋マウスにおいてディップスティックを用いて毎週
測定した。１２乃至１８月齢からのこれらの検定の結果が、図１５に示されてい
る。有意のタンパク尿が、ＭＲＬ／＋＋グループに比較して、ビヒクルで処理し
たＭＲＬ／ｌｐｒにおいて発現した。これに対して、ＦＴＳで処理したＭＲＬ／
ｌｐｒマウスは、有意のタンパク尿を発現せず、対照とは区別することができな
かった。リンパ節炎及びリンパ球の増殖を含む疾患活性の他の全身測定が、ＦＴ
Ｓ処理したＭＲＬ／ｌｐｒマウスにおいて正規化された（図示せず）。神経学的
には、水平バーでのグリップ強さによって測定される弱化が損なわれたが、ＭＲ
Ｌ／ｌｐｒマウスにおいて１６週齢で始まり、これもＦＴＳ処理により正規化さ
れた。

【０１５７】 実施例５ Ｒａｓアンタゴニスト、ファルネシルチオサリチル酸（ＦＴＳ） は、ラットにおいて実験的に誘発される肝硬変症を抑制する 本実施例の目的は、ＦＴＳが、ラットにおいて実験的に誘発される肝硬変症を
防止することができるかどうかを試験することにあった。結果は、繰り返し発作
の再生の際の肝臓におけるＲａｓ発現の抑制により、実験的に誘発される肝硬変
症の発現を防止することを示している。

【０１５８】 動物及び材料 テルアビブ大学アニマル・ブリーディング・センタ(Animal Breeding Center)
から入手した雄のウイスタラット(Wistar rat)を、ウルフソン・メディカル・セ
ンタ(Wolfson Medical Center)の動物飼育ハウスに保管し、プリナ(Purina)げっ
歯類餌アドリビタム(ad libitum)を与えた。全ての動物が、研究所のガイドライ
ンに従って、研究プロトコールの際に人間の手当てを受けた。チオアセトアミド
（ＴＡＡ）を、シグマ・ケミカル・カンパニ(Sigma Chemical Co.)（ミーズーリ
ー州、セントルイス）から入手した。

【０１５９】 ファルネシルサリチル酸（ＦＴＳ）の合成及び調製 ＦＴＳを、室温のアセトン７５ｍｌにおいて、サリチル酸（０．９ｇ、６ミリ
モル）と、炭酸グアニジン（１．３ｇ、７ミリモル）と、トランス、トランス−
ファルネシルブロミド（１．７ｇ、６ミリモル）とを一晩混合してつくった。ア
セトンを蒸発後、クロロホルムを、２ＮのＨＣｌ数滴とともに加えた。混合物を
水で洗浄し、有機層を分離して硫酸マグネシウム上で乾燥し、次いで、蒸発させ
た。生成物のＦＴＳを、クロロホルム及び酢酸エチルの混合物を用いてシリカゲ
ル上で精製した。

【０１６０】 各組の実験に関して、ＦＴＳをクロロホルム（０．１Ｍストック溶液）におい
て調製し、−７０℃に保持した。使用に先立ち、クロロホルムを、窒素流により
ストック溶液から除去し、次いで、ＦＴＳを、ＤＭＳＯ（インビトロ実験）また
はエタノール（インビボ実験）に溶解した。ＦＴＳ／ＤＭＳＯ溶液をＤＭＥＭ／
１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）で希釈して、１０％のＤＭＳＯを含む１００ｘ薬
剤ストック溶液を得た。この溶液の一部を、１：１００の希釈比で細胞に適用し
た。ＦＴＳ／エタノール溶液を、１ＮのＮａＯＨを添加してアルカリ性にし、次
いで、燐酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈して、１．０ｍｇＦＴＳ／ｍｌ（
ｐＨ８．０、０．５％エタノール）の溶液を得た。この溶液（ラット当たり１−
１．５ｍｌ）を、インビボ実験に使用した。別の組の実験においては、血漿及び
肝臓におけるＦＴＳの分布を、３Ｈ−ＦＴＳ（１２．５ｃｉ／ミリモル、ミズー
リー州、セントルイスに所在するＡＲＣ）を使用して検定した。これらの実験に
より、薬剤は、注入された用量（５ｍｇ／ｋｇ）の１０．７％に相当するピーク
血漿レベルと、注射された用量の１．７５％に相当するピーク肝臓レベルに到達
していることがわかった。ピーク時間（２０乃至６０分）の肝臓におけるＦＴＳ
の推測濃度は２９μＭであった。肝臓における薬剤レベルは、その後、２４時間
で０．５μＭのレベルに減少した。

【０１６１】 肝硬変症の誘発 従来説明されている（１、２）ように、ＴＡＡ２００ｍｇ／ｋｇを、週２回、
１２週に亘って腹腔内（ｉｐ）投与することにより、ラットにおいて肝硬変を誘
発させた。ＴＡＡのこのような長期間に亘る投与により、ラットの肝臓に微小節
状肝硬変を示す特徴的な病巣が生じた。

【０１６２】 急性肝臓損傷の誘発 肝線維症に対するＦＴＳの影響が、抗線維活性によるのではなく抗炎症性によ
る可能性を除外するために、急性肝損傷を、ＦＴＳで予め処理したラットの別の
グループにおいてＴＡＡ（４００ｍｇ／ｋｇを３回腹腔内注入）により誘発させ
た。最初にＴＡＡを注入してから５２時間後に、血液を取り出して、肝酵素及び
血液アンモニアの血清レベルを測定し、更に、肝組織の組織病理学的評価を行っ
た。

【０１６３】 実験構成 ＦＴＳを、ＰＢＳに溶解し、割り当てられたグループに従ってラットに週３回
腹腔内投与した。６匹のラットを含む４つの各グループを、次のように処理した
。１つのグループには、週２回、ＴＡＡを２００ｍｇ／ｋｇ腹腔内投与するとと
もに、ＰＢＳを週３日、１２週間に亘って、腹腔内注入した（ＦＴＳ処理グルー
プに対する肝硬変対照）。第２のグループは、ＴＡＡを１２週間及びＦＴＳ５ｍ
ｇ／ｋｇを週３回受けた。この用量は、３−１０ｍｇ／ｋｇの用量のＦＴＳが、
腫瘍の成長を有効に抑制することを示す以前の動物研究を考慮して選択された。
２つの対照グループは、１２週間、ＴＡＡなしにＰＢＳを受けたグループ（通常
の対照）と、ＦＴＳ５ｍｇ／ｋｇだけを１２週間腹腔内投与して、悪影響の出現
を監視する５匹のラットのグループであった。

【０１６４】 肝臓の組織病理学的分析 ラットを、処理プロトコールの終了時に犠牲にした。肝臓を取り出し、肝臓の
左葉の中央部を光顕微鏡処理した。この処理は、検体を５％中性ホルモール溶液
に固定し、検体をパラフィンに埋め込み、５μｍの厚さの切片をつくり、切片を
ヘマトキシリン及びエオシンで染色した。レチクリン染色を、肝線維症の程度及
び分布を目視し易くするように行った。組織のスライスを、サンプル源を承知し
ていない２人の病理学の専門家が走査して、評点即ちスコアをつけた。炎症と線
維症の程度を、ミューラ等（３）に従って０−３のスケールで分類された各スラ
イドの１０の異なるフィールドの平均として表した。

【０１６５】 肝のヒドロキシプロリンレベルの測定 肝のヒドロキシプロリンレベルの定量を、従来説明されている（２）ようにし
て行った。ヒドロキシプロリンのレベルを、各肝臓に関して、２回別々に分析し
た。

【０１６６】 Ｒａｓ発現の測定 ラットの肝臓のＲａｓタンパクのレベルを、従来説明されている（４、５）よ
うに、抗Ｒａｓ抗体（サンタ・クルーズのパンＲａｓＡｂ０３）を使用して免疫
ブロット検定することにより測定した。簡単に説明すると、肝臓を、０．３２Ｍ
のスクロース、５０ｍＭ のトリスＨＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡを含むｐＨ７．４
の緩衝液、５μｇのペプスタイン及び５単位／ｍｌのオプソトニンにおいて均質
化した（１０％重量／容量）。血漿膜に富んだフラクションを、２０，０００Ｘ
ｇ、３０分の回転により得た。得られたペレットを、均質化緩衝液に再懸濁し、
タンパク質を２０μｇ含むサンプルを、１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ミニゲル
）に使用した。ゲルを、従来説明されている（４）ようにして免疫ブロット検定
に供した。各ウエスタンブロットを３回分析した。図１７のデータは、これら３
つのブロットの平均±ＳＤ ＯＤを示している。更に、Ｒａｓを免疫組織化学に
より測定した。

【０１６７】 ヒト星状細胞の単離と培養 ヒトＨＳＣを、従来報告されている（６、７）ようにして、移植には適してい
ない正常な人間の肝臓細胞のウエッジ部から単離した。簡単に説明すると、コラ
ゲナーゼ／プロナーゼによる組合せ消化の後に、ＨＳＣを、ストラクタン(strac
tan)（ミネソタ州、セントポールに所在するラレックス・インコーポレイテッド
(Larex Inc.)のCellsep（商標）等張溶液）の傾きに亘って超遠心分離により、
他の肝臓の非実質性細胞から分離した。広範に亘る特徴づけを、（７）に記載の
ようにして行った。細胞を、０．６Ｕ／ｍｌのインスリン、グルタミン２．９ｍ
Ｍ、非必須アミノ酸０．１ｍＭ、ピルビン酸ナトリウム１．０ｍＭ、抗生抗かび
溶液（いずれもニューヨーク州、グランドアイランドのジブコ・ラボラトリーズ
(Gibco Laboratories)により提供）及びウシ胎児血清２０％（英国、アンドバー
に所在するインペリアル・ラボラトリーズ(Imperial Laboratories)）を補給し
たアイスコーブの改質したダルベッコ媒質(Iscove's modified Dulbecco's medi
um)においてプラスチックの培養皿（ニュージャージ州、リンカーン・パーク、
ファルコン、ベクトン・ディッキンソン）で培養した。この研究において説明さ
れている実験を、３つの独立した細胞系統を使用して、第３の連続パッセージ(s
erial passage)と第４の連続パッセージとの間（分割比：１：３）で細胞に対し
て行った。従来報告されている（７）ように、培養のこれらの段階においては、
ヒトＨＳＣは、「筋線維芽細胞様の細胞」の透過電子顕微鏡特性を示した。これ
は、活性化表現型への完全な移行を示している。

【０１６８】 ＤＮＡ合成 ＤＮＡ合成を、トリクロロ酢酸沈殿可能物質に取り込まれる〔メチル−^３Ｈ〕
チミジン（〔^３Ｈ〕ＴｄＲ）の量として測定した。細胞を、２０％ＦＢＳを含む
完全培地において２ｘ１０^４細胞／溜めの密度で２４個の溜めの皿において平板
培養した。融合(confluent)細胞（約１ｘ１０^５細胞／溜め）を無血清／無イン
スリン（ＳＦＩＦ）培地において２４時間温育し、次いで、異なる濃度のＦＴＳ
を含む新鮮なＳＦＩＦにおいて更に２４時間温育した。次に、細胞に、１０ｎｇ
／ｍｌのＰＤＧＦ−ＢＢを用いて２０時間刺激を与え、次いで、１．０μＣｉ／
ｍｌ〔^３Ｈ〕ＴｄＲ（６．７Ｃｉ／ミリモル）を用いて更に４時間パルス処理し
た。パルス処理期間の最後に、〔^３Ｈ〕ＴｄＲの細胞ＤＮＡへの取込を、従来報
告されている（８）ように測定した。細胞数を、各皿からの３つの異なる溜めに
おいて測定し、結果をｃｐｍ／１０５細胞として示した。

【０１６９】 化学走性(chemotactic)検定 細胞の移行を、従来説明されている（９、１０）ようにして行った。簡単に説
明すると、実験を、８μｍ穿孔の無ポリビニルピロリドンのポリカーボネートフ
ィルタ（１３ｍｍ直径）を備えた改良されたボイデンチャンバ技術(Boyden's ch
amber technique)を使用して行った。ポリカーボネートフィルタに、ヒトタイプ
Ｉコラーゲン２０μｇ／ｍｌを３０分間、３７℃でプレコートし、上部室と下部
室との間に配置した。６つの溜め／皿の融合ＨＳＣを無血清／無インスリン（Ｓ
ＦＩＦ）培地において２４時間温育し、次いで、異なる濃度のＦＴＳを含む新鮮
なＳＦＩＦにおいて、更に２４時間温育した。次に、これらを、穏やかなトリプ
シン化（０．０５％トリプシン／ＥＤＴＡ）により懸濁させた。４ｘ１０^４細胞
に相当する、得られた細胞懸濁体のアリコート（２１０μｌ）を、頂部溜めに加
えて、３７℃で６時間温育した。下部室に、無血清／無インスリン培地（対照）
またはＰＤＧＦ−ＢＢ（１０ｎｇ／ｍｌ）を満たした。９６％メタノールに固定
し、ハリス(Harris')ヘマトキシリン溶液で染色してから、フィルタの下側に移
行した細胞を、１０のハイパワーフィールド（ＨＰＦ）における細胞の数として
定量した。全ての実験を、３回行った。各３重検定を、異なるＨＳＣ製剤を用い
て２回繰り返した。可能性のある細胞毒性作用を、トリパンブルー除去試験によ
り監視した。

【０１７０】 統計学的分析 示した実験の番号に対する結果を、平均±ＳＤとして表す。インビトロ実験の
統計学的分析を、ワンウエイＡＮＯＶＡにより行うとともに、Ｆ値が有意である
ときにダンカン試験(Duncan's test)により行った。異なるインビトロ実験間の
差の有意性を、スチューデントｔ試験(Student's t-test)により定めた。

【０１７１】 結果 ＦＴＳによるラットの肝硬変の抑制 １２週に亘るＴＡＡの腹腔内投与により、ラットの肝臓の表面に均一の細かい
肉芽(granulation)が形成された。顕微鏡分析により、これらのＴＡＡ処理のラ
ットにおいては、混合サイズの線維芽結節を特徴とする肝硬変様の構造パターン
が明らかとなった。これに対して、ＴＡＡとＦＴＳを１２週間受けたラットの肝
臓は、穏やかなブリッジ線維症をもつ門脈及び門脈周囲炎症を極くわずかに示す
だけであったが、肝硬変結節（０．８±０．５対２．６±０．５、ｐ＜０．００
１、表４）または線維症中隔（０．９±０．５対２．７±０．５、ｐ＜０．００
１、表４）はなかった。これらの事実は、ラットにおけるＲａｓアンタゴニスト
の、ＦＴＳがＴＡＡ誘発の肝硬変の発現を抑制することを示している。

【０１７２】

【表４】 ＊ＴＡＡ：２００ｍｇ／ｋｇを週２回、１２週間腹腔内投与 ＊＊０−３のスケール：変化なし＝０、わずかな変化＝１、大きい変化＝２、強
い変化＝３。ＦＴＳ（５ｍｇ／ｋｇ）を週３回、１２週間投与した。

【０１７３】 肝のヒドロキシプロリン含量 肝線維症を、肝のヒドロキシプロリンレベルを測定することにより定量した。
図１６に示すように、ＴＡＡ処理したグループの平均ヒドロキシプロリンレベル
は、ＦＴＳだけで処理した対象グループの１．６±０．１ｍｇ／ｇタンパク質と
比較して、ＴＡＡプラスＦＴＳのグループ及び対照グループ（７．７±０．９対
３．８±０．５ｍｇ／ｇタンパク質）よりも有意に高かった。これらの定量測定
値は、定性的な組織病理学的評価と十分に相関するものである。

【０１７４】 定量Ｒａｓ発現 ラットの肝臓から抽出した膜のＲａｓレベルを、パン抗Ｒａｓ抗体を使用する
ウエスタンブロット分析により測定した。図１７に示すように、ＴＡＡ処理のグ
ループは、対照グループと比較して、Ｒａｓレベルが１７．６±２．０倍大きく
、一方、Ｒａｓレベルは、ＴＡＡ＋ＦＴＳ処理グループの対照グループよりも４
．９±１．２倍高いだけであった。同様の結果が、肝臓全体のホモジェネートを
試験したときにも得られた。従って、ＦＴＳ処理により、ＴＡＡ処理ラットの肝
臓におけるＲａｓ発現は、７０％低下した。

【０１７５】 生存ラット ＴＡＡ投与の１２週後、ＴＡＡで処理したラットのグループ及びＴＡＡ＋ＦＴ
Ｓで処理したラットのグループ（各グループともｎ＝６）のいずれにおいても、
ラットの死亡はなかった。

【０１７６】 ＦＴＳによるＴＡＡ誘発急性肝障害の抑制の欠如 ＦＴＳによる肝線維症の抑制が炎症及び細胞壊死の低下によるものであるとす
る可能性を排除するため、本発明者は、急性肝壊死のモデルにおいてＴＡＡとＦ
ＴＳを使用した。表５に示すように、ＦＴＳは、肝酵素及び血液アンモニアレベ
ルの上昇により示されるように、急性ＴＡＡ投与に応答する肝壊死を防止するこ
とができなかった。これらの結果により、ＦＴＳによる肝線維症の抑制は、炎症
及び細胞壊死の消滅によるものでないことがわかる。

【０１７７】

【表５】 各グループにおいて平均±ＳＤ、ｎ＝５。２つのグループの差は、上記したパラ
メータのいずれにおいても統計学的に有意ではない。

【０１７８】 ＴＡＡを、２４時間の間隔で、４００ｍｇ／ｋｇを３回連続して腹腔内投与し
た。肝臓酵素の血清レベル、血液アンモニア及び肝臓組織学を、最初のＴＡＡ投
与から５２時間後に測定した。ＦＴＳ投与（１日５ｍｇ／ｋｇ）を、最初のＴＡ
Ａ注入の３日前に開始した。

【０１７９】 ＦＴＳ副作用の欠如 ＦＴＳの長期投与により引き起こされる悪影響の存在を監視するために、対象
グループに、Ｒａｓアンタゴニストを１２週間与えた。処理の最後に、死亡また
は大きな悪影響は、処理されたラットに観察されなかった。肝臓、腎臓及び甲状
腺機能を含む血液化学並びに完全血球計算は、正常の範囲内にあった。このグル
ープの肝臓組織学は、完全に正常であった（表４）。これらの結果は、早期の研
究に従うものであり、ＦＴＳ処理の動物の体重、特定の器官サイズ、血球計算及
び化学に変化はなかった。しかしながら、これらの予備結果は、Ｒａｓアンタゴ
ニストの長期の投与後に現れる可能性のある潜在的な副作用を完全に除外するも
のではく、更なる毒性研究が、ＦＴＳ投与の安全性を十分に定めるのに必要であ
ると考えられる。

【０１８０】 ＨＳＣ活性化に及ぼすＦＴＳの影響 ＦＴＳによる肝硬変症の抑制を星状細胞の活性化の抑制と関連させる可能性を
試験するために、ヒトＨＣＳを培地に使用した（６、７、８）。最初の組の実験
においては、ＨＳＣにおけるＤＮＡへのＰＤＧＦ刺激３Ｈチミジンの取込に及ぼ
すＦＴＳの影響を試験した。これらの実験の結果から、ＦＴＳ（２５−５０μＭ
）は、ＨＳＣにおけるＤＮＡへのＰＤＧＦ刺激３Ｈチミジンの取込に影響を及ぼ
すことがわかった。第２の組の実験においては、ＦＴＳがＰＤＧＦ誘発細胞の移
行に影響を及ぼすかどうかに関して試験を行った。この実験の結果から、ＨＳＣ
は、ＦＴＳに対し著しい感受性を示し、２．０−２．５μＭのＦＴＳは、ＰＤＧ
Ｆ刺激細胞の移行を抑制した（５０％）。

【０１８１】 結論 肝線維症は、マトリックスの合成と分解との不釣り合いがあると生じて、細胞
外マトリックスの析出が増大する。この線維症処理の際には、コラーゲン、非コ
ラーゲングリコタンパク及びプロテオグリカンのような細胞外マトリックス成分
が、肝臓の細胞間スペースに蓄積する。線維形成の初期においては、ＨＳＣは、
ＰＤＧＦ及びＴＧＦ−βのようなサイトカインに応答して、細胞外スペースにお
いてマトリックス成分を増殖させるとともに、析出させる（１１、１２、１３、
１４）。

【０１８２】 ＦＴＳが、成長因子刺激ＨＳＣの移行及び増殖に影響を及ぼし、かつ、ＴＡＡ
の慢性投与により誘発される肝線維症の発現を抑制することができるかどうかを
みるために、ＦＴＳの試験を行った。投与後すぐに、ＦＴＳは、混合機能オキシ
ダーゼ系により、広範な代謝を行う（１５）。フリーラジカル仲介の脂質過酸化
が、ＴＡＡ誘発肝線維症の発現に寄与しているものと考えられる。慢性ＴＡＡ中
毒においては、実質的な肝線維症及び顕著な再性結節が、肝硬変の特徴である門
脈高血圧及び筋力過多血行と関連して、ＴＡＡ投与の３ヶ月後に発現することが
示された（３）。

【０１８３】 結果から、ＦＴＳが、Ｒａｓタンパク質に対するｆｔｓの作用に関する上記し
たモードと一致し、かつ、ＦＴＳが肝硬変の発現を抑制することができる可能性
と一致して、インビトロのＨＳＣのＰＤＧＦ誘発活性化を容量依存の態様で抑制
したことがわかった。実際に、比較的低用量（５ｍｇ／ｋｇ）を週に３回投与す
ると、ＦＴＳは、ＴＡＡで慢性的に処理したラットの肝硬変の発現を抑制すると
ともに、肝のＲａｓの量を低下させた。肝硬変の抑制は、光学顕微鏡により評価
されたように、肝のヒドロプロリンレベルの測定と相関していた。更にまた、Ｒ
ａｓのレベルも、ＴＡＡだけで処理したものと比較して、ＴＡＡ及びＦＴＳで処
理したラットの肝臓では著しく減少していた。ＦＴＳによる明らかな副作用は、
Ｒａｓアンタゴニストだけを１２週間受けたラットのグループにはみられなかっ
た。ＦＴＳによる肝硬変の抑制の機構を明らかにするため、更に実験を行ったが
、ＦＴＳは、ＴＡＡの急な投与により誘発される肝臓の炎症及び壊死を防止し得
なかった。これらの結果から、ＦＴＳによる肝線維症の低減は、炎症及び細胞の
壊死の抑制によるものではないことがわかる。

【０１８４】 文献 １．Dig Dis Sci、第３８巻、第２１９５−２０２頁（１９９３年）に掲載の
ホリ・エヌ(Hori N)、オカノウエ・ティー(Okanoue T)、サワ・ワイ(Sawa Y)、
モリ・ティー(Mori T)及びカシマ・ケイ(Kashima K)の「チオアセトアミド投与
に誘発される実験的肝硬変における血流力学的特徴(Hemodynamic characterizat
ion in experimental liver cirrhosis induced by thioacetamide administrat
ion)」と題する論文。

【０１８５】 ２．Arch Biochem Biophs、第９３巻、第４４０−４４７頁（１９６１）年に
掲載のウースナー・ジェイエフ(Woessner JF)の「組織におけるヒドロキシプロ
リン及びこのタンパク質を小さい割合で含むタンパク質サンプルの測定(The det
ermination of hydroxyproline in tissue and protein samples containing sm
all proportions of this imino acid)」と題する論文。

【０１８６】 ３．Exp Pathol、第３４巻、第２２９−３６頁（１９８８年）に掲載のミュー
ラ・エイ(Muller A)等の「ラットにおけるチオアセトアミド誘発肝硬変様の病巣
−動物モデルの有用性及び信頼性(Thioacetamide-induced cirrhosis-like lesi
ons in rats-usefulness and reliability of this anomal model)」と題する論
文。

【０１８７】 ４．J Biol Chem、第２７０巻、第２２２６３−２２２７０頁（１９９５年）
に掲載のマロム・エム(Marom M)等の「ファルネシルチオサリチル酸によるＲａ
ｓ依存細胞成長の選択的抑制(Selective inhibition of ras-dependent cell gr
owth by farnesyl thiosalicylic acid)」と題する論文。

【０１８８】 ５．Biochemistry、第３７巻、第１３０６−１３１４頁に掲載のハクライ・ア
ール(Haklai R)等の「Ｒａｓの除去加速分解(Dislodgment accelerated degrada
tion of Ras)」と題する論文。

【０１８９】 ６．J Clin Invest、第９０巻、第６４２−６４６頁（１９９２年）に掲載の
ピンザニ・エム(Pinzani M)等に掲載の「肝特異ペリサイトとしての脂肪蓄積細
胞：アゴニスト刺激細胞間カルシウム移行の空間ダイナミックス(Fat-storing c
ells as liver-specific pericytes: spatial dynamics of agonist-stimulated
intracellular calcium transients)」と題する論文。

【０１９０】 ７．Gastroenteroly、第１０５巻、第２４５−２５３頁（１９９３年）に掲載
のカシーニ・エイ(Casini A)等の「人脂肪蓄積細胞における成長因子−β１の形
質変換による細胞外マトリックス合成の規制(Regulation of extracellular mat
rix synthesis by transforming growth factor-β1 in human fat-storing cel
ls)」と題する論文。

【０１９１】 ８．J Clin Invest、第８４巻、第１７８６−１７９３頁（１９８９年）に記
載のピンザニ・エム(Pinzani M)等の「ＤＮＡ合成及び培養肝脂肪蓄積細胞の成
長に及ぼす血小板誘発成長因子その他のポリペプチドミトゲンの影響(Effects o
f platelet-derived growth factor and other polypeptide mitogens on DNA s
ynthesis and growth of cultured liver fat-storing cells)」と題する論文。

【０１９２】 ９．Gastroenterology、第１１２巻、第１１９７−１３０６頁（１９９７年）
に掲載のマラ・エフ(Marra F)等の「イノシトールリン脂質３−キナーゼは肝星
状細胞に対する血小板誘発成長因子の作用に必要である(Phosphaticylinositol
3-kinase is required for platelet-derived growth factor's action on hepa
tic stellate cell)」と題する論文。

【０１９３】 １０．Gastroenterology、第１１０巻、第１１２７−１１３６頁（１９９６年
）に掲載のカルロニ・ブイ(Carloni V.)等の「培養ヒト肝星状細胞におけるコラ
ーゲン及びラミニンに関するインテグリンレセプタの発現及び機能(Expression
and function of integrin receoptors for collagen and laminin in cultured
human hepatic stellate cells)」と題する論文。

【０１９４】 １１．Paris:John Libbery Eurotext, Les Editions INSERM、第２１６巻、第
１１５−３４頁（１９９２年）に掲載のシュッパン・ディー(Schuppann D)等の
「細胞外マトリックス：主要信号導入ネットワーク。ビー・クレメント、エイ・
ギロウゾ編集、肝硬変の細胞及び分子状の観点。パリ：ジョン・リベイ・ユーロ
テキスト・レス編集(The etracellular matrix: a major signal transduction
network. In: B. Clement A. Guillouzo, eds.)」と題する論文。

【０１９５】 １２．Dordre: Kluwer Academic Publishers、第８５−９８頁（１９９２年）
に掲載のクレメント・ビー(Clement B)等の肝細胞外マトリックスの細胞起源。
グレスナー・エイエム、ラマドリ・ジー編集、肝臓線維形成の分子及び細胞生物
学(Cellular origin of the hepatic extracellular matrix. In: Gressner AM,
Ramadori G, eds. Molecular and Cell Biology Biology of Liver Fibrogenes
is)」と題する論文。

【０１９６】 １３．Am J Pathol、第１２５巻、第６１１−１９頁（１９８６年）に掲載の
オガワ・ケイ(Ogawa K)等の「細胞外マトリックスの逐次変化と病巣肝損傷にお
けるデスミンとアクチンの強化発現を伴うイトウ細胞の増殖(Sequential change
s of extracellular matric and proliferation of Ito cells with enhanced e
xpression of desmin and actin in focal hepatic injury)」と題する論文。

【０１９７】 １４．Eur Surg Res、第２１巻、第８３−９１頁（１９８９年）に掲載のダシ
ュティ・エイチ(Dashti H)の「チオアセトアミド及び四塩化炭素誘発肝硬変(Thi
oacetamide- and carbon tetrachloride induced-liver cirrhosis)」と題する
論文。

【０１９８】 １５．Toxicology、第３１巻、第４１−５２頁（１９８４年）に掲載のキエリ
・イー(Chieli E)及びマラブルジ・ジー(Malavldi G)の「チオアセトアミドＳ−
酸化物の肝毒性におけるミクロソームＦＡＤ含有モノオキシゲナーゼの役割(Rol
e of the microsomal FAD-containing monooxygenase in the liver toxicity o
f thioacetamide S-oxide)」と題する論文。

【０１９９】 実施例６ ラットにおける頸動脈バルーンの損傷のモデル における内膜過形成に及ぼすＦＴＳの影響 本実施例の目的は、ＦＴＳが平滑筋細胞の増殖及び移行を低下させることによ
り再狭窄を改善することができるかどうかを示すものとして、ラットの頸動脈バ
ルーン損傷における内膜過形成(intimal hyperplasia)に及ぼすＦＴＳの影響を
調べることにある。

【０２００】 関節硬化症と再狭窄(restenosis)は、かなりの罹患率と死亡率もたらす血管の
機能制限を最終的に引き起こす細胞増殖と関係する２つのプロセスである（１−
４）。バルーンの裸出に続く新内膜の形成は、内側平滑筋細胞または改質した外
膜線維芽細胞の増殖及び移行に関係があると考えられている（４、５、６、７）
。最近では、活性化されたＴリンパ球の局所的な存在（３、４）とＣＲＰ、ＩＬ
−６その他のマーカのような炎症マーカの増大（８−１０）とにより示されるよ
うに、間接硬化症と再狭窄における免疫系の関わりを示す証拠が集められている
。

【０２０１】 経皮バルーン冠状血管形成術（ＰＴＣＡ）とステント移植の長期間の有効性は
、内膜の厚肉化の後にルーメンのロスを引き起こすことにより、依然として大き
く制限されている。幾つかの実験的な対策は、動物の内膜の厚肉化を小さくする
うえで、ある程度の成功を収めているが、人間に行われている臨床上の試みでは
、有意の改良を達成していない（１０−１７）。再狭窄の割合を小さくするうえ
での有効な臨床上の用途は、歯冠内照射治療に関してのみ、最近では示されてい
るだけである（１８−１９）。

【０２０２】 方法 動物 ６週齢の雄のウイスタラット（体重２５０−２８０グラム）。この動物を、テ
ルアビブ大学から購入して、地方の動物ハウスに保管した。

【０２０３】 研究構成 グループＡ：４匹のラットに、損傷誘発の日から、１４日後に犠牲になるまで
、ＦＴＳ（５ｍｇ／ｋｇ）を毎日腹腔内注入した。

【０２０４】 グループＢ：４匹のラットに、損傷誘発の日から、１４日後に犠牲になるまで
、対照ビヒクルを毎日腹腔内注入した。

【０２０５】 ラットの頸動脈損傷方法 動物に、ケタミン（８０ｍｇ／ｋｇ）とキシラジン（５ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内
注入することにより麻酔をかけた。内皮露出と血管損傷を、（６）に記載のよう
にして、左頸動脈において行った。簡単に説明すると、バルーンカテーテル（２
Ｆフォガーティ(forgaty)）を、外頸動脈を介して大動脈に通し、バルーンを頸
動脈を膨張させるように十分な水で膨らませ、次いで、外頸動脈に引き戻した。
この処置を３回繰り返し、次いで、カテーテルを取り出した。１４日後に、動物
を犠牲にし、左右の頸動脈を取り出し、１４％パラホルムアルデヒドに固定して
から、パラフィンに埋め込んだ。頸動脈を１０μｍの切片に切断し、Ｈ＆Ｅで染
色し、コンピュータ援用体型測定分析を行った。試験されたパラメータは、内膜
面積、内側(medial)面積、内膜／内側比及びルーメン面積であった。更に、％Ｃ
ＳＡＮ−Ｎ（％横断面積新内膜−ネオインタマル）(% cross sectional area ne
ointimal-neointamal)を算出した〔ＩＥＬ面積−ルーメン面積）ｘ１００／ＩＥ
Ｌ〕（血管壁のサイズの変化の影響を一層大きく正規化して、ＩＥＬが新内膜に
より減少される程度の測定）。血管再モデル化プロセスの評価を、ＥＥＬ（外部
弾性薄層(external elastic lamina)）面積に対するプラークの量をコンピュー
タ処理することにより更に行った。

【０２０６】 免疫組織化学 全てのパラメータの結果を、２つの尾のスチューデントのｔ−検定を使用して
コンピュータ処理した。結果を、平均±ＳＥＭとして表した。ｐ＜０．０５は、
有意であると考えられた。

【０２０７】 結果 内膜面積は、対照処理した動物（１．６１ｍｍ^２、ｐ＝０．０２）と比較して
、ＦＴＳで処理したラット（０．３８ｍｍ^２）では有意に減少（７６％）してい
た。ＦＴＳは、対照グループ（１．２±０．１４ｍｍ^２）と比較して、処理グル
ープ（０．９１ｍｍ^２）では内側面積に有意の影響は及ぼさなかった。内膜対内
側比は、対照（１．２９±０．２０ｍｍ^２、ｐ＝０．０２）と比較して、ＦＴＳ
処理のラット（０．４９±０．１９ｍｍ^２）では有意に低くなっていた。管腔の
面積は、対照動物（２．３０±０．３２、ｐ＝０．０１５）と比較して、ＦＴＳ
処理のラット（１．４５±０．３４ｍｍ^２）では有意に増大していた。ＦＴＳの
％ＣＳＡＮ−Ｎは、対照処理の動物（５２．４±７．４％、ｐ＝０．００４）に
比較して、有意に低下していた（１４．５±４．３％）。図１８Ａ及び１８Ｂに
示すように、新内膜増殖の増大量は、より大きなＥＥＬ面積とは連係していなか
った。Ｒａｓは、新内膜細胞に豊富に存在し、極低い発現が内側と外膜に認めら
れた。

【０２０８】 結論 ＦＴＳは、ラットにおける頸動脈バルーン損傷により誘起される内膜過形成の
重要なインヒビタと考えられる。ＦＴＳによる血管ルーメンの大きな開通性(pat
ency)は、主として、新内膜の増殖の阻止によるものであって、血管壁再モデリ
ングプロセルによるものではなかった。かくして、再狭窄の再発を抑制すること
ができ、あるいは再狭窄は、ステントの展開、ＰＴＣＡに続くＲａｓアンタゴニ
ストでの全身処理または加速された動脈硬化を抑制するための心臓移植もしくは
冠状動脈バイパス移植の前に、ステントをＲａｓアンタゴニストでコーティング
しあるいはＲａｓアンタゴニストと接触させることにより処置することができる
。

【０２０９】 文献 １．Circulation、第７９巻、第１３７４−１３８７頁（１９８９年）に掲載
のリー(Lie)等の論文。

【０２１０】 ２．N. Engl. J. Med.、第２３６巻、第２４２−２５０頁（１９９２年）に掲
載のファスタ(Fuster)等の論文。

【０２１１】 ３．Circulation、第８６（増補）巻、第ＩＩＩ４７−ＩＩＩ５２頁（１９９
２年）に掲載のリビー(Libby)等の論文。

【０２１２】 ４．Nature(Lond)、第３６２巻、第８０１−８０９頁（１９９３年）に掲載の
ロス(Ross)等の論文。

【０２１３】 ５．Circulation Res.、第６７巻、第６５１−６５９頁（１９９０年）に掲載
のハンケ(Hanke)等の論文。

【０２１４】 ６．Circulation、第９４巻、第１６５５−１６６４頁（１９９６年）に掲載
のシ(Shi)等の論文。

【０２１５】 ７．Circulation、第９３巻、第１７１６−１７２４頁（１９９６年）に掲載
のアンダーソン(Andersen)の論文。

【０２１６】 ８．Engl. J. Med.、第３３６巻、第９７３−９７９頁（１９９７年）に掲載
のリドカー(Ridker)等の論文。

【０２１７】 ９．Circulation、第９８巻、第７３１−７３３頁（１９９８年）に掲載のリ
ドカー(Ridker)等の論文。

【０２１８】 １０．Eur. Heart J. Suppl.第１巻、第Ｔ１９−Ｔ２６頁に掲載のコーイング
(Koeing)の論文。

【０２１９】 １１．Lab Invest.、第４９巻、第３２７−３３４頁に掲載のクロウズ(Clowes
)等の論文。

【０２２０】 １２．Eur. Heart J.、第６巻、第２７６−２８１頁（１９８５年）に掲載の(
Kaltenbach)等の論文。

【０２２１】 １３．J. Am. Coll. Cardiol.、第１２巻、第６１６−６２３頁（１９８８年
）に掲載のノブヨシ(Nobuyoshi)等の論文。

【０２２２】 １４．Lancet.、第３４１巻、第５７３−５８０頁に掲載の「ＲＩＴＡ試験参
加者（１９９３年）冠状血管形成術対冠状動脈バイパス手術：アンギナのランダ
ム化介入治療（ＲＩＴＡ）試験(RITA Trial Participants (1993) Coronary ang
ioplasty versus coronary artery bypass surgery: the Randomised Intervent
ion Treatment of Angina (RIA) trial)」と題する論文。

【０２２３】 １５．J.Am.Coll.Cardiol.、第１７巻、第２Ｂ−１３Ｂ頁（１９９１年）に掲
載のカリフ(Califf)等の論文。

【０２２４】 １６．Circulation、第８４巻、第１４２６−１４３６頁（１９９１年）に掲
載のポプマ(Popma)等の論文。

【０２２５】 １７．Coronary Artery Dis.、第４巻、第２３２−２４２頁（１９９３年）に
掲載のフランクリン(Franklin)等の論文。

【０２２６】 １８．N.Eng.J.Med、第３３６巻、第１６９７−１７０３頁（１９９７年）に
掲載のテアステイン(Teirstein)等の論文。

【０２２７】 １９．Circulation、第９６巻、第７２７−７３２頁（１９９７年）に掲載の
コンダド(Condado)等の論文。

【０２２８】 実施例７ 種々のＦＴＳ類似体の合成 材料 ：メチルチオサリチル酸塩（カタログ番号３５，７７５−８） ２−アミノ−５−クロロ安息香酸（カタログ番号３７，８０４０６） ２−アミノ−４−クロロ安息香酸（カタログ番号Ａ４，５４６−７）及び ２−アミノ−５−フルオロ安息香酸（カタログ番号３６７９８−２） をアルドリッチ(Aldrich)から得た。

【０２２９】 合成 ４−クロロチオサリチル酸、５−クロロチオサリチル酸及び５−フルオロチオ
サリチル酸を、従来説明されている一般的手順により調製した〔JOC、第１８巻
、第１３８０−１４０２頁（１９５３年）に掲載のカッツ(Katz)等の論文、Org.
Synthesis、第１１巻、第５８０頁に掲載のアレン・シーエフエイチ(Allen CFH
)及びマッケイ(McKay)の論文、Ogr. Synthesis、第ＩＶ巻、第２９５頁、J. Med
Chem.、第２８巻、第１７７２−１７７９頁（１９８５年）に掲載のオカチ(Oka
chi)等の論文、J.Med.Chem.、第２９巻、第７４３−７５１頁（１９９４年）に
掲載のカーメリン(Carmelin)等の論文、Am.Soc.、第７４巻、第４８頁（１９５
２年）に掲載のターベル(Tarbell)の論文、Org.React.、第５巻、第１９３−２
２８頁（１９４９年）に掲載の論文〕。

【０２３０】 ５−クロロチオサリチル酸及び４−クロロチオサリチル酸の合成 結晶の硫化ナトリウム（３９ｇ、０．１７モル）と粉末の硫黄（５．１ｇ）を
、４３．５ｃｃの沸騰水中で加熱し、攪拌することにより溶解した。次に、１５
ｃｃの水に４０ｇの水酸化ナトリウムを入れてつくった溶液を加え、混合物を、
最初は冷水で、次に、氷と塩の凍結混合物により徐々に冷却した。水７５ｃｃ、
５−クロロアントラニル酸または４−クロロアントラニル酸２５ｇ（０．１５モ
ル）、及び濃縮塩化水素酸３０ｃｃを、凍結混合物により０℃に設定した別のビ
ーカに加えた。混合物を攪拌し、約６℃に冷却した。一方、亜硝酸ナトリウム１
０．３５ｇ（０．１５モル）を、４２ｃｃの熱水に溶解し、溶液を氷上で冷却し
た。温度が５℃に低下したとき、亜硝酸溶液を、分液漏斗を介してアントラニル
酸溶液に流し込んだ。砕いた氷約７５ｇを、温度を５℃未満に保持するように加
えた。次に、ジアゾ溶液を、（２−４℃の温度に保持された）アルカリ硫化物溶
液に、氷１５０ｇとともに加え、温度を５℃未満に保持した。混合物を、室温に
加温し、窒素の発生が止まったときに（約２時間）、濃縮塩化水素酸（２７ｃｃ
）を、溶液がコンゴーレッド試験紙で酸性になるまで加えた。ジスルフィドの沈
殿をろ過し、水で洗浄した。

【０２３１】 過剰の硫黄を除去するため、水３００ｃｃに９ｇの無水炭酸ナトリウムを入れ
てつくった溶液を用いて沸騰することにより溶解し、混合物を、熱い状態でろ過
した。次に、溶液を塩化水素酸で酸性にし、沈殿をろ過し、ケークを吸引により
乾燥した。ケークを、トルエンを添加し、次いで、共沸蒸発により更に乾燥させ
た。手順を２回繰り返した。ケークを、亜鉛末４．０５ｇ及び氷酢酸４５ｃｃと
混合し、混合物を一晩還流させた。混合物を冷却し、吸引によりろ過した。フィ
ルタケークを水で１回洗浄し、１５０ｃｃのビーカに移した。ケークを水３０ｃ
ｃに懸濁させ、懸濁体を加熱して沸騰させた。高温溶液を、３３％水酸化ナトリ
ウム溶液約６ｃｃを加えることにより強アルカリ性にした。アルカリ溶液を約２
０分間沸騰させ、不溶物質をフィルタ処理した。次に、生成物を、濃縮塩化水素
酸を添加することにより沈殿させ、溶液をコンゴーレッド試験紙で酸性にした。
生成物をろ過し、水で１回洗浄し、１００−１３０℃の炉で乾燥させた（５−ク
ロロチオサリチル酸、融点１６２℃）。

【０２３２】 ５−フルオロチオサリチル酸の合成 結晶の硫化ナトリウム（１．８ｇ、０．０１モル）と粉末の硫黄（０．２４ｇ
）を、２ｃｃの沸騰水中で加熱し、攪拌することにより溶解した。次に、１ｃｃ
の水に０．３ｇの水酸化ナトリウムを入れてつくった溶液を加え、混合物を、上
記のようにして、徐々に冷却した。水４ｃｃ、５−フルオロアントラニル酸１ｇ
（０．００７モル）及び濃縮塩化水素酸１．４ｃｃを、凍結混合物により０℃に
設定した別のビーカに加えた。混合物を攪拌し、約６℃に冷却した。一方、亜硝
酸ナトリウム０．４８ｇ（０．００７モル）を、２ｃｃの熱水に溶解し、溶液を
氷上で冷却した。温度が５℃に低下したとき、亜硝酸溶液を、分液漏斗を介して
アントラニル酸溶液に流し込んだ。砕いた氷約３．５ｇを、温度を５℃未満に保
持するように加えた。次に、ジアゾ溶液を、（２−４℃の温度に保持された）ア
ルカリ硫化物溶液に、氷１０ｇとともに加え、温度を５℃未満に保持した。混合
物を、室温に加温し、窒素の発生が止まったときに（約２時間）、濃縮塩化水素
酸（〜１．５ｃｃ）を、溶液がコンゴーレッド試験紙で酸性になるまで加えた。
ジスルフィドの沈殿をろ過し、水で洗浄した。過剰の硫黄を除去するため、水１
５ｃｃに０．５ｇの無水炭酸ナトリウムを入れてつくった溶液を用いて沸騰する
ことにより溶解し、混合物を、熱い状態でろ過した。次に、溶液を塩化水素酸で
酸性にし、沈殿をろ過し、ケークを吸引により乾燥した。ケークを、トルエンを
添加し、次いで、共沸蒸発により更に乾燥させた。この手順を２回繰り返した。
ケークを、亜鉛末０．２ｇ及び氷酢酸２ｃｃと混合し、混合物を一晩還流させた
。混合物を冷却し、吸引によりろ過した。フィルタケークを水で１回洗浄し、１
０ｃｃのビーカに移した。ケークを水２ｃｃに懸濁させ、懸濁体を加熱して沸騰
させた。高温溶液を、３３％水酸化ナトリウム溶液約０．３ｃｃを加えることに
より強アルカリ性にした。アルカリ溶液を約２０分間沸騰させ、不溶物質をフィ
ルタ処理した。次に、生成物を、濃縮塩化水素酸を添加することにより沈殿させ
、溶液をコンゴーレッド試験紙で酸性にした。生成物を吸引ろ過し、水で１回洗
浄し、１００−１３０℃の炉で乾燥させた。融点は、１８５℃であった。

【０２３３】 ５−クロロ−ＦＴＳの合成 ５−クロロ−チオサリチル酸（１．９ｇ、１２ミリモル）、炭酸グァニジン（
２．６ｇ、１４．０ミリモル）及びトランス、トランス−ファルネシルブロミド
（３．４ｇ、１２ミリモル）をアセトン１５０ｍｌにおいて、一晩、室温で混合
した。アセトンを蒸発させてから、クロロホルムを２ＮのＨＣｌ数滴とともに加
えた。混合物を水で洗浄し、有機相を分離し、硫酸マグネシウム上で乾燥し、次
いで、蒸発させた。黄色がかった粉末を得た。生成物の５−Ｃｌ−ＦＴＳを、ア
セトン及びクロロホルムと酢酸エチルとの混合物を溶離剤として用いてシリカゲ
ルの上で精製した（収率１３％）。５−ＣＬ−ＦＴＳ：ＩＵＰＡＣ（純正応用化
学国際連合）の名称：５−クロロ−２−（３,７,１１−トリメチル−ドデカ−２
，６，１０−トリエニルスルファニル）安息香酸。

【０２３４】 外観：淡黄色オイル、ＴＬＣ（シリカゲル、クロロホルム酢酸エチル１：１）
Ｒｆ＝０．７０、ＨＲＭＳｍ／ｅ３９４，３９２［Ｍ＋］（Ｃ_２２Ｈ_２９Ｏ_３Ｓ
Ｃｌ）；^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３，ＴＭＳ）δ１．６（ｂｓ，９Ｈ）、１．６
５（ｓ，３Ｈ）２．１（ｍ，８Ｈ）３．６（ｄ、２Ｈ）、５．１（ｍ，２Ｈ）、
５．３（ｂｔ，１Ｈ）、７．２（ｍ，１Ｈ，アロム(Arom)）、７．４（ｍ、１Ｈ
、アロム）、７．９（ｍ，１Ｈ,アロム）ｐｐｍ。

【０２３５】 ４−クロロ−ＦＴＳの合成 ４−クロロ−チオサリチル酸（０．９ｇ、５ミリモル）、炭酸グァニジン（１
．３ｇ、７ミリモル）及びトランス、トランス−ファルネシルブロミド（１．４
ｇ、５ミリモル）をアセトン７５ｍｌにおいて、一晩、室温で混合した。アセト
ンを蒸発させてから、クロロホルムを２ＮのＨＣｌ数滴とともに加えた。混合物
を水で洗浄し、有機相を分離し、硫酸マグネシウム上で乾燥し、次いで、蒸発さ
せた。黄色がかった粉末を得た。生成物の４−Ｃｌ−ＦＴＳを、クロロホルムと
ヘキサンの混合物（１００％クロロホルムに対して１９：１）を溶離剤として用
いてシリカゲルの上で精製した（収率１７．８％）。４−ＣＬ−ＦＴＳ：ＩＵＰ
ＡＣの名称：４−クロロ−２−（３,７,１１−トリメチル−ドデカ−２，６，１
０−トリエニルスルファニル）安息香酸。

【０２３６】 外観：黄色のオイル、ＴＬＣ（シリカゲル、クロロホルム酢酸エチル１：１）
Ｒｆ＝０．６６、ＨＲＭＳｍ／ｅ３９４，３９２［Ｍ＋］（Ｃ_２２Ｈ_２９Ｏ_３Ｓ
Ｃｌ）；^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３，ＴＭＳ）δ１．６（ｓ，６Ｈ）、１．７４
（ｄ，６Ｈ）２．１（ｍ，８Ｈ）３．６（ｄ、２Ｈ）、５．１（ｂｔ，２Ｈ）、
５．３（ｂｔ，１Ｈ）、７．１６（ｍ，１Ｈ，アロム）、７．２９（ｍ、１Ｈ、
アロム）、８．０６（ｍ，１Ｈ,アロム）ｐｐｍ。

【０２３７】 ５−フルオロ−ＦＴＳの合成 ５−フルオロ−チオサリチル酸（０．３１ｇ、２ミリモル）、炭酸グァニジン
（０．４６ｇ、２．４ミリモル）及びトランス、トランス−ファルネシルブロミ
ド（０．６１ｇ、２．１５ミリモル）をアセトン２５ｍｌにおいて、一晩、室温
で混合した。アセトンを蒸発させてから、クロロホルムを２ＮのＨＣｌ数滴とと
もに加えた。混合物を水で洗浄し、有機相を分離し、硫酸マグネシウム上で乾燥
し、次いで、蒸発させた。黄色の固体を得た。生成物の５−Ｆ−ＦＴＳを、クロ
ロホルムと酢酸エチルとの混合物（５：１−１：５）を溶離剤として用いてシリ
カゲルの上で精製した（収率１８％）。５−Ｆ−ＦＴＳ：ＩＵＰＡＣの名称：４
−フルオロ−２−（３,７,１１−トリメチル−ドデカ−２，６，１０−トリエニ
ルスルファニル）安息香酸。

【０２３８】 外観：黄色の固体、ＴＬＣ（シリカゲル、クロロホルム酢酸エチル１：１）Ｒ
ｆ＝０．７１、ＨＲＭＳｍ／ｅ３７６［Ｍ＋］（Ｃ_２２Ｈ_２９Ｏ_３ＳＣｌ）；^１ Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）δ１．６（ｓ，６Ｈ）、１．７（ｓ，６Ｈ）２．１（
ｍ，８Ｈ）、３．６（ｄ、２Ｈ）、５．１（ｍ，２Ｈ）、５．３（ｂｔ，１Ｈ）
、７．３（ｍ，１Ｈ，アロム）、７．４３（ｍ、１Ｈ、アロム）、８．１（ｍ，
１Ｈ,アロム）ｐｐｍ。

【０２３９】 Ｓ−ファルネシル−メチルチオサリチル酸（ＦＭＴＳ）の合成 メチルチオサリチル酸（０．３ｇ、１．７６ミリモル）、炭酸グァニジン（０
．３８ｇ、２．０ミリモル）及びトランス、トランス−ファルネシルブロミド（
０．５ｇ、１．７６ミリモル）をアセトン２２ｍｌにおいて、一晩、室温で混合
した。アセトンを蒸発させてから、ヘキサンを加え、沈殿物を吸引ろ過した。Ｆ
ＭＴＳ：ＩＵＰＡＣの名称：メチル−２−（３,７,１１−トリメチル−ドデカ−
２，６，１０−トリエニルスルファニル）安息香酸。

【０２４０】 外観：黄褐色のペースト、ＴＬＣ（シリカゲル、クロロホルムペンタン１：１
）Ｒｆ＝０．７１、ＨＲＭＳｍ／ｅ３７２［Ｍ＋］（Ｃ_２３Ｈ_３２Ｏ_２Ｓ）；^１ Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）δ１．６（ｓ，６Ｈ）、１．６５（ｄ，６Ｈ）２．１
（ｍ，８Ｈ）、３．４７（ｓ、３Ｈ）、３．６（ｄ，２Ｈ）、５．１（ｂｔ，２
Ｈ）、５．３５（ｂｔ，１Ｈ）、７．２（ｍ，１Ｈ，アロム）、７．３５（ｍ、
１Ｈ、アロム）、７．４５（ｍ,１Ｈ，アロム）、８．１５（ｍ，１Ｈ,アロム）
ｐｐｍ。

【０２４１】 （産業上の利用可能性） 本発明は、所望しない細胞の増殖に関連する非悪性疾患、障害その他の病理学
的状態の処置に適用することができる。

【０２４２】 本明細書において引用されている全ての特許及び非特許刊行物は、当業者の技
術レベルを示すものである。本明細書においては、これら全ての刊行物を引用し
てその説明に代える。

【０２４３】 上記した本発明の種々の修正は、当業者に明らかである。かかる修正は、本発
明の範囲に含まれるものである。

【図面の簡単な説明】

【図１】 日グループ当たりの平均臨床スコアに基づいてＦＴＳにより処置された急性Ｅ
ＡＥの臨床経過を示すグラフ図であり、疾患の重度が０乃至６のスケールに従っ
て等級づけがされている。

【図２】 日グループ当たりの平均臨床スコアに基づいてＦＴＳによる慢性再発性ＥＡＥ
の臨床経過を示すグラフ図であり、ＥＡＥの重度が０−６のスケールに従って等
級づけがされており、平均臨床評点が日グループごとにされている。

【図３】 ０、１０及び５０μＭのＦＴＳ（＋ＳＥ）の存在下におけるＬＰＳとＣｏｎＡ
に対する刺激表示に基づいてインビトロ脾細胞増殖の抑制を示す棒グラフである
。

【図４Ａ】 ＦＴＳを用いて１０日間（ＦＴＳ＋１０）もしくは２８日間（ＦＴＳ＋２８）
処理し、または偽性キャリヤ（対照）で処理したＥＡＮラットにおける回転バー
（ロタロッド(rotarod)）に関する臨床スコアを示すグラフである。

【図４Ｂ】 ＦＴＳを用いて１０日間（ＦＴＳ＋１０）もしくは２８日間（ＦＴＳ＋２８）
処理し、または偽性キャリヤ（対照）で処理したＥＡＮラットにおける回転バー
（ロタロッド）に関する平均時間を示すグラフである。

【図５】 １０日及び２０日間ＦＴＳと反応させたＥＡＮラット及び通常の（未実験の(n
aive)）ラットの尾細胞の近位刺激及び遠位刺激による尾筋において引き起こさ
れる平均（＋ＳＥ）複合筋活動ポテンシャルを示す棒グラフである。

【図６】 ０−１５日、０−３日または１０−２０日からＦＴＳで処理し、生理食塩水（
対照）で処理し、またはアジュバントで免疫処理されたラットのグループ（ｎ＝
１０）におけるＥＡＮの接種後の指示されている日にちにおける平均（＋ＳＥ）
臨床スコアを示すグラフ図である。

【図７】 ３Ｈ−ＴｄＲ摂取により三重反復で測定され、平均±ＳＥとして与えられてい
る０、１０（ＦＴＳ１０）及び５０（ＦＴＳ）μＭｆｔｓの存在下でＬＰＳ及び
ＣｏｎＡに対する刺激指数を測定することにより、正常のマウスのインビトロ脾
細胞増殖のＦＴＳによるＭＲＬ／ｌｐｒマウスのＦＴＳ抑制を示す棒グラフ図で
あり、ミトゲンなしに培養された細胞におけるｄｐｍの平均値は１１９２±２３
９であった。

【図８Ａ】 ＬＰＳ、ＣｏｎＡまたはベータ２−ＧＰＩに応答して平均（±ＳＥ）刺激指数
を測定することによりＭＲＬ／ｌｐｒマウス脾臓リンパ球の増殖のＦＴＳによる
エキスビボ抑制を示す棒グラフ図であり、ミトゲン／抗原なしに培養された細胞
におけるｄｐｍの平均値は、生理食塩水処理のＭＲＬ／ｌｐｒグループ（密にハ
ッチングが入った棒）に関しては３１４６±８９１であり、ＦＴＳ処理のＭＲＬ
／ｌｐｒグループ（充填された棒）に関しては５３２１±１１０６であった。

【図８Ｂ】 ＬＰＳ、ＣｏｎＡまたはベータ２−ＧＰＩに応答して平均（±ＳＥ）刺激指数
を測定することにより、ＭＲＬ／＋＋マウス脾臓リンパ球の増殖のＦＴＳによる
エキスビボ抑制を示す棒グラフ図であり、ミトゲン／抗原なしに培養された細胞
におけるｄｐｍの平均値は、生理食塩水処理のＭＲＬ／＋＋グループ（粗にハッ
チングが入った棒）については５８６３±１３８２であり、ＦＴＳ処理のＭＲＬ
／＋＋グループ（空の棒）については９０９２±１６７８であった。

【図９】 ＦＴＳ処理及び生理食塩水処理した１６週齢のＭＲＬ／ｌｐｒ及びＭＲＬ／＋
＋マウスの血清における自己抗体を示す棒グラフであり、自己抗体のレベルは標
準誤差を有する平均平均吸光殿値として表されており、血清（β２−ＧＰＩ）依
存ａＣＬ抗体（抗β２−ＧＰＩ）、血清独立ａＣＬ抗体（抗ＣＬ）、抗ｓｓＤＮ
Ａ及び抗ｄｓＤＮＡ抗体のレベルは、生理食塩水処理（粗にハッチングが入った
棒）とＦＴＳ処理（空の棒）のＭＲＬ／＋＋マウスと比較してＭＲＬ／ｌｐｒま
うす（密にハッチングが入った棒）において測定した。

【図１０Ａ】 ＭＲＬ／ｌｐｒマウスにおけるＦＴＳ処理による一般化されたリンパ節炎の減
衰を示すグラフ図であり、腋部と鼠径部のリンパ節の触診により及び切除により
アデノパシが測定され、値は、生理食塩水処理（円）マウスにおけるｎ＝１６マ
ウス及びＦＴＳ処理（方形）ＭＲＬ／ｌｐｒにおけるｎ＝１７マウスの平均であ
る。

【図１０Ｂ】 ＭＲＬ／ｌｐｒマウスにおけるＦＴＳ処理による一般化されたリンパ節炎の減
衰を示すグラフ図であり、１８週齢において秤量することによりアデノパシが測
定されている。

【図１１】 表示されている週のＦＴＳ処理及び生理食塩水処理のＭＲＬ／ｌｐｒ及びＭＲ
Ｌ／＋＋マウスの尿において測定されたタンパク尿（平均±ＳＥ）を示す棒グラ
フ図であり、生理食塩水処理のＭＲＬ／ｌｐｒマウス（密にハッチングが入った
棒）はＦＴＳ処理のＭＲＬ／ｌｐｒマウス（充填された棒グラフ）、ＭＲＬ／＋
＋マウス（粗にハッチングが入った棒）及び生理食塩水処理のＭＲＬ／＋＋マウ
ス（空の棒）マウスにおいて検出された微量のタンパク質と比較して、有意のタ
ンパク尿を示した。

【図１２Ａ】 生理食塩水処理されたＭＲＬ／ｌｐｒマウス、ＦＴＳ処理されたＭＲＬ／ｌｐ
ｒマウス、生理食塩水処理のＭＲＬ／＋＋マウス及びＦＴＳ処理されたＭＲＬ／
＋＋マウスにおけるグリップ強度を示すグラフ図であり、１２−１７週齢の生理
食塩水処理された（丸）ＭＲＬ／ｌｐｒマウス（丸）とＦＴＳ処理のＭＲＬ／ｌ
ｐｒマウス（方形）の性能の平均±ＳＥ値を示す。

【図１２Ｂ】 生理食塩水処理されたＭＲＬ／ｌｐｒマウス、ＦＴＳ処理されたＭＲＬ／ｌｐ
ｒマウス、生理食塩水処理のＭＲＬ／＋＋マウス及びＦＴＳ処理されたＭＲＬ／
＋＋マウスにおけるグリップ強度を示すグラフ図であり、１５−１７週齢の４つ
のグループ（ＭＲＬ／ｌｐｒマウス（ｎ＝２５）、ＦＴＳ処理のＭＲＬ／ｌｐｒ
マウス（ｎ＝２５）、生理食塩水処理のＭＲＬ／＋＋マウス（ｎ＝２０）及びＦ
ＴＳ処理のＭＲＬ／＋＋マウス（ｎ＝１５））の性能の平均±ＳＥ値を示す。

【図１３Ａ】 ２０分間におけるＭＲＬ／ｌｐｒマウス（生理食塩水及びＦＴＳ処理）と生理
食塩水処理ＭＲＬ／＋＋マウスのオープンフィールドでの性能を示すグラフ図で
あり、カバーされた全距離を示す。

【図１３Ｂ】 ２０分間におけるＭＲＬ／ｌｐｒマウス（生理食塩水及びＦＴＳ処理）と生理
食塩水処理ＭＲＬ／＋＋マウスのオープンフィールドでの性能を示すグラフ図で
あり、各グループの５匹のマウスに関する平均ＳＥ値値として測定された３つの
グループのオープンフィールドの中心で費やされた時間を示す。

【図１４】 ４０５ｎｍにおける吸光度として測定された、ＦＴＳで処理された１４匹のＭ
ＲＬ／ｌｐｒマウスと１４の対照における種々の自己抗体のレベルを示す棒グラ
フ図であり、標準誤差の棒は標準偏差を示す。

【図１５】 表示された年齢の、ビヒクルだけで処理され及びＦＴＳ（ＦＴＳ）で処理され
たＭＲＬ／＋＋（ｍｒｌ＋＋）及びＭＲＬ／ｌｐｒ（ｌｐｒ）マウス（グループ
当たり１０匹）からの尿の平均＋ＳＥレベルを示す棒グラフである。

【図１６】 ラットのチアセトアミド誘起肝硬変における肝ヒドロキシプロリンに及ぼすＦ
ＴＳの影響を示す棒グラフであり、ヒドロキシプロリンは、ｍｇ／ｇタンパク質
で表され、平均±ＳＤで、各グループにおいてｎ＝６であり、ＴＡＡと比較して
ｐ＜０．０１である。

【図１７】 ＯＤパーセント／対照として表されるウエスタンブロット分析により測定され
た定量Ｒａｓ発現を示す棒グラフである。

【図１８Ａ】 ＦＴＳ処理のラットにおいて測定された、外部弾性薄膜領域に対する新内膜の
関係をリモデリングの測定値として示すグラフ図である。

【図１８Ｂ】 対照処理のラットにおいて測定された、外部弾性薄膜領域に対する新内膜の関
係をリモデリングの測定値として示すグラフ図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 1/16 Ａ６１Ｐ 1/16 25/00 １０１ 25/00 １０１ 37/00 37/00 // Ｃ０７Ｄ 213/70 Ｃ０７Ｄ 213/70 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ， ＺＡ，ＺＷ (71)出願人 ラモット・ユニバーシティ・オーソリテ ィ・フォー・アプライド・リサーチ・アン ド・インダストリアル・ディベロップメン ト・リミテッド ＲＡＭＯＴ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＡＵ ＴＨＯＲＩＴＹ ＦＯＲ ＡＰＰＬＩＥＤ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＆ ＩＮＤＵＳＴＲ ＩＡＬ ＤＥＶＥＬＯＰＭＥＮＴ ＬＴ Ｄ． イスラエル61392テル・アビブ、ピー・オ ー・ボックス39296、ハイム・レバノン・ ストリート32番 (72)発明者 クルーグ，ヨエル イスラエル国ヘルスリヤ，ノルドヴ・スト リート・17 (72)発明者 ブラウンスタイン，マイクル アメリカ合衆国20852メリーランド州ロッ クヴィル，オールド・ファーム・ロード・ 6515 (72)発明者 チャプマン，ジョアブ イスラエル国キルヤト・オノ・5520，ゴー ドン・ストリート・15 (72)発明者 ブルック，ラファエル イスラエル国75675リション・レ−シオン， ヤミット・ストリート・55 (72)発明者 レイフ，シモン イスラエル国44855カーニィ・ショムロン， エリアシヴ・ストリート・５ Ｆターム(参考） 4C055 AA01 BA02 BA33 CA02 CA47 DA01 4C084 AA17 ZA02 ZA75 ZB07 ZC42 4C086 AA01 AA02 BC17 MA01 NA14 ZA02 ZA75 ZB07 ZC42 4C206 AA01 AA02 DA17 DB15 MA01 NA14 ZA02 ZA75 ZB07 ZC42

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】非悪性疾患または病的状態に関連する細胞のＲａｓ誘発増殖を
   抑制する方法であって、増殖を抑制するのに有効な量のＲａｓアンタゴニストを
   患者に投与することを特徴とする方法。
2. 【請求項２】患者はＴ細胞の増殖に特徴がある自己免疫疾患に罹っているこ
   とを特徴とする請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】自己免疫疾患は全身性狼瘡紅斑であることを特徴とする請求項
   ２に記載の方法。
4. 【請求項４】自己免疫疾患は多発性硬化症であることを特徴とする請求項２
   に記載の方法。
5. 【請求項５】自己免疫疾患は二次抗リン脂質症候群であることを特徴とする
   請求項２に記載の方法。
6. 【請求項６】患者は肝硬変に罹っていることを特徴とする請求項１に記載の
   方法。
7. 【請求項７】前記Ｒａｓアンタゴニストは下記の式で表され、 【化１】 上記式において、 Ｒ^１はファルネシル、ゲラニルまたはゲラニル−ゲラニルを表し、 ＺはＣ−Ｒ^６またはＮを表し、 Ｒ^２はＨ、ＣＮ、ＣＯＯＲ^７基、ＳＯ_３Ｒ^７基、ＣＯＮＲ^７Ｒ^８基、ＣＯＯＭ
   基、ＳＯ_３Ｍ基またはＳＯ_２ＮＲ^７Ｒ^８基であり、 Ｒ^７及びＲ^８はそれぞれ独立して水素、アルキルまたはアルケニルであり、Ｍ
   はカチオンであり、 Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５及びＲ^６は、それぞれ独立して水素、カルボキシル、アルキ
   ル、アルケニル、アミノアルキル、ニトロアルキル、ニトロ、ハロ、アミノ、モ
   ノ−もしくはジ−アルキルアミノ、メルカプト、メルカプトアルキル、アキシド
   またはチオシアナートであり、 ＸはＯ、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ_２、ＮＨまたはＳｅを表し、 ＺがＮであるときに前記式の化合物の第四アンモニウム塩及びＮ酸化物である
   ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
8. 【請求項８】前記Ｒａｓアンタゴニストはファルネシルチオサリチル酸（Ｆ
   ＴＳ）であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
9. 【請求項９】Ｒａｓアンタゴニストは２−クロロ−５−ファルネシルアミノ
   安息香酸（ＮＦＣＢ）であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
10. 【請求項１０】Ｒａｓアンタゴニストはファルネシルチオニコアチン酸（Ｎ
    ＦＣＢ）であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
11. 【請求項１１】Ｒａｓアンタゴニストは５−フルオロ−ＦＴＳであることを
    特徴とする請求項１に記載の方法。
12. 【請求項１２】Ｒａｓアンタゴニストは５−クロロ−ＦＴＳであることを特
    徴とする請求項１に記載の方法。
13. 【請求項１３】Ｒａｓアンタゴニストは４−クロロ−ＦＴＳであることを特
    徴とする請求項１に記載の方法。
14. 【請求項１４】ＲａｓアンタゴニストはＳ−ファルネシルメチルチオサリチ
    ル酸であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
15. 【請求項１５】前記Ｒａｓアンタゴニストは非経口投与されることを特徴と
    する請求項１に記載の方法。
16. 【請求項１６】前記Ｒａｓアンタゴニストは経口投与されることを特徴とす
    る請求項１に記載の方法。
17. 【請求項１７】非悪性疾患または病的状態に関連する細胞のＲａｓ誘発増殖
    を抑制する方法であって、細胞を増殖を抑制するのに有効な量のＲａｓアンタゴ
    ニストと接触させる工程を備えることを特徴とする方法。