JP2003500080A - 設計された結合能を有するｓｈ３ドメインを製造するための方法および材料 - Google Patents

設計された結合能を有するｓｈ３ドメインを製造するための方法および材料

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サクセラ，カッレ
ヒーパッカ，マリタ
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リセンチア エルテーデー
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、Ｓｒｃホモロジー領域（ＳＨ３）の制御された修飾方法であって、ＳＨ３ ＲＴループの非保存性の領域をランダムな配列に置換することを包含する方法に関する。従って、本発明は、設計された結合能を有するＳＨ３ドメインを製造するための方法および材料、並びにそのようなＳＨ３ドメインの研究、治療、検査および薬の開発における用途に関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】技術分野 正常および異常な状態において重要な生物学的作用の多くはＳｒｃホモロジー
領域３（Src homology region 3、ＳＨ３）を介した細胞タンパク質の相互作用
の支配下にある。本願明細書の開示は、設計された結合能を有するＳＨ３ドメイ
ンを製造するための方法および材料、並びにそのようなＳＨ３ドメインの研究、
治療、検査および医薬の開発における用途に関する。
【０００２】従来技術 実質上、全ての細胞の挙動、例えば細胞外刺激に対して応答した細胞がその遺
伝子発現のパターンを変化させて刺激に順応することは細胞タンパク質の動態的
かつ規則正しい近接関係によって制御および実行されている。進化の過程におい
て、上記のような制御された特異的なタンパク質−タンパク質相互作用を仲介す
るように分化したタンパク質のドメインが何種類も発生した。ある種のタンパク
質ドメインは、相同性を有するが充分に多様なメンバーからなる特有の大きなフ
ァミリーを構成し、それぞれのメンバーが有する特異的リガンド結合能は重複す
る場合も多いが、特徴的な結合能を有している。
【０００３】 ＳＨ３ドメインは、発ガン性のレトロウイルスおよびそれに対応する細胞性ガ
ン原遺伝子によってコードされているＳｒｃファミリーチロシンキナーゼの間で
ホモロジーを示す領域として初めは同定されたものである。以後、ＳＨ３ドメイ
ンは、細胞生長の制御や分化などの機構において重要な役割を担う多数の（５０
種を越える）タンパク質に見出された。このような機能を有することから、ＳＨ
３ドメインは種々の疾患、特にガンの病原体と密接な関係にある。更に、種々の
病原性微生物、例えばＨＩＶはＳＨ３を介したプロセスをそのライフサイクルの
中に活用している。ＳＨ３ドメインを介したタンパク質複合体の形成に影響を与
える能力は、治療法として顕著な可能性を有している。
【０００４】 ＳＨ３ドメインは球状のタンパク質モジュールであり、典型的なものは種々の
異なるタンパク質、特に細胞情報伝達に関与するタンパク質に見られる５０〜７
０アミノ酸からなる（Cohen et al. 1995. Cell, 80, 237-248; Dalgarno et al
. 1997. Biopolymers, 43, 383-400）。ＳＨ３ドメインはポリプロリンII型（Ｐ
ＰII）へリックスと呼ばれる二次構造をとる領域を含んだリガンドと結合するこ
とによって、分子内相互作用および分子間相互作用を仲介する。これらのリガン
ドは２つの反対の配置でＳＨ３ドメインと結合することが可能で、典型的なもの
はコンセンサス配列ＲＸ０ＰＸＸＰとＰＸ０ＰＸＲ（０は疎水性のアミノ酸、Ｘ
は任意のアミノ酸）である“ＰｘｘＰモチーフ”を有している（Feng et al. 19
94. Science, 266, 1241-7; Lim et al. 1994. Nature, 372, 375-9）。保存さ
れた塩基性アミノ酸（通常はアルギニン；Ｒ）のＰｘｘＰモチーフ内の位置によ
って、リガンドがどのような配置で対応するＳＨ３ドメインと結合するのかが決
定される。更に、例外的なＳＨ３のリガンドには、上記の保存性の高い規則に則
らないＰＰIIへリックスを有するものもある。注目すべき例としては、Ｓｒｃの
ＰＰII領域が挙げられる。このＰII領域はＳｒｃ自身のＳＨ３ドメインに結合し
て酵素活性の自己阻害に関与するが、そこにはＰｘｘＰモチーフと定義されるモ
チーフ内の２つのプロリンの内の１つしか存在しない（Xu et al. 1997. Nature
, 385, 595-602）。
【０００５】 ＰIIへリックス領域の配列の多様性は、コンセンサス領域にも、そこに隣接す
る非コンセンサスな領域にも見られ、ＳＨ３／リガンド複合体形成の特異性に影
響することが知られている。例外的なＰｘｘＰコンセンサスモチーフのターゲッ
トに対する優先性については、Ａｂ１ ＳＨ３リガンドの選択に関する研究（Fen
g et al. 1994. Science, 266, 1241-7; Weng et al. 1995. Mol Cell Biol, 15
, 5627-34）やＣｒｋＮ−ＳＨ３／Ｃ３Ｇペプチド複合体に関する研究（Knudsen
et al. 1995. EMBO J, 14, 2191-8; Wu et al. 1995. Structure, 3, 215-226
）によって例示されている。共通していないアミノ酸残基を含む、ＳＨ３リガン
ドのＰII領域の配列の多様性の与える影響については、種々のＳＨ３ドメインか
らなる化学合成されたランダムなペプチドまたはファージが展示するランダムな
ペプチドのライブラリーから選択した特徴的なターゲット配列を用いた実験によ
って最もよく説明することができる（Sparks et al. 1994. J Biol Chem, 269,
23853-6; Viguera et al. 1994. Biochemistry, 33, 10925-33; Yu et al. 1994
. Cell, 76, 933-45）。しかしながら、上記した特異性に関するデータにもかか
わらず、短いＰIIリガンドペプチドの最大ＳＨ３結合親和性は低く、異なるＳＨ
３ドメインに対する結合性の相対的な差も中庸である。
【０００６】 一方、ＰIIへリックスの作用領域外の分子接触がＳＨ３結合に著しい特異性お
よび強度を与えることを示すデータが増えている。ＰｘｘＰモチーフがランダム
な配列の中に埋め込まれている長いペプチドを展示するファージのライブラリー
を用いることによって、隣接する配列がこのようなリガンドに対する選択性を増
加させること、最大では種々のＳＨ３ドメインに対する親和性の間に２０〜３０
倍もの差が生じることが明らかとなった（Rickles et al. 1994. EMBO J, 13, 5
598-604; Rickles et al. 1995. Proc Natl Acad Sci USA, 92, 10909-13; Spar
ks et al. 1996. Proc Natl Acad Sci USA, 93, 1540-4）。Ｓｒｃ−ＳＨ３と上
記のような２０アミノ酸残基からなるペプチド２種との相互作用に関する構造分
析によって、このような相互作用の比較的高い特異性および親和性（ＫD値はそ
れぞれ０．５４μＭと１．２μＭ）はペプチド内の隣接するアミノ酸残基とＳｒ
ｃ−ＳＨ３ドメインの２つのループ状の構造との接触を伴うことが判明した。こ
の２つのループ状の構造は、種々のＳｒｃ−ＳＨ３ドメインにおいて高い多様性
を示す配列であり、それぞれｎ−ｓｒｃループとＲＴループと呼ばれている（Fe
ng et al. 1995. Proc Natl Acad Sci USA, 92, 12408-15）。同様に、合理的に
設計したプロリンに富んだリガンドとＡｂ１ ＳＨ３との特異的結合（Ａｂ１の
ＫD値が０．４μＭであるのに対し、Ｆｙｎ−ＳＨ３のＫD値は２７３μＭ）も、
Ａｂ１ ＳＨ３における対応する分子接触によって説明することができる（Pisab
arro and Serrano. 1996. Biochemistry, 35, 10634-40; Pisabarro et al. 199
8. J Mol Biol, 281, 513-521）。
【０００７】 ＳＨ３結合特異性の基礎を解明するのに有益であり、かつＲＴループの役割を
強調する他の相互作用として、ＨＩＶ−１ ＮｅｆとチロシンキナーゼＨｃｋの
ＳＨ３ドメインとの相互作用が挙げられる。Ｎｅｆは霊長類のレンチウイルス（
ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２およびＳＩＶ）に由来する２７〜３４ｋＤのミリストロ
イル化されたタンパク質であり、感染した宿主における高ウイルス血症や免疫不
全の発症に重要なタンパク質である（Harris. 1996. J. Gen Viol, 77, 2379-92
; Saksela. 1997. Front Biosci, 2, 606-618）。興味深いことに、Ｎｅｆは著
しく選択的なＳＨ３結合特性を有する。ＮｅｆはＨｃｋ−ＳＨ３と強く結合し、
表面プラスモン共鳴によって測定した親和性はＫD値が約０．２μＭである（Lee
et al. 1995. EMBO J, 14, 5006-15）。Ｈｃｋに対する強い結合に反し、Ｎｅ
ｆとＦｙｎのＳＨ３ドメイン（ＨｃｋのＳＨ３との高いホモロジーを有する）と
の親和性は約１００倍も低い。生化学的および構造的な研究によって、選択性の
基礎は、Ｈｃｋに特徴的なＳＨ３の非保存性の残基、特にＨｃｋ−ＳＨ３のＲＴ
ループ内のイソロイシンの側鎖をＮｅｆが効率よく認識することにあると判明し
た（Lee et al. Cell, 85, 931-942）。Ｈｃｋ−ＳＨ３のＲＴループをリガンド
に適応させるための領域は複数の非連続的なＮｅｆポリペプチドの部分からなり
、Ｎｅｆの三次元構造においては、ＰII領域から離れた場所に存在する。
【０００８】 自然界で生じるＳＨ３との相互作用に競合することができる分子を作製する以
前の試みにおいては、ＰIIリガンドとそれに対応するＳＨ３ドメインとの結合に
競合することができるペプチドまたはペプチド様分子のランダムなライブラリー
から分子を設計するかまたは選択していた。複数のグループによってこのような
試みの成功例が報告されている（上記の参考文献を参照）。この試みを応用した
方法については特許出願もされている（例えばＷＯ ９５／２４４１９とＷＯ ９
６／０３６４９）。しかし、ＳＨ３／ＰＰIIの作用領域は種々のＳＨ３／リガン
ドペアの作用領域と比較的類似しているため、高い特異性を有する阻害分子を作
製するためには問題となる。この問題を克服するために、上記とは異なる方法を
用いた。具体的には、数々の研究によって示されてきたＳＨ３ドメイン内ＲＴル
ープによるリガンドの選択にかかわる見かけ上の役割、特にＨＩＶのＮｅｆタン
パク質と細胞性ＨｃｋチロシンキナーゼのＳＨ３ドメインとの複合体に関する我
々の以前の研究に基く方法を実施した。
【０００９】 上記の研究は、ＳＨ３リガンドのＰIIへリックス外領域がＳＨ３ドメイン間で
多様な領域（特にＲＴループの残基）と接触することで結合の特異性および親和
性を提供するという一般的なモデルを示している。この考えに基き、本発明にお
いては、Ｈｃｋより誘導した人工ＳＨ３ドメインであって、ＲＴループ内のＨｃ
ｋ特異的な非保存性の６アミノ酸をランダムな６アミノ酸残基からなるペプチド
（ＲＲＴ−ＳＨ３（randomized RT-loop）と命名した）で置換したものからなる
巨大なライブラリー（＞１億３０００万）を作製した。作製したライブラリーを
Ｍ１６バクテリオファージの表面に発現させ、設計された結合特性を有する新規
なＳＨ３ドメインを同定した。我々はファージディスプレー法が修飾したＳＨ３
ドメインの展示および選択に適していることを示し、ＳＨ３のＲＴループの担う
、特異性および親和性の決定因子としての広い役割に関する有利な実験的証拠を
提供する。
【００１０】 更に、以下に説明するように、ＲＴループの可変領域（本願においてはＨｃｋ
ＳＨ３ドメインの６アミノ酸残基）を包含するアミノ酸配列をランダムに作製
することによって、異なるリガンドタンパク質と自然界では考えられない高い親
和性および予め決めておいた特異性で結合する人工ＳＨ３ドメインを製造するこ
とも可能である。
【００１１】発明の概要 細かく特徴づけされているＨＩＶ−１ ＮｅｆとＨｃｋのＳＨ３ドメインとの
結合は、ＳＨ３を介する相互作用の中でも最も強いものとして知られている。我
々は以前に、ＲＴループ内にＨｃｋ様アミノ酸の置換を導入することで、Ｎｅｆ
に対するのと同様の結合能をＦｙｎ−ＳＨ３に転送することが可能であることを
示した。本発明は、天然の対応するＳＨ３ドメインの構造を真似る代りに、ラン
ダムなＲＴループ配列の調製と、親和性または機能を指標とする強力な選択方法
とを組合わせることで、所望のリガンド結合特性を有するＳＨ３ドメインを製造
することができるという知見に基くものである。注目すべきことに、本発明の開
示する方法は、すべての天然のＳＨ３ドメインに結合することが知られているタ
ンパク質に対して特異的且つ天然では考えられない高い親和性で結合するＳＨ３
ドメインのみならず、ＳＨ３ドメイン含有細胞内パートナーの同定されていない
、ＳＨ３リガンドと考えられるターゲットタンパク質と結合するＳＨ３ドメイン
の同定にも用いることもできる。
【００１２】 その結果、本発明は、設計された結合能を有するＳＨ３ドメインを作製するた
めの方法、並びに研究、治療、検査および医薬の開発に使用するための、本発明
の方法で得られた人工ＳＨ３ドメイン（ＲＲＴ−ＳＨ３ドメインと命名した）を
提供する。
【００１３】 以下、本発明を詳細に説明する。 本発明の基礎となる研究においては、複製連鎖反応（ＰＣＲ）を用いた突然変
異誘発を用い、ＲＲＴ−ＳＨ３と呼ばれる多種のＳＨ３ドメインからなる集合体
を作製した。ＲＲＴ−ＳＨ３は、Ｈｃｋ-ＳＨ３の全体構造を共有し、ＲＴルー
プの可変領域を構成する６アミノ酸残基がランダムなアミノ酸の組み合わせで置
換されている以外はＳＨ３ドメインと相同である。我々は組換えファージプラス
ミドの発現する約１億３０００万種のＲＲＴ−ＳＨ３ドメイン、即ち、２０種の
アミノ酸によって作製することのできる６アミノ酸残基からなるペプチドのすべ
ての組み合わせの数（２０6＝６４００万）を理論的には上回る数のドメインを
作製した。我々はファージディスプレー法として知られる方法がバクテリオファ
ージ粒子の表面に機能的なＳＨ３ドメインを発現させるのに適していることを見
出し、所望の結合性を有する希少なＲＲＴ−ＳＨ３ドメインを数十万の非結合性
分子から同定するための選択手段として用いた。今のところファージディスプレ
ー法はこのようなＲＲＴ−ＳＨ３ドメインを機能に基いて選択するための好まし
い方法であるが、本発明はこの方法に限定されるものではなく、他の方法も本発
明の目的を達成するために用いることができる。
【００１４】 本発明の方法の有用性を示す基本的なデータとして、ＨＩＶ-１ Ｎｅｆに強く
結合する（ＫD＝２５０ｎＭ）ことが知られている人工ＲＲＴ-ＳＨ３分子の骨格
となるＨｃｋ-ＳＨ３ドメインよりも、最大４０倍の高い親和性を有する個々の
ＲＲＴ-ＳＨ３の同定が可能であることを示した。このような優れた親和性は、
これらの分子が例え低濃度であってもＨｃｋ／Ｎｅｆ相互作用と効率的に競合可
能であることを意味し、これは容易に治療に応用できることを示している。注目
すべきことに、天然の未修飾のＨｃｋ-ＳＨ３には顕著な親和性を示さないＳＨ
３リガンドタンパク質に対して非常に高い親和性で結合するＲＲＴ-ＳＨ３分子
を、Ｈｃｋ誘導ライブラリーから同定することができた。そのようなＳＨ３リガ
ンドタンパク質の例として、野生型Ｈｃｋ−ＳＨ３ ＲＴループの調節を特異的
に妨げる突然変異によってＨｃｋ-ＳＨ３への結合能が阻害されたＮｅｆタンパ
ク質の変異体（ＮｅｆＲ９０）を用いた。これらの基本原理に関する研究は、本
発明の基本的な応用方法に関する詳細と共に下記の実施例１に示した。
【００１５】 本発明は、人工ＳＨ３ドメインに対するＳＨ３リガンドタンパク質を見出すた
めの一般的に有用な方法を提供する。我々の実験結果は、ある１つのＳＨ３ドメ
イン（ＨｃｋのＳＨ３）の基本骨格に含まれるＳＨ３ ＲＴループを変化させる
ことによって、全く異なる結合特性を有するＳＨ３ドメインが得られることを示
しているが、他のＳＨ３ドメインも本願記載の方法で修飾することにより同様に
変化させることが可能である。必要な場合には、すべてのＳＨ３リガンドタンパ
ク質に対して高い親和性を有するＳＨ３ドメインを作製することができる。また
、ＲＴループ領域を変化させることに基く結合特性の設計を、他のランダムな変
異または特定のＳＨ３ドメインの変異と共に用いることで、結合特性や他の物理
化学的特性（例えば、プロテアーゼ耐性や溶解性）を更に最適化する事ができる
。
【００１６】 公知のＳＨ３ターゲットタンパク質についてin vitroで個別に試験する代りに
、ＲＲＴ-ＳＨ３ライブラリーから目的の細胞内の現象（細胞増殖やプログラム
された細胞死など）に重要な役割を果たす未知のＳＨ３ターゲットタンパク質を
探索することもできる。この方法では、一般的に機能的クローニングとして知ら
れる方法において通常行なわれているように、ＲＲＴ-ＳＨ３ライブラリーを組
換えレトロウイルスなどのベクターを使って培養細胞に導入し、目的とした表現
型を持つ細胞を異なるＲＲＴ-ＳＨ３ドメインを発現している多数の細胞の中か
ら選択する。機能的クローニングとは、細胞誘導されたｃＤＮＡライブラリーを
ＲＲＴ-ＳＨ３ドメイン構成体の代わりに用いて細胞に誘導する方法である。変
化した細胞の表現型を誘導したＲＲＴ-ＳＨ３ドメインを単離し、単離したＲＲ
Ｔ−ＳＨ３ドメインは、in vitroでの親和性に基く選択によって発見されたＲＲ
Ｔ−ＳＨ３ドメインと同様に用いることができる。また、そのドメインに対応す
る特定のターゲットタンパク質（公知のＳＨ３ターゲットタンパク質、あるいは
初めに選択して変化させた目的の表現型との関りについては報告のない公知のタ
ンパク質）の同定に用いることができる。
【００１７】 本発明で開示する設計されたＳＨ３ドメインの貴重な応用方法をいくつも挙げ
ることができる。ＳＨ３ドメインを細胞に導入して発現させることで、ＳＨ３リ
ガンドタンパク質とその他のタンパク質との複合体の機能を活性化、阻害あるい
は制御または変化させることができる。もしＲＲＴ−ＳＨ３ドメインが適当な標
的シグナルを司るタンパク質の一部である場合には、このような方法によってタ
ーゲットタンパク質の細胞内における局在化に影響を与えることができる。更に
、ＲＲＴ−ＳＨ３ドメインとそのターゲット、例えばウイルスタンパク質、との
結合を細胞を含む系か含まない系において検出することで、感染性の微生物など
を検出するための検査方法を設計することもできる。
【００１８】 これらの知見から考えられる本発明の方法の最も明白な用途としては、ＳＨ３
を介した細胞機能に関する基礎研究であり、同様に遺伝子治療に有用であること
も明白である。ＳＨ３ドメインのサイズが比較的小さいことも、製造したＲＲＴ
−ＳＨ３タンパク質を膜透過性ペプチドに融合する方法や、その他の同様な方法
によって標的細胞に輸送することを可能にする。それ自体を治療用の薬剤として
用いる以外に、ＲＲＴ−ＳＨ３／リガンド複合体の構造を分析することもまた、
種々の疾病に関連した細胞タンパク質のＳＨ３結合領域を標的とした非ペプチド
性化合物の設計の助けとなる。従って、このようにしてＲＲＴ−ＳＨ３ドメイン
と類似した構造を有し、類似した結合特性を有する医薬の候補となる物質を作る
ことも可能である。最後に、ＲＲＴ−ＳＨ３がリガンドタンパク質のＳＨ３結合
面と強固に相互作用し、それゆえに同じ領域に結合するいかなる化合物とも競合
することは、機能的に重要な領域を検出するための合理的な医薬品検出のための
スクリーニングによって得られた分子を同定する上でも有用である。従って、Ｒ
ＲＴ−ＳＨ３を用いて、天然のＳＨ３ドメインとの間に生じる類似した相互作用
を阻害するための医薬を開発することができる。具体的には、医薬の標的とすべ
きターゲットタンパク質の分子領域をＲＲＴ−ＳＨ３を用いて認識する。
【００１９】 本発明において、ＲＲＴ−ＳＨ３ドメインを作製するために人工アミノ酸配列
で置換すべきＳＨ３の６アミノ酸残基は、ヒトｐ５９Ｈｃｋタンパク質（GenBan
k PID:2144421）の６９番から７４番（ＥＡＩＨＨＥ）に相当するアミノ酸残基
であり、これはＲＴループとして知られるＳＨ３構造の露出した部分を形成する
。ＳＨ３ドメインのこの領域のアミノ酸配列は多様化しているが、類似した残基
は他のＳＨ３ドメインのＲＴループにも存在する。他のＳＨ３ドメインにおいて
これらの類似したアミノ酸は、ＡＬＹＤＹコンセンサスモチーフと呼ばれる保存
されたアミノ酸配列の直後に続くポリペプチド鎖の中の６つの連続したアミノ酸
残基として特定することができ、この配列または関連した配列は事質的にすべて
のＳＨ３ドメインのアミノ酸配列において、配列の比較によって同定することが
できる。例えば、ヒトＮｃｋタンパク質（GenBank PID:88235）の３つのＳＨ３
ドメインにおいては、大部分のアミノ末端に見られる上記のアミノ酸残記はＶＡ
ＱＱＥＱであり、その位置は１４番〜１９番アミノ酸である。それに対してマウ
スＶａｖ１タンパク質（GenBank PID:6755955）のＳＨ３ドメインのカルボキシ
末端においては、これらの残基はＣＡＲＤＲＳであり、７９４番〜７９９番まで
のアミノ酸を占めている。
【００２０】 例えば、得られたＲＲＴ−ＳＨ３ドメインのアミノ酸配列を短くすることで、
機能に影響を与えることなくその構造を更に変化させて、ＲＲＴ−ＳＨ３ドメイ
ンの誘導体を得ることもできる。このような誘導体は細胞内での発現において有
利な特性を有する場合もある。
【００２１】 以下に、設計した結合特性を有するＳＨ３ドメインの製造方法の一例として、
ＨＩＶ−Ｎｅｆタンパク質と結合するように設計した、Ｈｃｋ−ＳＨ３から誘導
したＳＨ３ドメインの製造方法について詳細に説明する。
【００２２】実施例１：野生型ＨＩＶ−１ ＮｅｆおよびＨｃｋ−ＳＨ３非結合型ＨＩＶ−１ Ｎｅｆに対して高い親和性を有するＳＨ３ドメイン
【００２３】方法 Ｈｃｋ−ＳＨ３を含有するファージプラスミドベクターの作製 野生型のＨｃｋ−ＳＨ３を発現するファージプラスミドを作製するために、５
６アミノ酸からなるＨｃｋポリペプチド断片（NH2-VV...VDSL-COOH）をコードす
るＤＮＡ断片をＰｆｕポリメラーゼ（Stratagene製）並びに、PstIサイトおよび
NotIサイトを含有するプライマーを使ったＰＣＲで増幅した。増幅したＤＮＡ断
片をpCANTAB-5EP（pCANTAB-5E（Pharmacia製）の変異体であって、PstIクローニ
ングサイトを有する）の対応するサイトに挿入した。ＲＲＴ−ＳＨ３ドメインの
ライブラリーを作製するために、以下のＨｃｋのＲＴループコード領域を越えて
伸びる長い方のＰＣＲプライマーをセンス鎖として用いた：5’-AAT CTG CAG GA
A TTC GTG GTT GCC CTG TAT GAT TAT NNN NNK NNS NNK NNK NNS GAC CTC AGC TT
C CAG AAG GGG GAC-3’（ＮはＣまたはＧまたはＴまたはＡ、ＳはＧまたはＣ、
ＫはＧまたはＴ）。その結果として得られた断片を上記のpCANTAB-5EPにクロー
ニングした。合計１３７×１０6個の組換えコロニーを次のようにして作製した
。組換え体を大腸菌ＴＧ１にエレクトロポレーションで導入し、その後、菌体を
集め、以下に説明するようにＭ１３ＫＯ７ヘルパーファージに感染させた。
【００２４】感染性組換えファージの作製 目的のファージプラスミドを含有するＴＧ１細胞を１晩培養したものを、１０
０μｇ／ｍｌのアンピシリンと２％グルコースを含む２×ＹＴ（２×ＹＴ／ＡＧ
）で３０℃で更に培養した。培養液を２×ＹＴ／ＡＧを用いて１０分の１に希釈
し、５×１０8ｐｆｕ／ｍｌのＭ１３ＫＯ７ヘルパーファージ（Pharmacia製）と
ともに３７℃で２時間インキュベートした。バクテリアをペレットにし、培地を
１００μｇ／ｍｌアンピシリンと５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含む２×ＹＴ（
２×ＹＴ／ＡＫ）に交換した。２種の抗生物質に耐性を有するバクテリアを３７
℃で一晩培養した後に、組換えファージを含む上清を回収し、孔径が０．４５μ
ｍのフィルターで濾過し、一定量を必要になるまで４℃で保存した。
【００２５】ファージの選択 ６穴のマイクロプレートを以下のいずれかのタンパク質でコートした：ＧＳＴ
−Ｎｅｆ（典型的な初期ＨＩＶ−１単離物に存在するＮｅｆを模倣するためにＴ
７１Ｒ変異を導入したＨＩＶ−１ ＮＬ４−３ Ｎｅｆ；Saksela et al., 1995.
EMBO J, 14, 484-91）、ＧＳＴ−ＮｅｆＲ９０（本文を参照；Manninen et al.
1995. Virology, 250, 273-82）、ＧＳＴ−Ｎｅｆ−ＰＡ１（Ｐ７２Ａ変異とＰ
７５Ａ変異を有するＮｅｆ；Saksera et al. 1995. EMBO J, 14, 484-91）また
は未修飾のＧＳＴ。コーティングには、上記のＧＳＴ１０μｇ／ｍｌを含むｐＨ
９．６の５０ｍＭナトリウムフェノキシドを用い、４℃で一晩行った。非特異的
結合を５％のミルクを含むＰＢＳ/０．０５％ Tween溶液でブロックし、ＰＢＳ
で簡単にウェルを洗浄した。次に１０7〜１０11ｐｆｕの組換えファージを各ウ
ェルに添加し（選択の早い段階では高い力価を使用した）、室温で２時間インキ
ュベートした。ＮｅｆＲ９０でコートされたウェルを用いる実験においては、フ
ァージ溶解液に１０μｇ／ｍｌの溶解性野生型Ｎｅｆを添加して用いた。ファー
ジと共にインキュベートした後、ウェルをＰＢＳに０．０５％のTween 20を添加
したもので６回（５分）洗浄し、その後、ＰＢＳのみで３回洗浄した。
【００２６】 大部分の実験においては、結合したファージを、ウェルに固定したのと同じＮ
ｅｆを過剰に（１５０μｇ／ｍｌ）含有する少量のＰＢＳで溶出した。また、代
わりに、感染されるべきＴＧ１細胞を洗浄したウェルに直接添加した実験もある
。いずれの場合においても、一晩培養した培養液を用いて、初めにバクテリアを
２×ＹＴ中で対数増殖期まで培養し、親和性に基いて選択したファージをバクテ
リアに３７℃で２時間感染された。その後、サンプルの１％を取出してアンピシ
リンプレートで培養することでファージの感染力価を決定した。このプレートは
、このプレートと並行して作製した、ＧＳＴでコートしたウェルより得られたフ
ァージに感染させたプレートと比較することで特定クローンの濃縮を確認するこ
ともできる。感染したバクテリアの残りの９９％に１００μｇ／ｍｌのアンピシ
リンと２％のグルコースを添加し、３７℃で２時間の条件下で５×１０8ｐｆｕ
／ｍｌのＭ１３ＫＯ７ヘルパーファージに再度感染させた。その後、細胞をペレ
ット化し、等量の２×ＹＴ／ＡＫで再懸濁した。一晩培養した後、増殖した組換
えファージを含む上清を上記の方法で回収し、次の選択工程／感染工程に供した
。通常、８サイクルの選択の後に得られた１２コロニー以上のコロニーをファー
ジプラスミドＤＮＡの調製のために回収し、ABI Prism 310（Perkin Elmer Appl
ied Biosystems製）を使ってＲＲＴ−ＳＨ３挿入配列を決定した。
【００２７】組換えタンパク質の発現 ＮｅｆとＨｃｋ−ＳＨ３のそれぞれのＧＳＴ融合タンパク質をバクテリアに発
現させるためのpGEXベクターの作製法についてはすでに報告がある（Saksela et
al.1995. EMBO J, 14, 484-491; Manninen et al. 1998. Virology, 250, 273-
282）。ＧＳＴ−ＲＲＴ−ＳＨ３ベクターは次のように作製した。対応するファ
ージプラスミドからＳＨ３断片をＰＣＲで増幅し、pGEX-4T-1（Pharmacia製）の
Eco RIサイトとSalＩサイトの間に挿入し、挿入をシークエンシングによって確
認した。E.coliBL21によるＧＳＴ融合タンパク質の発現とその精製は、pGExベク
ターとグルタチオン結合樹脂の製造社（Pharmacia）が推奨する標準的な方法で
行なった。樹脂から融合タンパク質を溶出した後、タンパク質を濃縮し、Centre
x UF2 カラム（Schleicher & Schuell製）を用いた限外濾過により緩衝液をPBS
に交換した。次にBSAを標準として用いたBioRad社の方法（Lowry法）でタンパク
質濃度を測定した。濃度とタンパク質の純度はクマシーブルー染色を用いたＳＤ
Ｓ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で確認した。タンパク質のビオチン化は、
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin試薬を用い、メーカー(Pierce社）の推奨する方法
で行なった。その後、遊離したビオチンを除去するためにタンパク質を限外濾過
に３回付し、上記の方法で濃度を再度測定した。
【００２８】Ｎｅｆ／ＳＨ３の競合アッセイ Nunc Maxisorb F8のストリップを異なるＧＳＴ-Ｎｅｆタンパク質（各ウェル
につき１００μｌ中に２００ｎｇ）を用いて４℃で一晩コートした。続いて非特
異的タンパク質の結合を飽和するために１．５％のＢＳＡを含む洗浄用バッファ
ー（ＷＢ；ＰＢＳ＋０．０５％ Tween-20）と共に３０分間室温でインキュベー
トし、更にＷＢで２回洗浄した。競合物質として使用する未標識のＳＨ３タンパ
ク質を１．５％のＢＳＡと過剰量（４μＭ）の未修飾のＧＳＴを含むＷＢで希釈
し、ＧＳＴどうしの結合による融合タンパク質の２量体化を最小限に抑えた。こ
の溶液５０μｌを同容量のプローブ（ビオチン化されたＳＨ３のＷＢ溶液)と混
合し、最終的なプローブ濃度が６６ｎＭ（Ｈｃｋ−ＳＨ３／ＮｅｆアッセイとＲ
ＲＴ．Ａ１／ＮｅｆＲ９０アッセイ）、または７ｎＭ（ＲＲＴ．Ａ１／Ｎｅｆア
ッセイ）になるようにウェルに加えた。室温で１時間インキュベートした後、ウ
ェルをＷＢで３回洗浄し、各ウェルにストレプトアビジン−ビオチン−西洋わさ
びパーオキシダーゼ複合体（Amersham Life Sciences製）の１:２０００希釈溶
液を１００μｌ加えた。このプレートを室温で４５分間インキュベートし、再び
３回洗浄した後、１，２−フェニレンジアミン−ジヒドロクロリド（ＯＰＤ；０
．６ｍｇ／ｍｌ）（Fluka AB製）を基質としてパーオキシダーゼ活性を測定した
。１０分後に酵素反応を２Ｍの硫酸５０μｌ加えることで停止し、Victor 1420
Multilabel Counter（Wallac製）で４９２ｎｍにおける光学密度を測定した。
【００２９】結果 ＨＩＶ−１ Ｎｅｆの、ＨｃｋのＳｒｃホモロジー３（ＳＨ３）ドメインに対
する強力な結合（ＫD＝２５０ｎＭ）は、Ｈｃｋ−ＳＨ３のＲＴループと、Ｎｅ
ｆ内においてリガンド結合領域であると考えられていたポリプロリンII型（ＰＰ
II）ヘリックス含有ＳＨ３リガンド領域の外側にある残基との相互作用を伴う。
このような特徴的な相互作用は、他のＳＨ３／リガンドタンパク質複合体にも特
異性と親和性を与えるものと考えられる。本発明においては、ＳＨ３ドメインの
複雑なライブラリーを構築し、それをＭ１３バクテリオファージ粒子の表面に展
示することに成功した。ＳＨ３ドメインのライブラリーはＨｃｋから誘導された
ものであるが、ＲＴループ内にランダムなヘキサペプチドの置換が導入されてい
る（ＲＲＴ−ＳＨ３と称する）。このような方法によって、ＫD＝１０ｎＭより
も高い親和性でＮｅｆと結合し得る特定のＲＲＴ−ＳＨ３ドメインを同定した。
これらの高い親和性を有するＲＲＴ−ＳＨ３ドメインの中にはＨｃｋ−ＳＨ３に
類似するものがあり、天然のＨｃｋ ＲＴループとの結合に干渉するＦ９０Ｒ変
異を導入したＮｅｆ変異体とは結合しなかった。加えて、逆の特異性を有するＲ
ＲＴ−ＳＨ３ドメイン、即ち、強力な結合がＡｒｇ90残基に依存するものを選択
することも可能であり、未修飾のＮｅｆに対する親和性は１００倍低くかった。
これらの結果は、ＳＨ３リガンドの選択におけるＲＴループの重要性を強調し、
また目的とする結合能を有するＳＨ３ドメインを製造するための一般的な方法を
提案する。
【００３０】ファージ展示ＲＲＴ−ＳＨ３ライブラリーの製造 バクテリオファージの表面に機能的なＳＨ３ドメインを提示することが可能で
あるか検討するために、Ｈｃｋ−ＳＨ３を有するファージプラスミドを構築し、
Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーウィルスを用いて、ＰIIIコートタンパク質と融合したＳ
Ｈ３を発現する組換えファージを調製した。これらのファージを以下のＧＳＴで
コートした６穴のマイクロウェルプレートで培養した：精製したＧＳＴ−Ｎｅｆ
、ＧＳＴ−Ｎｅｆ−ＰＡ１（Ｐ７２Ａ変異によってＳＨ３結合性を欠失した、Ｎ
ｅｆのＰ７５Ａ変異体）又は未修飾のＧＳＴタンパク質。洗い流されない感染性
ファージ粒子の力価は、未修飾のＧＳＴタンパク質やＧＳＴ−Ｎｅｆ−ＰＡ１を
コートしたウェルと比較して、ＧＳＴ−Ｎｅｆをコートしたウェルにおいて２〜
３乗高いことが判明した（データは示さない）。従ってこの結果は、Ｍ１３ファ
ージ粒子の表面に機能的なＳＨ３ドメインの展示が可能であり、また、対応する
ＳＨ３リガンドを親和性試薬として用いることで、このようなファージの選択が
可能であることを表している。
【００３１】 新規なリガンド結合能を有するＳＨ３ドメインを作製するために、ＰＣＲを用
いた突然変異誘発法によってＲＲＴ−ＳＨ３と称するＳＨ３ドメインの集合体を
製造した。ＲＲＴ−ＳＨ３はＨｃｋ−ＳＨ３と同じ基本構造を有しており、ＲＴ
ループ内の可変領域を構成する６アミノ酸残基（ＥＡＩＨＨＥ）がランダムなア
ミノ酸に置換されている以外はＨｃｋ−ＳＨ３と相同である。２０種のアミノ酸
で得られる６残基のペプチドの理論上可能な組合わせの数（２０6＝６４００万
）を超える、異なるＲＲＴ−ＳＨ３ドメインを発現する１億３０００万個の組換
えファージプラスミドクローンを製造した。Ｈｃｋ−ＳＨ３発現ファージプラス
ミドに関する上記記載と同様に、異種のＲＲＴ−ＳＨ３タンパク質の集合を展示
する感染性ファージ群を製造し、後述する親和性に基く選択実験に使用した。
【００３２】Ｎｅｆに結合するＲＲＴ−ＳＨ３タンパク質の選択 ＲＲＴ−ＳＨ３ライブラリーが新規なＮｅｆ結合ＳＨ−３タンパク質を含有す
るか検査するために、野生型ＨＩＶ−１ Ｎｅｆに親和性を示すファージの選択
を鋭意に行った。選択方法は複数（合計１１回）の独立した実験からなり、各実
験においては、組換えファージの親和性選択及びヘルパーウィルスを用いた再増
幅を７又は８回行った。種々のファージ選択工程により誘導されたＲＲＴ−ＳＨ
３クローンの代表的なコレクションの配列を決定し、集団内でのタンパク質の多
様性の損失、およびＮｅｆ結合ＲＲＴ−ＳＨ３クローンと推定されるタンパク質
の発生を追跡した。Ｎｅｆを用いて選択した合計２７８のＲＲＴ−ＳＨ３クロー
ンの配列を決定した（表１に一部を示したが、残りのデータは表示しない）。６
回の選択の後では、概して１〜３種のＲＲＴ−ＳＨ３クローンがファージ集団を
占めていた。そのほとんどの場合、これらの優性クローンは、他の独立した実験
で誘導したクローンと同一であるか類似しており、この結果から、我々はＨＩＶ
−１ Ｎｅｆに高い親和性で結合しうるＳＨ３ドメインのライブラリーを全て検
討したと信じるに至った。
【００３３】 ７ラウンド以上の選択の後に優性であることが見出されたＲＲＴ−ＳＨ３クロ
ーンのＲＴループ配列を表１に列挙する。これらの配列は、４つのファミリーに
分類され、それぞれのファミリーは３又はそれ以上の共通のアミノ酸残基で特徴
付ることができる。加えて、これらのファミリーには明らかに類似する点があり
、最も顕著な点は６個のランダムなアミノ酸残基の２番目のアミノ酸（２／６）
がセリン残基であることである。あるドミナントなクローン（ＲＲＴ．Ｃ１）は
、２つの異なるＲＴループ配列ファミリー（Ｂ及びＣ）のコンセンサスモチーフ
を有していた。セリンが頻繁に出現する他にも、これらのＲＴループは芳香族残
基及びプロリン残基に富んでいた。天然のＮｅｆリガンドであるＨｃｋ−ＳＨ３
のＲＴループも２つの芳香族残基（ヒスチジン）を有するが、選択したＲＴルー
プ配列は、Ｈｃｋ−ＳＨ３の対応する領域や、GenBankのデータベースに登録さ
れている他の天然のＳＨ３ドメインとの類似性は見られなかった。
【００３４】
【表１】
【００３５】 表１に示したクローンがその大部分を占めている選択工程の後半で得られたＲ
ＲＴ−ＳＨ３ファージの上澄を、野生型ＮｅｆとＳＨ３非結合性であるＮｅｆ−
ＰＡ１変異体とを並行して用いた、親和性に基く選択に付した。その結果、前者
の場合にのみ組換えファージが効果的に獲得された。Ｎｅｆ−ＰＡ１をコートし
たウェルから回収したファージは、Ｎｅｆをコートしていない対照実験の結果と
差異はなかった（データは示していない)。このように、濃縮したＲＲＴ−ＳＨ
３ファージのＲＴループ配列は、ライブラリーの他のクローンと比較して、Ｎｅ
ｆに対して優れた親和性を有するが、真のＳＨ３が介在する結合について考えら
れているように、これらの相互作用はＮｅｆ内の完全なＰｘｘＰモチーフに強く
依存することが判明した。
【００３６】ＲＲＴ−ＳＨ３は高い親和性でＮｅｆと結合する 選択したＲＲＴ−ＳＨ３ドメインの結合能を更に詳細に検討するために、各々
のクローンファミリーから数種を選び、バクテリア発現ベクターに移して生化学
的な研究を行った。Ｎｅｆに対する親和性を評価するために９６穴のマイクロウ
ェルプレートによる結合競合アッセイ行った。このアッセイにおいては、固定化
したＮｅｆに対して段階希釈したＲＲＴ−ＳＨ３が一定量のビオチン化Ｈｃｋ−
ＳＨ３と競合する能力を試験し、結合したＨｃｋ−ＳＨ３を比色定量した。競合
物として用いた異なるＲＴＴ−ＳＨ３タンパク質の結合親和性は、十分に特徴付
けられているＨｃｋ−ＳＨ３／Ｎｅｆ相互作用のＫD値（２５０ｎＭ）に基づい
て容易に算出することができた。このアッセイ方法を選んだ理由は、この方法は
、非競合アッセイに影響を与えるような測定誤差の原因となりうる大部分の因子
（例えば、ＳＨ３融合タンパク質中のＧＳＴやインキュベーションおよび洗浄の
条件による影響）に対する感受性が比較的低いからである。このアッセイの有効
性は、ビオチン化Ｈｃｋ−ＳＨ３と非標識Ｈｃｋ−ＳＨ３との同種の競合におけ
る理論値と実験値の優れた相関関係、即ち、１：１の比率における５０％に近い
阻害率と広範囲の濃度比における予測した阻害率との一致によって確認された（
図２を参照)。
【００３７】 図２および表１から明らかなように、選択工程の後半に得られたすべてのＲＲ
Ｔ−ＳＨ３は、実質的にＨｃｋ−ＳＨ３よりも強くＮｅｆと結合した。これらの
ＲＲＴ−ＳＨ３の多くは、２０分の１の濃度であっても、ＮｅｆとＨｃｋ−ＳＨ
３との結合と５０％以上競合し、１２ｎＭ未満のＫD値を示した。このような強
く結合するＲＴ−ＳＨ３ドメインはすべてのＲＴル−プ配列ファミリーに見出さ
れ、Ser-Pro-Phe トリペプチドモチーフはＮｅｆに最も強く結合したクローンに
頻繁に存在していた。ＲＲＴ．Ａ１、ＲＲＴ．Ｂ６及びＲＲＴ．Ｃ１タンパク質
は濃度比が１：３５以下であっても、５０％又はそれ以上の阻害率でＨｃｋ−Ｓ
Ｈ３結合を阻害することができ、その時のＫD値は７ｎＭ程の低い値であった。
【００３８】 上記のような顕著な親和性は、逆の態様で行った９６穴マイクロウェルプレー
トアッセイ、即ち、高い親和性を有するＲＲＴ−ＳＨ３ドメイン（ＲＲＴ．Ａ１
）をプローブとして使用し、Ｈｃｋ−ＳＨ３又は他のＲＲＴ−ＳＨ３タンパク質
を競合物質として使用する実験（図３）によっても支持された。種々のＲＲＴ−
ＳＨ３タンパク質がＲＲＴ．Ａ１と競合する能力は、Ｈｃｋ−ＳＨ３との結合を
阻害能力と明確な相関関係を示した。特に、Ｈｃｋ−ＳＨ３はＲＲＴ．Ａ１とＮ
ｅｆとの相互作用に対しては非常に弱い競合物質であり、プローブとして使用し
たＲＲＴ．Ａ１の１００倍を超える量（７ｎＭ対＞ ０．８５μＭ）を添加しな
いと５０％阻害に達しなかった。Ｈｃｋ−ＳＨ３をプローブとして使用したとき
と同様に、未標識ＲＲＴ．Ａ１を等モル量用いた同種の競合では、予想通り５０
％結合阻害となった。以上より、選択したＲＲＴ−ＳＨ３タンパク質の優れた結
合親和性に関する結論はこの逆の態様によるアッセイによっても確かなものとな
り、Ｈｃｋ−ＳＨ３をプローブとして使用して概算した親和性よりも実際の親和
性が高い可能性がこのアッセイによって示された。
【００３９】ＲＲＴ−ＳＨ３ドメインは多様な方法によってＮｅｆを認識する 上述のように、Ｈｃｋ−ＳＨ３のＲＴループ内のイソロイシン（Ile）残基は
Ｎｅｆと結合するために重要である。Ile残基の脂肪族側鎖は、ＮｅｆのPhe90残
基を含む領域によって形成された疎水性ポケットに適合する。このフェニルアラ
ニンがアルギニンに変異した変異体（以下、ＮｅｆＲ９０と称する変異体）はＨ
ｃｋ−ＳＨ３に対する結合の親和性が大きく減少している（ＫD＝１．９９μＭ
）。この相互作用は、Ｈｃｋ−ＳＨ３の親和性に関する構造学的な説明を提供す
るだけでなく、その他のＮｅｆ ＳＨ３リガンド表面の認識方法に関する分子レ
ベルの説明を構想するためにも有用である。そこで、Ｎｅｆを用いて選択したＲ
ＲＴ−ＳＨ３ドメインも、同様の疎水性相互作用に依存しているのか、またＮｅ
ｆ内のＦ９０Ｒ変異の影響を受けるのかを試験することに興味があった。
【００４０】 Ｈｃｋ−ＳＨ３／ＮｅｆＲ９０相互作用の親和性は低いために、固定化したＮ
ｅｆＲ９０とＨｃｋ−ＳＨ３の結合に基づいた定量的な９６穴ウェルプレートア
ッセイを行うことは不可能であった。対称的に、ビオチン化されたＲＲＴ．Ａ１
タンパク質をプローブとして試験したときには、強い結合と適切なシグナル／ノ
イズ比が観察された。これはＲＲＴ−ＳＨ３ドメインＲＲＴ．Ａ１がＮｅｆと結
合する際には、Phe90残基に対する依存は重要ではないことを表していた。そこ
で、ＲＲＴ．Ａ１との競合に基づいて、他のＲＲＴ−ＳＨ３タンパク質のＮｅｆ
Ｒ９０に対する相対的な親和性を試験した（図４を参照)。
【００４１】 予想通り、Ｈｃｋ−ＳＨ３は、ＲＲＴ．Ａ１／ＮｅｆＲ９０相互作用に対して
全く非効果的な競合物質であり（図４及び表１を参照）、ＮｅｆＲ９０アッセイ
において実際に使用した競合物質：プローブ比の中で最も高い、１６倍を超える
モル量（６６ｎＭ対１．１μＭ）で用いた時でさえも５０％結合阻害を起こすこ
とができなかった。以前にＨｃｋ−ＳＨ３／ＮｅｆＲ９０複合体について測定さ
れたＫD値＝１．９９μＭ（Manninen et al. 1998. Virology, 250, 273-82）に
基き、ＲＲＴ．Ａ１のＮｅｆＲ９０に対する絶対的な親和性を１００ｎＭまたは
それ以上と評価した。その他のＮｅｆを用いて選択したＲＲＴ−ＳＨ３タンパク
質をＲＲＴ．Ａ１結合の競合物質として試験したときには、広範囲に渡る親和性
がＮｅｆＲ９０に対して認められた（図４および表１を参照）。数種のＲＲＴ−
ＳＨ３（ＲＲＴ．Ａ２やＲＲＴ．Ｂ４等）は、ＲＲＴ．Ａ１結合と効率よく競合
し、ＲＲＴ．Ａ１と同様に、Ｆ９０Ｒ変異の影響を比較的受けにくいことを表し
ている。一方、他のＲＲＴ−ＳＨ３（ＲＲＴ．Ｂ１やＲＲＴ．Ｃ１等）は、高濃
度で試験してもほとんどＲＲＴ．Ａ１／ＮｅｆＲ９０複合体に介入する事はでき
なかった。このように、数種の高い親和性を有するＲＲＴ−ＳＨ３タンパク質は
、Ｈｃｋ-ＳＨ３と同様に、ＮｅｆのPhe90がドミナントな役割を果たす結合形態
によってＮｅｆと結合する。これに対し他のＲＲＴ−ＳＨ３タンパク質は、異な
る機構によってＮｅｆを認識すると考えられ、ＮｅｆＲ９０とも強く結合する。
【００４２】ＮｅｆＲ９０変異体に対するＲＲＴ−ＳＨ３の特異性 上記の知見は、ＲＴループに依存して、選択したＳＨ３ドメインは多様な分子
戦略によってリガンドを認識することを示唆している。この知見を更に発展させ
るために、我々は完全に結合特異性を変化させたＳＨ３ドメインの設計を試みた
。具体的には、野生型のＮｅｆタンパク質には結合しないが、その代わりにＮｅ
ｆＲ９０変異体には強い親和性を示すＲＲＴ−ＳＨ３ドメインを開発した。従っ
て、このようなＲＲＴ−ＳＨ３ドメインの結合能は、変異したArg90残基が関与
する構造決定因子を介した相互作用に厳密に依存し、Ｈｃｋ−ＳＨ３による野生
型Ｎｅｆタンパク質の認知との類似点はほとんど存在しないと考えられる。この
目的を達成するために、Ｎｅｆ−Ｆ９０Ｒを上記の野生型Ｎｅｆと同様に親和性
に基く選択のための試薬として用いた。但し、いくつかの実験においては、過剰
な溶解性野生型Ｎｅｆも使用して、主にArg90依存性の決定因子を認識するＲＲ
Ｔ−ＳＨ３タンパク質の選択性を高めた。
【００４３】 ＮｅｆＲ９０を用いて選択したＲＲＴ−ＳＨ３において最も頻繁に観察された
ＲＴループ配列を表１の下のパネルに示した。これらの選択実験は、野生型Ｎｅ
ｆの場合と同様に徹底的に（６つの独立した実験を）行ったが、野生型のような
コンセンサスなＲＴループ配列を見つけることはできなかった。しかしながら、
表１に見られるように、特定のアミノ酸については好ましい位置が見出された。
例えば、Phe-Leuのジペプチドの好ましい位置は６残基の中の３番目と４番目（
３／６と４／６）、Gluは１番目（１／６）、Serは４番目（４／６）である。興
味深いことに、これらのＮｅｆＲ９０を用いて選択したＲＴループは、Ｎｅｆを
用いて選択したＲＲＴ−ＳＨ３ドメインに特徴的なコンセンサスモチーフを含ん
でいない。また、１つの例外（ＲＲＴ．ｍ４）を除いて、Ｎｅｆを用いて選択し
たクローンには不変的に存在した２番目（２／６）のSerは、ＮｅｆＲ９０を用
いて選択したＲＲＴ−ＳＨ３ドメインには存在しなかった。
【００４４】 図４と表１に示したように、ＮｅｆＲ９０に結合したすべてのＲＲＴ−ＳＨ３
タンパク質（ＲＲＴ．ｍ１〜ＲＲＴ．ｍ４）はＲＲＴ．Ａ１とＮｅｆＲ９０との
結合と効率よく競合し、“２者特異的（dual specific）”なクローンであるＲ
ＲＴ.Ａ１の４倍〜８倍の親和性を示すと概算された。注目すべきことに、これ
らのＮｅｆＲ９０で選択したＲＲＴ−ＳＨ３ドメインの結合の中にはArg90残基
の変異への依存が非常に強いものもあるが、他のものは２者特異性を示した。後
者の例としては、ＲＲＴ．ｍ３が挙げられる。ＲＲＴ．ｍ３は、ＲＲＴ．Ａ１／
ＮｅｆＲ９０相互作用の強力な阻害剤のみならず、Ｎｅｆとの結合においてＲＲ
Ｔ．Ａ１ともよく競合した。一方、ＲＲＴ．ｍ１とＲＲＴ．ｍ４は、Ｎｅｆとの
結合においてＲＲＴ．Ａ１と事実上競合しなかった（図４および表１を参照）。
従って、ＲＲＴ．ｍ１とＲＲＴ．ｍ４のＮｅｆＲ９０に対する強い親和性のごく
一部分のみが、変異Ａｒｇ90残基の関与しない構造決定因子によるものである。
この残基によってもたらされる親和性（Ａｒｇ90非依存的親和性）は、しかしな
がら、Ｈｃｋ−ＳＨ３／Ｎｅｆ相互作用に競合することができる。いずれにせよ
、これらのクローンがＨｃｋ−ＳＨ３またはＮｅｆを用いて選択したクローン（
例えばＲＲＴ．Ｃ１）よりも少なくとも１００倍は効率的にＮｅｆＲ９０に結合
することは、これらのクローンに新たな結合特性が付与されていること、即ち、
対応するリガンドの中に人工的に作られたエピトープに依存した高親和性の相互
作用をするように設計されていることを明示している。
【００４５】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 結合特性の変化したＳＨ３ドメインを作製するための本発明の方法を模式的に
示す図である。Ｈｃｋ−ＳＨ３のようなＳＨ３ドメインと、対応するリガンドタ
ンパク質との相互作用は、ＳＨ３ドメインとリガンドタンパク質のプロリンリピ
ート（ＰｘｘＰ）モチーフ領域との間の何対かの分子接触を伴う。結合に必要で
あるものの、このようなＰｘｘＰ特異的相互作用は弱く、また、大部分のＳＨ３
／リガンド複合体に見られる結合性は、いずれも比較的類似している。従って、
ＰｘｘＰ特異的相互作用の選択性およびその影響力は低い。
【図２】 Ｎｅｆに固定化した４つの異なるＲＲＴ−ＳＨ３ドメインが標識Ｈｃｋ−ＳＨ
３と競合した時の結合性に関する代表的な実験データを示す。アッセイの条件は
図３に示した標識ＲＴＴ．Ａ１を用いた実験と同じ（実施例１を参照）であるが
、プローブとして用いた標識Ｈｃｋ−ＳＨ３の量（６６ｎＭ）は、標識ＲＴＴ．
Ａ１の量（７ｎＭ）の約１０倍にした。添加した競合物質によるＮｅｆに対する
プローブの結合阻害をｙ軸に示し、５０％阻害を横の破線で示した。プローブに
対する競合物質の濃度（１:１２８〜４：１）をｘ軸に示し、プローブと競合物
質が等モル量になった点を縦の破線で示した。予想されたように、同じＳＨ３ド
メインをプローブおよび競合物質として使用した際には、阻害曲線は２本の破線
が交わる点の非常に近くを通過した。全てのＲＲＴ−ＳＨ３ドメインについて最
低３回試験し、そのデータのまとめを表１に示した。
【図３】 Ｎｅｆに固定化した４つの異なるＲＲＴ−ＳＨ３ドメインが標識ＲＴＴ．Ａ１
と競合した時の結合性に関する代表的な実験データを示す。アッセイの条件は図
２に示した標識ＲＴＴ−ＳＨ３を用いた実験と同じ（実施例１を参照）であるが
、プローブとして用いた標識Ｈｃｋ−ＳＨ３の量（６６ｎＭ）は、標識ＲＴＴ．
Ａ１の量（７ｎＭ）の約１０倍であった。添加した競合物質によるＮｅｆに対す
るプローブの結合阻害をｙ軸に示し、５０％阻害を横の破線で示した。プローブ
に対する競合物質の濃度（１:８〜２５６：１）をｘ軸に示し、プローブと競合
物質が等モル量になった点を縦の破線で示した。予想されたように、同じＳＨ３
ドメインをプローブおよび競合物質として使用した際には、阻害曲線は２本の破
線が交わる点の非常に近くを通過した。全てのＲＲＴ−ＳＨ３ドメインについて
最低３回試験し、そのデータのまとめを表１に示した。
【図４】 Ｆ９０Ｒ変異を有するＮＥＦ変異体に対する選ばれたＲＲＴ−ＳＨ３ドメイン
の結合。ＮｅｆＲ９０をビオチン化ＲＲＴ．Ａ１（６６ｎＭ）のリガンドとして
用い、ビオチン化ＲＲＴ．Ａ１に対して未標識のＳＨ３が１：２５６〜１６：１
の割合で存在する条件においてアッセイを行った。また、試験したＲＲＴ−ＳＨ
３ドメインに関する同様のデータを表１にまとめた。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１２年１２月２２日（２０００．１２．２２）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ // Ａ６１Ｋ 48/00 Ａ６１Ｋ 37/52 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ， ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，Ｋ Ｇ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ， ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，Ｓ Ｄ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ， ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 2G045 AA40 DA36 FB02 FB03 4B024 AA01 AA11 AA20 BA10 BA80 CA06 CA07 DA06 EA04 GA11 HA01 HA03 HA06 4C084 AA01 AA06 AA07 AA13 BA01 BA20 CA53 ZC80 4H045 AA10 AA20 AA30 BA20 BA41 CA40 DA89 EA20 EA50 FA74 GA26

Claims (16)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 設計された結合能を有するＳＨ３ドメインの製造方法であっ
    て、 ａ）ＲＲＴ−ＳＨ３ドメインを調製し、該ＲＲＴ−ＳＨ３ドメインはＳＨ３ド
    メインに含まれるＲＴループがランダム化されたＳＨ３ドメインの集合であり、 ｂ）該ＲＲＴ−ＳＨ３ドメインを発現する組換え体ライブラリーを作製し、そ
    して ｃ）該ライブラリーを親和性または機能を指標とする選択に付して、設計され
    たＳＨ３ドメインを同定する ことを包含する製造方法。
  2. 【請求項２】上記工程ａ）において、ＲＴループの可変領域内のアミノ酸残
    基を他のアミノ酸残基に置換することを特徴とする、請求項１に記載の製造方法
    。
  3. 【請求項３】該ＲＴループの可変領域内のアミノ酸残基が、ヒトＨｃｋタン
    パク質の６９番〜７４番である６アミノ酸残基（ＥＡＩＨＨＥ）に対応するアミ
    ノ酸残基であることを特徴とする、請求項２に記載の製造方法。
  4. 【請求項４】該組換え体ライブラリーが、プラスミド、ファージプラスミド
    及びウイルスからなる群より選ばれるライブラリーであることを特徴とする、請
    求項１に記載の製造方法。
  5. 【請求項５】ＳＨ３ドメインに含まれるＲＴループの可変領域内のアミノ酸
    残基が他のアミノ酸残基に置換されている人工ＳＨ３ドメイン。
  6. 【請求項６】該ＲＴループの可変領域内のアミノ酸残基が、ヒトＨｃｋタン
    パク質の６９番〜７４番に相当する６アミノ酸残基（ＥＡＩＨＨＥ）に相当する
    アミノ酸残基であることを特徴とする、請求項５に記載の人工ＳＨ３ドメイン。
  7. 【請求項７】Ｈｃｋ−ＳＨ３より誘導され、ＨＩＶ−１のＮｅｆタンパク質
    に結合するよう設計された人工ＳＨ３ドメインであって、ＲＴループの可変領域
    内のペプチドモチーフＥＡＩＨＨＥがＸＳＷＳＸＸ，ＸＳＰＦＸＸ及びＸＳＸＦ
    ＰＷ（但し、アミノ酸配列におけるＸはいかなるアミノ酸でもよい）からなる群
    より選ばれたペプチドモチーフで置換されている人工ＳＨ３ドメイン。
  8. 【請求項８】該アミノ酸ＸがＶ，Ｆ，Ｄ，Ｍ，Ｐ，Ｓ，Ｔ，Ｗ及びＹからな
    る群より選ばれるアミノ酸であることを特徴とする、請求項７に記載の人工ＳＨ
    ３ドメイン。
  9. 【請求項９】該ペプチドモチーフがＶＳＷＳＰＤ，ＦＳＷＳＤＴ，ＤＳＷＳ
    ＴＳ，ＹＳＷＳＤＭ，ＷＳＰＦＰＳ，ＤＳＰＦＳＦ，ＦＳＰＦＳＦ，ＦＳＰＦＤ
    Ｗ，ＳＳＰＦＤＷ，ＹＳＰＦＳＷ，ＴＳＰＦＰＷ，ＹＳＰＦＰＷ，ＹＳＤＦＰＷ
    及びＤＳＷＦＰＷからなる群より選ばれたペプチドモチーフであることを特徴と
    する、請求項８に記載の人工ＳＨ３ドメイン。
  10. 【請求項１０】Ｈｃｋ−ＳＨ３より誘導され、ＨＩＶ−１のＮｅｆタンパク
    質に結合するように設計された人工ＳＨ３ドメインであって、ＲＴループの可変
    領域内のペプチドモチーフＥＡＩＨＨＥがＳＳＦＹＳＳ，ＱＧＦＬＤＱ，ＮＡＦ
    ＬＰＳ，ＥＡＷＳＰＬ及びＥＳＹＳＥＷからなる群より選ばれたペプチドモチー
    フで置換されている人工ＳＨ３ドメイン。
  11. 【請求項１１】研究または治療を目的とした、細胞タンパク質または病原体
    をコードするタンパク質の機能を阻害、活性化または変化させるための、ＲＲＴ
    −ＳＨ３ドメインまたはその誘導体の使用。
  12. 【請求項１２】サンプルに含まれる感染性の生物を検出するための検査方法
    であって、ＲＲＴ−ＳＨ３ドメインまたはその誘導体と、該感染性の生物の有す
    るタンパク質との結合を検出することを包含する方法。
  13. 【請求項１３】医薬開発のためにターゲットタンパク質を同定することを目
    的とした、ＲＲＴ−ＳＨ３ドメインまたはその誘導体の使用。
  14. 【請求項１４】医薬品開発の指針の提供を目的とした、公知のＳＨ３リガン
    ドタンパク質の有する表面分子構造を同定するための、ＲＲＴ−ＳＨ３ドメイン
    またはその誘導体の使用。
  15. 【請求項１５】合理的なドラッグデザインを目的とした、ＲＲＴ−ＳＨ３ド
    メインまたはその誘導体の構造に関する情報の使用。
  16. 【請求項１６】ＳＨ３ドメインのターゲットタンパク質の同定方法であって
    、請求項１に記載の方法で機能を指標とした選択によって同定されたＲＲＴ−Ｓ
    Ｈ３ドメインまたはその誘導体と、ターゲットと考えられるタンパク質との結合
    を検出することを包含する方法。
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