JP2003102470A - 舌上皮前駆細胞の単離培養方法およびその分化誘導方法 - Google Patents
舌上皮前駆細胞の単離培養方法およびその分化誘導方法Info
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- JP2003102470A JP2003102470A JP2002216303A JP2002216303A JP2003102470A JP 2003102470 A JP2003102470 A JP 2003102470A JP 2002216303 A JP2002216303 A JP 2002216303A JP 2002216303 A JP2002216303 A JP 2002216303A JP 2003102470 A JP2003102470 A JP 2003102470A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 舌の上皮細胞から該前駆細胞を効率良く単離
する方法並びに単離した該細胞を培養して長期生存細胞
を得る方法を提供すると共に、該細胞を上皮細胞様もし
くは神経細胞様に分化誘導する方法を提供すること。 【解決手段】 舌上皮細胞よりインテグリンβ１を発現
する細胞を、磁気カラムを用いて選抜することを特徴と
する舌上皮前駆細胞の単離方法並びに該方法によって単
離した舌上皮前駆細胞を培養して得た培養上清の存在下
に、味細胞前駆細胞を含む舌上皮前駆細胞を培養するこ
とを特徴とする味細胞前駆細胞の増殖方法、さらにはこ
の細胞を分化誘導因子を添加した培地で培養して上皮細
胞様もしくは神経細胞様へ分化させる方法。
する方法並びに単離した該細胞を培養して長期生存細胞
を得る方法を提供すると共に、該細胞を上皮細胞様もし
くは神経細胞様に分化誘導する方法を提供すること。 【解決手段】 舌上皮細胞よりインテグリンβ１を発現
する細胞を、磁気カラムを用いて選抜することを特徴と
する舌上皮前駆細胞の単離方法並びに該方法によって単
離した舌上皮前駆細胞を培養して得た培養上清の存在下
に、味細胞前駆細胞を含む舌上皮前駆細胞を培養するこ
とを特徴とする味細胞前駆細胞の増殖方法、さらにはこ
の細胞を分化誘導因子を添加した培地で培養して上皮細
胞様もしくは神経細胞様へ分化させる方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、舌上皮前駆細胞の
単離方法およびその分化誘導方法に関し、詳しくは舌上
皮細胞より舌上皮前駆細胞を単離と培養する方法並びに
該前駆細胞を上皮様細胞または神経様細胞に分化誘導す
る方法に関する。
単離方法およびその分化誘導方法に関し、詳しくは舌上
皮細胞より舌上皮前駆細胞を単離と培養する方法並びに
該前駆細胞を上皮様細胞または神経様細胞に分化誘導す
る方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】上皮細胞は、体の表面あるいは内腔の内
面を覆っている組織であり、様々な種類の細胞の存在が
知られており、例えば皮膚の表皮、腸の粘膜上皮や腹膜
の上皮等がある。このうち、皮膚や小腸等の上皮につい
ては、該上皮前駆細胞や長期生存細胞を単離し、さらに
培養したことが報告されている（Kunimura C. ら、Onco
gene (1998) 17, 187-197)。一方、表皮や上皮組織で
は、低親和性神経成長因子受容体やインテグリンβ４が
特異的に発現している長期生存細胞が発見され、これら
を指標として長期生存細胞を単離する方法が提案されて
いる（特開２０００−４９００号公報）。
面を覆っている組織であり、様々な種類の細胞の存在が
知られており、例えば皮膚の表皮、腸の粘膜上皮や腹膜
の上皮等がある。このうち、皮膚や小腸等の上皮につい
ては、該上皮前駆細胞や長期生存細胞を単離し、さらに
培養したことが報告されている（Kunimura C. ら、Onco
gene (1998) 17, 187-197)。一方、表皮や上皮組織で
は、低親和性神経成長因子受容体やインテグリンβ４が
特異的に発現している長期生存細胞が発見され、これら
を指標として長期生存細胞を単離する方法が提案されて
いる（特開２０００−４９００号公報）。
【０００３】しかし、舌上皮細胞に関しては、舌の味細
胞の培養方法についての報告があるが、僅か３日程度し
か味細胞様の形態を維持できないことが知られている
（AnnNY Acad. Sci. 1998, Nov. 30; 855: 1-13）。ま
た、胎児舌の器官培養においても、７日間程度しか舌の
形状を保つことができず、培養は非常に困難であること
が知られている。舌上皮前駆細胞については、単離して
培養したという報告は全くなく、長期生存細胞も同定さ
れていない。
胞の培養方法についての報告があるが、僅か３日程度し
か味細胞様の形態を維持できないことが知られている
（AnnNY Acad. Sci. 1998, Nov. 30; 855: 1-13）。ま
た、胎児舌の器官培養においても、７日間程度しか舌の
形状を保つことができず、培養は非常に困難であること
が知られている。舌上皮前駆細胞については、単離して
培養したという報告は全くなく、長期生存細胞も同定さ
れていない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】舌上皮細胞において
は、長期生存細胞やインテグリンβ１を発現する上皮前
駆細胞を培養することは困難であった。その理由は、舌
上皮の上皮前駆細胞の細胞数が少なく、同定が困難であ
ったこと、舌上皮を筋肉層から効率よく剥離し、その後
舌上皮から舌上皮前駆細胞を効率よく単離することが難
しいこと、さらに該前駆細胞を舌の上皮細胞および味細
胞へ分化させる方法とそのことを確認する方法が確立さ
れていないからであった。本発明の目的は、第１に舌上
皮細胞から該前駆細胞を単離・培養する方法を確立する
ことであり、第２に該前駆細胞を上皮様細胞または神経
様細胞に分化誘導する方法を確立することである。
は、長期生存細胞やインテグリンβ１を発現する上皮前
駆細胞を培養することは困難であった。その理由は、舌
上皮の上皮前駆細胞の細胞数が少なく、同定が困難であ
ったこと、舌上皮を筋肉層から効率よく剥離し、その後
舌上皮から舌上皮前駆細胞を効率よく単離することが難
しいこと、さらに該前駆細胞を舌の上皮細胞および味細
胞へ分化させる方法とそのことを確認する方法が確立さ
れていないからであった。本発明の目的は、第１に舌上
皮細胞から該前駆細胞を単離・培養する方法を確立する
ことであり、第２に該前駆細胞を上皮様細胞または神経
様細胞に分化誘導する方法を確立することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の課
題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、インテグリンβ
１を発現する舌上皮前駆細胞を効率良く単離する方法を
確立することに成功した。さらに、該舌上皮前駆細胞を
培養するにあたり、舌上皮前駆細胞の培養上清を存在さ
せると、味細胞の前駆細胞が多く含まれる部位からの舌
上皮前駆細胞を増殖させることができ、この培養物から
該味細胞前駆細胞を取得できることを見出した。このよ
うにして得られた味細胞前駆細胞を含む舌上皮前駆細胞
を、分化誘導因子加えた培地で培養すると、舌上皮に存
在する上皮様細胞もしくは味細胞を含む神経様細胞に分
化誘導させることができることも判明した。本発明は、
これらの知見に基づいて完成されたものである。
題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、インテグリンβ
１を発現する舌上皮前駆細胞を効率良く単離する方法を
確立することに成功した。さらに、該舌上皮前駆細胞を
培養するにあたり、舌上皮前駆細胞の培養上清を存在さ
せると、味細胞の前駆細胞が多く含まれる部位からの舌
上皮前駆細胞を増殖させることができ、この培養物から
該味細胞前駆細胞を取得できることを見出した。このよ
うにして得られた味細胞前駆細胞を含む舌上皮前駆細胞
を、分化誘導因子加えた培地で培養すると、舌上皮に存
在する上皮様細胞もしくは味細胞を含む神経様細胞に分
化誘導させることができることも判明した。本発明は、
これらの知見に基づいて完成されたものである。
【０００６】請求項１記載の本発明は、舌上皮細胞より
インテグリンβ１を発現する細胞を、磁気カラムを用い
て選抜することを特徴とする舌上皮前駆細胞の単離方法
である。請求項２記載の本発明は、請求項１記載の方法
によって単離した舌上皮前駆細胞を培養して得られた培
養上清の存在下に、味細胞前駆細胞を含む舌上皮前駆細
胞を培養することを特徴とする味細胞前駆細胞を含む舌
上皮前駆細胞の増殖方法である。請求項３記載の本発明
は、請求項２記載の方法により取得した味細胞前駆細胞
を含む舌上皮前駆細胞を、分化誘導因子としてカルシウ
ムを加えた培地で培養し、上皮様細胞に分化させること
を特徴とする分化誘導方法である。請求項４記載の本発
明は、請求項２記載の方法により取得した味細胞前駆細
胞を含む舌上皮前駆細胞を、分化誘導因子としてレチノ
イン酸を加えた培地で培養し、神経様細胞に分化させる
ことを特徴とする分化誘導方法である。
インテグリンβ１を発現する細胞を、磁気カラムを用い
て選抜することを特徴とする舌上皮前駆細胞の単離方法
である。請求項２記載の本発明は、請求項１記載の方法
によって単離した舌上皮前駆細胞を培養して得られた培
養上清の存在下に、味細胞前駆細胞を含む舌上皮前駆細
胞を培養することを特徴とする味細胞前駆細胞を含む舌
上皮前駆細胞の増殖方法である。請求項３記載の本発明
は、請求項２記載の方法により取得した味細胞前駆細胞
を含む舌上皮前駆細胞を、分化誘導因子としてカルシウ
ムを加えた培地で培養し、上皮様細胞に分化させること
を特徴とする分化誘導方法である。請求項４記載の本発
明は、請求項２記載の方法により取得した味細胞前駆細
胞を含む舌上皮前駆細胞を、分化誘導因子としてレチノ
イン酸を加えた培地で培養し、神経様細胞に分化させる
ことを特徴とする分化誘導方法である。
【０００７】
【発明の実施の形態】請求項１記載の本発明は、上記し
たように、舌上皮細胞よりインテグリンβ１を発現する
細胞を、磁気カラムを用いて選抜することによって、舌
上皮前駆細胞を単離する方法である。本発明の方法を適
用することができる舌上皮細胞には特に制限がなく、例
えばマウス、ラット、ブタ、ヒトをはじめとするあらゆ
る哺乳動物由来の細胞が挙げられる。本発明に用いる舌
上皮細胞としては、幹細胞およびtransit amplifying細
胞を含むものが好ましい。これらの細胞を維持するため
の条件を採用することによって、舌上皮前駆細胞の培養
系樹立が可能となる。
たように、舌上皮細胞よりインテグリンβ１を発現する
細胞を、磁気カラムを用いて選抜することによって、舌
上皮前駆細胞を単離する方法である。本発明の方法を適
用することができる舌上皮細胞には特に制限がなく、例
えばマウス、ラット、ブタ、ヒトをはじめとするあらゆ
る哺乳動物由来の細胞が挙げられる。本発明に用いる舌
上皮細胞としては、幹細胞およびtransit amplifying細
胞を含むものが好ましい。これらの細胞を維持するため
の条件を採用することによって、舌上皮前駆細胞の培養
系樹立が可能となる。
【０００８】舌上皮前駆細胞の単離方法について、マウ
ス舌上皮前駆細胞の場合を例として詳しく説明する。ま
ず、マウスから舌を採取し、該舌から舌上皮細胞シート
を調製する。本発明の方法においては、舌上皮細胞シー
ト全体または有郭乳頭付近等の特定の部分を用いること
もできる。調製した舌上皮細胞シートから、上皮前駆細
胞集団を分離するために、プロテアーゼを上皮直下に注
射器で注入し、３０〜４０℃、好ましくは３７℃で１５
〜４５分間、好ましくは３０分間程反応させることによ
って、筋肉に富んだ層から上皮層を分離させる。
ス舌上皮前駆細胞の場合を例として詳しく説明する。ま
ず、マウスから舌を採取し、該舌から舌上皮細胞シート
を調製する。本発明の方法においては、舌上皮細胞シー
ト全体または有郭乳頭付近等の特定の部分を用いること
もできる。調製した舌上皮細胞シートから、上皮前駆細
胞集団を分離するために、プロテアーゼを上皮直下に注
射器で注入し、３０〜４０℃、好ましくは３７℃で１５
〜４５分間、好ましくは３０分間程反応させることによ
って、筋肉に富んだ層から上皮層を分離させる。
【０００９】このとき用いるプロテアーゼとしては、通
常の組織培養に用いられるものであれば特に制限はない
が、コラゲナーゼ、トリプシン、エラスターゼ等が好ま
しいものであり、これらの中から１種もしくは２種以上
を適宜選択して用いることができる。中でも、基底膜に
存在するコラーゲンタイプIVを分解するコラゲナーゼで
あるコラゲナーゼIV（フナコシ社製）およびエラスチン
を分解するエラスターゼ（フナコシ社製）を組み合わせ
ることが好ましい。プロテアーゼの使用量は、５〜３０
ｕｎｉｔｓ（２〜４ｍｇ）、好ましくは８〜１０ｕｎｉ
ｔｓ（２〜３ｍｇ）である。なお、プロテアーゼとし
て、コラゲナーゼIVおよびエラスターゼを用いた場合の
使用量の１例を示すと、コラゲナーゼIVは１０ｕｎｉｔ
ｓ（２．５ｍｇ）、エラスターゼは８ｕｎｉｔｓ（２ｍ
ｇ）である。
常の組織培養に用いられるものであれば特に制限はない
が、コラゲナーゼ、トリプシン、エラスターゼ等が好ま
しいものであり、これらの中から１種もしくは２種以上
を適宜選択して用いることができる。中でも、基底膜に
存在するコラーゲンタイプIVを分解するコラゲナーゼで
あるコラゲナーゼIV（フナコシ社製）およびエラスチン
を分解するエラスターゼ（フナコシ社製）を組み合わせ
ることが好ましい。プロテアーゼの使用量は、５〜３０
ｕｎｉｔｓ（２〜４ｍｇ）、好ましくは８〜１０ｕｎｉ
ｔｓ（２〜３ｍｇ）である。なお、プロテアーゼとし
て、コラゲナーゼIVおよびエラスターゼを用いた場合の
使用量の１例を示すと、コラゲナーゼIVは１０ｕｎｉｔ
ｓ（２．５ｍｇ）、エラスターゼは８ｕｎｉｔｓ（２ｍ
ｇ）である。
【００１０】プロテアーゼ処理によって筋層から分離し
た舌上皮層がよりピンセット等の器具を用いて上皮をシ
ート状に剥がし、メス刃で細かく裁断する。上皮を裁断
後、細胞を分散させるために、再度プロテアーゼ処理を
する。このプロテーゼ処理は、プロテアーゼの溶解した
酵素液に裁断した上皮細胞を浸漬し、３５〜４０℃、好
ましくは３７℃で１０〜２０分間、好ましくは１５分間
反応させることによって、細胞塊を１個ずつの細胞に分
散させる。このとき用いるプロテアーゼとしては、通常
の組織培養に用いられるものであれば特に制限はない
が、好適にはディスパーゼ等を用いることができる。デ
ィスパーゼの使用量は、９００〜１０５０ｕｎｉｔｓ
（３．０〜３．５ｍｇ）、好ましくは１０００ｕｎｉｔ
ｓ（３．３ｍｇ）である。
た舌上皮層がよりピンセット等の器具を用いて上皮をシ
ート状に剥がし、メス刃で細かく裁断する。上皮を裁断
後、細胞を分散させるために、再度プロテアーゼ処理を
する。このプロテーゼ処理は、プロテアーゼの溶解した
酵素液に裁断した上皮細胞を浸漬し、３５〜４０℃、好
ましくは３７℃で１０〜２０分間、好ましくは１５分間
反応させることによって、細胞塊を１個ずつの細胞に分
散させる。このとき用いるプロテアーゼとしては、通常
の組織培養に用いられるものであれば特に制限はない
が、好適にはディスパーゼ等を用いることができる。デ
ィスパーゼの使用量は、９００〜１０５０ｕｎｉｔｓ
（３．０〜３．５ｍｇ）、好ましくは１０００ｕｎｉｔ
ｓ（３．３ｍｇ）である。
【００１１】続いて、剥がれて分散した１個ずつの上皮
細胞を回収する。回収の方法は、常法によればよく、例
えばピペッティングをして７０μｍ幅のセルストレイナ
ーによって回収する。このようにして回収した舌上皮細
胞は、氷冷したＰＢＳ（−）で数回、通常は３回リンス
し、０．５〜２．０×１０6 ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、好まし
くは１．０×１０6 ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるようにＰＢ
Ｓ（−）に懸濁する。この懸濁液に、１〜５μｇ／ｍ
ｌ、好ましくは４μｇ／ｍｌの濃度となるように一次抗
体であるビオチン標識抗インテグリンβ１抗体を加え、
一定の振盪を与えながら舌上皮細胞と抗体とを２〜１０
℃、好ましくは４℃で２０〜４０分間、好ましくは３０
分間反応させる。
細胞を回収する。回収の方法は、常法によればよく、例
えばピペッティングをして７０μｍ幅のセルストレイナ
ーによって回収する。このようにして回収した舌上皮細
胞は、氷冷したＰＢＳ（−）で数回、通常は３回リンス
し、０．５〜２．０×１０6 ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、好まし
くは１．０×１０6 ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるようにＰＢ
Ｓ（−）に懸濁する。この懸濁液に、１〜５μｇ／ｍ
ｌ、好ましくは４μｇ／ｍｌの濃度となるように一次抗
体であるビオチン標識抗インテグリンβ１抗体を加え、
一定の振盪を与えながら舌上皮細胞と抗体とを２〜１０
℃、好ましくは４℃で２０〜４０分間、好ましくは３０
分間反応させる。
【００１２】次に、一次抗体と反応させた舌上皮細胞を
ＰＢＳ（−）で数回、通常は３回洗浄し、これを再度Ｐ
ＢＳ（−）に懸濁し、舌上皮前駆細胞を含む舌上皮細胞
懸濁液を得ることができる。該懸濁液に、磁気ビーズ１
０〜２０μｌ、好ましくは２０μｌを加え、６〜１２
℃、好ましくは１０℃で１０〜２０分間、好ましくは１
５分間反応させる。このとき用いる磁気ビーズは、抗体
等を考慮して適宜選択することができるが、選択に要す
る時間の短縮のため、ストレプトアビジン−マイクロビ
ーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社製）が好ましいものである。
反応終了後、磁気ビーズの結合した舌上皮前駆細胞をＰ
ＢＳ（−）で数回、通常は３回洗浄した後、磁気細胞分
離システム、すなわちバリオＭａｃｓ磁気装置（Ｍｉｌ
ｔｅｎｙｉ社製）にＲＳ＋カラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社
製）を装着したものに、該細胞をロードする。該細胞を
ロードしたカラムをＰＢＳ（−）で数回、通常は３回洗
浄した後、カラムを磁気装置から離し、抗体でトラップ
された舌上皮前駆細胞をＰＢＳ（−）で溶出する。この
とき用いるＰＢＳ（−）の量は１〜１．５ｍｌ、好まし
くは１ｍｌが適当である。この溶出液には、インテグリ
ンβ１陽性細胞集団である舌上皮前駆細胞のみが含まれ
ていることになる。
ＰＢＳ（−）で数回、通常は３回洗浄し、これを再度Ｐ
ＢＳ（−）に懸濁し、舌上皮前駆細胞を含む舌上皮細胞
懸濁液を得ることができる。該懸濁液に、磁気ビーズ１
０〜２０μｌ、好ましくは２０μｌを加え、６〜１２
℃、好ましくは１０℃で１０〜２０分間、好ましくは１
５分間反応させる。このとき用いる磁気ビーズは、抗体
等を考慮して適宜選択することができるが、選択に要す
る時間の短縮のため、ストレプトアビジン−マイクロビ
ーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社製）が好ましいものである。
反応終了後、磁気ビーズの結合した舌上皮前駆細胞をＰ
ＢＳ（−）で数回、通常は３回洗浄した後、磁気細胞分
離システム、すなわちバリオＭａｃｓ磁気装置（Ｍｉｌ
ｔｅｎｙｉ社製）にＲＳ＋カラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社
製）を装着したものに、該細胞をロードする。該細胞を
ロードしたカラムをＰＢＳ（−）で数回、通常は３回洗
浄した後、カラムを磁気装置から離し、抗体でトラップ
された舌上皮前駆細胞をＰＢＳ（−）で溶出する。この
とき用いるＰＢＳ（−）の量は１〜１．５ｍｌ、好まし
くは１ｍｌが適当である。この溶出液には、インテグリ
ンβ１陽性細胞集団である舌上皮前駆細胞のみが含まれ
ていることになる。
【００１３】次に、上記手法によって単離した上皮前駆
細胞を培養する方法について説明する。まず、単離した
舌上皮前駆細胞を２〜１０×１０4 個、好ましくは５×
１０4個となるように調製し、これを下記の組成を有す
る培地（ＭＣＤＢ基本培地）２０〜１００μｌ、好まし
くは５０μｌに懸濁する。このとき用いる培地のカルシ
ウム濃度は３．０〜７．０ｍｇ／ｍｌが適当で、５．０
ｍｇ／ｍｌが好ましい。その懸濁液をドロップレットと
して、直径３ｃｍ程度の培養皿の上に設置し、炭酸ガス
インキュベーター内で１５〜１８０分間、好ましくは３
０分間の培養を行う。次いで、舌上皮前駆細胞の前培養
液に、さらに下記の組成を有する培地（ＭＣＤＢ基本培
地）１〜３ｍｌ、好ましくは２ｍｌを加え、３５〜３８
℃、好ましくは３７℃で１〜３週間、好ましくは２週間
の培養を行う。
細胞を培養する方法について説明する。まず、単離した
舌上皮前駆細胞を２〜１０×１０4 個、好ましくは５×
１０4個となるように調製し、これを下記の組成を有す
る培地（ＭＣＤＢ基本培地）２０〜１００μｌ、好まし
くは５０μｌに懸濁する。このとき用いる培地のカルシ
ウム濃度は３．０〜７．０ｍｇ／ｍｌが適当で、５．０
ｍｇ／ｍｌが好ましい。その懸濁液をドロップレットと
して、直径３ｃｍ程度の培養皿の上に設置し、炭酸ガス
インキュベーター内で１５〜１８０分間、好ましくは３
０分間の培養を行う。次いで、舌上皮前駆細胞の前培養
液に、さらに下記の組成を有する培地（ＭＣＤＢ基本培
地）１〜３ｍｌ、好ましくは２ｍｌを加え、３５〜３８
℃、好ましくは３７℃で１〜３週間、好ましくは２週間
の培養を行う。
【００１４】
培地：ＭＣＤＢ１５３基本培地（Ｃａ濃度は、５．０ｍｇ／ｍｌ）
上皮細胞成長因子 最終濃度 １０ｎｇ／ｍｌ
塩基性繊維芽細胞成長因子 最終濃度 １０ｎｇ／ｍｌ
インシュリン 最終濃度 ５μｇ／ｍｌ
トランスフェリン 最終濃度 １０μｇ／ｍｌ
ヒドロコルチゾン ０．５μｇ／ｍｌ
エタノールアミン ０．５μＭ
ホスホエタノールアミン ０．５μＭ
透析された牛胎児血清 最終濃度 ０．５％
【００１５】上記の培養によって取得した味細胞前駆細
胞を含む舌上皮前駆細胞を、適当な分化誘導因子を添加
した培地にて培養することによって、上皮様細胞あるい
は神経様細胞に分化誘導することができる。上記の舌上
皮前駆細胞を上皮様細胞に分化させる場合には、分化誘
導因子としてカルシウムを培地に添加する。すなわち、
上記の培地に、分化誘導因子としてカルシウムを０．１
〜２．０ｍＭ、好ましくは１ｍＭを添加し、さらに２〜
５日間、好ましくは３日間培養を続けることにより、上
皮様細胞に分化誘導させることができる。なお、カルシ
ウムの添加濃度が上限を超えた場合は、細胞死を誘導す
るため好ましくない。また、下限に満たない場合は、上
皮様細胞に分化できないため好ましくない。上皮様細胞
に分化させる場合に用いることができる培地の組成を、
以下に示す。
胞を含む舌上皮前駆細胞を、適当な分化誘導因子を添加
した培地にて培養することによって、上皮様細胞あるい
は神経様細胞に分化誘導することができる。上記の舌上
皮前駆細胞を上皮様細胞に分化させる場合には、分化誘
導因子としてカルシウムを培地に添加する。すなわち、
上記の培地に、分化誘導因子としてカルシウムを０．１
〜２．０ｍＭ、好ましくは１ｍＭを添加し、さらに２〜
５日間、好ましくは３日間培養を続けることにより、上
皮様細胞に分化誘導させることができる。なお、カルシ
ウムの添加濃度が上限を超えた場合は、細胞死を誘導す
るため好ましくない。また、下限に満たない場合は、上
皮様細胞に分化できないため好ましくない。上皮様細胞
に分化させる場合に用いることができる培地の組成を、
以下に示す。
【００１６】
（分化誘導因子としてカルシウムを添加する場合の培地）
培地：ＭＣＤＢ１５３高カルシウム培地（Ｃａ濃度は、１１．８ｍｇ／ｍｌ（０
．１４５ｍＭ））
上皮細胞成長因子 最終濃度 １０ｎｇ／ｍｌ
塩基性繊維芽細胞成長因子 最終濃度 １ｎｇ／ｍｌ
インシュリン 最終濃度 ５μｇ／ｍｌ
トランスフェリン 最終濃度 １０μｇ／ｍｌ
ヒドロコルチゾン ０．５μｇ／ｍｌ
エタノールアミン ０．５μＭ
ホスホエタノールアミン ０．５μＭ
透析された牛胎児血清 最終濃度 ０．５％
なお、カルシウムはＣａＣｌ2 の溶液として用いた。
【００１７】舌上皮前駆細胞が上皮様細胞へ分化したこ
との確認については、常法によって行うことができる
が、下記にその１例を示す。すわちち、０．１％トライ
トンＸ−１００等の界面活性剤と４％パラホルムアルデ
ヒドを含むＰＢＳ（−）で分化させた細胞を固定後、抗
β−カテニン抗体と抗Ｅ−カドヘリン抗体等の抗体を用
いて免疫染色することによって確認することができる。
β−カテニンは、細胞間の接着分子であるカドヘリンの
細胞内領域に結合するタンパク質である。Ｅ−カドヘリ
ンは、上皮細胞等に存在するカドヘリン・スーパーファ
ミリーに属する細胞接着因子であり、カルシウム依存的
にＥ−カドヘリン同士が結合することが知られている。
これらは、共に上皮細胞のマーカーとして用いられてい
るタンパク質である。
との確認については、常法によって行うことができる
が、下記にその１例を示す。すわちち、０．１％トライ
トンＸ−１００等の界面活性剤と４％パラホルムアルデ
ヒドを含むＰＢＳ（−）で分化させた細胞を固定後、抗
β−カテニン抗体と抗Ｅ−カドヘリン抗体等の抗体を用
いて免疫染色することによって確認することができる。
β−カテニンは、細胞間の接着分子であるカドヘリンの
細胞内領域に結合するタンパク質である。Ｅ−カドヘリ
ンは、上皮細胞等に存在するカドヘリン・スーパーファ
ミリーに属する細胞接着因子であり、カルシウム依存的
にＥ−カドヘリン同士が結合することが知られている。
これらは、共に上皮細胞のマーカーとして用いられてい
るタンパク質である。
【００１８】また、単離した舌上皮前駆細胞を神経様細
胞に分化させる場合には、培地に分化誘導因子としてレ
チノイン酸を添加する。すなわち、前記した培地に、分
化誘導因子としてレチノイン酸を１〜５μＭ、好ましく
は２μＭを添加して３日間培養し、さらにレチノイン酸
のみを抜いて３〜１４日間、好ましくは５〜１０日間培
養を続けることにより、神経様細胞に分化させることが
できる。レチノイン酸の添加濃度が上限を超えた場合
は、細胞死を誘導するため好ましくない。また、下限に
満たない場合は、分化が十分に行われないため好ましく
ない。さらに、舌上皮前駆細胞を単離する際に、舌上皮
細胞シートのうち味細胞前駆細胞が多く含まれている有
郭乳頭付近等の特定の部分を用いた場合には、味細胞等
に分化させることができる。神経様細胞に分化させる場
合に用いることができる培地の組成を、以下に示す。
胞に分化させる場合には、培地に分化誘導因子としてレ
チノイン酸を添加する。すなわち、前記した培地に、分
化誘導因子としてレチノイン酸を１〜５μＭ、好ましく
は２μＭを添加して３日間培養し、さらにレチノイン酸
のみを抜いて３〜１４日間、好ましくは５〜１０日間培
養を続けることにより、神経様細胞に分化させることが
できる。レチノイン酸の添加濃度が上限を超えた場合
は、細胞死を誘導するため好ましくない。また、下限に
満たない場合は、分化が十分に行われないため好ましく
ない。さらに、舌上皮前駆細胞を単離する際に、舌上皮
細胞シートのうち味細胞前駆細胞が多く含まれている有
郭乳頭付近等の特定の部分を用いた場合には、味細胞等
に分化させることができる。神経様細胞に分化させる場
合に用いることができる培地の組成を、以下に示す。
【００１９】
（分化誘導因子としてレチノイン酸を添加する場合の培地）
培地：ＭＣＤＢ１５３神経分化培地（Ｃａ濃度は、５．０ｍｇ／ｍｌ）
上皮細胞成長因子 最終濃度 １０ｎｇ／ｍｌ
塩基性繊維芽細胞成長因子 最終濃度 １ｎｇ／ｍｌ
アクチビン 最終濃度 ５ｎｇ／ｍｌ
インシュリン 最終濃度 ５μｇ／ｍｌ
トランスフェリン 最終濃度 １０μｇ／ｍｌ
ヒドロコルチゾン ０．５μｇ／ｍｌ
エタノールアミン ０．５μＭ
ホスホエタノールアミン ０．５μＭ
レチノイン酸 ０．６μｇ／ｍｌ（２μＭ）
透析された牛胎児血清 最終濃度 ０．１％
【００２０】神経様細胞への分化の確認についても、上
皮様細胞の場合と同様に、常法によって行うことができ
る。以下に、その１例を示す。すなわち、培養後に０．
１％トライトンＸ−１００等の界面活性剤及び４％パラ
ホルムアルデヒドを含むＰＢＳ（−）で細胞を固定後、
抗神経中間系フィラメント抗体と抗脳特異的Ｌ型カルシ
ウムチャンネル抗体等の抗体を用いて免疫染色すること
によって確認することができる。なお、神経中間系フィ
ラメントおよび脳特異的Ｌ型カルシウムチャンネルは、
共に神経細胞のマーカーとして用いられているタンパク
質である。
皮様細胞の場合と同様に、常法によって行うことができ
る。以下に、その１例を示す。すなわち、培養後に０．
１％トライトンＸ−１００等の界面活性剤及び４％パラ
ホルムアルデヒドを含むＰＢＳ（−）で細胞を固定後、
抗神経中間系フィラメント抗体と抗脳特異的Ｌ型カルシ
ウムチャンネル抗体等の抗体を用いて免疫染色すること
によって確認することができる。なお、神経中間系フィ
ラメントおよび脳特異的Ｌ型カルシウムチャンネルは、
共に神経細胞のマーカーとして用いられているタンパク
質である。
【００２１】図１は、本発明に係る舌上皮前駆細胞の単
離方法および単離した上皮前駆細胞の培養方法の１例の
フローチャートを示したものである。すなわち、コラゲ
ナーゼIV（フナコシ社製）とエラスターゼ（フナコシ社
製）による処理を行って舌より剥がした舌上皮シート
を、さらに細かく裁断してから、ディスパーゼ処理によ
り細胞を１個ずつに分散させる。ここに、ビオチン標識
した抗インテグリンβ１抗体とストレプトアビジン磁気
ビーズを添加して、インテグリンβ１を発現する細胞を
磁場により選択して、培養を行う。この培養細胞は、培
養液中にカルシウムを加えると、上皮様に分化し、レチ
ノイン酸を加えると、神経様に分化した。
離方法および単離した上皮前駆細胞の培養方法の１例の
フローチャートを示したものである。すなわち、コラゲ
ナーゼIV（フナコシ社製）とエラスターゼ（フナコシ社
製）による処理を行って舌より剥がした舌上皮シート
を、さらに細かく裁断してから、ディスパーゼ処理によ
り細胞を１個ずつに分散させる。ここに、ビオチン標識
した抗インテグリンβ１抗体とストレプトアビジン磁気
ビーズを添加して、インテグリンβ１を発現する細胞を
磁場により選択して、培養を行う。この培養細胞は、培
養液中にカルシウムを加えると、上皮様に分化し、レチ
ノイン酸を加えると、神経様に分化した。
【００２２】
【実施例】以下において、実施例により本発明を詳しく
説明するが、本発明はこれらに限定されるものではな
い。 実施例１（抗インテグリンβ１抗体による舌上皮前駆細
胞の検出） 舌上皮前駆細胞の検出は、マウスから採取した舌から摘
出した有郭乳頭付近の組織を、抗インテグリンβ１抗体
（ベクトンディッキンソン社製）を用いて免疫染色する
ことによって行った。誕生４日後のマウスから舌を摘出
し、この舌から有郭乳頭付近をメス刃で切除した後、直
ちに凍結切片作製用の試薬であるＯ．Ｃ．Ｔ．コンパウ
ンド（サクラ精器製）０．５ｍｌ中で急速凍結した。こ
の後、クライオセクションＣＭ１８５０（ライカ社製）
を用いて１０μｍの凍結切片を作製した。
説明するが、本発明はこれらに限定されるものではな
い。 実施例１（抗インテグリンβ１抗体による舌上皮前駆細
胞の検出） 舌上皮前駆細胞の検出は、マウスから採取した舌から摘
出した有郭乳頭付近の組織を、抗インテグリンβ１抗体
（ベクトンディッキンソン社製）を用いて免疫染色する
ことによって行った。誕生４日後のマウスから舌を摘出
し、この舌から有郭乳頭付近をメス刃で切除した後、直
ちに凍結切片作製用の試薬であるＯ．Ｃ．Ｔ．コンパウ
ンド（サクラ精器製）０．５ｍｌ中で急速凍結した。こ
の後、クライオセクションＣＭ１８５０（ライカ社製）
を用いて１０μｍの凍結切片を作製した。
【００２３】切片（１０μｍ）を乗せたスライドグラス
を、０．１％トライトンＸ−１００（半井社製）と４％
ホルムアルデヒドを含むＰＢＳ（−）で２０分間室温に
て固定した。固定後、５％ヤギ血清（ケミコン社製）を
含むＰＢＳ（−）を用い室温で２時間ブロッキング処理
し、一次抗体である抗インテグリンβ１抗体（ベクトン
ディッキンソン社製）０．４μｇ／ｍｌと４℃で一晩反
応させた。固定化した切片と抗体との反応終了後、余分
な抗インテグリンβ１抗体を０．０５％ツウィーン２０
（半井社製）を含むＰＢＳ（−）で数回洗い流した。次
に、一次抗体の結合した固定された切片と蛍光色素であ
るＣｙ３で標識された抗ハムスター二次抗体（ジャクソ
ンラボ社製）１．２５μｇ／ｍｌとを、室温にて１時間
反応させた。反応終了後、余分な二次抗体を上記と同様
の０．０５％ツウィーン２０を含むＰＢＳ（−）で洗い
流し、蛍光顕微鏡ＤＭＲＩＢ（ライカ社製）で観察し
た。図２は、抗インテグリンβ１抗体を用いて有郭乳頭
付近の組織を免疫染色した場合の蛍光顕微鏡像の写真で
ある。
を、０．１％トライトンＸ−１００（半井社製）と４％
ホルムアルデヒドを含むＰＢＳ（−）で２０分間室温に
て固定した。固定後、５％ヤギ血清（ケミコン社製）を
含むＰＢＳ（−）を用い室温で２時間ブロッキング処理
し、一次抗体である抗インテグリンβ１抗体（ベクトン
ディッキンソン社製）０．４μｇ／ｍｌと４℃で一晩反
応させた。固定化した切片と抗体との反応終了後、余分
な抗インテグリンβ１抗体を０．０５％ツウィーン２０
（半井社製）を含むＰＢＳ（−）で数回洗い流した。次
に、一次抗体の結合した固定された切片と蛍光色素であ
るＣｙ３で標識された抗ハムスター二次抗体（ジャクソ
ンラボ社製）１．２５μｇ／ｍｌとを、室温にて１時間
反応させた。反応終了後、余分な二次抗体を上記と同様
の０．０５％ツウィーン２０を含むＰＢＳ（−）で洗い
流し、蛍光顕微鏡ＤＭＲＩＢ（ライカ社製）で観察し
た。図２は、抗インテグリンβ１抗体を用いて有郭乳頭
付近の組織を免疫染色した場合の蛍光顕微鏡像の写真で
ある。
【００２４】図２の蛍光顕微鏡像から明らかように、生
後４日目の有郭乳頭付近では、抗インテグリンβ１抗体
は基底膜および膜より上層部のtransit amplifying細胞
が存在すると考えられる部位を認識していた。このこと
から、インテグリンβ１発現細胞が該部位に存在するこ
とが強く示唆された。
後４日目の有郭乳頭付近では、抗インテグリンβ１抗体
は基底膜および膜より上層部のtransit amplifying細胞
が存在すると考えられる部位を認識していた。このこと
から、インテグリンβ１発現細胞が該部位に存在するこ
とが強く示唆された。
【００２５】実施例２（抗インテグリンβ１抗体による
舌上皮前駆細胞の単離と培養） マウス舌上皮前駆細胞の単離と、単離した該細胞の培養
は、以下の方法によって実施した。 （１）舌上皮前駆細胞の単離 実施例１と同様に、生後８−１２週齢のマウスから舌を
摘出し、これからシート状の上皮組織を作製し、舌上皮
前駆細胞集団を抗インテグリンβ１抗体を用いて選抜し
た。すなわち、１０ｕｎｉｔｓ（２．５ｍｇ）のコラゲ
ナーゼIV（フナコシ社製）と８ｕｎｉｔｓ（２ｍｇ）の
エラスターゼ（フナコシ社製）を上皮直下に注射器で注
入し、３７℃で３０分間反応させた。
舌上皮前駆細胞の単離と培養） マウス舌上皮前駆細胞の単離と、単離した該細胞の培養
は、以下の方法によって実施した。 （１）舌上皮前駆細胞の単離 実施例１と同様に、生後８−１２週齢のマウスから舌を
摘出し、これからシート状の上皮組織を作製し、舌上皮
前駆細胞集団を抗インテグリンβ１抗体を用いて選抜し
た。すなわち、１０ｕｎｉｔｓ（２．５ｍｇ）のコラゲ
ナーゼIV（フナコシ社製）と８ｕｎｉｔｓ（２ｍｇ）の
エラスターゼ（フナコシ社製）を上皮直下に注射器で注
入し、３７℃で３０分間反応させた。
【００２６】続いて、上記の処理をした舌上皮をピンセ
ットでシート状に剥がし、メス刃で細かく裁断した後、
さらに１０００ｕｎｉｔｓ（３．３ｍｇ）のディスパー
ゼ（三光純薬社製）を加えて、３７℃で１５分間反応さ
せた。反応終了後、数回ピペッティングを行い、剥がれ
た１個ずつの細胞を７０μｍ幅のセルストレーナー（ベ
クトンディキンソン社製）により回収した。こうして回
収した舌上皮細胞は、氷冷したＰＢＳ（−）で３回リン
スし、１．０×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるようにＰ
ＢＳ（−）に懸濁した。
ットでシート状に剥がし、メス刃で細かく裁断した後、
さらに１０００ｕｎｉｔｓ（３．３ｍｇ）のディスパー
ゼ（三光純薬社製）を加えて、３７℃で１５分間反応さ
せた。反応終了後、数回ピペッティングを行い、剥がれ
た１個ずつの細胞を７０μｍ幅のセルストレーナー（ベ
クトンディキンソン社製）により回収した。こうして回
収した舌上皮細胞は、氷冷したＰＢＳ（−）で３回リン
スし、１．０×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるようにＰ
ＢＳ（−）に懸濁した。
【００２７】この懸濁液に、４μｇ／ｍｌの濃度となる
ようにビオチン標識抗インテグリンβ１抗体（ベクトン
ディッキンソン社製）を加え、舌上皮細胞と抗体とを一
定の振盪条件下に４℃で３０分間反応させた。次に、抗
体と反応させた舌上皮前駆細胞をＰＢＳ（−）で３回洗
浄し、これをＰＢＳ（−）８０μｌに懸濁し、舌上皮前
駆細胞懸濁液を得た。該懸濁液に、磁気ビーズであるス
トレプトアビジン−マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ
社製）２０μｌを加え、１０℃で１５分間反応させた。
ようにビオチン標識抗インテグリンβ１抗体（ベクトン
ディッキンソン社製）を加え、舌上皮細胞と抗体とを一
定の振盪条件下に４℃で３０分間反応させた。次に、抗
体と反応させた舌上皮前駆細胞をＰＢＳ（−）で３回洗
浄し、これをＰＢＳ（−）８０μｌに懸濁し、舌上皮前
駆細胞懸濁液を得た。該懸濁液に、磁気ビーズであるス
トレプトアビジン−マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ
社製）２０μｌを加え、１０℃で１５分間反応させた。
【００２８】反応終了後、バリオＭａｃｓ磁気装置（Ｍ
ｉｌｔｅｎｙｉ社製）にＲＳ＋カラム（Ｍｉｌｔｅｎｙ
ｉ社製）を装着し、該細胞をロードした。該細胞をロー
ドしたカラムは、ＰＢＳ（−）で３回洗浄した後、カラ
ムを磁気装置から離し、抗体でトラップされた舌上皮前
駆細胞をＰＢＳ（−）５００μｌにて溶出した。この溶
出液に、インテグリンβ１陽性細胞集団である舌上皮前
駆細胞のみが含まれていることを間接免疫抗体法による
免疫染色にて確認した。
ｉｌｔｅｎｙｉ社製）にＲＳ＋カラム（Ｍｉｌｔｅｎｙ
ｉ社製）を装着し、該細胞をロードした。該細胞をロー
ドしたカラムは、ＰＢＳ（−）で３回洗浄した後、カラ
ムを磁気装置から離し、抗体でトラップされた舌上皮前
駆細胞をＰＢＳ（−）５００μｌにて溶出した。この溶
出液に、インテグリンβ１陽性細胞集団である舌上皮前
駆細胞のみが含まれていることを間接免疫抗体法による
免疫染色にて確認した。
【００２９】（２）単離された舌上皮前駆細胞の培養
上記（１）で単離された舌上皮前駆細胞の培養を以下の
方法で行った。すなわち、上記（１）で単離された舌上
皮前駆細胞を５×１０4 個となるように調整し、これを
下記の組成を有する培地５０μｌに懸濁した。その懸濁
液をドロップレットとして、直径３５ｍｍの培養皿の上
に設置し、炭酸ガスインキュベーター内で３０分間の培
養を行った。次いで、舌上皮前駆細胞の前培養液に、さ
らに下記の組成を有する培地２ｍｌを加えて、３７℃に
て２週間の培養を行った。
方法で行った。すなわち、上記（１）で単離された舌上
皮前駆細胞を５×１０4 個となるように調整し、これを
下記の組成を有する培地５０μｌに懸濁した。その懸濁
液をドロップレットとして、直径３５ｍｍの培養皿の上
に設置し、炭酸ガスインキュベーター内で３０分間の培
養を行った。次いで、舌上皮前駆細胞の前培養液に、さ
らに下記の組成を有する培地２ｍｌを加えて、３７℃に
て２週間の培養を行った。
【００３０】
培地：ＭＣＤＢ１５３基本培地（Ｃａ濃度は、５．０ｍｇ／ｍｌ）
上皮細胞成長因子 最終濃度 １０ｎｇ／ｍｌ
塩基性繊維芽細胞成長因子 最終濃度 １０ｎｇ／ｍｌ
インシュリン 最終濃度 ５μｇ／ｍｌ
トランスフェリン 最終濃度 １０μｇ／ｍｌ
ヒドロコルチゾン ０．５μｇ／ｍｌ
エタノールアミン ０．５μＭ
ホスホエタノールアミン ０．５μＭ
透析された牛胎児血清 最終濃度 ０．５％
【００３１】２週間の培養後、培養した舌上皮前駆細胞
をメタノールで固定した。固定後、５％ヤギ血清を含む
ＰＢＳ（−）で室温にて２時間処理し、０．４μｇ／ｍ
ｌの濃度となるように調製した一次抗体である抗インテ
グリンβ１抗体（ベクトンディッキンソン社製）と４℃
で一晩反応させた。反応終了後、舌上皮前駆細胞を０．
０５％ツウィーン２０を含むＰＢＳ（−）で３回洗浄し
た。洗浄後、蛍光色素であるＣｙ３で標識された抗ハム
スター二次抗体（ジャクソンラボ社製）１．２５μｇ／
ｍｌと室温で１時間反応させた。その後、余分な二次抗
体を０．０５％ツウィーン２０を含むＰＢＳ（−）で洗
い流してから、蛍光顕微鏡ＤＭＲＩＢ（ライカ社製）で
観察した。図３Ａは、舌上皮前駆細胞を透過光で撮影し
た顕微鏡像の写真である。また、蛍光を撮影した顕微鏡
像の写真を図３Ｂに示す。
をメタノールで固定した。固定後、５％ヤギ血清を含む
ＰＢＳ（−）で室温にて２時間処理し、０．４μｇ／ｍ
ｌの濃度となるように調製した一次抗体である抗インテ
グリンβ１抗体（ベクトンディッキンソン社製）と４℃
で一晩反応させた。反応終了後、舌上皮前駆細胞を０．
０５％ツウィーン２０を含むＰＢＳ（−）で３回洗浄し
た。洗浄後、蛍光色素であるＣｙ３で標識された抗ハム
スター二次抗体（ジャクソンラボ社製）１．２５μｇ／
ｍｌと室温で１時間反応させた。その後、余分な二次抗
体を０．０５％ツウィーン２０を含むＰＢＳ（−）で洗
い流してから、蛍光顕微鏡ＤＭＲＩＢ（ライカ社製）で
観察した。図３Ａは、舌上皮前駆細胞を透過光で撮影し
た顕微鏡像の写真である。また、蛍光を撮影した顕微鏡
像の写真を図３Ｂに示す。
【００３２】図３Ａは、透過光で撮影した顕微鏡像の写
真であり、細胞の形態を明確に識別することができる。
また、図３Ｂは、同一視野のＣｙ３で染色した蛍光顕微
鏡像の写真であり、培養細胞はインテグリンβ１を発現
していることが分かる。
真であり、細胞の形態を明確に識別することができる。
また、図３Ｂは、同一視野のＣｙ３で染色した蛍光顕微
鏡像の写真であり、培養細胞はインテグリンβ１を発現
していることが分かる。
【００３３】実施例３（上皮前駆細胞のカルシウム添加
による上皮様細胞への分化） 実施例２（２）に示したＭＣＤＢ１５３基本培地に、分
化誘導因子として１ｍＭのカルシウムを添加し、この培
地に実施例２（２）で得た培養細胞を接種し、さらに３
日間培養を続けた。なお、対照として、分化誘導因子で
あるカルシウムを添加しなかったこと以外は同じ条件で
培養した。培養終了後、０．１％トライトンＸ−１００
（半井社製）と４％パラホルムアルデヒド（シグマ社
製）を含むＰＢＳ（−）で細胞を固定したのち、抗β−
カテニン抗体（ベクトンディッキンソン社製）と抗Ｅ−
カドヘリン抗体（タカラ社製）を用いて免疫染色した。
図４は、カルシウム添加の有無による抗β−カテニン抗
体と抗Ｅ−カドヘリン抗体による免疫染色の結果を示し
た写真である。
による上皮様細胞への分化） 実施例２（２）に示したＭＣＤＢ１５３基本培地に、分
化誘導因子として１ｍＭのカルシウムを添加し、この培
地に実施例２（２）で得た培養細胞を接種し、さらに３
日間培養を続けた。なお、対照として、分化誘導因子で
あるカルシウムを添加しなかったこと以外は同じ条件で
培養した。培養終了後、０．１％トライトンＸ−１００
（半井社製）と４％パラホルムアルデヒド（シグマ社
製）を含むＰＢＳ（−）で細胞を固定したのち、抗β−
カテニン抗体（ベクトンディッキンソン社製）と抗Ｅ−
カドヘリン抗体（タカラ社製）を用いて免疫染色した。
図４は、カルシウム添加の有無による抗β−カテニン抗
体と抗Ｅ−カドヘリン抗体による免疫染色の結果を示し
た写真である。
【００３４】図４から明らかなように、分化誘導因子で
あるカルシウムを培養液に添加しないで培養を行った場
合、β−カテニンおよびＥ−カドヘリンの細胞膜で発現
量は共に低かった。これに対して、分化誘導因子として
１ｍＭのカルシウムを添加して培養した場合は、β−カ
テニンとＥ−カドヘリンの細胞膜、特に細胞と細胞とが
接している部位への両タンパク質の局在が認められ、形
態的にも上皮様細胞に分化していることが明らかとなっ
た。
あるカルシウムを培養液に添加しないで培養を行った場
合、β−カテニンおよびＥ−カドヘリンの細胞膜で発現
量は共に低かった。これに対して、分化誘導因子として
１ｍＭのカルシウムを添加して培養した場合は、β−カ
テニンとＥ−カドヘリンの細胞膜、特に細胞と細胞とが
接している部位への両タンパク質の局在が認められ、形
態的にも上皮様細胞に分化していることが明らかとなっ
た。
【００３５】実施例４（舌上皮前駆細胞のレチノイン酸
添加による神経様細胞への分化） 実施例２（２）に示したＭＣＤＢ１５３分化培地に、分
化誘導因子として２μＭのレチノイン酸（和光純薬社
製）を添加し、この培地に実施例２（２）で得た培養細
胞を接種して３日間培養を続けた。さらに、以下の培地
を用いて７日間培養を続けた。なお、対照として、分化
誘導処理しないものについても同様に実施した。
添加による神経様細胞への分化） 実施例２（２）に示したＭＣＤＢ１５３分化培地に、分
化誘導因子として２μＭのレチノイン酸（和光純薬社
製）を添加し、この培地に実施例２（２）で得た培養細
胞を接種して３日間培養を続けた。さらに、以下の培地
を用いて７日間培養を続けた。なお、対照として、分化
誘導処理しないものについても同様に実施した。
【００３６】
培地：ＭＣＤＢ１５３神経分化培地（Ｃａ濃度は、５．０ｍｇ／ｍｌ）
上皮細胞成長因子 最終濃度 １０ｎｇ／ｍｌ
塩基性繊維芽細胞成長因子 最終濃度 １ｎｇ／ｍｌ
アクチビン 最終濃度 ５ｎｇ／ｍｌ
インシュリン 最終濃度 ５μｇ／ｍｌ
トランスフェリン 最終濃度 １０μｇ／ｍｌ
ヒドロコルチゾン ０．５μｇ／ｍｌ
エタノールアミン ０．５μＭ
ホスホエタノールアミン ０．５μＭ
透析された牛胎児血清 最終濃度 ０．１％
【００３７】７日間および１４日間の培養を続けた後
に、０．１％トライトンＸ−１００（半井社製）と４％
パラホルムアルデヒド（シグマ社製）を含むＰＢＳ
（−）で細胞を固定後、抗神経中間系フィラメント抗体
（ケミコン社製）と抗脳特異的Ｌ型カルシウムチャンネ
ル抗体（ケミコン社製）を用いて免疫染色した。図５
は、レチノイン酸添加の有無による抗神経中間系フィラ
メント抗体と抗脳特異的Ｌ型カルシウムチャンネル抗体
による免疫染色の結果を示した顕微鏡写真である。
に、０．１％トライトンＸ−１００（半井社製）と４％
パラホルムアルデヒド（シグマ社製）を含むＰＢＳ
（−）で細胞を固定後、抗神経中間系フィラメント抗体
（ケミコン社製）と抗脳特異的Ｌ型カルシウムチャンネ
ル抗体（ケミコン社製）を用いて免疫染色した。図５
は、レチノイン酸添加の有無による抗神経中間系フィラ
メント抗体と抗脳特異的Ｌ型カルシウムチャンネル抗体
による免疫染色の結果を示した顕微鏡写真である。
【００３８】図５から明らかなように、通常の培養条件
の場合には、神経細胞のマーカーである神経中間系フィ
ラメントと脳特異的Ｌ型カルシウムチャンネルの発現レ
ベルは低かった。これに対して、分化誘導因子であるレ
チノイン酸を添加した分化培地で培養した場合には、神
経中間系フィラメントと脳特異的Ｌ型カルシウムチャン
ネルがいずれも、より顕著に発現が上昇していた。この
ことから、培地に分化誘導因子としてレチノイン酸を添
加した神経分化培地で舌上皮前駆細胞を培養することに
よって、神経様細胞に分化することが明らかとなった。
の場合には、神経細胞のマーカーである神経中間系フィ
ラメントと脳特異的Ｌ型カルシウムチャンネルの発現レ
ベルは低かった。これに対して、分化誘導因子であるレ
チノイン酸を添加した分化培地で培養した場合には、神
経中間系フィラメントと脳特異的Ｌ型カルシウムチャン
ネルがいずれも、より顕著に発現が上昇していた。この
ことから、培地に分化誘導因子としてレチノイン酸を添
加した神経分化培地で舌上皮前駆細胞を培養することに
よって、神経様細胞に分化することが明らかとなった。
【００３９】実施例５（培養上清存在下での特定部位由
来の舌上皮前駆細胞の培養と分化） 生後４週齢のマウスより得た舌上皮細胞シートから、有
郭乳頭付近の部位を鋏で切り出した。次に、該部位をマ
トリゲル（ベクトンディッキンソン社製）でコートした
３５ｍｍディッシュを用いて、炭酸ガスインキュベータ
ー内で３７℃で２週間培養した。このとき用いた培地
は、実施例２（２）で使用した培地に、実施例２におい
て舌上皮前駆細胞の培養で得た培養上清を該培地の１／
３〜１／１０量を加えたものである。
来の舌上皮前駆細胞の培養と分化） 生後４週齢のマウスより得た舌上皮細胞シートから、有
郭乳頭付近の部位を鋏で切り出した。次に、該部位をマ
トリゲル（ベクトンディッキンソン社製）でコートした
３５ｍｍディッシュを用いて、炭酸ガスインキュベータ
ー内で３７℃で２週間培養した。このとき用いた培地
は、実施例２（２）で使用した培地に、実施例２におい
て舌上皮前駆細胞の培養で得た培養上清を該培地の１／
３〜１／１０量を加えたものである。
【００４０】続いて、実施例４と同様に、分化誘導因子
としてレチノイン酸を添加した培地を用いて上記の舌上
皮前駆細胞を培養し、分化誘導を行った。培養終了後、
０．１％トライトンＸ−１００と４％パラホルムアルデ
ヒドを含むＰＢＳ（−）で、分化した細胞を固定した。
固定化した細胞について、味細胞で特異的に発現するこ
とが知られているガストデューシンの発現の有無を、抗
ガストデューシン抗体（サンタクルス社製）を用いた免
疫染色を以下のように行った。すなわち、培養した細胞
を、内在性のペルオキシダーゼの活性を抑えるために
０．３％ヒドロキシルペルオキシドを含むメタノールで
２５℃で３０分間処理し、その後０．２％トゥイン２０
を含むＰＢＳで５分間洗浄した。洗浄後、５％正常ウサ
ギ血清を含むブロッキング試薬で２５℃にて２時間処理
し、抗ガストデューシン抗体と４℃で一晩反応させた。
続いて、ビオチン標識化された二次抗体と２５℃で３０
分間反応させた後、ペルオキシダーゼ結合ストレプトア
ビジンと２５℃で１０分間反応させた。反応終了後、
３,３’−ジアミノベンチジン（ＤＡＢ）、１ｎＭ ヒ
ドロキシルペルオキシドを含むトリス−塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．６）で染色した。
としてレチノイン酸を添加した培地を用いて上記の舌上
皮前駆細胞を培養し、分化誘導を行った。培養終了後、
０．１％トライトンＸ−１００と４％パラホルムアルデ
ヒドを含むＰＢＳ（−）で、分化した細胞を固定した。
固定化した細胞について、味細胞で特異的に発現するこ
とが知られているガストデューシンの発現の有無を、抗
ガストデューシン抗体（サンタクルス社製）を用いた免
疫染色を以下のように行った。すなわち、培養した細胞
を、内在性のペルオキシダーゼの活性を抑えるために
０．３％ヒドロキシルペルオキシドを含むメタノールで
２５℃で３０分間処理し、その後０．２％トゥイン２０
を含むＰＢＳで５分間洗浄した。洗浄後、５％正常ウサ
ギ血清を含むブロッキング試薬で２５℃にて２時間処理
し、抗ガストデューシン抗体と４℃で一晩反応させた。
続いて、ビオチン標識化された二次抗体と２５℃で３０
分間反応させた後、ペルオキシダーゼ結合ストレプトア
ビジンと２５℃で１０分間反応させた。反応終了後、
３,３’−ジアミノベンチジン（ＤＡＢ）、１ｎＭ ヒ
ドロキシルペルオキシドを含むトリス−塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．６）で染色した。
【００４１】また、分化誘導前の細胞およびレチノイン
酸を添加して分化誘導した細胞を試料として用い、これ
らから常法によってＲＮＡを抽出し、これを用いてＲＴ
−ＰＣＲを行うことによって、ｍＲＮＡレベルでのガス
トデューシンの発現の有無を確認した。まず、１μｇの
トータルＲＮＡから、以下のようにして、Preamplifica
tion kit (Gibco 社、18089-011)を用いてｃＤＮＡを合
成した。１μｇの oligo(dT)とトータルＲＮＡを混合
し、７０℃で１０分間インキュベートした後、１分間氷
冷を行った。これにＰＣＲバッファー ２μｌ、２５ｍ
ＭＭｇＣｌ2 ２μｌ、１０ｍＭ ｄＮＴＰmix １μｌ、
０．１Ｍ ＤＴＴ １μｌを加え、４２℃で１５分間加
熱した。ここに、１μｌのSuperscript II Reverse Tra
nscriptaseを加え、４２℃で５０分間反応させた。次い
で、７０℃で１５分間加熱して酵素を失活させた後、室
温に戻して１μｌ ＲＮａｓｅ Ｈを加えて、３７℃で
２０分間反応させた。得られた反応液２μｌに、２μｌ
１０×ＰＣＲバッファー、２μｌ ２５ｍＭ ＭｇＣ
ｌ2 、１μｌ １０ｍＭ ｄＮＴＰmix 、１μｌ ガス
トデューシン プライマー セット、１μｌ Taq ＤＮ
Ａポリメラーゼ（タカラ社製）１μｌを加え、９４℃
１分間（変性）、５５℃ １分間（アニーリング）、７
２℃ １分間（伸長）を３５サイクル行ってＤＮＡを増
幅させて、その５μｌを電気泳動に供した。
酸を添加して分化誘導した細胞を試料として用い、これ
らから常法によってＲＮＡを抽出し、これを用いてＲＴ
−ＰＣＲを行うことによって、ｍＲＮＡレベルでのガス
トデューシンの発現の有無を確認した。まず、１μｇの
トータルＲＮＡから、以下のようにして、Preamplifica
tion kit (Gibco 社、18089-011)を用いてｃＤＮＡを合
成した。１μｇの oligo(dT)とトータルＲＮＡを混合
し、７０℃で１０分間インキュベートした後、１分間氷
冷を行った。これにＰＣＲバッファー ２μｌ、２５ｍ
ＭＭｇＣｌ2 ２μｌ、１０ｍＭ ｄＮＴＰmix １μｌ、
０．１Ｍ ＤＴＴ １μｌを加え、４２℃で１５分間加
熱した。ここに、１μｌのSuperscript II Reverse Tra
nscriptaseを加え、４２℃で５０分間反応させた。次い
で、７０℃で１５分間加熱して酵素を失活させた後、室
温に戻して１μｌ ＲＮａｓｅ Ｈを加えて、３７℃で
２０分間反応させた。得られた反応液２μｌに、２μｌ
１０×ＰＣＲバッファー、２μｌ ２５ｍＭ ＭｇＣ
ｌ2 、１μｌ １０ｍＭ ｄＮＴＰmix 、１μｌ ガス
トデューシン プライマー セット、１μｌ Taq ＤＮ
Ａポリメラーゼ（タカラ社製）１μｌを加え、９４℃
１分間（変性）、５５℃ １分間（アニーリング）、７
２℃ １分間（伸長）を３５サイクル行ってＤＮＡを増
幅させて、その５μｌを電気泳動に供した。
【００４２】結果を図６に示す。この図は、特定部位由
来の舌上皮前駆細胞における抗ガストデューシン抗体で
免疫染色の結果を示した顕微鏡写真である。また、図７
は、ＲＴ−ＰＣＲを行った試料についての電気泳動写真
である。図中、レーン１は有郭乳頭付近の細胞、２は分
化誘導前の細胞、３は分化誘導後の細胞を示す。
来の舌上皮前駆細胞における抗ガストデューシン抗体で
免疫染色の結果を示した顕微鏡写真である。また、図７
は、ＲＴ−ＰＣＲを行った試料についての電気泳動写真
である。図中、レーン１は有郭乳頭付近の細胞、２は分
化誘導前の細胞、３は分化誘導後の細胞を示す。
【００４３】図６から明らかなように、培養細胞の一部
の細胞質が染色されていることから、特定部位由来の舌
上皮前駆細胞を用いても、分化誘導因子であるレチノイ
ン酸を培地に添加することにより、味細胞に特異的なガ
ストデューシンを発現する神経様細胞に分化誘導できる
ことが明らかとなった。また、図７から明らかなよう
に、味細胞で特異的に発現するガストデューシンｍＲＮ
Ａは、レチノイン酸を培地に添加した場合に発現してお
り、このことからもレチノイン酸添加により味細胞に分
化している細胞が誘導されたことは明らかである。
の細胞質が染色されていることから、特定部位由来の舌
上皮前駆細胞を用いても、分化誘導因子であるレチノイ
ン酸を培地に添加することにより、味細胞に特異的なガ
ストデューシンを発現する神経様細胞に分化誘導できる
ことが明らかとなった。また、図７から明らかなよう
に、味細胞で特異的に発現するガストデューシンｍＲＮ
Ａは、レチノイン酸を培地に添加した場合に発現してお
り、このことからもレチノイン酸添加により味細胞に分
化している細胞が誘導されたことは明らかである。
【００４４】
【発明の効果】本発明の方法によれば、従来は困難であ
った舌上皮細胞および味細胞の前駆細胞を培養すること
が可能となる。また、本発明の方法により、味細胞の分
化過程を経時的に詳細に解析することが可能となると同
時に、分化途上の味細胞および分化した味細胞を長期間
に渡って維持することが可能となる。
った舌上皮細胞および味細胞の前駆細胞を培養すること
が可能となる。また、本発明の方法により、味細胞の分
化過程を経時的に詳細に解析することが可能となると同
時に、分化途上の味細胞および分化した味細胞を長期間
に渡って維持することが可能となる。
【図１】 舌上皮細胞から、免疫磁気ビーズにより上皮
前駆細胞を単離、培養する本発明の流れを示したフロー
チャートである。
前駆細胞を単離、培養する本発明の流れを示したフロー
チャートである。
【図２】 実施例１において、抗インテグリンβ１抗体
を用いて免疫染色を行った場合の蛍光顕微鏡像の写真で
ある。
を用いて免疫染色を行った場合の蛍光顕微鏡像の写真で
ある。
【図３】 実施例２において、培養した舌上皮前駆細胞
を撮影した顕微鏡像の写真である。図中のＡは、磁気ビ
ーズにより選択された培養細胞の顕微鏡の透過像、Ｂは
選択に用いた抗インテグリンβ１抗体によりＡの培養細
胞を免疫染色した顕微鏡像である。
を撮影した顕微鏡像の写真である。図中のＡは、磁気ビ
ーズにより選択された培養細胞の顕微鏡の透過像、Ｂは
選択に用いた抗インテグリンβ１抗体によりＡの培養細
胞を免疫染色した顕微鏡像である。
【図４】 実施例３のカルシウム添加の有無において、
抗β−カテニン抗体と抗Ｅ−カドヘリン抗体で免疫染色
した顕微鏡像の写真であり、各タンパク質が発現してい
ることを示している。図中、Ａは抗β−カテニン抗体を
用い通常の低カルシウムで培養したもの、Ｂは抗Ｅ−カ
ドヘリン抗体を用い通常の低カルシウムで培養したも
の、Ｃは抗β−カテニン抗体を用いカルシウムを添加し
て培養したもの（本発明）、Ｄは抗Ｅ−カドヘリン抗体
を用いカルシウムを添加して培養したもの（本発明）を
それぞれ示す。
抗β−カテニン抗体と抗Ｅ−カドヘリン抗体で免疫染色
した顕微鏡像の写真であり、各タンパク質が発現してい
ることを示している。図中、Ａは抗β−カテニン抗体を
用い通常の低カルシウムで培養したもの、Ｂは抗Ｅ−カ
ドヘリン抗体を用い通常の低カルシウムで培養したも
の、Ｃは抗β−カテニン抗体を用いカルシウムを添加し
て培養したもの（本発明）、Ｄは抗Ｅ−カドヘリン抗体
を用いカルシウムを添加して培養したもの（本発明）を
それぞれ示す。
【図５】 実施例４のレチノイン酸添加の有無におい
て、抗神経中間系フィラメント抗体と抗脳特異的Ｌ型カ
ルシウムチャンネル抗体で免疫染色した顕微鏡像の写真
であり、各タンパク質が発現していることを示してい
る。図中、Ａは基本培地で培養したものを抗神経中間系
フィラメント抗体で染色したもの（本発明）、Ｂは基本
培地で培養したものを抗脳特異的Ｌ型カルシウムチャン
ネル抗体で染色したもの、Ｃは基本培地にレチノイン酸
を添加して培養したものを抗神経中間系フィラメント抗
体で染色したもの（本発明）、Ｄは基本培地にレチノイ
ン酸を添加して培養したものを抗脳特異的Ｌ型カルシウ
ムチャンネル抗体で染色したもの（本発明）をそれぞれ
示す。
て、抗神経中間系フィラメント抗体と抗脳特異的Ｌ型カ
ルシウムチャンネル抗体で免疫染色した顕微鏡像の写真
であり、各タンパク質が発現していることを示してい
る。図中、Ａは基本培地で培養したものを抗神経中間系
フィラメント抗体で染色したもの（本発明）、Ｂは基本
培地で培養したものを抗脳特異的Ｌ型カルシウムチャン
ネル抗体で染色したもの、Ｃは基本培地にレチノイン酸
を添加して培養したものを抗神経中間系フィラメント抗
体で染色したもの（本発明）、Ｄは基本培地にレチノイ
ン酸を添加して培養したものを抗脳特異的Ｌ型カルシウ
ムチャンネル抗体で染色したもの（本発明）をそれぞれ
示す。
【図６】 実施例５において、特定部位由来の舌上皮前
駆細胞における抗ガストデューシン抗体で免疫染色の結
果を示した顕微鏡写真である。
駆細胞における抗ガストデューシン抗体で免疫染色の結
果を示した顕微鏡写真である。
【図７】 実施例５において、ＲＴ−ＰＣＲを行った各
試料についての電気泳動写真である。
試料についての電気泳動写真である。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 大倉 哲也
茨城県つくば市並木２丁目10−１ 211棟
303号
(72)発明者 日野 明寛
茨城県つくば市谷田部1077−61
(72)発明者 川本 恵子
茨城県牛久市上柏田３丁目58−４ キャッ
スルテラダＢ−101
Ｆターム(参考） 4B065 AA91X AC12 AC20 BA25
BB02 BB08 BB34 BB40
Claims (4)
- 【請求項１】 舌上皮細胞よりインテグリンβ１を発現
する細胞を、磁気カラムを用いて選抜することを特徴と
する舌上皮前駆細胞の単離方法。 - 【請求項２】 請求項１記載の方法によって単離した舌
上皮前駆細胞を培養して得られた培養上清の存在下に、
味細胞前駆細胞を含む舌上皮前駆細胞を培養することを
特徴とする味細胞前駆細胞の増殖方法。 - 【請求項３】 請求項２記載の方法により取得した味細
胞前駆細胞を含む舌上皮前駆細胞を、分化誘導因子とし
てカルシウムを加えた培地で培養し、上皮様細胞に分化
させることを特徴とする分化誘導方法。 - 【請求項４】 請求項２記載の方法により取得した味細
胞前駆細胞を含む舌上皮前駆細胞を、分化誘導因子とし
てレチノイン酸を加えた培地で培養し、神経様細胞に分
化させることを特徴とする分化誘導方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002216303A JP4129516B2 (ja) | 2001-07-26 | 2002-07-25 | 舌上皮前駆細胞の単離培養方法およびその分化誘導方法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001-225641 | 2001-07-26 | ||
| JP2001225641 | 2001-07-26 | ||
| JP2002216303A JP4129516B2 (ja) | 2001-07-26 | 2002-07-25 | 舌上皮前駆細胞の単離培養方法およびその分化誘導方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003102470A true JP2003102470A (ja) | 2003-04-08 |
| JP4129516B2 JP4129516B2 (ja) | 2008-08-06 |
Family
ID=26619302
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2002216303A Expired - Fee Related JP4129516B2 (ja) | 2001-07-26 | 2002-07-25 | 舌上皮前駆細胞の単離培養方法およびその分化誘導方法 |
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| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4129516B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006044594A2 (en) | 2004-10-15 | 2006-04-27 | Monell Chemical Senses Center | Methods for culturing mammalian taste cells |
| JP2014233280A (ja) * | 2013-06-05 | 2014-12-15 | 学校法人関西医科大学 | 舌上皮幹細胞の単離方法 |
-
2002
- 2002-07-25 JP JP2002216303A patent/JP4129516B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| WO2006044594A2 (en) | 2004-10-15 | 2006-04-27 | Monell Chemical Senses Center | Methods for culturing mammalian taste cells |
| EP1833961A2 (en) * | 2004-10-15 | 2007-09-19 | Monell Chemical Senses Center | Methods for culturing mammalian taste cells |
| JP2008516604A (ja) * | 2004-10-15 | 2008-05-22 | モネル ケミカル センシズ センター | 哺乳動物の味覚細胞の培養方法 |
| EP1833961A4 (en) * | 2004-10-15 | 2008-07-09 | Monell Chemical Senses Centre | METHOD FOR CULTIVATING TASTE CELLS FROM MAMMALS |
| US7488599B2 (en) | 2004-10-15 | 2009-02-10 | Monell Chemical Senses Center | Methods for culturing mammalian taste cells |
| US8030068B2 (en) | 2004-10-15 | 2011-10-04 | Monell Chemical Senses Center | Method for culturing mammalian taste cells |
| US8460925B2 (en) | 2004-10-15 | 2013-06-11 | Monell Chemical Senses Center | Methods for culturing mammalian taste cells |
| JP2014233280A (ja) * | 2013-06-05 | 2014-12-15 | 学校法人関西医科大学 | 舌上皮幹細胞の単離方法 |
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