JP2003125772A - コンピュータを利用して解析対象核酸塩基配列から最適なオリゴ核酸配列の候補を設計するためのコンピュータソフトウエアプログラム、その方法およびそのように設計されたオリゴ核酸配列が搭載されたオリゴ核酸アレイ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 二本鎖結合温度若しくは融解温度（Ｔｍ）値
に関して高い精度を有するオリゴ核酸塩基配列を一度に
多数決定する。 【解決手段】 コンピュータに、二本鎖結合温度の許容
範囲の指定を受け付けて記憶させる第１の指令と、前記
コンピュータに、前記解析対象核酸塩基配列の中で、部
分配列の長さを伸ばしながら各長さでの二本鎖結合温度
を算出させる第２の指令と、前記コンピュータに、上記
手段で算出した二本鎖結合温度が前記指定手段で指定さ
れた許容範囲に入るかを判断させ、入る場合には当該長
さの部分配列を候補オリゴ核酸配列として出力させる第
３の指令と、を有する

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】この発明は、解析対象核酸塩
基配列から最適なオリゴ核酸配列の候補を設計するため
のプログラムおよび方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】実験対象の遺伝子の細胞内での発現性を
解析する場合、一般的にＤＮＡチップと称される素子が
利用される。このＤＮＡチップは、数千から数万個の異
なる塩基配列情報を持つＤＮＡ断片やＲＮＡ断片をガラ
スやシリコンの基板上に配列してなるものである。

【０００３】このＤＮＡチップ上に配列された複数のＤ
ＮＡ断片やＲＮＡ断片の核酸配列は、キャプチャーと称
され、実験対象の特定の遺伝子と結合、つまりハイブリ
ダイゼーションを起こさせるために適宜配置されたもの
である。このようなＤＮＡチップによれば、例えば健康
な細胞が病気の細胞に変化した際、この細胞中のどの遺
伝子がハイブリダイゼーションを起こすかを調べること
によって、病気の原因になる発現遺伝子を突き止めるこ
とが可能になる。

【０００４】ここで、上記キャプチャーとして使用され
るＤＮＡ断片の核酸配列は、一般にライブラリから選択
される。ライブラリとは、細胞などから取得した遺伝子
の断片をクローニングして作られたＤＮＡのサンプルの
集合体や、ｃＤＮＡのサンプルの集合体である。ここ
で、ｃＤＮＡ（complementary ＤＮＡ)とは、メッセン
ジャーＲＮＡの全ての塩基に結合できるＤＮＡ配列の塩
基、つまり、メッセンジャーＲＮＡに相補的に合成され
たＤＮＡである。

【０００５】しかし、研究者がこれらのキャプチャーと
なる実際のサンプルを入手するのは、実在するＤＮＡ断
片を細胞から入手したりする必要があり、時間、費用、
技術の面でも困難である。そのため、最近では、既に配
列情報が読み取られたゲノムの配列情報やＥＳＴ（Ｅｘ
ｐｒｅｓｓｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｔａｇ）と呼ばれ
るメッセンジャーＲＮＡのポリＡ配列端末（ポリＡと
は、−ＡＡＡＡＯＨ というＲＮＡの端末に存在する配
列）の配列情報を同定した配列情報を用いて、数十塩基
長程度のオリゴ塩基配列を決定し、それを化学合成して
基盤上に載せる方法が使われているようになってきてい
る。ここで、オリゴ核酸とは、比較的短い塩基配列（例
えば、約２００ベースペア）を有した核酸を称する。

【０００６】従来、適切なオリゴ核酸配列の決定は、研
究者がライブラリ内の遺伝子や実験対象の遺伝子を部分
的に抜き出し、これらの配列を目視で比較・対比をし
て、配列に存在する相違点と共通点を探索することで成
されていた。しかし、近年ＤＮＡチップやＤＮＡアレイ
の集積度が上がり、より多数の核酸断片が集積されるよ
うになってきている。このような探索を目視で行う事は
現実的ではない。そこで、基板上に配列する核酸断片の
塩基配列を決定するにあたり、コンピュータを使用する
ことがより一般的になってきている。

【０００７】この様な技術として、従来、例えば特許第
３０５５９４２号に開示されたように、遺伝子配列デー
タソースのデータを利用したコンピュータ処理により共
通プローブや特異的プローブの設計を行えるオリゴプロ
ーブ設計ステーションがある。

【０００８】しかし、このような現在のコンピュータに
よる処理技術は、ハイブリダイゼーション強度モデリン
グを計算し、それに基づいてユーザーが適切なプローブ
を選択するに過ぎないものであり、プローブの結合温度
の精度を上げるようなものではない。

【０００９】すなわち、ＤＮＡチップ等用の多数の異な
ったプローブを設計する際、これらの全てのプローブは
同じ二本鎖結合温度を保持する必要がある。二本鎖結合
温度条件は、Ｔｍ値の温度によって与えられる。ここ
で、Ｔｍ値の温度とは、５０パーセントの二重結合が二
本鎖に存在する時の温度であるが、これは、ＧＣ含有量
などによって決定される。ところが、ＧＣ含有量は、塩
基配列とその長さによって変化する。そのため、合成条
件として決めた塩基長で固有の配列を持ち、適切な温度
条件になる配列を決定する際、これら全ての必要条件を
満たす配列を決定するのはかなり困難である。

【００１０】上記特許第３０５５９４２号に開示された
技術では、候補オリゴ核酸配列と特定遺伝子とのハイブ
リダイゼーション強度を二本鎖結合温度により求め、そ
の情報をユーザーに提示することで、最適温度条件にな
るプローブの選択を容易にするものである。しかし、こ
の技術で用いる候補のオリゴ核酸配列は、二本鎖結合温
度条件を考慮せずに決定された物であるから、上記のよ
うにしても候補オリゴ核酸配列の二本鎖結合温度に関す
る分散度を自体は小さくすることが出来ない。このた
め、候補オリゴ核酸配列から多くのプローブを得ようと
するとその分散度がかなり大きくなってしまう。発明者
等の分析によれば、従来の方法で求めたオリゴ核酸塩基
配列の二本鎖結合温度の誤差範囲は±２０度にも達して
しまう。また、この誤差範囲を小さくしようとすると十
分な数のオリゴ核酸塩基配列が得られないという問題が
生じてしまう。

【００１１】一方、オリゴ核酸配列を決定する必然性の
ある他の用途として、ＰＣＲ法（ポリメラーゼ・チェイ
ン・リアクション法）等の遺伝子増幅手段を目的とした
プローブの設計がある。ＰＣＲ法において、固有の塩基
配列部分を探してその部分を増幅することを目的とし
て、その増幅部の両端側開始位置に相当する数十塩基長
のプローブの塩基配列を設計しなければならない。キャ
プチャーの塩基配列設計の場合と同様に、この用途にお
いても、該当部位以外での二本鎖結合をしないような固
有の配列部分を設計しなければならない。また、二本鎖
結合温度に関しても同じ温度条件である必要がある。

【００１２】上記の目的のため、設計したプローブは対
象となる遺伝子や混在する核酸に対して希望の部分だけ
を増幅するような、固有の配列である必要がある。ま
た、複数の配列対象を同時に増幅する場合もあり、この
際、それらの所望の結合部分に関する適切な配列と二本
鎖結合温度の条件をそれぞれが満足している必要があ
る。

【００１３】上記公報には、このＰＣＲ法においてのプ
ローブ設計に関する技術も開示されているが、上述の理
由で、適宜な二本鎖結合温度条件を満たすような解決策
を提供していない。

【００１４】

【発明が解決しようとする課題】上述したように、従来
の技術によれば、合成条件として決めた塩基長で固有の
配列を持ち、適切な温度条件になる配列を決定する際、
これら全ての必要条件を満たす配列を決定するのはかな
り困難であるという問題があった。

【００１５】この発明は、このような事情に鑑みて成さ
れたものであり、二本鎖結合温度若しくは融解温度（Ｔ
ｍ）値に関して高い精度を有するオリゴ核酸配列を一度
に多数決定することができるプログラム及び方法を提供
することを目的とする。

【００１６】この発明のさらに詳しい目的は、オリゴ核
酸配列を決定する際に、所望の融解温度許容範囲を指定
して、その条件を満たすオリゴ核酸配列を決定すること
ができるプログラム及び方法を提供することにある。

【００１７】

【課題を解決するための手段】上記課題を解決するた
め、この発明の第１の主要な観点によれば、コンピュー
タを利用して、解析対象核酸塩基配列から最適なオリゴ
核酸配列の候補を設計するためのプログラムであって、
前記コンピュータに、二本鎖結合温度の許容範囲の指定
を受け付けて記憶させる第１の指令と、前記コンピュー
タに、前記解析対象核酸塩基配列の中で、部分配列の長
さを伸ばしながらその長さでの二本鎖結合温度を算出さ
せる第２の指令と、前記コンピュータに、上記手段で算
出した二本鎖結合温度が前記指定手段で指定された許容
範囲に入るかを判断させ、入る場合には当該長さの部分
配列を候補オリゴ核酸配列として出力させる第３の指令
とを有することを特徴とするプログラムが提供される。

【００１８】このような構成によれば、入力された二本
鎖結合温度の許容範囲に基づき、始点及び長さを変えな
がらこの二本鎖結合温度を満たすようなオリゴ核酸配列
を求めていくことができる。このことにより、二本鎖結
合温度条件を満たすオリゴ核酸配列を多数決定・出力す
ることができる。

【００１９】この発明の１の実施形態によれば、前記第
２の指令は、前記解析析対象核酸配列中で二本鎖結合温
度を求める部分配列の始点を順次ずらし、ずらした始点
から部分配列の長さを伸ばすものである。この場合、前
記第２の指令は、前記第２の指令は、部分配列の二本鎖
結合温度が前記第３の指令で許容範囲から外れると判断
された場合に、それ以上長さを伸ばすことをせずに始点
を次にずらすものであることが好ましい。

【００２０】また、この発明の別の１の実施形態によれ
ば、このプログラムはさらに、前記コンピュータに、前
記第３の指令によって出力された複数の候補オリゴ核酸
配列を表示させる第４の指令を有する。

【００２１】また、この発明の更なる別の実施形態によ
れば、このプログラムはさらに、前記コンピュータに、
複数の解析対象核酸配列同士の相同を比較して、各解析
対象核酸配列に固有の配列部分と非固有な配列部分とを
識別させる第５の指令を有し、前記第２の指令は、前記
解析析対象核酸配列中で二本鎖結合温度を求める部分配
列の始点を順次ずらし、ずらした始点から部分配列の長
さを伸ばすものである。

【００２２】この場合、前記第２の指令は、前記第３の
指令で前記部分配列の二本鎖結合温度が許容範囲から外
れると判断された場合に、それ以上長さを伸ばすことを
せずに始点を次にずらすものであることが望ましい。

【００２３】また、前記第２の指令は、長さを伸ばした
部分配列が前記非固有の配列部分を含む場合に前記コン
ピュータに当該部分配列の二本鎖結合温度を算出するか
若しくは候補オリゴ核酸配列とするかを判断させる第６
の指令をさらに含み、前記第２の指令は、この第６の指
令により二本鎖結合温度を算出しない若しくは候補オリ
ゴ核酸配列としないと判断された場合に前記部分配列の
始点を次の固有の配列部分の先頭にずらすものであるこ
とが望ましい。この場合、前記第６の指令は、コンピュ
ータに、前記長さを伸ばした部分配列に含まれる固有の
配列部分と非固有の配列部分の比若しくは夫々の配列数
に基づいて当該部分配列の二本鎖結合温度を算出するか
若しくは候補オリゴ核酸配列とするかを判断させるもの
である。

【００２４】さらに別の１の実施形態によれば、前記第
４の指令は、二本鎖結合温度許容範囲に入る部分配列に
前記非固有の配列部分が含まれている場合、その部分配
列を低グレードの候補オリゴ核酸配列として出力するも
のである。また、前記第２の指令は、各固有の配列部分
から二本鎖結合温度に達する長さの部分配列が得られな
い場合、この部分配列の長さを非固有の配列部分まで伸
ばし、二本鎖結合温度の許容値に入る部分配列を低グレ
ードの候補オリゴ核酸配列として出力するものであるこ
とが好ましい。

【００２５】この発明の別の観点によれば、解析対象核
酸塩基配列から最適なオリゴ核酸配列の候補を設計する
ための方法であって、（ａ）二本鎖結合温度の許容範囲
を指定する工程と、（ｂ）前記解析対象核酸塩基配列の
中で、部分配列の長さを伸ばしながらその長さでの二本
鎖結合温度を算出する工程と、（ｃ）上記手段で算出し
た二本鎖結合温度が前記指定手段で指定された許容範囲
に入るかを判断し、入る場合には当該長さの部分配列を
候補オリゴ核酸配列として出力する工程とを有する方法
が提供される。

【００２６】このような構成によれば、前記第１の観点
によるプログラムで実施することができる方法が提供さ
れる。

【００２７】この発明の第３の主要な観点によれば、複
数のオリゴ核酸を分布させて実装してなるオリゴ核酸ア
レイであって、前記オリゴ核酸アレイは、所定の二本鎖
結合温度を有するように設計されてなる配列長さを有す
るものであることを特徴とするオリゴ核酸アレイが提供
される。

【００２８】このような構成によれば、二本鎖結合温度
を基準として設計された可変長のオリゴ核酸配列を搭載
してなるオリゴ核酸アレイを得ることができる。これに
より、二本鎖結合温度に関して非常に高い精度を有する
オリゴ核酸アレイを実現できる。

【００２９】なお、この発明の他の特徴及び顕著な効果
は、次の発明の実施の形態の項の記載を図面と共に参照
することで当業者にとって明確に理解することができ
る。

【００３０】

【発明の実施の形態】以下、本発明の一実施形態を図に
示しながら説明する。図は発明を実施する形態の一例に
過ぎないものである。また、説明中の用語は特に述べな
い限り、この発明の属する分野において当業者が通常用
いるものを意味するものとする。

【００３１】図１は、本実施形態のシステム及びプログ
ラムを説明するための全体構成図である。

【００３２】このシステムは、ＣＰＵ１、ＲＡＭ２、キ
ーボードやマウス等の入力機器３、ディスプレイやプリ
ンタ等の出力機器４、モデム５が接続されてなるバス７
に、データ記憶部８とプログラム記憶部９が接続されて
なる。

【００３３】データ記憶部８には、この発明に関係する
構成のみ挙げると、オリゴ核酸配列決定条件１１と、解
析対象核酸塩基配列ファイル１２と、参照専用塩基配列
ファイル１５と、解析対象核酸塩基配列の類似性判別結
果１３と、オリゴ核酸配列候補１４とが格納されるよう
になっている。

【００３４】オリゴ核酸配列決定条件１１には、少なく
とも、二本鎖結合温度１６とオリゴ核酸の長さ条件１７
と、低グレードしきい値１８が格納される。この実施形
態では、二本鎖結合温度１６は、所望の二本鎖結合温度
Tｍを基準として、例えば上限許容温度Tmu＝Ｔｍ＋３
℃、下限許容温度Tml＝Ｔｍ−３℃からなる範囲が設定
される。また、長さ条件１７は、ミスハイブリダイゼー
ションを有効に防止する目的で例えば５０〜１００塩基
（最低５０塩基長、最長１００塩基長）の範囲が設定さ
れる。

【００３５】また、低グレードしきい値１８は、候補オ
リゴ核酸配列中に含まれることが許容される非固有部分
の配列の数を、同じ候補オリゴ核酸配列中に含まれる固
有部分の配列の数に対する比として表したものである。
この実施形態では例えば５０％に設定される。そして、
非固有部分の配列を一部に含む候補オリゴ核酸配列は
「低グレード」として出力され、固有部分のみからなる
候補オリゴ核酸配列とは区別される。

【００３６】解析対象核酸塩基配列ファイル１２は、ユ
ーザが収集した興味のある複数の核酸塩基配列を含むデ
ータである。前記参照専用塩基配列ファイル１５は、ｃ
DNA/ESTデータベース等の外部データベースから任意に
追加・設定された参照専用の塩基配列である。これらの
配列ファイル１２、１５は、前記モデム５を介して接続
した１又は２以上の特定の外部データベース１９からダ
ウンロードしてなるデータであっても良い。

【００３７】前記類似性判別結果１３は、前記解析対象
核酸塩基配列同士、解析対象核酸配列と参照専用塩基配
列同士の類似性を判別することで、各解析対象塩基配列
について固有の配列部分と非固有の配列部分とを識別し
たものである。そして、前記オリゴ核酸配列候補１４
は、前記類似性判別結果１３と前記オリゴ核酸配列決定
条件１１とに基づいて算出された様々な塩基長のオリゴ
核酸配列候補である。

【００３８】一方、プログラム記憶部９には、同じくこ
の発明に関係する構成のみ挙げると、大きく分けて、オ
リゴ核酸塩基配列決定条件入力部２０と、固有部分配列
フィルタ部２１と、二本鎖結合温度条件フィルタ部２２
と、オリゴ核酸塩基配列決定結果表示部２３とが格納さ
れている。

【００３９】これらの構成要素２０〜２３は実際には、
ハードディスク等の記録媒体に確保された一定の領域若
しくはその領域に格納されたコンピュータソフトウエア
の１又は２以上のプログラム命令からなり、前記ＣＰＵ
１によってＲＡＭ２上に呼び出されて適宜実行されるこ
とでこの発明の機能を奏するようになっている。以下、
上記構成要素の詳しい構成及び機能を、このシステムに
より実行される実際のオリゴ核酸塩基配列決定手順と共
に説明する。

【００４０】前記オリゴ核酸塩基配列決定条件入力部２
０は、例えば、前記ディスプレイ（出力機器４）上にユ
ーザ用の条件入力画面を表示する。この画面は、例えば
図２に２５で示すようなもので、解析対象核酸塩基配列
ファイル名の入力ボックス２６、二本鎖結合温度の上限
値・下限値の各入力ボックス２７、２８、配列長さ条件
の最小値及び最大値の各入力ボックス２９、３０、外部
データベース名の指定のための入力ボックス３２を含
む。ユーザが各入力ボックス１６〜３２に値を入力若し
くは選択した後ＯＫボタン３１を押すことで、解析対象
核酸塩基配列ファイル１２（外部データベース１９）が
指定されると共に、前記オリゴ核酸配列決定条件１１が
前記データ記憶部８に格納される。

【００４１】前記固有部分配列フィルタ部２１は、解析
対象核酸塩基配列ファイル１２及び参照専用塩基配列フ
ァイル１５から各核酸塩基配列情報を読み込み、各塩基
配列間の類似性を評価する機能を有する。類似性は塩基
に対応する文字列を単純比較することによって行う。こ
こで、適宜な配列を選択するのに塩基配列の正確な１対
１の相違比較が要求されるため、遺伝子配列検索で頻繁
に用いられる挿入欠失を加味したホモロジー検索は適し
ていない。あくまでも挿入欠失を想定しないで配列比較
を行うことが好ましい。そのためにギャップに対応して
いない検索手段が適している。

【００４２】BLAST法を使用する場合には、ギャップ対
応前のものを用いデータベースサイズに依存して変化す
る期待値E-valueをかなりゆるく設定（高く設定）し、
小さな部分一致でも取出せるようにする。ここで、E-va
lueとは、特定のサイズのデータベースを検索したとき
に、実験対象の遺伝子の断片が見つかる期待値である。
さらに、それらで見つかった断片のスコアを参照し、し
きい値で与えたスコア以上のものを類似配列とする。こ
こで、スコアとは比較対象の一致度（一致する配列の長
さ若しくは類似度）に対応する量である。

【００４３】図３は、解析対象核酸塩基配列のうちの１
本を取り出して示したものである。この図では、説明の
便宜のため、１本の解析対象核酸塩基配列を折り返して
複数行に亘って表示している。また、核酸の塩基情報
A、C、G、T（U)はすべて四角形で示されている。

【００４４】上記固有配列フィルタ部２１は、上述した
BLAST法によるホモロジー検索により、他の解析対象核
酸塩基配列若しくは参照専用塩基配列に部分一致したも
のを非固有部分配列（または、共通部分配列）として登
録していく。この図３では黒で塗りつぶして表示した部
分（図に３３で示す）が非固有部分配列を示している。
したがって、白抜きのままの部分（図に３４で示す）は
固有部分配列となる。

【００４５】なお、BLAST法を用いない場合でも、適切
な配列幅を決めて、それを窓幅としながら、ずらして比
較する文字列一致検索の手法も利用できる。

【００４６】このような方法で、所望のしきい値以上で
相互に一致する部分を検索し、ヒットした結果を非固有
部分配列（３３）として登録していく。このとき、一致
文字列長を基本とするスコアと、一致した位置情報も登
録する。また必要に応じて、繰返しの配列部分を非固有
部分配列として除くことが好ましい。

【００４７】そして、この固有部分配列フィルタ部２１
は、すべての解析対象核酸配列を比較した後で、その比
較によって得られた結果（一致性／類似性の高い部分）
を解析対象核酸塩基配列毎に集計する。このことで、そ
の類似性の高い非固有配列部分３３を消去した残りの配
列部分が、フィルタリングされた固有部分配列（また
は、相違部分配列）として出力されることになる（図に
３４で示す部分）。図３は、このようにしてフィルタリ
ングされた結果である。このような類似判別後の塩基配
列が、前記類似性判別結果１３としてデータ記憶部８内
に格納される。

【００４８】二本鎖結合温度条件フィルタ部２２は、前
記類似性判別結果１３として得られた核酸塩基配列か
ら、指定された二本鎖結合温度条件に入る長さのオリゴ
核酸配列を決定する機能を奏する。

【００４９】この二本鎖結合温度条件フィルタ部２２
は、図１に示すように、始点設定処理部３５と、長さ設
定部３６と、二本鎖結合温度算出部３７と、候補オリゴ
核酸配列決定部３８とからなる。

【００５０】二本鎖結合温度算出部３７は、前記始点設
定部３５で設定された始点から始まり前記長さ設定部３
６で設定された長さを有するオリゴ塩基配列の二本鎖結
合温度の算出を実行する。二本鎖結合温度の算定方法と
して、例えば、３６塩基以下のものについては、Neares
t-Neighbor法(SantaLucia, J. Jr. Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 95, 1460-1465, 1998)を用い、３７塩基以上
のものについては、J.Sambrook, E. F. Fritsch, T, Mo
lecular Cloning, p11.46: a laboratory Manual, Cold
Spring Harbor Laboratory Press, 1989に記載された
方法を用いることが現時点では好ましい。しかし、他の
方法であっても当然構わない。

【００５１】前記候補オリゴ核酸配列決定部３８は、前
記二本鎖結合温度算出部３７が二本鎖結合温度を算出す
る度に、この算出結果を受取る。そして、前記オリゴ核
酸配列決定条件１１として入力した二本鎖結合温度範
囲、及び長さ範囲に入るオリゴ核酸配列を候補として出
力する。このような処理を、前記始点ずらし配列長さを
伸ばしながら行なうことで、所望の二本鎖結合温度条件
に入る様々な長さのオリゴ核酸塩基配列の候補が得られ
ることになる。

【００５２】以下、図４〜図６を用い、解析対象核酸塩
基配列のひとつと、それから温度を推定しながらオリゴ
核酸塩基配列の候補を取出す手順を詳細に説明する。

【００５３】図４は、この手順を示す模式図である。

【００５４】図中４１は、図３と同様の類似性判別結果
である。この類似性判別結果の配列中、先頭の固有配列
部分３４の中の先頭部位（ｎ＝１）から逐次配列を伸ば
しながら二本鎖結合温度を計算する。そして、あらかじ
め指定されている温度に入ったら、４２に示すようにオ
リゴ核酸塩基配列の候補として保存する。そして、上限
温度Ｔｍｕを超える点まで伸張しながら候補として残し
ていく。

【００５５】この例では図示を簡略化するため、前記条
件で設定した長さ１７よりも短いものを候補として表示
しているが、実際には、上記設定した長さを満たす塩基
配列が候補として残される。そして上限Ｔｍｕに達した
ら、先頭位置をひとつずらし、新たな先頭部位から逐次
配列を伸ばしながら二本鎖結合温度を同様に計算する。
このことにより、図に４３で示すように別の候補群が得
られる。

【００５６】なお、固有部分配列の部分３４が短く、固
有部分配列内では前記二本鎖結合温度を満たす長さの候
補が十分な数得られない場合には、スコアの小さい非固
有配列部分の塩基を徐々に加えて二本鎖結合温度条件を
満たす長さまで伸長し、得られたオリゴ核酸塩基配列の
低グレードの候補として表示する。具体的には、前記低
グレードしきい値１８を参照し、前記被固有領域の部分
がこのしきい値１８を超えるまで配列を伸ばし、超えた
ならば、先頭位置をずらすようにする。

【００５７】なお、候補として出力するオリゴ核酸塩基
配列の長さとしては、５０塩基長以上で、１００塩基以
内が望ましい。この実施形態では、特定の長さ、６０以
上で７０以下などの値をしきい値として与えることによ
って、対象とする解析対象核酸塩基配列以外のサンプル
は確率的にプローブにハイブリダイズを起こしずらくな
り、ノイズを減らすことができる。

【００５８】次に、図５のフローチャートを参照し、こ
のシステムによる実際の処理手順を説明する。

【００５９】以下の説明及びフローチャートにおいて、
各定数及び変数は以下のように定義されているものとす
る。

【００６０】ｎ…各塩基核酸塩基配列の先頭からの配列
番号（図４に示す１，２，３，４…） ｎｍ…各塩基核酸塩基配列の最終塩基番号 ＰＲ（ｎ）…固有配列部分の場合＝１；非固有配列部分
の場合＝０ ｉｐ…二本鎖結合温度を求めるオリゴ核酸配列の先頭位
置 ｅｐ…二本鎖結合温度を求めるオリゴ核酸配列の最終位
置 Ｔｍ（ｉｐ，ｅｐ）…先頭位置ｉｐと終了位置ｅｐとの
間の配列の二本鎖結合温度 Ｔｍｕ…二本鎖結合温度の上限値 Ｔｍｌ…二本鎖結合温度の下限値 Ｌｓ…配列長さの下限値 Ｌｌ…配列長さの上限値 Ｌｎ…低グレードしきい値（固有配列部分に対する許容
非固有領域長さの割合）

【００６１】まず、工程Ｓ１で、ｎ＝１からｎ＝ｎｍま
でスキャンしながら順次ＰＲ値を設定していく。このこ
とで、解析対象配列の各塩基について、それが固有部分
配列領域に存在するならばＰＲ（ｎ）＝１（図２の白抜
き部分３４）、非固有部分配列領域に存在するならばＰ
Ｒ（ｎ）＝０（図２の黒塗りの部分３３）が設定されて
いく。

【００６２】次に、工程Ｓ２で、先頭位置番号ｉｐと終
了位置番号ｅｐの初期値として、ｉｐ＝１、ｅｐ＝１を
設定する。次の工程Ｓ３では、終了位置番号が対象核酸
塩基配列の最終塩基番号ｎｍに達しているかが判断され
達していない場合には、次の工程Ｓ４でｉｐとｅｐ間の
部分配列の長さが前記配列長さの上限値Ｌｌを超えてい
るかが判断される。

【００６３】超えている場合には先頭位置をずらす工程
Ｓ１２（後で説明する）に移行し、超えていない場合に
は、工程Ｓ５で、前記低グレードしきい値Ｌｎに基づ
き、ｉｐとｅｐ間の配列の中の固有配列部分と非固有部
分配列の比がＬｎよりも大きいかがチェックされる。こ
の例では、Ｌｎは５０％である。したがって、ｉｐとｅ
ｐ間の配列において、ＰＲ（ｎ）＝１を有する塩基の数
の、ＰＲ（ｎ）＝０を有する塩基の数に対する比が５０
％よりも大きいかをチェックする。

【００６４】もし大きければ、先頭位置をずらす工程Ｓ
１２に進み、小さければ二本鎖結合温度を求める工程Ｓ
６に進む。工程Ｓ６では、ｉｐとｅｐ間の配列の二本鎖
結合温度Ｔｍ（ｉｐ，ｅｐ）値を計算して、工程Ｓ７に
進む。工程Ｓ７においては、Ｔｍ（ｉｐ，ｅｐ）値が二
本鎖結合温度の上限値Ｔｍｕよりも大きいかを判断す
る。もし大きければ、この配列を候補として残すことを
せず前記先頭をずらすための工程Ｓ１２に進み、小さけ
れば次の工程Ｓ８に進む。一般に、配列がより長ければ
Ｔｍ値はより高くなるため、Ｔｍ（ｉｐ，ｅｐ）値がＴ
ｍｕよりも高いときには、これ以上部分塩基配列を伸ば
しても意味のないためである。

【００６５】次に、工程Ｓ８において、Ｔｍ（ｉｐ，ｅ
ｐ）値がＴｍｌよりも高いかをチェックする。高けれ
ば、この配列の二本鎖結合温度は上限値Ｔｍｕと下限値
Ｔｍｌの間に入っていると判断され、次の工程Ｓ９に進
む。この工程Ｓ９では、この配列の長さが下限値Ｌｓを
上回っているかが判断され、上回っている場合には、こ
の配列（ｉｐ、ｅｐ）は候補オリゴ核酸配列と決定され
前記データ記憶部８に格納される。また、この候補オリ
ゴ核酸配列の一部に非固有配列部分が含まれる場合には
（工程Ｓ５の比が１以上の場合）、当該配列には低グレ
ードのフラグが立てられた状態で保存される。

【００６６】工程Ｓ８で二本鎖結合温度が下限値よりも
低いと判断され、若しくは工程Ｓ９配列長さが短いと判
断された場合には、工程Ｓ１１に進んで、前記最終位置
番号を一つ増やす（ｅｐ＝ｅｐ＋１）。そして、前記工
程Ｓ３〜Ｓ１０を繰り返す。ここで、前記二本鎖結合温
度Ｔｍ（ｉｐ、ｅｐ）の計算は、一般に前回の計算結果
Ｔｍ（ｉｐ、ｅｐ−１）を利用することで積み上げ的に
かつ高速に行える。

【００６７】このような工程を繰り返すことで、上記始
点を基点とする様々な長さの塩基配列が候補として保存
されていくことになる。

【００６８】一方、前記工程Ｓ４、Ｓ５及びＳ７で条件
外と判断された場合には、工程Ｓ１２で先頭位置をずら
す処理を行う。このため、Ｓ１２では、（１）先頭位置
を一つシフトし、ここでは先頭位置番号ｉｐを一つ増や
す（ｉｐ＝ｉｐ＋１）、（２）終了位置番号ｅｐをこの
先頭位置番号ｉｐに合わせる（ｅｐ＝ｉｐ）。このこと
で、先頭位置がずらされ長さもリセットされる。そし
て、上記工程Ｓ３〜Ｓ１０を繰り返すことで、先頭位置
をずらしたオリゴ核酸配列が候補として逐次出力されて
いくことになる。

【００６９】なお、先頭位置が非固有領域３３に入った
場合には、前記工程Ｓ５でＬｎが１００％と判断される
から、この非固有領域を抜けるまで上記二本鎖結合温度
は計算されないことになる。このことで、非固有領域は
スキップされることになる。つまり、非固有部分配列領
域を飛ばしながら、二本鎖結合温度がＴｍｌとＴｍｕの
間にあるような部分塩基配列だけを記憶保存していくこ
とができる。

【００７０】そして、先頭位置ｉｐがこの解析対象核酸
塩基配列の最終位置ｎｍにまで移動したならば、前記工
程Ｓ３でこのことが検知され、全ての工程が終了する。

【００７１】このような処理によれば、二本鎖結合温度
を基準とし、オリゴ核酸塩基配列の長さを可変にして候
補を決定していくことができるから、二本鎖結合温度を
より狭い範囲に入るように設計する場合でも多数のオリ
ゴ核酸配列を得ることができる。

【００７２】このようにして得られたオリゴ核酸塩基配
列の候補は、前記データ記憶部８から、オリゴ核酸塩基
配列決定結果表示部２３によって取り出され、ディスプ
レイ（出力機器４）上に表示される。

【００７３】この設計結果は、基本的に、各解析対象核
酸塩基配列毎に表示されるが、必要であれば、たとえ
ば、オリゴ核酸塩基配列の長さ別にソート（分類）した
り、２次構造のとりやすさを評価し、２次構造のとりに
くいものを優先的に表示することが望ましい。

【００７４】図６は、本実施例で決定したオリゴ核酸塩
基配列を実装したオリゴ核酸アレイ７１である。このオ
リゴ核酸アレイ７１は、ポリLリジン７２をコートして
なるガラス基板７３上に、スポット装置を使用して上記
オリゴ核酸塩基配列の候補から絞られた配列を所定の区
画７４にそれぞれ実装してなるものである。このような
オリゴ核酸アレイ７１によれば、それぞれの区画７４ご
とにオリゴ核酸塩基配列の長さが異なっているが、それ
ぞれのスポットが適正な二本鎖結合温度範囲に入ってい
るため、ミスハイブリダイゼーションのない非常に使い
やすく安定した結果を得ることができる。

【００７５】なお、この実施形態ではガラス基板７３上
にオリゴ核酸塩基配列を実装する例を示したが、基板は
ガラス以外の樹脂などを利用することも可能である。ま
た、メンブレンにスポットしたアレイや、各オリゴ核酸
塩基配列が個別のエリアに存在するように区画化された
領域に埋め込まれた２次元状のアレイであれば、同様の
効果を得ることが可能である。

【００７６】また、この発明は上述した一実施形態に限
定されるものではなく、発明の要旨を変更しない範囲で
種々変形可能である。例えば、上記一実施形態では、二
本鎖結合温度を求める前に、ステップＳ５を実行するこ
とで非固有領域をスキップしていたがこの方法に限定さ
れるものではない。すなわち、この方法では、候補オリ
ゴ核酸塩基配列の先頭は常に固有配列部分になるが、非
固有部分から開始されるものであっても良い。このた
め、例えば図７に示すように前記ステップＳ５を前記一
実施形態のステップＳ９の後に実行するようにしても良
い。このような構成によれば、先頭の塩基が固有配列部
分であるか非固有配列部分であるかを問わず、配列全体
として、固有配列部分と非固有部分配列の比がＬｎ（例
えば５０％）よりも小さければ候補として保存されるこ
とになる。なお、このようにして一部に非固有配列部分
を含む候補は低グレードの候補として出力されることに
なる（ステップＳ１０）。このようにすることで、条件
を満たす候補の数をできるだけ増やすことが可能にな
る。

【００７７】

【発明の効果】以上、説明したように本発明によれば、
二本鎖結合温度若しくは融解温度（Ｔｍ）値に関して高
い精度を有するオリゴ核酸配列を一度に多数決定するこ
とができるシステム及び方法を得ることができる。

【００７８】また、このようにして得られたオリゴ核酸
配列を実装してなるオリゴ核酸アレイを得ることができ
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】この発明の一実施形態を示すシステム構成図。

【図２】解析対象核酸塩基配列を示す模式図

【図３】解析対象塩基配列から候補オリゴ核酸配列を決
定する手順を説明するための模式図。

【図４】オリゴ核酸配列決定条件を入力するための入力
画面を示す図。

【図５】オリゴ核酸配列決定手順を説明するためのフロ
ーチャート。

【図６】この実施形態により得られたオリゴ核酸アレイ
を示す正面図。

【図７】他の実施形態に係るオリゴ核酸配列決定手順を
説明するためのフローチャート。

【符号の説明】

１…ＣＰＵ ２…ＲＡＭ ３…入力機器 ４…出力機器 ５…モデム ７…バス ８…データ記憶部 ９…プログラム記憶部 １１…オリゴ核酸配列決定条件 １２…解析対象核酸塩基配列ファイル １３…類似性判別結果 １４…オリゴ核酸配列候補 １９…外部データベース ２０…オリゴ核酸塩基配列決定条件入力部 ２１…固有部分配列フィルタ部 ２２…二本鎖結合温度条件フィルタ部 ２３…オリゴ核酸塩基配列決定結果表示部 ２６…入力ボックス ３３…始点設定部 ３４…長さ設定部 ３５…二本鎖結合温度算出部 ３６…候補オリゴ核酸配列決定部 ７１…オリゴ核酸アレイ ７３…ガラス基板 ７４…区画

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０６Ｆ 17/50 ６３８ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｆ (72)発明者 青木 良晃 千葉県茂原市茂原643番地 株式会社ダイ ナコム内 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 CA01 CA11 HA11 4B029 AA07 BB20 CC03 FA15 5B046 AA00 5B075 ND20 QS20 UU19 (54)【発明の名称】 コンピュータを利用して解析対象核酸塩基配列から最適なオリゴ核酸配列の候補を設計するため のコンピュータソフトウエアプログラム、その方法およびそのように設計されたオリゴ核酸配列 が搭載されたオリゴ核酸アレイ

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 コンピュータを利用して、解析対象核酸
   塩基配列から最適なオリゴ核酸配列の候補を設計するた
   めのコンピュータソフトウエアプログラムであって、 前記コンピュータに、二本鎖結合温度の許容範囲の指定
   を受け付けて記憶させる第１の指令と、 前記コンピュータに、前記解析対象核酸塩基配列の中
   で、部分配列の長さを伸ばしながら各長さでの二本鎖結
   合温度を算出させる第２の指令と、 前記コンピュータに、上記手段で算出した二本鎖結合温
   度が前記指定手段で指定された許容範囲に入るかを判断
   させ、入る場合には当該長さの部分配列を候補オリゴ核
   酸配列として出力させる第３の指令と、 を有することを特徴とするプログラム。
2. 【請求項２】 請求項１記載のプログラムにおいて、 前記第２の指令は、前記解析析対象核酸配列中で二本鎖
   結合温度を求める部分配列の始点を順次ずらし、ずらし
   た始点から部分配列の長さを伸ばすものであることを特
   徴とするプログラム。
3. 【請求項３】 請求項２記載のプログラムにおいて、 前記第２の指令は、部分配列の二本鎖結合温度が前記第
   ３の指令で許容範囲から外れると判断された場合に、そ
   れ以上長さを伸ばすことをせずに始点を次にずらすもの
   であることを特徴とするプログラム。
4. 【請求項４】 請求項１記載のプログラムにおいて、 このプログラムはさらに、 前記コンピュータに、前記第３の指令によって出力され
   た複数の候補オリゴ核酸配列を表示させる第４の指令を
   有することを特徴とするプログラム。
5. 【請求項５】 請求項１記載のプログラムにおいて、 このプログラムはさらに、 前記コンピュータに、複数の解析対象核酸配列同士の相
   同を比較して、各解析対象核酸配列に固有の配列部分と
   非固有な配列部分とを識別させる第５の指令を有し、 前記第２の指令は、前記解析析対象核酸配列中で二本鎖
   結合温度を求める部分配列の始点を順次ずらし、ずらし
   た始点から部分配列の長さを伸ばすものであることを特
   徴とするプログラム。
6. 【請求項６】 請求項５記載のプログラムにおいて、 前記第２の指令は、前記第３の指令で前記部分配列の二
   本鎖結合温度が許容範囲から外れると判断された場合
   に、それ以上長さを伸ばすことをせずに始点を次にずら
   すものであることを特徴とするプログラム。
7. 【請求項７】 請求項５記載のプログラムにおいて、 前記第２の指令は、長さを伸ばした部分配列が前記非固
   有の配列部分を含む場合に前記コンピュータに当該部分
   配列の二本鎖結合温度を算出するか若しくは候補オリゴ
   核酸配列とするかを判断させる第６の指令をさらに含
   み、前記第２の指令は、この第６の指令により二本鎖結
   合温度を算出しない若しくは候補オリゴ核酸配列としな
   いと判断された場合に前記部分配列の始点を次の固有の
   配列部分の先頭にずらすものであることを特徴とするプ
   ログラム。
8. 【請求項８】 請求項７記載のプログラムにおいて、 前記第６の指令は、コンピュータに、前記長さを伸ばし
   た部分配列に含まれる固有の配列部分と非固有の配列部
   分の比若しくは夫々の配列数に基づいて当該部分配列の
   二本鎖結合温度を算出するか若しくは候補オリゴ核酸配
   列とするかを判断させるものであることを特徴とするプ
   ログラム。
9. 【請求項９】 請求項７記載のプログラムにおいて、 前記第４の指令は、二本鎖結合温度許容範囲に入る部分
   配列に前記非固有の配列部分が含まれている場合、その
   部分配列を低グレードの候補オリゴ核酸配列として出力
   するものであることを特徴とするプログラム。
10. 【請求項１０】 請求項５記載のプログラムにおいて、 前記第２の指令は、各固有の配列部分から二本鎖結合温
    度に達する長さの部分配列が得られない場合、この部分
    配列の長さを非固有の配列部分まで伸ばし、二本鎖結合
    温度の許容値に入る部分配列を低グレードの候補オリゴ
    核酸配列として出力するものであることを特徴とするプ
    ログラム。
11. 【請求項１１】 解析対象核酸塩基配列から最適なオリ
    ゴ核酸配列の候補を設計するための方法であって、
    （ａ） 二本鎖結合温度の許容範囲を指定する工程と、
    （ｂ） 前記解析対象核酸塩基配列の中で、部分配列の
    長さを伸ばしながらその長さでの二本鎖結合温度を算出
    する工程と、（ｃ） 上記手段で算出した二本鎖結合温
    度が前記指定手段で指定された許容範囲に入るかを判断
    し、入る場合には当該長さの部分配列を候補オリゴ核酸
    配列として出力する工程とを有することを特徴とする方
    法。
12. 【請求項１２】 請求項１１に記載された方法におい
    て、（ｂ）工程は、前記解析対象核酸配列中で二本鎖結
    合温度を求める部分配列の始点を順次ずらし、ずらした
    始点から部分配列の長さを伸ばすものであることを特徴
    とする方法。
13. 【請求項１３】 複数のオリゴ核酸を分布させて実装し
    てなるオリゴ核酸アレイであって、前記オリゴ核酸アレ
    イは、所定の二本鎖結合温度を有するように設計されて
    なる配列長さを有するものであることを特徴とするオリ
    ゴ核酸アレイ。