JP2003153694A - 新規ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質およびそのｄｎａ - Google Patents

新規ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質およびそのｄｎａ

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JP2003153694A JP2001363773A JP2001363773A JP2003153694A JP 2003153694 A JP2003153694 A JP 2003153694A JP 2001363773 A JP2001363773 A JP 2001363773A JP 2001363773 A JP2001363773 A JP 2001363773A JP 2003153694 A JP2003153694 A JP 2003153694A
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receptor protein
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Yasuko Terao
寧子 寺尾
Yasushi Shintani
靖 新谷
Mihoko Harada
美穂子 原田
Yukio Shimomura
行生 下村
Masaaki Mori
森　　正明
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Takeda Pharmaceutical Co Ltd
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Takeda Chemical Industries Ltd
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 アゴニスト／アンタゴニストのスクリーニン
グ等に有用な新規タンパク質の提供。 【解決手段】 ラットおよびマウス由来のタンパク質ま
たはその塩、該タンパク質をコードするＤＮＡ、該タン
パク質に対するリガンドの決定方法、リガンドと該タン
パク質との結合性を変化させる化合物のスクリーニング
方法／スクリーニング用キット、該スクリーニングで得
られる化合物またはその塩など。 【効果】 本発明のタンパク質またはそれをコードする
ＤＮＡは、（１）本発明のタンパク質に対するリガンド
の決定、（２）本発明のタンパク質の機能不全に関連す
る疾患の予防および／または治療剤、（３）本発明のタ
ンパク質とリガンドとの結合性を変化させる化合物（ア
ゴニスト、アンタゴニストなど）のスクリーニングなど
に用いることができる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ラット全脳由来の
新規Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質もしくは
マウス全脳由来の新規Ｇタンパク質共役型レセプタータ
ンパク質またはそれらの塩および該タンパク質をコード
するポリヌクレオチド等に関する。
【０００２】
【従来の技術】多くのホルモンや神経伝達物質などの生
理活性物質は、細胞膜に存在する特異的なレセプタータ
ンパク質を通じて生体の機能を調節している。これらの
レセプタータンパク質のうち多くは共役しているguanin
e nucleotide-binding protein（以下、Ｇタンパク質と
略称する場合がある）の活性化を通じて細胞内のシグナ
ル伝達を行ない、また、７個の膜貫通領域を有する共通
した構造をもっていることから、Ｇタンパク質共役型レ
セプタータンパク質あるいは７回膜貫通型レセプタータ
ンパク質（７ＴＭＲ）と総称される。Ｇタンパク質共役
型レセプタータンパク質は生体の細胞や臓器の各機能細
胞表面に存在し、それら細胞や臓器の機能を調節する分
子、例えばホルモン、神経伝達物質および生理活性物質
等の標的として生理的に重要な役割を担っている。レセ
プターは生理活性物質との結合を介してシグナルを細胞
内に伝達し、このシグナルにより細胞の賦活や抑制とい
った種々の反応が惹起される。各種生体の細胞や臓器の
内の複雑な機能を調節する物質と、その特異的レセプタ
ータンパク質、特にはＧタンパク質共役型レセプタータ
ンパク質との関係を明らかにすることは、各種生体の細
胞や臓器の機能を解明し、それら機能と密接に関連した
医薬品開発に非常に重要な手段を提供することとなる。
【０００３】例えば、生体の種々の器官では、多くのホ
ルモン、ホルモン様物質、神経伝達物質あるいは生理活
性物質による調節のもとで生理的な機能の調節が行なわ
れている。特に、生理活性物質は生体内の様々な部位に
存在し、それぞれに対応するレセプタータンパク質を通
してその生理機能の調節を行っている。生体内には未知
のホルモンや神経伝達物質その他の生理活性物質も多
く、それらのレセプタータンパク質の構造に関しても、
これまで報告されていないものが多い。さらに、既知の
レセプタータンパク質においてもサブタイプが存在する
かどうかについても分かっていないものが多い。生体に
おける複雑な機能を調節する物質と、その特異的レセプ
タータンパク質との関係を明らかにすることは、医薬品
開発に非常に重要な手段である。また、レセプタータン
パク質に対するアゴニスト、アンタゴニストを効率よく
スクリーニングし、医薬品を開発するためには、生体内
で発現しているレセプタータンパク質の遺伝子の機能を
解明し、それらを適当な発現系で発現させることが必要
であった。近年、生体内で発現している遺伝子を解析す
る手段として、ｃＤＮＡの配列をランダムに解析する研
究が活発に行なわれており、このようにして得られたｃ
ＤＮＡの断片配列がExpressed Sequence Tag（ＥＳＴ）
としてデータベースに登録され、公開されている。しか
し、多くのＥＳＴは配列情報のみであり、その機能を推
定することは困難である。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】従来、Ｇタンパク質共
役型レセプターと生理活性物質（すなわち、リガンド）
との結合を阻害する物質や、結合して生理活性物質（す
なわち、リガンド）と同様なシグナル伝達を引き起こす
物質は、これらレセプターの特異的なアンタゴニストま
たはアゴニストとして、生体機能を調節する医薬品とし
て活用されてきた。従って、このように生体内での生理
発現において重要であるばかりでなく、医薬品開発の標
的ともなりうるＧタンパク質共役型レセプタータンパク
質を新規に見出し、その遺伝子（例えばｃＤＮＡ）をク
ローニングすることは、新規Ｇタンパク質共役型レセプ
タータンパク質の特異的リガンドや、アゴニスト、アン
タゴニストを見出す際に、非常に重要な手段となる。し
かし、Ｇタンパク質共役型レセプターはその全てが見出
されているわけではなく、現時点でもなお、未知のＧタ
ンパク質共役型レセプター、また対応するリガンドが同
定されていない、いわゆるオーファンレセプターが多数
存在しており、新たなＧタンパク質共役型レセプターの
探索および機能解明が切望されている。Ｇタンパク質共
役型レセプターは、そのシグナル伝達作用を指標とす
る、新たな生理活性物質（すなわち、リガンド）の探
索、また、該レセプターに対するアゴニストまたはアン
タゴニストの探索に有用である。一方、生理的なリガン
ドが見出されなくても、該レセプターの不活化実験（ノ
ックアウト動物）から該レセプターの生理作用を解析す
ることにより、該レセプターに対するアゴニストまたは
アンタゴニストを作製することも可能である。これら該
レセプターに対するリガンド、アゴニストまたはアンタ
ゴニストなどは、Ｇタンパク質共役型レセプターの機能
不全に関連する疾患の予防／治療薬や診断薬として活用
することが期待できる。さらにまた、Ｇタンパク質共役
型レセプターの遺伝子変異に基づく、生体での該レセプ
ターの機能の低下または昂進が、何らかの疾患の原因と
なっている場合も多い。この場合には、該レセプターに
対するアンタゴニストやアゴニストの投与だけでなく、
該レセプター遺伝子の生体内（またはある特定の臓器）
への導入や、該レセプター遺伝子に対するアンチセンス
核酸の導入による、遺伝子治療に応用することもでき
る。この場合には該レセプターの塩基配列は遺伝子上の
欠失や変異の有無を調べるために必要不可欠な情報であ
り、該レセプターの遺伝子は、該レセプターの機能不全
に関与する疾患の予防／治療薬や診断薬に応用すること
もできる。本発明は、上記のように有用な新規Ｇタンパ
ク質共役型レセプタータンパク質を提供するものであ
る。すなわち、新規Ｇタンパク質共役型レセプタータン
パク質もしくはその部分ペプチドまたはそれらの塩、該
Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその部
分ペプチドをコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡ、Ｒ
ＮＡおよびそれらの誘導体）を含有するポリヌクレオチ
ド（ＤＮＡ、ＲＮＡおよびそれらの誘導体）、該ポリヌ
クレオチドを含有する組換えベクター、該組換えベクタ
ーを保持する形質転換体、該Ｇタンパク質共役型レセプ
タータンパク質またはその塩の製造法、該Ｇタンパク質
共役型レセプタータンパク質もしくはその部分ペプチド
またはそれらの塩に対する抗体、該Ｇタンパク質共役型
レセプタータンパク質の発現量を変化させる化合物、該
Ｇタンパク質共役型レセプターに対するリガンドの決定
方法、リガンドと該Ｇタンパク質共役型レセプタータン
パク質との結合性を変化させる化合物（アンタゴニス
ト、アゴニスト）またはその塩のスクリーニング方法、
該スクリーニング用キット、該スクリーニング方法もし
くはスクリーニングキットを用いて得られうるリガンド
と該Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質との結合
性を変化させる化合物（アンタゴニスト、アゴニスト）
またはその塩、およびリガンドと該Ｇタンパク質共役型
レセプタータンパク質との結合性を変化させる化合物
（アンタゴニスト、アゴニスト）もしくは該Ｇタンパク
質共役型レセプタータンパク質の発現量を変化させる化
合物またはその塩を含有してなる医薬などを提供する。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、鋭意研究
を重ねた結果、ラット全脳由来の新規なＧタンパク質共
役型レセプタータンパク質をコードするｃＤＮＡを単離
し、その全塩基配列を解析することに成功した。そし
て、この塩基配列をアミノ酸配列に翻訳したところ、第
１〜第７膜貫通領域が疎水性プロット上で確認され、こ
れらのｃＤＮＡにコードされるタンパク質が７回膜貫通
型のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質であるこ
とを確認した。本発明者らは、これらの知見に基づい
て、さらに研究を重ねた結果、本発明を完成するに至っ
た。
【０００６】すなわち、本発明は、（１）配列番号：１
または配列番号：１３８で表されるアミノ酸配列と同一
もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを
特徴とするＧタンパク質共役型レセプタータンパク質ま
たはその塩、（２）配列番号：１で表されるアミノ酸配
列を含有することを特徴とする上記（１）記載のＧタン
パク質共役型レセプタータンパク質、（３）配列番号：
１３８で表されるアミノ酸配列を含有することを特徴と
する上記（１）記載のＧタンパク質共役型レセプタータ
ンパク質、（４）上記（１）記載のＧタンパク質共役型
レセプタータンパク質の部分ペプチドまたはその塩、
（５）上記（１）記載のＧタンパク質共役型レセプター
タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポ
リヌクレオチド、（６）ＤＮＡである上記（５）記載の
ポリヌクレオチド、（７）配列番号：２または配列番
号：１３９で表される塩基配列を含有する上記（６）記
載のＤＮＡ、（８）上記（５）記載のポリヌクレオチド
を含有する組換えベクター、（９）上記（８）記載の組
換えベクターで形質転換させた形質転換体、（１０）上
記（９）記載の形質転換体を培養し、上記（１）記載の
Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質を生成せしめ
ることを特徴とする上記（１）記載のＧタンパク質共役
型レセプタータンパク質またはその塩の製造法、（１
１）上記（１）記載のＧタンパク質共役型レセプタータ
ンパク質もしくは上記（４）記載の部分ペプチドまたは
それらの塩に対する抗体、（１２）上記（１）記載のＧ
タンパク質共役型レセプタータンパク質のシグナル伝達
を不活性化する中和抗体である上記（１１）記載の抗
体、（１３）上記（１１）記載の抗体を含有してなる診
断薬、（１４）上記（１）記載のＧタンパク質共役型レ
セプタータンパク質もしくは上記（４）記載の部分ペプ
チドまたはそれらの塩を用いることにより得られうる上
記（１）記載のＧタンパク質共役型レセプタータンパク
質またはその塩に対するリガンド、（１５）上記（１
４）記載のＧタンパク質共役型レセプターのリガンドを
含有してなる医薬、（１６）上記（１）記載のＧタンパ
ク質共役型レセプタータンパク質もしくは上記（４）記
載の部分ペプチドまたはそれらの塩を用いることを特徴
とする上記（１）記載のＧタンパク質共役型レセプター
タンパク質またはその塩に対するリガンドの決定方法、
（１７）上記（１）記載のＧタンパク質共役型レセプタ
ータンパク質もしくは上記（４）記載の部分ペプチドま
たはそれらの塩を用いることを特徴とするリガンドと上
記（１）記載のＧタンパク質共役型レセプタータンパク
質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはそ
の塩のスクリーニング方法、（１８）上記（１）記載の
Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質もしくは上記
（４）記載の部分ペプチドまたはそれらの塩を含有する
ことを特徴とするリガンドと上記（１）記載のＧタンパ
ク質共役型レセプタータンパク質またはその塩との結合
性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用
キット、（１９）上記（１７）記載のスクリーニング方
法または上記（１８）記載のスクリーニング用キットを
用いて得られうるリガンドと上記（１）記載のＧタンパ
ク質共役型レセプタータンパク質またはその塩との結合
性を変化させる化合物またはその塩、（２０）上記（１
７）記載のスクリーニング方法または上記（１８）記載
のスクリーニング用キットを用いて得られうるリガンド
と上記（１）記載のＧタンパク質共役型レセプタータン
パク質またはその塩との結合性を変化させる化合物また
はその塩を含有してなる医薬、（２１）上記（５）記載
のポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下で
ハイブリダイズするポリヌクレオチド、（２２）上記
（５）記載のポリヌクレオチドと相補的な塩基配列また
はその一部を含有してなるポリヌクレオチド、（２３）
上記（５）記載のポリヌクレオチドまたはその一部を用
いることを特徴とする上記（１）記載のＧタンパク質共
役型レセプタータンパク質のｍＲＮＡの定量方法、（２
４）上記（１１）記載の抗体を用いることを特徴とする
上記（１）記載のＧタンパク質共役型レセプタータンパ
ク質の定量方法、（２５）上記（２３）または上記（２
４）記載の定量方法を用いることを特徴とする上記
（１）記載のＧタンパク質共役型レセプターの機能が関
連する疾患の診断方法、（２６）上記（２３）記載の定
量方法を用いることを特徴とする上記（１）記載のＧタ
ンパク質共役型レセプタータンパク質の発現量を変化さ
せる化合物またはその塩のスクリーニング方法、（２
７）上記（２４）記載の定量方法を用いることを特徴と
する細胞膜における上記（１）記載のＧタンパク質共役
型レセプタータンパク質量を変化させる化合物またはそ
の塩のスクリーニング方法、（２８）上記（２６）記載
のスクリーニング方法を用いて得られうる上記（１）記
載のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質の発現量
を変化させる化合物またはその塩、（２９）上記（２
７）記載のスクリーニング方法を用いて得られうる細胞
膜における上記（１）記載のＧタンパク質共役型レセプ
タータンパク質量を変化させる化合物またはその塩、
（３０）（ｉ）上記（１）記載のＧタンパク質共役型レ
セプタータンパク質もしくはその塩または上記（４）記
載の部分ペプチドもしくはその塩と、リガンドとを接触
させた場合と、（ii）上記（１）記載のＧタンパク質共
役型レセプタータンパク質もしくはその塩または上記
（４）記載の部分ペプチドもしくはその塩と、リガンド
および試験化合物とを接触させた場合との比較を行なう
ことを特徴とする上記（１７）記載のスクリーニング方
法、（３１）リガンドが、配列番号：８で表されるアミ
ノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含
有するポリペプチドである上記（３０）記載のスクリー
ニング方法、（３２）リガンドが、配列番号：８で表さ
れるアミノ酸配列を含有するポリペプチドである上記
（３０）記載のスクリーニング方法、（３３）リガンド
が、配列番号：８で表されるアミノ酸配列を有するポリ
ペプチドである上記（３０）記載のスクリーニング方
法、（３４）リガンドが、配列番号：９で表されるアミ
ノ酸配列を有するポリペプチドである上記（３０）記載
のスクリーニング方法、（３５）肥満の診断薬である上
記（１３）記載の診断薬、（３６）抗肥満薬である上記
（１５）または上記（２０）記載の医薬、（３７）食欲
増進剤である上記（１５）または上記（２０）記載の医
薬、（３８）プロラクチン産生抑制剤である上記（１
５）または上記（２０）記載の医薬、（３９）哺乳動物
に対し、上記（１９）記載の、リガンドと請求項１記載
のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその
塩との結合性を変化させる化合物またはその塩の有効量
を投与することを特徴とする肥満の予防・治療方法、
（４０）哺乳動物に対し、上記（１９）記載の、リガン
ドと請求項１記載のＧタンパク質共役型レセプタータン
パク質またはその塩との結合性を変化させる化合物また
はその塩の有効量を投与することを特徴とする食欲増進
方法、（４１）哺乳動物に対し、上記（１９）記載の、
リガンドと請求項１記載のＧタンパク質共役型レセプタ
ータンパク質またはその塩との結合性を変化させる化合
物またはその塩の有効量を投与することを特徴とするプ
ロラクチン産生抑制方法、（４２）抗肥満薬を製造する
ための、上記（１９）記載の、リガンドと請求項１記載
のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその
塩との結合性を変化させる化合物またはその塩の使用、
（４３）食欲増進剤を製造するための、上記（１９）記
載の、リガンドと請求項１記載のＧタンパク質共役型レ
セプタータンパク質またはその塩との結合性を変化させ
る化合物またはその塩の使用、（４４）プロラクチン産
生抑制剤を製造するための、上記（１９）記載の、リガ
ンドと請求項１記載のＧタンパク質共役型レセプタータ
ンパク質またはその塩との結合性を変化させる化合物ま
たはその塩の使用、（４５）外来性の、上記（１）記載
のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質をコードす
るＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを有する非ヒトトランス
ジェニック動物、（４６）非ヒト動物がゲッ歯動物であ
る上記（４５）記載の動物、（４７）ゲッ歯動物がマウ
スまたはラットである上記（４６）記載の動物、（４
８）外来性の、上記（１のＧタンパク質共役型レセプタ
ータンパク質をコードするＤＮＡまたはその変異ＤＮＡ
を含有し、非ヒト動物において発現しうる組換えベクタ
ー、（４９）上記（１）記載のＧタンパク質共役型レセ
プタータンパク質をコードするＤＮＡが不活性化された
非ヒト哺乳動物胚幹細胞、（５０）非ヒト哺乳動物がゲ
ッ歯動物である上記（４９）記載の胚幹細胞、（５１）
ゲッ歯動物がマウスである上記（５０）記載の胚幹細
胞、（５２）上記（１）記載のＧタンパク質共役型レセ
プタータンパク質をコードするＤＮＡが不活性化された
該ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物、（５３）非ヒト哺乳
動物がゲッ歯動物である上記（５２）記載の非ヒト哺乳
動物、（５４）ゲッ歯動物がマウスである上記（５３）
記載の非ヒト哺乳動物等に関する。
【０００７】さらには、（５５）タンパク質が、（１）
（i）配列番号：１で表されるアミノ酸配列、配列番
号：１で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上
（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１
０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミ
ノ酸が欠失したアミノ酸配列、（ii）配列番号：１で表
されるアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、
１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さら
に好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が付加した
アミノ酸配列、（iii）配列番号：１で表されるアミノ
酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜３０個
程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましく
は数個（１〜５個））のアミノ酸が他のアミノ酸で置換
されたアミノ酸配列、または（iv）それらを組み合わせ
たアミノ酸配列を含有するタンパク質または（２）
（i）配列番号：１３８で表されるアミノ酸配列、配列
番号：１で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上
（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１
０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミ
ノ酸が欠失したアミノ酸配列、（ii）配列番号：１３８
で表されるアミノ酸配列に１または２個以上（好ましく
は、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、
さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が付加
したアミノ酸配列、（iii）配列番号：１３８で表され
るアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１
〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに
好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が他のアミノ
酸で置換されたアミノ酸配列、または（iv）それらを組
み合わせたアミノ酸配列を含有するタンパク質である上
記（１）記載のＧタンパク質共役型レセプタータンパク
質またはその塩、（５６）上記（１）記載のＧタンパク
質共役型レセプタータンパク質もしくはその塩または上
記（４）記載の部分ペプチドもしくはその塩と、試験化
合物とを接触させることを特徴とする上記（１６）記載
のリガンドの決定方法、（５７）リガンドが、例えば、
アンギオテンシン、ボンベシン、カナビノイド、コレシ
ストキニン、グルタミン、セロトニン、メラトニン、ニ
ューロペプチドＹ、オピオイド、プリン、バソプレッシ
ン、オキシトシン、ＰＡＣＡＰ（例、ＰＡＣＡＰ２７，
ＰＡＣＡＰ３８）、セクレチン、グルカゴン、カルシト
ニン、アドレノメジュリン、ソマトスタチン、ＧＨＲ
Ｈ、ＣＲＦ、ＡＣＴＨ、ＧＲＰ、ＰＴＨ、ＶＩＰ（バソ
アクティブ インテスティナル ポリペプチド）、ソマ
トスタチン、ドーパミン、モチリン、アミリン、ブラジ
キニン、ＣＧＲＰ（カルシトニンジーンリレーティッド
ペプチド）、ロイコトリエン、パンクレアスタチン、プ
ロスタグランジン、トロンボキサン、アデノシン、アド
レナリン、ケモカインスーパーファミリー（例、ＩＬ−
８，ＧＲＯα，ＧＲＯβ，ＧＲＯγ，ＮＡＰ−２，ＥＮ
Ａ−７８，ＧＣＰ−２，ＰＦ４，ＩＰ−１０，Ｍｉｇ，
ＰＢＳＦ／ＳＤＦ−１などのＣＸＣケモカインサブファ
ミリー；ＭＣＡＦ／ＭＣＰ−１，ＭＣＰ−２，ＭＣＰ−
３，ＭＣＰ−４，ｅｏｔａｘｉｎ，ＲＡＮＴＥＳ，ＭＩ
Ｐ−１α、ＭＩＰ−１β，ＨＣＣ−１，ＭＩＰ−３α／
ＬＡＲＣ、ＭＩＰ−３β／ＥＬＣ，Ｉ−３０９，ＴＡＲ
Ｃ，ＭＩＰＦ−１，ＭＩＰＦ−２／ｅｏｔａｘｉｎ−
２，ＭＤＣ，ＤＣ−ＣＫ１／ＰＡＲＣ，ＳＬＣなどのＣ
Ｃケモカインサブファミリー；ｌｙｍｐｈｏｔａｃｔｉ
ｎなどのＣケモカインサブファミリー；ｆｒａｃｔａｌ
ｋｉｎｅなどのＣＸ３Ｃケモカインサブファミリー
等）、エンドセリン、エンテロガストリン、ヒスタミ
ン、ニューロテンシン、ＴＲＨ、パンクレアティックポ
リペプタイド、ガラニン、リゾホスファチジン酸（ＬＰ
Ａ）、スフィンゴシン１−リン酸または配列番号：８で
表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のア
ミノ酸配列を含有するポリペプチドである上記（５６）
記載のリガンドの決定方法、
【０００８】（５８）（ｉ）標識したリガンドを上記
（１）記載のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質
もしくはその塩または上記（４）記載の部分ペプチドも
しくはその塩に接触させた場合と、（ii）標識したリガ
ンドおよび試験化合物を上記（１）記載のＧタンパク質
共役型レセプタータンパク質もしくはその塩または上記
（４）記載の部分ペプチドもしくはその塩に接触させた
場合における、標識したリガンドの上記（１）記載のＧ
タンパク質共役型レセプタータンパク質もしくはその塩
または上記（４）記載の部分ペプチドもしくはその塩に
対する結合量を測定し、比較することを特徴とするリガ
ンドと上記（１）記載のＧタンパク質共役型レセプター
タンパク質またはその塩との結合性を変化させる化合物
またはその塩のスクリーニング方法、（５９）（ｉ）標
識したリガンドを上記（１）記載のＧタンパク質共役型
レセプタータンパク質を含有する細胞に接触させた場合
と、（ii）標識したリガンドおよび試験化合物を上記
（１）記載のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質
を含有する細胞に接触させた場合における、標識したリ
ガンドの該細胞に対する結合量を測定し、比較すること
を特徴とするリガンドと上記（１）記載のＧタンパク質
共役型レセプタータンパク質またはその塩との結合性を
変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（６０）（ｉ）標識したリガンドを上記（１）記載のＧ
タンパク質共役型レセプタータンパク質を含有する細胞
の膜画分に接触させた場合と、（ii）標識したリガンド
および試験化合物を上記（１）記載のＧタンパク質共役
型レセプタータンパク質を含有する細胞の膜画分に接触
させた場合における、標識したリガンドの該細胞の膜画
分に対する結合量を測定し、比較することを特徴とする
リガンドと上記（１）記載のＧタンパク質共役型レセプ
タータンパク質またはその塩との結合性を変化させる化
合物またはその塩のスクリーニング方法、
【０００９】（６１）（ｉ）標識したリガンドを上記
（９）記載の形質転換体を培養することによって該形質
転換体の細胞膜に発現したＧタンパク質共役型レセプタ
ータンパク質に接触させた場合と、（ii）標識したリガ
ンドおよび試験化合物を上記（９）記載の形質転換体を
培養することによって該形質転換体の細胞膜に発現した
Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質に接触させた
場合における、標識したリガンドの該Ｇタンパク質共役
型レセプタータンパク質に対する結合量を測定し、比較
することを特徴とするリガンドと上記（１）記載のＧタ
ンパク質共役型レセプタータンパク質またはその塩との
結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニン
グ方法、（６２）（ｉ）上記（１）記載のＧタンパク質
共役型レセプタータンパク質またはその塩を活性化する
化合物を上記（１）記載のＧタンパク質共役型レセプタ
ータンパク質を含有する細胞に接触させた場合と、（i
i）上記（１）記載のＧタンパク質共役型レセプタータ
ンパク質またはその塩を活性化する化合物および試験化
合物を上記（１）記載のＧタンパク質共役型レセプター
タンパク質を含有する細胞に接触させた場合における、
Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質を介した細胞
刺激活性を測定し、比較することを特徴とするリガンド
と上記（１）記載のＧタンパク質共役型レセプタータン
パク質またはその塩との結合性を変化させる化合物また
はその塩のスクリーニング方法、（６３）上記（１）記
載のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質またはそ
の塩を活性化する化合物を上記（９）記載の形質転換体
を培養することによって該形質転換体の細胞膜に発現し
たＧタンパク質共役型レセプタータンパク質に接触させ
た場合と、上記（１）記載のＧタンパク質共役型レセプ
タータンパク質またはその塩を活性化する化合物および
試験化合物を上記（９）記載の形質転換体を培養するこ
とによって該形質転換体の細胞膜に発現したＧタンパク
質共役型レセプタータンパク質に接触させた場合におけ
る、Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質を介する
細胞刺激活性を測定し、比較することを特徴とするリガ
ンドと上記（１）記載のＧタンパク質共役型レセプター
タンパク質またはその塩との結合性を変化させる化合物
またはその塩のスクリーニング方法、
【００１０】（６４）上記（１）記載のＧタンパク質共
役型レセプタータンパク質を活性化する化合物が、アン
ギオテンシン、ボンベシン、カナビノイド、コレシスト
キニン、グルタミン、セロトニン、メラトニン、ニュー
ロペプチドＹ、オピオイド、プリン、バソプレッシン、
オキシトシン、ＰＡＣＡＰ（例、ＰＡＣＡＰ２７，ＰＡ
ＣＡＰ３８）、セクレチン、グルカゴン、カルシトニ
ン、アドレノメジュリン、ソマトスタチン、ＧＨＲＨ、
ＣＲＦ、ＡＣＴＨ、ＧＲＰ、ＰＴＨ、ＶＩＰ（バソアク
ティブ インテスティナル ポリペプチド）、ソマトス
タチン、ドーパミン、モチリン、アミリン、ブラジキニ
ン、ＣＧＲＰ（カルシトニンジーンリレーティッドペプ
チド）、ロイコトリエン、パンクレアスタチン、プロス
タグランジン、トロンボキサン、アデノシン、アドレナ
リン、ケモカインスーパーファミリー（例、ＩＬ−８，
ＧＲＯα，ＧＲＯβ，ＧＲＯγ，ＮＡＰ−２，ＥＮＡ−
７８，ＧＣＰ−２，ＰＦ４，ＩＰ−１０，Ｍｉｇ，ＰＢ
ＳＦ／ＳＤＦ−１などのＣＸＣケモカインサブファミリ
ー；ＭＣＡＦ／ＭＣＰ−１，ＭＣＰ−２，ＭＣＰ−３，
ＭＣＰ−４，ｅｏｔａｘｉｎ，ＲＡＮＴＥＳ，ＭＩＰ−
１α、ＭＩＰ−１β，ＨＣＣ−１，ＭＩＰ−３α／ＬＡ
ＲＣ、ＭＩＰ−３β／ＥＬＣ，Ｉ−３０９，ＴＡＲＣ，
ＭＩＰＦ−１，ＭＩＰＦ−２／ｅｏｔａｘｉｎ−２，Ｍ
ＤＣ，ＤＣ−ＣＫ１／ＰＡＲＣ，ＳＬＣなどのＣＣケモ
カインサブファミリー；ｌｙｍｐｈｏｔａｃｔｉｎなど
のＣケモカインサブファミリー；ｆｒａｃｔａｌｋｉｎ
ｅなどのＣＸ３Ｃケモカインサブファミリー等）、エン
ドセリン、エンテロガストリン、ヒスタミン、ニューロ
テンシン、ＴＲＨ、パンクレアティックポリペプタイ
ド、ガラニン、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）、スフ
ィンゴシン１−リン酸または配列番号：８で表されるア
ミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を
含有するポリペプチドである上記（６２）または（６
３）記載のスクリーニング方法、（６５）上記（３０）
〜（３４）または上記（５８）〜（６４）記載のスクリ
ーニング方法で得られうるリガンドと上記（１）記載の
Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその塩
との結合性を変化させる化合物またはその塩、（６６）
上記（３０）〜（３４）または上記（５８）〜（６４）
記載のスクリーニング方法で得られうるリガンドと上記
（１）記載のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質
またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその
塩を含有することを特徴とする医薬、
【００１１】（６７）上記（１）記載のＧタンパク質共
役型レセプタータンパク質を含有する細胞を含有するこ
とを特徴とする上記（１８）記載のスクリーニング用キ
ット、（６８）上記（１）記載のＧタンパク質共役型レ
セプタータンパク質を含有する細胞の膜画分を含有する
ことを特徴とする上記（１８）記載のスクリーニング用
キット、（６９）上記（９）記載の形質転換体を培養す
ることによって該形質転換体の細胞膜に発現したＧタン
パク質共役型レセプタータンパク質を含有することを特
徴とする上記（１８）記載のスクリーニング用キット、
（７０）上記（６７）〜（６９）記載のスクリーニング
用キットを用いて得られうる、リガンドと上記（１）記
載のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質またはそ
の塩との結合性を変化させる化合物またはその塩、（７
１）上記（６７）〜（６９）記載のスクリーニング用キ
ットを用いて得られうる、リガンドと上記（１）記載の
Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその塩
との結合性を変化させる化合物またはその塩を含有する
ことを特徴とする医薬、（７２）上記（１１）記載の抗
体と、上記（１）記載のＧタンパク質共役型レセプター
タンパク質もしくは上記（４）記載の部分ペプチドまた
はその塩とを接触させることを特徴とする上記（１）の
Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質もしくは上記
（４）記載の部分ペプチドまたはその塩の定量法、（７
３）上記（１１）記載の抗体と、被検液および標識化さ
れた上記（１）記載のＧタンパク質共役型レセプタータ
ンパク質もしくは上記（４）記載の部分ペプチドまたは
その塩とを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化
された上記（１）記載のＧタンパク質共役型レセプター
タンパク質もしくは上記（４）記載の部分ペプチドまた
はその塩の割合を測定することを特徴とする被検液中の
上記（１）記載のＧタンパク質共役型レセプタータンパ
ク質もしくは上記（４）記載の部分ペプチドまたはその
塩の定量法、および（７４）被検液と担体上に不溶化し
た上記（１１）記載の抗体および標識化された上記（１
１）記載の抗体とを同時あるいは連続的に反応させたの
ち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することを特徴
とする被検液中の上記（１）記載のＧタンパク質共役型
レセプタータンパク質もしくは上記（４）記載の部分ペ
プチドまたはその塩の定量法等を提供する。
【００１２】
【発明の実施の形態】本発明のＧタンパク質共役型レセ
プタータンパク質（以下、レセプタータンパク質と略記
する場合がある）は、配列番号：１で表されるアミノ酸
配列（図１および図２）と同一もしくは実質的に同一の
アミノ酸配列を含有するレセプタータンパク質、または
配列番号：１３８で表されるアミノ酸配列と同一もしく
は実質的に同一のアミノ酸配列を含有するレセプタータ
ンパク質である。本発明のレセプタータンパク質は、例
えば、ヒトやその他の哺乳動物（例えば、モルモット、
ラット、マウス、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サルな
ど）のあらゆる細胞（例えば、脾細胞、神経細胞、グリ
ア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ラ
ンゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、繊
維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞
（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキ
ラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単
球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細
胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは間質細胞、ま
たはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくはガン細胞な
ど）や血球系の細胞、またはそれらの細胞が存在するあ
らゆる組織、例えば、脳、脳の各部位（例、嗅球、扁頭
核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、視床下核、大
脳皮質、延髄、小脳、後頭葉、前頭葉、側頭葉、被殻、
尾状核、脳染、黒質）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎
臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮
膚、筋肉、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心
臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、末梢血球、前立腺、
睾丸、精巣、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋など
に由来するタンパク質であってもよく、また合成タンパ
ク質であってもよい。
【００１３】配列番号：１で表されるアミノ酸配列と実
質的に同一のアミノ酸配列としては、例えば、配列番
号：１で表されるアミノ酸配列と８５％以上、好ましく
は約９０％以上、より好ましくは約９５％以上の相同性
を有するアミノ酸配列などが挙げられる。本発明の配列
番号：１で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミ
ノ酸配列を含有するタンパク質としては、例えば、配列
番号：１で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミ
ノ酸配列を含有し、配列番号：１で表されるアミノ酸配
列を有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタ
ンパク質などが好ましい。配列番号：１３８で表される
アミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、
例えば、配列番号：１３８で表されるアミノ酸配列と８
６％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約
９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げら
れる。本発明の配列番号：１３８で表されるアミノ酸配
列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質
としては、例えば、配列番号：１３８で表されるアミノ
酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番
号：１３８で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質
と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好まし
い。実質的に同質の活性としては、例えば、リガンド結
合活性、シグナル情報伝達作用などが挙げられる。実質
的に同質とは、それらの活性が性質的に同質であること
を示す。したがって、リガンド結合活性やシグナル情報
伝達作用などの活性が同等（例、約０．０１〜１００
倍、好ましくは約０．５〜２０倍、より好ましくは約
０．５〜２倍）であることが好ましいが、これらの活性
の程度やタンパク質の分子量などの量的要素は異なって
いてもよい。リガンド結合活性やシグナル情報伝達作用
などの活性の測定は、公知の方法に準じて行なうことが
できるが、例えば、後に記載するリガンドの決定方法や
スクリーニング方法に従って測定することができる。
【００１４】また、本発明のレセプタータンパク質とし
ては、（１）（i）配列番号：１で表されるアミノ酸配
列中の１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程
度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは
数個（１〜５個））のアミノ酸が欠失したアミノ酸配
列、（ii）配列番号：１で表されるアミノ酸配列に１ま
たは２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、より好ま
しくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５
個））のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、（iii）配
列番号：１で表されるアミノ酸配列中の１または２個以
上（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜
１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のア
ミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、また
は（iv）それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有する
タンパク質、（２）（i）配列番号：１３８で表される
アミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜
３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好
ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が欠失したアミ
ノ酸配列、（ii）配列番号：１３８で表されるアミノ酸
配列に１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程
度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは
数個（１〜５個））のアミノ酸が付加したアミノ酸配
列、（iii）配列番号：１３８で表されるアミノ酸配列
中の１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、
より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個
（１〜５個））のアミノ酸が他のアミノ酸で置換された
アミノ酸配列、または（iv）それらを組み合わせたアミ
ノ酸配列を含有するタンパク質なども用いられる。
【００１５】本明細書におけるレセプタータンパク質お
よびポリペプチドは、ペプチド標記の慣例に従って、左
端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシ
ル末端）である。配列番号：１で表されるアミノ酸配列
を含有するレセプタータンパク質をはじめとする、本発
明のレセプタータンパク質は、Ｃ末端がカルボキシル基
（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ-）、ア
ミド（−ＣＯＮＨ2）またはエステル（−ＣＯＯＲ）の
いずれであってもよい。ここでエステルにおけるＲとし
ては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプ
ロピルもしくはｎ−ブチルなどのＣ1-6アルキル基、例
えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ3-8シ
クロアルキル基、例えば、フェニル、α−ナフチルなど
のＣ6-12アリール基、例えば、ベンジル、フェネチルな
どのフェニル−Ｃ1-2アルキル基もしくはα−ナフチル
メチルなどのα−ナフチル−Ｃ1-2アルキル基などのＣ
7-14アラルキル基のほか、経口用エステルとして汎用さ
れるピバロイルオキシメチル基などが用いられる。本発
明のレセプタータンパク質がＣ末端以外にカルボキシル
基（またはカルボキシレート）を有している場合、カル
ボキシル基がアミド化またはエステル化されているもの
も本発明のレセプタータンパク質に含まれる。この場合
のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステル
などが用いられる。さらに、本発明のレセプタータンパ
ク質には、上記したタンパク質において、Ｎ末端のメチ
オニン残基のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、
アセチルなどのＣ2-6アルカノイル基などのＣ1-6アシル
基など）で保護されているもの、Ｎ端側が生体内で切断
され生成したグルタミル基がピログルタミン酸化したも
の、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば、−Ｏ
Ｈ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール
基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホル
ミル基、アセチルなどのＣ2-6アルカノイル基などのＣ
1-6アシル基など）で保護されているもの、あるいは糖
鎖が結合したいわゆる糖タンパク質などの複合タンパク
質なども含まれる。本発明のレセプタータンパク質の具
体例としては、例えば、配列番号：１で表されるアミノ
酸配列を含有するレセプタータンパク質、配列番号：１
３８で表されるアミノ酸配列を含有するレセプタータン
パク質などが用いられる。
【００１６】本発明のレセプタータンパク質の部分ペプ
チド（以下、部分ペプチドと略記する場合がある）とし
ては、上記した本発明のレセプタータンパク質の部分ペ
プチドであれば何れのものであってもよいが、例えば、
本発明のレセプタータンパク質分子のうち、細胞膜の外
に露出している部位であって、実質的に同質のレセプタ
ー結合活性を有するものなどが用いられる。具体的に
は、配列番号：１または配列番号：１３８で表されるア
ミノ酸配列を有するレセプタータンパク質の部分ペプチ
ドとしては、疎水性プロット解析において細胞外領域
（親水性（Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ）部位）であると分
析された部分を含むペプチドである。また、疎水性（Ｈ
ｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ）部位を一部に含むペプチドも同
様に用いることができる。個々のドメインを個別に含む
ペプチドも用い得るが、複数のドメインを同時に含む部
分のペプチドでもよい。本発明の部分ペプチドのアミノ
酸の数は、上記した本発明のレセプタータンパク質の構
成アミノ酸配列のうち少なくとも２０個以上、好ましく
は５０個以上、より好ましくは１００個以上のアミノ酸
配列を有するペプチドなどが好ましい。ここで、「実質
的に同質の活性」とは、上記と同意義を示す。「実質的
に同質の活性」の測定は上記と同様に行なうことができ
る。
【００１７】また、本発明の部分ペプチドは、（ｉ）上
記アミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１
〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））の
アミノ酸が欠失し、（ｉｉ）上記アミノ酸配列に１また
は２個以上（好ましくは、１〜２０個程度、より好まし
くは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５
個））のアミノ酸が付加し、または（ｉｉｉ）上記アミ
ノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜１０
個程度、より好ましくは数個、さらに好ましくは１〜５
個程度）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されていても
よい。より具体的には、本発明の部分ペプチドとして
は、配列番号：１で表されるアミノ酸配列中、（i）Ｎ
末端から第１番目（Ｍｅｔ）〜第８５番目（Ａｓｐ）の
アミノ酸残基からなる部分アミノ酸配列もしくはその一
部、または（ii）Ｎ末端から第２２２番目（Ｃｙｓ）〜
第３２９番目（Ａｌａ）のアミノ酸残基からなる部分ア
ミノ酸配列もしくはその一部を含有するペプチドが挙げ
られる。また、本発明の部分ペプチドはＣ末端がカルボ
キシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ
-）、アミド（−ＣＯＮＨ2）またはエステル（−ＣＯＯ
Ｒ）であってもよい（Ｒは上記と同意義を示す）。本発
明の部分ペプチドがＣ末端以外にカルボキシル基（また
はカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル
基がアミド化またはエステル化されているものも本発明
の部分ペプチドに含まれる。この場合のエステルとして
は、例えば上記したＣ末端のエステルなどが用いられ
る。さらに、本発明の部分ペプチドには、上記した本発
明のレセプタータンパク質と同様に、Ｎ末端のメチオニ
ン残基のアミノ基が保護基で保護されているもの、Ｎ端
側が生体内で切断され生成したＧｌｎがピログルタミン
酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適
当な保護基で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合
したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含ま
れる。本発明のレセプタータンパク質またはその部分ペ
プチドの塩としては、酸または塩基との生理学的に許容
される塩が挙げられ、とりわけ生理学的に許容される酸
付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機
酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との
塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン
酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン
酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベ
ンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。
【００１８】配列番号：８で表わされるアミノ酸配列と
同一または実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペ
プチド（以下、本発明で用いられるポリペプチドと略記
することがある）は、ヒトや温血動物（例えば、モルモ
ット、ラット、マウス、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒツ
ジ、ウシ、サルなど）の細胞（例えば、網膜細胞、肝細
胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄
細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細
胞、上皮細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細
胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細
胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中
球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟
骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細
胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹
細胞もしくは癌細胞など）もしくはそれらの細胞が存在
するあらゆる組織、例えば、脳、脳の各部位（例、網
膜、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下
部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膵
臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副
腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血
管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾
丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋など、または
血球系の細胞もしくはその培養細胞（例えば、ＭＥＬ，
Ｍ１，ＣＴＬＬ−２，ＨＴ−２，ＷＥＨＩ−３，ＨＬ−
６０，ＪＯＳＫ−１，Ｋ５６２，ＭＬ−１，ＭＯＬＴ−
３，ＭＯＬＴ−４，ＭＯＬＴ−１０，ＣＣＲＦ−ＣＥ
Ｍ，ＴＡＬＬ−１，Ｊｕｒｋａｔ，ＣＣＲＴ−ＨＳＢ−
２，ＫＥ−３７，ＳＫＷ−３，ＨＵＴ−７８，ＨＵＴ−
１０２，Ｈ９，Ｕ９３７，ＴＨＰ−１，ＨＥＬ，ＪＫ−
１，ＣＭＫ，ＫＯ−８１２，ＭＥＧ−０１など）に由来
するポリペプチドであってもよく、合成ポリペプチドで
あってもよい。
【００１９】配列番号：８で表わされるアミノ酸配列と
実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：８で
表わされるアミノ酸配列と約９０％以上、好ましくは約
９５％以上、より好ましくは約９８％以上の相同性を有
するアミノ酸配列などがあげられる。特に、配列番号：
８で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸
配列としては、上記のアミノ酸配列の他、（ｉ） 配列
番号：８で表されるアミノ酸配列中の１〜５個（好まし
くは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、より好まし
くは、１個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（ｉ
ｉ） 配列番号：８で表されるアミノ酸配列に１〜５個
（好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、よ
り好ましくは、１個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配
列、（ｉｉｉ） 配列番号：８で表されるアミノ酸配列
に１〜５個（好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１
〜２個、より好ましくは、１個）のアミノ酸が挿入され
たアミノ酸配列、（ｉｖ） 配列番号：８で表されるア
ミノ酸配列中の１〜５個（好ましくは１〜３個、さらに
好ましくは１〜２個、より好ましくは、１個）のアミノ
酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、（ｖ）
上記（ｉ）〜（ｉｖ）を組み合わせたアミノ酸配列など
があげられる。配列番号：８で表わされるアミノ酸配列
と実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドと
しては、例えば、前記の配列番号：８で表わされるアミ
ノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列
番号：８で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプ
チドと実質的に同質の活性を有するポリペプチドなどが
好ましい。
【００２０】実質的に同質の活性としては、例えば、本
発明で用いられるポリペプチドの有する活性（例えば、
後述の疾患の予防・治療活性、レセプターとの結合活
性、レセプター発現細胞に対する細胞刺激活性（例え
ば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃ
ａ2+遊離、細胞内ｃＡＭＰ産生促進・抑制、細胞内ｃＧ
ＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、
細胞内タンパク質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐ
Ｈの低下、ＧＴＰγＳ結合活性などを促進する活性
等））などがあげられる。実質的に同質とは、それらの
活性が性質的に（例、生理化学的に、または薬理学的
に）同質であることを示す。
【００２１】配列番号：８で表されるアミノ酸配列と実
質的に同一のアミノ酸配列の具体例としては、例えば、
配列番号：１４、配列番号：９、配列番号：１２８、配
列番号：１２９、配列番号：１３０、配列番号：１３
１、配列番号：２４、配列番号：２５、配列番号：５
６、配列番号：５７、配列番号：７３、配列番号：７
４、配列番号：９１、配列番号：９２、配列番号：９
５、配列番号：９６、配列番号：９７、配列番号：９
８、配列番号：９９、配列番号：１００、配列番号：１
０１、配列番号：１０２、配列番号：１０３、配列番
号：１０４、配列番号：１０５、配列番号：１０６、配
列番号：１０７、配列番号：１０８、配列番号：１０
９、配列番号：１１０、配列番号：１１１、配列番号：
１１２または配列番号：１１３で表されるアミノ酸配列
などがあげられる。本発明で用いられるポリペプチドの
具体例としては、例えば、配列番号：８で表わされるア
ミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号：１４で表
されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号：
９で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列
番号：１２８で表されるアミノ酸配列を有するポリペプ
チド、配列番号：１２９で表されるアミノ酸配列を有す
るポリペプチド、配列番号：１３０で表されるアミノ酸
配列を有するポリペプチド、配列番号：１３１で表され
るアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号：２４
で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番
号：２５で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチ
ド、配列番号：５６で表されるアミノ酸配列を有するポ
リペプチド、配列番号：５７で表されるアミノ酸配列を
有するポリペプチド、配列番号：７３で表されるアミノ
酸配列を有するポリペプチド、配列番号：７４で表され
るアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号：９１
で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番
号：９２で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチ
ド、配列番号：９５で表されるアミノ酸配列を有するポ
リペプチド、配列番号：９６で表されるアミノ酸配列を
有するポリペプチド、配列番号：９７で表されるアミノ
酸配列を有するポリペプチド、配列番号：９８で表され
るアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号：９９
で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番
号：１００で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチ
ド、配列番号：１０１で表されるアミノ酸配列を有する
ポリペプチド、配列番号：１０２で表されるアミノ酸配
列を有するポリペプチド、配列番号：１０３で表される
アミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号：１０４
で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番
号：１０５で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチ
ド、配列番号：１０６で表されるアミノ酸配列を有する
ポリペプチド、配列番号：１０７で表されるアミノ酸配
列を有するポリペプチド、配列番号：１０８で表される
アミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号：１０９
で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番
号：１１０で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチ
ド、配列番号：１１１で表されるアミノ酸配列を有する
ポリペプチド、配列番号：１１２で表されるアミノ酸配
列を有するポリペプチドおよび配列番号：１１３で表さ
れるアミノ酸配列を有するポリペプチドなどの本発明の
レセプタータンパク質と特異的に結合する能力を有する
ポリペプチドがあげられる。該ポリペプチドは、さら
に、ヒトＧＰＲ８および（または）ＧＰＲ７とも特異的
に結合する能力を有していてもよく、好ましくはヒトＧ
ＰＲ８およびＧＰＲ７とも特異的に結合する能力を有す
る。
【００２２】また、本発明で用いられるポリペプチド
は、本発明のタンパク質との結合活性、該タンパク質発
現細胞に対する細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊
離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ2+遊離、細胞内ｃ
ＡＭＰ産生促進・抑制、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシト
ールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内タンパク質の
リン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下、ＧＴＰγ
Ｓ結合活性などを促進する活性等）等を有するポリペプ
チドのみならず、該結合活性または細胞刺激活性を有す
るポリペプチドの前駆体ポリペプチドをも包含する意味
で用いられる。該結合活性または細胞刺激活性を有する
ポリペプチドの前駆体ポリペプチドの具体例としては、
例えば、配列番号：２３で表されるアミノ酸配列と同一
もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを
特徴とするポリペプチド等があげられる。より、具体的
には、配列番号：２３で表わされるアミノ酸配列と実質
的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：２３で表
わされるアミノ酸配列と約８０％以上、好ましくは約９
０％以上、より好ましくは約９５％以上の相同性を有す
るアミノ酸配列などがあげられる。
【００２３】特に、配列番号：２３で表わされるアミノ
酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、上記の
アミノ酸配列の他、（ｉ） 配列番号：２３で表される
アミノ酸配列中の１〜１５個（好ましくは１〜１０個、
さらに好ましくは１〜５個、より好ましくは、１〜３
個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（ｉｉ） 配
列番号：２３で表されるアミノ酸配列に１〜１００個
（好ましくは１〜５０個、さらに好ましくは１〜５個、
より好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が付加したアミ
ノ酸配列、（ｉｉｉ） 配列番号：２３で表されるアミ
ノ酸配列に１〜１５個（好ましくは１〜１０個、さらに
好ましくは１〜５個、より好ましくは、１〜３個）のア
ミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、（ｉｖ） 配列番
号：２３で表されるアミノ酸配列中の１〜１５個（好ま
しくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、より好
ましくは、１〜３個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換
されたアミノ酸配列、（ｖ） 上記（ｉ）〜（ｉｖ）を
組み合わせたアミノ酸配列などがあげられる。配列番
号：２３で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミ
ノ酸配列の具体例としては、例えば、配列番号：４２、
配列番号：５５、配列番号：７２または配列番号：９０
で表されるアミノ酸配列などがあげられる。上記前駆体
ポリペプチドの具体例としては、例えば、配列番号：２
３で表わされるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配
列番号：４２で表されるアミノ酸配列を有するポリペプ
チド、配列番号：５５で表されるアミノ酸配列を有する
ポリペプチド、配列番号：７２で表されるアミノ酸配列
を有するポリペプチドおよび配列番号：９０で表される
アミノ酸配列を有するポリペプチドなどがあげられる。
本発明で用いられるポリペプチドがＣ末端以外にカルボ
キシル基（またはカルボキシレート）を有している場
合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されて
いるものも本発明で用いられるポリペプチドに含まれ
る。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末
端のエステルなどが用いられる。
【００２４】本発明で用いられるポリペプチドの塩とし
ては、酸または塩基との生理学的に許容される塩が挙げ
られ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好まし
い。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩
酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機
酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マ
レイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚
酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン
酸）との塩などが用いられる。本発明で用いられるポリ
ペプチドは、例えば、食欲（摂食）増進作用および（ま
たは）プロラクチン産生促進作用を有する。
【００２５】本発明のレセプタータンパク質またはその
塩は、上記したヒトやその他の哺乳動物の細胞または組
織から公知のレセプタータンパク質の精製方法によって
製造することもできるし、後に記載する本発明のレセプ
タータンパク質をコードするＤＮＡを含有する形質転換
体を培養することによっても製造することができる。ま
た、後に記載するタンパク質合成法またはこれに準じて
製造することもできる。ヒトやその他の哺乳動物の組織
または細胞から製造する場合、ヒトやその他の哺乳動物
の組織または細胞をホモジナイズした後、酸などで抽出
を行ない、得られた抽出液を逆相クロマトグラフィー、
イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィ
ーを組み合わせることにより精製単離することができ
る。本発明のレセプタータンパク質もしくはその部分ペ
プチドまたはそれらの塩またはそれらのアミド体の合成
には、通常市販のタンパク質合成用樹脂を用いることが
できる。そのような樹脂としては、例えば、クロロメチ
ル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン
樹脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジル
アルコール樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹
脂、ＰＡＭ樹脂、４−ヒドロキシメチルメチルフェニル
アセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４
−（２’，４’−ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチ
ル）フェノキシ樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフ
ェニル−Ｆｍｏｃアミノエチル）フェノキシ樹脂などを
挙げることができる。このような樹脂を用い、α−アミ
ノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的と
するタンパク質またはペプチドのアミノ酸配列通りに、
公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させる。反応
の最後に樹脂からタンパク質またはペプチドを切り出す
と同時に各種保護基を除去し、さらに高希釈溶液中で分
子内ジスルフィド結合形成反応を実施し、目的のタンパ
ク質もしくはペプチドまたはそれらのアミド体を取得す
る。上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、タンパク
質合成に使用できる各種活性化試薬を用いることができ
るが、特に、カルボジイミド類がよい。カルボジイミド
類としては、ＤＣＣ、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボ
ジイミド、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプ
ロリル）カルボジイミドなどが用いられる。これらによ
る活性化にはラセミ化抑制添加剤（例えば、ＨＯＢｔ、
ＨＯＯＢｔ）とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加す
るか、または、対称酸無水物またはＨＯＢｔエステルあ
るいはＨＯＯＢｔエステルとしてあらかじめ保護アミノ
酸の活性化を行なった後に樹脂に添加することができ
る。
【００２６】保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用
いられる溶媒としては、タンパク質縮合反応に使用しう
ることが知られている溶媒から適宜選択されうる。例え
ば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド，Ｎ，Ｎ−ジメチル
アセトアミド，Ｎ−メチルピロリドンなどの酸アミド
類、塩化メチレン，クロロホルムなどのハロゲン化炭化
水素類、トリフルオロエタノールなどのアルコール類、
ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ピリジ
ン，ジオキサン，テトラヒドロフランなどのエーテル
類、アセトニトリル，プロピオニトリルなどのニトリル
類、酢酸メチル，酢酸エチルなどのエステル類あるいは
これらの適宜の混合物などが用いられる。反応温度はタ
ンパク質結合形成反応に使用され得ることが知られてい
る範囲から適宜選択され、通常約−２０℃〜５０℃の範
囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は
通常１．５〜４倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応
を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基
の脱離を行うことなく縮合反応を繰り返すことにより十
分な縮合を行なうことができる。反応を繰り返しても十
分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセチ
ルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化す
ることができる。
【００２７】原料のアミノ基の保護基としては、例え
ば、Ｚ、Ｂｏｃ、ターシャリーペンチルオキシカルボニ
ル、イソボルニルオキシカルボニル、４−メトキシベン
ジルオキシカルボニル、Ｃｌ−Ｚ、Ｂｒ−Ｚ、アダマン
チルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロ
イル、ホルミル、２−ニトロフェニルスルフェニル、ジ
フェニルホスフィノチオイル、Ｆｍｏｃなどが用いられ
る。カルボキシル基は、例えば、アルキルエステル化
（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ターシ
ャリーブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シク
ロヘプチル、シクロオクチル、２−アダマンチルなどの
直鎖状、分枝状もしくは環状アルキルエステル化）、ア
ラルキルエステル化（例えば、ベンジルエステル、４−
ニトロベンジルエステル、４−メトキシベンジルエステ
ル、４−クロロベンジルエステル、ベンズヒドリルエス
テル化）、フェナシルエステル化、ベンジルオキシカル
ボニルヒドラジド化、ターシャリーブトキシカルボニル
ヒドラジド化、トリチルヒドラジド化などによって保護
することができる。セリンの水酸基は、例えば、エステ
ル化またはエーテル化によって保護することができる。
このエステル化に適する基としては、例えば、アセチル
基などの低級アルカノイル基、ベンゾイル基などのアロ
イル基、ベンジルオキシカルボニル基、エトキシカルボ
ニル基などの炭酸から誘導される基などが用いられる。
また、エーテル化に適する基としては、例えば、ベンジ
ル基、テトラヒドロピラニル基、ｔ−ブチル基などであ
る。チロシンのフェノール性水酸基の保護基としては、
例えば、Ｂｚｌ、Ｃｌ2−Ｂｚｌ、２−ニトロベンジ
ル、Ｂｒ−Ｚ、ターシャリーブチルなどが用いられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、例えば、
Ｔｏｓ、４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼ
ンスルホニル、ＤＮＰ、ベンジルオキシメチル、Ｂｕ
ｍ、Ｂｏｃ、Ｔｒｔ、Ｆｍｏｃなどが用いられる。
【００２８】原料のカルボキシル基の活性化されたもの
としては、例えば、対応する酸無水物、アジド、活性エ
ステル〔アルコール（例えば、ペンタクロロフェノー
ル、２，４，５−トリクロロフェノール、２，４−ジニ
トロフェノール、シアノメチルアルコール、パラニトロ
フェノール、ＨＯＮＢ、Ｎ−ヒドロキシスクシミド、Ｎ
−ヒドロキシフタルイミド、ＨＯＢｔ）とのエステル〕
などが用いられる。原料のアミノ基の活性化されたもの
としては、例えば、対応するリン酸アミドが用いられ
る。保護基の除去（脱離）方法としては、例えば、Ｐｄ
−黒あるいはＰｄ−炭素などの触媒の存在下での水素気
流中での接触還元や、また、無水フッ化水素、メタンス
ルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオ
ロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理や、ジ
イソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリ
ジン、ピペラジンなどによる塩基処理、また液体アンモ
ニア中ナトリウムによる還元なども用いられる。上記酸
処理による脱離反応は、一般に約−２０℃〜４０℃の温
度で行なわれるが、酸処理においては、例えば、アニソ
ール、フェノール、チオアニソール、メタクレゾール、
パラクレゾール、ジメチルスルフィド、１，４−ブタン
ジチオール、１，２−エタンジチオールなどのようなカ
チオン捕捉剤の添加が有効である。また、ヒスチジンの
イミダゾール保護基として用いられる２，４−ジニトロ
フェニル基はチオフェノール処理により除去され、トリ
プトファンのインドール保護基として用いられるホルミ
ル基は上記の１，２−エタンジチオール、１，４−ブタ
ンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外
に、希水酸化ナトリウム溶液、希アンモニアなどによる
アルカリ処理によっても除去される。
【００２９】原料の反応に関与すべきでない官能基の保
護ならびに保護基、およびその保護基の脱離、反応に関
与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段
から適宜選択しうる。タンパク質のアミド体を得る別の
方法としては、例えば、まず、カルボキシ末端アミノ酸
のα−カルボキシル基をアミド化して保護した後、アミ
ノ基側にペプチド（タンパク質）鎖を所望の鎖長まで延
ばした後、該ペプチド鎖のＮ末端のα−アミノ基の保護
基のみを除いたタンパク質とＣ末端のカルボキシル基の
保護基のみを除去したタンパク質とを製造し、この両タ
ンパク質を上記したような混合溶媒中で縮合させる。縮
合反応の詳細については上記と同様である。縮合により
得られた保護タンパク質を精製した後、上記方法により
すべての保護基を除去し、所望の粗タンパク質を得るこ
とができる。この粗タンパク質は既知の各種精製手段を
駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥することで所望の
タンパク質のアミド体を得ることができる。タンパク質
のエステル体を得るには、例えば、カルボキシ末端アミ
ノ酸のα−カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合
しアミノ酸エステルとした後、タンパク質のアミド体と
同様にして、所望のタンパク質のエステル体を得ること
ができる。
【００３０】本発明のタンパク質の部分ペプチドまたは
その塩は、公知のペプチドの合成法に従って、あるいは
本発明のタンパク質を適当なペプチダーゼで切断するこ
とによって製造することができる。ペプチドの合成法と
しては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによ
っても良い。すなわち、本発明のタンパク質を構成し得
る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合さ
せ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離するこ
とにより目的のペプチドを製造することができる。公知
の縮合方法や保護基の脱離としては、例えば、以下の
（i）〜（v）に記載された方法が挙げられる。 （i）M. Bodanszky および M.A. Ondetti、ペプチド シ
ンセシス (Peptide Synthesis), Interscience Publish
ers, New York (1966年) （ii）SchroederおよびLuebke、ザ ペプチド(The Pepti
de), Academic Press,New York (1965年) （iii）泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、 丸善
(株) （1975年） （iv）矢島治明 および榊原俊平、生化学実験講座 1、
タンパク質の化学IV、205、(1977年) （v）矢島治明監修、続医薬品の開発 第14巻 ペプチド
合成 広川書店 また、反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出・蒸留
・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー
・再結晶などを組み合わせて本発明の部分ペプチドを精
製単離することができる。上記方法で得られる部分ペプ
チドが遊離体である場合は、公知の方法によって適当な
塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合
は、公知の方法によって遊離体に変換することができ
る。本発明で用いられるポリペプチドも、上記の方法に
準じて製造できる。
【００３１】本発明のレセプタータンパク質をコードす
るポリヌクレオチドとしては、上記した本発明のレセプ
タータンパク質をコードする塩基配列（ＤＮＡまたはＲ
ＮＡ、好ましくはＤＮＡ）を含有するものであればいか
なるものであってもよい。該ポリヌクレオチドとして
は、本発明のレセプタータンパク質をコードするＤＮ
Ａ、ｍＲＮＡ等のＲＮＡであり、二本鎖であっても、一
本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、二本鎖ＤＮＡ、
二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ：ＲＮＡのハイブリッドでも
よい。一本鎖の場合は、センス鎖（すなわち、コード
鎖）であっても、アンチセンス鎖（すなわち、非コード
鎖）であってもよい。本発明のレセプタータンパク質を
コードするポリヌクレオチドを用いて、例えば、公知の
実験医学増刊「新ＰＣＲとその応用」１５（７）、１９
９７記載の方法またはそれに準じた方法により、本発明
のレセプタータンパク質のｍＲＮＡを定量することがで
きる。本発明のレセプタータンパク質をコードするＤＮ
Ａとしては、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリ
ー、上記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、上記した細胞
・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいず
れでもよい。ライブラリーに使用するベクターは、バク
テリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミド
などいずれであってもよい。また、上記した細胞・組織
よりｔｏｔａｌＲＮＡまたはｍＲＮＡ画分を調製したも
のを用いて直接Reverse Transcriptase Polymerase Cha
in Reaction（以下、ＲＴ−ＰＣＲ法と略称する）によ
って増幅することもできる。具体的には、本発明のレセ
プタータンパク質をコードするＤＮＡとしては、例え
ば、（１）配列番号：２で表される塩基配列を含有する
ＤＮＡ、または配列番号：２で表される塩基配列を有す
るＤＮＡとハイストリンジェントな条件下でハイブリダ
イズするＤＮＡを有し、本発明のレセプタータンパク質
と実質的に同質の活性（例、リガンド結合活性、シグナ
ル情報伝達作用など）を有するレセプタータンパク質を
コードするＤＮＡ、または（２）配列番号：１３９で表
される塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：１
３９で表される塩基配列を含有するＤＮＡとハイストリ
ンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを有
し、本発明のレセプタータンパク質と実質的に同質の活
性（例、リガンド結合活性、シグナル情報伝達作用な
ど）を有するレセプタータンパク質をコードするＤＮＡ
であれば何れのものでもよい。配列番号：２または配列
番号：１３９で表される塩基配列を含有するＤＮＡとハ
イストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮ
Ａとしては、例えば、配列番号：２または配列番号：１
３９で表される塩基配列と８５％以上、好ましくは約９
０％以上、より好ましくは約９５％以上の相同性を有す
る塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
【００３２】ハイブリダイゼーションは、公知の方法あ
るいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クロ
ーニング（Molecular Cloning）２ｎｄ（J. Sambrook e
t al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載
の方法などに従って行なうことができる。また、市販の
ライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載
の方法に従って行なうことができる。より好ましくは、
ハイストリンジェントな条件に従って行なうことができ
る。該ハイストリンジェントな条件とは、例えば、ナト
リウム濃度が約１９〜４０ｍＭ、好ましくは約１９〜２
０ｍＭで、温度が約５０〜７０℃、好ましくは約６０〜
６５℃の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が約１９ｍ
Ｍで温度が約６５℃の場合が最も好ましい。より具体的
には、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含有する
レセプタータンパク質をコードするＤＮＡとしては、配
列番号：２で表される塩基配列を含有するＤＮＡなど
が、配列番号：１３８で表されるアミノ酸配列を含有す
るレセプタータンパク質をコードするＤＮＡとしては、
配列番号：１３９で表される塩基配列を含有するＤＮＡ
などが用いられる。本発明のレセプタータンパク質をコ
ードするＤＮＡの塩基配列の一部、または該ＤＮＡと相
補的な塩基配列の一部を含有してなるポリヌクレオチド
とは、下記の本発明の部分ペプチドをコードするＤＮＡ
を包含するだけではなく、ＲＮＡをも包含する意味で用
いられる。本発明に従えば、Ｇタンパク質共役型レセプ
タータンパク質遺伝子の複製または発現を阻害すること
のできるアンチセンス・ポリヌクレオチド（核酸）を、
クローン化した、あるいは決定されたＧタンパク質共役
型レセプタータンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列
情報に基づき設計し、合成しうる。そうしたポリヌクレ
オチド（核酸）は、Ｇタンパク質共役型レセプタータン
パク質遺伝子のＲＮＡとハイブリダイズすることがで
き、該ＲＮＡの合成または機能を阻害することができる
か、あるいはＧタンパク質共役型レセプタータンパク質
関連ＲＮＡとの相互作用を介してＧタンパク質共役型レ
セプタータンパク質遺伝子の発現を調節・制御すること
ができる。Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質関
連ＲＮＡの選択された配列に相補的なポリヌクレオチ
ド、およびＧタンパク質共役型レセプタータンパク質関
連ＲＮＡと特異的にハイブリダイズすることができるポ
リヌクレオチドは、生体内および生体外でＧタンパク質
共役型レセプタータンパク質遺伝子の発現を調節・制御
するのに有用であり、また病気などの治療または診断に
有用である。用語「対応する」とは、遺伝子を含めたヌ
クレオチド、塩基配列または核酸の特定の配列に相同性
を有するあるいは相補的であることを意味する。ヌクレ
オチド、塩基配列または核酸とペプチド（タンパク質）
との間で「対応する」とは、ヌクレオチド（核酸）の配
列またはその相補体から誘導される指令にあるペプチド
（タンパク質）のアミノ酸を通常指している。Ｇタンパ
ク質共役型レセプタータンパク質遺伝子の５’端ヘアピ
ンループ、５’端６−ベースペア・リピート、５’端非
翻訳領域、ポリペプチド翻訳開始コドン、タンパク質コ
ード領域、ＯＲＦ翻訳開始コドン、３’端非翻訳領域、
３’端パリンドローム領域、および３’端ヘアピンルー
プは好ましい対象領域として選択しうるが、Ｇタンパク
質共役型レセプタータンパク質遺伝子内の如何なる領域
も対象として選択しうる。
【００３３】目的核酸と、対象領域の少なくとも一部に
相補的なポリヌクレオチドとの関係、すなわち対象物と
ハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドとの
関係は、「アンチセンス」であるということができる。
アンチセンス・ポリヌクレオチドは、２−デオキシ−Ｄ
−リボースを含有しているポリデオキシヌクレオチド、
Ｄ−リボースを含有しているポリヌクレオチド、プリン
またはピリミジン塩基のＮ−グリコシドであるその他の
タイプのポリヌクレオチド、あるいは非ヌクレオチド骨
格を有するその他のポリマー（例えば、市販のタンパク
質核酸および合成配列特異的な核酸ポリマー）または特
殊な結合を含有するその他のポリマー（但し、該ポリマ
ーはＤＮＡやＲＮＡ中に見出されるような塩基のペアリ
ングや塩基の付着を許容する配置をもつヌクレオチドを
含有する）などが挙げられる。それらは、二本鎖ＤＮ
Ａ、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、さら
にＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドであることができ、さら
に非修飾ポリヌクレオチド（または非修飾オリゴヌクレ
オチド）、さらには公知の修飾の付加されたもの、例え
ば当該分野で知られた標識のあるもの、キャップの付い
たもの、メチル化されたもの、１個以上の天然のヌクレ
オチドを類縁物で置換したもの、分子内ヌクレオチド修
飾のされたもの、例えば非荷電結合（例えば、メチルホ
スホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデー
ト、カルバメートなど）を持つもの、電荷を有する結合
または硫黄含有結合（例えば、ホスホロチオエート、ホ
スホロジチオエートなど）を持つもの、例えばタンパク
質（ヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ・インヒビター、トキ
シン、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジンな
ど）や糖（例えば、モノサッカライドなど）などの側鎖
基を有しているもの、インターカレート化合物（例え
ば、アクリジン、ソラレンなど）を持つもの、キレート
化合物（例えば、金属、放射活性をもつ金属、ホウ素、
酸化性の金属など）を含有するもの、アルキル化剤を含
有するもの、修飾された結合を持つもの（例えば、αア
ノマー型の核酸など）であってもよい。ここで「ヌクレ
オシド」、「ヌクレオチド」および「核酸」とは、プリ
ンおよびピリミジン塩基を含有するのみでなく、修飾さ
れたその他の複素環型塩基をもつようなものを含んでい
て良い。こうした修飾物は、メチル化されたプリンおよ
びピリミジン、アシル化されたプリンおよびピリミジ
ン、あるいはその他の複素環を含むものであってよい。
修飾されたヌクレオチドおよび修飾されたヌクレオチド
はまた糖部分が修飾されていてよく、例えば、１個以上
の水酸基がハロゲンとか、脂肪族基などで置換されてい
たり、あるいはエーテル、アミンなどの官能基に変換さ
れていてよい。
【００３４】本発明のアンチセンス・ポリヌクレオチド
（核酸）は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、あるいは修飾された核酸
（ＲＮＡ、ＤＮＡ）である。修飾された核酸の具体例と
しては核酸の硫黄誘導体やチオホスフェート誘導体、そ
してポリヌクレオシドアミドやオリゴヌクレオシドアミ
ドの分解に抵抗性のものが挙げられるが、それに限定さ
れるものではない。本発明のアンチセンス核酸は次のよ
うな方針で好ましく設計されうる。すなわち、細胞内で
のアンチセンス核酸をより安定なものにする、アンチセ
ンス核酸の細胞透過性をより高める、目標とするセンス
鎖に対する親和性をより大きなものにする、そしてもし
毒性があるならアンチセンス核酸の毒性をより小さなも
のにする。こうした修飾は当該分野で数多く知られてお
り、例えば J. Kawakami et al.,Pharm Tech Japan, Vo
l. 8, pp.247, 1992; Vol. 8, pp.395, 1992; S. T. Cr
ooke et al. ed., Antisense Research and Applicatio
ns, CRC Press, 1993 などに開示がある。本発明のアン
チセンス核酸は、変化せしめられたり、修飾された糖、
塩基、結合を含有していて良く、リポゾーム、ミクロス
フェアのような特殊な形態で供与されたり、遺伝子治療
により適用されたり、付加された形態で与えられること
ができうる。こうして付加形態で用いられるものとして
は、リン酸基骨格の電荷を中和するように働くポリリジ
ンのようなポリカチオン体、細胞膜との相互作用を高め
たり、核酸の取込みを増大せしめるような脂質（例え
ば、ホスホリピド、コレステロールなど）といった疎水
性のものが挙げられる。付加するに好ましい脂質として
は、コレステロールやその誘導体（例えば、コレステリ
ルクロロホルメート、コール酸など）が挙げられる。こ
うしたものは、核酸の３’端あるいは５’端に付着させ
ることができ、塩基、糖、分子内ヌクレオシド結合を介
して付着させることができうる。その他の基としては、
核酸の３’端あるいは５’端に特異的に配置されたキャ
ップ用の基で、エキソヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅなどの
ヌクレアーゼによる分解を阻止するためのものが挙げら
れる。こうしたキャップ用の基としては、ポリエチレン
グリコール、テトラエチレングリコールなどのグリコー
ルをはじめとした当該分野で知られた水酸基の保護基が
挙げられるが、それに限定されるものではない。アンチ
センス核酸の阻害活性は、本発明の形質転換体、本発明
の生体内や生体外の遺伝子発現系、あるいはＧタンパク
質共役型レセプタータンパク質の生体内や生体外の翻訳
系を用いて調べることができる。該核酸は公知の各種の
方法で細胞に適用できる。
【００３５】本発明の部分ペプチドをコードするＤＮＡ
としては、上記した本発明の部分ペプチドをコードする
塩基配列を含有するものであればいかなるものであって
もよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリ
ー、上記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、上記した細胞
・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいず
れでもよい。ライブラリーに使用するベクターは、バク
テリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミド
などいずれであってもよい。また、上記した細胞・組織
よりｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接ＲＴ−Ｐ
ＣＲ法によって増幅することもできる。具体的には、本
発明の部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例え
ば、（１）配列番号：２または配列番号：１３９で表さ
れる塩基配列を含有するＤＮＡの部分塩基配列を有する
ＤＮＡ、または（２）配列番号：２または配列番号：１
３９で表される塩基配列を含有するＤＮＡとハイストリ
ンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを有
し、本発明のタンパク質ペプチドと実質的に同質の活性
（例、リガンド結合活性、シグナル情報伝達作用など）
を有するタンパク質をコードするＤＮＡの部分塩基配列
を有するＤＮＡなどが用いられる。配列番号：２または
配列番号：１３９で表される塩基配列を含有するＤＮＡ
とハイストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤ
ＮＡとしては、例えば、配列番号：２で表される塩基配
列と８５％以上、好ましくは約９０％以上、より好まし
くは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有する
ＤＮＡなどが用いられる。より具体的には、本発明の部
分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：１
で表されるアミノ酸配列中、（i）Ｎ末端から第１番目
（Ｍｅｔ）〜第８５番目（Ａｓｐ）のアミノ酸残基から
なる部分アミノ酸配列をコードする塩基配列（例、配列
番号：２で表される塩基配列中、５’末端から第１番目
〜第２５５番目の塩基配列）もしくはその一部、または
（ii）Ｎ末端から第２２２番目（Ｃｙｓ）〜第３２９番
目（Ａｌａ）のアミノ酸残基からなる部分アミノ酸配列
をコードする塩基配列（例、配列番号：２で表される塩
基配列中、５’末端から第６６４番目〜第９８７番目の
塩基配列）もしくはその一部を含有するペプチドをコー
ドするＤＮＡが挙げられる。
【００３６】本発明で用いられるポリペプチドをコード
するＤＮＡとしては、例えば（i）配列番号：１２６、
配列番号：１２７、配列番号：２６、配列番号：２７、
配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配
列番号：３１、配列番号：５８、配列番号：５９、配列
番号：７５、配列番号：７６、配列番号：９３、配列番
号：９４、配列番号：１１４、配列番号：１１５、配列
番号：１１６、配列番号：１１７、配列番号：１１８、
配列番号：１１９、配列番号：１２０、配列番号：１２
１、配列番号：１２２、配列番号：１２３、配列番号：
１２４または配列番号：１２５で表わされる塩基配列を
含有するＤＮＡ、または（ii）配列番号：１２６、配列
番号：１２７、配列番号：２６、配列番号：２７、配列
番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番
号：３１、配列番号：５８、配列番号：５９、配列番
号：７５、配列番号：７６、配列番号：９３、配列番
号：９４、配列番号：１１４、配列番号：１１５、配列
番号：１１６、配列番号：１１７、配列番号：１１８、
配列番号：１１９、配列番号：１２０、配列番号：１２
１、配列番号：１２２、配列番号：１２３、配列番号：
１２４または配列番号：１２５で表わされる塩基配列と
ハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩
基配列を含有し、本発明で用いられるポリペプチドと実
質的に同質の活性を有するポリペプチドをコードするＤ
ＮＡ、（iii）配列番号：２２、配列番号：４１、配列
番号：５４、配列番号：７１または配列番号：８９で表
わされる塩基配列を含有するＤＮＡ、または（iv）配列
番号：２２、配列番号：４１、配列番号：５４、配列番
号：７１または配列番号：８９で表わされる塩基配列と
ハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩
基配列を含有するＤＮＡなどであれば何れのものでもよ
い。
【００３７】配列番号：１２６、配列番号：１２７、配
列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列
番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番
号：５８、配列番号：５９、配列番号：７５、配列番
号：７６、配列番号：９３、配列番号：９４、配列番
号：１１４、配列番号：１１５、配列番号：１１６、配
列番号：１１７、配列番号：１１８、配列番号：１１
９、配列番号：１２０、配列番号：１２１、配列番号：
１２２、配列番号：１２３、配列番号：１２４または配
列番号：１２５、または配列番号：２２、配列番号：４
１、配列番号：５４、配列番号：７１または配列番号：
８９で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条
件下でハイブリダイズできる塩基配列を含有するＤＮＡ
としては、例えば、それぞれ配列番号：１２６、配列番
号：１２７、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番
号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番
号：３１、配列番号：５８、配列番号：５９、配列番
号：７５、配列番号：７６、配列番号：９３、配列番
号：９４、配列番号：１１４、配列番号：１１５、配列
番号：１１６、配列番号：１１７、配列番号：１１８、
配列番号：１１９、配列番号：１２０、配列番号：１２
１、配列番号：１２２、配列番号：１２３、配列番号：
１２４または配列番号：１２５、または配列番号：２
２、配列番号：４１、配列番号：５４、配列番号：７１
または配列番号：８９で表わされる塩基配列と約７０％
以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０
％以上、さらに好ましくは約９５％以上の相同性を有す
る塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
【００３８】ハイブリダイゼーションは、公知の方法あ
るいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クロ
ーニング（Molecular Cloning）２nd（J. Sambrook et
al.,Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の
方法などに従って行なうことができる。また、市販のラ
イブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の
方法に従って行なうことができる。より好ましくは、ハ
イストリンジェントな条件に従って行なうことができ
る。ハイストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリ
ウム濃度が約１９〜４０ｍＭ、好ましくは約１９〜２０
ｍＭで、温度が約５０〜７０℃、好ましくは約６０〜６
５℃の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が約１９ｍＭ
で温度が約６５℃の場合が最も好ましい。
【００３９】より具体的には、(i) 配列番号：８で表わ
されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードす
るＤＮＡとしては、配列番号：１２６で表わされる塩基
配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、(ii) 配列番
号：９で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチ
ドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：１２７で表
わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、(i
ii) 配列番号：１２８で表わされるアミノ酸配列を含有
するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番
号：２６で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが
用いられ、(iv) 配列番号：１２９で表わされるアミノ
酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとし
ては、配列番号：２７で表わされる塩基配列を含有する
ＤＮＡなどが用いられ、(v) 配列番号：１３０で表わさ
れるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードする
ＤＮＡとしては、配列番号：２８で表わされる塩基配列
を含有するＤＮＡなどが用いられ、(vi) 配列番号：１
３１で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチド
をコードするＤＮＡとしては、配列番号：２９で表わさ
れる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、(vii)
配列番号：２４で表わされるアミノ酸配列を含有するポ
リペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：３
０で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いら
れ、(viii) 配列番号：２５で表わされるアミノ酸配列
を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、
配列番号：３１で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡ
などが用いられ、(ix) 配列番号：５６で表わされるア
ミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
としては、配列番号：５８で表わされる塩基配列を含有
するＤＮＡなどが用いられ、(x) 配列番号：５７で表わ
されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードす
るＤＮＡとしては、配列番号：５９で表わされる塩基配
列を含有するＤＮＡなどが用いられ、(xi) 配列番号：
７３で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチド
をコードするＤＮＡとしては、配列番号：７５で表わさ
れる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、(xii)
配列番号：７４で表わされるアミノ酸配列を含有するポ
リペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：７
６で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いら
れ、(xiii) 配列番号：９１で表わされるアミノ酸配列
を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、
配列番号：９３で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡ
などが用いられ、(xiv) 配列番号：９２で表わされるア
ミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
としては、配列番号：９４で表わされる塩基配列を含有
するＤＮＡなどが用いられ、(xv) 配列番号：９５で表
わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコード
するＤＮＡとしては、配列番号：１２６で表わされる塩
基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、(xvi) 配列番
号：９６で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプ
チドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：１１４で
表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
(xvii) 配列番号：９７で表わされるアミノ酸配列を含
有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列
番号：１１５で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡな
どが用いられ、(xviii) 配列番号：９８で表わされるア
ミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
としては、配列番号：１１６で表わされる塩基配列を含
有するＤＮＡなどが用いられ、(xix) 配列番号：９９で
表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコー
ドするＤＮＡとしては、配列番号：１１７で表わされる
塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、(xx) 配列
番号：１００で表わされるアミノ酸配列を含有するポリ
ペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：１１
８で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いら
れ、(xxi) 配列番号：１０１で表わされるアミノ酸配列
を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、
配列番号：１１９で表わされる塩基配列を含有するＤＮ
Ａなどが用いられ、(xxii) 配列番号：１０２で表わさ
れるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードする
ＤＮＡとしては、配列番号：１２０で表わされる塩基配
列を含有するＤＮＡなどが用いられ、(xxiii) 配列番
号：１０３で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペ
プチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：５８で
表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
(xxiv) 配列番号：１０４で表わされるアミノ酸配列を
含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配
列番号：７５で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡな
どが用いられ、(xxv) 配列番号：１０５で表わされるア
ミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
としては、配列番号：１２６で表わされる塩基配列を含
有するＤＮＡなどが用いられ、(xxvi) 配列番号：１０
６で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドを
コードするＤＮＡとしては、配列番号：１２６で表わさ
れる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、(xxvi
i) 配列番号：１０７で表わされるアミノ酸配列を含有
するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番
号：１２１で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなど
が用いられ、(xxviii) 配列番号：１０８で表わされる
アミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮ
Ａとしては、配列番号：１２２で表わされる塩基配列を
含有するＤＮＡなどが用いられ、(xxix) 配列番号：１
０９で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチド
をコードするＤＮＡとしては、配列番号：１２３で表わ
される塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、(xx
x) 配列番号：１１０で表わされるアミノ酸配列を含有
するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番
号：１２４で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなど
が用いられ、(xxxi) 配列番号：１４で表わされるアミ
ノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡと
しては、配列番号：１２５で表わされる塩基配列を含有
するＤＮＡなどが用いられ、(xxxii) 配列番号：１１１
で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコ
ードするＤＮＡとしては、配列番号：１２１で表わされ
る塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、(xxxiii)
配列番号：１１２で表わされるアミノ酸配列を含有す
るポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番
号：１２６で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなど
が用いられ、(xxxiv) 配列番号：１１３で表わされるア
ミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
としては、配列番号：１２１で表わされる塩基配列を含
有するＤＮＡなどが用いられる。上記レセプタータンパ
ク質またはポリペプチドをコードするＤＮＡは、公知の
方法で標識化されていてもよく、具体的にはアイソトー
プラベル化されたもの、蛍光標識されたもの（例えば、
フルオレセインなどによる蛍光標識）、ビオチン化され
たものまたは酵素標識されたものなどがあげられる。
【００４０】本発明のレセプタータンパク質またはその
部分ペプチド（以下、本発明のレセプタータンパク質と
略記する場合がある）を完全にコードするＤＮＡのクロ
ーニングの手段としては、本発明のペプチドをコードす
るＤＮＡの塩基配列の部分塩基配列を有する合成ＤＮＡ
プライマーを用いてＰＣＲ法によって増幅するか、また
は適当なベクターに組み込んだＤＮＡを本発明のレセプ
タータンパク質の一部あるいは全領域をコードするＤＮ
Ａ断片もしくは合成ＤＮＡを用いて標識したものとのハ
イブリダイゼーションによって選別することができる。
ハイブリダイゼーションの方法は、例えば、モレキュラ
ー・クローニング（Molecular Cloning）２ｎｄ（J. Sa
mbrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 198
9）に記載の方法などに従って行なうことができる。ま
た、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説
明書に記載の方法に従って行なうことができる。
【００４１】ＤＮＡの塩基配列の変換は、ＰＣＲや公知
のキット、例えば、ＭｕｔａｎTM−ｓｕｐｅｒ Ｅｘｐ
ｒｅｓｓ Ｋｍ（宝酒造（株））、ＭｕｔａｎTM−Ｋ
（宝酒造（株））等を用いて、ＯＤＡ−ＬＡ ＰＣＲ法
やＧａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ法やＫｕｎｋｅｌ法等の
公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って行なう
ことができる。クローン化されたレセプタータンパク質
をコードするＤＮＡは目的によりそのまま、または所望
により制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりし
て使用することができる。該ＤＮＡはその５’末端側に
翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側
には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡ
Ｇを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳
終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付
加することもできる。本発明のレセプタータンパク質の
発現ベクターは、例えば、（イ）本発明のレセプタータ
ンパク質をコードするＤＮＡを含有するＤＮＡ（例えば
ｃＤＮＡ）から目的とするＤＮＡ断片を切り出し、
（ロ）該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモー
ターの下流に連結することにより製造することができ
る。
【００４２】ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミ
ド（例、ｐＣＲ４、ｐＣＲ２．１、ｐＢＲ３２２、ｐＢ
Ｒ３２５、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３）、枯草菌由来のプ
ラスミド（例、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９
４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９、ｐＳＨ１
５）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウ
イルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルスなどの
動物ウイルスなどの他、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲ
ｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏな
どが用いられる。本発明で用いられるプロモーターとし
ては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロ
モーターであればいかなるものでもよい。例えば、動物
細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、
ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプ
ロモーター、ＨＳＶ−ＴＫプロモーターなどが挙げられ
る。これらのうち、ＣＭＶプロモーター、ＳＲαプロモ
ーターなどを用いるのが好ましい。宿主がエシェリヒア
属菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモ
ーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰLプロモーター、
ｌｐｐプロモーターなどが、宿主がバチルス属菌である
場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモータ
ー、ｐｅｎＰプロモーターなど、宿主が酵母である場合
は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡ
Ｐプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。
宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモータ
ー、Ｐ１０プロモーターなどが好ましい。発現ベクター
には、以上の他に、所望によりエンハンサー、スプライ
シングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、
ＳＶ４０複製オリジン（以下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称す
る場合がある）などを含有しているものを用いることが
できる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸
還元酵素（以下、ｄｈｆｒと略称する場合がある）遺伝
子〔メソトレキセート（ＭＴＸ）耐性〕、アンピシリン
耐性遺伝子（以下、Ａｍｐrと略称する場合がある）、
ネオマイシン耐性遺伝子（以下、Ｎｅｏrと略称する場
合がある、Ｇ４１８耐性）等が挙げられる。特に、ＣＨ
Ｏ（ｄｈｆｒ-）細胞を用いてｄｈｆｒ遺伝子を選択マ
ーカーとして使用する場合、目的遺伝子をチミジンを含
まない培地によっても選択できる。また、必要に応じ
て、宿主に合ったシグナル配列を、本発明のレセプター
タンパク質のＮ端末側に付加する。宿主がエシェリヒア
属菌である場合は、ＰｈｏＡ・シグナル配列、ＯｍｐＡ
・シグナル配列などが、宿主がバチルス属菌である場合
は、α−アミラーゼ・シグナル配列、サブチリシン・シ
グナル配列などが、宿主が酵母である場合は、ＭＦα・
シグナル配列、ＳＵＣ２・シグナル配列など、宿主が動
物細胞である場合には、インシュリン・シグナル配列、
α−インターフェロン・シグナル配列、抗体分子・シグ
ナル配列などがそれぞれ利用できる。このようにして構
築された本発明のレセプタータンパク質をコードするＤ
ＮＡを含有するベクターを用いて、形質転換体を製造す
ることができる。宿主としては、例えば、エシェリヒア
属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞
などが用いられる。エシェリヒア属菌の具体例として
は、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）Ｋ１２・
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・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），
８７巻，４６４５−４６４９(１９９０)〕などが用いら
れる。バチルス属菌としては、例えば、バチルス・ズブ
チルス（Bacillus subtilis）ＭＩ１１４〔ジーン，２
４巻，２５５(１９８３)〕，２０７−２１〔ジャーナル
・オブ・バイオケミストリー（Journal of Biochemistr
y），９５巻，８７(１９８４)〕などが用いられる。酵
母としては、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ
（Saccharomyces cerevisiae）ＡＨ２２，ＡＨ２２
Ｒ-，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ、２０Ｂ−１
２、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomy
ces pombe）ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹＣ２０３６、ピ
キア・パストリス（Pichia pastoris）などが用いられ
る。
【００４３】昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡ
ｃＮＰＶの場合は、ヨトウガの幼虫由来株化細胞（Spod
optera frugiperda cell；Ｓｆ細胞）、Trichoplusia n
iの中腸由来のＭＧ１細胞、Trichoplusia niの卵由来の
High FiveTM 細胞、Mamestra brassicae由来の細胞また
はEstigmena acrea由来の細胞などが用いられる。ウイ
ルスがＢｍＮＰＶの場合は、カイコ由来株化細胞（Bomb
yx mori N；ＢｍＮ細胞）などが用いられる。該Ｓｆ細
胞としては、例えば、Ｓｆ９細胞（ATCC CRL1711）、Ｓ
ｆ２１細胞（以上、Vaughn, J.L.ら、イン・ヴィボ（In
Vivo）,13, 213-217,(1977)）などが用いられる。昆虫
としては、例えば、カイコの幼虫などが用いられる〔前
田ら、ネイチャー（Nature），３１５巻，５９２(１９
８５)〕。動物細胞としては、例えば、サル細胞ＣＯＳ
−７，Ｖｅｒｏ，チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ
（以下、ＣＨＯ細胞と略記）、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャ
イニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆ
ｒ-）細胞と略記）、マウスＬ細胞，マウスＡｔＴ−２
０、マウスミエローマ細胞、ラットＧＨ３、ヒトＦＬ細
胞などが用いられる。エシェリヒア属菌を形質転換する
には、例えば、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナ
ル・アカデミー・オブ・サイエンジイズ・オブ・ザ・ユ
ーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），６９巻，
２１１０(１９７２)やジーン（Gene），１７巻，１０７
(１９８２)などに記載の方法に従って行なうことができ
る。バチルス属菌を形質転換するには、例えば、モレキ
ュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Mole
cular ＆ General Genetics），１６８巻，１１１(１９
７９)などに記載の方法に従って行なうことができる。
酵母を形質転換するには、例えば、メッソズ・イン・エ
ンザイモロジー（Methods in Enzymology），１９４
巻，１８２−１８７（１９９１）、プロシージングズ・
オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシ
イズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA），７５巻，１９２９(１９７８）などに記載の
方法に従って行なうことができる。昆虫細胞または昆虫
を形質転換するには、例えば、バイオ／テクノロジー
（Bio/Technology）, 6, 47-55(1988)などに記載の方法
に従って行なうことができる。動物細胞を形質転換する
には、例えば、細胞工学別冊８新細胞工学実験プロトコ
ール．２６３−２６７（１９９５）（秀潤社発行）、ヴ
ィロロジー（Virology），５２巻，４５６(１９７３)に
記載の方法に従って行なうことができる。このようにし
て、Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質をコード
するＤＮＡを含有する発現ベクターで形質転換された形
質転換体が得られる。宿主がエシェリヒア属菌、バチル
ス属菌である形質転換体を培養する際、培養に使用され
る培地としては液体培地が適当であり、その中には該形
質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他
が含有せしめられる。炭素源としては、例えば、グルコ
ース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源
としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コー
ンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、
大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、
無機物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水
素ナトリウム、塩化マグネシウムなどが挙げられる。ま
た、酵母エキス、ビタミン類、生長促進因子などを添加
してもよい。培地のｐＨは約５〜８が望ましい。エシェ
リヒア属菌を培養する際の培地としては、例えば、グル
コース、カザミノ酸を含むＭ９培地〔ミラー（Mille
r），ジャーナル・オブ・エクスペリメンツ・イン・モ
レキュラー・ジェネティックス（Journal of Experimen
ts in Molecular Genetics），４３１−４３３，Cold S
pring Harbor Laboratory, New York１９７２〕が好ま
しい。ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせ
るために、例えば、３β−インドリルアクリル酸のよう
な薬剤を加えることができる。宿主がエシェリヒア属菌
の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行
ない、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約３０〜４０℃
で約６〜２４時間行ない、必要により通気や撹拌を加え
ることもできる。宿主が酵母である形質転換体を培養す
る際、培地としては、例えば、バークホールダー（Burk
holder）最小培地〔Bostian, K. L. ら、プロシージン
グズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイ
エンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Ac
ad. Sci. USA），７７巻，４５０５(１９８０)〕や０.
５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地〔Bitter, G. A.
ら、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデ
ミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー
（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），８１巻，５３３０
（１９８４）〕が挙げられる。培地のｐＨは約５〜８に
調整するのが好ましい。培養は通常約２０℃〜３５℃で
約２４〜７２時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加
える。
【００４４】宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換
体を培養する際、培地としては、Grace's Insect Mediu
m（Grace, T.C.C.,ネイチャー（Nature）,195,788(196
2)）に非動化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加え
たものなどが用いられる。培地のｐＨは約６．２〜６．
４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３
〜５日間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。宿
主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地とし
ては、例えば、約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ
培地〔サイエンス（Science），１２２巻，５０１(１９
５２)〕，ＤＭＥＭ培地〔ヴィロロジー（Virology），
８巻，３９６(１９５９)〕，ＲＰＭＩ １６４０培地
〔ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディカル・ア
ソシエーション（The Journal of the American Medica
l Association）１９９巻，５１９(１９６７)〕，１９
９培地〔プロシージング・オブ・ザ・ソサイエティ・フ
ォー・ザ・バイオロジカル・メディスン（Proceeding o
fthe Society for the Biological Medicine），７３
巻，１(１９５０)〕などが用いられる。ｐＨは約６〜８
であるのが好ましい。培養は通常約３０℃〜４０℃で約
１５〜６０時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加え
る。以上のようにして、形質転換体の細胞内、細胞膜ま
たは細胞外に本発明のＧタンパク質共役型レセプタータ
ンパク質を生成せしめることができる。
【００４５】上記培養物から本発明のレセプタータンパ
ク質を分離精製するには、例えば、下記の方法により行
なうことができる。本発明のレセプタータンパク質を培
養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養後、
公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩
衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結
融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠
心分離やろ過によりレセプタータンパク質の粗抽出液を
得る方法などが適宜用いられる。緩衝液の中に尿素や塩
酸グアニジンなどのタンパク質変性剤や、トリトンＸ−
１００TMなどの界面活性剤が含まれていてもよい。培養
液中にレセプタータンパク質が分泌される場合には、培
養終了後、公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分
離し、上清を集める。このようにして得られた培養上
清、あるいは抽出液中に含まれるレセプタータンパク質
の精製は、公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行
なうことができる。これらの公知の分離、精製法として
は、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透
析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差
を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの
荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラ
フィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液
体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方
法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法
などが用いられる。このようにして得られるレセプター
タンパク質が遊離体で得られた場合には、公知の方法あ
るいはそれに準じる方法によって塩に変換することがで
き、逆に塩で得られた場合には公知の方法あるいはそれ
に準じる方法により、遊離体または他の塩に変換するこ
とができる。なお、組換え体が産生するレセプタータン
パク質を、精製前または精製後に適当なタンパク質修飾
酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、
ポリペプチドを部分的に除去することもできる。タンパ
ク質修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリ
プシン、アルギニルエンドペプチダーゼ、プロテインキ
ナーゼ、グリコシダーゼなどが用いられる。このように
して生成する本発明のレセプタータンパク質またはその
塩の活性は、標識したリガンドとの結合実験および特異
抗体を用いたエンザイムイムノアッセイなどにより測定
することができる。
【００４６】本発明のレセプタータンパク質もしくはそ
の部分ペプチドまたはその塩に対する抗体は、本発明の
レセプタータンパク質もしくはその部分ペプチドまたは
その塩を認識し得る抗体であれば、ポリクローナル抗
体、モノクローナル抗体の何れであってもよい。本発明
のレセプタータンパク質もしくはその部分ペプチドまた
はその塩（以下、本発明のレセプタータンパク質等と略
記する場合がある）に対する抗体は、本発明のレセプタ
ータンパク質等を抗原として用い、公知の抗体または抗
血清の製造法に従って製造することができる。
【００４７】〔モノクローナル抗体の作製〕 （ａ）モノクローナル抗体産生細胞の作製 本発明のレセプタータンパク質等は、哺乳動物に対して
投与により抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担
体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生
能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全
フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は通常
２〜６週毎に１回ずつ、計２〜１０回程度行なわれる。
用いられる哺乳動物としては、例えば、サル、ウサギ、
イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギが挙
げられるが、マウスおよびラットが好ましく用いられ
る。モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗
原を免疫された温血動物、例えば、マウスから抗体価の
認められた個体を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓ま
たはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞
を骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル
抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。抗血
清中の抗体価の測定は、例えば、後記の標識化レセプタ
ータンパク質等と抗血清とを反応させたのち、抗体に結
合した標識剤の活性を測定することにより行なうことが
できる。融合操作は既知の方法、例えば、ケーラーとミ
ルスタインの方法〔ネイチャー（Nature)、２５６巻、
４９５頁（１９７５年）〕に従い実施することができ
る。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコ
ール（ＰＥＧ）やセンダイウィルスなどが挙げられる
が、好ましくはＰＥＧが用いられる。骨髄腫細胞として
は、例えば、ＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０などが挙
げられるが、Ｐ３Ｕ１が好ましく用いられる。用いられ
る抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細胞数との好ま
しい比率は１：１〜２０：１程度であり、ＰＥＧ（好ま
しくは、ＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００）が１０〜８
０％程度の濃度で添加され、約２０〜４０℃、好ましく
は約３０〜３７℃で約１〜１０分間インキュベートする
ことにより効率よく細胞融合を実施できる。
【００４８】モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの
スクリーニングには種々の方法が使用できるが、例え
ば、レセプタータンパク質等の抗原を直接あるいは担体
とともに吸着させた固相（例、マイクロプレート）にハ
イブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素
などで標識した抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用い
られる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗
体が用いられる）またはプロテインＡを加え、固相に結
合したモノクローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロ
ブリン抗体またはプロテインＡを吸着させた固相にハイ
ブリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素などで
標識したレセプタータンパク質等を加え、固相に結合し
たモノクローナル抗体を検出する方法などが挙げられ
る。モノクローナル抗体の選別は、公知あるいはそれに
準じる方法に従って行なうことができるが、通常はＨＡ
Ｔ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添
加した動物細胞用培地などで行なうことができる。選別
および育種用培地としては、ハイブリドーマが生育でき
るものならばどのような培地を用いても良い。例えば、
１〜２０％、好ましくは１０〜２０％の牛胎児血清を含
むＲＰＭＩ１６４０培地、１〜１０％の牛胎児血清を含
むＧＩＴ培地（和光純薬工業（株））またはハイブリド
ーマ培養用無血清培地（ＳＦＭ−１０１、日水製薬
（株））などを用いることができる。培養温度は、通常
２０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。培養時間
は、通常５日〜３週間、好ましくは１週間〜２週間であ
る。培養は、通常５％炭酸ガス下で行なうことができ
る。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清
中の抗体価の測定と同様にして測定できる。
【００４９】（ｂ）モノクローナル抗体の精製 モノクローナル抗体の分離精製は、通常のポリクローナ
ル抗体の分離精製と同様に免疫グロブリンの分離精製法
〔例、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気
泳動法、イオン交換体（例、ＤＥＡＥ）による吸脱着
法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相またはプロテ
インＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗
体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精
製法〕に従って行なうことができる。
【００５０】〔ポリクローナル抗体の作製〕本発明のポ
リクローナル抗体は、公知あるいはそれに準じる方法に
したがって製造することができる。例えば、免疫抗原
（本発明のタンパク質等の抗原）とキャリアータンパク
質との複合体をつくり、上記のモノクローナル抗体の製
造法と同様に哺乳動物に免疫を行ない、該免疫動物から
本発明のレセプタータンパク質等に対する抗体含有物を
採取して、抗体の分離精製を行なうことにより製造でき
る。哺乳動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキ
ャリアータンパク質との複合体に関し、キャリアータン
パク質の種類およびキャリアーとハプテンとの混合比
は、キャリアーに架橋させて免疫したハプテンに対して
抗体が効率良くできれば、どの様なものをどの様な比率
で架橋させてもよいが、例えば、ウシ血清アルブミン、
ウシサイログロブリン、キーホール・リンペット・ヘモ
シアニン等を重量比でハプテン１に対し、約０.１〜２
０、好ましくは約１〜５の割合でカプルさせる方法が用
いられる。また、ハプテンとキャリアーのカプリングに
は、種々の縮合剤を用いることができるが、グルタルア
ルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル、
チオール基、ジチオビリジル基を含有する活性エステル
試薬等が用いられる。縮合生成物は、温血動物に対し
て、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希
釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高
めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイ
ントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約２
〜６週毎に１回ずつ、計約３〜１０回程度行なうことが
できる。ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫され
た哺乳動物の血液、腹水など、好ましくは血液から採取
することができる。抗血清中のポリクローナル抗体価の
測定は、上記の血清中の抗体価の測定と同様にして測定
できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノ
クローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分
離精製法に従って行なうことができる。
【００５１】本発明のレセプタータンパク質またはその
塩、その部分ペプチドまたはその塩、および該レセプタ
ータンパク質またはその部分ペプチドをコードするＤＮ
Ａは、例えば、（１）本発明のＧタンパク質共役型レセ
プタータンパク質に対するリガンド（アゴニスト）の決
定、（２）本発明のＧタンパク質共役型レセプタータン
パク質の機能不全に関連する疾患の予防および／または
治療剤、（３）遺伝子診断剤、（４）本発明のレセプタ
ータンパク質またはその部分ペプチドの発現量を変化さ
せる化合物のスクリーニング方法、（５）本発明のレセ
プタータンパク質またはその部分ペプチドの発現量を変
化させる化合物を含有する各種疾病の予防および／また
は治療剤、（６）本発明のＧタンパク質共役型レセプタ
ータンパク質に対するリガンドの定量法、（７）本発明
のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質とリガンド
との結合性を変化させる化合物（アゴニスト、アンタゴ
ニストなど）のスクリーニング方法、（８）本発明のＧ
タンパク質共役型レセプタータンパク質とリガンドとの
結合性を変化させる化合物（アゴニスト、アンタゴニス
ト）を含有する各種疾病の予防および／または治療剤、
（９）本発明のレセプタータンパク質もしくはその部分
ペプチドまたはその塩の定量、（１０）細胞膜における
本発明のレセプタータンパク質またはその部分ペプチド
の量を変化させる化合物のスクリーニング方法、（１
１）細胞膜における本発明のレセプタータンパク質また
はその部分ペプチドの量を変化させる化合物を含有する
各種疾病の予防および／または治療剤、（１２）本発明
のレセプタータンパク質もしくはその部分ペプチドまた
はその塩に対する抗体による中和、（１３）本発明のＤ
ＮＡを有する非ヒト動物、（１４）本発明のＤＮＡが不
活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞および本発明のＤ
ＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物などに用いることができ
る。特に、本発明の組換え型Ｇタンパク質共役型レセプ
タータンパク質の発現系を用いたレセプター結合アッセ
イ系を用いることによって、ヒトやその他の哺乳動物に
特異的なＧタンパク質共役型レセプターに対するリガン
ドの結合性を変化させる化合物（例、アゴニスト、アン
タゴニストなど）をスクリーニングすることができ、該
アゴニストまたはアンタゴニストを各種疾病の予防・治
療剤などとして使用することができる。本発明のレセプ
タータンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩（以
下、本発明のレセプタータンパク質等と略記する場合が
ある）、本発明のレセプタータンパク質またはその部分
ペプチドをコードするＤＮＡ（以下、本発明のＤＮＡと
略記する場合がある）および本発明のレセプタータンパ
ク質等に対する抗体（以下、本発明の抗体と略記する場
合がある）の用途について、以下に具体的に説明する。
【００５２】（１）本発明のＧタンパク質共役型レセプ
タータンパク質に対するリガンド（アゴニスト）の決定 本発明のレセプタータンパク質もしくはその塩または本
発明の部分ペプチドもしくはその塩は、本発明のレセプ
タータンパク質またはその塩に対するリガンド（アゴニ
スト）を探索し、または決定するための試薬として有用
である。すなわち、本発明は、本発明のレセプタータン
パク質もしくはその塩または本発明の部分ペプチドもし
くはその塩と、試験化合物とを接触させることを特徴と
する本発明のレセプタータンパク質に対するリガンドの
決定方法を提供する。試験化合物としては、公知物質
（例えば、アンギオテンシン、ボンベシン、カナビノイ
ド、コレシストキニン、グルタミン、セロトニン、メラ
トニン、ニューロペプチドＹ、オピオイド、プリン、バ
ソプレッシン、オキシトシン、ＰＡＣＡＰ（例、ＰＡＣ
ＡＰ２７，ＰＡＣＡＰ３８）、セクレチン、グルカゴ
ン、カルシトニン、アドレノメジュリン、ソマトスタチ
ン、ＧＨＲＨ、ＣＲＦ、ＡＣＴＨ、ＧＲＰ、ＰＴＨ、Ｖ
ＩＰ（バソアクティブ インテスティナル アンド リ
レイテッド ポリペプチド）、ソマトスタチン、ドーパ
ミン、モチリン、アミリン、ブラジキニン、ＣＧＲＰ
（カルシトニンジーンリレーティッドペプチド）、ロイ
コトリエン、パンクレアスタチン、プロスタグランジ
ン、トロンボキサン、アデノシン、アドレナリン、ケモ
カインスーパーファミリー（例、ＩＬ−８，ＧＲＯα，
ＧＲＯβ，ＧＲＯγ，ＮＡＰ−２，ＥＮＡ−７８，ＧＣ
Ｐ−２，ＰＦ４，ＩＰ−１０，Ｍｉｇ，ＰＢＳＦ／ＳＤ
Ｆ−１などのＣＸＣケモカインサブファミリー；ＭＣＡ
Ｆ／ＭＣＰ−１，ＭＣＰ−２，ＭＣＰ−３，ＭＣＰ−
４，ｅｏｔａｘｉｎ，ＲＡＮＴＥＳ，ＭＩＰ−１α、Ｍ
ＩＰ−１β，ＨＣＣ−１，ＭＩＰ−３α／ＬＡＲＣ、Ｍ
ＩＰ−３β／ＥＬＣ，Ｉ−３０９，ＴＡＲＣ，ＭＩＰＦ
−１，ＭＩＰＦ−２／ｅｏｔａｘｉｎ−２，ＭＤＣ，Ｄ
Ｃ−ＣＫ１／ＰＡＲＣ，ＳＬＣなどのＣＣケモカインサ
ブファミリー；ｌｙｍｐｈｏｔａｃｔｉｎなどのＣケモ
カインサブファミリー；ｆｒａｃｔａｌｋｉｎｅなどの
ＣＸ３Ｃケモカインサブファミリー等）、エンドセリ
ン、エンテロガストリン、ヒスタミン、ニューロテンシ
ン、ＴＲＨ、パンクレアティックポリペプタイド、ガラ
ニン、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）、スフィンゴシ
ン１−リン酸など）の他に、例えば、前記の配列番号：
８で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチド、配
列番号：１４０、配列番号：１４３、配列番号：１４
６、配列番号：１５２または配列番号：１５５で表わさ
れるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ
酸配列を含有するペプチドなども用いられる。さらに、
ヒトまたは哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ブタ、
ウシ、ヒツジ、サルなど）の組織抽出物、細胞培養上清
などが用いられる。中でも、本発明で用いられるポリペ
プチド（好ましくは、配列番号：８で表されるアミノ酸
配列を含有するポリペプチドなど）などが好ましく用い
られる。例えば、該組織抽出物、細胞培養上清などを本
発明のレセプタータンパク質に添加し、細胞刺激活性な
どを測定しながら分画し、最終的に単一のリガンドを得
ることができる。配列番号：１４０で表わされるアミノ
酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列の具体
例としては、配列番号：１４０、配列番号：１４１また
は配列番号：１４２で表わされるアミノ酸配列が挙げら
れる。配列番号：１４３で表わされるアミノ酸配列と同
一または実質的に同一のアミノ酸配列の具体例として
は、配列番号：１４３、配列番号：１４４または配列番
号：１４５で表わされるアミノ酸配列が挙げられる。配
列番号：１４６で表わされるアミノ酸配列と同一または
実質的に同一のアミノ酸配列の具体例としては、配列番
号：１４６、配列番号：１４７、配列番号：１４８、配
列番号：１４９、配列番号：１５０または配列番号：１
５１で表わされるアミノ酸配列が挙げられる。配列番
号：１５２で表わされるアミノ酸配列と同一または実質
的に同一のアミノ酸配列の具体例としては、配列番号：
１５２、配列番号：１５３または配列番号：１５４で表
わされるアミノ酸配列が挙げられる。 配列番号：１５
５で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一
のアミノ酸配列の具体例としては、配列番号：１５５、
配列番号：１５６または配列番号：１５７で表わされる
アミノ酸配列が挙げられる。
【００５３】具体的には、本発明のリガンド決定方法
は、本発明のレセプタータンパク質もしくはその部分ペ
プチドもしくはその塩を用いるか、または組換え型レセ
プタータンパク質の発現系を構築し、該発現系を用いた
レセプター結合アッセイ系を用いることによって、本発
明のレセプタータンパク質に結合して細胞刺激活性（例
えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内
Ｃａ2+遊離、細胞内ｃＡＭＰ産生促進・抑制、細胞内ｃ
ＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変
動、細胞内タンパク質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓ活性化、
ｐＨの低下などを促進する活性または抑制する活性）を
有する化合物（例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプ
チド性化合物、合成化合物、発酵生産物など）またはそ
の塩を決定する方法である。本発明のリガンド決定方法
においては、本発明のレセプタータンパク質またはその
部分ペプチドと試験化合物とを接触させた場合の、例え
ば、該レセプタータンパク質または該部分ペプチドに対
する試験化合物の結合量や、細胞刺激活性などを測定す
ることを特徴とする。
【００５４】より具体的には、本発明は、（i）標識し
た試験化合物を、本発明のレセプタータンパク質もしく
はその塩または本発明の部分ペプチドもしくはその塩に
接触させた場合における、標識した試験化合物の該タン
パク質もしくはその塩、または該部分ペプチドもしくは
その塩に対する結合量を測定することを特徴とする本発
明のレセプタータンパク質またはその塩に対するリガン
ドの決定方法、（ii）標識した試験化合物を、本発明の
レセプタータンパク質を含有する細胞または該細胞の膜
画分に接触させた場合における、標識した試験化合物の
該細胞または該膜画分に対する結合量を測定することを
特徴とする本発明のレセプタータンパク質またはその塩
に対するリガンドの決定方法、（iii）標識した試験化
合物を、本発明のレセプタータンパク質をコードするＤ
ＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞
膜上に発現したレセプタータンパク質に接触させた場合
における、標識した試験化合物の該レセプタータンパク
質またはその塩に対する結合量を測定することを特徴と
する本発明のレセプタータンパク質に対するリガンドの
決定方法、
【００５５】（iv）試験化合物を、本発明のレセプター
タンパク質を含有する細胞に接触させた場合における、
レセプタータンパク質を介した細胞刺激活性（例えば、
アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ2+
遊離、細胞内ｃＡＭＰ産生促進・抑制、細胞内ｃＧＭＰ
生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞
内タンパク質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの
低下などを促進する活性または抑制する活性など）を測
定することを特徴とする本発明のレセプタータンパク質
またはその塩に対するリガンドの決定方法、および
（v）試験化合物を、本発明のレセプタータンパク質を
コードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養すること
によって細胞膜上に発現したレセプタータンパク質に接
触させた場合における、レセプタータンパク質を介する
細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコ
リン遊離、細胞内Ｃａ2+遊離、細胞内ｃＡＭＰ産生促進
・抑制、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産
生、細胞膜電位変動、細胞内タンパク質のリン酸化、ｃ
−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下などを促進する活性また
は抑制する活性など）を測定することを特徴とする本発
明のレセプタータンパク質またはその塩に対するリガン
ドの決定方法を提供する。特に、上記（i）〜（iii）の
試験を行ない、試験化合物が本発明のレセプタータンパ
ク質に結合することを確認した後に、上記（iv）〜
（v）の試験を行なうことが好ましい。
【００５６】まず、リガンド決定方法に用いるレセプタ
ータンパク質としては、上記した本発明のレセプタータ
ンパク質または本発明の部分ペプチドを含有するもので
あれば何れのものであってもよいが、動物細胞を用いて
大量発現させたレセプタータンパク質が適している。本
発明のレセプタータンパク質を製造するには、上記の発
現方法が用いられるが、該レセプタータンパク質をコー
ドするＤＮＡを哺乳動物細胞や昆虫細胞で発現すること
により行なうことが好ましい。目的とするタンパク質部
分をコードするＤＮＡ断片には、通常、相補ＤＮＡが用
いられるが、必ずしもこれに制約されるものではない。
例えば、遺伝子断片や合成ＤＮＡを用いてもよい。本発
明のレセプタータンパク質をコードするＤＮＡ断片を宿
主動物細胞に導入し、それらを効率よく発現させるため
には、該ＤＮＡ断片を昆虫を宿主とするバキュロウイル
スに属する核多角体病ウイルス（nuclear polyhedrosis
virus；ＮＰＶ）のポリヘドリンプロモーター、ＳＶ４
０由来のプロモーター、レトロウイルスのプロモータ
ー、メタロチオネインプロモーター、ヒトヒートショッ
クプロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、
ＳＲαプロモーターなどの下流に組み込むのが好まし
い。発現したレセプターの量と質の検査は公知の方法で
行うことができる。例えば、文献〔Nambi，P．ら、ザ・
ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.
Biol. Chem.），２６７巻，１９５５５〜１９５５９
頁，１９９２年〕に記載の方法に従って行うことができ
る。
【００５７】したがって、本発明のリガンド決定方法に
おいて、本発明のレセプタータンパク質もしくはその部
分ペプチドまたはその塩を含有するものとしては、公知
の方法に従って精製したレセプタータンパク質もしくは
その部分ペプチドまたはその塩であってもよいし、該レ
セプタータンパク質を含有する細胞またはその細胞膜画
分を用いてもよい。本発明のリガンド決定方法におい
て、本発明のレセプタータンパク質を含有する細胞を用
いる場合、該細胞をグルタルアルデヒド、ホルマリンな
どで固定化してもよい。固定化方法は公知の方法に従っ
て行なうことができる。本発明のレセプタータンパク質
を含有する細胞としては、本発明のレセプタータンパク
質を発現した宿主細胞をいうが、該宿主細胞としては、
大腸菌、枯草菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞などが用い
られる。細胞膜画分としては、細胞を破砕した後、公知
の方法で得られる細胞膜が多く含まれる画分のことをい
う。細胞の破砕方法としては、Potter−Elvehjem型ホモ
ジナイザーで細胞を押し潰す方法、ワーリングブレンダ
ーやポリトロン（Kinematica社製）による破砕、超音波
による破砕、フレンチプレスなどで加圧しながら細胞を
細いノズルから噴出させることによる破砕などが挙げら
れる。細胞膜の分画には、分画遠心分離法や密度勾配遠
心分離法などの遠心力による分画法が主として用いられ
る。例えば、細胞破砕液を低速（５００ｒｐｍ〜３００
０ｒｐｍ）で短時間（通常、約１分〜１０分）遠心し、
上清をさらに高速（１５０００ｒｐｍ〜３００００ｒｐ
ｍ）で通常３０分〜２時間遠心し、得られる沈澱を膜画
分とする。該膜画分中には、発現したレセプタータンパ
ク質と細胞由来のリン脂質や膜タンパク質などの膜成分
が多く含まれる。
【００５８】該レセプタータンパク質を含有する細胞や
その膜画分中のレセプタータンパク質の量は、１細胞当
たり１０3〜１０8分子であるのが好ましく、１０5〜１
０7分子であるのが好適である。なお、発現量が多いほ
ど膜画分当たりのリガンド結合活性（比活性）が高くな
り、高感度なスクリーニング系の構築が可能になるばか
りでなく、同一ロットで大量の試料を測定できるように
なる。本発明のレセプタータンパク質またはその塩に対
するリガンドを決定する上記の（i）〜（iii）の方法を
実施するためには、適当なレセプタータンパク質画分
と、標識した試験化合物が必要である。レセプタータン
パク質画分としては、天然型のレセプタータンパク質画
分か、またはそれと同等の活性を有する組換え型レセプ
ター画分などが望ましい。ここで、同等の活性とは、同
等のリガンド結合活性、シグナル情報伝達作用などを示
す。標識した試験化合物としては、〔3Ｈ〕、
〔125Ｉ〕、〔14Ｃ〕、〔35Ｓ〕などで標識したアンギ
オテンシン、ボンベシン、カナビノイド、コレシストキ
ニン、グルタミン、セロトニン、メラトニン、ニューロ
ペプチドＹ、オピオイド、プリン、バソプレッシン、オ
キシトシン、ＰＡＣＡＰ（例、ＰＡＣＡＰ２７，ＰＡＣ
ＡＰ３８）、セクレチン、グルカゴン、カルシトニン、
アドレノメジュリン、ソマトスタチン、ＧＨＲＨ、ＣＲ
Ｆ、ＡＣＴＨ、ＧＲＰ、ＰＴＨ、ＶＩＰ（バソアクティ
ブ インテスティナル アンド リイテッド ポリペプ
チド）、ソマトスタチン、ドーパミン、モチリン、アミ
リン、ブラジキニン、ＣＧＲＰ（カルシトニンジーンリ
レーティッドペプチド）、ロイコトリエン、パンクレア
スタチン、プロスタグランジン、トロンボキサン、アデ
ノシン、アドレナリン、ケモカインスーパーファミリー
（例、ＩＬ−８，ＧＲＯα，ＧＲＯβ，ＧＲＯγ，ＮＡ
Ｐ−２，ＥＮＡ−７８，ＧＣＰ−２，ＰＦ４，ＩＰ−１
０，Ｍｉｇ，ＰＢＳＦ／ＳＤＦ−１などのＣＸＣケモカ
インサブファミリー；ＭＣＡＦ／ＭＣＰ−１，ＭＣＰ−
２，ＭＣＰ−３，ＭＣＰ−４，ｅｏｔａｘｉｎ，ＲＡＮ
ＴＥＳ，ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β，ＨＣＣ−１，Ｍ
ＩＰ−３α／ＬＡＲＣ、ＭＩＰ−３β／ＥＬＣ，Ｉ−３
０９，ＴＡＲＣ，ＭＩＰＦ−１，ＭＩＰＦ−２／ｅｏｔ
ａｘｉｎ−２，ＭＤＣ，ＤＣ−ＣＫ１／ＰＡＲＣ，ＳＬ
ＣなどのＣＣケモカインサブファミリー；ｌｙｍｐｈｏ
ｔａｃｔｉｎなどのＣケモカインサブファミリー；ｆｒ
ａｃｔａｌｋｉｎｅなどのＣＸ３Ｃケモカインサブファ
ミリー等）、エンドセリン、エンテロガストリン、ヒス
タミン、ニューロテンシン、ＴＲＨ、パンクレアティッ
クポリペプタイド、ガラニン、リゾホスファチジン酸
（ＬＰＡ）、スフィンゴシン１−リン酸、本発明で用い
られるポリペプチドなどが好適である。中でも前記の配
列番号：８で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプ
チドが好ましい。さらには、配列番号：１４０、配列番
号：１４３、配列番号：１４６、配列番号：１５２また
は配列番号：１５５で表わされるアミノ酸配列と同一も
しくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチド
なども用いられる。
【００５９】具体的には、本発明のレセプタータンパク
質またはその塩に対するリガンドの決定方法を行なうに
は、まず本発明のレセプタータンパク質を含有する細胞
または細胞の膜画分を、決定方法に適したバッファーに
懸濁することによりレセプター標品を調製する。バッフ
ァーには、ｐＨ４〜１０（望ましくはｐＨ６〜８）のリ
ン酸バッファー、トリス−塩酸バッファーなどのリガン
ドとレセプタータンパク質との結合を阻害しないバッフ
ァーであればいずれでもよい。また、非特異的結合を低
減させる目的で、ＣＨＡＰＳ、Ｔｗｅｅｎ−８０TM（花
王−アトラス社）、ジギトニン、デオキシコレートなど
の界面活性剤やウシ血清アルブミンやゼラチンなどの各
種タンパク質をバッファーに加えることもできる。さら
に、プロテアーゼによるリセプターやリガンドの分解を
抑える目的でＰＭＳＦ、ロイペプチン、Ｅ−６４（ペプ
チド研究所製）、ペプスタチンなどのプロテアーゼ阻害
剤を添加することもできる。０．０１ｍｌ〜１０ｍｌの
該レセプター溶液に、一定量（５０００ｃｐｍ〜５００
０００ｃｐｍ）の〔3Ｈ〕、〔125Ｉ〕、〔14Ｃ〕、〔35
Ｓ〕などで標識した試験化合物を共存させる。非特異的
結合量（ＮＳＢ）を知るために大過剰の未標識の試験化
合物を加えた反応チューブも用意する。反応は約０℃〜
５０℃、望ましくは約４℃〜３７℃で、約２０分〜２４
時間、望ましくは約３０分〜３時間行なう。反応後、ガ
ラス繊維濾紙等で濾過し、適量の同バッファーで洗浄し
た後、ガラス繊維濾紙に残存する放射活性を液体シンチ
レーションカウンターあるいはγ−カウンターで計測す
る。全結合量（Ｂ）から非特異的結合量（ＮＳＢ）を引
いたカウント（Ｂ−ＮＳＢ）が０ｃｐｍを越える試験化
合物を本発明のレセプタータンパク質またはその塩に対
するリガンド（アゴニスト）として選択することができ
る。
【００６０】本発明のレセプタータンパク質またはその
塩に対するリガンドを決定する上記の（iv）〜（v）の
方法を実施するためには、該レセプタータンパク質を介
する細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチ
ルコリン遊離、細胞内Ｃａ2+遊離、細胞内ｃＡＭＰ産生
促進・抑制、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸
産生、細胞膜電位変動、細胞内タンパク質のリン酸化、
ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下などを促進する活性ま
たは抑制する活性など）を公知の方法または市販の測定
用キットを用いて測定することができる。具体的には、
まず、レセプタータンパク質を含有する細胞をマルチウ
ェルプレート等に培養する。リガンド決定を行なうにあ
たっては前もって新鮮な培地あるいは細胞に毒性を示さ
ない適当なバッファーに交換し、試験化合物などを添加
して一定時間インキュベートした後、細胞を抽出あるい
は上清液を回収して、生成した産物をそれぞれの方法に
従って定量する。細胞刺激活性の指標とする物質（例え
ば、アラキドン酸など）の生成が、細胞が含有する分解
酵素によって検定困難な場合は、該分解酵素に対する阻
害剤を添加してアッセイを行なってもよい。また、ｃＡ
ＭＰ産生抑制などの活性については、フォルスコリンな
どで細胞の基礎的産生量を増大させておいた細胞に対す
る産生抑制作用として検出することができる。
【００６１】本発明のレセプタータンパク質またはその
塩に結合するリガンド決定用キットは、本発明のレセプ
タータンパク質もしくはその塩、本発明の部分ペプチド
もしくはその塩、本発明のレセプタータンパク質を含有
する細胞、または本発明のレセプタータンパク質を含有
する細胞の膜画分などを含有するものである。本発明の
リガンド決定用キットの例としては、次のものが挙げら
れる。 １．リガンド決定用試薬 （i）測定用緩衝液および洗浄用緩衝液 Hanks' Balanced Salt Solution（ギブコ社製）に、０.
０５％のウシ血清アルブミン（シグマ社製）を加えたも
の。孔径０．４５μｍのフィルターで濾過滅菌し、４℃
で保存するか、あるいは用時調製しても良い。 （ii）Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質標品 本発明のレセプタータンパク質を発現させたＣＨＯ細胞
を、１２穴プレートに５×１０5個／穴で継代し、３７
℃、５％ＣＯ2、９５％ａｉｒで２日間培養したもの。 （iii）標識試験化合物 市販の〔3Ｈ〕、〔125Ｉ〕、〔14Ｃ〕、〔35Ｓ〕などで
標識した化合物、または適当な方法で標識化したもの 水溶液の状態のものを４℃あるいは−２０℃にて保存
し、用時に測定用緩衝液にて１μＭに希釈する。水に難
溶性を示す試験化合物については、ジメチルホルムアミ
ド、ＤＭＳＯ、メタノール等に溶解する。 （iv）非標識試験化合物 標識化合物と同じものを１００〜１０００倍濃い濃度に
調製する。
【００６２】２．測定法 （i）１２穴組織培養用プレートにて培養した本発明の
レセプタータンパク質発現ＣＨＯ細胞を、測定用緩衝液
１ｍｌで２回洗浄した後、４９０μｌの測定用緩衝液を
各穴に加える。 （ii）標識試験化合物を５μｌ加え、室温にて１時間反
応させる。非特異的結合量を知るためには非標識試験化
合物を５μｌ加えておく。 （iii）反応液を除去し、１ｍｌの洗浄用緩衝液で３回
洗浄する。細胞に結合した標識試験化合物を０．２Ｎ
ＮａＯＨ−１％ＳＤＳで溶解し、４ｍｌの液体シンチレ
ーターＡ（和光純薬製）と混合する。 （iv）液体シンチレーションカウンター（ベックマン社
製）を用いて放射活性を測定する。
【００６３】本発明のレセプタータンパク質またはその
塩に結合することができるリガンドとしては、例えば、
脳、大腸、小腸、膵臓、卵巣、胃、心臓、肝臓、精巣、
胎盤、肺、脊髄、脾臓、胸腺、腎臓、十二指腸、副腎、
前立腺、下垂体、子宮などに特異的に存在する物質など
が挙げられ、具体的には、アンギオテンシン、ボンベシ
ン、カナビノイド、コレシストキニン、グルタミン、セ
ロトニン、メラトニン、ニューロペプチドＹ、オピオイ
ド、プリン、バソプレッシン、オキシトシン、ＰＡＣＡ
Ｐ（例、ＰＡＣＡＰ２７，ＰＡＣＡＰ３８）、セクレチ
ン、グルカゴン、カルシトニン、アドレノメジュリン、
ソマトスタチン、ＧＨＲＨ、ＣＲＦ、ＡＣＴＨ、ＧＲ
Ｐ、ＰＴＨ、ＶＩＰ（バソアクティブ インテスティナ
ル アンドリレイテッド ポリペプチド）、ソマトスタ
チン、ドーパミン、モチリン、アミリン、ブラジキニ
ン、ＣＧＲＰ（カルシトニンジーンリレーティッドペプ
チド）、ロイコトリエン、パンクレアスタチン、プロス
タグランジン、トロンボキサン、アデノシン、アドレナ
リン、ケモカインスーパーファミリー（例、ＩＬ−８，
ＧＲＯα，ＧＲＯβ，ＧＲＯγ，ＮＡＰ−２，ＥＮＡ−
７８，ＧＣＰ−２，ＰＦ４，ＩＰ−１０，Ｍｉｇ，ＰＢ
ＳＦ／ＳＤＦ−１などのＣＸＣケモカインサブファミリ
ー；ＭＣＡＦ／ＭＣＰ−１，ＭＣＰ−２，ＭＣＰ−３，
ＭＣＰ−４，ｅｏｔａｘｉｎ，ＲＡＮＴＥＳ，ＭＩＰ−
１α、ＭＩＰ−１β，ＨＣＣ−１，ＭＩＰ−３α／ＬＡ
ＲＣ、ＭＩＰ−３β／ＥＬＣ，Ｉ−３０９，ＴＡＲＣ，
ＭＩＰＦ−１，ＭＩＰＦ−２／ｅｏｔａｘｉｎ−２，Ｍ
ＤＣ，ＤＣ−ＣＫ１／ＰＡＲＣ，ＳＬＣなどのＣＣケモ
カインサブファミリー；ｌｙｍｐｈｏｔａｃｔｉｎなど
のＣケモカインサブファミリー；ｆｒａｃｔａｌｋｉｎ
ｅなどのＣＸ３Ｃケモカインサブファミリー等）、エン
ドセリン、エンテロガストリン、ヒスタミン、ニューロ
テンシン、ＴＲＨ、パンクレアティックポリペプタイ
ド、ガラニン、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）、スフ
ィンゴシン１−リン酸などが用いられる。本発明のレセ
プタータンパク質またはその塩に結合することができる
リガンドとしての具体例としては、本発明で用いられる
ポリペプチド（好ましくは、前記の配列番号：８で表さ
れるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸
配列を含有するポリペプチドなど）が挙げられる。配列
番号：８で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に
同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドとしては、
配列番号：８で表されるアミノ酸配列を有するポリペプ
チド、配列番号：９で表されるアミノ酸配列を有するポ
リペプチドなどが挙げられる。配列番号：８で表される
アミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列
を含有するポリペプチドは、例えば食欲（摂食）増進作
用等および（または）プロラクチン産生促進作用を有す
る。配列番号：８で表されるアミノ酸配列を含有するポ
リペプチドは、上記したヒトや哺乳動物の細胞または組
織から公知のタンパク質の精製方法によって製造するこ
ともできるし、後述の参考例１２および１３に記載する
方法またはこれに準じた方法により製造することもでき
る。本発明のレセプタータンパク質またはその塩に結合
することができるリガンドとしての具体例として、前記
の配列番号：１４０、配列番号：１４３、配列番号：１
４６、配列番号：１５２または配列番号：１５５で表わ
されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ
ノ酸配列を含有するペプチドなども挙げられる。該ペプ
チドは、上記したヒトや哺乳動物の細胞または組織から
公知のタンパク質の精製方法によって製造することがで
きる。
【００６４】（２）本発明のＧタンパク質共役型レセプ
タータンパク質の機能不全に関連する疾患の予防および
／または治療剤 上記（１）の方法において、本発明のレセプタータンパ
ク質に対するリガンドが明らかになれば、該リガンドが
有する作用に応じて、（i）本発明のレセプタータンパ
ク質または（ii）該レセプタータンパク質をコードする
ＤＮＡを、本発明のレセプタータンパク質の機能不全に
関連する疾患の予防および／または治療剤などの医薬と
して使用することができる。例えば、生体内において本
発明のレセプタータンパク質が減少しているためにリガ
ンドの生理作用が期待できない（該レセプタータンパク
質の欠乏症）患者がいる場合に、（i）本発明のレセプ
タータンパク質を該患者に投与し該レセプタータンパク
質の量を補充したり、（ii）（イ）本発明のレセプター
タンパク質をコードするＤＮＡを該患者に投与し発現さ
せることによって、あるいは（ロ）対象となる細胞に本
発明のレセプタータンパク質をコードするＤＮＡを挿入
し発現させた後に、該細胞を該患者に移植することなど
によって、患者の体内におけるレセプタータンパク質の
量を増加させ、リガンドの作用を充分に発揮させること
ができる。すなわち、本発明のレセプタータンパク質を
コードするＤＮＡは、安全で低毒性な本発明のレセプタ
ータンパク質の機能不全に関連する疾患の予防および／
または治療剤として有用である。本発明のレセプタータ
ンパク質のひとつである配列番号：１で表されるアミノ
酸配列を有するレセプタータンパク質は、Ｇタンパク質
共役型レセプタータンパク質であるヒトＧＰＲ７〔ゲノ
ミクス（Genomics）,２８巻，８４−９１頁，１９９５
年〕およびヒトＧＰＲ８〔ゲノミクス（Genomics）,２
８巻，８４−９１頁，１９９５年〕にアミノ酸配列レベ
ルで、それぞれ８４．８％および５８．１％の相同性
が、配列番号：１３８で表されるアミノ酸配列を有する
レセプタータンパク質は、Ｇタンパク質共役型レセプタ
ータンパク質であるヒトＧＰＲ７〔ゲノミクス（Genomi
cs）,２８巻，８４−９１頁，１９９５年〕にアミノ酸
配列レベルで、８５．１％の相同性が認められる新規７
回膜貫通型レセプタータンパク質である。
【００６５】本発明のレセプタータンパク質または該レ
セプタータンパク質をコードするＤＮＡは、中枢疾患
（例えば、アルツハイマー病、痴呆、摂食障害など）、
内分泌疾患〔例えば、高血圧症、性腺機能異常、甲状腺
機能異常、下垂体機能異常、下垂体ホルモン分泌不全
（例、プロラクチン分泌不全（例、卵巣機能低下症、精
嚢発育不全、更年期障害、甲状腺機能低下等））な
ど〕、代謝疾患(例えば、糖尿病、脂質代謝異常、高脂
血症など)、癌（例えば、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立
腺癌、胃癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸
癌など）、心疾患（例えば、狭心症、心筋梗塞など）な
どの予防および／または治療に有用である。また、拒食
症の予防・治療、食欲（摂食）の増進、肥満症〔例、悪
性肥満細胞症（malignant mastocytosis)、外因性肥満
（exogenous obesity)、過インシュリン性肥満症（hype
rinsulinar obesity)、過血漿性肥満（hyperplasmic ob
esity)、下垂体性肥満（hypophyseal adiposity)、減血
漿性肥満症（hypoplasmic obesity)、甲状腺機能低下肥
満症（hypothyroid obesity)、視床下部性肥満（hypoth
alamic obesity)、症候性肥満症（symptomatic obesit
y)、小児肥満（infantile obesity)、上半身肥満（uppe
r body obesity)、食事性肥満症（alimentary obesit
y)、性機能低下性肥満（hypogonadal obesity)、全身性
肥満細胞症（systemic mastocytosis)、単純性肥満（si
mple obesity)、中心性肥満（central obesity）な
ど〕、摂食亢進症（hyperphagia）などの予防および／
または治療にも有用である。本発明のレセプタータンパ
ク質を上記予防・治療剤として使用する場合は、常套手
段に従って製剤化することができる。一方、本発明のレ
セプタータンパク質をコードするＤＮＡ（以下、本発明
のＤＮＡと略記する場合がある）を上記予防・治療剤と
して使用する場合は、本発明のＤＮＡを単独あるいはレ
トロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデ
ノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適
当なベクターに挿入した後、常套手段に従って実施する
ことができる。本発明のＤＮＡは、そのままで、あるい
は摂取促進のための補助剤とともに、遺伝子銃やハイド
ロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与でき
る。
【００６６】例えば、（i）本発明のレセプタータンパ
ク質または（ii）該レセプタータンパク質をコードする
ＤＮＡは、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル
剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口
的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得
る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形
で非経口的に使用できる。例えば、（i）本発明のレセ
プタータンパク質または（ii）該レセプタータンパク質
をコードするＤＮＡを生理学的に認められる公知の担
体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合
剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される
単位用量形態で混和することによって製造することがで
きる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲
の適当な用量が得られるようにするものである。
【００６７】錠剤、カプセル剤などに混和することがで
きる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスター
チ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性
セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチ
ン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグ
ネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリ
ンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチ
ェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態
がカプセルである場合には、上記タイプの材料にさらに
油脂のような液状担体を含有することができる。注射の
ための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性
物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油など
を溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って
処方することができる。注射用の水性液としては、例え
ば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張
液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩
化ナトリウムなど）などが用いられ、適当な溶解補助
剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアル
コール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリ
コール）、非イオン性界面活性剤（例、ポリソルベート
８０TM、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。油性液
としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶
解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール
などと併用してもよい。
【００６８】また、上記予防・治療剤は、例えば、緩衝
剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝
液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸
プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミ
ン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、
ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤な
どと配合してもよい。調製された注射液は通常、適当な
アンプルに充填される。このようにして得られる製剤は
安全で低毒性であるので、例えば、ヒトやその他の哺乳
動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブ
タ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与するこ
とができる。本発明のレセプタータンパク質の投与量
は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差
異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、肥満症
患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０.
１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、
より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に
投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓
器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば、
注射剤の形では通常例えば、肥満症患者（６０ｋｇとし
て）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程
度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましく
は約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するの
が好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに
換算した量を投与することができる。本発明のＤＮＡの
投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などに
より差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、
肥満症患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき
約０.１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０
ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経
口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対
象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例え
ば、注射剤の形では通常例えば、肥満症患者（６０ｋｇ
として）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ
程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好まし
くは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与する
のが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たり
に換算した量を投与することができる。
【００６９】（３）遺伝子診断剤 本発明のＤＮＡは、プローブとして使用することによ
り、ヒトまたはその他の哺乳動物（例えば、ラット、マ
ウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サル
など）における本発明のレセプタータンパク質またはそ
の部分ペプチドをコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡの異
常（遺伝子異常）を検出することができるので、例え
ば、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの損傷、突然変異あるいは
発現低下や、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの増加あるいは発
現過多などの遺伝子診断剤として有用である。本発明の
ＤＮＡを用いる上記の遺伝子診断は、例えば、公知のノ
ーザンハイブリダイゼーションやＰＣＲ−ＳＳＣＰ法
（ゲノミックス（Genomics），第５巻，８７４〜８７９
頁（１９８９年）、プロシージングズ・オブ・ザ・ナシ
ョナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ユ
ーエスエー（Proceedings of theNational Academy of
Sciences of the United States of America），第８６
巻，２７６６〜２７７０頁（１９８９年））などにより
実施することができる。
【００７０】（４）本発明のレセプタータンパク質また
はその部分ペプチドの発現量を変化させる化合物のスク
リーニング方法 本発明のＤＮＡは、プローブとして用いることにより、
本発明のレセプタータンパク質またはその部分ペプチド
の発現量を変化させる化合物のスクリーニングに用いる
ことができる。すなわち、本発明は、例えば、（ｉ）非
ヒト哺乳動物の（a）血液、（b）特定の臓器、（c）臓
器から単離した組織もしくは細胞、または（ｉｉ）形質
転換体等に含まれる本発明のレセプタータンパク質また
はその部分ペプチドのｍＲＮＡ量を測定することによ
る、本発明のレセプタータンパク質またはその部分ペプ
チドの発現量を変化させる化合物のスクリーニング方法
を提供する。
【００７１】本発明のレセプタータンパク質またはその
部分ペプチドのｍＲＮＡ量の測定は具体的には以下のよ
うにして行なう。 （ｉ）正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物（例え
ば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネ
コ、イヌ、サルなど、より具体的には痴呆ラット、肥満
マウス、動脈硬化ウサギ、担癌マウスなど）に対して、
薬剤（例えば、抗痴呆薬、血圧低下薬、抗癌剤、抗肥満
薬など）あるいは物理的ストレス（例えば、浸水ストレ
ス、電気ショック、明暗、低温など）などを与え、一定
時間経過した後に、血液、あるいは特定の臓器（例え
ば、脳、肺、大腸など）、または臓器から単離した組
織、あるいは細胞を得る。得られた細胞に含まれる本発
明のレセプタータンパク質またはその部分ペプチドのｍ
ＲＮＡは、例えば、通常の方法により細胞等からｍＲＮ
Ａを抽出し、例えば、ＴａｑＭａｎＰＣＲなどの手法を
用いることにより定量することができ、公知の手段によ
りノーザンブロットを行うことにより解析することもで
きる。 （ii）本発明のレセプタータンパク質もしくはその部分
ペプチドを発現する形質転換体を上記の方法に従い作製
し、該形質転換体に含まれる本発明のレセプタータンパ
ク質またはその部分ペプチドのｍＲＮＡを同様にして定
量、解析することができる。
【００７２】本発明のレセプタータンパク質またはその
部分ペプチドの発現量を変化させる化合物のスクリーニ
ングは、（ｉ）正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物
に対して、薬剤あるいは物理的ストレスなどを与える一
定時間前（３０分前〜２４時間前、好ましくは３０分前
〜１２時間前、より好ましくは１時間前〜６時間前）も
しくは一定時間後（３０分後〜３日後、好ましくは１時
間後〜２日後、より好ましくは１時間後〜２４時間
後）、または薬剤あるいは物理的ストレスと同時に被検
化合物を投与し、投与後一定時間経過後（３０分後〜３
日後、好ましくは１時間後〜２日後、より好ましくは１
時間後〜２４時間後）、細胞に含まれる本発明のレセプ
タータンパク質またはその部分ペプチドのｍＲＮＡ量を
定量、解析することにより行なうことができ、（ii）形
質転換体を常法に従い培養する際に被検化合物を培地中
に混合させ、一定時間培養後（１日後〜７日後、好まし
くは１日後〜３日後、より好ましくは２日後〜３日
後）、該形質転換体に含まれる本発明のレセプタータン
パク質またはその部分ペプチドのｍＲＮＡ量を定量、解
析することにより行なうことができる。
【００７３】本発明のスクリーニング方法を用いて得ら
れる化合物またはその塩は、本発明のレセプタータンパ
ク質またはその部分ペプチドの発現量を変化させる作用
を有する化合物であり、具体的には、（イ）本発明のレ
セプタータンパク質またはその部分ペプチドの発現量を
増加させることにより、Ｇタンパク質共役型レセプター
を介する細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、ア
セチルコリン遊離、細胞内Ｃａ2+遊離、細胞内ｃＡＭＰ
産生促進・抑制、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリ
ン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内タンパク質のリン酸
化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下などを促進する活
性または抑制する活性など）を増強させる化合物、
（ロ）本発明のレセプタータンパク質またはその部分ペ
プチドの発現量を減少させることにより、該細胞刺激活
性を減弱させる化合物である。該化合物としては、ペプ
チド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、
発酵生産物などが挙げられ、これら化合物は新規な化合
物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。該
細胞刺激活性を増強させる化合物は、本発明のレセプタ
ータンパク質等の生理活性を増強するための安全で低毒
性な医薬として有用である。該細胞刺激活性を減弱させ
る化合物は、本発明のレセプタータンパク質等の生理活
性を減少させるための安全で低毒性な医薬として有用で
ある。
【００７４】本発明のスクリーニング方法を用いて得ら
れる化合物またはその塩を医薬組成物として使用する場
合、常套手段に従って実施することができる。例えば、
上記した本発明のレセプタータンパク質を含有する医薬
と同様にして、錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイ
クロカプセル剤、無菌性溶液、懸濁液剤などとすること
ができる。このようにして得られる製剤は安全で低毒性
であるので、例えば、ヒトやその他の哺乳動物（例え
ば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネ
コ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、投与対象、対象臓
器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与
の場合、一般的に、例えば、肥満症患者（６０ｋｇとし
て）においては、一日につき約０.１〜１００ｍｇ、好
ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０
〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１
回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などに
よっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常例え
ば、肥満症患者（６０ｋｇとして）においては、一日に
つき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜
２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度
を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物
の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与すること
ができる。
【００７５】（５）本発明のレセプタータンパク質また
はその部分ペプチドの発現量を変化させる化合物を含有
する各種疾病の予防および／または治療剤 本発明のレセプタータンパク質は上記のとおり、種々の
組織（例えば、脳、大腸、小腸、膵臓、卵巣、胃、心
臓、肝臓、精巣、胎盤、肺、脊髄、脾臓、胸腺、腎臓、
十二指腸、副腎、前立腺、下垂体、子宮など）で、何ら
かの重要な役割を果たしていると考えられる。したがっ
て、本発明のレセプタータンパク質またはその部分ペプ
チドの発現量を変化させる化合物は、本発明のレセプタ
ータンパク質の機能不全に関連する疾患の予防および／
または治療剤として用いることができる。該化合物を本
発明のレセプタータンパク質の機能不全に関連する疾患
の予防および／または治療剤として使用する場合は、常
套手段に従って製剤化することができる。例えば、該化
合物は、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、
エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的
に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る
液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で
非経口的に使用できる。例えば、該化合物を生理学的に
認められる公知の担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防
腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製
剤実施に要求される単位用量形態で混和することによっ
て製造することができる。これら製剤における有効成分
量は指示された範囲の適当な用量が得られるようにする
ものである。
【００７６】錠剤、カプセル剤などに混和することがで
きる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスター
チ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性
セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチ
ン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグ
ネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリ
ンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチ
ェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態
がカプセルである場合には、上記タイプの材料にさらに
油脂のような液状担体を含有することができる。注射の
ための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性
物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油など
を溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って
処方することができる。注射用の水性液としては、例え
ば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張
液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩
化ナトリウムなど）などが用いられ、適当な溶解補助
剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアル
コール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリ
コール）、非イオン性界面活性剤（例、ポリソルベート
８０TM、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。油性液
としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶
解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール
などと併用してもよい。
【００７７】また、上記予防・治療剤は、例えば、緩衝
剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝
液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸
プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミ
ン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、
ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤な
どと配合してもよい。調製された注射液は通常、適当な
アンプルに充填される。このようにして得られる製剤は
安全で低毒性であるので、例えば、ヒトやその他の哺乳
動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブ
タ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与するこ
とができる。該化合物またはその塩の投与量は、投与対
象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はある
が、経口投与の場合、一般的に例えば、肥満症患者（６
０ｋｇとして）においては、一日につき約０.１〜１０
０ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましく
は約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合
は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与
方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では
通常例えば、肥満症患者（６０ｋｇとして）において
は、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは
約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１
０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合であ
る。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を
投与することができる。
【００７８】（６）本発明のＧタンパク質共役型レセプ
タータンパク質に対するリガンドの定量法 本発明のレセプタータンパク質等は、リガンドに対して
結合性を有しているので、生体内におけるリガンド濃度
を感度良く定量することができる。本発明の定量法は、
例えば、競合法と組み合わせることによって用いること
ができる。すなわち、被検体を本発明のレセプタータン
パク質等と接触させることによって被検体中のリガンド
濃度を測定することができる。具体的には、例えば、以
下の（i）または（ii）などに記載の方法あるいはそれ
に準じる方法に従って用いることができる。 （i）入江寛編「ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭
和４９年発行） （ii）入江寛編「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、
昭和５４年発行）
【００７９】（７）本発明のＧタンパク質共役型レセプ
タータンパク質とリガンドとの結合性を変化させる化合
物（アゴニスト、アンタゴニストなど）のスクリーニン
グ方法 本発明のレセプタータンパク質等を用いるか、または組
換え型レセプタータンパク質等の発現系を構築し、該発
現系を用いたレセプター結合アッセイ系を用いることに
よって、リガンドと本発明のレセプタータンパク質等と
の結合性を変化させる化合物（例えば、ペプチド、タン
パク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物
など）またはその塩を効率よくスクリーニングすること
ができる。このような化合物には、（イ）Ｇタンパク質
共役型レセプターを介して細胞刺激活性（例えば、アラ
キドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ2+遊
離、細胞内ｃＡＭＰ産生促進・抑制、細胞内ｃＧＭＰ生
成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内
タンパク質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低
下などを促進する活性または抑制する活性など）を有す
る化合物（いわゆる、本発明のレセプタータンパク質に
対するアゴニスト）、（ロ）該細胞刺激活性を有しない
化合物（いわゆる、本発明のレセプタータンパク質に対
するアンタゴニスト）、（ハ）リガンドと本発明のＧタ
ンパク質共役型レセプタータンパク質との結合力を増強
する化合物、あるいは（ニ）リガンドと本発明のＧタン
パク質共役型レセプタータンパク質との結合力を減少さ
せる化合物などが含まれる（なお、上記（イ）の化合物
は、上記したリガンド決定方法によってスクリーニング
することが好ましい）。すなわち、本発明は、（i）本
発明のレセプタータンパク質もしくはその部分ペプチド
またはその塩と、リガンドとを接触させた場合と（ii）
本発明のレセプタータンパク質もしくはその部分ペプチ
ドまたはその塩と、リガンドおよび試験化合物とを接触
させた場合との比較を行なうことを特徴とするリガンド
と本発明のレセプタータンパク質もしくはその部分ペプ
チドまたはその塩との結合性を変化させる化合物または
その塩のスクリーニング方法を提供する。該リガンドの
具体例としては、本発明で用いられるポリペプチド（好
ましくは、前記の配列番号：８で表されるアミノ酸配列
と同一または実質的同一のアミノ酸配列を含有するポリ
ペプチドなど）が挙げられる。また、前記の配列番号：
１４０、配列番号：１４３、配列番号：１４６、配列番
号：１５２または配列番号：１５５で表わされるアミノ
酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含
有するペプチドなども挙げられる。配列番号：８で表さ
れるアミノ酸配列と同一または実質的同一のアミノ酸配
列を含有するポリペプチドとしては、配列番号：８で表
されるアミノ酸を有するポリペプチド、配列番号：９で
表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドなどが挙げ
られる。本発明のスクリーニング方法においては、
（i）と（ii）の場合における、例えば、該レセプター
タンパク質等に対するリガンドの結合量、細胞刺激活性
などを測定して、比較することを特徴とする。
【００８０】より具体的には、本発明は、（i）標識し
たリガンドを、本発明のレセプタータンパク質等に接触
させた場合と、標識したリガンドおよび試験化合物を本
発明のレセプタータンパク質等に接触させた場合におけ
る、標識したリガンドの該レセプタータンパク質等に対
する結合量を測定し、比較することを特徴とするリガン
ドと本発明のレセプタータンパク質等との結合性を変化
させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、（i
i）標識したリガンドを、本発明のレセプタータンパク
質等を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた
場合と、標識したリガンドおよび試験化合物を本発明の
レセプタータンパク質等を含有する細胞または該細胞の
膜画分に接触させた場合における、標識したリガンドの
該細胞または該膜画分に対する結合量を測定し、比較す
ることを特徴とするリガンドと本発明のレセプタータン
パク質等との結合性を変化させる化合物またはその塩の
スクリーニング方法、（iii）標識したリガンドを、本
発明のＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによ
って細胞膜上に発現したレセプタータンパク質等に接触
させた場合と、標識したリガンドおよび試験化合物を本
発明のＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによ
って細胞膜上に発現した本発明のレセプタータンパク質
等に接触させた場合における、標識したリガンドの該レ
セプタータンパク質等に対する結合量を測定し、比較す
ることを特徴とするリガンドと本発明のレセプタータン
パク質等との結合性を変化させる化合物またはその塩の
スクリーニング方法、
【００８１】（iv）本発明のレセプタータンパク質等を
活性化する化合物（例えば、本発明のレセプタータンパ
ク質等に対するリガンドなど）を本発明のレセプタータ
ンパク質等を含有する細胞に接触させた場合と、本発明
のレセプタータンパク質等を活性化する化合物および試
験化合物を本発明のレセプタータンパク質等を含有する
細胞に接触させた場合における、レセプターを介した細
胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリ
ン遊離、細胞内Ｃａ2+遊離、細胞内ｃＡＭＰ産生促進・
抑制、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、
細胞膜電位変動、細胞内タンパク質のリン酸化、ｃ−ｆ
ｏｓの活性化、ｐＨの低下などを促進する活性または抑
制する活性など）を測定し、比較することを特徴とする
リガンドと本発明のレセプタータンパク質等との結合性
を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方
法、および（v）本発明のレセプタータンパク質等を活
性化する化合物（例えば、本発明のレセプタータンパク
質等に対するリガンドなど）を本発明のＤＮＡを含有す
る形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現し
た本発明のレセプタータンパク質等に接触させた場合
と、本発明のレセプタータンパク質等を活性化する化合
物および試験化合物を本発明のＤＮＡを含有する形質転
換体を培養することによって細胞膜上に発現した本発明
のレセプタータンパク質等に接触させた場合における、
レセプターを介する細胞刺激活性（例えば、アラキドン
酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ2+遊離、細胞
内ｃＡＭＰ産生促進・抑制、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノ
シトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内タンパク
質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下などを
促進する活性または抑制する活性など）を測定し、比較
することを特徴とするリガンドと本発明のレセプタータ
ンパク質等との結合性を変化させる化合物またはその塩
のスクリーニング方法を提供する。
【００８２】本発明のレセプタータンパク質等が得られ
る以前は、Ｇタンパク質共役型レセプターアゴニストま
たはアンタゴニストをスクリーニングする場合、まずラ
ットなどのＧタンパク質共役型レセプタータンパク質を
含む細胞、組織またはその細胞膜画分を用いて候補化合
物を得て（一次スクリーニング）、その後に該候補化合
物が実際にヒトのＧタンパク質共役型レセプタータンパ
ク質とリガンドとの結合を阻害するか否かを確認する試
験（二次スクリーニング）が必要であった。細胞、組織
または細胞膜画分をそのまま用いれば他のレセプタータ
ンパク質も混在するために、目的とするレセプタータン
パク質に対するアゴニストまたはアンタゴニストを実際
にスクリーニングすることは困難であった。しかしなが
ら、例えば、本発明のラット由来レセプタータンパク質
を用いることによって、一次スクリーニングの必要がな
くなり、リガンドとＧタンパク質共役型レセプタータン
パク質との結合を阻害する化合物を効率良くスクリーニ
ングすることができる。さらに、スクリーニングされた
化合物がアゴニストかアンタゴニストかを簡便に評価す
ることができる。本発明のスクリーニング方法の具体的
な説明を以下にする。まず、本発明のスクリーニング方
法に用いる本発明のレセプタータンパク質等としては、
上記した本発明のレセプタータンパク質等を含有するも
のであれば何れのものであってもよいが、本発明のレセ
プタータンパク質等を含有する哺乳動物の臓器の細胞膜
画分が好適である。しかし、特にヒト由来の臓器は入手
が極めて困難なことから、スクリーニングに用いられる
ものとしては、組換え体を用いて大量発現させたヒト由
来のレセプタータンパク質等などが適している。
【００８３】本発明のレセプタータンパク質等を製造す
るには、上記の方法が用いられるが、本発明のＤＮＡを
哺乳細胞や昆虫細胞で発現することにより行なうことが
好ましい。目的とするタンパク質部分をコードするＤＮ
Ａ断片には相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）が用いられるが、必
ずしもこれに制約されるものではない。例えば、遺伝子
断片や合成ＤＮＡを用いてもよい。本発明のレセプター
タンパク質をコードするＤＮＡ断片を宿主動物細胞に導
入し、それらを効率よく発現させるためには、該ＤＮＡ
断片を昆虫を宿主とするバキュロウイルスに属する核多
角体病ウイルス（nuclear polyhedrosis virus；ＮＰ
Ｖ）のポリヘドリンプロモーター、ＳＶ４０由来のプロ
モーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオ
ネインプロモーター、ヒトヒートショックプロモータ
ー、サイトメガロウイルスプロモーター、ＳＲαプロモ
ーターなどの下流に組み込むのが好ましい。発現したレ
セプターの量と質の検査は公知の方法で行うことができ
る。例えば、文献〔Nambi，P．ら、ザ・ジャーナル・オ
ブ・バイオロジカル・ケミストリー（J. Biol. Che
m.）, 267巻, 19555〜19559頁, 1992年〕に記載の方法
に従って行なうことができる。したがって、本発明のス
クリーニング方法において、本発明のレセプタータンパ
ク質等を含有するものとしては、公知の方法に従って精
製したレセプタータンパク質等であってもよいし、該レ
セプタータンパク質等を含有する細胞を用いてもよく、
また該レセプタータンパク質等を含有する細胞の膜画分
を用いてもよい。
【００８４】本発明のスクリーニング方法において、本
発明のレセプタータンパク質等を含有する細胞を用いる
場合、該細胞をグルタルアルデヒド、ホルマリンなどで
固定化してもよい。固定化方法は公知の方法に従って行
なうことができる。本発明のレセプタータンパク質等を
含有する細胞としては、該レセプタータンパク質等を発
現した宿主細胞をいうが、該宿主細胞としては、大腸
菌、枯草菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞などが好まし
い。細胞膜画分としては、細胞を破砕した後、公知の方
法で得られる細胞膜が多く含まれる画分のことをいう。
細胞の破砕方法としては、Potter−Elvehjem型ホモジナ
イザーで細胞を押し潰す方法、ワーリングブレンダーや
ポリトロン（Kinematica社製）による破砕、超音波によ
る破砕、フレンチプレスなどで加圧しながら細胞を細い
ノズルから噴出させることによる破砕などが挙げられ
る。細胞膜の分画には、分画遠心分離法や密度勾配遠心
分離法などの遠心力による分画法が主として用いられ
る。例えば、細胞破砕液を低速（５００ｒｐｍ〜３００
０ｒｐｍ）で短時間（通常、約１分〜１０分）遠心し、
上清をさらに高速（１５０００ｒｐｍ〜３００００ｒｐ
ｍ）で通常３０分〜２時間遠心し、得られる沈澱を膜画
分とする。該膜画分中には、発現したレセプタータンパ
ク質等と細胞由来のリン脂質や膜タンパク質などの膜成
分が多く含まれる。該レセプタータンパク質等を含有す
る細胞や膜画分中のレセプタータンパク質の量は、１細
胞当たり１０3〜１０8分子であるのが好ましく、１０5
〜１０7分子であるのが好適である。なお、発現量が多
いほど膜画分当たりのリガンド結合活性（比活性）が高
くなり、高感度なスクリーニング系の構築が可能になる
ばかりでなく、同一ロットで大量の試料を測定できるよ
うになる。
【００８５】リガンドと本発明のレセプタータンパク質
等との結合性を変化させる化合物をスクリーニングする
上記の（i）〜（iii）を実施するためには、例えば、適
当なレセプタータンパク質画分と、標識したリガンドが
必要である。レセプタータンパク質画分としては、天然
型のレセプタータンパク質画分か、またはそれと同等の
活性を有する組換え型レセプタータンパク質画分などが
望ましい。ここで、同等の活性とは、同等のリガンド結
合活性、シグナル情報伝達作用などを示す。標識したリ
ガンドとしては、標識したリガンド、標識したリガンド
アナログ化合物などが用いられる。例えば〔3Ｈ〕、〔
125Ｉ〕、〔14Ｃ〕、〔35Ｓ〕などで標識されたリガン
ドなどが用いられる。具体的には、リガンドと本発明の
レセプタータンパク質等との結合性を変化させる化合物
のスクリーニングを行なうには、まず本発明のレセプタ
ータンパク質等を含有する細胞または細胞の膜画分を、
スクリーニングに適したバッファーに懸濁することによ
りレセプタータンパク質標品を調製する。バッファーに
は、ｐＨ４〜１０（望ましくはｐＨ６〜８）のリン酸バ
ッファー、トリス−塩酸バッファーなどのリガンドとレ
セプタータンパク質との結合を阻害しないバッファーで
あればいずれでもよい。また、非特異的結合を低減させ
る目的で、ＣＨＡＰＳ、Ｔween−８０TM（花王−アトラ
ス社）、ジギトニン、デオキシコレートなどの界面活性
剤をバッファーに加えることもできる。さらに、プロテ
アーゼによるレセプターやリガンドの分解を抑える目的
でＰＭＳＦ、ロイペプチン、Ｅ−６４（ペプチド研究所
製）、ペプスタチンなどのプロテアーゼ阻害剤を添加す
ることもできる。０.０１ｍｌ〜１０ｍｌの該レセプタ
ー溶液に、一定量（５０００ｃｐｍ〜５０００００ｃｐ
ｍ）の標識したリガンドを添加し、同時に１０-4Ｍ〜１
０-1 0Ｍの試験化合物を共存させる。非特異的結合量
（ＮＳＢ）を知るために大過剰の未標識のリガンドを加
えた反応チューブも用意する。反応は約０℃から５０
℃、望ましくは約４℃から３７℃で、約２０分から２４
時間、望ましくは約３０分から３時間行う。反応後、ガ
ラス繊維濾紙等で濾過し、適量の同バッファーで洗浄し
た後、ガラス繊維濾紙に残存する放射活性を液体シンチ
レーションカウンターまたはγ−カウンターで計測す
る。拮抗する物質がない場合のカウント（Ｂ0）から非
特異的結合量（ＮＳＢ）を引いたカウント（Ｂ0−ＮＳ
Ｂ）を１００％とした時、特異的結合量（Ｂ−ＮＳＢ）
が、例えば、５０％以下になる試験化合物を拮抗阻害能
力のある候補物質として選択することができる。
【００８６】リガンドと本発明のレセプタータンパク質
等との結合性を変化させる化合物スクリーニングする上
記の（iv）〜（v）の方法を実施するためには、例え
ば、レセプタータンパク質を介する細胞刺激活性（例え
ば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃ
ａ2+遊離、細胞内ｃＡＭＰ産生促進・抑制、細胞内ｃＧ
ＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、
細胞内タンパク質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐ
Ｈの低下などを促進する活性または抑制する活性など）
を公知の方法または市販の測定用キットを用いて測定す
ることができる。具体的には、まず、本発明のレセプタ
ータンパク質等を含有する細胞をマルチウェルプレート
等に培養する。スクリーニングを行なうにあたっては前
もって新鮮な培地あるいは細胞に毒性を示さない適当な
バッファーに交換し、試験化合物などを添加して一定時
間インキュベートした後、細胞を抽出あるいは上清液を
回収して、生成した産物をそれぞれの方法に従って定量
する。細胞刺激活性の指標とする物質（例えば、アラキ
ドン酸など）の生成が、細胞が含有する分解酵素によっ
て検定困難な場合は、該分解酵素に対する阻害剤を添加
してアッセイを行なってもよい。また、ｃＡＭＰ産生抑
制などの活性については、フォルスコリンなどで細胞の
基礎的産生量を増大させておいた細胞に対する産生抑制
作用として検出することができる。細胞刺激活性を測定
してスクリーニングを行なうには、適当なレセプタータ
ンパク質を発現した細胞が必要である。本発明のレセプ
タータンパク質等を発現した細胞としては、天然型の本
発明のレセプタータンパク質等を有する細胞株、上記の
組換え型レセプタータンパク質等を発現した細胞株など
が望ましい。試験化合物としては、例えば、ペプチド、
タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生
産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などが
用いられ、これら化合物は新規な化合物であってもよい
し、公知の化合物であってもよい。
【００８７】リガンドと本発明のレセプタータンパク質
等との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリ
ーニング用キットは、本発明のレセプタータンパク質
等、本発明のレセプタータンパク質等を含有する細胞、
または本発明のレセプタータンパク質等を含有する細胞
の膜画分を含有するものなどである。本発明のスクリー
ニング用キットの例としては、次のものが挙げられる。 １．スクリーニング用試薬 （i）測定用緩衝液および洗浄用緩衝液 Hanks' Balanced Salt Solution（ギブコ社製）に、０.
０５％のウシ血清アルブミン（シグマ社製）を加えたも
の。孔径０.４５μｍのフィルターで濾過滅菌し、４℃
で保存するか、あるいは用時調製しても良い。 （ii）Ｇタンパク質共役型レセプター標品 本発明のレセプタータンパク質を発現させたＣＨＯ細胞
を、１２穴プレートに５×１０5個／穴で継代し、３７
℃、５％ＣＯ2、９５％ａｉｒで２日間培養したもの。 （iii）標識リガンド 市販の〔3Ｈ〕、〔125Ｉ〕、〔14Ｃ〕、〔35Ｓ〕などで
標識したリガンド水溶液の状態のものを４℃あるいは−
２０℃にて保存し、用時に測定用緩衝液にて１μＭに希
釈する。 （iv）リガンド標準液 リガンドを０.１％ウシ血清アルブミン（シグマ社製）
を含むＰＢＳで１ｍＭとなるように溶解し、−２０℃で
保存する。
【００８８】２．測定法 （i）１２穴組織培養用プレートにて培養した本発明の
レセプタータンパク質発現ＣＨＯ細胞を、測定用緩衝液
１ｍｌで２回洗浄した後、４９０μｌの測定用緩衝液を
各穴に加える。 （ii）１０-3〜１０-10Ｍの試験化合物溶液を５μｌ加
えた後、標識リガンドを５μｌ加え、室温にて１時間反
応させる。非特異的結合量を知るためには試験化合物の
代わりに１０-3Ｍのリガンドを５μｌ加えておく。 （iii）反応液を除去し、１ｍｌの洗浄用緩衝液で３回
洗浄する。細胞に結合した標識リガンドを０．２Ｎ Ｎ
ａＯＨ−１％ＳＤＳで溶解し、４ｍｌの液体シンチレー
ターＡ（和光純薬製）と混合する。 （iv）液体シンチレーションカウンター（ベックマン社
製）を用いて放射活性を測定し、Percent Maximum Bind
ing（ＰＭＢ）を次の式で求める。 ＰＭＢ＝［（Ｂ−ＮＳＢ）／（Ｂ0−ＮＳＢ）］×１０
０ ＰＭＢ：Percent Maximum Binding Ｂ ：検体を加えた時の値 ＮＳＢ：Non-specific Binding（非特異的結合量） Ｂ0 ：最大結合量
【００８９】本発明のスクリーニング方法またはスクリ
ーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩
は、リガンドと本発明のレセプタータンパク質等との結
合性を変化させる作用を有する化合物であり、具体的に
は、（イ）Ｇタンパク質共役型レセプターを介して細胞
刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン
遊離、細胞内Ｃａ2+遊離、細胞内ｃＡＭＰ産生促進・抑
制、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細
胞膜電位変動、細胞内タンパク質のリン酸化、ｃ−ｆｏ
ｓの活性化、ｐＨの低下などを促進する活性または抑制
する活性など）を有する化合物（いわゆる、本発明のレ
セプタータンパク質に対するアゴニスト）、（ロ）該細
胞刺激活性を有しない化合物（いわゆる、本発明のレセ
プタータンパク質に対するアンタゴニスト）、（ハ）リ
ガンドと本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパ
ク質との結合力を増強する化合物、あるいは（ニ）リガ
ンドと本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク
質との結合力を減少させる化合物である。該化合物とし
ては、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合
成化合物、発酵生産物などが挙げられ、これら化合物は
新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であって
もよい。本発明のスクリーニング方法またはスクリーニ
ング用キットを用いて得られる、リガンドと本発明のレ
セプタータンパク質等との結合性を変化させる作用を有
する化合物は、リガンドと本発明のレセプタータンパク
質等との結合性を調節することができるので、安全で低
毒性な医薬として有用である。該医薬としては、例え
ば、拒食症の予防・治療薬；食欲（摂食）増進剤；下垂
体ホルモン分泌不全〔例、プロラクチン分泌不全（例、
卵巣機能低下症、精嚢発育不全、更年期障害、甲状腺機
能低下等）〕の予防・治療薬；肥満症〔例、悪性肥満細
胞症（malignant mastocytosis）、外因性肥満 （exoge
nous obesity）、過インシュリン性肥満症（hyperinsul
inar obesity）、過血漿性肥満（hyperplasmic obesit
y）、下垂体性肥満（hypophyseal adiposity）、減血漿
性肥満症（hypoplasmic obesity）、甲状腺機能低下肥
満症（hypothyroid obesity）、視床下部性肥満（hypot
halamic obesity）、症候性肥満症（symptomatic obesi
ty）、小児肥満（infantile obesity）、上半身肥満（u
pper body obesity）、食事性肥満症（alimentaryobesi
ty）、性機能低下性肥満（hypogonadal obesity）、全
身性肥満細胞症（systemic mastocytosis）、単純性肥
満（simple obesity）、中心性肥満（centralobesity）
など〕、摂食亢進症（hyperphagia）などの予防・治療
薬；下垂体腺腫瘍、間脳腫瘍、月経異常、自己免疫疾
患、プロラクチノーマ、不妊症、インポテンス、無月経
症、乳汁漏症、末端肥大症、キアリ・フロンメル症候
群、アルゴンツ・デル・カスティロ症候群、フォーベス
・アルブライト症候群、リンパ腫、シーハン症候群、精
子形成異常などの安全で低毒性な予防・治療剤（プロラ
クチン産生抑制剤）などが挙げられる。好ましくは肥満
症、摂食亢進症などの安全で低毒性な予防・治療薬や食
欲増進剤などが挙げられる。なかでも、本発明のレセプ
タータンパク質等に対するアゴニストは、本発明のレセ
プタータンパク質等に対するリガンドが有する生理活性
と同様の作用を有しているので、該リガンド活性に応じ
て安全で低毒性な医薬として有用である。該医薬として
は、例えば、拒食症の予防・治療薬、食欲（摂食）増進
剤、下垂体ホルモン分泌不全〔例、プロラクチン分泌不
全（例、卵巣機能低下症、精嚢発育不全、更年期障害、
甲状腺機能低下等）〕の予防・治療薬などが挙げられ
る。一方、本発明のレセプタータンパク質等に対するア
ンタゴニストは、本発明のレセプタータンパク質等に対
するリガンドが有する生理活性を抑制することができる
ので、該リガンド活性を抑制する安全で低毒性な医薬と
して有用である。該医薬としては、例えば、肥満症
〔例、悪性肥満細胞症（malignant mastocytosis)、外
因性肥満 （exogenous obesity)、過インシュリン性肥
満症（hyperinsulinar obesity)、過血漿性肥満（hyper
plasmic obesity)、下垂体性肥満（hypophyseal adipos
ity)、減血漿性肥満症（hypoplasmic obesity)、甲状腺
機能低下肥満症（hypothyroid obesity)、視床下部性肥
満（hypothalamic obesity)、症候性肥満症（symptomat
ic obesity)、小児肥満（infantile obesity)、上半身
肥満（upper body obesity)、食事性肥満症（alimentar
y obesity)、性機能低下性肥満（hypogonadal obesit
y)、全身性肥満細胞症（systemic mastocytosis)、単純
性肥満（simple obesity)、中心性肥満（central obesi
ty）など〕、摂食亢進症（hyperphagia）などの予防・
治療薬、、下垂体腺腫瘍、間脳腫瘍、月経異常、自己免
疫疾患、プロラクチノーマ、不妊症、インポテンス、無
月経症、乳汁漏症、末端肥大症、キアリ・フロンメル症
候群、アルゴンツ・デル・カスティロ症候群、フォーベ
ス・アルブライト症候群、リンパ腫、シーハン症候群、
精子形成異常などの安全で低毒性な予防・治療剤（プロ
ラクチン産生抑制剤）、好ましくは肥満症、摂食亢進症
などの安全で低毒性な予防・治療薬などが挙げられる。
リガンドと本発明のＧタンパク質共役型レセプタータン
パク質との結合力を増強する化合物は、本発明のレセプ
タータンパク質等に対するリガンドが有する生理活性を
増強するための安全で低毒性な医薬として有用である。
リガンドと本発明のＧタンパク質共役型レセプタータン
パク質との結合力を減少させる化合物は、本発明のレセ
プタータンパク質等に対するリガンドが有する生理活性
を減少させるための安全で低毒性な医薬として有用であ
る。
【００９０】本発明のスクリーニング方法またはスクリ
ーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩
を上記の医薬組成物として使用する場合、常套手段に従
って実施することができる。例えば、上記した本発明の
レセプタータンパク質を含有する医薬と同様にして、錠
剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤、
無菌性溶液、懸濁液剤などとすることができる。このよ
うにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例え
ば、ヒトや哺乳動物（例えば、ラット、ウサギ、ヒツ
ジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与
することができる。該化合物またはその塩の投与量は、
投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異は
あるが、経口投与の場合、一般的に例えば、肥満症患者
（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０.１〜
１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ま
しくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する
場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、
投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形
では通常例えば、肥満症患者（６０ｋｇとして）におい
ては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましく
は約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜
１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合であ
る。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を
投与することができる。
【００９１】（８）本発明のＧタンパク質共役型レセプ
タータンパク質とリガンドとの結合性を変化させる化合
物（アゴニスト、アンタゴニスト）を含有する各種疾病
の予防および／または治療剤 本発明のレセプタータンパク質は上記のとおり、例えば
中枢機能、循環機能、消化機能、心機能など生体内で何
らかの重要な役割を果たしていると考えられる。従っ
て、本発明のレセプタータンパク質とリガンドとの結合
性を変化させる化合物（アゴニスト、アンタゴニスト）
や本発明のレセプタータンパク質に対するリガンドは、
本発明のレセプタータンパク質の機能不全に関連する疾
患の予防および／または治療剤として用いることができ
る。該化合物やリガンドを本発明のレセプタータンパク
質の機能不全に関連する疾患の予防および／または治療
剤として使用する場合は、常套手段に従って製剤化する
ことができる。例えば、該化合物やリガンドは、必要に
応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、
マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水も
しくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶
液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用
できる。例えば、該化合物を生理学的に認められる公知
の担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、
結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求さ
れる単位用量形態で混和することによって製造すること
ができる。これら製剤における有効成分量は指示された
範囲の適当な用量が得られるようにするものである。
【００９２】錠剤、カプセル剤などに混和することがで
きる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスター
チ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性
セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチ
ン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグ
ネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリ
ンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチ
ェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態
がカプセルである場合には、上記タイプの材料にさらに
油脂のような液状担体を含有することができる。注射の
ための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性
物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油など
を溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って
処方することができる。注射用の水性液としては、例え
ば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張
液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩
化ナトリウムなど）などが用いられ、適当な溶解補助
剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアル
コール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリ
コール）、非イオン性界面活性剤（例、ポリソルベート
８０TM、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。油性液
としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶
解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール
などと併用してもよい。
【００９３】また、上記予防・治療剤は、例えば、緩衝
剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝
液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸
プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミ
ン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、
ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤な
どと配合してもよい。調製された注射液は通常、適当な
アンプルに充填される。さらに、上記予防・治療剤は適
当な薬剤と組み合わせて例えば本発明のレセプタータン
パク質が高発現している臓器や組織を特異的なターゲッ
トとしたＤＤＳ製剤として使用することもできる。この
ようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例
えば、ヒトやその他の哺乳動物（例えば、ラット、マウ
ス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルな
ど）に対して投与することができる。該化合物またはそ
の塩の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法
などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例
えば、肥満症患者（６０ｋｇとして）においては、一日
につき約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５
０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非
経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、
対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例
えば、注射剤の形では通常例えば、肥満症患者（６０ｋ
ｇとして）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍ
ｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ま
しくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与す
るのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当た
りに換算した量を投与することができる。
【００９４】（９）本発明のレセプタータンパク質もし
くはその部分ペプチドまたはそれらの塩の定量 本発明の抗体は、本発明のレセプタータンパク質等を特
異的に認識することができるので、被検液中の本発明の
レセプタータンパク質等の定量、特にサンドイッチ免疫
測定法による定量などに使用することができる。すなわ
ち、本発明は、例えば、（ｉ）本発明の抗体と、被検液
および標識化レセプタータンパク質等とを競合的に反応
させ、該抗体に結合した標識化レセプタータンパク質等
の割合を測定することを特徴とする被検液中の本発明の
レセプタータンパク質等の定量法、（ii）被検液と担体
上に不溶化した本発明の抗体および標識化された本発明
の抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、不溶
化担体上の標識剤の活性を測定することを特徴とする被
検液中の本発明のレセプタータンパク質等の定量法を提
供する。上記（ii）においては、一方の抗体が本発明の
レセプタータンパク質等のＮ端部を認識する抗体で、他
方の抗体が本発明のレセプタータンパク質等のＣ端部に
反応する抗体であることが好ましい。
【００９５】本発明のレセプタータンパク質等に対する
モノクローナル抗体（以下、本発明のモノクローナル抗
体と称する場合がある）を用いて本発明のレセプタータ
ンパク質等の測定を行なえるほか、組織染色等による検
出を行なうこともできる。これらの目的には、抗体分子
そのものを用いてもよく、また、抗体分子のＦ(ａ
ｂ')2、Ｆａｂ'、あるいはＦａｂ画分を用いてもよい。
本発明のレセプタータンパク質等に対する抗体を用いる
測定法は、特に制限されるべきものではなく、被測定液
中の抗原量（例えば、レセプタータンパク質量）に対応
した抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的
または物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を
含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定
法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、
ネフロメトリー、競合法、イムノメトリック法およびサ
ンドイッチ法が好適に用いられるが、感度、特異性の点
で、後に記載するサンドイッチ法を用いるのが特に好ま
しい。標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤とし
ては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光
物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例え
ば、〔125Ｉ〕、〔131Ｉ〕、〔3Ｈ〕、〔14Ｃ〕などが
用いられる。上記酵素としては、安定で比活性の大きな
ものが好ましく、例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−
グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキ
シダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光
物質としては、例えば、フルオレスカミン、フルオレッ
センイソチオシアネートなどが用いられる。発光物質と
しては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシ
フェリン、ルシゲニンなどが用いられる。さらに、抗体
あるいは抗原と標識剤との結合にビオチン−アビジン系
を用いることもできる。
【００９６】抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、物
理吸着を用いてもよく、また通常、タンパク質あるいは
酵素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を
用いる方法でもよい。担体としては、例えば、アガロー
ス、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポ
リスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹
脂、あるいはガラス等が用いられる。サンドイッチ法に
おいては不溶化した本発明のモノクローナル抗体に被検
液を反応させ（１次反応）、さらに標識化した本発明の
モノクローナル抗体を反応させ（２次反応）た後、不溶
化担体上の標識剤の活性を測定することにより被検液中
の本発明のレセプタータンパク質量を定量することがで
きる。１次反応と２次反応は逆の順序に行なっても、ま
た、同時に行なってもよいし時間をずらして行なっても
よい。標識化剤および不溶化の方法は上記のそれらに準
じることができる。また、サンドイッチ法による免疫測
定法において、固相用抗体あるいは標識用抗体に用いら
れる抗体は必ずしも１種類である必要はなく、測定感度
を向上させる等の目的で２種類以上の抗体の混合物を用
いてもよい。本発明のサンドイッチ法によるレセプター
タンパク質等の測定法においては、１次反応と２次反応
に用いられる本発明のモノクローナル抗体はレセプター
タンパク質等の結合する部位が相異なる抗体が好ましく
用いられる。すなわち、１次反応および２次反応に用い
られる抗体は、例えば、２次反応で用いられる抗体が、
レセプタータンパク質のＣ端部を認識する場合、１次反
応で用いられる抗体は、好ましくはＣ端部以外、例えば
Ｎ端部を認識する抗体が用いられる。
【００９７】本発明のモノクローナル抗体をサンドイッ
チ法以外の測定システム、例えば、競合法、イムノメト
リック法あるいはネフロメトリーなどに用いることがで
きる。競合法では、被検液中の抗原と標識抗原とを抗体
に対して競合的に反応させたのち、未反応の標識抗原と
(Ｆ）と抗体と結合した標識抗原（Ｂ）とを分離し（Ｂ
／Ｆ分離）、Ｂ，Ｆいずれかの標識量を測定し、被検液
中の抗原量を定量する。本反応法には、抗体として可溶
性抗体を用い、Ｂ／Ｆ分離をポリエチレングリコール、
上記抗体に対する第２抗体などを用いる液相法、およ
び、第１抗体として固相化抗体を用いるか、あるいは、
第１抗体は可溶性のものを用い第２抗体として固相化抗
体を用いる固相化法とが用いられる。イムノメトリック
法では、被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識
化抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離する
か、あるいは、被検液中の抗原と過剰量の標識化抗体と
を反応させ、次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗体
を固相に結合させたのち、固相と液相を分離する。次
に、いずれかの相の標識量を測定し被検液中の抗原量を
定量する。また、ネフロメトリーでは、ゲル内あるいは
溶液中で抗原抗体反応の結果、生じた不溶性の沈降物の
量を測定する。被検液中の抗原量が僅かであり、少量の
沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用す
るレーザーネフロメトリーなどが好適に用いられる。
【００９８】これら個々の免疫学的測定法を本発明の測
定方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の
設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の
条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発
明のレセプタータンパク質またはその塩の測定系を構築
すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細について
は、総説、成書などを参照することができる〔例えば、
入江 寛編「ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和４
９年発行）、入江 寛編「続ラジオイムノアッセイ」
（講談社、昭和５４年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫
測定法」（医学書院、昭和５３年発行）、石川栄治ら編
「酵素免疫測定法」（第２版）（医学書院、昭和５７年
発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第３版）
（医学書院、昭和６２年発行）、「メソッズ・イン・エ
ンジモノジー（Methods in ENZYMOLOGY）」 Vol. 70(Imm
unochemical Techniques(Part A))、 同書 Vol. 73(Imm
unochemical Techniques(Part B))、 同書 Vol. 74(Imm
unochemical Techniques(PartC))、 同書 Vol. 84(Immu
nochemical Techniques(Part D:Selected Immunoassay
s))、 同書 Vol. 92(Immunochemical Techniques(Part
E:Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Me
thods))、 同書 Vol. 121(Immunochemical Techniques
(Part I:Hybridoma Technology and Monoclonal Antibo
dies))(以上、アカデミックプレス社発行)など参照〕。
以上のように、本発明の抗体を用いることによって、本
発明のレセプタータンパク質またはその塩を感度良く定
量することができる。さらに、本発明の抗体を用いて、
生体内での本発明のレセプタータンパク質またその塩を
定量することによって、本発明のレセプタータンパク質
の機能不全に関連する各種疾患の診断をすることができ
る。また、本発明の抗体は、体液や組織などの被検体中
に存在する本発明のレセプタータンパク質等を特異的に
検出するために使用することができる。また、本発明の
レセプタータンパク質等を精製するために使用する抗体
カラムの作製、精製時の各分画中の本発明のレセプター
タンパク質等の検出、被検細胞内における本発明のレセ
プタータンパク質の挙動の分析などのために使用するこ
とができる。
【００９９】（１０）細胞膜における本発明のレセプタ
ータンパク質またはその部分ペプチドの量を変化させる
化合物のスクリーニング方法 本発明の抗体は、本発明のレセプタータンパク質もしく
はその部分ペプチドまたはそれらの塩を特異的に認識す
ることができるので、細胞膜における本発明のレセプタ
ータンパク質またはその部分ペプチドの量を変化させる
化合物のスクリーニングに用いることができる。すなわ
ち本発明は、例えば、（ｉ）非ヒト哺乳動物の（a）血
液、（b）特定の臓器、（c）臓器から単離した組織もし
くは細胞等を破壊した後、細胞膜画分を単離し、細胞膜
画分に含まれる本発明のレセプタータンパク質またはそ
の部分ペプチドを定量することによる、細胞膜における
本発明のレセプタータンパク質またはその部分ペプチド
の量を変化させる化合物のスクリーニング方法、（ii）
本発明のレセプタータンパク質もしくはその部分ペプチ
ドを発現する形質転換体等を破砕した後、細胞膜画分を
単離し、細胞膜画分に含まれる本発明のレセプタータン
パク質またはその部分ペプチドを定量することによる、
細胞膜における本発明のレセプタータンパク質またはそ
の部分ペプチドの量を変化させる化合物のスクリーニン
グ方法、（iii）非ヒト哺乳動物の（a）血液、（b）特
定の臓器、（c）臓器から単離した組織もしくは細胞等
を切片とした後、免疫染色法を用いることにより、細胞
表層での該レセプタータンパク質の染色度合いを定量化
することにより、細胞膜上の該タンパク質を確認するこ
とによる、細胞膜における本発明のレセプタータンパク
質またはその部分ペプチドの量を変化させる化合物のス
クリーニング方法を提供する。（iv）本発明のレセプタ
ータンパク質もしくはその部分ペプチドを発現する形質
転換体等を切片とした後、免疫染色法を用いることによ
り、細胞表層での該レセプタータンパク質の染色度合い
を定量化することにより、細胞膜上の該タンパク質を確
認することによる、細胞膜における本発明のレセプター
タンパク質またはその部分ペプチドの量を変化させる化
合物のスクリーニング方法を提供する。
【０１００】細胞膜画分に含まれる本発明のレセプター
タンパク質またはその部分ペプチドの定量は具体的には
以下のようにして行なう。 （ｉ）正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物（例え
ば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネ
コ、イヌ、サルなど、より具体的には痴呆ラット、肥満
マウス、動脈硬化ウサギ、担癌マウスなど）に対して、
薬剤（例えば、抗痴呆薬、血圧低下薬、抗癌剤、抗肥満
薬など）あるいは物理的ストレス（例えば、浸水ストレ
ス、電気ショック、明暗、低温など）などを与え、一定
時間経過した後に、血液、あるいは特定の臓器（例え
ば、脳、肺、大腸など）、または臓器から単離した組
織、あるいは細胞を得る。得られた臓器、組織または細
胞等を、例えば、適当な緩衝液（例えば、トリス塩酸緩
衝液、リン酸緩衝液、ヘペス緩衝液など）等に懸濁し、
臓器、組織あるいは細胞を破壊し、界面活性剤（例え
ば、トリトンＸ１００TM、ツイーン２０TMなど）などを
用い、さらに遠心分離や濾過、カラム分画などの手法を
用いて細胞膜画分を得る。
【０１０１】細胞膜画分としては、細胞を破砕した後、
公知の方法で得られる細胞膜が多く含まれる画分のこと
をいう。細胞の破砕方法としては、Potter−Elvehjem型
ホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、ワーリングブレ
ンダーやポリトロン（Kinematica社製）による破砕、超
音波による破砕、フレンチプレスなどで加圧しながら細
胞を細いノズルから噴出させることによる破砕などが挙
げられる。細胞膜の分画には、分画遠心分離法や密度勾
配遠心分離法などの遠心力による分画法が主として用い
られる。例えば、細胞破砕液を低速（５００ｒｐｍ〜３
０００ｒｐｍ）で短時間（通常、約１分〜１０分）遠心
し、上清をさらに高速（１５０００ｒｐｍ〜３００００
ｒｐｍ）で通常３０分〜２時間遠心し、得られる沈澱を
膜画分とする。該膜画分中には、発現したレセプタータ
ンパク質等と細胞由来のリン脂質や膜タンパク質などの
膜成分が多く含まれる。細胞膜画分に含まれる本発明の
レセプタータンパク質またはその部分ペプチドは、例え
ば、本発明の抗体を用いたサンドイッチ免疫測定法、ウ
エスタンブロット解析などにより定量することができ
る。かかるサンドイッチ免疫測定法は上記の方法と同様
にして行なうことができ、ウエスタンブロットは公知の
手段により行なうことができる。
【０１０２】（ii）本発明のレセプタータンパク質もし
くはその部分ペプチドを発現する形質転換体を上記の方
法に従い作製し、細胞膜画分に含まれる本発明のレセプ
タータンパク質またはその部分ペプチドを定量すること
ができる。 細胞膜における本発明のレセプタータンパク質またはそ
の部分ペプチドの量を変化させる化合物のスクリーニン
グは、 （ｉ）正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物に対し
て、薬剤あるいは物理的ストレスなどを与える一定時間
前（３０分前〜２４時間前、好ましくは３０分前〜１２
時間前、より好ましくは１時間前〜６時間前）もしくは
一定時間後（３０分後〜３日後、好ましくは１時間後〜
２日後、より好ましくは１時間後〜２４時間後）、また
は薬剤あるいは物理的ストレスと同時に被検化合物を投
与し、投与後一定時間経過後（３０分後〜３日後、好ま
しくは１時間後〜２日後、より好ましくは１時間後〜２
４時間後）、細胞膜における本発明のレセプタータンパ
ク質またはその部分ペプチドの量を定量することにより
行なうことができ、 （ii）形質転換体を常法に従い培養する際に被検化合物
を培地中に混合させ、一定時間培養後（１日後〜７日
後、好ましくは１日後〜３日後、より好ましくは２日後
〜３日後）、細胞膜における本発明のレセプタータンパ
ク質またはその部分ペプチドの量を定量することにより
行なうことができる。
【０１０３】細胞膜画分に含まれる本発明のレセプター
タンパク質またはその部分ペプチドの確認は具体的には
以下のようにして行なう。 （iii）正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物（例え
ば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネ
コ、イヌ、サルなど、より具体的には痴呆ラット、肥満
マウス、動脈硬化ウサギ、担癌マウスなど）に対して、
薬剤（例えば、抗痴呆薬、血圧低下薬、抗癌剤、抗肥満
薬など）あるいは物理的ストレス（例えば、浸水ストレ
ス、電気ショック、明暗、低温など）などを与え、一定
時間経過した後に、血液、あるいは特定の臓器（例え
ば、脳、大腸、小腸、膵臓、卵巣、胃、心臓、肝臓、精
巣、胎盤、肺、脊髄、脾臓、胸腺、腎臓、十二指腸、副
腎、前立腺、下垂体、子宮など）または臓器から単離し
た組織、あるいは細胞を得る。得られた臓器、組織また
は細胞等を、常法に従い組織切片とし、本発明の抗体を
用いて免疫染色を行う。細胞表層での該レセプタータン
パク質の染色度合いを定量化することにより、細胞膜上
の該タンパク質を確認することにより、定量的または定
性的に、細胞膜における本発明のレセプタータンパク質
またはその部分ペプチドの量を確認することができる。 （iv）本発明のレセプタータンパク質もしくはその部分
ペプチドを発現する形質転換体等を用いて同様の手段を
とることにより確認することもできる。
【０１０４】本発明のスクリーニング方法を用いて得ら
れる化合物またはその塩は、細胞膜における本発明のレ
セプタータンパク質またはその部分ペプチドの量を変化
させる作用を有する化合物であり、具体的には、（イ）
細胞膜における本発明のレセプタータンパク質またはそ
の部分ペプチドの量を増加させることにより、Ｇタンパ
ク質共役型レセプターを介する細胞刺激活性（例えば、
アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ2+
遊離、細胞内ｃＡＭＰ産生促進・抑制、細胞内ｃＧＭＰ
生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞
内タンパク質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの
低下などを促進する活性または抑制する活性など）を増
強させる化合物、（ロ）細胞膜における本発明のレセプ
タータンパク質またはその部分ペプチドの量を減少させ
ることにより、該細胞刺激活性を減弱させる化合物であ
る。該化合物としては、ペプチド、タンパク質、非ペプ
チド性化合物、合成化合物、発酵生産物などが挙げら
れ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公
知の化合物であってもよい。該細胞刺激活性を増強させ
る化合物は、本発明のレセプタータンパク質等の生理活
性を増強するための安全で低毒性な医薬として有用であ
る。該細胞刺激活性を減弱させる化合物は、本発明のレ
セプタータンパク質等の生理活性を減少させるための安
全で低毒性な医薬として有用である。
【０１０５】本発明のスクリーニング方法を用いて得ら
れる化合物またはその塩を医薬組成物として使用する場
合、常套手段に従って実施することができる。例えば、
上記した本発明のレセプタータンパク質を含有する医薬
と同様にして、錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイ
クロカプセル剤、無菌性溶液、懸濁液剤などとすること
ができる。このようにして得られる製剤は安全で低毒性
であるので、例えば、ヒトやその他の哺乳動物（例え
ば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネ
コ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、投与対象、対象臓
器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与
の場合、一般的に例えば、肥満症患者（６０ｋｇとし
て）においては、一日につき約０.１〜１００ｍｇ、好
ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０
〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１
回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などに
よっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常例え
ば、肥満症患者（６０ｋｇとして）においては、一日に
つき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜
２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度
を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物
の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与すること
ができる。
【０１０６】（１１）細胞膜における本発明のレセプタ
ータンパク質またはその部分ペプチドの量を変化させる
化合物を含有する各種疾病の予防および／または治療剤 本発明のレセプタータンパク質は上記のとおり、種々の
組織（例えば、脳、大腸、小腸、膵臓、卵巣、胃、心
臓、肝臓、精巣、胎盤、肺、脊髄、脾臓、胸腺、腎臓、
十二指腸、副腎、前立腺、下垂体、子宮など）で何らか
の重要な役割を果たしていると考えられる。したがっ
て、細胞膜における本発明のレセプタータンパク質また
はその部分ペプチドの量を変化させる化合物は、本発明
のレセプタータンパク質の機能不全に関連する疾患の予
防および／または治療剤として用いることができる。該
化合物を本発明のレセプタータンパク質の機能不全に関
連する疾患の予防および／または治療剤として使用する
場合は、常套手段に従って製剤化することができる。例
えば、該化合物は、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カ
プセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとし
て経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許
容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射
剤の形で非経口的に使用できる。例えば、該化合物を生
理学的に認められる公知の担体、香味剤、賦形剤、ベヒ
クル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認め
られた製剤実施に要求される単位用量形態で混和するこ
とによって製造することができる。これら製剤における
有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られるよ
うにするものである。
【０１０７】錠剤、カプセル剤などに混和することがで
きる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスター
チ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性
セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチ
ン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグ
ネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリ
ンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチ
ェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態
がカプセルである場合には、上記タイプの材料にさらに
油脂のような液状担体を含有することができる。注射の
ための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性
物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油など
を溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って
処方することができる。注射用の水性液としては、例え
ば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張
液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩
化ナトリウムなど）などが用いられ、適当な溶解補助
剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアル
コール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリ
コール）、非イオン性界面活性剤（例、ポリソルベート
８０TM、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。油性液
としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶
解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール
などと併用してもよい。
【０１０８】また、上記予防・治療剤は、例えば、緩衝
剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝
液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸
プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミ
ン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、
ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤な
どと配合してもよい。調製された注射液は通常、適当な
アンプルに充填される。このようにして得られる製剤は
安全で低毒性であるので、例えば、ヒトやその他の哺乳
動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブ
タ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与するこ
とができる。該化合物またはその塩の投与量は、投与対
象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はある
が、経口投与の場合、一般的に例えば、肥満症患者（６
０ｋｇとして）においては、一日につき約０.１〜１０
０ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましく
は約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合
は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与
方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では
通常例えば、肥満症患者（６０ｋｇとして）において
は、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは
約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１
０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合であ
る。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を
投与することができる。
【０１０９】（１２）本発明のレセプタータンパク質、
その部分ペプチドまたはそれらの塩に対する抗体による
中和 本発明のレセプタータンパク質もしくはその部分ペプチ
ドまたはその塩に対する抗体の、それらレセプタータン
パク質などに対する中和活性とは、すなわち、該レセプ
タータンパク質の関与するシグナル伝達機能を不活性化
する活性を意味する。従って、該抗体が中和活性を有す
る場合は、該レセプタータンパク質の関与するシグナル
伝達、例えば、該レセプタータンパク質を介する細胞刺
激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊
離、細胞内Ｃａ2+遊離、細胞内ｃＡＭＰ産生促進・抑
制、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細
胞膜電位変動、細胞内タンパク質のリン酸化、ｃ−ｆｏ
ｓの活性化、ｐＨの低下などを促進する活性または抑制
する活性など）を不活性化することができる。したがっ
て、該レセプタータンパク質の過剰発現などに起因する
疾患の予防および／または治療に用いることができる。
【０１１０】（１３）本発明のＧタンパク質共役型レセ
プタータンパク質をコードするＤＮＡを有する動物 本発明のＤＮＡを用いて、本発明のレセプタータンパク
質等を発現するトランスジェニック動物を作出すること
ができる。動物としては、哺乳動物（例えば、ラット、
マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サ
ルなど）など（以下、動物と略記する場合がある）が挙
げられるが、特に、マウス、ウサギなどが好適である。
本発明のＤＮＡを対象動物に導入するにあたり、該ＤＮ
Ａを動物細胞で発現させうるプロモーターの下流に結合
した遺伝子コンストラクトとして用いるのが一般に有利
である。例えば、ウサギ由来の本発明のＤＮＡを導入す
る場合、これと相同性が高い動物由来の本発明のＤＮＡ
を動物細胞で発現させうる各種プロモーターの下流に結
合した遺伝子コンストラクトを、例えば、ウサギ受精卵
へマイクロインジェクションすることによって本発明の
レセプタータンパク質等を高産生するＤＮＡ導入動物を
作出できる。このプロモーターとしては、例えば、ウイ
ルス由来プロモーター、メタロチオネイン等のユビキア
スな発現プロモーターも使用しうるが、好ましくは脳、
肺、胃、心臓、腎臓などで特異的に発現する遺伝子のプ
ロモーターが用いられる。
【０１１１】受精卵細胞段階における本発明のＤＮＡの
導入は、対象動物の胚芽細胞および体細胞の全てに存在
するように確保される。ＤＮＡ導入後の作出動物の胚芽
細胞において本発明のレセプタータンパク質等が存在す
ることは、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体
細胞の全てに本発明のレセプタータンパク質等の遺伝子
（ＤＮＡ）を有することを意味する。遺伝子を受け継い
だこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞の全
てに本発明のレセプタータンパク質等を有する。本発明
のＤＮＡ導入動物は、交配により遺伝子を安定に保持す
ることを確認して、該ＤＮＡ保有動物として通常の飼育
環境で飼育継代を行うことができる。さらに、目的ＤＮ
Ａを保有する雌雄の動物を交配することにより、導入遺
伝子を相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取
得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子
孫が該ＤＮＡを有するように繁殖継代することができ
る。本発明のＤＮＡが導入された動物は、本発明のレセ
プタータンパク質等が高発現させられているので、本発
明のレセプタータンパク質等に対するアゴニストまたは
アンタゴニストのスクリーニング用の動物などとして有
用である。本発明のＤＮＡ導入動物を、組織培養のため
の細胞源として使用することもできる。例えば、本発明
のＤＮＡ導入マウスの組織中のＤＮＡもしくはＲＮＡを
直接分析するか、あるいは遺伝子により発現された本発
明のレセプタータンパク質が存在する組織を分析するこ
とにより、本発明のレセプタータンパク質等について分
析することができる。本発明のレセプタータンパク質等
を有する組織の細胞を標準組織培養技術により培養し、
これらを使用して、例えば、脳や末梢組織由来のような
一般に培養困難な組織からの細胞の機能を研究すること
ができる。また、その細胞を用いることにより、例え
ば、各種組織の機能を高めるような医薬の選択も可能で
ある。また、高発現細胞株があれば、そこから、本発明
のレセプタータンパク質等を単離精製することも可能で
ある。
【０１１２】（１４）ノックアウト動物 本発明は、本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳
動物胚幹細胞および本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳
動物を提供する。すなわち、本発明は、 １）本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚
幹細胞、 ２）該ＤＮＡがレポーター遺伝子（例、大腸菌由来のβ
−ガラクトシダーゼ遺伝子）を導入することにより不活
性化された第１）項記載の胚幹細胞、 ３）ネオマイシン耐性である第１）項記載の胚幹細胞、 ４）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第１）項記載の
胚幹細胞、 ５）ゲッ歯動物がマウスである第４）項記載の胚幹細
胞、 ６）本発明のＤＮＡが不活性化された該ＤＮＡ発現不全
非ヒト哺乳動物、 ７）該ＤＮＡがレポーター遺伝子（例、大腸菌由来のβ
−ガラクトシダーゼ遺伝子）を導入することにより不活
性化され、該レポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対す
るプロモーターの制御下で発現しうる第６）項記載の非
ヒト哺乳動物、 ８）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第６）項記載の
非ヒト哺乳動物、 ９）ゲッ歯動物がマウスである第８）項記載の非ヒト哺
乳動物、および １０）第７）項記載の動物に、試験化合物を投与し、レ
ポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発
明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進または阻害
する化合物またはその塩のスクリーニング方法などを提
供する。本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動
物胚幹細胞とは、該非ヒト哺乳動物が有する本発明のＤ
ＮＡに人為的に変異を加えることにより、ＤＮＡの発現
能を抑制するか、もしくは該ＤＮＡがコードしている本
発明のレセプタータンパク質の活性を実質的に喪失させ
ることにより、ＤＮＡが実質的に本発明のレセプタータ
ンパク質の発現能を有さない（以下、本発明のノックア
ウトＤＮＡと称することがある）非ヒト哺乳動物の胚幹
細胞（以下、ＥＳ細胞と略記する）をいう。非ヒト哺乳
動物としては、前記と同様のものが用いられる。本発明
のＤＮＡに人為的に変異を加える方法としては、例え
ば、遺伝子工学的手法により該ＤＮＡ配列の一部又は全
部の削除、他ＤＮＡを挿入または置換させることによっ
て行なうことができる。これらの変異により、例えば、
コドンの読み取り枠をずらしたり、プロモーターあるい
はエクソンの機能を破壊することにより本発明のノック
アウトＤＮＡを作製すればよい。
【０１１３】本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺
乳動物胚幹細胞（以下、本発明のＤＮＡ不活性化ＥＳ細
胞または本発明のノックアウトＥＳ細胞と略記する）の
具体例としては、例えば、目的とする非ヒト哺乳動物が
有する本発明のＤＮＡを単離し、そのエクソン部分にネ
オマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子を
代表とする薬剤耐性遺伝子、あるいはｌａｃＺ（β−ガ
ラクトシダーゼ遺伝子）、ｃａｔ（クロラムフェニコー
ルアセチルトランスフェラーゼ遺伝子）を代表とするレ
ポーター遺伝子等を挿入することによりエクソンの機能
を破壊するか、あるいはエクソン間のイントロン部分に
遺伝子の転写を終結させるＤＮＡ配列（例えば、polyＡ
付加シグナルなど）を挿入し、完全なｍＲＮＡを合成で
きなくすることによって、結果的に遺伝子を破壊するよ
うに構築したＤＮＡ配列を有するＤＮＡ鎖（以下、ター
ゲッティングベクターと略記する）を、例えば相同組換
え法により該動物の染色体に導入し、得られたＥＳ細胞
について本発明のＤＮＡ上あるいはその近傍のＤＮＡ配
列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析
あるいはターゲッティングベクター上のＤＮＡ配列とタ
ーゲッティングベクター作製に使用した本発明のＤＮＡ
以外の近傍領域のＤＮＡ配列をプライマーとしたＰＣＲ
法により解析し、本発明のノックアウトＥＳ細胞を選別
することにより得ることができる。また、相同組換え法
等により本発明のＤＮＡを不活化させる元のＥＳ細胞と
しては、例えば、前述のような既に樹立されたものを用
いてもよく、また公知のEvansとKaufmanの方法に準じて
新しく樹立したものでもよい。例えば、マウスのＥＳ細
胞の場合、現在、一般的には１２９系のＥＳ細胞が使用
されているが、免疫学的背景がはっきりしていないの
で、これに代わる純系で免疫学的に遺伝的背景が明らか
なＥＳ細胞を取得するなどの目的で例えば、Ｃ５７ＢＬ
／６マウスやＣ５７ＢＬ／６の採卵数の少なさをＤＢＡ
／２との交雑により改善したＢＤＦ1マウス（Ｃ５７Ｂ
Ｌ／６とＤＢＡ／２とのＦ1）を用いて樹立したものな
ども良好に用いうる。ＢＤＦ1マウスは、採卵数が多
く、かつ、卵が丈夫であるという利点に加えて、Ｃ５７
ＢＬ／６マウスを背景に持つので、これを用いて得られ
たＥＳ細胞は病態モデルマウスを作出したとき、Ｃ５７
ＢＬ／６マウスとバッククロスすることでその遺伝的背
景をＣ５７ＢＬ／６マウスに代えることが可能である点
で有利に用い得る。また、ＥＳ細胞を樹立する場合、一
般には受精後３.５日目の胚盤胞を使用するが、これ以
外に８細胞期胚を採卵し胚盤胞まで培養して用いること
により効率よく多数の初期胚を取得することができる。
また、雌雄いずれのＥＳ細胞を用いてもよいが、通常雄
のＥＳ細胞の方が生殖系列キメラを作出するのに都合が
良い。また、煩雑な培養の手間を削減するためにもでき
るだけ早く雌雄の判別を行なうことが望ましい。
【０１１４】ＥＳ細胞の雌雄の判定方法としては、例え
ば、ＰＣＲ法によりＹ染色体上の性決定領域の遺伝子を
増幅、検出する方法が、その１例としてあげることがで
きる。この方法を使用すれば、従来、核型分析をするの
に約１０6個の細胞数を要していたのに対して、１コロ
ニー程度のＥＳ細胞数（約５０個）で済むので、培養初
期におけるＥＳ細胞の第一次セレクションを雌雄の判別
で行なうことが可能であり、早期に雄細胞の選定を可能
にしたことにより培養初期の手間は大幅に削減できる。
また、第二次セレクションとしては、例えば、Ｇ−バン
ディング法による染色体数の確認等により行うことがで
きる。得られるＥＳ細胞の染色体数は正常数の１００％
が望ましいが、樹立の際の物理的操作等の関係上困難な
場合は、ＥＳ細胞の遺伝子をノックアウトした後、正常
細胞（例えば、マウスでは染色体数が２ｎ＝４０である
細胞）に再びクローニングすることが望ましい。このよ
うにして得られた胚幹細胞株は、通常その増殖性は大変
良いが、個体発生できる能力を失いやすいので、注意深
く継代培養することが必要である。例えば、ＳＴＯ繊維
芽細胞のような適当なフィーダー細胞上でＬＩＦ（１−
１００００U/ml）存在下に炭酸ガス培養器内（好ましく
は、５％炭酸ガス、９５％空気または５％酸素、５％炭
酸ガス、９０％空気）で約３７℃で培養するなどの方法
で培養し、継代時には、例えば、トリプシン／ＥＤＴＡ
溶液（通常０.００１−０.５％トリプシン／０.１−５
ｍＭ ＥＤＴＡ、好ましくは約０.１％トリプシン／１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ）処理により単細胞化し、新たに用意した
フィーダー細胞上に播種する方法などがとられる。この
ような継代は、通常１−３日毎に行なうが、この際に細
胞の観察を行い、形態的に異常な細胞が見受けられた場
合はその培養細胞は放棄することが望まれる。ＥＳ細胞
は、適当な条件により、高密度に至るまで単層培養する
か、または細胞集塊を形成するまで浮遊培養することに
より、頭頂筋、内臓筋、心筋などの種々のタイプの細胞
に分化させることが可能であり〔M. J. Evans及びM. H.
Kaufman, ネイチャー（Nature）第292巻、154頁、1981
年；G. R. Martin プロシーディングス・オブ・ナショ
ナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユーエスエー
（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.）第78巻、7634頁、1
981年；T. C. Doetschmanら、ジャーナル・オブ・エン
ブリオロジー・アンド・エクスペリメンタル・モルフォ
ロジー、第87巻、27頁、1985年〕、本発明のＥＳ細胞を
分化させて得られる本発明のＤＮＡ発現不全細胞は、イ
ンビトロにおける本発明のレセプタータンパク質の細胞
生物学的検討において有用である。
【０１１５】本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物
は、該動物のｍＲＮＡ量を公知方法を用いて測定して間
接的にその発現量を比較することにより、正常動物と区
別することが可能である。該非ヒト哺乳動物としては、
前記と同様のものが用いられる。本発明のＤＮＡ発現不
全非ヒト哺乳動物は、例えば、前述のようにして作製し
たターゲッティングベクターをマウス胚幹細胞またはマ
ウス卵細胞に導入し、導入によりターゲッティングベク
ターの本発明のＤＮＡが不活性化されたＤＮＡ配列が遺
伝子相同組換えにより、マウス胚幹細胞またはマウス卵
細胞の染色体上の本発明のＤＮＡと入れ換わる相同組換
えをさせることにより、本発明のＤＮＡをノックアウト
させることができる。本発明のＤＮＡがノックアウトさ
れた細胞は、本発明のＤＮＡ上またはその近傍のＤＮＡ
配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解
析またはターゲッティングベクター上のＤＮＡ配列と、
ターゲッティングベクターに使用したマウス由来の本発
明のＤＮＡ以外の近傍領域のＤＮＡ配列とをプライマー
としたＰＣＲ法による解析で判定することができる。非
ヒト哺乳動物胚幹細胞を用いた場合は、遺伝子相同組換
えにより、本発明のＤＮＡが不活性化された細胞株をク
ローニングし、その細胞を適当な時期、例えば、８細胞
期の非ヒト哺乳動物胚または胚盤胞に注入し、作製した
キメラ胚を偽妊娠させた該非ヒト哺乳動物の子宮に移植
する。作出された動物は正常な本発明のＤＮＡ座をもつ
細胞と人為的に変異した本発明のＤＮＡ座をもつ細胞と
の両者から構成されるキメラ動物である。該キメラ動物
の生殖細胞の一部が変異した本発明のＤＮＡ座をもつ場
合、このようなキメラ個体と正常個体を交配することに
より得られた個体群より、全ての組織が人為的に変異を
加えた本発明のＤＮＡ座をもつ細胞で構成された個体
を、例えば、コートカラーの判定等により選別すること
により得られる。このようにして得られた個体は、通
常、本発明のレセプタータンパク質のヘテロ発現不全個
体であり、本発明のレセプタータンパク質のヘテロ発現
不全個体同志を交配し、それらの産仔から本発明のレセ
プタータンパク質のホモ発現不全個体を得ることができ
る。
【０１１６】卵細胞を使用する場合は、例えば、卵細胞
核内にマイクロインジェクション法でＤＮＡ溶液を注入
することによりターゲッティングベクターを染色体内に
導入したトランスジェニック非ヒト哺乳動物を得ること
ができ、これらのトランスジェニック非ヒト哺乳動物に
比べて、遺伝子相同組換えにより本発明のＤＮＡ座に変
異のあるものを選択することにより得られる。このよう
にして本発明のＤＮＡがノックアウトされている個体
は、交配により得られた動物個体も該ＤＮＡがノックア
ウトされていることを確認して通常の飼育環境で飼育継
代を行なうことができる。さらに、生殖系列の取得およ
び保持についても常法に従えばよい。すなわち、該不活
化ＤＮＡの保有する雌雄の動物を交配することにより、
該不活化ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴー
ト動物を取得しうる。得られたホモザイゴート動物は、
母親動物に対して、正常個体１，ホモザイゴート複数に
なるような状態で飼育することにより効率的に得ること
ができる。ヘテロザイゴート動物の雌雄を交配すること
により、該不活化ＤＮＡを有するホモザイゴートおよび
ヘテロザイゴート動物を繁殖継代する。本発明のＤＮＡ
が不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞は、本発明の
ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を作出する上で、非常に
有用である。また、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳
動物は、本発明のレセプタータンパク質により誘導され
得る種々の生物活性を欠失するため、本発明のレセプタ
ータンパク質の生物活性の不活性化を原因とする疾病の
モデルとなり得るので、これらの疾病の原因究明及び治
療法の検討に有用である。
【０１１７】（１４ａ）本発明のＤＮＡの欠損や損傷な
どに起因する疾病に対して治療・予防効果を有する化合
物のスクリーニング方法 本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のＤ
ＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療・予
防効果を有する化合物のスクリーニングに用いることが
できる。すなわち、本発明は、本発明のＤＮＡ発現不全
非ヒト哺乳動物に試験化合物を投与し、該動物の変化を
観察・測定することを特徴とする、本発明のＤＮＡの欠
損や損傷などに起因する疾病に対して治療・予防効果を
有する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供
する。該スクリーニング方法において用いられる本発明
のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物としては、前記と同様
のものがあげられる。試験化合物としては、例えば、ペ
プチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合
物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽
出液、血漿などがあげられ、これら化合物は新規な化合
物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。具
体的には、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を、
試験化合物で処理し、無処理の対照動物と比較し、該動
物の各器官、組織、疾病の症状などの変化を指標として
試験化合物の治療・予防効果を試験することができる。
試験動物を試験化合物で処理する方法としては、例え
ば、経口投与、静脈注射などが用いられ、試験動物の症
状、試験化合物の性質などにあわせて適宜選択すること
ができる。また、試験化合物の投与量は、投与方法、試
験化合物の性質などにあわせて適宜選択することができ
る。
【０１１８】例えば、中枢疾患（例えば、アルツハイマ
ー病、痴呆、摂食障害など）、内分泌疾患〔例えば、高
血圧症、性腺機能異常、甲状腺機能異常、下垂体機能異
常、下垂体ホルモン分泌不全（例、プロラクチン分泌不
全（例、卵巣機能低下症、精嚢発育不全、更年期障害、
甲状腺機能低下等））など〕、代謝疾患(例えば、糖尿
病、脂質代謝異常、高脂血症など)、癌（例えば、非小
細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、乳癌、子
宮頸部癌、結腸癌、直腸癌など）、心疾患（例えば、狭
心症、心筋梗塞など）、拒食症、肥満症、摂食亢進症等
に対して治療・予防効果を有する化合物をスクリーニン
グする場合、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に
糖負荷処置を行ない、糖負荷処置前または処置後に試験
化合物を投与し、該動物の血糖値および体重変化などを
経時的に測定する。
【０１１９】該スクリーニング方法において、試験動物
に試験化合物を投与した場合、該試験動物の血糖値が約
１０％以上、好ましくは約３０％以上、より好ましくは
約５０％以上低下した場合、該試験化合物を上記の疾患
に対して治療・予防効果を有する化合物として選択する
ことができる。該スクリーニング方法を用いて得られる
化合物は、上記した試験化合物から選ばれた化合物であ
り、本発明のレセプタータンパク質の欠損や損傷などに
よって引き起こされる疾患に対して治療・予防効果を有
するので、該疾患に対する安全で低毒性な治療・予防剤
などの医薬として使用することができる。さらに、上記
スクリーニングで得られた化合物から誘導される化合物
も同様に用いることができる。該スクリーニング方法で
得られた化合物は塩を形成していてもよく、該化合物の
塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有
機酸など）や塩基（例、アルカリ金属など）などとの塩
が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が
好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例え
ば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あ
るいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フ
マル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リ
ンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼン
スルホン酸など）との塩などが用いられる。該スクリー
ニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医
薬は、前記した本発明のレセプタータンパク質を含有す
る医薬と同様にして製造することができる。このように
して得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例え
ば、ヒトまたはその他の哺乳動物（例えば、ラット、マ
ウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウ
マ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することがで
きる。該化合物またはその塩の投与量は、対象疾患、投
与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、
該化合物を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０
ｋｇとして）の拒食症患者においては、一日につき該化
合物を約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５
０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。
非経口的に投与する場合は、該化合物の１回投与量は投
与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、該
化合物を注射剤の形で通常成人（６０ｋｇとして）の拒
食症患者に投与する場合、一日につき該化合物を約０．
０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程
度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射
により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、
６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【０１２０】（１４ｂ）本発明のＤＮＡに対するプロモ
ーターの活性を促進または阻害する化合物をスクリーニ
ング方法 本発明は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に、
試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出す
ることを特徴とする本発明のＤＮＡに対するプロモータ
ーの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のス
クリーニング方法を提供する。上記スクリーニング方法
において、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物とし
ては、前記した本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物
の中でも、本発明のＤＮＡがレポーター遺伝子を導入す
ることにより不活性化され、該レポーター遺伝子が本発
明のＤＮＡに対するプロモーターの制御下で発現しうる
ものが用いられる。試験化合物としては、前記と同様の
ものがあげられる。レポーター遺伝子としては、前記と
同様のものが用いられ、β−ガラクトシダーゼ遺伝子
（ｌａｃＺ）、可溶性アルカリフォスファターゼ遺伝子
またはルシフェラーゼ遺伝子などが好適である。本発明
のＤＮＡをレポーター遺伝子で置換された本発明のＤＮ
Ａ発現不全非ヒト哺乳動物では、レポーター遺伝子が本
発明のＤＮＡに対するプロモーターの支配下に存在する
ので、レポーター遺伝子がコードする物質の発現をトレ
ースすることにより、プロモーターの活性を検出するこ
とができる。例えば、本発明のレセプタータンパク質を
コードするＤＮＡ領域の一部を大腸菌由来のβ−ガラク
トシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）で置換している場合、本
来、本発明のレセプタータンパク質の発現する組織で、
本発明のレセプタータンパク質の代わりにβ−ガラクト
シダーゼが発現する。従って、例えば、５−ブロモ−４
−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトピラノシド
（Ｘ−ｇａｌ）のようなβ−ガラクトシダーゼの基質と
なる試薬を用いて染色することにより、簡便に本発明の
レセプタータンパク質の動物生体内における発現状態を
観察することができる。具体的には、本発明のレセプタ
ータンパク質欠損マウスまたはその組織切片をグルタル
アルデヒドなどで固定し、リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢ
Ｓ）で洗浄後、Ｘ−ｇａｌを含む染色液で、室温または
３７℃付近で、約３０分ないし１時間反応させた後、組
織標本を１ｍＭ ＥＤＴＡ／ＰＢＳ溶液で洗浄すること
によって、β−ガラクトシダーゼ反応を停止させ、呈色
を観察すればよい。また、常法に従い、ｌａｃＺをコー
ドするｍＲＮＡを検出してもよい。上記スクリーニング
方法を用いて得られる化合物またはその塩は、上記した
試験化合物から選ばれた化合物であり、本発明のＤＮＡ
に対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物
である。該スクリーニング方法で得られた化合物は塩を
形成していてもよく、該化合物の塩としては、生理学的
に許容される酸（例、無機酸など）や塩基（例、有機酸
など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容
される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例え
ば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸
など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、
プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石
酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスル
ホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いら
れる。
【０１２１】本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性
を促進する化合物またはその塩は、本発明のレセプター
タンパク質の発現を促進し、該タンパク質の機能を促進
することができるので、例えば、中枢疾患（例えば、ア
ルツハイマー病、痴呆、摂食障害など）、内分泌疾患
〔例えば、高血圧症、性腺機能異常、甲状腺機能異常、
下垂体機能異常、下垂体ホルモン分泌不全（例、プロラ
クチン分泌不全（例、卵巣機能低下症、精嚢発育不全、
更年期障害、甲状腺機能低下等））など〕、代謝疾患
(例えば、糖尿病、脂質代謝異常、高脂血症など)、癌
（例えば、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、膀
胱癌、乳癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌など）、心疾
患（例えば、狭心症、心筋梗塞など）、拒食症、肥満
症、摂食亢進症等の疾病（好ましくは拒食症、肥満症
等）に対する安全で低毒性な治療・予防剤などの医薬と
して有用である。また、本発明のＤＮＡに対するプロモ
ーター活性を阻害する化合物またはその塩は、本発明の
レセプタータンパク質の発現を阻害し、該タンパク質の
機能を阻害することができるので、例えば肥満症［例、
悪性肥満細胞症(malignant mastocytosis)、外因性肥満
(exogenous obesity)、過インシュリン性肥満症(hyper
insulinar obesity)、過血漿性肥満(hyperplasmic obes
ity)、下垂体性肥満(hypophyseal adiposity)、減血漿
性肥満症(hypoplasmic obesity)、甲状腺機能低下肥満
症(hypothyroid obesity)、視床下部性肥満(hypothalam
ic obesity)、症候性肥満症(symptomatic obesity)、小
児肥満 (infantile obesity)、上半身肥満(upper body
obesity)、食事性肥満症 (alimentary obesity)、性機
能低下性肥満(hypogonadal obesity)、全身性肥満細胞
症(systemic mastocytosis)、単純性肥満(simple obesi
ty)、中心性肥満(central obesity)など］、摂食亢進症
(hyperphagia)、下垂体腺腫瘍、間脳腫瘍、月経異常、
自己免疫疾患、プロラクチノーマ、不妊症、インポテン
ス、無月経症、乳汁漏症、末端肥大症、キアリ・フロン
メル症候群、アルゴンツ・デル・カスティロ症候群、フ
ォーベス・アルブライト症候群、リンパ腫、シーハン症
候群、精子形成異常などの予防・治療剤（プロラクチン
産生抑制剤）などの予防・治療剤、好ましくは肥満症、
摂食亢進症などの予防・治療剤などの医薬として有用で
ある。さらに、上記スクリーニングで得られた化合物か
ら誘導される化合物も同様に用いることができる。
【０１２２】該スクリーニング方法で得られた化合物ま
たはその塩を含有する医薬は、前記した本発明のレセプ
タータンパク質またはその塩を含有する医薬と同様にし
て製造することができる。このようにして得られる製剤
は、安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたはその
他の哺乳動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、
ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル
など）に対して投与することができる。該化合物または
その塩の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートな
どにより差異はあるが、例えば、本発明のＤＮＡに対す
るプロモーター活性を促進する化合物を経口投与する場
合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）の拒食症患者
においては、一日につき該化合物を約０.１〜１００ｍ
ｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約
１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合
は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患などに
よっても異なるが、例えば、本発明のＤＮＡに対するプ
ロモーター活性を促進する化合物を注射剤の形で通常成
人（６０ｋｇとして）の拒食症患者に投与する場合、一
日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好まし
くは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１
〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合で
ある。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量
を投与することができる。一方、例えば、本発明のＤＮ
Ａに対するプロモーター活性を阻害する化合物を経口投
与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）の肥
満症患者においては、一日につき該化合物を約０.１〜
１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ま
しくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与す
る場合は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患
などによっても異なるが、例えば、本発明のＤＮＡに対
するプロモーター活性を阻害する化合物を注射剤の形で
通常成人（６０ｋｇとして）の肥満症患者に投与する場
合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ程度、
好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約
０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好
都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算
した量を投与することができる。このように、本発明の
ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のＤＮＡに対
するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物ま
たはその塩をスクリーニングする上で極めて有用であ
り、本発明のＤＮＡ発現不全に起因する各種疾患の原因
究明または予防・治療薬の開発に大きく貢献することが
できる。また、本発明のレセプタータンパク質のプロモ
ーター領域を含有するＤＮＡを使って、その下流に種々
のタンパクをコードする遺伝子を連結し、これを動物の
卵細胞に注入していわゆるトランスジェニック動物（遺
伝子導入動物）を作成すれば、特異的にそのポリペプチ
ドを合成させ、その生体での作用を検討することも可能
となる。さらに上記プロモーター部分に適当なレポータ
遺伝子を結合させ、これが発現するような細胞株を樹立
すれば、本発明のレセプタータンパク質そのものの体内
での産生能力を特異的に促進もしくは抑制する作用を持
つ低分子化合物の探索系として使用できる。
【０１２３】本明細書および図面において、塩基やアミ
ノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ
Commission on Biochemical Nomenclatureによる略号あ
るいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、
その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があ
り得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとす
る。 ＤＮＡ ：デオキシリボ核酸 ｃＤＮＡ ：相補的デオキシリボ核酸 Ａ ：アデニン Ｔ ：チミン Ｇ ：グアニン Ｃ ：シトシン Ｉ ：イノシン Ｒ ：アデニン（Ａ）またはグアニン（Ｇ） Ｙ ：チミン（Ｔ）またはシトシン（Ｃ） Ｍ ：アデニン（Ａ）またはシトシン（Ｃ） Ｋ ：グアニン（Ｇ）またはチミン（Ｔ） Ｓ ：グアニン（Ｇ）またはシトシン（Ｃ） Ｗ ：アデニン（Ａ）またはチミン（Ｔ） Ｂ ：グアニン（Ｇ）、グアニン（Ｇ）またはチミン（Ｔ） Ｄ ：アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）またはチミン（Ｔ） Ｖ ：アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）またはシトシン（Ｃ） Ｎ ：アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）もしく はチミン（Ｔ）または不明もしくは他の塩基 ＲＮＡ ：リボ核酸 ｍＲＮＡ ：メッセンジャーリボ核酸 ｄＡＴＰ ：デオキシアデノシン三リン酸 ｄＴＴＰ ：デオキシチミジン三リン酸 ｄＧＴＰ ：デオキシグアノシン三リン酸 ｄＣＴＰ ：デオキシシチジン三リン酸 ＡＴＰ ：アデノシン三リン酸 ＥＤＴＡ ：エチレンジアミン四酢酸 ＳＤＳ ：ドデシル硫酸ナトリウム ＢＨＡ ：ベンズヒドリルアミン ｐＭＢＨＡ ：ｐ−メチルベンズヒドリルアミン ＤＣＭ ：ジクロロメタン ＴＦＡ ：トリフルオロ酢酸 ＤＩＥＡ ：ジイソプロピルエチルアミン Ｇｌｙ又はＧ ：グリシン Ａｌａ又はＡ ：アラニン Ｖａｌ又はＶ ：バリン Ｌｅｕ又はＬ ：ロイシン Ｉｌｅ又はＩ ：イソロイシン Ｓｅｒ又はＳ ：セリン Ｔｈｒ又はＴ ：スレオニン Ｃｙｓ又はＣ ：システイン Ｍｅｔ又はＭ ：メチオニン Ｇｌｕ又はＥ ：グルタミン酸 Ａｓｐ又はＤ ：アスパラギン酸 Ｌｙｓ又はＫ ：リジン Ａｒｇ又はＲ ：アルギニン Ｈｉｓ又はＨ ：ヒスチジン Ｐｈｅ又はＦ ：フェニルアラニン Ｔｙｒ又はＹ ：チロシン Ｔｒｐ又はＷ ：トリプトファン Ｐｒｏ又はＰ ：プロリン Ａｓｎ又はＮ ：アスパラギン Ｇｌｎ又はＱ ：グルタミン ｐＧｌｕ ：ピログルタミン酸 Ｔｙｒ（Ｉ） ：３−ヨードチロシン ＊ ：終止コドンに対応する Ｍｅ ：メチル基 Ｅｔ ：エチル基 Ｂｕ ：ブチル基 Ｐｈ ：フェニル基 ＴＣ ：チアゾリジン−４（Ｒ）−カルボキサミド基
【０１２４】また、本明細書中で繁用される置換基、保
護基および試薬を下記の記号で表記する。 Ｔｏｓ ：ｐ−トルエンスルフォニル ＣＨＯ ：ホルミル Ｂｚｌ ：ベンジル Ｃl2Ｂｚｌ ：２，６−ジクロロベンジル Ｂｏｍ ：ベンジルオキシメチル Ｚ ：ベンジルオキシカルボニル Ｃｌ−Ｚ ：２−クロロベンジルオキシカルボニル Ｂｒ−Ｚ ：２−ブロモベンジルオキシカルボニル Ｂｏｃ ：ｔ−ブトキシカルボニル ＤＮＰ ：ジニトロフェノール Ｔｒｔ ：トリチル Ｂｕｍ ：ｔ−ブトキシメチル Ｆｍｏｃ ：Ｎ−９−フルオレニルメトキシカルボニル ＨＯＢｔ ：１−ヒドロキシベンズトリアゾール ＨＯＯＢｔ ：３,４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ− １,２,３−ベンゾトリアジン ＨＯＮＢ ：１−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボ キシイミド ＤＣＣ ：Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド ＤＭＦ ：Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド Ｐｂｆ ： ２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロベンゾ フラン−５−スルホニル Ｃｌｔ ：２−クロロトリチル Ｂｕt ：ｔ−ブチル Ｍｅｔ（Ｏ） ：メチオニンスルフォキシド
【０１２５】本明細書の配列表の配列番号は、以下の配
列を示す。 〔配列番号：１〕本発明のラット由来新規Ｇタンパク質
共役型レセプタータンパク質ＴＧＲ２６のアミノ酸配列
を示す。 〔配列番号：２〕本発明のラット由来新規Ｇタンパク質
共役型レセプタータンパク質ＴＧＲ２６をコードするｃ
ＤＮＡの塩基配列を示す。 〔配列番号：３〕以下の実施例１におけるＰＣＲ反応で
使用したプライマー１の塩基配列を示す。 〔配列番号：４〕以下の実施例１におけるＰＣＲ反応で
使用したプライマー２の塩基配列を示す。 〔配列番号：５〕以下の実施例３におけるＴＧＲ２６発
現ＣＨＯ細胞のＴＧＲ２６レセプター遺伝子発現量を測
定するのに使用したプライマーの塩基配列を示す。 〔配列番号：６〕以下の実施例３におけるＴＧＲ２６発
現ＣＨＯ細胞のＴＧＲ２６レセプター遺伝子発現量を測
定するのに使用したプライマーの塩基配列を示す。 〔配列番号：７〕以下の実施例３におけるＴＧＲ２６発
現ＣＨＯ細胞のＴＧＲ２６レセプター遺伝子発現量を測
定するのに使用したプローブの塩基配列を示す。 〔配列番号：８〕ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドの
ヒトホモログのアミノ酸配列を示す。 〔配列番号：９〕ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドの
ヒトホモログのアミノ酸配列を示す。 〔配列番号：１０〕ヒトＧＰＲ８タンパク質をコードす
るｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成ＤＮＡを示
す。 〔配列番号：１１〕ヒトＧＰＲ８タンパク質をコードす
るｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成ＤＮＡを示
す。 〔配列番号：１２〕５’側に制限酵素Ｃｌａ Ｉの認識
する塩基配列が付加され、また３’側に制限酵素Ｓｐｅ
Ｉの認識する塩基配列が付加されたヒトＧＰＲ８タン
パク質ｃＤＮＡの全塩基配列を示す。 〔配列番号：１３〕ＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞株の各クロ
ーンにおけるＧＰＲ８レセプタータンパク質ｍＲＮＡの
発現量を測定するために使用したｒｉｂｏｐｒｏｂｅの
配列を示す。 〔配列番号：１４〕ブタ視床下部から精製されたＧＰＲ
８に対するリガンドペプチドのアミノ末端アミノ酸配列
解析の結果から得られたアミノ酸配列を示す。 〔配列番号：１５〕相補鎖がＧＰＲ８リガンドペプチド
のヒトホモログの前駆体タンパク質の一部をコードして
いると推定されるＥＳＴ配列（アクセッション番号：Ａ
Ｗ００７５３１）を示す。 〔配列番号：１６〕相補鎖がＧＰＲ８リガンドペプチド
のヒトホモログの前駆体タンパク質の一部をコードして
いると推定されるＥＳＴ配列（アクセッション番号：Ａ
Ｉ５００３０３）を示す。 〔配列番号：１７〕相補鎖がＧＰＲ８リガンドペプチド
のヒトホモログの前駆体タンパク質の一部をコードして
いると推定されるＥＳＴ配列（アクセッション番号：Ａ
Ｉ９９０９６４ ）を示す。 〔配列番号：１８〕相補鎖がＧＰＲ８リガンドペプチド
のヒトホモログの前駆体タンパク質の一部をコードして
いると推定されるＥＳＴ配列（アクセッション番号：Ａ
Ａ７４４８０４）を示す。 〔配列番号：１９〕ＧＰＲ８リガンドペプチドのラット
ホモログの前駆体タンパク質の一部をコードしていると
推定されるＥＳＴ配列（アクセッション番号：Ｈ３１５
９８）を示す。 〔配列番号：２０〕ＧＰＲ８に対するリガンドペプチド
のヒトホモログの前駆体タンパク質の一部をコードする
ｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成ＤＮＡを示
す。 〔配列番号：２１〕ＧＰＲ８に対するリガンドペプチド
のヒトホモログの前駆体タンパク質の一部をコードする
ｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成ＤＮＡを示
す。 〔配列番号：２２〕ヒト脳由来ｃＤＮＡから増幅された
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのヒトホモログの前
駆体タンパク質の一部をコードするＤＮＡ配列を示す。 〔配列番号：２３〕ＧＰＲ８に対するリガンドペプチド
のヒトホモログの前駆体タンパク質の一部のアミノ酸配
列を示す。 〔配列番号：２４〕後述の参考例２０で合成されたヒト
ＧＰＲリガンド（１−２５）のアミノ酸配列を示す。 〔配列番号：２５〕後述の参考例２１で合成されたヒト
ＧＰＲリガンド（１−２４）のアミノ酸配列を示す。 〔配列番号：２６〕配列番号：１２８で表されるアミノ
酸配列をコードする塩基配列を示す。 〔配列番号：２７〕配列番号：１２９で表されるアミノ
酸配列をコードする塩基配列を示す。 〔配列番号：２８〕配列番号：１３０で表されるアミノ
酸配列をコードする塩基配列を示す。 〔配列番号：２９〕配列番号：１３１で表されるアミノ
酸配列をコードする塩基配列を示す。 〔配列番号：３０〕配列番号：２４で表されるアミノ酸
配列をコードする塩基配列を示す。 〔配列番号：３１〕配列番号：２５で表されるアミノ酸
配列をコードする塩基配列を示す。 〔配列番号：３２〕ヒトＧＰＲ８タンパク質の全アミノ
酸配列を示す。 〔配列番号：３３〕ＧＰＲ８に対するリガンドペプチド
のヒトホモログの前駆体タンパク質をコードするｃＤＮ
Ａの５’上流側配列を得るのに使用した合成ＤＮＡを示
す。 〔配列番号：３４〕ＧＰＲ８に対するリガンドペプチド
のヒトホモログの前駆体タンパク質をコードするｃＤＮ
Ａの５’上流側配列を得るのに使用した合成ＤＮＡを示
す。 〔配列番号：３５〕ＧＰＲ８に対するリガンドペプチド
のヒトホモログの前駆体タンパク質をコードするｃＤＮ
Ａの５’上流側ＤＮＡ配列を示す。 〔配列番号：３６〕ＧＰＲ８に対するリガンドペプチド
のヒトホモログの前駆体タンパク質をコードするｃＤＮ
Ａの３’下流側配列を得るのに使用した合成ＤＮＡを示
す。 〔配列番号：３７〕ＧＰＲ８に対するリガンドペプチド
のヒトホモログの前駆体タンパク質をコードするｃＤＮ
Ａの３’下流側配列を得るのに使用した合成ＤＮＡを示
す。 〔配列番号：３８〕ＧＰＲ８に対するリガンドペプチド
のヒトホモログの前駆体タンパク質をコードするｃＤＮ
Ａの３’下流側ＤＮＡ配列を示す。 〔配列番号：３９〕ＧＰＲ８に対するリガンドペプチド
のヒトホモログの前駆体タンパク質をコードするｃＤＮ
Ａを得るのに使用した合成ＤＮＡを示す。 〔配列番号：４０〕ＧＰＲ８に対するリガンドペプチド
のヒトホモログの前駆体タンパク質をコードするｃＤＮ
Ａを得るのに使用した合成ＤＮＡを示す。 〔配列番号：４１〕ＧＰＲ８に対するリガンドペプチド
のヒトホモログの前駆体タンパク質をコードするｃＤＮ
Ａの配列を示す。 〔配列番号：４２〕ＧＰＲ８に対するリガンドペプチド
のヒトホモログの前駆体タンパク質のアミノ酸配列を示
す。 〔配列番号：４３〕ＧＰＲ８に対するリガンドペプチド
のブタホモログの前駆体タンパク質をコードするｃＤＮ
Ａの５’上流側配列を得るのに使用した合成ＤＮＡを示
す。 〔配列番号：４４〕ＧＰＲ８に対するリガンドペプチド
のブタホモログの前駆体タンパク質をコードするｃＤＮ
Ａの５’上流側配列を得るのに使用した合成ＤＮＡを示
す。 〔配列番号：４５〕ＧＰＲ８に対するリガンドペプチド
のブタホモログの前駆体タンパク質をコードするｃＤＮ
Ａの５’上流側ＤＮＡ配列を示す。 〔配列番号：４６〕ＧＰＲ８に対するリガンドペプチド
のブタホモログの前駆体タンパク質をコードするｃＤＮ
Ａの５’上流側配列を得るのに使用した合成ＤＮＡを示
す。 〔配列番号：４７〕ＧＰＲ８に対するリガンドペプチド
のブタホモログの前駆体タンパク質をコードするｃＤＮ
Ａの５’上流側配列を得るのに使用した合成ＤＮＡを示
す。 〔配列番号：４８〕ＧＰＲ８に対するリガンドペプチド
のブタホモログの前駆体タンパク質をコードするｃＤＮ
Ａの５’上流側ＤＮＡ配列を示す。 〔配列番号：４９〕ＧＰＲ８に対するリガンドペプチド
のブタホモログの前駆体タンパク質をコードするｃＤＮ
Ａの３’下流側配列を得るのに使用した合成ＤＮＡを示
す。 〔配列番号：５０〕ＧＰＲ８に対するリガンドペプチド
のブタホモログの前駆体タンパク質をコードするｃＤＮ
Ａの３’下流側配列を得るのに使用した合成ＤＮＡを示
す。
【０１２６】〔配列番号：５１〕ＧＰＲ８に対するリガ
ンドペプチドのブタホモログの前駆体タンパク質をコー
ドするｃＤＮＡの３’下流側ＤＮＡ配列を示す。 〔配列番号：５２〕ＧＰＲ８に対するリガンドペプチド
のブタホモログの前駆体タンパク質をコードするｃＤＮ
Ａを得るのに使用した合成ＤＮＡを示す。 〔配列番号：５３〕ＧＰＲ８に対するリガンドペプチド
のブタホモログの前駆体タンパク質をコードするｃＤＮ
Ａを得るのに使用した合成ＤＮＡを示す。 〔配列番号：５４〕ＧＰＲ８に対するリガンドペプチド
のブタホモログの前駆体タンパク質をコードするｃＤＮ
Ａの配列を示す。 〔配列番号：５５〕ＧＰＲ８に対するリガンドペプチド
のブタホモログの前駆体タンパク質のアミノ酸配列を示
す。 〔配列番号：５６〕配列番号：５５から推定されたＧＰ
Ｒ８に対するリガンドペプチドのブタホモログのアミノ
酸配列を示す。 〔配列番号：５７〕配列番号：５５から推定されたＧＰ
Ｒ８に対するリガンドペプチドのブタホモログのアミノ
酸配列を示す。 〔配列番号：５８〕配列番号：５６で表されるアミノ酸
配列をコードする塩基配列を示す。 〔配列番号：５９〕配列番号：５７で表されるアミノ酸
配列をコードする塩基配列を示す。 〔配列番号：６０〕ＧＰＲ８に対するリガンドペプチド
のラットホモログの前駆体タンパク質の一部をコードす
るｃＤＮＡを得るのに使用した合成ＤＮＡを示す。 〔配列番号：６１〕ＧＰＲ８に対するリガンドペプチド
のラットホモログの前駆体タンパク質の一部をコードす
るｃＤＮＡを得るのに使用した合成ＤＮＡを示す。 〔配列番号：６２〕ＧＰＲ８に対するリガンドペプチド
のラットホモログの前駆体タンパク質の一部をコードす
るｃＤＮＡの配列を示す。 〔配列番号：６３〕ＧＰＲ８に対するリガンドペプチド
のラットホモログの前駆体タンパク質をコードするｃＤ
ＮＡの５’上流側配列を得るのに使用した合成ＤＮＡを
示す。 〔配列番号：６４〕ＧＰＲ８に対するリガンドペプチド
のラットホモログの前駆体タンパク質をコードするｃＤ
ＮＡの５’上流側配列を得るのに使用した合成ＤＮＡを
示す。 〔配列番号：６５〕ＧＰＲ８に対するリガンドペプチド
のラットホモログの前駆体タンパク質をコードするｃＤ
ＮＡの５’上流側ＤＮＡ配列を示す。 〔配列番号：６６〕ＧＰＲ８に対するリガンドペプチド
のラットホモログの前駆体タンパク質をコードするｃＤ
ＮＡの３’下流側配列を得るのに使用した合成ＤＮＡを
示す。 〔配列番号：６７〕ＧＰＲ８に対するリガンドペプチド
のラットホモログの前駆体タンパク質をコードするｃＤ
ＮＡの３’下流側配列を得るのに使用した合成ＤＮＡを
示す。 〔配列番号：６８〕ＧＰＲ８に対するリガンドペプチド
のラットホモログの前駆体タンパク質をコードするｃＤ
ＮＡの３’下流側ＤＮＡ配列を示す。 〔配列番号：６９〕ＧＰＲ８に対するリガンドペプチド
のラットホモログの前駆体タンパク質をコードするｃＤ
ＮＡを得るのに使用した合成ＤＮＡを示す。 〔配列番号：７０〕ＧＰＲ８に対するリガンドペプチド
のラットホモログの前駆体タンパク質をコードするｃＤ
ＮＡを得るのに使用した合成ＤＮＡを示す。 〔配列番号：７１〕ＧＰＲ８に対するリガンドペプチド
のラットホモログの前駆体タンパク質をコードするｃＤ
ＮＡの配列を示す。 〔配列番号：７２〕ＧＰＲ８に対するリガンドペプチド
のラットホモログの前駆体タンパク質のアミノ酸配列を
示す。 〔配列番号：７３〕配列番号：７２から推定されたＧＰ
Ｒ８に対するリガンドペプチドのラットホモログのアミ
ノ酸配列を示す。 〔配列番号：７４〕配列番号：７２から推定されたＧＰ
Ｒ８に対するリガンドペプチドのラットホモログのアミ
ノ酸配列を示す。 〔配列番号：７５〕配列番号：７３で表されるアミノ酸
配列をコードする塩基配列を示す。 〔配列番号：７６〕配列番号：７４で表されるアミノ酸
配列をコードする塩基配列を示す。 〔配列番号：７７〕ＧＰＲ８リガンドペプチドのマウス
ホモログの前駆体タンパク質の一部をコードしていると
推定されるマウスゲノム断片配列を示す。 〔配列番号：７８〕ＧＰＲ８に対するリガンドペプチド
のマウスホモログの前駆体タンパク質の一部をコードす
るｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成ＤＮＡを示
す。 〔配列番号：７９〕ＧＰＲ８に対するリガンドペプチド
のマウスホモログの前駆体タンパク質の一部をコードす
るｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成ＤＮＡを示
す。 〔配列番号：８０〕マウス精巣由来ｃＤＮＡから増幅さ
れたＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのヒトホモログ
の前駆体タンパク質の一部をコードするＤＮＡ配列を示
す。 〔配列番号：８１〕ＧＰＲ８に対するリガンドペプチド
のマウスホモログの前駆体タンパク質をコードするｃＤ
ＮＡの５’上流側配列を得るのに使用した合成ＤＮＡを
示す。 〔配列番号：８２〕ＧＰＲ８に対するリガンドペプチド
のマウスホモログの前駆体タンパク質をコードするｃＤ
ＮＡの５’上流側配列を得るのに使用した合成ＤＮＡを
示す。 〔配列番号：８３〕ＧＰＲ８に対するリガンドペプチド
のマウスホモログの前駆体タンパク質をコードするｃＤ
ＮＡの５’上流側ＤＮＡ配列を示す。 〔配列番号：８４〕ＧＰＲ８に対するリガンドペプチド
のマウスホモログの前駆体タンパク質をコードするｃＤ
ＮＡの３’下流側配列を得るのに使用した合成ＤＮＡを
示す。 〔配列番号：８５〕ＧＰＲ８に対するリガンドペプチド
のマウスホモログの前駆体タンパク質をコードするｃＤ
ＮＡの３’下流側配列を得るのに使用した合成ＤＮＡを
示す。 〔配列番号：８６〕ＧＰＲ８に対するリガンドペプチド
のマウスホモログの前駆体タンパク質をコードするｃＤ
ＮＡの３’下流側ＤＮＡ配列を示す。 〔配列番号：８７〕ＧＰＲ８に対するリガンドペプチド
のマウスホモログの前駆体タンパク質をコードするｃＤ
ＮＡを得るのに使用した合成ＤＮＡを示す。 〔配列番号：８８〕ＧＰＲ８に対するリガンドペプチド
のマウスホモログの前駆体タンパク質をコードするｃＤ
ＮＡを得るのに使用した合成ＤＮＡを示す。 〔配列番号：８９〕ＧＰＲ８に対するリガンドペプチド
のマウスホモログの前駆体タンパク質をコードするｃＤ
ＮＡの配列を示す。 〔配列番号：９０〕ＧＰＲ８に対するリガンドペプチド
のマウスホモログの前駆体タンパク質のアミノ酸配列を
示す。 〔配列番号：９１〕配列番号：９０から推定されたＧＰ
Ｒ８に対するリガンドペプチドのマウスホモログのアミ
ノ酸配列を示す。 〔配列番号：９２〕配列番号：９０から推定されたＧＰ
Ｒ８に対するリガンドペプチドのマウスホモログのアミ
ノ酸配列を示す。 〔配列番号：９３〕配列番号：９１で表されるアミノ酸
配列をコードする塩基配列を示す。 〔配列番号：９４〕配列番号：９２で表されるアミノ酸
配列をコードする塩基配列を示す。 〔配列番号：９５〕後述の参考例４０で合成されたヒト
ＧＰＲ８リガンド（１−２３）酸化体のアミノ酸配列を
示す。 〔配列番号：９６〕後述の参考例４１で合成されたヒト
ＧＰＲ８リガンド（１−２２）のアミノ酸配列を示す。 〔配列番号：９７〕後述の参考例４２で合成されたヒト
ＧＰＲ８リガンド（１−２１）のアミノ酸配列を示す。 〔配列番号：９８〕後述の参考例４３で合成されたヒト
ＧＰＲ８リガンド（１−２０）のアミノ酸配列を示す。 〔配列番号：９９〕後述の参考例４４で合成されたヒト
ＧＰＲ８リガンド（１−１９）のアミノ酸配列を示す。 〔配列番号：１００〕後述の参考例４５で合成されたヒ
トＧＰＲ８リガンド（１−１８）のアミノ酸配列を示
す。
【０１２７】〔配列番号：１０１〕後述の参考例４６で
合成されたヒトＧＰＲ８リガンド（１−１７）のアミノ
酸配列を示す。 〔配列番号：１０２〕後述の参考例４７で合成されたヒ
トＧＰＲ８リガンド（１−１６）のアミノ酸配列を示
す。 〔配列番号：１０３〕後述の参考例５０で合成さブタＧ
ＰＲ８リガンド（１−２３）酸化体のアミノ酸配列を示
す。 〔配列番号：１０４〕後述の参考例５１で合成されたラ
ットまたはマウスＧＰＲ８リガンド（１−２３）酸化体
のアミノ酸配列を示す。 〔配列番号：１０５〕後述の参考例１２で合成されたＦ
ｍｏｃ化ヒトＧＰＲ８リガンド（１−２３）のアミノ酸
配列を示す。 〔配列番号：１０６〕後述の参考例５２で合成された
［Ｎα−Ａｃｅｔｙｌ−Ｔｒｐ1］−ヒトＧＰＲ８リガ
ンド（１−２３）のアミノ酸配列を示す。 〔配列番号：１０７〕後述の参考例５３で合成されたヒ
トＧＰＲ８リガンド（２−２３）のアミノ酸配列を示
す。 〔配列番号：１０８〕後述の参考例５４で合成されたヒ
トＧＰＲ８リガンド（４−２３）のアミノ酸配列を示
す。 〔配列番号：１０９〕後述の参考例５５で合成されたヒ
トＧＰＲ８リガンド（９−２３）のアミノ酸配列を示
す。 〔配列番号：１１０〕後述の参考例５６で合成されたヒ
トＧＰＲ８リガンド（１５−２３）のアミノ酸配列を示
す。 〔配列番号：１１１〕後述の参考例５７で合成された
［Ｎ−Ａｃｅｔｙｌ−Ｔｙｒ2］−ヒトＧＰＲ８リガン
ド（２−２３）のアミノ酸配列を示す。 〔配列番号：１１２〕後述の参考例５８で合成された
［Ｄ−Ｔｒｐ1］−ヒトＧＰＲ８リガンド（１−２３）
のアミノ酸配列を示す。 〔配列番号：１１３〕後述の参考例５９で合成された
［Ｎ−３−Ｉｎｄｏｌｅｐｒｏｐａｎｏｙｌ−Ｔｙ
ｒ2］−ヒトＧＰＲ８リガンド（２−２３）のアミノ酸
配列を示す。 〔配列番号：１１４〕配列番号：９６で表されるアミノ
酸配列をコードする塩基配列を示す。 〔配列番号：１１５〕配列番号：９７で表されるアミノ
酸配列をコードする塩基配列を示す。 〔配列番号：１１６〕配列番号：９８で表されるアミノ
酸配列をコードする塩基配列を示す。 〔配列番号：１１７〕配列番号：９９で表されるアミノ
酸配列をコードする塩基配列を示す。 〔配列番号：１１８〕配列番号：１００で表されるアミ
ノ酸配列をコードする塩基配列を示す。 〔配列番号：１１９〕配列番号：１０１で表されるアミ
ノ酸配列をコードする塩基配列を示す。 〔配列番号：１２０〕配列番号：１０２で表されるアミ
ノ酸配列をコードする塩基配列を示す。 〔配列番号：１２１〕配列番号：１０７で表されるアミ
ノ酸配列をコードする塩基配列を示す。 〔配列番号：１２２〕配列番号：１０８で表されるアミ
ノ酸配列をコードする塩基配列を示す。 〔配列番号：１２３〕配列番号：１０９で表されるアミ
ノ酸配列をコードする塩基配列を示す。 〔配列番号：１２４〕配列番号：１１０で表されるアミ
ノ酸配列をコードする塩基配列を示す。 〔配列番号：１２５〕配列番号：１４で表されるアミノ
酸配列をコードする塩基配列を示す。 〔配列番号：１２６〕配列番号：８で表されるアミノ酸
配列をコードする塩基配列を示す。 〔配列番号：１２７〕配列番号：９で表されるアミノ酸
配列をコードする塩基配列を示す。 〔配列番号：１２８〕後述の参考例１６で合成されたヒ
トＧＰＲリガンド（１−２９）のアミノ酸配列を示す。 〔配列番号：１２９〕後述の参考例１７で合成されたヒ
トＧＰＲリガンド（１−２８）のアミノ酸配列を示す。 〔配列番号：１３０〕後述の参考例１８で合成されたヒ
トＧＰＲリガンド（１−２７）のアミノ酸配列を示す。 〔配列番号：１３１〕後述の参考例１９で合成されたヒ
トＧＰＲリガンド（１−２６）のアミノ酸配列を示す。 〔配列番号：１３２〕以下の実施例１０におけるＰＣＲ
反応で使用したプライマーの塩基配列を示す。 〔配列番号：１３３〕以下の実施例１０におけるＰＣＲ
反応で使用したプライマーの塩基配列を示す。 〔配列番号：１３４〕以下の実施例１０で得られたマウ
スＴＧＲ２６をコードするＤＮＡの５’上流端部分の塩
基配列を示す。 〔配列番号：１３５〕以下の実施例１１におけるＰＣＲ
反応で使用したプライマーの塩基配列を示す。 〔配列番号：１３６〕以下の実施例１１におけるＰＣＲ
反応で使用したプライマーの塩基配列を示す。 〔配列番号：１３７〕以下の実施例１１で得られたマウ
スＴＧＲ２６をコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。 〔配列番号：１３８〕本発明のマウス由来新規Ｇタンパ
ク質共役型レセプタータンパク質ＴＧＲ２６のアミノ酸
配列を示す。 〔配列番号：１３９〕本発明のマウス由来新規Ｇタンパ
ク質共役型レセプタータンパク質ＴＧＲ２６をコードす
るｃＤＮＡの塩基配列を示す。 〔配列番号：１４０〕ヒト型ＧＰＲ７リガンドＡのアミ
ノ酸配列を示す。 〔配列番号：１４１〕マウス型ＧＰＲ７リガンドＡのア
ミノ酸配列を示す。 〔配列番号：１４２〕ラット型ＧＰＲ７リガンドＡのア
ミノ酸配列を示す。 〔配列番号：１４３〕ヒト型ＧＰＲ７リガンドＢのアミ
ノ酸配列を示す。 〔配列番号：１４４〕マウス型ＧＰＲ７リガンドＢのア
ミノ酸配列を示す。 〔配列番号：１４５〕ラット型ＧＰＲ７リガンドＢのア
ミノ酸配列を示す。 〔配列番号：１４６〕ヒト型ＧＰＲ７リガンドＣのアミ
ノ酸配列を示す。 〔配列番号：１４７〕ヒト型ＧＰＲ７リガンドＤのアミ
ノ酸配列を示す。 〔配列番号：１４８〕マウス型ＧＰＲ７リガンドＣのア
ミノ酸配列を示す。 〔配列番号：１４９〕マウス型ＧＰＲ７リガンドＤのア
ミノ酸配列を示す。 〔配列番号：１５０〕ラット型ＧＰＲ７リガンドＣのア
ミノ酸配列を示す。 〔配列番号：１５１〕ラット型ＧＰＲ７リガンドＤのア
ミノ酸配列を示す。 〔配列番号：１５２〕ヒト型ＧＰＲ７リガンドＥのアミ
ノ酸配列を示す。 〔配列番号：１５３〕マウス型ＧＰＲ７リガンドＥのア
ミノ酸配列を示す。 〔配列番号：１５４〕ラット型ＧＰＲ７リガンドＥのア
ミノ酸配列を示す。 〔配列番号：１５５〕ヒト型ＧＰＲ７リガンドＦのアミ
ノ酸配列を示す。 〔配列番号：１５６〕マウス型ＧＰＲ７リガンドＦのア
ミノ酸配列を示す。 〔配列番号：１５７〕ラット型ＧＰＲ７リガンドＦのア
ミノ酸配列を示す。 〔配列番号：１５８〕ヒト型ＧＰＲ７リガンドＡをコー
ドするＤＮＡの塩基配列を示す。 〔配列番号：１５９〕マウス型ＧＰＲ７リガンドＡをコ
ードするＤＮＡの塩基配列を示す。 〔配列番号：１６０〕ラット型ＧＰＲ７リガンドＡをコ
ードするＤＮＡの塩基配列を示す。 〔配列番号：１６１〕ヒト型ＧＰＲ７リガンドＢをコー
ドするＤＮＡの塩基配列を示す。 〔配列番号：１６２〕マウス型ＧＰＲ７リガンドＢをコ
ードするＤＮＡの塩基配列を示す。 〔配列番号：１６３〕ラット型ＧＰＲ７リガンドＢをコ
ードするＤＮＡの塩基配列を示す。 〔配列番号：１６４〕ヒト型ＧＰＲ７リガンドＣをコー
ドするＤＮＡの塩基配列を示す。 〔配列番号：１６５〕ヒト型ＧＰＲ７リガンドＤをコー
ドするＤＮＡの塩基配列を示す。 〔配列番号：１６６〕マウス型ＧＰＲ７リガンドＣをコ
ードするＤＮＡの塩基配列を示す。 〔配列番号：１６７〕マウス型ＧＰＲ７リガンドＤをコ
ードするＤＮＡの塩基配列を示す。 〔配列番号：１６８〕ラット型ＧＰＲ７リガンドＣをコ
ードするＤＮＡの塩基配列を示す。 〔配列番号：１６９〕ラット型ＧＰＲ７リガンドＤをコ
ードするＤＮＡの塩基配列を示す。 〔配列番号：１７０〕ヒト型ＧＰＲ７リガンドＥをコー
ドするＤＮＡの塩基配列を示す。 〔配列番号：１７１〕マウス型ＧＰＲ７リガンドＥをコ
ードするＤＮＡの塩基配列を示す。 〔配列番号：１７２〕ラット型ＧＰＲ７リガンドＥをコ
ードするＤＮＡの塩基配列を示す。 〔配列番号：１７３〕ヒト型ＧＰＲ７リガンドＦをコー
ドするＤＮＡの塩基配列を示す。 〔配列番号：１７４〕マウス型ＧＰＲ７リガンドＦをコ
ードするＤＮＡの塩基配列を示す。 〔配列番号：１７５〕ラット型ＧＰＲ７リガンドＦをコ
ードするＤＮＡの塩基配列を示す。 〔配列番号：１７６〕分泌シグナルを含むヒト型ＧＰＲ
７リガンド前駆体のアミノ酸配列を示す。 〔配列番号：１７７〕分泌シグナルを含むマウス型ＧＰ
Ｒ７リガンド前駆体のアミノ酸配列を示す。 〔配列番号：１７８〕分泌シグナルを含むラット型ＧＰ
Ｒ７リガンド前駆体のアミノ酸配列を示す。 〔配列番号：１７９〕参考例６１で得られた、分泌シグ
ナルを含むヒト型ＧＰＲ７リガンド前駆体をコードする
ＤＮＡの塩基配列を示す。 〔配列番号：１８０〕参考例６２で得られた、分泌シグ
ナルを含むマウス型ＧＰＲ７リガンド前駆体をコードす
るＤＮＡの塩基配列を示す。 〔配列番号：１８１〕参考例６３で得られた、分泌シグ
ナルを含むラット型ＧＰＲ７リガンド前駆体をコードす
るＤＮＡの塩基配列を示す。 〔配列番号：１８２〕ヒトＧＰＲ７のアミノ酸配列を示
す。 〔配列番号：１８３〕ヒトＧＰＲ７をコードするＤＮＡ
の塩基配列を示す。 〔配列番号：１８４〕参考例６１で使用した合成ＤＮＡ
を示す。 〔配列番号：１８５〕参考例６１で使用した合成ＤＮＡ
を示す。 〔配列番号：１８６〕参考例６２で使用した合成ＤＮＡ
を示す。 〔配列番号：１８７〕参考例６２で使用した合成ＤＮＡ
を示す。 〔配列番号：１８８〕参考例６３で使用した合成ＤＮＡ
を示す。 〔配列番号：１８９〕参考例６３で使用した合成ＤＮＡ
を示す。 〔配列番号：１９０〕参考例６０で用いたプライマーの
塩基配列を示す。 〔配列番号：１９１〕参考例６０で用いたプライマーの
塩基配列を示す。
【０１２８】後述の実施例１で得られた形質転換体 大
腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＨ１０Ｂ
／ｐＡＫ−ｒＧＰＲ７は、２０００年１０月３１日から
大阪府大阪市淀川区十三本町２丁目１７番８５号（郵便
番号５３２−８６８６）、財団法人・発酵研究所（ＩＦ
Ｏ）に受託番号ＩＦＯ １６４９６として、２０００年
１１月１３日から茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中
央第６（郵便番号３０５−８５６６）、独立行政法人産
業技術総合研究所 特許生物寄託センター（旧通商産業
省工業技術院生命工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ））に
受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７３６５としてそれぞれ寄託
されている。後述の実施例１１で得られた形質転換体
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０
／ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ Ｍｏｕｓｅ ＧＰＲ７は、２
００１年９月２０日から大阪府大阪市淀川区十三本町２
丁目１７番８５号（郵便番号５３２−８６８６）、財団
法人・発酵研究所（ＩＦＯ）に受託番号ＩＦＯ １６７
０４として、２００１年１０月１５日から茨城県つくば
市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号３０５−８５６
６）、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託セ
ンターに受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７７７５としてそれ
ぞれ寄託されている。後述の参考例３で得られた形質転
換体 大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｄ
Ｈ５α／ｐＡＫＫＯ−ＧＰＲ８は、大阪府大阪市淀川区
十三本町２丁目１７番８５号（郵便番号５３２−８６８
６）、財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）に２００１年２月
２７日から寄託番号ＩＦＯ １６５６４として、茨城県
つくば市東１丁目１番地１ 中央第６（郵便番号３０５
−８５６６）、独立行政法人産業技術総合研究所 特許
生物寄託センターに２００１年４月１１日から受託番号
ＦＥＲＭ ＢＰ−７５４０として、それぞれ寄託されて
いる。後述の参考例２５で得られた形質転換体 大腸菌
（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０／ｐＣ
Ｒ２．１−ＴＯＰＯ Ｈｕｍａｎ ＧＰＲ８ Ｌｉｇａｎ
ｄ Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒは、大阪府大阪市淀川区十三本
町２丁目１７番８５号（郵便番号５３２−８６８６）、
財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）に２００１年２月２７日
から寄託番号ＩＦＯ １６５６８として、茨城県つくば
市東１丁目１番地１ 中央第６（郵便番号３０５−８５
６６）、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄
託センターに２００１年４月１１日から受託番号ＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−７５４４として、それぞれ寄託されている。
後述の参考例２９で得られた形質転換体 大腸菌（Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０／ｐＣＲ２．
１−ＴＯＰＯ Ｐｏｒｃｉｎｅ ＧＰＲ８ Ｌｉｇａｎｄ
Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒは、大阪府大阪市淀川区十三本町２
丁目１７番８５号（郵便番号５３２−８６８６）、財団
法人発酵研究所（ＩＦＯ）に２００１年２月２７日から
寄託番号ＩＦＯ １６５６５として、茨城県つくば市東
１丁目１番地１ 中央第６（郵便番号３０５−８５６
６）、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託
センターに２００１年４月１１日から受託番号ＦＥＲＭ
ＢＰ−７５４１として、それぞれ寄託されている。後述
の参考例３３で得られた形質転換体 大腸菌（Ｅｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０／ｐＣＲ２．１−
ＴＯＰＯ Ｒａｔ ＧＰＲ８ Ｌｉｇａｎｄ Ｐｒｅｃｕｒ
ｓｏｒは、大阪府大阪市淀川区十三本町２丁目１７番８
５号（郵便番号５３２−８６８６）、財団法人発酵研究
所（ＩＦＯ）に２００１年２月２７日から寄託番号ＩＦ
Ｏ １６５６７として、茨城県つくば市東１丁目１番地
１ 中央第６（郵便番号３０５−８５６６）、独立行政
法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに２００
１年４月１１日から受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７５４３
として、それぞれ寄託されている。後述の参考例３８で
得られた形質転換体 大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０／ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ Ｍｏ
ｕｓｅ ＧＰＲ８ Ｌｉｇａｎｄ Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ
は、大阪府大阪市淀川区十三本町２丁目１７番８５号
（郵便番号５３２−８６８６）、財団法人発酵研究所
（ＩＦＯ）に２００１年２月２７日から寄託番号ＩＦＯ
１６５６６として、茨城県つくば市東１丁目１番地１
中央第６（郵便番号３０５−８５６６）、独立行政法
人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに２００
１年４月１１日から受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７５４２
として、それぞれ寄託されている。後述の参考例６１で
得られた形質転換体 大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９／ｐＴＡｈＧＰＲ７−１は、Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＴＡｈＧ
ＰＲ７Ｌ−１として、２００１年６月２７日から茨城県
つくば市東１丁目１番地１ 中央第６（郵便番号３０５
−８５６６）の独立行政法人産業技術総合研究所 特許
生物寄託センターに寄託番号ＦＥＲＭＢＰ−７６４０と
して、２００１年６月１９日から大阪府大阪市淀川区十
三本町２丁目１７番８５号（郵便番号５３２−８６８
６）の財団法人・発酵研究所（ＩＦＯ）に寄託番号ＩＦ
Ｏ １６６４４として寄託されている。後述の参考例６
２で得られた形質転換体 大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａｃｏｌｉ）ＪＭ１０９／ｐＴＡｍＧＰＲ７−１は、
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＴＡ
ｍＧＰＲ７Ｌ−１として、２００１年６月２７日から茨
城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６（郵便番号３
０５−８５６６）の独立行政法人産業技術総合研究所
特許生物寄託センターに寄託番号ＦＥＲＭＢＰ−７６４
１として、２００１年６月１９日から大阪府大阪市淀川
区十三本町２丁目１７番８５号（郵便番号５３２−８６
８６）の財団法人・発酵研究所（ＩＦＯ）に寄託番号Ｉ
ＦＯ １６６５６として寄託されている。後述の参考例
６３で得られた形質転換体 大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａｃｏｌｉ）ＪＭ１０９／ｐＴＡｒＧＰＲ７−１
は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐ
ＴＡｒＧＰＲ７Ｌ−１として、２００１年６月２７日か
ら茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６（郵便番
号３０５−８５６６）の独立行政法人産業技術総合研究
所 特許生物寄託センターに寄託番号ＦＥＲＭＢＰ−７
６４２として、２００１年６月１９日から大阪府大阪市
淀川区十三本町２丁目１７番８５号（郵便番号５３２−
８６８６）の財団法人・発酵研究所（ＩＦＯ）に寄託番
号ＩＦＯ １６６５７として寄託されている。
【０１２９】
【実施例】以下に実施例および参考例を示して、本発明
をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を限定
するものではない。なお、大腸菌を用いての遺伝子操作
法は、モレキュラー・クローニング(Molecular clonin
g)に記載されている方法に従った。 実施例１ ラット全脳由来Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク
質をコードするｃＤＮＡのクローニングと塩基配列の決
定 ラット全脳ｃＤＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を鋳型とし、
ヒトＧＰＲ８をコードするＤＮＡの塩基配列を元に設計
した２個のプライマー、プライマー１（配列番号：３）
およびプライマー２（配列番号：４）を用いてＰＣＲ反
応を行った。該反応における反応液の組成は、上記ｃＤ
ＮＡを１０分の１量鋳型として使用し、Ａｄｖａｎｔａ
ｇｅ−２ ｃＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｍｉｘ（Ｃ
ＬＯＮＴＥＣＨ）１／５０量、プライマー３ ０．２μ
Ｍ、プライマー２ ０．２μＭ 、ｄＮＴＰｓ ２００μ
Ｍ、および酵素に添付のバッファーを加え、２５μｌの
液量とした。ＰＣＲ反応は、（i）９４℃・２分の後、
（ii）９４℃・２０秒、７２℃・２分のサイクルを３
回、（iii）９４℃・２０秒、６６℃・２０秒、６８℃
・２分のサイクルを３回、（iv）９４℃・２０秒、６０
℃・２０秒、６８℃・２分のサイクルを３６回繰り返
し、最後に６８℃・７分の伸長反応を行った。該ＰＣＲ
反応後の反応産物を、ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖ
ｉｔｒｏｇｅｎ）の処方に従い、プラスミドベクターｐ
ＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へサブ
クローニングした。これを大腸菌ＤＨ５αに導入し、ア
ンピシリンを含むＬＢ寒天培地中で、ｃＤＮＡを持つク
ローンを選択した。個々のクローンの配列を解析した結
果、新規Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質をコ
ードするｃＤＮＡの塩基配列（配列番号：２）を得た。
このＤＮＡの塩基配列がコードするアミノ酸配列（配列
番号：１）を含有する新規Ｇタンパク質共役型レセプタ
ータンパク質をＴＧＲ２６と命名した〔図１，図２〕。
配列番号：１で表されるアミノ酸配列は、既知のヒトＧ
タンパク質共役型レセプタータンパク質であるＧＰＲ７
〔ゲノミクス（Genomics），２８巻，８４−９１頁，１
９９５年〕との間に８４．８％の相同性を有していた。
ＴＧＲ２６をコードするＤＮＡを挿入したプラスミドを
有する前述した形質転換体から１クローンを選択し、ア
ンピシリンを含むＬＢ培地で振とう培養し、プラスミド
を得た。これを制限酵素ＣｌａＩおよびＳｐｅＩで処理
し、ＴＧＲ２６をコードするインサート部分を切り出し
た。同様に制限酵素ＣｌａＩおよびＳｐｅＩで処理した
ｐＡＫＫＯ−１．１１ＨおよびＬｉｇａｔｉｏｎ Ｅｘ
ｐｒｅｓｓ Ｋｉｔ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を用いて連結
し、大腸菌ＤＨ１０Ｂにエレクトロポーレーション法に
て導入した。得られたクローンについては、有する発現
細胞構築用プラスミドの構造を、制限酵素処理および配
列解析で確認したうえ、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ ｃｏｌｉ）ＤＨ１０Ｂ／ｐＡＫ−ｒＧＰＲ７と命名
した。ＴＧＲ２６の疎水性プロット図を〔図３〕に示
す。
【０１３０】実施例２ ＴＧＲ２６発現ＣＨＯ細胞の作製 実施例１に記載の発現プラスミドｐＡＫ−ｒＧＰＲ７で
形質転換したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ
５α（東洋紡）を培養後、Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉ
Ｋｉｔ（キアゲン）を用いてｐＡＫ−ｒＧＰＲ７プラス
ミドＤＮＡを調製した。これをＣｅｌｌＰｈｅｃｔ Ｔ
ｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（アマシャムファルマ
シアバイオテク）を用いて、添付のプロトコールに従っ
てＣＨＯｄｈｆｒ-細胞に導入した。５μｇのＤＮＡを
リン酸カルシウムとの共沈懸濁液とし、４８時間前に３
ｘ１０5個のＣＨＯ ｄｈｆｒ-細胞を播種した直径６ｃ
ｍシャーレ２枚に添加した。１０％ウシ胎児血清を含む
ＭＥＭα培地で１日間培養した後、継代し、選択培地で
ある１０％透析ウシ胎児血清を含む核酸不含ＭＥＭα培
地で培養した。選択培地中に増殖してくるＴＧＲ２６発
現ＣＨＯ細胞である形質転換細胞のコロニー４４クロー
ンを選択した。
【０１３１】実施例３ ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法を用いたＴＧＲ２６発現ＣＨＯ
細胞株のＴＧＲ２６発現量の定量 実施例２で得たＴＧＲ２６発現ＣＨＯ細胞株４４クロー
ンを、各２５ｃｍ2フラスコに培養し、ＲＮｅａｓｙ
Ｍｉｎｉ Ｋｉｔｓ（キアゲン）を用いてｔｏｔａｌ
ＲＮＡを調製した後、ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ ＤＮａｓ
ｅ Ｓｅｔ（キアゲン）を用いてＤＮａｓｅ処理をし
た。得られたｔｏｔａｌ ＲＮＡ ４μｇをランダムプラ
イマー（宝酒造）５００ｐｍｏｌを含む溶液１２μｌと
して７０℃で１０分間処理した後氷冷し、さらに１ｘＦ
ｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ Ｂｕｆｆｅｒ、１０ ｍＭ
ＤＴＴ、５００μＭ ｄＡ／ｄＣ／ｄＧ／ｄＴＴＰおよ
び２００ ｕｎｉｔｓ ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ ＩＩ
（ギブコ）を添加し、混合液２０μｌを、３０℃・１０
分、４２℃・６０分、５１℃・３０分、７０℃・１５分
で処理することにより逆転写反応を行なった。得られた
ｔｏｔａｌ ＲＮＡ５ｎｇ相当の逆転写産物、または後
に述べるようにして作製した１０から１ｘ１０7コピー
の標準ｃＤＮＡ、１ｘＵｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍ
ａｓｔｅｒＭｉｘ（ＰＥバイオシステムズ）、配列番
号：５で表されるプライマーおよび配列番号：６で表さ
れるプライマー各１００ｎＭ、および配列番号：７（Fa
m-tcctctgctg gacaccgtac cacctga-Tamra；配列中、Fam
は6-carboxy-fluoresceinを、Tamraは6-carboxy-tetram
ethyl-rhodamineを、それぞれ示す。)で表されるＴａｑ
Ｍａｎプローブ １００ｎＭを含む反応混合液２５μｌ
についてＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００ Ｓｅｑｕｅｎ
ｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（ＰＥバイオシステムズ）を用
いてＰＣＲを行なった。ＰＣＲは、５０℃・２分、９５
℃・１０分で処理後、９５℃・１５秒、６０℃・６０秒
のサイクルを４０回繰り返すことにより行なった。標準
ｃＤＮＡは、１００ｐｇのＴＧＲ２６発現プラスミドＤ
ＮＡ（ｐＡＫ−ｒＧＰＲ７）、配列番号：５で表される
プライマーおよび配列番号：６で表されるプライマー各
５００ｎＭ、１ｘＰＣＲ Ｇｏｌｄ Ｂｕｆｆｅｒ、
２．５ｍＭＭｇＣｌ2、２００μＭ ｄＡ／ｄＣ／ｄＧ
／ｄＴＴＰおよび２０ｕｎｉｔｓＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇ
ｏｌｄ（ＰＥバイオシステムズ）を含む反応混合液２０
０μｌを、ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９
７００（ＰＥバイオシステムズ）を用いて、９５℃・１
０分で処理後、９５℃・１０秒、６３℃・１５秒、７２
℃・１０秒のサイクルを４０回繰り返す条件のＰＣＲを
行なって増幅して調製した。ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ
Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（キアゲン）を用
いて精製した合成ｃＤＮＡの２６０ｎｍの吸光度を測定
して濃度を算出し、さらに標準ｃＤＮＡの正確なコピー
数を算出した後、１ｍＭ ＥＤＴＡを含む１０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）溶液で希釈し、１ｘ１０
8コピー／μｌの濃度の標準ｃＤＮＡ溶液を調製した。
また、ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ用プローブおよびプライマ
ーはＰｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｖｅｒｓｉｏｎ
１．０）（ＰＥバイオシステムズ）により設計した。発
現量はＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００ ＳＤＳソフトウ
ェアによって算出した。リポーターの蛍光強度が設定さ
れた値に達した瞬間のサイクル数を縦軸にとり、標準ｃ
ＤＮＡの初期濃度の対数値を横軸にとり、標準曲線を作
成した。標準曲線より各逆転写産物の初期濃度を算出
し、各クローンのｔｏｔａｌ ＲＮＡ当たりのＴＧＲ２
６遺伝子発現量を求めた。その結果、ＴＧＲ２６発現Ｃ
ＨＯ細胞株クローン番号１８および２８が高い発現量を
示すことがわかった。以後の実験にはこれら２つのクロ
ーンの発現細胞を用いた。
【０１３２】実施例４ ＴＧＲ２６発現ＣＨＯ細胞を用いた細胞内ｃＡＭＰ産生
量の測定 実施例３で作製したＴＧＲ２６発現ＣＨＯ細胞を２４穴
プレートに５ｘ１０4ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌで播種し、４
８時間培養した。細胞を０．２ｍＭ ３−イソブチル−
メチルキサンチン、０．０５％ ＢＳＡ（ウシ血清アル
ブミン）および２０ｍＭ ＨＥＰＥＳを含むＭＥＭαバ
ッファー（ｐＨ７．４）で洗浄した〔以下、０．２ｍＭ
３−イソブチル−メチルキサンチン、０．０５％ Ｂ
ＳＡおよび２０ｍＭ ＨＥＰＥＳを含むＭＥＭαバッフ
ァー（ｐＨ７．４）を、反応用バッファーと呼ぶ〕。そ
の後、０．５ｍｌの反応用バッファーを加えて３０分間
培養器で保温した。反応用バッファーを除き、新たに
０．２５ｍｌの反応用バッファーを細胞に加えた後、適
当な濃度のＤＭＳＯ溶液とした試料と２μＭフォルスコ
リンを含む０．２５ｍｌの反応用バッファーを細胞に加
え、３７℃で３０分間反応させた。１００μｌの２０％
過塩素酸を加えて反応を停止させ、次に氷上で１時間置
くことにより細胞内ｃＡＭＰを抽出した。抽出液中のｃ
ＡＭＰ量は、ｃＡＭＰ ＥＩＡキット（アマシャムファ
ルマシアバイオテク）を用いて測定した。
【０１３３】実施例５ ＴＧＲ２６発現ＣＨＯ細胞膜画分を用いて測定した２３
残基または３０残基のＧＰＲ８リガンドペプチドヒトホ
モログの細胞内ｃＡＭＰ産生抑制活性 参考例１２で得られた配列番号：８で表される２３残基
のＧＰＲ８リガンドペプチドヒトホモログ（以下、ｈＧ
ＰＲ８Ｌ（１−２３）と記載することがある）または参
考例１３で得られた配列番号：９で表される３０残基の
ＧＰＲ８リガンドペプチドヒトホモログ（以下、ｈＧＰ
Ｒ８Ｌ（１−３０）と記載することがある）を、種々の
濃度で実施例４に記載した方法でＴＧＲ２６発現ＣＨＯ
細胞膜画分に投与し、細胞内ｃＡＭＰ産生抑制活性を測
定した。結果を〔図４〕に示す。これより明らかに、ｈ
ＧＰＲ８Ｌ（１−２３）およびｈＧＰＲ８Ｌ（１−３
０）は濃度依存的にＴＧＲ２６発現ＣＨＯ細胞細胞内ｃ
ＡＭＰの産生を抑制した。図中、ｃＡＭＰ合成抑制活性
は、フォルスコリンを含む反応用バッファーを添加した
ときの細胞内ｃＡＭＰ量から反応用バッファーを添加し
たときの細胞内ｃＡＭＰ量を減じた量を１００％とし
て、ｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）またはｈＧＰＲ８Ｌ（１
−３０）を加えたときの細胞内ｃＡＭＰ量から反応用バ
ッファーを添加したときの細胞内ｃＡＭＰ量を減じた量
を％として表わした。これより、ｈＧＰＲ８Ｌ（１−２
３）またはｈＧＰＲ８Ｌ（１−３０）が、ＴＧＲ２６に
対するリガンドであることが明らかとなった。ｈＧＰＲ
８Ｌ（１−２３）のブタ、ラットおよびマウスのホモロ
グ（配列番号：５６、配列番号：７３および配列番号：
９１）およびｈＧＰＲ８Ｌ（１−３０）のブタ、ラット
およびマウスのホモログ（配列番号：５７、配列番号：
７４および配列番号：９２）を用いても、上記と同様
に、濃度依存的にＴＧＲ２６発現ＣＨＯ細胞細胞内ｃＡ
ＭＰの産生抑制を確認できる。
【０１３４】実施例６ ＴＧＲ２６発現ＣＨＯ細胞の膜画分を用いたＧＴＰγＳ
結合活性の測定 ＴＧＲ２６発現ＣＨＯ細胞膜画分に対する［35Ｓ］−ｇ
ｕａｎｏｓｉｎｅ ５’−（γ−ｔｈｉｏ）ｔｒｉｐｈ
ｏｓｐｈａｔｅ（ＧＴＰγＳ）の結合促進活性を以下の
方法により測定した。 １）膜画分の調整法 １ｘ１０8個のＴＧＲ２６発現ＣＨＯ細胞に１０ｍｌの
ホモジネートバッファー（１０ｍＭ ＮａＨＣＯ3、５
ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５ｍＭ ＰＭＳＦ（フェニルメチ
ルスルホニルフルオライド）、１μｇ／ｍｌ ペプスタ
チン、４μｇ／ｍｌ Ｅ−６４、２０μｇ／ｍｌ ロイ
ペプチン）を添加し、ポリトロン（１２，０００ｒｐ
ｍ、１分間）を用いて破砕した。細胞破砕液を遠心
（１，０００ｇ、１５分間）して上清を得た。次にこの
上清を超遠心分離（Ｂｅｃｋｍａｎ ｔｙｐｅ ３０ロ
ーター、３０，０００ｒｐｍ、１時間）し、得られた沈
殿物をＴＧＲ２６発現ＣＨＯ細胞膜画分とした。 ２）ＧＴＰγＳ結合活性の測定 ＴＧＲ２６発現ＣＨＯ細胞膜画分を膜希釈緩衝液（５０
ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）、５ ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ2、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１μＭ ＧＤＰ、
０．１％ ＢＳＡ）で希釈して、タンパク質濃度３０μ
ｇ／ｍｌのアッセイ用細胞膜画分溶液を調製した。アッ
セイ用膜画分溶液２００μｌに、５０ｎＭ濃度の
［35Ｓ］−ｇｕａｎｏｓｉｎｅ ５’−（γ−ｔｈｉ
ｏ）ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＮＥＮ社）を２μｌと
適当な濃度のＤＭＳＯ溶液とした試料２μｌとを添加
し、この混合液を２５℃で一時間保温した。混合液をフ
ィルター濾過し、さらにフィルターを洗浄用バッファー
（５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）、５ｍＭ
ＭｇＣｌ2、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ ＢＳＡ）
１．５ｍｌで２回洗浄した後、フィルターの放射活性を
液体シンチレーションカウンターで測定した。
【０１３５】実施例７ ＴＧＲ２６発現ＣＨＯ細胞膜画分を用いて測定した２３
残基または３０残基のＧＰＲ８リガンドペプチドヒトホ
モログのＧＴＰγＳ結合促進活性 ｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）またはｈＧＰＲ８Ｌ（１−３
０）を種々の濃度で、実施例６に記載した方法に従い、
ＴＧＲ２６発現ＣＨＯ細胞膜画分と混合し、ＧＴＰγＳ
結合促進活性を測定した。結果を〔図５〕に示す。これ
より明らかに、ｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）およびｈＧＰ
Ｒ８Ｌ（１−３０）は濃度依存的にＴＧＲ２６発現ＣＨ
Ｏ細胞膜画分のＧＴＰγＳ結合を促進した。ｈＧＰＲ８
Ｌ（１−２３）のブタ、ラットおよびマウスのホモログ
（配列番号：５６、配列番号：７３および配列番号：９
１）およびｈＧＰＲ８Ｌ（１−３０）のブタ、ラットお
よびマウスのホモログ（配列番号：５７、配列番号：７
４および配列番号：９２）を用いても、上記と同様に、
濃度依存的にＴＧＲ２６発現ＣＨＯ細胞膜画分のＧＴＰ
γＳ結合促進を確認できる。
【０１３６】実施例８ ［125Ｉ−Ｔｙｒ10］−ｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）を用
いたレセプター結合実験 参考例１５に記載した方法により作製した［125Ｉ−Ｔ
ｙｒ10］−ｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）および実施例６に
記載したＴＧＲ２６発現ＣＨＯ細胞から調製した細胞膜
画分を用いて以下のようにしてレセプター結合実験を行
なった。ＴＧＲ２６発現ＣＨＯ細胞から調製した細胞膜
画分を、アッセイ用バッファー（25 mM Tris-HCl、5 mM
EDTA、0.05% CHAPS（3−[(3−コラミドプロピル)ジメ
チルアンモニオ]-1-プロパン硫酸）、0.1％ BSA、0.5 m
M PMSF、1μg/ml ペプスタチン、20μg/ml ロイペプチ
ン、4μg/ml E-64、pH 7.4）で各種濃度に希釈後、ポリ
プロピレン製試験管（Falcon 2053）に２００μｌずつ
分注した。最大結合量を測定するために２μｌのＤＭＳ
Ｏと７ｎＭの［125Ｉ−Ｔｙｒ10］−ｈＧＰＲ８Ｌ（１
−２３） ２μｌを膜画分溶液に添加した。また、非特
異的結合を測定するために１００μＭ ｈＧＰＲ８Ｌ
（１−２３）のＤＭＳＯ溶液２μｌと７ｎＭの［125Ｉ
−Ｔｙｒ10］−ｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３） ２μｌを膜
画分溶液に添加した。２５℃で７５分間反応させた後、
ポリエチレンイミン処理したワットマングラスフィルタ
ー（ＧＦ−Ｆ）を用いて反応液を吸引ろ過しさらにフィ
ルターを洗浄用バッファー（25 mM Tris-HCl、5 mM EDT
A、0.05% CHAPS、0.1％ BSA、pH 7.4）1.5 mlで2回洗浄
した。ろ過後、γ−カウンターを用いてろ紙上に残った
放射活性を測定し、最大結合量から非特異的結合量を引
いて特異的結合量を見積もった。膜画分の濃度を変化さ
せると膜画分の濃度に依存した［125Ｉ−Ｔｙｒ10］−
ｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）の特異的な結合が認められ
た。膜画分濃度を３μｇ／ｍｌに設定してｈＧＰＲ８Ｌ
（１−２３）およびｈＧＰＲ８Ｌ（１−３０）による［
125Ｉ−Ｔｙｒ10］−ｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）のＴＧ
Ｒ２６発現細胞膜画分への特異的結合に対する結合阻害
を調べた。阻害率から５０％阻害濃度（ＩＣ 50値）を算
出したところ、ｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）のＩＣ50値は
０．１２ｎＭであった。また、ｈＧＰＲ８Ｌ（１−３
０）のＩＣ50値は０．０２８ｎＭであった。これより、
ｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）およびｈＧＰＲ８Ｌ（１−３
０）がＴＧＲ２６発現細胞膜画分に対して高い親和性を
有することが示された。このことは、ｈＧＰＲ８Ｌ（１
−２３）およびｈＧＰＲ８Ｌ（１−３０）がＴＧＲ２６
レセプターの高親和性リガンドであることを意味するも
のである。〔図７〕に種々の濃度におけるｈＧＰＲ８Ｌ
（１−２３）およびｈＧＰＲ８Ｌ（１−３０）の結合阻
害を示す。ｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）のラットおよびマ
ウスのホモログ（配列番号：７３および配列番号：９
１）およびｈＧＰＲ８Ｌ（１−３０）のブタ、ラットお
よびマウスのホモログ（配列番号：５７、配列番号：７
４および配列番号：９２）を用いても、上記と同様に、
［125Ｉ−Ｔｙｒ10］−ｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）のＴ
ＧＲ２６発現細胞膜画分への特異的結合に対する結合阻
害を確認できる。
【０１３７】実施例９ ＴＧＲ２６発現ＣＨＯ細胞膜画分および［125Ｉ−Ｔｙ
ｒ10］−ｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）を用いて測定したＧ
ＰＲ８リガンドペプチドのヒトおよびブタホモログの誘
導体のレセプター結合活性 参考例で得られたＧＰＲ８リガンドペプチドのヒトおよ
びブタホモログの誘導体のレセプター結合活性を、実施
例８に記載した方法でＴＧＲ２６発現ＣＨＯ細胞膜画分
および［125Ｉ−Ｔｙｒ10］−ｈＧＰＲ８Ｌ（１−２
３）を用いて測定した。測定した誘導体の配列番号とレ
セプター結合活性を表１に示す。レセプター結合活性
は、５０％結合阻害濃度（ＩＣ50値）で示した。
【０１３８】
【表１】
【０１３９】実施例１０ マウスＴＧＲ２６をコードするｃＤＮＡの５’上流端の
クローニング 5’RACE PCRクローニングによりマウスＴＧＲ２６をコ
ードするｃＤＮＡの５’上流塩基配列を明らかにした。
5’RACE PCRクローニングは、参考例３５に記載のマウ
ス脳ｃＤＮＡを鋳型としてSMARTTM RACE cDNA Amplific
ation Kitに添付のUniversal Primer Mixと配列番号：
１３２の合成プライマーでＰＣＲ反応を行ない、次にこ
のＰＣＲ反応液を鋳型としてキットに添付のNested Uni
versal Primerと配列番号：１３３の合成プライマーで
ＰＣＲ反応を行なうことにより達成された。配列番号：
１３２および配列番号：１３３のプライマーは、Genban
kに登録のマウスＧＰＲ７ ｃＤＮＡ断片配列（Accessio
n:U23807）を基に設計した。ＰＣＲの反応液組成と反応
条件は以下のとおりである。反応液はマウス脳ｃＤＮＡ
１μｌ、Universal Primer Mix ２μｌ、配列番号：１
３２の合成ＤＮＡプライマー０．２μＭ、0.8mM dNTP
s、Advantage-GC 2ポリメラーゼ(CLONTECH) ０．４μｌ
および酵素に付属のバッファーで総反応量を２０μｌと
し、サーマルサイクラー（ＰＥバイオシステムズ）を用
い、96℃・120秒の加熱の後、96℃・30秒、68℃・120秒
のサイクルを30回繰り返し、さらに72℃で10分間保温し
た。次に、キットに添付のTricine-EDTABufferで５０倍
希釈したＰＣＲ反応液０．５μｌ、Nested Universal P
rimer０．５μＭ、配列番号：１３３の合成ＤＮＡプラ
イマー０．５μＭ、0.8mM dNTPs、Advantage-GC 2ポリ
メラーゼ(CLONTECH)０．４μｌおよび酵素に付属のバッ
ファーで総反応量を２０μｌとし、サーマルサイクラー
（ＰＥバイオシステムズ）を用い、96℃・120秒の加熱
の後、96℃・30秒、60℃・30秒、72℃・60秒のサイクル
を30回繰り返し、さらに72℃で10分間保温した。増幅し
たＤＮＡを1.5%のアガロースゲル電気泳動により分離し
た後、約４５０塩基長のＤＮＡをカミソリで切り出し、
ＤＮＡをQIAquick Gel Extraction Kit（キアゲン）を
用いて回収した。このＤＮＡをTOPO TA Cloning Kit (I
nvitrogen)のプロトコールに従ってpCR2.1-TOPOベクタ
ーへクローニングした。これをエシェリヒア・コリ(Esc
herichia coli) TOP10 competent cell（Invitrogen）
に導入して形質転換した後、ｃＤＮＡ挿入断片を持つク
ローンをアンピシリンおよびＸ−ｇａｌを含むＬＢ寒天
培地で選択し、白色を呈するクローンのみを滅菌したつ
ま楊枝を用いて分離し、形質転換体を得た。個々のクロ
ーンをアンピシリンを含むＬＢ培地で一晩培養し、QIAw
ell 8 Plasmid Kit （キアゲン）を用いてプラスミドＤ
ＮＡを調整した。塩基配列の決定のための反応はBigDye
Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit(Ｐ
Ｅバイオシステムズ)を用いて行ない、蛍光式自動シー
ケンサーを用いて解読し、配列番号：１３４で表される
塩基配列を得た。
【０１４０】実施例１１ マウスＴＧＲ２６をコードするｃＤＮＡのクローニング マウス脳ｃＤＮＡを鋳型として配列番号：１３５の合成
プライマーと配列番号：１３６の合成プライマーを用い
たＰＣＲ法によりマウスＴＧＲ２６ ＤＮＡの増幅を行
なった。反応液の組成は、マウス脳ｃＤＮＡ １μｌ、
合成プライマー各０．２μＭ、0.8 mM dNTPs、Advantag
e cDNA Polymerase Mix (CLONTECH) ０．４μｌおよび
酵素に付属のバッファーで、総反応量を２０μｌとし
た。サーマルサイクラー (Applied Biosystems社) を用
い、９６℃で２分の加熱した後、９６℃で３０秒、６４
℃で３０秒、７２℃で１分の加熱サイクルを３０回繰り
返し、最後に７２℃で１０分間保温した。ＰＣＲ反応液
中の約１１００塩基長の増幅ＤＮＡ断片を、TOPO TA Cl
oning Kit (Invitrogen) のプロトコールに従い、pCR
2.1-TOPOへクローニングした。これをエシェリヒア・コ
リ（Escherichia coli）TOP10 competent cell（Invitr
ogen）に導入して形質転換した後、ｃＤＮＡ挿入断片を
持つクローンをアンピシリンおよびＸ−ｇａｌを含むＬ
Ｂ寒天培地で選択し、白色を呈するクローンのみを滅菌
したつま楊枝を用いて分離し、形質転換体を得た。個々
のクローンをアンピシリンを含むＬＢ培地で一晩培養
し、QIAwell 8 Plasmid Kit（キアゲン）を用いてプラ
スミドＤＮＡを調整した。塩基配列の決定のための反応
はBigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reactio
n Kit (ＰＥバイオシステムズ)を用いて行ない、蛍光式
自動シーケンサーを用いて解読し、配列番号：１３７で
表される塩基配列を得た。配列番号：１３７で表される
塩基配列をアミノ酸配列に翻訳したものをマウスＴＧＲ
２６アミノ酸配列とし、配列番号：１３８として示す。
配列番号：１３８をラット由来のＴＧＲ２６のアミノ酸
配列（配列番号：１）と比較したところ、９６．０％の
アミノ酸の一致が認められた。配列番号：１３７で表さ
れる塩基配列を有するＤＮＡを含むプラスミドで形質転
換した大腸菌を、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃ
ｏｌｉ）ＴＯＰ１０／ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯマウスＧ
ＰＲ７と命名した。
【０１４１】参考例１ ヒト脳由来ｃＤＮＡを用いたＰＣＲ法によるヒトＧＰＲ
８ｃＤＮＡの増幅 ヒト脳由来ｐｏｌｙ（Ａ）+ＲＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣ
Ｈ）を鋳型として、ランダムプライマーを用いて逆転写
反応を行なった。逆転写は、ＲＮＡ ＰＣＲ ｖｅｒ
２．１キット試薬（宝酒造）を使用した。次にこの逆転
写生成物を鋳型として用い、配列番号：１０および配列
番号：１１で表される合成プライマーを用いてＰＣＲ法
による増幅を行なった。合成プライマーはレセプタータ
ンパク質に翻訳される領域の遺伝子が増幅されるように
構築したが、その際に遺伝子の５’側に制限酵素Ｃｌａ
Ｉの認識する塩基配列が付加され、３’側に制限酵素Ｓ
ｐｅＩの認識する塩基配列が付加されるように、５’側
および３’側にそれぞれの制限酵素の認識配列を付加し
た。反応液の組成は、ｃＤＮＡ鋳型５μｌ，合成ＤＮＡ
プライマー各０．４μＭ、０．８ｍＭ ｄＮＴＰｓ、ｐ
ｆｕポリメラーゼ（ストラタジーン）０．５μｌおよび
酵素に付属のバッファーで、総反応量は５０μｌとし
た。増幅のためのサイクルはサーマルサイクラー（ＰＥ
バイオシステムズバイオシステムズ）を用い、９４℃・
６０秒の加熱の後、９４℃・６０秒、６５℃・６０秒、
７２℃・１５０秒のサイクルを３５回繰り返した。増幅
産物の確認は、０．８％アガロースゲル電気泳動の後、
エチジウムブロマイド染色によって行なった。
【０１４２】参考例２ ＰＣＲ産物のプラスミドベクターへのサブクローニング
および挿入ｃＤＮＡ部分の塩基配列の解読による増幅ｃ
ＤＮＡ配列の確認 参考例１で行なったＰＣＲ反応液を０．８％の低融点ア
ガロースゲル電気泳動により分離し、バンドの部分をか
みそりで切り出した後、細片化、フェノール抽出、フェ
ノール・クロロホルム抽出、エタノール沈殿の操作を行
なってＤＮＡを回収した。ＰＣＲ−ＳｃｒｉｐｔTM Ａ
ｍｐ ＳＫ（＋）クローニングキット（ストラタジー
ン）の処方に従い、回収したＤＮＡをプラスミドベクタ
ーｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ Ａｍｐ ＳＫ（＋）へサブク
ローニングした。これをエシェリヒア・コリ（Escheric
hia coli）ＤＨ５αｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌ（東
洋紡）に導入して形質転換した後、ｃＤＮＡ挿入断片を
持つクローンをアンピシリン、ＩＰＴＧおよびＸ−ｇａ
ｌを含むＬＢ寒天培地で選択し、白色を呈するクローン
のみを滅菌したつま楊枝を用いて分離し、形質転換体
Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α／ＧＰＲ８を得た。個々のクロ
ーンをアンピシリンを含むＬＢ培地で一晩培養し、ＱＩ
Ａｗｅｌｌ ８ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｋｉｔ（キアゲン）を
用いてプラスミドＤＮＡを調製した。調製したＤＮＡの
一部に対して制限酵素Ｃｌａ ＩおよびＳｐｅ Ｉによる
切断を行ない、挿入されているレセプターｃＤＮＡ断片
の大きさを確認した。塩基配列の決定のための反応は D
yeDeoxyTerminator Cycle Sequence Kit（ＰＥバイオシ
ステムズＰＥバイオシステムズ）を用いて行ない、蛍光
式自動シーケンサーを用いて解読した（配列番号：１
２）。
【０１４３】参考例３ ＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞の作製 参考例２で配列が確認されたヒト脳由来のＧＰＲ８の全
長アミノ酸配列をコードし５’側にＣｌａＩ認識配列を
付加し、また３’側にＳｐｅＩ認識配列を付加した遺伝
子が導入されたプラスミドによって形質転換されたＥ．
ｃｏｌｉのクローンからＰｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉ Ｋ
ｉｔ（キアゲン）を用いてプラスミドＤＮＡを調製し、
これを制限酵素ＣｌａＩおよびＳｐｅＩで消化してイン
サートＤＮＡを切り出した。インサートＤＮＡは電気泳
動後、アガロースゲルからカミソリで切り出し、次に細
片化、フェノール抽出、フェノール・クロロホルム抽
出、エタノール沈殿の操作により回収された。このイン
サートＤＮＡをＣｌａ ＩおよびＳｐｅ Ｉで切断した動
物細胞発現用ベクタープラスミドｐＡＫＫＯ−１１１Ｈ
（Hinuma, S. et al. Biochim. Biophys. Acta, Vol. 1
219, pp. 251-259 (1994））記載のｐＡＫＫＯ１．１１
Ｈと同一のベクタープラスミド）に加え、Ｔ４ライゲー
ス（宝酒造）を用いてライゲーションを行ない、タンパ
ク質発現用プラスミドｐＡＫＫＯ−ＧＰＲ８を構築し
た。ｐＡＫＫＯ−ＧＰＲ８で形質転換したＥ．ｃｏｌｉ
ＤＨ５α（東洋紡）を培養後、Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉ
ｄｉ Ｋｉｔ（キアゲン）を用いてｐＡＫＫＯ−ＧＰＲ
８プラスミドＤＮＡを調製した。これをＣｅｌｌＰｈｅ
ｃｔ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（アマシャム
ファルマシアバイオテク）を用いて、添付のプロトコー
ルに従ってＣＨＯ ｄｈｆｒ-細胞に導入した。４．５μ
ｇの ＤＮＡをリン酸カルシウムとの共沈懸濁液とし、
２４時間前に５ｘ１０5または１ｘ１０6個のＣＨＯ ｄ
ｈｆｒ-細胞を播種した直径６ｃｍシャーレに添加し
た。１０％ウシ胎児血清を含むＭＥＭα培地で１日間培
養した後、継代し、選択培地である１０％透析ウシ胎児
血清を含む核酸不含ＭＥＭα培地で培養した。選択培地
中に増殖してくるＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞である形質転
換細胞のコロニー４７クローンを選択した。
【０１４４】参考例４ 全長ヒトＧＰＲ８タンパク質ｍＲＮＡの発現量の高いＣ
ＨＯ／ＧＰＲ８細胞株の選択 参考例３で樹立されたＣＨＯ／ＧＰＲ８細胞株４７クロ
ーンの全長ＧＰＲ８タンパク質ｍＲＮＡの発現量をＣｙ
ｔｏｓｔａｒ Ｔ Ｐｌａｔｅ（アマシャムファルマシア
バイオテク）を用い、添付のプロトコールに従って以下
のように測定した。ＣＨＯ／ＧＰＲ８細胞株の各クロー
ンをＣｙｔｏｓｔａｒ Ｔ Ｐｌａｔｅに１ｗｅｌｌ当た
り２．５ｘ１０4個ずつ播種して２４時間培養した後、
１０％ホルマリンによって細胞を固定した。各ｗｅｌｌ
に０．２５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を添加して細
胞の透過性をあげた後、35Ｓラベルした配列番号：１３
のリボプローブ（ｒｉｂｏｐｒｏｂｅ）を加えてハイブ
リダイズさせた。２０μｇ／ｍｌのＲＮａｓｅ Ａを各
ｗｅｌｌに加えて遊離のリボプローブを消化し、プレー
トをよく洗浄した後、ハイブリダイズしたリボプローブ
の放射活性をＴｏｐｃｏｕｎｔｅｒで測定した。放射活
性の高い細胞株は、ｍＲＮＡ発現量が高い。ｍＲＮＡ発
現量の高い３クローン（＃１７，＃４１および＃４６）
を以下に実験に用いたが、特にクローン番号１７を用い
た。
【０１４５】参考例５ ＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞を用いた細胞内ｃＡＭＰ産生量
の測定 参考例４で作製したＣＨＯ／ＧＰＲ８細胞およびｍｏｃ
ｋ ＣＨＯ細胞を２４穴プレートに５ｘ１０4ｃｅｌｌ
／ｗｅｌｌで播種し、４８時間培養した。細胞を０．２
ｍＭ ３−イソブチル−メチルキサンチンと０．０５％
ＢＳＡと２０ｍＭ ＨＥＰＳを含むハンクスバッファ
ー（ｐＨ７．４）で洗浄した（以下、０．２ｍＭ ３−
イソブチル−メチルキサンチンと０．０５％ ＢＳＡと
２０ｍＭＨＥＰＳを含むハンクスバッファー（ｐＨ７．
４）を、反応用バッファーと呼ぶ）。その後０．５ｍｌ
の反応用バッファーを加えて３０分間培養器で保温し
た。反応用バッファーを除き、新たに０．２５ｍｌの反
応用バッファーを細胞に加えた後、試料と２μＭフォル
スコリンを含む０．２５ｍｌの反応用バッファーを細胞
に加え、３７℃で２４分間反応させた。１００μｌの２
０％過塩素酸を加えて反応を停止させ、次に氷上で１時
間置くことにより細胞内ｃＡＭＰを抽出した。抽出液中
のｃＡＭＰ量は、ｃＡＭＰ ＥＩＡキット（アマシャム
ファルマシアバイオテク）を用いて測定した。
【０１４６】参考例６ ＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞の膜画分を用いたＧＴＰγＳ結
合活性の測定 ＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞膜画分に対する［35Ｓ］−Ｇｕ
ａｎｏｓｉｎｅ ５’−（γ−ｔｈｉｏ）ｔｒｉｐｈｏ
ｓｐｈａｔｅの結合促進活性を以下の方法により測定し
た。最初に膜画分の調整法を記載する。１ｘ１０8個の
ＣＨＯ／ＧＰＲ８細胞に１０ｍｌのホモジネートバッフ
ァー（１０ｍＭ ＮａＨＣＯ3，５ｍＭＥＤＴＡ，０．５
ｍＭ ＰＭＳＦ，１μｇ／ｍｌ ｐｅｐｓｔａｔｉｎ，４
μｇ／ｍｌ Ｅ−６４，２０μｇ／ｍｌ ｌｅｕｐｅｐｔ
ｉｎ）添加し、ポリトロン（１２，０００ｒｐｍ、１分
間）を用いて破砕した。細胞破砕液を遠心（１，０００
ｇ，１５分間）して上清を得た。次にこの上清を超遠心
分離（Ｂｅｃｋｍａｎｔｙｐｅ ３０ローター、３０，
０００ｒｐｍ，１時間）し、得られた沈殿物をＧＰＲ８
発現ＣＨＯ細胞膜画分とした。ＧＴＰγＳ結合活性の測
定は以下の通りである。ＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞膜画分
を膜希釈緩衝液（５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．
４），５ｍＭ ＭｇＣｌ2，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１μ
Ｍ ＧＤＰ）で希釈して、タンパク質濃度３０ｍｇ／ｍ
ｌのアッセイ用細胞膜画分溶液を調製した。アッセイ用
膜画分溶液２００μｌに、５１．５ｎＭ濃度の［35Ｓ］
−Ｇｕａｎｏｓｉｎｅ ５’−（γ−ｔｈｉｏ）ｔｒｉ
ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＮＥＮ）を２μｌと試料を添加
し、この混合液を２５℃で一時間保温した。混合液をフ
ィルター濾過し、さらにフィルターを洗浄用バッファー
（５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４），５ｍＭ
ＭｇＣｌ2，１ｍＭ ＥＤＴＡ，０．１％ ＢＳＡ）
１．５ｍｌで２回洗浄した後、フィルターの放射活性を
液体シンチレーションカウンターで測定した。
【０１４７】参考例７ ブタ視床下部抽出物に含まれ、ＣＨＯ／ＧＰＲ８細胞株
に対して特異的にｃＡＭＰ産生抑制およびＧＴＰγＳ結
合促進を示す活性の検出 ブタ視床下部抽出物の高速液体クロマトグラフィー（Ｈ
ＰＬＣ）フラクションを以下に述べる方法で調製した。
東京芝浦臓器（株）より購入した、処理当日に屠殺して
摘出後は氷冷保存したブタ視床下部５００ｇ（３０頭
分）を細かく切断し、直ぐに沸騰した蒸留水２．０リッ
トルに投じて１０分間煮沸した。煮沸後、直ちに氷冷
し、１２０ｍｌの酢酸を加えて終濃度１．０Ｍとし、ポ
リトロン（２０，０００ｒｐｍ、６分間）を用いて破砕
した。破砕液を遠心（８，０００ｒｐｍ、３０分）して
上清を取り、沈殿には１．０Ｍ酢酸２．０リットルを加
えて再度ポリトロンによって破砕し、一晩攪拌した後、
遠心（８，０００ｒｐｍ、３０分）して上清を得た。上
清に２倍量の冷アセトンを４℃でゆっくり滴下した後、
１回目の遠心によって得た上清については一晩攪拌し、
２回目の遠心によって得た上清については４時間攪拌し
た。アセトンを加えた抽出液は遠心（８，０００ｒｐ
ｍ、３０分）して沈殿を除き、得られた上清からエバポ
レーターによって減圧下にアセトンを溜去した。アセト
ンを除いた抽出液に等量のジエチルエーテルを加え、分
液ロートを使って脂質を含むエーテル層を分離して水層
を回収した。エーテル脱脂した抽出液はエバポレーター
によって減圧下に濃縮してエーテルを完全に除去した。
濃縮液をガラス繊維濾紙（アドバンテック、ＤＰ７０
（９０ｍｍφ））で濾過し、濾液をガラス製カラム（３
０φｘ２４０ｍｍ）に充填したＣ１８（ワイエムシー、
ＹＭＣｇｅｌ ＯＤＳ−ＡＭ １２０−Ｓ５０）カラムに
添加した。カラムを１．０Ｍ酢酸４００ｍｌで洗浄後、
０．１％トリフルオロ酢酸を含む６０％アセトニトリル
５００ｍｌで溶出した。溶出液を減圧下に濃縮して溶媒
を溜去した後、濃縮液を凍結乾燥した。凍結乾燥品約
０．５ｇを３０ｍｌの０．１％トリフルオロ酢酸を含む
１０％アセトニトリルに溶解し、１０ｍｌずつをＣ１８
カラム（トーソー、ＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ−８０ＴＳ
（２１．５φｘ３００ｍｍ））を用いた１０％から６０
％の０．１％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリルの
濃度勾配溶出法によるＨＰＬＣにかけた。ＨＰＬＣは３
回行なった。溶出液は６０分画に分取し、３回分の溶出
液をまとめた。各分画を減圧下に濃縮・乾固し、残渣を
０．５ｍｌのジメチルスルフオキシド（ＤＭＳＯ）で溶
解した。上記によって得られたＨＰＬＣフラクションの
ＤＭＳＯ溶液を参考例５に示した方法によってＣＨＯ／
ＧＰＲ８細胞に投与し、細胞内ｃＡＭＰ産生量の測定を
行なった結果、分画番号３０に顕著なｃＡＭＰ産生抑制
活性が認められた。また同様な試料についてＧＰＲ８発
現ＣＨＯ細胞用いてＧＴＰγＳ結合促進活性を調べたと
ころ、やはり分画番号３０付近に顕著な活性が確認され
た。これらの活性は他のレセプター発現細胞では認めら
れなかったことからブタ視床下部抽出物にＧＰＲ８特異
的なリガンド活性物質が存在することが示された。
【０１４８】参考例８ ブタ視床下部抽出物中のＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞に対し
て特異的に細胞内ｃＡＭＰ産生抑制活性を示す活性物質
のプロナーゼによる失活 参考例７でＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞に対して細胞内ｃＡ
ＭＰ産生抑制活性を示したＨＰＬＣ分画３０をタンパク
質分解酵素であるプロナーゼ（Ｓｉｇｍａ，ｐｒｏｔｅ
ａｓｅ Ｔｙｐｅ ＸＩＶ（Ｐ５１４７））で処理し、
活性物質がタンパク質性であるかを調べた。上記視床下
部抽出物ＨＰＬＣ分画（＃３０）２μｌを０．２Ｍ酢酸
アンモニウム２００μｌに加え、これにプロナーゼ３μ
ｇを添加して３７℃で２時間インキュベートした後、沸
騰水中で１０分間加熱してプロナーゼを失活させた。こ
れにＢＳＡ ０．０５ｍｇおよびＣＨＡＰＳ ０．０５
ｍｇを含む蒸留水２ｍｌを加えてから凍結乾燥した。プ
ロナーゼそのものあるいは加熱および凍結乾燥の影響を
調べるため、プロナーゼのみ、ＨＰＬＣ分画のみおよび
プロナーゼのみを加熱処理した後にＨＰＬＣ分画を加え
たものについても同様に処理して凍結乾燥した。凍結乾
燥した各試料を参考例５に示す方法によってＧＰＲ８発
現ＣＨＯ細胞に添加して細胞内ｃＡＭＰ産生抑制活性を
測定した。ブタ視床下部抽出物中のＧＰＲ８発現ＣＨＯ
細胞に対する細胞内ｃＡＭＰ産生抑制活性を示す活性物
質はプロナーゼによって完全に失活したことからこの物
質がタンパク質もしくはペプチドであることが示され
た。
【０１４９】参考例９ ブタ視床下部からのＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞膜画分に対
して特異的にＧＴＰγＳ結合促進活性を示す活性物質の
精製 ＧＰＲ８に特異的なリガンド活性を示す物質をＧＰＲ８
発現ＣＨＯ細胞膜画分に対するＧＴＰγＳ結合促進活性
を指標としてブタ視床下部から精製した代表例を以下に
具体的に述べる。参考例７に述べた方法と全く同一の方
法により、ブタ視床下部５００ｇ（３０頭分）を１．０
Ｍ酢酸で抽出し、アセトン沈殿およびエーテル脱脂をし
た後、Ｃ１８（ワイエムシー、ＹＭＣｇｅｌ ＯＤＳ−
ＡＭ １２０−Ｓ５０）カラムに吸着させ、０．１％ト
リフルオロ酢酸を含む６０％アセトニトリルで溶出し
た。溶出液を濃縮し、凍結乾燥した後、Ｃ１８カラム
（トーソー、ＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ−８０ＴＳ（２１．
５φｘ３００ｍｍ））を用いたＨＰＬＣによって活性分
画を得た。活性は分画番号３０に回収された。これを以
下の方法によってさらに精製した。この分画を１０％ア
セトニトリルを含む１０ｍＭギ酸アンモニウム１０ｍｌ
に溶解し、陽イオン交換カラム（トーソー、ＴＳＫｇｅ
ｌ ＳＰ−５ＰＷ（２０ｍｍφｘ１５０ｍｍ））に添加
した後、１０％アセトニトリルを含む１０ｍＭから２．
０Ｍのギ酸アンモニウムの濃度勾配によってカラムを溶
出した。活性はギ酸アンモニウム０．８Ｍ付近に回収さ
れた。活性分画を凍結乾燥し、０．１％トリフルオロ酢
酸を含む１０％アセトニトリル１．０ｍｌに溶解し、Ｃ
Ｎカラム（野村化学、Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ ＣＮ−ＵＧ
−５（４．６ｍｍφｘ２５０ｍｍ））に添加した後、
０．１％トリフルオロ酢酸を含む２１％から２６％のア
セトニトリルの濃度勾配によって溶出した。活性はアセ
トニトリル２２．１％付近に出現した。活性分画を凍結
乾燥し、０．１ｍｌのＤＭＳＯで溶解し、さらに０．４
ｍｌの０．１％トリフルオロ酢酸を含む１０％アセトニ
トリルを加えてＯＤＳカラム（和光純薬、Ｗａｋｏｓｉ
ｌ−ＩＩ ３Ｃ１８ＨＧ（２．０ｍｍφｘ１５０ｍ
ｍ））に添加した後、０．１％トリフルオ酢酸を含む２
２．５％から３２．５％のアセトニトリルの濃度勾配に
よって溶出した。活性はアセトニトリル２６．５％付近
に単一ピークとして出現した。
【０１５０】参考例１０ ブタ視床下部から精製されたＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞膜
画分に対して特異的にＧＴＰγＳ結合促進活性を示す活
性物質のアミノ末端アミノ酸配列の解析およびＧＰＲ８
リガンドのヒトおよびラットホモログペプチドの前駆体
タンパク質の一部をコードしていると推定されるＥＳＴ
配列 参考例９で精製されたＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞膜画分に
対して特異的にＧＴＰγＳ結合促進活性を示す活性物質
のアミノ末端アミノ酸配列解析を行なった。本活性物質
は参考例８に示すようにタンパク質またはペプチドであ
ることが推定されていたので、活性ピークを含む溶出液
を用いてパーキンエルマー社Procise 494 Protein Sequ
encerによってアミノ末端アミノ酸配列分析を行なっ
た。その結果、アミノ末端から１７残基までに配列番
号：１４に示す配列が得られた。この配列はリガンドペ
プチドの一部であると考えられた。この配列に基づいて
遺伝子データベースの検索を行なったところ、そのもの
もしくはその相補鎖がこのペプチドの前駆体タンパク質
の一部をコードしていると推定される幾つかのＥＳＴ配
列が見出された。それらのアクセッション番号、ｃＤＮ
Ａの由来、配列の長さおよび配列番号は次の通りであ
る。AW007531 (anaplastic oligodendroglioma、438 ba
se、配列番号：１５)、AI500303 (anaplasticoligodend
roglioma、 264 base、配列番号：１６)、AI990964 (co
lonic mucosafrom patient of Crohn's disease、424 b
ase、配列番号：１７)、AA744804 (germinal center B
cell、375 base、配列番号：１８)、H31598 (PC12 cell
s、260base、配列番号：１９)。初めの４つはヒト由来
であり、最後の１つはラット由来である。これらのＥＳ
ＴのＤＮＡ配列はブタ視床下部より単離した活性ペプチ
ドの配列に相当するアミノ酸配列をコードする領域では
極めてよく一致してしており、また翻訳されたアミノ酸
配列はブタ視床下部より単離され明らかとなったペプチ
ドの配列とは５残基目のＴｈｒがＶａｌであること以外
はほぼ一致した。以上からこれらのＥＳＴはＧＰＲ８の
リガンドペプチドのヒトおよびラットホモログの前駆体
タンパク質の一部をコードしているものと推定した。
【０１５１】参考例１１ ＧＰＲ８リガンドペプチド前駆体の一部をコードするヒ
トｃＤＮＡの増幅と増幅ｃＤＮＡ配列の解読 参考例１０に述べたＧＰＲ８リガンドペプチドの前駆体
タンパク質の一部をコードすると推定されたＥＳＴ配列
に基づいてプライマーを設計し、ヒト脳由来ｃＤＮＡよ
りＰＣＲによってＧＰＲ８リガンドペプチド前駆体の一
部をコードするｃＤＮＡを増幅した。ヒト脳由来ｐｏｌ
ｙ（Ａ）+ＲＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を鋳型として、
ランダムプライマーを用いて逆転写反応を行なった。逆
転写反応には、ＲＮａｓｅＨ活性を欠失させたＭＭＬＶ
由来の逆転写酵素であるＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ（東
洋紡）を使用した。続いて参考例１０に述べたＥＳＴ配
列に基づいて設計した配列番号：２０および配列番号：
２１の合成ＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ法による増
幅を行なった。反応液の組成は、ｃＤＮＡ鋳型２μｌ、
合成ＤＮＡプライマー各０．５μＭ、１．６ｍＭ ｄＮ
ＴＰｓ、ＬＡ Ｔａｑ（宝酒造）０．２μｌおよび酵素
に付属のバッファーで、総反応量は２０μｌとした。増
幅のためのサイクルはサーマルサイクラー（ＰＥバイオ
システムズ）を用い、９６℃・１２０秒の加熱の後、９
６℃・３０秒、７２℃・４５秒のサイクルを４回、９６
℃・３０秒、７０℃・４５秒のサイクルを４回、９６℃
・３０秒、６８℃・４５秒のサイクルを４回、９６℃・
３０秒、６４℃・３０秒、７２℃・４５秒のサイクルを
５回、９６℃・３０秒、６０℃・３０秒、７２℃・４５
秒のサイクルを２０回繰り返し、最後に７２℃で１０分
間保温した。増幅産物の確認は、３％アガロースゲル電
気泳動の後、エチジウムブロマイド染色によって行なっ
た。ＰＣＲ反応液を３％の低融点アガロースゲル電気泳
動により分離し、バンドの部分をかみそりで切り出した
後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ
Ｋｉｔ（キアゲン）を用いてＤＮＡを回収した。ＴＯＰ
Ｏ ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
の処方に従い、回収したＤＮＡをプラスミドベクターｐ
ＣＲ２．１−ＴＯＰＯへサブクローニングした。これを
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＴＯＰ１０（Ｉｎｖ
ｉｔｒｏｇｅｎ）に導入して形質転換した後、ｃＤＮＡ
挿入断片を持つクローンをアンピシリンおよびＸ−ｇａ
ｌを含むＬＢ寒天培地で選択し、白色を呈するクローン
のみを滅菌したつま楊枝を用いて分離し、形質転換体を
得た。個々のクローンをアンピシリンを含むＬＢ培地で
一晩培養し、ＱＩＡｗｅｌｌ ８ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｋｉ
ｔ（キアゲン）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。
塩基配列の決定のための反応は DyeDeoxyTerminator Cy
cle Sequence Kit（ＰＥバイオシステムズ）を用いて行
ない、蛍光式自動シーケンサーを用いて解読し、配列番
号：２２に示すＤＮＡ配列を得た。このこの配列から翻
訳されるＧＰＲ８リガンドぺプチド前駆体タンパク質の
一部（配列番号：２３）には予想どおりブタ視床下部よ
り単離されて配列が明らかになった活性ペプチドに相当
するペプチド配列が存在した。さらに、そのＣ末側には
通常の生理活性ペプチドが切り出されると考えられるＡ
ｒｇ−Ａｒｇの配列（Seidah, N. G. et al.、Ann. N.
Y. Acad. Sci.、839巻、9-24頁、1998年）が２ヶ所存在
した。このことから、ＧＰＲ８のリガンドペプチドのヒ
トホモログのアミノ酸配列は配列番号：８および配列番
号：９のいずれかもしくは両方であると推定された。
【０１５２】参考例１２ ｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）：Trp-Tyr-Lys-His-Val-Ala-
Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Le
u-Leu-Met-Gly-Leu（配列番号：８）およびFmoc化ｈＧ
ＰＲ８Ｌ（１−２３）：Fmoc-Trp-Tyr-Lys-His-Val-Ala
-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-L
eu-Leu-Met-Gly-Leu（配列番号：１０５）の製造 市販の2-chlorotrityl resin (Clt resin,1.33mmol/g)
にFmoc-Leuを導入したFmoc-Leu-O-Clt resin(0.76mmol/
g) 0.25mmolを出発原料とし、ペプチド合成機ABI 433A
を用い、Fmoc/ DCC/ HOBt法により、Fmoc-Gly, Fmoc-Me
t, Fmoc-Leu, Fmoc-Leu, Fmoc-Gly, Fmoc-Ala, Fmoc-Al
a, Fmoc-Arg(Pbf), Fmoc-Gly, Fmoc-Val,Fmoc-Thr(B
ut), Fmoc-His(Trt), Fmoc-Tyr(But), Fmoc-Arg(Pbf),
Fmoc-Pro, Fmoc-Ser(But), Fmoc-Ala, Fmoc-Val, Fmoc-
His(Trt), Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Tyr(But), Fmoc-Trp(B
oc) の順に縮合を行い、Fmoc-Trp(Boc)-Tyr(But)-Lys(B
oc)-His(Trt)-Val-Ala-Ser(But)-Pro-Arg(Pbf)-Tyr(B
ut)-His(Trt)-Thr(But)-Val-Gly-Arg(Pbf)-Ala-Ala-Gly
-Leu-Leu-Met-Gly-Leu-O-Clt resin 830 mgを得た。こ
の樹脂150mgにTFA / thioanisole / m-cresol / triiso
propylsilane / ethanedithiol (85 / 5 / 5 / 2.5 /
2.5) 5 mlを加え、室温にて2時間振盪した後樹脂をろ
去し、溶媒を濃縮後エーテルを加え、粗Fmoc-Trp-Tyr-L
ys-His-Val-Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg
-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Met-Gly-Leuを沈殿として得た。
これをYMC D-ODS-5-ST S-5 120Aカラム（20 x 150mm)を
用いた分取HPLCで、A液: 0.1%TFA-水、B液: 0.1%TFA含
有アセトニトリルによるA/B: 72/28〜52/48への直線型
濃度勾配溶出(60分)を行い、目的物を含む分画を集め凍
結乾燥し白色粉末9.7mgを得た。得られた Fmoc-Trp-Tyr
-Lys-His-Val-Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-A
rg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Met-Gly-Leu 5 mg に 20% di
ethylamine / DMF 1 mLを加え室温にて 2 時間撹拌し
た。溶媒を留去後 YMC D-ODS-5-ST S-5 120A カラム(20
x 150mm)を用いた分取HPLCで、A液: 0.1%TFA-水、B液:
0.1%TFA含有アセトニトリルによるA/B: 74/26〜64/36
への直線型濃度勾配溶出(60分)を行い、目的物を含む分
画を集め凍結乾燥し白色粉末1.2mgを得た。 質量分析による(M+H)+ 2583.6 (計算値2583.4) HPLC溶出時間 20.4 分 溶出条件 カラム Wakosil-II 5C18 HG (4.6 x 100mm) 溶離液 A液: 0.1%TFA-水、B液: 0.1%TFA含有アセトニ
トリルを用い、 A/B: 100/ 0 〜30 / 70へ 直線
型濃度勾配溶出(35分) 流速 1.0ml/分
【０１５３】参考例１３ ｈＧＰＲ８Ｌ（１−３０）：Trp-Tyr-Lys-His-Val-Ala-
Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Le
u-Leu-Met-Gly-Leu-Arg-Arg-Ser-Pro-Tyr-Leu-Trp（配
列番号：９）の製造 市販の2-chlorotrityl resin (Clt resin,1.33mmol/g)
にFmoc-Trp(Boc) を導入したFmoc-Trp(Boc)-O-Clt resi
n(0.64mmol/g) 0.25mmol を出発原料として参考例１２
と同様に配列順通りにアミノ酸を縮合、最後のTrpを導
入後樹脂から切り出す前にFmoc基を樹脂上で除去したの
ち、TFA / thioanisole / m-cresol / triisopropylsil
ane / ethanedithiol (85 / 5 / 5 / 2.5 / 2.5)で処
理し樹脂からの切り出しと側鎖保護基の除去を同時に行
った。 粗ペプチドを参考例１２と同様の方法で精製しT
rp-Tyr-Lys-His-Val-Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val
-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Met-Gly-Leu-Arg-Arg-S
er-Pro-Tyr-Leu-Trpを得た。 質量分析による(M+H)+ 3543.4 (計算値3544.2) HPLC溶出時間 21.5 分 溶出条件 カラム Wakosil-II 5C18 HG (4.6 x 100mm) 溶離液 A液: 0.1%TFA-水、B液: 0.1%TFA含有アセトニ
トリルを用い、 A/B: 100/ 0 〜 30 / 70へ 直線型濃
度勾配溶出(35分) 流速 1.0ml/分
【０１５４】参考例１４ ＧＰＲ８リガンドの摂食行動に対する作用 Ｗｉｓｔａｒ雄性ラット（９週令）の側脳室（ＡＰ：
８．１，Ｌ：１．８，Ｈ：７．１ｍｍ）にペントバルビ
タール麻酔下でガイドカニューレ（ＡＧ−８）を挿入し
た。その後、1週間以上回復させてから実験を行った。
回復期間中、毎日ハンドリングを行い、脳室内投与時の
ストレスを軽減させた。摂食実験は１５：００から開始
した。ラットに無麻酔、無拘束下でマイクロインジェク
ションカニューレを取り付け、ＰＢＳに溶解させた参考
例１２で得たペプチド（配列番号：８で表されるアミノ
酸配列からなるペプチド）またはＰＢＳのみを５μｌ／
ｍｉｎで２分間投与した。投与終了後から１分後にマイ
クロインジェクションカニューレを取り外し、あらかじ
め重量を計測しておいた餌（固形飼料 ＣＥ２：日本ク
レア）を自由に摂食させた。投与開始から時間を計測
し、３０、６０および１２０分後に餌を計量して摂食量
を求めた。結果を〔図６〕に示す。
【０１５５】参考例１５ ラクトパーオキシダーゼ法を用いた［125Ｉ−Ｔｙｒ2］
−ｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）および［125Ｉ−Ｔｙ
ｒ10］−ｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）の作製 ＤＭＳＯ ５μｌに溶かしたｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）
１ｎｍｏｌを０．１Ｍ塩化ニッケル５μｌと混合し、
０．１ Ｍ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７）に溶かした０．００１
％ 過酸化水素水 １０μｌ、０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ （ｐ
Ｈ７）に溶かしたラクトパーオキシダーゼ（シグマ社）
１０μｇ／ｍｌを１０μｌおよび［125Ｉ］ ＮａＩ３
７ＭＢｑ（ＮＥＮライフサイエンスプロダクツ社）１０
μｌを混合後、室温で６０分反応し、以下の条件でＨＰ
ＬＣ分取した。用いたカラムは、ＯＤＳ−８０ＴＭ
（４．６ｍｍｘ１５ｃｍ）（トーソー社）、溶出液Ａと
して１０％ アセトニトリル／０．１％ ＴＦＡ、溶出
液Ｂとして６０％ アセトニトリル／０．１％ ＴＦＡ
を用い、０−０（２ｍｉｎ）、０−３０（３ｍｉ
ｎ）、３０−３８（５ｍｉｎ）、３８−４３（５５ｍｉ
ｎ）％Ｂ／Ａ＋Ｂのグラディエント溶出法を行なった。
流速は１ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度は２５℃、検出は２
２０ｎｍの吸光度を用いて行った。ｈＧＰＲ８Ｌ（１−
２３）には、チロシン残基が２つ存在するので、ヨード
化によって、［125Ｉ−Ｔｙｒ2］−ｈＧＰＲ８Ｌ（１−
２３）および［125Ｉ−Ｔｙｒ10］−ｈＧＰＲ８Ｌ（１
−２３）が生成する。このＨＰＬＣ条件では、ｈＧＰＲ
８Ｌ（１−２３）が２４分、［125Ｉ−Ｔｙｒ2］−ｈＧ
ＰＲ８Ｌ（１−２３）が３０分、［125Ｉ−Ｔｙｒ10］
−ｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）が３２分付近に溶出した。
【０１５６】参考例１６ ヒトGPR8 ligand (1-29)：Trp-Tyr-Lys-His-Val-Ala-Se
r-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-
Leu-Met-Gly-Leu-Arg-Arg-Ser-Pro-Tyr-Leu（配列番
号：１２８）の製造 参考例１２の樹脂を用い参考例１３と同様に配列順にア
ミノ酸を縮合したのち樹脂からの切り出しと精製を行い
Trp-Tyr-Lys-His-Val-Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Va
l-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Met-Gly-Leu-Arg-Arg-
Ser-Pro-Tyr-Leuを得る。 参考例１７ ヒトGPR8 ligand (1-28)：Trp-Tyr-Lys-His-Val-Ala-Se
r-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-
Leu-Met-Gly-Leu-Arg-Arg-Ser-Pro-Tyr（配列番号：１
２９）の製造 市販 2-chlorotrityl resin (Clt resin,1.33mmol/g)
にFmoc-Tyr(But) を導入したのち参考例１３と同様に配
列順にアミノ酸の縮合と樹脂からの切り出し、精製を行
いTrp-Tyr-Lys-His-Val-Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-
Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Met-Gly-Leu-Arg-Ar
g-Ser-Pro-Tyrを得る。
【０１５７】参考例１８ ヒトGPR8 ligand (1-27)：Trp-Tyr-Lys-His-Val-Ala-Se
r-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-
Leu-Met-Gly-Leu-Arg-Arg-Ser-Pro（配列番号：１３
０）の製造 市販 2-chlorotrityl resin (Clt resin,1.33mmol/g)
にFmoc-Proを導入したのち参考例１３と同様に配列順に
アミノ酸の縮合と樹脂からの切り出し、精製を行いTrp-
Tyr-Lys-His-Val-Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gl
y-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Met-Gly-Leu-Arg-Arg-Ser-
Proを得る。 参考例１９ ヒトGPR8 ligand (1-26)：Trp-Tyr-Lys-His-Val-Ala-Se
r-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-
Leu-Met-Gly-Leu-Arg-Arg-Ser（配列番号：１３１）の
製造 市販 2-chlorotrityl resin (Clt resin,1.33mmol/g)
にFmoc-Ser(But)を導入したのち参考例１３と同様に配
列順にアミノ酸の縮合と樹脂からの切り出し、精製を行
いTrp-Tyr-Lys-His-Val-Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-
Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Met-Gly-Leu-Arg-Ar
g-Serを得る。
【０１５８】参考例２０ ヒトGPR8 ligand (1-25)：Trp-Tyr-Lys-His-Val-Ala-Se
r-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-
Leu-Met-Gly-Leu-Arg-Arg（配列番号：２４）の製造 市販 2-chlorotrityl resin (Clt resin,1.33mmol/g)
にFmoc-Arg(Pbf)を導入したのち参考例１３と同様に配
列順にアミノ酸の縮合と樹脂からの切り出し、精製を行
いTrp-Tyr-Lys-His-Val-Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-
Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Met-Gly-Leu-Arg-Ar
gを得る。 参考例２１ ヒトGPR8 ligand (1-24)：Trp-Tyr-Lys-His-Val-Ala-Se
r-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-
Leu-Met-Gly-Leu-Arg（配列番号：２５）の製造 市販 2-chlorotrityl resin (Clt resin,1.33mmol/g)
にFmoc-Arg(Pbf)を導入したのち参考例１３と同様に配
列順にアミノ酸の縮合と樹脂からの切り出し、精製を行
いTrp-Tyr-Lys-His-Val-Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-
Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Met-Gly-Leu-Argを
得る。
【０１５９】参考例２２ ヒトＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質をコードするｃ
ＤＮＡの５’上流端のクローニング 参考例１１に記載したGPR8のリガンドペプチドのヒトホ
モログ（以下、ヒトGPR8リガンドと記載することがあ
る）の前駆体タンパク質の一部をコードするヒトｃＤＮ
Ａ配列（配列番号：２２）を基に作製したプライマーで
ヒト視床下部ｃＤＮＡを鋳型とした5’ RACE PCRを行な
い、ヒトGPR8リガンド前駆体タンパク質をコードするｃ
ＤＮＡの5’上流塩基配列を明らかにした。5’RACE PCR
クローニングは、ヒト視床下部Marathon-Ready cDNA
(CLONTECH)を鋳型としてキットに添付のAP1プライマー
と配列番号：３３の合成プライマーでＰＣＲ反応を行な
い、次にこのＰＣＲ反応液を鋳型としてキットに添付の
AP2プライマーと配列番号：３４の合成プライマーでＰ
ＣＲ反応を行なうことにより達成された。ＰＣＲ の反
応液組成と反応条件は以下のとおりである。反応液はヒ
ト視床下部ｃＤＮＡ４μｌ、AP1プライマー０．５μ
Ｍ、配列番号：３３の合成ＤＮＡプライマー０．５μ
Ｍ、0.4 mM dNTPs、LATaqポリメラーゼ（宝酒造）０．
２μｌおよび酵素に付属のGC（Ｉ）バッファーで総反応
量を２０μｌとし、サーマルサイクラー（ＰＥバイオシ
ステムズ）を用い、９６℃・１２０秒の加熱の後、９６
℃・３０秒、６８℃・２４０秒のサイクルを３０回繰り
返し、さらに７２℃で１０分間保温した。次に、キット
に添付のTricine-EDTA Bufferで５０倍希釈したＰＣＲ
反応液２μｌ、AP2プライマー０．５μＭ、配列番号：
３４の合成ＤＮＡプライマー０．５μＭ、0.4 mM dNTP
s、LATaqポリメラーゼ（宝酒造）０．２μｌおよび酵素
に付属のGC（Ｉ）バッファーで総反応量を２０μｌと
し、サーマルサイクラー（ＰＥバイオシステムズ）を用
い、９６℃・１２０秒の加熱の後、９６℃・３０秒、７
２℃・１８０秒のサイクルを４回、次に９６℃・３０
秒、７０℃・１８０秒のサイクルを４回、次に９６℃・
３０秒、６８℃・１８０秒のサイクルを１７回、最後に
７２℃で１０分間保温した。増幅したＤＮＡを1.2%のア
ガロースゲル電気泳動により分離した後、約1,200塩基
長のＤＮＡをカミソリで切り出し、ＤＮＡをQIAquick G
el Extraction Kit（キアゲン）を用いて回収した。こ
のＤＮＡを、TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen)のプロ
トコールに従ってpCR2.1-TOPOベクターへクローニング
した。これをエシェリヒア コリ(Escherichia coli) TO
P10 competent cell（Invitrogen）に導入して形質転換
した後、ｃＤＮＡ挿入断片を持つクローンをアンピシリ
ンおよびX-galを含むLB寒天培地で選択し、白色を呈す
るクローンのみを滅菌したつま楊枝を用いて分離し、形
質転換体を得た。個々のクローンをアンピシリンを含む
LB培地で一晩培養し、QIAwell 8 PlasmidKit （キアゲ
ン）を用いてプラスミドＤＮＡを調整した。塩基配列の
決定のための反応はBigDye Terminator Cycle Sequenci
ng Ready Reaction Kit (ＰＥバイオシステムズ)を用い
て行ない、蛍光式自動シーケンサーを用いて解読し、配
列番号：３５に示すＤＮＡ配列を得た。
【０１６０】参考例２３ ヒト脳ｃＤＮＡの作製 ヒト脳ｃＤＮＡは、MarathonTM cDNA Amplification K
it (CLONTECH)を用いてヒト脳poly A(+) RNA (CLONTEC
H)から作製した。RACE PCRに供されるｃＤＮＡは1st s
trand cDNA合成を除き、キットに添付のプロトコールに
従って作製した。1st strand cDNAは、キットに添付の
逆転写酵素AMVの代わりに逆転写酵素MMLV (-RNAse H)
（RevTraAce,東洋紡）を用いて、１μｇのヒト脳poly A
(+) RNAから合成した。
【０１６１】参考例２４ ヒトＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質をコードするｃ
ＤＮＡの３’下流端のクローニング 参考例１１に記載のヒトＧＰＲ８リガンド前駆体タンパ
ク質の一部をコードするヒトｃＤＮＡ配列（配列番号：
２２）を基に作製したプライマーでヒト脳ｃＤＮＡを鋳
型とした3’ RACE PCRを行ない、ヒトＧＰＲ８リガンド
をコードするｃＤＮＡの3’下流塩基配列を明らかにし
た。3’RACE PCR クローニングは、ヒト脳 ｃＤＮＡを
鋳型としてキットに添付のAP1プライマーと配列番号：
３６の合成プライマーでＰＣＲ反応を行ない、次にこの
ＰＣＲ反応液を鋳型としてキットに添付のAP2プライマ
ーと配列番号：３７の合成プライマーでＰＣＲ反応を行
なうことにより達成された。ＰＣＲ の反応液組成と反
応条件は以下のとおりである。反応液はキットに添付の
Tricine-EDTA Bufferで５０倍希釈したヒト脳ｃＤＮＡ
１μｌ、AP1プライマー０．５μＭ、配列番号：３６の
合成ＤＮＡプライマー０．５μＭ、0.4 mM dNTPs、LATa
qポリメラーゼ（宝酒造）０．２μｌおよび酵素に付属
のGC（Ｉ）バッファーで総反応量を２０μｌとし、サー
マルサイクラー（ＰＥバイオシステムズ）を用い、９６
℃・１２０秒の加熱の後、９６℃・３０秒、６８℃・２
４０秒のサイクルを３０回繰り返し、さらに７２℃で１
０分間保温した。次に、キットに添付のTricine-EDTA B
ufferで５０倍希釈したＰＣＲ反応液１μｌ、AP2プライ
マー０．５μＭ、配列番号：３７の合成ＤＮＡプライマ
ー０．５μＭ、0.4 mM dNTPs、LATaqポリメラーゼ（宝
酒造）０．２μｌおよび酵素に付属のGC（Ｉ）バッファ
ーで総反応量を２０μｌとし、サーマルサイクラー（Ｐ
Ｅバイオシステムズ）を用い、９６℃・１２０秒の加熱
の後、９６℃・３０秒、７２℃・１８０秒のサイクルを
４回、次に９６℃・３０秒、７０℃・１８０秒のサイク
ルを４回、次に９６℃・３０秒、６８℃・１８０秒のサ
イクルを１７回、最後に７２℃で１０分間保温した。増
幅したＤＮＡを1.5%のアガロースゲル電気泳動により分
離した後、約600塩基長のＤＮＡをカミソリで切り出
し、ＤＮＡをQIAquick Gel Extraction Kit（キアゲ
ン）を用いて回収した。このＤＮＡを、TOPO TA Clonin
g Kit (Invitrogen)のプロトコールに従ってpCR2.1-TOP
Oベクターへクローニングした。これをエシェリヒア
コリ(Escherichia coli) TOP10 competent cell（Invit
rogen）に導入して形質転換した後、ｃＤＮＡ挿入断片
を持つクローンをアンピシリンおよびX-galを含むLB寒
天培地で選択し、白色を呈するクローンのみを滅菌した
つま楊枝を用いて分離し、形質転換体を得た。個々のク
ローンをアンピシリンを含むLB培地で一晩培養し、QIAw
ell 8 Plasmid Kit （キアゲン）を用いてプラスミドＤ
ＮＡを調整した。塩基配列の決定のための反応はBigDye
Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit
(ＰＥバイオシステムズ)を用いて行ない、蛍光式自動シ
ーケンサーを用いて解読し、配列番号：３８に示すＤＮ
Ａ配列を得た。
【０１６２】参考例２５ ヒトＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質をコードするｃ
ＤＮＡのクローニングヒト視床下部ｃＤＮＡを鋳型とし
て、ヒトＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質をコードす
るｃＤＮＡの5’上流塩基配列を基に作製したプライマ
ーとヒトＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質をコードす
るｃＤＮＡの3’下流塩基配列を基に作製したプライマ
ーでＰＣＲ増幅を行なうことにより、ヒトＧＰＲ８リガ
ンド前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡをクローニ
ングした。ＰＣＲの反応液組成と反応条件は以下のとお
りである。反応液は、ヒト視床下部Marathon-Ready cDN
A (CLONTECH) １μｌ、配列番号：３９の合成DNAプライ
マー０．５μＭ、配列番号：４０の合成ＤＮＡプライマ
ー０．５μＭ、0.4 mM dNTPs、2.5 mM MgCl2、5%DMSO、
LATaqポリメラーゼ(宝酒造)０．２μｌおよび酵素に付
属のバッファーで総反応量を２０μｌとし、サーマルサ
イクラー（ＰＥバイオシステムズ）を用い、９６℃・６
０秒の加熱の後、９６℃・３０秒、６４℃・３０秒、７
２℃・１２０秒のサイクルを３５回、最後に７２℃で１
０分間保温した。増幅したＤＮＡを1.5%のアガロースゲ
ル電気泳動により分離した後、約700塩基長のＤＮＡを
カミソリで切り出し、ＤＮＡをQIAquick Gel Extractio
n Kit（キアゲン）を用いて回収した。このＤＮＡを、T
OPO TA Cloning Kit (Invitrogen)のプロトコールに従
ってpCR2.1-TOPOベクターへクローニングした。これを
エシェリヒア・コリ(Escherichia coli) TOP10 compete
nt cell（Invitrogen）に導入して形質転換した後、ｃ
ＤＮＡ挿入断片を持つクローンをアンピシリンおよびX-
galを含むLB寒天培地で選択し、白色を呈するクローン
のみを滅菌したつま楊枝を用いて分離し、形質転換体を
得た。個々のクローンをアンピシリンを含むLB培地で一
晩培養し、QIAwell 8 Plasmid Kit（キアゲン）を用い
てプラスミドＤＮＡを調整した。塩基配列の決定のため
の反応はBigDye Terminator Cycle Sequencing Ready R
eaction Kit (ＰＥバイオシステムズ)を用いて行ない、
蛍光式自動シーケンサーを用いて解読し、配列番号：４
１に示すＤＮＡ配列を得た。この配列（配列番号：４
１）はヒトＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質をコード
するため、このＤＮＡを含むプラスミドで形質転換した
大腸菌をTOP10/pCR2.1-TOPOヒトGPR8リガンド前駆体（E
scherichia coli TOP10/pCR2.1-TOPO Human GPR8 Ligan
d Precursor）と命名した。配列番号：４１に示すＤＮ
Ａ配列には、参考例１１に記載したヒトＧＰＲ８リガン
ドペプチドのアミノ酸配列をコードするようなフレーム
が存在するが、その5’上流側にはタンパク質翻訳の開
始コドンであると予想されるATGが存在しない。しか
し、これまでに幾つかのタンパク質でATG以外のコドン
を開始コドンとすることが予想されている例が報告され
ている（ヒト塩基性線維芽細胞増殖因子（H. Prats et
al.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、86巻、1836-1840
頁、1989年、R. Z. FlorkiewiczおよびA. Sommer、Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA、86巻、3978-3981頁、1989
年）、マウスレチノイン酸レセプターβ4（S. Nagpal e
t al.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、89巻、2718頁、1
992年）、ヒトホスホリボシルピロリン酸合成酵素（M.
Taira et al.、J. Biol. Chem.、265巻、16491-16497
頁、1990年）、ショウジョウバエコリンアセチル転移酵
素（H. Sugihara et al.、J.Biol. Chem.、265巻、2171
4-21719頁、1990年））。これらの例ではＡＴＧに代わ
りＬｅｕをコードするＣＴＧが開始コドンとして仮定さ
れていることが多い。ヒトＧＰＲ８リガンド前駆体タン
パク質においても同様であると考え、後述のブタあるい
はラットのＧＰＲ８リガンドホモログの前駆体タンパク
質との比較からこれらの前駆体タンパク質における開始
コドンと予想されるＡＴＧにほぼ対応する位置に存在す
るＣＴＧコドンを開始コドンと仮定し、前駆体タンパク
質の配列を推定した。この仮想的ヒトＧＰＲ８リガンド
前駆体タンパク質のアミノ酸配列を配列番号：４２に示
した。 参考例２６ ブタ脊髄ｃＤＮＡの作製 ブタ脊髄ｃＤＮＡは、MarathonTM cDNA Amplification
Kit (CLONTECH)を用いてブタ脊髄poly A(+) RNAから作
製した。ブタ脊髄poly A(+) RNAは、ブタ脊髄から以下
のように調製した。ブタ脊髄を、ISOGEN（日本ジーン）
中にてポリトロンホモゲナイザーで完全に破砕し、この
破砕溶液からISOGEN溶液を用いたtotalRNA調製法に従っ
てブタ脊髄total RNAを得た。次に、ブタ脊髄total RNA
からmRNA Purification Kit（Amersham Pharmacia Biot
ech）に添付のoligo dT celluloseカラムを用いた クロ
マトグラフィーを２回行なうことにより、７μｇのブタ
脊髄poly A(+) RNAを得た。RACE PCRに供したｃＤＮＡ
は1st strand cDNA合成を除き、キットに添付のプロト
コールに従って作製した。1st strand cDNAは、キット
に添付の逆転写酵素AMVの代わりに逆転写酵素MMLV (-RN
Ase H)（RevTraAce,東洋紡）を用いて、１μｇのブタ脊
髄poly A(+) RNAから合成した。
【０１６３】参考例２７ ブタＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質をコードするｃ
ＤＮＡの５’上流端のクローニング １回目の5’RACE PCR クローニングと、そのＰＣＲ増幅
ＤＮＡの塩基配列を利用した２回目の5’RACE PCR ク
ローニングにより、ＧＰＲ８のリガンドペプチドのブタ
ホモログ（以下、ブタＧＰＲ８リガンドと記載すること
がある）の前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡの
5’上流塩基配列を明らかにした。１回目の5’RACE PCR
クローニングは、上記ブタ脊髄ｃＤＮＡを鋳型として
キットに添付のAP1プライマーと配列番号：４３の合成
プライマーでＰＣＲ反応を行ない、次にこのＰＣＲ反応
液を鋳型としてキットに添付のAP2プライマーと配列番
号：４４の合成プライマーでＰＣＲ反応を行なうことに
より達成された。ＰＣＲ の反応液組成と反応条件は以
下のとおりである。反応液はキットに添付のTricine-ED
TA Bufferで５０倍希釈したブタ脊髄ｃＤＮＡ ４μｌ、
AP1プライマー０．５μＭ、配列番号：４３の合成ＤＮ
Ａプライマー０．５μＭ、0.4 mM dNTPs、LATaqポリメ
ラーゼ（宝酒造）０．２μｌおよび酵素に付属のGC
（Ｉ）バッファーで総反応量を２０μｌとし、サーマル
サイクラー（ＰＥバイオシステムズ）を用い、９６℃・
１２０秒の加熱の後、９６℃・３０秒、６８℃・１８０
秒のサイクルを３０回繰り返し、さらに７２℃で１０分
間保温した。次に、キットに添付のTricine-EDTA Buffe
rで１００倍希釈したＰＣＲ反応液１μｌ、AP2プライマ
ー０．５μＭ、配列番号：４４の合成ＤＮＡプライマー
０．５μＭ、0.4 mM dNTPs、Advantage-GC 2ポリメラー
ゼ(CLONTECH) ０．２μｌおよび酵素に付属のバッファ
ーで総反応量を２０μｌとし、サーマルサイクラー（Ｐ
Ｅバイオシステムズ）を用い、９６℃・６０秒の加熱の
後、９６℃・３０秒、７２℃・１８０秒のサイクルを３
回、次に９６℃・３０秒、７０℃・１８０秒のサイクル
を３回、次に９６℃・３０秒、６８℃・１８０秒のサイ
クルを４回、次に９６℃・３０秒、６４℃・３０秒、７
２℃・１８０秒のサイクルを１５回繰り返し、最後に７
２℃で１０分間保温した。増幅したＤＮＡを1.2%のアガ
ロースゲル電気泳動により分離した後、約300塩基長の
ＤＮＡをカミソリで切り出し、ＤＮＡをQIAquick GelEx
traction Kit（キアゲン）を用いて回収した。このＤＮ
Ａを、TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen)のプロトコー
ルに従ってpCR2.1-TOPOベクターへクローニングした。
これをエシェリヒア コリ(Escherichia coli) TOP10
F’ competent cell（Invitrogen）に導入して形質転換
した後、ｃＤＮＡ挿入断片を持つクローンをアンピシリ
ン、IPTGおよびX-galを含むLB寒天培地で選択し、白色
を呈するクローンのみを滅菌したつま楊枝を用いて分離
し、形質転換体を得た。個々のクローンをアンピシリン
を含むLB培地で一晩培養し、QIAwell 8 Plasmid Kit
（キアゲン）を用いてプラスミドＤＮＡを調整した。塩
基配列の決定のための反応はBigDye Terminator Cycle
Sequencing Ready Reaction Kit (ＰＥバイオシステム
ズ)を用いて行ない、蛍光式自動シーケンサーを用いて
解読し、配列番号：４５に示すＤＮＡ配列を得た。２回
目の5’RACE PCR クローニングは、ブタ脊髄ｃＤＮＡを
鋳型としてキットに添付のAP1プライマーと配列番号：
４６の合成プライマーでＰＣＲ反応を行ない、次にこの
ＰＣＲ反応液を鋳型としてキットに添付のAP2プライマ
ーと配列番号：４７の合成プライマーでＰＣＲ反応を行
なうことにより達成された。ＰＣＲの反応液組成と反応
条件は以下のとおりである。反応液は、キットに添付の
Tricine-EDTA Bufferで５０倍希釈したブタ脊髄ｃＤＮ
Ａ １μｌ、AP1プライマー０．５μＭ、配列番号：４６
の合成ＤＮＡプライマー０．５μＭ、0.4 mM dNTPs、Ad
vantage-GC 2ポリメラーゼ(CLONTECH) ０．２μｌおよ
び酵素に付属のバッファーで総反応量を２０μｌとし、
サーマルサイクラー（ＰＥバイオシステムズ）を用い、
９６℃・６０秒の加熱の後、９６℃・３０秒、７２℃・
１８０秒のサイクルを５回、次に９６℃・３０秒、７０
℃・１８０秒のサイクルを５回、次に９６℃・３０秒、
６８℃・１８０秒のサイクルを２０回繰り返し、最後に
７２℃で１０分間保温した。次に、キットに添付のTric
ine-EDTA Bufferで１００倍希釈したＰＣＲ反応液１μ
ｌ、AP2プライマー０．５μＭ、配列番号：４７の合成
ＤＮＡプライマー０．５μＭ、0.4 mM dNTPs、Advantag
e-GC 2ポリメラーゼ(CLONTECH) ０．２μｌおよび酵素
に付属のバッファーで総反応量を２０μｌとし、サーマ
ルサイクラー（ＰＥバイオシステムズ）を用い、９６℃
・６０秒の加熱の後、９６℃・３０秒、６８℃・１８０
秒のサイクルを３１回繰り返し、最後に７２℃で１０分
間保温した。増幅したＤＮＡを2.0%のアガロースゲル電
気泳動により分離した後、約200塩基長のＤＮＡをカミ
ソリで切り出し、ＤＮＡをQIAquick Gel Extraction Ki
t（キアゲン）を用いて回収した。このＤＮＡを、TOPO
TA Cloning Kit (Invitrogen)のプロトコールに従ってp
CR2.1-TOPOベクターへクローニングした。これをエシェ
リヒア コリ(Escherichia coli) TOP10F’ competent c
ell（Invitrogen）に導入して形質転換した後、ｃＤＮ
Ａ挿入断片を持つクローンをアンピシリン、IPTGおよび
X-galを含むLB寒天培地で選択し、白色を呈するクロー
ンのみを滅菌したつま楊枝を用いて分離し、形質転換体
を得た。個々のクローンをアンピシリンを含むLB培地で
一晩培養し、QIAwell 8 Plasmid Kit （キアゲン）を用
いてプラスミドＤＮＡを調整した。塩基配列の決定のた
めの反応はBigDye Terminator Cycle Sequencing Ready
Reaction Kit(ＰＥバイオシステムズ)を用いて行な
い、蛍光式自動シーケンサーを用いて解読し、配列番
号：４８に示すＤＮＡ配列を得た。
【０１６４】参考例２８ ブタＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質をコードするｃ
ＤＮＡの３’下流端のクローニング ブタＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質をコードするｃ
ＤＮＡの5’上流端の塩基配列を基に作製したプライマ
ーを用いた3’RACE PCRクローニングにより、ブタＧＰ
Ｒ８リガンドペプチドの前駆体タンパク質をコードする
ｃＤＮＡの3’下流塩基配列を明らかにした。3’RACE P
CR クローニングは、ブタ脊髄ｃＤＮＡを鋳型としてキ
ットに添付のAP1プライマーと配列番号：４９の合成プ
ライマーでＰＣＲ反応を行ない、次にこのＰＣＲ反応液
を鋳型としてキットに添付のAP2プライマーと配列番
号：５０の合成プライマーでＰＣＲ反応を行なうことに
より達成された。ＰＣＲの反応液組成と反応条件は以下
のとおりである。反応液は、キットに添付のTricine-ED
TA Bufferで５０倍希釈したブタ脊髄ｃＤＮＡ １μｌ、
AP1プライマー０．５μＭ、配列番号：４９の合成ＤＮ
Ａプライマー０．５μＭ、0.4 mM dNTPs、Advantage-GC
2ポリメラーゼ(CLONTECH) ０．２μｌおよび酵素に付
属のバッファーで総反応量を２０μｌとし、サーマルサ
イクラー（ＰＥバイオシステムズ）を用い、９６℃・６
０秒の加熱の後、９６℃・３０秒、７２℃・１２０秒の
サイクルを５回、次に９６℃・３０秒、７０℃・１２０
秒のサイクルを５回、次に９６℃・３０秒、６８℃・１
２０秒のサイクルを２０回繰り返し、最後に７２℃で１
０分間保温した。次に、キットに添付のTricine-EDTA B
ufferで１００倍希釈したＰＣＲ反応液１μｌ、AP2プラ
イマー０．５μＭ、配列番号：５０の合成ＤＮＡプライ
マー０．５μＭ、0.4 mM dNTPs、Advantage-GC 2ポリメ
ラーゼ(CLONTECH) ０．２μｌおよび酵素に付属のバッ
ファーで総反応量を２０μｌとし、サーマルサイクラー
（ＰＥバイオシステムズ）を用い、９６℃・１２０秒の
加熱の後、９６℃・３０秒、６８℃・１２０秒のサイク
ルを３１回繰り返し、最後に７２℃で１０分間保温し
た。増幅したＤＮＡを2.0%のアガロースゲル電気泳動に
より分離した後、約650塩基長のＤＮＡをカミソリで切
り出し、ＤＮＡをQIAquick Gel Extraction Kit（キア
ゲン）を用いて回収した。このＤＮＡを、TOPO TA Clon
ing Kit (Invitrogen)のプロトコールに従ってpCR2.1-T
OPOベクターへクローニングした。これをエシェリヒア
コリ(Escherichia coli) TOP10F’ competent cell（In
vitrogen）に導入して形質転換した後、ｃＤＮＡ挿入断
片を持つクローンをアンピシリンおよびX-gal、IPTGを
含むLB寒天培地で選択し、白色を呈するクローンのみを
滅菌したつま楊枝を用いて分離し、形質転換体を得た。
個々のクローンをアンピシリンを含むLB培地で一晩培養
し、QIAwell8 Plasmid Kit （キアゲン）を用いてプラ
スミドＤＮＡを調整した。塩基配列の決定のための反応
はBigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reactio
n Kit(ＰＥバイオシステムズ)を用いて行ない、蛍光式
自動シーケンサーを用いて解読し、配列番号：５１に示
すＤＮＡ配列を得た。
【０１６５】参考例２９ ブタＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質をコードするｃ
ＤＮＡのクローニングブタ脊髄ｃＤＮＡを鋳型として、
ブタＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質をコードするｃ
ＤＮＡの5’上流塩基配列を基に作製したプライマーと
ブタＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質をコードするｃ
ＤＮＡの3’下流塩基配列を基に作製したプライマーで
ＰＣＲ増幅を行なうことにより、ブタＧＰＲ８リガンド
前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡをクローニング
した。ＰＣＲの反応液組成と反応条件は以下のとおりで
ある。反応液は、キットに添付のTricine-EDTA Buffer
で５０倍希釈したブタ脊髄ｃＤＮＡ １μｌ、配列番
号：５２の合成ＤＮＡプライマー０．５μＭ、配列番
号：５３の合成ＤＮＡプライマー０．５μＭ、0.4 mMdN
TPs、Advantage 2ポリメラーゼ(CLONTECH) ０．２μｌ
および酵素に付属のバッファーで総反応量を２０μｌと
し、サーマルサイクラー（ＰＥバイオシステムズ）を用
い、９６℃・６０秒の加熱の後、９６℃・３０秒、７２
℃・７５秒のサイクルを４回、次に９６℃・３０秒、７
０℃・７５秒のサイクルを４回、次に９６℃・３０秒、
６８℃・７５秒のサイクルを４回、次に９６℃・３０
秒、６４℃・３０秒、７２℃・４５秒のサイクルを５
回、次に９６℃・３０秒、６０℃・３０秒、７２℃・４
５秒のサイクルを２０回繰り返し、最後に７２℃で１０
分間保温した。増幅したＤＮＡを1.2%のアガロースゲル
電気泳動により分離した後、約600塩基長のＤＮＡをカ
ミソリで切り出し、ＤＮＡをQIAquick Gel Extraction
Kit（キアゲン）を用いて回収した。このＤＮＡを、TOP
O TA Cloning Kit (Invitrogen)のプロトコールに従っ
てpCR2.1-TOPOベクターへクローニングした。これをエ
シェリヒア コリ(Escherichia coli) TOP10 competent
cell（Invitrogen）に導入して形質転換した後、ｃＤＮ
Ａ挿入断片を持つクローンをアンピシリンおよびX-gal
を含むLB寒天培地で選択し、白色を呈するクローンのみ
を滅菌したつま楊枝を用いて分離し、形質転換体を得
た。個々のクローンをアンピシリンを含むLB培地で一晩
培養し、QIAwell 8 Plasmid Kit （キアゲン）を用いて
プラスミドＤＮＡを調整した。塩基配列の決定のための
反応はBigDye Terminator CycleSequencing Ready Reac
tion Kit(ＰＥバイオシステムズ)を用いて行ない、蛍光
式自動シーケンサーを用いて解読し、配列番号：５４に
示すＤＮＡ配列を得た。この配列（配列番号：５４）は
ブタGPR8リガンド前駆体タンパク質をコードするためこ
のＤＮＡを含むプラスミドで形質転換した大腸菌をTOP1
0/pCR2.1-TOPOブタGPR8リガンド前駆体（Escherichia c
oli TOP10/pCR2.1-TOPO Porcine GPR8 Ligand Precurso
r）と命名した。配列番号：５４のＤＮＡ配列がコード
するブタＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質のアミノ酸
配列を配列番号：５５に示した。この前駆体タンパク質
のアミノ酸配列には参考例１０に記載のＧＰＲ８発現細
胞膜画分に対するＧＴＰγＳ結合活性を指標にブタ視床
下部より単離されたＧＰＲ８リガンドペプチドのアミノ
酸配列分析によって明らかにされたアミノ末端から１７
残基までの配列が存在した。さらにその配列のカルボキ
シ末端側にはGPR8リガンドペプチドのヒトホモログ前駆
体タンパク質の場合と同様に、通常の生理活性ペプチド
が切り出されると考えられるArg-Argの配列（Seidah,
N. G. et al.、Ann. N. Y. Acad. Sci.、839巻、9-24
頁、1998年）が2ヶ所存在した。このことから、GPR8リ
ガンドペプチドのブタホモログのアミノ酸配列は配列番
号：５６および５７のいずれかもしくは両方であると推
定された。
【０１６６】参考例３０ ラットＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質の一部をコー
ドするｃＤＮＡ断片のクローニング 参考例１０に記載したように、ＧＰＲ８発現細胞膜画分
に対するGTPγS結合活性を指標にブタ視床下部から精製
したペプチドのアミノ末端から１７アミノ酸配列（配列
番号：１４）に基づいてデータベース検索を行なったと
ころ、配列番号：１９の塩基配列に合致するラットＥＳ
Ｔ塩基配列（アクセッション番号：H31598）が見出され
た。このＤＮＡ配列は１５アミノ酸の配列がブタ視床下
部から精製したペプチドのアミノ酸配列（配列番号：１
４）と同一となる翻訳枠を持っていた。このH31598は、
ラットPC12細胞から作製したｃＤＮＡライブラリー由来
のＥＳＴ配列であり、未確定な７塩基を含む２６０塩基
からなる。このH31598はＧＰＲ８リガンドのラットホモ
ログペプチド（以下、ラットＧＰＲ８リガンドと記載す
ることがある）の前駆体タンパク質の一部をコードして
いると推定されたのでその正確な塩基配列を決定するた
め、H31598の5’塩基配列と3’塩基配列を基に作製した
それぞれのプライマーでラット脳Marathon-Ready cDNA
(CLONTECH)を鋳型としたＰＣＲクローニングを行なっ
た。ＰＣＲの反応液組成と反応条件は以下のとおりであ
る。ラット脳Marathon cDNA (CLONTECH) ２μｌ、配列
番号：６０の合成ＤＮＡプライマー０．５μＭ、配列番
号：６１の合成ＤＮＡプライマー０．５μＭ、0.4 mM d
NTPs、Advantage-GC 2ポリメラーゼ(CLONTECH) ０．２
μｌおよび酵素に付属のバッファーで総反応量を20μl
とし、サーマルサイクラー（ＰＥバイオシステムズ）を
用い、９６℃・６０秒の加熱の後、次に９６℃・３０
秒、６０℃・３０秒、７２℃・６０秒のサイクルを３５
回繰り返し、最後に７２℃で１０分間保温した。増幅し
たＤＮＡを4.0%のアガロースゲル電気泳動により分離し
た後、約250塩基長のＤＮＡをカミソリで切り出し、Ｄ
ＮＡをQIAquickGel Extraction Kit（キアゲン）を用い
て回収した。このＤＮＡを、TOPO TA Cloning Kit (Inv
itrogen)のプロトコールに従ってpCR2.1-TOPOベクター
へクローニングした。これをエシェリヒア コリ(Escher
ichia coli) TOP10 competent cell（Invitrogen）に導
入して形質転換した後、ｃＤＮＡ挿入断片を持つクロー
ンをアンピシリンおよびX-galを含むLB寒天培地で選択
し、白色を呈するクローンのみを滅菌したつま楊枝を用
いて分離し、形質転換体を得た。個々のクローンをアン
ピシリンを含むLB培地で一晩培養し、QIAwell 8 Plasmi
d Kit （キアゲン）を用いてプラスミドＤＮＡを調整し
た。塩基配列の決定のための反応はBigDye Terminator
Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (ＰＥバイオシ
ステムズ)を用いて行ない、蛍光式自動シーケンサーを
用いて解読し、配列番号：６２に示すＤＮＡ配列を得
た。ＰＣＲクローニングしたＤＮＡの塩基配列（配列番
号：６２）とH31598の塩基配列との比較により、１塩基
欠失の読み誤りがH31598の塩基配列にあることが明らか
になった。
【０１６７】参考例３１ ラットＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質をコードする
ｃＤＮＡの５’上流端のクローニング 5’RACE PCR クローニングによりラットＧＰＲ８リガン
ド前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡの5’上流塩
基配列を明らかにした。5’RACE PCR クローニングは、
ラット脳Marathon-Ready cDNA (CLONTECH)を鋳型として
キットに添付のAP1プライマーと配列番号：６３の合成
プライマーでＰＣＲ反応を行ない、次にこのＰＣＲ反応
液を鋳型としてキットに添付のAP2プライマーと配列番
号：６４の合成プライマーでＰＣＲ反応を行なうことに
より達成された。ＰＣＲ の反応液組成と反応条件は以
下のとおりである。 反応液はラット脳Marathon cDNA
２μｌ、AP1プライマー０．５μＭ、配列番号：６３の
合成ＤＮＡプライマー０．５μＭ、0.4 mM dNTPs、LATa
qポリメラーゼ（宝酒造）０．２μｌおよび酵素に付属
のGC（Ｉ）バッファーで総反応量を２０μｌとし、サー
マルサイクラー（ＰＥバイオシステムズ）を用い、９６
℃・６０秒の加熱の後、９６℃・３０秒、６８℃・１２
０秒のサイクルを３０回繰り返し、さらに７２℃で１０
分間保温した。次に、キットに添付のTricine-EDTA Buf
ferで２００倍希釈したＰＣＲ反応液２μｌ、AP2プライ
マー０．５μＭ、配列番号：６４の合成ＤＮＡプライマ
ー０．５μＭ、0.4 mM dNTPs、Advantage-GC 2ポリメラ
ーゼ(CLONTECH) ０．２μｌおよび酵素に付属のバッフ
ァーで総反応量を２０μｌとし、サーマルサイクラー
（ＰＥバイオシステムズ）を用い、９６℃・６０秒の加
熱の後、９６℃・３０秒、６８℃・１２０秒のサイクル
を３１回、最後に７２℃で１０分間保温した。増幅した
ＤＮＡを1.2%のアガロースゲル電気泳動により分離した
後、約600塩基長のＤＮＡをカミソリで切り出し、ＤＮ
ＡをQIAquick Gel Extraction Kit（キアゲン）を用い
て回収した。このＤＮＡを、TOPO TA Cloning Kit (Inv
itrogen)のプロトコールに従ってpCR2.1-TOPOベクター
へクローニングした。これをエシェリヒア コリ(Escher
ichia coli) TOP10 competent cell（Invitrogen）に導
入して形質転換した後、ｃＤＮＡ挿入断片を持つクロー
ンをアンピシリンおよびX-galを含むLB寒天培地で選択
し、白色を呈するクローンのみを滅菌したつま楊枝を用
いて分離し、形質転換体を得た。個々のクローンをアン
ピシリンを含むLB培地で一晩培養し、QIAwell 8 Plasmi
d Kit （キアゲン）を用いてプラスミドＤＮＡを調整し
た。塩基配列の決定のための反応はBigDye Terminator
Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (ＰＥバイオシ
ステムズ)を用いて行ない、蛍光式自動シーケンサーを
用いて解読し、配列番号：６５に示すＤＮＡ配列を得
た。
【０１６８】参考例３２ ラットＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質をコードする
ｃＤＮＡの３’下流端のクローニング ラットＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質をコードする
ｃＤＮＡの5’上流端の塩基配列を基に作製したプライ
マーおよびラットＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質の
一部をコードするｃＤＮＡ断片配列を基に作製したプラ
イマーを用いた3’RACE PCRクローニングにより、ラッ
トＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質をコードするｃＤ
ＮＡの3’下流塩基配列を明らかにした。3’RACE PCR
クローニングは、ラット脳Marathon-Ready cDNA (CLONT
ECH)を鋳型としてキットに添付のAP1プライマーと配列
番号：６６の合成プライマーでＰＣＲ反応を行ない、次
にこのＰＣＲ反応液を鋳型としてキットに添付のAP2プ
ライマーと配列番号：６７の合成プライマーでＰＣＲ反
応を行なうことにより達成された。ＰＣＲの反応液組成
と反応条件は以下のとおりである。反応液は、ラット脳
Marathon-Ready cDNA ２μｌ、AP1プライマー０．５μ
Ｍ、配列番号：６６の合成ＤＮＡプライマー０．５μ
Ｍ、0.4 mM dNTPs、Advantage-GC 2ポリメラーゼ(CLONT
ECH) ０．４μｌおよび酵素に付属のバッファーで総反
応量を２０μｌとし、サーマルサイクラー（ＰＥバイオ
システムズ）を用い、９６℃・６０秒の加熱の後、９６
℃・３０秒、６８℃・１８０秒のサイクルを３０回繰り
返し、最後に７２℃で１０分間保温した。次に、キット
に添付のTricine-EDTA Bufferで２００倍希釈したＰＣ
Ｒ反応液2μｌ、AP2プライマー０．５μＭ、配列番号：
６７の合成ＤＮＡプライマー０．５μＭ、0.4 mM dNTP
s、Advantage-GC 2ポリメラーゼ(CLONTECH) ０．４μｌ
および酵素に付属のバッファーで総反応量を２０μｌと
し、サーマルサイクラー（ＰＥバイオシステムズ）を用
い、９６℃・６０秒の加熱の後、９６℃・３０秒、６８
℃・１８０秒のサイクルを３０回繰り返し、最後に７２
℃で１０分間保温した。増幅したＤＮＡを1.2%のアガロ
ースゲル電気泳動により分離した後、約600塩基長のＤ
ＮＡをカミソリで切り出し、ＤＮＡをQIAquick Gel Ext
ractionKit（キアゲン）を用いて回収した。このＤＮＡ
を、TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen)のプロトコール
に従ってpCR2.1-TOPOベクターへクローニングした。こ
れをエシェリヒア コリ(Escherichia coli) TOP10 com
petent cell（Invitrogen）に導入して形質転換した
後、ｃＤＮＡ挿入断片を持つクローンをアンピシリンお
よびX-galを含むLB寒天培地で選択し、白色を呈するク
ローンのみを滅菌したつま楊枝を用いて分離し、形質転
換体を得た。個々のクローンをアンピシリンを含むLB培
地で一晩培養し、QIAwell 8 Plasmid Kit （キアゲン）
を用いてプラスミドＤＮＡを調整した。塩基配列の決定
のための反応はBigDye Terminator Cycle Sequencing R
eady Reaction Kit (ＰＥバイオシステムズ)を用いて行
ない、蛍光式自動シーケンサーを用いて解読し、配列番
号：６８に示すＤＮＡ配列を得た。
【０１６９】参考例３３ ラットＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質をコードする
ｃＤＮＡのクローニング ラット脳ｃＤＮＡを鋳型として、ラットＧＰＲ８リガン
ド前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡの5’上流塩
基配列を基にしたプライマーとラットＧＰＲ８リガンド
前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡの3’下流塩基
配列を基にしたプライマーでＰＣＲ増幅を行なうことに
より、ラットＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質をコー
ドするｃＤＮＡをクローニングした。ＰＣＲの反応液組
成と反応条件は以下のとおりである。反応液は、ラット
脳Marathon-Ready cDNA １μｌ、配列番号：６９の合成
DNAプライマー０．５μＭ、配列番号：７０の合成ＤＮ
Ａプライマー０．５μＭ、0.4 mM dNTPs、Advantage 2
ポリメラーゼ(CLONTECH) ０．４μｌおよび酵素に付属
のバッファーで総反応量を２０μｌとし、サーマルサイ
クラー（ＰＥバイオシステムズ）を用い、９６℃・６０
秒の加熱の後、９６℃・３０秒、６０℃・３０秒、７２
℃・６０秒のサイクルを３５回繰り返し、最後に７２℃
で１０分間保温した。増幅したＤＮＡを1.2%のアガロー
スゲル電気泳動により分離した後、約750塩基長のＤＮ
Ａをカミソリで切り出し、ＤＮＡをQIAquick Gel Extra
ction Kit（キアゲン）を用いて回収した。このＤＮＡ
を、TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen)のプロトコール
に従ってpCR2.1-TOPOベクターへクローニングした。こ
れをエシェリヒア コリ(Escherichia coli) TOP10 com
petent cell（Invitrogen）に導入して形質転換した
後、ｃＤＮＡ挿入断片を持つクローンをアンピシリンお
よびX-galを含むLB寒天培地で選択し、白色を呈するク
ローンのみを滅菌したつま楊枝を用いて分離し、形質転
換体を得た。個々のクローンをアンピシリンを含むLB培
地で一晩培養し、QIAwell 8 Plasmid Kit（キアゲン）
を用いてプラスミドＤＮＡを調整した。塩基配列の決定
のための反応はBigDye Terminator Cycle Sequencing R
eady Reaction Kit(ＰＥバイオシステムズ)を用いて行
ない、蛍光式自動シーケンサーを用いて解読し、配列番
号：７１に示すＤＮＡ配列を得た。この配列（配列番
号：７１）は、ラットGPR8リガンド前駆体タンパク質を
コードするためこのＤＮＡを含むプラスミドで形質転換
した大腸菌をTOP10/pCR2.1-TOPOラットGPR8リガンド前
駆体（Escherichia coli TOP10/pCR2.1-TOPO Rat GPR8
Ligand Precursor）と命名した。配列番号：７１のＤＮ
Ａ配列がコードするラットＧＰＲ８リガンド前駆体タン
パク質のアミノ酸配列を配列番号：７２に示した。この
前駆体タンパク質のアミノ酸配列には参考例１０に記載
のＧＰＲ８発現細胞膜画分に対するＧＴＰγＳ結合活性
を指標にブタ視床下部より単離されたＧＰＲ８リガンド
ペプチドのアミノ酸配列分析によって明らかにされたア
ミノ末端から１７残基までの配列と５残基目および１７
残基目のアミノ酸のみが異なる類似した配列が存在し
た。さらにその配列のカルボキシ末端側にはＧＰＲ８リ
ガンドペプチドのヒトあるいはブタホモログ前駆体タン
パク質の場合と同様に、通常の生理活性ペプチドが切り
出されると考えられるArg-Argの配列（Seidah, N. G. e
t al.、Ann. N. Y. Acad. Sci.、839巻、9-24頁、1998
年）が2ヶ所存在した。これらのことから、ＧＰＲ８リ
ガンドペプチドのラットホモログのアミノ酸配列は配列
番号：７３および７４のいずれかもしくは両方であると
推定された。
【０１７０】参考例３４ マウスＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質の一部をコー
ドするｃＤＮＡ断片のクローニング 配列番号：５８の２３アミノ酸残基のブタGPR8リガンド
ペプチドをコードする塩基配列に基づいてデータベース
検索を行なった。マウスゲノムデータベースに対して検
索を行なった結果、配列番号：５８の塩基配列に類似し
た塩基配列を含む配列番号：７７のマウスゲノム断片配
列が見出された。この配列はＧＰＲ８リガンドペプチド
のマウスホモログ（以下、マウスＧＰＲ８リガンドと記
載することがある）の前駆体タンパク質の一部をコード
するゲノム断片配列であることが予想された。マウス精
巣ｃＤＮＡを鋳型として、このマウスゲノム断片配列を
基に作製したプライマーでＰＣＲ増幅を行ない、増幅Ｄ
ＮＡの塩基配列を決定した。ＰＣＲの反応液組成と反応
条件は以下のとおりである。マウス精巣ｃＤＮＡ (CLON
TECH)１μｌ、配列番号：７８の合成ＤＮＡプライマー
０．５μＭ、配列番号：７９の合成ＤＮＡプライマー
０．５μＭ、0.4 mM dNTPs、LATaqポリメラーゼ（宝酒
造）０．２μｌおよび酵素に付属のGC（Ｉ）バッファー
で総反応量を２０μｌとし、サーマルサイクラー（ＰＥ
バイオシステムズ）を用い、９６℃・１２０秒の加熱の
後、９６℃・３０秒、６８℃・１２０秒のサイクルを１
０回繰り返し、次に９６℃・３０秒、６４℃・３０秒、
７２℃・１２０秒のサイクルを２５回繰り返し、最後に
７２℃で１０分間保温した。増幅したＤＮＡを1.5%のア
ガロースゲル電気泳動により分離した後、約350塩基長
のＤＮＡをカミソリで切り出し、ＤＮＡをQIAquick Gel
Extraction Kit（キアゲン）を用いて回収した。この
ＤＮＡを、TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen)のプロト
コールに従ってpCR2.1-TOPOベクターへクローニングし
た。これをエシェリヒア・コリ(Escherichia coli) TOP
10 competent cell（Invitrogen）に導入して形質転換
した後、ｃＤＮＡ挿入断片を持つクローンをアンピシリ
ンおよびX-galを含むLB寒天培地で選択し、白色を呈す
るクローンのみを滅菌したつま楊枝を用いて分離し、形
質転換体を得た。個々のクローンをアンピシリンを含む
LB培地で一晩培養し、QIAwell 8 PlasmidKit （キアゲ
ン）を用いてプラスミドＤＮＡを調整した。塩基配列の
決定のための反応はBigDye Terminator Cycle Sequenci
ng Ready Reaction Kit (ＰＥバイオシステムズ)を用い
て行ない、蛍光式自動シーケンサーを用いて解読した
（配列番号：８０）。ここに得られたＰＣＲクローニン
グしたｃＤＮＡの塩基配列（配列番号：８０）は、配列
番号：７８および配列番号：７９のプライマーに用いた
２つの塩基配列に挟まれたマウスゲノム断片塩基配列に
完全に一致した。
【０１７１】参考例３５ マウスＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質の一部をコー
ドするｃＤＮＡ断片のクローニング 配列番号：５８の２３アミノ酸残基のブタＧＰＲ８リガ
ンドペプチドをコードする塩基配列に基づいてデータベ
ース検索を行なった。セレラ社マウスゲノムデータベー
スに対して検索を行なった結果、配列番号：５８の塩基
配列に類似した塩基配列を含む配列番号：７７のマウス
ゲノム断片配列が見出された。この配列はＧＰＲ８リガ
ンドペプチドのマウスホモログ（以下、マウスＧＰＲ８
リガンドと記載することがある）の前駆体タンパク質の
一部をコードするゲノム断片配列であることが予想され
た。マウス精巣ｃＤＮＡを鋳型として、このマウスゲノ
ム断片配列を基に作製したプライマーでＰＣＲ増幅を行
ない、増幅ＤＮＡの塩基配列を決定した。ＰＣＲの反応
液組成と反応条件は以下のとおりである。マウス精巣ｃ
ＤＮＡ (CLONTECH)１μｌ、配列番号：７８の合成ＤＮ
Ａプライマー０．５μＭ、配列番号：７９の合成ＤＮＡ
プライマー０．５μＭ、0.4 mM dNTPs、LATaqポリメラ
ーゼ（宝酒造）０．２μｌおよび酵素に付属のGC（Ｉ）
バッファーで総反応量を２０μｌとし、サーマルサイク
ラー（ＰＥバイオシステムズ）を用い、９６℃・１２０
秒の加熱の後、９６℃・３０秒、６８℃・１２０秒のサ
イクルを１０回繰り返し、次に９６℃・３０秒、６４℃
・３０秒、７２℃・１２０秒のサイクルを２５回繰り返
し、最後に７２℃で１０分間保温した。増幅したＤＮＡ
を1.5%のアガロースゲル電気泳動により分離した後、約
350塩基長のＤＮＡをカミソリで切り出し、ＤＮＡをQIA
quick Gel Extraction Kit（キアゲン）を用いて回収し
た。このＤＮＡを、TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen)
のプロトコールに従ってpCR2.1-TOPOベクターへクロー
ニングした。これをエシェリヒア・コリ(Escherichia c
oli) TOP10 competent cell（Invitrogen）に導入して
形質転換した後、ｃＤＮＡ挿入断片を持つクローンをア
ンピシリンおよびX-galを含むLB寒天培地で選択し、白
色を呈するクローンのみを滅菌したつま楊枝を用いて分
離し、形質転換体を得た。個々のクローンをアンピシリ
ンを含むLB培地で一晩培養し、QIAwell 8 PlasmidKit
（キアゲン）を用いてプラスミドＤＮＡを調整した。塩
基配列の決定のための反応はBigDye Terminator Cycle
Sequencing Ready Reaction Kit (ＰＥバイオシステム
ズ)を用いて行ない、蛍光式自動シーケンサーを用いて
解読した（配列番号：８０）。ここに得られたＰＣＲク
ローニングしたｃＤＮＡの塩基配列（配列番号：８０）
は、配列番号：７８および配列番号：７９のプライマー
に用いた２つの塩基配列に挟まれたマウスゲノム断片塩
基配列に完全に一致した。
【０１７２】参考例３６ マウス脳ｃＤＮＡの作製 マウス脳ｃＤＮＡは、SMARTTM RACE cDNA Amplificatio
n Kit (CLONTECH)を用いてマウス脳poly A(+) RNA (CLO
NTECH)から、キットに添付のプロトコールに従って作製
した。合成した1st strand cDNA溶液を、キットに添付
のTricine-EDTABufferで１０倍に希釈し、この溶液をRA
CE PCR反応に供した。
【０１７３】参考例３７ マウスＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質をコードする
ｃＤＮＡの５’上流端のクローニング 5’RACE PCR クローニングにより、マウスＧＰＲ８リガ
ンド前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡの5’上流
塩基配列を明らかにした。5’RACE PCR クローニング
は、マウス脳ｃＤＮＡを鋳型としてSMARTTM RACE cDNA
Amplification Kitに添付のUniversal Primer Mixと配
列番号：８１の合成プライマーでＰＣＲ反応を行ない、
次にこのＰＣＲ反応液を鋳型としてキットに添付のNest
ed Universal Primerと配列番号：８２の合成プライマ
ーでＰＣＲ反応を行なうことにより達成された。ＰＣＲ
の反応液組成と反応条件は以下のとおりである。 反応
液はマウス脳ｃＤＮＡ １μｌ、Universal Primer Mix
２μｌ、配列番号：８１の合成ＤＮＡプライマー０．２
μＭ、0.8 mM dNTPs、Advantage-GC 2ポリメラーゼ(CLO
NTECH) ０．４μｌおよび酵素に付属のバッファーで総
反応量を２０μｌとし、サーマルサイクラー（ＰＥバイ
オシステムズ）を用い、９６℃・１２０秒の加熱の後、
９６℃・３０秒、６８℃・１２０秒のサイクルを３０回
繰り返し、さらに７２℃で１０分間保温した。次に、キ
ットに添付のTricine-EDTA Bufferで５０倍希釈したＰ
ＣＲ反応液０．５μｌ、Nested Universal Primer ０．
５μＭ、配列番号：８２の合成ＤＮＡプライマー０．５
μＭ、0.8 mM dNTPs、Advantage-GC 2ポリメラーゼ(CLO
NTECH) ０．４μｌおよび酵素に付属のバッファーで総
反応量を２０μｌとし、サーマルサイクラー（ＰＥバイ
オシステムズ）を用い、９６℃・１２０秒の加熱の後、
９６℃・３０秒、６０℃・３０秒、７２℃・１２０秒の
サイクルを３０回繰り返し、さらに７２℃で１０分間保
温した。増幅したＤＮＡを1.5%のアガロースゲル電気泳
動により分離した後、約300塩基長のＤＮＡをカミソリ
で切り出し、ＤＮＡをQIAquick Gel Extraction Kit
（キアゲン）を用いて回収した。このＤＮＡを、TOPO T
A Cloning Kit (Invitrogen)のプロトコールに従ってpC
R2.1-TOPOベクターへクローニングした。これをエシェ
リヒアコリ(Escherichia coli) TOP10 competent cell
（Invitrogen）に導入して形質転換した後、ｃＤＮＡ挿
入断片を持つクローンをアンピシリンおよびX-galを含
むLB寒天培地で選択し、白色を呈するクローンのみを滅
菌したつま楊枝を用いて分離し、形質転換体を得た。個
々のクローンをアンピシリンを含むLB培地で一晩培養
し、QIAwell 8 Plasmid Kit （キアゲン）を用いてプラ
スミドＤＮＡを調整した。塩基配列の決定のための反応
はBigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reactio
n Kit (ＰＥバイオシステムズ)を用いて行ない、蛍光式
自動シーケンサーを用いて解読し、配列番号：８３に示
すＤＮＡ配列を得た。
【０１７４】参考例３８ マウスＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質をコードする
ｃＤＮＡの３’下流端のクローニング 3’RACE PCRクローニングにより、マウスＧＰＲ８リガ
ンド前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡの3’下流
塩基配列を明らかにした。3’RACE PCR クローニング
は、マウス脳ｃＤＮＡを鋳型としてSMARTTM RACE cDNA
Amplification Kitに添付のUniversal Primer Mixと配
列番号：８４の合成プライマーでＰＣＲ反応を行ない、
次にこのＰＣＲ反応液を鋳型としてキットに添付のNest
ed Universal Primerと配列番号：８５の合成プライマ
ーでＰＣＲ反応を行なうことにより達成された。ＰＣＲ
の反応液組成と反応条件は以下のとおりである。反応液
は、マウス脳ｃＤＮＡ １μｌ、Universal Primer Mix
２μｌ、配列番号：８４の合成ＤＮＡプライマー０．５
μＭ、0.8 mM dNTPs、Advantage-GC 2ポリメラーゼ(CLO
NTECH) ０．４μｌおよび酵素に付属のバッファーで総
反応量を２０μｌとし、サーマルサイクラー（ＰＥバイ
オシステムズ）を用い、96℃・120秒の加熱の後、９６
℃・３０秒、６８℃・１２０秒のサイクルを３０回繰り
返し、最後に７２℃で１０分間保温した。次に、キット
に添付のTricine-EDTA Bufferで５０倍希釈したＰＣＲ
反応液０．５μｌ、Nested Universal Primer ０．５μ
Ｍ、配列番号：８５の合成ＤＮＡプライマー０．５μ
Ｍ、0.8 mM dNTPs、Advantage-GC 2ポリメラーゼ(CLONT
ECH) ０．４μｌおよび酵素に付属のバッファーで総反
応量を２０μｌとし、サーマルサイクラー（ＰＥバイオ
システムズ）を用い、９６℃・１２０秒の加熱の後、９
６℃・３０秒、６４℃・３０秒、７２℃・１２０秒のサ
イクルを３０回繰り返し、最後に７２℃で１０分間保温
した。増幅したＤＮＡを1.5%のアガロースゲル電気泳動
により分離した後、約700塩基長のＤＮＡをカミソリで
切り出し、ＤＮＡをQIAquick Gel Extraction Kit（キ
アゲン）を用いて回収した。このＤＮＡを、TOPO TA Cl
oning Kit (Invitrogen)のプロトコールに従ってpCR2.1
-TOPOベクターへクローニングした。これをエシェリヒ
ア・コリ(Escherichia coli) TOP10 competent cell（I
nvitrogen）に導入して形質転換した後、ｃＤＮＡ挿入
断片を持つクローンをアンピシリンおよびX-galを含むL
B寒天培地で選択し、白色を呈するクローンのみを滅菌
したつま楊枝を用いて分離し、形質転換体を得た。個々
のクローンをアンピシリンを含むLB培地で一晩培養し、
QIAwell 8 Plasmid Kit （キアゲン）を用いてプラスミ
ドＤＮＡを調整した。塩基配列の決定のための反応はBi
gDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Ki
t (ＰＥバイオシステムズ)を用いて行ない、蛍光式自動
シーケンサーを用いて解読し、配列番号：８６に示すＤ
ＮＡ配列を得た。
【０１７５】参考例３９ マウスＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質をコードする
ｃＤＮＡのクローニング マウス脳ｃＤＮＡを鋳型として、マウスＧＰＲ８リガン
ド前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡの5’上流塩
基配列を基にしたプライマーとマウスＧＰＲ８リガンド
前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡの3’下流塩基
配列を基にしたプライマーでＰＣＲ増幅を行なうことに
より、マウスＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質をコー
ドするｃＤＮＡをクローニングした。ＰＣＲの反応液組
成と反応条件は以下のとおりである。反応液は、マウス
脳ｃＤＮＡ 0.5μｌ、配列番号：８７の合成ＤＮＡプラ
イマー０．５μＭ、配列番号：８８の合成ＤＮＡプライ
マー０．５μＭ、1.6 mM dNTPs、LATaqポリメラーゼ
（宝酒造）０．２μｌおよび酵素に付属のGC（Ｉ）バッ
ファーで総反応量を２０μｌとし、サーマルサイクラー
（ＰＥバイオシステムズ）を用い、９６℃・１２０秒の
加熱の後、９６℃・３０秒、６４℃・３０秒、７２℃・
１２０秒のサイクルを４０回繰り返し、最後に７２℃で
１０分間保温した。増幅したＤＮＡを1.5%のアガロース
ゲル電気泳動により分離した後、約700塩基長のＤＮＡ
をカミソリで切り出し、ＤＮＡをQIAquick Gel Extract
ion Kit（キアゲン）を用いて回収した。このＤＮＡ
を、TOPO TACloning Kit (Invitrogen)のプロトコール
に従ってpCR2.1-TOPOベクターへクローニングした。こ
れをエシェリヒア コリ(Escherichia coli) TOP10 com
petentcell（Invitrogen）に導入して形質転換した後、
ｃＤＮＡ挿入断片を持つクローンをアンピシリンおよび
X-galを含むLB寒天培地で選択し、白色を呈するクロー
ンのみを滅菌したつま楊枝を用いて分離し、形質転換体
を得た。個々のクローンをアンピシリンを含むLB培地で
一晩培養し、QIAwell 8 Plasmid Kit （キアゲン）を用
いてプラスミドＤＮＡを調整した。塩基配列の決定のた
めの反応はBigDye Terminator Cycle Sequencing Ready
Reaction Kit (ＰＥバイオシステムズ)を用いて行な
い、蛍光式自動シーケンサーを用いて解読し、配列番
号：８９に示すＤＮＡ配列を得た。この配列（配列番
号：８９）は、マウスＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク
質をコードするため、このＤＮＡを含むプラスミドで形
質転換した大腸菌をTOP10/pCR2.1-TOPOマウスGPR8リガ
ンド前駆体（Escherichia coli TOP10/pCR2.1-TOPO Mou
se GPR8 Ligand Precursor）と命名した。配列番号：８
９に示すＤＮＡ配列には、参考例１０に記載のＧＰＲ８
発現細胞膜画分に対するＧＴＰγＳ結合活性を指標にブ
タ視床下部より単離されたＧＰＲ８リガンドペプチドの
アミノ酸配列分析によって明らかにされたアミノ末端か
ら１７残基までの配列と５残基目および１７残基目のア
ミノ酸のみが異なる類似したアミノ酸配列をコードする
ようなフレームが存在する。しかし、ヒトＧＰＲ８リガ
ンド前駆体の場合と同様に、その5’上流側にはタンパ
ク質翻訳の開始コドンであると予想されるＡＴＧが存在
しない。しかし、ヒトＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク
質において推測されたように、ブタあるいはラットのＧ
ＰＲ８リガンドホモログの前駆体タンパク質との比較か
らこれらの前駆体タンパク質における開始コドンと予想
されるATGにほぼ対応する位置に存在するＣＴＧコドン
を開始コドンと仮定し、マウスＧＰＲ８リガンド前駆体
タンパク質の配列を推定した。この仮想的マウスＧＰＲ
８リガンド前駆体タンパク質のアミノ酸配列を配列番
号：９０に示した。マウスＧＰＲ８リガンドのアミノ酸
配列と予想される配列のカルボキシ末端側にはＧＰＲ８
リガンドペプチドのヒト、ブタあるいはラットホモログ
前駆体タンパク質の場合と同様に、通常の生理活性ペプ
チドが切り出されると考えられるArg-Argの配列（Seida
h, N. G. et al.、Ann. N. Y. Acad. Sci.、839巻、9-2
4頁、1998年）が２ヶ所存在した。これらのことから、
ＧＰＲ８リガンドペプチドのマウスホモログのアミノ酸
配列は配列番号：９１および９２のいずれかもしくは両
方であると推定された。なお、配列番号：９１の２３残
基型マウスＧＰＲ８リガンドのアミノ酸配列は、２３残
基型ラットＧＰＲ８リガンドのアミノ酸配列（配列番
号：７３）と一致している。
【０１７６】参考例４０ ヒトGPR8 ligand (1-23)酸化体：Trp-Tyr-Lys-His-Val-
Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gl
y-Leu-Leu-Met(O)-Gly-Leu（配列番号：９５）の製造 参考例１２の化合物0.45 mg を 50% 酢酸水 0.5 mlに溶
解後、0.3% 過酸化水素水 0.05 mlを加え、室温にて8時
間放置した。減圧濃縮後SepPakにより精製し、白色粉末
0.443 mgを得た。 質量分析による(M+H)+：2599.2 (計算値2599.4) HPLC溶出時間：19.1 分 溶出条件 カラム：Wakosil-II 5C18HG (4.6 x 100 mm) 溶離液：A液: 0.1%TFA-水、B液: 0.1%TFA含有アセトニ
トリルを用い、A/B: 100/0〜0/70へ直線型濃度勾配溶出
(35分) 流速：1.0 ml/分
【０１７７】参考例４１ ヒトGPR8 ligand (1-22)：Trp-Tyr-Lys-His-Val-Ala-Se
r-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-
Leu-Met-Gly（配列番号：９６）の製造 市販 2-chlorotrityl resin (Clt resin、1.33 mmol/g)
にFmoc-Gly を導入したのち参考例１３と同様に配列順
にアミノ酸の縮合と樹脂からの切り出し、精製を行ない
目的物を得た。 参考例４２ ヒトGPR8 ligand (1-21)：Trp-Tyr-Lys-His-Val-Ala-Se
r-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-
Leu-Met（配列番号：９７）の製造 市販の2-chlorotrityl resin (Clt resin,1.33mmol/g)
にFmoc-Met を導入したのち参考例１３と同様に配列順
にアミノ酸の縮合と樹脂からの切り出し、精製を行ない
目的物を得た。
【０１７８】参考例４３ ヒトGPR8 ligand (1-20)：Trp-Tyr-Lys-His-Val-Ala-Se
r-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-
Leu（配列番号：９８）の製造 市販の2-chlorotrityl resin (Clt resin、1.33mmol/g)
にFmoc-Leuを導入したのち参考例１３と同様に配列順に
アミノ酸の縮合と樹脂からの切り出し、精製を行ない目
的物を得た。 質量分析によるM+ :2282.8 (計算値2282.6) HPLC溶出時間：17.2 分 溶出条件 カラム：Wakosil-II 5C18HG (4.6 x 100 mm) 溶離液：A液: 0.1%TFA-水、B液: 0.1%TFA含有アセトニ
トリルを用い、A/B: 100/0〜0/70へ直線型濃度勾配溶出
(35分) 流速：1.0 ml/分
【０１７９】参考例４４ ヒトGPR8 ligand (1-19)：Trp-Tyr-Lys-His-Val-Ala-Se
r-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu
（配列番号：９９）の製造市販2-chlorotrityl resin
(Clt resin、1.33mmol/g)にFmoc-Leuを導入したのち参
考例１３と同様に配列順にアミノ酸の縮合と樹脂からの
切り出し、精製を行ない目的物を得た。 質量分析によるM+ :2169.6 （計算値2169.5） HPLC溶出時間：16.4 分 溶出条件 カラム：Wakosil-II 5C18HG (4.6 x 100 mm) 溶離液：A液: 0.1%TFA-水、B液: 0.1%TFA含有アセトニ
トリルを用い、A/B: 100/0〜0/70へ直線型濃度勾配溶出
(35分) 流速：1.0 ml/分
【０１８０】参考例４５ ヒトGPR8 ligand (1-18)：Trp-Tyr-Lys-His-Val-Ala-Se
r-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly（配
列番号：１００）の製造 市販の2-chlorotrityl resin (Clt resin、1.33mmol/g)
にFmoc-Glyを導入したのち参考例１３と同様に配列順に
アミノ酸の縮合と樹脂からの切り出し、精製を行ない目
的物を得た。 質量分析によるM+ :2056.8 （計算値2056.3） HPLC溶出時間：14.2 分 溶出条件 カラム：Wakosil-II 5C18HG (4.6 x 100 mm) 溶離液：A液: 0.1%TFA-水、B液: 0.1%TFA含有アセトニ
トリルを用い、A/B: 100/0〜0/70へ直線型濃度勾配溶出
(35分) 流速：1.0 ml/分
【０１８１】参考例４６ ヒトGPR8 ligand (1-17)：Trp-Tyr-Lys-His-Val-Ala-Se
r-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ala（配列番
号：１０１）の製造 市販の2-chlorotrityl resin (Clt resin、1.33mmol/g)
にFmoc-Alaを導入したのち参考例１３と同様に配列順に
アミノ酸の縮合と樹脂からの切り出し、精製を行ない目
的物を得た。 参考例４７ ヒトGPR8 ligand (1-16)：Trp-Tyr-Lys-His-Val-Ala-Se
r-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala（配列番号：
１０２）の製造 市販の2-chlorotrityl resin (Clt resin、1.33mmol/g)
にFmoc-Alaを導入したのち参考例１３と同様に配列順に
アミノ酸の縮合と樹脂からの切り出し、精製を行ない目
的物を得た。
【０１８２】参考例４８ ブタGPR8 ligand (1-23)：Trp-Tyr-Lys-His-Thr-Ala-Se
r-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-
Leu-Met-Gly-Leu（配列番号：５６）の製造 市販の2-chlorotrityl resin (Clt resin,1.33mmol/g)
にFmoc-Leuを導入したのち参考例１３と同様に配列順に
アミノ酸の縮合と樹脂からの切り出し、精製を行ない目
的物を得た。 質量分析による(M+H)+：2585.2 (計算値2585.4) HPLC溶出時間：20.2 分 溶出条件 カラム：Wakosil-II 5C18HG (4.6 x 100 mm) 溶離液：A液: 0.1%TFA-水、B液: 0.1%TFA含有アセトニ
トリルを用い、A/B: 100/0〜0/70へ直線型濃度勾配溶出
(35分) 流速：1.0 ml/分
【０１８３】参考例４９ ラット／マウスGPR8 ligand (1-23)：Trp-Tyr-Lys-His-
Val-Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Se
r-Gly-Leu-Leu-Met-Gly-Leuの製造（配列番号：７３お
よび配列番号：９１） 参考例４８と同様に配列順にアミノ酸の縮合と樹脂から
の切り出し、精製を行ない目的物を得ることができる。 参考例５０ ブタGPR8 ligand (1-23)酸化体：Trp-Tyr-Lys-His-Thr-
Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gl
y-Leu-Leu-Met(O)-Gly-Leu（配列番号：１０３）の製造 参考例４８の化合物を用い参考例４０と同様に酸化して
目的物を得た。 質量分析による(M+H)+：2601.3 (計算値2601.4) HPLC溶出時間：18.9 分 溶出条件 カラム：Wakosil-II 5C18HG (4.6 x 100 mm) 溶離液：A液: 0.1%TFA-水、B液: 0.1%TFA含有アセトニ
トリルを用い、A/B: 100/0〜0/70へ直線型濃度勾配溶出
(35分) 流速：1.0 ml/分
【０１８４】参考例５１ ラット／マウスGPR8 ligand (1-23)酸化体：Trp-Tyr-Ly
s-His-Val-Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-
Ala-Ser-Gly-Leu-Leu-Met(O)-Gly-Leu（配列番号：１０
４）の製造 参考例４９の化合物を用い参考例４０と同様に酸化して
目的物を得ることができる。 参考例５２ [Nα-Acetyl-Trp1]-ヒトGPR8 ligand (1-23)：Ac-Trp-T
yr-Lys-His-Val-Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly
-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Met-Gly-Leu（配列番号：１
０６）の製造 参考例１２で調製した樹脂のFmoc基を除去、無水酢酸で
アセチル化した後、TFA / thioanisole / m-cresol / t
riisopropylsilane / ethanedithiol (85 / 5/ 5 / 2.
5 / 2.5)で処理し樹脂からの切り出しと側鎖保護基の除
去を同時に行った。 粗ペプチドを参考例１２と同様の
方法で精製し目的物を得た。 質量分析による (M+H)+ 2626.12625.8 (計算値2627.1
2626.1) HPLC溶出時間 21.4 分 溶出条件 カラム Wakosil-II 5C18 HG (4.6 x 100mm) 溶離液 A液: 0.1%TFA-水、B液: 0.1%TFA含有アセトニ
トリルを用い、 A/B: 100/ 0 〜 30 / 70へ 直線型濃
度勾配溶出(35分) 流速 1.0ml/分
【０１８５】参考例５３ ヒトGPR8 ligand (2-23)： Tyr-Lys-His-Val-Ala-Ser-P
ro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu
-Met-Gly-Leu（配列番号：１０７）の製造 参考例１２と同様に所望のアミノ酸配列を樹脂に導入し
た。最後のTyrを導入後樹脂から切り出す前にFmoc基を
樹脂上で除去したのち、 TFA / thioanisole /m-cresol
/ triisopropylsilane / ethanedithiol (85 / 5 / 5
/ 2.5 / 2.5)で処理し樹脂からの切り出しと側鎖保護
基の除去を同時に行った。粗ペプチドを参考例１２と同
様の方法で精製し目的物を得た。 質量分析による(M+H)+ 2397.1 (計算値2397.3) HPLC溶出時間 19.9 分 溶出条件 カラム Wakosil-II 5C18 HG (4.6 x 100mm) 溶離液 A液: 0.1%TFA-水、B液: 0.1%TFA含有アセトニ
トリルを用い、 A/B: 100/ 0 〜 30 / 70へ 直線型濃
度勾配溶出(35分) 流速 1.0ml/分
【０１８６】参考例５４ ヒトGPR8 ligand (4-23)： His-Val-Ala-Ser-Pro-Arg-T
yr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Met-Gly
-Leu（配列番号：１０８）の製造 参考例１２と同様に所望のアミノ酸配列を樹脂に導入し
た。最後のHisを導入後樹脂から切り出す前にFmoc基を
樹脂上で除去したのち、 TFA / thioanisole /m-cresol
/ triisopropylsilane / ethanedithiol (85 / 5 / 5
/ 2.5 / 2.5)で処理し樹脂からの切り出しと側鎖保護
基の除去を同時に行った。粗ペプチドを参考例１２と同
様の方法で精製し目的物を得た。 質量分析による(M+H)+ 2106.0 (計算値2106.1) HPLC溶出時間 20.0 分 溶出条件 カラム Wakosil-II 5C18 HG (4.6 x 100mm) 溶離液 A液: 0.1%TFA-水、B液: 0.1%TFA含有アセトニ
トリルを用い、 A/B: 100/ 0 〜 30 / 70へ 直線型濃
度勾配溶出(35分) 流速 1.0ml/分
【０１８７】参考例５５ ヒトGPR8 ligand (9-23)： Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-A
rg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Met-Gly-Leu（配列番号：１０
９）の製造 参考例１２と同様に所望のアミノ酸配列を樹脂に導入し
た。最後のArgを導入後樹脂から切り出す前にFmoc基を
樹脂上で除去したのち、 TFA / thioanisole /m-cresol
/ triisopropylsilane / ethanedithiol (85 / 5 / 5
/ 2.5 / 2.5)で処理し樹脂からの切り出しと側鎖保護
基の除去を同時に行った。粗ペプチドを参考例１２と同
様の方法で精製し目的物を得た。 質量分析による(M+H)+ 1615.0 (計算値1614.9) HPLC溶出時間 20.2 分 溶出条件 カラム Wakosil-II 5C18 HG (4.6 x 100mm) 溶離液 A液: 0.1%TFA-水、B液: 0.1%TFA含有アセトニ
トリルを用い、 A/B: 100/ 0 〜 30 / 70へ 直線型濃
度勾配溶出(35分) 流速 1.0ml/分
【０１８８】参考例５６ ヒトGPR8 ligand (15-23)： Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-
Met-Gly-Leu（配列番号：１１０）の製造 参考例１２と同様に所望のアミノ酸配列を樹脂に導入し
た。最後のArgを導入後樹脂から切り出す前にFmoc基を
樹脂上で除去したのち、 TFA / thioanisole /m-cresol
/ triisopropylsilane / ethanedithiol (85 / 5 / 5
/ 2.5 / 2.5)で処理し樹脂からの切り出しと側鎖保護
基の除去を同時に行った。粗ペプチドを参考例１２と同
様の方法で精製し目的物を得た。 質量分析による(M+H)+ 901.4 (計算値901.5) HPLC溶出時間 20.2 分 溶出条件 カラム Wakosil-II 5C18 HG (4.6 x 100mm) 溶離液 A液: 0.1%TFA-水、B液: 0.1%TFA含有アセトニ
トリルを用い、 A/B: 100/ 0 〜 30 / 70へ 直線型濃
度勾配溶出(35分) 流速 1.0ml/分
【０１８９】参考例５７ [N-Acetyl-Tyr2]-ヒトGPR8 ligand (2-23)：Ac-Tyr-Lys
-His-Val-Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-A
la-Ala-Gly-Leu-Leu-Met-Gly-Leu（配列番号：１１１）
の製造 参考例５３で調製した樹脂を無水酢酸でアセチル化した
後、参考例５３と同様に処理、精製し目的物を得た。 質量分析による(M+H)+ 2439.3 (計算値2439.3) HPLC溶出時間 20.2 分 溶出条件 カラム Wakosil-II 5C18 HG (4.6 x 100mm) 溶離液 A液: 0.1%TFA-水、B液: 0.1%TFA含有アセトニ
トリルを用い、 A/B: 100/ 0 〜 30 / 70へ 直線型濃
度勾配溶出(35分) 流速 1.0ml/分
【０１９０】参考例５８ [D-Trp1]-ヒトGPR8 ligand (1-23)：D-Trp-Tyr-Lys-His
-Val-Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-A
la-Gly-Leu-Leu-Met-Gly-Leu（配列番号：１１２）の製
造 参考例１２のFmoc-Trp(Boc)の代りにFmoc-D-Trp(Boc)を
用い同様に目的物を得た。 質量分析による(M+H)+ 2583.4 (計算値2583.4) HPLC溶出時間 20.6 分 溶出条件 カラム Wakosil-II 5C18 HG (4.6 x 100mm) 溶離液 A液: 0.1%TFA-水、B液: 0.1%TFA含有アセトニ
トリルを用い、 A/B: 100/ 0 〜 30 / 70へ 直線型濃
度勾配溶出(35分) 流速 1.0ml/分
【０１９１】参考例５９ [N-3-Indolepropanoyl-Tyr2]-ヒトGPR8 ligand (2-2
3)：3-Indolepropanoyl-Tyr-Lys-His-Val-Ala-Ser-Pro-
Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Me
t-Gly-Leu（配列番号：１１３）の製造 参考例１２のFmoc-Trp(Boc)の代りに3-Indolepropionic
acidを用い所望の樹脂を得、これをTFA / thioanisole
/ m-cresol / triisopropylsilane / ethanedithiol
(85 / 5 / 5 / 2.5 / 2.5)で処理し樹脂からの切り出し
と側鎖保護基の除去を同時に行った。粗ペプチドを参考
例１２と同様の方法で精製し目的物を得た。 質量分析による(M+H)+ 2568.4 (計算値2568.4) HPLC溶出時間 21.7 分 溶出条件 カラム Wakosil-II 5C18 HG (4.6 x 100mm) 溶離液 A液: 0.1%TFA-水、B液: 0.1%TFA含有アセトニ
トリルを用い、 A/B: 100/ 0 〜 30 / 70へ 直線型濃
度勾配溶出(35分) 流速 1.0ml/分
【０１９２】参考例６０ １）ヒト染色体ＤＮＡを用いたＰＣＲ法によるヒトＧＰ
Ｒ７ＤＮＡの増幅 ヒト染色体ＤＮＡを鋳型として、２種の合成プライマー
（配列番号：１９０および配列番号：１９１）を用いた
ＰＣＲ法によるＤＮＡ増幅を行なった。合成プライマー
はレセプタータンパク質に翻訳される領域の遺伝子が増
幅されるように構築したが、その際に遺伝子の5’側に
制限酵素Cla Iの認識する塩基配列が付加され、3’側に
制限酵素Spe Iの認識する塩基配列が付加されるよう
に、5’側および3’側にそれぞれの制限酵素の認識配列
を付加した。反応液の組成は、ヒト染色体ＤＮＡ（宝酒
造）０．５μｇ、合成ＤＮＡプライマー各１μＭ、0.8
mM dNTPs、1 mM MgCl2、KODポリメラーゼ（東洋紡）1μ
ｌおよび酵素に付属のバッファーで、総反応量は５０μ
ｌとした。増幅のためのサイクルはサーマルサイクラー
（宝酒造）を用い、９４℃・６０秒の加熱の後、９８℃
・１５秒、６５℃・２秒、７４℃・３０秒のサイクルを
３５回繰り返した。増幅産物の確認は、0.8%アガロース
ゲル電気泳動の後、エチジウムブロマイド染色によって
行なった。
【０１９３】２）ＰＣＲ産物のプラスミドベクターへの
サブクローニングおよび挿入ＤＮＡ部分の塩基配列の解
読による増幅ＤＮＡ配列の確認 上記１）で行なったＰＣＲ反応液を０．８％の低融点ア
ガロースゲル電気泳動により分離し、バンドの部分をか
みそりで切り出した後、細片化、フェノール抽出、フェ
ノール・クロロホルム抽出、エタノール沈殿の操作を行
なってＤＮＡを回収した。pCR-ScriptTM Amp SK(+)クロ
ーニングキット（ストラタジーン）の処方に従い、回収
したＤＮＡをプラスミドベクターpCR-Script Amp SK(+)
へサブクローニングした。これをエシェリヒア・コリ(E
scherichia coli) DH5αcompetent cell（東洋紡）に導
入して形質転換した後、ＤＮＡ挿入断片を持つクローン
をアンピシリン、IPTGおよびX-galを含むLB寒天培地で
選択し、白色を呈するクローンのみを滅菌したつま楊枝
を用いて分離し、形質転換体E. coli DH5α/GPR7を得
た。個々のクローンをアンピシリンを含むLB培地で一晩
培養し、QIAwell 8 Plasmid Kit （キアゲン）を用いて
プラスミドＤＮＡを調整した。調整したＤＮＡの一部に
対して制限酵素Cla IおよびSpe Iによる切断を行ない、
挿入されているレセプターＤＮＡ断片の大きさを確認し
た。塩基配列の決定のための反応はDyeDeoxyTerminator
Cycle Sequence Kit (Applied Biosystems社)を用いて
行ない、蛍光式自動シーケンサーを用いて解読した（配
列番号：１８３）。配列番号：１８３で表わされる塩基
配列を有するＤＮＡを保持するpCR-Script Amp SK(+)プ
ラスミドを、pCR-ScriptヒトGPR7と命名した。配列番
号：１８３で表わされる塩基配列を有するＤＮＡがコー
ドするヒトＧＰＲ７のアミノ酸配列を配列番号：１８２
に示した。ここで配列を決定したヒトＧＰＲ７のＤＮＡ
配列はO’Dowdらの報告（O’Dowd, B. F. et al.、Genom
ics、28巻、84-91頁、1995年）にあるＤＮＡ配列とは２塩
基が異なっていた。これらは配列番号：１８３の８９３
番目および８９４番目に当たり、O’Dowdらの報告では
それぞれＣおよびＧであるが、本参考例ではＧおよびＣ
であった。これにより、翻訳されるアミノ酸配列におい
て配列番号：１８２の２９６番目のアミノ酸が、O’Dow
ｄらの報告のＴｈｒが本実施例ではＳｅｒとなる。
【０１９４】参考例６１ ヒト全脳ｃＤＮＡからのＰＣＲ法によるＧＰＲ７リガン
ド前駆体遺伝子の取得と発現プラスミドの構築 クローンテック社より購入したヒト全脳ｃＤＮＡを鋳型
として、以下の２種類の合成ＤＮＡを用いて、ＰＣＲに
よる増幅を行った。 GSF1: 5’-GTCGACATGGCCCGGTCCGCGACACTGGCGGCC-3’（配列番号：１８４） GSR2: 5’-GCTAGCAGCGGTGCCAGGAGAGGTCCGGGCTCA-3’（配列番号：１８５） ＰＣＲの反応液はｃＤＮＡ溶液１μｌ、０．５μｌ GSF
1（１０μＭ）、０．５μｌ GSR2（１０μＭ）、２．５
μｌ 添付の10 x 反応液、２．５μｌ dNTP（１０ｍ
Ｍ）、０．５μｌ KlenTaq（クローンテック）、１７．
５μｌ大塚蒸留水を加えて合計２５μｌにした。反応液
を、ThermalCycler9600を用いてＰＣＲ反応にかけた。
ＰＣＲの条件は９５℃・２分の変性の後、９８℃・１０
秒、６０℃・２０秒、７２℃・２０秒のサイクルを３５
回繰り返した。ＰＣＲ産物の一部を用いて電気泳動で約
４００ｂｐのＰＣＲ産物の増幅を確認した後、ＰＣＲ産
物をQIAGENPCR purification Kitを用いて精製し、直接
配列決定を行ったところ図８で示す配列がえられた。図
８のＤＮＡ配列から予測されるアミノ酸配列は図９に示
すものであった。次に、ゲルから回収したＰＣＲ産物を
TAクローニングキット（Invitrogen社）を用いて大腸菌
JM109にサブクローニングし、大腸菌JM109/pTAhGPR7-1
を取得した。サブクローニングで得られた大腸菌からプ
ラスミドpTAhGPR7-1をプラスミド抽出機（クラボウ社）
を用いて抽出し、挿入断片の塩基配列を決定し、その配
列が図８と同じヒト型ＧＰＲ７リガンドｃＤＮＡである
ことを確認した。次にそのプラスミドから制限酵素Sal1
ＩおよびNheＩによって消化後約0.4kbのヒト型ＧＰＲ７
リガンドｃＤＮＡ断片を得た。さらに、動物細胞用の発
現ベクターであるpAKKO-111Hはマルチクローニングサイ
ト部分の制限酵素サイトSalＩおよびNheＩによって消化
後、電気泳動を行い、ベクター部分を回収した。以上の
操作によって調製したヒト型ＧＰＲ７リガンドｃＤＮＡ
断片および発現ベクターをライゲーションによって連結
し、大腸菌JM109を形質転換してE.coli JM109/pAK-S64
を得た。形質転換体E.coli JM109/pAK-S64を培養し、プ
ラスミドpAK-S64のＤＮＡを大量に調製した。
【０１９５】参考例６２ マウス全脳ｃＤＮＡからのＰＣＲ法によるＧＰＲ７リガ
ンド前駆体遺伝子の取得 マウス全脳ｃＤＮＡを鋳型として、以下の２種類の合成
ＤＮＡを用いて、ＰＣＲによる増幅を行った。 MFSAL1: 5’-GTCGACAGCTCCATGGCCCGGTGTAGGACGCTG-3’（配列番号：１８６） MRNHE1: 5’-GCTAGCTCAGGTGCTCTGGCAATCAGTCTCGTG-3’（配列番号：１８７） ＰＣＲの反応液はｃＤＮＡ溶液１μｌ、０．５μｌ MFS
AL1（10 μM）、０．５μｌ MRNHE1（10 μM）、２．５
μｌ 添付の10 x 反応液、２．５μｌ dNTP（１０ｍ
Ｍ）、０．５μｌ KlenTaq（クローンテック）、１７．
５μｌ大塚蒸留水を加えて合計２５μｌにした。反応液
を、ThermalCycler9600を用いてＰＣＲ反応にかけた。
ＰＣＲの条件は９５℃・２分の変性の後、９８℃・１０
秒、６０℃・２０秒、７２℃・２０秒のサイクルを３５
回繰り返した。ＰＣＲ産物の一部を用いて電気泳動で約
４００ｂｐのＰＣＲ産物の増幅を確認した後、ＰＣＲ産
物をQuiagen PCR purification Kitを用いて精製し、直
接配列決定を行ったところ図１０で示す配列がえられ
た。図１０のＤＮＡ配列から予測されるアミノ酸配列は
図１１に示すものであった。次に、ゲルから回収したＰ
ＣＲ産物をTAクローニングキット（Invitrogen）を用い
て大腸菌JM109にサブクローニングし、大腸菌JM109/pTA
mGPR7-1を取得した。サブクローニングで得られた大腸
菌からプラスミドpTAmGPR7-1をプラスミド抽出機（クラ
ボウ）を用いて抽出し、挿入断片の塩基配列を決定し、
その配列が図１０と同じマウス型ＧＰＲ７リガンドｃＤ
ＮＡであることを確認した。
【０１９６】参考例６３ ラット全脳ｃＤＮＡからのＰＣＲ法によるＧＰＲ７リガ
ンド前駆体遺伝子の取得 ラット全脳ｃＤＮＡを鋳型として、以下の２種類の合成
ＤＮＡを用いて、ＰＣＲによる増幅を行った。 RF: 5’-CACGGCTCCATGGTCCGGTGTAGGACG-3’（配列番号：１８８） RR: 5’-CAGCGTCGAGGTTTGGGTTGGGGTTCA-3’（配列番号：１８９） ＰＣＲの反応液はｃＤＮＡ溶液１μｌ、０．５μｌ RF
（１０μＭ）、０．５μｌ RR（１０μＭ）、２．５μ
ｌ 添付の10 x 反応液、２．５μｌ dNTP（１０ｍ
Ｍ）、０．５μｌ KlenTaq（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）、１
７．５μｌ大塚蒸留水を加えて合計２５μｌにした。反
応液を、ThermalCycler9600を用いてＰＣＲ反応にかけ
た。ＰＣＲの条件は９５℃・２分の変性の後、９８℃・
１０秒、６０℃・２０秒、７２℃・２０秒のサイクルを
３５回繰り返した。ＰＣＲ産物の一部を用いて電気泳動
で約４００ｂｐのＰＣＲ産物の増幅を確認した後、ＰＣ
Ｒ産物をQuiagen PCR purification Kitを用いて精製
し、直接配列決定を行ったところ図１２で示す配列がえ
られた。図１２のＤＮＡ配列から予測されるアミノ酸配
列は図１３に示すものであった。次に、ゲルから回収し
たＰＣＲ産物をTAクローニングキット（Invitrogen）を
用いて大腸菌JM109にサブクローニングし、大腸菌JM109
/pTArGPR7-1を取得した。サブクローニングで得られた
大腸菌からプラスミドpTArGPR7-1をプラスミド抽出機
（クラボウ）を用いて抽出し、挿入断片の塩基配列を決
定し、その配列が図１２と同じラット型ＧＰＲ７リガン
ドｃＤＮＡであることを確認した。
【０１９７】参考例６４ ＧＰＲ７発現プラスミドおよびレポータープラスミドの
チャイニーズハムスターオバリー（ＣＨＯ）細胞での一
過的な発現 上記参考例で得たヒト型ＧＰＲ７のＤＮＡを、公知の方
法により動物細胞用発現プラスミドpAKKO-111Ｈに挿入
したプラスミドを用いて大腸菌JM109を形質転換した。
得られたコロニーを単離・培養後、QUIAGEN Plasmid Ma
xi Kit（キアゲン）を用いてＧＰＲ7発現プラスミドＤ
ＮＡの調製を行なった。また、ｃＡＭＰレスポンスエレ
メント（CRE）の下流にレポーターとしてルシフェラー
ゼ遺伝子が連結されたpCRE-Luc（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）の
プラスミドＤＮＡを同様の方法で調製した。ＧＰＲ７発
現プラスミドおよびpCRE-Lucはレセプター遺伝子を挿入
していない発現ベクターを導入したＣＨＯ細胞に一過性
に発現させた。ＣＨＯ細胞は９６-ウェルプレート（コ
ーニングコースター）に40,000細胞／ウェル、培養液量
１００μｌで播種し、３７℃で一晩培養した。プレート
上での培養にはDMEM（Dulbecco’s modified Eagle’s
medium, GibcoBRL）に10%のウシ胎児血清のみを添加し
た培地を用いた。各プラスミドは２４０ｎｇ／μｌの濃
度に希釈し、ＧＰＲ７の発現プラスミド９μｌとpCRE-L
uc １μｌの割合で２４０μｌのOpti-MEM-I（GibcoBR
L）に添加した。これを、同じく２４０μｌのOpti-MEM-
Iに１０μｌのリポフェクトアミン2000（GibcoBRL社）
を添加したものと等量混合して、リポフェクトアミン20
00に添付のマニュアル記載の方法に従って、リポソーム
とプラスミドＤＮＡの複合体を形成させた。これを２５
μｌ／ウェルずつＣＨＯ細胞の培養液に添加し、その４
時間後に培養液をアッセイバッファー（0.1%のウシ血清
アルブミンを添加したDMEM）に交換して無血清化し、３
７℃で一晩培養した。
【０１９８】参考例６５ リガンド遺伝子のＣＨＯ細胞での発現 上記参考例で作製したヒト型リガンドｃＤＮＡを挿入し
た動物細胞用発現プラスミドｐＡＫ−Ｓ６４を上記と同
様の方法でＣＨＯ細胞に一過性に発現させた。ただし細
胞は６-ウェルプレート（ファルコン）に600,000細胞／
ウェルで播種し、一晩培養の後、リガンド遺伝子プラス
ミドを導入した。２４０ｎｇ／μｌの濃度に希釈したプ
ラスミドを１０μｌと２４０μｌのOpti-MEM-Iに添加
し、これを、同じく２４０μｌのOpti-MEM-Iに１０μｌ
のリポフェクトアミン2000を添加したものと等量混合し
て、リポフェクトアミン2000に添付のマニュアル記載の
方法に従ってリポソームとプラスミドＤＮＡの複合体を
形成させた。これを５００μｌ／ウェルずつＣＨＯ細胞
の培養液に添加し、その４時間後に培養液をアッセイバ
ッファーに交換し、無血清化をおこなった。培地交換の
１８時間後に各ウェルの培地を回収しリガンドペプチド
を含むＣＨＯ細胞培養上清を得た。
【０１９９】参考例６６ １）Ｓ６４発現細胞上清によるＧＰＲ７を一過性に発現
させたＣＨＯ細胞でのルシフェラーゼ活性の抑制の検出 参考例６４の方法に従いＧＰＲ７を一過性に発現させた
ＣＨＯ細胞の培養液に、参考例６５で調製したｐＡＫ−
Ｓ６４発現培養上清および終濃度２μＭとなるようにホ
ルスコリンを添加した。またリガンド遺伝子を挿入して
いない空の発現ベクター(pAKKO-111H)を参考例６５の方
法で一過性に発現させたＣＨＯ細胞の培養上清も同様に
添加した。その際発現上清はアッセイバッファーにて２
倍、４倍、８倍、１６倍に希釈した。上清を添加してか
ら４時間３７℃でインキュベーションを行ない、レセプ
ターを介したリガンドのアゴニスト活性によって惹起さ
れる細胞内シグナル伝達に由来するレポーター（ルシフ
ェラーゼ）遺伝子の転写・翻訳の促進あるいは抑制を誘
導した。インキュベーション終了後に各ウェルのアッセ
イバッファーを除去し、PicaGene LT2.0 （東洋イン
キ）発光基質を５０μｌずつ加えた。細胞が溶解し、基
質と充分に混合した後、各ウェルのレポーター遺伝子の
発現誘導量に由来する発光量をプレートリーダー（ARVO
sxマルチラベルカウンター、PerkinElmer）を用いて測
定した。その結果、ｐＡＫ−Ｓ６４の培養上清を添加し
た際にのみレポーター遺伝子の発現抑制がルシフェラー
ゼ活性の低下として検出された（図１５）。さらに、こ
の抑制の程度はｐＡＫ−Ｓ６４の培養上清の濃度依存的
であった。このことはｐＡＫ−Ｓ６４に挿入されたプラ
スミドによって発現した産物が、ＧＰＲ７を介した細胞
内のシグナルを伝達した、すなわちＧＰＲ７のリガンド
として作用したことを示している。
【０２００】２）Ｓ６４発現細胞上清によるＴＧＲ２６
を一過性に発現させたＣＨＯ細胞でのルシフェラーゼ活
性の抑制の検出 参考例６３で得たＴＧＲ２６ ＤＮＡを、公知の方法に
より動物細胞用発現プラスミドｐＡＫＫＯ−１１１Ｈに
挿入したプラスミドを用いて、参考例６４と同様の方法
でＴＧＲ２６発現プラスミドＤＮＡの調製を行なった。
これを、参考例６４に示した方法でＣＨＯ細胞にルシフ
ェラーゼ遺伝子とともに一過性に発現させた。この細胞
に、参考例６５で調製したｐＡＫ−Ｓ６４発現培養上
清、空の発現ベクターのみを発現させた細胞の培養上清
および終濃度２μＭとなるようにホルスコリンを添加
し、上記１）と同様の方法でリガンド活性の検出を試み
た。その結果ｐＡＫ−Ｓ６４の上清は、ホルスコリンに
よって上昇したルシフェラーゼ活性を濃度依存的に低下
させた（図１６）。
【０２０１】
【発明の効果】本発明のＧタンパク質共役型レセプター
タンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩、該
レセプタータンパク質またはその部分ペプチドをコード
するポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡおよび
それらの誘導体）は、リガンド（アゴニスト）の決
定、抗体および抗血清の入手、組換え型レセプター
タンパク質の発現系の構築、同発現系を用いたレセプ
ター結合アッセイ系の開発と医薬品候補化合物のスクリ
ーニング、構造的に類似したリガンド・レセプターと
の比較にもとづいたドラッグデザインの実施、遺伝子
診断におけるプローブやＰＣＲプライマーの作成のため
の試薬、トランスジェニック動物の作製または遺伝
子予防・治療剤等の医薬等として用いることができる。
【０２０２】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Takeda Chemical Industries, Ltd. <120> Novel G Protein-Coupled Receptor and its DNA <130> P01-0255 <150> JP 2000-364801 <151> 2000-11-30 <150> JP 2001-087482 <151> 2001-03-26 <150> JP 2001-145434 <151> 2001-05-15 <150> JP 2001-270838 <151> 2001-09-06 <160> 191 <210> 1 <211> 329 <212> PRT <213> Rat <400> 1 Met His Asn Leu Ser Leu Phe Glu Pro Gly Arg Gly Asn Val Ser Cys 5 10 15 Gly Gly Pro Phe Leu Gly Cys Pro Asn Glu Ser Asn Pro Ala Pro Leu 20 25 30 Pro Leu Pro Gln Pro Leu Ala Val Ala Val Pro Val Val Tyr Gly Val 35 40 45 Ile Cys Ala Val Gly Leu Ala Gly Asn Ser Ala Val Leu Tyr Val Leu 50 55 60 Leu Arg Thr Pro Arg Met Lys Thr Val Thr Asn Val Phe Ile Leu Asn 65 70 75 80 Leu Ala Ile Ala Asp Glu Leu Phe Thr Leu Val Leu Pro Ile Asn Ile 85 90 95 Ala Asp Phe Leu Leu Arg Arg Trp Pro Phe Gly Glu Val Met Cys Lys 100 105 110 Leu Ile Val Ala Val Asp Gln Tyr Asn Thr Phe Ser Ser Leu Tyr Phe 115 120 125 Leu Ala Val Met Ser Ala Asp Arg Tyr Leu Val Val Leu Ala Thr Ala 130 135 140 Glu Ser Arg Arg Val Ser Gly Arg Thr Tyr Gly Ala Ala Arg Ala Val 145 150 155 160 Ser Leu Ala Val Trp Ala Leu Val Thr Leu Val Val Leu Pro Phe Ala 165 170 175 Val Phe Ala Arg Leu Asp Glu Glu Gln Gly Arg Arg Gln Cys Val Leu 180 185 190 Val Phe Pro Gln Pro Glu Ala Phe Trp Trp Arg Ala Ser Arg Leu Tyr 195 200 205 Thr Leu Val Leu Gly Phe Ala Ile Pro Val Ser Thr Ile Cys Ala Leu 210 215 220 Tyr Ile Thr Leu Leu Cys Arg Leu Arg Ala Ile Gln Leu Asp Ser His 225 230 235 240 Ala Lys Ala Leu Asp Arg Ala Lys Lys Arg Val Thr Leu Leu Val Val 245 250 255 Ala Ile Leu Ala Val Cys Leu Leu Cys Trp Thr Pro Tyr His Leu Ser 260 265 270 Thr Ile Val Ala Leu Thr Thr Asp Leu Pro Gln Thr Pro Leu Val Ile 275 280 285 Gly Ile Ser Tyr Phe Ile Thr Ser Leu Ser Tyr Ala Asn Ser Cys Leu 290 295 300 Asn Pro Phe Leu Tyr Ala Phe Leu Asp Asp Ser Phe Arg Arg Ser Leu 305 310 315 320 Arg Gln Leu Val Ser Cys Arg Thr Ala 325 329 <210> 2 <211> 987 <212> DNA <213> Rat <400> 2 atgcacaact tgtcgctctt cgagcctggc aggggcaatg tgtcttgcgg cggcccattt 60 ttgggctgtc ctaacgagtc gaacccagcg cctctgccac tgccgcagcc tctggcggta 120 gcagtgcctg tggtctacgg ggtgatctgc gcggtgggac tggcgggcaa ctccgcggtg 180 ctgtacgtac tgctgcgcac gccgcgcatg aagactgtta ccaacgtgtt cattctcaac 240 ctggctatcg cggacgagct cttcaccctc gtgctgccca tcaacatcgc ggacttcctg 300 ctgaggcgct ggcccttcgg ggaagtcatg tgcaagctca tcgtggctgt cgaccagtac 360 aacactttct ctagcctcta cttcctcgcc gtcatgagcg cagaccgcta cctggttgtc 420 ctggccacag ccgagtcgcg ccgggtgtcc gggcgcactt atggtgcagc gcgggctgtc 480 agtctggcgg tgtgggcgct ggtgacattg gtcgtgctgc cttttgcggt attcgcccgg 540 ctggacgaag agcagggtcg gcgtcagtgc gtgctggtct tcccgcagcc tgaggccttc 600 tggtggcgcg ccagccgtct gtacactcta gtgttgggct tcgccatccc ggtgtccacc 660 atctgcgccc tctatatcac cctgttgtgc cgactgcgtg ctatccagct agacagccac 720 gccaaggccc tggaccgtgc caagaagcgc gtgaccttgt tggtggtggc gattctggct 780 gtgtgcctcc tctgctggac accgtaccac ctgagcacca tagtggcgct caccaccgac 840 ctcccgcaaa caccgttggt catcggcatc tcttacttca tcaccagtct gagctatgcc 900 aacagctgcc tcaacccttt cctctatgcc ttcctggacg acagcttccg caggagcctg 960 cggcagctgg tgtcatgccg cacagcc 987 <210> 3 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 3 actgatatgc acaacttgtc gctcttcg 28 <210> 4 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 4 actagttcag gctgtgcggc atgacacc 28 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 5 gttggtggtg gcgattctg 19 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 6 tggtgagcgc cactatggt 19 <210> 7 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 7 tcctctgctg gacaccgtac cacctga 27 <210> 8 <211> 23 <212> PRT <213> Human <400> 8 Trp Tyr Lys His Val Ala Ser Pro Arg Tyr His Thr Val Gly Arg Ala 1 5 10 15 Ala Gly Leu Leu Met Gly Leu 20 23 <210> 9 <211> 30 <212> PRT <213> Human <400> 9 Trp Tyr Lys His Val Ala Ser Pro Arg Tyr His Thr Val Gly Arg Ala 1 5 10 15 Ala Gly Leu Leu Met Gly Leu Arg Arg Ser Pro Tyr Leu Trp 20 25 30 <210> 10 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 10 atcgattaca atgcaggccg ctgggcaccc ag 32 <210> 11 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 11 actagtgccc ttcagcaccg caatatgctg cg 32 <210> 12 <211> 1023 <212> DNA <213> Human <400> 12 atcgattaca atgcaggccg ctgggcaccc agagcccctt gacagcaggg gctccttctc 60 cctccccacg atgggtgcca acgtctctca ggacaatggc actggccaca atgccacctt 120 ctccgagcca ctgccgttcc tctatgtgct cctgcccgcc gtgtactccg ggatctgtgc 180 tgtggggctg actggcaaca cggccgtcat ccttgtaatc ctaagggcgc ccaagatgaa 240 gacggtgacc aacgtgttca tcctgaacct ggccgtcgcc gacgggctct tcacgctggt 300 actgcccgtc aacatcgcgg agcacctgct gcagtactgg cccttcgggg agctgctctg 360 caagctggtg ctggccgtcg accactacaa catcttctcc agcatctact tcctagccgt 420 gatgagcgtg gaccgatacc tggtggtgct ggccaccgtg aggtcccgcc acatgccctg 480 gcgcacctac cggggggcga aggtcgccag cctgtgtgtc tggctgggcg tcacggtcct 540 ggttctgccc ttcttctctt tcgctggcgt ctacagcaac gagctgcagg tcccaagctg 600 tgggctgagc ttcccgtggc ccgagcaggt ctggttcaag gccagccgtg tctacacgtt 660 ggtcctgggc ttcgtgctgc ccgtgtgcac catctgtgtg ctctacacag acctcctgcg 720 caggctgcgg gccgtgcggc tccgctctgg agccaaggct ctaggcaagg ccaggcggaa 780 ggtgaccgtc ctggtcctcg tcgtgctggc cgtgtgcctc ctctgctgga cgcccttcca 840 cctggcctct gtcgtggccc tgaccacgga cctgccccag accccactgg tcatcagtat 900 gtcctacgtc atcaccagcc tcagctacgc caactcgtgc ctgaacccct tcctctacgc 960 ctttctagat gacaacttcc ggaagaactt ccgcagcata ttgcggtgct gaagggcact 1020 agt 1023 <210> 13 <211> 687 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Riboprobe <400> 13 caaaagcugg agcuccaccg cgguggcggc cgcucuagcc cacuagugcc cuucagcacc 60 gcaauaugcu gcggaaguuc uuccggaagu ugucaucuag aaaggcguag aggaaggggu 120 ucaggcacga guuggcguag cugaggcugg ugaugacgua ggacauacug augaccagug 180 gggucugggg cagguccgug gucagggcca cgacagaggc cagguggaag ggcguccagc 240 agaggaggca cacggccagc acgacgagga ccaggacggu caccuuccgc cuggccuugc 300 cuagagccuu ggcuccagag cggagccgca cggcccgcag ccugcgcagg aggucugugu 360 agagcacaca gauggugcac acgggcagca cgaagcccag gaccaacgug uagacacggc 420 uggccuugaa ccagaccugc ucgggccacg ggaagcucag cccacagcuu gggaccugca 480 gcucguugcu guagacgcca gcgaaagaga agaagggcag aaccaggacc gugacgccca 540 gccagacaca caggcuggcg accuucgccc cccgguaggu gcgccagggc auguggcggg 600 accucacggu ggccagcacc accagguauc gguccacgcu caucacggcu aggaaguaga 660 ugcuggagaa gauguuguag uggucga 687 <210> 14 <211> 17 <212> PRT <213> Porcine <400> 14 Trp Tyr Lys His Thr Ala Ser Pro Arg Tyr His Thr Val Gly Arg Ala 1 5 10 15 Ala 17 <210> 15 <211> 438 <212> DNA <213> Human <400> 15 gccccatgag caggccagcg gcgcggccca ccgtgtggta gcggggactc gccacgtgct 60 tgtaccacgc gccggagggc agcggcagca ggagcagaag cagcagcagt gccagccgcg 120 gccggctcgc gggagccccc cgctcccctg ggcgccacgc cagggcgctc gcgtcgacgg 180 ccgcccggcg gggcgggcca cgaaccggct cggctggggt tgggcgcgca gtggagttgg 240 gacgcccagg taccggagcg caggaggctg gaggcgagcc gtgggtcccc tgcaggccca 300 gctataaccg ctcggtggcc ccgcctcgtt ccgccccctc agtaccgctg ggctccccag 360 atggggggag ggacggaggg aggagaggga accctggcag ctggcggngg acgtgggtac 420 ttgagcacct cactgagt 438 <210> 16 <211> 264 <212> DNA <213> Human <400> 16 gatagggtga gcgacgcagc cccatgagca ggccagcggc gcggcccacc gtgtggtagc 60 ggggactcgc cacgtgcttg taccacgcgc cggagggcag cggcagcagg agcagaagca 120 gcagcagtgc cagccgcggc cggctcgcgg gagccccccg ctcccctggg cgccacgcca 180 gggcgctcgc gtcgacggcc gcccggcggg gcgggccacg aaccggctcg gctgggtttg 240 ggcgcgcagt ggagttggga cgcc 264 <210> 17 <211> 424 <212> DNA <213> Human <400> 17 gatagggtga gcgacgcagc cccatgagca ggccagcggc gcggcccacc gtgtggtagc 60 ggggactcgc cacgtgcttg taccacgcgc cggagggcag cggcagcagg agcagaagca 120 gcagcagtgc cagccgcggc cggctcgcgg gagccccccg ctcccctggg cgccacgcca 180 gggcgctcgc gtcgacggcc gcccggcggg gcgggccacg aaccggctcg gctgggtttg 240 ggcgcgcagt ggagttggga cgcccaggta ccggagcgca ggaggctgga ggcgagccgt 300 gggtcccctg caggcccagc tataaccgct cggtggcccc gcctcgttcc gccccctcag 360 taccgctggg ctccccagat ggggggaggg acggagggag gagagggaac cctggcagct 420 ggcg 424 <210> 18 <211> 375 <212> DNA <213> Human <400> 18 gcgcctcacc gtgtggtagc ggggactcgc cacgtgcttg taccacgcgc cggaggcagc 60 ggcacgagga gcagaagcag cagcagtgcc agccgcggcc ggctcgcggg agccccccgc 120 tcccctgggc gccacgcagg gctacagcgt cgacggccgc ccgcggggcc atcgcaaccg 180 gctcggctgg gtttgggcgc gcagtggagt tgggacgccc aggtaccgga gcgcaggagg 240 ctggaggcga gccgtgggtc ccctgcaggc ccagctataa ccgctcggtg gccccgcctc 300 gttccgcccc ctcagtaccg ctgggctccc cagaatgggg gagggacgga gggaggagag 360 ggaaccctgg cagct 375 <210> 19 <211> 260 <212> DNA <213> Human <400> 19 cnacgttctc ggggacataa accctgttct tgtcctaacc cgccaagggg ccatggactt 60 nagcgcgctg gcgtcgagca gagaagtacg gggccctggg ccggggctcc ggtgaaccgg 120 cccctgctac cgctactgct gcttctnctc ttgctacctc tgcccgccag cgcctggtac 180 aagcacgtng cgagccctcg ctatcacaca gtnggtcgtg cctccgggct gctcatnggg 240 ctgcgccgnt cgtcctacct 260 <210> 20 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 20 aactccactg cgcgcccaaa ccca 24 <210> 21 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 21 tctcccacag ctcctgaacc cacg 24 <210> 22 <211> 375 <212> DNA <213> Human <400> 22 aactccactg cgcgcccaaa cccagccgag ccggttcgtg gcccgccccg ccgggcggcc 60 gtcgacgcga gcgccctggc gtggcgccca ggggagcggg gggctcccgc gagccggccg 120 cggctggcac tgctgctgct tctgctcctg ctgccgctgc cctccggcgc gtggtacaag 180 cacgtggcga gtccccgcta ccacacggtg ggccgcgccg ctggcctgct catggggctg 240 cgtcgctcac cctatctgtg gcgccgcgcg ctgcgcgcgg ccgccgggcc cctggccagg 300 gacaccctct cccccgaacc cgcagcccgc gaggctcctc tcctgctgcc ctcgtgggtt 360 caggagctgt gggag 375 <210> 23 <211> 125 <212> PRT <213> Human <400> 23 Asn Ser Thr Ala Arg Pro Asn Pro Ala Glu Pro Val Arg Gly Pro Pro 1 5 10 15 Arg Arg Ala Ala Val Asp Ala Ser Ala Leu Ala Trp Arg Pro Gly Glu 20 25 30 Arg Gly Ala Pro Ala Ser Arg Pro Arg Leu Ala Leu Leu Leu Leu Leu 35 40 45 Leu Leu Leu Pro Leu Pro Ser Gly Ala Trp Tyr Lys His Val Ala Ser 50 55 60 Pro Arg Tyr His Thr Val Gly Arg Ala Ala Gly Leu Leu Met Gly Leu 65 70 75 80 Arg Arg Ser Pro Tyr Leu Trp Arg Arg Ala Leu Arg Ala Ala Ala Gly 85 90 95 Pro Leu Ala Arg Asp Thr Leu Ser Pro Glu Pro Ala Ala Arg Glu Ala 100 105 110 Pro Leu Leu Leu Pro Ser Trp Val Gln Glu Leu Trp Glu 115 120 125 <210> 24 <211> 25 <212> PRT <213> Human <400> 24 Trp Tyr Lys His Val Ala Ser Pro Arg Tyr His Thr Val Gly Arg Ala 1 5 10 15 Ala Gly Leu Leu Met Gly Leu Arg Arg 20 25 <210> 25 <211> 24 <212> PRT <213> Human <400> 25 Trp Tyr Lys His Val Ala Ser Pro Arg Tyr His Thr Val Gly Arg Ala 1 5 10 15 Ala Gly Leu Leu Met Gly Leu Arg 20 24 <210> 26 <211> 87 <212> DNA <213> Human <400> 26 tggtacaagc acgtggcgag tccccgctac cacacggtgg gccgcgccgc tggcctgctc 60 atggggctgc gtcgctcacc ctatctg 87 <210> 27 <211> 84 <212> DNA <213> Human <400> 27 tggtacaagc acgtggcgag tccccgctac cacacggtgg gccgcgccgc tggcctgctc 60 atggggctgc gtcgctcacc ctat 84 <210> 28 <211> 81 <212> DNA <213> Human <400> 28 tggtacaagc acgtggcgag tccccgctac cacacggtgg gccgcgccgc tggcctgctc 60 atggggctgc gtcgctcacc c 81 <210> 29 <211> 78 <212> DNA <213> Human <400> 29 tggtacaagc acgtggcgag tccccgctac cacacggtgg gccgcgccgc tggcctgctc 60 atggggctgc gtcgctca 78 <210> 30 <211> 75 <212> DNA <213> Human <400> 30 tggtacaagc acgtggcgag tccccgctac cacacggtgg gccgcgccgc tggcctgctc 60 atggggctgc gtcgc 75 <210> 31 <211> 72 <212> DNA <213> Human <400> 31 tggtacaagc acgtggcgag tccccgctac cacacggtgg gccgcgccgc tggcctgctc 60 atggggctgc gt 72 <210> 32 <211> 333 <212> PRT <213> Human <400> 32 Met Gln Ala Ala Gly His Pro Glu Pro Leu Asp Ser Arg Gly Ser Phe 1 5 10 15 Ser Leu Pro Thr Met Gly Ala Asn Val Ser Gln Asp Asn Gly Thr Gly 20 25 30 His Asn Ala Thr Phe Ser Glu Pro Leu Pro Phe Leu Tyr Val Leu Leu 35 40 45 Pro Ala Val Tyr Ser Gly Ile Cys Ala Val Gly Leu Thr Gly Asn Thr 50 55 60 Ala Val Ile Leu Val Ile Leu Arg Ala Pro Lys Met Lys Thr Val Thr 65 70 75 80 Asn Val Phe Ile Leu Asn Leu Ala Val Ala Asp Gly Leu Phe Thr Leu 85 90 95 Val Leu Pro Val Asn Ile Ala Glu His Leu Leu Gln Tyr Trp Pro Phe 100 105 110 Gly Glu Leu Leu Cys Lys Leu Val Leu Ala Val Asp His Tyr Asn Ile 115 120 125 Phe Ser Ser Ile Tyr Phe Leu Ala Val Met Ser Val Asp Arg Tyr Leu 130 135 140 Val Val Leu Ala Thr Val Arg Ser Arg His Met Pro Trp Arg Thr Tyr 145 150 155 160 Arg Gly Ala Lys Val Ala Ser Leu Cys Val Trp Leu Gly Val Thr Val 165 170 175 Leu Val Leu Pro Phe Phe Ser Phe Ala Gly Val Tyr Ser Asn Glu Leu 180 185 190 Gln Val Pro Ser Cys Gly Leu Ser Phe Pro Trp Pro Glu Gln Val Trp 195 200 205 Phe Lys Ala Ser Arg Val Tyr Thr Leu Val Leu Gly Phe Val Leu Pro 210 215 220 Val Cys Thr Ile Cys Val Leu Tyr Thr Asp Leu Leu Arg Arg Leu Arg 225 230 235 240 Ala Val Arg Leu Arg Ser Gly Ala Lys Ala Leu Gly Lys Ala Arg Arg 245 250 255 Lys Val Thr Val Leu Val Leu Val Val Leu Ala Val Cys Leu Leu Cys 260 265 270 Trp Thr Pro Phe His Leu Ala Ser Val Val Ala Leu Thr Thr Asp Leu 275 280 285 Pro Gln Thr Pro Leu Val Ile Ser Met Ser Tyr Val Ile Thr Ser Leu 290 295 300 Ser Tyr Ala Asn Ser Cys Leu Asn Pro Phe Leu Tyr Ala Phe Leu Asp 305 310 315 320 Asp Asn Phe Arg Lys Asn Phe Arg Ser Ile Leu Arg Cys 325 330 333 <210> 33 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 33 tctcccacag ctcctgaacc cacg 24 <210> 34 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 34 acagataggg tgagcgacgc agcc 24 <210> 35 <211> 1102 <212> DNA <213> Human <400> 35 gccatttaag tggagtcttg aaggatgagt aggtgttagg cacagacgca cagaggcagg 60 caaagccaca ggctgttggt ttaggcaaaa attgagactg gctggataaa gtggtcttgg 120 gggaccatca ccagagagga ggcgctggag gtctgcaagg ccttgtcctg cccctccagg 180 ggtagaggtt ccaggagggg ctgacttttt ctcctggaag cctcacagaa ctgcagaccc 240 cacggatggc ttggtgttgc caacatgagg cttctaaggc ttctgcgggg agatgggttg 300 gtggggagaa gctgggggtg gcagtggaca ggacagggtg tggggacagc tttgggagct 360 atgctaggca aggacaaggg acaactcttg gggggactca cccagagggg tcttgaatgg 420 tgctgaaggc ccccgacagc cctcctgcaa tagccactgt agctctgcct gcacctgggc 480 cttcgctctg ctgtcgtccc accggcagga gtctggctaa aggggcatcc ctcagcccta 540 ctccctcatc agtgttccca gtacccactc cctggcactt ccactcctag agggaggagg 600 ctgagcaggc 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catcctcctc tcccttgggc atgtgccgcg ggggcgagcc 360 ggggcggggc cattgagaag ctgtagtcgc accaactgac tagtctcttc catcctccgg 420 agctccgacg ttctcgggga cataaaccct gttcttgtcc taacccgcca aggggccatg 480 gacttgagcg cgctggcgtc gagcagagaa gtacggggcc ctgggcccgg ggctccggtg 540 aaccggcccc tgctaccgct actgctgctt ctgctcttgc tacctctgcc cgccagcgcc 600 tggtacaagc acgtg 615 <210> 66 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 66 cgttctcggg gacataaacc ctg 23 <210> 67 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 67 cgagccctcg ctatcacaca gtgg 24 <210> 68 <211> 497 <212> DNA <213> Rat <400> 68 gtcgtgcctc cgggctgctc atggggctgc gccgctcgcc ctacctgtgg cgccgtgcct 60 tgggtggggc cgctggaccg ctcgtggggc tcccgggaca gatggcccgc agcgctctcc 120 tgcttccttc ccccgggcag gagctgtggg aggtacgaag caggagttca ccggcaggac 180 ttcccgtgca tgcaacccgg agtctgcggg acctggaggg agccggccaa cctgagcagt 240 cgctaagctt tcagtcctgg acttcagcag agcccgctgc tagagccttc ggtgagacgc 300 ttcgtgccca gccatggttc 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actcccagga 120 accggcccct gctgcccctg ctgctgcttc tgctcttgct accgctgccc gccagcgcct 180 ggtataagca cgtggcgagt ccccgctatc acacagtggg tcgtgcctcc gggctgctca 240 tggggctgcg ccgctcgccc taccagtggc gccgtgccct gggcggggct gctggacccc 300 tctcccggct cccaggaccg gtcgcccgcg gcgctctcct gcttccttcc tcagggcagg 360 agctgtggga ggtacgaagc aggagctcac ctgcagggct tcccgtccat gcaccctgga 420 gtccgcggga cctggaggga gtccgccaac cggagcagtc gctaagcctt cactcctgga 480 tgtcagagga gcccgctgat aggtaagtag gaaagagagg aggcgggcg 529 <210> 78 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 78 acccagttct tgtcctaacc ctcc 24 <210> 79 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 79 cctgcttcgt acctcccaca gctc 24 <210> 80 <211> 311 <212> DNA <213> Mouse <400> 80 aaggggcaat tgacgtgagc gcgctggcgt ctaacagaga agtacggggc cctgggcccg 60 ggactcccag gaaccggccc ctgctgcccc tgctgctgct tctgctcttg ctaccgctgc 120 ccgccagcgc ctggtataag cacgtggcga gtccccgcta tcacacagtg ggtcgtgcct 180 ccgggctgct catggggctg cgccgctcgc cctaccagtg gcgccgtgcc ctgggcgggg 240 ctgctggacc cctctcccgg ctcccaggac cggtcgcccg cggcgctctc ctgcttcctt 300 cctcagggca g 311 <210> 81 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 81 catgagcagc ccggaggcac gacc 24 <210> 82 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 82 gtgatagcgg ggactcgcca cgtg 24 <210> 83 <211> 237 <212> DNA <213> Mouse <400> 83 aaaggctgta gtcgcaccaa ctgactggtc tccatcctct ggagctccga cgtgctcgtt 60 ctcggagaca taaacccagt tcttgtccta accctccaag gggcaattga cgtgagcgcg 120 ctggcgtcta acagagaagt acggggccct gggcccggga ctcccaggaa ccggcccctg 180 ctgcccctgc tgctgcttct gctcttgcta ccgctgcccg ccagcgcctg gtataag 237 <210> 84 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 84 acccagttct tgtcctaacc ctcc 24 <210> 85 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 85 gggcaattga cgtgagcgcg ctgg 24 <210> 86 <211> 598 <212> DNA <213> Mouse <400> 86 cgtctaacag agaagtacgg ggccctgggc ccgggactcc caggaaccgg cccctgctgc 60 ccctgctgct gcttctgctc ttgctaccgc tgcccgccag cgcctggtat aagcacgtgg 120 cgagtccccg ctatcacaca gtgggtcgtg cctccgggct gctcatgggg ctgcgccgct 180 cgccctacca gtggcgccgt gccctgggcg gggctgctgg acccctctcc cggctcccag 240 gaccggtcgc ccgcggcgct ctcctgcttc cttcctcagg gcaggagctg tgggaggtac 300 gaagcaggag ctcacctgca gggcttcccg tccatgcacc ctggagtccg cgggacctgg 360 agggagtccg ccaaccggag cagtcgctaa gccttcactc ctggatctca gaggagcccg 420 ctgctagagc cttcggagag acgcttcgtg cccagccatg gttcctgcag caagtcatct 480 ttgccgatcc tgtcaggccc aagaaccgat ggcgccccca tgcttgacct aggcaggagc 540 acagcttgaa gctccagtca ggcctcgtgt ttctggtcaa taaaaccaac ctgattcc 598 <210> 87 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 87 aaaggctgta gtcgcaccaa c 21 <210> 88 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 88 accagaaaca cgaggcctga c 21 <210> 89 <211> 659 <212> DNA <213> Mouse <400> 89 tgactggtct ccatcctctg gagctccgac gtgctcgttc tcggagacat aaacccagtt 60 cttgtcctaa ccctccaagg ggcaattgac gtgagcgcgc tggcgtctaa cagagaagta 120 cggggccctg ggcccgggac tcccaggaac cggcccctgc tgcccctgct gctgcttctg 180 ctcttgctac cgctgcccgc cagcgcctgg tataagcacg tggcgagtcc ccgctatcac 240 acagtgggtc gtgcctccgg gctgctcatg gggctgcgcc gctcgcccta ccagtggcgc 300 cgtgccctgg gcggggctgc tggacccctc tcccggctcc caggaccggt cgcccgcggc 360 gctctcctgc ttccttcctc agggcaggag ctgtgggagg tacgaagcag gagctcacct 420 gcagggcttc ccgtccatgc accctggagt ccgcgggacc tggagggagt ccgccaaccg 480 gagcagtcgc taagccttca ctcctggatc tcagaggagc ccgctgctag agccttcgga 540 gagacgcttc gtgcccagcc atggttcctg cagcaagtca tctttgccga tcctgtcagg 600 cccaagaacc gatggcgccc ccatgcttga cctaggcagg agcacagctt gaagctcca 659 <210> 90 <211> 176 <212> PRT <213> Mouse <400> 90 Leu Ala Ser Asn Arg Glu Val Arg Gly Pro Gly Pro Gly Thr Pro Arg 1 5 10 15 Asn Arg Pro Leu Leu Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu 20 25 30 Pro Ala Ser Ala Trp Tyr Lys His Val Ala Ser Pro Arg Tyr His Thr 35 40 45 Val Gly Arg Ala Ser Gly Leu Leu 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118 <211> 54 <212> DNA <213> Human <400> 118 tggtacaagc acgtggcgag tccccgctac cacacggtgg gccgcgccgc tggc 54 <210> 119 <211> 51 <212> DNA <213> Human <400> 119 tggtacaagc acgtggcgag tccccgctac cacacggtgg gccgcgccgc t 51 <210> 120 <211> 48 <212> DNA <213> Human <400> 120 tggtacaagc acgtggcgag tccccgctac cacacggtgg gccgcgcc 48 <210> 121 <211> 66 <212> DNA <213> Human <400> 121 tacaagcacg tggcgagtcc ccgctaccac acggtgggcc gcgccgctgg cctgctcatg 60 gggctg 66 <210> 122 <211> 60 <212> DNA <213> Human <400> 122 cacgtggcga gtccccgcta ccacacggtg ggccgcgccg ctggcctgct catggggctg 60 <210> 123 <211> 45 <212> DNA <213> Human <400> 123 cgctaccaca cggtgggccg cgccgctggc ctgctcatgg ggctg 45 <210> 124 <211> 27 <212> DNA <213> Human <400> 124 cgcgccgctg gcctgctcat ggggctg 27 <210> 125 <211> 51 <212> DNA <213> Porcine <400> 125 tggtacaagc acacggcgag tccccgctac cacacggtgg gccgcgccgc g 51 <210> 126 <211> 69 <212> DNA <213> Human <400> 126 tggtacaagc acgtggcgag tccccgctac cacacggtgg gccgcgccgc tggcctgctc 60 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cagcctggct cctctgccgc tgccgcagcc actggcggta 120 gcagtgcctg tcgtctacgg ggtaatttgc gccgtgggac tggctggcaa ctctgcggtg 180 ctgtacgtac tgctgcgcac gccgcgcatg aagactgtca ccaacgtgtt catcctcaac 240 ctggctatcg ccgatgagct cttcaccctc gtgctgccca tcaacatcgc ggacttcctg 300 ctgaggcgct ggcccttcgg ggaggtcatg tgcaagctca ttgtagccgt cgaccagtac 360 aacactttct ctagcctcta cttcctcgcc gtcatgagcg ccgaccgata cctggtggtt 420 ctggccacag cagagtcgcg ccgggtgtcc gggcgcactt acggtgcagc gcgtgctgtc 480 agtctggcgg tgtgggcgct ggtgacgctg gtcgtgctgc cctttgcggt attcgctcgg 540 ctggacgagg agcagggtcg gcgccagtgc gtgctggtct tcccgcagcc cgaggccttc 600 tggtggcgtg ccagccgtct ctacacacta gtattgggct ttgccatccc ggtgaccacc 660 atctgtgctc tctataccac tctgctctgc cgactgcgtg ctatccagct agatagccac 720 gccaaggccc tggatcgtgc caagaagcgc gtgaccttgt tggtggcggc gattctggct 780 gtgtgcctcc tctgctggac gccttatcac ctgagtacca tagtggccct caccaccgac 840 ctcccgcaaa cgccgctggt catcggcatc tcttacttca tcaccagcct gagctatgct 900 aacagctgcc tcaacccttt cctctatgcc ttcctggacg acagcttccg cagaagcctc 960 cggcaattgg tgtcatgccg ttcagcc 987 <210> 140 <211> 23 <212> PRT <213> Human <400> 140 Trp Tyr Lys Pro Ala Ala Gly His Ser Ser Tyr Ser Val Gly Arg Ala 5 10 15 Ala Gly Leu Leu Ser Gly Leu 20 <210> 141 <211> 24 <212> PRT <213> Mouse <400> 141 Trp Tyr Lys Pro Ala Ala Gly Pro His His Tyr Ser Val Gly Arg Ala 5 10 15 Ser Gly Leu Leu Ser Ser Phe His 20 <210> 142 <211> 24 <212> PRT <213> Rat <400> 142 Trp Tyr Lys Pro Ala Ala Gly Ser His His Tyr Ser Val Gly Arg Ala 5 10 15 Ala Gly Leu Leu Ser Ser Phe His 20 <210> 143 <211> 29 <212> PRT <213> Human <400> 143 Trp Tyr Lys Pro Ala Ala Gly His Ser Ser Tyr Ser Val Gly Arg Ala 5 10 15 Ala Gly Leu Leu Ser Gly Leu Arg Arg Ser Pro Tyr Ala 20 25 <210> 144 <211> 29 <212> PRT <213> Mouse <400> 144 Trp Tyr Lys Pro Ala Ala Gly Pro His His Tyr Ser Val Gly Arg Ala 5 10 15 Ser Gly Leu Leu Ser Ser Phe His Arg Phe Pro Ser Thr 20 25 <210> 145 <211> 29 <212> PRT <213> Rat <400> 145 Trp Tyr Lys Pro Ala Ala Gly Ser His His Tyr Ser Val Gly Arg Ala 5 10 15 Ala Gly Leu Leu Ser Ser Phe His Arg Phe Pro Ser Thr 20 25 <210> 146 <211> 13 <212> PRT <213> Human <400> 146 Trp Tyr Lys Pro Ala Ala Gly His Ser Ser Tyr Ser Val 5 10 <210> 147 <211> 14 <212> PRT <213> Human <400> 147 Trp Tyr Lys Pro Ala Ala Gly His Ser Ser Tyr Ser Val Gly 5 10 <210> 148 <211> 13 <212> PRT <213> Mouse <400> 148 Trp Tyr Lys Pro Ala Ala Gly Pro His His Tyr Ser Val 5 10 <210> 149 <211> 14 <212> PRT <213> Mouse <400> 149 Trp Tyr Lys Pro Ala Ala Gly Pro His His Tyr Ser Val Gly 5 10 <210> 150 <211> 13 <212> PRT <213> Rat <400> 150 Trp Tyr Lys Pro Ala Ala Gly Ser His His Tyr Ser Val 5 10 <210> 151 <211> 14 <212> PRT <213> Rat <400> 151 Trp Tyr Lys Pro Ala Ala Gly Ser His His Tyr Ser Val Gly 5 10 <210> 152 <211> 70 <212> PRT <213> Human <400> 152 Ser Gln Pro Tyr Arg Gly Ala Glu Pro Pro Gly Gly Ala Gly Ala Ser 5 10 15 Pro Glu Leu Gln Leu His Pro Arg Leu Arg Ser Leu Ala Val Cys Val 20 25 30 Gln Asp Val Ala Pro Asn Leu Gln Arg Cys Glu Arg Leu Pro Asp Gly 35 40 45 Arg Gly Thr Tyr Gln Cys Lys Ala Asn Val Phe Leu Ser Leu Arg Ala 50 55 60 Ala Asp Cys Leu Ala Ala 65 70 <210> 153 <211> 67 <212> PRT <213> Mouse <400> 153 Ser Glu Ser Pro Ala Leu Arg Val Gly Thr Gly Pro Leu Arg Asn Leu 5 10 15 Glu Met Arg Pro Ser Val Arg Ser Leu Ala Leu Cys Val Lys Asp Val 20 25 30 Thr Pro Asn Leu Gln Ser Cys Gln Arg Gln Leu Asn Ser Arg Gly Thr 35 40 45 Phe Gln Cys Lys Ala Asp Val Phe Leu Ser Leu His Glu Thr Asp Cys 50 55 60 Gln Ser Thr 65 <210> 154 <211> 67 <212> PRT <213> Rat <400> 154 Ser Glu Ser Pro Ala Leu Arg Val Gly Thr Val Pro Leu Arg Asn Leu 5 10 15 Glu Met Arg Pro Ser Val Arg Ser Leu Ala Leu Cys Val Lys Asp Val 20 25 30 Thr Pro Asn Leu Gln Ser Cys Gln Arg Gln Leu Asn Ser Arg Gly Thr 35 40 45 Phe Gln Cys Lys Ala Asp Val Phe Leu Ser Leu His Lys Ala Glu Cys 50 55 60 Gln Ser Ala 65 <210> 155 <211> 44 <212> PRT <213> Human <400> 155 Ser Leu Ala Val Cys Val Gln Asp Val Ala Pro Asn Leu Gln Arg Cys 5 10 15 Glu Arg Leu Pro Asp Gly Arg Gly Thr Tyr Gln Cys Lys Ala Asn Val 20 25 30 Phe Leu Ser Leu Arg Ala Ala Asp Cys Leu Ala Ala 35 40 <210> 156 <211> 44 <212> PRT <213> Mouse <400> 156 Ser Leu Ala Leu Cys Val Lys Asp Val Thr Pro Asn Leu Gln Ser Cys 5 10 15 Gln Arg Gln Leu Asn Ser Arg Gly Thr Phe Gln Cys Lys Ala Asp Val 20 25 30 Phe Leu Ser Leu His Glu Thr Asp Cys Gln Ser Thr 35 40 <210> 157 <211> 44 <212> PRT <213> Rat <400> 157 Ser Leu Ala Leu Cys Val Lys Asp Val Thr Pro Asn Leu Gln Ser Cys 5 10 15 Gln Arg Gln Leu Asn Ser Arg Gly Thr Phe Gln Cys Lys Ala Asp Val 20 25 30 Phe Leu Ser Leu His Lys Ala Glu Cys Gln Ser Ala 35 40 <210> 158 <211> 69 <212> DNA <213> Human <400> 158 tggtacaagc cagcggcggg gcacagctcc tactcggtgg gccgcgccgc ggggctgctg 60 tccggcctc 69 <210> 159 <211> 72 <212> DNA <213> Mouse <400> 159 tggtacaagc ccgcggcggg accccaccac tactcggtgg gccgcgcctc ggggctactg 60 tcgagtttcc ac 72 <210> 160 <211> 72 <212> DNA <213> Rat <400> 160 tggtacaagc ccgcggcggg atcccaccac tactcggtgg gccgcgctgc ggggctactg 60 tcgagtttcc ac 72 <210> 161 <211> 87 <212> DNA <213> Human <400> 161 tggtacaagc cagcggcggg gcacagctcc tactcggtgg gccgcgccgc ggggctgctg 60 tccggcctcc gcaggtcccc gtacgcg 87 <210> 162 <211> 87 <212> DNA <213> Mouse <400> 162 tggtacaagc ccgcggcggg accccaccac tactcggtgg gccgcgcctc ggggctactg 60 tcgagtttcc acaggttccc gtccacg 87 <210> 163 <211> 87 <212> DNA <213> Rat <400> 163 tggtacaagc ccgcggcggg atcccaccac tactcggtgg gccgcgctgc ggggctactg 60 tcgagtttcc acaggttccc atccacg 87 <210> 164 <211> 39 <212> DNA <213> Human <400> 164 tggtacaagc cagcggcggg gcacagctcc tactcggtg 39 <210> 165 <211> 42 <212> DNA <213> Human <400> 165 tggtacaagc cagcggcggg gcacagctcc tactcggtgg gc 42 <210> 166 <211> 39 <212> DNA <213> Mouse <400> 166 tggtacaagc ccgcggcggg accccaccac tactcggtg 39 <210> 167 <211> 42 <212> DNA <213> Mouse <400> 167 tggtacaagc ccgcggcggg accccaccac tactcggtgg gc 42 <210> 168 <211> 39 <212> DNA <213> Rat <400> 168 tggtacaagc ccgcggcggg atcccaccac tactcggtg 39 <210> 169 <211> 42 <212> DNA <213> Rat <400> 169 tggtacaagc ccgcggcggg atcccaccac tactcggtgg gc 42 <210> 170 <211> 210 <212> DNA <213> Human <400> 170 tcccagccct acagaggggc ggaacccccg ggcggggccg gcgcctcccc ggagctgcaa 60 ctgcacccca ggctgcggag cctcgctgtg tgcgtccagg acgtcgcccc aaacctgcag 120 aggtgcgagc ggctccccga cggccgcggg acctaccagt gcaaggcgaa cgtcttcctg 180 tccctgcgcg cagccgactg cctcgccgcc 210 <210> 171 <211> 201 <212> DNA <213> Mouse <400> 171 tccgagtctc cagcactccg ggtgggaacc ggacctctgc gcaatttaga gatgcgcccc 60 agcgtaagga gccttgccct gtgtgtcaaa gatgtgaccc cgaacctgca gagctgccag 120 cggcaactca acagccgagg gactttccag tgtaaagcgg acgtcttctt gtcgctgcac 180 gagactgatt gccagagcac c 201 <210> 172 <211> 201 <212> DNA <213> Rat <400> 172 tccgagtctc cagcactccg ggtgggaacc gtacctctgc gcaacttgga gatgcgccca 60 agcgtaagaa gccttgccct gtgtgtcaaa gatgtgaccc cgaacctgca gagctgccag 120 cggcaactca acagccgagg gactttccag tgtaaggcgg acgtcttctt gtcgctgcac 180 aaggctgaat gccaaagcgc c 201 <210> 173 <211> 132 <212> DNA <213> Human <400> 173 agcctcgctg tgtgcgtcca ggacgtcgcc ccaaacctgc agaggtgcga gcggctcccc 60 gacggccgcg ggacctacca gtgcaaggcg aacgtcttcc tgtccctgcg cgcagccgac 120 tgcctcgccg cc 132 <210> 174 <211> 132 <212> DNA <213> Mouse <400> 174 agccttgccc tgtgtgtcaa agatgtgacc ccgaacctgc agagctgcca gcggcaactc 60 aacagccgag ggactttcca gtgtaaagcg gacgtcttct tgtcgctgca cgagactgat 120 tgccagagca cc 132 <210> 175 <211> 132 <212> DNA <213> Rat <400> 175 agccttgccc tgtgtgtcaa agatgtgacc ccgaacctgc agagctgcca gcggcaactc 60 aacagccgag ggactttcca gtgtaaggcg gacgtcttct tgtcgctgca caaggctgaa 120 tgccaaagcg cc 132 <210> 176 <211> 125 <212> PRT <213> Human <400> 176 Met Ala Arg Ser Ala Thr Leu Ala Ala Ala Ala Leu Ala Leu Cys Leu 5 10 15 Leu Leu Ala Pro Pro Gly Leu Ala Trp Tyr Lys Pro Ala Ala Gly His 20 25 30 Ser Ser Tyr Ser Val Gly Arg Ala Ala Gly Leu Leu Ser Gly Leu Arg 35 40 45 Arg Ser Pro Tyr Ala Arg Arg Ser Gln Pro Tyr Arg Gly Ala Glu Pro 50 55 60 Pro Gly Gly Ala Gly Ala Ser Pro Glu Leu Gln Leu His Pro Arg Leu 65 70 75 80 Arg Ser Leu Ala Val Cys Val Gln Asp Val Ala Pro Asn Leu Gln Arg 85 90 95 Cys Glu Arg Leu Pro Asp Gly Arg Gly Thr Tyr Gln Cys Lys Ala Asn 100 105 110 Val Phe Leu Ser Leu Arg Ala Ala Asp Cys Leu Ala Ala 115 120 125 <210> 177 <211> 119 <212> PRT <213> Mouse <400> 177 Met Ala Arg Cys Arg Thr Leu Val Ala Ala Ala Leu Ala Leu Leu Leu 5 10 15 Pro Pro Ala Leu Ala Trp Tyr Lys Pro Ala Ala Gly Pro His His Tyr 20 25 30 Ser Val Gly Arg Ala Ser Gly Leu Leu Ser Ser Phe His Arg Phe Pro 35 40 45 Ser Thr Arg Arg Ser Glu Ser Pro Ala Leu Arg Val Gly Thr Gly Pro 50 55 60 Leu Arg Asn Leu Glu Met Arg Pro Ser Val Arg Ser Leu Ala Leu Cys 65 70 75 80 Val Lys Asp Val Thr Pro Asn Leu Gln Ser Cys Gln Arg Gln Leu Asn 85 90 95 Ser Arg Gly Thr Phe Gln Cys Lys Ala Asp Val Phe Leu Ser Leu His 100 105 110 Glu Thr Asp Cys Gln Ser Thr 115 119 <210> 178 <211> 119 <212> PRT <213> Rat <400> 178 Met Val Arg Cys Arg Thr Leu Val Ala Ala Ala Leu Ala Leu Leu Leu 5 10 15 Thr Pro Ala Leu Ala Trp Tyr Lys Pro Ala Ala Gly Ser His His Tyr 20 25 30 Ser Val Gly Arg Ala Ala Gly Leu Leu Ser Ser Phe His Arg Phe Pro 35 40 45 Ser Thr Arg Arg Ser Glu Ser Pro Ala Leu Arg Val Gly Thr Val Pro 50 55 60 Leu Arg Asn Leu Glu Met Arg Pro Ser Val Arg Ser Leu Ala Leu Cys 65 70 75 80 Val Lys Asp Val Thr Pro Asn Leu Gln Ser Cys Gln Arg Gln Leu Asn 85 90 95 Ser Arg Gly Thr Phe Gln Cys Lys Ala Asp Val Phe Leu Ser Leu His 100 105 110 Lys Ala Glu Cys Gln Ser Ala 115 119 <210> 179 <211> 375 <212> DNA <213> Human <400> 179 atggcccggt ccgcgacact ggcggccgcc gccctggcgc tgtgcctgct gctggcgccg 60 cctggcctcg cgtggtacaa gccagcggcg gggcacagct cctactcggt gggccgcgcc 120 gcggggctgc tgtccggcct ccgcaggtcc ccgtacgcgc ggcgctccca gccctacaga 180 ggggcggaac ccccgggcgg ggccggcgcc tccccggagc tgcaactgca ccccaggctg 240 cggagcctcg ctgtgtgcgt ccaggacgtc gccccaaacc tgcagaggtg cgagcggctc 300 cccgacggcc gcgggaccta ccagtgcaag gcgaacgtct tcctgtccct gcgcgcagcc 360 gactgcctcg ccgcc 375 <210> 180 <211> 357 <212> DNA <213> Mouse <400> 180 atggcccggt gtaggacgct ggtggccgct gccctggcgc tgctcctgcc gccagccctc 60 gcgtggtaca agcccgcggc gggaccccac cactactcgg tgggccgcgc ctcggggcta 120 ctgtcgagtt tccacaggtt cccgtccacg cgacgctccg agtctccagc actccgggtg 180 ggaaccggac ctctgcgcaa tttagagatg cgccccagcg taaggagcct tgccctgtgt 240 gtcaaagatg tgaccccgaa cctgcagagc tgccagcggc aactcaacag ccgagggact 300 ttccagtgta aagcggacgt cttcttgtcg ctgcacgaga ctgattgcca gagcacc 357 <210> 181 <211> 357 <212> DNA <213> Rat <400> 181 atggtccggt gtaggacgct ggtggccgcc gccctggcgc tgctcctgac gccagccctc 60 gcgtggtaca agcccgcggc gggatcccac cactactcgg tgggccgcgc tgcggggcta 120 ctgtcgagtt tccacaggtt cccatccacg cgacgttccg agtctccagc actccgggtg 180 ggaaccgtac ctctgcgcaa cttggagatg cgcccaagcg taagaagcct tgccctgtgt 240 gtcaaagatg tgaccccgaa cctgcagagc tgccagcggc aactcaacag ccgagggact 300 ttccagtgta aggcggacgt cttcttgtcg ctgcacaagg ctgaatgcca aagcgcc 357 <210> 182 <211> 328 <212> PRT <213> Human <400> 182 Met Asp Asn Ala Ser Phe Ser Glu Pro Trp Pro Ala Asn Ala Ser Gly 1 5 10 15 Pro Asp Pro Ala Leu Ser Cys Ser Asn Ala Ser Thr Leu Ala Pro Leu 20 25 30 Pro Ala Pro Leu Ala Val Ala Val Pro Val Val Tyr Ala Val Ile Cys 35 40 45 Ala Val Gly Leu Ala Gly Asn Ser Ala Val Leu Tyr Val Leu Leu Arg 50 55 60 Ala Pro Arg Met Lys Thr Val Thr Asn Leu Phe Ile Leu Asn Leu Ala 65 70 75 80 Ile Ala Asp Glu Leu Phe Thr Leu Val Leu Pro Ile Asn Ile Ala Asp 85 90 95 Phe Leu Leu Arg Gln Trp Pro Phe Gly Glu Leu Met Cys Lys Leu Ile 100 105 110 Val Ala Ile Asp Gln Tyr Asn Thr Phe Ser Ser Leu Tyr Phe Leu Thr 115 120 125 Val Met Ser Ala Asp Arg Tyr Leu Val Val Leu Ala Thr Ala Glu Ser 130 135 140 Arg Arg Val Ala Gly Arg Thr Tyr Ser Ala Ala Arg Ala Val Ser Leu 145 150 155 160 Ala Val Trp Gly Ile Val Thr Leu Val Val Leu Pro Phe Ala Val Phe 165 170 175 Ala Arg Leu Asp Asp Glu Gln Gly Arg Arg Gln Cys Val Leu Val Phe 180 185 190 Pro Gln Pro Glu Ala Phe Trp Trp Arg Ala Ser Arg Leu Tyr Thr Leu 195 200 205 Val Leu Gly Phe Ala Ile Pro Val Ser Thr Ile Cys Val Leu Tyr Thr 210 215 220 Thr Leu Leu Cys Arg Leu His Ala Met Arg Leu Asp Ser His Ala Lys 225 230 235 240 Ala Leu Glu Arg Ala Lys Lys Arg Val Thr Phe Leu Val Val Ala Ile 245 250 255 Leu Ala Val Cys Leu Leu Cys Trp Thr Pro Tyr His Leu Ser Thr Val 260 265 270 Val Ala Leu Thr Thr Asp Leu Pro Gln Thr Pro Leu Val Ile Ala Ile 275 280 285 Ser Tyr Phe Ile Thr Ser Leu Ser Tyr Ala Asn Ser Cys Leu Asn Pro 290 295 300 Phe Leu Tyr Ala Phe Leu Asp Ala Ser Phe Arg Arg Asn Leu Arg Gln 305 310 315 320 Leu Ile Thr Cys Arg Ala Ala Ala 325 328 <210> 183 <211> 1000 <212> DNA <213> Human <400> 183 atcgatatgg acaacgcctc gttctcggag ccctggcccg ccaacgcatc gggcccggac 60 ccggcgctga gctgctccaa cgcgtcgact ctggcgccgc tgccggcgcc gctggcggtg 120 gctgtaccag ttgtctacgc ggtgatctgc gccgtgggtc tggcgggcaa ctccgccgtg 180 ctgtacgtgt tgctgcgggc gccccgcatg aagaccgtca ccaacctgtt catcctcaac 240 ctggccatcg ccgacgagct cttcacgctg gtgctgccca tcaacatcgc cgacttcctg 300 ctgcggcagt ggcccttcgg ggagctcatg tgcaagctca tcgtggctat cgaccagtac 360 aacaccttct ccagcctcta cttcctcacc gtcatgagcg ccgaccgcta cctggtggtg 420 ttggccactg cggagtcgcg ccgggtggcc ggccgcacct acagcgccgc gcgcgcggtg 480 agcctggccg tgtgggggat cgtcacactc gtcgtgctgc ccttcgcagt cttcgcccgg 540 ctagacgacg agcagggccg gcgccagtgc gtgctagtct ttccgcagcc cgaggccttc 600 tggtggcgcg cgagccgcct ctacacgctc gtgctgggct tcgccatccc cgtgtccacc 660 atctgtgtcc tctataccac cctgctgtgc cggctgcatg ccatgcggct ggacagccac 720 gccaaggccc tggagcgcgc caagaagcgg gtgaccttcc tggtggtggc aatcctggcg 780 gtgtgcctcc tctgctggac gccctaccac ctgagcaccg tggtggcgct caccaccgac 840 ctcccgcaga cgccgctggt catcgctatc tcctacttca tcaccagcct gagctacgcc 900 aacagctgcc tcaacccctt cctctacgcc ttcctggacg ccagcttccg caggaacctc 960 cgccagctga taacttgccg cgcggcagcc tgacactagt 1000 <210> 184 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 184 gtcgacatgg cccggtccgc gacactggcg gcc 33 <210> 185 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 185 gctagcagcg gtgccaggag aggtccgggc tca 33 <210> 186 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 186 gtcgacagct ccatggcccg gtgtaggacg ctg 33 <210> 187 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 187 gctagctcag gtgctctggc aatcagtctc gtg 33 <210> 188 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 188 cacggctcca tggtccggtg taggacg 27 <210> 189 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 189 cagcgtcgag gtttgggttg gggttca 27 <210> 190 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 190 atcgatatgg acaacgcctc gttctcggag cc 32 <210> 191 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 191 actagtgtca ggctgccgcg cggcaagtta tc 32
【図面の簡単な説明】
【図１】ＴＧＲ２６をコードするＤＮＡの塩基配列およ
びＴＧＲ２６のアミノ酸配列を示す図である（図２につ
づく）。
【図２】ＴＧＲ２６をコードするＤＮＡの塩基配列およ
びＴＧＲ２６のアミノ酸配列を示す図である（図１のつ
づき）。
【図３】ＴＧＲ２６の疎水性プロット図である。
【図４】ｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）およびｈＧＰＲ８Ｌ
（１−３０）のＣＨＯ／ＴＧＲ２６細胞に対するｃＡＭ
Ｐ産生抑制活性を示す図である。図中、−○−は、ｈＧ
ＰＲ８Ｌ（１−２３）を投与した場合を、−△−は、ｈ
ＧＰＲ８Ｌ（１−３０）を投与した場合を示す。
【図５】ｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）およびｈＧＰＲ８Ｌ
（１−３０）のＣＨＯ／ＴＧＲ２６細胞膜画分に対する
ＧＴＰγＳ結合促進活性を示す図である。図中、−○−
は、ｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）を投与した場合を、−△
−は、ｈＧＰＲ８Ｌ（１−３０）を混合した場合を示
す。
【図６】ＧＰＲ８リガンドペプチドの摂食量に対する作
用を示す。各値は平均値±ＳＥＭを示す（ｎ＝１０）。
【図７】［125Ｉ］で標識した２３残基のヒトＧＰＲ８
リガンドのＴＧＲ２６発現ＣＨＯ細胞から調製した細胞
膜画分への結合に対する種々の濃度のｈＧＰＲ８Ｌ（１
−２３）およびｈＧＰＲ８Ｌ（１−３０）の結合阻害活
性を示す図を示す。図中、−○−は、ｈＧＰＲ８Ｌ（１
−２３）を投与した場合を、−△−は、ｈＧＰＲ８Ｌ
（１−３０）を投与した場合を示す。
【図８】ヒト型ＧＰＲ７リガンド前駆体ＨのＤＮＡ配列
を示す。
【図９】ヒト型ＧＰＲ７リガンド前駆体Ｈのアミノ酸配
列を示す。
【図１０】マウス型ＧＰＲ７リガンド前駆体ＨのＤＮＡ
配列を示す。
【図１１】マウス型ＧＰＲ７リガンド前駆体Ｈのアミノ
酸配列を示す。
【図１２】ラット型ＧＰＲ７リガンド前駆体ＨのＤＮＡ
配列を示す。
【図１３】ラット型ＧＰＲ７リガンド前駆体Ｈのアミノ
酸配列を示す。
【図１４】ヒト型、ラット型およびマウス型ＧＰＲ７リ
ガンド前駆体Ｈの比較図を示す。一致するアミノ酸はボ
ックスで囲む。また矢印は分泌シグナルの予想される切
断部位を示す。
【図１５】リガンド発現ベクターｐＡＫ−Ｓ６４および
空の発現ベクター（ｐＡＫＫＯ−１１１Ｈ）を発現させ
たＣＨＯ細胞の培養上清を、ＧＰＲ７ｃＤＮＡを挿入し
た発現プラスミドを一過性に発現させたＣＨＯ細胞の培
地にホルスコリン（ＦＳＫ）とともに添加し、リガンド
刺激によるルシフェラーゼ活性の抑制を検出した結果を
示す。
【図１６】Ｓ６４を一過性に発現させたＣＨＯ細胞の培
養上清を、ＴＧＲ２６を一過性に発現させたＣＨＯ細胞
の培地にＦＳＫと共に添加した際のルシフェラーゼ活性
の抑制を検出した結果を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 48/00 Ａ６１Ｐ 3/06 ４Ｃ０８４ Ａ６１Ｐ 3/04 3/10 ４Ｃ０８６ 3/06 5/00 ４Ｈ０４５ 3/10 5/06 5/00 5/14 5/06 9/10 5/14 15/00 9/10 25/00 １０１ 15/00 25/18 25/00 １０１ 35/00 25/18 43/00 １１１ 35/00 Ｃ０７Ｋ 14/705 43/00 １１１ 16/28 Ｃ０７Ｋ 14/705 Ｃ１２Ｎ 1/15 16/28 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｚ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｐ 21/02 33/50 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/68 33/53 Ｄ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｍ 33/50 33/566 33/53 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 5/00 Ａ 33/566 Ｂ Ａ６１Ｋ 37/02 (31)優先権主張番号 特願2001−270838(P2001−270838) (32)優先日 平成13年９月６日(2001．9．6) (33)優先権主張国 日本（ＪＰ） (72)発明者 原田 美穂子 茨城県つくば市東２丁目14番地５ 仕黒マ ンション201号 (72)発明者 下村 行生 茨城県つくば市松代３丁目12番地１ 武田 松代レジデンス410号 (72)発明者 森 正明 茨城県つくば市春日３丁目８番地５ Ｆターム(参考） 2G045 AA25 AA29 AA40 BB20 CA25 CB01 CB17 CB26 DA12 DA13 DA14 DA36 DA77 FB02 FB03 FB04 FB07 4B024 AA01 BA63 CA04 CA09 CA12 DA02 HA17 4B063 QA01 QQ08 QQ43 QQ53 QR32 QR36 QR77 QS25 QS34 QX02 QX07 4B064 AG20 CA19 CC24 DA01 4B065 AA91X AA91Y AA93Y AB01 CA24 CA44 4C084 AA02 AA06 AA07 AA13 AA17 BA01 BA08 BA22 BA23 MA01 NA14 ZA022 ZA162 ZA402 ZA422 ZA702 ZB262 ZC022 ZC042 ZC062 ZC212 ZC332 ZC352 4C086 AA01 AA02 AA03 AA04 EA16 MA01 MA04 NA14 ZA02 ZA16 ZA40 ZA42 ZA70 ZB26 ZC02 ZC04 ZC06 ZC21 ZC33 ZC35 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 CA45 EA21 FA74

Claims (54)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 配列番号：１または配列番号：１３８で
    表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のア
    ミノ酸配列を含有することを特徴とするＧタンパク質共
    役型レセプタータンパク質またはその塩。
  2. 【請求項２】 配列番号：１で表されるアミノ酸配列を
    含有することを特徴とする請求項１記載のＧタンパク質
    共役型レセプタータンパク質。
  3. 【請求項３】 配列番号：１３８で表されるアミノ酸配
    列を含有することを特徴とする請求項１記載のＧタンパ
    ク質共役型レセプタータンパク質。
  4. 【請求項４】 請求項１記載のＧタンパク質共役型レセ
    プタータンパク質の部分ペプチドまたはその塩。
  5. 【請求項５】 請求項１記載のＧタンパク質共役型レセ
    プタータンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有
    するポリヌクレオチド。
  6. 【請求項６】 ＤＮＡである請求項５記載のポリヌクレ
    オチド。
  7. 【請求項７】 配列番号：２または配列番号：１３９で
    表される塩基配列を含有する請求項６記載のＤＮＡ。
  8. 【請求項８】 請求項５記載のポリヌクレオチドを含有
    する組換えベクター。
  9. 【請求項９】 請求項８記載の組換えベクターで形質転
    換させた形質転換体。
  10. 【請求項１０】 請求項９記載の形質転換体を培養し、
    請求項１記載のＧタンパク質共役型レセプタータンパク
    質を生成せしめることを特徴とする請求項１記載のＧタ
    ンパク質共役型レセプタータンパク質またはその塩の製
    造法。
  11. 【請求項１１】 請求項１記載のＧタンパク質共役型レ
    セプタータンパク質もしくは請求項４記載の部分ペプチ
    ドまたはそれらの塩に対する抗体。
  12. 【請求項１２】 請求項１記載のＧタンパク質共役型レ
    セプタータンパク質のシグナル伝達を不活性化する中和
    抗体である請求項１１記載の抗体。
  13. 【請求項１３】 請求項１１記載の抗体を含有してなる
    診断薬。
  14. 【請求項１４】 請求項１記載のＧタンパク質共役型レ
    セプタータンパク質もしくは請求項４記載の部分ペプチ
    ドまたはそれらの塩を用いることにより得られうる請求
    項１記載のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質ま
    たはその塩に対するリガンド。
  15. 【請求項１５】 請求項１４記載のＧタンパク質共役型
    レセプターのリガンドを含有してなる医薬。
  16. 【請求項１６】 請求項１記載のＧタンパク質共役型レ
    セプタータンパク質もしくは請求項４記載の部分ペプチ
    ドまたはそれらの塩を用いることを特徴とする請求項１
    記載のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質または
    その塩に対するリガンドの決定方法。
  17. 【請求項１７】 請求項１記載のＧタンパク質共役型レ
    セプタータンパク質もしくは請求項４記載の部分ペプチ
    ドまたはそれらの塩を用いることを特徴とするリガンド
    と請求項１記載のＧタンパク質共役型レセプタータンパ
    ク質またはその塩との結合性を変化させる化合物または
    その塩のスクリーニング方法。
  18. 【請求項１８】 請求項１記載のＧタンパク質共役型レ
    セプタータンパク質もしくは請求項４記載の部分ペプチ
    ドまたはそれらの塩を含有することを特徴とするリガン
    ドと請求項１記載のＧタンパク質共役型レセプタータン
    パク質またはその塩との結合性を変化させる化合物また
    はその塩のスクリーニング用キット。
  19. 【請求項１９】 請求項１７記載のスクリーニング方法
    または請求項１８記載のスクリーニング用キットを用い
    て得られうるリガンドと請求項１記載のＧタンパク質共
    役型レセプタータンパク質またはその塩との結合性を変
    化させる化合物またはその塩。
  20. 【請求項２０】 請求項１７記載のスクリーニング方法
    または請求項１８記載のスクリーニング用キットを用い
    て得られうるリガンドと請求項１記載のＧタンパク質共
    役型レセプタータンパク質またはその塩との結合性を変
    化させる化合物またはその塩を含有してなる医薬。
  21. 【請求項２１】 請求項５記載のポリヌクレオチドとハ
    イストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリ
    ヌクレオチド。
  22. 【請求項２２】 請求項５記載のポリヌクレオチドと相
    補的な塩基配列またはその一部を含有してなるポリヌク
    レオチド。
  23. 【請求項２３】 請求項５記載のポリヌクレオチドまた
    はその一部を用いることを特徴とする請求項１記載のＧ
    タンパク質共役型レセプタータンパク質のｍＲＮＡの定
    量方法。
  24. 【請求項２４】 請求項１１記載の抗体を用いることを
    特徴とする請求項１記載のＧタンパク質共役型レセプタ
    ータンパク質の定量方法。
  25. 【請求項２５】 請求項２３または請求項２４記載の定
    量方法を用いることを特徴とする請求項１記載のＧタン
    パク質共役型レセプターの機能が関連する疾患の診断方
    法。
  26. 【請求項２６】 請求項２３記載の定量方法を用いるこ
    とを特徴とする請求項１記載のＧタンパク質共役型レセ
    プタータンパク質の発現量を変化させる化合物またはそ
    の塩のスクリーニング方法。
  27. 【請求項２７】 請求項２４記載の定量方法を用いるこ
    とを特徴とする細胞膜における請求項１記載のＧタンパ
    ク質共役型レセプタータンパク質量を変化させる化合物
    またはその塩のスクリーニング方法。
  28. 【請求項２８】 請求項２６記載のスクリーニング方法
    を用いて得られうる請求項１記載のＧタンパク質共役型
    レセプタータンパク質の発現量を変化させる化合物また
    はその塩。
  29. 【請求項２９】 請求項２７記載のスクリーニング方法
    を用いて得られうる細胞膜における請求項１記載のＧタ
    ンパク質共役型レセプタータンパク質量を変化させる化
    合物またはその塩。
  30. 【請求項３０】（ｉ）請求項１記載のＧタンパク質共役
    型レセプタータンパク質もしくはその塩または請求項４
    記載の部分ペプチドもしくはその塩と、リガンドとを接
    触させた場合と、（ii）請求項１記載のＧタンパク質共
    役型レセプタータンパク質もしくはその塩または請求項
    ４記載の部分ペプチドもしくはその塩と、リガンドおよ
    び試験化合物とを接触させた場合との比較を行なうこと
    を特徴とする請求項１７記載のスクリーニング方法。
  31. 【請求項３１】リガンドが、配列番号：８で表されるア
    ミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を
    含有するポリペプチドである請求項３０記載のスクリー
    ニング方法。
  32. 【請求項３２】リガンドが、配列番号：８で表されるア
    ミノ酸配列を含有するポリペプチドである請求項３０記
    載のスクリーニング方法。
  33. 【請求項３３】リガンドが、配列番号：８で表されるア
    ミノ酸配列を有するポリペプチドである請求項３０記載
    のスクリーニング方法。
  34. 【請求項３４】リガンドが、配列番号：９で表されるア
    ミノ酸配列を有するポリペプチドである請求項３０記載
    のスクリーニング方法。
  35. 【請求項３５】肥満の診断薬である請求項１３記載の診
    断薬。
  36. 【請求項３６】抗肥満薬である請求項１５または請求項
    ２０記載の医薬。
  37. 【請求項３７】食欲増進剤である請求項１５または請求
    項２０記載の医薬。
  38. 【請求項３８】プロラクチン産生抑制剤である請求項１
    ５または請求項２０記載の医薬。
  39. 【請求項３９】哺乳動物に対し、請求項１９記載の、リ
    ガンドと請求項１記載のＧタンパク質共役型レセプター
    タンパク質またはその塩との結合性を変化させる化合物
    またはその塩の有効量を投与することを特徴とする肥満
    の予防・治療方法。
  40. 【請求項４０】哺乳動物に対し、請求項１９記載の、リ
    ガンドと請求項１記載のＧタンパク質共役型レセプター
    タンパク質またはその塩との結合性を変化させる化合物
    またはその塩の有効量を投与することを特徴とする食欲
    増進方法。
  41. 【請求項４１】哺乳動物に対し、請求項１９記載の、リ
    ガンドと請求項１記載のＧタンパク質共役型レセプター
    タンパク質またはその塩との結合性を変化させる化合物
    またはその塩の有効量を投与することを特徴とするプロ
    ラクチン産生抑制方法。
  42. 【請求項４２】抗肥満薬を製造するための、請求項１９
    記載の、リガンドと請求項１記載のＧタンパク質共役型
    レセプタータンパク質またはその塩との結合性を変化さ
    せる化合物またはその塩の使用。
  43. 【請求項４３】食欲増進剤を製造するための、請求項１
    ９記載の、リガンドと請求項１記載のＧタンパク質共役
    型レセプタータンパク質またはその塩との結合性を変化
    させる化合物またはその塩の使用。
  44. 【請求項４４】プロラクチン産生抑制剤を製造するため
    の、請求項１９記載の、リガンドと請求項１記載のＧタ
    ンパク質共役型レセプタータンパク質またはその塩との
    結合性を変化させる化合物またはその塩の使用。
  45. 【請求項４５】外来性の、請求項１記載のＧタンパク質
    共役型レセプタータンパク質をコードするＤＮＡまたは
    その変異ＤＮＡを有する非ヒトトランスジェニック動
    物。
  46. 【請求項４６】非ヒト動物がゲッ歯動物である請求項４
    ５記載の動物。
  47. 【請求項４７】ゲッ歯動物がマウスまたはラットである
    請求項４６記載の動物。
  48. 【請求項４８】外来性の、請求項１のＧタンパク質共役
    型レセプタータンパク質をコードするＤＮＡまたはその
    変異ＤＮＡを含有し、非ヒト動物において発現しうる組
    換えベクター。
  49. 【請求項４９】請求項１記載のＧタンパク質共役型レセ
    プタータンパク質をコードするＤＮＡが不活性化された
    非ヒト哺乳動物胚幹細胞。
  50. 【請求項５０】非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である請求
    項４９記載の胚幹細胞。
  51. 【請求項５１】ゲッ歯動物がマウスである請求項５０記
    載の胚幹細胞。
  52. 【請求項５２】請求項１記載のＧタンパク質共役型レセ
    プタータンパク質をコードするＤＮＡが不活性化された
    該ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物。
  53. 【請求項５３】非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である請求
    項５２記載の非ヒト哺乳動物。
  54. 【請求項５４】ゲッ歯動物がマウスである請求項５３記
    載の非ヒト哺乳動物。
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