JP2003344415A - エンドトキシン濃度の測定装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 注射液、輸液、透析液などの医薬品と、その
中間製品、精製水などの検体液の貯蔵タンク又は供給ラ
インから、検体液の一部をパイプで取込みエンドトキシ
ンの濃度を連続的にモニターすることができ、かつエン
ドトキシン濃度が５０ＥＵ／Ｌ以下の低濃度液、特に１
０〜＜１ＥＵ／Ｌレベルの極低濃度液であってもモニタ
ーでき、しかもエンドトキシン濃度を短時間にモニター
できるエンドトキシン濃度の測定装置の提供。 【解決手段】 エンドトキシンを含む検体液を、測定回
路に順次自動的に取込む手段と、取込まれた検体液に発
色合成基質を含むリムルス試薬の所定量を注入して両液
を混合させる手段と、検体液中のエンドトキシン濃度を
算定する吸光度測定手段と、測定後に混合液を測定セル
又は測定セルを含む測定回路から排出する手段と、から
なることを特徴とするエンドトキシン濃度の測定装置に
て提供。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、エンドトキシン濃
度の測定装置に関し、更に詳しくは注射液、輸液、透析
液などの医薬品と、その中間製品、これらの原料の一部
となる精製水中に存在すると、多彩な生物活性を示し弊
害があるエンドトキシンの濃度を測定し、医療に使用
中、或いは医薬品として製造中、または貯蔵中の注射
液、輸液、透析液などの医薬品と、その中間製品、又は
これらの原料の一部となる精製水の品質管理等に役立て
るために使用するエンドトキシン濃度の測定装置に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】エンドトキシンは、グラム陰性細菌の外
膜に存在する耐熱性の毒素であり菌体内毒素と言われ、
本体はリポ多糖であるとされている。リポ多糖はリピド
Ａとよばれる脂質と糖鎖からなるが、エンドトキシンと
しての活性中心はリピドＡにあり、分離したリピドＡで
ほぼすべての活性が再現される。

【０００３】エンドトキシンは血液凝固線の反応促進、
血小板・白血球の減少、血圧の低下、ショックなど循環
系への影響、発熱、サイトカインの誘導、免疫系への影
響など多彩な生物活性を示す（竹沢真吾編、透析液エン
ドトキシンがよくわかる本、１５〜２４頁及び４５〜５
１頁（１９９５）、東京医学社）。エンドトキシンを一
構成成分としているグラム陰性細菌は、空気中、水中あ
るいは食品中に存在し、菌体が機械的損傷を受けたり、
死菌が溶解したりあるいは菌体の分裂に際してエンドト
キシンが溶液中に放出され、溶液中に存在することとな
る。

【０００４】したがって、エンドトキシンは、直接的ま
たは間接的に、注射液、輸液、透析液などの医薬品と、
その中間製品、これらの原料の一部となる精製水中に混
入したり、存在したりすると、上記した多彩な生物活性
を示す弊害があるので、エンドトキシンの濃度を測定す
ることは、医療に使用中、或いは医薬品として製造中ま
たは貯蔵中の注射液、輸液、透析液などの医薬品と、そ
の中間製品、又はこれらの原料の一部となる精製水の品
質管理に必要である。また、エンドトキシンの濃度をモ
ニターすることは、生菌の増殖を早期に検出する手段と
しても有効である。しかし、現状ではエンドトキシン濃
度をモニターする装置は存在せず、検体液を採取してオ
フラインでエンドトキシン濃度を測定して、これらの品
質管理に役立てている。

【０００５】エンドトキシンの濃度を定量測定する方法
としては、唯一リムルス試験（Ｌｉｍｕｌｕｓ ｔｅｓ
ｔ）がある。 この方法は、カブトガニ（Ｌｉｍｕｌｕ
ｓｐｏｌｙｐｈｅｍｕｓ）の血球中に存在する前凝固性
酵素（Ｐｒｏｃｌｏｔｔｉｎｇ Ｅｎｚｙｍｅ）をエン
ドトキシンが活性化し、凝固酵素（Ｃｌｏｔｔｉｎｇ
Ｅｎｚｙｍｅ）とする反応を利用したものであり、カブ
トガニ血球抽出成分（Ｌｉｍｕｌｕｓ ａｍｅｂｏｃｙ
ｔｅ ｌｙｓａｔｅ）を試薬として使用する方法であ
り、ゲル化法と、高感度測定法として比濁法と比色法と
の三つの方法がある。

【０００６】比色法は、発色合成基質法とも呼ばれ、エ
ンドトキシンとリムルス・アメボサイト・ライセート中
のＣ因子系反応によって最終的に活性化された凝固酵素
が、コアグロゲンをコアグリンに変換する際のコアグロ
ゲンの水解部位のアミノ酸配列と類似の配列をもつ合成
ペプチドに、発色基として例えばパラニトロアニリン
（ｐＮＡ）を結合させた発色合成基質（Ｂｏｃ−Ｌｅｕ
−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡなど）を用い、活性化された
凝固酵素のアミダーゼ活性によって遊離するパラニトロ
アニリン（ｐＮＡ）の吸光度を測定してエンドトキシン
量を定量する方法である。比色法には、一定時間内に遊
離するｐＮＡの量が検体液中のエンドトキシン濃度に比
例することに基づき、反応を所定時間で停止してｐＮＡ
の吸光度を測定するエンドポイント法と、吸光度の経時
変化率、又は、所定の吸光度に達する時間を測定するカ
イネティック法がある。カイネティック法の内、前者は
吸光度の経時変化率が検体液中のエンドトキシン濃度に
比例することに基づくもので比色反応速度法、後者は、
所定の吸光度に達する時間の対数が検体液中のエンドト
キシン濃度の対数に逆比例することに基づくもので比色
反応時間法と、それぞれ呼ばれている。カイネティック
法が感度、精度ともに高く、エンドトキシン濃度の低い
検体液に適した方法である。

【０００７】しかしながら、既存のエンドトキシン濃度
測定機器では、濃度１ＥＵ／Ｌまで検出するには９０〜
１５０分の反応時間が必要である（竹沢真吾、石崎允監
修、南東北水質検討会編集、透析液エンドトキシン実測
集、９３頁（１９９７）、（株）メディカ出版）。濃度
５０ＥＵ／Ｌ以下の低濃度液、特に１０〜＜１ＥＵ／Ｌ
レベルが要求されるＨＤＦ透析液のエンドトキシン濃度
のモニターとしては時間がかかりすぎ不充分であった。
また、測定検体量は、リムルス試薬量（０．１〜０．０
５ｍｌ）と等量が通常であり、この制約から測定セルな
どの容積が制限され、光路長を長く取ることも反応液を
循環することも困難であった。したがって、エンドトキ
シン濃度が低濃度の場合に測定が困難であり、また短時
間に測定することは困難であった。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記の従来
技術の問題点に鑑み、注射液、輸液、透析液などの医薬
品と、その中間製品、精製水などの検体液の貯蔵タンク
又は供給ラインから、検体液の一部をパイプで取込みエ
ンドトキシンの濃度を連続的にモニターすることがで
き、かつエンドトキシンの濃度が５０ＥＵ／Ｌ以下の低
濃度液、特に１０〜＜１ＥＵ／Ｌレベルの極低濃度液で
あってもモニターでき、しかもエンドトキシンの濃度を
短時間にモニターできるエンドトキシン濃度の測定装置
の提供を課題とする。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者等は、上記の課
題に鑑み、注射液、輸液、透析液などの医薬品、その中
間製品、精製水などの検体液の貯蔵タンク又は供給ライ
ンから、検体液の一部を取込み、エンドトキシンが低濃
度でも短時間に測定できる特定形状の測定セルを有する
吸光度測定手段を採用し、各手段を特定に結合すると、
良好な結果が得られることを見出し、本発明を完成させ
た。

【００１０】すなわち、本発明の第１の発明によれば、
エンドトキシンを含む検体液を、複数の測定セル又は測
定セルを含む測定回路に順次自動的に取込む手段と、取
込まれた検体液に発色合成基質を含むリムルス試薬の所
定量を注入して両液を混合させる手段と、該測定セルに
導入された混合液中に遊離する発色基に起因する吸光度
の変化量、又はその経時変化率、又は、所定の変化量に
到達する時間を測定し、検量線に基づいて検体液中のエ
ンドトキシン濃度を算定する吸光度測定手段と、測定後
に混合液を測定セル又は測定セルを含む測定回路から排
出する手段と、からなることを特徴とするエンドトキシ
ン濃度の測定装置が提供される。

【００１１】また、本発明の第２の発明によれば、第１
の発明において、測定セルの形状を、断面が光源からの
光束の断面に等しいか、それ以下の細長い筒形にする
か、又は、多角形の柱体として光束が測定セル内面を複
数回反射することにより、光路長を１ｃｍ以上としたこ
とを特徴とするエンドトキシン濃度の測定装置が提供さ
れる。

【００１２】また、本発明の第３の発明によれば、第１
〜２の発明において、複数の測定セルと、リムルス試薬
を注入する手段と、検体液を取込み注入する手段と、測
定セルに注入されたリムルス試薬と検体液を混合する手
段と、該測定セルに導入された混合液中に遊離する発色
基に起因する吸光度の変化量、又はその経時変化率、又
は、所定の変化量に到達する時間を測定し、検量線に基
づいて検体液中のエンドトキシン濃度を算定する吸光度
測定手段と、測定後に混合液を測定セルから排出して洗
浄する手段、に順次自動的に接続して、エンドトキシン
濃度の測定を連続して行い、更には、１検体に要する測
定時間よりも短い間隔で検体液のエンドトキシン濃度を
連続して測定することを特徴とするエンドトキシン濃度
の測定装置が提供される。

【００１３】さらに、本発明の第４の発明によれば、第
１〜２の発明において、複数の測定系を検体液の流路に
並列に切換え可能に結合して、順繰りに自動切換えて、
吸光度の測定と測定セルの洗浄を並行して行ない、或い
は１検体に要する測定時間よりも短い間隔で連続測定す
ることを特徴とするエンドトキシン濃度の測定装置が提
供される。

【００１４】さらに、本発明の第５の発明によれば、第
３〜４の発明において、複数の測定系は、単一の光源と
それに対応する光検出器を中心として相対的に回転する
複数の測定セルとからなることを特徴とするエンドトキ
シン濃度の測定装置が提供される。

【００１５】さらに、本発明の第６の発明によれば、第
３〜４の発明において、複数の測定系は、複数の測定セ
ルに対して相対的に併進往復する単一の光源とそれに対
応する光検出器とからなることを特徴とするエンドトキ
シン濃度の測定装置が提供される。

【００１６】さらに、本発明の第７の発明によれば、第
１〜６のいずれかの発明において、検体液中のエンドト
キシン濃度が低レベルの場合に、検体液量をリムルス試
薬量に対して２倍量〜２０倍量とした後、両液を混合し
て得られる混合液を測定することを特徴とするエンドト
キシンの濃度測定装置が提供される。

【００１７】さらに、本発明の第８の発明によれば、第
１〜７のいずれかの発明において、光源からの光束を、
直径０．４ｃｍ以下に細く絞って、測定セルに入射する
ことを特徴とするエンドトキシンの濃度測定装置が提供
される。

【００１８】

【発明の実施の形態】以下、本発明のエンドトキシンの
濃度測定装置について、各項目毎に詳細に説明する。

【００１９】１． エンドトキシンを含む検体液を測定
セル、又は測定回路内に取込む手段

【００２０】１．１ エンドトキシンを含む検体液 本発明においてエンドトキシンを含む検体液とは、注射
液、輸液、透析液などの医薬品と、その中間製品、又は
これらの原料の一部となる精製水などであり、検体液は
貯糟、タンク、ガラス瓶、プラスチック容器、プラスチ
ックバッグ等の貯蔵手段に貯蔵されており、或は連続的
に輸送されており、検体液を本来の目的で使用するとき
は、貯蔵手段又は輸送手段の一部を出発点とするパイ
プ、管、ホース等の輸送手段（１）で検体液が使用され
る使用場所や使用機器に送られる。上記貯留液の一部又
は輸送手段（１）中を流れる検体液の一部を、本発明の
エンドトキシンの濃度測定装置に導入しエンドトキシン
の濃度を測定するが、サンプリングするためには、上記
輸送手段（１）の一部に別のパイプ、管、ホース、検定
液の取込みポンプ（定量ポンプ）等の輸送手段（２）
（図２の７）を設け、支流として検体液の一部を本発明
のエンドトキシンの濃度測定装置の測定回路（図３
（Ａ）の１５）内に取込む。なお、検定液の取込みポン
プ（定量ポンプ）４を省略することもでき、その場合
は、減圧弁と定流量弁を設けることが好ましい。

【００２１】１．２ 測定セル 本発明において測定セル（図３（Ａ）の１６、図３
（Ｂ）の１６、図３（Ｃ）の１６、図４（Ａ）の１６、
図（Ｂ）の１６）とは、検体液中のエンドトキシンの濃
度を測定するセル（部屋）であり、本発明で使用する吸
光度測定手段の一部を構成し、ここにおいて混合液に光
源からの光束を照射しエンドトキシンと発色合成基質を
含むリムルス試薬が反応して遊離した発色基パラニトロ
アニリンによる吸光度を計測する。測定セルの素材とし
ては、光束を透過させる部分は透明性が要求されるの
で、高純度ガラス、石英ガラスなどが好ましい。測定セ
ルを、測定毎に更新するディスポーザブル部品とする場
合は、ポリメチルメタクリレート、ポリ４メチルペンテ
ン１、ポリエチレンテレフタレート等の透明なプラスチ
ックを使用することが好ましい。

【００２２】１．３ 測定回路 本発明において測定回路（図３（Ａ）の１５、図４
（Ｂ）の１５）とは、検体液とリムルス試薬を反応させ
る流路であり、検体液の取込み封鎖手段とリムルス試薬
注入手段に各々接続し、上記した測定セルを一部に含
み、測定後混合液を排出する手段に接続した構造であれ
ば如何なる構造であってもよいが、円形、楕円形、正方
形又は長方形のパイプ（管）で構成されていることが好
ましい。パイプ（管）の材質については、上記した測定
セル以外の部分では、特に限定されないが、弗素樹脂、
ポリ四弗化エチレン、ライニングした金属、ＳＵＳのよ
うな非ライニング金属、セラミックス等が挙げられ、非
汚染性、洗浄性等の観点からポリ四弗化エチレン、弗素
樹脂が特に好ましい。なお、本発明においては、測定回
路を循環できる構成にして、検体液とリムルス試薬をリ
サイクル（循環）させ、測定中も両者を均一に混合させ
反応させることもできる。

【００２３】１．４ 取込み手段 本発明において取込みとは、エンドトキシンを含む検体
液を測定セルに取込むことであり、その手段としては、
上記１．１にて説明したパイプ、管、ホース、検体液の
取込みポンプ（定量ポンプ）４等の輸送手段（２）（図
２の７）である。輸送手段（２）の構造は、検体液を輸
送できる構造であれば如何なる構造であってもよいが、
円形のパイプ（管）で構成されていることが好ましい。
パイプ（管）の材質については、特に限定されないが、
ガラス、弗素樹脂、ポリ四弗化エチレン、ライニングし
た金属、ＳＵＳのような非ライニング金属、セラミック
ス等が挙げられ、非汚染性、洗浄性等の観点から弗素樹
脂、特にポリ四弗化エチレンが好ましい。なお、検体液
の取込みポンプ４は、検体液が圧送されているラインか
ら取り込む場合は省略できる。

【００２４】１．５ 封鎖する手段 本発明において封鎖とは、エンドトキシンを含む検体液
を測定セルを含む測定回路内に封鎖することであり、測
定回路の入口と出口を封鎖し、測定回路を形成させ、必
要に応じてエンドトキシンを含む検体液を測定回路内で
循環できるようにするものであり、封鎖手段としては、
測定回路の入口と出口を封鎖できれば如何なる構造のも
のであってもよいが、仕切弁（ゲートバルブ）、球形弁
（グローブバルブ）、コック（プラグバルブ）、ボール
バルブ等が挙げられる。洗浄液を注入する弁９とリムル
ス試薬を注入する弁１２は、チェックバルブまたは注射
針などの細管による穿孔を、細管を抜去すれば自己閉鎖
する能力を持つ仕切りにすることができる。具体的に
は、図３において、Ｖ１、Ｖ３、Ｖ４等のバルブ、また
は、開閉可能な仕切りを閉じた状態にしておけばよい。

【００２５】２． 検体液に所定量のリムルス試薬を注
入して両液を混合させる手段 本発明において、検体液に所定量のリムルス試薬を注入
して両液を混合し混合液をつくる手段としては、マイク
ロポンプ、マイクロシリンジ、バイブレータや揺動器を
使用する。

【００２６】３． 吸光度測定手段 本発明において、吸光度測定手段とは、測定セルに導入
された混合液中に遊離する発色基パラニトロアニリン
（ｐＮＡ）によって混合液に起こる吸光度の経時的変
化、又はその経時変化率、又は所定時間に達する時間を
連続的に測定して、予め作成した検量線と比較してエン
ドトキシン濃度を算出して表示、記録、出力する手段で
あり、光源（図４の１３、図５の１３）と、光検出器
（図４の１４、図５の１４）と、電子回路（図示せず）
と、測定セルから構成される。

【００２７】かかる吸光度測定手段の一例としては、下
記の手段が挙げられる。すなわち、本発明にて用いる吸
光度測定手段は光源１３と、この光源からの光を光束と
する光学系と、この光学系からの光束が透過する混合液
を容れた測定セル１６と、測定セル１６からの透過光の
光路上に配置された光検出器１４と、この光検出器１４
からの電気信号から混合液中の遊離発色基パラニトロア
ニリン（ｐＮＡ）に起因する吸光度を連続的に計測し
て、その変化量、又はその経時変化率、又は所定変化量
に達する時間を算定し、予め作成した検量線と比較する
ことによってエンドトキシン濃度を算定する電気回路２
３とによって構成することができる。

【００２８】測定セルはガラス等任意の材料で作ること
ができるが、光束が通過する部分は透明でなければなら
ない。測定セルの形状としては、円筒状、又は多角柱体
が好ましく、光束が直進透過するタイプでは、内径が光
束の径に等しく、長さが１ｃｍ以上、好ましくは２ｃｍ
以上の円筒形が好ましく、光束が測定セル内で多重反射
するタイプでは高さが光束の径に等しいか、それ以下の
多角形柱体が好ましい。測定セルの内面は光が多重に反
射するように鏡面とすることが好ましい。光源として
は、ハロゲンランプを用いることができ、光検出器は、
高感度の光電子増倍菅（フォトマル）が好ましい。

【００２９】４． 排出する手段 本発明において排出とは、エンドトキシンを含む検体液
を測定セルを含む測定回路内に取込み、取込み封鎖され
た検体液に所定量のリムルス試薬を注入して両液を混合
させ、混合液の吸光度の経時変化を連続的に測定後に、
該混合液を測定回路内から排出することであり、その手
段としては、パイプ、管、ホース、検定液の取込みポン
プ（定量ポンプ）４等の輸送手段（図３の２０）であ
る。なお、排出パイプの開閉バルブは、測定時は閉じた
状態になっており、排出させる場合は、開いた状態にな
っている。

【００３０】輸送手段の構造は、検体液を輸送できる構
造であれば如何なる構造であってもよいが、円形のパイ
プ（管）で構成されていることが好ましい。パイプ
（管）の材質については、特に限定されない。軟質チュ
ーブ（シリコーンゴム、軟質ＰＶＣなど）の使用も可能
である。

【００３１】５． 複数測定系の自動切換え連続測定手
段 本発明において、複数測定系の自動切換え連続測定手段
とは、請求項３の「複数の測定セルと、リムルス試薬を
注入する手段、検体液を取込み注入する手段、測定セル
の混合液を混合する手段、吸光度測定手段に順次自動接
続して、エンドトキシン濃度を連続測定する手段」と、
請求項４の「複数の測定系を検体液の流路に並列に切換
え可能に結合して、順繰りに自動切換えて連続測定する
手段」であり、それぞれ２つのケースがあ。請求項５の
ケースは、下記の５．１に、請求項６のケースは、下記
の５．２に更に詳細に説明する。

【００３２】ここにおいて、複数の測定系とは、単数の
測定系が２つ以上並列に配置されたものを意味する。単
数の測定系とは、図１の（Ａ）に概念図を示すように、
検体液を取込み封鎖する手段１、検体液の測定手段２及
び検体液を排出し封鎖する手段３からなる１ユニットの
エンドトキシンの濃度測定装置における測定手段２であ
り、２つの測定系とは図１の（Ｂ）に示すように、１つ
（単数）の測定系が２系列あり、並列になっているもの
であり、これを更に具体的に構成したものとして、請求
項３に対応するものを図４（Ａ）に、請求項４に対応す
るものを図４（Ｂ）に示す。３つの測定系とは図１の
（Ｃ）に示すように、１つ（単数）の測定系が３系列あ
り、並列になっているものである。また、請求項３に対
応する複数の測定系を具体的に構成したものを図１０に
示す。

【００３３】なお、検体液を取込み封鎖する手段１と
は、上記した各手段の結合構造であり、図２（Ａ）に示
した結合構造であり、検体液取込みパイプ７と、検体液
の取込みポンプ（定量ポンプ）４、検体液開閉バルブ６
と、洗剤液注入パイプ８（オプション）と、洗剤液開閉
バルブ９（オプション）から構成される。検体液の測定
手段２とは、図３（Ａ）、図３（Ｂ）と、図３（Ｃ）に
示したに示した結合構造であり、測定回路１５と、測定
セル１６と、光源１３と、光検出器１４と、電子回路
（図示せず）と、リムルス試薬注入パイプ１１と、開閉
バルブ１２と、から構成される。検体液を排出し封鎖す
る手段３（オプション）とは、図３（Ａ）に示した、排
出パイプ２０と、排出パイプの開閉バルブ１９との結合
構造である。

【００３４】なお、複数の測定系の場合、検体液の取込
み手段の一部は兼用できるので、図２の（Ｂ）や（Ｃ）
のように、検体液開閉バルブより上流は、１つの検体液
の取込みパイプ７より構成され、これらより複数の測定
系の数が増すほど、図６に示すように複数のエンドトキ
シンの濃度測定時刻の間隔を短縮することが可能とな
り、連続的にエンドトキシンの濃度モニターが可能とな
る効果がある。

【００３５】５．１ 単一の光源とそれに対応する検出
器を中心として相対的に回転する関係の複数の測定セル 本発明においては、原則として１つの測定系（測定セ
ル）に対して、一組の光源と光検出器を用いるが、光源
と光検出器は高価格のものであるから、複数の測定系
（測定セル）の場合に各測定系（測定セル）に一組の光
源と検出器を付けるとコストアップとなるので、単一の
光源とそれに対応する光検出器を特定場所に固定し、そ
の同心円周上に等間隔に配置した複数の測定セルのどち
らかを回転・移動し単一の光源とそれに対応する光検出
器に順次取りつけ付け、測定セル内の発色基パラニトロ
アニリンの吸光度を測定してエンドトキシン濃度を算定
する。コストダウンと濃度測定装置の容積や重量を省
き、小型化し、省スペースと持ち運びを容易にし、メイ
ンテナンスの回数も減らせる効果がある。

【００３６】この項における手段の説明は、請求項５に
対応するものであり、図７（Ａ）と（Ｂ）に基づき更に
詳細に説明する。図７（Ａ）では、１つの測定系（測定
セル１６）に対して、一組の光源１３と光検出器１４を
用いており、このペァーを１３＋１４を長方形で囲んで
表現してある。図７（Ｂ）では、上段に回転移動可能な
４つの測定系（測定セル１６がと４個並べてあ
る。）が示してあり、中段に固定された一組の光源１３
と光検出器１４があり、１３＋１４を長方形で囲んで表
現してある。上段の左端にある一つの回転移動可能な測
定系（測定セル１６）が、移動し中段に固定された一
組の光源１３と光検出器１４に合体し、下段のの状態
になり、微粒子の数が測定される。次いで、上段の左か
ら２番目の一つの回転移動可能な測定系（測定セル１６
）が、移動し中段に固定された一組の光源１３と検出
器１４に合体し、下段のの状態になり、発色基パラニ
トロアニリンの吸光度が測定される。順次、及びの
発色基パラニトロアニリンの吸光度が測定される。

【００３７】５．２ 複数の測定セルに対して相対的に
併進往復する関係の単一の光源とそれに対応する検出器 本発明においては、原則として１つの測定系（測定セ
ル）に対して、一組の光源と光検出器を用いるが、光源
と光検出器は高価格のものであるから、複数の測定系
（測定セル）の場合に各測定系（測定セル）に一組の光
源と光検出器を付けるとコストアップとなるので、複数
の測定セルに対して併進往復する単一の光源とそれに対
応する光検出器を付け、コストダウンと濃度測定装置の
容積や重量を省き、小型化し、省スペースと持ち運びを
容易にし、メインテナンスの回数も減らせる効果があ
る。

【００３８】この項における手段の説明は、請求項６に
対応するものであり、図８（Ａ）と（Ｂ）に基づき更に
詳細に説明する。図８（Ａ）では、１つの測定系（測定
セル１６）に対して、一組の光源１３と光検出器１４を
用いており、このペァーを１３＋１４を長方形で囲んで
表現してある。図８（Ｂ）では、上段に移動可能な一組
の光源１３と光検出器１４が示してあり、１３＋１４を
長方形で囲んで表現してある。矢印で移動を示し、下段
にそれぞれ固定されている４個所の測定系（測定セル１
６がと４個並べてある。）に合体する。すなわ
ち、移動可能な一組の光源１３と光検出器１４のペァー
（１３＋１４）が、下段のの状態にある測定系（測定
セル１６）に合体し発色基パラニトロアニリンの吸光度
が測定される。次いで、移動可能な一組の光源１３と光
検出器１４のペァー（１３＋１４）が、下段のの状態
にある測定系（測定セル１６）に合体し発色基パラニト
ロアニリンの吸光度の経時変化率が測定される。さら
に、およびの状態にある測定系（測定セル１６）に
合体し発色基パラニトロアニリンの吸光度が測定され
る。

【００３９】６． エンドトキシンの濃度測定装置 本発明のエンドトキシンの濃度測定装置とは、上記した
各手段を有機的に結合した構造体である。上位概念的に
は、単数の測定系の場合、図１の（Ａ）に概念図を示す
ように、検体液を取込み封鎖する手段１、検体液の測定
手段２及び検体液を排出し封鎖する手段３（オプショ
ン）からなる１ユニットのエンドトキシンの濃度測定装
置である。２つの測定系の場合は、図１の（Ｂ）に示す
ように、１つ（単数）の測定系が２系列あり、並列にな
っている２ユニットのエンドトキシンの濃度測定装置で
ある。これを更に具体的に構成したものを図４に示す。
３つの測定系の場合は、図１の（Ｃ）に示すように、１
つ（単数）の測定系が３系列あり、並列になっている３
ユニットのエンドトキシンの濃度測定装置である。

【００４０】７． エンドトキシンの濃度測定方法 本発明において、本発明のエンドトキシンの濃度測定装
置を用いて、下記の方法でエンドトキシンの濃度を測定
する。まず、エンドトキシンを含む検体液（注射液、輸
液、透析液等の医薬品と、その中間製品、又はこれらの
原料の一部となる精製水など）が貯蔵されている貯糟、
タンク、ガラス瓶、プラスチック容器、プラスチックバ
ッグ等の貯蔵手段から、又は、これらが流れている供給
ラインからパイプなどの取込み手段により、検体液を測
定セル又は測定回路にポンプで輸送する。なお、流れて
いる供給ラインからの場合は、ポンプを省略できる。次
いで、測定セル又は測定回路内に検体液を入れたのち、
測定セル又は測定回路の入口と出口のバルブを閉じて測
定セル又は測定回路を封鎖する。

【００４１】次いで、リムルス試薬注入パイプのバルブ
又は仕切りを開き、測定セル又は測定回路内の検体液に
リムルス試薬を注入し、振動、又は揺動して、検体液と
リムルス試薬の混合液をつくり、遊離した発色基パラニ
トロアニリンの吸光度を吸光度測定手段の光源と光検出
器で測定する。なお、測定セル又は測定回路へのリムル
ス試薬の導入を検体液導入の前に行ってもよい。測定の
終了後、混合液を測定回路内から排出パイプのバルブを
開き、排出パイプから廃棄する。この場合、測定回路内
及び排出パイプ内を洗浄するために、洗浄液パイプのバ
ルブを開き、洗浄液を測定回路内に導入し、内部を洗浄
しながら、測定回路内の混合液を洗浄液と共に流出させ
廃棄してもよい。図４（Ａ）の装置では、測定セル、又
は測定回路をディスポーザブル部品にでき、混合液の排
出と測定セル又は測定回路の洗浄は不要である。

【００４２】８． 検体液中のエンドトキシン濃度が低
レベルの場合の測定方法 通常は、検体液量とリムルス試薬量は１：１の比率で両
液を混合して得られる混合液を用いてエンドトキシンの
濃度測定を行う。測定セルの光路長を１ｃｍ以上、好ま
しくは２ｃｍ以上にした場合、一過性の測定セルとして
は容量／光路長の比が最も小さい細管型よりも更に小さ
い本発明の多重反射型の特殊な形状の測定セルであって
も、断面積を０．１ｃｍ^２より小さくしなければ測定セ
ルの内容積が既存のエンドトキシン濃度測定装置で使用
する０．１ｍｌよりも大きくなるため、測定セルを満た
すには、混合液量を増量することが必要となる。しかし
ながら、リムルス試薬は高価なものであるから、検体量
の増量に合わせて増量することは経済的な負担が非常に
大きくなり、エンドトキシン濃度を連続的にモニターす
る場合に大きい障害となる。本発明の対象となる検体液
は、注射液、輸液、透析液などの医薬品と、その中間製
品、又はこれらの原料の一部となる精製水であって、エ
ンドトキシン濃度が低いため、通常の使用条件である検
体液と等量のリムルス試薬は、その大部分がエンドトキ
シンと未反応で残るであろうことに注目して、リムルス
試薬量に対して２倍量〜２０倍量の検体量を混合して
も、検体液中のエンドトキシンがリムルス試薬と反応す
る量は、等量混合の場合と殆ど変わらないであろうこと
に想到して本発明に至った。検体液量をリムルス試薬量
に対して２倍量〜２０倍量とした後、両液を混合して得
られる混合液を使用して遊離した発色基パラニトロアニ
リンを測定することによって、エンドトキシン濃度が低
い検体液のエンドトキシンの濃度を短時間で測定するこ
とが、始めて可能となった。この項における方法の説明
は、請求項７に対応するものである。

【００４３】９． 光源からの光束を細く集光して測定
セルに入射する測定方法 光路長を１ｃｍ以上、好ましくは２ｃｍ以上にすると、
測定セルの容積を発色合成基質を含む高感度のリムルス
試薬であるエンドスペシーを使用する通常の混合液の容
積である０．１ｍｌに収めるためには、本発明の、光路
長／容積の比が大きい効率的な測定セルであっても、光
束の直径を０．３５５ｃｍ以下、或は０．２５ｃｍ以下
に絞ることが必要になり（表１）、光検出器が受ける光
量を著しく減少させて感度低下と精度低下の原因とな
る。光検出器が受ける光量は、光束の面積と強度の積で
あることに着目すると、一つの方法として光源の出力を
高くすることが考えられるが、装置内の限られた空間で
発熱を伴なう光源の出力を高くすることは、装置内の温
度を高くするので好ましくない。そこで、他の方法とし
て光源は変えずにレンズで集光して測定セルに入射すれ
ば、光源の消費電力を増やすことなく、強度を光束径に
逆比例して高めることができることに想到した。レンズ
で集光した光束は並行光線ではなくなるが、測定セルの
内面を光線が反射するよう鏡面にしておくことによっ
て、入射した全光線が測定セルから入射した時と等しい
角度の広がりで出射される。光検出器を測定セルから離
れ過ぎない位置に設定することにより、測定セルから出
射される全光線を受取ることができる。従って、混合液
量を発色合成基質を含むリムルス試薬を使用する通常の
混合溶液から増量することなく、光束径が大きい場合と
同様に、高感度、高精度の測定を実施することができ
る。この項における方法の説明は、請求項８に対応する
ものである。

【００４４】１０． 並列の測定セルが３系列の場合の
自動切替えダイアグラム 図１（Ｃ）に示すように、測定セルが３系列の場合に
は、第１系列、第２系列、及び第３系列が一定の時間の
間隔をおいて、順次、遊離した発色基パラニトロアニリ
ンに起因する吸光度の測定を行い、次いで各系列の洗浄
液による洗浄を一定の時間の間隔をおいて、順次行う。
洗浄がおわれば、また順次遊離した発色基パラニトロア
ニリンに起因する吸光度の測定を行う。並列の測定セル
が３系列の場合の自動切替えダイアグラムを図９に示し
た。なお、本発明において、洗浄液は糖脂質と蛋白を溶
解するものであって、微量が残留した場合でも、検体
液、エンドトキシン、リムルス試薬などに悪影響を及ぼ
さず、エンドトキシンとリムルス試薬との反応を促進し
たり阻害しないものであれば、いかなるタイプのもので
あってもよく、塩酸水溶液や界面活性剤から選択するこ
とができる。

【００４５】１１． 特に好ましい実施の形態 現存するリムルス試薬の中で最も感度、精度ともに高い
ものの一つとして発色合成基質を持つエンドスぺシー
（生化学工業（株）製）があり、検体中のエンドトキシ
ンと反応して、一定時間内に合成基質から遊離する発色
基パラニトロアニリンの量がエンドトキシン濃度に比例
する（竹沢真吾編、透析液エンドトキシンがよくわかる
本、３８頁（１９９５）、東京医学社）ことから、反応
液の吸光度係数（遊離した発色基パラニトロアニリン濃
度に比例する）がエンドトキシン濃度に比例することに
なる。

【００４６】従って、光検出器が検出する吸光度（＝透
過光強度比の対数）が発色基パラニトロアニリンの濃度
に比例する吸光度係数μと光路長ｄの積（μｄ）に比例
することに着目して、光路長ｄを長くすることによって
低い濃度の吸光度係数μを測定できることに想到して、
その方法を鋭意研究した。測定する反応液の量が、試料
と試薬の量が夫々、０．０５ｍｌ、合計０．１ｍｌと少
量で光路長を単純に長くすることはできない。

【００４７】そこで測定セルの形状を円筒形にして、そ
の内径を光源からの光束の直径に等しいか、それよりも
細くすることによって容積を小さくして光路長を１ｃｍ
以上、好ましくは２ｃｍ以上にすることができ、測定感
度を高くすることで、測定可能なエンドトキシン濃度範
囲を低い方に拡張し、測定時間を短縮することができ
る。また、測定セルの断面を多面体にして、１辺から光
束を導入して、内面で複数回反射させた後同じまたは他
の１辺から導出することによって、等しい内容積の円筒
形測定セルよりも５０％以上光路長を長くすることがで
き、測定感度を高くすることで、測定可能なエンドトキ
シン濃度範囲を低い方に拡張し、測定時間を短縮するこ
とができることに想到して本発明の好ましい発明の実施
の形態に到った。

【００４８】

【発明の実施の形態】［実施態様１］測定セルとして、
内径０．５ｃｍ、長さ１ｃｍ、内容積０．２ｍｌの硬質
ガラス管を使用することで、０．２５ｍｌの反応液を光
路長１ｃｍで測定した。

【００４９】［実施態様２］図５及び図６は、複数回反
射により光路長を長くする多面体セル（吸光増幅セル）
の例である。多面体としては、図５に示すように、長方
形の短い方の一辺から２ヶの等しい直角二等辺三角形を
切り取ってできた５角形の柱体を選び、光束を該直角二
等辺三角形を切り取ってできた一辺（高さと長さを光束
径に等しいか、その１／２乗に等しい正方形にすること
が好ましい）に垂直に入射し、内面で複数回の反射を往
復させた後、もう一つの該直角二等辺三角形を切り取っ
てできた９０°の頂角を介して隣接するもう一つの、入
射面と対を成す一面から垂直に導出することによって、
光路長を１．５ｃｍ以上、好ましくは２ｃｍ以上にする
ことができる。

【００５０】図５に示す５角柱で、９０°の頂角を介し
て隣接する２面が辺長０．５ｃｍの正方形、他の３面の
辺長さが０．７１ｃｍ、内容積０．３１ｍｌの測定セル
で３回反射させて光路長を２．５ｃｍにすることができ
る。また、５角形の寸法はそのままで高さのみ０．３９
ｃｍにすると、内容積０．２５ｍｌで光路長を２．５ｃ
ｍにすることができる。この場合の光束が出入りする面
の面積は直径０．５ｃｍの円形の面積に等しい。光束の
断面を円形でなく、長方形にできるなら、光路長を等し
く維持して、容積を約２０％削減することができる。

【００５１】なお、多面体は図５に示したような５角柱
に限られるものではなく、面数の多い多面体でも複数回
の反射が可能であり、その例を図６に示す。円筒型セル
と多重反射型直方体の測定セルの光路長とその光束の直
径の関係を表１に示す。表１は、光束径を指定すると、
多重反射回数が増す程光路長が長くなるが、容積も増す
こと、また光路長を指定すると多重反射型の方が容積を
小さくできることを示している。

【００５２】

【表１】

【００５３】筒型セルと多角柱セルの比較を、光路長と
容積の比率で表２に示す。等しい光束径で比較すると、
多角柱セルの数値が大きく、多角柱セルの方が効率的で
あることが示されている。

【００５４】

【表２】

【００５５】複数の測定セルを、一定の間隔でエンドト
キシン濃度の測定装置に順次接続して検体液のエンドト
キシン濃度を自動的に連続測定する方式の基本的な例を
図４（Ａ）に示す。複数の測定セル（１６）を、移動手
段（図示せず）によって、所定の間隔で順次リムルス試
薬注入口（１２）に接続して所定量のリムルス試薬を注
入し、次いで検体液取込み口（６）に接続して所定量の
検体液を取込み、混合手段（図示せず）によってリムル
ス試薬と検体液を混合させた後、吸光度測定手段の吸光
度測定部（１３＋１４）に接続して吸光度の測定を断続
的に繰り返すことによって吸光度の経時変化の連続測定
を所定の測定時間実施する。所定の間隔（測定セルが送
られてくる間隔、例えば２０分）が所定の測定時間（例
えば３０分）よりも短い場合は、複数の測定セルが順次
交代して吸光度測定部（１３＋１４）に接続して交互に
断続的な測定を繰り返して、所定の測定時間経過した測
定セルから順に洗浄液供給口（９）と混合液排出口（１
９）に接続して、測定済みの混合液を洗浄液で押出して
測定セルを洗浄する。測定セルがディスポーザブルの場
合は、排出洗浄手段（９＋１９）に接続することなく、
装置から排出される。なお、検定液取込みバルブは、検
体液が滞留することないように、測定セルと接続すると
き以外は常時開いて検体液を流出させるよう制御する。
また、定量ポンプ４を停止させない場合は、Ｖ１２の直
前にバイパスライン（図示せず）を設けて、Ｖ１２が開
く時のみ同期して閉じるバルブ（図示せず）を設ける
か、または、設定圧以上で開放するリリーフ弁（図示せ
ず）を設けるかして検体液の流量と圧力の変動を防ぐよ
うに制御する。

【００５６】［実施態様３］複数の装置を測定対象液の
流路に並列に切換え可能に結合して、順繰りに自動切換
えて連続測定する方式の基本的な例として、２組の装置
（一組の光源と受光器を共用することは可能）を対象液
の流路に並列に切換え可能に結合して、順繰りに自動切
換えて連続測定する装置の例を図４（Ｂ）に示す。並列
の装置が３系列の場合の自動切換え操作ダイアグラムの
例を図９に示す。

【００５７】［実施態様４］光束径０．５ｃｍでは、光
路長を１ｃｍ以上にするには、表１で示すように、円筒
型セルで約０．２ｍｌの混合溶液が必要になり、光路長
を２ｃｍ以上にするためには、円筒型セルで約０．４ｍ
ｌ、３回反射型５角柱セルで約０．３ｍｌの混合溶液が
必要になる。また、光路長を１ｃｍ以上で、且つ、測定
セルの内容積をエンドスペシーの通常の混合液量である
０．１ｍｌに保つには、光束径を円筒型セルで０．３５
５ｃｍに、３回反射型５角柱セルで０．３４ｃｍ（但
し、光路長は１．７ｃｍ）に絞ることが必要になる。混
合液量を増やすことは、高価なリムルス試薬を標準的な
使用量の２〜４倍使用することで経済的な負担増が大き
く、実施上の障害になる。また、光束を細く絞ること
は、光検出器の出力信号増倍の負担を大きくするだけで
なく、精度も低下させるので好ましくない。

【００５８】本発明の対象となる検体液のエンドトキシ
ン濃度は低いので、通常の検体液量と等量混合したリム
ルス試薬の大部分は、エンドトキシンと反応しないで残
るであろうことに着目して、リムルス試薬量の２〜２０
倍量の検体液を混合しても、検体液中のエンドトキシン
がリムルス試薬と反応する量は、標準的な等量混合の場
合と殆ど変わらないであろうことに想到した。即ち、本
発明では、標準的な等量混合は０．２〜２ｍｌになり、
光束の直径を太く、測定光道長を著しく長くしても、測
定可能なエンドトキシン濃度を従来の一桁低い範囲まで
拡張することができ、測定時間も実濃度の一桁高い濃度
の検体液に相当する短時間に短縮することができる。

【００５９】

【実施例】以下に、実施例に基づいて本発明をより詳細
に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定さ
れるものではない。

【００６０】［実施例１］検体液取込みパイプ７、開閉
バルブ６、洗剤液注入パイプ８（図省略）、開閉バルブ
９（図省略）、定量ポンプ（図省略）、リムルス試薬注
入パイプ１１、開閉バルブ付リムルス試薬注入器２５、
測定回路１５、測定セル１６、測定セル輸送器２６、２
７、２８、２９、測定セル振動器３０、開閉バルブ１
９、排出パイプ２０、恒温槽２１（図省略）、及び移動
可能な光源１３と光検出器１４の結合体からなるエンド
トキシン濃度の自動連続測定装置を作成した。これを図
１０に示す。

【００６１】

【発明の効果】本発明の装置によれば、注射液、輸液、
透析液などの医薬品と、その中間製品、精製水などの検
体液の貯蔵タンク又は供給ラインから、検体液の一部を
パイプで取込みエンドトキシンの濃度を連続的にモニタ
ーすることができ、かつエンドトキシンの濃度が５０Ｅ
Ｕ／Ｌ以下の低濃度液、特に１０〜＜１ＥＵ／Ｌレベル
の極低濃度液であってもモニターでき、しかもエンドト
キシンの濃度を短時間にモニターできる効果がある。

【図面の簡単な説明】

【図１】装置の構成を示す概念図 図（Ａ）は検体液を取込み封鎖する手段と、検体液の測
定手段と、検体液を排出し封鎖する手段が１系列の場
合、図（Ｂ）は２系列の場合、図（Ｃ）は３系列の場
合。

【図２】検体液を取込み封鎖する手段の例。図（Ａ）は
混合液が測定回路を循環している場合であり、図（Ｂ）
は測定回路の上部の一部は測定セルとなっていることを
示す図。

【図３】検体液の測定手段。図（Ａ）は１系列の場合で
あり、図（Ｂ）は２系列の場合、図（Ｃ）は３系列の場
合。

【図４】複数の測定セル又は測定系を並列に設置して、
自動切換えて順繰りに連続測定する装置の例。図（Ａ）
は請求項３に、図（Ｂ）は請求項４に対応する図。

【図５】複数回反射により光路長を長くした５角柱セル
（吸光増幅セル）の形状を示す図。図（Ａ）は平面図、
図（Ｂ）は正面図。

【図６】複数回反射により光路長を長くした多面体セル
（吸光増幅セル）の例を示す図。

【図７】単一の光源とそれに対応する検出器を中心とし
て回転する複数の測定セルを示す図。

【図８】複数の測定セルに対して併進往復する単一の光
源とそれに対応する検出器を示す図。

【図９】並列の測定セルが２系列の場合の自動切替えダ
イアグラムを示す図。

【図１０】請求項３の実施態様の詳細な装置図。図
（Ａ）は平面図、図（Ｂ）は側面図。

【符号の説明】

１ 検体液を取込み封鎖する手段 ２ 検体液の測定手段 ３ 検体液を排出し封鎖する手段 ４ 検体液の取込みポンプ（定量ポンプ） ６ 検体液取込みパイプの開閉バルブ ７ 検体液取込みパイプ ８ 洗剤液注入パイプ ９ 洗剤液注入パイプの開閉バルブ １１ リムルス試薬注入パイプ １２ リムルス試薬注入パイプの開閉バルブ １３ 光源 １４ 検出器 １５ 測定回路 １６ 測定セル １７ 循環ポンプ １８ ミキサー １９ 排出パイプの開閉バルブ ２０ 排出パイプ ２１ 恒温槽 ２２ 光束 ２３ 電気回路（演算部） ２５ リムルス試薬注入口 ２６ 測定セル輸送器 ２７ 測定セル輸送器 ２８ 測定セル輸送器 ２９ 測定セル輸送器 ３０ 測定セル振動器 なお、図４において番号の上付きカンマは、異なる測定
系を表わす。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 原田 徳三 大阪府大阪市阿倍野区王子町３−13−２ (72)発明者 三浦 薫 千葉県浦安市当代島２−８−１−401 Ｆターム(参考） 2G045 CB18 DA80 FA11 FB01 GC10 JA07 2G054 AA10 AB03 CA21 CA30 EA04 FA06

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 エンドトキシンを含む検体液を、複数の
   測定セル又は測定セルを含む測定回路に順次自動的に取
   込む手段と、取込まれた検体液に発色合成基質を含むリ
   ムルス試薬の所定量を注入して両液を混合させる手段
   と、該測定セルに導入された混合液中に遊離する発色基
   に起因する吸光度の変化量、又はその経時変化率、又
   は、所定の変化量に到達する時間を測定し、検量線に基
   づいて検体液中のエンドトキシン濃度を算定する吸光度
   測定手段と、測定後に混合液を測定セル又は測定セルを
   含む測定回路から排出する手段と、からなることを特徴
   とするエンドトキシン濃度の測定装置。
2. 【請求項２】 測定セルの形状を、断面が光源からの光
   束の断面に等しいか、それ以下の細長い筒形にするか、
   又は、光束が測定セル内面を複数回反射する多角形の柱
   体にすることにより、光路長を１ｃｍ以上としたことを
   特徴とする請求項１に記載のエンドトキシン濃度の測定
   装置。
3. 【請求項３】 複数の測定セルと、リムルス試薬を注入
   する手段と、検体液を取込み注入する手段と、測定セル
   に注入されたリムルス試薬と検体液を混合する手段と、
   該測定セルに導入された混合液中に遊離する発色基に起
   因する吸光度の変化量、又はその経時変化率、又は、所
   定の変化量に到達する時間を測定し、検量線に基づいて
   検体液中のエンドトキシン濃度を算定する吸光度測定手
   段と、測定後に混合液を測定セルから排出して洗浄する
   手段、に順次自動的に接続して、エンドトキシン濃度の
   測定を連続して行い、更には、１検体に要する測定時間
   よりも短い間隔で検体液のエンドトキシン濃度を連続し
   て測定することを特徴とする請求項１〜２に記載のエン
   ドトキシン濃度の測定装置。
4. 【請求項４】 複数の測定系を検体液の流路に並列に切
   換え可能に結合して、順繰りに自動切換えて、吸光度の
   測定と測定セルの洗浄を並行して行ない、或いは１検体
   に要する測定時間よりも短い間隔で連続測定することを
   特徴とする請求項１〜２に記載のエンドトキシン濃度の
   測定装置。
5. 【請求項５】 複数の測定系は、単一の光源とそれに対
   応する光検出器を中心として相対的に回転する複数の測
   定セルとからなることを特徴とする請求項３〜４に記載
   のエンドトキシン濃度の測定装置。
6. 【請求項６】 複数の測定系は、複数の測定セルに対し
   て相対的に併進往復する単一の光源とそれに対応する光
   検出器とからなることを特徴とする請求項３〜４に記載
   のエンドトキシン濃度の測定装置。
7. 【請求項７】 検体液中のエンドトキシン濃度が低レベ
   ルの場合に、検体液量をリムルス試薬量に対して２倍量
   〜２０倍量とした後、両液を混合して得られる混合液を
   測定することを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記
   載のエンドトキシンの濃度測定装置。
8. 【請求項８】 光源からの光束を、直径０．４ｃｍ以下
   に細く絞って、測定セルに入射することを特徴とする請
   求項１〜７のいずれかに記載のエンドトキシンの濃度測
   定装置。