JP2003125779A - 麹菌のフェリクローム生合成に関与するクラスター遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【解決手段】 麹菌のフェリクローム生合成クラスター
を形成する、アセチラーゼ、ＡＢＣトランスポーター、
プロテインキナーゼＡ、アンキリンリピート含有ＤＨＨ
Ｃジンクフィンガー蛋白質が明らかにされ、これらをコ
ードする遺伝子、すなわち、ａｓｂ３、ａｓｂＴ、ａｎ
ｋＯ、ａｓｂＲのクローニングが行われ、その塩基配列
も決定された。 【効果】 本発明によりクローニングした上記遺伝子断
片は、麹菌のフェリクローム生合成に関与するａｓｂ
１、ａｓｂ２と染色体上でクラスターを形成することが
確認された。これらの遺伝子を用いて、麹菌のフェリク
ロームを鉄制限下で高生産あるいは非生産することがで
きる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、麹菌のフェリクロ
ーム生合成クラスターを形成するアセチラーゼ、ＡＢＣ
トランスポーター、プロテインキナーゼＡ、アンキリン
リピート含有ＤＨＨＣジンクフィンガー蛋白質、該蛋白
質をコードする遺伝子、該遺伝子を含有する組み換えベ
クター、該組み換えベクターを含有する形質転換体、該
遺伝子を含有する組み換え麹菌、該形質転換体を用いる
アセチラーゼ、ＡＢＣトランスポーター、プロテインキ
ナーゼＡ、またはアンキリンリピート含有ＤＨＨＣジン
クフィンガー蛋白質を生産させることによってフェリク
ローム高生産麹菌を育種する方法、蛋白質の発現を麹菌
菌体内で抑制させフェリクローム非生産麹菌を育種する
方法、及びフェリクローム生合成遺伝子クラスターを麹
菌以外の生物に導入して生産させる方法に関するもので
ある。

【０００２】

【従来の技術】鉄イオンは一部の乳酸菌を除く、ほとん
どすべての生物にとって必須の原子である。鉄は、生体
内ではＦｅ（II）やＦｅ（III）の形態で利用され、主
に酸化還元に関与する酵素群の補欠因子として機能す
る。しかしながら、一般的に鉄は自然界において鉄鉱石
として存在し、可溶化されたイオン状態としてはほとん
ど存在しない。さらに鉄鉱石から微生物の働きにより可
溶化された鉄イオンも、すぐに不溶性の酸化物や水酸化
物となるため、生物が利用できる鉄イオンはきわめて微
量である。細菌や放線菌、真核微生物はこのような微量
な鉄イオンを効率的に獲得するために、シデロフォアと
呼ばれる分子量１５００以下の低分子の鉄イオンキレー
ト物質を生産する。このシデロフォアに鉄イオンをキレ
ートすることにより、貴重な鉄イオンの不溶化を防ぎ、
鉄イオンを優先的に利用することを図っている。また鉄
イオンは生物にとって必須のイオンであるが、過剰に存
在すると遊離のラジカルの発生を促し、逆に生体に危害
を加える。シデロフォアは鉄イオンの獲得と同時に、こ
のような鉄イオンの無害化にも大きく寄与している。シ
デロフォアは非キレート状態では無色であるが、鉄イオ
ンをキレートすると、赤色を示し、可視光の吸収を示す
ことが知られている。

【０００３】現在までに様々なシデロフォアが同定され
ているが、糸状菌が生産するシデロフォアはhydroxamat
es familyと呼ばれ、一般に構成アミノ酸誘導体として
Ｎ−ヒドロキシオルニチンを含む。研究用モデル糸状
菌、工業用微生物、病原性糸状菌として幅広く研究が進
められているアスペルギルス属糸状菌はhydroxamates f
amilyの中でもフェリクローム類とフザリニン類と呼ば
れるシデロフォアを生産する。前者は、Ｎ−ヒドロキシ
オルニチンのトリペプチドにグリシン、セリン、アラニ
ンが環状ペプチドを形成している。一方、後者では一部
のＮ−ヒドロキシオルニチンのＮ位が無水メバロン酸に
よってアシル化されている特徴を有する。糸状菌はこの
ような多種多様なシデロフォアを生産することにより、
鉄イオンを優先的に獲得し、自然界での生存競争に活用
しているものと考えられる。

【０００４】一方、清酒醸造では、アスペルギルス・オ
リゼを蒸米上に生育させて「麹」を作成し、清酒醸造の
原料として利用している。この麹造りにおいてアスペル
ギルス・オリゼが大量のフェリクローム類（中でも主成
分はフェリクリシン）を生産し、これが酒造用水の鉄イ
オンをキレートし、清酒が着色することが知られてい
る。従って、清酒醸造においては、シデロフォアである
フェリクローム類が、品質劣化の原因であり、できるだ
けフェリクローム類を生産しない菌株の育種が進められ
てきた。

【０００５】このように、麹菌（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）は
フェリクローム類を大量に生産することが古くから知ら
れているが、その生合成系に関しては、ほとんど明らか
になっていない。現在でも、フェリクローム低生産菌の
育種は主に、スクリーニング法や変異法に頼らざるを得
ない。また、近年このシデロフォアの鉄キレート力は、
貧血症の医薬としても利用されるようになっている。麹
菌が産生するフェリクロームも鉄イオン結合能力につい
ては非常に優れているが、その生産性の向上が困難で工
業レベルでの生産の対象とはなっていない。

【０００６】もし、フェリクローム類の生合成遺伝子が
同定されれば、麹菌によるフェリクローム類の生産を自
由に調節できる可能性がある。すなわち、清酒醸造にお
いては、フェリクローム生合成に関与する遺伝子の発現
が抑制できれば、全くフェリクロームを生産しない株が
育種できる。また、医薬品製造においては、フェリクロ
ーム生合成に関与する遺伝子の発現をより活発に誘導さ
せることにより、大量のフェリクローム生産が可能とな
る。さらに、麹菌が生産するフェリクロームは清酒や酒
粕として長年摂取されており、極めて安全性の高い物質
である。麹菌によりフェリクロームが大量に生産できれ
ば、医薬品から食品まで幅広い応用が可能となる。この
ように、麹菌のフェリクローム生産についてはさまざま
な分野に応用が期待されるが、その生合成遺伝子が未解
明なため、いまだに効率的な活用がなされていない。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、麹菌Asperg
illus oryzaeのフェリクローム生産を自由に制御するた
めに、麹菌のフェリクローム生合成に関与するクラスタ
ー遺伝子群を提供することにある。本発明の他の目的は
本遺伝子群を含有する組み換えベクターとこの組み換え
ベクターを含有する形質転換体を提供することにある。

【０００８】麹菌におけるフェリクロームの生合成経路
については、Ustilago maydisやAureobasidium pullula
nsなどの他の糸状菌におけるフェリクローム類の合成経
路の研究をもとにして、我々は、既にその生合成の第一
段階を担うオルニチンＮ５−オキシゲナーゼをコードす
る遺伝子ａｓｂ１（特願２００１−１７６２６４）とフ
ェリクローム生合成におけるペプチド結合の合成に関与
するペプチドシンテターゼをコードするａｓｂ２（特願
２００１−３２４１１２）を同定するのに成功してい
る。

【０００９】しかし、糸状菌のフェリクローム合成で
は、ａｓｂ１、ａｓｂ２遺伝子産物によるフェリクロー
ム合成以外に、アセチラーゼによるヒドロキシオルニチ
ンのＮ位のアシル化やフェリクローム特異的トランスポ
ーターによる細胞外への排出などが必須となる。そこで
真のフェリクローム高生産を実現するためにはａｓｂ
１、ａｓｂ２遺伝子とクラスターを形成する上記アセチ
ラーゼやトランスポーターの遺伝子が取得できて初めて
実現する。従って、麹菌においてもこれらのクラスター
遺伝子を抑制すればフェリクロームの生産は抑制され、
本遺伝子の発現を上昇させれば大量のフェリクローム生
産が期待できる。すなわち本発明の目的の一つは上記形
質転換体を用いるフェリクローム生合成クラスター遺伝
子群の麹菌体内での発現を抑制することによって、米麹
を用いた固体培養でフェリクロームを生産しない麹菌を
提供することにある。その結果、該麹菌を清酒、味噌、
醤油、みりんなどの我が国独自の醸造産業へ利用するこ
とが可能となる。

【００１０】本発明の他の目的は、フェリクローム生合
成クラスター遺伝子群の発現を遺伝子工学的手法を用い
て高めることによって、あらゆる培養条件下でフェリク
ロームを高生産する麹菌を提供することにある。またこ
うして生産されたフェリクロームを鉄キレート剤として
の試薬、ならびに貧血の改善効果が期待できる機能性食
品への添加に提供するのが可能となる。またさらなる目
的はこれらの麹菌のフェリクローム生合成に関わる遺伝
子クラスターを麹菌以外の生物に導入してフェリクロー
ム類を生産させることにある。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明は、上記目的を達
成するためになされたものであって、先ずはじめに麹菌
（アスペルギルス・オリゼー：Aspergillus oryzae）に
ついて検討を行った。

【００１２】麹菌Ａ．ｏｒｙｚａｅは清酒、醤油、味噌
などの我が国の伝統的醗酵産業で使用されてきた糸状菌
である。本菌株は、上記醗酵産業で有用な蛋白質や低分
子を非常に大量に生産することが知られている。本菌株
が持つ高い蛋白質生産能と醸造微生物としての安全性か
ら、異種蛋白質生産の宿主として注目されている[Biote
chnology, 6, 1419 (1988)]（特開昭６２−２７２９８
８）。発明者らの研究から、Ａ．ｏｒｙｚａｅを用いた
異種蛋白質生産においては、アスペルギルス属などの近
種の遺伝子であれば、その生産能はさらに増大すること
が認められた。特に、Ａ．ｏｒｙｚａｅの遺伝子を、
Ａ．ｏｒｙｚａｅの高発現プロモーター制御下で発現さ
せた場合、非常に大量の蛋白質が生産されることを見出
した（特開平１１−１５４２７１，特願２０００−３６
７５４）。

【００１３】また、Ａ．ｏｒｙｚａｅは、上記のような
蛋白質、酵素のみならず、産業的にも非常に貴重な低分
子成分の生産も報告されている。中でも麹菌が固体培養
で生産するフェリクロームは、近年貧血などの鉄欠乏症
用の機能性成分としても非常に注目されている物質であ
る。

【００１４】この麹菌のフェリクロームを医薬・食品に
利用するためには、生産性をさらに向上させる必要があ
るが、変異法などの既存の菌株育種方法では、工業生産
レベルにまで生産性が向上した変異株の取得はできなか
った。そこで、フェリクローム生合成に関与する遺伝子
を単離し、これらの遺伝子の発現能を強化することによ
りフェリクロームの大量生産が可能であると考えた。麹
菌におけるフェリクロームの生合成経路については、Us
tilago maydisやAureobasidium pullulansなどの他の糸
状菌におけるフェリクローム類の合成経路の研究をもと
にして、我々は既にその生合成の第一段階を担うオルニ
チンＮ５−オキシゲナーゼをコードする遺伝子ａｓｂ１
（特願２００１−１７６２６４）とフェリクローム生合
成におけるペプチド結合の合成に関与するペプチドシン
テターゼをコードするａｓｂ２（特願２００１−３２４
１１２）を同定している。

【００１５】しかし、糸状菌のフェリクローム合成で
は、ａｓｂ１、ａｓｂ２遺伝子産物によるフェリクロー
ム合成以外に、アセチラーゼによるヒドロキシオルニチ
ン残基のＮ位のアシル化やフェリクローム特異的トラン
スポーターによる細胞外への排出などが必須となる。そ
こで真のフェリクローム高生産を実現するためにはａｓ
ｂ１、ａｓｂ２遺伝子とクラスターを形成する上記アセ
チラーゼやトランスポーターの遺伝子が取得できて初め
て実現する。従って、麹菌においてもこれらのクラスタ
ー遺伝子が収得できれば、フェリクロームの生産を自由
に制御できる遺伝子組み換え麹菌を育種でき、フェリク
ロームの工業生産が可能になると考えた。以下は麹菌が
生産するフェリクローム類の中でも、最も含有量の多い
フェリクリシンの生産を中心に記述するが、本発明は全
てのフェリクローム類に応用が可能な技術であり、フェ
リクリシンだけに限定するものではない。

【００１６】我々は、清酒醸造において清酒の着色を起
こす鉄イオンキレート低分子フェリクリシンを貧血改善
用の機能性成分などとして大量生産させるために、フェ
リクリシン生合成クラスターの遺伝子クローニングを行
い、フェリクリシンの工業生産に適した遺伝子組み換え
麹菌を育種することを試みた。

【００１７】麹菌におけるフェリクロームの生合成経路
については、Ustilago maydisやAureobasidium pullula
nsなどの他の糸状菌におけるフェリクローム類の合成経
路の研究をもとにして、我々は既にその生合成の第一段
階を担うオルニチンＮ５−オキシゲナーゼをコードする
ａｓｂ１（特願２００１−８３６４０）とフェリクロー
ム生合成におけるペプチド結合の合成に関与するペプチ
ドシンテターゼをコードするａｓｂ２（特願２００１−
３２４１１２）を同定している。しかし、糸状菌のフェ
リクローム合成では、ａｓｂ１、ａｓｂ２遺伝子産物に
よるフェリクローム合成以外に、アセチラーゼによるヒ
ドロキシオルニチン残基のＮ位のアシル化やフェリクロ
ーム特異的トランスポーターによる細胞外への排出など
が必須となる。そこで真のフェリクローム高生産を実現
するためにはａｓｂ１、ａｓｂ２遺伝子と上記アセチラ
ーゼやトランスポーターの遺伝子が取得できて初めて実
現する。

【００１８】そこで本発明者らは、Ustilago maydisやA
ureobasidium pullulansのフェリクローム生合成遺伝子
に着目し、広く検討した結果、麹菌においても、フェリ
クローム生合成は、アフラトキシン生合成遺伝子群やア
ミラーゼ遺伝子群と同様に、染色体上でクラスターを形
成する可能性について、はじめて、その着想を得た。

【００１９】上記のように本発明者らは、麹菌における
フェリクローム生合成遺伝子のクラスター形成の可能性
という新規着想に基づき更に検討の結果、本発明者らが
麹菌から新たに単離するのに成功した新規遺伝子ａｓｂ
１、ａｓｂ２においても、フェリクローム生合成遺伝子
クラスター形成の可能性を推論し、遂にそれをはじめて
確認するに至った。

【００２０】すなわち、ａｓｂ１、ａｓｂ２をそれぞれ
プローブとしてラムダＥＭＢＬ３ファージを用いた麹菌
ゲノム遺伝子ライブラリーのスクリーニングを行った。
得られた両陽性ファージクローンにおいてａｓｂ１、ａ
ｓｂ２の周辺領域の網羅的ＤＮＡシーケンスを行った。
その結果、両陽性ファージクローンはA. nidulansのプ
ロテインキナーゼＡをコードする遺伝子ａｎｋＡと相同
な遺伝子配列上の約５００ｂｐでオーバーラップ領域を
含むことが明らかとなった。これはａｓｂ１とａｓｂ２
の両者が麹菌染色体上でクラスターを形成していること
を意味している。両陽性ファージクローンの全塩基配列
を決定した結果、ａｓｂ１、ａｓｂ２周辺には少なくと
もアセチラーゼ、ＡＢＣトランスポーター、プロテイン
キナーゼＡ、そしてアンキリンリピート含有ＤＨＨＣジ
ンクフィンガー蛋白質のコーディング領域の存在が明ら
かとなった。アセチラーゼ遺伝子は４６２アミノ酸残基
からなる蛋白質をコードしており、１つのイントロンを
含んでおり、ａｓｂ３と命名した。ＡＢＣトランスポー
ター遺伝子は１３２６アミノ酸残基からなる蛋白質をコ
ードしており、イントロンを含んでおらず、ａｓｂＴと
命名した。プロテインキナーゼＡ遺伝子は１０６５アミ
ノ酸残基からなる蛋白質をコードしており、１つのイン
トロンを含んでおり、ａｎｋＯと命名した。アンキリン
リピート含有ＤＨＨＣジンクフィンガー蛋白質遺伝子は
７３６アミノ酸残基からなる蛋白質をコードしており、
５つのイントロンを含んでおり、ａｓｂＲと命名した。

【００２１】単離した遺伝子は単独であるいはｍｅｌＯ
やｇｌａＢ遺伝子プロモーター（特願平１１−１５４２
７１、特開平１１−２４３９６５）のような高発現プロ
モーターと共に、Ａ．ｏｒｙｚａｅにて発現させて、フ
ェリクリシンの生産を制御しうるものである。遺伝子導
入方法は、例えば宿主としてｎｉａＤ変異株を用いる公
知方法により、目的遺伝子とマーカー遺伝子であるｎｉ
ａＤ遺伝子を同時に導入する。（Ｅ．Ｓ．Ｕｎｋｌｅ
ら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２１８，ｐ．９９
−１０４、１９８９）この遺伝子導入の際に、ベクター
配列などの異種遺伝子を排除することにより、異種遺伝
子を全く含まないセルフクローニング株の形質転換体を
得ることができる。ｎｉａＤ変異株（硝酸を資化できな
い麹菌変異株：Ｎｉｔｒａｔｅ Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ欠
損株）としては、例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏ
ｒｙｚａｅ １０１３−ｎｉａＤ（ＦＥＲＭ Ｐ−１７
７０７）を使用することができる。以下に本発明の詳細
について述べる。

【００２２】上記のように、本発明者らは、麹菌から新
たに単離した新規フェリクローム生合成遺伝子ａｓｂ
１、ａｓｂ２についてのクラスター形成の可能性を新た
に推論した。そこで、ａｓｂ１、ａｓｂ２それぞれをプ
ローブとしてフルオレッセンラベル化後、ラムダＥＭＢ
Ｌ３ファージを用いた麹菌ゲノム遺伝子ライブラリーの
スクリーニングを行った。

【００２３】本発明者らが、新たにクローニングした遺
伝子断片ａｓｂ１には、フェリクローム又はそのデフェ
リ体生合成の第１段階を触媒するオルニチンＮ５−オキ
シゲナーゼがコードされており、また、この遺伝子を含
有する形質転換体エシェリヒア・コリ（Escherichia co
li）ａｓｂ１は、ＦＥＲＭ Ｐ−１８３６０として特許
生物寄託センターに寄託されているので、ａｓｂ１遺伝
子を保持するプラスミド（ｐＥＡＳ１）を抽出すること
により適宜取得することができる（特願２００１−１７
６２６４）。ａｓｂ１遺伝子の塩基配列を配列番号１３
（図３４、３５）に示す。

【００２４】また、本発明者らが、新たにクローニング
した遺伝子断片ａｓｂ２には、麹菌のフェリクローム生
合成に関与するペプチドシンテターゼがコードされてお
り、また、この遺伝子を含有する形質転換体エシェリヒ
ア・コリ（Escherichia coli）ＡＳＢ２はＦＥＲＭ Ｐ
−１８５４１として特許生物寄託センターに寄託されて
いるので、ａｓｂ２遺伝子を保持するプラスミド（ｐＥ
ＡＳ２）を抽出することにより適宜取得することができ
る（特願２００１−３２４１１２）。ａｓｂ２遺伝子の
塩基配列を配列番号１４（図３６〜図４０）に示す。

【００２５】ａｓｂ１、ａｓｂ２それぞれをプローブと
してフルオレッセンラベル化した後、アスペルギルス・
オリゼー Ｏ−１０１３株（ＦＥＲＭ Ｐ−１６５２
８）のラムダＥＭＢＬ３ファージを用いた麹菌ゲノム遺
伝子ライブラリーをスクリーニングすることにより、目
的とする遺伝子を取得することができる。

【００２６】すなわち、プローブとして用いるａｓｂ
１、ａｓｂ２については、その塩基配列、及びそれがコ
ードする蛋白質のアミノ酸配列が本発明者らによって明
らかにされているだけでなく、それらを含有する形質転
換体は、いずれも、独立行政法人 産業技術総合研究所
特許生物寄託センターに寄託されており、また、Ａ．
ｏｒｙｚａｅ Ｏ−１０１３も同じく寄託されているの
で、本明細書の記載にしたがって各操作を行っていけ
ば、当業者は本発明を容易に実施することができる。

【００２７】上記のライブラリーのスクリーニングの結
果、得られた両陽性ファージクローンにおいて、ａｓｂ
１、ａｓｂ２の周辺領域の網羅的ＤＮＡシーケンスを行
った。シーケンスの手法としては、ファージクローンの
アーム領域のプライマーを用いてＬＡ−ＰＣＲにより約
２０ｋｂのインサートＤＮＡを増幅した。このインサー
トＤＮＡをＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄIII、Ｐ
ｓｔＩで処理後に、ｐＵＣ１１８へサブクローニングし
た。任意のインサートサイズを含む各２０クローンをＭ
１３フォワードプライマーとＭ１３リバースプライマー
を用いてＤＮＡシーケンスした。ギャップ部分は、シー
ケンスプライマーを合成してファージＤＮＡを鋳型にＤ
ＮＡシーケンスを行った。その結果、両陽性ファージク
ローンはA. nidulansのプロテインキナーゼＡをコード
する遺伝子ａｎｋＡと相同な遺伝子配列上の約５００ｂ
ｐでオーバーラップ領域を含むことが明らかとなった。
これはａｓｂ１とａｓｂ２の両者が麹菌染色体上でクラ
スターを形成していることを意味するものである。

【００２８】両陽性ファージクローンの全塩基配列を決
定した結果、ａｓｂ１、ａｓｂ２周辺には少なくともア
セチラーゼ、ＡＢＣトランスポーター、プロテインキナ
ーゼＡ、そしてアンキリンリピート含有ＤＨＨＣジンク
フィンガー蛋白質のコーディング領域の存在が明らかと
なった。

【００２９】アセチラーゼ遺伝子は、４６２アミノ酸残
基からなる蛋白質（配列番号１）をコードしており、１
つのイントロンを含んでおり、ａｓｂ３と命名した。ａ
ｓｂ３のプロモーター領域は配列番号２の１から２３５
ｂｐ、コーディング領域は配列番号２の２３６から１６
９３ｂｐ、ターミネーター領域は配列番号２の１６９４
から２２６４ｂｐまでである。イントロンは、１つ含ま
れており、配列番号２の１２２０から１２８８ｂｐまで
である。

【００３０】ＡＢＣトランスポーター遺伝子は、１３２
６アミノ酸残基からなる蛋白質（配列番号３）をコード
しており、イントロンを含んでおらず、ａｓｂＴと命名
した。ａｓｂＴのプロモーター領域は配列番号４の１か
ら７０８ｂｐ、コーディング領域は配列番号４の７０９
から４６８９ｂｐ、ターミネーター領域は配列番号４の
４６９０から５０５６ｂｐまでである。イントロンは、
上述のように含まれていない。

【００３１】プロテインキナーゼＡ遺伝子は、１０６５
アミノ酸残基からなる蛋白質（配列番号５）をコードし
ており、１つのイントロンを含んでおり、ａｎｋＯと命
名した。ａｎｋＯのプロモーター領域は配列番号６の１
から５６７ｂｐ、コーディング領域は配列番号６の５６
８から３８２０ｂｐ、ターミネーター領域は配列番号６
の３８２１から４１２４ｂｐまでである。イントロン
は、１つ含まれており、配列番号６の３０３１から３０
８５ｂｐまでである。

【００３２】アンキリンリピート含有ＤＨＨＣジンクフ
ィンガー蛋白質遺伝子は、７３６アミノ酸残基からなる
蛋白質（配列番号７）をコードしており、５つのイント
ロンを含んでおり、ａｓｂＲと命名した。ａｓｂＲのプ
ロモーター領域は配列番号８の１から２８４ｂｐ、コー
ディング領域は配列番号８の２８５から２８０８ｂｐ、
ターミネーター領域は配列番号８の２８０９から３０６
８ｂｐまでである。イントロンは、５つ含まれており、
配列番号８のそれぞれ５９１から６７６ｂｐ、１４７８
から１５３０ｂｐ、１６０４から１６７３ｂｐ、１９３
９から１９８８ｂｐ、２１０２から２１５５ｂｐまでで
ある。

【００３３】上記のクローニングしたクラスター遺伝子
の機能を確認するためにＲＴ−ＰＣＲを行った。以前に
取得した麹菌のフェリクローム生合成遺伝子であるａｓ
ｂ１、ａｓｂ２は、鉄制限培養条件下でのみ誘導的に発
現が認められたことから今回得られたクラスター遺伝子
の発現もａｓｂ１、ａｓｂ２と同様の発現挙動を示すこ
とが予測された。そこで鉄制限培養した麹菌から全ＲＮ
Ａ、ｍＲＮＡを取得し、これに対してａｓｂ３、ａｓｂ
Ｔ、ａｎｋＯ、ａｓｂＲのＲＴ−ＰＣＲを行った。その
結果、ａｓｂ３、ａｓｂＴ、ａｓｂＲはａｓｂ１、ａｓ
ｂ２と同様に鉄制限培養条件下でのみ誘導的に発現する
ことが明らかとなった。一方、ａｎｋＯのみは鉄制限、
鉄存在下にかかわらず恒常的な発現が認められた。

【００３４】また、クローニングしたアセチラーゼ遺伝
子ａｓｂ３の機能を確認するために大腸菌での発現を試
みた。鉄制限培養した麹菌より抽出したＲＮＡをもとに
えられたａｓｂ３ ｃＤＮＡをｐＵＣ１１８のｌａｃＺ
プロモーター下流のＰｓｔＩに連結し、大腸菌ＪＭ１０
９へ形質転換した。形質転換体をＩＰＴＧ誘導培養した
結果、菌体内にオルニチンをアセチル化するオルニチン
アセチラーゼ活性が存在することをＨＰＬＣにより確認
できた。本形質転換体をエシェリヒア・コリ（Escheric
hia coli）ＡＣＥＴＹ１と命名し、これを独立行政法人
産業技術総合研究所特許生物寄託センターへＦＥＲＭ
Ｐ−１８５４２として寄託した。本菌株を培養すること
によりフェリクローム生合成のオルニチンをアセチル化
するアセチラーゼ蛋白質を得ることができる。

【００３５】以上の結果より、クローニングした遺伝子
断片ａｓｂ３、ａｓｂＴ、ａｎｋＯ、ａｓｂＲは、麹菌
のフェリクローム生合成に関与するａｓｂ１、ａｓｂ２
と染色体上で約３７ｋｂのクラスターを形成しているこ
とが判明した。またａｓｂ３、ａｓｂＴ、ａｓｂＲは、
ａｓｂ１、ａｓｂ２と同様に鉄制限培養条件下でのみ誘
導的に発現することから、麹菌のフェリクローム生合成
に関する遺伝子群であることが明らかとなった。またこ
れらのクラスター遺伝子を用いて、麹菌のフェリクロー
ム生合成を高生産あるいは非生産させたり、また他の生
物にクラスター遺伝子を導入してフェリクローム類を高
生産させることが可能であり、用途に応じたフェリクロ
ーム生産の改変が分子レベルで可能となり、様々な産業
分野に応用が可能であることも確認した。

【００３６】

【実施例１】ａｓｂ１、ａｓｂ２遺伝子のクローニング
と周辺領域の塩基配列の決定 現在までに麹菌から単離したフェリクローム生合成遺伝
子ａｓｂ１（その塩基配列を配列番号１３（図３４、３
５）に示した：特願２００１−１７６２６４）、及びａ
ｓｂ２（その塩基配列を配列番号１４（図３６〜４０）
に示した：特願２００１−３２４１１２）それぞれをプ
ローブとして、アマシャムファルマシア社製のＧｅｎｅ
Ｉｍａｇｅ ラベリングキットを用いて蛍光標識化し
た後、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ Ｏ−１
０１３（ＦＥＲＭ Ｐ−１６５２８）のラムダＥＭＢＬ
３ファージを用いた麹菌ゲノム遺伝子ライブラリー約５
０００個のスクリーニングを行った。得られた１つずつ
の両陽性ファージクローンにおいて、ａｓｂ１、ａｓｂ
２の周辺領域の網羅的ＤＮＡシーケンスを行った。シー
ケンスの手法としてはファージクローンのアーム領域の
プライマーＰ１：配列番号９（図３０）とＰ２：配列番
号１０（図３１）を用いて、宝酒造ＬＡ‐Ｔａｑにより
約２０ｋｂのインサートＤＮＡを増幅した。

【００３７】ＰＣＲ条件は、以下に示した。 ・９６℃（５分），１サイクル ・９６℃（２０秒），５０℃（３０秒），７２℃（２０
分），３０サイクル ・７２℃（７分），１サイクル

【００３８】このインサートＤＮＡをＢａｍＨＩ、Ｅｃ
ｏＲＩ、ＨｉｎｄIIIあるいは、ＰｓｔＩで処理後に、
ｐＵＣ１１８へサブクローニングした。任意のインサー
トサイズを含む各２０クローンをＭ１３フォワードプラ
イマーＰ３：配列番号１１（図３２）とＭ１３リバース
プライマーＰ４：配列番号１２（図３３）を用いて、Ｄ
ＮＡシーケンスした。ギャップ部分は、シーケンスプラ
イマーを合成してファージＤＮＡを鋳型にＤＮＡシーケ
ンスを行った。

【００３９】その結果、両陽性ファージクローンは、A.
nidulansのプロテインキナーゼＡをコードする遺伝子
ａｎｋＡと相同な遺伝子配列上の約５００ｂｐでオーバ
ーラップ領域を含むことが明らかとなった。これはａｓ
ｂ１とａｓｂ２の両者が麹菌染色体上でクラスターを形
成していることを意味している。両陽性ファージクロー
ンの全塩基配列を決定した結果、ａｓｂ１、ａｓｂ２周
辺には少なくともアセチラーゼ、ＡＢＣトランスポータ
ー、プロテインキナーゼＡ、そしてアンキリンリピート
含有ＤＨＨＣジンクフィンガー蛋白質のコーディング領
域の存在が明らかとなった。

【００４０】アセチラーゼ遺伝子は、４６２アミノ酸残
基からなる蛋白質をコードしており、１つのイントロン
を含んでおり、ａｓｂ３と命名した。ａｓｂ３のプロモ
ーター領域は配列番号２の１から２３５ｂｐ、コーディ
ング領域は配列番号２の２３６から１６９３ｂｐ、ター
ミネーター領域は配列番号２の１６９４から２２６４ｂ
ｐまでである。イントロンは、１つ含まれており、配列
番号２の１２２０から１２８８ｂｐまでである。ａｓｂ
３遺伝子の塩基配列を配列番号２（図６、７）に示し、
それによってコードされるアミノ酸配列を配列番号１
（図４、５）に示す。

【００４１】ＡＢＣトランスポーター遺伝子は、１３２
６アミノ酸残基からなる蛋白質をコードしており、イン
トロンを含んでおらず、ａｓｂＴと命名した。ａｓｂＴ
のプロモーター領域は配列番号４の１から７０８ｂｐ、
コーディング領域は配列番号４の７０９から４６８９ｂ
ｐ、ターミネーター領域は配列番号４の４６９０から５
０５６ｂｐまでである。イントロンは、上述のように含
まれていない。ａｓｂＴ遺伝子の塩基配列を配列番号４
（図１４〜１６）に示し、それによってコードされるア
ミノ酸配列を配列番号３（図８〜１３）に示す。

【００４２】プロテインキナーゼＡ遺伝子は、１０６５
アミノ酸残基からなる蛋白質をコードしており、１つの
イントロンを含んでおり、ａｎｋＯと命名した。ａｎｋ
Ｏのプロモーター領域は配列番号６の１から５６７ｂ
ｐ、コーディング領域は配列番号６の５６８から３８２
０ｂｐ、ターミネーター領域は配列番号６の３８２１か
ら４１２４ｂｐまでである。イントロンは、１つ含まれ
ており、配列番号６の３０３１から３０８５ｂｐまでで
ある。ａｎｋＯ遺伝子の塩基配列を配列番号６（図２２
〜２４）に示し、それによってコードされるアミノ酸配
列を配列番号５（図１７〜２１）に示す。

【００４３】アンキリンリピート含有ＤＨＨＣジンクフ
ィンガー蛋白質遺伝子は、７３６アミノ酸残基からなる
蛋白質をコードしており、５つのイントロンを含んでお
り、ａｓｂＲと命名した。ａｓｂＲのプロモーター領域
は配列番号８の１から２８４ｂｐ、コーディング領域は
配列番号８の２８５から２８０８ｂｐ、ターミネーター
領域は配列番号８の２８０９から３０６８ｂｐまでであ
る。イントロンは、５つ含まれており、配列番号８のそ
れぞれ５９１から６７６ｂｐ、１４７８から１５３０ｂ
ｐ、１６０４から１６７３ｂｐ、１９３９から１９８８
ｂｐ、２１０２から２１５５ｂｐまでである。ａｓｂＲ
遺伝子の塩基配列を配列番号８（図２８、２９）に示
し、それによってコードされるアミノ酸配列を配列番号
７（図２５〜２７）に示す。

【００４４】またこれらの遺伝子クラスターの模式図を
図１（図面代用写真）に示した。得られたフェリクロー
ム遺伝子クラスターは、約３７ｋｂからなることが明ら
かとなった。

【００４５】

【実施例２】クラスター遺伝子のＲＴ−ＰＣＲによる発
現条件の解析 上記のクローニングしたクラスター遺伝子の機能を確認
するために、ＲＴ−ＰＣＲによる発現条件の解析を行っ
た。以前に取得した麹菌のフェリクローム生合成遺伝子
であるａｓｂ１、ａｓｂ２は、鉄制限培養条件下でのみ
誘導的に発現が認められたことから今回得られたクラス
ター遺伝子の発現もａｓｂ１、ａｓｂ２と同様の発現挙
動を示すことが予測された。そこで鉄制限培養した麹菌
から全ＲＮＡを取得し、これに対してａｓｂ３、ａｓｂ
Ｔ、ａｎｋＯ、ａｓｂＲのＲＴ−ＰＣＲを行った。

【００４６】具体的には、３０℃、４日間、鉄制限培地
（２％グルコース、０．６％アスパラギン、０．１％リ
ン酸１水素２カリウム、０．１％硫酸マグネシウム、
０．０４％塩化カルシウム、ｐＨ６．０）で液体培養し
た麹菌Ａ．ｏｒｙｚａｅからニッポンジーン社ＩＳＯＧ
ＥＮを利用して全ＲＮＡを抽出した。その全ＲＮＡから
宝酒造Oligotex-dT30<Super>mRNA purification kitを
用いてｍＲＮＡを抽出した。得られたｍＲＮＡ ０．５
μｇをもとに宝酒造のTakara RNA LA PCR kit (AMV) ve
r.1.1によりＲＴ−ＰＣＲを試みた。

【００４７】その反応条件は、以下にしたがった。 ＰＣＲ条件 ・３０℃（１０分），４２℃（６０分），９９℃（５
分），５℃（５分），９６℃（５分），１サイクル ・９６℃（２０秒），６０℃（３０秒），７２℃（５
分），３０サイクル ・７２℃（７分），１サイクル

【００４８】その結果、図２（図面代用写真）に示した
ように、ａｓｂ３、ａｓｂＴ、ａｓｂＲはａｓｂ１、ａ
ｓｂ２と同様に鉄制限培養条件下でのみ誘導的に発現す
ることが明らかとなった。一方、ａｎｋＯのみは鉄制
限、鉄存在下にかかわらず恒常的な発現が認められた。

【００４９】

【実施例３】アセチラーゼ遺伝子ａｓｂ３の大腸菌での
発現 クローニングしたアセチラーゼ遺伝子ａｓｂ３の機能を
確認するために、大腸菌での発現を試みた。上記のＲＴ
−ＰＣＲで得られたａｓｂ３ ｃＤＮＡをＴ４ＤＮＡリ
ガーゼ（宝酒造製）を用いて、プラスミドｐＵＣ１１８
のｌａｃＺプロモーター下流のＰｓｔＩサイトに連結
し、組み換えベクター（ｐＡＣＥ１）を得た。なお、そ
の制限酵素地図を図３に示す。このようにして得た組換
えベクターである該連結ＤＮＡを大腸菌ＪＭ１０９に形
質転換した。アンピシリン含有培地で培養し、アンピシ
リン耐性株を選択し、得られた形質転換体をエシェリヒ
ア・コリ（Escherichia coli）ＡＣＥＴＹ１と命名し、
独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託セン
ターにＦＥＲＭ Ｐ−１８５４２として寄託した。

【００５０】形質転換体をＬＢ培地にて３７℃でＯＤが
０．６になるまで培養後、１ｍＭＩＰＴＧを添加しさら
に３０℃にて３時間誘導培養した結果、菌体内にオルニ
チンをアセチル化するオルニチンアセチラーゼ活性が存
在することをＨＰＬＣにより確認できた。具体的には大
腸菌粗酵素抽出液、１０ｍＭアセチルグルタミン酸、１
０ｍＭオルニチンを１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ
５．０）存在下で３５℃にて１時間反応させた。得られ
た反応液を逆相Ｃ１８のＯＤＳカラムによって０−５０
％メタノールのグラジェントによって分離した。その結
果、SIGUMA社より購入した標準物質であるＮ−アセチル
オルニチンと同じ溶出位置にバンドを確認することがで
きた。よって本大腸菌を、上記のように、Ｅｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＡＣＥＴＹ１と命名し、独立行
政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、ＦＥ
ＲＭ Ｐ−１８５４２として寄託した。本菌株を培養す
ることによりフェリクローム生合成のオルニチンをアセ
チル化するアセチラーゼ蛋白質を得ることができる。

【００５１】

【発明の効果】本発明により、クローニングした遺伝子
断片ａｓｂ３、ａｓｂＴ、ａｎｋＯ、ａｓｂＲは、麹菌
のフェリクローム生合成に関与するａｓｂ１、ａｓｂ２
と染色体上でクラスターを形成していることが判明し
た。またａｓｂ３、ａｓｂＴ、ａｓｂＲは、ａｓｂ１、
ａｓｂ２と同様に鉄制限培養条件下でのみ誘導的に発現
することから麹菌のフェリクローム生合成に関する遺伝
子群であることが明らかとなった。またこれらのクラス
ター遺伝子を用いて、麹菌のフェリクローム生合成を高
生産あるいは非生産させたり、また他の生物にクラスタ
ー遺伝子を導入してフェリクローム類を高生産させるこ
とが可能であり、用途に応じたフェリクローム生産の改
変が分子レベルで可能となり、様々な産業分野に応用が
可能であることも確認した。

【００５２】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Gekkeikan Inc., Ltd.；National Institute of Advanced Industrial Science and Technology <120> Ferrichrome Biosynthetic Gene Cluster of koji mold <130> 6520 <141> 2001-10-22 <160> 14 <210> 1 <211> 462 <212> PRT <213> Aspergillus oryzae <400> 1 Met Ser Leu Ser His Ala Glu Ser Thr Pro Lys Ser Lys Pro Ser Tyr 5 10 15 Pro Trp Val Lys Leu Pro His Pro Tyr Leu Thr Ser Tyr Lys Ile His 20 25 30 Ile Val Ser Glu Ser Thr Ala Arg Val Leu Gln Leu Gln Leu His Asp 35 40 45 Ser Ser Leu Gly Lys Pro Leu Pro Glu Pro Leu His Asn Asn Ser Leu 50 55 60 Thr Tyr Thr Asp Val Ser Trp Asp Glu Ser Ala Lys Glu Ile Pro Asp 65 70 75 80 Asn Asp Asn Ser Pro Trp Ala Arg Thr Arg Arg Ala Pro Gly Ile Ser 85 90 95 Phe His Trp Thr Ser Pro Glu Ala Pro Thr Leu Gly Gln Ile Trp Asn 100 105 110 Val Ile His Ala Thr Phe Leu Thr His Pro Gln Tyr Glu Ile Leu Arg 115 120 125 Leu Asp Leu Ile Gly Ser Gly Ser Glu Ile Ile Arg Asp Glu Cys Ile 130 135 140 Arg Thr Gly Leu Thr Val Pro Phe Pro Ser Arg Arg Val Pro Phe Gly 145 150 155 160 Asn Glu Asn Lys Ser Ser Asp Val Asn Thr Leu Val Leu Leu Arg Ser 165 170 175 Ala Phe Trp Gln Gly Ala Ala Ser Pro Leu Gly Pro Arg Pro Ile Trp 180 185 190 Ala Val Asp Gln Asp Ile His Gly Leu Leu Arg Lys Ser Val Ser Gln 195 200 205 Tyr Pro Ala Leu Ala Gln Asn Tyr Glu Phe Ser Met Lys Phe Pro Glu 210 215 220 Glu Arg Ile Tyr Ala Arg His Pro Ile Arg Pro Thr Lys Pro Thr Pro 225 230 235 240 Gly Ser Leu Val Tyr Ser Arg Tyr Ile Pro His Leu Asp Lys His Phe 245 250 255 Ser Leu Met Ala Val Asp Trp Gln Asp Glu Glu His Leu Arg Leu Phe 260 265 270 Asn Lys Trp Gln Asn Asp Pro Arg Val Ala Lys Gly Trp Asn Glu Thr 275 280 285 Gly Thr Leu Asp Glu His Arg Glu Tyr Leu Arg Arg Leu His Glu Asp 290 295 300 Lys His Val Leu Cys Leu Phe Gly Arg Phe Asp Asp Phe Lys Phe Ala 305 310 315 320 Tyr Phe Glu Val Tyr Trp Ala Lys Glu Asp His Tyr Gly Ala His Tyr 325 330 335 Asp Ala Ala Asp Tyr Asp Arg Gly Arg His Ser Leu Val Gly Glu Ser 340 345 350 Ser Val Arg Gly Ala Tyr Arg Val Asn Ala Trp Trp Gly Ser Val Ile 355 360 365 His Tyr Ile Phe Leu Asp Glu Pro Arg Thr Gln Ala Val Val Gly Glu 370 375 380 Pro Lys Ala Asn Thr Thr Val Leu Ser Tyr Glu Asn Ala Gln Gly Leu 385 390 395 400 Thr Ile Gln Lys Tyr Val Asp Leu Gly His Lys Arg Ser Val His Val 405 410 415 His Cys Ser Ala Arg Ser Gly Ser Ser Cys Val Arg Phe Ser Gly Met 420 425 430 Asp Gly Arg Gly Arg Trp Arg Ala Arg Ile Val Trp Leu Ser Met Arg 435 440 445 Asn Ser Ser Phe Arg Leu Leu Met Glu Ala Asn Ser Leu Val 450 455 460 462 <210> 2 <211> 2264 <212> DNA <213> Aspergillus oryzae <400> 2 tctggccagc ttcacatgga ccaatgcaca ttctagccaa agttcggctt tcttgtgctc 60 ggctttccgt atagtgtaaa ctttctccac ttaaccgtcc ctgggcctcg gagttatctc 120 tctccatgtc ttatatatac caggcccaga tccttgcgct ttgagagcca ctgtcctcat 180 tacaaatgct caattgctca gatateaacc agggcacctt catattcacg caaaaatgag 240 cctgtcccac gcagagtcta cgcctaagag caaaccatca tatccttggg tgaaacttcc 300 tcatccatac ctcacdagct acaaaattca cattgtttct gaatctacag cacgagtgct 360 tcagctccaa ttacatgatt cttctctcgg aaagccactc ccagagccac tgcacaacaa 420 ttccctcacc tacacagacg tttcctggga cgaatccgcc aaggaaatcc ccgacaatga 480 caacagtccc tgggcgcgaa cccgcagagc gccaggaatc tcattccatt ggacaagccc 540 agaggcacca actctcggcc agatctggaa cgtcatccac gcaacctttc tgacacacac 600 acaatacgag atcctgcgcc tagatttgat cggatccggt agcgagatca ttcgcgatga 660 atgcattcgc accggcctga cagtcccctt cccctcccgc cgagtcccat tcggcaacga 720 aaacaaatcc tccgacgtca acaccctcgt ccttctccgc agcgccttct ggcaaggcgc 780 cgcctcacca ctcggtcccc gacccatctg ggccgttgac caggacattc atggcctcct 840 ccggaaatct gtaagccagt atccagccct cgcacagaat tatgagttct cgatgaagtt 900 ccccgaagag cgcatctacg ctcgtcaccc cattcgacct acaaagccca ccccgggatc 960 cttggtctac agtcgctaca tcccgcatct ggacaagcat ttctccctca tggccgtcga 1020 ctggcaggac gaggagcacc tccggctctt caacaaatgg caaaatgacc cgcgcgtcgc 1080 aaagggctgg aacgagaccg gtaccctaga cgaacaccgc gaataoctgc gccgtctgca 1140 tgaagataaa catgtcctgt gcttgttcgg ccggttcgac gatttcaagt tcgcatactt 1200 cgaagtttac tgggctaagg tgcgtctaca ccatccacta tacatcccca tctaacttta 1260 ttatacctga ttctaacccc ccaaacagga agatcactac ggagcccact acgacgcagc 1320 cgactacgac cgcggtcgcc actccttggt cggcgaaagc agtgtccgcg gcgcataccg 1380 cgtaaacgcc tggtggggta gcgtaatcca ctacatcttc ctcgatgagc cgcgcacgca 1440 ggccgtggtc ggcgagccga aggcgaatac aactgttttg tcctacgaga atgcccaagg 1500 attaacgatt caaaaatacg ttgaccttgg tcataagcgc tctgtccatg tgcattgcag 1560 tgcgagaagt ggttccagtt gtgtccgctt ttctgggatg gacgggagag gccgttggag 1620 agctcggatc gtatggcttt cgatgcgaaa ctctagcttt agacttctta tggaagcgaa 1680 tagtcttgta taatttgtga tatgcatata cgcgttatgg attattttct catgctactg 1740 tgatactatg gtctatgctt tggtccattg ctgtaaagtc agagggatgc tgtagggatt 1800 atgcttgttt attcaatgaa tagtgacaat gaataggcaa agggaagggc ggttcggcaa 1860 atcagataag gaaaaaccga actgataatc ggttagacag ttgaacccct cgcgaatgat 1920 ccgattatat tccaggcgga tacgccaagc aagcaagtcc tcttgcceag gaactagtgg 1980 attgttaagc gagaggtcag atttttcttt gttcaaacac ctaggatctc gctgcgttcg 2040 gctttgtatt caaaatcggc atctagctac cagggcagat agtgtaaatc aattactgct 2100 ttggataggg ctacagtaaa caccccgttt acccagagca acgggtatag gtgggccagc 2160 tgtcaatgtc gatgatcgag cacgataccg gactagagtt acctacttta ccggaactcg 2220 ggtgtaccga gcggaagcga actacctccg atcgcttggt gaga 2264 <210> 3 <211> 1326 <212> PRT <213> Aspergillus oryzae <400> 3 Met Lys Leu Gly Lys Lys Leu Ala Gly Tyr Pro Ser Leu Leu Leu Ala 5 10 15 Gly Asn Pro Ser Lys Val Asp Ile Gly Arg Leu Leu Leu Gly Met Val 20 25 30 Ala Ser Ala Ala Ser Gly Val Pro Phe Pro Leu Ile Ala Ile Leu Phe 35 40 45 Gly Gln Leu Leu Asp Asp Phe Asn Ala Val Thr Cys Asp Glu Thr Glu 50 55 60 Ser Thr Gly Ser Asp Ala Asp Tyr Gln His Asp Ile Asn Gly Lys Ile 65 70 75 80 Leu Ile Ile Val Tyr Leu Ala Ile Ala Gln Phe Val Ala Ile Tyr Ile 85 90 95 His Leu Ser Cys Trp Ser Leu Asn Gly Ala Arg Leu Ala Gln Arg Leu 100 105 110 Arg Glu Thr Tyr Leu Gln Asn Leu Leu Arg Gln Glu Pro Ser Phe Phe 115 120 125 Asp Asp Leu Pro Pro Gly Glu Leu Ala Ser Arg Leu Asn Gly Asp Ile 130 135 140 Gln Ala Ile Arg Ser Gly Thr Ser Glu Lys Val Gly Ile Cys Leu Ser 145 150 155 160 Thr Leu Ser Phe Phe Ile Thr Ala Tyr Val Val Ala Phe Ile Lys Asp 165 170 175 Tyr Arg Leu Ala Ala Met Leu Ile Ser Leu Val Pro Ala Tyr Phe Leu 180 185 190 Met Ser Ser Val Gly Ser His Tyr Ile Glu Glu Tyr Ser Gly Arg Met 195 200 205 Ser Asp Tyr Ser Ala Thr Ala Ala Ser Ile Ala Ser Glu Ala Leu Ser 210 215 220 Asn Thr Val Val Val Gln Ala Phe Gly Ala Ser Tyr Arg Leu Glu Asp 225 230 235 240 Lys Phe Ser Lys Ala Leu Lys Ala Ser Glu Gln Glu Gly Leu Lys Lys 245 250 255 Ala Ala Ala Val Gly Ile Gln Ser Gly Phe Leu Tyr Phe Ile Ala Tyr 260 265 270 Ser Ala Asn Gly Leu Ala Phe Trp Gln Gly Ser Arg Arg Val Ala Asp 275 280 285 Ala Val Gly Ser Asp Thr Ala Gly Ala Thr Val Gly Ala Thr Phe Thr 290 295 300 Val Ile Phe Val Leu Val Glu Ala Thr Leu Leu Leu Ser Gln Val Ala 305 310 315 320 Pro Phe Leu His Leu Phe Thr Ala Ala Val Ala Ser Tyr Gln Lys Leu 325 330 335 Arg Ala Asp Ile Asp Arg Gln Pro Gln Ile Asp Ala Thr Thr Glu Ser 340 345 350 Gly Ile Arg Leu Ser Gln Ala Glu Gly Gly Phe Glu Phe Lys Asn Val 355 360 365 Ser Phe Thr Tyr Pro Ser Arg Pro Glu Ile Thr Val Leu Asp Gln Ile 370 375 380 Ser Leu Ser Ile Pro Ala Asn Lys His Thr Ala Leu Val Gly Leu Ser 385 390 395 400 Gly Ser Gly Lys Ser Thr Ile Ala Gly Leu Val Thr Arg Leu Tyr Asp 405 410 415 Pro Thr Glu Gly Gln Val Leu Phe Asp Gly His Asp Leu Arg Glu Val 420 425 430 Asn Thr Arg Asp Leu Arg Ser Phe Leu Ser Leu Val Gln Gln Glu Pro 435 440 445 Ser Leu Leu Asp Arg Ser Leu Leu Glu Asn Ile Ala His Gly Leu Ile 450 455 460 Asn Ser Ser Asn Pro Ser His Ala His Leu Arg Thr Thr Leu Leu Ser 465 470 475 480 Thr Gly Leu Thr Asp Leu Ala Ala Glu Val Arg Glu Gly Val Asp Leu 485 490 495 Met Ala Ala Ala Glu Lys Arg Gly Ser Glu Val Val Glu Ile Val Asn 500 505 510 Leu Val Arg Lys Ala Ala Thr Leu Ala Asp Ala Asp Gly Phe Ile Ser 515 520 525 Ala Leu Gln Tyr Gly Tyr Gly Thr Leu Val Gly Ser Ser Gly Arg Leu 530 535 540 Ile Ser Gly Gly Gln Lys Gln Arg Val Ser Leu Ala Arg Ala Leu Ile 545 550 555 560 Lys Asp Pro Ala Val Leu Ile Leu Asp Glu Ala Thr Ala Ser Leu Asp 565 570 575 Ser Arg Ser Glu Gln Arg Ile Gln Arg Ala Ile Ser Asn Ile Ala Thr 580 585 590 Gly Arg Thr Met Ile Thr Ile Ala His Arg Leu Ser Thr Ile Thr Asn 595 600 605 Ala Asp Asn Ile Ile Val Met His Lys Gly His Ile Val Glu Gln Gly 610 615 620 Asp His Ala Thr Leu Met Ala Lys Asn Gly Ala Tyr Ala Asp Leu Val 625 630 635 640 Asn Leu Gln Thr Leu Gly Ser Ala Pro Gly Lys Lys Glu Lys Thr Ala 645 650 655 Ser Ala Asp Asn Val Ser Gln Ser Asp Gln Ala Ser Leu Ser Asp Ala 660 665 670 Gly Val Glu Glu Ser Ser Val Ser Lys Asp Gly Leu Glu Thr Ala Glu 675 680 685 Lys Lys Glu Val Leu Ala Ser Ala Ala Pro Val Thr Glu Pro Ala Glu 690 695 700 Pro Ala Glu Glu Glu Glu Glu Pro Glu Thr Pro Lys Lys Ser Met Trp 705 710 715 720 Ala Leu Leu Arg Gly Tyr Ala Pro Thr Leu Arg Pro His Leu Leu Phe 725 730 735 Ile Phe Leu Ala Leu Leu Gly Ser Ser Ile Val Gly Gly Ala Phe Ser 740 745 750 Gly Glu Val Ile Phe Gly Asn Thr Val Gly Ser Leu Asn Pro Cys His 755 760 765 Ser Glu Ser Tyr Ile Arg Ser Ala Gly Asn Phe Phe Gly Leu Met Phe 770 775 780 Phe Val Leu Ala Ile Ile Glu Phe Phe Ala Asn Leu Val Ser Trp Thr 785 790 795 800 Gly Phe Gly Trp Val Ser Glu Lys Ile Val Phe Thr Val Arg Val Leu 805 810 815 Ser Phe Arg Ser Leu Phe Glu Gln Asp Leu Gln Trp His Gln Ser Asn 820 825 830 Gly Arg Ser Pro Ala Leu Leu Leu Ser Tyr Ile Thr Arg Asp Gly Asn 835 840 845 Ala Leu Ala Gly Leu Ser Gly Ser Val Ile Gly Thr Leu Phe Ser Ile 850 855 860 Thr Val Asn Leu Ile Ala Ala Ile Ile Leu Thr His Ile Ile Ala Trp 865 870 875 880 Arg Ile Ala Leu Val Cys Leu Ala Leu Val Pro Leu Leu Leu Gly Ala 885 890 895 Gly Leu Met Glu Leu His Val Leu Gly Lys Phe Glu Glu Arg His Glu 900 905 910 Asn Ala Tyr Thr Lys Ser Val Asp Ile Gly Val Glu Glu Val Thr Ser 915 920 925 Ile Lys Thr Ile Ala Ser Leu Ser Leu Glu Glu Asp Thr Leu Arg Thr 930 935 940 Tyr Arg Arg Ser Leu Lys Gly Pro Arg Lys Glu Thr Phe Gln Val Thr 945 950 955 960 Leu His Ala Ser Leu Trp Gln Ala Met Thr Tyr Phe Leu Gly Asn Cys 965 970 975 Val Asn Ala Leu Ala Tyr Trp Trp Gly Ser Lys Gln Ile Ile Asn Gly 980 985 990 Asn Tyr Thr Gln Thr Gln Phe Leu Ile Val Val Phe Ser Leu Leu Val 995 1000 1005 Ser Ala Leu Leu Trp Ser Gln Met Phe Ala Leu Ala Pro Glu Leu Ser 1010 1015 1020 Ala Ala Arg Ala Ala Met Ala Arg Ile Leu Gly Leu Ile Glu Ile Gly 1025 1030 1035 1040 Ser Asp Lys Met Gln Gly Arg Val Pro Ser Arg Ser Pro Thr Ile Ser 1045 1050 1055 Ser Ser Glu Glu Lys Asp Val Glv Thr Ala Glu Thr Lys Ser Val Tyr 1060 1065 1070 Val Ser Gly Asn Asn Arg Ala Ser Ser Val Gln Leu Arg Asn Ile His 1075 1080 1085 Phe Ala Tyr Pro Ala Arg Pro Asp Ile Lys Val Leu Lys Gly Leu Asp 1090 1095 1100 Val Asp Ile His Pro Gly Gln Phe Gly Ala Leu Val Gly Pro Ser Gly 1105 1110 1115 1120 Ala Gly Lys Ser Thr Ile Ile Ser Leu Val Glu Arg Leu Tyr Thr Pro 1125 1130 1135 Glu Thr Gly Ser Ile Val Ile Asp Gly Val Asp Val Thr Arg His Arg 1140 1145 1150 Gly Val Asp Phe Arg Asp Ser Ile Ala Leu Val Pro Gln Glu Ser Val 1155 1160 1165 Leu Phe Glu Gly Ser Ile Glu Phe Asn Ile Gly Leu Gly Ala Arg Pro 1170 1175 1180 Gly His Glu Ala Thr Ile Glu Glu Ile Lys Glu Ala Cys Lys Leu Ala 1185 1190 1195 1200 Asn Ile His Asp Val Ile Glu Ala Leu Pro Glu Gly Tyr Lys Thr Leu 1205 1210 1215 Cys Gly Pro Asn Gly Ser Gln Phe Ser Gly Gly Gln Lys Gln Arg Leu 1220 1225 1230 Ser Ile Ala Arg Ala Leu Val Arg Lys Pro Lys Leu Leu Ile Leu Asp 1235 1240 1245 Glu Ser Thr Ser Ala Leu Asp Ala Glu Ser Glu Lys Leu Leu Gln Asp 1250 1255 1260 Gly Leu Glu Lys Ala Ala Lys Gly Ile Thr Val Ile Ala Ile Ala His 1265 1270 1275 1280 Arg Leu His Thr Ile Arg Ala Ala Asp Val Ile Phe Leu Ile Glu Gly 1285 1290 1295 Gly Lys Cys Ile Asp Arg Gly Ser His Glu Glu Leu Leu Glu Arg Ser 1300 1305 1310 Asp Ser Tyr Arg Ala Asn Val Met His Gln Thr Val Ala Thr 1315 1320 1325 1326 <210> 4 <211> 5056 <212> DNA <213> Aspergillus oryzae <400> 4 ttctagctac taggcggctg taccaaatat tttccaatac cgaactttcg tagcaagcca 60 gtgacccgac tgccttgctt atatcgacga cacaatcctg taatctgtta gtcaatagac 120 atacgttagg gtattccaat gactcgtatg acgttccata catacgatac gccttgtggg 180 ggcccgtatt gtactgatac ctggatcatg 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cattttccgc ctggtattat gatcaggtga tgcgggcacc 720 cctaattcgc acgccagtat cagaacttta gctccctcac gagtaaaaag aaaaaagaaa 780 ctgaaaatac cgttttgtaa cttgtttact gtttccagtt ctcaagcgag acataccgta 840 catacatacc atattttcgt actgtacagg ctgtattgta cctgaacagc attggggccc 900 gacactcttc cactgcgcaa ttatgggtcc catccgttca tcggacacgc ggatacggag 960 tacatacaca tactctgctc tacttgcgtc caagagacat gtgggcatct gactagccca 1020 cagcctcctg ccatggcgat ctcggtcaga ctctacagag tacctgcagg tacggagtta 1080 ttcaggttac tttccggctc gtccgtcggt ggaggacaat gctagcacaa ccttggttgc 1140 ttagttatat aacttgcgcc ttaccacttc agtgcggtcc ggctagtcca aagctccagc 1200 aacttgaacg gccggccgag gtctaacccc tcttcgtacc cttatacccc gccaagattt 1260 cgagtccagg taggctgggc tgccggaaga atggctatac aggttgatgg tacacataat 1320 caaagccaac acagaaatgg gtctgttggc gaataatctg ccggtcaggc tgatggtgac 1380 agtttcacat catttgaggt cgtcggcctt gcagccgacg agcccaccac tcccactagc 1440 atgaaggagg aagttttgct tatctcatgg cttattgtgc tcttgcgaac ccgcgatagt 1500 ggtcaggtcc aatatgaagt gggcgtacaa 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ggcaacaact atcatgtcag acggaaagca 2400 catcgttgtg gaagctgacg catttgcaca cctgtcaaat tcggaacccc ttccactgtt 2460 gccggcagtc ccctcatctg ccctaatgta catcatcttc acttctggca gcacgggtac 2520 gcccaaagga gtcaagatct ctcacgaaac atatacaagc agcgctttcc cacgagccaa 2580 ggctgtgggt tatacggagg agtccagggt cctcgatttt gcatcctacg ctttcgatgt 2640 cagtatcgac agcatgcttt tgacgttggc aaacggcggt tgcctttgta ttccctccga 2700 tgaggatcga ctgaacgata ttaatgaagt gatacgaaga atgaaaatca actacgcagg 2760 tataactcct tctgtggcca gaattctgga gcctgatgta atagcatcgc tgagtgctct 2820 tggtctggga ggagaggcag cagcagcaac ggatgtgacg cgctggggcc atgacactag 2880 gattgtcata ggttacggcc cctgtgagtg cacgatcgga tgtacggtga acagcgatac 2940 tgccactggt agagactata tctctattgg gacaggaaac ggcgcagcca tctggattgc 3000 cgaccctaac gaccacaatg tcttaatgcc agtcggcgct gtgggcgagc tactcgttga 3060 aggtccgatt gtaggacagg gttacttgaa tgatccagac aaaaccgcag cggctttcat 3120 ccacgaccca gcttggcttg tctctggcca caatggctac gctggtcgtt cggggcgtct 3180 gtacaagact ggagaccttg gaaagtatga 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gtcagtcaag ccatatattg cccagagagt 4080 cgcacgcatt ccctcacaca tcagttctga tgcttggaaa aaggcatggg gtgaggttgt 4140 cgcggcaagc cccatcctgc gcactcgagt qgcccagctg caggaacgtg gtcttcagca 4200 agtcgtgcta aaggaaacta tctcctggag gtcttcatcc gatcttgtac agtacctaga 4260 gactgatcgg aaggagagaa tgagtcttgg agaaagtcta gctcgatacg ccatagttag 4320 cgatccacag actgagacga ggtatatggt ctggacgatt catcacgtgg tctacgacgg 4380 gtggtcagag ccagtaatac ttaagaatgt cagtgattcc ttgcaaggcc agtcgattga 4440 aacccaggct caaatcagag acttcgtcaa atgggtacgc gatacagatg aagttgccat 4500 gcaggaattc tggagacggg aattaaaagg cgcggtcgga cctcaattcc ctcgattgcc 4560 cgcgagagac tacttgcccg ttccgaatgc catggtcgaa cgtcagatac cgctcgagac 4620 aggttccggt tggcctttca cactggcaac acttattcgc ggtgcctggg cccttgtagc 4680 gtcgcagtat acagggagcg acgatgttgt gttcggcgaa acacttaccg ggcgagacat 4740 ttcgttgcca ggagtggaaa gcattgtggg cccattgatt gcaacagtac ctatccgcgt 4800 acgtatacct cgaaccagct cagtcgaatc ttatttgcgg gatgtgcagc aaagcgttgt 4860 ggcccgtacc ccgtatcagc atatggggat gcaaaacatt cggaaggtca gccaagacgc 4920 gcaacatgca tgtgaagctg gtacaggctt ggtcatccag ccagagccgg agtatgtggg 4980 cagcgaactt ggctttgagc tcggagacgt cgtacgtgaa gcgctgcatt tcaacccgta 5040 tccgcttatg ttaggctgtg gtatccgaaa gggtggtttc agaatatgcg caaatttcga 5100 tagctccttg gtggagatcc cacaaatgga acgaatcctc gcgcagctcg aaatggcttg 5160 cttgcaattg acaaaaggcc tctctagaag ggtagacgag atatcctgct tgcccgaggc 5220 ggaactggat ctgatttggc aatggaatca aattgctccc ttgtccttgg atgaatcgtc 5280 cggaaggctt cgagcaaaca caaacatcaa gcaaggatcg gtttacccac ctacggtggt 5340 ttcctgggtg tgtgacccga ggaacccgtc gttgctatcg ccaatcggct gtgttgggcg 5400 agctctggct cgaagggcgc tttcctttca ggagatgcca ttgaaatccc cctcctggct 5460 cgtggctggc agctccaatt ttagaggccg gacgggaaga gtgcagccga ctggagacat 5520 ggttaattta caagaggata gaagcttagt atttgttggc cgaaaggaaa atgttgtgcc 5580 agttcacggg catgcggtgg atatcgccga tgtcgaatct cacttttcaa agtacctccc 5640 accaaatgtt cgtgctgcgg ctgccgtctt ccaaccatct tcagatgaca cccactctgt 5700 aacagaacaa gagctggccg tattcataga gcaagagcct tttgagcaag acagtgttga 5760 gctcctatcg gcgcaatatg acatcacttg tgagggttca gacacgcaaa acctctcgac 5820 gtctgttcgt gccacaattt ccgttagtct tctcgttgca ctgaagcgac tcagcaagtt 5880 tatgcaagac tcccttccat catacatggt gccctcagcc tacgttgttc ttgccaaatt 5940 gcccactgat gtgggtgaag tcaaccacag tttgctcaaa cagctagcct cgaatattcc 6000 taaacacgta ctcacccaac ttcgtgaagc cttccagcag gcctggacga agaacttagg 6060 gcaaactaat atgtcccttc cagagagtat cctgcggtcc gcctgggcaa agatactagg 6120 aatcagtccc gagaagattg atgtcgacga taacttcttc cgcctgggtg gtgattccgt 6180 tttagcgatg aaactggtct caagccttcg tgcacagggg cacagtttgt cagtggctga 6240 catcttccaa cacatgcgtc ttggtgatgc agctaaagta ttgaaactgg gccaggtatc 6300 gcaacagaaa gtccagcctt acaaggcttt ctcgactctg ggccatttgg atgtagagca 6360 gttcttgtcc gaaattgtcc ggccgaagct tgctgatgtt acgtggtcca tccaggacgt 6420 atgtccggtg acagactccc aagcactcga cgtcagagct accatccagg gaccgcgcac 6480 ctcgatacaa tatactatgt tgtacctgga caaaagcatc gatcgagagc aattgttccg 6540 cgcctgcaac gacctggtca agactcacga cattctgcga actgtcttca tcgaacacga 6600 atctactttc taccaggttg tgttgaatga gttggaagtt cctgtagcca tgcaccaagc 6660 tgataaggat cttggtccat acatcaagga tctttgtaca tcacacacag aatccttcca 6720 cctaggatcg tccttcttca aattgctcca tgtcgagggc aacgatggcc aagaatgcct 6780 catcttaggt ctttcacacg ctcagtacga cggaatgtct ctgcctaggc tgctacaaga 6840 tctggaaact ttgtacactg gcggaaagat tgtcgacttc gagccgttct cagcatacat 6900 tgcacggatt tctgatgagg gtgtccaaac taaagcaatc aactactggc gcaacctttt 6960 gaacgggtca tccctatctg ttctggaggg aacgtcagta cagcctacag acaaagccat 7020 attccatact aagcccgtcg atgtctccca gcccctcgac ctcgacgagg tcacgactgc 7080 gaacttgctc accgcagctt gggcactggt actggcatgc cgtctccaaa aacccgacgt 7140 gacattcggt ggcgtgactt caggccgaaa tatcgacctc gcaaatgtgg aaaatgtaat 7200 gggtcactgc taccaattaa ccccgattag agtcgcgttc cagtcacagt ggaccgcgat 7260 ggatctactg cgctttgttc agaggcaaag cgccgaatct gcagctcacg acttcctcgg 7320 attcaataag atctccaaga aatgcacgca atggtcatcg gaagcaacat gtttcgactc 7380 cctcgtccat catcaggact gggatgattt tgacaccatg ccttttgccg ggggaacttg 7440 caaggttgat attctgaacc cagatgggga tgccccttat cctttgaagg ttgtttcatt 7500 tgtccgtggt gggcaattga atgtcggagt cgctggaagt gaaagagatg cggcgttcgt 7560 ggacgcagcc cttgatgagt tggctgccac ggtcaaggag ctggcgacgc gtccgtcgga 7620 gcacgtgttg attgacggtc acatgttcta gacccaagac tggtcaaagt cgccgatacc 7680 tccctcgaca ttggttcatg gataacgatt tcatttggtt ctttttgcat gtatttctct 7740 taggagtcga ttttcttgtt atatcctagt agtatatcat tagaaatgtc aaatccagct 7800 ctaaaacaaa tgttcttggc acctcccgct gtttttcccc aaaagtcacg ggacagtgta 7860 taatgaggtc atattggaca aacctgtata ttaagagtct gttggaggaa gtcattgtgc 7920 catagctaaa gatttatgac tcgaacttaa gtcaccatta ttatcgttgt attttaccta 7980 ccgtagaagt gtgagaatag ggctagttgt taagatatat tttctgtccg tgcaacccta 8040 aaatacatac ggccatatag ctgtaccttt agttttggag attttggaca attcagctga 8100 gatattcggg acttgtacaa cgtattcaat aattacaata agaattgtgt aaataaattc 8160 ttactgttct ttcttttgta cctcggtgat tgagctgtca agccaagcgg cttgaatctt 8220 caaccacgca aggtacatag attttaccac cgccgagcta tggtagagat gaaggctaga 8280 ctgtactttt ctctcattgt cttgcaaaac ataaaaacca caaattgaaa tattataata 8340 tatagattta aaaaaaggtg ccgctattac aaatatatag aaagtctatc cggggaataa 8400 tttaaaaaca gtctctgcag atatgcaatc aaaatggtcc aaaaatcgca acaatggttt 8460 atccggcaca atccacgatc acgtggccac tgtttgatgc atgacgtttg ctctgtagct 8520 gtccgatctt tcgagcaact cctcgtgcga tccgcgatca atgcatttac ccccttcaat 8580 caagaagatg acatctgctg ctctaattgt gtgaagacga tgggcgatag caatgacagt 8640 aatgcccttt gcggcctttt cgagtccgtc ttgcagtagc ttctccgatt cagcgtccaa 8700 agcgctggtc gattcatcga gaatcagaag cttaggcttc cgaacaaggg cccgagcaat 8760 agacaacctc tgcttctgac ctcccgagaa ctggctacca ttaggtccgc aaagagtctt 8820 gtagccctct ggcagcgcct ctataacgtc gtggatgttg gcaagcttgc atgcctcttt 8880 gatttctcga tagtcgcttt catgtcctgg tctagcacca aggccatgtt gaactcaata 8940 ctgccctcaa aaagcacgct ttcttgtggc acaagagcga tagagtcgcg gaagtcaacg 9000 cctcggtgcc tggtaacgtc gacgccatcg atcacgatgg atccggtttc gg 9052

【図面の簡単な説明】

【図１】麹菌フェリクローム生合成遺伝子群の染色体上
マップの写真である（図面代用写真）。

【図２】クラスター遺伝子のＲＴ−ＰＣＲによる発現条
件の解析写真である。図中（−）は鉄制限培養、（＋）
は鉄含有培養を示す（図面代用写真）。

【図３】アセチラーゼ遺伝子ａｓｂ３の大腸菌発現プラ
スミドを示す。

【図４】アセチラーゼ蛋白質のアミノ酸配列を示す。

【図５】同上続きを示す。

【図６】アセチラーゼ遺伝子ａｓｂ３の塩基配列を示
す。

【図７】同上続きを示す。

【図８】ＡＢＣトランスポーター蛋白質のアミノ酸配列
を示す。

【図９】同上続きを示す。

【図１０】同上続きを示す。

【図１１】同上続きを示す。

【図１２】同上続きを示す。

【図１３】同上続きを示す。

【図１４】ＡＢＣトランスポーター遺伝子ａｓｂＴの塩
基配列を示す。

【図１５】同上続きを示す。

【図１６】同上続きを示す。

【図１７】プロテインキナーゼＡ蛋白質のアミノ酸配列
を示す。

【図１８】同上続きを示す。

【図１９】同上続きを示す。

【図２０】同上続きを示す。

【図２１】同上続きを示す。

【図２２】プロテインキナーゼＡ遺伝子ａｎｋＯの塩基
配列を示す。

【図２３】同上続きを示す。

【図２４】同上続きを示す。

【図２５】アンキリンリピート含有ＤＨＨＣジンクフィ
ンガー蛋白質のアミノ酸配列を示す。

【図２６】同上続きを示す。

【図２７】同上続きを示す。

【図２８】アンキリンリピート含有ＤＨＨＣジンクフィ
ンガー蛋白質をコードする遺伝子ａｓｂＲの塩基配列を
示す。

【図２９】同上続きを示す。

【図３０】プライマーＰ１を示す。

【図３１】プライマーＰ２を示す。

【図３２】プライマーＰ３を示す。

【図３３】プライマーＰ４を示す。

【図３４】オルニチンＮ５−オキシゲナーゼ遺伝子ａｓ
ｂ１の塩基配列を示す。

【図３５】同上続きを示す。

【図３６】ペプチドシンテターゼ遺伝子ａｓｂ２の塩基
配列を示す。

【図３７】同上続きを示す。

【図３８】同上続きを示す。

【図３９】同上続きを示す。

【図４０】同上続きを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 9/12 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ // Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:66 (Ｃ１２Ｎ 1/15 1:19 Ｃ１２Ｒ 1:66） Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 秦 洋二 京都市伏見区片原町300 月桂冠株式会社 総合研究所内 (72)発明者 川戸 章嗣 京都市伏見区下鳥羽小柳町24 月桂冠株式 会社総合研究所内 (72)発明者 杉並 孝二 京都市伏見区片原町300 月桂冠株式会社 内 (72)発明者 安部 康久 京都市伏見区片原町300 月桂冠株式会社 内 (72)発明者 町田 雅之 茨城県つくば市東１−１−１ 独立行政法 人産業技術総合研究所つくばセンター内 (72)発明者 佐野 元昭 茨城県つくば市東１−１−１ 独立行政法 人産業技術総合研究所つくばセンター内 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA05 BA10 CA01 CA04 DA06 DA11 EA04 FA02 GA11 HA01 4B050 CC01 CC03 CC08 DD03 LL01 LL02 LL05 4B064 AG01 AG37 CA02 CA05 CA21 CC24 DA01 DA10 4B065 AA01X AA26X AA57X AA63X AA63Y AB01 BA01 BA22 CA24 CA41 CA44 4H045 AA10 AA20 BA10 BA30 CA10 DA00 DA89 EA20 FA72 FA74

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 以下の（ａ）または（ｂ）の蛋白質： （ａ）配列表の配列番号１、３、５、７のいずれか１つ
   に示されるアミノ酸配列を有する蛋白質、または、アミ
   ノ酸配列（ａ）においてアミノ酸が欠失、置換もしくは
   付加されたアミノ酸配列を有し、且つフェリクローム生
   合成クラスターを形成するアセチラーゼ（配列番号
   １）、ＡＢＣトランスポーター（配列番号３）、プロテ
   インキナーゼＡ（配列番号５）、アンキリンリピート含
   有ＤＨＨＣジンクフィンガー蛋白質（配列番号７）から
   なる群から選ばれる少なくとも１つの蛋白質。
2. 【請求項２】 請求項１に記載の蛋白質（ａ）をコード
   する遺伝子のＤＮＡ、または、該遺伝子とストリンジェ
   ントな条件下でハイブリダイズし、且つフェリクローム
   生合成クラスターを形成するアセチラーゼ遺伝子（配列
   番号２）、ＡＢＣトランスポーター遺伝子（配列番号
   ４）、プロテインキナーゼＡ遺伝子（配列番号６）、ア
   ンキリンリピート含有ＤＨＨＣジンクフィンガー蛋白質
   遺伝子（配列番号８）からなる群から選ばれる少なくと
   も１つの遺伝子のＤＮＡ。
3. 【請求項３】 請求項２に記載のＤＮＡの内、少なくと
   もコーディング領域を含んでなる組換えベクター。
4. 【請求項４】 組換えベクターｐＡＣＥ１。
5. 【請求項５】 請求項３又は４に記載の組換えベクター
   を挿入してなる形質転換体。
6. 【請求項６】 形質転換体、エシェリヒア・コリ（Ｅｓ
   ｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）ＡＣＥＴＹ１（ＦＥＲＭ
   Ｐ−１８５４２）。
7. 【請求項７】 請求項３又は４に記載の組換えベクター
   を含む組換え麹菌。
8. 【請求項８】 請求項５又は７に記載の形質転換体にお
   いて、フェリクローム生合成クラスターを形成するアセ
   チラーゼ、ＡＢＣトランスポーター、プロテインキナー
   ゼＡ、またはアンキリンリピート含有ＤＨＨＣジンクフ
   ィンガー蛋白質の少なくともひとつを生産させることに
   よってフェリクローム高生産麹菌を育種すること、を特
   徴とする育種方法。
9. 【請求項９】 請求項１記載の蛋白質の発現を麹菌菌体
   内で抑制させ、フェリクローム非生産麹菌を育種するこ
   と、を特徴とする育種方法。
10. 【請求項１０】 麹菌フェリクローム生合成に関与する
    遺伝子クラスターを、麹菌以外の生物に導入してフェリ
    クローム類を生産させる方法。