JP2003212895A - ３０ｓリボソームに結合した抗生物質の結晶構造およびその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 【解決手段】 本発明は、Thermus thermophilus 30Sサ
ブユニットより取得した30Sリボソームの高分解能Ｘ線
結晶構造を提供する。該構造は、正方晶系空間群P4₁2₁2
を有し、パロモマイシン、ストレプトマイシン、スペク
チノマイシン、テトラサイクリン、パクタマイシンおよ
びハイグロマイシンＢからなる群より選択される抗生物
質に結合している。該構造の有利な特徴は、約３Åの分
解能で回折する点である。本発明はまた、表１〜４のい
ずれかに示されている30Sリボソームの３次元原子座標
を有する30Sの結晶を提供する。30Sリボソームに対する
インヒビターの合理的な設計およびモデリングに該デー
タを利用することができる。このようなインヒビターは
抗生物質としての有用性を秘めている。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、原核生物の30Sリ
ボソームサブユニットの高分解能結晶構造の提供、およ
びこの構造の薬物探索への使用に関する。

【０００２】

【従来の技術】構造遺伝学への尽力およびコンピュータ
技術の進歩により利用可能になった大量の情報から、構
造に基づく薬物設計が医化学における有益な手段となっ
た。従来は、ハイスループット法と組み合わせたコンビ
ナトリアルケミストリーが、より一層の構造に基づく方
法から注意をそらしていた。大規模なタンパク質構造決
定は、タンパク質構造から着手してそれを用いて新規の
リガンドを同定および設計することにより、薬物探索過
程を逆転させつつある。構造に基づく方法、仮想的スク
リーニング、およびコンビナトリアルケミストリーの集
積が、将来のより効果的な薬物設計の基礎を提供し、薬
物設計サイクルの期間、および市場に出る薬物の単価を
顕著に低減するであろう。すでに、AIDS、関節炎、およ
び癌、ならびに高血圧の治療（例えば、カプトリル(cap
tril)）において顕著な進歩が達成されている。

【０００３】遺伝暗号の翻訳は２つのサブユニットから
なる大きな核タンパク質複合体であるリボソーム上で起
こる。細菌では、この２つのサブユニットは、30Sおよ
び50Sと記される。50Sサブユニットはペプチジルトラン
スフェラーゼ活性の触媒部位を含み、一方の30Sサブユ
ニットは、メッセンジャーRNAの解読に重要な役割を担
っている。タンパク質合成は、開始、伸長、および終結
の主な段階それぞれにおいて、数種の外因性GTP-加水分
解性タンパク質性因子を必要とする複雑な多段階プロセ
スである。ここ数十年にわたる研究にもかかわらず、こ
のプロセスの分子的な詳細はあまり解っておらず、翻訳
機構の解明は、現在、分子生物学の基本的な課題の一つ
である。最近の論文を集約したものにより、本技術分野
の解明の状況が概説されている[1]。

【０００４】Yonathおよびその共同研究者らが、この課
題に大きく貢献した。彼らは、ほぼ10年の研究の後、50
Sリボソームサブユニットという大きな構造が3Åより優
れた分解能の回折を有する結晶を形成することを示した
[2]。元来、これほど大きな非対称の１つの単位から、
位相情報が高分解能に至るまで得られることが明らかで
はなかったが、明るく、波長の調整可能なシンクロトロ
ン放射線源、大型で精密な位置検出器、結晶学のコンピ
ュータ解析の多大な進歩、および低温結晶解析の出現の
全てが、リボソームの構造研究をより容易にするのに役
立った。本発明者らの研究では、ランタニド系およびオ
スミウムのLIIIエッジからの異常な散乱を用いること
も、位相を得るのに重要な役割を演じた。

【０００５】Thermus thermophilus由来の30Sリボソー
ムサブユニット(本明細書中では以下30Sと称する)は、
最初、Trakhanovらにより、2-メチル-2,4-ペンタンジオ
ール(MPD)中で結晶化され[3]、その後すぐにYonathとそ
の共同研究者らにより、エチルブタノールおよびエタノ
ールの混合液中で結晶化された[4]。２つのグループが
続いて行った研究により、MPD結晶型は分解能が約9〜12
Åまでの回折を有することが示された[5,6]。これらの
結晶の回折限界は、ほぼ10年間で7Åより優れた分解能
には向上しなかったが[7,8]、最近になって、Yonathと
その共同研究者ら[7,8]、および本発明者ら[9]は、顕著
な回折の向上を示すMPD型の結晶を得た。しかし、本発
明者らの得た結晶は、Yonathのグループにより得られた
結晶[6]とは異なり、高分解能の回折を得るために、タ
ングステンのクラスター中への取り込み、または熱処理
を必要としない。

【０００６】本発明者らは以前、5.5Å分解能での30Sの
構造を記載した[9]。本発明者らは、当時構造が分かっ
ていた7つのタンパク質全てについて掲載でき、S20タン
パク質の構造が３つのヘリックスの束であることを推定
し、16Sの完全なドメインの折り畳み構造を精査して、3
0Sの解読部位を含む境界面上に長いRNAヘリックスを特
定することができた。S5およびS7タンパク質は、Yonath
とその共同研究者により得られた30Sの電子密度地図に
も掲載された。

【０００７】30Sリボソームサブユニットは、抗生物質
の重要な標的である。30Sの構造は原核生物間で広く保
存されており、広域抗生物質の可能性があるため、リボ
ソームは抗生物質の有用な標的となる。しかしながら、
現存する抗生物質に対する耐性は、現在、医学分野にお
ける重要な課題である。現在のところ、MRSA(メチシリ
ン耐性黄色ブドウ球菌)などの伝染が広範に拡大しつつ
ある強力な耐性菌の処置に利用できる新規な抗生物質は
非常に少ない。

【０００８】抗生物質とリボソームとの相互作用を分子
レベルで解明することは、２つの理由により重要であ
る。第1の理由は、抗生物質は、リボソーム機能の種々
の局面を妨害することにより作用することである。従っ
て、抗生物質とリボソームの相互作用を理解すること
は、翻訳に関与する機構を解明する助けとなるであろ
う。第2の理由は、抗生物質とリボソームとの相互作用
に関する詳細な知見は、抵抗性が増している細菌株に対
する新規薬物の開発に役立ちうることである。抗生物質
は数十年前に特性解析されたが、その作用機構の詳細な
知見には、一般に、抗生物質とリボソームとの複合体の
3次元構造が必要である。

【０００９】上述の低分解能(3Åより大きい分解能)の
結晶構造は、30Sの結晶構造の有用なモデリングにとっ
て十分に詳細な分解能を提供せず、従って、新規の治療
薬の開発に有効に利用可能な高分解能構造が必要とされ
ている。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、今回、
数種の抗生物質に結合した30Sの構造を３Åの分解能で
解明し、改良を行った。この構造は、16S RNAと20個の
結合タンパク質が整列した領域を全て含み、かつ、RNA
配列を99％以上、タンパク質配列を95％以上含んでお
り、喪失部分はRNA鎖またはポリペプチド鎖の末端に集
中している。

【００１１】本明細書に示す30Sのリファインされた原
子分解モデルは、30Sの機能に関する膨大な量の生化学
的データの詳細な構造的見地からの解釈を与える。該構
造は、電子顕微鏡またはX線結晶解析による種々の機能
状態の、より低い分解能のモデルの分子的見地からの解
釈の基礎としても役立つだろう。30Sの構造は、リボソ
ーム機能の種々の局面に対する試験可能なモデルの作製
に役立つだろう。

【００１２】第１の態様では、本発明は、抗生物質Ｚ
(Ｚは以下に定義)に結合したThermusthermophilus 30S
サブユニットの結晶を提供する。該結晶は、下記の抗生
物質Ｚの各々について、単位格子寸法の正方晶系空間群
P4₁2₁2を有するものである。

【００１３】

【００１４】該構造の有利な特徴は、3Åより優れた分
解能で回折することである。この構造のさらなる特徴
は、重原子(例えば、タングステンまたはタンタル)のク
ラスターへの結晶の取り込み、または熱活性化を含まな
い方法で得られることである。さらに、特に16S RNAの8
85〜888/910〜912の塩基対合が確認されることである。
これらの特徴は全て、単独でおよび組み合わされて、本
発明の有利な特徴に寄与する。

【００１５】第２の態様では、本発明はまた、表n(表n
は表１〜４のいずれかである)の３次元原子座標を有す
る30Sの結晶を提供する。抗生物質パロモマイシン、ス
ペクチノマイシンおよびストレプトマイシンの結合を表
1Aの座標に示すが、これらは本発明者らの原データをさ
らに改良したものである。改良後の座標を表1Bに示す。
ここで言う「表１」とは、表1Aもしくは表1Bのいずれか
(または、状況によっては双方)を指すものである。さら
に、表1Cは、30Sリボソームに結合した抗生物質パロモ
マイシンのさらなるデータセットに該当し、従って、抗
生物質Ｚがパロモマイシンである場合には、表１(また
は１を含む表n)とは、1A、1Bまたは1Cのいずれかを意味
する。

【００１６】従って、例えば、本発明が「表１に従う原
子座標データが記録された」コンピュータ読取可能媒体
に言及すると記述されている場合には、該媒体が、表1A
のデータもしくは表1Bのデータ(パロモマイシンの場合
には、さらに表1Cのデータ)のいずれか、または双方(パ
ロモマイシンの場合には、前記表のいずれか２つまたは
３つ全て)を記録していることを意味する。同様に、nが
１である場合の表nについても、1Aおよび／もしくは1B
のいずれか、または双方を意味する。

【００１７】同様に、表1Aまたは表1Bが、単一の抗生物
質データセットのみが提供された30Sリボソーム由来の
データを備えていてもよいこと、このような表が本発明
の一部をなすこと、は明らかであろう。

【００１８】30Sの結晶はS1サブユニットタンパク質を
含有しないことも、本発明者らにより確認された。本発
明者らの研究では、結晶化の前にこのタンパク質を選択
的に取り除くことにより、本明細書に記載の分解能の向
上が得られていたことがわかった。下記の表nに示す原
子座標により、当業者は30Sの結晶化を行う必要性を回
避できるが、この結晶化法は、なお、本発明の更なる態
様をも形成する。

【００１９】従って、30Sサブユニットの高分解能構造
を得るための30Sサブユニットの結晶化法が提供され、
該方法は、30Sサブユニットを提供すること、30Sサブユ
ニットからS1サブユニットを選択的に除去すること、30
Sを結晶化すること、および抗生物質Xを結晶へ取り込む
ことを含む。

【００２０】さらなる態様において、本発明は、 a. 30S、または30Sの少なくとも1つのサブドメインの3
次元構造を用いて、少なくとも抗生物質Xが結合する部
位を特性決定すること、ただし、該3次元構造は表1〜６
の原子座標データにより規定されること；および b. 該活性部位との相互作用について化合物を設計する
かまたは選択することにより、潜在的インヒビターを同
定すること； を含む、30Sの潜在的インヒビターの同定方法を提供す
る。

【００２１】さらなる態様において、本発明は、(a) コ
ンピュータ読取可能な媒体に記録された、30Sまたは30S
の少なくとも1つのサブドメインの3次元構造を規定する
表nの原子座標データ、または(b) 上記の媒体に記録さ
れた、表nの原子座標データから誘導できる30Sの構造因
子データ、のいずれかを含むコンピュータ読取可能な媒
体を提供する。

【００２２】

【課題を解決するための手段】定義 用語「サブドメイン」とは、以下のものを含む： (a) 以下のものから選択されるエレメント：2次構造の
少なくとも１つの完全なエレメント、即ち、αヘリック
スもしくはβシート、またはRNAヘリックス(詳細につい
ては後述する)；互いに相互作用する2つ以上の上記エレ
メントのグループ；少なくとも１つのサブユニットタン
パク質；サブユニットタンパク質のサブグループ、例え
ば、互いに相互作用することが認められている2つ以上
のタンパク質を含むグループ；タンパク質またはそのエ
レメントである上記のいずれかであって、上記エレメン
トまたはタンパク質と会合した16S RNA構造の全てもし
くは一部分と共に用いられるもの； (b) 対象の特定の原子(例えば、抗生物質への結合に関
与する原子)のいずれか１つの周囲の領域を規定する容
積の空間であり、該容積は、完全な結晶の正方晶系の空
間の総容積より小さい。例えば、約500〜15,000ųの容
積内にある原子の座標を、本発明のために選択して使用
できる。かかる空間は、対象の１点に中心がある直径約
10Å〜約30Åの球でありうる；そして、 (c) 表nの座標により規定される少なくとも10個、例え
ば、少なくとも25個、あるいは少なくとも50個、より好
ましくは少なくとも100個、さらに好ましくは少なくと
も500個の原子、最も好ましくは少なくとも1000個の原
子の集合体であって、その集合体の該原子の少なくとも
2個、好ましくは該原子の少なくとも50％が、互いに50
Å以内に位置する集合体。

【００２３】用語「適合させる(fitting)」は、自動的
または半自動的な手段により潜在的インヒビター分子の
1つ以上の原子と30Sの１つ以上の原子もしくは結合部位
との間の相互作用を決定し、その相互作用がどの程度安
定なものであるかを算出することを意味する。様々なコ
ンピュータに基づく適合方法が、本明細書中にさらに記
載されている。

【００２４】用語「平均二乗偏差の平方根」は、平均か
らの偏差の２乗の算術平均の平方根を意味することとす
る。

【００２５】30Sの「活性部位」は、抗生物質Ｚへの結
合に関与する本構造の任意の部分、または、Ｚの結合に
よってコンフォメーションが変化する抗生物質の領域で
ある。tRNAもしくはmRNAの結合、合成またはトランスロ
ケーションに関与する本構造の任意の部分、例えば、tR
NAまたはmRNAの結合には直接関与しないが、リボソーム
が機能するのに必要な複合体領域も含まれ、このような
領域としては、タンパク質合成に伴う構造変化を受ける
領域、または、補因子による調節、リン酸化もしくはア
セチル化に対する標的部位である領域が挙げられる。

【００２６】30Sの特定の領域としては、本発明におい
て、表nおよび図１〜６に示すデータに基づいて抗生物
質結合領域と同定される領域が挙げられる。領域には、
さらに、３つのtRNA部位、即ち、アミノアシル(A)部
位、ペプチジル(P)部位および(出口)Ｅ部位が含まれ
る。他の活性部位は、tRNAがＡ部位からＰ部位へ、およ
びＰ部位からＥ部位へ転位する際に移動する部位であ
る。

【００２７】用語「コンピュータ読取可能な媒体」と
は、コンピュータで読取ることができ、直接アクセスで
きる任意の媒体をいう。このような媒体には、限定しな
いが、フロッピー（登録商標）ディスク、ハードディス
ク記憶媒体および磁気テープなどの磁気記憶媒体；光デ
ィスクまたはCD-ROMなどの光学記憶媒体；RAMおよびROM
などの電子記憶媒体；ならびに磁気/光学記憶媒体のよ
うな上記分類の混成品が含まれる。

【００２８】用語「コンピュータシステム」とは、本発
明の原子座標データの解析に用いる、ハードウェア手
段、ソフトウェア手段、およびデータ記憶手段をいう。
本発明のコンピュータに基づくシステムの最低限のハー
ドウェア手段は、セントラルプロセシングユニット(CP
U)、入力手段、出力手段、およびデータ記憶手段を含
む。モニターにより、構造データを可視化できることが
望ましい。データ記憶手段は、RAMまたは本発明のコン
ピュータ読取可能な媒体に接続するための手段でよい。
このようなシステムの例としては、Silicon Graphics I
ncorporatedおよびSun Microsystemsから入手可能な、U
nixに基づくオペレーティングシステム、Ｗｉｎｄｏｗ
ｓ ＮＴ （登録商標）もしくはIBM OS/2オペレーティ
ングシステムが機能するマイクロコンピュータワークス
テーションが挙げられる。

【００２９】表n 表１〜４の座標は、原子の位置を測定したものを、オン
グストロームで、小数点以下３桁まで示している。本発
明の態様であると本明細書に記載した目的のためにこれ
らの表にある情報を利用するには、これらの座標は、+
1.0オングストロームまで、例としては+0.7オングスト
ロームまで、より好ましくは+0.5オングストローム以下
まで変えてよく、これは本発明の範囲を逸脱するもので
はない。

【００３０】さらに、該構造の原子の相対的な原子位置
を変えて、16S RNAまたはS2〜S20タンパク質の骨格原子
の平均二乗偏差の平方根が、表nに示すこれらの構造に
ついての座標に重ねた場合に、1.5Å未満(好ましくは、
1.0Å未満、そして、より好ましくは、0.5Å未満)にす
ることは、一般に、30Sリガンドの構造に基づく薬物設
計についてその構造特徴および効力の双方の点で、表n
の構造と実質的に等しい構造をもたらすことになるであ
ろう。

【００３１】従って、本発明の態様であると本明細書に
記載する目的のためには：表nの座標が異なる起点およ
び/または軸に対して転移される；該構造の原子の相対
的原子位置が、保存された残基骨格原子の平均二乗偏差
の平方根を、表nに示す保存された残基骨格原子の座標
に重ねた場合、1.5Å未満(好ましくは1.0Å未満、より
好ましくは0.5Å未満)となるように変えられる；ならび
に/または、水分子の数および/もしくは位置が変えられ
る；場合には、本発明の範囲内である。従って、表nの
座標の使用への言及は、上記のような方法で表の個々の
値の１つ以上を変更した座標の使用を含む。

【００３２】表nは、鉛、コバルトおよびマグネシウム
から選択される金属イオンの座標を含んでいる。これら
のイオンのいくつかまたは全ては、場合によっては、デ
ータを用いる場合表から削除してもよい。該表はまた、
26アミノ酸のペプチドであるThx、ならびに6ヌクレオチ
ドのmRNA断片であるNNNUCU（分子Xとして示す）の座標
も列挙している。これら２つの分子の座標は双方とも、
場合によっては同様に削除してよく、即ち、16S RNAお
よびタンパク質S2〜S20の座標のみをモデリングして本
発明の適用法に用いてよい。

【００３３】S2〜S20タンパク質のN末端またはC末端の
わずかな配列は、16S RNAの5'および3'末端のいくつか
の残基とともに、表nの構造の中では解析されていな
い。これらは、本発明の目的のために必須ではない。

【００３４】本発明は、T. thermophilusの30Sの結晶を
提供する手段を当業者に提供する。原核生物間(例えば
ブドウ球菌(Staphylococcus spp)などのヒト病原体であ
る原核生物間)における、リボソーム構造の保存、特に
その機能に不可欠な構造の領域の保存のため、本明細書
中の構造は一般的に抗菌剤の提供に役立つものとなる。
従って、該構造を利用して、分子置換技術により30Sサ
ブユニットを解明することができる。このような方法
で、別の種（例えば、ヒトに対して病原性のある細菌
種）に由来する30Sサブユニットの結晶からX線回折デー
タが得られる。表nの座標を用いて、結晶中の未知の分
子の配向性を見出し、電子密度地図を算出することがで
きる。その後、これらの電子密度地図は対象の種の配列
を用いて解釈され、本発明者らの30Sの構造の座標はこ
の解釈を支援し、この解釈を迅速化することができる。
このように、本発明者らの30Sの構造は、30Sサブユニッ
トならびに他の生物に由来する全リボソームの構造の決
定を容易にする。

【００３５】従って、本発明は、T. thermophilus以外
の種に由来する細菌の30Sの構造を決定する方法を提供
し、該方法は、 (a) 上記の種の30Sを結晶化し、結晶を得ること； (b) 該結晶についてX線結晶解析を実施して、X線回折
データを得ること； (c) 表1の構造データを提供すること； (d) 分子置換を用いて、30Sの電子密度地図を算出する
こと； を含む。

【００３６】結晶化工程(a)は、抗生物質Ｚを用い、共
結晶化によって、または、結晶形成後に抗生物質を取り
込むことにより適宜行う。従って、計算による電子密度
地図は、30S-抗生物質複合体の地図となり得る。

【００３７】このような方法では、本明細書に記載する
ように、30SはS1サブユニットを除去することにより作
製できる。

【００３８】次いで、取得した電子密度地図を使用し
て、抗生物質Ｚが適宜結合した30Sの原子座標データを
計算することができる。このようにして取得した原子座
標データは、本明細書に記載するように、30Sに対する
新規かつ特異的なリガンドの設計と解析に利用すること
ができる。

【００３９】30S結晶構造 本明細書において提供される高分解能の構造は、付属の
表において上述のように少数第３位まで示される単位格
子サイズを有する結晶を提供する。しかしながら、本明
細書に記載の結晶化を再現してこのような結晶を得よう
とする当業者は、ある程度の実験による変化可能性およ
び誤差により、本発明の結晶が、このサイズの範囲内で
あるがこの大きさに正確には一致しない単位格子サイズ
で得られる場合もあることを理解するであろう。従っ
て、本発明の結晶は、一般に、先に定義した単位格子寸
法a、bおよびcを有するものと定義でき、aの場合には±
4.0Åまで変動し、bの場合には±4.0Åまで変動し、cの
場合には±5.0Åまで変動し、好ましくは、aの場合には
±1.0Åまで変動し、bの場合には±1.0Åまで変動し、c
の場合には±2.0Åまで変動する。より好ましくは、分
散は、a±0.7Å、b±0.7Åおよびc±1.4Å以下であり、
より一層好ましくは、a±0.2Å、b±0.2Åおよびc±0.4
Å以下である。これらの単位格子寸法は、当該技術分野
で従来可能であったものよりも分解能の高い新規な単位
格子寸法を定義するものと考えられる。

【００４０】結晶の作製 本発明の結晶を取得するためには、S1サブユニットタン
パク質の選択的な除去が有利であることが見出された。
これは、疎水性相互作用クロマトグラフィーカラム(por
os-ET)の使用により達成し得る。S1サブユニットを欠失
した30Sリボソームサブユニットは、20mM HEPES、pH 7.
5および10mM酢酸を含む1.5Mから0.5Mへの硫酸アンモニ
ウム逆勾配でカラムを通過させて、S1サブユニットを含
有する30Sリボソームから好適に分離される。S1サブユ
ニットを欠失した30Sサブユニットが最初に溶出し、第
一の主要ピークを与える。30Sピークの溶出の間の硫酸
アンモニウム濃度は一定レベルに維持する。30Sピーク
の溶出後、次いで硫酸アンモニウム濃度をさらに減少さ
せ、30S＋S1画分を溶出させる。

【００４１】S1サブユニットタンパク質の選択的除去の
ための別の方法は、調製用セファロースまたはゲル電気
泳動によるものである。好適には、ゲル電気泳動は、ま
ず３％アクリルアミドと0.5％アガロース円筒形ゲルと
を調製、混合し、このゲルをBioRad Prep Cell中に注ぐ
ことにより行う。次いで30Sリボソームサブユニットを
ゲル上にロードし、それらはゲルの他方の末端から現れ
る際に、連続的に溶出される。S1サブユニットを欠失し
た30S画分が最初に溶出し、第一の主要ピークを与え
る。30S＋S1画分が引き続いてのピーク(すなわちショル
ダー)を与えるが、このピークは廃棄してよい。

【００４２】S1を除去した後、好適な条件を用いて結晶
を形成させ得る。この条件には、50〜150mM(例えば約10
0mM)のカコジル酸ナトリウムもしくはカリウム、または
MES(2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸)中、pH 6.0〜
7.5(例えばpH約6.3〜6.7、pH6.5など)で、200〜300mM
(例えば約250mM)のKCl、50〜100mM(例えば約75mM)の塩
化アンモニウム、15〜30mM(例えば約15または約25mM)の
MgCl₂の存在下で13〜17％(v/v)メチル-2,4-ペンタンジ
オールを使用することを含む。

【００４３】特定の態様においては、この条件には、沈
殿剤として13〜17％のMPDを有する、pH 6.5の0.1 Mカコ
ジル酸カリウムまたは0.1 M MES(2-N-モルホリノエタン
スルホン酸)中の、250mM KCl、75mM NH₄Cl、25mM MgC
l₂、6mM 2-メルカプトエタノールの使用を含み得る。

【００４４】当業者には自体公知である任意の適切な方
法で結晶を成長させることができる。適切には、約４℃
で４〜８週間かけて結晶を成長させるのがよい。結晶が
得られたら、抗生物質Ｚを結晶へ取り込ませればよい。
抗生物質は、都合のよい任意の溶解状態にて、10〜500
μM、好ましくは50〜100μM、例えば約80μMの濃度で使
用することができる。このようにして取得した結晶の構
造を解明し、少なくとも３Åの分解能まで分解される結
晶を選択すればよい。このような方法によって少なくと
も３Åの分解能まで分解される結晶は、本発明のさらな
る態様である。

【００４５】表nの構造の使用 30Sの３次元構造の決定により、30Sに対する新規かつ特
異的リガンドの設計のための基礎が提供される。例え
ば、30Sの３次元構造を知ることにより、コンピュータ
ーモデリングプログラムを使用して、30Sの潜在的活性
部位もしくは確認済の活性部位(結合部位など)、または
30Sの他の構造的もしくは機能的特徴と相互作用するこ
とが期待される種々の分子を設計できる。

【００４６】表nによって表される30Sの高分解能モデル
を使用して、抗生物質であるパロモマイシン、ストレプ
トマイシン、スペクチノマイシン、テトラサイクリン、
パクタマイシンおよびハイグロマイシンＢの30Sリボソ
ームへの結合を検討および判定することができ、なおか
つ、この情報を利用することにより、当業者であれば、
これらの抗生物質と競合可能であり、かつこれらの抗生
物質に対する細菌細胞の耐性を克服し得るリガンドを設
計することが可能である。

【００４７】候補リガンド、特にインヒビター分子とし
て機能するものは、入手し得る任意の化合物でよい。市
販されている多数の化合物構造ライブラリーが入手可能
であり、そのような例には、ケンブリッジ構造データベ
ースが挙げられる。このようなライブラリーを使用し
て、リボソームの活性部位と相互作用する能力を有する
化合物を同定するために、多数の化合物に関して、コン
ピューターに基づくハイスループットのスクリーニング
が可能となる。

【００４８】より具体的には、30S活性をモジュレート
する能力を有する潜在的リガンドを、GRAM、DOCKまたは
AUTODOCKなどのドッキングプログラム(Waltersら、Drug
Discovery Today, Vol.3, No.4, (1998), 160-178、お
よびDunbrackら、Folding and Design, 2, (1997), 27-
42を参照されたい)を用いるコンピューターモデリング
の使用を通して試験し、30Sの潜在的リガンドを同定し
得る。この手順には、潜在的リガンドを30Sに対してコ
ンピューターによって適合させ、その潜在的リガンドの
形状および化学的構造がどの程度酵素に結合するかを確
認することを含んでもよい。

【００４９】同様に、コンピューターに補助された、30
Sの活性部位構造の手動での試験も行い得る。プログラ
ム、例えば種々の官能基を有する分子と酵素表面との間
の、予測される相互作用部位を決定するプログラムであ
るGRID (Goodford, J. Med.Chem., 28, (1985), 849-85
7)などのプログラムを使用して活性部位を分析し、その
部位に対するリガンドの部分的構造を予測することも可
能である。

【００５０】コンピュータープログラムを用いて、２つ
の結合パートナー(30Sおよび潜在的リガンドなど)の引
力、反発力、および立体障害を評価できる。一般に、適
合が密であるほど、立体障害は少なくなり、また引力は
大きくなり、潜在的リガンドはより強力となる。なぜな
ら、これらの特性はより密な結合定数に一致するからで
ある。さらに、潜在的リガンドの設計において特異性が
高いほど、リガンドが他のタンパク質とも相互作用する
可能性が少なくなる。このことは、他のタンパク質との
望ましくない相互作用に起因する潜在的な副作用を最小
とするであろう。

【００５１】第１の態様では、上記方法を使用して、コ
ンピュータを利用した合理的な薬物設計法を実施し得
る。該方法には、表nに見られる座標によって定義され
る30Sリボソームの構造を提供し、候補インヒビター分
子の構造を提供し、該候補を30Sの構造へフィッティン
グさせて結果を取得し、該結果を、前記表の30Sと前記
表の抗生物質座標データとを含む構造と比較することが
含まれる。

【００５２】表nが表２（テトラサイクリン）である場
合、テトラサイクリン分子を結合したものもしくはその
他のもの、またはそれら両方と比較しうる。

【００５３】本発明で使用した30Sリボソームは、別の
小さなタンパク質分子Thx、ならびに分子Xと称する短い
ヌクレオチド配列を含む。上記および本明細書中で使用
される場合、「表nの座標によって規定される30Sリボソ
ームの構造」という表現（ここでnは１〜４の任意の整
数）は、表nのタンパク質S2〜S20および16S RNAの原子
によって規定される座標に関し、Thxおよび分子Xの座標
を含むかまたは含まず、場合により、表nにより規定さ
れる金属イオンのいずれかまたはすべてと関連してい
る。

【００５４】表nのデータは、抗生物質Zと30Sリボソー
ムとの間の主な接触が、16S RNAによって媒介されるこ
とを示している。従って、本発明の上記態様において
は、当業者は薬物設計の過程で、16S RNAおよび抗生物
質Zの１つに関連する表nのデータを選択して使用しう
る。従って、本発明はまた、表nの座標によって規定さ
れる30Sリボソームの16S RNAの構造を提供すること；候
補インヒビター分子の構造を提供すること；上記候補の
構造を30Sリボソームの16S RNAの構造にフィッティング
させて結果を提供すること；および前記の結果を、前記
表の抗生物質の構造とともに前記表の30Sリボソームの1
6SRNAを含む構造と比較すること、を含む合理的な薬物
設計のためのコンピューターに基づく方法を提供する。

【００５５】別の態様において、本発明の方法は、Zが
中に結合するポケットをモデル化するために、抗生物質
Z結合領域の近傍にある30Sリボソームにおける目的の原
子の座標を利用しうる。これらの座標を使用して空間を
規定し、続いてこの空間を候補インヒビター分子に対し
て、「in silico」でスクリーニングする。従って、本
発明は、30Sリボソームの表nにおける少なくとも１つの
原子の座標を提供すること；候補インヒビター分子の構
造を提供すること；上記候補の構造を、提供される30S
リボソームの座標にフィッティングさせて結果を得るこ
と；および前記結果を、表nの提供される30Sリボソーム
の座標および１種の抗生物質の構造からの少なくとも１
つの原子の座標を含む構造と比較すること；を含む合理
的な薬物設計のためのコンピューターに基づく方法を提
供する。

【００５６】この実施形態において、提供される30Sリ
ボソームの少なくとも１つの原子は、表nに記載された
抗生物質分子のいずれかにおける少なくとも１つの原子
から好ましくは50Åの距離、より好ましくは10Åの距離
内にありうる。

【００５７】実際問題として、結合ポケットを表す表n
の座標によって規定される30Sリボソームの十分な数の
原子をモデル化することが好ましい。結合ポケットおよ
び抗生物質Zと30Sリボソームとの相互作用に関するその
他の特徴を、本明細書中の実施例に記載する。従って、
本発明のこの実施形態においては、30Sリボソームの少
なくとも5原子、好ましくは少なくとも10原子、より好
ましくは少なくとも50原子、よりいっそう好ましくは少
なくとも100原子（例えば500原子）、最も好ましくは少
なくとも1,000原子の座標が提供される。提供されるこ
れらの原子うち、少なくとも１つは、表nに記載の抗生
物質分子から上記の距離内にあることが好ましい。

【００５８】同様に、上記候補が、30Sリボソームの選
択した座標にフィッティングした場合、抗生物質との比
較は、表nに提供される抗生物質Zの構造のいずれかにお
ける原子の少なくとも3原子、好ましくは少なくとも5原
子、より好ましくは少なくとも8原子、よりいっそう好
ましくは少なくとも16原子に関して行う。

【００５９】別の態様においては、本発明の方法は、抗
生物質結合領域の近傍にある30Sリボソームにおける目
的のサブドメインを利用しうる。従って、本発明は、30
Sリボソームの少なくともサブドメインの座標を提供す
ること；候補インヒビター分子の構造を提供すること；
上記候補の構造を、提供される30Sリボソームのサブド
メインの座標にフィッティングさせて結果を得ること；
および前記結果を、提供される同一のサブドメインの30
Sリボソームにおける座標および表nの抗生物質Zの構造
からの少なくとも１つの原子の座標を含む構造と比較す
ること；を含む合理的な薬物設計のためのコンピュータ
ーに基づく方法を提供する。

【００６０】さらなる態様において、本明細書中の実施
例および添付の図面により、抗生物質Zと30Sリボソーム
との相互作用における特異的部位を示す。これらのデー
タを使用して、同定された各抗生物質Zの相互作用部位
の少なくとも１つ、好ましくは図１〜６それぞれにおい
て別々の各抗生物質Zについて同定された相互作用部位
の少なくとも50％と相互作用するリガンドを設計するこ
とができる。このようなリガンドは、以下： グループI: G1405, A1408、C1490、G1491、A1493、G149
4およびU1495; グループII: G1064、C1066、G1068およびC1192; グループIII: U14、C526、G527、A913、A914、C1490、G
1941およびS12Lys45; グループIV: A965、G966、G1053、C1054、C1195、U119
6、G1197およびG1198; グループV: U244、A892およびC893; グループVI: G693、A694、C788、C795、C796、S7Gly81
および場合によりU1540; グループVII: C1403、G1405、G1494、U1495、C1496およ
びU1498 に示す30Sリボソームの核酸またはアミノ酸残基の少な
くとも１つに関する原子座標データを提供すること；潜
在的リガンドを提供すること；および前記リガンドを30
Sリボソームにフィッティングさせて、該リガンドと選
択したグループにおける核酸またはアミノ酸残基に存在
する化学基の少なくとも１つとの相互作用を判定するこ
と；によって設計しうる。

【００６１】好ましくは各グループのメンバーの少なく
とも半分、より好ましくは各グループの半分からt個ま
でのメンバーを使用する。ここでtは、半分より多く、
かつ少なくともT、好ましくはT-1およびより好ましくは
T-2の数を表す。ここでTは、各グループのメンバーの総
数であり、tがT/2より大きいことが必要条件である（す
なわち、グループIIについては、2、3または4つのメン
バーをすべて使用でき、グループVについては2または3
つのメンバーを使用しうる）。

【００６２】別の態様においては、in silico法の代わ
りに、リボソーム結合活性を有する化合物を選択するた
めの、化合物のハイスループットスクリーニングを実施
してもよい。そして、リボソーム結合活性を示す化合物
を、候補インヒビターの可能性があるものとして選択
し、さらに、X線解析のために30Sリボソームとともに結
晶化しうる（例えば、共結晶化（co-crystallization）
により、または取り込むことにより結晶化する）。得ら
れたX線構造は、様々な目的で、表nの構造と比較しう
る。例えば、このような化合物が接触する点が、抗生物
質Zが接触する点と重複する場合、Zとその他のインヒビ
ターの双方の接触点を有する残基を含む新規分子が提供
されうる。

【００６３】潜在的結合リガンドを設計または選択し、
次いでこれらを活性に関してスクリーニングできる。当
然の帰結として、この方法は好ましくは、下記の工程：
該潜在的リガンドを取得または合成すること、および、
該潜在的リガンドを30Sと接触させ、該潜在的リガンド
の30Sと相互作用する能力を測定すること、をさらに含
むのが好ましい。

【００６４】より詳細には、後者の工程においては、例
えば無細胞(cell free)翻訳系において、潜在的リガン
ドの機能を測定し得る条件下で該潜在的リガンドを30S
と接触させる。

【００６５】このようなアッセイに代えて、またはこの
ようなアッセイに加えて、本方法はさらなる工程：前記
潜在的リガンドを取得または合成すること、30Sと該潜
在的リガンドとの複合体を形成すること、および、該複
合体をＸ線結晶解析により解析し、該潜在的リガンドの
30Sと相互作用する能力を測定すること、を含み得る。

【００６６】これにより、その潜在的リガンドの30Sへ
の結合について、より詳細な構造情報が提供され、また
この情報に基づき、例えば活性部位への結合の改善など
の、該潜在的リガンドの構造および機能に対する調整を
行い得る。必要に応じて、工程c.〜e.を反復し、またさ
らに反復してもよい。

【００６７】本発明の別の態様には、本発明の上記の態
様の方法により30Sのリガンドとして同定された化合物
が含まれる。

【００６８】別の態様においては、本発明は30S-リガン
ド(ここで、リガンドは、上記発明の方法により得られ
る)複合体の解析方法であって、下記の工程： (i) 30Sをリガンドと共に結晶化するか、またはリガン
ドを30Sの結晶内に取り込む(soaking)こと、(ii) Ｘ線
結晶学的回折データを30S-リガンド複合体の結晶から集
めること、および、(iii) 表nの30Sの３次元構造または
少なくとも１つのそのサブドメインを使用して、該30S-
リガンドの示差フーリエ電子密度地図を作製すること、
および(iv) 該示差フーリエ電子密度中で該リガンドを
モデリングすること、を含む前記方法である。

【００６９】従って、30S-リガンド複合体を結晶化し、
Ｘ線回折法(例えばGreerら、J. ofMedicinal Chemistr
y, Vol. 37, (1994), 1035-1054に記載の方法)を用いて
解析することが可能であり、また、リガンドを取り込む
かまたはリガンドと共に結晶化した30SのＸ線回折パタ
ーンと、複合体化されていない30Sの解析された構造に
基づいて、示差フーリエ電子密度地図を算出できる。続
いてこれらの地図を用いて、30Sに結合したリガンドの
構造、および/または30Sのコンホメーション変化を決定
し得る。

【００７０】30Sに結合したリガンドから得られたデー
タを用いて、例えば、官能基の付加もしくは除去、基の
置換、またはその形状の変更によって該リガンドを改善
し、改善された候補物を得ることができる。次いで、こ
のような候補物をスクリーニングし、本明細書において
記載したように反復工程において複合体中で解析し得
る。

【００７１】電子密度地図はCCP4 computing package(C
ollaborative Computational Project 4。CCP4 １式：P
rograms for Protein Crystallography, Acta Crystall
ographica, D50, (1994), 760-763)からのプログラムな
どを用いて算出できる。地図の視覚化およびモデル確率
のために、「O」(Jonesら、Acta Crystallography, A4
7, (1991), 110-119)などのプログラムを用いることが
できる。

【００７２】本明細書で提供する高分解能データによ
り、30Sリボソームの粗悪な分解能での構造を得ていた
当業者は、表nのデータを考慮してその構造をリファイ
ンメントすることが可能となる。従って、更なる態様に
おいて、本発明は30Sリボソームの構造をモデル化する
ための方法を提供する。該方法は、3Åより低分解能
（例えば、5Åより低分解能、5〜12Åなど）で構造の原
子モデルを提供し、得られた構造を表nのデータと比較
し、得られたモデルをリファインメントして構造解析す
ることでより高分解能の構造を提供することからなる。
このような方法は、30Sリボソーム自体または70Sリボソ
ームの一部として様々な機能状態にある30Sリボソーム
（例えば、mRNA、伸長因子などに結合している状態）の
リファインメントのためにも有用である。

【００７３】このような方法は、その他の細菌起源の30
Sリボソームの構造を提供する際にも有用である。なぜ
なら、このようなリボソームの２次元構造および３次元
構造全体は、本明細書で提供するサーモス・サーモフィ
ラス（T. thermophilus）における構造と比較すると、
高度に保存されている可能性があるからである。本明細
書で提供したデータは、エネルギー最小化基準を用いた
相同性モデル化により、その他未知の種に由来する30S
リボソームをモデル化する方法において使用しうる。

【００７４】このような、コンピュータ読取可能な媒体
を提供することにより、原子座標データに慣例的にアク
セスし、30Sまたはそのサブドメインをモデリングし得
る。例えば、RASMOLは公的に入手し得るコンピュータソ
フトウェアパッケージであり、これにより構造決定およ
び/または合理的な薬物設計のための原子座標データの
アクセスおよび解析が可能となる。

【００７５】他方、原子座標データから誘導可能な構造
因子データ(例えば、Blundellら、Protein Crystallogr
aphy, Academic Press, New York, LondonおよびSan Fr
ancisco, (1976)を参照されたい)は、例えば示差フーリ
エ電子密度地図を算出するのに特に有用である。

【００７６】別の態様においては、本発明は、30Sリガ
ンド複合体について構造を作製し、および/または合理
的薬物設計を行うこと意図するシステム(特にコンピュ
ータシステム)を提供する。このようなシステムは、(a)
30Sもしくは30Sの少なくとも１つのサブドメインの３次
元構造を規定する表nの原子座標データ、または(b)表１
の原子座標データから誘導可能な30Sの構造因子デー
タ、のいずれかを含むものである。

【００７７】これらの抗生物質の作用に対して耐性を有
する変異株は、30Sにおけるタンパク質サブユニットの
変異を通して、16S RNAにおける変異もしくは改変(例え
ば2’ O-メチル化)を通して、または抗生物質の修飾(例
えばアセチル化)により生じ得る。いくつかの場合に
は、変異部位が公知であるか、または同定し得る。この
ような部位が、例えば一次配列データを通して同定され
る場合には、本発明により該変異体の構造をモデリング
するための手段が提供される。

【００７８】このように、表nの30Sリボソームの構造を
提供すること、該構造の１アミノ酸または１ヌクレオチ
ドを変化させて30S変異体を提供すること、および、該3
0S変異体の構造をモデリングして該変異体の構造を提供
すること、を含んでなる方法が提供される。該変異体
は、野生型に対して前述の方法、例えばコンピュータ読
取可能形態で保存し、リガンド提供のためにモデリング
する等の方法で使用し得る。モデリングは、本明細書に
おいて提供されたモデルにおける、変更されたアミノ酸
の原子と該原子を取り巻く原子との相互作用に基づく、
変更されたアミノ酸原子の予測された挙動に基づくもの
であってもよい。

【００７９】本方法は、30S構造内へ逐次的な変異(例え
ば２，３，４または５〜10の変異)をもたらすために反
復的であってもよい。

【００８０】本発明のこの態様の対象となり得る30Sの
領域には、抗生物質への結合に関与している30Sの領域
として、後述の実施例において同定された領域を含む。

【００８１】さらなる態様においては、本発明は、70S
リボソーム全体の電子密度地図を低分解能または高分解
能で解析または解釈し、それにより70Sリボソーム全体
の構造を解析するための手段を提供する。

【００８２】特に本発明は、細菌の70Sリボソームの構
造を決定するための方法を提供する。

【００８３】該方法は、(a) 上記種の70Sを結晶化し、
結晶を得ること、(b) 該結晶についてＸ線結晶解析を行
い、Ｘ線回折データを得ること、(c) 表１の構造データ
を提供すること、および(d) 分子置換を用いて、該70S
の電子密度地図を算出すること、を含んでなる。

【００８４】結晶化工程(a)は、場合により、共結晶化
によりまたは結晶形成の後に抗生物質Zを取り込むこと
によって、抗生物質Zとともに行ってもよい。従って、
算出された電子密度図は、30S-抗生物質複合体のもので
あり得る。

【００８５】本発明を、後述の実施例、それらに付属の
図面および表によって以下に説明する。表nにおいて、
各列には、原子番号、元素のタイプ、残基(アミノ酸、
ヌクレオチドなど)、分子内の番号(タンパク質について
はN末端からC末端の方向、核酸については5’末端から
3’末端の方向)、Ｘ,ＹおよびＺ座標、占有率(occupanc
y)、Ｂ因子(Ų)、および30Sのメンバーの識別子が示さ
れている。

【００８６】付随の実施例を通して、本発明者らはE. c
oli 16S RNAについてのナンバリングシステム、ならび
に二次構造エレメント[19]に関しては、H1-H45と表記し
た標準ヘリックス(standard helix)ナンバリングを、図
１に示した若干の変更を加えて用いた。E. coliの配列
とT. thermophilusの配列との間の最も重要な差異は、
より短いH6およびH10であり、またH9およびH33a中の挿
入であった。E. coliと比較してのT. thermophilusにお
ける挿入はいずれも、tRNAについての様式に従い、ヌク
レオチド番号の後の挿入文字により座標中に示す。

【００８７】

【発明の実施の形態】実施例 実施例１ パロマイシン、スペクチノマイシンおよびス
トレプトマイシンと30Sリボソームとの結晶化 30Sの結晶化 30Sの結晶がリボソームタンパク質S1を完全に欠いてい
ることが観察されたので、結晶化に先立って30Sから選
択的にS1を除去するために特別な注意を払った。結晶は
Trakhanovらによって報告されている塩およびマグネシ
ウムの条件下の広範なpHで13-17% MPD中で得られた
[3]。0.1M カコジル酸塩もしくはMESバッファー中でpH
6.5のときに最も大きくかつ最も再現よく結晶が得られ
た。結晶は最大の大きさにまで成長するのに4℃で6週間
かかった。最大の結晶、それは高分解能のデータを得る
ために必要とされるものであるが、80-100 ×80-100 ×
200-300ミクロンに成長した。ポリ(U)誘導性タンパク
質合成における再溶解した結晶の活性は、新たに単離し
た30Sサブユニットの活性と同等であった。

【００８８】データ収集 結晶を26%MPDへ蒸気拡散によって6日間かけて2ステップ
で移した。全ての結晶(オスミウムヘキサミンもしくは
オスミウムペンタミンに取り込んだものを除く)は凍結
防止剤中の1mMコバルトヘキサミンをも含有していた。
結晶を液体窒素中に沈めることによって急速に冷却し、
データの収集は極低温流中60-100 Kで行った。

【００８９】結晶の多数のものをDaresbury Laboratori
esのSRSでビームライン9.6もしくは14.1で、少なくとも
40度の間隔をおいた2回の短時間の露光を用いてスクリ
ーニングした。次いでこれらの結晶の回折限界、単位格
子サイズおよびモザイク幅を分析した。類似の単位格子
サイズを有し適切なモザイク幅を持つ結晶のみをデータ
収集に用いた。

【００９０】重原子同型置換体の可能性のあるものにつ
いてはBrookhaven National LaboratoryのNSLSでビーム
ラインX25、およびESRF(Grenoble)のBM-14でスクリーニ
ングした。約4.5オングストロームまでのデータがX25か
ら得られた。高分解能データはArgonne National Labor
atoryのAPSのSBC ID-19、およびESRFのID14-4で収集し
た。全ての場合において、重原子同形置換体データは異
常散乱差を最大とするためにLIIIエッジの蛍光のピーク
で収集した。X25およびSBC ID-19では、小さな異常散乱
差が正確に測定されるように鏡面の周囲を正確に回転さ
せるためにκゴニオスタットを用いた。各結晶は典型的
には3-10度のデータを示した。データはHKL-2000をもち
いてまとめ、スケーリングした[10]。

【００９１】構造決定 あらかじめ定めた5.5オングストロームでの位相を異常
散乱差フーリエ図を用いて重原子部位の位置を定めるた
めに用いた。最初に、それらの部位はSOLVEプログラム
[11]を用いて3.35オングストロームの位相決定のために
用い、次いで電子密度図の改良をSHARPで行われた方法
を用いて[13]、SOLOMON[12]で行った。翻訳可能なマッ
プを得るためにはこの方法での種々のパラメーターの最
適化が必要であった。RNAおよびいくつかのタンパク質
をSOLVEマップを用いて構築した。この構造を構築する
ためにThermus thermophilusの16S RNAの配列[14]を用
いた。タンパク質については、既に公表されている配列
およびGottingen Thermusゲノム配列プロジェクトから
得られた新たな配列を組み合わせて用いた。3.2オング
ストロームの実験的位相をSHARPを用いて計算し、次い
で電子密度図の改良およびDMで3.05オングストロームへ
の位相の延伸（phase extention）[15]を行って、改良
されたマップを得た。改良されたマップによってその構
造の配列された部分を全て構築することができた。その
モデルはプログラムOを用いて構築し[16]、CNSプログラ
ム[17]を用いて改良した。最尤改良法（Maximum likeli
hood refinement）を用い、最初は振幅と実験的位相確
率分布を3.35オングストロームの分解能に用い、次いで
振幅を3.05オングストロームの分解能に用いた。

【００９２】結果 Thermus thermophilusから得た30Sサブユニットは1522
個のヌクレオチドを有する16SリボソームRNA[14]および
それに関連した21個のタンパク質からなっており、その
うちの20個については相当するタンパク質が大腸菌中で
知られている。タンパク質S21はThermus thermophilus
中には存在せず、タンパク質S1は我々の実験では結晶化
の前に30sから除去されている。さらに、26個の残基を
有するペプチドであるThxがThermus thermophilusの30S
サブユニット中に存在する[18]。

【００９３】実験的に位相を定めたマップでは、RNAと
タンパク質の主鎖の密度、個々の塩基(それらはしばし
ばプリンとピリミジンとを区別するために十分な質を有
していた)、およびタンパク質の側鎖で大きな良く整列
したものが明瞭に示されていた。これらのマップを16S
RNAおよびこれまでに知られていなかったタンパク質S
2、S3、S9、S10、S11、S12、S13、S14、およびThxを構
築するために用いた。さらに、単離された構造物中では
整列していない領域もしくは顕著な変化を示した領域も
構築した。このようなものはしばしばそのタンパク質の
N末端部およびC末端部の大きな部分からなり、ときには
単離の際に広げられたドメイン全体を含んでいる。S16
およびS17などの小さなコアと長いループを有するタン
パク質は、それらのループは液体NMR構造では通常整列
していないため、実質的に再構築しなければならなかっ
た。最後に、第1回目の改良の後に全構造を再構築し
た。我々の現在のモデルはThermus thermophilus16S RN
Aのヌクレオチド5-1511(これは大腸菌16S RNAの5-1534
に対応する)およびそれに関連した20個のタンパク質の
整列している領域の全てからなる。現在得られているモ
デルは、3.05オングストロームのデータに対して、従来
のR因子を0.213、free R因子を0.256、適切な幾何学的
配置にして改良したものである。それらのタンパク質に
ついては、残基の94%はコアもしくはラマチャンドラン
プロットの許容領域にあり、3.9%は十分に許容しうる領
域、1.8%は非許容領域にあった。

【００９４】パロモマイシン パロモマイシンはリボソームのエラー率を増加させる、
アミノグリコシドファミリーの抗生物質の１メンバーで
ある。このファミリーはリボソームからのA部位のtRNA
の解離率を低下させると考えられている。最近の実験か
ら、これは最初の選択(selection)と校正(proofreadin
g)の両方に影響することが示唆されている。結晶を取得
し、採取したデータを表１に提供する。図１は16S RNA
残基とパロモマイシン間の相互作用を示す。

【００９５】パロモマイシンは突然変異誘発および保護
データに合致する位置でH44の主溝(major groove)に結
合する。これはまた一般的に、その結合部位に対応する
RNA断片に結合したパロモマイシンのNMR構造にも一致し
ている[20]。接触を図１に示す。リングIVはヘリックス
の両側の骨格と、NMR構造とは異なる方向で接触してい
るが、一方リングIIIはRNAと弱い接触をしているのみで
ある。リングIIは塩基およびRNAの骨格の両方と密な相
互作用を形成し、一方リングＩはRNAヘリックス内に挿
入されて、パロモマイシンが不在の場合の構造に比較し
て、塩基A1192およびA1493をはじき出すのを助ける。リ
ングIはヌクレオチド塩基の１つを模倣し、G1491の上に
重なり、A1408と水素結合する。その上、A1493のリン酸
骨格と密なH結合を形成して、はじき出された塩基をそ
の位置に固定するのを助ける。言及した以外は、相互作
用の多くはNMR構造[20]で報告されたものと同様であ
る。ただし、塩基はずっと高い度合ではじき出され、そ
の結果、A1408とA1493の間に塩基対は見られない。

【００９６】本発明者らは、tRNAおよびmRNAと結合した
70Sリボソームの7.8Å構造との重ね合わせを使用して、
A部位中のコドンおよびアンチコドンをモデル化した。
はじき出された塩基は直接A部位中に向かい、コドン-ア
ンチコドン相互作用によって形成されたヘリックスの副
溝(minor groove)と相互作用する位置に置かれる。A部
位のコドン-アンチコドンヘリックスは解読部位の校正
段階へのコンホメーションの変化において、EF-Tuによ
るGTPの加水分解中またはその後に、ある程度の旋回を
するに違いないものと見られる。しかし、A部位アンチ
コドン、そして特にP部位コドンおよび下流メッセージ
の両方に共有結合で結合したコドンには、さらに厳密な
共有結合性および立体的な拘束がある。したがって、コ
ドン-アンチコドンヘリックスの方向性に何らかの旋回
による不確定性があっても、1492-1493塩基が副溝以外
のコドン-アンチコドンヘリックスのどこかの部位と相
互作用するとは考えられない。ただし、A部位 tRNAアン
チコドンループのその他の部分との相互作用が除外され
るわけではない。このモデルはどのようにしてパロモマ
イシンがtRNAに対するA部位の親和性を増加させるかに
ついての手がかりを提供する。パロモマイシン不在下で
は、A1492-A1493をはじき出してtRNAと接触するために
は何らかのエネルギーが必要とされるものと見られ、こ
のエネルギーのコストはtRNAとの好ましい相互作用の形
成によって相殺されるものと推定される。H44に結合す
ることによって、パロモマイシンは、これらの塩基がす
でにはじき出された構造を形成し、これによって同種お
よび非同種の両方のtRNAとの結合のエネルギー消費が低
下し、A部位に対するtRNAの親和性が増加する。

【００９７】この構造は全体として、A1492およびA1493
がmRNA-tRNA二本鎖の副溝と接触するようになる、以前
提案されたモデル[21]と一致する。このモデルにおい
て、これらの塩基がメッセージの2'-OHと水素結合する
ことが示唆された。本発明者らのモデル中のA部位 tRNA
の位置付けには旋回による不確定性があると仮定する
と、これらのアデニンがメッセージに対して水素結合す
ると決定することはできない。しかし、このモデルの制
限内で２つのシナリオが可能であると考えられる。アデ
ニンがtRNAアンチコドンのステムループのみの2'OH基と
水素結合するか、あるいはtRNAおよびメッセージの両方
の2'OH基と水素結合するかのいずれかである。これらは
抗生物質が存在するときのtRNAの増加した親和性（およ
び低下した解離率）の直接の説明を提供するので、両方
の可能性はともに魅力的である。最後に、この構造中で
塩基がはじき出される度合から、mRNAがH44 23の主溝で
結合するという提案と、A1492 およびA1493がコドン-ア
ンチコドン相互作用の副溝を探り出すという見解の調和
が可能になる。

【００９８】パロモマイシンのリングＩおよびIIはゲン
タマイシンを含むその他の多数の抗生物質中に見られ
る。H44の同一の断片に結合したゲンタマイシンのNMR構
造は、これらの２つのリングがパロモマイシン中[20]と
同一の様式でRNAと相互作用することを示した。このこ
とは、H44上の解読センターに結合するその他のアミノ
グリコシドがパロモマイシンと同一の機構によって翻訳
中のエラーを誘発することを示唆している。

【００９９】スペクチノマイシン 融通がきくアミノグリコシド類とは対照的に、スペクチ
ノマイシン中の融合したリングシステムでは、変動しに
くいモデルとなる。スペクチノマイシンはH34の一端と
副溝で結合する。これによって、骨格リン酸との単一の
接触と多数の塩基との水素結合がもたらされる（図
２）。最大の相互作用はG1064とC1192間のものであり、
保護研究[22]ならびにこれらの塩基における置換のあら
ゆる組合せがスペクチノマイシンに対する耐性を与える
ことを示す突然変異誘発データ[23]と整合している。こ
れらの２つの塩基は遠く離れているのでWatson-Crick塩
基対を形成することはできないが、単一の水素結合をす
ることはできる。

【０１００】S5および16S RNAのH28の部分のループはス
ペクチノマイシン結合部位に接近するが、この状態では
直接の接触はない。しかし、30Sの別のコンホメーショ
ンにおいて、スペクチノマイシンはこれらの領域とより
直接的に接触する。

【０１０１】70SリボソームからのA、PおよびE部位 tRN
Aを本発明者らの30S構造と重ね合わせると、多数の高度
に特異的な頭部からの接触が、これらのtRNAを安定化し
ていることが示される。tRNAの１つの部位から別の部位
への移動には頭部のエレメントの移動がかならず関与す
るにちがいない。こうした移動には、H34、ならびに、H
34とヘリックス35および38との間の接続の生じ得る再配
置が関与するはずである。この構造は、変動しにくいス
ペクチノマイシン分子が頭部のこの旋回部分付近に結合
して、移動を立体的にブロックすることを示唆してい
る。ただし、これがH34の上部ステムを安定化するよう
に作用することも考えられる[23]。上記のように、スペ
クチノマイシンに対する耐性の原因となるS5の突然変異
[24]は抗生物質と直接接触させないものである。むし
ろ、これらはH1、とH34に直接接続したH35-H36領域との
相互作用を安定化する１ループに位置している。魅力的
な１仮説は、突然変異体がこの相互作用を不安定化し、
これによりS5を介した主体部と頭部のコンホメーション
を安定化させる相互作用のネットワークを取りのぞくこ
とによって、スペクチノマイシンが結合しても動くこと
ができるようにすることである。

【０１０２】ストレプトマイシン リボソームRNAの単離された断片と結合することができ
るパロモマイシンとは異なって、ストレプトマイシン
は、この分子の４つの異なる部分から16S RNAのリン酸
塩骨格に、塩結合および水素結合の両方によって、密に
結合している（図３）。これはまたリボソームタンパク
質 S12からのリシンの１つ（K45）とも接触する。保護
[22]、交差結合[25]および突然変異データ[26-28]（総
説[29]）を基礎として、16S RNAの４つの領域（1490、9
15、526および13）はすべてストレプトマイシンの結合
に関与していた。

【０１０３】翻訳の忠実度には、リボソームの２つの状
態、ヌクレオチド910-912が885-887と対になっている点
に特徴がある、錯誤しがちなまたはラム(ram)（885）状
態と、910-912が888-890と対になっている、制限若しく
は超厳密(hyperaccurate)（888）状態との間のスイッチ
が関与することが提案されている[30]。

【０１０４】本明細書で報告する30Sの構造は、7.8Åで
の70Sリボソームの場合[31]と同様に、885対形成配置と
なっており、したがって、ラム状態にあると推測され
る。上記の密な相互作用は、ストレプトマイシンがこの
形態を選択的に安定化していることを示唆する。888状
態のA部位はtRNA親和性が低く、一方885状態は親和性が
高い[30、32]。したがって、885状態を安定化すること
によって、ストレプトマイシンは非同種tRNAとの最初の
結合を増加させるものと期待される。885状態の選択的
な安定化は、また888状態への遷移をさらに困難にし
て、これによって校正にも影響を与えるものと見られ
る。このように、本発明者らが得た結果はストレプトマ
イシンについて観察された特性の構造上の論理的説明を
提供する。

【０１０５】本発明者らの構造によって示唆されるスト
レプトマイシンによるこの885状態の安定化から、抗生
物質に関する遺伝的データの多くを説明することができ
る。S12における突然変異は超厳密表現型をもたらす[32
-38]（総説[39]）。弱い表現型はストレプトマイシン耐
性を表し、（多重突然変異の結果であることが多い）強
い表現型はストレプトマイシン依存性をもたらす。これ
らの突然変異体の大部分は、野生型リボソームよりも、
種々の度合でさらに超厳密性であり、遅く機能するもの
であり、このことは888状態に対する885状態の不安定化
に一致している。

【０１０６】H44に接触する１変異体 K56（大腸菌 K5
3）を除いて、S12のすべての変異は908-915および524-5
27領域を接続してその位置に保持するタンパク質ループ
に位置している（図３）。こうして、S12はストレプト
マイシンによって安定化される領域と同一の領域を安定
化する。耐性変異においては、ストレプトマイシンによ
ってさらなる安定化を誘発しても、リボソームをこの状
態に保つことができないほどに、885状態を不安定化さ
せる。ストレプトマイシン依存性変異では、885状態が
非常に不安定化されて888（超厳密）形態が優勢とな
り、タンパク質合成が非常に遅滞する。このとき、スト
レプトマイシンは、２つの状態のバランスを回復させ、
また翻訳の復活を助けるように、885状態が十分安定化
するのを助ける。

【０１０７】K45R（大腸菌 K42）変異はストレプトマイ
シンに耐性であるが、超厳密性ではない[39]。K45はリ
ン酸塩 A913と塩架橋(salt bridge)を形成し、それによ
って885状態の安定化に寄与する。これはまた、ストレ
プトマイシン上の２つのOH基に直接水素結合による接触
をさせる（図３）。このリシンのアルギニンへの変異は
水素結合を崩壊させ、これによってストレプトマイシン
に対する30Sの親和性を低下させ、耐性へと導くであろ
う。しかし、この変異は塩架橋を完全なままで残し、そ
のため885形態は不安定化されず、したがって翻訳は正
常のままになるはずである。

【０１０８】rRNA中の多数の変異もまた超厳密性をもた
らす[26、27、40-43]。これらのヌクレオチドのいくつ
かはストレプトマイシン結合部位に近い領域での水素結
合による相互作用に関与する。このようにこの変異は、
885状態を安定化するのを助ける相互作用を崩壊させ
る。A915などのその他のものはその他のどの塩基とも接
触しない。この塩基の変異は888状態におけるさらに好
ましい接触をもたらし、それによって885状態を不安定
化するというより、888状態を安定化することによっ
て、作用する。

【０１０９】ラム変異は錯誤しがちなリボソームをもた
らし、一般的にストレプトマイシン耐性のサプレッサー
として見られる。S4[35、44、45]およびS5[12]における
これらの変異はS12中の超厳密性変異の影響を阻止する
ことができる（総説[39]）。rRNAの骨格に直接水素結合
するS52（大腸菌 S49）以外は、すべてのS4およびS5内
のラム変異体は２つのタンパク質の間の境界付近に位置
する。低分解能において[9]、ラム変異がS4-S5境界を不
安定化するように見受けられた。しかし、原子分解能に
おいては、変異の２つ、S4におけるV56（大腸菌 V53）
およびS5におけるG99（大腸菌 G103）はその他のタンパ
ク質と接触していないことがわかり、本発明者らの構造
からは、それらがラム状態の安定性にどのように影響す
るかは明らかでない。実際、885から888への遷移時に接
近し得る２つのタンパク質の間には裂け目が１つある。
このことから、本発明者らはこれらの残基（およびおそ
らくはS4およびS5のこれに対応する表面）が888状態に
おける密接な接触に関与し、これらの接触がラム変異に
よって崩壊することを提唱する。このモデルにおいて、
ラム変異は888状態を不安定化することによって作用
し、そして錯誤しがちな885状態に平衡を移動させる。
ラム変異がストレプトマイシンに対するリボソームの親
和性を増加するという観察[46]はこのモデルに整合す
る。なぜならば、リボソームは優先的に885形態をとる
からである。このモデルを確定する試験は888形態の原
子分解能の構造を待たなければならない。それでも、本
発明者らの得た結果は最適な翻訳のために885状態およ
び888状態間に微妙なバランスが存在するという見解の
ための構造的基礎を提供し、またこのバランスの崩壊が
どのようにして各種の観察される表現型をもたらすかを
説明する。

【０１１０】実施例２ 30Sリボソームに対するテトラ
サイクリンの結晶化 テトラサイクリンは広い特異性を持つ抗生物質で、1940
年代から広範囲のグラム陰性およびグラム陽性細菌の両
方に対して使用されてきた[47]。これらの薬剤は最初の
いわゆる「広域スペクトル」抗生物質で、ヒトおよび脊
椎動物の両方の医薬において広く使用されてきた。しか
し、後年になって、テトラサイクリンの広範囲の使用
は、これらの抗生物質に対する顕著な微生物耐性の出現
によって、制限されるようになった。テトラサイクリン
は30Sリボソームサブユニットに結合し[48]、そこでA部
位へのアミノアシル化tRNAの結合のみに影響する[49]。
P部位へのtRNAの結合にも翻訳の忠実度にも影響しない
[50]。翻訳中のA部位へのtRNAの結合の阻害と同様に、
テトラサイクリンはまた、停止コドンに関係なく、終結
中に終結因子RF-1および2の両方の結合を阻止する[5
1]。大部分の抗生物質とは対照的に、テトラサイクリン
に対する耐性は通常、16S RNAまたはリボソームタンパ
ク質中の変異に起因するのではなく、延長因子の構造お
よび機能を見掛け上模倣するいくつかの外部タンパク質
因子の存在に起因する[52-54]。

【０１１１】30Sリボソームサブユニットと複合体化し
たテトラサイクリン、または4-(ジメチルアミノ)-1,4,4
a,5,5a,6,11,12a-オクタヒドロ-3,6,10,12,12a-ペンタ
ヒドロキシ-6-メチル-1,11-ジオキソ-2-ナフタセンカル
ボキサミド、の結晶構造を3.0Å解像度で決定した。上
記実施例１に記載したようにして、30S結晶を調製し、
結晶化後に80μMテトラサイクリン中に取り込ませた。
フランス、GrenobleのEuropean Synchrotron Radiation
Facilityにおいて、ビーム線 ID14-4でＸ線回折データ
を採取した。測定した構造因子の振幅に対する天然の30
S構造の最大の可能性に基づく精密化を数回実施した
後、算出した回折フーリエマップから、30Sサブユニッ
ト内の抗生物質の位置を同定した。

【０１１２】本発明者らは30Sサブユニット内にテトラ
サイクリンのための２つの強力な結合部位を発見した。
その１つは頭部と主体部の間のアミノアシル化tRNA（A
部位）のためのアクセプター部位の近くに位置し、もう
１つはサブユニットの主体部中の３つのドメインの境界
部に存在する。別の結合部位の発見は驚くべきことでは
ない。なぜならば、テトラサイクリンは両サブユニット
上に多数の二次部位がある他に、30S上に一次結合部位
があることが知られているからである[55]。この30S内
の一次結合部位において、テトラサイクリンは、アミノ
アシル化tRNAのための結合部位を構成する3'小ドメイン
の長いH44と5'ドメインのH18のステムループの間の小さ
なギャップの真上にあたる肩の部分と、30Sの頭部との
間にある裂け目の上側の3'主要ドメインにのみ、結合す
る。この分子は、小さなH31ステムループ構造の一部と
組み合わさって標準のA型RNA二重ヘリックスコンホメー
ションから外れたH34中の残基によって造られた小さな
ポケット内にはまる。しかし、H31との接触はかなり弱
く、この抗生物質の16S RNAへの結合はほとんどH34との
相互作用のみに依存するようである。以前提案されたも
のとは対照的に、テトラサイクリンの一次結合に関与す
るタンパク質はない。（一次結合部位ほど明確ではない
と思われるが）本発明者らがディフェレンスマップで明
確に観察したテトラサイクリンの二次結合部位は、末端
から二番目のH44に近接して、サブユニットの主体部に
位置し、中心ドメイン中の機能的に重要なH27と、16S R
NAの5'ドメイン中のH11の最先端の間にはさまれてい
る。結合部位は一方でH27の主溝（残基891-894：908-91
1）とカーブしたH27の端部（残基242-245）によって規
定されている。押し出された塩基U244はH27中のC893と
交差して、非ワトソン-クリック塩基対となり、結合部
位の底部を形成する。ここでも、抗生物質とリボソーム
間のすべての相互作用はRNAによって仲介されるが、S12
の長いN末端伸張部がテトラサイクリンに非常に接近す
る（〜8Å、Arg19）。結合ポケットはおよそ幅14Å、深
さ7Åである。

【０１１３】実施例3 30Sリボソームに対するパクタマ
イシンの結晶化 パクタマイシンは潜在的な新規ヒト抗腫瘍抗生物質とし
てS.pactumから単離され、真核生物および原核生物の双
方における翻訳の強力な阻害剤である[56]。それはA部
位における開始複合体の隔離により[58]、開始プロセ
ス、例えば、開始因子が媒介するリボソームへのfMet-t
RNAの結合を阻害すると考えられている[57]。これは完
全な70Sリボソームの形成を効果的に阻害し、その結
果、翻訳を停止させる。結合の際の作用は原核生物と真
核生物とで同様である[59]。

【０１１４】30Sリボソームサブユニットとの複合体中
の、パクタマイシン、すなわち、2-ヒドロキシ-6-メチ
ル安息香酸[5-[(3-アセチルフェニル)アミノ]-4-アミノ
-3-[[(ジメチルアミノ)-カルボニル]アミノ]-1,2-ジヒ
ドロキシ-3-(1-ヒドロキシエチル)-2-メチルシクロペン
チル]メチルエステルの結晶構造を3.1Åの分解能で測定
した。30S結晶は上記のように調製し、結晶化後80μMの
パクタマイシンに取り込んだ。X線回折データはフラン
ス、グルノーブルのEuropean Synchrotron Radiation F
acilityにおいてビームラインID14-4で収集した。30Sサ
ブユニット内の抗生物質の位置は、数回の、測定された
構造因子振幅に対する天然の30S構造の最大尤推定法に
基づいた精密化後に算出した差分フーリエ合成図から同
定した。

【０１１５】パクタマイシンは3個のtRNA分子の結合に
あずかる、サブユニットの間隙に極めて近い、プラット
フォームの上部に結合する。本発明者らは30Sにおいて
パクタマイシンの単一の強力な結合部位のみを見出し
た。抗生物質はH24aの付近の2、3塩基の他にも、16S RN
Aの中央のドメインにおいてH23bステムループの尖部で
主に残基と相互作用する(図５)。結合部位は3'の小さな
ドメインおよび最後のH45に極めて接近しているが、こ
の領域との直接の相互作用はない。RNAへの結合では、
パクタマイシンはH23bのテトラループにおける塩基のス
タッキングを広げ、塩基および糖リン酸塩主鎖の双方に
関してRNAを模倣する。この領域では、H24aループは規
則的ならせん形ステムループを形成し、それにH23bステ
ムループが主としてH23b中の突出塩基とH24aの主鎖の間
の相互作用によって結合している。H23bの尖部付近の塩
基はあちこちで曲がり、H24bの主溝に密集し、この傾向
は単一のパクタマイシン分子によって2個の「塩基」に
まで広げられる。抗生物質は、その間に、糖環と類似す
る5炭素を含むヌクレオチドのように2つの末端の6炭素
環が互いに積み重なるように折りたたまれる。ある程度
まででさえ、中央の環でのNCON(CH₃)₂伸長はRNAのリン
酸エステル部分を模倣する。最も近いタンパク質はS7お
よびS11であり、S7のGly81の主鎖カルボニルへの弱い水
素結合があると思われる。

【０１１６】図５では、本発明者らは残基「Ul450mRN
A」との相互作用を示している。本発明者らのデータか
ら、この残基は主たる16S RNA配列と連続していない
が、結晶において現れる、mRNAの一続きの部分として現
れる。しかしながら、配列に基づいて、それは16S RNA
の最末端（3'末端）に相当すると考えられており、従っ
て、この図では16Sからの配列番号が示されている(1539
〜1544)。しかしながら、座標の表では、これらの残基
は個別に1〜6と番号付けられており、座標は16S RNAの
ものの直後に示されている。

【０１１７】パクタマイシンは主としてリボソームのP
部位に結合すると記載されているが[57、60]、この抗生
物質に関して認められる保護はむしろE部位に関すると
考えられる。この考えは、パクタマイシンの2個の「塩
基」が天然の30S構造において認められるmRNAのE部位コ
ドンの2個の最後の塩基と一致する[61]本構造とより一
致する。実際、天然構造のE部位コドンにおける第1の塩
基とともにパクタマイシンはE部位tRNAと相互作用する
ためにほぼ右側の位置に模擬トリプレットコドンを形成
する。しかしながら、抗生物質が結合した構造では、E
部位コドンにおける塩基の実際の位置は、E部位に結合
したtRNAとの可能な相互作用を排除するように、顕著に
移動する。天然の30S構造では、PおよびE部位間の接点
でメッセンジャーRNAの主鎖にねじれが認められるが、m
RNAの全体的な方向は依然として相対的に直線であり、S
7の長い73〜90のβヘアピンとプラットフォームのH23お
よびH24aのステムループの間に至る。しかしながら、パ
クタマイシンが結合した構造では、E部位におけるmRNA
はサブユニットの後ろの方へ、さらに先頭のH28とS7の
ヘアピンの間に押し出される。これはE部位コドンにお
ける塩基の最後に対して平均12.5Åを含んでなる著しい
ゆがみである。

【０１１８】実施例4 30Sリボソームに対するハイグロ
マイシンBの結晶化 ハイグロマイシンBは、最初はS.hygroscopicusから単離
された第2の抗生物質として、一置換2-デオキシストレ
プトアミン-含有アミノグリコシド抗生物質である[6
2]。原核細胞および真核細胞の双方に対して活性であ
り、かつ、その他のアミノグリコシドとは構造が異なる
点において、特異なアミノグリコシド抗生物質である[6
3]。この薬剤は主として伸長のトランスロケーションプ
ロセスを阻害することによって作用し[63〜65]、わずか
な程度ではあるがメッセンジャーRNAの誤読を引き起こ
す[50,65]。抗生物質は、真核生物においてA部位に結合
したtRNAのP部位へのEF-2(EF-G)媒介性トランスロケー
ションに影響を及ぼすが、リボソームへの因子の結合ま
たは結合したGTPの加水分解、すわなち、トランスロケ
ーションとは別であることが示されているプロセスのい
ずれにも影響を及ぼさない[63]。トランスロケーション
の阻害は、アミノアシル化tRNAに対するA部位の親和性
の増加をともなう[50]。

【０１１９】30Sリボソームサブユニットとの複合体中
の、ハイグロマイシンB、すなわち、O-6-アミノ-6-デオ
キシ-L-グリセロ-D-ガラクト-ヘプトピラノシリデン-(1
→2-3)-O-β-D-タロピラノシル-(1→5)-2-デオキシ-N³-
メチル-D-ストレプトアミンの結晶構造は3.1Åの分解能
で測定した。30S結晶は上記のように調製し、結晶化後
に80μMのハイグロマイシンに取り込ませた。X線回折デ
ータはフランス、グルノーブルのEuropean Synchrotron
Radiation FacilityにおいてビームラインID14-4で収
集した。30Sサブユニット内の抗生物質の位置は、数回
の、測定された構造因子振幅に対する天然の30S構造の
最大尤推定法に基づいた精密化後に算出した差分フーリ
エ合成図から同定した。

【０１２０】ハイグロマイシンBは、翻訳に対して単相
性作用を有するという発見[66]と一致して、30S内に単
一の明白な結合部位を有する。それはA、PおよびE部位t
RNA結合部位を含む領域において、16S RNAの長い最後か
ら2番目のへリックス44の最上部近くに結合する。抗生
物質は16S RNAとのみ（いずれかのタンパク質とではな
く）、さらにヘリックス44とのみ接触している。実際、
それはヘリックス軸に非常に近く、従って領域1490〜15
00および1400〜1410の両RNA鎖由来の残基によって囲ま
れたヘリックスの主溝に位置する。ハイグロマイシンB
はほとんど独占的にRNAの主鎖と対立する塩基と接触
し、この塩基に関しては高度に配列特異的であると予測
される。最も近いタンパク質は、解読に重要であると知
られているS12であるが、ハイグロマイシン結合部位か
ら14Åよりも大きく離れている。ハイグロマイシンBの
結合は、RNAの構造においていずれの重要な変化も誘導
しないようであり、へリックス44の1本の鎖において3個
よりも多い配列の塩基に及ぶ強力な塩基特異的水素結合
によって支配されていると考えられる。三環抗生物質の
構造は30S内のその結合部位において折りたたまれず、
従って、分子が約13Å長となるので、このことはあり得
ることである。

【０１２１】ハイグロマイシンBはパロモマイシンおよ
びゲンタマイシンなどのその他の抗生物質の標的でもあ
る、重要な機能的領域において30Sに結合する。これら
の抗生物質は双方ともハイグロマイシンが結合するより
もさらに下方のへリックス44に結合し、従って、解読に
重大に関与しているアデノシンA1492およびA1493に影響
を及ぼす。興味深いことに、ゲンタマイシンを含むその
他のアミノグリコシド抗生物質においても認められるパ
ロモマイシンの環IIは、正確に1残基に相当する約3Aさ
らに下方のへリックスであるだけで、ハイグロマイシン
の環Iとほとんど同一の方向をとる。RNAとの相互作用の
廃止（ハイグロマイシンの場合には）は耐性を導くの
で、このことはこの種の六員環は抗生物質結合の重要な
一般的な方法であるということを示唆する[67、68]。

【０１２２】以下の表において、表1（表1A(TABLE 1
A)、1B(TABLE 1B)および1C(TABLE 1C)）は、抗生物質で
あるパロモマイシン、スペクチノマイシンおよびストレ
プトマイシン(1Aおよび1B)、並びにパロモマイシン単独
(1C)に結合した30Sリボソームの座標を表す。表２（TAB
LE 2）は、テトラサイクリン(第１および第２部位)に結
合した30Sリボソームの座標を表す。表３(TABLE 3)は、
パクタマイシンに結合した30Sリボソームの座標を表
す。表４(TABLE 4)は、ハイグロマイシンＢに結合した3
0Sリボソームの座標を表す。

【表１Ａ】

【表１Ｂ】

【表１Ｃ】

【表２】

【表３】

【表４】参考文献： 1. Garrett, R. A. et al. (eds.) リボソーム. 構造,
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【配列表】

配列表は公開・登録公報長大データＣＤ−ＲＯＭ「１５
（２００３）−００１（００４）」を参照。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、パロモマイシンの30Sリボソームへの
結合を示す図である。

【図２】図２は、スペクチノマイシンの30Sリボソーム
への結合を示す図である。

【図３】図３は、ストレプトマイシンの30Sリボソーム
への結合を示す図である。

【図４】図4Aは、テトラサイクリン(第１部位)の30Sリ
ボソームへの結合を示す図である。図4Bは、テトラサイ
クリン(第２部位)の30Sリボソームへの結合を示す図で
ある。

【図５】図５は、パクタマイシンの30Sリボソームへの
結合を示す図である。

【図６】図６は、ハイグロマイシンＢの30Sリボソーム
への結合を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号 ００２９８７０．３ (32)優先日 平成12年12月７日(2000．12．7) (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (31)優先権主張番号 ００２９８７１．１ (32)優先日 平成12年12月７日(2000．12．7) (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (31)優先権主張番号 ０１１０８８５．１ (32)優先日 平成13年５月３日(2001．5．3) (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） 公開・登録公報長大データＣＤ−ＲＯＭ 15(2003)−001(004） (72)発明者 ディトレフ，ブローダーセン エゲスコフ イギリス国 シービー２ ２キューエイチ ケンブリッジ，ヒルズ ロード，エムア ールシー ラボラトリー オブ モレキュ ラー バイオロジー ストラクチュラル スタディーズ ディビジョン (72)発明者 アンドリュー，カーター フィリップ イギリス国 シービー２ ２キューエイチ ケンブリッジ，ヒルズ ロード，エムア ールシー ラボラトリー オブ モレキュ ラー バイオロジー ストラクチュラル スタディーズ ディビジョン Ｆターム(参考） 4H045 AA10 AA20 AA30 CA11 EA20 FA71 FA84 GA01 GA40

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 抗生物質Ｚ(Ｚは以下に定義)に結合した
   30Sサブユニットの結晶であって、下記の抗生物質Ｚの
   各々について、単位格子寸法の正方晶系空間群P4₁2₁2を
   有する前記結晶。
2. 【請求項２】 a＝401.4Å、b＝401.4Å、c＝175.9Åの
   単位格子寸法を有する正方晶系空間群P4₁2₁2を有する、
   抗生物質パロモマイシンに結合した30Sサブユニットの
   結晶。
3. 【請求項３】 a＝401.2Å、b＝401.2Å、c＝176.4Åの
   単位格子寸法を有する正方晶系空間群P4₁2₁2を有する、
   抗生物質パロモマイシンに結合した30Sサブユニットの
   結晶。
4. 【請求項４】 a＝401.4Å、b＝401.4Å、c＝175.9Åの
   単位格子寸法を有する正方晶系空間群P4₁2₁2を有する、
   抗生物質ストレプトマイシンに結合した30Sサブユニッ
   トの結晶。
5. 【請求項５】 a＝401.2Å、b＝401.2Å、c＝176.4Åの
   単位格子寸法を有する正方晶系空間群P4₁2₁2を有する、
   抗生物質スペクチノマイシンに結合した30Sサブユニッ
   トの結晶。
6. 【請求項６】 a＝401.2Å、b＝401.2Å、c＝180.0Åの
   単位格子寸法を有する正方晶系空間群P4₁2₁2を有する、
   抗生物質テトラサイクリンに結合した30Sサブユニット
   の結晶。
7. 【請求項７】 a＝401.7Å、b＝401.7Å、c＝177.0Åの
   単位格子寸法を有する正方晶系空間群P4₁2₁2を有する、
   抗生物質パクタマイシンに結合した30Sサブユニットの
   結晶。
8. 【請求項８】 a＝402.1Å、b＝402.1Å、c＝175.3Åの
   単位格子寸法を有する正方晶系空間群P4₁2₁2を有する、
   抗生物質ハイグロマイシンＢに結合した30Sサブユニッ
   トの結晶。
9. 【請求項９】 パロモマイシン、ストレプトマイシン、
   スペクチノマイシン、テトラサイクリン、パクタマイシ
   ンおよびハイグロマイシンＢからなる群より選択される
   抗生物質に結合し、約３Åよりも良好な(数字的には約
   ３Å未満の)分解能を有する30Sリボソームサブユニット
   の結晶。
10. 【請求項１０】 表１〜４からなる群より選択される表
    の座標によって定義される構造を有する、抗生物質に結
    合した30Sリボソームサブユニットの結晶。
11. 【請求項１１】 コンピュータを利用した合理的な薬物
    設計法であって、 表１〜４からなる群より選択される表の座標によって定
    義されるような30Sリボソームサブユニットの構造を提
    供し、 候補モジュレーター分子の構造を提供し、 候補の構造を、前記表の30Sの構造へフィッティングさ
    せる、ことを含んでなる前記方法。
12. 【請求項１２】 コンピュータを利用して30Sリボソー
    ムの潜在的インヒビターを同定する方法であって、 a. 30Sまたはその少なくとも１つのサブドメインの３
    次元構造を利用して、少なくとも１つの活性部位を特性
    決定し、ここで、該３次元構造は、表１〜４からなる群
    より選択される表に従う原子座標データによって定義さ
    れており、 b. 活性部位との相互作用について化合物を設計または
    選択することにより、潜在的なインヒビターを同定する 工程を含んでなる前記方法。
13. 【請求項１３】 c. 潜在的なインヒビターを取得また
    は合成し、 d. 潜在的なインヒビターを30Sと接触させて、前記イ
    ンヒビターの30Sとの相互作用能を判定する ことをさらに含んでなる、請求項１２記載の方法。
14. 【請求項１４】 c. 前記潜在的なリガンドを取得また
    は合成し、 d. 30Sと前記潜在的なリガンドとの複合体を形成さ
    せ、 e. 前記複合体をＸ線結晶学によって解析して、前記潜
    在的なリガンドの30Sとの相互作用能を判定する ことをさらに含んでなる、請求項１２記載の方法。
15. 【請求項１５】 コンピュータを利用した合理的な薬物
    設計法であって、 30Sリボソームの表１〜４からなる群より選択される表
    の少なくとも１つの原子の座標を提供し、 候補インヒビター分子の構造を提供し、 候補の構造を、提供された30Sリボソームの座標へフィ
    ッティングさせて結果を取得し、 前記結果を、提供された30Sリボソームの座標と前記表
    の１つの抗生物質構造に由来する少なくとも１つの原子
    の座標とを含む構造と比較することを含んでなる前記方
    法。
16. 【請求項１６】 座標が、30Sリボソームのサブドメイ
    ンを含んでなる、請求項１５記載の方法。
17. 【請求項１７】 座標が、下記の残基群のいずれか１つ
    の少なくとも１つのメンバーから選択されるものであ
    る、請求項１５記載の方法： 群I：G1405、A1408、C1490、G1491、A1493、G1494およ
    びU1495、 群II：G1064、C1066、G1068およびC1192、 群III：U14、C526、G527、A913、A914、C1490、G1941お
    よびS12Lys45、 群IV：A965、G966、G1053、C1054、C1195、U1196、G119
    7およびG1198、 群V：U244、A892およびC893、 群VI：G693、A694、C788、C795、C796、S7Gly81および
    任意にU1540、並びに 群VII：C1403、G1405、G1494、U1495、C1496およびU149
    8。
18. 【請求項１８】 30Sリボソームまたは30Sリボソームと
    潜在的なモジュレーターとの複合体に対する、構造の作
    成および／または合理的な薬物設計の実施を意図したコ
    ンピュータシステムであって、(a)30Sもしくはその少な
    くとも１つのサブドメインの３次元構造を定義する、表
    １〜４からなる群より選択される表に従う原子座標デー
    タ、または(b)表１〜４からなる群より選択される表の
    原子座標データから誘導し得る、30Sに対する構造因子
    データ、のいずれかを含んでなる前記システム。
19. 【請求項１９】 (a)30Sリボソーム、その少なくとも１
    つの原子もしくはその少なくとも１つのサブドメインの
    ３次元構造を定義する、表１〜４からなる群より選択さ
    れる表に従う原子座標データ、または、(b)表１〜４か
    らなる群より選択される表の原子座標データから誘導し
    得る、30Sリボソームに対する構造因子データ、のいず
    れかが記録されているコンピュータ読取可能媒体。