JP2003500074A - 骨髄性細胞系列においてJunB発現を欠損するトランスジェニックマウスの使用 - Google Patents
骨髄性細胞系列においてJunB発現を欠損するトランスジェニックマウスの使用Info
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Abstract
(57)【要約】
骨髄系細胞においてJunB発現を欠く動物のヒト慢性骨髄性白血病のモデルとしての使用。骨髄性細胞の増殖を阻害する薬剤の同定のためのJunB欠損骨髄性細胞の使用。細胞増殖に対するJunBの阻害的効果に対する負の制御因子としての化合物であって、化学療法及び/または放射線療法後に骨髄性細胞を爆発的に増殖させるための薬剤として有用な前記化合物を同定する方法。
Description
【0001】
本発明は骨髄性白血病の分野に関する。
骨髄性造血は、顆粒球及び単球を生成する制御された過程であり、細胞分化、
前駆細胞増殖、生存及びアポトーシスのような機構を含む。骨髄分化に非常に重
要な多数の転写制御因子が同定されているが(Tenenらの総説、1997)、細胞増
殖および細胞死によって骨髄性細胞系列において細胞数を調節している転写因子
についてはあまり分かっていない。
前駆細胞増殖、生存及びアポトーシスのような機構を含む。骨髄分化に非常に重
要な多数の転写制御因子が同定されているが(Tenenらの総説、1997)、細胞増
殖および細胞死によって骨髄性細胞系列において細胞数を調節している転写因子
についてはあまり分かっていない。
【0002】
AP-1(活性化タンパク質-1)は共通のDNA部位、AP-1結合部位に結合するJun、
FosまたはATF(活性化転写因子)ファミリーのメンバーから構成される2量体転
写因子であり、細胞外シグナルを多くの細胞遺伝子およびウイルス遺伝子の転写
における変化に変換する(AngelおよびKarin、1991の総説)。AP-1活性は成長因
子、サイトカイン、腫瘍プロモーター、発癌物質および特異的癌遺伝子を含む種
々のシグナルによって調節される。AP-1は細胞増殖、細胞分化およびアポトーシ
スのような種々の生物学的過程に関係している。しかしながら、in vivoおよび
組織培養細胞におけるAP-1機能の解析は種々のAP-1メンバーが種々の標的遺伝子
を制御し、従って、細胞型特異的な様式で別々の生物学的機能を達成することを
明らかにした。
FosまたはATF(活性化転写因子)ファミリーのメンバーから構成される2量体転
写因子であり、細胞外シグナルを多くの細胞遺伝子およびウイルス遺伝子の転写
における変化に変換する(AngelおよびKarin、1991の総説)。AP-1活性は成長因
子、サイトカイン、腫瘍プロモーター、発癌物質および特異的癌遺伝子を含む種
々のシグナルによって調節される。AP-1は細胞増殖、細胞分化およびアポトーシ
スのような種々の生物学的過程に関係している。しかしながら、in vivoおよび
組織培養細胞におけるAP-1機能の解析は種々のAP-1メンバーが種々の標的遺伝子
を制御し、従って、細胞型特異的な様式で別々の生物学的機能を達成することを
明らかにした。
【0003】
全てのJunタンパク質(c-Jun、JunBおよびJunD)はその一次構造およびDNA結
合特異性の点で類似している。しかしながら、JunBはその塩基性ロイシンジッパ
ー領域における少数のアミノ酸変異のためにc-Junに比べて10倍弱いDNA結合性お
よび低下した二量体形成特性を示す。トランスフェクション研究はJunBがAP-1-
媒介トランス活性化の抑制因子であることを示唆している。なぜなら、JunBはc-
Jun媒介トランス活性化およびトランスフォーメーションを、おそらく不活性c-J
un/JunB二量体の優先的形成によって抑制したからである(Chiuら、1989;Deng
とKarin、1993)。しかしながら、in vitroおよびin vivoデータはJunBが相互作
用する相手方およびプロモーターとの関係に依存して強いトランス活性化因子で
もあり得ることを明らかにした(Chiuら、1989;Liら、1999)。近年、junBを欠
く胎仔は、胎仔母体相互作用不全のために胚発生の第9.5日頃に死ぬことを明ら
かにした(Schorpp-Kistnerら、1999)。対照的に、マウスjunB遺伝子をヒトユ
ビキチンCプロモーターの制御下に(Ubi-junB)多数の異なる組織において構成的
に発現するトランスジェニックマウスは明らかな表現型を有しない(Schorppら
、1996)。Schorpp-Kistnerら(1999)はjunB変異胚の胚致死性はUbi-junB導入遺
伝子によってレスキューされることを明らかにし、junBの欠損は単に胚における
致死性表現型に関与することを示した。
合特異性の点で類似している。しかしながら、JunBはその塩基性ロイシンジッパ
ー領域における少数のアミノ酸変異のためにc-Junに比べて10倍弱いDNA結合性お
よび低下した二量体形成特性を示す。トランスフェクション研究はJunBがAP-1-
媒介トランス活性化の抑制因子であることを示唆している。なぜなら、JunBはc-
Jun媒介トランス活性化およびトランスフォーメーションを、おそらく不活性c-J
un/JunB二量体の優先的形成によって抑制したからである(Chiuら、1989;Deng
とKarin、1993)。しかしながら、in vitroおよびin vivoデータはJunBが相互作
用する相手方およびプロモーターとの関係に依存して強いトランス活性化因子で
もあり得ることを明らかにした(Chiuら、1989;Liら、1999)。近年、junBを欠
く胎仔は、胎仔母体相互作用不全のために胚発生の第9.5日頃に死ぬことを明ら
かにした(Schorpp-Kistnerら、1999)。対照的に、マウスjunB遺伝子をヒトユ
ビキチンCプロモーターの制御下に(Ubi-junB)多数の異なる組織において構成的
に発現するトランスジェニックマウスは明らかな表現型を有しない(Schorppら
、1996)。Schorpp-Kistnerら(1999)はjunB変異胚の胚致死性はUbi-junB導入遺
伝子によってレスキューされることを明らかにし、junBの欠損は単に胚における
致死性表現型に関与することを示した。
【0004】
JunBは骨髄性細胞を含む種々の細胞型の増殖および分化の制御に関与している
(Schlingensiepenら、1993;Lordら、1990)。JunBはヒト成熟顆粒球において構
成的に発現している(Mollinedoら、1991)。さらに、JunB発現は骨髄の骨髄性
前駆細胞の最終分化にともなって、およびHL-60、U937およびM1のような樹立し
た骨髄性細胞株において強く誘導される(Lordら、1990;MollinedoとNaranjo、
1991;Lordら、1993)。従って、JunBは骨髄性細胞分化促進に重要な役割を果た
すかもしれないことが仮定され、JunB発現に影響を与える遺伝的変化が白血病発
生に寄与するかもしれないと考えられた。しかしながら、junBの役割は全く明ら
かにされていない。
(Schlingensiepenら、1993;Lordら、1990)。JunBはヒト成熟顆粒球において構
成的に発現している(Mollinedoら、1991)。さらに、JunB発現は骨髄の骨髄性
前駆細胞の最終分化にともなって、およびHL-60、U937およびM1のような樹立し
た骨髄性細胞株において強く誘導される(Lordら、1990;MollinedoとNaranjo、
1991;Lordら、1993)。従って、JunBは骨髄性細胞分化促進に重要な役割を果た
すかもしれないことが仮定され、JunB発現に影響を与える遺伝的変化が白血病発
生に寄与するかもしれないと考えられた。しかしながら、junBの役割は全く明ら
かにされていない。
【0005】
ヒト慢性骨髄性白血病(CML)は、骨髄性細胞系列の増殖増加を特徴とする、造
血幹細胞のクローン性悪性疾病である(Deiniger, 1998の総説;Sawyers、1999)
。CMLは成人白血病の約25%に達する。主要な臨床的特徴には、末梢血におけ
る白血球の数の上昇、肝脾腫大および骨髄の骨髄性細胞増生が含まれる。この疾
病の自然な経過は漸進性のものである。初期の慢性期は3年から5年以内の急速
な致死的急性転化へ続く。CML患者の90〜95%において、フィラデルフィア染色
体、相互交換転座によって生じ、この疾病の細胞質遺伝学的な顕著な特徴として
役立つ短くなった第22番染色体、t(9;22)(q34;q11)が存在している。
血幹細胞のクローン性悪性疾病である(Deiniger, 1998の総説;Sawyers、1999)
。CMLは成人白血病の約25%に達する。主要な臨床的特徴には、末梢血におけ
る白血球の数の上昇、肝脾腫大および骨髄の骨髄性細胞増生が含まれる。この疾
病の自然な経過は漸進性のものである。初期の慢性期は3年から5年以内の急速
な致死的急性転化へ続く。CML患者の90〜95%において、フィラデルフィア染色
体、相互交換転座によって生じ、この疾病の細胞質遺伝学的な顕著な特徴として
役立つ短くなった第22番染色体、t(9;22)(q34;q11)が存在している。
【0006】
患者のわずかなパーセンテージしか同種骨髄移植または幹細胞移植のような高
い治療効果のある治療手順を受けることができないのでCMLの治療はたいてい対
症的である。CMLの慢性期の間に、ブスルファンおよびヒドロキシウレアのよう
な経口化学治療薬剤を用いた細胞減少性の治療は血液学的緩解を誘導し、好中球
の数を正常範囲に維持し、血栓性合併症を回避することができる。あるいは、イ
ンターフェロンαは慢性期CMLの患者の血液学的および細胞遺伝学的緩解を誘導
することができる。対照的に、患者の少数のパーセンテージにおいて短期の緩解
がえられるものの、CMLの芽球期は大部分の化学治療薬剤養生法に対して抗療性
である。急性転化期患者の予後があまりよくないことは、治療のより効果的な態
様に対する差し迫った需要を明確に意味するものである。しかしながら、この線
に沿った前進は、CMLの急性転化期への移行の原因またはそれに伴う分子的事象
のよりよい理解を必要とする。
い治療効果のある治療手順を受けることができないのでCMLの治療はたいてい対
症的である。CMLの慢性期の間に、ブスルファンおよびヒドロキシウレアのよう
な経口化学治療薬剤を用いた細胞減少性の治療は血液学的緩解を誘導し、好中球
の数を正常範囲に維持し、血栓性合併症を回避することができる。あるいは、イ
ンターフェロンαは慢性期CMLの患者の血液学的および細胞遺伝学的緩解を誘導
することができる。対照的に、患者の少数のパーセンテージにおいて短期の緩解
がえられるものの、CMLの芽球期は大部分の化学治療薬剤養生法に対して抗療性
である。急性転化期患者の予後があまりよくないことは、治療のより効果的な態
様に対する差し迫った需要を明確に意味するものである。しかしながら、この線
に沿った前進は、CMLの急性転化期への移行の原因またはそれに伴う分子的事象
のよりよい理解を必要とする。
【0007】
白血病発生に寄与する機構を明らかにすること、および究極的にはそれらの機
構と干渉する効果的なCML治療法を設計するため、ヒトCMLのための動物モデルを
作製するために多くの実験アプローチがとられてきた。それらのアプローチは3
つのカテゴリーにグループ分けすることができる: 1.ヒト骨髄性白血病細胞のSCIDマウスへの導入 樹立された成長因子非依存性ヒト骨髄性白血病細胞株(K562、U937)または、
急性転化期の慢性骨髄性白血病の患者に由来する末梢血/骨髄細胞が重度免疫不
全(SCID)マウスに注射され、CML-様疾病が誘導された(Sawyers 1992, Cesano 1
992)。
構と干渉する効果的なCML治療法を設計するため、ヒトCMLのための動物モデルを
作製するために多くの実験アプローチがとられてきた。それらのアプローチは3
つのカテゴリーにグループ分けすることができる: 1.ヒト骨髄性白血病細胞のSCIDマウスへの導入 樹立された成長因子非依存性ヒト骨髄性白血病細胞株(K562、U937)または、
急性転化期の慢性骨髄性白血病の患者に由来する末梢血/骨髄細胞が重度免疫不
全(SCID)マウスに注射され、CML-様疾病が誘導された(Sawyers 1992, Cesano 1
992)。
【0008】
2.レトロウイルスベクターを用いた造血幹細胞への遺伝子トランスダクション
レトロウイルスベクターを用いて、野生型骨髄細胞が、G-CSF(Changら、1989
)、GM-CSF(Johnsonら、1989)、IL-3(Changら、1989;Wongら、1989)、IL-6
(Hawleyら、1992)、PDGF-B(Yanら、1994)、v-src(KellerとWagner、1989)、
Bcr-abl(Daleyら、1990;Elefantyら、1990;Kelliherら、1990)、v-myc(Bon
hamら、1992)、TEL/JAK2(Schwallerら、1998)、N-ras(MacKanzieら、1999)
および変異p53(Shounaら、1997)のような造血成長因子、癌遺伝子および変異
腫瘍抑制因子遺伝子をコードする遺伝子でトランスダクションされた。遺伝的に
改変された骨髄が致死的に照射した野生型レシピエントマウスに導入されたが、
そのマウスは種々の期間の後、骨髄増殖性症候群を発症させた。
)、GM-CSF(Johnsonら、1989)、IL-3(Changら、1989;Wongら、1989)、IL-6
(Hawleyら、1992)、PDGF-B(Yanら、1994)、v-src(KellerとWagner、1989)、
Bcr-abl(Daleyら、1990;Elefantyら、1990;Kelliherら、1990)、v-myc(Bon
hamら、1992)、TEL/JAK2(Schwallerら、1998)、N-ras(MacKanzieら、1999)
および変異p53(Shounaら、1997)のような造血成長因子、癌遺伝子および変異
腫瘍抑制因子遺伝子をコードする遺伝子でトランスダクションされた。遺伝的に
改変された骨髄が致死的に照射した野生型レシピエントマウスに導入されたが、
そのマウスは種々の期間の後、骨髄増殖性症候群を発症させた。
【0009】
3.遺伝的に改変されたマウス
CML-関連Bcr-Ablタンパク質をメタロチオネイン-1プロモーターの制御下に発
現するトランスジェニックマウスは誕生時に急性白血病を発症した(Heisterkam
pら、1990)。造血系においてICSBP(Holtschkeら、1996)、Ship(Helgasonら
、1998)またはNf-1(Largaespadaら、1996)を欠損するマウスは骨髄増殖性症
候群を発症させ、ICSBP変異マウスおよびNf-1変異マウスの場合は急性転化まで
進行することができた。
現するトランスジェニックマウスは誕生時に急性白血病を発症した(Heisterkam
pら、1990)。造血系においてICSBP(Holtschkeら、1996)、Ship(Helgasonら
、1998)またはNf-1(Largaespadaら、1996)を欠損するマウスは骨髄増殖性症
候群を発症させ、ICSBP変異マウスおよびNf-1変異マウスの場合は急性転化まで
進行することができた。
【0010】
慢性期から急性転化期への移行を研究し、および、造血細胞の腫瘍形成におけ
るJunBの役割を明らかにし、それらの知見を白血病の治療に活用するために特に
適切な、ヒトCMLの代替え的動物モデルを提供することは本発明の目的の内であ
る。 造血系におけるjunBの役割はjunB-/-Ubi-junBトランスジェニックマウスを用
いて研究された。これらのマウスはSchorpp-Kistnerら(1999)によって記載され
た方法に従って得られた。簡単に言うと、Ubi-junBトランスジェニックマウスを
junB変異ヘテロ接合マウスと交配し、トランスジェニックjunB変異ヘテロ接合子
孫を交雑して、Ubi-junB導入遺伝子を有する不活性化junBアレルについてホモ接
合であるマウスを作製した(図1)。そのようなjunB-/-Ubi-junBマウスは予想
されるメンデル比で得られた(表1)。 意外なことに、本発明の実験においてjunB-/-Ubi-junBマウスは骨髄性細胞系
列においてJunB発現を欠くために骨髄増殖性疾病を発症させることが見いだされ
た。
るJunBの役割を明らかにし、それらの知見を白血病の治療に活用するために特に
適切な、ヒトCMLの代替え的動物モデルを提供することは本発明の目的の内であ
る。 造血系におけるjunBの役割はjunB-/-Ubi-junBトランスジェニックマウスを用
いて研究された。これらのマウスはSchorpp-Kistnerら(1999)によって記載され
た方法に従って得られた。簡単に言うと、Ubi-junBトランスジェニックマウスを
junB変異ヘテロ接合マウスと交配し、トランスジェニックjunB変異ヘテロ接合子
孫を交雑して、Ubi-junB導入遺伝子を有する不活性化junBアレルについてホモ接
合であるマウスを作製した(図1)。そのようなjunB-/-Ubi-junBマウスは予想
されるメンデル比で得られた(表1)。 意外なことに、本発明の実験においてjunB-/-Ubi-junBマウスは骨髄性細胞系
列においてJunB発現を欠くために骨髄増殖性疾病を発症させることが見いだされ
た。
【0011】
実験の第1組において、JunB-/-Ubi-junBマウスに由来する種々の造血系にお
いて、mRNAおよびタンパク質レベルでJunB発現が解析された。骨髄性細胞系列を
除いて全ての造血系がJunBを発現することが見いだされた(図2)。ユビキチン
Cプロモーターのサイレンシングは転写レベルでおこり、厳格に骨髄性細胞特異
的および年齢依存的様式で生じる。 更に、骨髄性細胞系列におけるUbi-junB導入遺伝子発現の漸進的な欠損は骨髄
増殖性疾病の発症と完全に相関した。 全てのJunB-/-Ubi-junBマウスは、11月齢までに完全浸透度をもって骨髄増
殖性疾病を発症した。 骨髄増殖性疾病は造血系器官における顆粒球生成区画の漸進的かつ選択的拡大
によって特徴づけられる疾病である(図3および表2)。JunB-/-Ubi-junBマウ
スのある割合では、この疾病は致死的急性転化期へ進行する。
いて、mRNAおよびタンパク質レベルでJunB発現が解析された。骨髄性細胞系列を
除いて全ての造血系がJunBを発現することが見いだされた(図2)。ユビキチン
Cプロモーターのサイレンシングは転写レベルでおこり、厳格に骨髄性細胞特異
的および年齢依存的様式で生じる。 更に、骨髄性細胞系列におけるUbi-junB導入遺伝子発現の漸進的な欠損は骨髄
増殖性疾病の発症と完全に相関した。 全てのJunB-/-Ubi-junBマウスは、11月齢までに完全浸透度をもって骨髄増
殖性疾病を発症した。 骨髄増殖性疾病は造血系器官における顆粒球生成区画の漸進的かつ選択的拡大
によって特徴づけられる疾病である(図3および表2)。JunB-/-Ubi-junBマウ
スのある割合では、この疾病は致死的急性転化期へ進行する。
【0012】
骨髄増殖性疾病は、野生型レシピエントマウスに移植可能なので細胞自律性で
あること(図4)、および、junB-/-胎仔肝臓幹細胞で再構成したマウスにおい
て発症するのでJunB欠損に特異的であることが見いだされた。in vitroおよびin
vivoの両方でサイクリングしている骨髄性細胞前駆体の数の増加が見られるた
め、JunBの欠損は骨髄造血に前駆細胞レベルで影響を与えることが見いだされた
(図5)。骨髄性細胞前駆体の数の増加は骨髄増殖性疾病を引き起こし易い。更
なるin vitro特徴解析は、JunB-欠損骨髄性細胞前駆体はアポトーシスレベルが
低下しており、そのことは成長因子およびサイトカイン環境に非依存性であり、
成長因子GM-CSF存在下で増殖が増すことを明らかにした。
あること(図4)、および、junB-/-胎仔肝臓幹細胞で再構成したマウスにおい
て発症するのでJunB欠損に特異的であることが見いだされた。in vitroおよびin
vivoの両方でサイクリングしている骨髄性細胞前駆体の数の増加が見られるた
め、JunBの欠損は骨髄造血に前駆細胞レベルで影響を与えることが見いだされた
(図5)。骨髄性細胞前駆体の数の増加は骨髄増殖性疾病を引き起こし易い。更
なるin vitro特徴解析は、JunB-欠損骨髄性細胞前駆体はアポトーシスレベルが
低下しており、そのことは成長因子およびサイトカイン環境に非依存性であり、
成長因子GM-CSF存在下で増殖が増すことを明らかにした。
【0013】
このように、JunBの欠損は骨髄性白血病を生じさせるので、本発明の実験はJu
nBはin vivo骨髄性造血の際に重要な役割を果たすことを明らかにした。これら
の実験は、JunBは骨髄性細胞前駆体の増殖と生存のいずれをも骨髄成熟と干渉せ
ずに制御することによって骨髄性造血の負の制御因子として作用することを明ら
かにした。 junB-/-Ubi-junBマウスに見られる骨髄増殖性疾病は驚くべきことにヒトCMLの
本質的特徴を再現するものである。骨髄性細胞系列においてJunB発現が存在しな
いことは骨髄性細胞増殖およびそれに続く骨髄性細胞過増殖をもたらす。多段階
腫瘍形成のモデルと矛盾無く、ある割合のjunB-/-Ubi-junBマウスは骨髄増殖性
疾病の過程で急性転化を発症させ、このことは過増殖が結局芽球性トランスフォ
ーメーション(blastic transformation)へつながる更なる遺伝的変異の素因とな
ることを示している。junB-/-Ubi-junBマウスの骨髄増殖性疾病とヒトCMLとの類
似性は、これらのマウスが白血病発生、特に芽球性トランスフォーメーションに
寄与する遺伝子を同定するための非常に有効な手段であることを示している。
nBはin vivo骨髄性造血の際に重要な役割を果たすことを明らかにした。これら
の実験は、JunBは骨髄性細胞前駆体の増殖と生存のいずれをも骨髄成熟と干渉せ
ずに制御することによって骨髄性造血の負の制御因子として作用することを明ら
かにした。 junB-/-Ubi-junBマウスに見られる骨髄増殖性疾病は驚くべきことにヒトCMLの
本質的特徴を再現するものである。骨髄性細胞系列においてJunB発現が存在しな
いことは骨髄性細胞増殖およびそれに続く骨髄性細胞過増殖をもたらす。多段階
腫瘍形成のモデルと矛盾無く、ある割合のjunB-/-Ubi-junBマウスは骨髄増殖性
疾病の過程で急性転化を発症させ、このことは過増殖が結局芽球性トランスフォ
ーメーション(blastic transformation)へつながる更なる遺伝的変異の素因とな
ることを示している。junB-/-Ubi-junBマウスの骨髄増殖性疾病とヒトCMLとの類
似性は、これらのマウスが白血病発生、特に芽球性トランスフォーメーションに
寄与する遺伝子を同定するための非常に有効な手段であることを示している。
【0014】
第一の側面において、本発明は、骨髄性細胞系列においてJunB発現を欠損する
トランスジェニック動物の、ヒトCMLのためのモデルとしての使用に関する。 遺伝子操作技術はマウスについてもっともよく開発されているので、好ましい
実施態様では、その動物はマウスである。しかしながら、ラット、サル、ブタ等
の他の哺乳動物も、対応する表現型を導く同等の遺伝子操作を可能とする方法を
適用して使用することができる。 骨髄性細胞系列においてjunBを欠損するマウスを作製するいくつかの方法が利
用できる。 第1の方法によれば、このマウスは、通常のjunBノックアウトにjunB導入遺伝
子を適用することによる遺伝子導入相補によって得ることができ、そこでは初期
胚発生の間の発現をもたらす強力な構成的プロモーターの制御下にjunBが置かれ
ている。この例は、本発明の実験で使用されている、ヒトユビキチンCプロモー
ター(Schorppら、1996)である。
トランスジェニック動物の、ヒトCMLのためのモデルとしての使用に関する。 遺伝子操作技術はマウスについてもっともよく開発されているので、好ましい
実施態様では、その動物はマウスである。しかしながら、ラット、サル、ブタ等
の他の哺乳動物も、対応する表現型を導く同等の遺伝子操作を可能とする方法を
適用して使用することができる。 骨髄性細胞系列においてjunBを欠損するマウスを作製するいくつかの方法が利
用できる。 第1の方法によれば、このマウスは、通常のjunBノックアウトにjunB導入遺伝
子を適用することによる遺伝子導入相補によって得ることができ、そこでは初期
胚発生の間の発現をもたらす強力な構成的プロモーターの制御下にjunBが置かれ
ている。この例は、本発明の実験で使用されている、ヒトユビキチンCプロモー
ター(Schorppら、1996)である。
【0015】
別の方法では、このマウスは、確立された遺伝的アプローチにより骨髄性細胞
系列においてjunBを条件的不活性化することによって作製することができる。そ
のような条件的不活性化の例は、充分に確立されたCre/loxP系(Arakiら、1995
)およびFlp/FRT系(Dymecki、1996)である。Cre/loxP系において、Capecchi(1
989)によって記載された標準的なES細胞技術によって、内在性junB遺伝子がフロ
ックス(floxed)junBアレル(junBコード配列全体が2つのloxP部位に挟まれてい
る)によって置き換えられているES細胞を胚盤胞に注射することにより、フロッ
クスjunBノックインマウスが作製される。次にフロックスjunBマウスは骨髄性細
胞系列、好ましくは骨髄性細胞前駆体でCreリコンビナーゼを発現するトランス
ジェニックマウスと交配される。ヒトHMRP8遺伝子(LagasseとWeismann、1994;
Brownら、1997)およびヒトカテプシンG遺伝子(Grisolanoら、1997)のプロモ
ーターのように、骨髄性細胞特異的遺伝子の多数のプロモーター要素が導入遺伝
子発現を骨髄性細胞へ標的化するために示されている。しかしながら、CREリコ
ンビナーゼ活性を骨髄性細胞系列に向けさせるどんなプロモーター要素もこのア
プローチに適切である。同様なストラテジーは、junBの両側にFRT部位を置き、F
lpリコンビナーゼを骨髄性細胞特異的プロモーターの制御下に発現させることに
よってFlp/FRT系についても適用できる。
系列においてjunBを条件的不活性化することによって作製することができる。そ
のような条件的不活性化の例は、充分に確立されたCre/loxP系(Arakiら、1995
)およびFlp/FRT系(Dymecki、1996)である。Cre/loxP系において、Capecchi(1
989)によって記載された標準的なES細胞技術によって、内在性junB遺伝子がフロ
ックス(floxed)junBアレル(junBコード配列全体が2つのloxP部位に挟まれてい
る)によって置き換えられているES細胞を胚盤胞に注射することにより、フロッ
クスjunBノックインマウスが作製される。次にフロックスjunBマウスは骨髄性細
胞系列、好ましくは骨髄性細胞前駆体でCreリコンビナーゼを発現するトランス
ジェニックマウスと交配される。ヒトHMRP8遺伝子(LagasseとWeismann、1994;
Brownら、1997)およびヒトカテプシンG遺伝子(Grisolanoら、1997)のプロモ
ーターのように、骨髄性細胞特異的遺伝子の多数のプロモーター要素が導入遺伝
子発現を骨髄性細胞へ標的化するために示されている。しかしながら、CREリコ
ンビナーゼ活性を骨髄性細胞系列に向けさせるどんなプロモーター要素もこのア
プローチに適切である。同様なストラテジーは、junBの両側にFRT部位を置き、F
lpリコンビナーゼを骨髄性細胞特異的プロモーターの制御下に発現させることに
よってFlp/FRT系についても適用できる。
【0016】
所望の表現型を有するマウスを得るための別の方法は、従前に記載されたよう
に(Wangら、1997)、junBホモ接合変異ES細胞を野生型4倍体胚盤胞に導入する
ことである。この技術は、junB変異胚の初期胚致死性をレスキューすることがで
き、junB変異胚の発生を妊娠中期まで許す(Schorpp-Kistnerら、1999;我々の
結果)。造血幹細胞を含む胎仔肝細胞懸濁液をそのようなレスキューされたjunB
変異胎仔E12.5四倍体から調製し、標準的な手順に従って、致死的照射をした野
生型レシピエントマウスを再構成するために使用した。本発明の実験において、
junB変異胎仔肝細胞が実際に致死的照射同系マウスレシピエントの造血系を再構
成し、そのようなレシピエントマウスが骨髄増殖性疾病を発症することを証明す
ることができた。
に(Wangら、1997)、junBホモ接合変異ES細胞を野生型4倍体胚盤胞に導入する
ことである。この技術は、junB変異胚の初期胚致死性をレスキューすることがで
き、junB変異胚の発生を妊娠中期まで許す(Schorpp-Kistnerら、1999;我々の
結果)。造血幹細胞を含む胎仔肝細胞懸濁液をそのようなレスキューされたjunB
変異胎仔E12.5四倍体から調製し、標準的な手順に従って、致死的照射をした野
生型レシピエントマウスを再構成するために使用した。本発明の実験において、
junB変異胎仔肝細胞が実際に致死的照射同系マウスレシピエントの造血系を再構
成し、そのようなレシピエントマウスが骨髄増殖性疾病を発症することを証明す
ることができた。
【0017】
これらの方法によって得られるマウスは、以下の目的に有用である:
第1に、実施例6に記載したように、骨髄性細胞系列においてJunB発現を欠損
するマウスはJunB欠損骨髄性細胞株を樹立するための供給源として使用すること
ができる。本発明の実験において、JunB発現を欠損する骨髄性細胞株はjunB-/-U
bi-junBマウスからうまく誘導された(図6)。あるいは、そのような細胞株は
骨髄性細胞系列においてJunB発現を欠くどんなマウスからも得ることができる。 従って、本発明はJunB発現を欠損する骨髄性細胞に関する。 これらの細胞は、(a)骨髄性細胞の増殖を阻害する薬剤、従って、CML、特
に急性転化期における治療に有用な薬剤の同定、(b)骨髄性細胞の増殖及び分
化の制御に関与するJunB標的遺伝子の探索、および(c)骨髄性細胞のトランス
フォーメーションに関与する遺伝的事象のスクリーニング、に有用な道具である
。
するマウスはJunB欠損骨髄性細胞株を樹立するための供給源として使用すること
ができる。本発明の実験において、JunB発現を欠損する骨髄性細胞株はjunB-/-U
bi-junBマウスからうまく誘導された(図6)。あるいは、そのような細胞株は
骨髄性細胞系列においてJunB発現を欠くどんなマウスからも得ることができる。 従って、本発明はJunB発現を欠損する骨髄性細胞に関する。 これらの細胞は、(a)骨髄性細胞の増殖を阻害する薬剤、従って、CML、特
に急性転化期における治療に有用な薬剤の同定、(b)骨髄性細胞の増殖及び分
化の制御に関与するJunB標的遺伝子の探索、および(c)骨髄性細胞のトランス
フォーメーションに関与する遺伝的事象のスクリーニング、に有用な道具である
。
【0018】
この原理に基づくスクリーニングアッセイの実施の例は以下のとおりである。
JunB欠損骨髄性細胞株は以下のために使用することができる:
(a)細胞増殖を阻害し、最終分化を誘導する薬剤又は成分を同定すること。
(b)骨髄性細胞の増殖および分化に関与するJunB標的遺伝子を同定すること:
この目的のためには、JunB欠損骨髄性細胞株にjunBを再導入することによって人
工的制御をつくりだすことができる。細胞は、ヒトエストロゲンレセプター(ER)
またはヒトプロゲステロンレセプター(PR)のホルモン結合領域のような、誘導可
能な系にインフレームで融合させた完全長マウスjunB遺伝子を含む組換えDNA分
子で、慣用的な方法によって安定にトランスフェクション又はインフェクション
される。これらの誘導可能系の原理は、キメラタンパク質は構成的に発現される
ものの、それはエストロゲンレセプターに対する外来性β−エストラジオールの
ような適切なリガンドの非存在下では不活性状態にある(Picard、1994)という
ことである。この擬似−制御細胞およびjunB-/-Ubi-junB細胞を解析にかけて、
遺伝子およびタンパク質の差異的発現を決定するためのこの分野で知られた方法
(例えば、ディファレンシャルディスプレイ、RT-PCR解析、DNAマイクロアレイ
技術、サブトラクションハイブリダイゼーションまたはプロテオーム解析など)
を用いてJunB標的遺伝子を同定することができる。 (c)芽球性トランスフォーメーションと関連した遺伝的事象の同定。遺伝子再
配置および染色体転座を解析するための標準的方法を用いて統計的な数の独立の
JunB欠損骨髄性細胞株に見られる共通のトランスフォーメーション事象を探索す
ることができる。
この目的のためには、JunB欠損骨髄性細胞株にjunBを再導入することによって人
工的制御をつくりだすことができる。細胞は、ヒトエストロゲンレセプター(ER)
またはヒトプロゲステロンレセプター(PR)のホルモン結合領域のような、誘導可
能な系にインフレームで融合させた完全長マウスjunB遺伝子を含む組換えDNA分
子で、慣用的な方法によって安定にトランスフェクション又はインフェクション
される。これらの誘導可能系の原理は、キメラタンパク質は構成的に発現される
ものの、それはエストロゲンレセプターに対する外来性β−エストラジオールの
ような適切なリガンドの非存在下では不活性状態にある(Picard、1994)という
ことである。この擬似−制御細胞およびjunB-/-Ubi-junB細胞を解析にかけて、
遺伝子およびタンパク質の差異的発現を決定するためのこの分野で知られた方法
(例えば、ディファレンシャルディスプレイ、RT-PCR解析、DNAマイクロアレイ
技術、サブトラクションハイブリダイゼーションまたはプロテオーム解析など)
を用いてJunB標的遺伝子を同定することができる。 (c)芽球性トランスフォーメーションと関連した遺伝的事象の同定。遺伝子再
配置および染色体転座を解析するための標準的方法を用いて統計的な数の独立の
JunB欠損骨髄性細胞株に見られる共通のトランスフォーメーション事象を探索す
ることができる。
【0019】
骨髄性細胞系列においてjunB発現を欠損するマウスは、抗増殖効果についての
スクリーニングアッセイ(a)において同定される候補化合物を確認するための
動物モデルとして使用することができる。化合物はこのマウスに投与され、その
化合物の効果がその潜在的治療効果を測定することによって、例えば、末梢血中
の好中性顆粒球の絶対数を測定することによって監視されるであろう。これらの
細胞の数を減少させる化合物はヒトCMLの、特に慢性期における治療のための薬
剤としての候補である。 骨髄性細胞系列においてjunB発現を欠損する、急性転化期にあるマウスは、(
c)において同定される事象のin vivo顕示を確認するために、この技術分野で
知られた適切な方法によって解析される適切な材料(組織、細胞、DNA、RNA、タ
ンパク質)の供給源としても使用することができる。
スクリーニングアッセイ(a)において同定される候補化合物を確認するための
動物モデルとして使用することができる。化合物はこのマウスに投与され、その
化合物の効果がその潜在的治療効果を測定することによって、例えば、末梢血中
の好中性顆粒球の絶対数を測定することによって監視されるであろう。これらの
細胞の数を減少させる化合物はヒトCMLの、特に慢性期における治療のための薬
剤としての候補である。 骨髄性細胞系列においてjunB発現を欠損する、急性転化期にあるマウスは、(
c)において同定される事象のin vivo顕示を確認するために、この技術分野で
知られた適切な方法によって解析される適切な材料(組織、細胞、DNA、RNA、タ
ンパク質)の供給源としても使用することができる。
【0020】
更に、本発明の実験において、細胞増殖の制御におけるJunBの役割はUbi-junB
トランスジェニックマウス由来の線維芽細胞を用いてin vitroで解析された(図
7)。高いレベルでJunBを発現する自発的不死化3T3-線維芽細胞は、細胞周期の
長くなったG1期のために著しい増殖不全を起こす。これらの線維芽細胞はサイク
リン依存性キナーゼ阻害因子p16/INK4aのレベルが上昇しており、サイクリンD1/
CDK4-6キナーゼ活性の完全な阻害およびpRbリン酸化の低下を生じさせる。最後
に、3つのJunB/AP-1結合部位がマウスp16プロモーター中で解析された(このプ
ロモーターを通してJunBは転写的にp16発現を制御する)。これらの結果は、Jun
Bを細胞増殖の負の因子として明らかにするものであり、成長因子シグナル伝達
とサイクリン依存性キナーゼ阻害因子による細胞周期進行の制御との分子的つな
がりを提供するものである。 これらの発見を上述のin vivoの結果と合わせると、最終分化過程に際して細
胞の増殖停止を生じさせるように、例えば、最終分化過程で骨髄性細胞の増殖停
止を生じさせるようにin vivoで働くことができる潜在的腫瘍抑制遺伝子としてJ
unBを考えることができる。
トランスジェニックマウス由来の線維芽細胞を用いてin vitroで解析された(図
7)。高いレベルでJunBを発現する自発的不死化3T3-線維芽細胞は、細胞周期の
長くなったG1期のために著しい増殖不全を起こす。これらの線維芽細胞はサイク
リン依存性キナーゼ阻害因子p16/INK4aのレベルが上昇しており、サイクリンD1/
CDK4-6キナーゼ活性の完全な阻害およびpRbリン酸化の低下を生じさせる。最後
に、3つのJunB/AP-1結合部位がマウスp16プロモーター中で解析された(このプ
ロモーターを通してJunBは転写的にp16発現を制御する)。これらの結果は、Jun
Bを細胞増殖の負の因子として明らかにするものであり、成長因子シグナル伝達
とサイクリン依存性キナーゼ阻害因子による細胞周期進行の制御との分子的つな
がりを提供するものである。 これらの発見を上述のin vivoの結果と合わせると、最終分化過程に際して細
胞の増殖停止を生じさせるように、例えば、最終分化過程で骨髄性細胞の増殖停
止を生じさせるようにin vivoで働くことができる潜在的腫瘍抑制遺伝子としてJ
unBを考えることができる。
【0021】
細胞周期制御におけるJunBの役割およびその作用機序を明らかにすることは、
それ自体、その腫瘍抑制機能を直接的または間接的に増強する薬剤を同定するた
めの方法の基礎を提供する。そのような薬剤の例は、JunB標的遺伝子、例えば細
胞周期の負の制御因子p16の活性を増加させる、または、JunB-媒介シグナル伝達
経路の下流の構成要素、例えば、細胞周期の正の制御因子であるサイクリンD/CD
K4-6複合体(サイクリンD1はJunBによって抑制され、従ってJunBの非存在下で増
加する;Bakiriら、2000)の活性を阻害する物質である。 B-Jun標的遺伝子の更なる例は、JunBによって抑制され、従って、JunBの非存
在下(DengとKarin、1993)で増加するc-Jun、および、JunBによって活性化され
るIL4(Liら、1999)である。
それ自体、その腫瘍抑制機能を直接的または間接的に増強する薬剤を同定するた
めの方法の基礎を提供する。そのような薬剤の例は、JunB標的遺伝子、例えば細
胞周期の負の制御因子p16の活性を増加させる、または、JunB-媒介シグナル伝達
経路の下流の構成要素、例えば、細胞周期の正の制御因子であるサイクリンD/CD
K4-6複合体(サイクリンD1はJunBによって抑制され、従ってJunBの非存在下で増
加する;Bakiriら、2000)の活性を阻害する物質である。 B-Jun標的遺伝子の更なる例は、JunBによって抑制され、従って、JunBの非存
在下(DengとKarin、1993)で増加するc-Jun、および、JunBによって活性化され
るIL4(Liら、1999)である。
【0022】
JunB標的遺伝子の制御配列および新たに発見されたJunB標的遺伝子は細胞増殖
に対するJunBの阻害的効果を抑制する薬剤の効果を検討するために使用すること
ができる。 この原理に基づくスクリーニングアッセイを行う例は以下のとおりである: 適切な試験細胞はJunBタンパク質を高レベルで発現している線維芽細胞、例え
ば、実施例7に記載したようなUbi-junBトランスジェニックマウス由来の線維芽
細胞である。細胞は、既知の方法でレポーター遺伝子に融合させたJunB標的遺伝
子、例えば、p16(Soloffら、1996;Genbankアクセション番号AF022809)、の制
御領域を含む組換えDNA分子により、通常の技術によって安定的にトランスフェ
クションされる。その発現産物がその濃度に釣り合ったシグナルを測定すること
により検出でき、定量できるどんなレポーター遺伝子を用いてもよい。好ましく
は、ルシフェラーゼ遺伝子、緑色蛍光タンパク質(GFP)遺伝子またはLacZ遺伝子
のようにその発現が自動化アッセイにおいて高感度で測定することのできるレポ
ーター遺伝子が用いられる。細胞は、試験すべき物質の存在下または非存在下で
適切な培地中で生育され、(1)細胞の増殖および(2)レポーター遺伝子活性
に対する影響についてアッセイされる。増殖は、標準的な技術、例えば、細胞数
を定量することにより、または3H-チミジンまたはデスオキシブロモウリジン取
り込みを測定することにより測定することができる。 所望の効果を示す物質は、試験細胞の増殖を増加させ、レポーター遺伝子の活
性を下方調節するであろう。
に対するJunBの阻害的効果を抑制する薬剤の効果を検討するために使用すること
ができる。 この原理に基づくスクリーニングアッセイを行う例は以下のとおりである: 適切な試験細胞はJunBタンパク質を高レベルで発現している線維芽細胞、例え
ば、実施例7に記載したようなUbi-junBトランスジェニックマウス由来の線維芽
細胞である。細胞は、既知の方法でレポーター遺伝子に融合させたJunB標的遺伝
子、例えば、p16(Soloffら、1996;Genbankアクセション番号AF022809)、の制
御領域を含む組換えDNA分子により、通常の技術によって安定的にトランスフェ
クションされる。その発現産物がその濃度に釣り合ったシグナルを測定すること
により検出でき、定量できるどんなレポーター遺伝子を用いてもよい。好ましく
は、ルシフェラーゼ遺伝子、緑色蛍光タンパク質(GFP)遺伝子またはLacZ遺伝子
のようにその発現が自動化アッセイにおいて高感度で測定することのできるレポ
ーター遺伝子が用いられる。細胞は、試験すべき物質の存在下または非存在下で
適切な培地中で生育され、(1)細胞の増殖および(2)レポーター遺伝子活性
に対する影響についてアッセイされる。増殖は、標準的な技術、例えば、細胞数
を定量することにより、または3H-チミジンまたはデスオキシブロモウリジン取
り込みを測定することにより測定することができる。 所望の効果を示す物質は、試験細胞の増殖を増加させ、レポーター遺伝子の活
性を下方調節するであろう。
【0023】
更なる段階では、この同定した物質を、JunBが細胞増殖に阻害的効果を有する
どんな細胞型の増殖、例えば骨髄由来初代骨髄性細胞の増殖に対する効果につい
てテストすることもできる。所望の効果を示す物質は、骨髄性細胞の増殖速度を
増加させるであろうし、例えば化学療法および/または放射線療法の後で骨髄性
細胞の増殖を爆発的に生じさせるためのヒトの薬剤としての応用に有用である。 従って、更なる側面において、本発明は、活性成分として正常細胞において細
胞増殖の負の制御因子としてのJunB活性を阻害する物質を含む医薬組成物に関す
る。JunBの活性を阻害する物質は、造血が損傷された状況において、例えば、化
学療法および/または放射線療法の後で、骨髄性細胞のような細胞の再生を促進
する薬剤として有用である。それらは種々の機構により、例えば、JunB発現、Ju
nB安定性、JunB DNA結合および/またはトランス活性化活性を低下させることに
より作用することができるであろう。
どんな細胞型の増殖、例えば骨髄由来初代骨髄性細胞の増殖に対する効果につい
てテストすることもできる。所望の効果を示す物質は、骨髄性細胞の増殖速度を
増加させるであろうし、例えば化学療法および/または放射線療法の後で骨髄性
細胞の増殖を爆発的に生じさせるためのヒトの薬剤としての応用に有用である。 従って、更なる側面において、本発明は、活性成分として正常細胞において細
胞増殖の負の制御因子としてのJunB活性を阻害する物質を含む医薬組成物に関す
る。JunBの活性を阻害する物質は、造血が損傷された状況において、例えば、化
学療法および/または放射線療法の後で、骨髄性細胞のような細胞の再生を促進
する薬剤として有用である。それらは種々の機構により、例えば、JunB発現、Ju
nB安定性、JunB DNA結合および/またはトランス活性化活性を低下させることに
より作用することができるであろう。
【0024】
更なる側面では、本発明は活性成分として、腫瘍細胞増殖の負の制御因子とし
てのJunBの活性を増強する物質を含む医薬組成物に関する。従って、JunB活性を
増強する物質は抗腫瘍剤として有用である。それらは、種々の機構に従って、例
えば、JunB発現、JunB安定性、JunB DNA結合および/またはトランス活性化活性
を増加させることにより作用することができるであろう。 JunB活性を増強する化合物は、JunB遺伝子の制御領域の制御下にあるレポータ
ー遺伝子でトランスフェクションした細胞を用いて、それ自体既知である方法に
(WO 92/13063)従ったスクリーニングアッセイで同定することができる。所望
の効果を有する物質はレポーター遺伝子発現を増強するであろう。 あるいは、有用な化合物は、JunB cDNAを含むプラスミドでトランスフェクシ
ョンした細胞を生育させて試験化合物の存在下または非存在下でJunBを過剰発現
させ、発現させたJunBの安定性を、例えば、メチオニンパルスチェイス標識法に
よって測定し、JunB安定性を増加させる化合物を選抜することによって同定する
ことができる。
てのJunBの活性を増強する物質を含む医薬組成物に関する。従って、JunB活性を
増強する物質は抗腫瘍剤として有用である。それらは、種々の機構に従って、例
えば、JunB発現、JunB安定性、JunB DNA結合および/またはトランス活性化活性
を増加させることにより作用することができるであろう。 JunB活性を増強する化合物は、JunB遺伝子の制御領域の制御下にあるレポータ
ー遺伝子でトランスフェクションした細胞を用いて、それ自体既知である方法に
(WO 92/13063)従ったスクリーニングアッセイで同定することができる。所望
の効果を有する物質はレポーター遺伝子発現を増強するであろう。 あるいは、有用な化合物は、JunB cDNAを含むプラスミドでトランスフェクシ
ョンした細胞を生育させて試験化合物の存在下または非存在下でJunBを過剰発現
させ、発現させたJunBの安定性を、例えば、メチオニンパルスチェイス標識法に
よって測定し、JunB安定性を増加させる化合物を選抜することによって同定する
ことができる。
【0025】
(実施例)
実施例1.junB-/-Ubi-junBマウスの作製
junB-/-Ubi-junBマウスはSchorpp-Kistnerら(1999)によって記載された方法
に従って得た。簡単に言うと、Ubi-junBトランスジェニックマウスをjunB変異ヘ
テロ接合マウスに交配し、トランスジェニックjunB変異ヘテロ接合子孫を交雑し
て、不活性junBアレルについてホモ接合である、Ubi-junB導入遺伝子を有するマ
ウスを作製した。使用したアプローチは図1に模式的に概略を記載してある。そ
のようなjunB-/-Ubi-junBマウスは、表1に記載した、予測されるメンデル比で
得られた。
に従って得た。簡単に言うと、Ubi-junBトランスジェニックマウスをjunB変異ヘ
テロ接合マウスに交配し、トランスジェニックjunB変異ヘテロ接合子孫を交雑し
て、不活性junBアレルについてホモ接合である、Ubi-junB導入遺伝子を有するマ
ウスを作製した。使用したアプローチは図1に模式的に概略を記載してある。そ
のようなjunB-/-Ubi-junBマウスは、表1に記載した、予測されるメンデル比で
得られた。
【0026】
【表1】
【0027】
実施例2.種々の造血系列におけるJunB発現の解析
junB-/-Ubi-junBマウスの造血系におけるJunB発現を調べるために、種々の造
血系列細胞をそれらの細胞表面マーカー型に従って既知の方法(Coliganら、199
2)でFACS-ソーティングした。これらの細胞集団のmRNAおよびタンパク質調製物
を標準的な方法(Sambrookら、1989)に従って得た。RT-PCRおよびタンパク質解
析は、junB-/-Ubi-junBマウスからの骨髄性細胞(M: GR-1+/Mac-1+)だけがJunB
発現を欠いており、一方、JunB発現はBリンパ細胞(B: CD19+/Ig-M+)、Tヘル
パーリンパ細胞(T: CD4+/CD8-)および赤血球系細胞(E: TER-119+)において
検出されることを明らかにした(図2)。この発現プロファイルはjunB-/-Ubi-j
unBマウスマウスは骨髄性細胞系列においてJunB発現の細胞型特異的欠損を示す
ことを表している。
血系列細胞をそれらの細胞表面マーカー型に従って既知の方法(Coliganら、199
2)でFACS-ソーティングした。これらの細胞集団のmRNAおよびタンパク質調製物
を標準的な方法(Sambrookら、1989)に従って得た。RT-PCRおよびタンパク質解
析は、junB-/-Ubi-junBマウスからの骨髄性細胞(M: GR-1+/Mac-1+)だけがJunB
発現を欠いており、一方、JunB発現はBリンパ細胞(B: CD19+/Ig-M+)、Tヘル
パーリンパ細胞(T: CD4+/CD8-)および赤血球系細胞(E: TER-119+)において
検出されることを明らかにした(図2)。この発現プロファイルはjunB-/-Ubi-j
unBマウスマウスは骨髄性細胞系列においてJunB発現の細胞型特異的欠損を示す
ことを表している。
【0028】
実施例3.junB-/-Ubi-junBマウスの表現型解析
実施例1で得られた全てのjunB-/-Ubi-junBマウスは11月齢までに完全な浸
透度をもって骨髄増殖性疾病を発症した。血液細胞の絶対数を測定することによ
る、および染色した血液塗沫標本を評価することによる末梢血の血液学的解析は
、6〜11月齢においてjunB-/-Ubi-junBマウスの白血球数の10倍増加を明ら
かにした。この増加はほとんど好中性顆粒球数の上昇によるものであった。赤血
球、リンパ細胞、単球および抗酸性顆粒球のような他の造血系細胞の数は、野生
型対照と同等であった。しかしながら、低下したヘモグロビン濃度は低色素性貧
血の存在を示していた。結果を表2に示した(n=各ゲノム型について解析した
マウスの数)
透度をもって骨髄増殖性疾病を発症した。血液細胞の絶対数を測定することによ
る、および染色した血液塗沫標本を評価することによる末梢血の血液学的解析は
、6〜11月齢においてjunB-/-Ubi-junBマウスの白血球数の10倍増加を明ら
かにした。この増加はほとんど好中性顆粒球数の上昇によるものであった。赤血
球、リンパ細胞、単球および抗酸性顆粒球のような他の造血系細胞の数は、野生
型対照と同等であった。しかしながら、低下したヘモグロビン濃度は低色素性貧
血の存在を示していた。結果を表2に示した(n=各ゲノム型について解析した
マウスの数)
【0029】
【表2】
【0030】
疾病junB-/-Ubi-junBマウスの概略的な解剖学的解析は脾臓およびリンパ節の
矛盾のない広範な拡大を明らかにした。脾臓切片の組織学的検査は、種々の成熟
段階にある骨髄性細胞による赤脾髄の浸潤によって示される顕著な骨髄過形成を
明らかにした。クロロアセテートエステラーゼに対する組織化学的染色により、
多数の成熟好中性顆粒球の存在が示された。 脾臓細胞の染色サイトスピン(cytospin)標本によって、種々の骨髄性細胞、主
として成熟顆粒球の存在が確認された。junB-/-Ubi-junBマウスの骨髄は、サイ
トスピン標本及び骨髄の組織学的切片の検査によって決定されたように、増加し
た細胞質および骨髄過形成を示した。junB-/-Ubi-junB肝臓の組織学的解析は顆
粒球系列の成熟および未成熟細胞による門脈路の浸潤を明らかにした。細胞型特
異的表面マーカーに対する抗体を用いた骨髄および脾臓細胞の単一細胞懸濁液の
FACS解析は、リンパ系細胞区画の減少を続いて伴う骨髄性細胞区画の劇的な拡張
を明らかにした(図3)。 造血器官または心臓、肺、腎臓および皮膚のような非造血器官の未成熟芽細胞
による浸潤によって示されるように、junB-/-Ubi-junBマウスの10〜20%におい
て、急性転化への疾病進行が観察された。
矛盾のない広範な拡大を明らかにした。脾臓切片の組織学的検査は、種々の成熟
段階にある骨髄性細胞による赤脾髄の浸潤によって示される顕著な骨髄過形成を
明らかにした。クロロアセテートエステラーゼに対する組織化学的染色により、
多数の成熟好中性顆粒球の存在が示された。 脾臓細胞の染色サイトスピン(cytospin)標本によって、種々の骨髄性細胞、主
として成熟顆粒球の存在が確認された。junB-/-Ubi-junBマウスの骨髄は、サイ
トスピン標本及び骨髄の組織学的切片の検査によって決定されたように、増加し
た細胞質および骨髄過形成を示した。junB-/-Ubi-junB肝臓の組織学的解析は顆
粒球系列の成熟および未成熟細胞による門脈路の浸潤を明らかにした。細胞型特
異的表面マーカーに対する抗体を用いた骨髄および脾臓細胞の単一細胞懸濁液の
FACS解析は、リンパ系細胞区画の減少を続いて伴う骨髄性細胞区画の劇的な拡張
を明らかにした(図3)。 造血器官または心臓、肺、腎臓および皮膚のような非造血器官の未成熟芽細胞
による浸潤によって示されるように、junB-/-Ubi-junBマウスの10〜20%におい
て、急性転化への疾病進行が観察された。
【0031】
実施例4.CML様疾病が細胞自律性欠損であることを証明するための骨髄移植実
験 骨髄性造血はIL-3、IL-6、GM-CSFおよびG-GSFのような、骨髄性細胞の増殖お
よび分化をin vitroおよびin vivoで刺激することができるサイトカインによっ
て制御されている。junB-/-Ubi-junBマウスの骨髄増殖性疾病が細胞自律性欠損
のためであるかをテストするために、KellerとWagner(1989)に記載されたように
、骨髄細胞を致死的照射した野生型レシピエントに移植した。レシピエントを染
色血液塗沫標本によって骨髄増殖性疾病の発症について追跡した。8ヶ月の追跡
期間内において、85%のレシピエントは末梢血塗沫標本中の上昇した好中性顆粒
球数およびFACSによって測定される脾臓及び骨髄の骨髄性細胞区画の拡張によっ
て特徴づけられる疾病を発症した(図4A)。骨髄細胞および脾臓細胞から抽出
したDNAのPCRベースの解析により、junB-/-Ubi-junB骨髄細胞によるレシピエン
トの完全な再構成が示された(図4B)。
験 骨髄性造血はIL-3、IL-6、GM-CSFおよびG-GSFのような、骨髄性細胞の増殖お
よび分化をin vitroおよびin vivoで刺激することができるサイトカインによっ
て制御されている。junB-/-Ubi-junBマウスの骨髄増殖性疾病が細胞自律性欠損
のためであるかをテストするために、KellerとWagner(1989)に記載されたように
、骨髄細胞を致死的照射した野生型レシピエントに移植した。レシピエントを染
色血液塗沫標本によって骨髄増殖性疾病の発症について追跡した。8ヶ月の追跡
期間内において、85%のレシピエントは末梢血塗沫標本中の上昇した好中性顆粒
球数およびFACSによって測定される脾臓及び骨髄の骨髄性細胞区画の拡張によっ
て特徴づけられる疾病を発症した(図4A)。骨髄細胞および脾臓細胞から抽出
したDNAのPCRベースの解析により、junB-/-Ubi-junB骨髄細胞によるレシピエン
トの完全な再構成が示された(図4B)。
【0032】
実施例5.junB-/-Ubi-junBマウスにおけるサイクリング(cycling)している骨髄
性細胞前駆体の数の増加 骨髄性細胞区分の拡張がその系列における前駆細胞の増殖増加によるものであ
るかを調べるために、骨髄系脾臓細胞(Gr-1+/Mac-1+)のDNA含量を実施例2と
同様な方法を用いてFACSによって解析した。junB-/-Ubi-junBマウスにおいて、
骨髄性細胞集団の13%が細胞周期のS期およびG2/M期にあることが分かり、これ
は対照マウスにおける3%と対照的であり、junB-/-Ubi-junBマウスにおける骨
髄性細胞集団におけるサイクリングしている細胞数の増加を示すものである(図
5)。このことは、junB-/-Ubi-junBマウスにおけるin vivoでサイクリングして
いる細胞数の増加を証明するものである。加えて、骨髄性前駆細胞の数の増加は
in vitroでjunB-/-Ubi-junBマウスの脾臓由来および骨髄由来の培養物のどちら
においても見いだされた。
性細胞前駆体の数の増加 骨髄性細胞区分の拡張がその系列における前駆細胞の増殖増加によるものであ
るかを調べるために、骨髄系脾臓細胞(Gr-1+/Mac-1+)のDNA含量を実施例2と
同様な方法を用いてFACSによって解析した。junB-/-Ubi-junBマウスにおいて、
骨髄性細胞集団の13%が細胞周期のS期およびG2/M期にあることが分かり、これ
は対照マウスにおける3%と対照的であり、junB-/-Ubi-junBマウスにおける骨
髄性細胞集団におけるサイクリングしている細胞数の増加を示すものである(図
5)。このことは、junB-/-Ubi-junBマウスにおけるin vivoでサイクリングして
いる細胞数の増加を証明するものである。加えて、骨髄性前駆細胞の数の増加は
in vitroでjunB-/-Ubi-junBマウスの脾臓由来および骨髄由来の培養物のどちら
においても見いだされた。
【0033】
実施例6.JunB発現を欠損する骨髄性細胞株の誘導
junB発現を欠損する不死化骨髄性細胞株をjunB-/-Ubi-junBマウスから作製し
た。マウスの長骨から骨髄細胞を単離し、Liuら(1996)に記載されているように
、顆粒球系列に沿った増殖及び分化を支持する成長因子およびサイトカイン(例
えば、GM-CSF、G-CSF、SCF、IL-3およびIL-6)の組み合わせを含むメチルセルロ
ース培地中で生育させた。7日後、単一分化コロニーをメチルセルロースから拾
い、成長因子とサイトカインの同じカクテルを含む液体培地中で生育させた。2
〜3週間後、野生型由来コロニーは増殖を停止し、最終的に分化した。対照的に
、junB-/-Ubi-junBマウスから由来する、JunB発現を欠損するコロニーは増殖を
続け不死化されていた(図6)。
た。マウスの長骨から骨髄細胞を単離し、Liuら(1996)に記載されているように
、顆粒球系列に沿った増殖及び分化を支持する成長因子およびサイトカイン(例
えば、GM-CSF、G-CSF、SCF、IL-3およびIL-6)の組み合わせを含むメチルセルロ
ース培地中で生育させた。7日後、単一分化コロニーをメチルセルロースから拾
い、成長因子とサイトカインの同じカクテルを含む液体培地中で生育させた。2
〜3週間後、野生型由来コロニーは増殖を停止し、最終的に分化した。対照的に
、junB-/-Ubi-junBマウスから由来する、JunB発現を欠損するコロニーは増殖を
続け不死化されていた(図6)。
【0034】
実施例7.
JunBは、サイクリン依存性キナーゼ阻害因子p16/INK4aの発現を転写的に活性
化することによって3T3-線維芽細胞増殖を抑制する。 JunB高レベル発現の細胞増殖に対する効果を決定するために、マウス胚性線維
芽細胞をE12.5 Ubi-junBトランスジェニック胚から導き(Schorppら、1996)、3
T3-プロトコル(TodaroとGreen、1963)に従って樹立した。樹立した全てのUbi-
junBトランスジェニック3T3-線維芽細胞株はゆっくりと増殖した(図7A)。その
倍化時間は、43±2.5時間であり、野生型対応物における19.4±1.3時間と対照的
であり、野生型細胞のわずか50%の飽和密度であった。 JunBが線維芽細胞増殖を損傷する機構を明らかにするために、サイクリン依存
性キナーゼ阻害因子(CKI)のp21およびp16ファミリーのメンバーの発現レベル
を調べた。CKIはサイクリン/CDK複合体の結合及び阻害を通じて細胞周期進行を
負に調節することが知られている(SherrとRoberts、1995)。CKI p16/INK4aの
レベルのみが、調べた全てのUbi-junBトランスジェニック3T3-線維芽細胞におい
てタンパク質レベル(図7B)およびmRNAレベル(図7C)で劇的に上昇することが
見いだされた。
化することによって3T3-線維芽細胞増殖を抑制する。 JunB高レベル発現の細胞増殖に対する効果を決定するために、マウス胚性線維
芽細胞をE12.5 Ubi-junBトランスジェニック胚から導き(Schorppら、1996)、3
T3-プロトコル(TodaroとGreen、1963)に従って樹立した。樹立した全てのUbi-
junBトランスジェニック3T3-線維芽細胞株はゆっくりと増殖した(図7A)。その
倍化時間は、43±2.5時間であり、野生型対応物における19.4±1.3時間と対照的
であり、野生型細胞のわずか50%の飽和密度であった。 JunBが線維芽細胞増殖を損傷する機構を明らかにするために、サイクリン依存
性キナーゼ阻害因子(CKI)のp21およびp16ファミリーのメンバーの発現レベル
を調べた。CKIはサイクリン/CDK複合体の結合及び阻害を通じて細胞周期進行を
負に調節することが知られている(SherrとRoberts、1995)。CKI p16/INK4aの
レベルのみが、調べた全てのUbi-junBトランスジェニック3T3-線維芽細胞におい
てタンパク質レベル(図7B)およびmRNAレベル(図7C)で劇的に上昇することが
見いだされた。
【0035】
JunBがp16プロモーターをトランス活性化することができるかどうかを調べる
ために、マウスp16プロモーターの1.2kbの5'-断片をルシフェラーゼレポーター
構築物にクローン化し(p16-Luc)、一過性トランスフェクション実験を、野生
型、Ubi-junBトランスジェニックおよびjunB-/- 3T3-線維芽細胞で行った(図7D
)。野生型線維芽細胞は発現されるp16 mRNAおよびタンパク質のレベルの低さと
一致した中程度のp16-Luc活性レベルを示した。対照的に、Ubi-junBトランスジ
ェニック細胞は野生型に比較して3〜5倍高いp16転写活性を示し、一方、junB- /- 細胞においてはわずかに半分の活性しか検出されなかった。 最後に、3つのJunB/AP-1結合部位をマウスp16プロモーター中に同定し(図7E
に記載した)、それらがp16の基礎発現およびJunB-媒介発現のどちらにも重要で
あることを証明した。なぜなら、それらの変異は野生型細胞においてp16トラン
ス活性化の低下およびJunB-媒介p16トランス活性化の完全な阻害の両方を生じさ
せたからである。
ために、マウスp16プロモーターの1.2kbの5'-断片をルシフェラーゼレポーター
構築物にクローン化し(p16-Luc)、一過性トランスフェクション実験を、野生
型、Ubi-junBトランスジェニックおよびjunB-/- 3T3-線維芽細胞で行った(図7D
)。野生型線維芽細胞は発現されるp16 mRNAおよびタンパク質のレベルの低さと
一致した中程度のp16-Luc活性レベルを示した。対照的に、Ubi-junBトランスジ
ェニック細胞は野生型に比較して3〜5倍高いp16転写活性を示し、一方、junB- /- 細胞においてはわずかに半分の活性しか検出されなかった。 最後に、3つのJunB/AP-1結合部位をマウスp16プロモーター中に同定し(図7E
に記載した)、それらがp16の基礎発現およびJunB-媒介発現のどちらにも重要で
あることを証明した。なぜなら、それらの変異は野生型細胞においてp16トラン
ス活性化の低下およびJunB-媒介p16トランス活性化の完全な阻害の両方を生じさ
せたからである。
【0036】
文献
Angel P and Karin M (1991). Biochim. Biophys. Acta 1072, 129-157
Araki K, Araki M, Mijazaki J, Vassalli P (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. 9
2: 160 Bakiri,L., Lallemand,D., Bossy-Wetzel,E. and Yaniv,M. (2000). Cell cycle
-dependent variations in c-Jun and JunB phosphorylation: a role in the c
ontrol of cyclinD1 expression. EMBO J., 19, 2056-2068. Bonham L, MacKenzie K, Wood S, Rowe PB, Symonds G (1992) Oncogene 7:2219
-2229 Brown D, Kogan S, Lagasse E, Weissmann I, Alcalay M, Pelicci PG, Atwater
S, Bishop JM (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:2551-2556 Capecchi MR (1989) Science 244: 1288-1292 Cesana A, Hoxie JA, Lange B. Nowell PC, Bishop J, Santoli D (1992) Oncog
ene 7:827-836 Chang JM, Metcalf D, Gonda TJ, Johnson GR (1989a) J. Clin. Invest. 84:14
88 Chang JM, Mecalf D, Lang RA, Gonda TJ, Johnson GR (1989b) Blood 73:1487-
1497 Chiu R, Angel P, and Karin M (1989) Cell 59: 979-986
2: 160 Bakiri,L., Lallemand,D., Bossy-Wetzel,E. and Yaniv,M. (2000). Cell cycle
-dependent variations in c-Jun and JunB phosphorylation: a role in the c
ontrol of cyclinD1 expression. EMBO J., 19, 2056-2068. Bonham L, MacKenzie K, Wood S, Rowe PB, Symonds G (1992) Oncogene 7:2219
-2229 Brown D, Kogan S, Lagasse E, Weissmann I, Alcalay M, Pelicci PG, Atwater
S, Bishop JM (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:2551-2556 Capecchi MR (1989) Science 244: 1288-1292 Cesana A, Hoxie JA, Lange B. Nowell PC, Bishop J, Santoli D (1992) Oncog
ene 7:827-836 Chang JM, Metcalf D, Gonda TJ, Johnson GR (1989a) J. Clin. Invest. 84:14
88 Chang JM, Mecalf D, Lang RA, Gonda TJ, Johnson GR (1989b) Blood 73:1487-
1497 Chiu R, Angel P, and Karin M (1989) Cell 59: 979-986
【0037】
Coligan JE, Kruisbeek AM, Margulies DH, Shevach EM and Strober W (1992)
Current Protocols in Immunology, NIH press (second edition) Daley GQ, Van Etten RA, Baltimore D (1990) Science 247:824-830 Deininger MWN and Goldman JM (1998) Curr. Opin. Hematol. 5:302-308 Deng T and Karin M (1993) Genes Dev. 7: 479-490 Dymecki SM (1996). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 6191-6196 Elefanty GA, Hariharan IK, Cory S (1990) EMBO J. 9: 1069-1078 Grisolano JL, Wesselschmidt RL, Pelicci PG, Ley TJ (1997) Blood 89:376-3
87 Hawley RG, Fong AZC, Burns BF, Hawley TS (1992) J. Exp. Med. 176:1149-1163 Heisterkamp N, Jenster G, ten Hoeve J, Zovich D, Pattengale PK, Groffen
J (1990) Nature 344:251-253 Helgason CD, Damen JE, Rosten P, Grewal R, Sorensen P, Chappel SM, Borow
sky A, Jirik F, Holtschke T, Lo(:)hler J, Kanno Y, Fehr T, Giese N, Rosenbauer F, Lou J,
Knobeloch K-P, Gabriele L, Waring JF, Bachmann MF, Zinkernagel RM, Mors
e III HC, Ozato K, Horak I (1996) Cell 87:307-317
Current Protocols in Immunology, NIH press (second edition) Daley GQ, Van Etten RA, Baltimore D (1990) Science 247:824-830 Deininger MWN and Goldman JM (1998) Curr. Opin. Hematol. 5:302-308 Deng T and Karin M (1993) Genes Dev. 7: 479-490 Dymecki SM (1996). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 6191-6196 Elefanty GA, Hariharan IK, Cory S (1990) EMBO J. 9: 1069-1078 Grisolano JL, Wesselschmidt RL, Pelicci PG, Ley TJ (1997) Blood 89:376-3
87 Hawley RG, Fong AZC, Burns BF, Hawley TS (1992) J. Exp. Med. 176:1149-1163 Heisterkamp N, Jenster G, ten Hoeve J, Zovich D, Pattengale PK, Groffen
J (1990) Nature 344:251-253 Helgason CD, Damen JE, Rosten P, Grewal R, Sorensen P, Chappel SM, Borow
sky A, Jirik F, Holtschke T, Lo(:)hler J, Kanno Y, Fehr T, Giese N, Rosenbauer F, Lou J,
Knobeloch K-P, Gabriele L, Waring JF, Bachmann MF, Zinkernagel RM, Mors
e III HC, Ozato K, Horak I (1996) Cell 87:307-317
【0038】
Kelliher MA, McLaughlin J, Witte ON, Rosenberg N (1990) Proc. Natl. Acad
. Sci. USA 87:6649-6653 Krystal G, Humphries RK (1998) Genes Dev. 12:1610-1620 Johnson GR, Gonza TJ, Metcalf D, Hariharan IK, Cory S (1989) EMBO J 8:44
1-448 Keller G and Wagner EF (1989) Genes Dev. 3:827-837 Lagasse E and Weissmann I (1994) J. Exp. Med. 1047-1052 Largaespada DA, Brannan CI, Jenkins NA, Copeland NG (1996) Nat. Gen. 12:
137-143 Li B, Tournier C, Davis RJ, Flavell RA (1999) EMBO J 18: 420-432 Liebermann DA, Hoffmann-Liebermann B (1994) Curr. Opin. Hemato. 1: 24-32 Liu F, Wu HY, Wesselschmidt R, Kornaga T and Link DC (1996) Immunity 5:
491-501 Lord KA, Hoffmann-Liebermann B, Liebermann, DA (1990) Oncogene 5: 387-39
6 Lord KA, Abdollahi A, Hoffmann-Liebermann B, Liebermann DA (1993) Mol. C
ell. Biol. 13:841-851
. Sci. USA 87:6649-6653 Krystal G, Humphries RK (1998) Genes Dev. 12:1610-1620 Johnson GR, Gonza TJ, Metcalf D, Hariharan IK, Cory S (1989) EMBO J 8:44
1-448 Keller G and Wagner EF (1989) Genes Dev. 3:827-837 Lagasse E and Weissmann I (1994) J. Exp. Med. 1047-1052 Largaespada DA, Brannan CI, Jenkins NA, Copeland NG (1996) Nat. Gen. 12:
137-143 Li B, Tournier C, Davis RJ, Flavell RA (1999) EMBO J 18: 420-432 Liebermann DA, Hoffmann-Liebermann B (1994) Curr. Opin. Hemato. 1: 24-32 Liu F, Wu HY, Wesselschmidt R, Kornaga T and Link DC (1996) Immunity 5:
491-501 Lord KA, Hoffmann-Liebermann B, Liebermann, DA (1990) Oncogene 5: 387-39
6 Lord KA, Abdollahi A, Hoffmann-Liebermann B, Liebermann DA (1993) Mol. C
ell. Biol. 13:841-851
【0039】
MacKenzie KL, Dolnikov A, Millington M, Shounan Y, Symonds G (1999) Bloo
d 93:2043-2056 Mollinedo F, Vaquerizo MJ, Naranjo JR (1991) Biochem. J. 273:477-479 Mollinedo F and Naranjo JR (1991) Eur. J. Biochem. 200: 483-486 Picard, D (1994 ) Curr. Opin. Biotechnol. 5: 511-515 Sambrook J, Fritsch EF and Maniatis T (1989) Molecular Cloning, Cold Spr
ing Harbor Laboratory Press (second edition) Sawyers CL, Gishizky ML, Quan S, Golde DW, Witte ON (1992) Blood 79:2089
-2098 Sawyers CL (1999) New Engl. J. Med. 340:1330-1340 Schlingensiepen KH, Schlingensiepen R, Kunst M, Klinger I, Gerdes W, Sei
fert W, Brysch W (1993) Dev. Genet. 14: 305-312 Schorpp-Kistner M, Wang Z-Q, Angel P, and Wagner EF (1999) EMBO J 18:934
-948 Schorpp M, Ja(:)ger R, Schellander K, Schenkel J, Wagner EF, Weiher H, A
ngel P (1996) Nucleic. Acids. Res. 24: 1787-1788 Schwaller J, Frantsve J, Aster J, Williams IR, Tomasson MH, Ross TS, Pee
ters P, Van Rompaey L, Van Etten RA, Ilaria R Jr, Marynen P, Gilliland D
G (1998) EMBO J 17:5321-5333
d 93:2043-2056 Mollinedo F, Vaquerizo MJ, Naranjo JR (1991) Biochem. J. 273:477-479 Mollinedo F and Naranjo JR (1991) Eur. J. Biochem. 200: 483-486 Picard, D (1994 ) Curr. Opin. Biotechnol. 5: 511-515 Sambrook J, Fritsch EF and Maniatis T (1989) Molecular Cloning, Cold Spr
ing Harbor Laboratory Press (second edition) Sawyers CL, Gishizky ML, Quan S, Golde DW, Witte ON (1992) Blood 79:2089
-2098 Sawyers CL (1999) New Engl. J. Med. 340:1330-1340 Schlingensiepen KH, Schlingensiepen R, Kunst M, Klinger I, Gerdes W, Sei
fert W, Brysch W (1993) Dev. Genet. 14: 305-312 Schorpp-Kistner M, Wang Z-Q, Angel P, and Wagner EF (1999) EMBO J 18:934
-948 Schorpp M, Ja(:)ger R, Schellander K, Schenkel J, Wagner EF, Weiher H, A
ngel P (1996) Nucleic. Acids. Res. 24: 1787-1788 Schwaller J, Frantsve J, Aster J, Williams IR, Tomasson MH, Ross TS, Pee
ters P, Van Rompaey L, Van Etten RA, Ilaria R Jr, Marynen P, Gilliland D
G (1998) EMBO J 17:5321-5333
【0040】
Sherr CJ and Roberts JM (1995). Genes Dev. 9, 1149-1163
Shounan Y, MacKenzie K, Dolnikov A, Miller M, Symonds G (1997) Leukemia
11:1641-1649 Soloff E.V., Herzog C.R. and You M. (1996). The 5'-flanking region of th
eE1alpha form of the murine p16/INK4a (MST1) gene. Gene, 180, 213-215. Tenen DG, Hromas R, Licht JD, Zhang DE (1997) Blood 90:489-519 Todaro GJ and Green H (1963). J. Cell Biol. 17, 299-313 Wang Z-Q, Kiefer F, Urba(′)neck P, Wagner EF (1997) Mech. Dev. 62:137-1
45 Wong PMC, Chung S-W, Dunbar CE, Bodine DM, Ruscetti S, Nienhuis AW (1989
) Mol. Cell. Biol.:9:798-808 Yan X-Q, Brady G, Iscove NN (1994) Oncogene 9:163-173
11:1641-1649 Soloff E.V., Herzog C.R. and You M. (1996). The 5'-flanking region of th
eE1alpha form of the murine p16/INK4a (MST1) gene. Gene, 180, 213-215. Tenen DG, Hromas R, Licht JD, Zhang DE (1997) Blood 90:489-519 Todaro GJ and Green H (1963). J. Cell Biol. 17, 299-313 Wang Z-Q, Kiefer F, Urba(′)neck P, Wagner EF (1997) Mech. Dev. 62:137-1
45 Wong PMC, Chung S-W, Dunbar CE, Bodine DM, Ruscetti S, Nienhuis AW (1989
) Mol. Cell. Biol.:9:798-808 Yan X-Q, Brady G, Iscove NN (1994) Oncogene 9:163-173
【図1】 Ubi-junb導入遺伝子を含むjunB-/-マウスの育種スキーム。
【図2】 A)FACS-ソーティングした種々の造血系における、内在性junB
遺伝子およびUbi-junB導入遺伝子の発現レベルのRT-PCR解析。 B)FACS-ソーティングしたB細胞および骨髄性細胞におけるJunBタンパク質レ
ベルのウエスタンブロット解析。
遺伝子およびUbi-junB導入遺伝子の発現レベルのRT-PCR解析。 B)FACS-ソーティングしたB細胞および骨髄性細胞におけるJunBタンパク質レ
ベルのウエスタンブロット解析。
【図3】 対照マウスおよびjunB-/-Ubi-junBマウスの脾臓および骨髄の骨
髄性区画のFACS解析。
髄性区画のFACS解析。
【図4】 A)対照細胞およびjunB-/-Ubi-junB骨髄細胞を移植したレシピ
エントマウスの骨髄の骨髄性区画のFACS解析。 B)レシピエントマウスのゲノム型解析。
エントマウスの骨髄の骨髄性区画のFACS解析。 B)レシピエントマウスのゲノム型解析。
【図5】 対照マウスおよびjunB-/-Ubi-junBマウスの脾臓の骨髄性細胞集
団の細胞周期プロファイル。
団の細胞周期プロファイル。
【図6】 A)対照マウスおよびjunB-/-Ubi-junBマウスに由来する骨髄性
細胞系列における内在性junB遺伝子およびUbi-junB導入遺伝子の発現レベルにつ
いてのRT-PCR解析。 B)対照細胞株およびJunB欠損骨髄性細胞株の増殖速度。
細胞系列における内在性junB遺伝子およびUbi-junB導入遺伝子の発現レベルにつ
いてのRT-PCR解析。 B)対照細胞株およびJunB欠損骨髄性細胞株の増殖速度。
【図7A】 野生型およびUbi-junB遺伝子導入3T3-線維芽細胞の増殖速度。
【図7B】 野生型およびUbi-junB遺伝子導入3T3-線維芽細胞におけるp16
タンパク質レベルのウエスタンブロット解析。
タンパク質レベルのウエスタンブロット解析。
【図7C】 野生型およびUbi-junB遺伝子導入3T3-線維芽細胞におけるp16
mRNAレベルのノーザンブロット解析。
mRNAレベルのノーザンブロット解析。
【図7D】 野生型、Ubi-junB遺伝子導入およびjunB-/- 3T3-線維芽細胞に
おけるp16転写活性。
おけるp16転写活性。
【図7E】 マウスp16プロモーター中に同定されるJunB/AP-1結合部位。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考)
C12N 15/09 C12Q 1/68 Z
C12Q 1/02 G01N 33/15 Z
1/68 33/50 Z
G01N 33/15 33/53 M
33/50 33/566
33/53 C12N 15/00 A
33/566 5/00 B
(72)発明者 ヴァーグナー エルヴィン エフ
オーストリア アー−1030 ヴィエンナ
ブリューテンガッセ 9/25
Fターム(参考) 2G045 AA40 CB01 DA12 DA13 DA14
FB02
4B024 AA01 AA12 BA80 CA02 DA02
FA02 GA11 HA11
4B063 QA05 QQ21 QQ41 QQ61 QQ89
QR77 QR80 QS31 QX10
4B065 AA91X AA91Y AB01 AC14
AC20 BA01 CA28 CA46
4C084 AA16 NA14 ZB262 ZC412
Claims (14)
- 【請求項1】 骨髄性細胞系列においてJunB発現を欠損するトランスジェニ
ック動物のヒト慢性骨髄性白血病のモデルとしての使用。 - 【請求項2】 動物がマウスである、請求項1に記載の使用。
- 【請求項3】 トランスジェニック動物がjunBノックアウト動物および初期
胚発生の間に発現を生じさせる強力な構成的プロモーターの制御下にあるjunB導
入遺伝子の適用による導入遺伝子相補によって得ることのできるトランスジェニ
ック動物である、請求項1または2に記載のトランスジェニック動物の使用。 - 【請求項4】 プロモーターがユビキチンCプロモーターである、請求項3
に記載の使用。 - 【請求項5】 トランスジェニック動物が骨髄性細胞におけるjunBの不活性
化によって得られるトランスジェニック動物である、請求項1または2に記載の
トランスジェニック動物の使用。 - 【請求項6】 トランスジェニック動物がjunBホモ接合変異ES細胞を野生型
4倍体胚盤胞に導入することによって得られるトランスジェニック動物である、
請求項1または2に記載のトランスジェニック動物の使用。 - 【請求項7】 請求項1または2に記載のトランスジェニック動物から得る
ことができるJunB欠損骨髄性細胞。 - 【請求項8】 骨髄性細胞の増殖を阻害する薬剤を同定するためのJunB欠損
骨髄性細胞の使用。 - 【請求項9】 細胞増殖に対するJunBの阻害的効果の負の制御因子としての
化合物を同定する方法であって、JunB標的遺伝子の制御領域の制御下にあるレポ
ーター遺伝子でトランスフェクションされ、かつ、JunBを高レベルで発現する細
胞を、試験化合物の存在下で培養し、細胞増殖および前記レポーター遺伝子発現
に対する前記化合物の効果を測定し、細胞増殖を増大させる能力および前記レポ
ーター遺伝子発現を下方調節する能力について前記化合物を選抜することを特徴
とする、前記方法。 - 【請求項10】 細胞が線維芽細胞である請求項9に記載の方法。
- 【請求項11】 レポーター遺伝子がヒトp16遺伝子の制御領域の制御下に
ある請求項9または10に記載の方法。 - 【請求項12】 選抜した化合物を、骨髄性細胞の増殖を増大させる能力に
ついて更に試験することを特徴とする、請求項9〜11のいずれか1項に記載の
方法。 - 【請求項13】 化学療法および/または放射線療法後の患者投与用の、請
求項9〜12のいずれか1項の方法によって同定される化合物。 - 【請求項14】 腫瘍細胞の増殖の負の制御因子としてのJunB活性を増強す
る物質を活性成分として含む医薬組成物。
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PCT/EP2000/004793 WO2000072666A2 (en) | 1999-05-26 | 2000-05-25 | USE OF TRANSGENIC MICE LACKING JunB EXPRESSION IN THE MYELOID LINEAGE |
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Cited By (1)
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---|---|---|---|---|
JP2007518413A (ja) * | 2004-01-21 | 2007-07-12 | ベーリンガー インゲルハイム インターナショナル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | 乾癬及び乾癬性関節炎のためのマウスモデル |
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EP0856579A1 (en) * | 1997-01-31 | 1998-08-05 | BIOGNOSTIK GESELLSCHAFT FÜR BIOMOLEKULARE DIAGNOSTIK mbH | An antisense oligonucleotide preparation method |
-
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2000
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- 2000-05-25 CA CA002371979A patent/CA2371979A1/en not_active Abandoned
- 2000-05-25 WO PCT/EP2000/004793 patent/WO2000072666A2/en not_active Application Discontinuation
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2007518413A (ja) * | 2004-01-21 | 2007-07-12 | ベーリンガー インゲルハイム インターナショナル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | 乾癬及び乾癬性関節炎のためのマウスモデル |
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WO2000072666A2 (en) | 2000-12-07 |
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