JP2003500023A

JP2003500023A - ラミニン８及びその使用方法

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Publication number: JP2003500023A
Application number: JP2000615756A
Authority: JP
Inventors: ヤルーココルテスマー、; カールトリググヴァソン、
Original assignee: バイオストラタムインコーポレイテッド
Priority date: 1999-04-30
Filing date: 2000-04-28
Publication date: 2003-01-07
Also published as: WO2000066732A2; AU4678400A; WO2000066732A3; US6638907B1; EP1177291A2

Abstract

(57)【要約】本発明は、実質的に精製されたラミニン８、再結合ラミニン８の作成方法、再結合ラミニン８を発現する細胞、および血管組織および間葉起源の組織への傷の治療を加速し、かつ細胞付着および細胞移動を促進するために再結合ラミニン８を使用する方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】相互参照本出願は、１９９９年４月３０日提出の暫定特許出願番号６０／１３１，７２
０、１９９９年８月１９日提出の６０／１４９，７３８、１９９９年９月２４日
提出の６０／１５５，９４５、２０００年２月１１日提出の６０／１８２，０１
２に優先権を主張し、全件をその全体を参照としてここに組み込む。

【０００２】発明の分野本出願は精製ラミニン８とその使用方法に関する。

【０００３】発明の背景基底層（基底膜）はシート状の細胞付随の細胞外マトリクスで、細胞増殖、組
織発達、および組織維持において中心的な役割をしている。それらは実質的に全
組織に存在し、胚発生の最も早い段階に出現する。

【０００４】基底層は、種々の構築と細胞相互作用の以下の機能の中枢である：（例として
ＭａｌｉｎｄａとＫｌｅｉｎｍａｎ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ
Ｂｉｏｌ．２８：９５７−９５９、１９９６年；ＡｕｍａｉｌｌｅｙとＫｒｉ
ｅｇ，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ１０６：２０９−２１４、
１９９６年を参照）１．組織に対する構造上の支持体として用いられ、細胞に接着性基層を
供給する。

【０００５】２．組織区画の間に、細胞遊走を妨害する永続選択性の障壁を作成し、
高分子の交換を受動的に調節する。これらの特質は、ほとんどのタンパク質と細
胞に対し透過性でない効果的な血液−組織障壁を作成し、重要な濾過構造として
機能する、腎糸球体基底膜により示される。

【０００６】３．基底層は、胚発生と創傷修復の間の細胞遊走と細胞伸長を促進しう
る、高度に相互作用的な表面を作成する。損傷後に、その上で細胞が通常の組織
機能の回復を再生する表面を供給する。

【０００７】４．基底層はそれらの構造にコードされる情報を、分化と組織維持にと
って重要な細胞に接触させることで提示する。情報は、インテグリン、ジストロ
グリカン、および細胞表面プロテオグリカンを含む、様々なレセプターを通って
細胞へ伝達される。シグナル伝達は、不十分な結合性と相互作用するマトリクス
リガンドと対応するレセプターの存在だけでなく、三次元マトリクス「ランドス
ケープ」におけるリガンドの密度、および基底層成分のクラスターレセプターの
能力といった組織分布的な要因といったような場合にも依存する。これらのマト
リクスタンパク質は長命でありうるため、基底層は基底層内で常在性および一過
性の細胞のための「表面記憶」を作成する。

【０００８】基底膜は主にラミニンと、順繰りに重合複合体へと組織化されるようになるＩ
Ｖ型コラーゲンヘテロ三量体から構成される。これまでに、６つのＩＶ型コラー
ゲン鎖と少なくとも１２のラミニンサブユニットが同定されている。これらの鎖
は共通しかつ独特な機能を持ち、特異的な一時的（発展的）かつ空間的（組織部
位特異的）なパターンを発現される。

【０００９】ラミニンは、主に基底膜に存在するヘテロ三量体糖タンパクのファミリーであ
る。それらは隣接細胞レセプターとの、かつラミニンネットワークを形成するこ
とにより、結合相互作用を経て機能し、そしてそれらは細胞機能に強く影響しう
る重要なシグナル伝達分子である。ラミニンは、細胞増殖と組織の修復と発達に
おける分化の促進と同様、細胞／組織表現型の維持にもまた重要である。

【００１０】ラミニンは大きな、多ドメインタンパクで、一般構造的な機構をもっている。
ラミニン分子は様々なマトリクスと、一分子への細胞相互作用機能を統合する。

【００１１】ラミニン分子は、コイルドコイル・ドメインを通じて一緒に結合されるα−、
β−、およびγ−鎖サブユニットを含む。が、他のラミニンおよび基底膜分子と
の結合活性と、膜結合レセプターを持つ同定可能ドメインは、この構造の範囲内
である。ドメインＶＩ、ＩＶｂ、およびＩＶａは球状構造を形成し、ドメインＶ
、ＩＩＩｂ、およびＩＩＩａ（これはシステインリッチＥＧＦ様成分を含む）は
棒状構造を形成する。（Ｋａｍｉｇｕｃｈｉら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓ
ｃｉ．２１：９７−１２５、１９９８年）三つの鎖のうちのドメインＩとＩＩは
三本鎖コイルドコイル構造（長腕）の形成に関与する。

【００１２】

【表１】ラミニンの４つの構造的定義ファミリー群が同定されている。５つの同定され
たラミニン分子の第一群は、全てβ１とγ１鎖が共通しており、それらのα鎖成
分（α１からα５鎖）では異なっている。５つの同定ラミニン分子の第二群は、
全てβ２とγ１鎖が共通で、この場合もそのα−鎖成分が異なっている。同定ラ
ミニン分子の第三群は、一つの同定メンバー、ラミニン５をふくみ、鎖の成分は
α３β３γ２である。同定ラミニン分子の第四群は、一つの同定メンバー、ラミ
ニン１２をふくみ、新規に同定されたγ３鎖を含む（α２β１γ３）。

【００１３】ドメイン構造と機能との関係の解明において、いくつかの進展が成された。（
例として、ＷｅｗｅｒとＥｎｇｖａｌｌ，Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃ．Ｄｉｓｏｒｄ．
６：４０９−４１８、１９９６年を参照のこと）異なる鎖の多様での相同ドメ
インの間での全長配列の類似性は、しかしドメインＶＩ（ラミニン多量体化の鍵
となる役目を果たすためと考えられる）で最も高く、続いてドメインＶ（おそら
くタンパク質−タンパク質相互作用に関わる）とドメインＩＩＩ（エンタクチン
／ニドゲン結合；細胞接着可能な部位）によって、そして最も低いのがドメイン
Ｉ、ＩＩ（どちらも分子間構築に含まれると考えられ、細胞接着可能な部位を含
む）およびＧである。球形Ｇドメイン（細胞レセプター結合に関係すると考えら
れている）はα鎖にだけ存在している。他のドメインは特定の鎖の型のうちでは
、全ての鎖には存在しないかもしれない。例えば、ドメインＶＩはα３、α４、
およびγ２鎖にはない。（ＷｅｗｅｒとＥｎｇｖａｌｌ、１９９６年）大分子である（＞６００ｋＤ）ことと特有の構造のために、ラミニン分子は電
子顕微鏡中で分解しうる。（ＷｅｗｅｒとＥｎｇｖａｌｌ、１９９６年）一般的
には、ラミニンはＥＭ中では十字型分子として現れる。十字の３つの短い腕が３
つの分かれたラミニン鎖のそれぞれのアミノ末端部分に相当する（鎖あたり一本
の短腕）。十字の長腕は３つの鎖のＣ−末端部を構成し、一緒にコイルドコイル
構造を形成する。（ＷｅｗｅｒとＥｎｇｖａｌｌ、１９９６年）長腕は球形Ｇド
メインで終わる。

【００１４】長腕のコイルドコイル・ドメインは、ラミニンの３つの鎖の構築に決定的であ
る。（Ｙｕｒｃｈｅｎｃｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９４：
１０１８９−１０１９４、１９９７年）ジスルフィド結合は長腕の最基部部位に
３つの鎖の全てを架橋し安定化し、長腕の最端部位にβおよびγ鎖を結合する。

【００１５】ラミニンレセプター促進自己構築の一つのモデルは、培養骨格筋管とシュワン
細胞について実施された研究を基盤とし、リガンドがない場合、流体膜内で自由
に拡散するそのレセプターにラミニンが結合することを予測する。レセプターの
結合はラミニンに高い局所の二次元の濃度を強制し、それらの質量作用を円滑化
が指示通りの表面多量体への構築を促進する。この経過中、結合レセプターはま
た認識され、細胞骨格再編成を伴う。（Ｃｏｌｏｇｎａｔｏ，Ｊ．ＣｅｌｌＢ
ｉｏｌ．１４５：６１９−６３１、１９９９年）この認識はレセプターを活性化
し、形態／行動の細胞発現の変更のシグナル伝達を引き起こす。ラミニンが、異
なるタンパク質ドメインと異なるサブユニット上に位置づけられる、細胞相互作
用と構造形成の両方の部位を持つことがその証拠である。

【００１６】ラミニンレセプターの１クラスはインテグリンで、多くの細胞マトリクスと細
胞−細胞相互作用を仲介する細胞表面レセプターである。インテグリンはヘテロ
二量体で、αおよびβサブユニットから成り立つ。１６つのα−および８つのβ
−サブユニットが知られており、少なくとも２２のαとβサブユニットの組み合
わせが現在までに同定されている。インテグリンのいくつかは１またはわずかな
既知リガンドを持つのみであるが、対してその他は大変無差別に混じって現れる
。インテグリンへの結合は一般に低親和性で、二価の陽イオンに依存している。
インテグリンはそのリガンドへの結合を通じて活性化され、限局性付着とマイト
ジェン活性化キナーゼのような、キナーゼ活性化カスケードを経てシグナルを伝
達する。いくつかの異なるインテグリンは、異なるラミニンアイソフォームに多
少に関わらず特異的に結合する。（Ａｕｍａｉｌｌｅｙら、ラミニンにおいて、
ＴｉｍｐｌとＥｋｂｌｏｍ編、ＨａｒｗｏｏｄＡｃａｄｅｍｉｃＰｕｂｌ
ｉｓｈｅｒｓ，アムステルダム、１２７−１５８頁、１９９６年）ラミニン８は、最近同定されたラミニンで、α４、β１、およびγ１ラミニン
鎖から構成される。ラミニンα４鎖は、成体と発育段階の途中との両方に広く分
布している。（Ｉｉｖａｎａｉｎｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２
７８６２−２７８６８、１９９７年）成体において、それは心臓、骨格、および
平滑筋繊維の周辺の基底膜と、肺では肺胞の隔壁に見つけられる。さらに、毛細
血管と大血管の両方の内皮基底膜と、末梢神経の神経周膜の基底膜にも、類洞内
空間、大動脈、および骨随の小細動脈と同様に見つけられる。（Ｆｒｉｅｓｔｅ
ｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｙ２４６：７２７−７３５、１９９
７年；Ｍｉｎｅｒら、Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．１３７：６８５−７０１、１
９９７年；Ｇｅｂｅｒｈｉｗｏｔら、Ｅｘｐｔｌ．ＣｅｌｌＲｅｓ．２５３
：７２３−７３２、１９９９年；Ｇｕら、Ｂｌｏｏｄ９３：２５３３−２５
４２、１９９９年；Ｉｉｖａｎａｉｎｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７
２：２７８６２−２７８６８、１９９７年）ラミニン８は血管内皮の主要なラミニンアイソフォームで（Ｉｉｖａｎａｉｎ
ｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２７８６２−２７８６８、１９９７
年；Ｆｒｉｅｓｅｒら、１９９７年）血小板で発現し付着し（Ｇｅｂｅｒｈｉ
ｗｏｔら、Ｅｘｐｔｌ．ＣｅｌｌＲｅｓ．２５３：７２３−７３２、１９９９
年）３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞で合成される唯一のラミニンアイソフォームで、その
合成レベルは細胞の脂肪転換が増加していることを示す。（Ｎｉｉｍｉら、Ｍａ
ｔｒｉｘＢｉｏｌｏｇｙ１６：２２３−２３０、１９９７年）ラミニン８は
さらに、結合組織内で微小血管を誘導するために間葉細胞系統に広く発現するラ
ミニンアイソフォームであると推測される。（Ｎｉｉｍｉら、１９９７年）ラミニン８はまた、マウス骨髄初代細胞培養、細動脈壁、および類洞内空間で
同定され、ここではデータは主要なラミニンアイソフォームが発達中の骨髄にあ
ることを示した。（Ｇｕら、１９９９年）ラミニンα４鎖とラミニン８の広域組織分布にも関わらず、充分量の精製ラミ
ニン８を細胞または組織原料から、研究または治療目的のために調製する手段は
なく、またラミニン８の組み換え発現の手段も開発されていない。そのような研
究および治療目的は、間葉由来の組織、例えば骨、軟骨、腱、および靱帯への創
傷治療、血管組織への創傷治療、細胞吸着と遊走の促進、治療用の血管形成誘導
と神経再生の促進、生体外細胞治療、医療用装置の生体適合性の改善、および改
善された細胞培養装置と培地の調製のための手段を含むが、これらに限定されな
い。

【００１７】よって、研究と治療の目的で本質的に精製された適量のラミニン−８を、また
ラミニン８の作製方法を、従来必要としている。このようなラミニン８は培養の
株細胞または生体組替体ＤＮＡ技術により調製される。

【００１８】組替え体ラミニン−８（“ｒ−ラミニン８”）を製造するための、ヒトの株細
胞の選択を操作するために好ましい製造方法は、組替体ＤＮＡ技術の使用である
。組替え体を基本にしたラミニン−８の製造方法は、ヒトの培養の株細胞からの
分離やヒトの組織からの精製よりも幾つかの利点がある。

【００１９】１．蛋白質を製造した組替え体はヒトの病原体がない。蛋白質を製造した内在性
の細胞培養にも当てはまり、ヒトの組織に由来する蛋白質はＨＩＶ、肝炎、およ
び他の感染性の病原体混入のリスクを帯びている。

【００２０】２．蛋白質の発現レベル、および収率は、符号化した蛋白質の製造を増強する遺
伝子改変遺伝子／ベクターの使用により改良される。

【００２１】３．商業的に生存可能な親和性の精製方法のための結合部位を用意する蛋白質
鎖への付加ペプチド配列を操作することができる。

【００２２】４．この方法は、付加、置換、脱離、および／または他の蛋白質領域構造の変更
により、蛋白質構造／機能の変更を用意できる。例えば、インテグリン結合部位
（例えばＲＧＤ）を導入すること、インテグリン認識部位を転換すること、また
は合成基質への安定な結合部位で操作することが望まれている。よって、ラミニ
ン鎖を発現する発現ベクターの創造は、今後の使用への莫大な柔軟性を生じ、第
２世代の“設計者”ラミニンを創造する基礎を作る。

【００２３】発明の概要本発明は実質的に精製されたラミニン８蛋白質源、実質的に精製された組替え
体ラミニン８（下にｒ−ラミニン８として参照する。）の製造方法、ラミニン８
を構成する薬学的組成、骨、軟骨、腱および靭帯のような間葉の起点の組織の損
傷治療、血管組織の損傷治療、細胞の付着と転位の促進、生体外細胞療法、医学
装置の生体適合性の改良、および改良された細胞培養の装置及び媒体の作成のた
めのラミニン８の使用方法に対する従来の需要をみたす。

【００２４】一つの見地からは、本発明は、ラミニン８鎖を発現し、ｒ−ラミニン８を分泌
する組替え体ホスト細胞を供給する。他の見地からは、本発明は、実質的に精製
されたラミニン８、および実質的に精製されたｒ−ラミニン８の製造方法を提供
する。

【００２５】さらなる見地からは、本発明は、薬学的に許容される担体と共にラミニン８を
含む薬学的組成物を提供する。このような薬学的組成物は他の細胞外基質成分と
共に随意に供給される。

【００２６】別の見地からは、本発明は、骨、軟骨、腱、靭帯のような間葉の起点の組織の
損傷治癒、血管組織の損傷治療の促進、およびこのような損傷の治療に使用され
る移植片の生体適合性の改良のための、方法およびキットを提供する。特に例を
挙げると、ラミニン８またはその薬学的組成物は、多様な方法のための有効量の
ｒ−ラミニン８を提供することにより、ａ．血管損傷の部位での再内皮化を促進ｂ．移植片の“取り込み”の改良ｃ．医学装置の生体適合性の改良ｄ．神経損傷の治療（神経再生）ｅ．血管形成の調整およびｄ．細胞の付着および遊走の促進に使用される。これらの全ての方法の好ましい体現において、組換え体ラミニン
８が使用される。キットは、所望の効果のための有効量のラミニン８と、その使
用のための説明書きとを含む。

【００２７】別の見地では、本発明は、改良された医学装置及び移植片と、改良された医学
装置及び移植片の作製方法を提供する。ここで、改良は、有効量の本発明のラミ
ニン８または薬学的組成物を所望の適用のための装置または移植片へ適用するこ
とを含む。

【００２８】別の見地からは、本発明は、培養物の中の細胞の成長と維持のため、細胞の引
き続いての増殖／分化／静止のための細胞培養装置への細胞付着に有効な量のラ
ミニン８を提供することにより、改良された細胞培養装置、改良された細胞培養
装置の作製方法を提供する。

【００２９】もう一つの見地からは、本発明は、細胞培養の成長補充を提供し、ラミニン８
を含む。もう一つの見地からは、本発明は、細胞培養の成長媒体を改良し、改良
はｒ−ラミニン８の添加を含む。

【００３０】好ましい態様の詳細な記載全ての参照、発明および発明の適用は、参照によって全てこれにより組み込ま
れる。

【００３１】この適用の範囲で、もし他の方法で述べられなかったならば、利用された技術
は、いくつかの有名な参照のうちのどれででも見つかるかもしれない。例えば、
分子クローン：実験室マニュアル（Molecular Cloning：A Laboratory Manual）
（Sambrookら、1989,Cold Spring Harbor Laboratory Press）、遺伝子発現技術
（Gene Expression Technology）(Methods in Enzymology, 185巻、D.Goeddel
刊、1991、Academic Press,San Diego,CA)、「酵素学の手法」内の「蛋白質精製
ガイド」（”Guide to Protein Purification” in Methods in Enzymology）(M
.P.Deutshcer 刊(1990) Academic Press,Inc.)；ＰＣＲ手順：手法と適用（PCR
Protocols:A Guide to Methods and Applications）(Innis,ら、1990.Academic
Press,San Dego,CA)、動物細胞の培養：基本技術のマニュアル（Culture of An
imal Cells:A Manual of Basic Technique）第２版(R.I.Freshney.1987.Liss,In
c.New York,NY)、遺伝子移植と発現手順（Gene Transfer and Expression Proto
cols）１０９−１２８頁、刊E.L.Murray,The Humana Press Inc.,Clifton,N.J.
刊)、およびアンビオン（the Ambion）1998カタログ(Ambion,Austin,TX)。

【００３２】ここで「ラミニン８」は、自然発生源からのヘテロ三量体ラミニン８とｒ−ラ
ミニン８との双方を含む。

【００３３】ここで、語句「ｒ−ラミニン８」は、α４、β１およびγ１鎖、またはヘテロ
三量体ラミニン８の形成とラミニン８アクティビティの維持とが可能な鎖の部分
から選ばれるラミニン８鎖を符号化する、少なくとも一つの核酸配列を含む一つ
かそれ以上の発現ベクターで形質移入された細胞により発現された組換え体ヘテ
ロ三量体ラミニン８、またはその処理された形態に当てはまる。このようなｒ−
ラミニン８は、単一の生物体または異なる生物体に由来するα４、β１およびγ
１配列を含む。多様なラミニン８鎖ＤＮＡ配列が従来知られており、本発明のｒ
−ラミニン８を調製するそれぞれの使用が熟慮されている。（例えばIivanainan
ら、FEBS Letters 365:183-188(1995)；FrieserらEur.J.Biochem.246:727-735(1
997)；Richardsら、Eur.J.Biochem.238:813-821(1996)；LiuおよびMayne、15:43
3-437(1996)；Vuolteenahoら、J.Biol.Chem.265:15611-15616(1990)；Kallunki
ら、J.Biol.Chem.266:221-228(1991)；Sasakiら、J.Biol.Chem.263:16536-16544
(1988)；SasakiおよびYamada、J.Biol.Chem.262:17111-17117(1987)；Sasakiら
、Proc.Natl.Acad.Sci.84:935-939(1987)；Pikkarainenら、J.Biol.Chem.262:10
454-10462(1987)参照。全ての参照は、参照によって全てこれにより組み込まれ
る。）本発明はヘテロ三量体ラミニン８を構成する鎖の一つまたは二つが内在性ラミ
ニン８鎖により符号化されている、これらのラミニン分子を含む。好ましい態様
では、細胞は、α４、β１およびγ１鎖のそれぞれ、またはヘテロ三量体ラミニ
ン８の形成とラミニン８アクティビティの維持とが可能なそれぞれの鎖の部分を
符号化する核酸配列を含む一つかそれ以上の発現ベクターで形質移入されている
。

【００３４】本発明において、ラミニン８は分泌した蛋白質であり、これは、信号配列を必
ずしも含まない細胞外空間の中にこれらの蛋白質が放出されると同様に、ＥＲ、
分泌性ベシクル、および信号配列の結果としての細胞外空間に向けられることが
できる。もしも分泌された蛋白質が細胞外空間に放出されると、分泌された蛋白
質は細胞外処理を経て「完成した」蛋白質を生成する。このような処理事象は可
変であり、最終の「完成した蛋白質」の異なったバージョンを生じることができ
る。本発明における実質的に精製されたラミニン８は、充分な長さ及び任意のこ
のような処理をされたラミニン８鎖の双方を含むヘテロ三量体を含む。

【００３５】ここで用いられるように、「実質的に精製された」という用語は、そのように
称されるラミニン８がその生体内の細胞環境から分離されたことを意味する。

【００３６】ここで用いられるように、ラミニン８のポリペプチド鎖は、以下のうちの1つ
以上に一致するポリペプチド鎖にあてはまる。

【００３７】（ａ）次のグループから選択されるポリペプチド構造から成る。

【００３８】１．Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３２．Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３（ｅ）３．Ｒ３４．Ｒ３（ｅ）５．Ｒ１−Ｒ３６．Ｒ１−Ｒ３（ｅ）７．Ｒ２−Ｒ３８．Ｒ２−Ｒ３（ｅ）ここで、Ｒ１はアミノ末端のメチオニンである。Ｒ２は、ポリペプチドの分泌を
導くことができるシグナル配列である。ここで、シグナル配列は、特別なラミニ
ン鎖のための自然なシグナル配列、他の分泌されたタンパク質のそれ、または人
工的な配列である。Ｒ３は、α4、β１およびγ1鎖から選ばれる分泌されたラミ
ニン鎖である。そして、Ｒ３（ｅ）はエピトープ・タグ（例えば後述するもの）
から更に成るα4、β１およびγ1つの鎖から選ばれる分泌されたラミニン鎖であ
る。そして、それはラミニン鎖のアミノ酸配列の範囲内で、いかなる位置でも配
置されることができる。および／または（ｂ）開示されたラミニン鎖のポリヌクレオチド配列またはその部分のうちの
1つ以上と本質的に同様であるポリヌクレオチドによってコード化される（SEQ I
D番号：1,3,5,7,9,11,13,15,17,19,21,23,25または27）。および／または（ｃ）ここに開示された組換え型のラミニン８の鎖ＤＮＡ配列（SEQ ID番号：
1,3,5,7,9,11,13、15,17,19,21,23,25,27）、またはその補足的な配列の１つ以
上の、コード領域またはその部分に対する高厳密性または低厳密性の条件の下で
交雑するポリヌクレオチドによってコード化される。および／または（ｄ）開示されたラミニン８のポリペプチド鎖アミノ酸配列（SEQ ID番号：2,
4,6,8,10,12,14,16,18、20,22,24,26または28）の1つ以上に対して少なくとも７
０％の同一性、好ましくは少なくとも８０％の同一性、そして、最も好ましくは
少なくとも約９０％の同一性を有する。

【００３９】「実質的に類似した」というフレーズは、ここに開示されるラミニン８の配列
からの、欠失、挿入、逆位、反復および置換を含むがこれに限らない、１つ以上
の保存的な変異を有するポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列に関して本願
明細書において用いられる。ここで、結果として生じるラミニン鎖は、機能的に
ここに開示されるそれらと等しい。

【００４０】例えば、保存的なポリヌクレオチド変異体は、コード領域、非コード領域、ま
たはその両方における変異を含む。特に好ましいのは、サイレント置換、付加ま
たは欠失を生じるが、コード化されたポリペプチドの特性または活性を変えない
変異を含むポリヌクレオチド変異体である。遺伝暗号の縮重によるサイレント置
換によって生じるヌクレオチド変異体は、好ましい。さらに、５−１０、１−５
または１−２アミノ酸が置換、欠失または付加した変異体は、いかなる組合せで
あっても、好ましい。ポリヌクレオチド変異体は、様々な理由で生成されること
ができる。それは、これに限らないが、特別な宿主（人間のmRNAにおけるコドン
を大腸菌のようなバクテリアの宿主によって好まれるそれらに変える）のための
コドン発現を最適化することを含む。

【００４１】自然に起こる保存的な変異体は、「対立形質の変異体」と呼ばれ、有機体の染
色体上の与えられた場所を占有する遺伝子のいくつかの交替の形式の1つにあて
はまる。（Genes II, Lewin, B., ed., John Wiley & Sons, New York (1985)）
これらの対立形質の変異体は、ポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチド・
レベルのどちらでも変化することができる。これに対して、非自然に起こる保存
的な変異体は、突然変異誘発技術によってまたは直接の合成によって生成される
。

【００４２】タンパク質工学および組み換えＤＮＡテクノロジーの周知の方法を利用するこ
とによって、保存的なポリヌクレオチド変異体は、表れたラミニン鎖のポリペプ
チドの特徴を改善または変更するために生成される。例えば、１つ以上のアミノ
酸が、分泌されたタンパク質のＮ−末端またはＣ−末端から欠失されることがで
きる。（例えば、Ron et al., J. Biol. Chem. 268: 2984-2988 (1993)； Dobel
i et al., J. Biotechnology 7: 199-216 (1988)を参照のこと。）変異体がしば
しば自然に起こるタンパク質のそれと同様の生物学的活性を維持することを、十
分な証拠が証明する。（例えば、Gayle et al., J. Biol. Chem. 268: 22105-22
111 (1993)を参照のこと。）さらに、たとえポリペプチドのＮ−末端またはＣ−
末端から１つ以上のアミノ酸を欠失することが１つ以上の生物学的機能の変更ま
たは喪失という結果になっても、他の生物学的活性は、依然として維持される。

【００４３】表現型的にサイレント・アミノ酸置換をする方法に関するガイダンスは、Bowi
e, J. U. et al., Science 247: 1306-1310 (1990)において提供される。ここで
著者は、アミノ酸配列の変化に対する許容度を研究するための２つの主要な方策
があることを示している。

【００４４】第１の方策は、進化の過程の間の自然淘汰によるアミノ酸置換の許容度を利用
する。異なる種のアミノ酸配列を比較することによって、保存されたアミノ酸を
識別することができる。これらの保存されたアミノ酸は、おそらくタンパク質機
能のために重要である。対照的に、自然淘汰によって置換が許容されるアミノ酸
の位置は、これらの位置がタンパク質機能のために重要でないことを示す。した
がって、タンパク質の生物学的活性を依然として維持する限りは、アミノ酸置換
を許容している位置は修正されてもよい。

【００４５】第２の方策は、タンパク質機能のための重要な領域を識別するために複整され
た遺伝子の特定の位置で、アミノ酸変化を導くために遺伝子工学を利用する。

【００４６】たとえば、突然変異誘発またはアラニン・スキャニング変異誘発（分子の全ての
残基への単一のアラニン変異の挿入）に向けられた部位を利用することができる
。（CurminghamおよびWells（Science 244: l08 1-1085 (1 989)））結果として
生じる変異分子は、それから生物学的活性について試験されることができる。

【００４７】著者が述べるように、これらの２つの方策は、タンパク質が意外にもアミノ酸
置換に寛容なことを明らかにした。著者は、さらに、どのアミノ酸変化がタンパ
ク質の特定のアミノ酸の位置で許容されているらしいかを示している。例えば、
大部分の埋没された（タンパク質の３次構造の範囲内で）アミノ酸残基は無極性
の側鎖を必要とするのに、表面側鎖のほとんどの特徴は一般に保存されない。さ
らに、許容される保存的なアミノ酸置換は、脂肪族かまたは疎水性アミノ酸Ala
、Val、LeuおよびIleの置換；水酸基を含む残基SerおよびThrの置換；酸性の残
基AspおよびGluの置換；アミド残基AsnおよびGlnの置換、塩基性の残基Lys、Arg
およびHisの置換；芳香族の残基Pheの置換、TyrおよびTrpおよび小さい大きさ
のアミノ酸Ala、Ser、Thr、MetおよびGlyの置換を含む。

【００４８】本発明の「実質的に類似した」ポリペプチドも、（ｉ）非保存されたアミノ酸
残基の１つ以上を有する置換であり、置換されたアミノ酸残基は、遺伝暗号によ
ってコード化されるものであってもなくてもよい、または（ｉｉ）置換基グルー
プを有する１つ以上のアミノ酸残基を有する置換、または（iii）他の合成物、
例えば、ポリペプチド（例えばポリエチレングリコール）の安定性および／また
は可溶性を増大する合成物を有する成熟したポリペプチドの融合、または（ｉｖ
）追加のアミノ酸、例えば、IgG Fc融合領域ペプチド配列、またはリーダー配列
または分泌配列、または精製を容易にしている配列を有するポリペプチドの融合
、を含む。このような異なるポリペプチドは、ここでの教示から当業者の範囲内
であるとみなされる。

【００４９】例えば、その他荷電されるかまたは中性のアミノ酸を有する荷電されたアミノ
酸のアミノ酸置換を含んでいるポリペプチド変異体が、改良された特徴（例えば
より少ない凝集）を有するタンパク質を生じる。製薬処方の凝集は、活性を減ら
すおよび凝集体の免疫原性活性のためにクリアランスを増やす。（Pinckard et
al., Clin. Exp. Immunol. 2: 331-340 (1967)；Robbins et al., Diabetes 36:
838-845 (1987)；Cleland et al., Crit. Rev. Therapeutic Drug Carrier Sys
tems 10: 307-377 (1993)）「交雑の厳密性」は、核酸ハイブリッドが安定する条件を引用するために本願
明細書において用いられる。本発明も、ここに開示されるラミニン鎖のポリヌク
レオチドのコード配列またはそれらの補体の全てまたは部分に対する（ここに定
義されるような）より高い厳密性の条件の下で交雑する核酸を含む。交雑する核
酸の交雑している部分は、一般的に少なくとも５０個のヌクレオチドの長さであ
る。当業者にとって知られるように、ハイブリッドの安定性はハイブリッドの融
解温度（ＴＭ）に反映される。ＴＭは、配列ホモロジーの１％毎の減少によって
約１〜１．５℃低下する。一般に、ハイブリッドの安定性は、ナトリウム・イオ
ン濃度および温度の関数である。概して、交雑反応はより低い厳密性の条件の下
で実行され、続いて変化するがより高い厳密な洗浄が実行される。交雑の厳密性
との関係はこのような洗浄の条件に関連する。したがって、ここに用いられるよ
うに、高い厳密性は５０％のホルムアミド、５×SSC（７５０ｍＭのNaCl、７５
ｍＭのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５
×デンハート液、１０％のデキストラン硫酸塩および２０ｐｇ／ｍｌの変性し、
剪断されたサケ精子ＤＮＡを含む溶液における４２℃での一晩の培養、続く約６
５℃の０．１×SSCでのフィルタの洗浄に引用される。

【００５０】また、本発明のポリヌクレオチドに交雑するラミニン８のコード化核酸配列は
、より低い厳密性の交雑条件で意図される。交雑およびシグナル発見の厳密性に
おける変化は、主にホルムアミド濃度（ホルムアミドのより低いパーセンテージ
は、より低い厳密性という結果になる）；塩分条件または温度の操作で達成され
る。例えば、より低い厳密性の条件は、６×SSPE（２０×SSPE＝３ＭNaCI；０．
２ＭNaH₂PO₄；００２ＭEDTA、ｐＨ７．４）、０．５％SDS、３０％ホルムアミド
、１００ｕｇ／ｍｌのサケ精子ブロッキングＤＮＡから成る溶液における３７℃
での一晩の培養、続く１×SSPE、０．１％SDSによって５０℃での洗浄を含む。
加えて、さらに低い厳密性を提供するために、厳密な交雑に続いて実行される洗
浄をより高い塩分濃度（例えば５×SSC）で行うことができる。

【００５１】上記の条件の変化が代わりのブロッキング試薬の封入および／または置換で達
成されるという記録は、交雑実験の背景を隠したものである。代表的なブロッキ
ング試薬は、デンハート試薬、ＢＬＯＴＴＯ、ヘパリン、変性するサケ精子ＤＮ
Ａおよび市販の専売の処方を含む。互換性に関する課題のために、特定のブロッ
キング試薬の封入は、上記した交雑の条件の変更を必要とする。

【００５２】ここで使用しているように、２つのアミノ酸のまたは２つの核酸の「パーセン
ト同一性」はKarlin and Altschul（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-226
8,1990）のアルゴリズムを利用して決定される。そして、Karlin and Altschul
（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877,1993）のように修正される。こ
のようなアルゴリズムは、Altschul et al. (J. Mol. Biol. 215: 403-410,1990
)のNBLASTおよびXBLASTプログラムに組み込まれる。本発明の核酸分子に相同な
ヌクレオチド配列を得るために、BLASTヌクレオチド検索はNBLASTプログラム、
スコア＝１００、ワードレングス＝１２によって実行される。本発明のポリペプ
チドに相同なアミノ酸配列を得るために、BLASTタンパク質検索はXBLASTプログ
ラム、スコア＝５０、ワードレングス＝３によって実行される。比較目的のため
のギャップを有する配列を得るために、Altschul et al. (Nucleic Acids. Res.
25: 3389-3402,1997)に記載されているように、Gapped BLASTが利用される。BL
ASTおよびGapped BLASTプログラムを利用するとき、それぞれのプログラムのデ
フォルト・パラメータ（例えば、XBLASTおよびNBLAST）が利用される。http://w
ww. ncbi. nlm. nih. govを参照のこと。

【００５３】本発明の更なる実施例は、SEQ ID番号：10,12,14,16,18,20,22,24,26,28また
はそれのフラグメントに含まれるポリペプチド配列のうちの1つ以上に対して、
少なくとも７０％の同一性、好ましくは少なくとも８０％の同一性、そして、最
も好ましくは少なくとも９０％の同一性を有しているラミニン８の鎖ポリペプチ
ドをコード化しているポリヌクレオチドを含む。

【００５４】ここで使われるように、「a4ポリヌクレオチド」は同じ名前のα4 ラミニン鎖
をコードしているポリヌクレオチドに関連する。そのようなポリヌクレオチドは
、以下のように特徴づけられることができる(a)前述したポリヌクレオチドは、S
EQ ID NO:2、4、6、8、10、12あるいはこれらの断片に記載される配列と実質上
類似のアミノ酸配列をコードすることができる（ｂ）SEQ ID NO:2、4、6、8、10
、12あるいはこれらの断片に記載されるポリペプチド配列と、少なくとも70％、
好ましくは80％の同一配列を共有する（ｃ）α4ポリヌクレオチドは、条件が厳
しくても厳しくなくても、SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11あるいはこれらの断片
、もしくはこれらと相補的な断片が符号化する配列と交雑する（ｄ）α4ポリヌ
クレオチドは(1) R1-R2 R3; (2) Rl-R2 R3(e); (3) R3; (4) R3(e); (5) R1-R3;
(6) Rl-R3(e); (7) R2-R3；及び(8) R2-R3(e)から選ばれる一般的な構造を有す
るポリペプチドをコードする。ここで、Ｒ１およびＲ２は上述されており、Ｒ３
およびＲ３（ｅ）は上述したα４ポリペプチド鎖から分泌される。

【００５５】ここで使われる、「β1ポリヌクレオチド」は同じ名前のβ１ラミニン鎖をコ
ードしているポリヌクレオチドに関連する。そのようなポリヌクレオチドは、以
下のように特徴づけられることができる(a)前記ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO
：14、16、18、20あるいはこれらの断片に記載される配列と実質上類似のアミノ
酸配列をコードすることができる(b)SEQ ID NO：14、16、18、20あるいはこれら
の断片に記載されるポリペプチド配列と、少なくとも70%、好ましくは少なくと
も80%、および最も好ましくは少なくとも90%の同一配列を共有する（c）：β1の
ポリヌクレオチドは、条件が厳しくても厳しくなくても、SEQ ID NO：13、15、1
7、19あるいはこれらの断片、もしくはこれらと相補的な断片がコードする配列
と交雑する(d)：β1ポリヌクレオチドは(1) R1-R2 R3; (2) Rl-R2 R3(e); (3) R
3; (4) R3(c); (5) R1-R3; (6) Rl-R3(e); (7) R2-R3；及び(8) R2-R3(e)から選
ばれる一般的な構造を有するポリペプチドをコードする。ここで、R1およびR2は
上述されており、R3およびR3(e)は上述したβ１ポリペプチド鎖から分泌される
。

【００５６】ここで使われる、「γ1ポリペプチド」は同じ名前のγ1ラミニン鎖をコードし
ているポリヌクレオチドに関連する。そのようなポリヌクレオチドは、以下のよ
うに特徴づけられることができる (a)前記ポリヌクレオチドのヌクレオチドは、
SEQ ID NO：22、24、26、28あるいはこれらの断片に記載される配列と実質上類
似のアミノ酸配列をコードすることができる(b)SEQ ID NO：22、24、26、28ある
いはこれらの断片に記載されるポリペプチド配列と、少なくとも70%、好ましく
は少なくとも80%、最も好ましくは少なくとも90%の同一配列を共有する(c)γ1の
ポリヌクレオチドは、条件が厳しくても厳しくなくてもSEQ ID NO：21、23、25
、27あるいはこれらの断片、もしくはこれらと相補的な断片がコードする配列と
交雑する(d)γ1ポリヌクレオチドは(1) R1-R2 R3; (2) R1-R2 R3(e); (3) R3; (
4) R3(e); (5) R3-R3; (6) Rl-R3(e); (7) R2-R3；及び(8) R2-R3(e)から選ばれ
る一般的な構造を有するポリペプチドをコードする。ここで、R1およびR2は上述
されており、R3およびR3(e)は上述したγ1ポリペプチド鎖から分泌される。

【００５７】ここで使用している語句「エピトープタグ」はキメラタンパク質の一部として
表されるポリペプチド配列に関連する。ここで、エピトープタグはエピトープタ
グに対する抗体、またはエピトープタグと結合できる配列を持つ他の分子を精製
する場合に使用することができる。

【００５８】ここで使用している語句「生体適合性の増加」は急性もしくは慢性の炎症性反
応に関連する。そして、ラミニン8-コーティッド生体適合物質の注入により、周
囲組織の分化のための分裂はノンコーティッド生体適合物質に比べ減少する。

【００５９】ここで使用している語句「移植片」は自然で補綴の移植片と注入に関連する。

【００６０】一つの方法では、本発明はｒ−ラミニンを発現する細胞を提供するが、これは
、α4、β1およびラミニン8のγ１鎖及びそれらの断片から成る、少なくとも一
つのポリペプチド配列をコードする核酸配列に連結されるプロモータ配列を発現
するベクターによってトランスフェクトされる。ここで、トランスフェクトされ
る細胞は、組み換え型のラミニン鎖を含んでいるヘテロトリメリックなラミニン
8を分泌する。好適な具体例において、細胞はプロモータ配列含む組み換えベク
ターを系統的にトランスフェクトされる。そのプロモータ配列は、α４、β１、
ラミニン８のγ１鎖から成るポリペプチド鎖をコードする核酸配列と連鎖する。
多数のトランスフェクトの後、細胞はヘテロトリマーから各々の組み換えラミニ
ン8鎖を、ｒ−ラミニン８を媒体に入れる前に形成する。

【００６１】好ましい具体例として、α4、β１及びγ1鎖あるいはそれらの断片をコードし
ているｃＤＮＡは、ベクターにサブクローニングされる。あるいは、ラミニン8
、α4、β1及び／またはγ1の遺伝子配列は、一つ以上のイントロンを含んで使
うことができる。

【００６２】 r-ラミニン8を分泌することができるどんな細胞でも使うことができる。好ま
しくは、真核生物細胞を使うことができ、より好ましくは哺乳動物の細胞を使う
ことができるが、上皮細胞系統に限定されるものではない。最も好ましい具体例
において、哺乳類の細胞が、内因性のラミニン8鎖の全てを発現するわけではな
い。炭水化物と二硫化物の翻訳後の修正は、ラミニン8タンパク質の折りたたみ
と機能のために必要だと考えられている。これは、機能性r-ラミニン8を生産す
るために好ましい真核生物生物細胞を使用できる、またより別のシステムでは、
たとえば抗体生産のために抗原を得ることに役立つ。

【００６３】「組み換え発現ベクター」は、核酸がコードする領域または遺伝子と結合する
ベクターであり、遺伝子の発現をもたらすことができるどんなプロモータにでも
結合できる。個々の鎖またはr-ラミニン8の発現をもたらすプロモータ配列は、
構成性であるかもしれないし（CMV、SV40、RSV、アクチン、EFに限定されない、
いろいろなプロモータによってもたらされる）誘導性であるかもしれない（テト
ラサイクリン、エクジソン、ステロイド反応に限定されない、いろいろなプロモ
ータによってもたらされる）。ベクターの発現は、宿主内においてエピソームま
たは宿主染色体のDNAへの組み込みによって、再生可能でなければならない。好
ましい具体例として、ベクターの発現はプラスミドから成る。しかし、本発明は
、ウィルスのような同様な機構のベクターの発現を含むつもりである。

【００６４】具体例の一つとして、少なくともラミニン鎖ポリペプチド配列の一つまたはそ
の断片は、エピトープタグをコードする核酸配列と連結する。そのため、少なく
とも鎖の一つは、エピトープタグと融合するタンパク質として発現する。エピト
ープタグは、アミノ基終点、カルボキシ基終点、またはｒ−ラミニン８の機能が
残る限りにおいてｒ−ラミニン８から成るポリペプチド鎖のいずれかの部分、と
して発現する。何れのエピトープタグも、ｒ−ラミニン８によって得られるアフ
ィニティー精製のための塩基として使用されるかもしれない。そのようなエピト
ープタグとしては、FLAG (Sigma Chemical, St. Louis, MO)、myc (9E10) (Invi
trogen, Carlsbad, CA)、6-His (Invitrogen; Novagen, Madison, WI)、及びHA
(Boehringer Manheim Biochemicals)が挙げられるが、これらに限定されるもの
ではない。

【００６５】他の具体例として、ｒ−ラミニン８鎖の一つは、最初のエピトープタグと融合
するタンパク質として発現する。そして少なくとも他のｒ−ラミニン鎖の一つは
、２番目のエピトープ・タグと結合するタンパク質として発現する。これは、精
製が繰り返されることを許容する。あるいは、同じエピトープタグは、一つ以上
のr-ラミニン鎖と融合するタンパク質をつくるのに用いられることができる。

【００６６】さらに別の具体例では、エピトープタグはｒ−ラミニン８から開裂するために
計画することもできる。あるいは、エピトープタグは何れのｒ−ラミニン８鎖と
も融合せず、ｒ−ラミニン８は、通常の方法であるラミニン８抗体あるいはラミ
ニン８と結合する分子を用いたアフィニティークロマトグラフィーで精製される
が、これらに限定されるものではない。

【００６７】真核生物細胞へのベクター発現のトランスフェクトは、燐酸カルシウムとの共
沈、電気泳動、あるいはリポソーム媒介、ＤＥＡＥデキストラン媒介、ポリカチ
オン媒介、あるいはウィルス媒介のトランスフェクトなどの公知技術を用いて行
うことができるが、これらに限定されるものではない。細菌細胞のトランスフェ
クトは、標準の方法によって行うことができる。

【００６８】好ましい具体例として、細胞は安定してトランスフェクトされる。安定したト
ランスフェクト方法と適切なトランスフェクト細胞の選択は公知の技術である。
最も好ましい具体例として、ＣＭＶプロモータによって引き起こされるベクター
発現は、ヒト腎臓胚２９３細胞系列において使用される。

【００６９】一つのラミニン鎖をトランスフェクトする細胞からの媒体は、最初ラミニン鎖
抗体を用いたウエスタンブロット（ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔｓ）で分析される
。トランスフェクトに続く一つのラミニン鎖の発現は通常細胞内で起こる。トラ
ンスフェクトされた鎖に対する反応性を示しているクローンは、ＰＣＲ、逆トラ
ンスフェクトＰＣＲ、あるいはトランスフェクト遺伝子を確認するための核酸の
交雑など適当な方法で検証することができる。好ましくは、そのようなクローン
からのゲノムＤＮＡ準備の分析は、ラミニン鎖特有のプライマーペアを用いたＰ
ＣＲによってなされる。ｒ−ラミニン８の分泌及び／または活性のための、トラ
ンスフェクトしたクローンが作る三つの鎖すべてからの媒体の分析は、ウエスタ
ンブロットと細胞結合アッセイを含む適当な方法で行われる。ｒ−ラミニン８の
活性は、好ましくは細胞付着アッセイによって分析される。

【００７０】別の態様において、本発明は実質上精製されたラミニン８を、好ましくはｒ−
ラミニン８を提供する。具体例の一つとして、実質上精製されたラミニン８は、
α４ポリペプチド鎖から成る第１の鎖；β１ポリペプチド鎖から成る第２の鎖；
γ１ポリペプチド鎖から成る第３の鎖；から成る。あるいは、ｒ−ラミニン８は
、実質上少なくともSEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12で示される配列の一つもし
くはこれらの断片に類似した第１の鎖；実質上少なくともSEQ ID NO: 14, 16, 1
8, 20で示される配列の一つもしくはこれらの断片に類似した第２の鎖；実質上
少なくともSEQ ID NO: 22, 24, 26, 28で示される配列の一つもしくはこれらの
断片に類似する第３の鎖；から成る。

【００７１】別の具体例において、実質上精製されたｒ−ラミニン８は、SEQ ID NO: 2, 4,
6, 8, 10, 12で示される配列の少なくとも一つ、あるいはこれらの断片と、少
なくとも約７０％が同一のポリペプチドから成る第１の鎖；SEQ ID NO: 14, 16,
18, 20で示される配列の少なくとも一つ、あるいはこれらの断片と、少なくと
も７０％が同一のポリペプチドから成る第２の鎖；ID NO: 22, 24, 26, 28で示
される配列の少なくとも一つ、あるいはこれらの断片と、少なくとも７０％が同
一なポリペプチドから成る第３の鎖；から成り、ここで、第１、第２、第３の鎖
は、会合してラミニン８のヘテロトリメトリックに組換わる。

【００７２】好適な具体例において、実質的に精製されたヒトのr-ラミニン8の第1、第2、
第3の鎖のうち少なくとも1つは、エピトープタグと融合するタンパク質として発
現する。

【００７３】あるいは、ｒ−ラミニン８はヘテロトリメトリックポリペプチド構造から成り
、ここでそれぞれの鎖は、(1) R1-R2-R3; (2) Rl-R2-R3(e); (3) R3; (4) R3(e)
; (5) R1-R3; (6) Rl-R3(e); (7) R2-R3;および(8) R2-R3(e)から成る。ここで
、Ｒ１はアミノ基終点メチオニン；Ｒ２はポリペプチドを直接分泌することので
きるシグナル配列、ここで、シグナル配列は特定のラミニン鎖のための天然のシ
グナル配列であるかもしれないし、他のタンパク質を分泌するもの、あるいは人
工的な配列であるかもしれない；Ｒ３はα４、β１あるいはγ１ラミニン鎖を分
泌する；そしてＲ３(e)はラミニンα４、β１、及びγ１鎖を分泌しこれらはラ
ミニン鎖アミノ酸配列のいずれかの部位に位置することのできるエピトープタグ
（上述したような）から成る。

【００７４】好ましい態様において、ｒ−ラミニン８の精製は、トランスフェクトされた細
胞の培地を抗体アフィニィティーカラムに通すことにより行われる。１つの態様
において、少なくとも組み換え鎖として表現されるペプチドエピトープに対する
抗体は、アフィニィティーカラムに結合し、そして培地中に分泌されたｒ−ラミ
ニン８にバインドされる。カラムに過剰のペプチドを通すことにより、ｒ−ラミ
ニン８はカラムから取り除かれる。抽出された断片は、ゲル電気泳動、ウエスタ
ンブロット分析を含む適当な方法により分析される。他の態様において、ペプチ
ドエピトープは、精製後に切断され得る。他の態様において、２又は３つのセパ
レートｒ−ラミニン鎖は、融合プロテインとして表現される、異なるエピトープ
タグ毎に２又は３回精製することにより、２重又は３重に精製されたｒ−ラミニ
ン８が得られる。エピトープタグを工作することにより、精製後のｒ−ラミニン
８から切断され得る。他の方法として、エピトープタグは、ｒ−ラミニン８鎖の
いずれかに融合することはなく、またｒ−ラミニン８はアフィニィティークロマ
トグラフィーに限定されない標準的な方法によりラミニン８特定抗体や他のラミ
ニン８結合分子を用いることにより精製される。

【００７５】本発明はさらに、実質的に精製されたラミニン８と薬学的に適用しうる担体と
からなる組成物を提供する。好ましい態様において、薬学的組成物は実質的に精
製されたｒ−ラミニン８からなる。本発明のこの観点によれば、取り扱われる条
件によって、他の助剤も薬学的組成物中に含まれ得る。薬学的組成物は、さらに
１もしくはそれよりも多くの化合物を含んでもよく、前記化合物はいくつかのコ
ラーゲンに限定されることなく、他のラミニンタイプの、フィブロネクチン、ビ
トロネクチン、カドヘリン、インテグリン、α―ディストログリカン、エンタク
チン／ニドーゲン、α―ディストログリカン、グリコプロテイン、プロテオグリ
カン、ヘパランスルフェートプロテオグリカン、グリコサミノグリカン、表皮成
長因子、管内皮成長因子、線維芽細胞成長因子、又は神経成長、及びそれらのペ
プチドフラグメントが含まれる。

【００７６】実質的に精製されたラミニン８からなる薬学的製剤は、適当な形態で調製され
得るものであって、一般的にラミニン８と公知の薬学的に受け入れられ得る担体
との組み合わせからなる。担体は、注射可能な担体、局所用担体、経皮性の担体
等で有り得る。調製は都合良くは局所施用に適した形態、例えば軟膏、ゲル、ク
リーム、スプレー、ディスパーション、サスペンション又はペーストの形態で調
製してもよい。調製はさらに都合が良くは、保存料、抗菌剤、抗真菌剤、抗酸化
剤、浸透圧調節剤、並びに成分及び量が類似している通常用いられている材料を
含んでもよい。本発明において使用される適当な溶液は、無菌であって施用に対
して有害でないものであり、慣用される薬学的操作、例えば滅菌に供されてもよ
く及び／又は慣用の助剤例えば保存料、安定剤、水和剤、乳化剤、バッファー等
を含有してもよい。本発明の組成物を調製するための参考として、レミングトン
の薬学の科学、１５版、マックパブリッシュング社、イーストン、Ｐａ（１９７
５）が援用される。

【００７７】他の観点から、本発明はラミニン８からなる方法及びキット、又はそれらの薬
学的組成物（及びキットにラミニン８を用いるための説明）を提供する。係る発
明は、間充織の原因部、例えば骨、軟骨、腱、及び靭帯の組織の損傷の治療、管
及び神経組織の損傷治療、及び前記損傷の治療に使用されるグラフトの生物学的
適合性の改善を促進するものである。

【００７８】以下に開示される方法のそれぞれの態様において、ｒ−ラミニン８が使用され
る。具体例として、実質的に精製されたラミニン８、ｒ−ラミニン８、又はそれ
らの薬学的組成物は、以下のために使用される：ａ、管の損傷部におけるリエンドセリアライゼーションの促進ｂ、グラフト量の改善ｃ、医療器具の生物学的適合性の改善、ｄ、神経組織の治療（神経の再生）ｅ、血管形成の制御，及びｄ、細胞の移行この場合、効果的な量のラミニン８又はそれらの薬学的組成物を種々の方法に
適用される。

【００７９】１つの態様において、ラミニン８は、リエンドセリアライゼーションを促進し
、そして管の損傷部における異常な平滑筋細胞の増殖を阻害する。α４鎖は、間
充織的に誘導される細胞の内皮及び平滑筋細胞を含む（これらに制限されること
はない。）固体群と適合し、そしてラミニン８は管の内皮の第１の薄片として示
される。

【００８０】再狭窄／再閉塞率が５０〜７０％であることより、閉塞した冠状動脈を洗浄す
る血管形成の評価には制限がある。いくつかの研究により、管ステントの挿入に
より、以下のような血管形成が現れ、再狭窄の発生が減少するということが明ら
かにされているが、この治療の効果は未だに制限されているという問題がある。
再狭窄は、血管形成処置に対応して、増殖する管平滑筋のある一部に発症する。
血管形成のスクラッピング作用は問題となる閉塞だけでなく、管基部の薄片部分
を取り除くようなものである。不連続の基部の薄片は、結果として、再狭窄に導
かれる管平滑筋細胞の異常な成長に対して寄与する。

【００８１】ラミニン８を管ステントに付着することにより、リエンドセリアライゼーショ
ンが促進されて、再狭窄が制御され得る。管内皮細胞と、ラミニン８がコートさ
れたステントとの相互作用により、接着及び付着が促進され、それにより損傷／
内皮細胞の再狭窄との反応が活性化することに代わって、ホメオスタシス及び通
常の細胞成長が促される。活性化された小板はラミニン８に接着することがある
が、活性化されていない小板は接着することはない。さらに、溶解性ラミニン８
は、小板の活性化を起こさないが、古典的な活性剤例えばトロビン、コラーゲン
Ｉ、及びＡＤＰ（未発表の結果である）により抗体が小板の活性に影響すること
が明らかにされてきている。リエンドセリアライゼーションの速度をより正常に
また制御することにより、再閉塞の発生率が低下し、また血管形成術の成果を改
善することになるであろう。

【００８２】同様に、人工管グラフフトは、血液凝固因子と人工グラフト材料を作用させる
ことにより、血液の凝固及び血栓症を低下させることができる。ラミニン８で管
グラフトをコーティングすると、人工管のエンドセリアライゼーションが促進さ
れることにより、血管形成性の表面が提供されることになる。基細胞膜に存在す
る他の細胞のように、管内皮細胞は、好んで適当な樹細胞膜物質に接着する。ラ
ミニン８は、管基薄膜の構成成分として認識され、また基薄膜をサポートする管
内皮細胞の付着に関与することが推測されてきた。この材料をグラフト材料とし
て提供することにより、非―血管形成性の表面が作り出され、エンドセリアライ
ゼーシンが促進し、そして内皮血管形成及び管障害が阻害されることになる。損
傷した血管への投与は、ラミニン８又はその薬学的組成物を損傷箇所に単純にコ
ーティングすることにより行われ得る。他の態様において、放出は、以下のよう
にして行うことができる。

【００８３】１、ステントをコーティングすること、２、ステントの表面に生物学的に分解可能なスリーブをコーティングすること、
又は３、ラミニン８もしくはその薬学的組成物を多孔質のカテーテルを介して損傷箇
所に押し付けること他の態様において、本発明は骨を作り出す方法及び結合組織の修復方法を提供
することを目的とする。ラミニン８又はその薬学的組成物を傷口に組み込むこと
によりドレッシング及び細胞間質が修復され、並びに組織がグラフトして骨及び
結合組織の回復を促進し、正常なリガンド界面が与えられることにより正常な細
胞結合、細胞成長及び組織の発育が促進されることとなる。グラフトを多く使用
することにより、結合組織が置き換わり、細胞層が基薄皮に接着することとなる
。不適当な表面がこれらの細胞（以下のグラフティング）に供給される場合、グ
ラフトによる正常な細胞層のリストレーションが失敗するおそれがある。これら
をラミニン８でグラフトすることの利点は、正常な基薄皮充分に繰り返されて、
細胞のリポピュレーシンが生み出されることにある。本明細書において、「グラ
フト」という用語は、自然の及び補綴学のグラフトを意味する。

【００８４】本発明の方法は、腱、軟骨又は靭帯、奇形部及び欠陥、骨折、欠損の回復、並
びに腱、軟骨又は靭帯と骨もしくは他の組織の改良された固定に用いられる。さ
らに、補綴装置内へ骨質が成長することにより種々の補綴装置の効果が増幅され
る結果、人工的な部分は、人工部を取り巻く骨格のような組織（自然の骨に似た
ブリッジを介して）によって、硬くしかも永続的にアンカーされることになる。

【００８５】他の観点において、本発明は生物学的適合性が改善された医療用器具に関する
。ここで、本発明の器具は、ラミニン8又はその薬学的組成物でコートされてお
り、前記ラミニン8等はそれ自体又は他の器具表面の生物学的適合性の向上に寄
与する他のタンパク質もしくは助剤と組み合わせてコートされている。コートさ
れた器具は細胞の付着を促進し、また適用した箇所の炎症及び／又は感染を和ら
げる。

【００８６】このような医療用器具としては、人体に取り入れることができる材料であれば
どのような材料であっても使用することができるが、好ましくはステンレスもし
くはチタンのような生物学的適合性金属で構成されているか又はコートされてい
るものを使用する。他に、器具はセラミック材料、又はポリエステル、ポリグリ
コール酸もしくはポリガラクトース−ポリグリコール酸コポリマーを含む（これ
らに制限されることはない。）ポリマーで構成されているかもしくはコートされ
ている。

【００８７】本発明の好ましい用途として、目的表面への細胞の接着を増加することが挙げ
られる。ここで、細胞には、内皮、骸骨のような筋肉、平滑筋、及び他の間充織
由来の細胞が含まれる。例えば、管グラフト及びステントは、ラミニン8又はそ
の薬学的組成物でコートすると内皮細胞の付着を促進するであろう。他にも、骨
もしくは結合組織グラフト又は人工器具をラミニン8もしくはその薬学的組成物
でコートして細胞の付着を促進しまたグラフト効果を向上させてもよい。

【００８８】器具が自然の又は人工の生物学的適合性材料でメッシュ状、シート状又は織物
状に作られている場合、ラミニン８又はその薬学的組成物をそれらの表面に直接
適用してもよい。適当な細胞をその後細胞間質上で培養することで移植可能なイ
ンプラント器具が形成されるであろう。ここで、前記器具として歯科用アバント
メントピース、ニードル、金属ピンもしくはロッド、インドウエリングカテーテ
ル、コロストミーチューブ、外科用メッシュ及びその他の装置が含まれ、それら
はラミニン8でコーティングされていることが望ましい。他に、装置を移植し、
そして体内において細胞と接触させてもよい。

【００８９】実質的に精製されたラミニン8の結合は、共有結合ではないか（例えば吸着）
又は共有結合によるものであろう。器具をラミニン8又はその薬学的組成物に浸
漬、インキュベートするか、又は器具に前記ラミニン8等を噴霧してもよい。

【００９０】本発明のラミニン8を使用する種々の治療法に用いる適用量は、多くの要因に
基づいて定められる。ここで、前記要因として、年齢、体重、性別、個人の医療
状態、状態の厳しさ、及び投与のルートが含まれる。従って、適用量は、幅広く
変化するであろうが、基本的な方法を用いて医師により機械的に決められ得る。
ラミニンは、極めてよく効く分子であり、１細胞当たりに１もしくは２，３の分
子で効果が得られる。従って、効果的な施用量は、放出が最適化された場合、１
ミリリットル当たりピコグラムの範囲で使用することができる。ラミニンは、ラ
ミニンのアイソフォームや条件によるが、しばしば基膜に不溶解性の形態で存在
し約５０μｇ／ｍｌほどの低い濃度でポリマー化する能力を有する。ラミニンは
また約２〜３ｍｇ／ｍｌの濃度でゲルにポリマー化できる。適用量は１nｇ／ｍ
ｌから１０nｇ／ｍｌのオーダーで本明細書に開示された全ての方法に使用し得
るが、好ましくは、約１μｇ／ｍｌから３ｍｇ／ｍｌである。

【００９１】本発明はまた前記した器具への付着を促進する方法に関し、係る方法は所望の
用途に適用させるために細胞をインキュベートする前に、装置をラミニン8又は
その薬学的組成物でコーティングすることからなる。

【００９２】ラミニンの調製方法はニューロンを成長し分化することにより行われることが
知られており（米国特許第５２２９３６５号）、また前記ラミニンをタイプ１の
コラーゲンと組み合わせて使用して中空の導管をコートし、切断された神経のギ
ャップを横断するように神経の再生が促進されてきた（米国特許第５０１９０８
７号）。

【００９３】また、他の実施態様において、神経を再生する方法が提供される。その方法は、
神経再生を促進するために効果的な量のラミニン8または医薬組成物を、必要と
する物質（subject）に投与することから成る。移植片は神経の移植片または人
工器官の移植片を含有する。神経の間隙をふさぐための管として、生体再吸収性
の材料と生体非再吸収性の材料の両方を使用する(例えば、Nyilasら(Trans. Soc.
Biomater.,6,85,1983),Molanderら(Biomaterials,Vol.4,pp.276-280,October,1
983)、Colinら(Journal of Dental Research July,1984,pp.987-993)。その方法
は、神経単位や神経の機能低下及び/または変性によって特徴付けられる疾患や
損傷の治療に用いることが出来る。ラミニンまたはラミニンを含有する細胞抽出物は、二層性の方法において脈管
形成を調整することが示されている(例えば、Nicosiaら、Dev. Biol. 164:197-20
6(1994); Bonfilら、Int. J. Cancer 58:233-239(1994)参照)。低濃度(30-300μ
ｇ/ml)において、ラミニン-エンタクチン錯体は立体培養において脈管形成を刺激
する。しかし、3000μｇ/mlでは同じ錯体は脈管形成を抑制する。例えば、他の面
において、本発明は脈管形成を調整する方法を提供する。その方法は、組織または
培養基質を、脈管形成を調整するために効果的な量のラミニン8または医薬組成
物と接触させることから成る。一つの実施態様において、組織または細胞基質を、
脈管形成を促進するために効果的な量のラミニン8と接触させることによって、
ラミニン8を脈管形成を促進するために使用する。他の実施態様において、組織ま
たは細胞基質を、脈管形成を抑制するために効果的な量のラミニン8と接触させ
ることによって、ラミニン8を脈管形成を抑制するために使用する。脈管形成を
抑制するためにラミニン8と接触させる培養基質の一例は、組織工学上の目的の為
に使われるものである。

【００９４】本発明の他の面において、細胞の付着と増殖/分化/状態を刺激するために効果
的な量のラミニン8と細胞を接触させることにより、ラミニン8を細胞の培養のた
めに使用する。その細胞は、内皮細胞、神経細胞、造血系統の細胞及び間葉由来
の細胞に限定されないし、骨由来の細胞、結合組織、脂肪組織、骨格筋細胞、平
滑筋細胞に限定されない。ラミニン8を細胞培養液に、すなわち細胞培養液の補足
として供給し得る。また、ラミニン8を細胞増基質の表面において覆い得る。好ま
しい実施態様において、その方法はさらに細胞を他の化合物と接触させることを
含んでいる。他の化合物は、コラーゲン、他のラミニン類似物、フィブロネクチ
ン、α−ジストログリカン、カドヘリン、インテグリン、エンタクチン/ナイド
ジェン、α−ジストログリカン、糖たんぱく質、プロテオグリカン、ヘパラン硫
酸プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、上皮増殖因子または神経成長因子
、血管内皮細胞増殖因子、繊維芽細胞増殖因子、ペプチドフラグメントに限定され
ない。

【００９５】細胞は一次細胞または細胞培養細胞系を含む。本発明のこの観点の方法は、生
体内、遺伝子治療、試験管内において用いることが出来る。好ましい実施態様において、ラミニン8を用いて基質の表面を覆い、基質への
細胞の付着を促進し、細胞の増殖/分化/状態を刺激する。ここにおいて使われる
基質は望ましい基質であればいずれでも良い。研究室での使用を目的とする場合、
基質はガラスやプラスチックのような簡素な物でよい。生体内での使用を目的と
する場合、基質は細胞の付着を支援し得る生体適合性の材料であればいずれでも
良い。適当な基質材料は、コラーゲン、再生コラーゲン、ポリグリコール酸、ポリ
ガラクトース、ポリ乳酸、又はそれらの誘導体、チタンやステンレススチールの
ような生体適合金属、ヒドロキシアパタイトのような補綴材料を含むセラミック
材料、ポリエステルやナイロンを含む合成ポリマー、ポリスチレン、ポリアクリ
レート、ポリテトラフルオロエチレン及び生物分子がそれに容易く付着し得る他
の材料のような材料から形作られているか、それら材料で覆われているものを含
む。本発明のγ-ラミニン8の付着を支援する為の特定の材料の能力を決定するこ
とは、熟練した技術者による日々の研究にのみ成し得る。更なる面において、本発明は細胞の付着や培養のための細胞成長基質を提供す
る。それは細胞培養装置への細胞の付着、次いで細胞の増殖/分化/状態に効果的
な量のラミニン8を提供することによりなる。基質は上記で検討された基質のど
れでも含む。本発明の他の面において、改良された細胞培養培地が提供される。そこにおいて
、細胞の付着、増殖及び/または維持を促進するために、細胞培養培地に効果的
な量のラミニン8を追加することからなる改良がなされる。細胞の成長を支援し
得る細胞培養培地であればどれでも本発明において使用できる。そのような細胞
培養培地はBasal Media Eagle、Dulbecco’s Modified Eagle Medium、Iscove’
s Modifiede Dulbecco’s Medium、McCoy’s Medium、Minimum Essential Mediu
m、F-10 Nutrient Mixtures、Opti-MEN(登録商標) Reduced-Serum Medium、RPMI
Medium及びMacrophage-SFM Medium、またはそれらの組み合わせに限定されない
。改良された細胞培養培地は濃縮された形態(すなわち10×)または濃縮されてい
ない形態のどちらで供給されても良し、液体、粉、または凍結乾燥したものとし
て供給されても良い。細胞培養は化学的に定義づけられても良いし、血清の補足を
含んでいても良い。培養メディアは商業的にGIBCO BRL (Gaithersburg, MD)及びS
igma (St. Louis, MO)のような多くの源から入手できる。より好ましい実施態様
として、ラミニン8を細胞培養補足として使う。

【００９６】本発明におけるラミニン8または医薬組成物は、ここで述べるように、さまざ
まな状態や疾患の処置に用いられる。それらは、さまざまな血管、神経及び間葉
組織の損傷に限定されないし、血管形成再狭窄、組織の虚血、神経の損傷、血管
の外科的な処置、アテローム硬化症、骨粗しょう症や変形性関節症のような骨の
弱化による結果である骨折、骨の欠損、骨の障害、歯周病、癌や医薬的処置によ
る副作用による骨の欠損、骨質量の年齢に関係する低下、間接軟骨の断裂、変形
、関節炎のような軟骨の欠損、軟骨組織の損傷、腱や帯の断裂、変形、腱炎や手
根トンネル症候群のような腱や帯の欠損、歯周帯の損傷及び腱と骨の剥離に限定
されない。

【００９７】そのような処置に使われるラミニン8または医薬組成物の量は、もちろん、処置
する状態や疾患の種類やひどさ、選択される投与経路に依存するものであり、治
療を行う医師や獣医によって決められる。ラミニン8または医薬組成物の「治療上
の効果的な量」なる語は、外因的に適用された要因が存在しない状態で、哺乳動
物の治療上の反応を生じうるよう決定されるラミニン8または医薬組成物の量を
言及する。そのような治療上、効果のある量はこの分野において通常の技術を有
する者であれば容易く決定できる。

【００９８】本発明は実施例を伴う参考と共により理解できる。それは実施例の効果を意図
するものであり、ここに添付した請求項によって定義されたような本発明の範囲
を限定するよう解釈されるべきでない。実施例構成の発現Ｃ-末端 FLAGエピトープを含むヒトラミニンα４鎖の発現の為に、完全な長
さのｃＤＮＡを組み立て以下のとおり修飾した。先の研究(Iivanainenら,1995)か
らのpBluescript(商標)またはpCRscript(商標)(Stratagene)プラスミドベクター
の中で、サブクローン化した補足のＤＮＡラムダクローンを、クローンF136を除
いて、ｃDNA源として用いた。FL136ラムダDNAから挿入したEcoRIをpBluescript(
商標)EcoRIサイト中でクローン化してFL136Eを作成した。クローンFL76由来の０
．７８kb SacＩ-BamHIフラグメントはpSL1180（Pharmacia）を消化したSacI-Ba
mHI中で結合し、FL76SBを作成した。ヒトラミニンα4ｃDNAのヌクレオチド2378-4
274に関する配列を、鋳型としてｃDNAライブラリーを用いるPCRにより詳説する
。SacIを用いて消化しFL76SB SacIサイト中でクローン化し、その配向を確認し
、HL4-SBを作成した。FL64 BamHI-SalIフラグメントをHL4-SB BamHI-Sal中でク
ローン化し、IHL4-3’を作成した。クローンFL117由来のEco72I-XhoIフラグメントをFL136EのEco72I-XhoIサイト
中で結合し、HL4-5’を作成した。マウスとヒトラミニンα4ｃDNAの両方とも、幾
つかの余分の5’非翻訳領域(UTR)ATG配列と同様に、翻訳開始サイトにおいて、K
ozak-配列の保有が乏しい。効率が良く、正確な翻訳の開始を確実にするため、Ko
zak配列をコンセンサスと合うように編集し、5’UTRのレスト（rest）を標準的な
分子生物学的手法により消去した。その結果として生じた生成物はEcoRI-EagI-消
化物であり、EcoRI-EagI-消化されたHL4-5’へとクローン化し、HL4Mut-5’を作
成した。HL4Mut-5’由来のSpeI-XhoIフラグメントをHL4-3’中でクローン化し、
完全な長さのｃDNAを有するクローンHL4-Fullを作成した。HL4-Full由来のEcoRI
挿入断片をpcDNA3.1/Zeo（-）発現ベクター（Invitrogen）中でクローン化し、H
L4-Full.pcDNAを作成した。(SEQID NO：1) FLAGエピトープ（SEQID NO：3）を符号化する配列を以下のように挿入した。F
L64 BamHI-HindIIIフラグメントをpUC19中でクローン化し、FL64BHを作成した。
鋳型としてHL4-3’を用い、FLAGエピトープを導入する為にプライマーを用いる
ことにより、PCRを行った。生成物をXbaIとHindIIIと共に消化し、FL64BHを消化
したXbal-HindIII中でクローン化し、HL4FLAG-3’を作成した。これは、又、最初
の3’UTRの削除の結果である。HL4FLAG-3’由来のBamHI-HindIIIフラグメントをB
amHI-HindIII-消化HL4-Full．PcDNAベクター中でクローン化し、最初のBamHI-Hi
ndIIIフラグメントを置き換えて、HL4FLAG-Bを作成した。それは、BamHI-BamHIフ
ラグメントが欠けていた。HL4FLG-Fullと称されている最終的な構成の発現は、見
えないBamHIフラグメントを正確な配向において挿入することにより成された。ｃ
DNA配列のすべてのPCR-誘導部分は、突然変異が増幅中に起こらないことを保証
するように配列していた。マウスラミニンβ1鎖(SEQID NO：15)の発現のために使用する構成は、既に述
べられている（Yurchencoら、Proc. Natl.Acad.Sci.Ｕ.S.A. 94(19),10189-94(1
997)）。ヒトラミニンγ1鎖の発現のためにHG1と称される構成を作成する目的で、ヒト
ラミニンγ1鎖をエンコードする完全な長さのｃＤＮＡ(SEQID NO：19)をBamHI
と共にバキュロウィルス発現ベクターpVL941（発表されていない）から遊離した
。そして、pcDNA3.1/Hygro（-）mammalian発現ベクター（Invitrogen）のBamHI
サイト中でクローン化した。

【００９９】抗体、対照たんぱく質、及び細胞系統親和力により精製されたポリクローナル抗ラミニンα４抗体（Ａｂ）Ｓ８は、
上述した通り準備された。（Ｉｉｖａｎａｉｎｅｎｅｔａｌ．，１９９７
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（４４），２７８６２−８）ポリクローナル抗
ＥＨＳラミニンＡｂ、抗ＦＬＡＧＭ２モノクローナルＡｂ（ｍＡｂ）、精製さ
れた対照マウスＩｇＧ、ＲＧＤＳペプチド及びへパリン（グレードＩ−Ａ）は、
シグマ・ケミカル・カンパニー（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｍｐａｎｙ
）（ミズーリー州、セントルイス）から購入した。抗ラミニンγ１（クローン２
２）ｍＡｂは、トランスダクション・ラボラトリーズ（Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏ
ｎＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（ケンタッキー州、レキシントン）からのもの
であった。インテグリンα１（クローンＦＢ１２）、インテグリンα２（クロー
ンＰ１Ｅ６）、及びインテグリンα３（クローンＰ１Ｂ５）に対するマウス機能
阻止ｍＡｂは、ケミコン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）（カリフォルニア州、テメキュラ
（Ｔｅｍｅｃｕｌａ））から入手した。ラット機能阻止ｍＡｂ抗インテグリンα
６（クローンＧｏＨ３）及び対照ラットＩｇＧ_２もまたケミコンからのものであ
った。インテグリンα５（クローンＢＩＩＧ２）及びインテグリンβ１（クロー
ンＡＩＩＢ２）に対するラット機能阻止ｍＡｂは、ハイブリドーマ標本としてＣ
．ダムスキー（Ｃ．Ｄａｍｓｋｙ）博士（カリフォルニア大学、サンフランシス
コ）から供与された。免疫グロブリンは、製造業社の使用説明書に従って、ＧＡ
ＭＭＡＢＩＮＤＰＬＵＳ（商標）セファロース（ファーマシア（Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ）；スウェーデン、ストックホルム）を用いて上清から精製された。二次
Ａｂ抱合体抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ及び抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰは、ダコパッツ
（Ｄａｋｏｐａｔｔｓ）（デンマーク）からのものであった。ＥＨＳ腫瘍からの
ラミニン１、ＥＨＳ腫瘍からのコラーゲンタイプＩＶ、及びヒトの胎盤ラミニン
は、シグマから入手した。フィブロネクチン及びＥＨＳ腫瘍からのいくらかのラ
ミニン１は、ギブコＢＲＬ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）（メリーランド州、ロック
ビル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ））から購入した。ＥＨＳから得られたラミニン１／
ニドゲン複合体は、Ｊ．エンゲル（Ｊ．Ｅｎｇｅｌ）博士（スイス、バセル大学
（Ｕｎｉｖ．ｏｆＢａｓｅｌ））から親切にも供与された。ヒトの線維肉腫
ＨＴ−１０８０（ＣＣＬ−１２１）細胞は、アメリカン・タイプ・ティシュー・コ
レクション（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＴｉｓｓｕｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏ
ｎ）（バージニア州、マナサス（Ｍａｎａｓｓａｓ））からのものであった。Ｉ
ＭＭＯＲＴＯＭＯＵＳＥ（商標）脳キャピラリー内皮（ＩＢＥ，Ｋａｎｄａｅ
ｔａｌ．，１９９９，Ｅｘｐ．ＣｅｌｌＲｅｓ．２４８（１），２０３−１
３）及びウシの副腎微小血管（ＢＣＥ，Ｆｏｌｋｍａｎｅｔａｌ．，１９７
９）の細胞は、Ｌ．クレーソン−ウエルシュ（Ｌ．Ｃｌａｅｓｓｏｎ−Ｗｅｌｓ
ｈ）博士（ウプサラ大学、医学生化学及び微生物学）及びＫ．オラウソン（Ｋ．
Ｏｌａｕｓｓｏｎ）博士（ウプサラ大学、医学細胞生物学）から親切にも供与さ
れた。インテグリンα３（Ｄｅｌｗｅｌｅｔａｌ．，１９９４，Ｍｏｌ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｅｌｌ５（２）、２０３−１５）、α６（Ｄｅｌｗｅｌｅｔａ
ｌ．，１９９３，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８（３４）、２５８６５−７５
）、またはα６とα４の両方（Ｎｉｅｓｓｅｎｅｔａｌ．，１９９４，Ｅｘ
ｐ．ＣｅｌｌＲｅｓ．２１１（２），３６０−７Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌ
ｌ）を発現するために形質移入された３つのヒト赤白血病Ｋ５６２細胞系統は、
Ａ．ソネンベルグ（Ａ．Ｓｏｎｎｅｎｂｅｒｇ）博士（ネーデルランド・キャン
サー・インスティテュート（ＮｅｔｈｅｒｌａｎｄｓＣａｎｃｅｒＩｎｓｔ
ｉｔｕｔｅ）、オランダ、アムステルダム）により供与された。

【０１００】組換え型ラミニン８の製造及び精製組換え型ラミニン８（「ｒ−ラミニン８」）は、加湿された５％ＣＯ_２大気中
で、３７℃にて、ＤＭＥ／ピルビン酸／１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）中で培養
されたヒトの胚性腎細胞（ＨＥＫ−２９３、ＡＴＣＣＣＲＬ−１５７３）中に
生成された。野生型細胞は、上述したように（Ｙｕｒｃｈｅｎｃｏｅｔａｌ
．）ラミニンβ１発現作成物と共に安定して形質移入され、５００μｇ／ｍｌの
Ｇ４１８を用いて選択された。その他すべての細胞培養物及びクローンの増殖は
、関連する選択抗生物質の継続的な存在下で行なわれた。高度に発現しているク
ローンは、次いで、標準のリン酸カルシウム形質移入法を用いてＨＬ４ＦＬＡＧ
−Ｆｕｌｌ作成物と共に形質移入され、３００μｇ／ｍｌのゼオシンを用いて安
定したコロニーが選択された。クローンは、クローニング・リングを用いて単離
され、増殖され、抗ラミニンα４ＡｂＳ８を用いた培養液のウエスタンブロット
法によりラミニンα４の分泌のために分析された。最も高度な発現をもつクロー
ンが、ＨＧＩ作成物と共に形質移入され、安定したクローンが１００μｇ／ｍｌ
のハイグロマイシンを用いて選択された。これらのクローンは、次いで、ラミニ
ンγ１に対するｍＡｂを用いたウエスタンブロッティング法を経てスクリーンさ
れ、最も高度な分泌を示すクローンがさらに増殖された。

【０１０１】ｒ−ラミニン８の生成のため、細胞は４日間まで培養液で成長され、その後、
培養液が収集され、細胞片を除去するために遠心分離される。収集の後、Ｔｒｉ
ｓ−Ｃｌ、ｐＨ７．５が５０ｍＭに加えられ、ＥＤＴＡが１０ｍＭの濃度に加え
られた。直ちに用いられない場合、培養液は−７０℃で貯蔵される。血清を含ま
ない培養液へのたんぱく質の生成のため、集密的な培養物がＰＢＳで２回洗浄さ
れ、培養液はピルビン酸、インシュリン−トランスフェリン−セレンサプリメン
ト（シグマ）及び１μｇ／ｍｌアプロチニン（シグマ）で補われたＤＭＥに変更
された。

【０１０２】ｒ−ラミニン８は、抗ＦＬＡＧＭ２マトリックス（シグマ）を用いて親和力
を使って精製された。使用に先だって、マトリックスは、０．１Ｍのグリシン（
ｐＨ３．５）及びＴＢＳ（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５／１５０ｍ
ＭＮａＣｌ）で製造業社の説明書に従って洗浄された。Ｂｒｉｊ−２０（フル
カ（Ｆｌｕｋａ），ウィスコンシン州、ミルウォーキー）が培養液に０．０５％
（ｖ／ｖ）の最終濃度まで加えられ、培養液はバッチモードにてマトリックス（
２５μｌマトリックス／ｍｌ）と共に一晩、４℃で、攪拌しながらインキュベ
ートされた。マトリックスは、培養液を焼結カラム中に通過させることによって
収集され、カラム内で最初にＴＢＳ／１ｍＭＥＤＴＡで、次いでＰＢＳ／１ｍ
ＭＥＤＴＡで広範に洗浄された。結合されたｒ−ラミニン８は、室温にてＰＢ
Ｓ／１ｍＭＥＤＴＡ内に１００μｇ／ｍｌＦＬＡＧペプチド（シグマ）と共
に競合的に溶出された。次いで、マトリックスは製造業社に推薦されるように再
生された。溶出液は２０ｍＭＮａＰＯ_４／１ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）で
１：１に希釈され、ＵＮＯ−Ｑイオン交換カラム（バイオ−ラッド（Ｂｉｏ−Ｒ
ａｄ），カリフォルニア州、ヘラクレス）内に注入された。この塩濃度にてＦＬ
ＡＧペプチドは通り抜けるが、ｒ−ラミニン８は結合される。カラムは次いで２
０ｍＭリン酸塩／１ｍＭＥＤＴＡで洗浄され、ｒ−ラミニン８は２０ｍＭＮ
ａＰＯ_４／１．５ＭＮａＣｌ／１ｍＭＥＤＴＡと共に溶出された。溶出液は
２０ｍＭＮａＰＯ_４（ｐＨ７．５）／１ｍＭＥＤＴＡで、１：１０で１５０
ｍＭの最終塩濃度まで希釈され、１００ｋＤのカットオフ限外濾過（Ｇｅｌｍａ
ｎ；ミシガン州、アナーバー）を用いてほぼ０．５ｍｇ／ｍｌまで濃縮された。

【０１０３】ｒ−ラミニン８の特徴づけ細胞培養液で分泌され精製された後のｒ−ラミニン８は、還元性の及び非還元
性の条件下で直線状の５％または６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び３〜１２％の勾配Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥを用いて特徴づけられた。たんぱく質は、銀染色を用いて可視化
されるか、半乾燥ブロッティングシステム（バイオ−ラッド）を用いてＰＶＤＦ
膜にブロットされる。免疫検出には、ルネサンスＥＣＬシステム（デュポン，マ
サチューセッツ州、ワルサム（Ｗａｌｔｈａｍ））が上述したＡｂと関連して用
いられた。たんぱく質の定量化は、２８０ｎｍで吸光度を測定して、またはブラ
ッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）法（バイオ−ラッドたんぱく質アッセイキッ
ト）を用いて行なわれた。

【０１０４】ロータリーシャドーイング電子顕微鏡写真（ＥＭ）が上述のように行なわれた
。（Ｙｕｒｃｈｅｎｃｏ及びＣｈｅｎ，１９９３）ロータリーシャドーイングの
ために精製するとき、マトリックスは０．１５ＭＮＨ_４ＨＣＯ_３−アセテート
緩衝液（ｐＨ７．４）と平衡化し、ｒ−ラミニン８は次いでＦＬＡＧ−ペプチ
ドと共に同じ緩衝液内に溶出される。

【０１０５】接着アッセイ及び細胞培養接着アッセイのため、フラット−ボトム９６ウェルプレート（Ｍａｘｉ−Ｓｏ
ｒｐ，Ｎｕｎｃ；ニューヨーク州、ロチェスター）は、ＰＢＳ内に希釈されたた
んぱく質で４℃にて一晩インキュベートすることによりコートされる（５０μｌ
／ウェル）。残存するプロテイン結合能力は、ＰＢＳ内に２％の熱不活化された
ＢＳＡ（５０μｌ／ウェル）を加え、さらに少なくとも４時間インキュベートす
ることによって飽和される。アッセイする前に、コーティング／ブロッキング溶
液は吸引され、ウェルは結合培養液（１００μｌ／ウェル）で洗浄された。コー
トされたたんぱく質の乾燥は、これが接着に有害である場合があることが認めら
れているため、避けられた。

【０１０６】全ての細胞は加湿された５％ＣＯ_２大気中で培養された。ＨＴ−１０８０及び
ＢＣＥ細胞は、ＤＭＥ／１０％ＦＣＳ／ピルビン酸中で、３７℃にて培養され、
ＢＣＥはゼラチンでコートされたプラスチック上で培養された。ＩＢＥ細胞は、
Ｆ１２／１０％ＦＣＳ／２Ｕ／ｍｌ γ−インターフェロン中で、３３℃にて
、ゼラチンでコートされたプラスチック上で培養された。形質移入されたＫ５６
２細胞は、１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８で補われたＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳ中で３７
℃にて懸濁して成長された。α４及びβ４インテグリンの両方と共に形質移入さ
れたＫ５６２細胞には、０．７ｍｇ／ｍｌハイグロマイシンが培養液に含まれて
いる。解離に先だって、細胞はＰＢＳで２回洗浄される。ＨＴ−１０８０細胞は
、５ｍＭのＥＤＴＡを用いてＰＢＳ中で解離され、一方、その他のものはトリプ
シン−ＥＤＴＡ（ギブコ−ＢＲＬ）を用いて解離された。トリプシンを除去する
ため、細胞はペレット状にされ、血清を含まない培養液で２度再懸濁された。細
胞は数えられ、２〜３×１０^５細胞／ｍｌにて血清を含まない緩衝培養液中で懸
濁された。Ｋ５６２細胞は、血清を含まない培養液で２度洗浄され、１０^６細胞
／ｍｌにて再懸濁された。ＤＭＥ／２５ｍＭのＨＥＰＥＳ／ピルビン酸がＨＴ−
１０８０細胞に用いられ、Ｆ１２／２５ｍＭのＨＥＰＥＳ／０．２５％ＢＳＡが
その他の細胞タイプに用いられた。

【０１０７】Ｋ５６２細胞刺激は、５ｎｇ／ｍｌのＰＭＡ（シグマ）を用いて行なわれた。
抗体またはその他の試験化合物が細胞懸濁に加えられ、細胞は３７℃で３０分間
で回復することを許された。細胞は、次いでたんぱく質がコートされた９６ウェ
ルプレート（１００μｌ／ウェル）に加えられ、３７℃にて３０分間（Ｋ５６２
）または６０分間（その他の細胞）で接着することを許された。結合しなかった
細胞を除去するため、ウェルは、慎重に１００μｌの結合培養液を加えた後、吸
引するサイクルを２または３回繰り返すことによって洗浄された。残存する細胞
は、室温にて１０分間、ＰＢＳ中で１％グルタルアルデヒドと共に固定された。
細胞は０．１％クリスタルバイオレット（シグマ）で３０分間染色され、結合さ
れなかった染色物は水による４回の洗浄で除去された。結合された染色物は、２
％ＳＤＳ（１００μｌ／ウェル）中で可溶化され、マイクロプレートリーダーを
用いて５９５ｎｍにて吸光度を計測することにより定量化される。

【０１０８】細胞系統のいずれも、目に見えるほどにＢＳＡには結合しない。定量的結果が
計算されたとき、ＢＳＡへの結合にはゼロの値が得られ、一方、関連する対照に
は１００の値が得られた。平均値とＳＥＭはパラレルなウェルから得られた結果
から計算された。

【０１０９】結果ｒ−ラミニン８の生成と特徴づけ野生型ＨＥＫ−２９３細胞からの濃縮されない培養液は、ウエスタンブロット
法にて、抗ラミニンα４、抗ラミニンγ１、抗ＥＨＳラミニン、または抗ＦＬＡ
Ｇ抗体に反応せず、これは、これらの細胞が内在性のラミニンを、あるとすれば
非常に少量だけ発現することを示している。形質移入されたα４鎖は、単独で発
現されたときにでもある程度分泌され得るが、他の鎖の分泌は３つの鎖全ての同
時の発現を必要とする。ラミニンα４、β１、及びγ１鎖発現生成物と共に形質
移入された細胞は、大量の３つの鎖全てを培養液に分泌した。最良の細胞クロー
ン（「Ｇ１−２」及び「Ｇ１−３」）は、培養液１リットルに対して３〜５ミリ
グラムのｒ−ラミニン８を生成することが見込まれた。

【０１１０】ｒ−ラミニン８は、抗ＦＬＡＧＭ２培養液に高い特殊性をもって結合した。
ＦＬＡＧペプチドと競合的に溶出されたとき、ラミニンα４、β１、及びγ１バ
ンドだけが銀染色された３〜１２％勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル中に見られた。（
図１）非還元性の条件下では、精製されたたんぱく質はほとんどゲルに入らず、
これは成熟した三量体の予測される分子量が少なくとも５７０ｋＤであることが
予想された。精製された三量体の微量のフラクションが非共有結合的に結合され
ているように見られた（検討を参照）。このフラクションにおいて、β１及びγ
１鎖は共有結合的に結合された二量体であり、一方α４鎖は非共有結合的に結合
されているように見られた。還元性の条件下で、たんぱく質は２００ｋＤ付近で
幅の広いバンドとして見られ、これはウエスタンブロット法にてα４、ＥＨＳ、
γ１、及び抗ＦＬＡＧ抗体と反応した。成熟したα４、β１、及びγ１ポリペプ
チドに対する予測される分子量は、それぞれ２００、１９５、及び１７４ｋＤで
ある。ラミニンは大量にグリコシル化され、これがＳＤＳ−ＰＡＧＥにて観察さ
れた分子量におけるわずかな食い違いの原因になっている可能性がある。ＥＨＳ
腫瘍から精製されたラミニン１のβ１及びγ１鎖は、ｒ−ラミニン８のものと類
似かそれよりわずかに遅い可動性を示した。

【０１１１】ロータリーシャドーイングＥＭは、予測された構造に従ってｒ−ラミニン８が
２本の短いアームと１本の長いアームをもつＹ形の分子であることを明らかにし
た。（図２）多くの場合、非常に短い（５〜１０ｎｍ）ロッド状のスタブがアー
ムの接合部にて見られた。Ｇドメインは、二つの部分から成っていることが時々
見られた。

【０１１２】 γ−ラミニン８への細胞結合およびレセプター認識我々は、アンチインテグリン抗体を相異する阻害状態として、人間の繊維状肉
腫（HT―1080）およびトランスフェクションしたＫ５６２細胞を分析試験し、γ
−ラミニン８に結合するアンチインテグリンレセプターを見分けた。また、イン
モートマウス脳毛細血管内皮細胞（ＩＢＥ）および牛科の副腎微小管内皮細胞（
ＢＣＥ）を使用し、内皮細胞がγ−ラミニン１８に接着する事項に関して研究し
た。ＢＣＥ細胞は、細胞膜貫通型接着分子であるインテグリンとして、α６β１
，α６β４，α１β１，α２β１，α３β１，α６β１，α５β１，αｖβ１，
αｖβ３およびα５β５を発現させており、(Kleinら1993,Mol.Biol.Cell 4(10)
973-82)、一方、ＩＢＥ細胞は、インテグリンとしてα３，α５，β１だけでな
く、インテグリンα１，α２，β６をも発現させていると報告されている（Kand
aら、1999）。

【０１１３】 γ−ラミニン８の接着性についてγ−ラミニン１と比較する場合に、洗浄後に
両基質に結合する細胞定着数とほぼ同数の定着数として、細胞系で試験すると、
γ−ラミニン８の接着性は、γ−ラミニン８の接着性と量的には同様でありか、
またはその接着性はわずかに弱かった（図３）。図示していないが、似たような
結果が、ＩＢＥ細胞およびＢＣＥ細胞においても得られた。さらに、細胞接着の
分析調査（図４〜図８）によると、細胞は、９６well platesの１０μｇ／ｍｌ
でコートされたγ−ラミニン８あるいはγ−ラミニン１へのいずれにも結合する
ことが許容された。分析調査に先立って、相異する成分を細胞培地に添加した。
数値は、制御抗体（マウスの抗体として正常マウスの抗体ＩｇＧ、ラットのモノ
クローナル抗体としてラットの抗体ＩｇＧ２Ｂ）の数値と相対的に表示したもの
であり、制御抗体の数値を１００として表示する。他の実施例として、同量の緩
衝剤を添加した。牛科の血清アルブミン（ＢＳＡ）の接着性はゼロと表示された
。培地での試験は、インテグリンのサブユニットが阻害が阻害されるか、あるい
は、加えられたサブスタンスを示している。誤差の線はＳＥＭを示している。イ
ンテグリンのモノクローナル抗体を10μg/ml、ヘパリンを２mg/ml、EDTAを５mM
使用した。

【０１１４】ＨＴ−１０８０細胞系のみにおいてインテグリンα１，α２に対するモノクロ
ーナル抗体を試験したが、その細胞系においては、細胞結合に全く効果がないか
あるいはわずかな効果があるにすぎず、これらのインテグリンはγ−ラミニン８
への接着に関して主に関与していなかった。（図４）タイプＩＶコラーゲンへの
接着は、アンチインテグリンα２ｍＡｂにより約５０％減少しており、図示しな
いが、このことは活性α２インテグリンの存在を実証している。図示しないが、
インテグリンα１ｍＡｂは、単独で使用されると、コラーゲンＩＶへの接着効果
がごく僅かであるが、活性α２インテグリンと組み合わせて使用すると、相乗効
果を発揮する。また、同様に図示しないが、インテグリンα３に対するＡｂは、
単独で使用されると、ＨＴ−１０８０への接着効果は低いが、α２ｍＡｂと組み
合わせて使用すると相乗効果を発揮する。α２インテグリンに対するモノクロー
ナル抗体について、ＨＴ−１０８０細胞が（図４）、フィブロネクティンまたは
ラミニンに接着する効果はごく僅かな効果であり、それは、たとえ、細胞がα３
α１を高いレベルで発現している場合であっても効果は僅かであった（Waynerら
、1993,J.Cell Biol.121(5)1141-52）。インテグリンα５を阻害すると、γ−ラ
ミニン１およびγ−ラミニン８の両者ともにＨＴ−１０８０に対して接着を僅か
に刺激する効果があり、これに対して、γ−ラミニン８についてのＢＣＥ細胞へ
の接着は僅かに減少した（図５）。図示しないが、ｍＡｂは、ほぼ完全にフィブ
ロネクティンへのＨＴ−１０８０細胞の接着を阻害しており、これらの細胞中に
活性α５インテグリンが存在することを示している。

【０１１５】インテグリンを含むα−６基質は、γ−ラミニン８への接着に主に関与してい
ることが認識されていた。インテグリンα６基質は、β１またはβ４のどちらか
と関わっていることが知られている。α６β１およびα６β４の結合関与を阻害
するｍＡｂ（ＧｏＨ３）を用いて、ＨＴ−１０８０細胞およびＣＥ細胞のγ−ラ
ミニン８への結合を完全に無くした。アンチβ１インテグリンｍＡｂ（ＡＩＩＢ
２）もまた、γ−ラミニン８へのＨＴ−１０８０細胞の結合を阻止しており、こ
れは、インテグリンα６β１が、γ−ラミニン８への接着に対して決定的である
ことを示している（図４）。これに対して、ＢＣＥ細胞の結合は、アンチβ１イ
ンテグリンｍＡｂによってかなり阻害され（約７０％）、これらの内皮細胞は、
γ−ラミニン８に接着するためにα６β１とα６β４との両方を使用することを
示している（図５）。他の内皮細胞系において、マウスＩＢＥ細胞であるアンチ
α６基質ｍＡｂは、γ−ラミニン８への結合をかなり阻止しており（約６０％）
、これは、インテグリンを含有するα６基質に加え、他のレセプターを加えると
細胞が消費することを示している（図６）。

【０１１６】興味深いことに、γ−ラミニン１およびラミニン８の接着を比較したときに、
アンチα６およびアンチα１インテグリンｍＡｂを阻害すると、接着にかなり異
なる影響を及ぼすことが観察された。ＨＴ−１０８０細胞は、α６β１だけでな
く、インテグリンを含む他のβ１基質によりγ−ラミニン１と相互に影響し合い
、その結果として、アンチα６により部分的に阻害されるだけでなく、アンチα
１により完全に阻害される（図４）。さらに、ＢＣＥ細胞がγ−ラミニン１に接
着するのは、α６β１よりもむしろβ1が関与しており（図６）、これは、接着
が、アンチβ１により完全に阻害されるが、アンチα６によりごく最小の影響を
受けたことによるものである（図５）。同様に、ＩＢＥ細胞では、アンチα６に
より影響を受けなかったため（図６）、γ−ラミニン１に対しての接着は、イン
テグリンα６よりもむしろレセプターが関与していた。

【０１１７】 γ−ラミニン８としてのα６β１およびα６β４のインテグリンの役目を実証
するために、トランスフェクションしたＫ５６２細胞を使用した。親Ｋ５６２細
胞は、内在的にインテグリンα５β1のみを発現しており、それは不活性な状態
にある。通常、細胞は懸濁液で成長するが、活性化したアンチβ１Ａｂによって
接着されるか、あるいは、ＰＭＡにより促進される場合もある。α6基質により
トランスフェクションしたＫ５６２細胞は、細胞の表面においてα６β１を発現
する（Delwel ら1993）。興味深いことに、これらの細胞は、ＰＭＡにより促進
された後にだけγ−ラミニン１を強固に結合するものであるが、このような促進
処理をしない場合にも、γ−ラミニン８を強固に結合する（図８）。この調査結
果は、γ−ラミニン８の接着特性がγ−ラミニン１２とは異なっていることを実
証している。両ラミニン異性体への細胞接着は、アンチインテグリンα６あるい
はβ１ mAbsのいずれかによって阻害されており、このことは他の細胞系にて得
られた結果とも一致している（図４、図５）。不活性α６β１のほかに、α６お
よびβ１の基質によってトランスフェクションしたＫ５６２細胞は、活性α６β
４複合体を発現し、促進処理しない場合でもラミニン１に結合し得る（Niessen
ら1994）。ＰＭＡとともにβ１インテグリンを活性化すると接着が増加するが、
これらの細胞は促進処理しない場合であってもγ−ラミニン１およびγ−ラミニ
ン８の両方に結合することが判明した。促進処理しない細胞の接着は、アンチイ
ンテグリンβ１によって部分的に阻害されるだけであるが、アンチインテグリン
α６により完全に阻害され、逆に、α６β４は、γ−ラミニン８への接着に関与
する可能性を有することを示している（図７）。反対に、図示しないが、α３β
１を発現しているＫ５６２細胞は、両方のラニミン異性体にわずかに接着した。
このことは、α３トランスフェクションＫ５６２細胞では、γ−ラミニン８には
効果的に結合し、γ−ラミニン８にはわずかに結合するにすぎないという傾向が
あるという初期段階の研究と合致するものである（Delwel ら1994）。

【０１１８】図４から図８までに示すように、全細胞系での試験により、５ｍＭＥＤＴＡに
よりγ−ラミニン１およびγ−ラミニン８の両方の細胞接着が壊滅するため、γ
−ラミニン１およびγ−ラミニン８の両方への細胞接着は、２価の陽イオンによ
るものであることが判明した。また、図４から図６までに示すように、ヘパリン
を２ｍｇ／ｍｌ使用すると、ヘパリンは、ＨＴ−１０８０細胞，ＢＣＥ細胞，Ｉ
ＢＥ細胞がγ−ラミニン８に対して接着する効果が無くなった。しかし、ラミニ
ン１では、ＢＣＥに対しての接着性が減少したが（図５）、他の細胞系には影響
が無かった（図４，図６）、ＲＧＤＳペプチドは、各種のインテグリン（Piersc
hbacher,Ruoslahti,1984,Nature 309(5963),30-3）の機能を阻害すると報告され
ているが、このＲＧＤＳペプチドは、図示しないが、１ｍＭの濃度では、ＨＴ−
１０８０細胞，ＢＣＥ細胞，ＩＢＥ細胞に対する接着性に全く影響を与えなかっ
た。

【０１１９】さらに、γ−ラミニン８の細胞結合活性は、大気中下における乾燥に非常に感
度が高いことが観測された。細胞に添加する前に、コーティングされた蛋白質を
、室温下、１５分間大気中に晒すと、γ−ラミニン８の細胞結合の活性は、完全
に失われた（図４）。図示しないが、１５分よりも短い時間、大気中に晒した場
合であっても細胞結合の活性が失われた。プラスチック上に緩衝剤を滴下するこ
とが許容されるが、wellの残りは、短時間で空気乾燥にさらされる。乾燥した環
境下では、ＢＣＥ細胞は、球状であり、細胞のうちのごく僅かは伸びた様子であ
った。湿気のある環境下では、ほぼ全ての細胞が十分に伸びており、表面にしっ
かりと付着していた。従って、洗浄すると、乾燥した環境下で存在する細胞は無
くなる。ラミニン１は、このような要因に対して敏感ではないが、乾燥すること
により、細胞結合の活性が半分程度減少する。（図４）議論本研究は、最新のラミニン８異性体およびそのα４鎖を記述しており、意義深
い進歩を与えている。多量のγ−ラミニン８は、培養した人間細胞では、天然３
量体たんぱく質として作り出され、そのγ−ラミニン８は、生物的に活性であり
、細胞接着特性を有することが示されている。さらに、γ−ラミニン８は、α６
インテグリンとの結合を優先的に選択することが示されている。

【０１２０】本研究において生産されたγ−ラミニン８は、２人の人間の（α４，γ１）一
匹のマウスの（β１）鎖とのハイブリット種であり、そのハイブリット種が、α
４鎖のＣ末端にＦＬＡＧ抗原決定基の断片を含んでいる。このような制限にもか
かわらず、回転シャドウＥＭを実証した場合に、天然のラミニンたんぱく質から
一定の方法を用いて予測した３量体の中にγ−ラミニン８が集まった。単層培養
によりＨＥＫ−２９３細胞から生産されたγ−ラミニン８の量は、たんぱく質の
大きさや複雑さを考慮すると、かなり多い量であった。培養培地の3−5mg/Lの量
は、例えば、バキュロウィルス昆虫細胞組織などの真核生物の組織でよく得られ
る量と近似している。

【０１２１】現在特徴づけられたラミニンと同様に、γ−ラミニン８の全鎖は、相互に関連
けされて二硫化されている。微量な留分だけが、二量体および架橋されていない
α４を含有した架橋されたα１／γ１により成っている。これらの鎖は３量体に
も関連しており、その理由は、アンチＦＬＡＧｍＡｂを使用する免疫沈降におい
て、２量体がＦＬＡＧ端のα４鎖を伴うからである。γ−ラミニン８の３量体に
α４が存在することは、また以下により実証されている。図示しないが、全ての
α４鎖は、α４鎖，β１鎖およびγ１鎖を認識するアンチラニミンIＡｂによる
数回にわたる免疫沈降を行った後、α４の全てが免疫沈降していた。

【０１２２】異なる大きさの２つの微量γ−ラミニン８がＥＨＳおよびγ１抗体と反応する
理由は明らかではない。大きい方は２量体のサイズと一致しているが、小さい方
は説明することができない。大きさの相異は、１００ｋＤ程度である。これらの
二量体および非共有結合の三量体は、過剰表現すると、完全ではなく、正確では
ない翻訳過程の前段階である可能性がある。

【０１２３】精製されたγ−ラミニン８は、生物的活性を有し、この研究で得られた全ての
場合において、ラミニン１と同様にγ−ラミニン８に付着し、等しく広がった。
この活性は、たんぱく質を乾燥させることにより失われるが、このことは天然の
たんぱく質の構造であると、細胞結合の活性が十分となることが重要であること
を示している。全例においてＥＤＴＡにより細胞結合が壊滅されており、このこ
とは、細胞接着が２価の陽イオンによるものであることを示している。

【０１２４】多くの種類のインテグリンは、異なるラミニン異性体に対する受容体として関
係している。この検討において、我々は、インテグリンα6β1とα6β4が、γ-
ラミニン8へ細胞が付着することの主要なメディエーターであることを証明した。
HT-1080とBCE細胞の付着は、両方の細胞系がβ1とανインテグリンの広いスペ
クトルを表し、それらの幾つかは他のラミニン異性体に結合するという事実にも
かかわらず、抗インテグリンα6 ｍAbによって完全に妨げられた(Confortiら,19
94,Cell Adhes. Commun. 1(4),279-93)。その付着は抗-α6 mAbによるだけでなく
、またβ1抗体によっても妨げることが可能であるので、γ-ラミニン8へのHT-10
80細胞の付着は、インテグリンα6β1によって単独で媒介される。対比して、β1
mAbはBCE細胞への付着を部分的に妨げる。α6β4はBCE細胞がγ-ラミニン8への
結合に寄与していることが示唆されている。γ-ラミニン8受容体としてのα6β4
の役割を、α6とα4移入化K562細胞の結合を分析することにより確認した。移入
化K562細胞は細胞表面にα6β1とα6β4の両方を発現するものである。実際に、
付着はα6 mAbと共に完全に妨げられ、β1 mAbと共に部分的にのみ完全に妨げら
れる。α6β4錯体は又、γ-ラミニン8へ結合することを示している。α6β1を発
現するK562細胞はγ-ラミニン8と結合し、α3β1発現細胞は結合しなかった。従
って、インテグリンα6β1がγ-ラミニン8に結合することを確認した。我々の結果
は、γ-ラミニン8への付着は抗-インテグリンα6 mAbによって激しく混乱される
ので、報告されているIBE細胞中のインテグリンα6サブユニットの欠如と多少矛
盾する(Kandaら,1999)。その結果は、γ-ラミニン8と結合するためにα6インテ
グリンの他に、これらの細胞は依然として他の受容体を使用することを示唆する
。しかしながら、ある場合、GoH3はα6β4錯体中のインテグリンα6を完全に妨
げることができない(Sonnenbergら,1993,j.Cell Sci.106(Pt 4),1083-102)。従
って、残存する付着はα6β4錯体を不完全に妨げた結果である。

【０１２５】興味深いことには、γ-ラミニン8へ試験された細胞系の付着は、ラミニン1へ
の細胞系の付着よりも、インテグリンα6により大きく依存していることが分か
った。γ-ラミニン8とラミニン1の異なる粘着特性の別の兆候は、α6β1-発現K56
2細胞が刺激なしでγ-ラミニン8に結合するが、先に報告されているように（Del
welら.,1993）、表面を覆われているラミニン1に十分に結合するためにはPMAに
よって刺激を受けることを必要としている。従って、γ-ラミニン8はラミニン1
よりも、α6β1に対してより強い結合性と親和性を有していることが明らかであ
る。α6β1インテグリンは、ラミニン1への結合を不可能にする立体配座において
でさえ、γ-ラミニン8を結合するであろう。また、細胞は、未知のメカニズムに
よってγ-ラミニン8の存在下に刺激を受け得るであろう。生物学的意味において
、結合性/親和性の違いは、多数のラミニンのイソ型の存在下に対する一つの理
由である。

【０１２６】インテグリンに追加して、いくつかの他の細胞表面のたんぱく質がラミニン受
容体として報告されている。収縮性の細胞骨格を細胞外マトリックスへ結合する
と考えられている骨格筋において、アルファ-ジストログリカンは、ジストロフ
ィン-ジストログリカン錯体の構成要素である。また、ジストログリカンはラミ
ニン2とジストロフィンを結合させ、その2つの間に連結を形成する（ErvastiとCa
mpbell,1993,J.Cell Biol.122(4),809-23）。間接的な証拠は、ラミニン8がα-ジ
ストログリカンと結合するであろうことを示唆する。へパリンによる抑制に対し
て感受性を示す方法において、通常の筋肉由来のラミニンと比較して、ラミニン
αｄ-欠陥ジスロトロフィン化筋肉由来のラミニンはジストログリカンと結合す
ることが知られている(McDearmonら,1998,J.Biol.Chem.273(37),24139-44)。ラミ
ニラン4の調整は、ラミニンα2欠陥筋肉ジストロフィーにおいて観察される(Pat
tonら,1997;Ringlemannら,1999)。ラミニンα4鎖は観察された相互作用に関係す
ることが推測され得る(Durbeejら,1998, J. Histochem. Cytochem. 46(4) ,449-
57)。最近、それは、ウシの大動脈の内皮細胞中において、ヘパリン、硫酸デキ
ストラン及びフコイダンに対して感受性を示す方法において結合して、ラミニン
1に対する受容体であることが示されている(Shimizuら, 1999, J. Biol. Chem.
274(17), 11995-2000)。ヘパリン感受性の相互作用は、この検討では見つけられ
なかったが、これは他の細胞型または生体内でのそのような相互作用の可能性を
排除するものではない。我々は、生理的塩類濃度においてγ-ラミニン8がヘパリ
ン-セファロースと結合するのを観察した。（データは示さず）。

【０１２７】この検討において、培養細胞中、インテグリンα6β1とα6β4とを、γ-ラミニ
ン8に対する受容体として確認した。従って、生体内において、これらのインテグ
リンは、ラミニン8が内皮細胞や筋肉細胞のような細胞へ結合するのを媒介する
と考えられる。内皮細胞は広い種類のインテグリンが発生段階、活性状態、ロケ
ーションに依存していることを表している。内皮の基底膜（BM）中の主たるラミ
ニンイソ型はラミニン8と10であるのに反して、少なくともインテグリンα2β1、
α5β1、α6β1、α6β4及びαγβ3は、生体内の内皮細胞において見つけられ
た(Sonnenberg 1990;Conforti 1992)。内皮細胞を除く他の細胞は内皮のBMにお
いてラミニン8と相互に作用すると考えられ、α6β1を用いて血小板を刺激し、付
着した時に、血小板はラミニン8を含み、分泌する。

【０１２８】又、ラミニン8と9は、発育中の筋肉、末梢神経系において見つけられ、インテグ
リンα6と共に発現することと重なっている。ラミニンα2-欠陥筋肉において、ラ
ミニンα4とインテグリンα6は両方とも調整される。(Vachonら,1997,J.Clin.Inv
est.100(7),1870-81)。興味深いことには、インテグリンα6とインテグリンβ4
はepidemolysis bullosaにおいてすばらしい成果であるが(Georges-Labouesseら
,1996,Nat.Genet.13(3),370-3;van der Neutら,1996,Nat.Genet.13(3)366-9)、
筋肉または血管表現型は報告されていなかった。

【０１２９】本発明は上記の特定の好ましい実施形態により制限されることはない。この分
野の通常の知識を有する者にとってこの発明の概念から外れることなく開示され
た好ましい実施形に種々の改変を行うことができよう。そのようなすべての改変
は本発明の範囲内にあるものと意図される。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの３−１２％勾配の写真である。ＬＮ−１は、
成分鎖の同一性が左に示されているラミニン１／ニドゲン（ｎｄｇ）複合体であ
る；ＬＮ−８は組換え体ラミニン８である。ｒ−ラミニン８蛋白質帯の同一性の
解釈は、ウエスタンブロット法データにより示される：α４＝抗ヒトラミニン
α４及び抗ＦＬＧＡ単クローン抗体（ｍＡｂ）との反応性；β１＝ポリクローン
の抗マウスのラミニンα１／β１／γ１との反応性；γ１＝抗ヒトラミニンγ１
ｍＡｂとの反応性；^＊＝抗ラミニン γ１ｍＡｂ及び抗マウスα１／β１／
γ１との反応性。両サンプルは同じゲル上で実験され、その後銀染色された。

【図２】図２はｒ−ラミニン８のロータリシャドウ電子顕微鏡写真である。上：幾つか
のｒ−ラミニン８分子を示す低拡大率の視野である。下：個々の分子。それぞれ
の分子は二つの短い腕と一つの長い腕を持つ。いくつかの分子では非常に短い（
５−１０ｎｍ）ロッド状の根が腕の分岐点で見られる。矢印：幾つかの分子で二
つの部分からなるＧ−ドメインが見られる。（線＝５０ｎｍ）

【図３】図３はｒ−ラミニン８またはラミニン１への細胞癒着の滴定を示すグラフであ
る。

【図４】図４は多様な機能遮断性インテグリン抗体及び他の化合物の存在下または非存
在下で、９６穴プレートに１０μｇ／ｍｌでコートしたｒ−ラミニン８またはラ
ミニン１へのＨＴ−１０８０細胞の癒着を示すグラフである。

【図５】図５は多様な機能遮断性インテグリン抗体及び他の化合物の存在下または非存
在下で、９６穴プレートに１０μｇ／ｍｌでコートしたｒ−ラミニン８またはラ
ミニン１へのウシの毛管内皮（ＢＣＥ）細胞の癒着を示すグラフである。

【図６】図６は多様な機能遮断性インテグリン抗体及び他の化合物の存在下または非存
在下で、９６穴プレートに１０μｇ／ｍｌでコートしたｒ−ラミニン８またはラ
ミニン１へのインモルトなマウスの脳の内皮（ＩＢＥ）細胞の癒着を示すグラフ
である。

【図７】図７は多様な機能遮断性インテグリン抗体及び他の化合物の存在下または非存
在下で、９６穴プレートに１０μｇ／ｍｌでコートしたｒ−ラミニン８またはラ
ミニン１へのインテグリンα６β４形質移入したＫ５６２細胞の癒着を示すグラ
フである。

【図８】図８は多様な機能遮断性インテグリン抗体及び他の化合物の存在下または非存
在下で、９６穴プレートに１０μｇ／ｍｌでコートしたｒ−ラミニン８またはラ
ミニン１へのインテグリンα６形質移入したＫ５６２細胞の癒着を示すグラフで
ある。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 19/04 Ａ６１Ｐ 25/00 ４Ｈ０４５ 19/08 Ｃ０７Ｋ 14/47 25/00 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ０７Ｋ 14/47 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:91 5/06 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 5/10 5/00 ＡＣ１２Ｐ 21/02 Ｅ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (31)優先権主張番号６０／１５５，９４５ (32)優先日平成11年９月24日(1999．9．24) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号６０／１８２，０１２ (32)優先日平成12年２月11日(2000．2．11) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷＦターム(参考） 4B024 AA01 BA21 BA80 CA04 DA02 EA04 GA11 HA01 HA12 HA15 4B064 AG01 AG02 AG31 CA10 CA19 CC24 CE12 DA01 4B065 AA93X AA93Y AB01 AC14 BA02 BB19 BC41 CA24 CA44 4C081 AB04 AB18 BA12 CE02 4C084 AA02 AA06 AA07 BA44 MA01 NA14 ZA012 ZA512 ZA942 ZA962 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 BA53 CA40 DA01 DA86 EA24 EA27 EA34 FA74 GA26

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】実質的に精製されたラミニン８。
【請求項２】組換えラミニン８からなる請求項１に記載の実質的に精製さ
れたラミニン８。
【請求項３】 α４ラミニン鎖とほぼ類似のポリペプチドからなる第１の鎖
と、 β１ラミニン鎖とほぼ類似のポリペプチドからなる第２の鎖と、 γ１ラミニン鎖とほぼ類似のポリペプチドからなる第３の鎖と、からなり、前記第１、第２及び第３の鎖は組換えヘテロトリメリック・ラミニン
８に組み立てられる請求項２に記載の実質的に精製された組換えラミニン８。
【請求項４】高い緊縮条件下で配列番号１，３，５，７，９またはそのフ
ラグメントの１つ以上のコード領域にハイブリッド形成するポリヌクレオチドに
よりコード化された第１の鎖と、高い緊縮条件下で配列番号１１，１３，１５，１７またはそのフラグメントの
１つ以上のコード領域にハイブリッド形成するポリヌクレオチドによりコード化
された第２の鎖と、高い緊縮条件下で配列番号１９，２１，２３，２５またはそのフラグメントの
１つ以上のコード領域にハイブリッド形成するポリヌクレオチドによりコード化
された第３の鎖と、からなり、前記第１、第２及び第３の鎖は組換えヘテロトリメリック・ラミニン
８に組み立てられる請求項２に記載の実質的に精製された組換えラミニン８。
【請求項５】配列番号２，４，６，８，１０またはそのフラグメントと少
なくとも７０％同等なポリペプチドからなる第１の鎖と、配列番号１２，１４，１６，１８またはそのフラグメントと少なくとも７０％
同等なポリペプチドからなる第２の鎖と、配列番号２０，２２，２４，２６またはそのフラグメントと少なくとも７０％
同等なポリペプチドからなる第３の鎖と、からなり、前記第１、第２及び第３の鎖は組換えヘテロトリメリック・ラミニン
８に組み立てられる請求項２に記載の実質的に精製された組換えラミニン８。
【請求項６】第１、第２及び第３のポリペプチド鎖からなり、前記第１、
第２及び第３のポリペプチド鎖はそれぞれ、（１）Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３，（２）Ｒ
１−Ｒ２−Ｒ３（ｅ），（３）Ｒ３，（４）Ｒ３（ｅ），（５）Ｒ１−Ｒ３，（
６）Ｒ１−Ｒ３（ｅ）、（７）Ｒ２−Ｒ３及び（８）Ｒ２−Ｒ３（ｅ）からなる
群から選択された一般構造を有し、ここで、Ｒ１はアミノ端末メチオニンであり、Ｒ２はポリペプチドの分泌に向
けることが可能な信号配列であり、ここで、上記信号配列はもう１つの分泌され
たタンパク質である、特定のラミニン鎖のための天然の信号配列であって良く、
または人工の配列であっても良く、Ｒ３は第１のポリペプチド鎖のための分泌さ
れたα４ラミニン鎖、第２のポリペプチド鎖のための分泌されたβ１ラミニン鎖
及び第３のポリペプチド鎖のための分泌されたγ１ラミニン鎖であり、Ｒ３（ｅ
）はＲ３と同じであるが、さらにエピトープ・タグを含む、請求項２に記載の実質的に精製された組換えラミニン８。
【請求項７】組換えラミニン８発現宿主細胞。
【請求項８】細胞は、 α４ラミニンポリペプチドとほぼ類似の組換えポリペプチドからなる第１の鎖
と、 β１ラミニンポリペプチド配列とほぼ類似の組換えポリペプチドからなる第２
の鎖と、 γ１ラミニンポリペプチド配列とほぼ類似の組換えポリペプチドからなる第３
の鎖と、からなる組換えラミニン８を発現し、細胞は前記第１、第２及び第３の鎖を発現
し、前記第１、第２及び第３の鎖は培養された細胞によってメディアに分泌され
た組換えラミニン８に組み立てられる請求項７に記載の組換えラミニン８発現宿
主細胞。
【請求項９】細胞は、高い緊縮条件下で配列番号１，３，５，７または９またはそのフラグメントの
１つ以上のコード領域にハイブリッド形成するポリペプチドによりコード化され
た第１の鎖と、高い緊縮条件下で配列番号１１，１３またはそのフラグメントの１つ以上のコ
ード領域にハイブリッド形成するポリペプチドによりコード化された第２の鎖と
、高い緊縮条件下で配列番号１５，１７またはそのフラグメントの１つ以上のコ
ード領域にハイブリッド形成するポリペプチドによりコード化された第３の鎖と
、からなる組換えラミニン８を発現し、細胞は前記第１、第２及び第３の鎖を発現
し、前記第１、第２及び第３の鎖は培養された細胞によってメディアに分泌され
た組換えラミニン８に組み立てられる請求項７に記載の組換えラミニン８発現宿
主細胞。
【請求項１０】配列番号２，４，６，８，１０またはそのフラグメントの
１つ以上と少なくとも７０％同等なポリペプチドからなる第１の鎖と、配列番号１２，１４，１６，１８またはそのフラグメントの１つ以上と少なく
とも７０％同等なポリペプチドからなる第２の鎖と、配列番号２０，２２，２４，２６またはそのフラグメントの１つ以上と少なく
とも７０％同等な組換えポリペプチドからなる第３の鎖と、からなる組換えラミニン８を発現し、細胞は前記第１、第２及び第３の鎖を発現
し、前記第１、第２及び第３の鎖は培養された細胞によってメディアに分泌され
た組換えラミニン８に組み立てられる請求項７に記載の組換えラミニン８発現宿
主細胞。
【請求項１１】細胞は第１、第２及び第３のポリペプチド鎖からなる組換
えラミニン８を発現し、前記第１、第２及び第３のポリペプチド鎖はそれぞれ、
（１）Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３，（２）Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３（ｅ），（３）Ｒ３，（４）
Ｒ３（ｅ），（５）Ｒ１−Ｒ３，（６）Ｒ１−Ｒ３（ｅ）、（７）Ｒ２−Ｒ３及
び（８）Ｒ２−Ｒ３（ｅ）からなる群から選択された一般構造を有し、ここで、Ｒ１はアミノ端末メチオニンであり、Ｒ２はポリペプチドの分泌に向
けることが可能な信号配列であり、ここで、上記信号配列はもう１つの分泌され
たタンパク質である、特定のラミニン鎖のための天然の信号配列であって良く、
または人工の配列であっても良く、Ｒ３は第１のポリペプチド鎖のための分泌さ
れたα４ラミニン鎖、第２のポリペプチド鎖のための分泌されたβ１ラミニン鎖
及び第３のポリペプチド鎖のための分泌されたγ１ラミニン鎖であり、Ｒ３（ｅ
）はＲ３と同じであるが、さらにエピトープ・タグを含む、請求項７に記載の実質的に精製された組換えラミニン８。
【請求項１２】前記宿主細胞が哺乳動物細胞である、請求項７−１１のい
ずれかの宿主細胞。
【請求項１３】前記第１、第２、第３の鎖の少なくとも１つがワクチンタ
グを有する融合タンパクとして発現される、請求項１２の宿主細胞。
【請求項１４】ａ．請求項１２の前記宿主細胞を供給し；ｂ．細胞培養培地にて前記再結合ラミニン８鎖の発生を刺激する条件下で前記
細胞を成長させ；ｃ．前記再結合ラミニン８に結合する化合物を含むカラムを用いた、アフィニ
ティークロマトグラフィーカラムに前記細胞培養培地を通過させ；ｄ．結合しなかった物質を取り除くために前記アフィニティーカラムを洗浄し
；かつｅ．前記カラムから結合した再結合ラミニン８を溶離する；ことを含む、再結合ラミニン８を精製する方法。
【請求項１５】請求項１４の方法により単離される実質的精製された再結
合ラミニン８。
【請求項１６】ａ．ラミニン８；およびｂ．医薬的に許容される担体、を含む医薬組成物。
【請求項１７】ラミニン８が再結合ラミニン８を含む、請求項１６の医薬
組成物。
【請求項１８】血管組織の損傷箇所の再内皮化を促進するためにラミニン
８の有効な量を前記血管組織の損傷箇所に接触させることを含む、血管組織の損
傷箇所の修復を加速するための方法。
【請求項１９】血管損傷が、血管形成再狭窄、血管の外科的処置、動脈瘤
、およびアテローム性動脈硬化症からなる群から選択される、請求項１８の方法
。
【請求項２０】骨または結合組織の損傷の修復を加速するためにラミニン
８の有効な量を前記骨または結合組織の損傷箇所に接触させることを含む、骨ま
たは結合組織の損傷箇所の修復を加速するための方法。
【請求項２１】修復が包帯、マトリックス、組織移植片への再結合ラミニ
ン８の混入によって達成される、請求項２０の方法。
【請求項２２】骨または結合組織の損傷が、破砕、引裂け、変形、または
骨、腱、軟骨および靭帯の欠陥からなる群から選択される、請求項２０の方法。
【請求項２３】医療機器または移植片の生物学的適合性を改良するために
ラミニン８の有効な量を前記医療機器または移植片に接触させることを含む、医
療機器または移植片の生物学的適合性を改良するための方法。
【請求項２４】改良された医療機器または移植片であって、医療機器また
は移植片の生物学的適合性を改良するためにラミニン８の有効な量を前記医療機
器または移植片に供給することからなる、改良された医療機器または移植片。
【請求項２５】血管形成を調整するためにラミニン８の有効な量を血管形
成を必要とする箇所に接触させることを含む、血管形成を調整するための方法。
【請求項２６】神経再生を促進するためにラミニン８の有効な量を神経再
生を必要とする箇所に接触させることを含む、神経再生を促進するための方法。
【請求項２７】表面への細胞付着を促進するためにラミニン８の有効な量
を細胞に接触させることを含む、表面への細胞付着を促進するための方法。
【請求項２８】改良された細胞成長基質であって、細胞成長基質への細胞
付着を促進するためにラミニン８の有効な量で覆われた前記細胞成長基質を提供
することからなる、改良された細胞成長基質。
【請求項２９】ラミニン８が再結合ラミニン８を含む、請求項１８−２８
のいずれかの方法。
【請求項３０】血管組織の損傷箇所の再内皮化を促進するために請求項１
６または１７の医薬組成物の有効な量を前記血管組織の損傷箇所に接触させるこ
とを含む、血管組織の損傷箇所の修復を加速するための方法。
【請求項３１】血管損傷が、血管形成再狭窄、血管の外科的処置、動脈瘤
、およびアテローム性動脈硬化症からなる群から選択される、請求項３０の方法
。
【請求項３２】骨または結合組織の損傷の修復を加速するために請求項１
６または１７の医薬組成物の有効な量を前記骨または結合組織の損傷箇所に接触
させることを含む、骨または結合組織の損傷箇所の修復を加速するための方法。
【請求項３３】修復が包帯、マトリックス、組織移植片への再結合ラミニ
ン８の混入によって達成される、請求項３２の方法。
【請求項３４】骨または結合組織の損傷が、破砕、引裂け、変形、または
骨、腱、軟骨および靭帯の欠陥からなる群から選択される、請求項３２の方法。
【請求項３５】医療機器または移植片の生物学的適合性を改良するために
請求項１６または１７の医薬組成物の有効な量を前記医療機器または移植片に接
触させることを含む、医療機器または移植片の生物学的適合性を改良するための
方法。
【請求項３６】改良された医療機器または移植片であって、医療機器また
は移植片の生物学的適合性を改良するために請求項１６または１７の医薬組成物
の有効な量を前記医療機器または移植片に供給することからなる、改良された医
療機器または移植片。
【請求項３７】血管形成を促進するために請求項１６または１７の医薬組
成物の有効な量を血管形成を必要とする箇所に接触させることを含む、血管形成
を促進するための方法。
【請求項３８】神経再生を促進するために請求項１６または１７の医薬組
成物の有効な量を神経再生を必要とする箇所に接触させることを含む、神経再生
を促進するための方法。
【請求項３９】表面への細胞付着を促進するために請求項１６または１７
の医薬組成物の有効な量を細胞に接触させることを含む、表面への細胞付着を促
進するための方法。
【請求項４０】改良された細胞成長基質であって、細胞成長基質への細胞
付着を促進するために請求項１６または１７の医薬組成物の有効な量で覆われた
前記細胞成長基質を提供することからなる、改良された細胞成長基質。
【請求項４１】（ａ）前記方法を行うためのラミニン８の有効な量；およ
び（ｂ）前記方法を行うためのラミニン８を使用するための指導書を含む、請求項１８−２８のいずれかの方法を行うためのキット。
【請求項４２】ラミニン８への細胞付着を阻害するためにインテグリンα
６β１およびα６β４の少なくとも１つのアンタゴニストの有効な量を細胞に接
触させることを含む、ラミニン８への細胞付着を阻害するための方法。