JP2003135064A - アッセイ方法 - Google Patents

アッセイ方法

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ニール・ベンソン
Helen Frances Boyd
ヘレン・フランセス・ボイド
Leonard Gabriel Contillo
レオナード・カブリエル・コンティロ
David H Singleton
デーヴィッド・ハーラン・シングルトン
Peter Stacey
ピーター・ステイシー
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Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】エキソペプチダーゼまたはエンドペプチダー
ゼ、好ましくはヒト可溶性分泌エンドペプチダーゼ（Ｓ
ＥＰ）、オキシトシナーゼ、中性エンドペプチダーゼ
（ＮＥＰ）、または非ヒトＳＥＰに結合、および／また
は、これらを調整する作用物質を同定する方法を提供す
る。 【解決手段】作用物質を、特定の配列を有するポリヌク
レオチド配列によりコードされるポリペプチドと接触さ
せること、そして結合および／または調整が起るかどう
かを決定することを好ましくは含む、前記作用物質を同
定するための方法に関する。好ましくは、本方法は、少
なくとも一つの蛍光供与体色素および少なくとも一つの
蛍光受容体色素で標識された基質ペプチドの存在下で、
前記作用物質を検出するのに使われる方法が競合結合蛍
光共鳴エネルギー伝達（ＦＲＥＴ）アッセイで行われ
る。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、エキソペプチダー
ゼ類またはエンドペプチダーゼ類、好ましくはヒト可溶
性分泌エンドペプチダーゼ（ＳＥＰ）、オキシトシナー
ゼ、中性エンドペプチダーゼ（ＮＥＰ）、または非ヒト
ＳＥＰ、に結合する、および／または、これらを調整す
る、作用物質を同定する方法に関する。
【０００２】好ましい方法は、少なくとも一つの蛍光供
与体色素および少なくとも一つの蛍光受容体色素で標識
された基質ペプチドの存在下で、前記作用物質を検出す
るのに使用される方法である競合結合型蛍光共鳴エネル
ギー伝達（ＦＲＥＴ）アッセイにより、行われるもので
ある。
【０００３】また本発明は、本発明の方法により同定さ
れた作用物質（候補モジュレーター、好ましくは阻害剤
または選択阻害剤の候補）に関する。
【０００４】
【従来の技術】ヒト可溶性分泌エンドペプチダーゼ（ヒ
トＳＥＰ） プロテアーゼ類は、ペプチドまたはタンパク質鎖のバッ
クボーンを形成するペプチド結合のところで、タンパク
質やペプチドを切断する酵素の大ファミリーを形成して
いる。プロテアーゼ類は、バクテリアからヒトまであら
ゆる生物に見られる。ヒトでは、全遺伝子の約１％（４
００−１０００）が、プロテアーゼ酵素類をコードする
と推定されている。それらは、未成熟のポリペプチドの
活性化および成熟、ミスフォールドされたタンパク質お
よび損傷されたタンパク質の分解、細胞の内部および外
部でのペプチドおよびタンパク質の制御された代謝回
転、に関係する。それらの活性は、消化、正常な成長、
内分泌機能、創傷治癒、炎症、血管新生、胚発生中の組
織再構築（ｒｅｍｏｄｅｌｌｉｎｇ）、腫瘍の転移、心
臓血管疾患、神経疾患、および、細菌性、寄生虫性およ
びウイルス性感染、を含む多くのプロセスに重要であ
る。
【０００５】プロテアーゼ類は、基質をどこで切断する
かに基づいて、大まかに分類できる。アミノペプチダー
ゼ、ジペプチジルペプチダーゼ、トリペプチダーゼ、カ
ルボキシペプチダーゼ、ペプチジル−ジ−ペプチダー
ゼ、ジペプチダーゼおよびオメガペプチダーゼを含む、
エキソペプチダーゼ類は、それらの基質の末端にある残
基を切断する。セリンプロテアーゼ、システインプロテ
アーゼ、およびメタロエンドペプチダーゼを含む、エン
ドペプチダーゼ類は、当該ペプチド内の配列で切断す
る。
【０００６】亜鉛メタロプロテアーゼとして知られるエ
ンドペプチダーゼの重要なグループは、その触媒部位に
亜鉛イオンの結合を必要とするのが特徴である。亜鉛メ
タロプロテアーゼは、いくつかのクラスに細区分できる
が（総説については、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３５
４（１９９４）１−６ページを参照）、そうしたクラス
の一つがネプリリシン（ＮＥＰ）様亜鉛メタロプロテア
ーゼ類である（ＦＡＳＥＢ Ｊｏｕｒｎａｌ、１１巻、
１９９７、３５５−３８４ページ）。ＮＥＰクラスは、
相互に構造的に関係がある少なくとも７種の酵素を含む
（下記参照）。それらは典型的に膜結合性で、大きなカ
ルボキシ末端細胞外ドメイン、短い膜貫通領域、および
アミノ末端にある短い細胞内ドメインをもつ。このファ
ミリーの既知メンバーは、ネプリリシン（中性エンドペ
プチダーゼ（ＮＥＰ）、ＣＤ１０、ＣＡＬＬＡ、エンケ
ファリナーゼまたはＥＣ３．４．２４．１１とも呼ばれ
る）、エンドセリン転換酵素類（ＥＣＥ−１およびＥＣ
Ｅ−２）、ＰＥＸ、ＫＥＬＬ、Ｘ転換酵素／損傷誘導性
神経エンドペプチダーゼ（ＸＣＥ／ＤＩＮＥ）、および
可溶性分泌エンドペプチダーゼ／ネプリリシンＩＩ（Ｓ
ＥＰ／ＮＥＰＩＩ；Ｇｈａｄｄａｒ、Ｇら、Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ Ｊｏｕｒｎａｌ、３４７巻、２０００、４１９−
４２９ページ；Ｉｋｅｄａ、Ｋら、Ｊｏｕｒｎａｌ Ｂ
ｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２７４巻、
１９９９、３２４６９−３２４７７ページ；Ｔａｎｊ
ａ、Ｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈＣｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ、２７１巻、２０
００、５６５−５７０ページ；国際特許出願 ＷＯ９９
／５３０７７）と呼ばれる齧歯類で同定された酵素であ
る。このクラスのメンバーの機能は、ペプチド作動性シ
グナル伝達に関係すると考えられている。これは、ヒト
を含む大部分の生物で起こるプロセスで、その際ペプチ
ド分子は、生理的応答を引き出すための「メッセンジャ
ー」として用いられる。これは典型的には、特定の細胞
によるペプチドメッセンジャーの産生および放出に伴
い、時にはプロテアーゼにより切断されて活性になる、
不活性な前駆体として産生・放出される。次いで該ペプ
チドの活性型は、それが応答を誘発する別の細胞表面の
特定の受容体に結合する。それから該ペプチドは、別の
プロテアーゼによる分解によって、不活性化される。
【０００７】ＮＥＰは、このクラスの最初のメンバーと
して、発見された。ＮＥＰは、例えばエンケファリン
類、ブラジキニンおよびサブスタンスＰなど、多くの生
体ペプチドを加水分解し、不活性化できる点で、無差別
なプロテアーゼである。それは通常、疎水性残基のアミ
ノ末端側で該ペプチドを切断する。ＮＥＰは、身体の多
くの組織で見い出され、腎臓に最も豊富にある。その生
理機能は完全にはわかっていないが、ＮＥＰ「ノックア
ウト」マウスの表現型からの一つの兆候は、それが内毒
素ショックを防ぐことに関与していることである。
【０００８】ＥＣＥ−１はＮＥＰと３７％同一なタンパ
ク質である。ＥＣＥ−１は、体内いたるところに広く分
布し、不活性な前駆体ペプチドであるビッグエンドセリ
ンをエンドセリンに変換するが、このエンドセリンは、
血管の緊張を維持するのに大切な、強力な血管収縮物質
である。ＥＣＥ−２酵素は、ＥＣＥ−１に対するものと
は別の遺伝子に由来するが、そのアミノ酸配列は似てお
り、５９％の全体相同性をもつ。エンドセリン産生に対
するＥＣＥ−２の生理的意義は不明である。ＥＣＥ−２
ｍＲＮＡは、ＥＣＥ−１ｍＲＮＡよりずっと低いレベル
で存在し、ＥＣＥ−１とは異なる至適ｐＨをもち、中性
ｐＨで不活性で、ｐＨ５．５で最大活性を示す。
【０００９】ケル（ＫＥＬＬ）酵素は、赤血球組織に見
られるＮＥＰクラスの臨床的に重要なメンバーである。
ケル血液型系の抗原はこのタンパク質にあり、それが、
輸血に対して溶血反応を起すことがある。
【００１０】ＰＥＸ遺伝子は、Ｘ連関低リン酸塩血症性
くる病という疾病に遺伝的に連鎖するとして同定され
た；それは腎尿細管リン酸塩再吸収の減少を特徴とする
優性遺伝病である。ＮＥＰファミリーの他のメンバーへ
のその近い相同性（４９−６０％）に基づき、ＰＥＸも
膜結合性のメタロプロテアーゼと推定されているが、基
質はまだ何も見い出されていない。
【００１１】ＸＣＥ（Ｖａｌｄｅｎａｉｒｅ、Ｏら、Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、６
４巻、１９９９、２１１−２２１ページ）、およびその
ラット相当体ＤＩＮＥ（Ｋｉｒｙｕ−Ｓｅｏ、Ｓら、Ｐ
ｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ
Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＵＳＡ、２
０００、４３４５−４３５０ページ）は、中枢神経系で
主に発現される。ＤＩＮＥ発現は、ニューロン損傷後に
アップレギュレートされるが、これは、恐らくＤＩＮＥ
仲介による抗酸化酵素類のタンパク質分解活性化の結果
として、ニューロンアポトーシスを防ぐのを助けるため
と、考えられている。ＸＣＥ／ＤＩＮＥの生理的基質も
まだ同定されていないが、それらの配列からプロテア−
ゼ類と明らかに推定され、そしてＤＩＮＥについては、
合成ペプチド基質を用いて証明されている。
【００１２】齧歯類のＳＥＰおよびＮＥＰＩＩはごく最
近発見された。それらは９１％アミノ酸同一性を共有し
ているので、ＮＥＰＩＩは、マウスの酵素であるＳＥＰ
のラット相当体らしい。それらは、アミノ酸配列でＮＥ
Ｐに最も近縁のこのクラスのメンバーで、いずれもヒト
ＮＥＰに５４％同一である。両者のｍＲＮＡは、精巣に
特に豊富で、広範囲の他の組織にも低レベルで検出され
る。ラットＮＥＰＩＩの場合、そのｍＲＮＡは、脳およ
び下垂体にも、比較的高レベルで認められた。哺乳類細
胞中で組換え的に産生されると、マウスＳＥＰおよびラ
ットＮＥＰＩＩいずれも増殖培地中に見い出される。こ
のことは、それらが、循環でき、従って体内の他の部位
でペプチドを切断できる分泌プロテアーゼであること
を、示唆している。ＥＣＥ−１のようなこのクラスのい
くつかの他のメンバーのように、マウスＳＥＰおよびラ
ットＮＥＰＩＩは、スプライス変異（ｖａｒｉａｔｉｏ
ｎ）を示す。マウスＳＥＰおよびラットＮＥＰＩＩの場
合、このスプライス変異は、膜局在および分泌に関与す
る配列に変化をもつアイソフォームを生じる。このこと
の生理的意義は不明だが、それらの酵素の膜結合型、循
環型、および細胞内型である可能性がある。マウスＳＥ
Ｐは、エンケファリン、エンドセリン、ビッグ−エンド
セリン、ブラジキニンおよびサブスタンスＰを含む、一
連の重要な生体ペプチド類を切断できることが明らかに
されている。それ故、ＮＥＰと同様に、それはかなり広
い基質特異性をもち、異なる組織でいくつかの生理機能
をもっているらしい。
【００１３】他のメタロプロテアーゼ酵素類と同様に、
このＮＥＰクラス中の酵素も、薬剤様の小分子（例えば
チオルファンおよびホスホラミドン）による阻害を受け
易いことが明らかにされている。このことは、ペプチド
作動性シグナル伝達の調整におけるＮＥＰ様酵素のいく
つかのメンバーの生理的機能の性質が明らかになりつつ
あることと相まって、それらを、薬剤介入の魅力的な標
的にしている。ＮＥＰ阻害剤は、心臓血管疾患を含む適
応症用に開発されており、それらの機能についての知識
がさらに増えるにつれて、ＮＥＰ様酵素類の特異的阻害
剤は、性機能不全（特に男性性機能不全、例えば男性勃
起不全（ＭＥＤ）、および女性性機能不全（ＦＳＤ）、
例えば女性性覚醒障害（ＦＳＡＤ））、早期分娩、子癇
前症、子宮内膜症、生殖障害（特に男性および女性不
妊、多のう胞性卵巣症候群、着床不全）、高血圧、心不
全、狭心症、腎機能不全、周期性浮腫、高アルドステロ
ン症、緑内障、喘息、炎症、白血病、疼痛、癲癇、情動
障害、痴呆および老人性錯乱、肥満および胃腸障害（特
に下痢および過敏性腸管症候群）、敗血症性ショック、
胃酸分泌の調整および高レニン血症の治療のような、多
くの他の適応症の予防および／または治療に役立つよう
である。
【００１４】性機能不全 性機能不全（ＳＤ）は、男性および女性両方に影響する
ことがある、重大な臨床問題である。ＳＤの原因は、器
質的なものだけでなく、心理的なものもある。ＳＤの器
質的側面は、高血圧または真性糖尿病に随伴するような
素地にある血管疾患により、処方投薬により、および／
またはうつ病のような精神疾患により、起るのが典型的
である。生理的要因には、恐怖、業績不安、対人摩擦が
含まれる。ＳＤは、性行為を損ない、自尊心を傷つけ、
対人関係を壊し、そのため個人的に悩むようになる。臨
床的には、ＳＤ障害は、女性性機能不全（ＦＳＤ）障害
および男性性機能不全（ＭＳＤ）障害に分けられてきた
（Ｍｅｌｍａｎら １９９９）。ＦＳＤは、ある女性が
性的表現に満足を見い出すことが、困難か、不可能な状
態として、最もよく定義される。男性性機能不全（ＭＳ
Ｄ）は、一般に勃起不全を伴っており、男性勃起不全
（ＭＥＤ）としても知られる（Ｂｅｎｅｔら１９９
４）。
【００１５】本発明の方法により同定された作用物質
は、男性における性機能不全（例えば、男性勃起不全−
ＭＥＤ）および女性おける女性性機能不全（ＦＳＤ）、
例えば女性性覚醒障害（（ＦＳＡＤ）、の予防および／
または治療に特に有益である。
【００１６】女性性機能不全（ＦＳＤ） ＦＳＤは、ある女性が性的表現に満足を見い出すこと
が、困難か、不可能な状態として定義できる。ＦＳＤは
いくつかの多様な女性性障害についての総括的用語であ
る（Ｌｅｉｂｌｕｍ、Ｓ．Ｒ．（１９９８）．女性性障
害の定義と分類。Ｉｎｔ．Ｊ．Ｉｍｐｏｔｅｎｃｅ Ｒ
ｅｓ．、１０、Ｓ１０４−Ｓ１０６；Ｂｅｒｍａｎ、
Ｊ．Ｒ．、Ｂｅｒｍａｎ、Ｌ．＆ Ｇｏｌｄｓｔｅｉ
ｎ、Ｉ．（１９９９）．女性性機能不全：発生、病態生
理、評価および治療オプション。Ｕｒｏｌｏｇｙ、５
４、３８５−３９１）。当該婦人は、性欲の欠如、覚醒
またはオルガスムの困難、性交に伴う痛み、またはこれ
らの問題の複合をもつ可能性がある。複数のタイプの疾
患、投薬、損傷または心理的問題が、ＦＳＤを起すこと
がある。開発中の治療は、特定のサブタイプのＦＳＤ、
主に性欲および覚醒障害を治療することを、標的として
いる。
【００１７】ＦＳＤのカテゴリーは、正常な女性の性応
答の位相：欲望、覚醒、そしてオルガスム、にそれらを
対比することにより、最もよく限定される（Ｌｅｉｂｌ
ｕｍ、Ｓ．Ｒ．（１９９８）．女性性障害の定義と分
類。Ｉｎｔ．Ｊ．Ｉｍｐｏｔｅｎｃｅ Ｒｅｓ．、１
０、Ｓ１０４−Ｓ１０６）。性欲すなわちリビドは性表
現のための衝動である。その表明は、好ましいパートナ
ーと一緒にいるとき、あるいは他のエロチックな刺激に
曝されたときの、性的思考を含むことが多い。覚醒は性
的刺激に対する血管応答で、その重要な構成要素は、性
器の充血で、そして膣潤滑の増加、膣の伸長、および性
器の感覚／感度の増加を含む。オルガスムは、覚醒中に
絶頂に達した性的緊張の解放である。
【００１８】従って、それらの位相、通常は性欲、覚醒
あるいはオルガスムのいずれかに、不適切または不満足
な応答を婦人がもつ場合に、ＦＳＤが生じる。ＦＳＤカ
テゴリーは、活性低下性欲障害、性覚醒障害、オルガス
ム障害および性疼痛障害を含む。（女性性覚醒障害の場
合のように）性的刺激に対する性器応答の改善によっ
て、それに伴う痛み、悩みおよび性交に随伴する不快感
も改善し、そのため他の女性性障害が治ることがある。
【００１９】このように、本発明の好ましい側面に従っ
て、活性低下性欲障害、性覚醒障害、オルガスム障害ま
たは性疼痛障害の治療または予防のための、より好まし
くは性覚醒障害、オルガスム障害、または性疼痛障害の
治療または予防のための、そして最も好ましくは性覚醒
障害の治療または予防における、薬の調製に本発明の方
法により同定された作用物質の使用が提供される。
【００２０】活性低下性欲障害（ＨＳＤＤ）は、ある婦
人が、性的になる欲望を全然またはほとんどもたない
か、性的な思考や空想を全くあるいはほとんどもたない
場合に、見られる。このタイプのＦＳＤは、自然月経閉
止または外科的月経閉止による、低いテストステロンレ
ベルに起因することがある。その他の原因として、病
気、投薬、疲労、うつ病および不安がある。
【００２１】女性性覚醒障害（ＦＳＡＤ）は、性的刺激
に対する不適切な性器応答が特徴である。性器が、正常
な性的覚醒の特徴である充血を受けない。膣壁はあまり
潤滑にならず、そのため性交は痛みを伴う。オルガスム
も妨げられる。覚醒障害は、月経閉止時または出産後お
よび授乳中のエストロゲンの減少、ならびに、糖尿病お
よびアテロ−ム性動脈硬化症のような血管構成要素をも
つ病気、が原因のこともある。他の原因として、利尿
剤、抗ヒスタミン剤、抗うつ剤、例えば選択的セロトニ
ン再吸収阻害剤（ＳＳＲＩｓ）、または抗高血圧剤によ
る治療がある。
【００２２】女性オルガスム障害（ＦＯＤ）は、正常な
性的興奮位相後にオルガスムが、常にまたは時に遅延す
るか、欠如するのが特徴である。オルガスムを引き起す
刺激のタイプや強度は、婦人によって大きく変わる。Ｆ
ＯＤの診断は、当該婦人のオルガスム能力が、彼女の年
令、性経験、および彼女が受ける性的刺激の適切度に対
して妥当なものより低いとする、医師の判断に基づくべ
きである。
【００２３】性疼痛障害（性感異常および膣痙を含む）
は、貫入に由来する痛みが特徴で、潤滑性を減らす投
薬、子宮内膜症、骨盤炎症性疾患、炎症性腸管疾患また
は尿管障害に起因することもある。
【００２４】ＦＳＤの罹患率は、事項が複数のタイプの
問題にまたがり、中には計測困難なものもあり、またＦ
ＳＤの治療は比較的最近関心がもたれるようになったた
め、測定が難しい。婦人の性的問題の多くは、当該女性
の加齢プロセスと、あるいは糖尿病や高血圧のような慢
性病と、直接関連する。
【００２５】ＦＳＤは、性的応答サイクルの別々の位相
で症状を発現するいくつかのサブタイプから成るので、
単一の療法はない。ＦＳＤの現行の治療は、主に心理的
または対人関係問題に焦点を合せている。ＦＳＤの治療
は、一層臨床的なものに次第に進展してきており、そし
て基礎科学研究は、この医学問題の調査に向けられてい
る。女性の性的苦情は、すべてが必ずしも、病態生理学
での心理的なものではなく、女性の性的苦情全体に影響
する血管形成機能不全の構成要素（例えばＦＳＡＤ）を
もつような個人については、特にそうである。現在、Ｆ
ＳＤの治療用に認可された薬剤はない。経験的薬剤療法
として、エストロゲン投与（局所的に、またはホルモン
代償療法として）、アンドロゲン類、またはブスピロン
やトラゾドンのような気分転換薬がある。これらの治療
オプションは、低効能あるいは受容しがたい副作用のた
めに、不満足なことが多い。
【００２６】ＦＳＤを薬理学的に治療することに関心が
向けられたのは比較的最近なので、療法は下記より成っ
ている：心理学的カウンセリング、店頭販売の性的潤滑
剤、および、別の病状に認可された薬剤を含む試験的候
補薬である。これらの投薬は、ホルモン作用物質、テス
トステロンか、エストロゲンとテストステロンの組合
せ、および、さらに最近では、男性勃起不全（ＭＥＤ）
に有効なことが明らかになった血管薬から構成されてい
る。これらの作用物質はいずれも、ＦＳＤの治療に有効
とはまだ証明されていない。
【００２７】既述のように、本発明の方法により同定さ
れた作用物質は、女性性覚醒障害（ＦＳＡＤ）の予防お
よび／または治療に特に有用である。米国精神医学協会
の診断および統計マニュアル（ＤＳＭ）ＩＶは、女性性
覚醒障害（ＦＳＡＤ）を次のように定義している：「・
・・性的興奮の潤滑・膨張応答に十分な性的活性の完成
まで、常にあるいは時に達成または維持することが不
能。この障害は、顕著な苦悩または対人関係の邪魔とな
るはず・・・・」。
【００２８】覚醒応答は、骨盤の血管充血、膣の潤滑と
拡張、および外部性器の膨張から成る。その障害は、顕
著な苦悩および／または対人関係の邪魔になる。夫婦の
性的不全を調べた研究は、婦人の７６％までが性的不全
の不満をもっており、米国の婦人の３０−３５％がＦＳ
Ｄの経験がある、ことを明らかにしている（Ｂｅｒｍａ
ｎ、Ｊ．Ｒ．、Ｂｅｒｍａｎ、Ｌ．Ａ．、Ｗｅｒｂｉ
ｎ、Ｔ．Ｊ．ら（１９９９）、女性性機能不全：解剖
学、生理学、評価および治療選択。Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ
Ｕｒｏｌｏｇｙ、９、５６３−５６８）。
【００２９】ＦＳＡＤは、月経閉止の前期、近期、およ
び後期（±ホルモン代償療法（ＨＲＴ））の婦人が罹る
非常に多い性的障害である。それは、うつ病、心臓血管
疾患、糖尿病、および尿生殖器（ＵＧ）障害のような付
随障害と関連する。
【００３０】ＦＳＡＤの一次結果は、充血／膨張の欠
乏、潤滑の欠乏および性器快感の欠乏である。ＦＳＡＤ
の二次結果は、性欲の減退、性交中の痛み、およびオル
ガスム到達の困難である。
【００３１】ＦＳＡＤの症状をもつ患者の少なくとも一
部については、血管障害素地があると、最近考えられて
おり（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｉｍｐｏ
ｔ．Ｒｅｓ．１０、Ｓ８４−Ｓ９０、１９９８）、この
見解は動物のデータからも支持される（Ｐａｒｋら、Ｉ
ｎｔ．Ｊ．Ｉｍｐｏｔ．Ｒｅｓ．、９、２７−３７、１
９９７）。
【００３２】理論的裏付けはないが、本発明者らは、血
管作動性腸管ペプチド（ｖａｓｏａｃｔｉｖｅ ｉｎｔ
ｅｓｔｉｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ、ＶＩＰ）のような神
経ペプチドが、女性性覚醒応答の制御、特に性器血流の
制御における主要な神経伝達物質候補と、考えている。
ＶＩＰおよび他の神経ペプチドは、ＳＥＰにより分解／
代謝される。それ故、ＳＥＰ阻害剤は、覚醒中に放出さ
れたＶＩＰの内因性血管弛緩作用を高めるはずである。
これは、性器血流の亢進を介し、従って性器の充血など
で、ＦＳＡＤの予防および／または治療をもたらすはず
である。本発明者らは、ＳＥＰの阻害剤が、膣および陰
核の血流に骨盤神経刺激性かつＶＩＰ誘導性の増加を、
亢進することを明らかにした。さらに、ＳＥＰ阻害剤
が、分離した膣壁のＶＩＰおよび神経媒介の弛緩を亢進
することも、明らかにした。
【００３３】このように本発明は優れており、それは、
正常な性覚醒応答、すなわち、膣、陰核、および陰唇の
充血をもたらす性器血流の増加を、回復するための手段
の提供を助けるからである。これにより、プラスマ濾出
を介する膣潤滑の増加、膣のコンプライアンス（ｃｏｍ
ｐｌｉａｎｃｅ）の増加、および性器感度の増加が生じ
るはずである。従って、本発明は、正常な性覚醒応答を
回復する、または高めるための手段を提供する。
【００３４】本明細書における女性性器の意味は：「生
殖器官は内部および外部群から成る。内部器官は、骨盤
内に位置し、そして卵巣、尿管、子宮および膣より成
る。外部器官は、尿生殖器隔膜の上部および骨盤弓の下
部にある。それらは、恥丘、大陰唇および小陰唇、陰
核、前庭、前庭球、および大前庭腺で構成される」（Ｇ
ｒａｙ’ｓ Ａｎａｔｏｍｙ、Ｃ．Ｄ．Ｃｌｅｍｅｎｔ
ｅ、米国第１３版）である。
【００３５】Ｒ．Ｊ．Ｌｅｖｉｎは、「・・・男性およ
び女性生殖器は、共通の組織原基から発生するので、男
性および女性性器構造は相互に相同体と言われている。
従って、陰核は陰茎相同体であり、陰唇は陰嚢の相同体
である・・・」と教示している（Ｌｅｖｉｎ、Ｒ．Ｊ．
（１９９１）、Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏ
ｌ．、９８、６１−６９）。
【００３６】男性勃起不全（ＭＥＤ） 男性勃起不全（ＭＥＤ）に悩んでいる者がいることが知
られている。男性勃起不全（ＭＥＤ）は次のように定義
されている：「・・・満足できる性行為ための陰茎勃起
を達成および／または維持することの不能（ＮＩＨ Ｃ
ｏｎｓｅｎｓｕｓ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｐａｎｅ
ｌｏｎ Ｉｍｐｏｔｅｎｃｅ、１９９３）・・・」。
【００３７】あらゆる程度（最軽度、中度、および完全
インポテンツ）の勃起不全（ＥＤ）の罹病率は、４０か
ら７０才の男性の５２％、７０才以上ではさらに高い割
合と推定されている（Ｍｅｌｍａｎら、１９９９）。そ
の状態は、当該患者およびそのパートナーの生活の質に
重大な負のインパクトを与え、しばしば不安と緊張の増
加をもたらし、それがうつ病や自己嫌悪につながる。２
０年ほど前は、ＭＥＤは主に心理的な障害と考えられて
いたが（Ｂｅｎｅｔら、１９９４）、現在は大多数の患
者について、器官的原因の素地があることがわかってい
る。その結果、正常な陰茎勃起の機構およびＭＥＤの病
態生理学の解明に、長足の進歩がなされた。
【００３８】陰茎勃起は、血行動態事象で、海綿体平滑
筋および陰茎の脈管構造の収縮と弛緩のバランスに依存
する（Ｌｅｒｎｅｒら、１９９３）。海綿体平滑筋は、
本明細書では、体平滑筋（ｃｏｒｐｏｒａｌ ｓｍｏｏ
ｔｈ ｍｕｓｃｌｅ）または複数扱いで海綿体（ｃｏｒ
ｐｕｓ ｃａｖｅｒｎｏｓａ）とも言う。海綿体平滑筋
の弛緩は、当該海綿体の肉柱スペース中への血流増加を
もたらし、周囲膜に対してそれらの膨張と流出静脈の圧
縮とを起す。これは血圧の膨大な上昇もたらし、結果と
して勃起する（Ｎａｙｌｏｒ、１９９８）。
【００３９】勃起過程で起る変化は複雑で、末梢および
中枢神経系と内分泌系を含む高度に整合された制御を必
要とする（Ｎａｙｌｏｒ、１９９８）。体平滑筋収縮
は、シナプス後膜α1アドレナリン受容体の活性化を介
する交感神経ノルアドレナリン作動性神経支配により、
調整される。ＭＥＤは、海綿体の内因性平滑筋緊張の増
加に関連するらしい。しかし、海綿体平滑筋弛緩のプロ
セスは、非アドレナリン作動性、非コリン作動性（ＮＡ
ＮＣ）神経伝達によっても、一部仲介される。カルシト
ニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）や血管作動性腸管
ペプチド（ＶＩＰ）のような、酸化窒素（ＮＯ）以外
の、多数の他のＮＡＮＣ神経伝達物質が陰茎中に認めら
れる。この弛緩を媒介するためにかかわる主要な弛緩因
子はＮＯで、それは酸化窒素合成酵素（ＮＯＳ）により
Ｌ−アルギニンから合成される（Ｔａｕｂら １９９
３；Ｃｈｕａｎｇら １９９８）。体平滑筋の緊張を低
下させるには、海綿体の弛緩を誘導するためにＮＯを支
援してもよいと考えられている。男性における性覚醒の
際、ＮＯはニューロンと内皮から放出され、当該平滑筋
細胞および内皮中にある可溶性グアニル酸シクラーゼ
（ｓＧＣ）に結合して活性化し、細胞内サイクリックグ
アノシン３’、５’一リン酸（ｃＧＭＰ）レベルの上昇
をもたらす。ｃＧＭＰのこの上昇は、プロテインキナー
ゼＧ活性化を含むとされる未知の機構（多分、Ｃａ2+ポ
ンプおよびＣａ2+活性化Ｋ+チャンネルの活性化によ
る；Ｃｈｕａｎｇら、１９９８）を介して、細胞内カル
シウム濃度（［Ｃａ2+］i）の低下による海綿体の弛緩
をもたらす。
【００４０】シルデナフィルクエン酸（Ｓｉｌｄｅｎａ
ｆｉｌ ｃｉｔｒａｔｅ）（ＶｉａｇｒａTMとしても知
られる）は、ＭＥＤ用の最初の経口薬治療として、Ｐｆ
ｉｚｅｒにより最近開発されたものである。シルデナフ
ィルは、選択的にホスホジエステラーゼ５（ＰＤＥ５）
を阻害することにより海綿体中でｃＧＭＰ分解を阻害し
て作用し、それによってｃＧＭＰの５’ＧＭＰへの加水
分解を制限し（Ｂｏｏｌｅｌら、１９９６；Ｊｅｒｅｍ
ｙら、１９９７）、そしてそれによってｃＧＭＰの細胞
内濃度を上昇させ、海綿体平滑筋の弛緩を容易にする。
【００４１】現在、プロスタグランジンに基づく化合物
を用いる治療、すなわち尿道内（ＭｕｓｅTMとしてＶｉ
ｖｕｓ Ｉｎｃ．から入手可能）または小針注射（Ｃａ
ｖｅｒｊｅｃｔTMとしてＰｈａｒｍａｃｉａ ＆ Ｕｐ
ｊｏｈｎから入手可能）により投与されるアルプロスタ
ジルのような、市販の入手可能な他のすべてのＭＥＤ療
法は、使い難く、および／または、侵襲的である。他の
治療には、真空狭窄装置、血管活性剤注射またはペニス
人工補装具移植がある（Ｍｏｎｔａｇｕｅら、１９９
６）。注射用血管活性剤は高い効能を示すものの、ペニ
スの痛み、繊維症、および持続勃起のような副作用がよ
く見られ、そして注射療法は経口療法ほど便利ではない
ので、シルデナフィルが、市販の療法として、現在最も
好まれている。
【００４２】陰茎または海綿体中、または勃起機構／過
程における、ＳＥＰの発現または機能的役割について、
先行の文献証拠はない。また、陰茎または海綿体への、
あるいは勃起機構／過程における、ＳＥＰ阻害剤につい
ての機能的または生化学的作用に関する先行の文献証拠
もない。
【００４３】膣または陰核海綿体中、または女性性覚醒
機構／過程における、ＳＥＰの発現または機能的役割に
ついて、先行の文献証拠はない。また、膣または陰核海
綿体中、または女性性覚醒機構／過程における、ＳＥＰ
阻害剤についての機能的または生化学的作用に関する先
行の文献証拠もない。
【００４４】それ故、本明細書に記載の有力な知見は、
性的不全、特にＭＥＤまたはＦＳＡＤ、に悩む男性また
は女性を、可溶性分泌エンドペプチダーゼ阻害剤（ＳＥ
Ｐｉ）を用いて、治療可能なことである。意外にも、当
該出願人らは、ＳＥＰｉによるＳＥＰの阻害が、神経刺
激覚醒プロセスを顕著に亢進することも、見い出した。
【００４５】本発明の利点は、正常な性的覚醒応答、す
なわち、男性では陰茎の勃起をもたらす陰茎血流の増加
および女性では性器充血をもたらす膣陰核血流の増加、
を回復または亢進できる作用物質を同定するための方法
を提供することにある。
【００４６】参考文献 Ａｒｇｉｏｌａｓ、Ａ．ら（１９９５）、陰茎勃起の神
経調整。Ｐｒｏｇ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．４７：２３５
−２５５。
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試験管内における（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）家兎海綿体中の
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【００５３】Ｎａｙｌｏｒ、Ａ．Ｍ．（１９９８）。陰
茎勃起を媒介する内因性神経伝達物質。Ｂｒ．Ｊ．Ｕｒ
ｏｌｏｇｙ ８１：４２４−４３１。ＮＩＨ Ｃｏｎｓ
ｅｎｓｕｓ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｐａｎｅｌ ｏ
ｎＩｍｐｏｔｅｃｅ（１９９３）．インポテンスに関す
る米国立衛生研究所（ＮＩＨ）コンセンサス会議。Ｊ．
Ａ．Ｍ．Ａ．２７０：８３。
【００５４】Ｏｍｏｔｅ、Ｍ．（１９９９）。勃起不全
の治療におけるシルデナフィル（ＶＩＡＧＲＡ）の薬理
学的プロファイル：効能および硝酸塩との薬剤相互作
用。Ｎｉｐｐｏｎ Ｙａｋｕｒｉｇａｋｕ Ｚａｓｓｈ
ｉ １１４：２１３−８。
【００５５】Ｔａｕｂ、Ｈ．Ｃ．ら（１９９３）。ヒト
および家兎の海綿体における収縮と弛緩との関係。Ｕｒ
ｏｌｏｇｙ ４２：６９８−７０４。Ｔｒａｉｓｈ、
Ａ．Ｍ．ら（１９９９）。家兎モデルにおける勃起機能
に及ぼす去勢およびアンドロゲン代償の影響。Ｅｎｄｏ
ｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １４０：１８６１−８。
【００５６】
【発明が解決しようとする課題】広い側面において、本
発明は、新規アミノ酸配列のモジュレーター（特に阻害
剤）およびそれらを同定する方法に関する。本発明のモ
ジュレーターおよび方法は、既に同定されている特定の
新規アミノ酸配列（国際特許出願公開ＷＯ ０２／０６
４９２−２００１年７月１６日出願を参照）に関する
が、本発明は、前記配列ならびにその新しい変異体（ｖ
ａｒｉａｎｔｓ）、断片、誘導体および相同体にも関連
すると、了解されるものとする。本発明の前記モジュレ
ーターおよび方法は、同一のまたは同様なタイプ／ファ
ミリーの他のアミノ酸にも関する。
【００５７】従って、要するに、本発明のいくつかの側
面は、以下に関する： ・ 新規配列を用いる検定方法。 ・ 一般的にはペプチダーゼ類、特定のペプチダーゼ
類、および、より明確には、新規アミノ類を用いる新規
な検定方法。
【００５８】・ 前記検定方法の使用により同定された
作用物質／化合物。 本明細書で使われる場合、「アミノ酸配列」は、ペプチ
ドまたはタンパク質配列を指し、および、それらの部分
を指すこともある。さらに、用語「アミノ酸配列」は語
句「ポリペプチド配列」と同義である。また、用語「ヌ
クレオチド配列」は語句「ポリヌクレオチド配列」と同
義である。
【００５９】本発明のその他の特徴および長所は、発明
の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかであろ
う。本発明は、特定の実施態様との関連で説明される
が、実行可能な他の変化および修飾も、本発明の一部で
あり、付随の請求事項の範囲内にあることも、了解され
よう。本出願は、当該技術分野内で既知または慣行的実
施に該当する本開示からの逸脱を含め、全般的に、本発
明の原理に従い、無用な実験をしなくても確かめられ
る、本発明のすべての同等物、変化、使用、または適用
を網羅することを、意図する。核酸およびポリペプチド
の作製および使用に関する別の手引きは、分子生物学、
タンパク質科学、および免疫学の標準的教科書に見られ
る（例えば、Ｄａｖｉｓら、Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｅｌ
ｓｅｖｉｒ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎ
ｇ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ、１９８６；Ｈ
ａｍｅｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄ
ｉｚａｔｉｏｎ、ＩＬ Ｐｒｅｓｓ、１９８５；Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、
Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊ
ｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ；Ｃｕｒｒｅｎ
ｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ
ｔｉｃｓ、Ｄｒａｃｏｐｏｌｉら編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌ
ｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏ
ｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｊ
ｏｈｎ Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎら編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅ
ｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ；ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏ
ｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｅ．Ｃ
ｏｌｉｇａｎら編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓ
ｏｎｓを参照）。本明細書で述べたすべての出版物は、
全体が参考文献として援用される。
【００６０】
【課題を解決するための手段】本発明の第一側面に従っ
て、配列番号２を含むポリペプチド、配列番号１または
配列番号５のポリヌクレオチドによりコードされるアミ
ノ酸配列、またはＮＣＩＭＢ ４１１１０のｃＤＮＡに
よりコードされるポリペプチド、と作用物質を接触さ
せ、そして結合および／または調整が起るかどうかを決
定することを含む、ＳＥＰポリペプチドに、結合する、
および／または、を調整する該作用物質を同定するため
の方法が提供される。
【００６１】好ましくは、前記ＳＥＰポリペプチドは、
次の一つまたは一つより多くを含む： （ａ） 配列番号１または配列番号５中のポリヌクレオ
チド配列から翻訳されたアミノ酸配列に由来するをもつ
ポリペプチドおよびその変異体、断片、相同体、類似体
および誘導体； （ｂ） 配列番号２のポリペプチドおよびその変異体、
断片、相同体、類似体および誘導体； （ｃ） ＮＣＩＭＢ ４１１１０のｃＤＮＡによりコー
ドされるポリペプチドおよびその変異体、断片、相同
体、類似体および誘導体；または （ｄ） （ｉ）配列番号１または配列番号５のポリヌク
レオチドによりコードされるポリペプチド、（ｉｉ）配
列番号２のポリペプチド、または（ｉｉｉ）ＮＣＩＭＢ
４１１１０のｃＤＮＡによりコードされるポリペプチ
ド、に少なくとも７８％同一性をもつポリペプチド。
【００６２】好ましくは、当該ポリペプチドは、（ｉ）
配列番号１または配列番号５のポリヌクレオチドにより
コードされるポリペプチド、（ｉｉ）配列番号２のポリ
ペプチド、または（ｉｉｉ）ＮＣＩＭＢ ４１１１０の
ｃＤＮＡによりコードされるポリペプチド、に少なくと
も８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましく
は少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％
同一性をもつ、ポリペプチド配列を含む。
【００６３】好ましくは、上記のポリペプチドは、アミ
ノ酸配列ＭＧＫＳＥＧＰＶＧ（配列番号６）を含む。好
ましくは、当該アミノ酸配列ＭＧＫＳＥＧＰＶＧ（配列
番号６）は、該ポリペプチドのアミノ末端か、近傍にあ
る。
【００６４】好ましくは、上記ポリペプチドをコードす
るポリヌクレオチドは、ヌクレオチド配列ＡＴＧＧＧＧ
ＡＡＧＴＣＣＧＡＡＧＧＣＣＣＣＧＴＧＧＧＧ（配列番
号７）を含む。好ましくは、当該ヌクレオチド配列ＡＴ
ＧＧＧＧＡＡＧＴＣＣＧＡＡＧＧＣＣＣＣＧＴＧＧＧＧ
（配列番号７）は、該ポリヌクレオチドの５’端か、近
傍にある。
【００６５】前記ＳＥＰポリペプチドは、本明細書に全
体が参考文献として援用されている国際特許出願公開Ｗ
Ｏ ０２／０６４９２（２００１年７月１６日出願）
に、さらに詳しく記載されている。
【００６６】好ましくは、本発明の第一側面に従う方法
は、前記ＳＥＰポリペプチドを、前記作用物質の存在下
にＳＥＰ基質ペプチドに接触させ、ここで該基質ペプチ
ドが、前記ＳＥＰポリペプチドによる切断に応答して検
出可能なシグナルを提供でき、ここで前記作用物質が、
前記作用物質の存在下および非存在下での検出可能シグ
ナルに差がある場合、前記ＳＥＰポリペプチドのモジュ
レーターとして同定されることを含む。より好ましく
は、前記方法は、当該検出可能シグナルを減少させる作
用物質を、そしてそれをＳＥＰポリペプチド阻害剤であ
ると同定する。なお一層好ましくは、前記基質ペプチド
が少なくとも一つの蛍光供与体色素で標識され、そして
当該シグナルが蛍光共鳴エネルギー伝達（ＦＲＥＴ）ア
ッセイにより検出される。まださらに好ましくは、当該
標識基質ペプチドが、ローダミングリーン（Ｒｈｏｄａ
ｍｉｎｅ ｇｒｅｅｎ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ｄＰｈｅ−
Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ（ＱＳＹ
TM７）−βＡｌａ−ＮＨ2、５−（および６）テトラメ
チルローダミンＧｌｙ−Ｇｌｙ−ｄＰｈｅ−Ｌｅｕ−Ａ
ｒｇ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ（ＱＳＹTM７）−βＡｌ
ａ−ＮＨ2または５−カルボキシフルオレセイン−Ｇｌ
ｙ−Ｇｌｙ−ｄＰｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｖａ
ｌ−Ｃｙｓ（５−（および６）テトラメチルローダミ
ン）−βＡｌａ−ＮＨ 2である。好ましくは、前記ＳＥ
Ｐポリペプチドと前記作用物質との結合が検出される。
最も好ましくは、前記方法が、競合結合アッセイであ
る。
【００６７】本発明の第二側面に従い、前記作用物質の
存在下に、あるペプチダーゼと、ローダミングリーンＧ
ｌｙ−Ｇｌｙ−ｄＰｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｖ
ａｌ−Ｃｙｓ（ＱＳＹTM７）−βＡｌａ−ＮＨ2、５−
（および６）テトラメチルローダミンＧｌｙ−Ｇｌｙ−
ｄＰｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ
（ＱＳＹTM７）−βＡｌａ−ＮＨ2および５−カルボキ
シフルオレセイン−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ｄＰｈｅ−Ｌｅｕ
−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ（５−（および６）
テトラメチルローダミン）−βＡｌａ−ＮＨ2より成る
群より選択されたペプチダーゼ基質ペプチドとを接触さ
せ、ここで該基質ペプチドが、該ペプチダーゼによる切
断に応答して、蛍光共鳴エネルギー伝達（ＦＲＥＴ）ア
ッセイにより検出されるような検出可能なシグナルを提
供でき、またはここで該作用物質の存在下で、該作用物
質の非存在下と比較して、検出可能シグナルに減少があ
る場合、該作用物質が該ペプチダーゼの阻害剤として同
定されることを含む、該ペプチダーゼを阻害または選択
的に阻害する作用物質を同定するための方法が提供され
る好ましくは、前記ペプチダーゼは、エキソペプチダー
ゼまたはエンドペプチダーゼである。より好ましくは、
前記ペプチダーゼは、オキシトシナーゼ、中性エンドペ
プチダーゼ（ＮＥＰ）、または非ヒトＳＥＰである。
【００６８】本発明の第三側面に従って、上記の方法の
いずれかによって同定された作用物質が提供されるが；
ここで該作用物質は、ホスホラミドン、チオルファン、
ファシドトリラット、オマパトリラット、またはＦＲ９
０１５３３ではない。ＳＥＰモジュレーターを探す場
合、好ましくは該作用物質は、上記のＳＥＰポリペプチ
ドをモジュレートする。さらに好ましくは、該化合物
は、ＳＥＰポリペプチドを阻害または選択的に阻害す
る。
【００６９】好ましくは、ＳＥＰモジュレーターを同定
するために使われた方法のいずれかにより同定された該
作用物質は、中性エンドペプチダーゼ ＮＥＰ ＥＣ
３．４．２４．１１およびアンギオテンシン変換酵素
（ＡＣＥ）よりも、ＳＥＰについて３０倍以上の選択性
（好ましくは５０倍以上の選択性）をもつ。
【００７０】好ましくは、ＳＥＰモジュレーターを同定
するために使われた方法のいずれかにより同定された該
作用物質は、エンドセリン変換酵素（ＥＣＥ）よりも、
ＳＥＰについて１００倍以上の選択性をもつ。
【００７１】本発明により、上記の方法により同定され
た作用物質および一つまたは一つより多い薬理学的に受
容可能な担体、希釈剤、または賦形剤を含む、医薬品組
成物も、提供される。
【００７２】本発明のもう一つの側面に従って、該ＳＥ
Ｐポリペプチドを候補モジュレーターと接触させ、およ
び調整が起るかどうかを決めることを含む、上記ＳＥＰ
ポリペプチドに結合する、および／または、これを調整
する、候補モジュレーターを同定するための、方法が提
供される。
【００７３】好ましくは、本方法は、下記を含む： （ａ） （ｉ）上記のＳＥＰポリペプチドの基質ペプチ
ドを、（ｉｉ）該ＳＥＰポリペプチドに接触させ、それ
は（ｉｉｉ）該ＳＥＰポリペプチドの候補モジュレータ
ーの存在下で行うが、ここで、該基質ペプチドが、該Ｓ
ＥＰポリペプチドによる該基質ペプチドの切断に応答し
て、検出可能なシグナルを提供できること；および
（ｂ） ＳＥＰポリペプチドによる該基質ペプチドの切
断が、該候補モジュレーターにより調整されたかどうか
を、該基質ペプチドに随伴する該検出可能なシグナルの
存否を検出することにより、決定すること。
【００７４】好ましくは、該候補モジュレーターは候補
阻害剤である。さらに好ましくは、該基質ペプチドは、
少なくとも一つの蛍光供与体色素および少なくとも一つ
の蛍光受容体色素で標識され、そして上記のポリペプチ
ドの候補阻害剤を検出するのに使用されるアッセイが、
蛍光共鳴エネルギー伝達（ＦＲＥＴ）アッセイである。
最も好ましくは、該標識基質ペプチドが、ローダミング
リーンＧｌｙ−Ｇｌｙ−ｄＰｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａ
ｒｇ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ（ＱＳＹTM７）−βＡｌａ−ＮＨ
2（ＣＰ４）（配列番号８）または５−（および６）テ
トラメチルローダミンＧｌｙ−Ｇｌｙ−ｄＰｈｅ−Ｌｅ
ｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ（ＱＳＹTM７）−
βＡｌａ−ＮＨ2（ＣＰ５）（配列番号８）または５−
カルボキシフルオレセイン−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ｄＰｈｅ
−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ（５−（お
よび６）テトラメチルローダミン）−βＡｌａ−ＮＨ2
（ＣＰ６）（配列番号８）である。
【００７５】また本発明により、標識基質ペプチドＣＰ
４、ＣＰ５、またはＣＰ６を用いるＦＲＥＴアッセイが
意図されるが、ここで、上記のＳＥＰポリペプチドが何
らかのペプチダーゼにより置換される。好ましくは、該
ペプチダーゼはエキソペプチダーゼまたはエンドペプチ
ダーゼである。より好ましくは、当￥該エキソペプチダ
ーゼはオキシトシナーゼであり、そして当該エンドペプ
チダーゼはＮＥＰまたは非ヒトＳＥＰである。
【００７６】それ故、本発明の好ましい側面に従って、
上記のＳＥＰポリペプチドに結合し、および／または、
これを阻害する候補阻害剤を同定するための方法が提供
されるが、それは下記を含む： （ａ） （ｉ）上記のＳＥＰポリペプチドの基質ペプチ
ドを、（ｉｉ）該ＳＥＰポリペプチドに接触させ、それ
は（ｉｉｉ）該ＳＥＰポリペプチドの候補阻害剤の存在
下で行うが、ここで、該基質ペプチドが、該ＳＥＰポリ
ペプチドによる該基質ペプチドの切断に応答して、検出
可能なシグナルを提供できること；および（ｂ） ＳＥ
Ｐポリペプチドによる該基質ペプチドの切断が、該候補
阻害剤により阻害されたかどうかを、該基質ペプチドに
随伴する該検出可能なシグナルの存否を検出することに
より、決定すること。
【００７７】好ましくは、当該基質ペプチドは、少なく
とも一つの蛍光供与体色素および少なくとも一つの蛍光
受容体色素で標識され、そして上記のポリペプチドの候
補阻害剤を検出するのに使用されるアッセイが、蛍光共
鳴エネルギー伝達（ＦＲＥＴ）アッセイである。最も好
ましくは、該標識基質ペプチドは、ＣＰ４、ＣＰ５、ま
たはＣＰ６である。
【００７８】また本発明により、標識基質ペプチドＣＰ
４、ＣＰ５、またはＣＰ６を用いるＦＲＥＴアッセイが
意図されるが、ここで、上記のＳＥＰポリペプチドが何
らかのペプチダーゼにより置換される。好ましくは、当
該ペプチダーゼはエキソペプチダーゼまたはエンドペプ
チダーゼである。より好ましくは、当該エキソペプチダ
ーゼはオキシトシナーゼであり、そして当該エンドペプ
チダーゼはＮＥＰまたは非ヒトＳＥＰである。
【００７９】本発明のＦＲＥＴアッセイは、ＮＥＰでの
使用のためにＣａｒｖａｌｈｏらにより開発されたアッ
セイに基づいている（Ｃａｒｖａｌｈｏら、Ａｎｎａ
ｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３７、１６７−１７３ページ
（１９９６））。本発明のＦＲＥＴアッセイは、同様の
分子内で消光された蛍光生成ペプチド基質を利用する
が、蛍光生成供与体／受容体色素類は新規な組合せによ
っている。
【００８０】合成標識基質ペプチド、例えばＣＰ４、Ｃ
Ｐ５、およびＣＰ６の調製は、以下にさらに詳しく述べ
る。本発明の別の側面に従って、ＳＥＰポリペプチドを
候補モジュレーターと接触させ、および調整が起るかど
うかを決めることを含む（ここで、該ＳＥＰポリペプチ
ドと当該モジュレーターとの当該結合が検出される）、
上記ＳＥＰポリペプチドに結合する、および／または、
これを調整する、候補モジュレーターを同定するための
方法が提供される。
【００８１】好ましくは、前記方法は下記を含む： （ａ） 候補モジュレーターを上記のＳＥＰポリペプチ
ドを分泌する細胞に接触させること、該ＳＥＰポリペプ
チドは、候補モジュレーターの当該ＳＥＰポリペプチド
への結合に応答して検出可能なシグナルを提供できる第
二成分に随伴されていること；当該接触は、候補モジュ
レーター類の該ＳＥＰポリペプチドへの結合を十分可能
にする条件下にあること；そして（ｂ） ＳＥＰポリペ
プチド結合のできる候補モジュレーターを、前記第二成
分により産生されるシグナルを検出することにより、同
定すること。
【００８２】好ましくは、前記方法は競合結合アッセイ
である。さらに好ましくは、当該方法は下記を含む： （ａ） （ｉ）上記のＳＥＰポリペプチドに結合するこ
とが知られている検出可能な第一成分および（ｉｉ）候
補モジュレーターを、上記ＳＥＰポリペプチドを分泌す
る細胞と接触させ、該ＳＥＰポリペプチドは、候補モジ
ュレーターの該ＳＥＰポリペプチドへの結合に応答して
検出可能なシグナルを提供できる第二成分と会合してい
ること；該接触は、候補モジュレーター類の該ＳＥＰポ
リペプチドへの結合を十分可能にする条件下にあるこ
と；そして（ｂ） 第一成分がＳＥＰポリペプチドへ結
合するかどうかを、該第一成分と該ＳＥＰポリペプチド
との相互作用から発生するシグナルが無いか、そうでな
いかを、検出することにより、決定すること。
【００８３】また本発明により、標識基質ペプチドＣＰ
４、ＣＰ５、またはＣＰ６を用いるＦＲＥＴアッセイが
意図されるが、ここで、上記のＳＥＰポリペプチドが何
らかのペプチダーゼにより置換される。好ましくは、当
該ペプチダーゼはエキソペプチダーゼまたはエンドペプ
チダーゼである。より好ましくは、当該エキソペプチダ
ーゼはオキシトシナーゼであり、そして当該エンドペプ
チダーゼはＮＥＰまたは非ヒトＳＥＰである。
【００８４】本発明のもう一つの側面に従って、上記の
方法のいずれかにより同定された候補モジュレーターが
提供される。好ましくは、当該モジュレーターは、上記
のＳＥＰポリペプチドまたはペプチダーゼ類に結合す
る、および／または、これを阻害または選択的に阻害す
る。
【００８５】さらなる側面において、本発明は、女性性
機能不全、特にＦＳＡＤ、または男性性機能不全、特に
ＭＥＤ、の治療に使用可能な作用物質（以下、ＳＥＰ阻
害剤またはＳＥＰｉと呼ぶ）を同定するためのアッセイ
（検定）方法に関するが、該アッセイ方法は下記を含
む：テスト作用物質が内因性性器充血プロセスまたは勃
起プロセスを直接亢進できるかどうかを決定すること；
ここで該亢進は、本明細書で定義されるようなテスト作
用物質の存在下で、性器血流または海綿体内圧（ＩＣ
Ｐ）（および／または海綿体血流）の増強と定義され
る；あるテスト作用物質によるそのような増強作用は、
該テスト作用物質が、女性性機能不全、特にＦＳＡＤ、
または男性性機能不全、特にＭＥＤ、の予防および／ま
たは治療に有用と思われることを示しており、そしてそ
こでは、当該テスト作用物質はＳＥＰｉである。
【００８６】例として、本発明は、女性性機能不全、特
にＦＳＡＤ、または男性性機能不全、特にＭＥＤ、を治
療するために、内因性性器覚醒または勃起プロセスを直
接亢進できる作用物質を同定するためのアッセイ方法に
関するが、当該アッセイ方法は下記を含む：あるペプチ
ド（好ましくは、ローダミングリーンＧｌｙ−Ｇｌｙ−
ｄＰｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ
（ＱＳＹTM７）−βＡｌａ−ＮＨ2のような蛍光標識ペ
プチド）（配列番号８）または上記のその他の蛍光標識
ペプチド類で、ＳＥＰにより通常は代謝される当該ペプ
チド、の代謝的分解を阻止できる部分をもつテスト作用
物質を接触させること；そして一定時間後に残るペプチ
ドの活性および／またはレベルを測定すること（例えば
蛍光分析による）；ここで、切断産物ペプチド、ローダ
ミングリーンＧｌｙ−Ｇｌｙ−ｄＰｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｒ
ｇ−Ａｒｇ−ＯＨ、による蛍光のレベルの変化は、該テ
スト作用物質の効力（ＩＣ50）を示し、そして該テスト
作用物質は、女性性機能不全、特にＦＳＡＤ、または男
性性機能不全、特にＭＥＤ、の予防および／または治療
に有用らしいことを示す；そしてここで、該作用物質は
ＳＥＰｉである。
【００８７】さらなる側面において、本発明は、工程
（ａ）本発明に従いアッセイを遂行すること；（ｂ）内
因性性器覚醒プロセスまたは勃起プロセスを直接亢進で
きる一つまたは一つより多い作用物質を同定すること；
および（ｃ）それらの一つまたは一つより多い同定され
た作用物質を多量に調製すること、を含むプロセス（方
法）に関する；そしてここで、該作用物質はＳＥＰｉで
ある。
【００８８】この側面について、工程（ｂ）で同定され
た作用物質は、例えば活性を最大にするように修飾し、
そしてそれから工程（ａ）を繰返してもよい。これらの
工程は、所望の活性または薬物動態プロファイルが達成
されるまで、反復してもよい。
【００８９】ゆえに、さらなる側面では、本発明は、
（ａ１）本発明に従うアッセイを遂行すること；（ｂ
１）内因性性器覚醒プロセスまたは勃起プロセスを直接
亢進できる一つまたは一つより多い作用物質を同定する
こと；（ｂ２）当該同定作用物質の一つまたは一つより
多くを修飾すること；（ａ２）工程（ａ１）を所望によ
り反復すること；そして（ｃ）多量にそれら一つまたは
一つより多い同定された作用物質（すなわち、修飾され
たもの）を調製すること；の諸工程を含む方法に関す
る：そしてここで、該作用物質はＳＥＰｉである。
【００９０】ゆえに、本発明の好ましい側面に従って、
本明細書に記載された本発明の方法のいずれかにより同
定された作用物質が、女性性機能不全（ＦＳＤ）、特に
ＦＳＡＤ、または男性性機能不全、特にＭＥＤの治療ま
たは予防のための薬の製造の使用に提供される。低活性
性欲障害（ＨＳＤＤ）、女性オルガスム障害（ＦＯＤ）
および性疼痛障害（特に性感異常または膣痙）を含む、
他のＦＳＤの治療または予防も意図される。
【００９１】上記のいずれかのアッセイ（またはその修
飾）を用いて同定された候補モジュレーター、候補阻害
剤、候補選択的阻害剤、作用物質（以下、ＳＥＰ阻害剤
またはＳＥＰｉと呼ぶ）などは、どれでもやはり、本発
明の側面と見なされることは、了解されよう。さらに、
何らかのペプチダーゼを調整（好ましくは阻害または選
択的に阻害）でき、そして上記のいずれかのアッセイ
（またはその修飾）を用いて同定される候補モジュレー
ター、候補阻害剤、候補選択的阻害剤、作用物質など
も、どれでもやはり、本発明の側面と見なされること
は、了解されよう。好ましくは、前記候補モジュレータ
ー、候補阻害剤、候補選択的阻害剤、作用物質などは、
エキソペプチダーゼまたはエンドペプチダーゼを調整す
る（好ましくは、阻害する、または、選択的に阻害す
る）。さらに好ましくは、前記エキソペプチダーゼはオ
キシトシナーゼであり、そして前記エンドペプチダーゼ
はＮＥＰまたは非ヒトＳＥＰである。
【００９２】エンドペプチダーゼ類は、中でも、生理活
性ペプチド活性（例えばペプチド作動性シグナル伝達プ
ロセス）の調節に関与するので、エンドペプチダーゼ類
のモジュレーター類（例えば選択的阻害剤を含む阻害剤
類）は、そうした活性の調整に用途を見い出す可能性が
ある。
【００９３】ＥＣＥ−１のような、いくつかのエンドペ
プチダーゼは、生体的に不活性なペプチドのそれらの活
性型へのタンパク質分解に関与している。従って、エン
ドペプチダーゼ類のモジュレーター類（例えば選択的阻
害剤を含む阻害剤類）は、そうした活性の調整に用途を
見い出す可能性がある。
【００９４】特にヒトＳＥＰは、従って、生理活性ペプ
チド活性の調節および／または生体的に不活性なペプチ
ドのそれらの活性型へのタンパク質分解に関与すること
があり得る。
【００９５】その結果として、本発明は、上記の方法の
いずれかにより同定された作用物質を、医薬品としての
使用に提供する。従って、上記のＳＥＰポリペプチドま
たはペプチダーゼのモジュレーター（好ましくは阻害剤
または選択的阻害剤）として作用可能なその種の作用物
質は、ペプチド作動性シグナル伝達プロセスの調整のよ
うな生理活性ペプチド活性を調節する側面に関する治療
分野に、および／または生体的に不活性なペプチドのそ
れらの活性型へのタンパク質分解に、用途を見い出す可
能性がある。そうした治療的に有用な分野は、非限定的
に、性的機能不能（例えば女性性機能不全、特にＦＳＡ
Ｄ、または男性性機能不全、特にＭＥＤ）、妊性障害、
卒中のような神経変性障害、高血圧のような心臓血管疾
患、創傷治癒／組織修復など、を含む。
【００９６】本発明の関係における用語「阻害剤」（お
よび同類物）は、「阻害される」分子がその通常の生体
機能／作用を実行するのを実質的に阻止できる作用物質
を、意味する。そのような「阻害剤」は、一つより多い
タイプの分子を阻害することも可能である、すなわち、
「非選択的阻害剤」でもあり得る。
【００９７】本発明の関係における用語「選択的阻害
剤」（および同類物）は、「阻害される」分子がその通
常の生体機能／作用を実行するのを実質的に阻止できる
作用物質を、意味する。そのような「阻害剤」は、一つ
のタイプの分子だけを、または限られた数のタイプの分
子を、一般には阻害する。いくつかの「選択的阻害剤」
は、当然、他のものより一層選択的である。
【００９８】例えば、本発明の作用物質がＳＥＰ阻害剤
（ＳＥＰｉ）である場合、本発明の該ＳＥＰｉ類は１０
０ナノモラー以下に、より好ましくは５０ナノモラー以
下にＩＣ50をもつ。
【００９９】好ましくは、本発明に従うＳＥＰ阻害剤
は、中性エンドペプチダーゼＮＥＰＥＣ３．４．２４．
１１およびアンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）より
も、ＳＥＰに対して３０倍以上、より好ましくは５０倍
以上の選択性をもつ。このことは、該ＳＥＰｉが全身的
に（例えば経口により）投与された場合、心臓血管事象
の見込み（例えば血圧の低下）を、減少させる。好まし
くは、また該ＳＥＰｉは、エンドセリン変換酵素（ＥＣ
Ｅ）よりも、１００倍以上の選択性をもつ。
【０１００】ＳＥＰｉ化合物は、実験の部（後記）に記
述の教示に従って、調製される。それらは作用物質とし
てテストされ、そして内因性勃起プロセスの亢進に有用
なことが見い出されており、そのためＭＥＤおよびＦＳ
ＡＤの予防および／または治療に有用である。
【０１０１】何らかの特定理論に限定されずに、本明細
書では、ＳＥＰを阻害することにより、性覚醒中に放出
される、ニューロン的に放出される他の血管作動性作用
物質（最もありそうなのは血管作動性腸管タンパク質
（ＶＩＰ））が亢進されると提案する。該ＳＥＰｉの使
用は、性的刺激の際に放出されるニューロペプチド（最
もありそうなのがＶＩＰ）の作用を増強し、それ故、海
綿体血流従って海綿体内圧を増加することにより男性勃
起機構を、また性器血流を増加することにより女性充血
を、増強する。
【０１０２】本発明に従う化合物類の使用は、非ＮＯ依
存性ＮＡＮＣ経路を亢進することを介して働き、ＭＥＤ
およびＦＳＡＤを治療し、そして陰茎および膣／陰核中
の窒素作動性シグナル伝達を増強または容易にすると、
さらに提案する。
【０１０３】研究により本発明者らは、男性および女性
の性覚醒の生理についての強健で再現性のあるモデルを
開発した。このモデルは麻酔した家兎を用い、レーザー
ドップラー技術を採用し、心臓血管パラメーターをルー
ティンに記録しながら、海綿体内圧および性器血流をモ
ニターする。テスト作用物質の不在および存在下で、骨
盤神経刺激またはＶＩＰの注入により誘導される、陰茎
内の海綿体内圧および膣（そして陰核の場合でも）の血
流における僅かの変化を測定できる。
【０１０４】出願人らは、この動物モデルが臨床データ
を直接反映すると考えている。従って、このモデルは、
海綿体内圧の増加を介する陰茎勃起の亢進および膣また
は陰核血流の亢進を測定するような、例えばＭＥＤおよ
びＦＳＡＤの予防および／または治療のための候補作用
物質を研究するのに、使用可能である。
【０１０５】さらなる側面において、本発明は、ＦＳＡ
ＤまたはＭＥＤを治療するために、内因性性器覚醒プロ
セスまたは勃起プロセスを直接亢進可能な作用物質を同
定するためのアッセイ方法に関するが、当該アッセイ方
法は下記を含む：すなわち、本発明の動物モデルに作用
物質を投与すること；そして内因性性器覚醒プロセスま
たは勃起プロセスにおける変化を測定すること；ここ
で、該変化は、定義されたようなテスト作用物質の存在
下で、該動物モデルにおける膣／陰核血流、海綿体内圧
（ＩＣＰ）（および／または海綿体血流）の増強と定義
される；そしてここで、該作用物質はがＳＥＰｉであ
る。
【０１０６】さらなる側面において、本発明は診断方法
に関するが、該方法は下記を含む：すなわち、女性また
は男性から試料を単離すること；該試料が、女性性機能
不全、好ましくはＦＳＡＤ、または男性性機能不全、好
ましくはＭＥＤを起すほどの量に存在する構成要素を、
含むかどうかを決定すること；なお、そこでは、該構成
要素が、女性における内因性性器覚醒プロセスまたは男
性の海綿体における勃起プロセスに、直接作用を及ぼ
し；そしてそこでは、該構成要素が、作用物質の使用に
より有益な作用を達成するように調整が可能であり；そ
してここで、当該作用物質はＳＥＰｉである。
【０１０７】さらなる側面において、本発明は、単離さ
れた女性または男性試料中に構成要素を検出するための
手段を含む、診断組成物またはキットに関するが；ここ
で該手段は、該試料が該構成要素を、女性性機能不全好
ましくはＦＳＡＤ、または男性性機能不全好ましくはＭ
ＥＤを起すような量で含むか、または性機能不全、好ま
しくはＦＳＡＤまたはＭＥＤを起すための量で存在する
かどうかを決定するのに使用可能であり；ここで該構成
要素は、内因性性器覚醒プロセスまたは勃起プロセスに
直接作用を及ぼし、そしてそこでの当該構成要素は、作
用物質の使用により有益な作用を達成するように調整が
可能であり；そしてここで、当該作用物質はＳＥＰｉで
ある。
【０１０８】参照を容易にするために、本発明のこれら
およびさらなる側面は、ここで適当な節見出しの下に、
論考することとする。ただし、各節下の教示内容は、各
特定節に必ずしも限定されるものではない。
【０１０９】ヒトＳＥＰ酵素 上に説明したように、本発明は、ヒト可溶性分泌エンド
ペプチダーゼ（ヒトＳＥＰ）と名付けられた、新規エン
ドペプチダーゼ酵素の使用、およびアッセイ方法で同一
物をコードするヌクレオチド配列に関する。本発明はま
た、疾患の診断および予防および／または治療に有用な
作用物質を同定するための方法における新規核酸および
アミノ酸配列の使用に関する。本発明は特に、エンドペ
プチダーゼ活性、好ましくはヒトＳＥＰ活性を調整（好
ましくは阻害または選択的に阻害）できる作用物質を評
価および／またはスクリーンするための新規核酸および
アミノ酸配列の使用に関する。
【０１１０】ヒトＳＥＰは、さまざまなソースに存在
し、またそこから得られると考えられている。例とし
て、ヒトＳＥＰは、心臓血管系、神経系、内分泌系およ
び精巣のいずれかの一つまたは一つより多くに見られ
る。
【０１１１】また出願人らは、例えば：齧歯類（マウス
（Ｉｋｅｄａら、ＪｏｕｒｎａｌＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ
Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２７４巻、１９９９、３２４６
９−３２４７７ページ）およびラット（ＮＥＰ ＩＩ−
国際特許出願公開ＷＯ ９９／５３０７７）、ウシ属、
ヒツジ、ブタ、およびウマ科のような多くの他のソース
にも存在すると考えている。
【０１１２】該ヒトＳＥＰは天然に存在する型と同じで
あってもよい−この側面については、好ましくは、該ヒ
トＳＥＰは、非天然アミノ酸配列である（すなわち、そ
れは自然環境には存在しない）−またはその変異体、相
同体、断片または誘導体である。加えて、または別に、
該ヒトＳＥＰは単離されたヒトＳＥＰおよび／または精
製されたヒトＳＥＰである。該ヒトＳＥＰは、天然であ
るかないかを問わず、どのような適切なソースから得て
もよく、あるいは、それにより産生されてもよく、また
は、それは合成品、半合成品、あるいは組換え体でもよ
い。
【０１１３】該ヒトＳＥＰコード配列は、天然に存在す
る型と同じであってもよい−この側面については、好ま
しくは、該ヒトＳＥＰコード配列は、非天然ヌクレオチ
ド配列である（すなわち、それは自然環境には存在しな
い）−またはその変異体、相同体、断片または誘導体で
ある。加えて、または別に、該ヒトＳＥＰコード配列
は、単離されたヒトＳＥＰコード配列および／または精
製されたヒトＳＥＰコード配列である。該ヒトＳＥＰコ
ード配列は、天然であるかないかを問わず、どのような
適切なソースから得てもよく、あるいは、それにより産
生されてもよく、または、それは合成品、半合成品、あ
るいは組換え体でもよい。
【０１１４】ヒトＳＥＰ活性およびスクリーニング ヒトＳＥＰおよび／またはそのコード配列および／また
はそれにハイブリダイズできる配列は、異なるＳＥＰ間
で薬剤候補の選択性をテストするのに有用である。
【０１１５】ヒトＳＥＰは、さまざまな生理活性ペプチ
ドを加水分解（タンパク質分解）できると考えられてい
る。ヒトＳＥＰ ｍＲＮＡは、他の組織に比べて、精巣
に最も豊富にあることが、（本明細書で）証明されてい
る。これは、マウスＳＥＰについて公表されたデータ
（Ｇｈａｄｄａｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊｏｕ
ｒｎａｌ、３４７巻、２０００、４１９−４２９ペー
ジ）と軌を一にするが、そこではさらに、該ｍＲＮＡは
円形および楕円形の精細胞に局在化されている。
【０１１６】複数の異なるタンパク質分解活性が、精巣
に既に確認されており、そしていくつかの場合には、精
巣機能（例えばＡＣＥ活性）に必須なことが示されてい
る。この組織に豊富なことから、ＳＥＰの一つの可能性
のある生理的役割は、精巣の機能に関連するはずである
（例えば妊性）。
【０１１７】ヒトＳＥＰは、精巣の妊性または別の機能
の面に関与する、精巣内の特定の生理的に重要な生体ペ
プチドを加水分解し、そのペプチドを活性化、または不
活性化するらしい。この（予示される）生理的ペプチド
の正確な性質については、まだはっきりしない。しかし
ＳＥＰは、ビッグ−エンドセリン、エンドセリン−１、
アンギオテンシン−Ｉ、サブスタンス Ｐ、ブラジキニ
ン、エンケファリン類、および心房性ナトリウム利尿ペ
プチド（ＡＮＰ）を含む多くの生体ペプチドを加水分解
できる。これらのいくつかは精巣で機能することが知ら
れている。例えばエンドセリン−１は、精巣中に見ら
れ、そこで精細管の収縮性の促進に関与する。興味深い
ことに、ビッグ−エンドセリンからエンドセリン−１を
生成すると考えられている精巣内に検出される酵素活性
（ＥＣＥ）は、阻害剤ホスホラミドンおよびチオルファ
ンに感受性がある。マウスＳＥＰおよびヒトＳＥＰもこ
れらの阻害剤に感受性があるので、この活性はＥＣＥよ
りもＳＥＰに関係するらしい。ヒトＳＥＰ活性を阻害す
る化合物は、従って、精巣内のエンドセリンのレベルの
変更（増加または減少）をもたらし、そしてこれは、不
妊の予防および／または治療に、あるいは、男性用避妊
薬として、役立つ可能性がある。
【０１１８】血管作動性腸管ペプチド（ＶＩＰ）は、精
巣で役割を担うもう一つの可能性のあるヒトＳＥＰ基質
である。ＶＩＰは、精巣中の血流を増加し、そしてまた
精巣ステロイド産生ならびにヒト精子の運動性を促進す
ることが、示された（Ｓｉｏｗら、Ａｒｃｈｉｖｅｓ
ｏｆ Ａｎｄｒｏｌｏｇｙ、４３巻、１９９９、６７７
１ページ）。ヒトＳＥＰ活性を阻害する薬剤は、精巣中
のＶＩＰレベルの調整に、従って精巣血流、ステロイド
産生または精子運動性に有用である可能性がある。
【０１１９】ヒトＳＥＰ ｍＲＮＡは精巣に最も豊富に
あるが、逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−Ｐ
ＣＲ）のような鋭敏な方法を用いれば、多様な組織（例
えば、唾液腺および甲状腺）にもより低いレベルで検出
可能である。マウスでは、ＳＥＰは、心臓、脳、脾臓、
肺、腎臓、腸、および副腎に検出されている。完全長ヒ
トＳＥＰ ｃＤＮＡの単離に本明細書で使用されたｃＤ
ＮＡライブラリースクリーニングアプローチでも、ヒト
の脳、胎盤、小腸および腎臓組織に由来するライブラリ
ー中にヒトＳＥＰ ｃＤＮＡを同定した。
【０１２０】ヒトＳＥＰ酵素は、細胞からも分泌される
ことがある。従って、ヒトＳＥＰタンパク質は、精巣に
豊富なだけでなく、体中の広い範囲の他の組織にも中程
度のレベルで見られるらしい。これらの組織ではヒトＳ
ＥＰが、上述の生体ペプチド基質を加水分解するらし
い。
【０１２１】ＳＥＰの酵素活性を阻害する薬剤は、それ
故、多様な異なる組織において上述のヒトＳＥＰ基質の
多くについてレベルの変化をもたらようである。これら
のヒトＳＥＰ基質は、通常、ペプチド作動性シグナル伝
達プロセスにしばしば随伴している生体活性分子または
それらの前駆体なので、ヒトＳＥＰ阻害剤は、可能性が
もっとも高いものとして性機能不全（例えば女性性機能
不全、特にＦＳＡＤ、または男性性機能不全、特にＭＥ
Ｄ）および生殖障害、ならびに神経変性障害（例えば卒
中）のような他の疾患／障害、および高血圧のような心
臓血管疾患などを非限定的に含む、ペプチド作動性シグ
ナル伝達に伴う多くの異なる障害の予防および／または
治療に有用と思われる。
【０１２２】このように、ヒトＳＥＰおよび／またはそ
のコード配列および／またはそれにハイブリダイズでき
る配列は、ペプチド作動性シグナル伝達に関連する疾患
の予防および／または治療用の薬剤候補をスクリーニン
グするのに有用であろう。さらに、ヒトＳＥＰおよび／
またはそのコード配列および／またはそれにハイブリダ
イズできる配列は、上記のもののような疾患の予防およ
び／または治療用の薬剤候補をスクリーニングするのに
有用と考えられる。
【０１２３】ヒトＳＥＰをコードするヌクレオチド配列
またはヒトＳＥＰ酵素そのものの一方または両方を、Ｓ
ＥＰ活性に影響する可能性がある作用物質をスクリーニ
ングするのに、使ってもよい。特に、ヒトＳＥＰ自身を
コードするヌクレオチド配列は、ＳＥＰ活性を阻害する
可能性がある作用物質のスクリーニングに使用可能であ
る。さらに、ヒトＳＥＰをコードするヌクレオチド配列
またはヒトＳＥＰ酵素そのものは、選択的にＳＥＰ活性
を阻害するような、選択的にＳＥＰ活性に影響する作用
物質のスクリーニングに使用可能である。
【０１２４】ヒトＳＥＰ活性の測定‐ヒトＳＥＰアッセ
イ ヒトＳＥＰタンパク質の酵素的（タンパク分解性）活性
は、例えば、ヒトＳＥＰ酵素の試料を基質ペプチドと緩
衝液（例えば５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ；ｐＨ７．４）中で
混合し、その混合物を、ＳＥＰ活性に適当な温度（普通
は３０−３７℃）で、ヒトＳＥＰが該ペプチド基質の測
定可能な部分を産物へ切断するために作用するのに十分
な（１−３時間のような）時間、インキュベートするこ
とを含むアッセイで測定可能である。その後で、該タン
パク質分解の基質および／または産物を、該基質が該Ｓ
ＥＰ酵素により切断されたことを証明するために、分析
してもよい。
【０１２５】候補ヒトＳＥＰ阻害剤化合物、またはヒト
ＳＥＰの活性を変える可能性があるホスホラミドンおよ
びチオルファンのような対照テスト化合物の作用は、そ
れらを初期混合物中に適当なテスト濃度の範囲、典型的
には０．１ｎＭから５０μＭ、に含ませることにより、
このタイプのアッセイで測定可能である。
【０１２６】上のタイプのアッセイでの使用に適したＳ
ＥＰ酵素の試料は、組換え体発現系を用いて産生でき
る。それは典型的には、ヒトＳＥＰ ｃＤＮＡまたは遺
伝子を含む発現プラスミド（例えば、ＮＣＩＭＢ ４１
１１０から得られる発現ベクター）を、そこでヒトＳＥ
Ｐタンパク質が次いで発現される、宿主生物または細胞
中へ導入することを、含む。ＳＥＰタンパク質は、該宿
主から増殖培地中へ（例えば、もし哺乳類細胞中で人工
的に発現されれば）放出されるか（すなわち、細胞外に
分泌される）、または細胞中に保留される（例えば、も
し酵母または昆虫細胞中で人工的に発現されれば、その
場合、可能性のある不適切な発現により、ヒトＳＥＰが
当該細胞から分泌されなくなることがあり、従ってその
細胞内における所在位置からの分離が必要になる）。典
型的には宿主は、酵母、昆虫細胞、哺乳類細胞、または
細菌でもよい。該ＳＥＰ酵素は、次いで、培養培地また
は宿主細胞（例えば、該細胞を溶解することにより）か
ら回収されるが、それにはタンパク質精製法を使うこと
が必要になろう。
【０１２７】上述のアッセイ用のヒトＳＥＰ酵素は、適
当な組織源（もし十分な量が得られるなら）から精製し
てもよい。この組織には精巣または脳を含むことがあり
得る。
【０１２８】該ヒトＳＥＰアッセイでの使用に適した基
質は、ＳＥＰが、時間について有用な期間、例えば５時
間、で測定可能な速度で切断できる、どのようなペプチ
ドでもよい。そうした基質ペプチドは、エンケファリ
ン、ＶＩＰ、ブラジキニン、サブスタンスＰ、ビッグエ
ンドセリン、エンドセリン、アンギオテンシン−Ｉまた
はＡＮＰのような、生体ペプチドと同一の、または同様
な、ペプチドを非限定的に含んでよい。該ペプチドは、
該アッセイの前、間、または後に、基質および／または
産物の測定を容易にする蛍光性、着色性、放射性または
他の化学基を含むように、修飾が可能である。
【０１２９】該ヒトＳＥＰアッセイにおける使用に適し
た好ましい基質は、少なくとも一つの蛍光供与体色素お
よび少なくとも一つの蛍光受容体色素で標識されたＳＥ
Ｐ切断可能合成ペプチドで、そして当該ＳＥＰ切断（タ
ンパク質分解）の阻害を検出するのに用いられるアッセ
イは、蛍光共鳴エネルギー伝達（ＦＲＥＴ）アッセイで
ある。
【０１３０】ＦＲＥＴアッセイ ＦＲＥＴは、第１蛍光色素（「供与体」色素）が、典型
的には光照射により励起され、その吸収したエネルギー
を、より長波長をもち、そのためより低いエネルギー放
出をする第２色素（「受容体」色素）へ伝達するプロセ
スである。第２色素が蛍光性であると、エネルギー伝達
により、該第２色素の波長において蛍光放出が起る。し
かし、第２色素が非蛍光性の場合、吸収されたエネルギ
ーは蛍光放出を起さず、最初の供与体色素の蛍光は「消
光された」と言われる。ＦＲＥＴの一般的原理は、図９
に図解されている。
【０１３１】エネルギー伝達は、リン光性および化学発
光性供与体を含む発光性（ルミニセンスの）供与体の放
出（発光）を消光するためにも、利用できる。エネルギ
ー伝達を妨げることによって、ルミニセンス放出が回復
すると、そのルミニセンスは「脱消光された」または
「不消光された」と言われる。ＦＲＥＴは、ＤＮＡのハ
イブリッド形成および増幅、タンパク質フォールディン
グの動態、（本発明におけるような）タンパク質加水分
解的な分解、および他の生体分子間の相互作用を調べる
のに利用されてきた。これらの応用に利用される群を抜
いて一般的な供与体・受容体色素ペアは、ダブシル（ｄ
ａｂｃｙｌ）（消光色素）およびＥＤＡＮＳ（ｆｌｕｏ
ｒｏｐｈｏｒｅ、蛍光色素）である（これらはＴｈｅ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ
ｏｆ ＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅＰｒｏｂｅｓ ａｎ
ｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、１９９
６、第９．３章に論考されている）。
【０１３２】ダブシル・ＥＤＡＮＳエネルギー伝達ペア
の広範な使用にもかかわらず、この技術には、細胞性自
己蛍光、ＤＮＡ架橋形成、および多くの薬剤や生物活性
タンパク質の強い固有の吸収を含む、多数の短所があ
る。ダブシルおよびＥＤＡＮＳの両者とも吸光係数が低
いため、比較的感度の悪いアッセイになっている。
【０１３３】紫外励起の使用に伴う難点を避けるため、
エネルギー受容体の吸収は、使用する可視光蛍光色素に
隣接して整列させるべきである。紫外部で励起される色
素を含むだけでなく、フルオレセイン類、ローダミン
類、そしてＣＹ５およびアロフィコシアニンのようなさ
らに長波長蛍光色素も含む、非常に多様な色素の蛍光を
消光するための化合物が発見されている。加えて、その
ような化合物は、エネルギー伝達アッセイに通常使われ
る消光化合物よりも、相当大きな吸光係数をもってい
る。
【０１３４】そうした新しい極めて有用なクラスの非蛍
光エネルギー受容体（ａｃｃｅｐｔｏｒ）の例は、ＱＳ
ＹTM−７（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎ
ｃ．、オレゴン、米国）である。好ましくは、該受容体
を、供与体蛍光色素、好ましくはローダミングリーン
と、本発明のＦＲＥＴアッセイで、一対にする。さらに
好ましくは、該受容体／供与体ＦＲＥＴペアリングを、
（例えばＳＥＰによるタンパク質加水分解的分解を受け
る）基質ペプチドにリンクさせる。最も好ましくは、該
標識基質ペプチドは、蛍光作動性小ペプチド、好ましく
はローダミングリーンＧｌｙ−Ｇｌｙ−ｄＰｈｅ−Ｌｅ
ｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ（ＱＳＹTM７）−
βＡｌａ−ＮＨ2（配列番号８）である。
【０１３５】ＳＥＰ ＦＲＥＴアッセイ そのようなＦＲＥＴに基づくＳＥＰアッセイは、ＮＥＰ
を用いる使用のためにＣａｒｖａｌｈｏらにより開発さ
れたアッセイに基づいている（Ｃａｒｖａｌｈｏら、Ａ
ｎｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３７、１６７−１７３ペ
ージ（１９９６））。該ＳＥＰ ＦＲＥＴアッセイは、
同様の分子内的に消光された蛍光作動性ペプチド基質を
利用するが、新規な蛍光作動性の供与体／受容体色素の
組合せを用いている。
【０１３６】合成標識ペプチドＣＰ４、ＣＰ５、および
ＣＰ６の調製は、下記でさらに説明する。ヒトＳＥＰア
ッセイに使用する適切な緩衝液は、その中でヒトＳＥＰ
に活性が認められ、そして該アッセイの最終結果に別途
干渉しなければ、どのようなものでもよい。普通それ
は、中性ｐＨを維持する緩衝液であろう。そうした緩衝
液の例は、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ Ｃ１；ｐＨ７．４であ
る。しかしＴｒｉｓは温度変動によるｐＨの変化をきわ
めて起し易いので、ヒトＳＥＰ ＦＲＥＴアッセイでの
使用には、その種の緩衝液は好ましくない。それ故、ヒ
トＳＥＰ ＦＲＥＴアッセイで使用する好ましい緩衝液
は、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ；ｐＨ７．４である。
【０１３７】ペプチダーゼＦＲＥＴアッセイ 上述の新規ペプチド基質、例えばＣＰ４、ＣＰ５、ＣＰ
６、または他のもののいずれであっても、ＳＥＰ以外の
広い種類のペプチダーゼ酵素類のタンパク質分解性の分
解を分析するのに、等しく使えることは、どの当業者に
よっても理解されるだろう。
【０１３８】上述のペプチド基質は、ペプチダーゼ阻害
剤を同定するために、ＦＲＥＴアッセイで使用可能と、
一般的に考えられる（その際、該酵素のタンパク質分解
作用は、阻害剤によって阻害され、そのためシグナルが
出ない（すなわち、供与体色素の蛍光は「消光され
る」））。
【０１３９】酵素類 用語「ペプチダーゼ」は、ペプチド結合を加水分解する
すべての酵素のための用語「ペプチドヒドロラーゼ」と
同義的に使用可能である。ペプチダーゼ類は、ポリペプ
チド鎖の末端近くでのみ働く「エキソペプチダーゼ」
と、ポリペプチド鎖の内部で働く「エンドペプチダー
ゼ」に、さらに分けられる。本発明のＦＲＥＴアッセイ
で有用なエキソペプチダーゼおよびエンドペプチダーゼ
のタイプについて、さらに詳しく以下に説明する。用語
「ペプチダーゼ」の用法は、エキソペプチダーゼ類およ
びエンドペプチダーゼ類の両者に対する全体的用語とし
て、元来使われたような用語「プロテアーゼ」の用法と
同義である（Ｇｒａｓｓｍａｎｎ、Ｗ．およびＤｙｃｋ
ｅｒｈｏｆｆ、Ｈ．酵母のプロテイナーゼとポリペプチ
ダーゼについて、第１３報；Ｒ．Ｗｉｌｌｓｔａｔｔｅ
ｒおよび共同研究者らにより始められた研究系列中にお
ける植物プロテアーゼに関する論述。Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅ
ｙｌｅｒ‘ｓ Ｚ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１７９
（１９２８）４１−７８を参照されたい）、しかし、以
前、Ｅｎｚｙｍｅ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ（１９８
４）では、「ペプチダーゼ」は、サブクラスＥＣ３．
４．１１−１９、ｔｈｅ ｅｘｏｐｅｐｔｉｄａｓｅｓ
（エキソペプチダーゼ類）に含まれる酵素類に制限され
ていたことに、留意すべきである。また、サブクラスＥ
Ｃ３．４．２１−９９に含まれる酵素類について以前使
われた用語「プロテイナーゼ」は、「エンドペプチダー
ゼ」と同じ意味をもっており、整合性のために「エンド
ペプチダーゼ」に置換されたものである。
【０１４０】従って、本発明のＦＲＥＴアッセイは、エ
キソペプチダーゼ類（ＥＣ３．４．１１−１９）および
エンドペプチダーゼ類（ＥＣ３．４．２１−２４および
ＥＣ３．４．９９）を含む、ペプチダーゼ類（ＥＣ３．
４）全体の阻害剤を同定するのにも使用してよい。
【０１４１】エキソペプチダーゼ類はポリペプチド鎖の
末端近くでのみ作用し、遊離のＮ末端で作用するもの
は、単一アミノ酸残基（アミノペプチダーゼ類、ＥＣ
３．４．１１）またはジペプチドまたはトリペプチド
（ジペプチジルペプチダーゼ類およびトリペプチジルペ
プチダーゼ類、ＥＣ３．４．１４）を、遊離する。遊離
のＣ末端で作用するエキソペプチダーゼ類は、単一残基
（カルボキシペプチダーゼ類、ＥＣ３．４．１６−１
８）またはジペプチド（ペプチジルジペプチダーゼ類、
ＥＣ３．４．１５）を遊離する。カルボキシペプチダー
ゼ類は触媒機構に基づいて４群に割振られる：セリン型
カルボキシペプチダーゼ類（ＥＣ３．４．１６）、メタ
ロカルボキシペプチダーゼ類（ＥＣ３．４．１７）、お
よびシステイン型カルボキシペプチダーゼ類（ＥＣ３．
４．１８）である。他のエキソペプチダーゼ類は、ジペ
プチドに特異的（ジペプチダーゼ、ＥＣ３．４．１３）
か、または置換された、環化された、またはイソペプチ
ド結合（αアミノ基へのαカルボキシル基のもの以外の
ペプチド結合）により連結された末端残基を除去する
（オメガペプチダ−ゼ類、３．４．１９）。
【０１４２】上述のエキソペプチダーゼ類のサブ・サブ
クラスはすべて、本発明のＦＲＥＴアッセイで有用な一
連の酵素類の範疇に含まれる。しかし、エキソペプチダ
ーゼ類の好ましい群は、アミノペプチダーゼ類である。
本発明で有用なアミノペプチダーゼの一例はオキシトシ
ナーゼである。
【０１４３】エンドペプチダーゼ類は触媒機構に基づい
てサブ・サブクラスに分けられ、特異性は、群内の個々
の酵素を同定するためにのみ、使われる。それらは、セ
リンエンドペプチダーゼ類（ＥＣ３．４．２１）、シス
テインエンドペプチダーゼ類（ＥＣ３．４．２２）、ア
スパラギン酸エンドペプチダーゼ類（ＥＣ３．４．２
３）、メタロエンドペプチダーゼ類（ＥＣ３．４．２
４）およびトレオニンエンドペプチダーゼ類（ＥＣ３．
４．２５）のサブ・サブクラスである。サブ・サブクラ
スＥＣ３．４．２１−２５のどれにも割当てられないエ
ンドペプチダーゼ類は、サブ・サブクラスＥＣ３．４．
９９にリストされる。
【０１４４】上述のエンドペプチダーゼ類のサブ・サブ
クラスはすべて、本発明のＦＲＥＴアッセイで有用な一
連の酵素類の範疇に含まれる。しかし、エンドペプチダ
ーゼ類の好ましい群は、メタロエンドペプチダーゼ類で
ある。酵素のメタロエンドペプチダーゼ群内に、メタロ
エンドペプチダーゼ類のネプリリシンファミリーがあ
る。メタロエンドペプチダーゼ類のネプリリシンファミ
リーの例は、ネプリリシン（ＮＥＰ、ＣＤ１０、ＣＡＬ
ＬＡ、エンケファリナーゼまたはＥＣ３．４．２４．１
１とも呼ばれる）、エンドセリン変換酵素類（ＥＣＥ−
１およびＥＣＥ−２）、ＰＥＸ、ＫＥＬＬ、Ｘ変換酵素
／損傷誘導性神経エンドペプチダーゼ（ＸＣＥ／ＤＩＮ
Ｅ）、および可溶性分泌エンドペプチダーゼ／ネプリリ
シンＩＩ（ＳＥＰ／ＮＥＰＩＩ；Ｇｈａｄｄａｒ、Ｇ．
ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊｏｕｒｎａｌ、３４７巻、２０
００、４１９−４２９ページ；Ｉｋｅｄａ、Ｋ．ら、Ｊ
ｏｕｒｎａｌ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ、２７４巻、１９９９、３２４６９−３２４７７ペ
ージ；Ｔａｎｊａ、Ｏ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏ
ｎ、２７１巻、２０００、５６５−５７０ページ；国際
特許出願公開ＷＯ ９９／５３０７７）と呼ばれる、齧
歯類に発見された酵素、を含む。好ましいネプリリシン
ファミリーメンバーはＮＥＰおよびＳＥＰである。さら
に好ましいのは、本明細書および国際特許出願公開ＷＯ
０２／０６４９２に記載のヒトＳＥＰを含む、ＳＥＰ
である。
【０１４５】エンドペプチダーゼ類の特異性を説明する
場合、用語「オリゴペプチダーゼ」は、タンパク質より
小さな基質にのみ（または至適に）作用するものを指す
のに使われる。
【０１４６】本発明の一つの態様は特定的にＳＥＰ Ｆ
ＲＥＴアッセイに関するが、他のペプチダーゼＦＲＥＴ
アッセイ、好ましくはエンドペプチダーゼＦＲＥＴアッ
セイ、さらに好ましくはＮＥＰ ＦＲＥＴアッセイ、も
本発明により意図される。オキシトシナーゼＦＲＥＴア
ッセイも本発明によって意図される。
【０１４７】アッセイ測定 例えば、ヒトＳＥＰアッセイにおける、基質および／ま
たは産物の測定の方法は、選択されるペプチド基質およ
びその修飾の性質に依存するはずである。例えば、選ば
れる基質が蛍光基を含むならば、蛍光光度計が使える。
同様に、基質が放射性標識されているならば、シンチレ
ーション計数器が使用可能である。大部分の基質および
産物は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）また
はマススペクトロメトリーを用いて測定可能であり、基
質が放射標識または蛍光標識を含むように修飾されてい
ないならば、それらを方法として選択することになろ
う。
【０１４８】さらに、ヒトＳＥＰをコードするヌクレオ
チド配列またはそれに相補的な配列も、ヒト細胞中にヒ
トＳＥＰコード配列の存在を検出するためのアッセイに
使用可能である。これらのアッセイは、本酵素の組織分
布および特定の疾患状態についてのその生体的関連に関
する情報を提供するはずである。
【０１４９】用語「ＳＥＰポリペプチド」、「ＳＥＰ酵
素」（および同類）は、ヒトＳＥＰ配列のスプライス変
異体（イソ酵素類）を包含する。特に、該ヒトＳＥＰイ
ソ酵素類の一つまたは一つより多いどれか、同じものを
コードするヌクレオチド配列、同じものに相補的なヌク
レオチド配列、および同じものに向けられる抗体は、該
イソ酵素類の一つに選択的に影響する作用物質をスクリ
ーンするためのアッセイに使用可能である。これらのア
ッセイは、特定の疾患状態について該イソ酵素類のそれ
ぞれの生体的関連に関する情報を提供するはずである。
これらのアッセイはまた、どの当業者にも、特定組織に
おけるまた特定疾患状態におけるような、ヒトＳＥＰの
発現または活性に影響するのに有用な作用物質を、テス
トし、そして同定するのを可能にする。
【０１５０】ＳＥＰポリペプチド 用語「タンパク質」と取替え可能な用語「ポリペプチ
ド」は、一本鎖ポリペプチド分子、ならびに、個々の構
成ポリペプチドが共有または非共有手段により連結され
ている多ポリペプチド複合体を含む。
【０１５１】好ましくは、本明細書（および、その内容
が全体が参考文献として本明細書に援用されている国際
特許出願公開ＷＯ ０２／０６４９２に詳細に）に記載
のＳＥＰポリペプチドは、一本鎖ポリペプチドである。
【０１５２】本発明の方法で使用されるＳＥＰポリペプ
チドは、実質的に単離された形であってもよい。該ポリ
ペプチドの意図された目的を妨害せず、そして実質的に
なお単離されていると見なされる、担体または希釈剤と
該ポリペプチドが混合可能なことは、理解されるだろ
う。該ＳＥＰポリペプチドは実質的に精製された形であ
ってもよいが、その場合、それは一般に、調製物中のポ
リペプチドの９０％以上、例えば９５％、９８％または
９９％が、本明細書に記載のようなＳＥＰポリペプチド
である、調製物中に該ポリペプチドを、含む。ＳＥＰポ
リペプチド類は、それらの精製を助けるために、例えば
ヒスチジン残基の付加により、修飾されてもよい。
【０１５３】ＳＥＰポリペプチド類は、以下に説明する
ように、合成手段（例えばＧｅｙｓｅｎら、１９９６に
よる記載のように）により、または組換え的に、産生し
てもよい。
【０１５４】疑いを避けるために、本発明の方法は、該
ＳＥＰポリペプチドのネイティブの（天然の）および非
ネイティブの両型（および本発明の方法で有用と本明細
書で述べられているその他のペプチダーゼ類）を利用可
能と考えている。
【０１５５】好ましい態様では、本発明の方法で使われ
るＳＥＰポリペプチドのアミノ酸配列それ自体は、それ
が自然環境中にある場合の、そして、やはりその自然環
境中にあるそのネイティブヌクレオチドコード配列によ
り発現された場合の、そして、やはりその自然環境中に
あるそのネイティブプロモーターのコントロール下に該
ヌクレオチド配列がある場合の、ネイティブヒトＳＥＰ
を網羅しない。参照の便宜上、出願人らは、この好まし
い態様を、「非ネイティブアミノ酸配列」と呼称してい
る。
【０１５６】ＳＥＰポリペプチドの酵素についてのアミ
ノ酸配列に関連する用語「変異体」、「相同体」、「誘
導体」または「断片」は、結果として生じる酵素がＳＥ
Ｐ活性をもつ、好ましくは、添付の配列番号２で示され
る酵素と少なくとも同程度の生体的活性をもつ配列から
のまたはその配列への、一つの（または一つより多い）
アミノ酸の、何らかの置換、変更、修飾、交換、欠失、
または付加を含む。特に、用語「相同体」は、構造およ
び／または機能に関しての相同性を網羅する。配列相同
性に関しては、配列番号２に示す配列に対して、好まし
くは少なくとも７８％、より好ましくは少なくとも８５
％、より好ましくは少なくとも９０％の相同性がある。
配列番号２に示される配列に対して、より好ましくは少
なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％の相
同性がある。
【０１５７】典型的には、変異体、相同体、誘導体また
は断片について、行えるアミノ酸置換のタイプは、該ア
ミノ酸配列の疎水性／親水性を維持しなければならな
い。例えば１、２、または３から１０、２０、または３
０への置換は、その修飾配列がＳＥＰ酵素として作用す
る能力を保持しているという前提で、アミノ酸置換を行
うことが可能である。アミノ酸置換は、非天然性類似体
の使用を含んでもよい。
【０１５８】ＳＥＰポリヌクレオチドのアミノ酸配列
は、適当な発現系で同一物をコードするヌクレオチド配
列の発現により、産生してもよい。加えて、または別
に、該タンパク質そのものを、ヒトＳＥＰアミノ酸配列
の全体または部分を合成する化学的方法を用いて、産生
可能である。例えば、ペプチドは、固相法により合成
し、樹脂から切離し、調製用高速液体クロマトグラフィ
ーにより精製が可能である（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏ
ｎ（１９８３）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ
ｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ
ｓ、ＷＨ Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．、ニューヨ
ーク、ニューヨーク州、米国）。該合成ペプチドの組成
は、アミノ酸分析または配列決定（例えばエドマン分解
法）により確認可能である。
【０１５９】直接ペプチド合成は、各種固相技術（Ｒｏ
ｂｅｒｇｅ ＪＹら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６９巻、１９
９５、２０２−２０４ページ）を用いて実施可能であ
り、そして自動化合成は、例えば、ＡＢＩ ４３１ Ａ
型ペプチドシンテサイザー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅ
ｒ、ボストン、マサチューセッツ、米国）を用いて、該
製造会社により提供された説明書に従って、達成可能で
ある。加えて、ヒトＳＥＰ、またはそのどこか一部、の
アミノ酸配列は、直接合成中および／または化学的方法
の使用と組合わせて、変異体ポリペプチドを産生するた
めに、他のサブユニットからの配列、またはそのどこか
一部と、変更してもよい。
【０１６０】もう一つの態様において、ヒトＳＥＰ天
然、修飾、または組換え配列は、融合タンパク質をコー
ドするために、非相同配列に連結してもよい。例えば、
ＳＥＰ活性の阻害剤についてのペプチドライブラリーを
スクリーニングするために、市販の抗体により認識され
る非相同エピトープを発現するキメラＳＥＰタンパク質
をコードするのが、有用であろう。ＳＥＰ配列および該
非相同タンパク質配列との間に位置する切断部位を含む
ように、融合タンパク質を操作してもよく、そうすれ
ば、そのＳＥＰは非相同構成部分から切離して、精製可
能である。
【０１６１】ヒトＳＥＰは、タンパク質精製を容易にす
るために加えられた一つまたは一つより多い付加的ポリ
ペプチドドメインをもつ、組換え体タンパク質として発
現されてもよい。そうした精製容易化ドメインは、非限
定的に、固定化金属上での精製を可能にするヒスチジン
・トリプトファンモジュールのような金属キレートペプ
チド類（Ｐｏｒａｔｈ Ｊ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐ
ｒ．Ｐｕｒｉｆ．、３巻、１９９２、２６３−２８１ペ
ージ）、固定化免疫グロブリン上での精製を可能にする
プロテインＡドメイン類、およびＦＬＡＧＳエクステン
ション／アフィニティー精製システム（Ｉｍｍｕｎｅｘ
Ｃｏｒｐ、シアトル、ワシントン州、米国）で利用さ
れるドメイン、を含む。該精製ドメインとＳＥＰの間
に、ファクターＸＡまたはエンテロキナーゼ（Ｉｎｖｉ
ｔｒｏｇｅｎ、サンディエゴ、カリフォルニア、米国）
のような切断可能リンカー配列の介在は、精製を容易に
するのに有用である。
【０１６２】ヒトＳＥＰの特定のアミノ酸配列は、配列
番号２に示される。しかし、本発明は、その特定のアミ
ノ酸配列に少なくとも７８％同一性（より好ましくは少
なくとも８５％同一性）をもつアミノ酸配列を含むはず
の、ＳＥＰファミリーからの他のメンバーをコードする
アミノ酸配列を使う方法を包含する。
【０１６３】本明細書に記載されたポリペプチドは、本
アミノ酸配列の断片およびその変異体も含む。適当な断
片は、サイズで少なくとも５、例えば少なくとも１０、
１２、１５または２０アミノ酸であろう。
【０１６４】本明細書に記載されたポリペプチドは、ま
た、保存性置換を含め、一つまたは一つより多い（例え
ば、少なくとも２、３、５または１０）置換、欠失、ま
たは挿入を含むように、修飾されてもよい。これらの側
面は後節で論考される。
【０１６５】ＳＥＰヌクレオチド配列 本明細書で使われる用語「ヌクレオチド配列」は、オリ
ゴヌクレオチド配列またはポリヌクレオチド配列、およ
び（それらの部分のような）それらの変異体、相同体、
断片および誘導体を指す。そのヌクレオチド配列はＤＮ
ＡまたはＲＮＡでよく、それは、ゲノムの、合成の、ま
たは組換え体の起源でよく、二本鎖またはセンスまたは
アンチセンス鎖を表すいずれの一本鎖でもよい。
【０１６６】好ましくは、用語「ヌクレオチド配列」は
ＤＮＡを意味する。より好ましくは、用語「ヌクレオチ
ド配列」は、組換え体ＤＮＡ技術の使用により調製され
たＤＮＡ（すなわち組換えＤＮＡ）を意味する。
【０１６７】疑いを避けるために、本発明の方法は、そ
れぞれネイティブな（天然の）または非ネイティブな
（組換えの）ヌクレオチド配列によりコードされた、該
ＳＥＰポリペプチドのネイティブな（天然の）および非
ネイティブな両方の型（および本発明の方法で有用と本
明細書で述べられているその他のペプチダーゼ類）を利
用可能と考えている。
【０１６８】好ましい態様では、本発明の方法で使われ
るＳＥＰポリペプチドのヌクレオチド配列それ自体は、
やはりその自然環境中にあるそのネイティブプロモータ
ーのコントロール下にそれがある場合の、その自然環境
中の該ネイティブヌクレオチドコード配列を網羅しな
い。参照の便宜上、出願人らは、この好ましい態様を、
「非ネイティブヌクレオチド配列」と呼称している。
【０１６９】本明細書に記載されたヌクレオチド配列
は、それらの中に合成のまたは修飾のヌクレオチドを含
んでもよい。オリゴヌクレオチドに対する多数の異なる
タイプの修飾が、当該技術分野では知られている。これ
らは、メチルホスホネートおよびホスホロチオエートの
バックボーン、該分子の３’および／または５’端にア
クリジンまたはポリリシン鎖の付加、を含む。本発明の
目的のために、本明細書に記載されたヌクレオチド配列
は、当該技術分野で利用可能な如何なる方法によって修
飾されてもよい。そうした修飾は、ヌクレオチド配列の
生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）活性または寿命を亢進するた
めに、行われてもよい。
【０１７０】該「ＳＥＰヌクレオチド」（「ＳＥＰポリ
ヌクレオチド」）はまた、本明細書に提示された配列に
相補的なヌクレオチド配列、またはそれらのどの誘導
体、断片、または変異体を包含する。該配列がその断片
に相補的であれば、その配列は、他の生物などで同様な
コード配列を同定するためのプローブに使用できる。
【０１７１】該「ＳＥＰヌクレオチド」（「ＳＥＰポリ
ヌクレオチド」）はまた、本明細書に提示された配列に
ハイブリッド形成可能なヌクレオチド配列、またはそれ
らのどの誘導体、断片、または変異体を包含する。
【０１７２】該「ＳＥＰヌクレオチド」（「ＳＥＰポリ
ヌクレオチド」）はまた、本明細書に提示された配列に
相補的な配列にハイブリッド形成可能なヌクレオチド配
列、またはそれらのどの誘導体、断片、または変異体を
包含する。
【０１７３】用語「変異体」はまた、本明細書に提示さ
れたヌクレオチド配列にハイブリッド形成可能である配
列に相補的である配列を、包含する。好ましくは、用語
「変異体」は、本明細書に提示されたヌクレオチド配列
に、ストリンジェントな条件（例えば６５℃および０．
１ｘＳＳＣ｛１ｘＳＳＣ＝０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．
０１５ Ｎａ3クエン酸 ｐＨ７．０｝）下で、ハイブ
リッド形成可能な配列に相補的である配列を、包含す
る。
【０１７４】該「ＳＥＰヌクレオチド」（「ＳＥＰポリ
ヌクレオチド」）はまた、（本明細書に提示されたもの
の相補的配列を含め）本明細書に提示されたヌクレオチ
ド配列にハイブリッド形成できるヌクレオチド配列に関
する。
【０１７５】用語「ＳＥＰヌクレオチド」（「ＳＥＰポ
リヌクレオチド」）はまた、（本明細書に提示されたも
のの相補的配列を含め）本明細書に提示されたヌクレオ
チド配列にハイブリッド形成できる配列に相補的である
ヌクレオチド配列に関する。
【０１７６】用語「ＳＥＰヌクレオチド」（「ＳＥＰポ
リヌクレオチド」）はまた、中間から最高のストリンジ
ェンシーの条件下で、本明細書に提示されたヌクレオチ
ド配列にハイブリッド形成可能であるヌクレオチド配列
に関する。
【０１７７】用語「ＳＥＰヌクレオチド」（「ＳＥＰポ
リヌクレオチド」）はまた、ストリンジェントな条件
（例えば６５℃および０．１ｘＳＳＣ）下で、本明細書
に提示されたヌクレオチド配列、またはその相補的配列
にハイブリッド形成できるヌクレオチド配列に関する。
【０１７８】模範的な核酸は、あるいは、ヒトＳＥＰタ
ンパク質をコードし、配列番号１または配列番号５に示
されるＤＮＡ配列にハイブリッド形成する、それらのヌ
クレオチド配列のように特徴づけることが可能である。
好ましいのは、配列番号１または配列番号５に示される
配列またはその相補的な配列に、高度なストリンジェン
シーの条件下で、ハイブリッド形成する、ヒトＳＥＰを
コードするような配列である。
【０１７９】有利には、配列番号１または配列番号５に
示される配列またはその相補的配列の断片に、ストリン
ジェントな条件下で、ハイブリッド形成が可能な核酸配
列が、提供される。好ましくは、該断片は長さ１５およ
び５０塩基の間である。便利には、それは長さ約２５塩
基である。
【０１８０】本発明の方法で使用される好ましい酵素を
コードするヌクレオチド配列に関係する用語「変異
体」、「相同体」、「誘導体」または「断片」は、その
結果生じるヌクレオチド配列がＳＥＰ活性をもつ酵素を
コードするか、コードすることが可能で、そして好まし
くは、配列番号１または配列番号５に示される配列によ
りコードされる酵素と少なくとも同程度に生体的に活性
がある、一つの（または一つ以上の）核酸からの、また
は該配列への、どのような置換、変異、修飾、交換、欠
失、付加でも、含む。特に、用語「相同体」は、その結
果生じるヌクレオチド配列がＳＥＰ活性をもつ酵素をコ
ードするか、コード可能であれば、構造および／または
機能に関する相同性を網羅する。配列相同性に関して
は、配列番号２に示されるアミノ酸配列をコードするヌ
クレオチド配列に、好ましくは少なくとも８３％、より
好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくと
も９０％の相同性がある。配列番号２に示されるアミノ
酸配列をコードするヌクレオチド配列に、より好ましく
は少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％
の相同性がある。配列相同性に関しては、配列番号１ま
たは配列番号５に示される配列に、好ましくは少なくと
も８３％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ま
しくは少なくとも９０％の相同性がある。配列番号１ま
たは配列番号５に示される配列に、より好ましくは少な
くとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％の相同
性がある。
【０１８１】指摘されているように、本発明は、好まし
くは、ｃＤＮＡ配列によりコードされるヒトＳＥＰ（Ｓ
ＥＰポリペプチド）を用いる方法に関する。本発明はま
た、（ｉ）配列番号１または配列番号５に示されるＤＮ
Ａ配列またはその対立遺伝子変異（ｖａｒｉａｔｉｏｎ
ｓ）を含むＤＮＡセグメント、（ｉｉ）配列番号１また
は配列番号５に示されるＤＮＡ配列またはその対立遺伝
子変異を含む非ネイティブＤＮＡ、または（ｉｉｉ）配
列番号１または配列番号５に示されるＤＮＡ配列または
その対立遺伝子変異を含む組換えＤＮＡ、によりコード
されるヒトＳＥＰ（ＳＥＰポリペプチド）を用いる方法
に関する。
【０１８２】本明細書に記載されているようなポリヌク
レオチドは、本発明の方法に使われるようなポリヌクレ
オチドをコードする核酸配列を含む。一連の異なるポリ
ヌクレオチドが、遺伝暗号の縮重の結果として、一定の
アミノ酸配列をコードすることは、理解されるだろう。
【０１８３】本明細書で説明されたアミノ酸配列の知識
によって、本明細書に記載されたようなポリペプチドを
コードするｃＤＮＡおよび／またはゲノムクローンのよ
うな部分的および完全長核酸配列を工夫することは可能
である。例えば、ポリヌクレオチド類は、本明細書に提
示されたアミノ酸配列をコードする標的配列に対して設
計されたプライマーを用いる縮重ポリメラーゼ連鎖反応
（ＰＣＲ）を用い得ることが可能である。該プライマー
類は、典型的には複数の縮重位置を含むはずである。し
かし、縮重を最少にするために、１トリプレットのみに
よりコードされるメチオニンのようなアミノ酸を含む、
本明細書に提示されたアミノ酸配列の領域をコードする
ような、配列が選ばれることになろう。さらに、ＰＣＲ
法のための鋳型ＤＮＡとしてその核酸が使用される生物
におけるコドン使用を考慮して、配列は選ばれることに
なろう。ＰＣＲは、既知配列に対して単一配列（非縮
重）プライマーで配列をクローニングするのに使われる
ものより低いストリンジェンシーの条件で、使われるこ
とになろう。
【０１８４】本発明の方法で使われるポリペプチド断片
をコードする、ＰＣＲにより得られる核酸配列は、次
に、ハイブリッド形成ライブラリースクリーニング技術
を用いて、より大きな配列を得るのに使用してもよい。
例えば、ＰＣＲクローンは放射性原子で標識し、他種、
好ましくは他の哺乳動物種、からのｃＤＮＡまたはゲノ
ムライブラリーをスクリーンするのに使用してもよい。
ハイブリッド形成条件は、典型的には、中程度から高度
にストリンジェントな（例えば約５０℃から約６０℃
で、０．０３Ｍ塩化ナトリウムおよび０．０３Ｍクエン
酸ナトリウム）条件になろう。
【０１８５】アミノ酸配列の全部または一部をコードす
る縮重核酸プローブも、他種、好ましくは他の哺乳動物
種、からのｃＤＮＡおよび／またはゲノムライブラリー
をプローブするのに使用してもよい。しかし、さらなる
スクリーニング処置で使用するための単一配列を得るた
めに、ＰＣＲ法を当初実施することが好ましい。
【０１８６】ヒトＳＥＰ、該ポリヌクレオチドの断片、
融合タンパク質、またはそれらの機能性相当体をコード
するポリヌクレオチド配列は、適当な宿主細胞中でヒト
ＳＥＰの発現を指令する組換えＤＮＡを産生するのに、
使用されてもよい。遺伝暗号の固有の縮重のために、実
質的に同一物をコードする他のＤＮＡ配列、または機能
的に同等なアミノ酸配列は、ヒトＳＥＰをクローン化
し、そして発現するのに、使用されてもよい。当業者に
は理解されるであろうように、非天然的に存在するコド
ンをもつヒトＳＥＰコードヌクレオチド配列を産生する
のが、便利であろう。特定の原核生物のまたは真核生物
の宿主により好まれるコドン（Ｍｕｒｒａｙ Ｅら、
（１９８９）、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１７：
４７７−５０８）は、例えば、ヒトＳＥＰ発現の速度を
増すために、または、天然に存在する配列から産生され
る転写体より、長い寿命のような、望ましい性質をもつ
組換えＲＮＡ転写体を産生するために、選択されてもよ
い。
【０１８７】本明細書に記載され、上記の技術を用いて
得られるポリヌクレオチド配列は、上記の該技術を用い
てさらなる相同性配列および変異体を得るのに、使用さ
れてもよい。それらはまた、例えば該ポリヌクレオチド
配列が発現されつつある特定の宿主細胞についてコドン
選択を至適にするために、各種宿主細胞系で該ポリペプ
チドの発現で使用するように修飾されてもよい。他の配
列変化は、制限酵素認識部位を導入するために、または
該ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの
性質または機能を変更するために、期待されてもよい。
【０１８８】本発明に従って使用されるであろう変更ヒ
トＳＥＰポリヌクレオチド配列は、同一または機能的に
同等のＳＥＰをコードするポリヌクレオチドをもたら
す、異なるヌクレオチド残基の欠失、挿入、または置換
を含む。該タンパク質はまた、サイレント変化を生み、
そして機能的に同等なＳＥＰをもたらす、アミノ酸残基
の欠失、挿入、または置換をもってもよい。故意のアミ
ノ酸置換は、ＳＥＰの生体活性が保持されている限り、
残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性、および／
または両親媒性的性質における類似性に基づいて、行わ
れてもよい。例えば、負に荷電したアミノ酸はアスパラ
ギン酸およびグルタミン酸を含み；正に荷電したアミノ
酸はリシンおよびアルギニンを含み；そして同じような
親水性価をもち非荷電極性頭部基を有するアミノ酸は、
ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニ
ン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、
フェニルアラニン、およびチロシンを含む。
【０１８９】本明細書の範囲内に含まれるのは、ヒトＳ
ＥＰの対立遺伝子である。本明細書で使われる場合、
「対立遺伝子」または「対立遺伝子配列」は、ヒトＳＥ
Ｐの代替型である。対立遺伝子は、突然変異、すなわち
核酸配列の変化に由来し、そして通常は変更されたｍＲ
ＮＡまたはポリペプチドを産生するが、それらの構造ま
たは機能は変更されることも、されないこともある。ど
の遺伝子でも、対立遺伝子型をもたないもの、一つまた
は多数もつものがある。対立遺伝子を生じる普通の突然
変異変化は、アミノ酸の欠失、付加または置換に通常は
帰される。これらのタイプの変化の各々は、単独で、あ
るい他のものと組合わさって、ある一定の配列中で一度
または一度より多く生じることがある。
【０１９０】本明細書に記載のヌクレオチド配列は、該
遺伝子産物のクローニング、プロセシングおよび／また
は発現を修飾する変更を、非限定的に含む、さまざまな
理由で、ヒトＳＥＰコード配列を変更するために操作さ
れてもよい。例えば、新しい制限部位を挿入するため
の、糖鎖形成パターンを変更するための、またはコドン
選択を変えるための、例えば、部位特異的変異誘発など
の当該技術分野では周知である技術を用いて、突然変異
を導入することが可能である。
【０１９１】本明細書に記載されているようなポリヌク
レオチドは、プライマー例えばＰＣＲプライマー、選択
的増幅反応用のプライマー、例えば放射性または非放射
性標識を用いる通常の手段による明白な標識で標識され
たプローブ、を産生するのに使用されてよいし、または
該ポリヌクレオチドはベクターへクローン化されてもよ
い。そのようなプライマー、プローブおよび他の断片
は、長さが少なくても１５、好ましくは少なくても２
０、例えば少なくとも２５、３０、または４０ヌクレオ
チドであるはずで、そしてまた、本明細書で使われるよ
うな用語ポリヌクレオチドにより包含される。
【０１９２】本明細書に記載されているようなポリヌク
レオチドまたはプライマーは、明白な標識を備えていて
もよい。適当な標識は、32Ｐまたは35Ｓのような放射性
同位体、酵素標識、またはビオチンのような他のタンパ
ク質標識、を含む。そうした標識は、ポリヌクレオチド
またはプライマーに付加し、当該技術分野で知られる技
術を用いることにより検出可能である。
【０１９３】ＤＮＡポリヌクレオチドおよびプライマー
のようなポリヌクレオチドは、組換え的に、合成的に、
または当該技術分野の者に利用できるどの手段によって
でも、産生可能である。それらはまた、標準技術により
クローン化も可能である。
【０１９４】一般に、プライマー類は、所望の核酸配列
の一度に１ヌクレオチドの段階的製造を含む、合成的手
段で産生されよう。自動化技術を用いてこれを達成する
ための技法は、当該技術分野で既に利用可能である。
【０１９５】より長いポリヌクレオチド類は、組換え手
段、例えばＰＣＲクローニング技術を用いて、普通は産
生されよう。これは、クローン化したいと思うヌクレオ
チド配列の一領域に対する一対のプライマー（例えば、
約１５−３０ヌクレオチドのもの）をつくること、例え
ばカビの、植物のまたは原核生物の細胞から得たｍＲＮ
ＡまたはｃＤＮＡに当該プライマー類を接触させるこ
と、該所望領域の増幅をもたらす条件下でポリメラーゼ
連鎖反応を行うこと、増幅された断片を（例えば、アガ
ロースゲル上で反応混合物を精製することにより）単離
すること、そして該増幅ＤＮＡを回収すること、を含む
はずである。該プライマーは、適当な制限酵素認識部位
を含むように設計され、その結果、増幅されたＤＮＡが
適当なクローニングベクター中へクローン化できるよう
にしてもよい。
【０１９６】ＤＮＡ分子は、細胞内安定性および半減期
を増すために、修飾することも可能である。可能な修飾
は、該分子の５’および／または３’端のフランキング
配列の添加、または該分子の骨格内にホスホジエステラ
ーゼ結合よりもホスホロチオエートまたは２’Ｏ−メチ
ル結合の使用を、非限定的に、含む。
【０１９７】さらに、ＤＮＡ配列は、一旦わかれば、イ
ソ酵素またはスプライス変異体を特異的に検出するため
のアッセイを設計するのに必要な情報を与える。イソ酵
素特異的ＰＣＲプライマー対は、イソ酵素またはスプラ
イス変異体の特異的ＤＮＡ配列の知識に完全に依存する
アッセイのただ一つの例である。そのようなアッセイ
は、各イソ酵素の特定の疾患状態に対する組織分布およ
び生体関連をアクセスするために、該イソ酵素に対する
ｍＲＮＡの検出を可能にする。それはまた、唯一のイソ
酵素を天然に発現するかもしれない細胞系の同定を可能
にするが、それは、組換え遺伝子を発現する必要のない
ようにする発見である。特定のヒトＳＥＰイソ酵素が特
定の疾患状態と関連することが明らかにされれば、それ
は、イソ酵素ｍＲＮＡの存在を検出するための診断アッ
セイの設計に有用なはずである。
【０１９８】生体試料中のヒトＳＥＰ酵素をコードする
ヌクレオチド配列の異常レベルは、核酸欠失または突然
変異のような染色体異常を反映する可能性がある。従っ
て、ヒトＳＥＰ酵素をコードするヌクレオチド配列は、
ヒトＳＥＰをコードする遺伝子の欠失、突然変異または
染色体転座のような染色体異常を検出するために、診断
的に使用可能なプローブのための基礎を提供する。ヒト
ＳＥＰ遺伝子発現は、そのような疾患状態では変更され
ている可能性があり、あるいは、ヒトＳＥＰをコードす
る遺伝子の領域に存在する染色体異常がある可能性もあ
る。
【０１９９】別の態様では、ヒトＳＥＰのコード配列
は、当該技術分野で周知の化学的方法を用いて、全部ま
たは一部を、合成可能である（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ Ｍ
Ｈら、（１９８０）、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．Ｓ
ｙｍｐ．Ｓｅｒ．、２１５−２２３ページ；Ｈｏｒｎ
Ｔら、（１９８０）、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．Ｓ
ｙｍｐ．Ｓｅｒ．、２２５−２３２ページを参照）。
【０２００】天然に存在する 本明細書で使われる場合、「天然に存在する」は、自然
界に見られるアミノ酸配列をもつヒトＳＥＰを指す。
【０２０１】単離された／精製された 本明細書で使われる場合、用語「単離された」および
「精製された」は、それらの自然環境から除かれ、そし
てそれらが自然に会合している少なくとも一つの他の成
分から単離された、または、分離された核酸配列または
アミノ酸配列のいずれかである分子を指す。
【０２０２】生体的に活性な 本明細書で使われる場合、「生体的に活性な」は、ヒト
ＳＥＰ（ＳＥＰポリペプチド）、好ましくは組換えヒト
ＳＥＰのような、タンパク質（特に酵素）であって、天
然に存在する該タンパク質（特に酵素）と、同様な構造
的機能を（しかし必ずしも同一程度の必要はない）、お
よび／または同様な調節機能を（しかし必ずしも同一程
度の必要はない）、および／または同様な生化学的機能
を（しかし必ずしも同一程度の必要はない）、および／
または免疫学的活性を（しかし必ずしも同一程度の必要
はない）をもつものを指す。特定的には、ヒトＳＥＰ
は、ある種のペプチド基質をタンパク質分解的に切断す
る能力をもち、それが、本明細書で提示されたヒトＳＥ
Ｐ酵素の特徴的活性の一つである。
【０２０３】免疫学的活性 本明細書で使われる場合、「免疫学的活性」は、適切な
動物または細胞中で特定の免疫応答を誘導し、そして特
定の抗体と結合するための、天然の、組換えの、または
合成のタンパク質（特に酵素）またはそれらの何らかの
オリゴペプチドの能力と定義される。
【０２０４】誘導体 アミノ酸配列に関連して本明細書で使われるような用語
「誘導体」は、ヒトＳＥＰの化学修飾を含む。そうした
修飾の例証は、アルキル、アシルまたはアミノ基による
水素の置換があろう。
【０２０５】欠失 本明細書で使われる場合、「欠失」は、一つまたは一つ
より多いヌクレオチドまたはアミノ酸残基が、それぞ
れ、欠けている、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列いず
れかにおける変化として定義される。
【０２０６】挿入／付加 本明細書で使われる場合、「挿入」または「付加」は、
天然に存在するヒトＳＥＰに比べて、一つまたは一つよ
り多いヌクレオチドまたはアミノ酸残基の付加をそれぞ
れもたらした、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列におけ
る変化である。
【０２０７】置換 本明細書で使われる場合、「置換」は、異なるヌクレオ
チドまたはアミノ酸による、それぞれ、一つまたは一つ
より多いヌクレオチドまたはアミノ酸の交換に由来す
る。
【０２０８】相同体 本明細書に記載されたヌクレオチド配列およびアミノ酸
配列に関する用語「相同体」は、該配列の対立遺伝子変
異と同義語としてよい。
【０２０９】特に、本明細書で使われる場合の用語「相
同性」は、用語「同一性」と同等としてよい。ここで、
本明細書に記載されたヌクレオチド配列およびアミノ酸
配列に関する配列相同性は、当該配列のどれか一つまた
は一つより多くを、もう一つの配列と単純な「眼球」比
較（厳密な比較）により、その別の配列が、該ヌクレオ
チド配列に対して少なくとも８３％同一性を、そして該
アミノ酸配列に対して少なくとも７８％同一性をもつか
どうかを見て、決定できる。相対配列相同性（すなわ
ち、配列同一性）は、二つまたは二つより多い配列間の
相同性百分率（％）を計算できる市販のコンピューター
プログラムにより決定することも可能である。その種の
コンピュータープログラムの典型的な例は、ＣＬＵＳＴ
ＡＬまたはＢＬＡＳＴである。
【０２１０】相同性百分率（％）は隣接配列にわたって
計算してもよい、すなわち、一つの配列を他の配列と整
列させ、そして一つの配列中の各アミノ酸を、他の配列
中の対応するアミノ酸と、一度に１残基づつ、直接比較
することである。これは「アンギャップト（ｕｎｇａｐ
ｐｅｄ）」整列と呼ばれる。典型的には、そうしたアン
ギャップト整列は、割合に短い数の残基（例えば５０以
下の隣接アミノ酸）にわたってのみ実施される。
【０２１１】これは非常に簡単で確実な方法であるが、
例えば、その他の点では同一の一対の配列において、一
つの挿入または欠失が、それに続くアミノ酸残基を整列
からずらすことになり、全体的な整列が行われる場合に
は、相同性％に大きな低下を招きかねないことには、配
慮できない。そのため、大半の配列比較法は、総合的相
同性スコアを不等に不利にすることなしに、可能性のあ
る挿入および欠失を考慮に入れた最適整列になるよう
に、設計されている。これは、局所的相同性が最大にな
るように配列整列に「ギャップ」を挿入することによ
り、達成される。
【０２１２】しかしこれらのより複雑な方法は、整列中
に生じる各ギャップに「ギャップペナルティー」を割当
ており、そのため、同じ数の同一アミノ酸について、で
きるだけ少ないギャップをもつ配列整列（二つの比較さ
れた配列間により高い関連を反映する）は、多くのギャ
ップをもつものより、高いスコアを達成するはずであ
る。ギャップの存在に対して比較的高いコストと該ギャ
ップ中の以降の各残基により小さなペナルティーを課す
「アフィンギャップコスト」が典型的には使われる。こ
れがもっとも普通に使われるギャップスコアリングシス
テムである。高いギャップペナルティーは、当然、ギャ
ップのより少ない最適化整列をもたらすはずである。大
部分の整列プログラムはギャップペナルティーを修飾で
きるようにしている。しかし、配列比較にそのようなソ
フトウェアを用いる場合、デフォルト値（初期値）を使
うことが好まれる。例えばｔｈｅ ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏ
ｎｓｉｎ Ｂｅｓｔｆｉｔ ｐａｃｋａｇｅ（下記参
照）を用いる場合、アミノ酸配列についてのデフォルト
ギャップペナルティーは、ギャップ当り−１２で、各エ
クステンション当り−４である。
【０２１３】最大相同性％の計算には、従ってまず、ギ
ャップペナルティーを考慮して、最適整列をつくること
が必要である。そのような整列を実行するための適当な
コンピュータープログラムは、ｔｈｅ ＧＣＧ Ｗｉｓ
ｃｏｎｓｉｎ Ｂｅｓｔｆｉｔ ｐａｃｋａｇｅ（Ｕｎ
ｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、米国；
Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、１９８４、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ
ｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２：３８７）である。配
列比較を実施可能な他のソフトウェアの例は、非限定的
に、ｔｈｅ ＢＬＡＳＴ ｐａｃｋａｇｅ（Ａｕｓｕｂ
ｅｌら、１９９９同上−第１８章を参照）、ＦＡＳＴＡ
（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．、４０３−４１０）およびｔｈｅ ＧＥＮＥＷＯＲ
ＫＳ ｓｕｉｔｅ ｏｆ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｔｏ
ｏｌｓ、を含む。ＢＬＡＳＴおよびＦＡＳＴＡの両者
は、オフラインおよびオンライン検索用に利用可能であ
る（Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９９同上、７−５８から７
−６０ページを参照）。しかし、用途によっては、ｔｈ
ｅ ＧＣＧ Ｂｅｓｔｆｉｔ ｐｒｏｇｒａｍの使用が
好ましい。
【０２１４】最終相同性％は、同一性に換算して測定可
能であるが、場合によっては、整列プロセスそのもの
が、オールオアナッシングペア比較に典型的には基づい
ていない。代わりに、化学的類似性または進化的距離に
基づく各ペアワイズ比較にスコアを割当てる、目盛り付
き類似性スコアマトリックスが一般に使われる。普通に
使われるそうしたマトリックスの例は、ｔｈｅ ＢＬＯ
ＳＵＭ６２ ｍａｔｒｉｘ−ｔｈｅ ｄｅｆａｕｌｔ
ｍａｔｒｉｘ ｆｏｒ ｔｈｅ ＢＬＡＳＴ ｓｕｉｔ
ｅ ｏｆ ｐｒｏｇｒａｍｓである。ＧＣＧ Ｗｉｓｃ
ｏｎｓｉｎ ｐｒｏｇｒａｍｓは、公開初期値または供
給される場合にはカスタムシンボル比較表（さらに詳細
はユーザーマニュアルを参照されたい）のいずれかを、
通常、使用する。ｔｈｅ ＧＣＧ ｐａｃｋａｇｅにつ
いては公開初期値を、または他のソフトウェアの場合に
は、ＢＬＯＳＵＭ６２のようなデフォルトマトリックス
を使用することが好ましい。
【０２１５】一旦ソフトウェアが最適整列をつくったな
らば、相同性％、好ましくは配列同一性％を計算するこ
とができる。該ソフトウェアは典型的には、配列比較の
一部としてこれを行い、そして数値結果を作出する。
【０２１６】指摘したように、用途によっては、配列相
同性（または同一性）は、何らかの適当な相同性アルゴ
リズムを使って、例えばデフォルトパラメーターを使っ
て、決めてもよい。配列データベースの類似性検索にお
ける基本的問題の論考については、Ａｌｔｓｃｈｕｌら
（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ６：１
１９−１２９を参照されたい。用途によっては、初期値
にセットされたパラメーターで、ＢＬＡＳＴアルゴリズ
ムが採用される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、ｈｔｔ
ｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳ
Ｔ／ｂｌａｓｔ＿ｈｅｌｐ．ｈｔｍｌに詳細に説明され
ている。有利には、「実質的相同性」は、ＢＬＡＳＴに
より査定された場合、少なくとも約ｅ−７、好ましくは
少なくとも約ｅ−９、そして最も好ましくはｅ−１０ま
たはそれ以下のＥＸＰＥＣＴ値にマッチする配列に相等
しい。ＢＬＡＳＴ検索におけるＥＸＰＥＣＴについての
デフォルト閾値は通常１０である。
【０２１７】配列同一性を決定する場合に、ギャップペ
ナルティーが使われるならば、好ましくは下記のパラメ
ーターが用いられる：
【０２１８】
【表１】
【０２１９】二つの配列間の同一性および類似性を決め
る他のコンピュータープログラム法は、ｔｈｅ ＧＣＧ
ｐｒｏｇｒａｍ ｐａｃｋａｇｅ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ
ら、１９８４、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ、１２：３８７）およびＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓ
ｃｈｕｌら、１９９０、Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．、
４０３−４１０ページ）を含むが、これらに限定されな
い。
【０２２０】ポリペプチド変異体および誘導体 本明細書に記載されたアミノ酸配列に関係する用語「変
異体」または「誘導体」は、結果として生じるアミノ酸
配列がヒトＳＥＰ活性をもつ、好ましくは配列番号２で
提示されるポリペプチドと少なくとも同一の活性をも
つ、該配列からの、または該配列への、一つの（または
一つより多い）アミノ酸の、何らかの置換、変異、修
飾、交換、欠失、または付加を含む。
【０２２１】本明細書に提示された配列は、本発明の方
法における使用のために、修飾が可能である。典型的に
は、修飾は、該配列のヒトＳＥＰ活性を維持するよう
に、なされる。アミノ酸置換は、例えば１、２、または
３から１０、２０、または３０への置換を、その修飾さ
れた配列がヒトＳＥＰ活性を保持しているという前提
で、行うことが可能である。アミノ酸置換は、非天然的
に存在する類似体の使用を含んでもよい。
【０２２２】保存性の置換は、例えば、下表に従って行
ってもよい。第２列の同じブロック中の、そして好まし
くは第３列の同じ行中のアミノ酸は、相互に置換可能で
ある：
【０２２３】
【表２】
【０２２４】上に指摘したように、本明細書に提示され
たようなタンパク質は、典型的には、組換え手段によ
り、および／または、固相合成のような当業者にはよく
知られた技術を用いる合成手段を用いることにより、つ
くられる。そうした配列の変異体および誘導体は融合タ
ンパク質を含むが、そこでの該融合たんぱく質は、もう
一つのアミノ酸配列に（直接的または間接的に）連結さ
れた、本明細書に記載のＳＥＰポリペプチドの少なくと
もアミノ酸配列を含む。これらの他のアミノ酸配列（そ
れらは時に融合タンパク質パートナーと呼ばれる）は、
該アミノ酸配列の抽出および精製を助けるような、有利
な機能性を典型的には与えるものである。融合タンパク
質パートナーの例は、グルタチオン−Ｓ−トランスフェ
ラーゼ（ＧＳＴ）、６ｘＨｉｓ、ＧＡＬ４（ＤＮＡ結合
および／または転写活性化ドメイン類）およびβガラク
トシダーゼを含む。また該融合タンパク質パートナーお
よび該タンパク質配列との間に、タンパク質加水分解切
断部位を入れて、後者の取出しをできるようにするの
も、都合がよいであろう。好ましくは該融合タンパク質
は、該タンパク質の機能を妨害しないものである。
【０２２５】ポリヌクレオチド変異体および誘導体 本明細書に記載されたヌクレオチド配列に関係する用語
「変異体」または「誘導体」は、結果として生じるヌク
レオチド配列が、ヒトＳＥＰ活性をもつ、好ましくは配
列番号１または配列番号５で提示される配列によりコー
ドされるポリペプチドと少なくとも同一の活性をもつ、
ポリペプチドをコードする、該配列からの、または該配
列への、一つの（または一つより多い）核酸の、何らか
の置換、変異、修飾、交換、欠失、または付加を含む。
【０２２６】上に指摘したように、配列相同性に関して
は、配列番号１または配列番号５に示される配列に、好
ましくは少なくとも８３％、より好ましくは少なくとも
８５％、より好ましくは少なくとも９０％の相同性があ
る。より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは
少なくとも９８％の相同性がある。ヌクレオチド相同性
比較は、上記のように行うことが可能である。用途によ
っては、好ましい配列比較プログラムは、上で説明した
ｔｈｅ ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｅｓｔｆｉｔ
ｐｒｏｇｒａｍである。デェフォルトスコアリングマ
トリックスは、各同一のヌクレオチドについて、１０の
マッチ値を、各ミスマッチについて−９をもつ。デフォ
ルトギャップクリエーションペナルティーは−５０で、
そしてデフォルトギャップエクステンションペナルティ
ーは各ヌクレオチドについて−３である。
【０２２７】本明細書で使われる場合、用語「変異
体」、「相同体」、「断片」および「誘導体」は、該配
列の対立遺伝子変異を包括する。用語「変異体」はま
た、本明細書に提示されたヌクレオチドにハイブリッド
形成できる配列に相補的である配列を包含する。
【０２２８】ハイブリッド形成 本明細書で使われる場合の用語「ハイブリッド形成」
は、「核酸の鎖が塩基対合を通じて相補鎖と結合するこ
とによるプロセス」（Ｃｏｏｍｂｓ Ｊ（１９９４）Ｄ
ｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｙ、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク市、
ニューヨーク州）、ならびにＤｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ
ＣＷおよびＧＳ Ｄｖｅｋｓｌｅｒ（１９９５、ＰＣＲ
Ｐｒｉｍｅｒ、ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕ
ａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅ
ｓｓ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、ニューヨーク、米国）に記
載されているようにＰＣＲ技術で実行されるような増幅
のプロセスを、含むものとする。
【０２２９】ハイブリッド形成条件は、Ｂｅｒｇｅｒお
よびＫｉｍｍｅｌ（１９８７、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ
ｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１
５２巻、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、サンディエゴ、
カリフォルニア、米国）に教示されているように、核酸
結合複合体の融解温度（Ｔｍ）に基づき、下に説明する
ように、限定された「ストリンジェンシー」を与える。
【０２３０】ハイブリッド形成のストリンジェンシー
は、その下でポリ核酸ハイブリッドが安定である条件を
指す。そのような条件は、当該分野の普通の技術者に明
白である。当業者に知られているように、ハイブリッド
の安定性は該ハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）に反映さ
れ、それは、配列相同性の１％減少毎に、約１から１．
５℃低下する。一般に、ハイブリッドの安定性は、ナト
リウムイオン濃度および温度の関数である。典型的に
は、ハイブリッド形成反応は、より高度なストリンジェ
ンシーの条件下で実施され、その後、ストリンジェンシ
ーを変化させて洗浄が行われる。
【０２３１】本明細書で使われる場合、高いストリンジ
ェンシーとは、６５−６８℃で１ＭＮａ+中で安定なハ
イブリッドを形成する核酸配列のもののみのハイブリッ
ド形成が可能な条件を指す。
【０２３２】最高のストリンジェンシーは、典型的に
は、約Ｔｍ−５℃（プローブのＴｍの５℃下）で起る。
高いストリンジェンシーは、プローブのＴｍの約５℃か
ら１０℃下で起る。高度ににストリンジェントな条件
は、例えば６ｘＳＳＣ、５ｘＤｅｎｈａｒｄｔ’ｓ、１
％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、０．１Ｎａ+ピ
ロリン酸および非特異的競合体として０．１ｍｇ／ｍｌ
変性サケ精子ＤＮＡを含む水溶液中でのハイブリッド形
成により、提供できる。ハイブリッド形成後、高度にス
トリンジェントな条件での洗浄は、数段階で行ってもよ
く、最終洗浄（約３０分間）を０．２−０．１ｘＳＳ
Ｃ、０．１％ＳＤＳ中ハイブリッド形成温度で行う。
【０２３３】中または中間のストリンジェンシーは、典
型的には、プローブのＴｍの約１０℃から２０℃下で起
る。低いストリンジェンシーは、典型的には、プローブ
のＴｍの約２０℃から２５℃下で起る。
【０２３４】当業者には理解されるように、最高にスト
リンジェントな条件下でのハイブリッド形成は、同一の
ポリヌクレオチド配列を同定または検出するのに使わ
れ、それに対して、中程度（または低度）にストリンジ
ェントな条件下でのハイブリッド形成は、同様なまたは
関係があるポリヌクレオチド配列を同定または検出する
のに使われる可能性がある。
【０２３５】中程度にストリンジェントな条件は、上記
の溶液中でのハイブリッド形成に相当する条件を指す
が、温度は約６０℃から６２℃である。その場合、最終
洗浄は、１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で該ハイブリッ
ド形成温度で実施される。
【０２３６】低度にストリンジェントな条件は、約５０
から５２℃で上記の溶液中でのハイブリッド形成に相当
する条件を指す。その場合、最終洗浄は、２ｘＳＳＣ、
０．１％ＳＤＳ中で該ハイブリッド形成温度で実施され
る。
【０２３７】これらの条件は、各種緩衝液、例えば、ホ
ルムアミド基本の緩衝液、および温度を用いて、適用お
よび重複してもよいことは、理解される。Ｄｅｎｈａｒ
ｄｔ’ｓ溶液およびＳＳＣは、他の適当なハイブリッド
形成緩衝液（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら編（１９８
９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓ
ｓ、ニューヨーク；またはＡｕｓｕｂｅｌら編（１９９
０）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅ
ｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．を参照）のように、当業者
には周知である。最適ハイブリッド形成条件は、プロー
ブの長さおよびＧＣ含量も関与するので、経験的に決め
る必要がある。
【０２３８】本明細書に提示されたヌクレオチド配列
に、またはそれらの相補体に、選択的にハイブリッド形
成できるポリヌクレオチドは、少なくとも２０、好まし
くは少なくとも２５または３０、例えば少なくとも４
０、６０、または１００またはそれより多い隣接ヌクレ
オチドの領域にわたって、本明細書に提示された対応ヌ
クレオチドに対して、一般に少なくとも８３％、好まし
くは少なくとも８５％または９０％およびより好ましく
は少なくとも９５％または９８％相同的であるはずであ
る。
【０２３９】用語「選択的にハイブリッド形成できる」
は、プローブとして使われるポリヌクレオチドが、バッ
クグラウンドより有意に高いレベルで該プローブに標的
ポリヌクレオチドがハイブリッド形成するのが見られる
条件下で、使われることを、意味する。バックグラウン
ドハイブリッド形成は、例えば、スクリーンされるｃＤ
ＮＡまたはゲノムＤＮＡライブラリー中に、他のポリヌ
クレオチドが存在するために、起ることがある。この場
合、バックグラウンドは、該プローブおよび該ライブラ
リーの非特異的ＤＮＡメンバーとの間の相互作用により
発生するシグナルのレベルを意味し、それは、標的ＤＮ
Ａで観察される特異的相互作用の強度の１／１０以下、
好ましくは１／１００以下である。相互作用の強度は、
例えば32Ｐによるプローブの例えば放射能標識により、
例えば、測定可能である。
【０２４０】ポリヌクレオチドが二本鎖の場合、該二重
体の両鎖は、単独でも、組合わせでも、用語「ポリヌク
レオチド」により包含される。該ポリヌクレオチドが一
本鎖の場合、そのポリヌクレオチドの相補的配列も、用
語「ポリヌクレオチド」の範囲内に含まれると、理解さ
れる。
【０２４１】本明細書に記載された配列の他の変異体
は、個体の範囲、例えば異なる集団からの個体から作ら
れたＤＮＡライブラリーをプローブすることによって、
得ることも可能である。加えて、他のウイルス性／細菌
性、または細胞性相同体、特に哺乳動物細胞（例えばウ
シ属、ヒツジ、ブタ、ウマ科および霊長類細胞）中に見
られる細胞性相同体を得てもよく、そしてそのような相
同体およびそれらの断片は、一般に、配列番号１または
配列番号５に示される配列と選択的にハイブリッド形成
ができるはずである。そうした配列は、中から高厳密性
の条件下で、他の動物種から作られるｃＤＮＡライブラ
リーまたは、から由来のゲノムＤＮＡライブラリーをプ
ローブすること、および配列番号１または配列番号５に
示される配列の全部または一部を含むプローブでそうし
たライブラリーをプローブすることにより、得てもよ
い。同様な考慮は、本発明のポリペプチドまたはヌクレ
オチド配列の種相同体および対立遺伝子変異体を得るの
に、当てはまる。
【０２４２】変異体および株／種相同体は、本発明の配
列内の保存性アミノ酸配列をコードする変異体および相
同体内の標的配列に対してデザインされたプライマーを
使用する、縮重ＰＣＲを用いて得ることも可能である。
保存性配列は、例えば、数種の変異体／相同体からのア
ミノ酸配列を整列することにより、推定可能である。配
列整列は、当該技術分野で知られるコンピューターソフ
トウェアを用いて、実施可能である。例えばｔｈｅ Ｇ
ＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ ＰｉｌｅＵｐ ｐｒｏｇｒ
ａｍが広く使われる。
【０２４３】縮重ＰＣＲで使われるプライマーは、一つ
または一つより多い縮重位置を含み、そして既知配列に
対する単一配列プライマーで配列をクローニングするた
めに使われるものより低度にストリンジェントな条件
で、使用されるはずである。
【０２４４】あるいは、そうしたポリヌクレオチドは、
特徴解明された配列の部位特異的変異誘発により、得て
もよい。これは、該ポリヌクレオチド配列が発現されて
いる特定の宿主細胞に対するコドン選択を最適化するた
めに、例えばサイレントコドン変化が配列に必要な場所
に、有用であろう。他の配列変化は、制限酵素認識部位
を導入するために、または該ポリヌクレオチドによりコ
ードされるポリペプチドの性質あるいは機能を変更する
ために、所望されてもよい。
【０２４５】本明細書に記載されたようなポリヌクレオ
チドは、プライマー、ＰＣＲプライマー、別の増幅反応
用プライマー、例えば放射性または非放射性標識を用い
る通常手段による明白な標識で例えば標識されたプロー
ブを、産生するのに使用してもよい、または該ポリヌク
レオチドはベクター中へクローン化してもよい。そのよ
うなプライマー、プローブおよび他の断片は、長さが少
なくとも１５、好ましくは少なくとも２０、例えば少な
くとも２５、３０、または４０ヌクレオチドであるはず
で、そしてまた、本明細書で使われるような用語「ポリ
ヌクレオチド」により包含される。
【０２４６】ＤＮＡポリヌクレオチドおよびプローブの
ようなポリヌクレオチドは、組換え的に、合成的に、ま
たは当業者に利用可能などのような手段によっても、産
生してよい。それらはまた、標準技術によりクローン化
可能である。
【０２４７】一般に、プライマー類は、所望の核酸配列
の一度に１ヌクレオチドの段階的製造を含む、合成的手
段で産生されよう。自動化技術を用いてこれを達成する
ための技法は、当該技術分野で容易に利用可能である。
【０２４８】より長いポリヌクレオチド類は、組換え手
段、例えばＰＣＲクローニング技術を用いて、普通は産
生されよう。これは、クローン化したいと思う配列の一
領域に隣接する一対のプライマー（例えば、約１５から
３０ヌクレオチドのもの）を作ること、当該プライマ−
類を動物またはヒト細胞から得たｍＲＮＡまたはｃＤＮ
Ａに接触させること、該所望領域の増幅をもたらす条件
下でポリメラーゼ連鎖反応を行うこと、増幅された断片
を（例えば、アガロースゲル上で反応混合物を精製する
ことにより）単離すること、そして該増幅ＤＮＡを回収
すること、を含むはずである。該プライマーは、適当な
制限酵素認識部位を含むように設計され、その結果、増
幅されたＤＮＡが適当なクローニングベクター中へクロ
ーン化できるようにしてもよい。
【０２４９】下記のリストは、その内容がそのまま参考
文献として本明細書援用される、ＷＯ ０２／０６４９
２に、同一（または同様な）タイトルで再掲されてい
る、説明文のタイトルを示す：調節配列、分泌、構築
体、ベクター、組織、宿主細胞、生物、宿主細胞／宿主
生物の形質転換、遺伝的に操作されたあるいは遺伝的に
修飾された、機能的に破壊された、遺伝的に修飾された
動物細胞、ポリペプチドの産生、リボザイム、検出、診
断薬、プローブ、医薬品および医薬品組合せ物。
【０２５０】抗体 本明細書に記載されたＳＥＰポリペプチドのアミノ酸配
列は、当該アミノ酸配列に対して、標準的技術の使用に
よるような、抗体の産生にも使用が可能である。
【０２５１】当該技術分野でよく知られる手順は、ヒト
ＳＥＰポリペプチドに対する抗体の産生に使用可能であ
る。そのような抗体は、非限定的に、ポリクローナル、
モノクローナル、キメラ性、一本鎖、Ｆａｂ断片、およ
びＦａｂ発現ライブラリーにより産生される断片を含
む。中和抗体、すなわち、ヒトＳＥＰポリペプチドの生
理活性を阻害するものは、診断および治療のために特に
好まれる。
【０２５２】抗体の産生のためには、山羊、家兎、ラッ
ト、マウスなどを含むさまざまな宿主を、該ペプチダー
ゼ（例えばヒトＳＥＰ）またはそのいずれかの部分、変
異体、相同体、断片または誘導体または免疫原性を保持
するオリゴペプチドでの注射により免疫することも可能
である。宿主の種類により、免疫応答を増加させるのに
さまざまなアジュバントを使用してもよい。そのような
アジュバントは、非限定的に、フロイントのもの（Ｆｒ
ｅｕｎｄ’ｓ）、水酸化アルミニウムのような金属ゲ
ル、およびリゾレシチン、プルロニックポリオール類、
ポリアニオン類、ペプチド類、油懸濁物、キーホールリ
ンペットヘモシアニン、およびジニトロフェノールのよ
うな表面活性剤を含む。ＢＣＧ（カルメット−ゲラン
菌）およびコリネバクテリウム パルブムは、採用の可
能性のある潜在的に有用なヒトアジュバントである。
【０２５３】ペプチダーゼ（例えばヒトＳＥＰ）に対す
るモノクローナル抗体は、培養中の連続細胞系による抗
体分子の産生を提供するどの技術を使っても、調製して
よい。これらは、非限定的に、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉ
ｌｓｔｅｉｎ（１９７５、Ｎａｔｕｒｅ、２５６巻、４
９５−４９７ページ）により最初に記載されたハイブリ
ドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｓｂ
ｏｒら、（１９８３）、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ、
４巻、７２ページ；Ｃｏｔｅら、（１９８３）、Ｐｒｏ
ｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ
Ａｃａｄｅｍｙｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＵＳＡ）、８
０巻、２０２６−２０３０ページ）およびＥＢＶハイブ
リドーマ技術（Ｃｏｌｅら、（１９８５）、Ｍｏｎｏｃ
ｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃ
ｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、 Ａｌａｎ Ｒ Ｌｉｓｓ Ｉ
ｎｃ．、７７−９６ページ）、を含む。加えて、「キメ
ラ性抗体」の産生のために開発された技術、すなわち、
適切な抗原特異性および生体活性をもつ分子を得るため
に、ヒト抗体遺伝子に対するマウス抗体遺伝子のスプラ
イシングが使用可能である（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、（１
９８４）、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎ
ａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆＳｃｉｅｎｃｅ
ｓ（ＵＳＡ）、８１巻、６８５１−６８５５ページ；Ｎ
ｅｕｂｅｒｇｅｒら、（１９８４）、Ｎａｔｕｒｅ、３
１２巻、６０４−６０８；Ｔａｋｅｄａら、（１９８
５）、Ｎａｔｕｒｅ、３１４巻、４５２−４５４ペー
ジ）。あるいは、一本鎖抗体の産生について記載された
技術（米国特許第ＵＳ−Ａ−４９４６７７９号）が、阻
害剤特異的一本鎖抗体を産生するために、適用できる。
【０２５４】抗体はまた、リンパ球集団中で生体内（ｉ
ｎ ｖｉｖｏ）産生を誘導することにより、またはＯｒ
ｌａｎｄｉら（１９８９、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏ
ｆｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ
Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＵＳＡ）、８６巻、３８３３−３８
３７ページ、およびＷｉｎｔｅｒ ＧおよびＭｉｌｓｔ
ｅｉｎ Ｃ（１９９１；Ｎａｔｕｒｅ、３４９巻、２９
３−２９９ページ）の論文中に開示されたような高度に
特異的な結合試薬の組換え免疫グロブリンライブラリー
またはパネルをスクリーニングすることにより、産生さ
れてもよい。
【０２５５】ヒトＳＥＰに対して特異的な結合部位をも
つ抗体断片の生成も可能である。例えば、そのような断
片は、非限定的に、抗体分子のペプシン消化により産生
可能であるＦ（ａｂ’）2断片および該Ｆ（ａｂ’）2断
片のジスルフィド架橋を還元することにより生成できる
Ｆａｂ断片を含む。あるいは、Ｆａｂ発現ライブラリー
は、所望の特異性をもつモノクローナルＦａｂ断片の迅
速かつ容易な同定を可能にするために、構築されてもよ
い（Ｈｕｓｅ ＷＤら、（１９８９）、Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ、２５６巻、１２７５−１２８１ページ）。
【０２５６】別の技術は、例えばファージが、非常に多
様な相補性決定領域（ＣＤＲｓ）と共にｓｃＦｖ断片を
彼らのコートの表面上に発現するところの、ファージデ
ィスプレイライブラリーをスクリーニングすることを、
含む。この技術は、当該技術分野で周知である。
【０２５７】ヒトＳＥＰ特異的抗体は、ヒトＳＥＰポリ
ペプチドの発現に随伴する容態および疾患に診断に有用
である。確立された特異性をもつポリクローナルまたは
モノクローナル抗体のいずれかを用いる競合結合または
イムノラジオメトリックアッセイに対する各種プロトコ
ールは、当該技術分野では周知である。そのようなイム
ノアッセイは、ヒトＳＥＰポリペプチドとその特異的抗
体（または同様なヒトＳＥＰ結合分子）との間の複合体
の形成および複合体形成の測定とを、典型的に含む。特
定のヒトＳＥＰタンパク質上の二つの非干渉性エピトー
プに反応性のモノクローナル抗体を利用する２部位モノ
クローナル基盤イムノアッセイが好まれるが、競合結合
アッセイの採用も可能である。これらのアッセイは、Ｍ
ａｄｄｏｘ ＤＥら（１９８３、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、１５
８巻、１２１１ページ）に記載されている。
【０２５８】抗ヒトＳＥＰ抗体は、異常なペプチドシグ
ナル伝達が関与する障害、またはヒトＳＥＰの異常発現
により特徴づけられる他の障害または疾患の診断のため
に、有用である。ヒトＳＥＰについての診断上のアッセ
イは、ヒトの体液、細胞、組織、または、そうした組織
の切片または抽出物中にヒトＳＥＰポリペプチドを検出
するための抗体および標識を利用する方法を含む。本明
細書に記載されたポリペプチドおよび抗体は、修飾をし
て、または修飾せずに、使用可能である。しばしば、該
ポリペプチドおよび抗体は、レポーター分子と、共有的
にまたは非共有的に、それらを連結することによって、
標識されるはずである。非常にさまざまなレポーター分
子が、当業者には知られている。
【０２５９】抗体は、（ａ）先に記載されているような
抗体を提供すること；（ｂ）生体試料を前記抗体と、抗
体抗原複合体の形成を可能にする条件下でインキュベー
トすること；および（ｃ）前記抗体を含む抗体抗原複合
体が形成されるかどうかを決定すること、を含む方法に
より、本明細書に記載されたようなポリペプチドが生体
試料中に存在するのを検出するために、使用可能であ
る。
【０２６０】状況次第では、適当な試料は、精巣または
脳のような、またはそうした組織から由来した腫瘍増殖
物からの抽出組織を、含んでもよい。抗体は、固体支持
体へ結合させてよいし、および／または適当な試薬、対
照、説明書などとともに、適当な容器中にキットにして
包装してもよい。
【０２６１】アッセイ／同定方法 本出願はまた、（ヒト細胞のような）細胞中のヒトＳＥ
Ｐの存在を検出するためのアッセイ方法も記載してお
り、それは、（ａ）配列番号１または配列番号５に示さ
れるＤＮＡ配列またはその対立遺伝子変異から決定され
るような、ヒトＳＥＰに特異的なＰＣＲプライマーのペ
アを用いて、そうした細胞からの（全ＲＮＡのような）
ＲＮＡ上で逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−
ＰＣＲ）を実施すること；および（ｂ）適当なサイズの
ＰＣＲ断片の出現を、アガロースゲル電気泳動によるな
どで、アッセイすること、を含む。
【０２６２】本発明はまた、ヒトＳＥＰの活性および／
またはその発現に（阻害する、または別のやり方で修飾
するような）影響する（化合物、他の物質またはそれを
含む組成物のような）作用物質を同定する方法に関する
が、該方法は、ヒトＳＥＰまたはそれをコードするヌク
レオチド配列を該作用物質と接触させること、そしてそ
れから、ヒトＳＥＰの活性および／またはその発現を測
定することを、含む。
【０２６３】本発明はまた、ヒトＳＥＰの活性および／
またはその発現に（選択的に阻害する、または別のやり
方で選択的に修飾するような）選択的に影響する（化合
物、他の物質またはそれを含む組成物のような）作用物
質を同定する方法に関するが、該方法は、ヒトＳＥＰま
たはそれをコードするヌクレオチド配列を該作用物質と
接触させること、そしてそれから、ヒトＳＥＰの活性お
よび／またはその発現を測定することを、含む。
【０２６４】本発明はまた、ヒトＳＥＰの活性および／
またはその発現に（阻害する、または別のやり方で修飾
するような）影響する（化合物、他の物質またはそれを
含む組成物のような）作用物質を同定することの方法に
関するが、該方法は、（ａ）配列番号１または配列番号
５に示されるＤＮＡ配列またはその対立遺伝子変異を含
む組換えＤＮＡがその中へ取込まれている細胞系、また
は（ｂ）自然に選択的にヒトＳＥＰを発現する細胞集団
または細胞系：中に該作用物質の存在下で、または該作
用物質を添加後に、ヒトＳＥＰの活性および／またはそ
の発現を測定することを、含む。好ましくは、ヒトＳＥ
Ｐの活性は、上記のアッセイ方法により決定される。
【０２６５】本発明はまた、ヒトＳＥＰの活性および／
またはその発現に（阻害する、または別のやり方で修飾
するような）選択的に影響する（化合物、他の物質また
はそれを含む組成物のような）作用物質を同定すること
の方法に関するが、該方法は、（ａ）配列番号１または
配列番号５に示されるＤＮＡ配列またはその対立遺伝子
変異を含む組換えＤＮＡがその中へ取込まれている細胞
系、または（ｂ）自然に選択的にヒトＳＥＰを発現する
細胞集団または細胞系：中に該作用物質の存在下で、ま
たは該作用物質を添加後に、ヒトＳＥＰの活性および／
またはその発現を測定することを、含む。好ましくは、
ヒトＳＥＰの活性は、上記のアッセイ方法により決定さ
れる。
【０２６６】本発明はまた、ヒトＳＥＰ（またはその誘
導体、相同体、変異体または断片）活性、または同一物
（その誘導体、相同体、変異体または断片を含む）をコ
ードするヌクレオチド配列の発現、の調整（好ましくは
特定の調整）のための作用物質をスクリーニングするこ
との方法に関するが、該方法は、（ａ）候補作用物質を
提供すること；（ｂ）ヒトＳＥＰ（またはその誘導体、
相同体、変異体または断片）または同一物（またはその
誘導体、相同体、変異体または断片）をコードするヌク
レオチド配列を、適当な条件下で調整が可能な十分な時
間、該候補作用物質と組合せること；そして（ｃ）該候
補作用物質がヒトＳＥＰ（またはその誘導体、相同体、
変異体または断片）活性、または同一物（またはその誘
導体、相同体、変異体または断片）をコードするヌクレ
オチド配列の発現、を調整するかどうかを確かめるため
に、該候補作用物質（またはその誘導体、相同体、変異
体または断片）または同一物（またはその誘導体、相同
体、変異体または断片）をコードするヌクレオチド配列
による、ヒトＳＥＰの調整を検出すること：の工程を、
含む。
【０２６７】本発明はまた、ヒトＳＥＰ（またはその誘
導体、相同体、変異体または断片）または同一物（その
誘導体、相同体、変異体または断片を含む）をコードす
るヌクレオチド配列との、特異的結合親和性のための作
用物質をスクリーニングすることの方法に関するが、該
方法は、（ａ）候補作用物質を提供すること；（ｂ）ヒ
トＳＥＰ（またはその誘導体、相同体、変異体または断
片）または同一物（またはその誘導体、相同体、変異体
または断片）をコードするヌクレオチド配列を、適当な
条件下で結合が可能な十分な時間、該候補作用物質と組
合せること；そして（ｃ）該候補作用物質がヒトＳＥＰ
（またはその誘導体、相同体、変異体または断片）また
は同一物（またはその誘導体、相同体、変異体または断
片）をコードするヌクレオチド配列に、結合するかどう
かを確かめるために、ヒトＳＥＰ（またはその誘導体、
相同体、変異体または断片）または同一物（またはその
誘導体、相同体、変異体または断片）をコードするヌク
レオチド配列への、該候補作用物質の結合を検出するこ
と：の工程を、含む。
【０２６８】本発明はまた、ヒトＳＥＰを調整すること
ができる作用物質を同定する方法に関するが、該方法
は、（ａ）ヒトＳＥＰ（またはその誘導体、相同体、変
異体または断片）または同一物（またはその誘導体、相
同体、変異体または断片）をコードするヌクレオチド配
列と、該作用物質を接触させること；（ｂ）工程（ａ）
の混合物を、生理活性ペプチドのタンパク質分解に適当
な条件下で、該生理活性ペプチドと、インキュベートす
ること；（ｃ）生理活性ペプチドタンパク質分解の量を
測定すること；そして（ｄ）工程（ｃ）の生理活性ペプ
チドタンパク質分解の量を、該作用物質なしでインキュ
ベートされたヒトＳＥＰ（またはその誘導体、相同体、
変異体または断片）または同一物（またはその誘導体、
相同体、変異体または断片）をコードするヌクレオチド
配列で得られた生理活性ペプチドタンパク質分解の量と
比較し、それによって、該作用物質が、生理活性ペプチ
ドタンパク質分解に影響（阻害または選択的に阻害する
のように）するかどうかを決定すること：の工程を、含
む。
【０２６９】このように、本発明のいくらかの若干の態
様では、ヒトＳＥＰまたはその変異体、相同体、断片ま
たは誘導体および／またはヒトＳＥＰまたはその変異
体、相同体、断片または誘導体を発現する細胞系は、エ
ンドペプチダーゼの活性またはその発現のモジュレータ
ーとして作用する、有機または無機分子のような、抗
体、ペプチド、または他の作用分子をスクリーンするた
めに使用可能で、それによって、生理活性ペプチドレベ
ルを調整できる治療剤を同定する。例えば、ヒトＳＥＰ
の活性を中和できる抗ヒトＳＥＰ抗体は、生理活性ペプ
チドのヒトＳＥＰタンパク質分解を阻害するのに使用可
能で、それにより、それらのレベルを上昇させる。ある
いは、組換え的に発現されたヒトＳＥＰまたはその変異
体、相同体、断片または誘導体、またはヒトＳＥＰまた
はその変異体、相同体、断片または誘導体を発現する細
胞系によるコンビナトリアルケミストリーによりつくら
れたペプチドライブラリーまたは有機ライブラリーのス
クリーニングは、生理活性ペプチドのヒトＳＥＰによる
タンパク質分解を調整すること（例えば阻害することま
たは選択的に阻害すること）により機能する治療剤の同
定に有用であろう。合成化合物、天然物、および潜在的
に生理的に活性な物質の他の素材を、当業者には日常的
と思われる多くの仕方でスクリーンすることが可能であ
る。例えば、ヒトＳＥＰのＮ末端領域をコードするヌク
レオチド配列は、ヒトＳＥＰ活性の、アゴニストまたは
アンタゴニストのいずれかのアロステリックモジュレー
ターのスクリーニングに使用可能な、細胞系中で発現さ
れる可能性もある。
【０２７０】あるいは、ヒトＳＥＰの保存性触媒ドメイ
ンをコードするヌクレオチド配列は、細胞系中で発現可
能で、そして生理活性ペプチドタンパク質分解の阻害剤
または選択的阻害剤に対するスクリーンに使用可能であ
る。
【０２７１】ヒトＳＥＰ活性または生理活性ペプチドタ
ンパク質分解に干渉するテスト作用物質の能力は、ヒト
ＳＥＰレベルまたは生理活性ペプチドレベルを測定する
ことにより決定可能である。
【０２７２】従って、本発明は、ヒトＳＥＰ、またはそ
の変異体、相同体、断片または誘導体の生理活性ペプチ
ドタンパク質分解活性を調整できる化合物を同定するこ
との方法に関するもので、（ａ）該化合物を、ヒトＳＥ
Ｐ、またはその変異体、相同体、断片または誘導体と接
触させること；（ｂ）工程（ａ）の混合物を、生理活性
ペプチドのタンパク質分解に適当な条件下で、該生理活
性ペプチドとインキュベートすること；（ｃ）生理活性
ペプチドタンパク質分解の量を測定すること；そして
（ｄ）工程（ｃ）の生理活性ペプチドタンパク質分解の
量を、該化合物なしでインキュベートされた、ヒトＳＥ
Ｐ、またはその変異体、相同体、断片または誘導体で得
られた生理活性ペプチドタンパク質分解の量と比較し、
それによって、該化合物が生理活性ペプチドタンパク質
分解を促進するか、または阻害するかを決定すること：
の工程を含む。本方法の一つの態様では、該断片は、ヒ
トＳＥＰのＮ末端領域からでもよく、ヒトＳＥＰのアロ
ステリックモジュレーターを同定するための方法を提供
する。本発明のもう一つの態様では、該断片は、ヒトＳ
ＥＰのカルボキシ末端領域からでもよく、生理活性ペプ
チドタンパク質分解の阻害剤または選択的阻害剤を同定
するための方法を提供する。
【０２７３】生理活性ペプチドは完全長でも、またはそ
れらの断片でもよく、そして組換え的に、または、好ま
しくは合成的に、産生されてもよい。好ましくは、当該
生理活性ペプチドは、ヒトＳＥＰにより調整可能な（好
ましくはタンパク質分解／加水分解により切断される）
小さな合成ペプチドである。より好ましくは、当該合成
ペプチドは標識されている（好ましくは蛍光標識されて
いる、さらに好ましくは本明細書に記載されたＦＲＥＴ
アッセイで使用可能なような分子内的に消光可能な蛍光
発生色素で蛍光的に標識される）。
【０２７４】ヒトＳＥＰは、生理活性ペプチド活性を調
節するのに、および／または生理的に不活性なペプチド
のそれらの活性型へのタンパク質分解に、関与も可能な
ので、上文の「生理活性ペプチド（類）」（および類似
物）に対する引例は、これらの引例が、必要な変更を加
えて、適切に解釈されるように存在するような文脈で
は、「生理的に不活性なペプチド（類）」（および類似
物）に対する引例を意味するととることも可能である。
例えば、ヒトＳＥＰ活性の阻害が生理活性ペプチド
（類）のレベル増加をもたらす可能性がある場合、そう
した阻害はやはり、または代わりに、生理的に不活性な
ペプチド（類）のレベル増加をもたらし、それにより、
それらの「活性型」でのペプチドのレベル減少を招くこ
ともあり得る。
【０２７５】ヒトＳＥＰポリペプチド、その免疫原性断
片またはそれらのオリゴペプチドは、各種の薬剤スクリ
ーニング技術のいずれにおいても、治療用化合物のスク
リーニングに使用も可能である。そうしたテストで採用
されるポリペプチドは、溶液中で遊離でも、固体支持体
に固定されていても、細胞表面に支えられていても、細
胞内に位置していてもよい。活性の破壊、またはヒトＳ
ＥＰポリペプチドおよびテストされる作用物質との間の
結合複合体の形成が、測定されてもよい。
【０２７６】従って、本発明は、ヒトＳＥＰまたはその
発現の、またはその部分の、またはその変異体、相同
体、断片または誘導体の、調整（好ましくは、特異的結
合親和性または阻害のような特異的調整）のための一つ
または複数の化合物をスクリーニングするための方法に
関するが、一つまたは複数の化合物を提供すること；ヒ
トＳＥＰまたはその同一物またはその部分をコードする
ヌクレオチド配列、またはその変異体、相同体、断片ま
たは誘導体を、該化合物または複数の化合物の各々に、
適当な条件下で調整を可能にする十分な時間、組合せる
こと；そして、例えば、（ｉ）ヒトＳＥＰ、またはその
部分、またはその変異体、相同体、断片または誘導体
と、上記複数の化合物の各々の結合を検出し、それによ
って、ヒトＳＥＰまたは同一物をコードするヌクレオチ
ド配列を調整する化合物または化合物類を同定するこ
と；または（ｉｉ）ヒトＳＥＰ、またはその部分、また
はその変異体、相同体、断片または誘導体の、上記複数
の化合物の各々による阻害を検出し、それによって、ヒ
トＳＥＰまたはそのものをコードするヌクレオチド配列
を調整（阻害）する化合物または化合物類を同定するこ
と；を含む。そのようなアッセイにおいては、上記複数
の化合物は、当業者に知られるコンビナトリアルケミス
トリー技術により産生されてもよい。
【０２７７】薬剤スクリーニングのためのもう一つの技
術は、ヒトＳＥＰポリペプチドに対して適当な結合親和
性をもつ化合物のハイスループットスクリーニング（Ｈ
ＴＳ）を提供するもので、そして１９８４年９月１３日
に公刊されたＧｅｙｓｅｎ、国際特許出願公開ＷＯ ８
４／０３５６４中に詳細に記載された方法に基づいてい
る。要するに、非常に多くの異なる小ペプチドテスト化
合物を、プラスチックピンまたは他の表面のような固体
基質の上に合成する。該ペプチドテスト化合物は、ヒト
ＳＥＰ断片と反応させ、そして洗浄する。結合されたヒ
トＳＥＰは、次いで、当該技術分野では周知の方法を適
宜適用することによるなどで、検出される。精製された
ヒトＳＥＰは、前述の薬剤スクリーニング技術における
使用のためのプレート上に直接コートされてもよい。あ
るいは、非中和抗体は、該ペプチドを捕らえ、そしてそ
れを固形支持体上に固定化するのにも使用可能である。
【０２７８】この発明はまた、ヒトＳＥＰを特異的に結
合できる中和抗体が、ヒトＳＥＰを結合するためのテス
ト化合物と競合する、競合的薬剤スクリーニングアッセ
イの使用も意図している。このように、抗体は、ヒトＳ
ＥＰと一つまたは一つより多い抗原決定基を共有する、
どのペプチドの存在でも検出するのに使用も可能であ
る。
【０２７９】本発明のアッセイ方法はハイスループット
スクリーニング（ＨＴＳ）であってもよい。これに関し
ては、国際特許出願公開ＷＯ ８４／０３５６４の教示
が、本発明のヒトＳＥＰに適用可能である。
【０２８０】米国特許第ＵＳ−Ａ−５７３８９８５号の
教示も、本発明のアッセイ方法に適用可能である。本発
明により特異的に意図されるのは、例えば、上記のヒト
ＳＥＰにより切断可能な、標識基質ペプチドのローダミ
ングリーンＧｌｙ−Ｇｌｙ−ｄＰｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ
−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ（ＱＳＹTM−７）−βＡｌａ
−ＮＨ2（配列番号８）を用いる、ＦＲＥＴアッセイで
ある。加えて、ヒトＳＥＰ酵素が何らかのペプチダーゼ
により置換された、上に記載されたようなＦＲＥＴアッ
セイも、本発明により意図されている。好ましくは、前
記ペプチダーゼはエキソペプチダーゼまたはエンドペプ
チダーゼである。さらに好ましくは、前記エキソペプチ
ダーゼはオキシトシナーゼであり、そして前記エンドペ
プチダーゼはＮＥＰまたは非ヒトＳＥＰである。
【０２８１】作用物質 本発明はまた、本発明のアッセイ、方法および同定方法
により同定された一つまたは一つより多い作用物質を提
供する。
【０２８２】本発明の作用物質は、例えば有機化合物ま
たは無機化合物であってもよい。該作用物質は、例え
ば、配列番号１または配列番号５に示される配列の全部
または一部のアンチセンスであるヌクレオチド配列であ
ってもよい。好ましくは、該作用物質は、ＳＥＰ活性の
モジュレーターであり、さらに好ましくはＳＥＰ阻害剤
（ＳＥＰｉ）または選択的ＳＥＰｉであろう。
【０２８３】ＳＥＰｉは、ＳＥＰの酵素活性を阻害す
る、すなわち、それが基質ペプチド、ポリペプチドまた
はタンパク質を（タンパク質分解により）切断するのを
阻止する、化合物である。
【０２８４】本発明はさらに、本発明の作用物質（また
はその薬剤的に許容可能な塩、またはその薬剤的に許容
可能な溶媒和物でも）、または前述の何れかを含む薬剤
組成物を、薬としての使用のために、提供する。
【０２８５】本発明はまた、尿生殖系、心臓血管系、神
経系、内分泌系のいずれか一つまたは一つより多くで、
ヒトＳＥＰ活性に影響する（阻害する、選択的に阻害す
る、調整する、または作動する（ａｇｏｎｉｓｅ）のよ
うに）、作用物質の使用に関する。
【０２８６】上記のどれかのアッセイ（またはその修
飾）を用いて同定される、何らかの作用物質（それは、
非限定的に、ヒトＳＥＰのモジュレーター、阻害剤また
は選択的阻害剤を含む）も、本発明の側面と見なされる
と、理解されるものとする。さらに、どのペプチダーゼ
でも調整すること（好ましくは、阻害すること、または
選択的に阻害すること）が可能で、そして上記のどれか
のアッセイ（またはその修飾）を用いて同定される、何
らかの作用物質（それは、非限定的に、モジュレータ
ー、阻害剤または選択的阻害剤を含む）も、本発明の側
面と見なされると、理解されるものとする。好ましく
は、前記作用物質（それは、非限定的に、モジュレータ
ー、阻害剤または選択的阻害剤を含む）は、エキソペプ
チダーゼまたはエンドペプチダーゼを調整する（好まし
くは、阻害する、または選択的に阻害する）。さらに好
ましくは、前記エキソペプチダーゼはオキシトシナーゼ
であり、そして前記エンドペプチダーゼはＮＥＰまたは
非ヒトＳＥＰである。
【０２８７】医薬品 本発明はまた、ヒトＳＥＰ活性が原因で薬剤組成物を必
要とする、個人を治療するための薬剤組成物を提供する
が、該組成物は、前記活性に影響する（阻害する、また
は選択的に阻害するのような）作用物質の治療的に有効
な量および薬剤的に許容可能な担体、希釈剤または賦形
剤を含む。
【０２８８】それ故、本発明はまた、本発明の作用物質
（本発明のヌクレオチド配列の発現パターンまたはその
発現産物の活性を調整できる作用物質および／または本
発明に従うアッセイにより同定された作用物質）を含む
薬剤組成物を網羅する。これに関連して、特にヒト治療
用に、本発明の作用物質が単独で投与できるとしても、
意図された投与ルートおよび標準的薬剤慣例に留意して
選択された薬剤担体、賦形剤または希釈剤との混和物
で、通常は投与されるはずである。
【０２８９】例として、本発明の薬剤組成物では、本発
明の作用物質は、どの適当な結合剤（類）、光沢剤
（類）、懸濁剤（類）、被覆剤（類）、または可溶化剤
（類）と混和してもよい。
【０２９０】一般に、本発明の作用物質の治療的に有効
な１日あたりの経口または静脈注射用量は、治療される
対象者の体重１ｋｇ当り、０．０１から５０ｍｇ／ｋ
ｇ、好ましくは０．０１から２０ｍｇ／ｋｇ、さらに好
ましくは０．１から２０ｍｇ／ｋｇの範囲であろう。本
発明の作用物質は、およそ０．００１−１０ｍｇ／ｋｇ
／ｈｒの範囲にある用量で、静脈注射注入により投与し
てもよい。
【０２９１】それ故、本発明はまた、ヒトＳＥＰ活性が
原因で治療が必要な、個人を治療する方法を提供する
が、それは、本発明の方法により同定された作用物質を
含む薬剤組成物の有効量を当該個人に投与することを含
む。
【０２９２】典型的には、個々の患者に最も適当とされ
る実際の用量を、医師が決めることになろうが、それ
は、当該患者の年令、体重、性別および応答により変動
するはずである。上記の用量は、平均的なケースの模範
例である。当然、もっと高いあるいは低い用量範囲の個
々の事例があり得よう、そしてそれらは本発明の範囲内
にある。
【０２９３】適切な場合には、該薬剤組成物は、吸入に
より、坐薬またはペッサリーの形で、ローション、溶
液、クリーム、軟膏または散布剤の形で局所的に、皮膚
パッチの使用により、デンプンやラクトースのような賦
形剤を含む錠剤の形で経口的に、またはカプセルやオビ
ュール単独でまたは賦形剤との混和で、または香料や着
色剤を含むエリキシル剤、溶液または懸濁物の形で、投
与してもよく、またはそれらは非経口的に、例えば空洞
内に、静脈内に、筋肉内に、または皮下に、注射しても
よい。非経口投与の場合、該組成物は滅菌水溶液の形で
最もよく使われるようだが、該溶液を血液と等張にする
ために、他の物質、例えば十分な塩類または単糖類を、
含有してもよい。頬側または舌下投与の場合、該組成物
は、既成の仕方で処方可能な錠剤やトローチ剤の形で投
与してもよい。
【０２９４】対象者（患者のような）に経口的、非経口
的、頬側的および舌下的な投与の場合、本発明の作用物
質の１日あたりの用量レベルは、典型的には１０から５
００ｍｇまで（単回または分割用量で）があり得る。そ
れ故、そして例として、錠剤またはカプセルは、１度
に、または適宜１回に二つまたはそれより多くの投与に
ついて、５から１００ｍｇまでの活性作用物質を含むこ
とになる。徐放性処方で本発明の作用物質を投与するこ
とも可能である。
【０２９５】適用によっては、一般にヒトでは、本発明
の作用物質の経口投与が好ましいルートで、最も便利で
あり、そして場合によっては、空洞内（ｉ．ｃ．）投与
に伴うもののような、他のルートの投与に伴う不利益を
避けることができる。受容者が嚥下障害または経口投与
後の薬剤吸収の障害を患らっている場合には、該薬剤は
非経口的に投与してもよい。
【０２９６】獣医分野での使用の場合、本発明の作用物
質は、正常な獣医慣例に従って適切に許容可能な処方と
して典型的には投与され、そして獣医師が、特定の動物
に対して最もふさわしいと思われる投与の用量方式とル
ートを決めることになる。しかし、ヒトの治療の場合と
同様に、獣医治療用に該作用物質を単独で投与すること
も可能であろう。
【０２９７】典型的には、該薬剤組成物（ヒトまたは動
物使用のためがあり得る）は、どのような一つまたは一
つより多い薬剤的に許容できる希釈剤、担体または賦形
剤を含んでもよい。薬剤の担体、賦形剤または希釈剤の
選択は、意図された投与ルートおよび標準的薬剤慣例に
留意して選ばれることになる。上に指摘したように、該
薬剤組成物は、該担体、賦形剤または希釈剤として、ま
たはそれに加えて、どの適当な結合剤（類）、光沢剤
（類）、懸濁剤（類）、被覆剤（類）、または可溶化剤
（類）を含んでもよい。
【０２９８】本出願はまださらに、ヒトＳＥＰポリヌク
レオチド配列、ヒトＳＥＰアンチセンス分子、ヒトＳＥ
Ｐポリペプチド、タンパク質、ペプチド、または阻害
剤、選択的阻害剤、アンタゴニスト（抗体を含む）のよ
うなヒトＳＥＰ生理活性の有機モジュレーター、の全部
または一部を、単独でもまたは安定化化合物のような少
なくとも一つの他の作用物質と組合せでも含み、そして
塩類溶液、緩衝化塩類溶液、デキストローズ、および水
を、非限定的に含む、どの滅菌済み生体適合性薬剤担体
中ででも、投与可能な、薬剤組成物に関する。
【０２９９】一般方法論参考文献 全般的に、本明細書で述べられた技術は当該分野でよく
知られているが、特にＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８９）およびＡｕｓｕｂｅｌ
ら、ＳｈｏｒｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９９）第４版、Ｊｏｈ
ｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．を参考文献に
してよいと思われる。ＰＣＲについては、米国特許第Ｕ
Ｓ−Ａ−４６８３１９５号、第ＵＳ−Ａ−４８００１９
５号および第ＵＳ−Ａ−４９６５１８８号に記載されて
いる。
【０３００】寄託 下記の試料は、ブダペスト条約に従って、２００１年６
月２９日、公認寄託機関Ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃ
ｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ、
Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｍａｒｉｎｅ Ｂａｃｔｅｒｉａ
（ＮＣＩＭＢ）、２３ Ｓｔ．Ｍａｃｈａｒ Ｄｒｉｖ
ｅ、アバディーン、スコットランド、ＡＢ２４ ３Ｒ
Ｙ、英国、に寄託された：ＮＣＩＭＢ番号ＮＣＩＭＢ
４１１１０はＥ．ｃｏｌｉ ＭＳＳＥ８２である。
【０３０１】寄託者は、Ｐｆｉｚｅｒ Ｌｉｍｉｔｅ
ｄ、Ｒａｍｓｇａｔｅ Ｒｏａｄ、Ｓａｎｄｗｉｃｈ、
ケント、ＣＴ１３ ９ＮＪ、連合王国、であった。当業
者は、上記のＥ．ｃｏｌｉクローン（ＮＣＩＭＢ ４１
１１０）を、アンピシリンを含むルリアブロス中で容易
に増殖させ、そしてＳａｍｂｒｏｏｋら、編、（１９８
９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓ
ｓ、ニューヨーク市、ニューヨーク州、米国、に記載さ
れているようなアルカリ溶菌法を用いて、該クローンの
プラスミドＤＮＡを単離できるであろう。次いで、蛍光
検出について、Ｓａｎｇｅｒら（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ
ｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ
ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＵＳＡ）、（１９７７年、
１２月）、７４（１２）：５４６３−５４６７）により
記載され、そしてＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ
ｓ、ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ、カリフォルニア、米国（Ａ
ｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製造会社の文献を
参照されたい）により改修された、ジデオキシ終止法を
用いて、該ＤＮＡを配列決定し、ヒトＳＥＰを同定でき
るであろう。
【０３０２】アクセス番号ＮＣＩＭＢ ４１１１０で寄
託された上記の寄託生物材料を指す場合、本明細書で使
われる用語「細胞」または「細胞類」は、相当用語「微
生物」または「微生物類」または「細菌」または「細菌
類（バクテリア）」と互換可能である。
【０３０３】本出願はまた、前記寄託物から誘導可能
な、および／または、発現可能な配列および同一物を含
む態様を包含する。本出願はまた、前記寄託物から誘導
可能な、および／または、発現可能な部分配列および同
一物を含む態様を包含するが、そこでのそれら部分配列
は、活性ポリペプチド（活性酵素性部位）をコードす
る。本出願はまた、前記寄託物から誘導可能な、および
／または、発現可能な配列を含むタンパク質および同一
物を含む態様を包含する。本出願はまた、前記寄託物か
ら誘導可能な、および／または、発現可能な部分配列を
含むタンパク質および同一物を含む態様を包含するが、
そこでのそれら部分配列は、活性ポリペプチド（活性酵
素性部位）をコードする。
【０３０４】
【実施例】実施例１‐ヒトＳＥＰの同定 データベースマイニング ヒトＳＥＰの新規遺伝子は、ネプリリシンタンパク質を
プローブとして、そしてＢＬＡＳＴアルゴリズムを用
い、ヒト発現配列タグ（ＥＳＴｓ）のデータベースをマ
イニングすることにより見い出した。ＥＳＴヒット（デ
ータベース＝Ｉｎｃｙｔｅ ＧｏｌｄTM；遺伝子ｉｄ．
＝２４１１６１）は、次に、隣接配列中へアセンブルし
たところ、それはコード配列の大きな断片を予示した。
これは、ネプリリシンタンパク質配列との相同性（同一
性６０％）により、該触媒ドメインに対応する。該新規
遺伝子についての該予示コード配列のこの領域を用い
て、ＰＣＲクローニング用のプローブを設計した。その
後、ヒトゲノムデーターベースからの未終了配列のさら
なるマイニングにより、５推定エキソンを同定したが、
それらは不明Ｎ末端領域中の同一新規遺伝子に属すると
仮定された。これは後で、ヒト精巣ライブラリーから得
た完全長クローンの配列決定後に、確認された（後記参
照）。
【０３０５】該新規ヒトＳＥＰ配列は、３’ＵＴＲおよ
び、二つの活性触媒部位の一つを含むヒトＳＥＰの高度
に保存されたＣ末端領域中のコード配列の一部とを、含
む。該新規ヒトＳＥＰは、３７アミノ酸の挿入断片を含
むらしい。
【０３０６】完全長ヒトＳＥＰｃＤＮＡの単離 オリゴヌクレオチド（５’−ｃｔｇｔｃｔｔｇａｔｇｇ
ａｔｔｇｇａｔｇ−３’）を、５’−ＲＡＣＥ（５’ｃ
ＤＮＡ端の迅速増幅）ＰＣＲを用いて、より長いヒトＳ
ＥＰ ｃＤＮＡｓを、ｃＤＮＡライブラリーから増幅す
るのを可能にはずの、隣接発現配列タグ（ＥＳＴｓ）の
上記アセンブリーからの部分ヒトＳＥＰｃＤＮＡ配列を
用いて、設計した。
【０３０７】次いで、１２アレイ９６ウエルフォーマッ
ト ヒトＲａｐｉｄ−Ｓｃｒｅｅｎ TMｃＤＮＡライブラ
リーのパネルを、５’−ＲＡＣＥ ＰＣＲによりスクリ
ーニングした。ヒトＳＥＰに対応するｃＤＮＡが、脳、
肝臓、胎盤、小腸、および精巣に由来するライブラリー
で同定された。
【０３０８】これらのｃＤＮＡはいずれも完全長でなか
ったので、精巣からの、より長いが、部分長ｃＤＮＡの
一つの配列から設計されたプライマー（５’−ｇｔｃｃ
ｔｔｇｇｃａｇｔｃｇａａｔｔｃｔｃｃ−３’）を用
い、ライブラリーのパネルについて、さらに５’−ＲＡ
ＣＥを実施した。これにより、精巣ライブラリーで、よ
り長い（〜３．０ｋｂ）推定完全長ｃＤＮＡクローンが
同定され、それを単離し、両端から配列決定した。その
完全長ヒトＳＥＰクローンをＭＳＳＥ８２と名付け、
（アクセス番号ＮＣＩＭＢ ４１１１０でＮＣＩＭＢに
寄託した）、またその完全長ｃＤＮＡを、Ｇｅｎｂａｎ
ｋアクセス番号＃ＡＦ０６７１９６をもつｐＣＭＶ６−
ＸＬ４ベクター中へクローン化した。
【０３０９】配列番号１は、ヒトＳＥＰをコードするヌ
クレオチド配列（ｃＤＮＡ）を示す。配列番号２は、＋
１オープンリーディングフレームのｃＤＮＡ配列の翻訳
から予測されるヒトＳＥＰタンパク質を示す。
【０３１０】配列番号３および４は、ヒトＳＥＰをコー
ドするヌクレオチド配列（ｃＤＮＡ）の同定に使われる
オリゴヌクレオチドプライマー配列を示す。配列番号５
は、５’および３’部分ベクター配列（それぞれ、最初
の６５ヌクレオチドおよび最後の１７ヌクレオチド）を
含む、ヒトＳＥＰをコードするヌクレオチド配列（ｃＤ
ＮＡ）を示す。
【０３１１】実施例２‐ヒトＳＥＰｍＲＮＡの組織分布 多組織メッセンジャーＲＮＡブロットをヒトＳＥＰにつ
いてプローブした。ＳＥＰｍＲＮＡは精巣試料で検出さ
れたが、他の組織には検出されなかった。
【０３１２】全ヒトＳＥＰコード配列に対応するＤＮＡ
の断片を、ＳＥＰクローンＭＳＳＥ８２を鋳型として用
いるＰＣＲにより、増幅した。該断片は、メガプライム
キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ ＰＬＣ、英国）を用いて32
Ｐ ｄＣＴＰで、放射性同位体標識した。その放射性同
位体標識断片をハイブリッド形成プローブとして用い、
異なるヒト組織および細胞系の選択物（７６）からのｍ
ＲＮＡ類を含む、多組織ｍＲＮＡアレイ（ドットブロッ
ト）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製、米国）をスクリーンした。
ハイブリッド形成および洗浄後、ブロットをオートラジ
オグラフィーに付した。シグナルは、精巣から検出され
たが、他の組織からは検出されなかった。
【０３１３】ＲＴ−ＰＣＲ分析は、ヒトＳＥＰ ｍＲＮ
Ａを、精巣だけでなく、唾液腺や甲状腺にも示した（デ
ータは示してない）。
【０３１４】実施例３‐組換えＳＥＰ酵素の産生 チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞の培養を、
リポフェクタミン試薬プロトコール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇ
ｅｎ Ｌｔｄ、Ｐａｉｓｌｅｙ、英国）に記載されてい
るようなリポフェクタミン法を用いて、プラスミドＭＳ
ＳＥ８２でトランスフェクトした。細胞培地は、トラン
スフェクション後２４または４８時間で収穫し、そして
３０００ｇで５分間の遠心分離により細胞破片を除去し
た。次いで該培地は、“ｓｌｉｄｅ ａ ｌｙｓｅｒ”
（Ｐｉｅｒｃｅ ａｎｄ Ｗａｒｎｅｒ製、チェスタ
ー、英国）を用いて、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．
４／１０％グリセロールに対して４℃で一晩透析する。
その透析済みの試料は、次いで、アリコート（一定量宛
小分け）にして凍結し、液体窒素下で貯蔵する。
【０３１５】実施例４‐ペプチダーゼ活性のアッセイ ペプチダーゼの活性を分析するためのＦＲＥＴの利用
は、エンドペプチダーゼ類、ＮＥＰ（中性エンドペプチ
ダーゼ）およびＳＥＰ（可溶性分泌エンドペプチダー
ゼ）、の分析のための同質ＦＲＥＴアッセイにより、本
明細書に例示されている。
【０３１６】背景 本発明の新規同質ペプチダーゼアッセイは、ＮＥＰを用
いる使用のためにＣａｒｖａｌｈｏらにより開発された
ＦＲＥＴアッセイに基づいている（Ｃａｒｖａｌｈｏ
ら、Ａｎｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３７、１６７−１
７３ページ（１９９６））。該ペプチダーゼＦＲＥＴア
ッセイは、同様な分子内的に消光された蛍光作動性ペプ
チド基質を利用するが、同一ではなく、ローダミングリ
ーン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎｃ．）
およびＱＳＹTM７（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ
ｓ、Ｉｎｃ．）、または５−（および６）テトラメチル
ローダミン＊混合異性体＊（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒ
ｏｂｅｓ、Ｉｎｃ．）およびＱＳＹTM７、または５−カ
ルボキシフルオロセイン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏ
ｂｅｓ、Ｉｎｃ．）および５−（および６）テトラメチ
ルローダミン＊混合異性体＊のような、蛍光作動性の供
与体／受容体色素の新規な組合せに置換した。
【０３１７】例えば、エンドペプチダ−ゼ類ＮＥＰまた
はＳＥＰのペプチダーゼ活性は、合成ペプチド基質、受
容体色素−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ｄＰｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ
−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ（供与体色素）−βＡｌａ−
ＮＨ2（配列番号８）をタンパク質分解する能力をモニ
ターすることにより、測定される。例えば、ＣＰ４はエ
ンドペプチダーゼＮＥＰまたはＳＥＰにより切断され、
切断産物ローダミングリーンＧｌｙ−Ｇｌｙ−ｄＰｈｅ
−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＯＨ（配列番号９）を生
じ、その放出が蛍光によりモニターされる。
【０３１８】これらのアッセイのために選択された二つ
の蛍光色素（蛍光作動性色素）は、重複する発光および
吸収スペクトルをもっており、そのためエネルギー転移
に適している。ローダミングリーンは供与体として働
き、４８５ｎｍで励起されると、５３５ｎｍで発光（蛍
光）し、今度はそれがＱＳＹTM７を励起する（ＦＲＥＴ
が生じている）。ＱＳＹTM７は蛍光的にはサイレント
で、そしてそのため５３５ｎｍ以上では発光しないの
で、シグナルは観察されない（ローダミングリーン発光
は消光される）。
【０３１９】該ペプチド基質のＡｒｇ−Ｖａｌペプチド
結合でＮＥＰまたはＳＥＰによる切断（選択的加水分
解）が起ると、ローダミングリーンとＱＳＹTM７の分子
部分が離れ、そのため４８５ｎｍで励起しても、エネル
ギー転移はもはや起らない。その結果、蛍光の増加がロ
ーダミングリーンについての５３５ｎｍで観察される。
他の適切な蛍光色素は、同一ではないが、同様な挙動を
示し、各色素の個々の性質に依存して、異なる波長で励
起され、そしてエネルギーを放出する。
【０３２０】合成ペプチド基質の調製 ペプチド構築は、製造会社（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓ
ｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、カリフォルニ
ア、米国）供給の９−フルオレニルメトキシカルボニル
（ＦＭＯＣ）に基づく合成サイクルに対する改修法を用
いる固相ペプチド合成プロトコールにより、０．２５ｍ
ｍｏｌ ＦＭＯＣ−ＰＡＬ−ＰＥＧ−ＰＳ樹脂上で完成
した。出願人らの改修サイクルは、２０％ピペリジン／
Ｎ−メチルピロリジノン（ＮＭＰ）による２ｘ５分間処
理でアミノ末端を脱保護するが；その効率は、ＵＶ吸収
検出計を介する小アリコートの脱保護溶液の通過によ
り、３０１ｎｍにおけるＵＶ吸収でモニターする。別の
カートリッジで、導入するアミノ酸を、Ｎ，Ｎ−ジメチ
ルフォルムアミド（ＤＭＦ）に溶解した２−（１Ｈ−ベ
ンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３テトラ
メチルウロニウム ヘキサフルオロホスフェート（ＨＢ
ＴＵ）／１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢ
ｔ）の各０．９当量で活性化する。２当量のジイソプロ
ピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）を添加する。同時に、該
樹脂を、次いで、ＮＭＰで洗い、脱保護副産物を除去す
る。洗浄液は樹脂から排流し、そして活性化されたアミ
ノ酸エステルをその樹脂に移し、そのアミノ末端にカッ
プリングできるよう、２０分間撹拌する。残るカップリ
ング溶液は、排流し、樹脂を再びＮＭＰで洗浄する。ペ
プチドの均質性を確保するため、ＮＭＰ中０．４Ｍ無水
酢酸／０．０４Ｍ ＨＯＢｔおよび１２ｍｍｏｌｅ Ｄ
ＩＥＡの溶液を該樹脂に加え、潜在的未反応部位をすべ
てアセチル化する。最後に、樹脂をＮＭＰで洗い、排流
し、次いで１：１ジクロロメタン／２，２，２−トリフ
ルオロエタノールの混合物で洗い、そして排流する。こ
れが、ペプチド合成の典型的な１サイクルである。完了
した合成樹脂を切断し、Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋ（Ｋｉｎ
ｇ、Ｄ．Ｓ．ら、（１９９０）、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐ．
Ｐｒｏｔ．Ｒｅｓ．、３６、２５５−２６６ページ）を
用いて脱保護したところ、２５１ｍｇ（１００％）の粗
ペプチドＣＰ１ エレクトロスプレイ質量分析法（ＥＳ
ＭＳ）（ｍ／ｚ計算（理論値）＝９７７．２１（ＭＨ+
平均）、測定値＝９７７．４７）を得た。
【０３２１】ローダミングリーンＧｌｙ−Ｇｌｙ−ｄＰ
ｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ（ＱＳ
ＹTM７）−βＡｌａ−ＮＨ2（ＣＰ４）の調製 ５０ｍｇ（５１μｍｏｌ）の粗ＣＰ１を、４５ｍｇ（５
２．４μｍｏｌ）ＱＳＹTM−７マレイミドを含む１０％
ＤＩＥＡ／ＤＭＦの溶液に溶解した。１０分間後、該反
応は、ＨＰＬＣ−ＭＳ分析により不完全と判断され、追
加の３０ｍｇ（３０．７μｍｏｌ）粗ペプチドを加え
た。さらに３０分間後、ＨＰＬＣ−ＭＳにより該反応は
完全と判断し、全出発試薬は消費された。産物は、Ｃ１
８分取用ＨＰＬＣクロマトグラフィーにより単離され、
マトリックスアシステッドレーザー脱離イオン化質量分
析法（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）により所望の産物分子量を示
す画分を集め、凍結乾燥し、７３．７ｍｇ（５０％）の
紫色粉末、ＣＰ２ ＥＳＭＳ（ｍ／ｚ理論値＝１７９
７．８６（ＭＨ+モノアイソトピック）、測定値＝１７
９７．８６）を得た。
【０３２２】７３．７ｍｇ（４１μｍｏｌ）のＣＰ２
を、３５ｍｇ（５２．８μｍｏｌ）のローダミングリー
ンカルボン酸，トリフルオロアセタミド，スクシンイミ
ジルエステル（５（６）−ＣＲ １１０ ＴＦＡ，Ｓ
Ｅ）＊混合異性体＊を含む、２％ＤＩＥＡ／ＤＭＦ溶液
中に溶解した。２時間後、該反応は完了したと、ＨＰＬ
Ｃ−ＭＳ分析により判断した。産物は、Ｃ４分取用ＨＰ
ＬＣクロマトグラフィーにより単離され、所望の産物分
子量（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）を示す画分を集め、凍結乾燥
し、７１．４ｍｇ（７４％）の紫色粉末、ＣＰ３ ＥＳ
ＭＳ（ｍ／ｚ理論値＝２３４５．９２（ＭＨ+モノアイ
ソトピック）、測定値＝２３４５．４７）を得た。
【０３２３】７１．４ｍｇ（３０．４μｍｏｌ）のＣＰ
３を、１０ｍｌの４：１ＣＨ3ＣＮ／Ｈ2Ｏに溶解した。
これに、２００ｍｇ（１８８６μｍｏｌ）のＮａ2ＣＯ3
を加えた。１６時間の渦撹拌後、上澄みを不溶物からデ
カンテーションで採取した。反応容器は１ｍｌのＤＭＳ
Ｏですすぎ；これを前記上澄みと合一し、産物は、Ｃ４
分取用ＨＰＬＣクロマトグラフィーにより単離した。所
望の産物分子量（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）を示す画分を合一
し、凍結乾燥し、６４ｍｇ（９８％）の紫色粉末、ＣＰ
４ ＥＳＭＳ（ｍ／ｚ理論値＝２１５５．５４（ＭＨ+
平均）、測定値＝２１５５．２７）を得た。ＣＰ４は、
所望の合成ペプチド基質ローダミングリーンＧｌｙ−Ｇ
ｌｙ−ｄＰｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｃ
ｙｓ（ＱＳＹTM７）−βＡｌａ−ＮＨ2である。
【０３２４】５−（および６）テトラメチルロ−ダミン
Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ｄＰｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−
Ｖａｌ−Ｃｙｓ（ＱＳＹTM７）−βＡｌａ−ＮＨ2（Ｃ
Ｐ５）の調製 ＣＰ５は、全く同じように調製されたＣＰ２でスタート
し、ＣＰ４に対するのと同様な仕方で調製した。１．０
５ｍｇ（０．５８μｍｏｌ）のＣＰ２を、３６０μｌの
２％ＤＩＥＡ／ＤＭＦ溶液中に溶解した。これに、５−
（および−６）−カルボキシテトラメチルローダミン，
スクシンイミジルエステル（５（６）−ＴＡＭＲＡ，Ｓ
Ｅ）＊混合異性体＊の１０ｍｇ／ｍｌ溶液を３０μｌ
（０．４３２μｍｏｌ）加えた。４時間後、該反応は完
了したと、ＨＰＬＣ−ＭＳ分析により判断した。産物
は、Ｃ４分取用クロマトグラフィーにより単離され、所
望の産物分子量（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）を示す画分を集
め、凍結乾燥し、１．３５ｍｇ（９９＋％）のＣＰ５
ＥＳＭＳ（ｍ／ｚ理論値＝２３２３．８１（ＭＨ+平
均）、測定値＝２３２３．４２）を得た。
【０３２５】５−カロボキシフルオレセイン−Ｇｌｙ−
Ｇｌｙ−ｄＰｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−
Ｃｙｓ（５−（および６）テトラメチルローダミン）−
βＡｌａ−ＮＨ2（ＣＰ６）の調製 まず、５−カロボキシフルオレセイン−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ
−ｄＰｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ
（Ｈ）−βＡｌａ−ＮＨ2（ＣＰ７）を調製した。ＣＰ
１を生じるように作った合成樹脂の５１２ｍｇ（０．１
３７ｍｍｏｌ／ｇｍ、したがって０．０７ｍｍｏｌ）
を、４０ｍｇ（０．０８５ｍｍｏｌ）の５−カルボキシ
フルオレセイン，スクシンイミジルエステル（５−ＦＡ
Ｍ，ＳＥ）＊単一異性体＊を含む５ｍｌ ＤＭＦ中にス
ラリーした。１時間後、樹脂を濾過し、３ｘ１５ｍｌ
ＤＭＦで洗浄し、続いて３ｘ１５ｍｌのジクロロメタン
で洗い、そして真空乾燥して、３００ｍｇのタグ付き樹
脂を得た。ペプチドＣＰ７は、Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋ（上
記）で該固体支持体から切断し、５０ｍｇ（５４％）の
ＣＰ７、ＥＳＭＳ（ｍ／ｚ理論値＝１３３５．５１
（ＭＨ+平均）、測定値＝１３３５．０２）を得た。
【０３２６】１０ｍｇ（７．５μｍｏｌ）のＣＰ７を１
ｍｌのＤＭＦに溶解した。これに、１ｍｌの２０％ＤＩ
ＥＡ／ＤＭＦに溶解した５ｍｇのテトラメチルローダミ
ン−５−マレイミド＊単一異性体＊を、添加した。９０
分間後、ＨＰＬＣ−ＭＳ分析により反応は完結したと判
断した。産物は、Ｃ４分取用クロマトグラフィーにより
単離され、所望の産物分子量（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）を示
す画分を集め、凍結乾燥し、１．１５ｍｇ（８％）のＣ
Ｐ６ ＥＳＭＳ（ｍ／ｚ理論値＝１８１７．０２（ＭＨ
+平均）、測定値＝１８１６．９１）を得た。
【０３２７】材料 試薬はすべて、市販の最高純度のものを購入し、さらに
精製せずに使用した。ペプチド合成用の全試薬は、下記
のもの以外、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、
Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、カリフォルニア、米国から購
入した：ＱＳＹ TM−７マレイミド（カタログ番号Ｑ−１
０２５７）、ローダミングリーンカルボン酸，トリフル
オロアセタミド，スクシンイミジルエステル（５（６）
−ＣＲ１１０ ＴＦＡ，ＳＥ）＊混合異性体＊（カタロ
グ番号Ｒ−６１１２）、５−（および−６）−カルボキ
シテトラメチルローダミン，スクシンイミジルエステル
（５（６）−ＴＡＭＲＡ，ＳＥ）＊混合異性体＊（カタ
ログ番号Ｃ１１７１）、５−カルボキシフルオレセイ
ン，スクシンイミジルエステル（５−ＦＡＭ，ＳＥ）＊
単一異性体＊（カタログ番号Ｃ２２１０）およびテトラ
メチルローダミン−５−マレイミド＊単一異性体＊（カ
タログ番号Ｔ−６０２７）は、すべてＭｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎｃ．、オレゴン、米国、から購
入した；ＦＭＯＣ−ＰＡＬ−ＰＥＧ−ＰＳはＰｅｒｃｅ
ｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、マサチューセッ
ツ、米国（カタログ番号ＧＥＮ９１３３８４）；ＦＭＯ
Ｃ−Ｂ−ＡｌａｎｉｎｅおよびＦＭＯＣ−ｄ−ｐｈｅｎ
ｙｌａｌａｎｉｎｅは、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ、カリ
フォルニア、米国から購入した；ＦＭＯＣ−Ａｒｇ（Ｐ
ｂｆ）−ＯＨはＡｎａＳｐｅｃ、Ｉｎｃ．、カリフォル
ニア、米国から購入した；２，２，２−トリフルオロエ
タノールはＡｌｄｒｉｃｈ、ウイスコンシン、米国から
購入した。炭酸ナトリウムはＦｉｓｈｅｒ、ペンシルバ
ニア、米国から購入した。
【０３２８】分取用ＨＰＬＣクロマトグラフィーは、Ｖ
ｙｄａｃ（カリフォルニア、米国）Ｃ１８（カタログ番
号２１８ＴＰ１０２２）またはＣ４（カタログ番号２１
４ＴＰ１０２２）カラム上、流速１０ｍｌ／分で、０％
から８０％（Ａ＝５％ＣＨ3ＣＮ／０．１％ＴＦＡ／９
４．９％Ｈ2Ｏ、Ｂ＝１００％ＣＨ3ＣＮ）の直線勾配に
より３０分間にわたり溶離し、３０秒間画分を集めなが
ら、実施した。分析用ＨＰＬＣ−ＭＳは、Ｍｉｃｒｏｍ
ａｓｓ（マンチェスター、英国）ＬＣＴ質量分析計（外
部校正基準に基づく質量）を、Ｗａｔｅｒｓ（マサチュ
ーセッツ、米国）２６９０ＨＰＬＣ注入口およびＷａｔ
ｅｒｓ９９６ホトダイオードアレー検出器と組合わせて
用い、Ｖｙｄａｃ Ｃ４（カタログ番号２１４ＴＰ５４
１５）カラム上、０％から８０％（Ａ＝５％ＣＨ3ＣＮ
／０．１％ＴＦＡ／９４．９％Ｈ2Ｏ、Ｂ＝１００％Ｃ
Ｈ3ＣＮ）の直線勾配により３０分間にわたり、流速１
ｍｌ／分でクロマトグラフィーを実施した。デコンボリ
ューションした分子量は、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓトランス
フォームソフトウエアを用い、観察された多価イオンか
ら計算した。ＭＡＬＤＩ−ＭＳは、Ｐｅｒｃｅｐｔｉｖ
ｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｖｏｙａｇｅｒ−ＤＥ線形
質量分析計上で、アルファシアノ４−ヒドロキシケイ皮
酸マトリックス（Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ、カ
リフォルニア、米国）および外部校正に基づく質量報告
値とを用いて、得た。
【０３２９】方法（化学構造を含む） ＣＰ４（＝合成ペプチド基質ローダミングリーンＧｌｙ
−Ｇｌｙ−ｄＰｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｖａｌ
−Ｃｙｓ（ＱＳＹTM−７）−βＡｌａ−ＮＨ2）は、固
相ペプチド合成スキームにキー中間体ＣＰ３を取込ん
で、合成する。
【０３３０】
【化１】
【０３３１】要するに、ＦＭＯＣ−ＰＡＬ−ＲＥＧ樹脂
は、収量および時間の効率について最適化した固相ペプ
チド合成プロトコールを用いて、加工する。これらのサ
イクル（詳細は上記）は、２ＦＭＯＣ脱保護、洗浄、Ｈ
ＢＴＵ活性化アミノ酸の単一カップリング、洗浄、キャ
ッピング、そして最後に、まずＮＭＰで、次いで１：１
トリフルオロエタノール／ジクロロメタンで洗浄、を組
み込む。これらの洗浄は、樹脂の二次構造を緩め、次の
サイクルにおける完全な脱保護および次に引き込むアミ
ノ酸の効率的なカップリングを可能にするのに、役立
つ。
【０３３２】ＣＰ２は以下のように合成される（詳細は
上記）：
【０３３３】
【化２】
【０３３４】ＱＳＹTM−７タグのこの取込み後、第二の
蛍光色素ローダミングリーンを、下に示すようにビスト
リフルオロアセチル保護色素として添加する。
【０３３５】
【化３】
【０３３６】最後に、該トリフルオロアセチル基をＮａ
2ＣＯ3での処理により除き、所望の基質ＣＰ４を得る。
【０３３７】
【化４】
【０３３８】ＣＰ５はＣＰ４と同じように調製するが、
そこでは５−カルボキシフルオレセイン，スクシンイミ
ジルエステル（５−ＦＡＭ，ＳＥ）＊単一異性体＊を、
ローダミングリーンカルボン酸、トリフルオロアセタミ
ド、スクシンイミジルエステルに代えて入換え、そして
トリフルオロアセチル保護基を必要とせずに、該カップ
リング反応から直接ＣＰ５を得る：
【０３３９】
【化５】
【０３４０】ＣＰ６は下記のフローダイアグラムに従っ
て調製する：
【０３４１】
【化６】
【０３４２】ＣＰ７は次いで５−テトラメチルローダミ
ンマレイミドでタグ付けし、ＣＰ６を得る
【０３４３】
【化７】
【０３４４】ＦＲＥＴアッセイ （ａ）ＮＥＰ ＦＲＥＴアッセイ 序論 次の実施例は、メタロエンドペプチダーゼ、特にＮＥＰ
についての新規同質ＦＲＥＴに基づくアッセイの開発お
よびスクリ−ニングを説明している。この３８４ウエル
アッセイは、低ｋm値をもつ新規基質（その調製は上に
記載されている）を利用しており、それはハイスループ
ットスクリーニング（ＨＴＳ）のために費用に対して効
率をよくしている。加えて、該基質の設計に使われる蛍
光色素類は、化合物干渉を避けるために、望ましい光学
性質を備えている。
【０３４５】アッセイ開発後、該アッセイは、Ｒｏｂｏ
ｌａｂ ９６００直線軌道スクリーニングロボット（Ｒ
ｏｂｏｃｏｎ、ウィーン、オーストリア）上に移すのに
成功し、そして確証された。このアッセイの質の高さの
例は、ＨＴＳが運行された速度とともに、下に示すが、
２４時間以内に６２、０００データポイントの平均処理
能力を達成した。
【０３４６】材料および方法 すべてのアッセイは、Ｍａｔｒｉｘ Ｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｉｅｓ Ｌｔｄ．（Ｃｈｅｓｈｉｒｅ、英国）から購
入した、３８４ウエル黒色平底プレート中で実施した。
【０３４７】スクリーニング用の化合物は、１０μＭの
最終スクリーニング濃度を達成するように、１％ＤＭＳ
Ｏ中４０μＭで個別に供給した。ペプチド基質（ローダ
ミングリーンＧｌｙ−Ｇｌｙ−ｄＰｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｒ
ｇ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ（ＱＳＹTM７）−βＡｌａ
−ＮＨ2）（配列番号８）は上記のように作り、そして
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎｃ．から購入
した蛍光色素類で標識した。すべての他の試薬は、Ｓｉ
ｇｍａ／Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｐｏｏｌｅ、Ｄｏｒｓｅｔ、
英国）から購入した。
【０３４８】組換えヒトＮＥＰ酵素は、Ｐｉｃｈｉａ
ｐａｓｔｏｒｉｓを用いて発現させ、そして３工程精製
手順を用いて均一に精製した。すべてのアッセイは、５
０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ緩衝液ｐＨ８、０．１％ ｖ／ｖｐ
ｌｕｒｏｎｉｃ−Ｆ１２７および１％ ｖ／ｖプロテア
ーゼ阻害剤カクテル（アンチパイン、アプロチニン、ロ
イペプチン、ペプスタチンＡ）中で、実施した。１％
ＤＭＳＯ中の化合物の１０μｌを各ウエルに、次いで２
０μｌの組換え酵素（１０ｎＭ最終濃度）を、添加し
た。反応は、１０μｌの基質（１μＭ最終濃度）の添加
により開始し、そしてプレートを２５℃で１時間インキ
ュベートした。反応の終結は、２０μｌのＳｔｏｐ（既
知阻害剤の過剰量）を加え、ウエル中で１０μＭの濃度
になるようにして、達成した。プレートはＴｅｃａｎ
Ｕｌｔｒａ（４８５ｎｍ励起、５３５ｎｍ発光；Ｔｅｃ
ａｎ Ａｕｓｔｒｉａ、ザルツブルク、オーストリア）
を用いてカウントした。
【０３４９】アッセイ展開および定常状態速度論 ＮＥＰ酵素の定常状態速度論を、ｋcatおよびｋm値に換
算して調べた（表１参照）が、それらは、文献とよく一
致していた。さらに、ＮＥＰ酵素濃度および反応時間を
至適化し、そして適切な停止試薬を同定した（効力標準
品の過剰量）。溶媒耐性も調べ、該アッセイで１％ＤＭ
ＳＯ最終濃度まで許容できることがわかった。最後に、
該アッセイでは０．１％ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ１２７が
絶対に必要で、これは、ペプチド基質が非常に疎水性
で、３８４ウエルプレート中のウエルに付着するためと
考えられる。
【０３５０】
【表３】
【０３５１】ＨＴＳアッセイ実証およびスクリーニング 該アッセイは、二つの標準実証処置を用いて、Ｒｏｂｏ
ｌａｂ ９６００スクリーニングロボット（Ｒｏｂｏｃ
ｏｎ）に移すのに成功した： １． 試薬安定性は、アッセイ値比（Ａｓｓａｙ Ｖａ
ｌｕｅ Ｒａｔｉｏ（ＡＶＲ））の計算により長時間に
わたり測定した；そして ２． Ｐｆｉｚｅｒ化合物コレクションのサブセットを
スクリーンして、一次活性化合物（アクティブス、ａｃ
ｔｉｖｅｓ）の選択についてカットオフ百分率を決定し
た。
【０３５２】試薬安定性は、該自動化システムで２４時
間スクリーニングが可能かどうかを明らかにするため
に、長時間にわたり測定する。ＡＶＲすなわちアッセイ
値比は、下に示す式を用いて計算されるアッセイ品質の
統計的な尺度である。許容統計値は、ＡＶＲ≦０．６
（ｚ’≧０．４）のときに、得られる。
【０３５３】
【数１】
【０３５４】ＡＶＲ値を測定するために、最大（０．２
５％ＤＭＳＯ最終濃度）および最小（効力標準品の過剰
量）ウエルをもつスクリーニングプレートを調製した。
次いで各ＡＶＲプレートを、４時間サイクル時を用い
て、該ロボット上でスケジュールした。結果は図１０に
示す。
【０３５５】実証方法の第２部は、一次活性化合物の選
択についてカットオフ百分率を決定するための、Ｐｆｉ
ｚｅｒ化合物コレクションのサブセットのスクリーニン
グを含めた。二つのセットの同一化合物プレートをスク
リーンしたが、一つのセットは既知濃度の阻害剤をスパ
イク（添加）してあり、もう一つはスパイクなしであっ
た。結果は図１１に示す。
【０３５６】一次スクリ−ニングは、７回スケジュール
ロボット走査で完結し、１日当り１７０プレート（６
２，０００化合物）の平均処理能力を達成した。プレー
トは、８分間サイクル時を用いて、ロボット上でスケジ
ュールした。対照および酵素は、Ｔｅｃａｎ Ｇｅｎｅ
ｓｉｓ液体処理ロボット （Ｔｅｃａｎ ＡＧ、Ｈｏｍ
ｂｒｅｃｈｔｉｋｏｎ、スイス）を用いて、プレ−トに
添加した。基質はＬａｂｓｙｓｔｅｍｓ ３８４ マル
チドロップ（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ Ｏｙ、ヘルシン
キ、フィンランド）を用いて添加し、停止溶液はＲｏｂ
ｏｃｏｎ Ｒｅａｇ液体ディスペンサー（Ｒｏｂｏｃｏ
ｎ）を用いて添加した。試薬はすべて４℃に冷却した。
【０３５７】図１３および１４は、ＨＴＳを通じて達成
された高アッセイ品質を示す。ＡＶＲ値は常に高水準に
あり、しかもスクリーニング中に実際に改善した。一次
スクリーニングキャンペーンの全アクティブスは、Ｐｆ
ｉｚｅｒ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｌｉｑｕｉｄ Ｓａｍ
ｐｌｅ Ｂａｎｋ（ＡＬＳＢ）から注文し、十分にイン
テグレートされたＴｅｃａｎ Ｇｅｎｅｓｉｓ、Ｇｅｎ
ｍａｔｅ、Ｕｌｔｒａ システム（Ｔｅｃａｎ Ａｕｓ
ｔｒｉａ；Ｔｅｃａｎ ＡＧ）上で再テストした。再テ
ストで確認された一次アクティブスの５０％、そして１
２００の化合物がＩＣ50決定のために選択された。
【０３５８】そのＩＣ50データの品質は高水準で、１２
００の確認アクティブスから、３つの１μＭ以下のヒッ
トが同定された。これらの化合物の一つから得られたデ
ータの例を図１４に示す。全ＩＣ50曲線（例を図１５に
示す）は、Ｇｒａｆｉｔ ４（Ｅｒｉｔｈａｃｕｓ Ｓ
ｏｆｔｗａｒｅ、Ｈｏｒｌｅｙ、Ｓｕｒｒｅｙ、英国）
またはＰｆｉｚｅｒ ＨＴＳデータ処理プログラムを用
い、完全４パラメーターロジスティック方程式にフィッ
トした。
【０３５９】アッセイの小型化 該３８４ウエルＨＴＳが成功裏に完成したのに続き、少
容量３８４Ｃｏｒｎｉｎｇ／Ｃｏｓｔａｒプレート（Ｃ
ｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ ＵＫ、ＨｉｇｈＷｙｃｏ
ｍｂｅ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、英国）およ
び１５３６ウエルＧｒｅｉｎｅｒプレート（Ｇｒｅｉｎ
ｅｒ Ｌａｂｏｒｔｅｃｈｎｉｋ Ｌｔｄ．、Ｇｌｏｕ
ｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ、英国）を検討した。これらの
実験からのデータは、下の表２に示す。
【０３６０】
【表４】
【０３６１】要約および結論 新規ＮＥＰ阻害剤（ＮＥＰｉ）が、新規３８４ウエルＦ
ＲＥＴ基盤アッセイを用いて同定された。該アッセイ
は、ＮＥＰ酵素の定常状態速度論の確定に続いて、開発
され、そしてハイスループットスクリーニング（ＨＴ
Ｓ）用の３８４ウエルフォーマットでの確証に成功し
た。該ＨＴＳキャンペーンは、Ｒｏｂｏｃｏｎ９６００
直線軌道スクリーニングロボット（Ｒｏｂｏｃｏｎ）を
用いて、行った。１日当り６２，０００データポイント
の平均処理能力が達成され、そしてその一次ＨＴＳは７
回スケジュール走査で完結した。これにより、一連の多
様な阻害剤の同定が容易になり、そのうちいくつかはマ
イクロモル以下の効力を示した。
【０３６２】３８４ウエルＨＴＳに続き、少容量３８４
および１５３６ウエルプレートでのアッセイ小型化を検
討した。初期の結果は非常に良好であり、該アッセイを
最適化するための、さらなる研究が計画されている。少
容量３８４ウエルアッセイは、新しい３８４および１５
３６液体処理技術を評価する上で、有用なモデルとなる
だろう。
【０３６３】要するに上記は、自動化および小型化の両
方に適合する多目的な、ＨＴＳのための同質蛍光に基づ
くアッセイの実施例を提供している。化合物の数が増加
し続けており、処理能力の増大および経費の節減の必要
性はＨＴＳのための駆動力の鍵となっているので、蛍光
に基づくスクリーニングは、今後益々大きな役割を果す
ようになって行くであろう。
【０３６４】（ｂ）ＳＥＰ ＦＲＥＴアッセイ ＳＥＰ ＦＲＥＴアッセイは、ＮＥＰ ＦＲＥＴアッセ
イについて上に述べたのと本質的に同じ方法に従う。し
かし、検討する酵素については若干の相違がある。
【０３６５】該アッセイ用の試薬はまず次のように調製
する：基質溶液は、基質ローダミングリーンＧｌｙ−Ｇ
ｌｙ−ｄＰｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｃ
ｙｓ（ＱＳＹTM７）−βＡｌａ−ＮＨ2（配列番号８）
を、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７．４（Ｓｉｇｍ
ａ、英国）中に２μＭの濃度に再懸濁することにより作
り、次に２５ｍｌにつき、ＥＤＴＡフリープロテアーゼ
阻害剤カクテル錠剤（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉ
ｃｓ、英国）を１錠添加する。
【０３６６】上記ＳＥＰ酵素のアリコートを融解し、次
いで、各酵素バッチに対し特定の予め決められた係数に
より５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４中に希釈し、そ
の結果、５０μｌが、基質の約３０％をアッセイ時に産
物に変換するのに十分な酵素を含むようにする。
【０３６７】４ｍｌのＤＭＳＯを加えた９６ｍｌの５０
ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４を含む４％ＤＭＳＯ溶液
を調製する。産物溶液を、５００μｌの基質溶液を、２
５０μｌの酵素溶液を加えた２５０μｌの４％ＤＭＳＯ
溶液に加え、そして３７℃で１６時間インキュベートす
ることにより、調製する。
【０３６８】アッセイは次のように組立てる：黒色９６
ウエルマイクロタイタープレート中で、１００μｌの基
質溶液を５０μｌの４％ＤＭＳＯ溶液に加える。同様な
非特異的バックグラウンドブランクも設定するが、その
中では５０μｌの４％ＤＭＳＯ溶液が、さらに４０μＭ
のホスホラミドンを含む。５０μｌの酵素溶液を該アッ
セイおよびブランクに加え、そして該９６ウエルプレー
トをＢＭＧギャラクシー蛍光リーダー中に置き、Ｂｉｏ
ｌｉｓｅソフトウエアパッケージ（ＢＭＧ Ｌａｂ ｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｏｆｆｅｎｂｅｒｇ、ドイ
ツ）で作動する。
【０３６９】プレートは蛍光リーダー中で３７℃、１時
間インキュベートし、そして３分間毎に蛍光測定を行う
（励起（Ｅｘ）４８５ｎｍ／発光（Ｅｍ）５３５ｎ
ｍ）．ＳＥＰのタンパク質分解活性は、試料の蛍光の増
加の速度から、非特異的バックグラウンドブランクの蛍
光ユニットの増加の速度を引いた速度に相当する。４回
の連続リーディングについて該ソフトウエアにより計算
された最大速度測定値（ＭａｘＶ）を、この計算に使用
する。
【０３７０】同一マイクロタイタープレート上のウエル
中の２００μｌの産物から得た蛍光測定値をとる。必要
ならば、この値と、該ＳＥＰアッセイの６０分間時点で
測定された蛍光の単位とを使って、１時間のインキュベ
ーション期間にタンパク質分解された基質の百分率
（％）を計算するか、または測定された蛍光の増加速度
をタンパク質分解された基質ｎｇ／分／ｍｌ酵素のよう
な他の有用な単位へ変換する。
【０３７１】該アッセイは、１９７９年Ｂｕｔｔｅｒｗ
ｏｒｔｈｓにより刊行されたＡｔｈｅｌ Ｃｏｒｎｉｓ
ｈ Ｂｏｗｄｅｎ著、Ｆｕｄａｍｅｎｔａｌｓ ｏｆ
Ｅｎｚｙｍｅ Ｋｉｎｅｔｉｃｓに記載された標準原理
に従って、ＶｍａｘおよびＫｍのような酵素動力学的パ
ラメーターの計算に、使われる。
【０３７２】ＳＥＰ阻害剤の阻害パラメーターを決定す
るのにＳＥＰ ＦＲＥＴアッセイを使用すること ＳＥＰ阻害剤（ＳＥＰｉ；例えばホスホラミドン）のＩ
Ｃ50を決めるために、５０μｌのＤＭＳＯ溶液（阻害剤
の１０ｍＭ インヒビターの１００％ＤＭＳＯストック
溶液を４％ＤＭＳＯ／５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．
４で適宜希釈して作る）中に含まれる、一連のテスト濃
度の阻害剤で、上記のように多数回のＳＥＰアッセイを
実施する。適当な標準グラフフィッティングコンピュー
タープログラムを用いて、シグモイド状用量応答曲線
を、阻害剤濃度の対数に対してＭａｘＶ（または阻害％
または活性％）のプロットに合わせる。ＩＣ50は、最大
阻害の５０％を起す阻害剤濃度として計算する。典型的
には、ある一つのＩＣ50の決定に、半対数単位増分で異
なる少なくとも１０阻害剤濃度の用量範囲を用いる。
【０３７３】該ＳＥＰアッセイは、例えば、１９７９年
Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓにより刊行されたＡｔｈｅｌ
Ｃｏｒｎｉｓｈ Ｂｏｗｄｅｎ著、Ｆｕｄａｍｅｎｔ
ａｌｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅ Ｋｉｎｅｔｉｃｓに記載
された標準酵素学原理に従って、Ｋｉおよび阻害の様式
（すなわち、阻害が拮抗的、混合的、非拮抗的かなど）
を決定するのに、使用する。
【０３７４】上記ＳＥＰ ＦＲＥＴアッセイは、（前述
したＮＥＴ ＦＲＥＴアッセイにより）該３８４ウエル
プレートフォーマットを使用するためにも、適用した。
該ＮＥＰ ＦＲＥＴアッセイにより、０．１％ｖ／ｖ
ｐｌｕｒｏｎｉｃ−Ｆ１２７は、さらに小型のウエルフ
ォーマットアッセイを効率的に機能させるのにも、必要
であった。
【０３７５】実施例５‐性覚醒の動物モデル 当該出願人らの研究で、男性および女性の性覚醒の生理
についての確固とした再現性のあるモデルを開発した。
このモデルは麻酔した家兎を用い、レーザードップラー
技術を採用し、心臓血管パラメーターをルーティンに記
録しながら、海綿体内圧および性器血流をモニターす
る。テスト作用物質の不在および存在下で、骨盤神経刺
激またはＶＩＰの注入により誘導される、陰茎内の海綿
体内圧および膣（そして陰核の場合でも）の血流におけ
る僅かの変化も測定できる。
【０３７６】発明者らは、この動物モデルが臨床データ
を直接反映すると考えている。従って、このモデルは、
海綿体内圧の増加を介する陰茎勃起の亢進および膣また
は陰核血流の亢進を測定するような、ＭＥＤおよびＦＳ
ＡＤの予防および／または治療のための候補作用物質を
研究するのに、使用可能である。
【０３７７】男性および女性の性覚醒に関与する潜在的
基質としてＶＩＰおよび他のニューロペプチドを同定す
ること 血管作動性腸管ペプチド（ＶＩＰ）として知られる性ニ
ューロペプチド前駆体を分解するＳＥＰの能力を、例え
ば、米国、カリフォルニア、Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから商業的に入手できるＶＩＰラ
ジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）のようなＲＩＡを利用し
て、測定する。
【０３７８】ＳＥＰ酵素の試料、（上記のような方法に
より産生された）典型的には５−１００μｌの組換えＳ
ＥＰを、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４のような緩
衝液中で、３７℃、５時間、ＶＩＰペプチドの試料、典
型的には１−１０ｎｇ、とインキュベートする。これと
同じだが１０μＭのホスホラミドンも含む負の対照を設
定し、同じ仕方で処理する。インキュベーション期間
後、当該試料および負の対照の両方の中に残るＶＩＰの
量を、製造会社の取扱説明書によりＲＩＡを用いて、定
量する。負の対照に比較して試料中のＶＩＰの量の減少
は、ＳＥＰのＶＩＰタンパク質分解活性の尺度である。
該アッセイは、例えば、１９７９年Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒ
ｔｈｓにより刊行されたＡｔｈｅｌ Ｃｏｒｎｉｓｈ
Ｂｏｗｄｅｎ著、Ｆｕｄａｍｅｎｔａｌｓ ｏｆ Ｅｎ
ｚｙｍｅ Ｋｉｎｅｔｉｃｓに記載された標準原理に従
って、ＶｍａｘおよびＫｍのような酵素動力学的パラメ
ーターの決定に、使われる。
【０３７９】実施例６‐ＳＥＰ阻害剤についての動物テ
スト法 女性性機能不全動物モデル 麻酔プロトコール 雌のニュージーランド家兎（〜２．５ｋｇ）に、顔マス
クを介して酸素摂取を維持しながら、Ｍｅｄｅｔｏｍｉ
ｄｉｎｅ（ＤｏｍｉｔｏｒR）０．５ｍｌ／ｋｇ筋肉内
およびＫｅｔａｍｉｎｅ（ＶｅｔａｌａｒR）０．２５
ｍｌ／ｋｇ筋肉内の組合わせで、前投薬する。それらの
家兎は、ＰｏｒｔｅｘTM無袖気管内チューブ３ＩＤを用
いて、気管切開し、ベンチレータに接続し、そして約１
８−２０ｍｌの呼吸容量、および１０ｃｍ Ｈ2Ｏの最
大気道圧により、毎分３０−４０呼吸の換気速度で維持
する。次いで麻酔はＩｓｏｆｌｕｒａｎｅに替え、換気
は２ｌ／分でＯ2により続ける。右縁耳静脈に２３Ｇま
たは２４Ｇカテーテルを用いてカニューレ挿入し、そし
てラクテーテッドリンゲル（Ｌａｃｔａｔｅｄ Ｒｉｎ
ｇｅｒ）溶液を０．５ｍｌ／分で潅流する。家兎は、侵
襲性手術の際は３％Ｉｓｏｆｌｕｒａｎｅで維持し、維
持麻酔では２％に落とす。
【０３８０】血管のカニュ−レ挿入 家兎の左鼡径領野を剃り、大腿に沿って長さ約５ｃｍに
垂直切開する。大腿静脈を露出させ、分離し、次いで薬
剤および化合物の注入用にＰＶＣカテーテル（１７Ｇ；
Ｐｏｒｔｅｘ Ｌｉｍｉｔｅｄ、Ｈｙｔｈｅ、ケント、
英国）でカニューレ挿入する。カニューレ挿入は大腿動
脈について反復し、カテーテルが腹大動脈に確実に届く
ように、１０ｃｍの深さに該カテーテルを挿入する。こ
の動脈カテーテルは、血圧を記録するために、Ｇｏｕｌ
ｄシステムに接続する。血液ガス分析用の試料も、その
動脈カテーテルを介して採取する。収縮期および拡張期
圧を測定し、そして平均動脈圧は、公式［（拡張期ｘ２
＋ 収縮期）÷３］を用いて計算する。心拍数は、パ
ルスオキシメーターおよびＰｏ−ｎｅ−ｍａｈデータ入
手ソフトウエアシステム（Ｐｏｎｅｍａｈ Ｐｈｙｓｉ
ｏｌｏｇｙ Ｐｌａｔｆｏｒｍ、Ｇｏｕｌｄ Ｉｎｓｔ
ｒｕｍｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．、オハイオ、
米国）を介して測定する。
【０３８１】骨盤神経の刺激 腹中線切開を腹腔中へ行う。切開は恥骨の直ぐ上で長さ
約５ｃｍである。脂肪および筋肉は鈍く切り分け、体腔
下へ走る下腹部神経を明らかにする。恥骨の上にある、
大腿静脈および動脈を傷つけないようにするため、恥骨
壁の側面カーブの近くを保つことが不可欠である。坐骨
神経および骨盤神経はさらに深くにあり、さらに切り分
けると、家兎の背側に位置する。坐骨神経が確認されれ
ば、骨盤神経の位置は容易にわかる。用語骨盤神経は大
まかに適用される；該対象物に関する解剖学書は、当該
神経を十分詳細には同定していない。しかし該神経の刺
激は、膣および陰核血流の増加および骨盤領域の神経支
配を起す。該骨盤神経から周囲の組織を除き、Ｈａｒｖ
ａｒｄ双極刺激電極を該神経の周りに置く。神経を僅か
に持ち上げて、多少張力を与え、該電極を定位置に確保
する。約１ｍｌの軽パラフィン油を該神経と電極の周り
に置く。これは、神経に対する保護潤滑剤として働き、
電極の血液汚染を防ぐ。電極はＧｒａｓｓ Ｓ８８ Ｓ
ｔｉｍｕｌａｔｏｒに接続する。骨盤神経は、次のパラ
メーターを用いて刺激する：５Ｖ、パルス幅０．５ミリ
秒、刺激の持続１０秒、および２から１６Ｈｚの周波数
範囲。１５から２０分間毎に神経を刺激した場合に、再
現性のある応答が得られる。
【０３８２】最大下限の応答として使用するための最適
周波数、普通は４Ｈｚ、を決めるため、各実験の開始時
に周波数応答曲線を決定する。テストする化合物（類）
は、連続１５分間刺激サイクルを可能にするＨａｒｖａ
ｒｄ２２注入ポンプを用い、大腿静脈を介して、注入す
る。
【０３８３】Ｌａｓｅｒ Ｄｏｐｐｌｅｒプローブの位
置決め 腹中線切開を恥骨の尾端で行い、恥骨領野を露出させ
る。結合組織を除去し、陰核の膜を露出させ、その壁に
小血管がないように確保する。外膣壁も結合組織を完全
に除くことにより、露出させる。一つのＬａｓｅｒ Ｄ
ｏｐｐｌｅｒフロープローブを膣内へ３ｃｍ挿入し、該
プローブシャフトの半分がなお見えるようにする。第２
プローブは、外陰核壁の直ぐ上になるように、位置決め
をする。次いでこれらのプローブの位置は、シグナルが
得られるまで、調整する。第２プローブは、外膣壁上の
血管の表面の直ぐ上に置く。両プローブは定位置にクラ
ンプでとめる。
【０３８４】膣および陰核血流は、Ｐｏ−ｎｅ−ｍａｈ
データ入手ソフトウエア（Ｐｏｎｅｍａｈ Ｐｈｙｓｉ
ｏｌｏｇｙ Ｐｌａｔｆｏｒｍ、Ｇｏｕｌｄ Ｉｎｓｔ
ｒｕｍｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．）を用いてＦ
ｌｏｗｍｅｔｅｒから直接に数字として、またはＧｏｕ
ｌｄチャートレコーダートレースから間接的に、記録す
る。校正は、実験の始めに設定する（０−１２５ｍｌ／
分／組織１００ｇ）。
【０３８５】血管作動性腸管ペプチド（ＶＩＰ）の注入 注入されるＶＩＰ（Ｂａｃｈｅｍ、Ｈ−３７７５）の用
量は、２．０、６．０、２０．０、６０．０μｇ／ｋｇ
静脈内で、０．５ｍｌの塩類液の容量で注入する。ＶＩ
Ｐは、Ｈａｒｖａｒｄ ２２ポンプを用いて注入し、大
腿静脈内へ三つ又栓を経由して５００μｌ／分で注入す
る。ＶＩＰ注入後、ＶＩＰがカテーテル内に残らないよ
うに、該カテーテルをヘパリン入りの塩類液（Ｈｅｐｓ
ａｌｉｎｅ）で洗浄する。
【０３８６】ＶＩＰ注入を用いる実験では、再現性のあ
る応答を得るために、初期感作用量応答曲線（２−６０
μｇ／ｋｇ）が必要である。Ｈｅｐｓａｌｉｎｅ（５０
ＵＩ／ｍｌ）の初期注入は、負の対照として作動するた
めに、注入される。
【０３８７】阻害剤類の注入 ＳＥＰ阻害剤および担体対照は、ＶＩＰと同じ速度で注
入する。ＳＥＰ阻害剤は、ＶＩＰ用量応答曲線の前には
３０分間、骨盤神経刺激の前には１５分間、放置する。
【０３８８】データは、平均性器（膣／陰核）血流±平
均値の標準誤差（ｓ．ｅ．ｍ．）として表す。有意な変
化はステューデントのｔ検定を用いて確認する。
【０３８９】男性性機能不全動物モデル 麻酔家兎方法論 雄のニュージーランド家兎（〜２．５ｋｇ）に、顔マス
クを介して酸素摂取を維持しながら、Ｍｅｄｅｔｏｍｉ
ｄｉｎｅ（ＤｏｍｉｔｏｒR）０．５ｍｌ／ｋｇ筋肉内
およびＫｅｔａｍｉｎｅ（ＶｅｔａｌａｒR）０．２５
ｍｌ／ｋｇ筋肉内の組合わせで、前投薬する。それらの
家兎は、ＰｏｒｔｅｘTM無袖気管内チューブ３ＩＤを用
いて、気管切開し、ベンチレータに接続し、そして約１
８−２０ｍｌの呼吸容量、および１０ｃｍ Ｈ2Ｏの最
大気道圧により、毎分３０−４０呼吸の換気速度で維持
する。次いで麻酔はＩｓｏｆｌｕｒａｎｅに替え、換気
は２ｌ／分でＯ2により続ける。右縁耳静脈に２３Ｇま
たは２４Ｇカテーテルを用いてカニューレ挿入し、そし
てラクテーテッドリンゲル溶液を０．５ｍｌ／分で潅流
する。家兎は、侵襲性手術の際は３％Ｉｓｏｆｌｕｒａ
ｎｅで維持し、維持麻酔では２％に落とす。
【０３９０】血管のカニュ−レ挿入 家兎の左鼡径領野を剃り、大腿に沿って長さ約５ｃｍに
垂直切開する。大腿静脈を露出させ、分離し、次いで薬
剤および化合物の注入用にＰＶＣカテーテル（１７Ｇ；
Ｐｏｒｔｅｘ Ｌｉｍｉｔｅｄ）でカニューレ挿入す
る。あるいは、または、加えて、左頚静脈を露出させ、
分離し、次いで薬剤および化合物の注入用にＰＶＣカテ
ーテル（１７Ｇ；Ｐｏｒｔｅｘ Ｌｉｍｉｔｅｄ）でカ
ニューレ挿入する。カニューレ挿入は大腿動脈について
反復し、カテーテルが腹大動脈に確実に届くように、１
０ｃｍの深さに該カテーテルを挿入する。この動脈カテ
ーテルは、血圧を記録するために、Ｇｏｕｌｄシステム
に接続する。血液ガス分析用の試料も、その動脈カテー
テルを介して採取する。収縮期および拡張期圧を測定
し、そして平均動脈圧は、公式［（拡張期ｘ２ ＋ 収
縮期）÷３］を用いて計算する。心拍数は、パルスオキ
シメーターおよびＰｏ−ｎｅ−ｍａｈデータ入手ソフト
ウエアシステム（Ｐｏｎｅｍａｈ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇ
ｙ Ｐｌａｔｆｏｒｍ、Ｇｏｕｌｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅ
ｎｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．）を介して測定する。
【０３９１】骨盤神経の刺激 腹中線切開を腹腔中へ行う。切開は恥骨の直ぐ上で長さ
約５ｃｍである。脂肪および筋肉は鈍く切り分け、体腔
下へ走る下腹部神経を明らかにする。恥骨の上にある、
大腿静脈および動脈を傷つけないようにするため、恥骨
壁の側面カーブの近くに保つことが不可欠である。坐骨
神経および骨盤神経はさらに深くにあり、さらに切り分
けると、家兎の背側に位置する。坐骨神経が確認されれ
ば、骨盤神経の位置は容易にわかる。用語骨盤神経は大
まかに適用される；該対象物に関する解剖学書は、当該
神経を十分詳細には同定していない。しかし該神経の刺
激は、海綿体内圧および海綿体血流の増加および骨盤領
域の神経支配を起す。該骨盤神経から周囲の組織を除
き、Ｈａｒｖａｒｄ双極刺激電極を該神経の周りに置
く。神経を僅かに持ち上げて、多少張力を与え、該電極
を定位置に確保する。約１ｍｌの軽パラフィン油を該神
経と電極の周りに置く。これは、神経に対する保護潤滑
剤として働き、電極の血液汚染を防ぐ。電極はＧｒａｓ
ｓ Ｓ８８ Ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒに接続する。骨盤神
経は、次のパラメーターを用いて刺激する：５Ｖ、パル
ス幅０．５ミリ秒、１６Ｈｚの周波数で刺激の持続２０
秒間。１５から２０分間毎に神経を刺激した場合に、再
現性のある応答が得られる。
【０３９２】平均対照応答を確立するために、上記のパ
ラメーターを用いて数回刺激を行う。テストする化合物
（類）は、連続１５分間刺激サイクルを可能にするＨａ
ｒｖａｒｄ２２注入ポンプを用い、大腿静脈を経由し
て、注入する。陰茎の周りの皮膚および結合組織を除去
し、陰茎を露出さす。カテーテルセット（Ｉｎｓｙｔｅ
−Ｗ、Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ２０ Ｇａ
ｕｇｅ １．１ｘ４８ｍｍ、Ｂｅｃｋｔｏｎ−Ｄｉｃｋ
ｉｎｓｏｎ）を、白膜を介して左海綿体スペースに挿入
し、針を除去し、柔軟なカテーテルを残す。このカテー
テルは、海綿体内圧を記録するために、圧力変換器（Ｏ
ｈｍｅｄａ ５２９９−０４）を経由してＧｏｕｌｄシ
ステムに連結する。海綿体内圧が一旦確立したら、該カ
テーテルは、Ｖｅｔｂｏｎｄ（組織接着剤、３Ｍ）を用
いて定位置にシールする。心拍数は、パルスオキシメー
ターおよびＰｏ−ｎｅ−ｍａｈデータ入手ソフトウエア
システム（Ｐｏｎｅｍａｈ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ Ｐ
ｌａｔｆｏｒｍ、ＧｏｕｌｄＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｓ
ｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．）を介して測定する。
【０３９３】海綿体内血流は、Ｐｏ−ｎｅ−ｍａｈデー
タ入手ソフトウエア（Ｐｏｎｅｍａｈ Ｐｈｙｓｉｏｌ
ｏｇｙ Ｐｌａｔｆｏｒｍ、Ｇｏｕｌｄ Ｉｎｓｔｒｕ
ｍｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．）を用いてＦｌｏ
ｗｍｅｔｅｒから直接に数字として、またはＧｏｕｌｄ
チャートレコーダートレースから間接的に、記録する。
校正は、実験の始めに設定する（０−１２５ｍｌ／分／
組織１００ｇ）。
【０３９４】阻害剤類の注入 ＳＥＰ阻害剤および担体対照は、０．１ｍｌ／秒の速度
で注入する。ＳＥＰ阻害剤は、骨盤神経刺激の前には１
５分間、放置する。
【０３９５】データは、平均海綿体内血流±ｓ．ｅ．
ｍ．として表す。有意な変化はステューデントのｔ検定
を用いて確認する。以上の説明は例としてのみ提供した
もので、細部の修飾が本発明の範疇から逸脱せずになし
得ることは、了解されよう。
【０３９６】疑念を避けるために、本明細書に開示され
たすべての参考文献は、引用により援用される。配列表
【０３９７】
【表５】
【０３９８】
【０３９９】
【０４００】
【０４０１】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Pfizer Limited (EP (GB) only) Pfizer Inc. (EP except GB / US / CA / JP) <120> Assay Methods <130> PCS22036APME <150> US 09/948,429 <151> 2001-09-07 <150> GB 0017387.2 <151> 2000-07-14 <160> 9 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 2893 <212> DNA Homo sapiens <400> 1 ggcaccagct cagccccaag ccactgctct cccatcccag tccctggaaa tccacccact 60 tggcccagct caccccaact ccaacccact gggacccagt ctccaggggc ctgactgtgg 120 gcggcagcca ctcctgagtg agcaaaggtt cctccgcggt gctctcccgt ccagagccct 180 gctgatgggg aagtccgaag gccccgtggg gatggtggag agcgctggcc gtgcagggca 240 gaagcgcccg gggttcctgg agggggggct gctgctgctg ctgctgctgg tgaccgctgc 300 cctggtggcc ttgggtgtcc tctacgccga ccgcagaggg aagcagctgc cacgccttgc 360 tagccggctg tgcttcttac aggaggagag gacctttgta aaacgaaaac cccgagggat 420 cccagaggcc caagaggtga gcgaggtctg caccacccct ggctgcgtga tagcagctgc 480 caggatcctc cagaacatgg acccgaccac ggaaccgtgt gacgacttct accagtttgc 540 atgcggaggc tggctgcggc gccacgtgat ccctgagacc aactcaagat acagcatctt 600 tgacgtcctc cgcgacgagc tggaggtcat cctcaaagcg gtgctggaga attcgactgc 660 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Gln Glu Glu Arg Thr Phe Val Lys Arg Lys Pro Arg Gly Ile Pro 65 70 75 80 Glu Ala Gln Glu Val Ser Glu Val Cys Thr Thr Pro Gly Cys Val Ile 85 90 95 Ala Ala Ala Arg Ile Leu Gln Asn Met Asp Pro Thr Thr Glu Pro Cys 100 105 110 Asp Asp Phe Tyr Gln Phe Ala Cys Gly Gly Trp Leu Arg Arg His Val 115 120 125 le Pro Glu Thr Asn Ser Arg Tyr Ser Ile Phe Asp Val Leu Arg Asp 130 135 140 Glu Leu Glu Val Ile Leu Lys Ala Val Leu Glu Asn Ser Thr Ala Lys 145 150 155 160 Asp Arg Pro Ala Val Glu Lys Ala Arg Thr Leu Tyr Arg Ser Cys Met 165 170 175 Asn Gln Ser Val Ile Glu Lys Arg Gly Ser Gln Pro Leu Leu Asp Ile 180 185 190 Leu Glu Val Val Gly Gly Trp Pro Val Ala Met Asp Arg Trp Asn Glu 195 200 205 Thr Val Gly Leu Glu Trp Glu Leu Glu Arg Gln Leu Ala Leu Met Asn 210 215 220 Ser Gln Phe Asn Arg Arg Val Leu Ile Asp Leu Phe Ile Trp Asn Asp 225 230 235 240 Asp Gln Asn Ser Ser Arg His Ile Ile Tyr Ile Asp Gln Pro Thr Leu 245 250 255 Gly Met Pro Ser Arg Glu Tyr Tyr Phe Asn Gly Gly Ser Asn Arg Lys 260 265 270 Val Arg Glu Ala Tyr Leu Gln Phe Met Val Ser Val Ala Thr Leu Leu 275 280 285 Arg Glu Asp Ala Asn Leu Pro Arg Asp Ser Cys Leu Val Gln Glu Asp 290 295 300 Met Val Gln Val Leu Glu Leu Glu Thr Gln Leu Ala Lys Ala Thr Val 305 310 315 320 Pro Gln Glu Glu Arg His Asp Val Ile Ala Leu Tyr His Arg Met Gly 325 330 335 Leu Glu Glu Leu Gln Ser Gln Phe Gly Leu Lys Gly Phe Asn Trp Thr 340 345 350 Leu Phe Ile Gln Thr Val Leu Ser Ser Val Lys Ile Lys Leu Leu Pro 355 360 365 Asp Glu Glu Val Val Val Tyr Gly Ile Pro Tyr Leu Gln Asn Leu Glu 370 375 380 Asn Ile Ile Asp Thr Tyr Ser Ala Arg Thr Ile Gln Asn Tyr Leu Val 385 390 395 400 Trp Arg Leu Val Leu Asp Arg Ile Gly Ser Leu Ser Gln Arg Phe Lys 405 410 415 Asp Thr Arg Val Asn Tyr Arg Lys Ala Leu Phe Gly Thr Met Val Glu 420 425 430 Glu Val Arg Trp Arg Glu Cys Val Gly Tyr Val Asn Ser Asn Met Glu 435 440 445 Asn Ala Val Gly Ser Leu Tyr Val Arg Glu Ala Phe Pro Gly Asp Ser 450 455 460 Lys Ser Met Val Arg Glu Leu Ile Asp Lys Val Arg Thr Val Phe Val 465 470 475 480 Glu Thr Leu Asp Glu Leu Gly Trp Met Asp Glu Glu Ser Lys Lys Lys 485 490 495 Ala Gln Glu Lys Ala Met Ser Ile Arg Glu Gln Ile Gly His Pro Asp 500 505 510 Tyr Ile Leu Glu Glu Met Asn Arg Arg Leu Asp Glu Glu Tyr Ser Asn 515 520 525 Leu Asn Phe Ser Glu Asp Leu Tyr Phe Glu Asn Ser Leu Gln Asn Leu 530 535 540 Lys Val Gly Ala Gln Arg Ser Leu Arg Lys Leu Arg Glu Lys Val Asp 545 550 555 560 Pro Asn Leu Trp Ile Ile Gly Ala Ala Val Val Asn Ala Phe Tyr Ser 565 570 575 Pro Asn Arg Asn Gln Ile Val Phe Pro Ala Gly Ile Leu Gln Pro Pro 580 585 590 Phe Phe Ser Lys Glu Gln Pro Gln Ala Leu Asn Phe Gly Gly Ile Gly 595 600 605 Met Val Ile Gly His Glu Ile Thr His Gly Phe Asp Asp Asn Gly Arg 610 615 620 Asn Phe Asp Lys Asn Gly Asn Met Met Asp Trp Trp Ser Asn Phe Ser 625 630 635 640 Thr Gln His Phe Arg Glu Gln Ser Glu Cys Met Ile Tyr Gln Tyr Gly 645 650 655 Asn Tyr Ser Trp Asp Leu Ala Asp Glu Gln Asn Val Asn Gly Phe Asn 660 665 670 Thr Leu Gly Glu Asn Ile Ala Asp Asn Gly Gly Val Arg Gln Ala Tyr 675 680 685 Lys Ala Tyr Leu Lys Trp Met Ala Glu Gly Gly Lys Asp Gln Gln Leu 690 695 700 Pro Gly Leu Asp Leu Thr His Glu Gln Leu Phe Phe Ile Asn Tyr Ala 705 710 715 720 Gln Val Trp Cys Gly Ser Tyr Arg Pro Glu Phe Ala Ile Gln Ser Ile 725 730 735 Lys Thr Asp Val His Ser Pro Leu Lys Tyr Arg Val Leu Gly Ser Leu 740 745 750 Gln Asn Leu Ala Ala Phe Ala Asp Thr Phe His Cys Ala Arg Gly Thr 755 760 765 Pro Met His Pro Lys Glu Arg Cys Arg Val Trp 770 775 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 ctgtcttgat ggattggatg 20 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 gtccttggca gtcgaattct cc 22 <210> 5 <211> 2975 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 cagagctcgt ttagtgaacc gtcagaattt tgtaatacga ctcactatag ggcggccgcg 60 aattcggcac cagctcagcc ccaagccact gctctcccat cccagtccct ggaaatccac 120 ccacttggcc cagctcaccc caactccaac ccactgggac ccagtctcca ggggcctgac 180 tgtgggcggc agccactcct gagtgagcaa aggttcctcc gcggtgctct cccgtccaga 240 gccctgctga tggggaagtc cgaaggcccc gtggggatgg tggagagcgc tggccgtgca 300 gggcagaagc gcccggggtt cctggagggg gggctgctgc tgctgctgct gctggtgacc 360 gctgccctgg tggccttggg tgtcctctac gccgaccgca gagggaagca gctgccacgc 420 cttgctagcc ggctgtgctt cttacaggag gagaggacct ttgtaaaacg aaaaccccga 480 gggatcccag aggcccaaga ggtgagcgag gtctgcacca cccctggctg cgtgatagca 540 gctgccagga tcctccagaa catggacccg accacggaac cgtgtgacga cttctaccag 600 tttgcatgcg gaggctggct gcggcgccac gtgatccctg agaccaactc aagatacagc 660 atctttgacg tcctccgcga cgagctggag gtcatcctca aagcggtgct ggagaattcg 720 actgccaagg accggccggc tgtggagaag gccaggacgc tgtaccgctc ctgcatgaac 780 cagagtgtga tagagaagcg aggctctcag cccctgctgg acatcttgga ggtggtggga 840 ggctggccgg tggcgatgga caggtggaac gagaccgtag gactcgagtg ggagctggag 900 cggcagctgg cgctgatgaa ctcacagttc aacaggcgcg tcctcatcga cctcttcatc 960 tggaacgacg accagaactc cagccggcac atcatctaca tagaccagcc caccttgggc 1020 atgccctccc gagagtacta cttcaacggc ggcagcaacc ggaaggtgcg ggaagcctac 1080 ctgcagttca tggtgtcagt ggccacgttg ctgcgggagg atgcaaacct gcccagggac 1140 agctgcctgg tgcaggagga catggtgcag gtgctggagc tggagacaca gctggccaag 1200 gccacggtac cccaggagga gagacacgac gtcatcgcct tgtaccaccg gatgggactg 1260 gaggagctgc aaagccagtt tggcctgaag ggatttaact ggactctgtt catacaaact 1320 gtgctatcct ctgtcaaaat caagctgctg ccagatgagg aagtggtggt ctatggcatc 1380 ccctacctgc agaaccttga aaacatcatc gacacctact cagccaggac catacagaac 1440 tacctggtct ggcgcctggt gctggaccgc attggtagcc taagccagag attcaaggac 1500 acacgagtga actaccgcaa ggcgctgttt ggcacaatgg tggaggaggt gcgctggcgt 1560 gaatgtgtgg gctacgtcaa cagcaacatg gagaacgccg tgggctccct ctacgtcagg 1620 gaggcgttcc ctggagacag caagagcatg gtcagagaac tcattgacaa ggtgcggaca 1680 gtgtttgtgg agacgctgga cgagctgggc tggatggacg aggagtccaa gaagaaggcg 1740 caggagaagg ccatgagcat ccgggagcag atcgggcacc ctgactacat cctggaggag 1800 atgaacaggc gcctggacga ggagtactcc aatctgaact tctcagagga cctgtacttt 1860 gagaacagtc tgcagaacct caaggtgggc gcccagcgga gcctcaggaa gcttcgggaa 1920 aaggtggacc caaatctctg gatcatcggg gcggcggtgg tcaatgcgtt ctactcccca 1980 aaccgaaacc agattgtatt ccctgccggg atcctccagc cccccttctt cagcaaggag 2040 cagccacagg ccttgaactt tggaggcatt gggatggtga tcgggcacga gatcacgcac 2100 ggctttgacg acaatggccg gaacttcgac aagaatggca acatgatgga ttggtggagt 2160 aacttctcca cccagcactt ccgggagcag tcagagtgca tgatctacca gtacggcaac 2220 tactcctggg acctggcaga cgaacagaac gtgaacggat tcaacaccct tggggaaaac 2280 attgctgaca acggaggggt gcggcaagcc tataaggcct acctcaagtg gatggcagag 2340 ggtggcaagg accagcagct gcccggcctg gatctcaccc atgagcagct cttcttcatc 2400 aactatgccc aggtgtggtg cgggtcctac cggcccgagt tcgccatcca atccatcaag 2460 acagacgtcc acagtcccct gaagtacagg gtactggggt cgctgcagaa cctggccgcc 2520 ttcgcagaca cgttccactg tgcccggggc acccccatgc accccaagga gcgatgccgc 2580 gtgtggtagc caaggccctg ccgcgctgtg cggcccacgc ccacctgctg ctcggaggca 2640 tctgtgcgaa ggtgcagcta gcggcgaccc agtgtacgtc ccgccccggc caaccatgcc 2700 aagcctgcct gccaggcctc tgcgcctggc ctagggtgca gccacctgcc tgacacccag 2760 ggatgagcag tgtccagtgc agtacctgga ccggagcccc ctccacagac acccgcgggg 2820 ctcagtgccc ccgtcacagc tctgtagaga caatcaactg tgtcctgccc accctccaag 2880 gtgcattgtc ttccagtatc tacagcttca gacttgagct aagtaaatgc ttcaaagaaa 2940 aaaaaaaaaa aaaaaaaact cgactctaga ttgcg 2975 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Met Gly Lys Ser Glu Gly Pro Val Gly 1 5 <210> 7 <211> 27 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 atggggaagt ccgaaggccc cgtgggg 27 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Synthetic <400> 8 Gly Gly Phe Leu Arg Arg Val Cys Ala 1 5 <210> 9 <211> 6 <212> PRT <213> Synthetic <400> 9 Gly Gly Phe Leu Arg Arg 1 5
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、ヒトＳＥＰｃＤＮＡのオープンリー
ディングフレーム（ＯＲＦｓ）の分析を示す。
【図２】 図２は、ｂｌａｓｔｐアルゴリズムからのペ
アワイズ整列による最も近縁なヒトタンパク質に対する
ヒトＳＥＰの比較を示す。
【図３】 図３は、ｂｌａｓｔｐ（タンパク質）および
ｆａｓｔａ（コードヌクレオチド）アルゴリズムからの
ペアワイズ整列によるＳＥＰに対するヒト、ラットおよ
びマウス配列の比較を示す。
【図４】 図４は、触媒ドメインを表示したヒトＳＥＰ
および関連ヒトタンパク質の多重整列を示す。
【図５】 図５は、触媒ドメインを表示したヒト、ラッ
トおよびマウスＳＥＰタンパク質の多重整列を示す。
【図６】 図６は、触媒ドメインを表示したヒト、ラッ
トおよびマウスＳＥＰコード配列の多重整列を示す。
【図７】 図７は、全ＳＥＰ様タンパク質の多重整列か
ら由来する放射樹として表現された、近隣結合距離法
（Ｎｅｉｇｈｂｏｕｒ−Ｊｏｉｎｉｎｇ Ｄｉｓｔａｎ
ｃｅ ｍｅｔｈｏｄ）による系統分析を示す。
【図８】 図８は、該多重整列の触媒ドメイン領域から
由来する放射樹として表現された、近隣結合距離法（Ｎ
ｅｉｇｈｂｏｕｒ−Ｊｏｉｎｉｎｇ Ｄｉｓｔａｎｃｅ
ｍｅｔｈｏｄ）による系統分析を示す。
【図９】 図９は、ＦＲＥＴに基づくアッセイ原理を示
す。蛍光の増加は、基質ペプチド切断酵素の非存在下
（“−酵素”）で検出される蛍光レベルと比較して、基
質ペプチド切断酵素の存在下（“＋酵素”）で検出され
る。適切な酵素阻害剤の存在下では、検出される蛍光レ
ベルは、基質ペプチド切断酵素の非存在下（“−酵
素”）で検出されるものと同様になろう。強度＝蛍光強
度。波長＝ｎｍ（ナノメートル）による。
【図１０】 図１０は、Ｒｏｂｏｌａｂ上での長時間に
わたるアッセイ値比（ＡＶＲ）結果のプロットを示す。
【図１１】 図１１は、第２実証実験を示す。一次アク
ティブスの選択のためのカットオフ百分率は３０％にセ
ットした。“＋スパイク”＝既知阻害剤化合物の添加。
“−スパイク”＝阻害剤化合物は添加しない。
【図１２】 図１２は、一次スクリーニングの際のアッ
セイ値比（ＡＶＲ）結果のプロットを示す。「◇」は１
つの１ＡＶＲプレートを表す。
【図１３】 図１３は、一次スクリーニングにおける結
果の分布を示す。アクティブスについてのヒット率は
２．２％であった。
【図１４】 図１４は、いくつかのスクリーニング統計
値を示す。
【図１５】 図１５は、ある確認アクティブのＩＣ50曲
線の１例を示す。該データは全体に高水準にあり、該ア
ッセイの質を反映していた。ＲＦＵ＝相対蛍光単位。
［Ｉ｝ｕＭ＝［Ｉ］μＭ＝マイクロモルでの阻害剤
（Ｉ）の濃度。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成１４年７月２６日（２００２．７．２
６）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正内容】
【図面の簡単な説明】
【図１ａ】 図１ａは、ヒトＳＥＰｃＤＮＡのオープン
リーディングフレーム（ＯＲＦｓ）の分析のうち、塩基
番号１〜３００番までを示す。
【図１ｂ】 図１ｂは、ヒトＳＥＰｃＤＮＡのオープン
リーディングフレーム（ＯＲＦｓ）の分析の図１ａの続
きを示す。
【図１ｃ】 図１ｃは、ヒトＳＥＰｃＤＮＡのオープン
リーディングフレーム（ＯＲＦｓ）の分析の図１ｂの続
きを示す。
【図１ｄ】 図１ｄは、ヒトＳＥＰｃＤＮＡのオープン
リーディングフレーム（ＯＲＦｓ）の分析の図１ｃの続
きを示す。
【図１ｅ】 図１ｅは、ヒトＳＥＰｃＤＮＡのオープン
リーディングフレーム（ＯＲＦｓ）の分析の図１ｄの続
きを示す。
【図１ｆ】 図１ｆは、ヒトＳＥＰｃＤＮＡのオープン
リーディングフレーム（ＯＲＦｓ）の分析の図１ｅの続
きを示す。
【図１ｇ】 図１ｇは、ヒトＳＥＰｃＤＮＡのオープン
リーディングフレーム（ＯＲＦｓ）の分析の図１ｆの続
きを示す。
【図１ｈ】 図１ｈは、ヒトＳＥＰｃＤＮＡのオープン
リーディングフレーム（ＯＲＦｓ）の分析の図１ｇの続
きを示す。
【図１ｉ】 図１ｉは、ヒトＳＥＰｃＤＮＡのオープン
リーディングフレーム（ＯＲＦｓ）の分析の図１ｈの続
きを示す。
【図２】 図２は、ｂｌａｓｔｐアルゴリズムからのペ
アワイズ整列による最も近縁なヒトタンパク質に対する
ヒトＳＥＰの比較を示す。
【図３】 図３は、ｂｌａｓｔｐ（タンパク質）および
ｆａｓｔａ（コードヌクレオチド）アルゴリズムからの
ペアワイズ整列によるＳＥＰに対するヒト、ラットおよ
びマウス配列の比較を示す。
【図４ａ】 図４ａは、触媒ドメインを表示したヒトＳ
ＥＰおよび関連ヒトタンパク質の多重整列のうち、先頭
部分を示す。
【図４ｂ】 図４ｂは、触媒ドメインを表示したヒトＳ
ＥＰおよび関連ヒトタンパク質の多重整列の図４ａの続
きを示す。
【図４ｃ】 図４ｃは、触媒ドメインを表示したヒトＳ
ＥＰおよび関連ヒトタンパク質の多重整列の図４ｂの続
きを示す。
【図５ａ】 図５ａは、触媒ドメインを表示したヒト、
ラットおよびマウスＳＥＰタンパク質の多重整列の前半
を示す。
【図５ｂ】 図５ｂは、触媒ドメインを表示したヒト、
ラットおよびマウスＳＥＰタンパク質の多重整列の後半
を示す。
【図６ａ】 図６ａは、触媒ドメインを表示したヒト、
ラットおよびマウスＳＥＰコード配列の多重整列のう
ち、先頭部分を示す。
【図６ｂ】 図６ｂは、触媒ドメインを表示したヒト、
ラットおよびマウスＳＥＰコード配列の多重整列の図６
ａの続きを示す。
【図６ｃ】 図６ｃは、触媒ドメインを表示したヒト、
ラットおよびマウスＳＥＰコード配列の多重整列の図６
ｂの続きを示す。
【図６ｄ】 図６ｄは、触媒ドメインを表示したヒト、
ラットおよびマウスＳＥＰコード配列の多重整列の図６
ｃの続きを示す。
【図７】 図７は、全ＳＥＰ様タンパク質の多重整列か
ら由来する放射樹として表現された、近隣結合距離法
（Ｎｅｉｇｈｂｏｕｒ−Ｊｏｉｎｉｎｇ Ｄｉｓｔａｎ
ｃｅ ｍｅｔｈｏｄ）による系統分析を示す。
【図８】 図８は、該多重整列の触媒ドメイン領域から
由来する放射樹として表現された、近隣結合距離法（Ｎ
ｅｉｇｈｂｏｕｒ−Ｊｏｉｎｉｎｇ Ｄｉｓｔａｎｃｅ
ｍｅｔｈｏｄ）による系統分析を示す。
【図９】 図９は、ＦＲＥＴに基づくアッセイ原理を示
す。蛍光の増加は、基質ペプチド切断酵素の非存在下
（“−酵素”）で検出される蛍光レベルと比較して、基
質ペプチド切断酵素の存在下（“＋酵素”）で検出され
る。適切な酵素阻害剤の存在下では、検出される蛍光レ
ベルは、基質ペプチド切断酵素の非存在下（“−酵
素”）で検出されるものと同様になろう。強度＝蛍光強
度。波長＝ｎｍ（ナノメートル）による。
【図１０】 図１０は、Ｒｏｂｏｌａｂ上での長時間に
わたるアッセイ値比（ＡＶＲ）結果のプロットを示す。
【図１１】 図１１は、第２実証実験を示す。一次アク
ティブスの選択のためのカットオフ百分率は３０％にセ
ットした。“＋スパイク”＝既知阻害剤化合物の添加。
“−スパイク”＝阻害剤化合物は添加しない。
【図１２】 図１２は、一次スクリーニングの際のアッ
セイ値比（ＡＶＲ）結果のプロットを示す。「◇」は１
つの１ＡＶＲプレートを表す。
【図１３】 図１３は、一次スクリーニングにおける結
果の分布を示す。アクティブスについてのヒット率は
２．２％であった。
【図１４】 図１４は、いくつかのスクリーニング統計
値を示す。
【図１５】 図１５は、ある確認アクティブのＩＣ50曲
線の１例を示す。該データは全体に高水準にあり、該ア
ッセイの質を反映していた。ＲＦＵ＝相対蛍光単位。
［Ｉ｝ｕＭ＝［Ｉ］μＭ＝マイクロモルでの阻害剤
（Ｉ）の濃度。
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１ａ】
【図１ｂ】
【図１ｉ】
【図２】
【図３】
【図４ｃ】
【図１ｃ】
【図１ｄ】
【図５ｂ】
【図６ｄ】
【図１ｅ】
【図１ｆ】
【図７】
【図８】
【図１ｇ】
【図１ｈ】
【図１１】
【図４ａ】
【図４ｂ】
【図５ａ】
【図６ａ】
【図６ｂ】
【図６ｃ】
【図９】
【図１０】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 9/99 Ｃ１２Ｑ 1/37 ＺＮＡ Ｃ１２Ｑ 1/37 ＺＮＡ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/483 Ｃ 33/483 33/50 Ｚ 33/50 33/68 33/68 Ｃ１２Ｎ 9/48 // Ｃ１２Ｎ 9/48 15/00 Ａ (72)発明者 ヘレン・フランセス・ボイド イギリス国ケント シーティー13・９エヌ ジェイ，サンドウィッチ，ラムズゲート・ ロード，ファイザー・グローバル・リサー チ・アンド・ディベロプメント (72)発明者 レオナード・カブリエル・コンティロ アメリカ合衆国コネチカット州06340，グ ロトン，イースタン・ポイント・ロード, ファイザー・グローバル・リサーチ・アン ド・ディベロプメント (72)発明者 デーヴィッド・ハーラン・シングルトン アメリカ合衆国コネチカット州06340，グ ロトン，イースタン・ポイント・ロード, ファイザー・グローバル・リサーチ・アン ド・ディベロプメント (72)発明者 ピーター・ステイシー イギリス国ケント シーティー13・９エヌ ジェイ，サンドウィッチ，ラムズゲート・ ロード，ファイザー・グローバル・リサー チ・アンド・ディベロプメント Ｆターム(参考） 2G045 AA29 AA40 CB17 DA12 DA13 DA20 DA36 FB01 FB06 FB07 FB08 FB12 4B024 AA11 BA14 CA04 CA12 DA02 EA04 GA11 HA03 4B050 CC01 CC03 DD11 LL03 4B063 QA01 QA18 QQ20 QR16 QR41 QR48 QR58 QR66 QR67 QS12 QS36 QX02 4C084 AA17 DC02 MA02 MA52 MA55 MA66 NA14 ZA811 ZC201 ZC781

Claims (14)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】配列番号２を含むポリペプチド、配列番号
    １または配列番号５のポリヌクレオチド配列によりコー
    ドされるアミノ酸配列、またはＮＣＩＭＢ ４１１１０
    のｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドと、作用物
    質とを接触させること、そして結合および／または調整
    が起るかどうかを決定することを含む、ＳＥＰポリペプ
    チドに結合する、および／または、これらを調整する、
    作用物質を同定するための方法。
  2. 【請求項２】前記ＳＥＰポリペプチドを、作用物質の存
    在下にＳＥＰの基質となるペプチドに接触させ、ここで
    該基質ペプチドはＳＥＰポリペプチドによる切断に応答
    して検出可能なシグナルを提供できるものであり、ここ
    で該作用物質の存在下および非存在下での検出可能シグ
    ナルに差がある場合、該作用物質は該ＳＥＰポリペプチ
    ドのモジュレーターであると同定される事を含む、請求
    項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】方法が、前記検出可能シグナルを減少さ
    せ、そしてＳＥＰポリペプチド阻害剤である作用物質を
    同定する、請求項２に記載の方法。
  4. 【請求項４】前記基質ペプチドが少なくとも一つの蛍光
    供与体色素で標識され、そして前記シグナルが蛍光共鳴
    エネルギー伝達（ＦＲＥＴ）アッセイにより検出され
    る、請求項２または請求項３に記載の方法。
  5. 【請求項５】前記標識基質ペプチドが、ローダミングリ
    ーン（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ ｇｒｅｅｎ）−Ｇｌｙ−Ｇ
    ｌｙ−ｄＰｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｃ
    ｙｓ（ＱＳＹTM７）−βＡｌａ−ＮＨ2、５−（および
    ６）テトラメチルローダミンＧｌｙ−Ｇｌｙ−ｄＰｈｅ
    −Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ（ＱＳＹ TM
    ７）−βＡｌａ−ＮＨ2または５−カルボキシフルオレ
    セイン−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ｄＰｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−
    Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ（５−（および６）テトラメチ
    ルローダミン）−βＡｌａ−ＮＨ2である、請求項４に
    記載の方法。
  6. 【請求項６】前記ＳＥＰポリペプチドと前記作用物質と
    の結合が検出される、請求項１から５のいずれか一つに
    記載の方法。
  7. 【請求項７】方法が競合結合アッセイである、請求項６
    に記載の方法。
  8. 【請求項８】作用物質の存在下に、あるペプチダーゼ
    と、ローダミングリーンＧｌｙ−Ｇｌｙ−ｄＰｈｅ−Ｌ
    ｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ（ＱＳＹTM７）
    −βＡｌａ−ＮＨ2、５−（および６）テトラメチルロ
    ーダミンＧｌｙ−Ｇｌｙ−ｄＰｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−
    Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ（ＱＳＹTM７）−βＡｌａ−Ｎ
    Ｈ2および５−カルボキシフルオレセイン−Ｇｌｙ−Ｇ
    ｌｙ−ｄＰｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｃ
    ｙｓ（５−（および６）テトラメチルローダミン）−β
    Ａｌａ−ＮＨ2より成る群より選択されたペプチダーゼ
    基質ペプチドとを接触させ、ここで該基質ペプチドが、
    該ペプチダーゼによる切断に応答して、蛍光共鳴エネル
    ギー伝達（ＦＲＥＴ）アッセイにより検出されるような
    検出可能なシグナルを提供でき、またここで該作用物質
    の存在下で、該作用物質の非存在下と比較して検出可能
    シグナルに減少がある場合、該作用物質が該ペプチダー
    ゼの阻害剤として同定される、該ペプチダーゼを阻害ま
    たは選択的に阻害する作用物質を同定するための方法。
  9. 【請求項９】ペプチダーゼがエキソペプチダーゼまたは
    エンドペプチダーゼである、請求項８に記載の方法。
  10. 【請求項１０】ペプチダーゼがオキシトシナーゼ、中性
    エンドペプチダーゼ（ＮＥＰ）、または非ヒトＳＥＰで
    ある、請求項８に記載の方法。
  11. 【請求項１１】作用物質がホスホラミドン（ｐｈｏｓｐ
    ｈｏｒａｍｉｄｏｎ）、チオルファン（ｔｈｉｏｒｐｈ
    ａｎ）、ファシドトリラット（ｆａｓｉｄｏｔｒｉｌａ
    ｔ）、オマパトリラット（ｏｍａｐａｔｒｉｌａｔ）、
    またはＦＲ９０１５３３ではない、請求項１から１０の
    いずれか一つに記載の方法により同定された作用物質。
  12. 【請求項１２】作用物質が、中性エンドペプチダーゼ
    ＮＥＰ ＥＣ３．４．２４．１１およびアンギオテンシ
    ン変換酵素（ＡＣＥ）よりも、ＳＥＰについて３０倍よ
    り大きい選択性をもつ、請求項１から７のいずれか一つ
    に記載の方法により同定された作用物質。
  13. 【請求項１３】作用物質が、中性エンドペプチダーゼ
    ＮＥＰ ＥＣ３．４．２４．１１およびアンギオテンシ
    ン変換酵素（ＡＣＥ）よりも、ＳＥＰについて５０倍よ
    り大きい選択性をもつ、請求項１２に記載の作用物質。
  14. 【請求項１４】作用物質が、エンドセリン変換酵素（Ｅ
    ＣＥ）よりも、ＳＥＰについて１００倍より大きい選択
    性をもつ、請求項１から７のいずれか一つに記載のの方
    法により同定された作用物質。
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