JP2003093066A - 癌細胞の増殖および細胞死を制御する方法 - Google Patents
癌細胞の増殖および細胞死を制御する方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 PEG10を介して癌細胞の増殖を制御する方法
を提供する。 【解決手段】 PEG10蛋白質が、アポトーシスを抑制
し、癌細胞の増殖を促進することを実証した。また、PE
G10蛋白質は、SIAH1蛋白質との相互作用を介して分解さ
れることを見出した。本発明は、PEG10蛋白質を介して
細胞増殖および細胞死を制御する方法を提供する。また
本発明は、PEG10蛋白質を利用した新たな抗癌剤のスク
リーニング方法を提供する。本発明のスクリーニングに
より、癌細胞を特異的なターゲットとしてアポトーシス
を誘導し、細胞増殖を抑制する薬剤を開発することが可
能になる。特にPEG10蛋白質は肝癌細胞に特異的に発現
することから、肝癌の診断および治療のためにPEG10蛋
白質は理想的な標的分子である。
を提供する。 【解決手段】 PEG10蛋白質が、アポトーシスを抑制
し、癌細胞の増殖を促進することを実証した。また、PE
G10蛋白質は、SIAH1蛋白質との相互作用を介して分解さ
れることを見出した。本発明は、PEG10蛋白質を介して
細胞増殖および細胞死を制御する方法を提供する。また
本発明は、PEG10蛋白質を利用した新たな抗癌剤のスク
リーニング方法を提供する。本発明のスクリーニングに
より、癌細胞を特異的なターゲットとしてアポトーシス
を誘導し、細胞増殖を抑制する薬剤を開発することが可
能になる。特にPEG10蛋白質は肝癌細胞に特異的に発現
することから、肝癌の診断および治療のためにPEG10蛋
白質は理想的な標的分子である。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明はPEG10を介して細胞
増殖を制御する方法、およびPEG10を用いた癌抑制薬の
スクリーニング方法に関する。
増殖を制御する方法、およびPEG10を用いた癌抑制薬の
スクリーニング方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】原発性肝細胞癌（HCC）は世界的に共通
して悪性度が高いものの１つである。近年、幾つかの新
しい治療様式が開発されたが、現在でも進行性HCCの予
後は悪い。肝発癌にはTP53、CTNNB1、およびAXIN1の改
変が関与していることが分子解析により明らかとなって
いる（Tanaka, S. et al., Cancer Res. 53, 2884-2887
(1993); Miyoshi, Y. et al., Cancer Res. 58, 2524-2
527 (1998)）が、これは限られたHCCで見られるに過ぎ
ない。従って、癌で特異的に発現しており、大多数のケ
ースにおいて決定的な関与を有する新たな標的分子を発
見することが、肝癌の治療介入および予後の改善に必須
であると考えられる。
して悪性度が高いものの１つである。近年、幾つかの新
しい治療様式が開発されたが、現在でも進行性HCCの予
後は悪い。肝発癌にはTP53、CTNNB1、およびAXIN1の改
変が関与していることが分子解析により明らかとなって
いる（Tanaka, S. et al., Cancer Res. 53, 2884-2887
(1993); Miyoshi, Y. et al., Cancer Res. 58, 2524-2
527 (1998)）が、これは限られたHCCで見られるに過ぎ
ない。従って、癌で特異的に発現しており、大多数のケ
ースにおいて決定的な関与を有する新たな標的分子を発
見することが、肝癌の治療介入および予後の改善に必須
であると考えられる。
【０００３】マイクロアレイ技術により、実験モデルの
みならずヒト癌においても、遺伝子発現に関する包括的
なデータを得ることが可能となった（Clark, E.A. et a
l.,Nature 406, 532-535 (2000); Perou, C.M. et al.,
Nature 406, 747-752 (2000)）。マイクロアレイ法
は、生理学的応答、様々な条件や薬剤に対する応答、ま
たは病理学的条件において発現が変化する遺伝子を同定
することを可能にする（Clark, E.A. et al., Nature 4
06, 532-535 (2000); Perou, C.M. et al., Nature 40
6, 747-752 (2000)）。また、マイクロアレイ法は生理
学的または病理学的な表現型を反映しうる細胞集団のサ
ブセットの系統的な発現プロフィールを提供することも
可能である。以前の報告において、本発明者らは20のHC
Cとそれらに対応する非癌肝組織の発現プロフィール
を、23,040遺伝子からなるcDNAマイクロアレイを用いて
比較した結果を報告した（Okabe, H. et al., Cancer R
es. 61,2129-2137 (2001)）。それらの実験により、肝
癌の発生・伸展に関与していることが示唆される多数の
遺伝子が明らかとなり、さらにまた、HBV陽性HCCとHCV
陽性HCCでは発現プロフィールが異なることが判明した
（Okabe, H. et al., Cancer Res. 61, 2129-2137 (200
1)）。B型またはC型肝炎ウイルスによる慢性肝炎は、HC
Cの主要なリスク因子と考えられている（Stuver, S.O.,
Cancer Biol. 8, 299-306 (1998)）が、それぞれのウ
イルスは、異なる経路を介して肝癌の発生・伸展を引き
起こす可能性がある（Koike, K. et al., Hepatology 1
9, 810-819 (1994); Moriya, K. et al., Nature Med.
4, 1065-1067 (1998)）。本発明者らが見出した発現パ
ターンの違いは、2つのタイプの癌において、多くの遺
伝子が共通して発現上昇するものの、その性質は異なっ
ていることを示唆している。
みならずヒト癌においても、遺伝子発現に関する包括的
なデータを得ることが可能となった（Clark, E.A. et a
l.,Nature 406, 532-535 (2000); Perou, C.M. et al.,
Nature 406, 747-752 (2000)）。マイクロアレイ法
は、生理学的応答、様々な条件や薬剤に対する応答、ま
たは病理学的条件において発現が変化する遺伝子を同定
することを可能にする（Clark, E.A. et al., Nature 4
06, 532-535 (2000); Perou, C.M. et al., Nature 40
6, 747-752 (2000)）。また、マイクロアレイ法は生理
学的または病理学的な表現型を反映しうる細胞集団のサ
ブセットの系統的な発現プロフィールを提供することも
可能である。以前の報告において、本発明者らは20のHC
Cとそれらに対応する非癌肝組織の発現プロフィール
を、23,040遺伝子からなるcDNAマイクロアレイを用いて
比較した結果を報告した（Okabe, H. et al., Cancer R
es. 61,2129-2137 (2001)）。それらの実験により、肝
癌の発生・伸展に関与していることが示唆される多数の
遺伝子が明らかとなり、さらにまた、HBV陽性HCCとHCV
陽性HCCでは発現プロフィールが異なることが判明した
（Okabe, H. et al., Cancer Res. 61, 2129-2137 (200
1)）。B型またはC型肝炎ウイルスによる慢性肝炎は、HC
Cの主要なリスク因子と考えられている（Stuver, S.O.,
Cancer Biol. 8, 299-306 (1998)）が、それぞれのウ
イルスは、異なる経路を介して肝癌の発生・伸展を引き
起こす可能性がある（Koike, K. et al., Hepatology 1
9, 810-819 (1994); Moriya, K. et al., Nature Med.
4, 1065-1067 (1998)）。本発明者らが見出した発現パ
ターンの違いは、2つのタイプの癌において、多くの遺
伝子が共通して発現上昇するものの、その性質は異なっ
ていることを示唆している。
【０００４】ところで、Konopitzky, R.らは膵臓癌細胞
由来の癌抗原としてR11を報告している（国際公開番号W
O01/11040）。しかしながら、この蛋白質が癌化または
細胞増殖異常を引き起こす原因となるのか、または結果
に過ぎないのかは明らかにされていない。また、R11蛋
白質の活性または機能は全く知られていない。さらに、
R11の肝癌細胞における発現は全く知られていない。
由来の癌抗原としてR11を報告している（国際公開番号W
O01/11040）。しかしながら、この蛋白質が癌化または
細胞増殖異常を引き起こす原因となるのか、または結果
に過ぎないのかは明らかにされていない。また、R11蛋
白質の活性または機能は全く知られていない。さらに、
R11の肝癌細胞における発現は全く知られていない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、PEG10を介
して細胞増殖を制御する方法を提供する。また本発明
は、PEG10を利用した癌抑制薬のスクリーニング方法を
提供する。
して細胞増殖を制御する方法を提供する。また本発明
は、PEG10を利用した癌抑制薬のスクリーニング方法を
提供する。
【０００６】
【課題を解決するための手段】肝細胞癌（hepatocellul
ar carcinoma; HCC）の処置のための創薬の新たな標的
を見つけ出すため、本発明者らはゲノムワイドのcDNAマ
イクロアレイを用いて得られたHCCの発現プロフィール
（Okabe, H. et al., Cancer Res. 61, 2129-2137 (200
1)）を解析し、HCCで共通し、かつ排他的に発現が上昇
している遺伝子を検索した。その結果、本発明者らは、
正常肝臓細胞では発現していないが、癌組織で選択的に
高発現するあるESTの完全な転写産物を単離することに
成功した。最終的にこの遺伝子は、PEG10（paternally
expressed gene 10）（Ono, R. etal., Genomics 73, 2
32-237 (2001)）と同一であることが見出された。抗PEG
10抗体を用いた免疫組織化学的解析によりPEG10が癌特
異的に発現することが支持された。またPEG10を、この
遺伝子の内因的発現がない肝癌細胞に導入すると、細胞
増殖が促進することが判明した。PEG10の発現を抑制す
るアンチセンスS-オリゴヌクレオチドは、トランスフェ
クトした肝癌細胞の増殖を顕著に阻害した。さらに、本
発明者らはPEG10蛋白質が、アポトーシスに重要な役割
を果たすSIAH蛋白質（Roperch, J.P. et al., Proc. Na
tl. Acad. Sci. U S A. 96, 8070-8073 (1999)）と相互
作用することを実証した。アデノウイルスを介したSIAH
1の遺伝子導入は肝癌細胞の細胞死を誘導できたが、こ
れらの細胞でPEG10を過剰発現させると細胞死を抑制で
きることが判明した。これらの知見は、PEG10活性を抑
制することが肝細胞癌の処置のための創薬の新規なアプ
ローチとなることを示唆している。
ar carcinoma; HCC）の処置のための創薬の新たな標的
を見つけ出すため、本発明者らはゲノムワイドのcDNAマ
イクロアレイを用いて得られたHCCの発現プロフィール
（Okabe, H. et al., Cancer Res. 61, 2129-2137 (200
1)）を解析し、HCCで共通し、かつ排他的に発現が上昇
している遺伝子を検索した。その結果、本発明者らは、
正常肝臓細胞では発現していないが、癌組織で選択的に
高発現するあるESTの完全な転写産物を単離することに
成功した。最終的にこの遺伝子は、PEG10（paternally
expressed gene 10）（Ono, R. etal., Genomics 73, 2
32-237 (2001)）と同一であることが見出された。抗PEG
10抗体を用いた免疫組織化学的解析によりPEG10が癌特
異的に発現することが支持された。またPEG10を、この
遺伝子の内因的発現がない肝癌細胞に導入すると、細胞
増殖が促進することが判明した。PEG10の発現を抑制す
るアンチセンスS-オリゴヌクレオチドは、トランスフェ
クトした肝癌細胞の増殖を顕著に阻害した。さらに、本
発明者らはPEG10蛋白質が、アポトーシスに重要な役割
を果たすSIAH蛋白質（Roperch, J.P. et al., Proc. Na
tl. Acad. Sci. U S A. 96, 8070-8073 (1999)）と相互
作用することを実証した。アデノウイルスを介したSIAH
1の遺伝子導入は肝癌細胞の細胞死を誘導できたが、こ
れらの細胞でPEG10を過剰発現させると細胞死を抑制で
きることが判明した。これらの知見は、PEG10活性を抑
制することが肝細胞癌の処置のための創薬の新規なアプ
ローチとなることを示唆している。
【０００７】このように本発明者らは、PEG10蛋白質が
癌細胞の細胞死を抑制し、増殖を促進する活性を有する
ことを初めて実証した。さらに本発明者らは、PEG10蛋
白質は、SIAH蛋白質との相互作用による調節を受けるこ
とを証明した。これらの知見は、PEG10蛋白質レベルま
たはPEG10蛋白質とSIAH蛋白質との相互作用を調節する
ことにより、細胞死および細胞増殖を制御することが可
能となることを示している。このように、PEG10蛋白質
は癌の予防または治療のための理想的な分子ターゲット
となる。すなわち本発明は、PEG10蛋白質を介した細胞
死および細胞増殖の制御方法、およびPEG10蛋白質を利
用した癌抑制薬のスクリーニング方法等に関し、より具
体的には、（１）細胞におけるPEG10蛋白質レベルを上
昇または低下させる工程を含む、細胞の増殖をそれぞれ
促進または抑制する方法、（２）細胞におけるPEG10蛋
白質レベルを上昇または低下させる工程を含む、細胞死
をそれぞれ抑制または促進する方法、（３）細胞におけ
るPEG10蛋白質レベルを上昇または低下させる工程が、
細胞におけるPEG10蛋白質のSIAH蛋白質との相互作用レ
ベルを抑制または促進する工程である、（１）または
（２）に記載の方法、（４）細胞におけるPEG10蛋白質
レベルを上昇させる工程が、PEG10遺伝子を外来的に発
現させる工程である、（１）から（３）のいずれかに記
載の方法、（５）細胞におけるPEG10蛋白質レベルを低
下させる工程が、PEG10遺伝子に対するアンチセンスポ
リヌクレオチドを細胞に導入または発現させる工程であ
る、（１）から（３）のいずれかに記載の方法、（６）
細胞が癌細胞である、（１）から（５）のいずれかに記
載の方法、（７）癌細胞が肝癌細胞である、（６）に記
載の方法、（８）肝癌細胞が肝細胞癌細胞である、
（７）に記載の方法、（９）細胞増殖または細胞死を調
節する活性を有する化合物をスクリーニングする方法で
あって、（ａ）被検化合物を含む試料の存在下、細胞に
おけるPEG10遺伝子の発現レベルを検出する工程、
（ｂ）該発現レベルを上昇または低下させる活性を有す
る化合物を選択する工程、を含む方法、（１０）細胞増
殖または細胞死を調節する活性を有する化合物をスクリ
ーニングする方法であって、（ａ）被検化合物を含む試
料の存在下、PEG10蛋白質とSIAH蛋白質との相互作用を
検出する工程、（ｂ）該相互作用を上昇または低下させ
る活性を有する化合物を選択する工程、を含む方法、
（１１）細胞増殖または細胞死を調節する活性を有する
化合物をスクリーニングする方法であって、（ａ）被検
化合物を含む試料の存在下、PEG10蛋白質を外来的に発
現する細胞を培養する工程、（ｂ）該細胞の増殖または
細胞死を上昇または低下させる活性を有する化合物を選
択する工程、を含む方法、（１２）（９）から（１１）
のいずれかに記載の方法により単離しうる化合物を含
む、細胞増殖性疾患の予防または治療のための医薬組成
物、（１３）PEG10遺伝子に対するアンチセンスポリヌ
クレオチドを含む、（１２）に記載の医薬組成物、（１
４）PEG10遺伝子および/またはSIAH遺伝子の構造変異ま
たは発現異常を検出する工程を含む、肝癌の検査または
診断方法、（１５）肝癌が肝細胞癌である、（１４）に
記載の検査または診断方法、（１６）PEG10遺伝子また
はSIAH遺伝子の塩基配列またはその相補鎖の一部を含む
ポリヌクレオチド、あるいはPEG10蛋白質またはSIAH蛋
白質に結合する抗体を含む、肝癌の検査または診断試
薬、（１７）肝癌が肝細胞癌である、（１６）に記載の
検査または診断試薬、に関する。
癌細胞の細胞死を抑制し、増殖を促進する活性を有する
ことを初めて実証した。さらに本発明者らは、PEG10蛋
白質は、SIAH蛋白質との相互作用による調節を受けるこ
とを証明した。これらの知見は、PEG10蛋白質レベルま
たはPEG10蛋白質とSIAH蛋白質との相互作用を調節する
ことにより、細胞死および細胞増殖を制御することが可
能となることを示している。このように、PEG10蛋白質
は癌の予防または治療のための理想的な分子ターゲット
となる。すなわち本発明は、PEG10蛋白質を介した細胞
死および細胞増殖の制御方法、およびPEG10蛋白質を利
用した癌抑制薬のスクリーニング方法等に関し、より具
体的には、（１）細胞におけるPEG10蛋白質レベルを上
昇または低下させる工程を含む、細胞の増殖をそれぞれ
促進または抑制する方法、（２）細胞におけるPEG10蛋
白質レベルを上昇または低下させる工程を含む、細胞死
をそれぞれ抑制または促進する方法、（３）細胞におけ
るPEG10蛋白質レベルを上昇または低下させる工程が、
細胞におけるPEG10蛋白質のSIAH蛋白質との相互作用レ
ベルを抑制または促進する工程である、（１）または
（２）に記載の方法、（４）細胞におけるPEG10蛋白質
レベルを上昇させる工程が、PEG10遺伝子を外来的に発
現させる工程である、（１）から（３）のいずれかに記
載の方法、（５）細胞におけるPEG10蛋白質レベルを低
下させる工程が、PEG10遺伝子に対するアンチセンスポ
リヌクレオチドを細胞に導入または発現させる工程であ
る、（１）から（３）のいずれかに記載の方法、（６）
細胞が癌細胞である、（１）から（５）のいずれかに記
載の方法、（７）癌細胞が肝癌細胞である、（６）に記
載の方法、（８）肝癌細胞が肝細胞癌細胞である、
（７）に記載の方法、（９）細胞増殖または細胞死を調
節する活性を有する化合物をスクリーニングする方法で
あって、（ａ）被検化合物を含む試料の存在下、細胞に
おけるPEG10遺伝子の発現レベルを検出する工程、
（ｂ）該発現レベルを上昇または低下させる活性を有す
る化合物を選択する工程、を含む方法、（１０）細胞増
殖または細胞死を調節する活性を有する化合物をスクリ
ーニングする方法であって、（ａ）被検化合物を含む試
料の存在下、PEG10蛋白質とSIAH蛋白質との相互作用を
検出する工程、（ｂ）該相互作用を上昇または低下させ
る活性を有する化合物を選択する工程、を含む方法、
（１１）細胞増殖または細胞死を調節する活性を有する
化合物をスクリーニングする方法であって、（ａ）被検
化合物を含む試料の存在下、PEG10蛋白質を外来的に発
現する細胞を培養する工程、（ｂ）該細胞の増殖または
細胞死を上昇または低下させる活性を有する化合物を選
択する工程、を含む方法、（１２）（９）から（１１）
のいずれかに記載の方法により単離しうる化合物を含
む、細胞増殖性疾患の予防または治療のための医薬組成
物、（１３）PEG10遺伝子に対するアンチセンスポリヌ
クレオチドを含む、（１２）に記載の医薬組成物、（１
４）PEG10遺伝子および/またはSIAH遺伝子の構造変異ま
たは発現異常を検出する工程を含む、肝癌の検査または
診断方法、（１５）肝癌が肝細胞癌である、（１４）に
記載の検査または診断方法、（１６）PEG10遺伝子また
はSIAH遺伝子の塩基配列またはその相補鎖の一部を含む
ポリヌクレオチド、あるいはPEG10蛋白質またはSIAH蛋
白質に結合する抗体を含む、肝癌の検査または診断試
薬、（１７）肝癌が肝細胞癌である、（１６）に記載の
検査または診断試薬、に関する。
【０００８】HCCの大多数（cDNAマイクロアレイ、RT-PC
R、および/または免疫染色により解析した36のHCCのう
ち35）で発現が上昇していたPEG10遺伝子は、対応する
非癌肝組織では極めて低いレベルでしか発現していなか
ったことから、PEG10は診断マーカーとして有用であ
り、原発性肝細胞癌患者の治療のための薬剤開発の理想
的な分子ターゲットとなり得る。
R、および/または免疫染色により解析した36のHCCのう
ち35）で発現が上昇していたPEG10遺伝子は、対応する
非癌肝組織では極めて低いレベルでしか発現していなか
ったことから、PEG10は診断マーカーとして有用であ
り、原発性肝細胞癌患者の治療のための薬剤開発の理想
的な分子ターゲットとなり得る。
【０００９】内因性PEG10蛋白質を検出可能に発現しな
い肝癌細胞へのPEG10の導入は、有意な増殖促進活性を
発揮した。血清飢餓は、PEG10を高レベルで発現する細
胞の増殖を抑制しなかった。HEK293、Cos7、およびNIH3
T3細胞へのPEG10の導入は増殖を促進しなかった（デー
タ省略）ことから、本発明者らのデータは、PEG10の癌
遺伝子としての活性は、肝細胞に特異的である可能性が
高いことを示している。
い肝癌細胞へのPEG10の導入は、有意な増殖促進活性を
発揮した。血清飢餓は、PEG10を高レベルで発現する細
胞の増殖を抑制しなかった。HEK293、Cos7、およびNIH3
T3細胞へのPEG10の導入は増殖を促進しなかった（デー
タ省略）ことから、本発明者らのデータは、PEG10の癌
遺伝子としての活性は、肝細胞に特異的である可能性が
高いことを示している。
【００１０】PEG10はマウスmyelin expression factor
3（MyEF-3）と61.4％のホモロジーを示す。MyEF-3の遺
伝子産物は転写因子として機能し、脳の発生においてmy
elinbasic proteinの発現を制御すると考えられている
（Steplewski, A. et al., Biochem. Biophys. Res. Co
mmun. 243, 295-301 (1998)）。MyEF-3蛋白質は235アミ
ノ酸からなり、C末領域にzinc fingerドメインを有す
る。このドメインが保存されていること、そしてPEG10
は主にHCC細胞の核に局在する事実から、PEG10そのもの
が転写因子として機能する可能性がある。PEG10のN末領
域にはまた、一般に蛋白質間の相互作用に働くcoiled-c
oilモチーフが含まれることから、本発明者らは酵母two
-hybrid系を用いてPEG10と相互作用し得る蛋白質を検索
し、PEG10蛋白質がSIAH-1およびSIAH-2蛋白質と相互作
用できることを見出した。これらの蛋白質はDrosophila
seven in absentia（sina）のホモログであり、SIAH-2
蛋白質はDrosophilaの眼発生においてR7光受容体細胞の
運命決定に関与する（Carthew, R.W. & Rubin, G.M., C
ell 63, 561-577 (1990)）。また、ヒトSIAH1は、アポ
トーシスおよびp53依存的な細胞周期停止において発現
が誘導されることが報告されている（Roperch, J.P. et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 96, 8070-8073
(1999); Matsuzawa, S. et al., EMBO J. 17, 2736-274
7 (1998)）。ヒトSIAH-1は染色体バンド16q12-q13に位
置するが、この領域はHCCを含む様々な組織で発生した
癌において頻繁に欠失している（Medhioub, M. et al.,
Int. J. Cancer 87, 794-797 (2000); Okabe, H. et a
l., Hepatology 31, 1073-1079 (2000)）ことから、SIA
H1は癌抑制因子として機能する可能性が示唆される。HC
C細胞株でSIAH1の発現が減少しており、HCC細胞にSIAH1
を外来的に導入するとアポトーシスが誘導されることか
ら、SIAH1は肝発癌の抑制に重要な役割を果たしている
ことが示唆される。
3（MyEF-3）と61.4％のホモロジーを示す。MyEF-3の遺
伝子産物は転写因子として機能し、脳の発生においてmy
elinbasic proteinの発現を制御すると考えられている
（Steplewski, A. et al., Biochem. Biophys. Res. Co
mmun. 243, 295-301 (1998)）。MyEF-3蛋白質は235アミ
ノ酸からなり、C末領域にzinc fingerドメインを有す
る。このドメインが保存されていること、そしてPEG10
は主にHCC細胞の核に局在する事実から、PEG10そのもの
が転写因子として機能する可能性がある。PEG10のN末領
域にはまた、一般に蛋白質間の相互作用に働くcoiled-c
oilモチーフが含まれることから、本発明者らは酵母two
-hybrid系を用いてPEG10と相互作用し得る蛋白質を検索
し、PEG10蛋白質がSIAH-1およびSIAH-2蛋白質と相互作
用できることを見出した。これらの蛋白質はDrosophila
seven in absentia（sina）のホモログであり、SIAH-2
蛋白質はDrosophilaの眼発生においてR7光受容体細胞の
運命決定に関与する（Carthew, R.W. & Rubin, G.M., C
ell 63, 561-577 (1990)）。また、ヒトSIAH1は、アポ
トーシスおよびp53依存的な細胞周期停止において発現
が誘導されることが報告されている（Roperch, J.P. et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 96, 8070-8073
(1999); Matsuzawa, S. et al., EMBO J. 17, 2736-274
7 (1998)）。ヒトSIAH-1は染色体バンド16q12-q13に位
置するが、この領域はHCCを含む様々な組織で発生した
癌において頻繁に欠失している（Medhioub, M. et al.,
Int. J. Cancer 87, 794-797 (2000); Okabe, H. et a
l., Hepatology 31, 1073-1079 (2000)）ことから、SIA
H1は癌抑制因子として機能する可能性が示唆される。HC
C細胞株でSIAH1の発現が減少しており、HCC細胞にSIAH1
を外来的に導入するとアポトーシスが誘導されることか
ら、SIAH1は肝発癌の抑制に重要な役割を果たしている
ことが示唆される。
【００１１】SIAH-1蛋白質は、そのRING fingerドメイ
ンを介して、Kid（kinesin like DNAbinding protei
n）、BAG-1、およびDCC（deleted in colorectal cance
r）を含む幾つかの蛋白質のユビキチンを介したプロテ
オリシスに関与している（Hu, G.et al., Genes Dev. 1
1, 2701-2714 (1997); Germani, A. et al., Oncogene
19, 5997-6006 (2000); Hu, G. & Fearon, E.R., Mol.
Cell. Biol. 19, 724-732(1999)）。SIAH1は癌抑制因子
であるAPCと相互作用し、GSK3β（glycogen synthase k
inase 3β）に非依存的なdegradation complexの形成を
介してβ-cateninの分解を促進することが示されている
（Matsuzawa, S. & Reed, J.C., Mol. Cell 7, 915-926
(2001); Liu, J. et al., Mol. Cell 7, 927-936 (200
1)）。本発明者らのデータから、SIAH-1はPEG10蛋白質
の発現も用量依存的に低下させることが実証された。従
って、PEG10はSIAH-1によるユビキチン化の標的の１つ
である可能性が高い。さらに、本発明者らの実験から、
PEG10を安定に発現する細胞では、SIAH1を発現する組み
換えアデノウイルスAd-SIAH1に応答して起こる細胞死が
有意に減少することが判明した。このことから、PEG10
とSIAH1の発現の不均衡が、アポトーシスの抑制を介し
て肝発癌に関与している可能性が示唆される。PEG10
は、新しく定義された7q21のインプリンティング領域か
らpaternal（父方）に発現する遺伝子として単離された
（Ono, R. et al., Genomics 73, 232-237(2001)）。HC
Cにおけるこの遺伝子の発現亢進には、インプリンティ
ングの喪失が関与している可能性があるが、これを支持
する証拠は見出されなかった（データ省略）。PEG10の
プロモーター領域をさらに解析することは、この遺伝子
の発現上昇の機構を明らかにするために大いに役立つと
予想される。
ンを介して、Kid（kinesin like DNAbinding protei
n）、BAG-1、およびDCC（deleted in colorectal cance
r）を含む幾つかの蛋白質のユビキチンを介したプロテ
オリシスに関与している（Hu, G.et al., Genes Dev. 1
1, 2701-2714 (1997); Germani, A. et al., Oncogene
19, 5997-6006 (2000); Hu, G. & Fearon, E.R., Mol.
Cell. Biol. 19, 724-732(1999)）。SIAH1は癌抑制因子
であるAPCと相互作用し、GSK3β（glycogen synthase k
inase 3β）に非依存的なdegradation complexの形成を
介してβ-cateninの分解を促進することが示されている
（Matsuzawa, S. & Reed, J.C., Mol. Cell 7, 915-926
(2001); Liu, J. et al., Mol. Cell 7, 927-936 (200
1)）。本発明者らのデータから、SIAH-1はPEG10蛋白質
の発現も用量依存的に低下させることが実証された。従
って、PEG10はSIAH-1によるユビキチン化の標的の１つ
である可能性が高い。さらに、本発明者らの実験から、
PEG10を安定に発現する細胞では、SIAH1を発現する組み
換えアデノウイルスAd-SIAH1に応答して起こる細胞死が
有意に減少することが判明した。このことから、PEG10
とSIAH1の発現の不均衡が、アポトーシスの抑制を介し
て肝発癌に関与している可能性が示唆される。PEG10
は、新しく定義された7q21のインプリンティング領域か
らpaternal（父方）に発現する遺伝子として単離された
（Ono, R. et al., Genomics 73, 232-237(2001)）。HC
Cにおけるこの遺伝子の発現亢進には、インプリンティ
ングの喪失が関与している可能性があるが、これを支持
する証拠は見出されなかった（データ省略）。PEG10の
プロモーター領域をさらに解析することは、この遺伝子
の発現上昇の機構を明らかにするために大いに役立つと
予想される。
【００１２】また本発明者らは、アンチセンス S-オリ
ゴヌクレオチドの処理によりPEG10発現を低下させる
と、HCC細胞の増殖が有意に低下することを実証した。
興味深いことに、アンチセンス配列はPEG10を内因的に
発現するHCC細胞に対してのみ増殖を抑制し、そうでな
い細胞株の増殖は抑制しなかった。この遺伝子の発現は
HCC組織の大半で上昇しており、生殖腺を除く正常成体
ヒト組織では、いずれも非常に低いか発現していない。
従って、PEG10は原発性肝細胞癌の治療のための理想的
な分子標的になる可能性が高い。本発明は、肝発癌をよ
り深く理解し、新規な治療アプローチを開発するために
貢献するものである。
ゴヌクレオチドの処理によりPEG10発現を低下させる
と、HCC細胞の増殖が有意に低下することを実証した。
興味深いことに、アンチセンス配列はPEG10を内因的に
発現するHCC細胞に対してのみ増殖を抑制し、そうでな
い細胞株の増殖は抑制しなかった。この遺伝子の発現は
HCC組織の大半で上昇しており、生殖腺を除く正常成体
ヒト組織では、いずれも非常に低いか発現していない。
従って、PEG10は原発性肝細胞癌の治療のための理想的
な分子標的になる可能性が高い。本発明は、肝発癌をよ
り深く理解し、新規な治療アプローチを開発するために
貢献するものである。
【００１３】
【発明の実施の形態】本発明は、PEG10を介して細胞の
増殖および細胞死を制御する方法を提供する。細胞の増
殖を制御する本発明の方法は、細胞におけるPEG10蛋白
質レベルを上昇または低下させる工程を含む方法であ
る。細胞におけるPEG10蛋白質レベルを上昇させること
により、細胞の増殖は促進され、逆にPEG10蛋白質レベ
ルを低下させることにより、細胞の増殖は抑制される。
また、細胞におけるPEG10蛋白質レベルを上昇または低
下させる工程により、細胞死を制御することができる。
細胞におけるPEG10蛋白質レベルを上昇させることによ
り、細胞死は抑制され、逆にPEG10蛋白質レベルを低下
させることにより、細胞死は促進される。PEG10蛋白質
レベルの上昇および低下は、当業者に公知の数多くの手
段により達成することができる。
増殖および細胞死を制御する方法を提供する。細胞の増
殖を制御する本発明の方法は、細胞におけるPEG10蛋白
質レベルを上昇または低下させる工程を含む方法であ
る。細胞におけるPEG10蛋白質レベルを上昇させること
により、細胞の増殖は促進され、逆にPEG10蛋白質レベ
ルを低下させることにより、細胞の増殖は抑制される。
また、細胞におけるPEG10蛋白質レベルを上昇または低
下させる工程により、細胞死を制御することができる。
細胞におけるPEG10蛋白質レベルを上昇させることによ
り、細胞死は抑制され、逆にPEG10蛋白質レベルを低下
させることにより、細胞死は促進される。PEG10蛋白質
レベルの上昇および低下は、当業者に公知の数多くの手
段により達成することができる。
【００１４】例えば、細胞において、PEG10蛋白質を外
来的に発現させることができる。具体的には、例えばPE
G10蛋白質をコードする遺伝子を保持する発現ベクター
を細胞に導入する工程により、容易かつ効果的にPEG10
蛋白質レベルを上昇させることができる。すなわち本発
明は、PEG10遺伝子を外来的に発現させる工程を含む、
細胞の増殖をそれぞれ促進または抑制する方法、並びに
細胞死をそれぞれ抑制または促進する方法を提供する。
発現ベクターとしては特に制限はなく、プラスミドベク
ターおよびウイルスベクターを含む公知のベクター系を
利用することができる。例えば遺伝子治療などの目的で
も使用できるウイルスベクターとしては、レトロウイル
スベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイ
ルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、レンチウ
イルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、アルファ
ウイルスベクター、EBウイルスベクター、パピローマウ
イルスベクター、フォーミーウイルスベクターなどが挙
げられる。また、カチオニックリポソーム、リガンドDN
A複合体、ジーンガンなどの非ウイルスベクターなどに
よりPEG10遺伝子を導入して発現させることもできる
（Y. Niitsuら, Molecular Medicine 35: 1385-1395 (1
998)）。遺伝子は培養細胞、組織、器官、または生体内
等へ導入され得る。生体への遺伝子の導入は、インビボ
やエクスビボなどで行うことが考えられる。
来的に発現させることができる。具体的には、例えばPE
G10蛋白質をコードする遺伝子を保持する発現ベクター
を細胞に導入する工程により、容易かつ効果的にPEG10
蛋白質レベルを上昇させることができる。すなわち本発
明は、PEG10遺伝子を外来的に発現させる工程を含む、
細胞の増殖をそれぞれ促進または抑制する方法、並びに
細胞死をそれぞれ抑制または促進する方法を提供する。
発現ベクターとしては特に制限はなく、プラスミドベク
ターおよびウイルスベクターを含む公知のベクター系を
利用することができる。例えば遺伝子治療などの目的で
も使用できるウイルスベクターとしては、レトロウイル
スベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイ
ルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、レンチウ
イルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、アルファ
ウイルスベクター、EBウイルスベクター、パピローマウ
イルスベクター、フォーミーウイルスベクターなどが挙
げられる。また、カチオニックリポソーム、リガンドDN
A複合体、ジーンガンなどの非ウイルスベクターなどに
よりPEG10遺伝子を導入して発現させることもできる
（Y. Niitsuら, Molecular Medicine 35: 1385-1395 (1
998)）。遺伝子は培養細胞、組織、器官、または生体内
等へ導入され得る。生体への遺伝子の導入は、インビボ
やエクスビボなどで行うことが考えられる。
【００１５】また、インビトロで調製したPEG10蛋白質
を、細胞にトランスフェクションすることにより細胞に
おけるPEG10蛋白質レベルを上昇させることも可能であ
る。このためには、例えば組み換えPEG10蛋白質を公知
のトランスフェクション試薬と組み合わせて蛋白質を導
入することができる。あるいは、PEG10蛋白質を、マイ
クロインジェクターを用いて細胞に注入することもでき
る。
を、細胞にトランスフェクションすることにより細胞に
おけるPEG10蛋白質レベルを上昇させることも可能であ
る。このためには、例えば組み換えPEG10蛋白質を公知
のトランスフェクション試薬と組み合わせて蛋白質を導
入することができる。あるいは、PEG10蛋白質を、マイ
クロインジェクターを用いて細胞に注入することもでき
る。
【００１６】PEG10蛋白質レベルの低下は、PEG10遺伝子
の発現を阻害したり、あるいはPEG10蛋白質の分解を促
進することにより達成することができる。本発明者ら
は、ユビキチン-プロテオソームを介した蛋白質分解に
関与するSIAH1蛋白質が、PEG10蛋白質の発現を低下させ
ることを実証した。従って、例えば細胞においてSIAH1
蛋白質レベルを上昇させたり、あるいはPEG10蛋白質の
ユビキチン化を促進することにより、PEG10蛋白質の分
解を促進し、細胞におけるPEG10蛋白質レベルを低下さ
せることが可能である。細胞においてSIAH1蛋白質レベ
ルを上昇させるには、上記のPEG10蛋白質レベルを上昇
させる場合と同様の方法を適用すればよい。例えば、SI
AH1遺伝子を含むウイルスベクターを細胞に導入し、外
来的SIAH1蛋白質を発現させることにより、SIAH1蛋白質
レベルを上昇させることができる。また、細胞内におけ
るPEG10蛋白質の分解を抑制すれば、PEG10蛋白質レベル
を上昇させることができる。例えば、細胞内SIAH1蛋白
質レベルを低下させれば、SIAH1蛋白質によるPEG10蛋白
質分解が抑制され、細胞内PEG10蛋白質レベルが上昇す
る。SIAH1蛋白質レベルを低下させるには、例えばSIAH1
遺伝子の発現を阻害したり、あるいはSIAH1蛋白質の分
解を促進することにより達成することができる。また、
SIAH蛋白質の阻害剤により、SIAH蛋白質活性を阻害して
もよい。
の発現を阻害したり、あるいはPEG10蛋白質の分解を促
進することにより達成することができる。本発明者ら
は、ユビキチン-プロテオソームを介した蛋白質分解に
関与するSIAH1蛋白質が、PEG10蛋白質の発現を低下させ
ることを実証した。従って、例えば細胞においてSIAH1
蛋白質レベルを上昇させたり、あるいはPEG10蛋白質の
ユビキチン化を促進することにより、PEG10蛋白質の分
解を促進し、細胞におけるPEG10蛋白質レベルを低下さ
せることが可能である。細胞においてSIAH1蛋白質レベ
ルを上昇させるには、上記のPEG10蛋白質レベルを上昇
させる場合と同様の方法を適用すればよい。例えば、SI
AH1遺伝子を含むウイルスベクターを細胞に導入し、外
来的SIAH1蛋白質を発現させることにより、SIAH1蛋白質
レベルを上昇させることができる。また、細胞内におけ
るPEG10蛋白質の分解を抑制すれば、PEG10蛋白質レベル
を上昇させることができる。例えば、細胞内SIAH1蛋白
質レベルを低下させれば、SIAH1蛋白質によるPEG10蛋白
質分解が抑制され、細胞内PEG10蛋白質レベルが上昇す
る。SIAH1蛋白質レベルを低下させるには、例えばSIAH1
遺伝子の発現を阻害したり、あるいはSIAH1蛋白質の分
解を促進することにより達成することができる。また、
SIAH蛋白質の阻害剤により、SIAH蛋白質活性を阻害して
もよい。
【００１７】また、PEG10遺伝子の発現は、PEG10遺伝子
のアンチセンスポリヌクレオチドにより阻害することが
できる。PEG10遺伝子とは、PEG10蛋白質をコードするポ
リヌクレオチドを言う。PEG10遺伝子としては、天然に
存在する塩基配列であってもよく、人工的に作られた塩
基配列でもよい。例えば、PEG10蛋白質をコードする限
り、コドンの縮重に基づいて構成される任意の塩基配列
も本発明においてPEG10遺伝子に含まれる。PEG10遺伝子
としては、mRNA、cDNA、ゲノムDNAに由来するものであ
ってよい。PEG10遺伝子は、非翻訳配列（UTS）を含んで
いてもよい。PEG10遺伝子は、イントロンを含んでいる
ものも含まれる。これらのUTSおよびイントロンも、本
発明においてPEG10遺伝子の一部に含まれる。PEG10遺伝
子に対するアンチセンスポリヌクレオチドとしては、PE
G10遺伝子の転写産物のいずれかの箇所にハイブリダイ
ズするアンチセンスポリヌクレオチドが含まれる。PEG1
0遺伝子の転写産物としては、スプライシングを受け成
熟したmRNAのみならず、スプライシングされていない初
期転写産物、およびスプライシングの過程で生じる中間
産物が含まれる。例えば、本発明においてアンチセンス
ポリヌクレオチドは、PEG10遺伝子の転写産物の非翻訳
配列（UTS）、エクソン、またはイントロンの塩基配列
に対して相補的なポリヌクレオチドが含まれる。本発明
において、PEG10遺伝子の最初のエクソン-イントロン境
界を覆うアンチセンスポリヌクレオチドは、PEG10遺伝
子の発現を有意に低下させることが実証された。このよ
うに、エクソン-イントロン境界またはイントロン-エク
ソン境界を跨ぐようなアンチセンスポリヌクレオチド
は、PEG10遺伝子のスプライシングを阻害するために有
効と考えられる。また、PEG10転写産物の翻訳開始コド
ンを含む領域に対するアンチセンスポリヌクレオチドな
どであってもよい。
のアンチセンスポリヌクレオチドにより阻害することが
できる。PEG10遺伝子とは、PEG10蛋白質をコードするポ
リヌクレオチドを言う。PEG10遺伝子としては、天然に
存在する塩基配列であってもよく、人工的に作られた塩
基配列でもよい。例えば、PEG10蛋白質をコードする限
り、コドンの縮重に基づいて構成される任意の塩基配列
も本発明においてPEG10遺伝子に含まれる。PEG10遺伝子
としては、mRNA、cDNA、ゲノムDNAに由来するものであ
ってよい。PEG10遺伝子は、非翻訳配列（UTS）を含んで
いてもよい。PEG10遺伝子は、イントロンを含んでいる
ものも含まれる。これらのUTSおよびイントロンも、本
発明においてPEG10遺伝子の一部に含まれる。PEG10遺伝
子に対するアンチセンスポリヌクレオチドとしては、PE
G10遺伝子の転写産物のいずれかの箇所にハイブリダイ
ズするアンチセンスポリヌクレオチドが含まれる。PEG1
0遺伝子の転写産物としては、スプライシングを受け成
熟したmRNAのみならず、スプライシングされていない初
期転写産物、およびスプライシングの過程で生じる中間
産物が含まれる。例えば、本発明においてアンチセンス
ポリヌクレオチドは、PEG10遺伝子の転写産物の非翻訳
配列（UTS）、エクソン、またはイントロンの塩基配列
に対して相補的なポリヌクレオチドが含まれる。本発明
において、PEG10遺伝子の最初のエクソン-イントロン境
界を覆うアンチセンスポリヌクレオチドは、PEG10遺伝
子の発現を有意に低下させることが実証された。このよ
うに、エクソン-イントロン境界またはイントロン-エク
ソン境界を跨ぐようなアンチセンスポリヌクレオチド
は、PEG10遺伝子のスプライシングを阻害するために有
効と考えられる。また、PEG10転写産物の翻訳開始コド
ンを含む領域に対するアンチセンスポリヌクレオチドな
どであってもよい。
【００１８】アンチセンスポリヌクレオチドは、PEG10
蛋白質のコード領域全体をカバーするようなアンチセン
スポリヌクレオチドであってもよいし、PEG10遺伝子の
転写産物のごく一部に対するアンチセンスポリヌクレオ
チドであってもよい。アンチセンスポリヌクレオチド
は、PEG10蛋白質の発現を有効に阻害できるものであれ
ば、PEG10遺伝子の塩基配列もしくはその部分配列に対
し、完全に相補的でなくてもよいが、PEG10遺伝子のア
ンチセンス鎖の塩基配列に対し、好ましくは70％以上、
より好ましくは80％以上、さらに好ましくは90％以上の
同一性を有する。より好ましくは完全な（100％の）同
一性を有する。塩基配列の同一性は、例えば、Karlinお
よびAltschulによるアルゴリズムBLAST (Karlin, S. an
d Altschul, S.F., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:22
64-2268, 1990、Proc. Natl. Acad.Sci. USA 90:5873-5
877, 1993)によって決定することができる。BLASTとGap
pedBLASTプログラムを用いる場合には、各プログラムの
デフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の
具体的な手法は公知である(http://www.ncbi.nlm.nih.g
ov.)。あるいは、PEG10遺伝子に対するアンチセンスポ
リヌクレオチドは、PEG10遺伝子mRNAの塩基配列中の連
続する少なくとも15ヌクレオチド以上、好ましくは16ヌ
クレオチド以上、より好ましくは17、18、または20ヌク
レオチド以上に対して完全に相補的な（すなわちアンチ
センス鎖の塩基配列と100％の同一性を有する）塩基配
列を含むアンチセンスポリヌクレオチドも好ましい。ア
ンチセンスポリヌクレオチドは、DNAであってもRNAであ
ってもよい。また、修飾されたヌクレオチドを含むもの
であってもよい。また、PNA等の核酸類似体であっても
よい。PEG10遺伝子に対するアンチセンスポリヌクレオ
チドは、細胞増殖抑制剤、および細胞死促進剤（アポト
ーシス促進剤）として有用である。特にPEG10遺伝子に
対するアンチセンスポリヌクレオチドは、癌細胞、特に
肝癌細胞、より好ましくは肝細胞癌細胞に対する細胞死
誘導および細胞増殖抑制のための薬剤（試薬および医薬
を含む）として有用である。
蛋白質のコード領域全体をカバーするようなアンチセン
スポリヌクレオチドであってもよいし、PEG10遺伝子の
転写産物のごく一部に対するアンチセンスポリヌクレオ
チドであってもよい。アンチセンスポリヌクレオチド
は、PEG10蛋白質の発現を有効に阻害できるものであれ
ば、PEG10遺伝子の塩基配列もしくはその部分配列に対
し、完全に相補的でなくてもよいが、PEG10遺伝子のア
ンチセンス鎖の塩基配列に対し、好ましくは70％以上、
より好ましくは80％以上、さらに好ましくは90％以上の
同一性を有する。より好ましくは完全な（100％の）同
一性を有する。塩基配列の同一性は、例えば、Karlinお
よびAltschulによるアルゴリズムBLAST (Karlin, S. an
d Altschul, S.F., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:22
64-2268, 1990、Proc. Natl. Acad.Sci. USA 90:5873-5
877, 1993)によって決定することができる。BLASTとGap
pedBLASTプログラムを用いる場合には、各プログラムの
デフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の
具体的な手法は公知である(http://www.ncbi.nlm.nih.g
ov.)。あるいは、PEG10遺伝子に対するアンチセンスポ
リヌクレオチドは、PEG10遺伝子mRNAの塩基配列中の連
続する少なくとも15ヌクレオチド以上、好ましくは16ヌ
クレオチド以上、より好ましくは17、18、または20ヌク
レオチド以上に対して完全に相補的な（すなわちアンチ
センス鎖の塩基配列と100％の同一性を有する）塩基配
列を含むアンチセンスポリヌクレオチドも好ましい。ア
ンチセンスポリヌクレオチドは、DNAであってもRNAであ
ってもよい。また、修飾されたヌクレオチドを含むもの
であってもよい。また、PNA等の核酸類似体であっても
よい。PEG10遺伝子に対するアンチセンスポリヌクレオ
チドは、細胞増殖抑制剤、および細胞死促進剤（アポト
ーシス促進剤）として有用である。特にPEG10遺伝子に
対するアンチセンスポリヌクレオチドは、癌細胞、特に
肝癌細胞、より好ましくは肝細胞癌細胞に対する細胞死
誘導および細胞増殖抑制のための薬剤（試薬および医薬
を含む）として有用である。
【００１９】アンチセンスポリヌクレオチドは、これを
細胞に導入または発現させることによってPEG10遺伝子
の発現を阻害することができる。アンチセンスポリヌク
レオチドを細胞で発現させるためには、アンチセンスポ
リヌクレオチドをコードする発現ベクターを細胞に導入
する。発現ベクターとしては、例えば、上記のようなレ
トロウイルスベクター、アデノウィルスベクター、アデ
ノ随伴ウイルスベクターなどのウイルスベクターやリポ
ソームなどの非ウイルスベクターなどを利用することが
できる。また、アンチセンスポリヌクレオチドを直接細
胞に取り込ませることにより、PEG10遺伝子の発現を阻
害することができる。例えば、10〜30ヌクレオチド程度
のアンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞にトランスフ
ェクションすることが考えられる。本発明者らは、PEG1
0に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞にト
ランスフェクションすることにより、PEG10遺伝子の発
現を抑制することに成功した。従って、PEG10に対する
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、PEG10遺伝子の発
現を抑制するために好適に用いられる。アンチセンスポ
リヌクレオチドは天然のヌクレオチドから構成されてい
てもよいし、修飾ヌクレオチドなどを含んでもよい。ホ
スホロチオエート型オリゴヌクレオチド（S-オリゴ）は
本発明のアンチセンスポリヌクレオチドとして特に好適
である。ホスホロチオエート型オリゴヌクレオチドに
は、部分的にホスホロチオエートが挿入（部分S化）さ
れたものも含む。
細胞に導入または発現させることによってPEG10遺伝子
の発現を阻害することができる。アンチセンスポリヌク
レオチドを細胞で発現させるためには、アンチセンスポ
リヌクレオチドをコードする発現ベクターを細胞に導入
する。発現ベクターとしては、例えば、上記のようなレ
トロウイルスベクター、アデノウィルスベクター、アデ
ノ随伴ウイルスベクターなどのウイルスベクターやリポ
ソームなどの非ウイルスベクターなどを利用することが
できる。また、アンチセンスポリヌクレオチドを直接細
胞に取り込ませることにより、PEG10遺伝子の発現を阻
害することができる。例えば、10〜30ヌクレオチド程度
のアンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞にトランスフ
ェクションすることが考えられる。本発明者らは、PEG1
0に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞にト
ランスフェクションすることにより、PEG10遺伝子の発
現を抑制することに成功した。従って、PEG10に対する
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、PEG10遺伝子の発
現を抑制するために好適に用いられる。アンチセンスポ
リヌクレオチドは天然のヌクレオチドから構成されてい
てもよいし、修飾ヌクレオチドなどを含んでもよい。ホ
スホロチオエート型オリゴヌクレオチド（S-オリゴ）は
本発明のアンチセンスポリヌクレオチドとして特に好適
である。ホスホロチオエート型オリゴヌクレオチドに
は、部分的にホスホロチオエートが挿入（部分S化）さ
れたものも含む。
【００２０】本発明において「PEG10」蛋白質には、Gen
Bank Accession No. NM_015068 で同定されるヒトPEG10
（Ono, R. et al., Genomics 73, 232-237 (2001)）、
およびこれと同等の機能と有するホモログおよび派生体
などの構造的に類似した蛋白質が含まれる。ヒトPEG10
と同等の機能を有するとは、細胞増殖を促進する活性、
または細胞死を抑制する活性を有することを言う。これ
らの活性は、対象蛋白質を発現させない場合と比べ有意
な活性である。例えば、統計学的手法により有意水準5
％以上で有意と判断される活性である。これらの活性を
測定するには、例えば対象蛋白質をコードする発現ベク
ターを所望の細胞にトランスフェクションして、細胞増
殖または細胞死を測定すればよい。これらの測定方法の
詳細は後述する。細胞としては、特に肝細胞（hepatocy
te）または肝細胞に由来する細胞（肝細胞癌細胞を含
む）が好適である。例えば内因性PEG10蛋白質の発現が
ないあるいはほとんどない細胞を用いることができる。
例えば、Korea cell-line bankから入手可能なSNU423、
SNU449、またはSNU475等を用いて測定することができ
る。ヒトPEG10蛋白質のホモログとは、ヒトPEG10蛋白質
と同等の機能を有する他の生物が持つカウンターパート
を含む。また派生体には、ヒトPEG10蛋白質またはその
ホモログのアミノ酸配列において、１または複数のアミ
ノ酸が置換、欠失、付加、および/または挿入されたア
ミノ酸配列を有する蛋白質が含まれる。派生体は天然に
存在する蛋白質に限られず、アミノ酸配列を人工的に改
変する方法によっても調製することができる。この人工
的な改変は、例えば、蛋白質をコードするDNAを当業者
に公知の技術、すなわちdeletion-mutant作製方法、PCR
法、カセット変異法などを用いたsite-directed mutage
nesisにより実行することができる。改変されるアミノ
酸数は、ヒトPEG10蛋白質と同等の機能を有する限り制
限はないが、典型的には、元となるヒトPEG10蛋白質ま
たはそのホモログの全アミノ酸の10％以内であり、好ま
しくは全アミノ酸の5％以内であり、さらに好ましくは
全アミノ酸の1％以内であると考えられる。具体的に
は、改変されるアミノ酸数は30個以内が好ましく、より
好ましくは20個以内であり、さらに好ましくは10個以内
であり、さらに好ましくは5個以内である。アミノ酸配
列の改変にあたっては、PEG10蛋白質のC末領域に存在す
るzinc fingerドメインおよびN末領域に存在するcoiled
-coilモチーフにおいて、活性に必須のアミノ酸および
これらのモチーフで一般的に保存されているアミノ酸を
改変しないようにすることが好ましい。これらのモチー
フで保存されているアミノ酸は当業者によく知られてい
る。本発明において、ヒトPEG10蛋白質のホモログおよ
び派生体などの構造的に類似した蛋白質は、ヒトPEG10
蛋白質のアミノ酸配列と高い相同性を有することが好ま
しい。高い相同性とは、少なくとも70％以上、好ましく
は80％以上、さらに好ましくは90％以上、さらに好まし
くは95％以上、さらに好ましくは99％以上の配列の同一
性を指す。アミノ酸配列の同一性は、例えば、Karlinお
よびAltschulによるアルゴリズムBLAST (Karlin, S. an
d Altschul, S.F., Proc. Natl.Acad. Sci. USA 87:226
4-2268, 1990、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5
877, 1993)によって決定することができる。このアルゴ
リズムに基づいて、BLASTXと呼ばれるプログラムが開発
されている(Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403
-410, 1990)。BLASTXによってアミノ酸配列を解析する
場合には、パラメーターはたとえば score = 50、wordl
ength = 3とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用
いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーター
を用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知であ
る(http://www.ncbi.nlm.nih.gov.)。
Bank Accession No. NM_015068 で同定されるヒトPEG10
（Ono, R. et al., Genomics 73, 232-237 (2001)）、
およびこれと同等の機能と有するホモログおよび派生体
などの構造的に類似した蛋白質が含まれる。ヒトPEG10
と同等の機能を有するとは、細胞増殖を促進する活性、
または細胞死を抑制する活性を有することを言う。これ
らの活性は、対象蛋白質を発現させない場合と比べ有意
な活性である。例えば、統計学的手法により有意水準5
％以上で有意と判断される活性である。これらの活性を
測定するには、例えば対象蛋白質をコードする発現ベク
ターを所望の細胞にトランスフェクションして、細胞増
殖または細胞死を測定すればよい。これらの測定方法の
詳細は後述する。細胞としては、特に肝細胞（hepatocy
te）または肝細胞に由来する細胞（肝細胞癌細胞を含
む）が好適である。例えば内因性PEG10蛋白質の発現が
ないあるいはほとんどない細胞を用いることができる。
例えば、Korea cell-line bankから入手可能なSNU423、
SNU449、またはSNU475等を用いて測定することができ
る。ヒトPEG10蛋白質のホモログとは、ヒトPEG10蛋白質
と同等の機能を有する他の生物が持つカウンターパート
を含む。また派生体には、ヒトPEG10蛋白質またはその
ホモログのアミノ酸配列において、１または複数のアミ
ノ酸が置換、欠失、付加、および/または挿入されたア
ミノ酸配列を有する蛋白質が含まれる。派生体は天然に
存在する蛋白質に限られず、アミノ酸配列を人工的に改
変する方法によっても調製することができる。この人工
的な改変は、例えば、蛋白質をコードするDNAを当業者
に公知の技術、すなわちdeletion-mutant作製方法、PCR
法、カセット変異法などを用いたsite-directed mutage
nesisにより実行することができる。改変されるアミノ
酸数は、ヒトPEG10蛋白質と同等の機能を有する限り制
限はないが、典型的には、元となるヒトPEG10蛋白質ま
たはそのホモログの全アミノ酸の10％以内であり、好ま
しくは全アミノ酸の5％以内であり、さらに好ましくは
全アミノ酸の1％以内であると考えられる。具体的に
は、改変されるアミノ酸数は30個以内が好ましく、より
好ましくは20個以内であり、さらに好ましくは10個以内
であり、さらに好ましくは5個以内である。アミノ酸配
列の改変にあたっては、PEG10蛋白質のC末領域に存在す
るzinc fingerドメインおよびN末領域に存在するcoiled
-coilモチーフにおいて、活性に必須のアミノ酸および
これらのモチーフで一般的に保存されているアミノ酸を
改変しないようにすることが好ましい。これらのモチー
フで保存されているアミノ酸は当業者によく知られてい
る。本発明において、ヒトPEG10蛋白質のホモログおよ
び派生体などの構造的に類似した蛋白質は、ヒトPEG10
蛋白質のアミノ酸配列と高い相同性を有することが好ま
しい。高い相同性とは、少なくとも70％以上、好ましく
は80％以上、さらに好ましくは90％以上、さらに好まし
くは95％以上、さらに好ましくは99％以上の配列の同一
性を指す。アミノ酸配列の同一性は、例えば、Karlinお
よびAltschulによるアルゴリズムBLAST (Karlin, S. an
d Altschul, S.F., Proc. Natl.Acad. Sci. USA 87:226
4-2268, 1990、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5
877, 1993)によって決定することができる。このアルゴ
リズムに基づいて、BLASTXと呼ばれるプログラムが開発
されている(Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403
-410, 1990)。BLASTXによってアミノ酸配列を解析する
場合には、パラメーターはたとえば score = 50、wordl
ength = 3とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用
いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーター
を用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知であ
る(http://www.ncbi.nlm.nih.gov.)。
【００２１】本発明において「SIAH蛋白質」とは、Dros
ophila seven in absentiaのヒトホモログとして知られ
るヒトSIAH1およびSIAH2蛋白質、およびこれらと同等の
機能と有するホモログおよび派生体などの構造的にヒト
SIAH1またはSIAH2蛋白質と類似した蛋白質が含まれる。
ヒトSIAH1は、GenBank Accession No. NM_003031、XM_0
08013、U76247 等に示されている（Nemani, M. et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 9039-9042 (199
6); Hu, G.et al., Genes Dev. 11, 2701-2714(1997);
Hu, G. et al., Genomics 46, 103-111 (1997)）。ま
た、ヒトSIAH2は、例えばGenBank Accession No. NM_00
5067、XM_003089、XM_042171、Y15268、U76248 等に示
されている（Hu, G. et al., Genes Dev. 11, 2701-271
4 (1997);Hu, G. et al., Genomics 46, 103-111 (199
7); Germani, A. et al., Mol. Cell. Biol. 19, 3798-
3807 (1999)）。本発明におけるSIAH蛋白質は、好まし
くはヒトSIAH1蛋白質およびこれと同等の機能と有する
ホモログおよび派生体などのヒトSIAH1蛋白質と構造的
に類似した蛋白質である。
ophila seven in absentiaのヒトホモログとして知られ
るヒトSIAH1およびSIAH2蛋白質、およびこれらと同等の
機能と有するホモログおよび派生体などの構造的にヒト
SIAH1またはSIAH2蛋白質と類似した蛋白質が含まれる。
ヒトSIAH1は、GenBank Accession No. NM_003031、XM_0
08013、U76247 等に示されている（Nemani, M. et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 9039-9042 (199
6); Hu, G.et al., Genes Dev. 11, 2701-2714(1997);
Hu, G. et al., Genomics 46, 103-111 (1997)）。ま
た、ヒトSIAH2は、例えばGenBank Accession No. NM_00
5067、XM_003089、XM_042171、Y15268、U76248 等に示
されている（Hu, G. et al., Genes Dev. 11, 2701-271
4 (1997);Hu, G. et al., Genomics 46, 103-111 (199
7); Germani, A. et al., Mol. Cell. Biol. 19, 3798-
3807 (1999)）。本発明におけるSIAH蛋白質は、好まし
くはヒトSIAH1蛋白質およびこれと同等の機能と有する
ホモログおよび派生体などのヒトSIAH1蛋白質と構造的
に類似した蛋白質である。
【００２２】ヒトSIAH1蛋白質と同等の機能を有すると
は、本発明におけるPEG10蛋白質のいずれかと相互作用
し、該PEG10蛋白質による細胞増殖促進活性または細胞
死抑制活性を抑制することを言う。これらの活性は、対
象とするSIAH蛋白質を発現させない場合と比べ有意な活
性である。例えば、統計学的手法により有意水準5％以
上で有意と判断される活性である。これらの活性を測定
するには、例えばPEG10蛋白質を発現する細胞に対象蛋
白質をコードする発現ベクターをトランスフェクション
して、細胞増殖または細胞死を測定すればよい。これら
の測定方法の詳細は後述する。細胞としては、例えば内
因性PEG10蛋白質の発現が亢進した癌細胞などが用いら
れ得る他、PEG10蛋白質を外来的に発現させた細胞など
を用いることができる。特に肝細胞（hepatocyte）また
は肝細胞に由来する細胞（肝細胞癌細胞を含む）が好適
である。例えばPEG10蛋白質の発現が亢進した肝細胞癌
細胞株であるHepG2、Huh7、またはAlexanderなどが好適
である。あるいは、内因性PEG10蛋白質の発現がないSNU
423、SNU449、またはSNU475に外来的にPEG10蛋白質を発
現させた細胞などを用いてもよい。ヒトSIAH1またはSIA
H2蛋白質のホモログとは、該蛋白質と同等の機能を有す
る他の生物が持つカウンターパートを含む。例えば、ヒ
トSIAH1およびSIAH2のホモログとしては、マウス蛋白
質、アフリカツメガエル蛋白質等が既に知られている
（NM_009172、Z19580、M38384、Z19581、U89792、AF155
509等を参照）（Della, N.G. et al., Development 11
7, 1333-1343(1993); Bogdan, S. et al., Mech. Dev.
103, 61-69 (2001)）。また派生体には、ヒトSIAH1また
はSIAH2蛋白質およびそのホモログのアミノ酸配列にお
いて、１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、お
よび/または挿入されたアミノ酸配列を有する蛋白質が
含まれる。派生体は天然に存在する蛋白質およびアミノ
酸配列を人工的に改変した蛋白質を含む。改変されるア
ミノ酸数は、ヒトSIAH1またはSIAH2蛋白質と同等の機能
を有する限り制限はないが、典型的には、元となるヒト
SIAH1またはSIAH2蛋白質またはそのホモログの全アミノ
酸の10％以内であり、好ましくは全アミノ酸の5％以内
であり、さらに好ましくは全アミノ酸の1％以内である
と考えられる。具体的には、改変されるアミノ酸数は30
個以内が好ましく、より好ましくは20個以内であり、さ
らに好ましくは10個以内であり、さらに好ましくは5個
以内である。本発明において、ヒトSIAH1またはSIAH2蛋
白質のホモログおよび派生体等の構造的に類似した蛋白
質は、ヒトSIAH1またはSIAH2蛋白質のアミノ酸配列と高
い相同性を有することが好ましい。高い相同性とは、少
なくとも70％以上、好ましくは80％以上、さらに好まし
くは90％以上、さらに好ましくは95％以上、さらに好ま
しくは99％以上の配列の同一性を指す。アミノ酸配列の
同一性は上記の通り決定することができる。
は、本発明におけるPEG10蛋白質のいずれかと相互作用
し、該PEG10蛋白質による細胞増殖促進活性または細胞
死抑制活性を抑制することを言う。これらの活性は、対
象とするSIAH蛋白質を発現させない場合と比べ有意な活
性である。例えば、統計学的手法により有意水準5％以
上で有意と判断される活性である。これらの活性を測定
するには、例えばPEG10蛋白質を発現する細胞に対象蛋
白質をコードする発現ベクターをトランスフェクション
して、細胞増殖または細胞死を測定すればよい。これら
の測定方法の詳細は後述する。細胞としては、例えば内
因性PEG10蛋白質の発現が亢進した癌細胞などが用いら
れ得る他、PEG10蛋白質を外来的に発現させた細胞など
を用いることができる。特に肝細胞（hepatocyte）また
は肝細胞に由来する細胞（肝細胞癌細胞を含む）が好適
である。例えばPEG10蛋白質の発現が亢進した肝細胞癌
細胞株であるHepG2、Huh7、またはAlexanderなどが好適
である。あるいは、内因性PEG10蛋白質の発現がないSNU
423、SNU449、またはSNU475に外来的にPEG10蛋白質を発
現させた細胞などを用いてもよい。ヒトSIAH1またはSIA
H2蛋白質のホモログとは、該蛋白質と同等の機能を有す
る他の生物が持つカウンターパートを含む。例えば、ヒ
トSIAH1およびSIAH2のホモログとしては、マウス蛋白
質、アフリカツメガエル蛋白質等が既に知られている
（NM_009172、Z19580、M38384、Z19581、U89792、AF155
509等を参照）（Della, N.G. et al., Development 11
7, 1333-1343(1993); Bogdan, S. et al., Mech. Dev.
103, 61-69 (2001)）。また派生体には、ヒトSIAH1また
はSIAH2蛋白質およびそのホモログのアミノ酸配列にお
いて、１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、お
よび/または挿入されたアミノ酸配列を有する蛋白質が
含まれる。派生体は天然に存在する蛋白質およびアミノ
酸配列を人工的に改変した蛋白質を含む。改変されるア
ミノ酸数は、ヒトSIAH1またはSIAH2蛋白質と同等の機能
を有する限り制限はないが、典型的には、元となるヒト
SIAH1またはSIAH2蛋白質またはそのホモログの全アミノ
酸の10％以内であり、好ましくは全アミノ酸の5％以内
であり、さらに好ましくは全アミノ酸の1％以内である
と考えられる。具体的には、改変されるアミノ酸数は30
個以内が好ましく、より好ましくは20個以内であり、さ
らに好ましくは10個以内であり、さらに好ましくは5個
以内である。本発明において、ヒトSIAH1またはSIAH2蛋
白質のホモログおよび派生体等の構造的に類似した蛋白
質は、ヒトSIAH1またはSIAH2蛋白質のアミノ酸配列と高
い相同性を有することが好ましい。高い相同性とは、少
なくとも70％以上、好ましくは80％以上、さらに好まし
くは90％以上、さらに好ましくは95％以上、さらに好ま
しくは99％以上の配列の同一性を指す。アミノ酸配列の
同一性は上記の通り決定することができる。
【００２３】ある蛋白質のホモログ等の構造的に類似し
た蛋白質をコードするcDNAを単離するには、該蛋白質の
cDNAをプローブにしてcDNAライブラリーをスクリーニン
グすればよい。PEG10蛋白質およびSIAH蛋白質のホモロ
グ等の構造的に類似した蛋白質であって、各々と機能的
に同等の蛋白質をコードするDNAを得るためのストリン
ジェントなハイブリダイゼーション条件としては、当業
者であれば、適宜選択することができる。一例を示せ
ば、25％ホルムアミド、より厳しい条件では50％ホルム
アミド、4×SSC、50mM Hepes pH7.0、10×デンハルト溶
液、20μg/ml変性サケ精子DNAを含むハイブリダイゼー
ション溶液中、42℃で一晩プレハイブリダイゼーション
を行った後、標識したプローブを添加し、42℃で一晩保
温することによりハイブリダイゼーションを行う。その
後の洗浄における洗浄液および温度条件は、「1xSSC、
0.1% SDS、37℃」程度で、より厳しい条件としては「0.
5xSSC、0.1% SDS、42℃」程度で、さらに厳しい条件と
しては「0.5xSSC、0.1% SDS、60℃」程度で、さらに厳
しい条件としては「0.2xSSC、0.1% SDS、65℃」程度で
実施することができる。このようにハイブリダイゼーシ
ョンの洗浄の条件が厳しくなるほどプローブ配列と高い
相同性を有するDNAの単離を期待しうる。但し当業者で
あれば、上記SSC、SDSおよび温度の条件の組み合わせ以
外でも、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシー
を決定する上記若しくは他の要素（例えば、メンブレン
等の担体の種類、ハイブリダイゼーション溶液の組成、
プローブの長さやGC含量など）を適宜組み合わせること
により、上記と同様のストリンジェンシーを実現するこ
とが可能である。
た蛋白質をコードするcDNAを単離するには、該蛋白質の
cDNAをプローブにしてcDNAライブラリーをスクリーニン
グすればよい。PEG10蛋白質およびSIAH蛋白質のホモロ
グ等の構造的に類似した蛋白質であって、各々と機能的
に同等の蛋白質をコードするDNAを得るためのストリン
ジェントなハイブリダイゼーション条件としては、当業
者であれば、適宜選択することができる。一例を示せ
ば、25％ホルムアミド、より厳しい条件では50％ホルム
アミド、4×SSC、50mM Hepes pH7.0、10×デンハルト溶
液、20μg/ml変性サケ精子DNAを含むハイブリダイゼー
ション溶液中、42℃で一晩プレハイブリダイゼーション
を行った後、標識したプローブを添加し、42℃で一晩保
温することによりハイブリダイゼーションを行う。その
後の洗浄における洗浄液および温度条件は、「1xSSC、
0.1% SDS、37℃」程度で、より厳しい条件としては「0.
5xSSC、0.1% SDS、42℃」程度で、さらに厳しい条件と
しては「0.5xSSC、0.1% SDS、60℃」程度で、さらに厳
しい条件としては「0.2xSSC、0.1% SDS、65℃」程度で
実施することができる。このようにハイブリダイゼーシ
ョンの洗浄の条件が厳しくなるほどプローブ配列と高い
相同性を有するDNAの単離を期待しうる。但し当業者で
あれば、上記SSC、SDSおよび温度の条件の組み合わせ以
外でも、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシー
を決定する上記若しくは他の要素（例えば、メンブレン
等の担体の種類、ハイブリダイゼーション溶液の組成、
プローブの長さやGC含量など）を適宜組み合わせること
により、上記と同様のストリンジェンシーを実現するこ
とが可能である。
【００２４】細胞におけるPEG10蛋白質レベルを上昇ま
たは低下させるには、細胞におけるPEG10蛋白質のSIAH
蛋白質との相互作用レベルを促進または抑制する工程に
より実施することができる。本発明者らは、PEG10蛋白
質はSIAH蛋白質と相互作用することを見出し、この相互
作用がPEG10蛋白質による細胞増殖および細胞死を調節
することを実証した。「細胞におけるPEG10蛋白質のSIA
H蛋白質との相互作用レベル」とは、細胞内のPEG10蛋白
質全体に対するSIAH蛋白質と相互作用するPEG10蛋白質
の部分（割合）をいう。細胞におけるPEG10蛋白質のSIA
H蛋白質との相互作用レベルを上昇させることにより、P
EG10蛋白質の分解が促進され、細胞の増殖は抑制され
る。逆にPEG10蛋白質のSIAH蛋白質との相互作用レベル
を低下させることにより、PEG10蛋白質の分解が抑制さ
れ、細胞の増殖は促進される。また、細胞におけるPEG1
0蛋白質のSIAH蛋白質との相互作用レベルを上昇させる
ことにより、PEG10蛋白質の分解が促進され、細胞死が
促進される。逆にPEG10蛋白質のSIAH蛋白質との相互作
用レベルを低下させることにより、PEG10蛋白質の分解
が抑制され、細胞死が抑制される。細胞におけるPEG10
蛋白質のSIAH蛋白質との相互作用レベルは、例えば細胞
におけるSIAH蛋白質レベルを上昇させることにより上昇
させることができる。PEG10蛋白質発現が亢進している
細胞にSIAH蛋白質を発現させると、PEG10蛋白質の発現
が低下し、細胞死が誘導される。
たは低下させるには、細胞におけるPEG10蛋白質のSIAH
蛋白質との相互作用レベルを促進または抑制する工程に
より実施することができる。本発明者らは、PEG10蛋白
質はSIAH蛋白質と相互作用することを見出し、この相互
作用がPEG10蛋白質による細胞増殖および細胞死を調節
することを実証した。「細胞におけるPEG10蛋白質のSIA
H蛋白質との相互作用レベル」とは、細胞内のPEG10蛋白
質全体に対するSIAH蛋白質と相互作用するPEG10蛋白質
の部分（割合）をいう。細胞におけるPEG10蛋白質のSIA
H蛋白質との相互作用レベルを上昇させることにより、P
EG10蛋白質の分解が促進され、細胞の増殖は抑制され
る。逆にPEG10蛋白質のSIAH蛋白質との相互作用レベル
を低下させることにより、PEG10蛋白質の分解が抑制さ
れ、細胞の増殖は促進される。また、細胞におけるPEG1
0蛋白質のSIAH蛋白質との相互作用レベルを上昇させる
ことにより、PEG10蛋白質の分解が促進され、細胞死が
促進される。逆にPEG10蛋白質のSIAH蛋白質との相互作
用レベルを低下させることにより、PEG10蛋白質の分解
が抑制され、細胞死が抑制される。細胞におけるPEG10
蛋白質のSIAH蛋白質との相互作用レベルは、例えば細胞
におけるSIAH蛋白質レベルを上昇させることにより上昇
させることができる。PEG10蛋白質発現が亢進している
細胞にSIAH蛋白質を発現させると、PEG10蛋白質の発現
が低下し、細胞死が誘導される。
【００２５】細胞の増殖および細胞死の促進または抑制
は、公知の方法により検査することができる。例えば、
実施例に記載のように、MTT［3-(4,5-dimethylthiazol-
2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide］やWST-1［2-
(4-Iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophe
nyl)-2H-tetrazolium salt］等のテトラゾリウム塩を用
いたアッセイ、BrdU取り込みアッセイ、またはフローサ
イトメトリーによる細胞周期の測定などにより、細胞増
殖を検出することできる。細胞死は、例えばトリパンブ
ルー排除による生細胞測定や、上記の細胞周期の測定、
種々のアポトーシスアッセイにより検出することができ
る。本発明において細胞死の制御には、特にアポトーシ
スの制御を含む。アポトーシスは、例えば核の凝縮や断
片化を顕微鏡により観察したり、あるいはTUNEL（termi
nal transferase-mediated dUTPnick end-labeling）ア
ッセイやDNAラダーの検出等により検出することができ
る。これらのアッセイは当業者にはよく知られた一般的
な手法により実施することができるが、TUNELアッセイ
であれば、例えば、Apoptag Direct (Oncor)を用いて添
付のプロトコールに従って行うことが可能である。
は、公知の方法により検査することができる。例えば、
実施例に記載のように、MTT［3-(4,5-dimethylthiazol-
2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide］やWST-1［2-
(4-Iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophe
nyl)-2H-tetrazolium salt］等のテトラゾリウム塩を用
いたアッセイ、BrdU取り込みアッセイ、またはフローサ
イトメトリーによる細胞周期の測定などにより、細胞増
殖を検出することできる。細胞死は、例えばトリパンブ
ルー排除による生細胞測定や、上記の細胞周期の測定、
種々のアポトーシスアッセイにより検出することができ
る。本発明において細胞死の制御には、特にアポトーシ
スの制御を含む。アポトーシスは、例えば核の凝縮や断
片化を顕微鏡により観察したり、あるいはTUNEL（termi
nal transferase-mediated dUTPnick end-labeling）ア
ッセイやDNAラダーの検出等により検出することができ
る。これらのアッセイは当業者にはよく知られた一般的
な手法により実施することができるが、TUNELアッセイ
であれば、例えば、Apoptag Direct (Oncor)を用いて添
付のプロトコールに従って行うことが可能である。
【００２６】本発明において細胞増殖または細胞死を制
御する対象となる細胞は、PEG10蛋白質レベルの制御に
応答して細胞増殖または細胞死が調節される限り特に制
限はない。細胞増殖を抑制、および/または細胞死を促
進する目的には、好適には癌細胞が挙げられる。特に、
本発明の適用においては肝癌細胞への適用が好ましい。
肝癌には肝細胞癌および胆管細胞癌が含まれる。本発明
において細胞増殖を抑制および/または細胞死を促進す
るには、肝癌細胞の中でも特に肝細胞癌（HCC）が好適
である。本発明において肝細胞癌には、特に原発性肝細
胞癌が挙げられ、また原発性肝細胞癌に由来する転移癌
も含まれる。本発明の方法を癌細胞に適用して、癌細胞
におけるPEG10蛋白質レベルを低下させることにより、
この癌細胞の増殖を抑制し、アポトーシスを誘導するこ
とができる。PEG10蛋白質は原発性肝細胞癌において発
現が亢進しており、正常肝では発現がほとんど認められ
ないことから、肝細胞癌の予防および治療において、PE
G10蛋白質レベルの制御は理想的な戦略となり得る。ま
た、正常細胞または非癌細胞に本発明の方法を適用する
ことも有用である。生殖細胞を除き、大部分の臓器で
は、PEG10遺伝子の発現は検出されないか、ほとんど発
現していない。これらの細胞においてPEG10蛋白質レベ
ルを上昇させることにより細胞増殖を促進すれば、癌細
胞モデルとして利用することができる。このような細胞
は、PEG10遺伝子以外に変異を有さないことが期待で
き、PEG10蛋白質を標的とした薬剤スクリーニングなど
において有用である。細胞増殖を促進、または細胞死を
抑制する目的には、好適には肝臓細胞、特に肝細胞（he
patocytes）が好ましい。
御する対象となる細胞は、PEG10蛋白質レベルの制御に
応答して細胞増殖または細胞死が調節される限り特に制
限はない。細胞増殖を抑制、および/または細胞死を促
進する目的には、好適には癌細胞が挙げられる。特に、
本発明の適用においては肝癌細胞への適用が好ましい。
肝癌には肝細胞癌および胆管細胞癌が含まれる。本発明
において細胞増殖を抑制および/または細胞死を促進す
るには、肝癌細胞の中でも特に肝細胞癌（HCC）が好適
である。本発明において肝細胞癌には、特に原発性肝細
胞癌が挙げられ、また原発性肝細胞癌に由来する転移癌
も含まれる。本発明の方法を癌細胞に適用して、癌細胞
におけるPEG10蛋白質レベルを低下させることにより、
この癌細胞の増殖を抑制し、アポトーシスを誘導するこ
とができる。PEG10蛋白質は原発性肝細胞癌において発
現が亢進しており、正常肝では発現がほとんど認められ
ないことから、肝細胞癌の予防および治療において、PE
G10蛋白質レベルの制御は理想的な戦略となり得る。ま
た、正常細胞または非癌細胞に本発明の方法を適用する
ことも有用である。生殖細胞を除き、大部分の臓器で
は、PEG10遺伝子の発現は検出されないか、ほとんど発
現していない。これらの細胞においてPEG10蛋白質レベ
ルを上昇させることにより細胞増殖を促進すれば、癌細
胞モデルとして利用することができる。このような細胞
は、PEG10遺伝子以外に変異を有さないことが期待で
き、PEG10蛋白質を標的とした薬剤スクリーニングなど
において有用である。細胞増殖を促進、または細胞死を
抑制する目的には、好適には肝臓細胞、特に肝細胞（he
patocytes）が好ましい。
【００２７】また本発明は、以下に述べる細胞増殖また
は細胞死を調節する活性を有する化合物のスクリーニン
グ方法を提供する。これらのスクリーニングで選択され
る化合物は、上記した細胞増殖および細胞死の制御のた
めに用いることができる。細胞増殖または細胞死を調節
する活性を有する化合物をスクリーニングする本発明の
方法の一つの態様は、（ａ）被検化合物を含む試料の存
在下、細胞におけるPEG10遺伝子の発現レベルを検出す
る工程、および（ｂ）該発現レベルを上昇または低下さ
せる活性を有する化合物を選択する工程、を含む方法で
ある。このスクリーニング方法は、具体的には以下のよ
うな工程を含む方法が含まれる。
は細胞死を調節する活性を有する化合物のスクリーニン
グ方法を提供する。これらのスクリーニングで選択され
る化合物は、上記した細胞増殖および細胞死の制御のた
めに用いることができる。細胞増殖または細胞死を調節
する活性を有する化合物をスクリーニングする本発明の
方法の一つの態様は、（ａ）被検化合物を含む試料の存
在下、細胞におけるPEG10遺伝子の発現レベルを検出す
る工程、および（ｂ）該発現レベルを上昇または低下さ
せる活性を有する化合物を選択する工程、を含む方法で
ある。このスクリーニング方法は、具体的には以下のよ
うな工程を含む方法が含まれる。
【００２８】（ａ）被検化合物を含む試料の存在下、細
胞におけるPEG10 mRNAを検出する工程、および（ｂ）該
mRNA量を上昇または低下させる活性を有する化合物を選
択する工程。 （ａ）被検化合物を含む試料の存在下、細胞におけるPE
G10蛋白質を検出する工程、および（ｂ）該蛋白質量を
上昇または低下させる活性を有する化合物を選択する工
程。 （ａ）被検化合物を含む試料の存在下、細胞におけるPE
G10遺伝子プロモーターの転写活性を検出する工程、お
よび（ｂ）該転写活性を上昇または低下させる活性を有
する化合物を選択する工程。 （ａ）被検化合物を含む試料の存在下、細胞におけるPE
G10蛋白質の活性を検出する工程、および（ｂ）該活性
を上昇または低下させる活性を有する化合物を選択する
工程。
胞におけるPEG10 mRNAを検出する工程、および（ｂ）該
mRNA量を上昇または低下させる活性を有する化合物を選
択する工程。 （ａ）被検化合物を含む試料の存在下、細胞におけるPE
G10蛋白質を検出する工程、および（ｂ）該蛋白質量を
上昇または低下させる活性を有する化合物を選択する工
程。 （ａ）被検化合物を含む試料の存在下、細胞におけるPE
G10遺伝子プロモーターの転写活性を検出する工程、お
よび（ｂ）該転写活性を上昇または低下させる活性を有
する化合物を選択する工程。 （ａ）被検化合物を含む試料の存在下、細胞におけるPE
G10蛋白質の活性を検出する工程、および（ｂ）該活性
を上昇または低下させる活性を有する化合物を選択する
工程。
【００２９】PEG10 mRNAは、ノーザンブロッティング、
RT-PCRなどの公知の方法により検出することができる。
RT-PCR解析の具体例は、例えば実施例３に記載されてい
る。TaqMan PCR等により、発現レベルのより正確な定量
を行うことも可能である（Okabe, H. et al., Cancer R
es. 61, 2129-2137 (2001)）。また、PEG10蛋白質は、P
EG10蛋白質に対する抗体を用いたウェスタンブロッティ
ング、免疫沈降、ELISA（enzyme linked immunosorbent
assay）、免疫組織化学染色などにより検出することが
できる。PEG10蛋白質に対する抗体は、PEG10蛋白質の全
長または部分アミノ酸配列を含む合成ペプチドを用い
て、公知の方法により製造することができる。PEG10抗
体は、ポリクローナル抗体でも、モノクローナル抗体で
もよい。PEG10抗体を用いたウェスタンブロッティング
および免疫組織化学染色の具体例は、例えば実施例３に
記載されている。
RT-PCRなどの公知の方法により検出することができる。
RT-PCR解析の具体例は、例えば実施例３に記載されてい
る。TaqMan PCR等により、発現レベルのより正確な定量
を行うことも可能である（Okabe, H. et al., Cancer R
es. 61, 2129-2137 (2001)）。また、PEG10蛋白質は、P
EG10蛋白質に対する抗体を用いたウェスタンブロッティ
ング、免疫沈降、ELISA（enzyme linked immunosorbent
assay）、免疫組織化学染色などにより検出することが
できる。PEG10蛋白質に対する抗体は、PEG10蛋白質の全
長または部分アミノ酸配列を含む合成ペプチドを用い
て、公知の方法により製造することができる。PEG10抗
体は、ポリクローナル抗体でも、モノクローナル抗体で
もよい。PEG10抗体を用いたウェスタンブロッティング
および免疫組織化学染色の具体例は、例えば実施例３に
記載されている。
【００３０】本発明のスクリーニングに用いる被検化合
物を含む試料としては、これらに制限されないが、例え
ば、合成低分子化合物のライブラリー、精製タンパク
質、遺伝子ライブラリーの発現産物、天然または合成ペ
プチドのライブラリー、細胞抽出液、細胞培養上清、天
然化合物、血清成分などが挙げられる。
物を含む試料としては、これらに制限されないが、例え
ば、合成低分子化合物のライブラリー、精製タンパク
質、遺伝子ライブラリーの発現産物、天然または合成ペ
プチドのライブラリー、細胞抽出液、細胞培養上清、天
然化合物、血清成分などが挙げられる。
【００３１】また、これらのスクリーニングに用いる細
胞は上記と同様であり、特に制限はなく、例えばPEG10
遺伝子発現を低下させる化合物をスクリーニングする場
合には、PEG10遺伝子発現の亢進が見られる癌細胞株ま
たは初代癌細胞などを用いることができる。好適には、
肝癌細胞、特に肝細胞癌細胞（HCC）が用いられる。HCC
ではほとんどの細胞でPEG10遺伝子発現が亢進している
ことから、それらの細胞をスクリーニングに用いること
ができるが、例えば、HepG2、Huh7、Alexanderなどを例
示することができる。被検化合物を含む試料の存在下で
これらの細胞を培養し、PEG10 mRNAまたは蛋白質の発現
を測定する。被検化合物を添加しないで同様の操作を行
った際の発現レベルと比較し、PEG10 mRNAまたは蛋白質
レベルを上昇または低下させる化合物を選択する。PEG1
0 mRNAまたは蛋白質レベルを上昇させる化合物は、PEG1
0遺伝子の発現を亢進させ、細胞増殖を促進し、アポト
ーシスを抑制する薬剤として有用である。PEG10 mRNAま
たは蛋白質レベルを低下させる化合物は、PEG10遺伝子
の発現を低下させ、細胞増殖を抑制し、アポトーシスを
促進させる薬剤として有用である。PEG10遺伝子の発現
を低下させる化合物は、特に癌の予防または治療薬とし
ての利用が期待される。
胞は上記と同様であり、特に制限はなく、例えばPEG10
遺伝子発現を低下させる化合物をスクリーニングする場
合には、PEG10遺伝子発現の亢進が見られる癌細胞株ま
たは初代癌細胞などを用いることができる。好適には、
肝癌細胞、特に肝細胞癌細胞（HCC）が用いられる。HCC
ではほとんどの細胞でPEG10遺伝子発現が亢進している
ことから、それらの細胞をスクリーニングに用いること
ができるが、例えば、HepG2、Huh7、Alexanderなどを例
示することができる。被検化合物を含む試料の存在下で
これらの細胞を培養し、PEG10 mRNAまたは蛋白質の発現
を測定する。被検化合物を添加しないで同様の操作を行
った際の発現レベルと比較し、PEG10 mRNAまたは蛋白質
レベルを上昇または低下させる化合物を選択する。PEG1
0 mRNAまたは蛋白質レベルを上昇させる化合物は、PEG1
0遺伝子の発現を亢進させ、細胞増殖を促進し、アポト
ーシスを抑制する薬剤として有用である。PEG10 mRNAま
たは蛋白質レベルを低下させる化合物は、PEG10遺伝子
の発現を低下させ、細胞増殖を抑制し、アポトーシスを
促進させる薬剤として有用である。PEG10遺伝子の発現
を低下させる化合物は、特に癌の予防または治療薬とし
ての利用が期待される。
【００３２】また、PEG10遺伝子プロモーターを利用し
てスクリーニングを行うことができる。この方法では、
PEG10遺伝子の発現を制御している転写制御領域または
その一部の配列を、レポーター遺伝子と機能的に結合さ
せたレポーター構築物を作製し、これを導入した細胞を
用いてスクリーニングを行う。具体的には、（ａ）被検
化合物を含む試料の存在下、該レポーター構築物を含む
細胞における該レポーター遺伝子の発現量を検出する工
程、（ｂ）被検化合物非存在下における場合と比較し
て、レポーター遺伝子の発現量を上昇または低下させる
化合物を選択する工程、を含む方法である。「機能的に
結合した」とは、PEG10遺伝子の発現を制御しているプ
ロモーター領域またはその一部の配列に依存して、レポ
ーター遺伝子の発現が制御されるように、該配列とレポ
ーター遺伝子とが結合していることをいう。レポーター
遺伝子の上流には、PEG10遺伝子以外の遺伝子に由来す
るプロモーター配列が含まれていてもよい。例えば、SV
40やその他の汎用プロモーターなどに由来する最小単位
のプロモーター配列を備え、さらに該プロモーター配列
近傍にPEG10遺伝子由来の転写制御配列を配置させるこ
とができる。このようなキメラプロモーターを使ったア
ッセイは、当業者が通常行っている。
てスクリーニングを行うことができる。この方法では、
PEG10遺伝子の発現を制御している転写制御領域または
その一部の配列を、レポーター遺伝子と機能的に結合さ
せたレポーター構築物を作製し、これを導入した細胞を
用いてスクリーニングを行う。具体的には、（ａ）被検
化合物を含む試料の存在下、該レポーター構築物を含む
細胞における該レポーター遺伝子の発現量を検出する工
程、（ｂ）被検化合物非存在下における場合と比較し
て、レポーター遺伝子の発現量を上昇または低下させる
化合物を選択する工程、を含む方法である。「機能的に
結合した」とは、PEG10遺伝子の発現を制御しているプ
ロモーター領域またはその一部の配列に依存して、レポ
ーター遺伝子の発現が制御されるように、該配列とレポ
ーター遺伝子とが結合していることをいう。レポーター
遺伝子の上流には、PEG10遺伝子以外の遺伝子に由来す
るプロモーター配列が含まれていてもよい。例えば、SV
40やその他の汎用プロモーターなどに由来する最小単位
のプロモーター配列を備え、さらに該プロモーター配列
近傍にPEG10遺伝子由来の転写制御配列を配置させるこ
とができる。このようなキメラプロモーターを使ったア
ッセイは、当業者が通常行っている。
【００３３】PEG10遺伝子のプロモーター配列は、ゲノ
ムDNAから単離することができる。例えば、PEG10 cDNA
をプローブとしたゲノムDNAライブラリーのスクリーニ
ング等により、PEG10の転写開始部位の上流領域のDNAを
単離する。一般に、転写開始部位から上流数kbの配列中
に、発現を制御している調節配列が複数存在している。
PEG10遺伝子の発現を制御する転写制御配列は、例えば
単離したDNAを段階的に欠失させたシリーズを作製し、
レポーター遺伝子を用いてプロモーターアッセイを行う
ことにより特定することができる。より詳細には、部位
特異的変異導入により転写活性が低下するかを確認した
り、あるいは候補配列を含むオリゴヌクレオチドを用い
たEMSA（electrophoretic mobility shift assay）や競
合アッセイ等により転写因子の関与を確認することもで
きる（J. Sambrook and D. W. Russell eds., "Molecul
ar cloning: a laboratory manual", 3rd ed., Cold Sp
ring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,
NY, 2001）。レポーター遺伝子としては、その発現を検
出し得るものであれば特に制限はなく、当業者が一般的
に各種解析系に使用し得るレポーター遺伝子、ルシフェ
ラーゼ遺伝子、CAT（chrolamphenicol acetyl taransfe
rase）遺伝子、βカラクトシダーゼ遺伝子などのいずれ
を使用することができる。
ムDNAから単離することができる。例えば、PEG10 cDNA
をプローブとしたゲノムDNAライブラリーのスクリーニ
ング等により、PEG10の転写開始部位の上流領域のDNAを
単離する。一般に、転写開始部位から上流数kbの配列中
に、発現を制御している調節配列が複数存在している。
PEG10遺伝子の発現を制御する転写制御配列は、例えば
単離したDNAを段階的に欠失させたシリーズを作製し、
レポーター遺伝子を用いてプロモーターアッセイを行う
ことにより特定することができる。より詳細には、部位
特異的変異導入により転写活性が低下するかを確認した
り、あるいは候補配列を含むオリゴヌクレオチドを用い
たEMSA（electrophoretic mobility shift assay）や競
合アッセイ等により転写因子の関与を確認することもで
きる（J. Sambrook and D. W. Russell eds., "Molecul
ar cloning: a laboratory manual", 3rd ed., Cold Sp
ring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,
NY, 2001）。レポーター遺伝子としては、その発現を検
出し得るものであれば特に制限はなく、当業者が一般的
に各種解析系に使用し得るレポーター遺伝子、ルシフェ
ラーゼ遺伝子、CAT（chrolamphenicol acetyl taransfe
rase）遺伝子、βカラクトシダーゼ遺伝子などのいずれ
を使用することができる。
【００３４】このスクリーニングに用いる細胞は上記と
同様であり、特に制限はなく、例えばPEG10遺伝子発現
を低下させる化合物をスクリーニングする場合には、PE
G10遺伝子発現の亢進が見られる癌細胞株または初代癌
細胞などを用いることができる。好適には、肝癌細胞、
特に肝細胞癌細胞（HCC cells）が用いられる。HCCでは
ほとんどの細胞でPEG10遺伝子発現が亢進しており、こ
れらのいずれの細胞もスクリーニングに用いることがで
きるが、例えば、HepG2、Huh7、Alexanderなどを例示す
ることができる。また、これら細胞へのレポーターベク
ターの導入は、当業者に公知の種々の方法、例えば、電
気パルス穿孔法、リポフェクチン法等を利用して行うこ
とができる。さらに、発現量の検出は、該レポーター遺
伝子の種類に応じて、当業者によって一般的に行われる
方法で実施することができる。例えば、レポーター遺伝
子としてルシフェラーゼ遺伝子を用いた場合、市販のDu
al Luciferase system (Promega)を用いて、ルシフェラ
ーゼ活性の測定を行うことができる。
同様であり、特に制限はなく、例えばPEG10遺伝子発現
を低下させる化合物をスクリーニングする場合には、PE
G10遺伝子発現の亢進が見られる癌細胞株または初代癌
細胞などを用いることができる。好適には、肝癌細胞、
特に肝細胞癌細胞（HCC cells）が用いられる。HCCでは
ほとんどの細胞でPEG10遺伝子発現が亢進しており、こ
れらのいずれの細胞もスクリーニングに用いることがで
きるが、例えば、HepG2、Huh7、Alexanderなどを例示す
ることができる。また、これら細胞へのレポーターベク
ターの導入は、当業者に公知の種々の方法、例えば、電
気パルス穿孔法、リポフェクチン法等を利用して行うこ
とができる。さらに、発現量の検出は、該レポーター遺
伝子の種類に応じて、当業者によって一般的に行われる
方法で実施することができる。例えば、レポーター遺伝
子としてルシフェラーゼ遺伝子を用いた場合、市販のDu
al Luciferase system (Promega)を用いて、ルシフェラ
ーゼ活性の測定を行うことができる。
【００３５】検出結果の評価は、被検化合物を添加しな
いで同様の操作を行った際の発現量と比較して行い、評
価の結果、レポーター遺伝子の発現量を上昇または低下
させる化合物を選択する。レポーター遺伝子の発現を上
昇させる化合物は、PEG10遺伝子の発現を亢進させ、細
胞増殖を促進し、アポトーシスを抑制する薬剤として有
用である。レポーター遺伝子の発現を低下させる化合物
は、PEG10遺伝子の発現を低下させ、細胞増殖を抑制
し、アポトーシスを促進させる薬剤として有用である。
PEG10遺伝子の発現を低下させる化合物は、特に癌の予
防または治療薬としての利用が期待される。
いで同様の操作を行った際の発現量と比較して行い、評
価の結果、レポーター遺伝子の発現量を上昇または低下
させる化合物を選択する。レポーター遺伝子の発現を上
昇させる化合物は、PEG10遺伝子の発現を亢進させ、細
胞増殖を促進し、アポトーシスを抑制する薬剤として有
用である。レポーター遺伝子の発現を低下させる化合物
は、PEG10遺伝子の発現を低下させ、細胞増殖を抑制
し、アポトーシスを促進させる薬剤として有用である。
PEG10遺伝子の発現を低下させる化合物は、特に癌の予
防または治療薬としての利用が期待される。
【００３６】また、PEG10蛋白質の活性の検出を通して
スクリーニングを行うことができる。本発明者らは、PE
G10蛋白質が核に移行する活性を有することを実証し
た。また本発明者らは、PEG10蛋白質が細胞増殖を促進
する活性を有すること、さらに細胞死を抑制する活性を
有することを明らかにした。また本発明者らは、PEG10
蛋白質がSIAH蛋白質と結合する活性を有することを見出
した。また、PEG10蛋白質はC末領域にzinc fingerドメ
インを有し、転写因子として知られるMyEF-3蛋白質と類
似性を持つ。PEG10は主に核に局在する事実からも、PEG
10が転写因子として機能する可能性が支持される。これ
らのPEG10蛋白質の活性を指標に、細胞増殖または細胞
死を調節する活性を有する化合物をスクリーニングする
ことが可能となる。例えば、核移行を指標にしたスクリ
ーニングは、具体的には、（ａ）被検化合物を含む試料
の存在下、細胞におけるPEG10蛋白質の核移行を検出す
る工程、および（ｂ）該核移行を促進または抑制する活
性を有する化合物を選択する工程、を含む方法により実
施することができる。
スクリーニングを行うことができる。本発明者らは、PE
G10蛋白質が核に移行する活性を有することを実証し
た。また本発明者らは、PEG10蛋白質が細胞増殖を促進
する活性を有すること、さらに細胞死を抑制する活性を
有することを明らかにした。また本発明者らは、PEG10
蛋白質がSIAH蛋白質と結合する活性を有することを見出
した。また、PEG10蛋白質はC末領域にzinc fingerドメ
インを有し、転写因子として知られるMyEF-3蛋白質と類
似性を持つ。PEG10は主に核に局在する事実からも、PEG
10が転写因子として機能する可能性が支持される。これ
らのPEG10蛋白質の活性を指標に、細胞増殖または細胞
死を調節する活性を有する化合物をスクリーニングする
ことが可能となる。例えば、核移行を指標にしたスクリ
ーニングは、具体的には、（ａ）被検化合物を含む試料
の存在下、細胞におけるPEG10蛋白質の核移行を検出す
る工程、および（ｂ）該核移行を促進または抑制する活
性を有する化合物を選択する工程、を含む方法により実
施することができる。
【００３７】PEG10蛋白質の核移行を検出するには、抗P
EG10抗体を用いて免疫組織化学染色を行ったり、細胞か
ら核を調製後、免疫沈降またはウェスタンブロッティン
グなどにより核画分に含まれるPEG10蛋白質を検出すれ
ばよい。あるいは、PEG10蛋白質にGFPなどの標識ペプチ
ドを付加した融合蛋白質を細胞で発現させれば、より簡
便にPEG10蛋白質の細胞内局在を検出することができ
る。被検化合物を含む試料により、細胞内のPEG10蛋白
質に対する核に存在するPEG10蛋白質の割合が上昇また
は低下すれば、この化合物はPEG10蛋白質の核移行をそ
れぞれ促進または抑制すると判断される。
EG10抗体を用いて免疫組織化学染色を行ったり、細胞か
ら核を調製後、免疫沈降またはウェスタンブロッティン
グなどにより核画分に含まれるPEG10蛋白質を検出すれ
ばよい。あるいは、PEG10蛋白質にGFPなどの標識ペプチ
ドを付加した融合蛋白質を細胞で発現させれば、より簡
便にPEG10蛋白質の細胞内局在を検出することができ
る。被検化合物を含む試料により、細胞内のPEG10蛋白
質に対する核に存在するPEG10蛋白質の割合が上昇また
は低下すれば、この化合物はPEG10蛋白質の核移行をそ
れぞれ促進または抑制すると判断される。
【００３８】PEG10蛋白質とSIAH蛋白質とが相互作用
し、これによりPEG10蛋白質による細胞増殖促進活性お
よびアポトーシス抑制活性が低下することは、本発明者
らが得た重要な知見の一つである。上記の通り本発明
は、細胞増殖または細胞死を調節する活性を有する化合
物をスクリーニングする方法であって、（ａ）被検化合
物を含む試料の存在下、PEG10蛋白質とSIAH蛋白質との
相互作用を検出する工程、および（ｂ）該相互作用を上
昇または低下させる活性を有する化合物を選択する工
程、を含む方法を提供する。PEG10蛋白質とSIAH蛋白質
との相互作用を促進または抑制する化合物は、細胞増殖
および細胞死を制御するために使用することができる。
PEG10蛋白質とSIAH蛋白質との相互作用とは、PEG10蛋白
質とSIAH蛋白質との結合の他、PEG10蛋白質とSIAH蛋白
質と接触に依存した蛋白質修飾（ユビキチン化を含
む）、構造変化、活性化・不活化、分解、安定化、細胞
内局在の変化などが含まれる。これらの相互作用は、公
知の分子生物学的手法により検出することができる。
し、これによりPEG10蛋白質による細胞増殖促進活性お
よびアポトーシス抑制活性が低下することは、本発明者
らが得た重要な知見の一つである。上記の通り本発明
は、細胞増殖または細胞死を調節する活性を有する化合
物をスクリーニングする方法であって、（ａ）被検化合
物を含む試料の存在下、PEG10蛋白質とSIAH蛋白質との
相互作用を検出する工程、および（ｂ）該相互作用を上
昇または低下させる活性を有する化合物を選択する工
程、を含む方法を提供する。PEG10蛋白質とSIAH蛋白質
との相互作用を促進または抑制する化合物は、細胞増殖
および細胞死を制御するために使用することができる。
PEG10蛋白質とSIAH蛋白質との相互作用とは、PEG10蛋白
質とSIAH蛋白質との結合の他、PEG10蛋白質とSIAH蛋白
質と接触に依存した蛋白質修飾（ユビキチン化を含
む）、構造変化、活性化・不活化、分解、安定化、細胞
内局在の変化などが含まれる。これらの相互作用は、公
知の分子生物学的手法により検出することができる。
【００３９】例えばPEG10蛋白質とSIAH蛋白質との結合
を指標としたスクリーニング方法は、（ａ）被検化合物
を含む試料の存在下、PEG10蛋白質とSIAH蛋白質とを接
触させる工程、（ｂ）PEG10蛋白質とSIAH蛋白質との結
合を検出する工程、および（ｃ）該試料の非存在下にお
いて測定した場合と比較して、PEG10蛋白質とSIAH蛋白
質との結合を促進または抑制する化合物を選択する工
程、を含む方法である。また、（ａ）PEG10蛋白質とSIA
H蛋白質とを含む複合体に被検化合物を含む試料を接触
させる工程、（ｂ）PEG10蛋白質とSIAH蛋白質との結合
を検出する工程、および（ｃ）該試料の非存在下におい
て測定した場合と比較して、PEG10蛋白質とSIAH蛋白質
との結合を促進または抑制する化合物を選択する工程、
を含むスクリーニング方法も本発明に含まれる。スクリ
ーニングに用いるPEG10蛋白質とSIAH蛋白質は、両者が
結合する限り、部分ペプチド等の欠失蛋白質や他のペプ
チドが付加された蛋白質などであってもよい。PEG10蛋
白質としてはヒトPEG10蛋白質またはその断片を、SIAH
蛋白質としてはヒトSIAH1蛋白質またはその断片を好適
に用いることができる。
を指標としたスクリーニング方法は、（ａ）被検化合物
を含む試料の存在下、PEG10蛋白質とSIAH蛋白質とを接
触させる工程、（ｂ）PEG10蛋白質とSIAH蛋白質との結
合を検出する工程、および（ｃ）該試料の非存在下にお
いて測定した場合と比較して、PEG10蛋白質とSIAH蛋白
質との結合を促進または抑制する化合物を選択する工
程、を含む方法である。また、（ａ）PEG10蛋白質とSIA
H蛋白質とを含む複合体に被検化合物を含む試料を接触
させる工程、（ｂ）PEG10蛋白質とSIAH蛋白質との結合
を検出する工程、および（ｃ）該試料の非存在下におい
て測定した場合と比較して、PEG10蛋白質とSIAH蛋白質
との結合を促進または抑制する化合物を選択する工程、
を含むスクリーニング方法も本発明に含まれる。スクリ
ーニングに用いるPEG10蛋白質とSIAH蛋白質は、両者が
結合する限り、部分ペプチド等の欠失蛋白質や他のペプ
チドが付加された蛋白質などであってもよい。PEG10蛋
白質としてはヒトPEG10蛋白質またはその断片を、SIAH
蛋白質としてはヒトSIAH1蛋白質またはその断片を好適
に用いることができる。
【００４０】工程（ａ）は、例えば、被検化合物を含む
試料、PEG10蛋白質、およびSIAH蛋白質を溶液中に共存
させることにより行うことができるがこれらに制限され
ない。例えば、PEG10蛋白質およびSIAH蛋白質を外来発
現する細胞から抽出物を調製し、これを適当なバッファ
ー中に懸濁して被検化合物を含む試料を添加することが
できる。あるいは、PEG10蛋白質およびSIAH蛋白質を外
来発現する細胞の培養液中に被検化合物を含む試料を添
加し、ここから細胞抽出物を調製することもできる。上
記工程（ｂ）の結合の検出は、当業者においては、免疫
沈降法やウェスタンブロット解析等の公知の方法により
実施することができる。例えば、PEG10蛋白質に対する
抗体およびSIAH蛋白質に対する抗体を利用して免疫沈降
法により行うことができる。具体的には、例えば工程
（ａ）の溶液から、PEG10蛋白質およびSIAH蛋白質の複
合体をPEG10蛋白質またはSIAH蛋白質に対する抗体を利
用して免疫沈降させる。次いで、沈降した免疫複合体に
対して他方の蛋白質に対する抗体を用いてウェスタンブ
ロット解析を行い、両者が結合していたかを評価する。
試料、PEG10蛋白質、およびSIAH蛋白質を溶液中に共存
させることにより行うことができるがこれらに制限され
ない。例えば、PEG10蛋白質およびSIAH蛋白質を外来発
現する細胞から抽出物を調製し、これを適当なバッファ
ー中に懸濁して被検化合物を含む試料を添加することが
できる。あるいは、PEG10蛋白質およびSIAH蛋白質を外
来発現する細胞の培養液中に被検化合物を含む試料を添
加し、ここから細胞抽出物を調製することもできる。上
記工程（ｂ）の結合の検出は、当業者においては、免疫
沈降法やウェスタンブロット解析等の公知の方法により
実施することができる。例えば、PEG10蛋白質に対する
抗体およびSIAH蛋白質に対する抗体を利用して免疫沈降
法により行うことができる。具体的には、例えば工程
（ａ）の溶液から、PEG10蛋白質およびSIAH蛋白質の複
合体をPEG10蛋白質またはSIAH蛋白質に対する抗体を利
用して免疫沈降させる。次いで、沈降した免疫複合体に
対して他方の蛋白質に対する抗体を用いてウェスタンブ
ロット解析を行い、両者が結合していたかを評価する。
【００４１】その他、上記工程（ｂ）の結合活性は、プ
ルダウンアッセイ、ELISA、酵母または哺乳動物細胞を
用いたツーハイブリッド法（実施例参照）、または大腸
菌で合成した組み換え蛋白質あるいはインビトロ・トラ
ンスレーション（インビトロ翻訳系）を用いた試験管内
の蛋白質合成系で合成した蛋白質を用いたインビトロ結
合実験法や、免疫沈降法および免疫染色法等により測定
することができる。またBIACORE等を用いて、表面プラ
ズモン共鳴を利用した蛋白質間相互作用の検出によりス
クリーニングを行うことも可能である。また、PEG10蛋
白質とSIAH蛋白質の複合体の一方の蛋白質分子を固定化
し、これに合成化合物、天然物バンクなどを作用させ、
PEG10蛋白質とSIAH蛋白質の結合を阻害する分子をスク
リーニングする方法や、コンビナトリアルケミストリー
技術によるハイスループットを用いたスクリーニングに
より目的の化合物を単離する方法も当業者に周知の技術
である。また、蛍光標識した蛋白質を用いて蛍光偏光測
定法による蛋白質間相互作用解析を通してスクリーニン
グを行うことも考えられる。
ルダウンアッセイ、ELISA、酵母または哺乳動物細胞を
用いたツーハイブリッド法（実施例参照）、または大腸
菌で合成した組み換え蛋白質あるいはインビトロ・トラ
ンスレーション（インビトロ翻訳系）を用いた試験管内
の蛋白質合成系で合成した蛋白質を用いたインビトロ結
合実験法や、免疫沈降法および免疫染色法等により測定
することができる。またBIACORE等を用いて、表面プラ
ズモン共鳴を利用した蛋白質間相互作用の検出によりス
クリーニングを行うことも可能である。また、PEG10蛋
白質とSIAH蛋白質の複合体の一方の蛋白質分子を固定化
し、これに合成化合物、天然物バンクなどを作用させ、
PEG10蛋白質とSIAH蛋白質の結合を阻害する分子をスク
リーニングする方法や、コンビナトリアルケミストリー
技術によるハイスループットを用いたスクリーニングに
より目的の化合物を単離する方法も当業者に周知の技術
である。また、蛍光標識した蛋白質を用いて蛍光偏光測
定法による蛋白質間相互作用解析を通してスクリーニン
グを行うことも考えられる。
【００４２】測定したPEG10蛋白質とSIAH蛋白質との相
互作用が、被検化合物の非存在下において測定した場合
と比較して低下した場合、該被検化合物は、細胞増殖を
促進する候補化合物、および細胞死を抑制する候補化合
物となる。これらの化合物は細胞増殖促進剤、および細
胞死抑制剤（特にアポトーシス抑制剤）として有用であ
る。また、相互作用が増加した場合、該被検化合物は、
細胞増殖を抑制する候補化合物、および細胞死を促進す
る候補化合物となる。これらの化合物は細胞増殖抑制
剤、および細胞死促進剤（特にアポトーシス促進剤）と
して有用である。特に、両蛋白質の相互作用を促進する
化合物は、癌を含む細胞増殖性疾患およびアポトーシス
障害を伴う疾患の予防または治療のための医薬としての
利用が期待される。
互作用が、被検化合物の非存在下において測定した場合
と比較して低下した場合、該被検化合物は、細胞増殖を
促進する候補化合物、および細胞死を抑制する候補化合
物となる。これらの化合物は細胞増殖促進剤、および細
胞死抑制剤（特にアポトーシス抑制剤）として有用であ
る。また、相互作用が増加した場合、該被検化合物は、
細胞増殖を抑制する候補化合物、および細胞死を促進す
る候補化合物となる。これらの化合物は細胞増殖抑制
剤、および細胞死促進剤（特にアポトーシス促進剤）と
して有用である。特に、両蛋白質の相互作用を促進する
化合物は、癌を含む細胞増殖性疾患およびアポトーシス
障害を伴う疾患の予防または治療のための医薬としての
利用が期待される。
【００４３】特に本発明は、PEG10遺伝子のアンチセン
スポリヌクレオチドを含む細胞増殖抑制剤、および細胞
死促進剤を提供する。PEG10遺伝子のアンチセンスポリ
ヌクレオチドは、細胞増殖性疾患、およびアポトーシス
障害を伴う疾患に対する医薬としての応用が考えられ
る。PEG10遺伝子のアンチセンスポリヌクレオチドは、
例えば、レトロウイルスベクター、アデノウィルスベク
ター、アデノ随伴ウイルスベクターなどのウイルスベク
ターやリポソームなどの非ウイルスベクターなどを利用
して、エクスビボ法やインビボ法などにより患者へ投与
することができる。このような遺伝子治療により患者の
標的細胞でのPEG10蛋白質の発現を阻害することを通し
て、アポトーシスの阻害を解除し、細胞増殖を抑制する
ことが可能である。
スポリヌクレオチドを含む細胞増殖抑制剤、および細胞
死促進剤を提供する。PEG10遺伝子のアンチセンスポリ
ヌクレオチドは、細胞増殖性疾患、およびアポトーシス
障害を伴う疾患に対する医薬としての応用が考えられ
る。PEG10遺伝子のアンチセンスポリヌクレオチドは、
例えば、レトロウイルスベクター、アデノウィルスベク
ター、アデノ随伴ウイルスベクターなどのウイルスベク
ターやリポソームなどの非ウイルスベクターなどを利用
して、エクスビボ法やインビボ法などにより患者へ投与
することができる。このような遺伝子治療により患者の
標的細胞でのPEG10蛋白質の発現を阻害することを通し
て、アポトーシスの阻害を解除し、細胞増殖を抑制する
ことが可能である。
【００４４】本発明においてPEG10遺伝子のアンチセン
スポリヌクレオチドは、上記に記載したように、PEG10
遺伝子の転写産物の塩基配列に相補的な配列を有するポ
リヌクレオチドが含まれる。例えば、PEG10遺伝子のア
ンチセンスポリヌクレオチドは、PEG10 mRNAの非翻訳配
列（UTS）、エクソン、またはイントロンの配列に対し
て相補的な配列を含むアンチセンスポリヌクレオチドで
あってよい。相補的とは、PEG10遺伝子のアンチセンス
鎖の塩基配列に対し、好ましくは70％以上、より好まし
くは80％以上、さらに好ましくは90％以上の同一性を有
することを言う。より好ましくは完全な（100％の）同
一性を有する。塩基配列の同一性は、例えば、Karlinお
よびAltschulによるアルゴリズムBLAST (Karlin, S. an
d Altschul, S.F., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:22
64-2268, 1990、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-
5877, 1993)によって決定することができる。BLASTとGa
pped BLASTプログラムを用いる場合には、各プログラム
のデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法
の具体的な手法は公知である(http://www.ncbi.nlm.ni
h.gov.)。PEG10遺伝子の転写産物としては、スプライシ
ングを受け成熟したmRNAのみならず、スプライシングさ
れていない初期転写産物、およびスプライシングの過程
で生じる中間産物が含まれる。本発明において特に好適
なアンチセンスポリヌクレオチドは、PEG10遺伝子のエ
クソン-イントロン境界またはイントロン-エクソン境界
の少なくとも１つを覆うアンチセンスポリヌクレオチド
である。より好ましくは、PEG10遺伝子の最初のエクソ
ン-イントロン境界を覆うアンチセンスポリヌクレオチ
ドである。覆うとは、境界部位を含む連続する少なくと
も15ヌクレオチドの領域、好ましくは16ヌクレオチド以
上、より好ましくは17、18、または20ヌクレオチド以上
の領域のセンス鎖の塩基配列に対して相補的な塩基配列
を含むことを言う。また、PEG10転写産物の翻訳開始コ
ドンを覆うアンチセンスポリヌクレオチドなどであって
もよい。アンチセンスポリヌクレオチドはDNAであって
もRNAであってもよい。また、修飾されたヌクレオチド
を含むものであってもよい。ホスホロチオエート型オリ
ゴヌクレオチド（S-オリゴ）は本発明のアンチセンスポ
リヌクレオチドとして特に好適である。ホスホロチオエ
ート型オリゴヌクレオチドには、部分的にホスホロチオ
エートが挿入（部分S化）されたものでもよい。また、P
NA等の核酸類似体であってもよい。本発明は、PEG10遺
伝子のアンチセンスポリヌクレオチドを含む医薬を提供
する。この医薬は、細胞増殖性疾患に対する予防および
治療に有用である。
スポリヌクレオチドは、上記に記載したように、PEG10
遺伝子の転写産物の塩基配列に相補的な配列を有するポ
リヌクレオチドが含まれる。例えば、PEG10遺伝子のア
ンチセンスポリヌクレオチドは、PEG10 mRNAの非翻訳配
列（UTS）、エクソン、またはイントロンの配列に対し
て相補的な配列を含むアンチセンスポリヌクレオチドで
あってよい。相補的とは、PEG10遺伝子のアンチセンス
鎖の塩基配列に対し、好ましくは70％以上、より好まし
くは80％以上、さらに好ましくは90％以上の同一性を有
することを言う。より好ましくは完全な（100％の）同
一性を有する。塩基配列の同一性は、例えば、Karlinお
よびAltschulによるアルゴリズムBLAST (Karlin, S. an
d Altschul, S.F., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:22
64-2268, 1990、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-
5877, 1993)によって決定することができる。BLASTとGa
pped BLASTプログラムを用いる場合には、各プログラム
のデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法
の具体的な手法は公知である(http://www.ncbi.nlm.ni
h.gov.)。PEG10遺伝子の転写産物としては、スプライシ
ングを受け成熟したmRNAのみならず、スプライシングさ
れていない初期転写産物、およびスプライシングの過程
で生じる中間産物が含まれる。本発明において特に好適
なアンチセンスポリヌクレオチドは、PEG10遺伝子のエ
クソン-イントロン境界またはイントロン-エクソン境界
の少なくとも１つを覆うアンチセンスポリヌクレオチド
である。より好ましくは、PEG10遺伝子の最初のエクソ
ン-イントロン境界を覆うアンチセンスポリヌクレオチ
ドである。覆うとは、境界部位を含む連続する少なくと
も15ヌクレオチドの領域、好ましくは16ヌクレオチド以
上、より好ましくは17、18、または20ヌクレオチド以上
の領域のセンス鎖の塩基配列に対して相補的な塩基配列
を含むことを言う。また、PEG10転写産物の翻訳開始コ
ドンを覆うアンチセンスポリヌクレオチドなどであって
もよい。アンチセンスポリヌクレオチドはDNAであって
もRNAであってもよい。また、修飾されたヌクレオチド
を含むものであってもよい。ホスホロチオエート型オリ
ゴヌクレオチド（S-オリゴ）は本発明のアンチセンスポ
リヌクレオチドとして特に好適である。ホスホロチオエ
ート型オリゴヌクレオチドには、部分的にホスホロチオ
エートが挿入（部分S化）されたものでもよい。また、P
NA等の核酸類似体であってもよい。本発明は、PEG10遺
伝子のアンチセンスポリヌクレオチドを含む医薬を提供
する。この医薬は、細胞増殖性疾患に対する予防および
治療に有用である。
【００４５】本発明のスクリーニング方法により単離さ
れうる化合物、およびPEG10遺伝子のアンチセンスポリ
ヌクレオチドを医薬組成物として用いる場合には、化合
物またはアンチセンスポリヌクレオチド自体を直接患者
に投与する以外に、公知の製剤学的方法により製剤化し
て投与を行うことも可能である。本発明は、上記スクリ
ーニングにより選択しうる化合物、または特にPEG10遺
伝子のアンチセンスポリヌクレオチドを含む医薬組成物
に関する。本発明の医薬組成物は、細胞死調節および細
胞増殖調節のために有用である。例えば、薬理学的上許
容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理
食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定
剤、徐放剤などと適宜組み合わせて製剤化して投与する
ことが考えられる。医薬組成物として用いる場合は、水
溶液、錠剤、カプセル、トローチ、バッカル錠、エリキ
シル、懸濁液、シロップ、点鼻液、または吸入液などの
形態であり得る。組成物における該化合物の含有率は適
宜決定すればよい。患者への投与は、例えば、動脈内、
静脈内、皮下からの投与のほか、鼻腔内的、経気管支
的、筋内的または経口的に当業者に公知の方法により行
い得るがそれらに限定されない。また、全身的または局
所的に投与され得る。薬剤の投与による全身的な副作用
が問題となる場合には、局所投与により投与量を抑える
ことができる。投与量は、医薬組成物の有効成分の組織
移行性、治療目的、患者の体重や年齢、症状、投与方法
などにより変動するが、当業者であれば適当な投与量を
適宜選択することが可能である。有効成分となる化合物
は、典型的には 1μg/kg〜50mg/kg、好ましくは10μg/k
g〜10mg/kg、より好ましくは10μg/kg〜5mg/kgの範囲内
となるように投与するとよい。投与は１回、あるいは適
当な期間をあけて複数回行うことができる。
れうる化合物、およびPEG10遺伝子のアンチセンスポリ
ヌクレオチドを医薬組成物として用いる場合には、化合
物またはアンチセンスポリヌクレオチド自体を直接患者
に投与する以外に、公知の製剤学的方法により製剤化し
て投与を行うことも可能である。本発明は、上記スクリ
ーニングにより選択しうる化合物、または特にPEG10遺
伝子のアンチセンスポリヌクレオチドを含む医薬組成物
に関する。本発明の医薬組成物は、細胞死調節および細
胞増殖調節のために有用である。例えば、薬理学的上許
容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理
食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定
剤、徐放剤などと適宜組み合わせて製剤化して投与する
ことが考えられる。医薬組成物として用いる場合は、水
溶液、錠剤、カプセル、トローチ、バッカル錠、エリキ
シル、懸濁液、シロップ、点鼻液、または吸入液などの
形態であり得る。組成物における該化合物の含有率は適
宜決定すればよい。患者への投与は、例えば、動脈内、
静脈内、皮下からの投与のほか、鼻腔内的、経気管支
的、筋内的または経口的に当業者に公知の方法により行
い得るがそれらに限定されない。また、全身的または局
所的に投与され得る。薬剤の投与による全身的な副作用
が問題となる場合には、局所投与により投与量を抑える
ことができる。投与量は、医薬組成物の有効成分の組織
移行性、治療目的、患者の体重や年齢、症状、投与方法
などにより変動するが、当業者であれば適当な投与量を
適宜選択することが可能である。有効成分となる化合物
は、典型的には 1μg/kg〜50mg/kg、好ましくは10μg/k
g〜10mg/kg、より好ましくは10μg/kg〜5mg/kgの範囲内
となるように投与するとよい。投与は１回、あるいは適
当な期間をあけて複数回行うことができる。
【００４６】該化合物がDNAまたはRNAなどの核酸により
コードされ得るものであれば、該核酸を遺伝子治療用ベ
クターに組込み、遺伝子治療を行うことも考えられる。
特にPEG10遺伝子のアンチセンスポリヌクレオチドは、
遺伝子治療ベクターに組み込み標的細胞に投与して発現
させることができる。このような目的で使用され得るベ
クターとしては、本明細書に記載したウイルスベクター
などを挙げることができる。投与量、投与方法は、患者
の体重や年齢、症状などにより変動することが、当業者
であれば適宜選択することが可能である。
コードされ得るものであれば、該核酸を遺伝子治療用ベ
クターに組込み、遺伝子治療を行うことも考えられる。
特にPEG10遺伝子のアンチセンスポリヌクレオチドは、
遺伝子治療ベクターに組み込み標的細胞に投与して発現
させることができる。このような目的で使用され得るベ
クターとしては、本明細書に記載したウイルスベクター
などを挙げることができる。投与量、投与方法は、患者
の体重や年齢、症状などにより変動することが、当業者
であれば適宜選択することが可能である。
【００４７】投与対象となる個体に制限はなく、例えば
ヒト、サル、マウス、ラット、ウサギなどの哺乳動物、
およびその他の脊椎動物が挙げられる。マウス、ラッ
ト、サルなどの非ヒト哺乳動物への適用は、ヒト疾患に
対する予防法または治療法を開発するためのモデルとす
る上でも有用である。
ヒト、サル、マウス、ラット、ウサギなどの哺乳動物、
およびその他の脊椎動物が挙げられる。マウス、ラッ
ト、サルなどの非ヒト哺乳動物への適用は、ヒト疾患に
対する予防法または治療法を開発するためのモデルとす
る上でも有用である。
【００４８】本発明の医薬組成物は、PEG10蛋白質が関
与する疾患の予防および治療に有用である。具体的に
は、本発明の医薬組成物は、PEG10蛋白質を介した細胞
増殖および/またはアポトーシスの異常などに起因する
疾患の予防剤または治療剤として用いることができる。
特に本発明の医薬組成物は、腫瘍などの新生物の増殖を
抑制したり、アポトーシスを誘導するために有用であ
る。本発明の医薬組成物は、特に肝細胞癌の予防または
治療のために好適に用いられる。
与する疾患の予防および治療に有用である。具体的に
は、本発明の医薬組成物は、PEG10蛋白質を介した細胞
増殖および/またはアポトーシスの異常などに起因する
疾患の予防剤または治療剤として用いることができる。
特に本発明の医薬組成物は、腫瘍などの新生物の増殖を
抑制したり、アポトーシスを誘導するために有用であ
る。本発明の医薬組成物は、特に肝細胞癌の予防または
治療のために好適に用いられる。
【００４９】また、本発明は、PEG10遺伝子および/また
はSIAH遺伝子の構造変異または発現異常を調べる工程を
含む、肝癌の検査および診断方法を提供する。本発明者
らは、36の異なる肝細胞癌におけるPEG10遺伝子の発現
を調べた結果、驚くべきことに、35の肝細胞癌において
共通してPEG10遺伝子の発現が亢進していることを見出
した。HCCの大多数で発現が上昇していたPEG10遺伝子
は、対応する非癌肝組織では極めて低いレベルでしか発
現していなかったことから、PEG10は診断マーカーとし
て極めて有用と考えられる。また、PEG10遺伝子の発現
が亢進しているHCC細胞株でSIAH1の発現が減少してお
り、HCC細胞にSIAH1を外来的に導入するとアポトーシス
が誘導されることから、SIAH1は肝発癌の抑制に重要な
役割を果たしていることが示された。また、SIAH-1はPE
G10蛋白質の発現を用量依存的に低下させることが実証
された。これらのことから、PEG10とSIAH1の発現の不均
衡が、アポトーシスの抑制を介して肝発癌に関与してい
ると考えられる。以上の事実から、本発明者らは、PEG1
0遺伝子および/またはSIAH遺伝子の異常を検出すること
により、信頼性を持つ肝癌の検査が実施可能となること
を初めて実証した。
はSIAH遺伝子の構造変異または発現異常を調べる工程を
含む、肝癌の検査および診断方法を提供する。本発明者
らは、36の異なる肝細胞癌におけるPEG10遺伝子の発現
を調べた結果、驚くべきことに、35の肝細胞癌において
共通してPEG10遺伝子の発現が亢進していることを見出
した。HCCの大多数で発現が上昇していたPEG10遺伝子
は、対応する非癌肝組織では極めて低いレベルでしか発
現していなかったことから、PEG10は診断マーカーとし
て極めて有用と考えられる。また、PEG10遺伝子の発現
が亢進しているHCC細胞株でSIAH1の発現が減少してお
り、HCC細胞にSIAH1を外来的に導入するとアポトーシス
が誘導されることから、SIAH1は肝発癌の抑制に重要な
役割を果たしていることが示された。また、SIAH-1はPE
G10蛋白質の発現を用量依存的に低下させることが実証
された。これらのことから、PEG10とSIAH1の発現の不均
衡が、アポトーシスの抑制を介して肝発癌に関与してい
ると考えられる。以上の事実から、本発明者らは、PEG1
0遺伝子および/またはSIAH遺伝子の異常を検出すること
により、信頼性を持つ肝癌の検査が実施可能となること
を初めて実証した。
【００５０】本発明の検査・診断は、PEG10遺伝子およ
び/またはSIAH遺伝子の構造変異または発現異常を検出
することにより実施することができる。PEG10遺伝子お
よび/またはSIAH遺伝子の構造変異を検出するには、例
えば被験者由来の染色体DNAまたはmRNAからPEG10遺伝子
および/またはSIAH遺伝子をPCR等により増幅し、塩基配
列を決定することにより実施することができる。正常型
遺伝子の塩基配列と比較して、変異の有無および種類を
決定する。本発明において変異には多型を含む。すなわ
ち、PEG10遺伝子またはSIAH遺伝子におけるSNP（一塩基
多型）などを検査することにより、肝癌の発症リスクや
予後を検査・診断することが可能であると考えられる。
細胞増殖促進活性または細胞死抑制活性が上昇するよう
なPEG10遺伝子変異、およびPEG10蛋白質の分解活性が低
下するようなSIAH遺伝子変異は、肝癌発症および伸展の
リスク要因と判断される。またPEG10遺伝子および/また
はSIAH遺伝子の発現異常を検出するには、例えば被験者
由来の肝細胞におけるPEG10遺伝子またはSIAH遺伝子の
発現をマイクロアレイ解析、定量または半定量的RT-PC
R、免疫組織化学染色、ウェスタンブロッティング等に
より解析する。正常型組織における発現と比較して、発
現異常を決定する。発現異常には、発現の亢進、低下、
喪失を含む。PEG10遺伝子の発現の亢進、またはSIAH遺
伝子の発現の低下は、肝癌発症および伸展のリスク要因
と判断される。本発明に検査・診断には、肝癌発症前に
行うリスク検査および発症後に行う肝癌の分類や悪性度
評価、治療戦略作成のための検査などが含まれる。例え
ば癌発生後であれば、腫瘍組織の検査においてPEG10遺
伝子および/またはSIAH遺伝子の構造変異または発現異
常を検出し、変異および異常の有無および種類を決定す
る。また、発癌前の検査により肝発癌リスクが高いと判
断されれば、例えば頻繁な予防検診のスケジュールを組
むことにより初期癌の発見の確率を高めることができ
る。また、発癌後であれば、癌の分類または判別を通し
て治療方法の選択や予後の予測を適正に行うことができ
る。本発明の検査は、本発明のスクリーニングにより得
られる薬剤が有効かを判断するためにも有用である。こ
れらの検査により、個々の肝癌に応じたテーラーメイド
の医療を実現することが可能になる。
び/またはSIAH遺伝子の構造変異または発現異常を検出
することにより実施することができる。PEG10遺伝子お
よび/またはSIAH遺伝子の構造変異を検出するには、例
えば被験者由来の染色体DNAまたはmRNAからPEG10遺伝子
および/またはSIAH遺伝子をPCR等により増幅し、塩基配
列を決定することにより実施することができる。正常型
遺伝子の塩基配列と比較して、変異の有無および種類を
決定する。本発明において変異には多型を含む。すなわ
ち、PEG10遺伝子またはSIAH遺伝子におけるSNP（一塩基
多型）などを検査することにより、肝癌の発症リスクや
予後を検査・診断することが可能であると考えられる。
細胞増殖促進活性または細胞死抑制活性が上昇するよう
なPEG10遺伝子変異、およびPEG10蛋白質の分解活性が低
下するようなSIAH遺伝子変異は、肝癌発症および伸展の
リスク要因と判断される。またPEG10遺伝子および/また
はSIAH遺伝子の発現異常を検出するには、例えば被験者
由来の肝細胞におけるPEG10遺伝子またはSIAH遺伝子の
発現をマイクロアレイ解析、定量または半定量的RT-PC
R、免疫組織化学染色、ウェスタンブロッティング等に
より解析する。正常型組織における発現と比較して、発
現異常を決定する。発現異常には、発現の亢進、低下、
喪失を含む。PEG10遺伝子の発現の亢進、またはSIAH遺
伝子の発現の低下は、肝癌発症および伸展のリスク要因
と判断される。本発明に検査・診断には、肝癌発症前に
行うリスク検査および発症後に行う肝癌の分類や悪性度
評価、治療戦略作成のための検査などが含まれる。例え
ば癌発生後であれば、腫瘍組織の検査においてPEG10遺
伝子および/またはSIAH遺伝子の構造変異または発現異
常を検出し、変異および異常の有無および種類を決定す
る。また、発癌前の検査により肝発癌リスクが高いと判
断されれば、例えば頻繁な予防検診のスケジュールを組
むことにより初期癌の発見の確率を高めることができ
る。また、発癌後であれば、癌の分類または判別を通し
て治療方法の選択や予後の予測を適正に行うことができ
る。本発明の検査は、本発明のスクリーニングにより得
られる薬剤が有効かを判断するためにも有用である。こ
れらの検査により、個々の肝癌に応じたテーラーメイド
の医療を実現することが可能になる。
【００５１】上記の本発明の検査には、PEG10遺伝子ま
たはSIAH遺伝子の塩基配列またはその相補配列の一部を
含むポリヌクレオチド、あるいはPEG10蛋白質またはSIA
H蛋白質に対する抗体が用いられ得る。PEG10遺伝子また
はSIAH遺伝子の塩基配列またはその相補鎖の一部を含む
ポリヌクレオチドとしては、mRNA、cDNA、ゲノムDNAに
おけるこれらの遺伝子の塩基配列またはその相補鎖の一
部を含むポリヌクレオチドであってよく、例えば蛋白質
コード領域の配列、5'および3'UTS、イントロン、エク
ソン、および転写制御領域の配列であってよい。上記ポ
リヌクレオチドは、好ましくはPEG10遺伝子またはSIAH
遺伝子の塩基配列またはその相補配列中の連続する少な
くとも15個以上、好ましくは16ヌクレオチド以上、より
好ましくは17、18、または20ヌクレオチド以上を含むポ
リヌクレオチドである。これらのポリヌクレオチドは、
DNAであってもRNAであってもよい。また、修飾されたヌ
クレオチドを含むものであってもよい。ポリヌクレオチ
ドは、プローブとして、DNAマイクロアレイにおける固
定化ポリヌクレオチドとして、またはRT-PCR等のプライ
マーとして検査に用いることができる。また、抗体は、
PEG10遺伝子および/またはSIAH遺伝子の発現を蛋白質レ
ベルで検出したり、蛋白質の構造を解析することを通し
た検査を実施するために有用である。本発明は、これら
のポリヌクレオチドまたは抗体を含む肝癌の検査または
診断試薬を提供する。ポリヌクレオチドおよび抗体は、
担体または支持体等に結合していてもよい。例えばDNA
マイクロアレイ等の形態であることができる。また、ポ
リヌクレオチドおよび抗体は、適宜溶媒や溶質と組み合
わせることができる。本発明の検査・診断試薬は、例え
ば水溶液として提供される。本発明の試薬は適当な容器
に入れられ、包装箱および/または説明書が添付された
検査・診断キットとすることができる。本発明の検査・
診断試薬は、その容器、包装箱、または説明書等に肝細
胞癌を含む肝癌の検査・診断のために使用できることが
記載されているか、あるいはそのことが他の印刷物やUR
L等に表示されており、これと試薬が関連付けられてい
ることが好ましい。
たはSIAH遺伝子の塩基配列またはその相補配列の一部を
含むポリヌクレオチド、あるいはPEG10蛋白質またはSIA
H蛋白質に対する抗体が用いられ得る。PEG10遺伝子また
はSIAH遺伝子の塩基配列またはその相補鎖の一部を含む
ポリヌクレオチドとしては、mRNA、cDNA、ゲノムDNAに
おけるこれらの遺伝子の塩基配列またはその相補鎖の一
部を含むポリヌクレオチドであってよく、例えば蛋白質
コード領域の配列、5'および3'UTS、イントロン、エク
ソン、および転写制御領域の配列であってよい。上記ポ
リヌクレオチドは、好ましくはPEG10遺伝子またはSIAH
遺伝子の塩基配列またはその相補配列中の連続する少な
くとも15個以上、好ましくは16ヌクレオチド以上、より
好ましくは17、18、または20ヌクレオチド以上を含むポ
リヌクレオチドである。これらのポリヌクレオチドは、
DNAであってもRNAであってもよい。また、修飾されたヌ
クレオチドを含むものであってもよい。ポリヌクレオチ
ドは、プローブとして、DNAマイクロアレイにおける固
定化ポリヌクレオチドとして、またはRT-PCR等のプライ
マーとして検査に用いることができる。また、抗体は、
PEG10遺伝子および/またはSIAH遺伝子の発現を蛋白質レ
ベルで検出したり、蛋白質の構造を解析することを通し
た検査を実施するために有用である。本発明は、これら
のポリヌクレオチドまたは抗体を含む肝癌の検査または
診断試薬を提供する。ポリヌクレオチドおよび抗体は、
担体または支持体等に結合していてもよい。例えばDNA
マイクロアレイ等の形態であることができる。また、ポ
リヌクレオチドおよび抗体は、適宜溶媒や溶質と組み合
わせることができる。本発明の検査・診断試薬は、例え
ば水溶液として提供される。本発明の試薬は適当な容器
に入れられ、包装箱および/または説明書が添付された
検査・診断キットとすることができる。本発明の検査・
診断試薬は、その容器、包装箱、または説明書等に肝細
胞癌を含む肝癌の検査・診断のために使用できることが
記載されているか、あるいはそのことが他の印刷物やUR
L等に表示されており、これと試薬が関連付けられてい
ることが好ましい。
【００５２】
【実施例】以下実施例により本発明を具体的に説明する
が、本発明はこれらの実施例に限定されるものではな
い。なお、本明細書において引用された文献は、全て本
明細書の一部として組込まれる。
が、本発明はこれらの実施例に限定されるものではな
い。なお、本明細書において引用された文献は、全て本
明細書の一部として組込まれる。
【００５３】［実施例１］ 細胞株および組織試料
ヒト胚腎臓293細胞（HEK293）およびヒト肝癌細胞株Hep
G2、Huh7、およびAlexanderはAmerican Type Culture C
ollection（ATCC, Rockville, MD）から入手した。SNU4
23、SNU449、およびSNU475はKorea cell-line bankから
入手した。全ての細胞株は10％ウシ胎児血清および1％
antibiotic/antimycotic solution（Sigma, St. Louis,
MO）を含む適当な培地中、5％ CO2を含む大気中37℃に
維持して単層培養により増殖させた。全てのHCCおよび
対応する非癌肝組織はインフォームドコンセントのもと
に肝切除を受けた患者から得た。
G2、Huh7、およびAlexanderはAmerican Type Culture C
ollection（ATCC, Rockville, MD）から入手した。SNU4
23、SNU449、およびSNU475はKorea cell-line bankから
入手した。全ての細胞株は10％ウシ胎児血清および1％
antibiotic/antimycotic solution（Sigma, St. Louis,
MO）を含む適当な培地中、5％ CO2を含む大気中37℃に
維持して単層培養により増殖させた。全てのHCCおよび
対応する非癌肝組織はインフォームドコンセントのもと
に肝切除を受けた患者から得た。
【００５４】［実施例２］ HCCで頻繁に発現が上昇す
る新規遺伝子の同定 23,040遺伝子からなるゲノムワイドcDNAマイクロアレイ
（Okabe, H. et al.,Cancer Res. 61, 2129-2137 (200
1)）を用いて、本発明者らは、計20のB型肝炎ウイルス
陽性およびC型肝炎ウイルス陽性HCC中で共通して発現が
上昇する１つのESTを同定した。KIAA1051（Hs.137476）
に相当するこの遺伝子の発現亢進を、複数の癌において
TaqMan PCRにより確認した（データ省略）。TaqMan PCR
により確認した相対発現比は、cDNAマイクロアレイを用
いて得られたものとよく一致していた。
る新規遺伝子の同定 23,040遺伝子からなるゲノムワイドcDNAマイクロアレイ
（Okabe, H. et al.,Cancer Res. 61, 2129-2137 (200
1)）を用いて、本発明者らは、計20のB型肝炎ウイルス
陽性およびC型肝炎ウイルス陽性HCC中で共通して発現が
上昇する１つのESTを同定した。KIAA1051（Hs.137476）
に相当するこの遺伝子の発現亢進を、複数の癌において
TaqMan PCRにより確認した（データ省略）。TaqMan PCR
により確認した相対発現比は、cDNAマイクロアレイを用
いて得られたものとよく一致していた。
【００５５】cDNAをプローブとして用いてmulti-tissue
ノーザンブロット解析を行った。ノーザンブロット解析
では、ヒトmulti-tissue blots（Clontech, Palo Alto,
CA）に32PラベルしたPEG10 cDNAをハイブリダイズさせ
た。プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーシ
ョン、および洗浄は、供給もとの推奨に従って行った。
ブロットは増感スクリーンを使い、-80℃で24時間オー
トラジオグラフィーを行った。その結果、胎盤、精巣、
および卵巣で6.4kbの転写産物が優勢に発現しているこ
とが示された（図１A）。5' RACE法を用いて、この遺伝
子の転写産物全体をほとんどカバーするcDNA配列を得
た。その結果、この遺伝子は最終的にPEG10（Ono, R. e
t al., Genomics 73, 232-237 (2001)）と同一であるこ
とが判明した。Simple Modular Architecture Research
Tool（SMART ver.3, http://smart.embl-heidelberg.d
e）（Schultz et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 95, 5857-5864; Schultz et al. (2000) Nucleic A
cids Res 28, 231-234）による解析では、予想される蛋
白質はcoiled-coilモチーフ（コドン 1-50）およびzinc
-fingerモチーフ（コドン 294-310）を含むことが示唆
された（図１B）。
ノーザンブロット解析を行った。ノーザンブロット解析
では、ヒトmulti-tissue blots（Clontech, Palo Alto,
CA）に32PラベルしたPEG10 cDNAをハイブリダイズさせ
た。プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーシ
ョン、および洗浄は、供給もとの推奨に従って行った。
ブロットは増感スクリーンを使い、-80℃で24時間オー
トラジオグラフィーを行った。その結果、胎盤、精巣、
および卵巣で6.4kbの転写産物が優勢に発現しているこ
とが示された（図１A）。5' RACE法を用いて、この遺伝
子の転写産物全体をほとんどカバーするcDNA配列を得
た。その結果、この遺伝子は最終的にPEG10（Ono, R. e
t al., Genomics 73, 232-237 (2001)）と同一であるこ
とが判明した。Simple Modular Architecture Research
Tool（SMART ver.3, http://smart.embl-heidelberg.d
e）（Schultz et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 95, 5857-5864; Schultz et al. (2000) Nucleic A
cids Res 28, 231-234）による解析では、予想される蛋
白質はcoiled-coilモチーフ（コドン 1-50）およびzinc
-fingerモチーフ（コドン 294-310）を含むことが示唆
された（図１B）。
【００５６】［実施例３］ HCC細胞株および原発性肝
細胞癌におけるPEG10の発現 HCCでのPEG10の役割を調べるため、この遺伝子産物に対
するウサギポリクローナル抗体を作製した。PEG10に対
するポリクローナル抗体は、免疫したウサギの血清か
ら、E. coliで産生させた組み換えGST-PEG10蛋白質を用
いて精製した。この抗体を用いて、6つの肝癌細胞株に
おけるこの蛋白質の発現を評価した。イムノブロッティ
ングを次のように行った。細胞抽出物をリシスバッファ
ー（150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 50 mM Tris-HCl p
H 7.4, および 1 mM DTT、complete Protease Inhibito
r Cocktail (Boehringer Mannheim, Mannheim, German
y) を含む）を用いて調製した。蛋白質は10% SDS-PAGE
で分離し、ウサギ抗PEG10抗体を用いてイムノブロット
を行った。HRP結合ヤギ抗ウサギIgG（Santa CruzBiotec
hnology, Santa Cruz, CA）を2次抗体に用い、ECL Dete
ction System（Amersham Pharmacia Biotech, Piscataw
ay, NJ）によりシグナルを検出した。
細胞癌におけるPEG10の発現 HCCでのPEG10の役割を調べるため、この遺伝子産物に対
するウサギポリクローナル抗体を作製した。PEG10に対
するポリクローナル抗体は、免疫したウサギの血清か
ら、E. coliで産生させた組み換えGST-PEG10蛋白質を用
いて精製した。この抗体を用いて、6つの肝癌細胞株に
おけるこの蛋白質の発現を評価した。イムノブロッティ
ングを次のように行った。細胞抽出物をリシスバッファ
ー（150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 50 mM Tris-HCl p
H 7.4, および 1 mM DTT、complete Protease Inhibito
r Cocktail (Boehringer Mannheim, Mannheim, German
y) を含む）を用いて調製した。蛋白質は10% SDS-PAGE
で分離し、ウサギ抗PEG10抗体を用いてイムノブロット
を行った。HRP結合ヤギ抗ウサギIgG（Santa CruzBiotec
hnology, Santa Cruz, CA）を2次抗体に用い、ECL Dete
ction System（Amersham Pharmacia Biotech, Piscataw
ay, NJ）によりシグナルを検出した。
【００５７】また、免疫組織化学染色を次のように行っ
た。チャンバースライド上で培養した細胞は、4％パラ
ホルムアルデヒドを含むPBSで15分固定し、0.1％Triton
X-100を含むPBSで室温で2.5分透過化処理を行った。原
発性肝細胞癌および非癌肝組織の凍結切片はアセトンで
15分固定した。細胞は2％BSAを含むPBSで4℃で24時間イ
ンキュベートし、抗PEG10抗体とハイブリダイズさせ
た。抗体は、蛍光基質を結合した抗ウサギ2次抗体（ICN
Pharmaceuticals, Costa Mesa, CA）により染色した。
4',6'-diamidine-2'-phenylidole dihydrochloride（DA
PI）により核を対比染色した。ECLIPSE E800顕微鏡（Ni
kon, Tokyo, Japan）により蛍光像を得た。
た。チャンバースライド上で培養した細胞は、4％パラ
ホルムアルデヒドを含むPBSで15分固定し、0.1％Triton
X-100を含むPBSで室温で2.5分透過化処理を行った。原
発性肝細胞癌および非癌肝組織の凍結切片はアセトンで
15分固定した。細胞は2％BSAを含むPBSで4℃で24時間イ
ンキュベートし、抗PEG10抗体とハイブリダイズさせ
た。抗体は、蛍光基質を結合した抗ウサギ2次抗体（ICN
Pharmaceuticals, Costa Mesa, CA）により染色した。
4',6'-diamidine-2'-phenylidole dihydrochloride（DA
PI）により核を対比染色した。ECLIPSE E800顕微鏡（Ni
kon, Tokyo, Japan）により蛍光像を得た。
【００５８】またRT-PCR解析を次のようにして行った。
RT-PCR実験は20μl容量のPCR buffer（TaKaRa, Tokyo,
Japan）中で、GeneAmp PCR system 9700（Perkin-Elme
r, Foster City, CA）を用いて94℃4分の変性の後、94
℃30秒、56℃30秒、および72℃30秒を20サイクル（GAPD
Hの場合）または30サイクル（PEG10およびSIAH1の場
合）行った。プライマー配列を以下に示す。GAPDHに
は、フォワード 5'-ACAACAGCCTCAAGATCATCAG-3'（配列
番号：１）およびリバース5'-GGTCCACCACTGACACGTTG-3'
（配列番号：２）、PEG10には、フォワード 5'-AACAACA
ACAACAACTCCAAGC-3'（配列番号：３）およびリバース5'
-TCTGCACCTGGCTCTGCAC-3'（配列番号：４）、そしてSIA
H1には、フォワード 5'-TCCAACAATGACTTGGCGAGT-3'（配
列番号：５）およびリバース5'-CTTTTTCTGTGTGTGGCAGAG
-3'（配列番号：６）（実施例６参照）。
RT-PCR実験は20μl容量のPCR buffer（TaKaRa, Tokyo,
Japan）中で、GeneAmp PCR system 9700（Perkin-Elme
r, Foster City, CA）を用いて94℃4分の変性の後、94
℃30秒、56℃30秒、および72℃30秒を20サイクル（GAPD
Hの場合）または30サイクル（PEG10およびSIAH1の場
合）行った。プライマー配列を以下に示す。GAPDHに
は、フォワード 5'-ACAACAGCCTCAAGATCATCAG-3'（配列
番号：１）およびリバース5'-GGTCCACCACTGACACGTTG-3'
（配列番号：２）、PEG10には、フォワード 5'-AACAACA
ACAACAACTCCAAGC-3'（配列番号：３）およびリバース5'
-TCTGCACCTGGCTCTGCAC-3'（配列番号：４）、そしてSIA
H1には、フォワード 5'-TCCAACAATGACTTGGCGAGT-3'（配
列番号：５）およびリバース5'-CTTTTTCTGTGTGTGGCAGAG
-3'（配列番号：６）（実施例６参照）。
【００５９】HepG2、Huh7、および Alexander細胞は恒
常的に40kDのPEG10蛋白質を発現しており（図２A）、免
疫組織化学染色により、PEG10はそれらの細胞の核およ
び細胞質の両方に局在することが明らかとなった（図２
B）。SNU423、SNU449、またはSNU475細胞では染色は見
られず、ウェスタン解析の結果もそれと一致していた。
cDNAマイクロアレイ解析で用いた20のHCCとは異なる16
のHCCのうち15において、癌組織にけるPEG10の核および
細胞質での強い染色が検出されたが、それらに対応する
正常組織では検出されなかった（図２C）。
常的に40kDのPEG10蛋白質を発現しており（図２A）、免
疫組織化学染色により、PEG10はそれらの細胞の核およ
び細胞質の両方に局在することが明らかとなった（図２
B）。SNU423、SNU449、またはSNU475細胞では染色は見
られず、ウェスタン解析の結果もそれと一致していた。
cDNAマイクロアレイ解析で用いた20のHCCとは異なる16
のHCCのうち15において、癌組織にけるPEG10の核および
細胞質での強い染色が検出されたが、それらに対応する
正常組織では検出されなかった（図２C）。
【００６０】［実施例４］ PEG10によるヒト肝癌細胞
の増殖促進 肝癌細胞の増殖におけるPEG10の遺伝子導入の効果を解
析するため、PEG10を含む発現プラスミドを、PEG10蛋白
質の内因的発現がないことが示されている２つの細胞株
（SNU423およびSNU475）にトランスフェクトし、コロニ
ー形成アッセイおよび増殖抑制アッセイを行った。具体
的には、細胞へのトランスフェクションは、PEG10の全
コーディング領域を発現するプラスミドベクターを、Fu
GENE6試薬（Boehringer）を用い、供給もとのプロトコ
ールに従って行った。適当な濃度のgeneticinを含む培
地で2週間培養し、100％メタノールで固定後、Giemsa溶
液で染色した。pcDNA3.1(+)、pcDNA3.1(-)/PEG10、また
はpcDNA3.1(+)/PEG10をトランスフェクトして2週間後
に、1mmより大きいコロニーを計数した。なお、PEG10の
センス S-オリゴヌクレオチド（5'-CCTCGCGTGGTGAGTA-
3'／配列番号：７）またはアンチセンス S-オリゴヌク
レオチド（5'-TACTCACCACGCGAGG-3'／配列番号：８）を
トランスフェクトした細胞も、同様に染色した（実施例
７）。
の増殖促進 肝癌細胞の増殖におけるPEG10の遺伝子導入の効果を解
析するため、PEG10を含む発現プラスミドを、PEG10蛋白
質の内因的発現がないことが示されている２つの細胞株
（SNU423およびSNU475）にトランスフェクトし、コロニ
ー形成アッセイおよび増殖抑制アッセイを行った。具体
的には、細胞へのトランスフェクションは、PEG10の全
コーディング領域を発現するプラスミドベクターを、Fu
GENE6試薬（Boehringer）を用い、供給もとのプロトコ
ールに従って行った。適当な濃度のgeneticinを含む培
地で2週間培養し、100％メタノールで固定後、Giemsa溶
液で染色した。pcDNA3.1(+)、pcDNA3.1(-)/PEG10、また
はpcDNA3.1(+)/PEG10をトランスフェクトして2週間後
に、1mmより大きいコロニーを計数した。なお、PEG10の
センス S-オリゴヌクレオチド（5'-CCTCGCGTGGTGAGTA-
3'／配列番号：７）またはアンチセンス S-オリゴヌク
レオチド（5'-TACTCACCACGCGAGG-3'／配列番号：８）を
トランスフェクトした細胞も、同様に染色した（実施例
７）。
【００６１】mock（偽トランスフェクション）またはア
ンチセンスプラスミドをトランスフェクトしたクローン
と比べ、PEG10センスプラスミドベクターは両細胞株に
おいてコロニー形成を促進した（図３A）。センスベク
ターをトランスフェクトした細胞株におけるPEG10蛋白
質の発現をイムノブロッティングにより確認した。コロ
ニー形成アッセイの結果は、３つの独立した実験で確認
された。
ンチセンスプラスミドをトランスフェクトしたクローン
と比べ、PEG10センスプラスミドベクターは両細胞株に
おいてコロニー形成を促進した（図３A）。センスベク
ターをトランスフェクトした細胞株におけるPEG10蛋白
質の発現をイムノブロッティングにより確認した。コロ
ニー形成アッセイの結果は、３つの独立した実験で確認
された。
【００６２】PEG10の増殖促進効果をさらに調べるた
め、本発明者らは内因的PEG10発現が欠失しているSNU42
3細胞を用いて、安定なトランスフェクタントを作製し
た。細胞周期をフローサイトメトリーにより解析した。
具体的には、決められた時間にトリプシン処理により1
×105細胞を回収し、70％冷エタノールにより固定し
た。RNaseおよびpropidium iodide（50μg/ml）を含むP
BSで細胞を処理後、FACScan（Becton Dickinson, San J
ose, CA）により解析した。PEG10の安定なトランスフェ
クタント細胞では、恒常的なPEG10蛋白質の発現が主に
核で見られ（図３BおよびC）、親細胞またはmock（偽ト
ランスフェクション）細胞と比べ有意に増殖が促進され
ることが判明した（図４A）。低血清培養条件下（0.1％
FBS）では、mock細胞は急速に増殖が停止したが、安定
にPEG10を発現する細胞は増殖を継続した（図４B）。細
胞周期を解析したところ、mock細胞はG1期で停止してい
ることが判明した。一方、PEG10をトランスフェクトし
た細胞は増殖を続け、その細胞集団の周期は血清飢餓に
影響されなかった（図４C）。
め、本発明者らは内因的PEG10発現が欠失しているSNU42
3細胞を用いて、安定なトランスフェクタントを作製し
た。細胞周期をフローサイトメトリーにより解析した。
具体的には、決められた時間にトリプシン処理により1
×105細胞を回収し、70％冷エタノールにより固定し
た。RNaseおよびpropidium iodide（50μg/ml）を含むP
BSで細胞を処理後、FACScan（Becton Dickinson, San J
ose, CA）により解析した。PEG10の安定なトランスフェ
クタント細胞では、恒常的なPEG10蛋白質の発現が主に
核で見られ（図３BおよびC）、親細胞またはmock（偽ト
ランスフェクション）細胞と比べ有意に増殖が促進され
ることが判明した（図４A）。低血清培養条件下（0.1％
FBS）では、mock細胞は急速に増殖が停止したが、安定
にPEG10を発現する細胞は増殖を継続した（図４B）。細
胞周期を解析したところ、mock細胞はG1期で停止してい
ることが判明した。一方、PEG10をトランスフェクトし
た細胞は増殖を続け、その細胞集団の周期は血清飢餓に
影響されなかった（図４C）。
【００６３】［実施例５］ PEG10のSIAH-1およびSIAH-
2との相互作用 PEG10の癌遺伝子としての機構を調べるため、酵母two-h
ybridスクリーニング系を用いてPEG10と相互作用する蛋
白質を検索した。酵母two-hybridアッセイはMATCHMAKER
GAL4 Two-Hybrid System 3（Clontech, Palo Alto, C
A）を用いて、製造もとのプロトコールに従って行っ
た。PEG10の全コーディング配列をpAS2-1ベクターのEco
R I-Sal I部位にクローニングしてbaitとして用い、ヒ
ト精巣cDNAライブラリー（Clontech）をスクリーニング
した。同定されたクローンの中で、Drosophila seven i
n absentiaのホモログ（SIAH-1および2）が、pAS2.1-PE
G10とpACT2-SIAH1または2とで同時に形質転換すること
によりPEG10と相互作用した（図５A）。PEG10とSIAH-1
の相互作用を確認するため、Hisタグを付加した組み換
えSIAH-1蛋白質を調製し、哺乳動物細胞でPEG10蛋白質
を発現させたところ、この結合が検出された（図５
B）。本発明者らはさらに、GST-PEG10融合蛋白質がHEK2
93細胞で発現させたflagタグを付加したSIAH-2蛋白質と
結合することを実証した（図５C）。
2との相互作用 PEG10の癌遺伝子としての機構を調べるため、酵母two-h
ybridスクリーニング系を用いてPEG10と相互作用する蛋
白質を検索した。酵母two-hybridアッセイはMATCHMAKER
GAL4 Two-Hybrid System 3（Clontech, Palo Alto, C
A）を用いて、製造もとのプロトコールに従って行っ
た。PEG10の全コーディング配列をpAS2-1ベクターのEco
R I-Sal I部位にクローニングしてbaitとして用い、ヒ
ト精巣cDNAライブラリー（Clontech）をスクリーニング
した。同定されたクローンの中で、Drosophila seven i
n absentiaのホモログ（SIAH-1および2）が、pAS2.1-PE
G10とpACT2-SIAH1または2とで同時に形質転換すること
によりPEG10と相互作用した（図５A）。PEG10とSIAH-1
の相互作用を確認するため、Hisタグを付加した組み換
えSIAH-1蛋白質を調製し、哺乳動物細胞でPEG10蛋白質
を発現させたところ、この結合が検出された（図５
B）。本発明者らはさらに、GST-PEG10融合蛋白質がHEK2
93細胞で発現させたflagタグを付加したSIAH-2蛋白質と
結合することを実証した（図５C）。
【００６４】なお、インビトロ蛋白質結合アッセイは以
下のようにして行った。SIAH1およびSIAH2の全コーディ
ング領域を、それぞれプライマー 5'-CGCGAATTCCGCCCAC
AGAAATGAGCC-3'（配列番号：９）および 5'-CATCTCGAGA
CATGGAAATAGTTACATTGATGC-3'（配列番号：１０）、また
は 5'-TGCGAATTCCATGGTTGGTTCGGAGC-3'（配列番号：１
１）および 5'-GTGCTCGAGGACAACATGTAGAAATAGTAAC-3'
（配列番号：１２）を用いて増幅し、pET21bベクター
（Novagen, Madison, WI）またはpCMV-Flag5（Sigma）
の適当なクローニング部位にクローニングした。Hisタ
グを付加した組み換えSIAH-1蛋白質をXpressTM system
（Invitrogen, Carlsbad, CA）を用いて製造もとの推奨
に従って調製した。ProBondTM histidine affinity res
in（Invitrogen）を10μgのHisタグ付加SIAH-1蛋白質の
存在下または非存在下、4℃で1時間インキュベートし、
結合バッファー（20 mM NaH2PO4, 500 mM NaCl, pH 7.
8）でよく洗い、PEG10を外来的に過剰発現するSNU423-P
EG10細胞の細胞抽出物 50μgとNP-40リシスバッファー
（150 mM NaCl, 50 mM Tris (pH 8.0), および 1% NP-4
0）中でインキュベートした。それぞれpH 7.8、pH 6.
0、および pH 5.5で、レジンを洗浄バッファー（20 mM
NaH2PO4 および 500 mM NaCl）で2回ずつ洗い、溶出バ
ッファー（300 mM imidazoleを含む洗浄バッファー）で
蛋白質を溶出した。溶出した蛋白質を抗Hisプローブ抗
体（Santa Cruz）または抗PEG10抗体を用いたイムノブ
ロッティングにより解析した。同様に、GSTまたはGST-P
EG10融合蛋白質をGlutathione SepharoseTM 4Bビーズ
（Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden）に
固定化し、Flagタグ付加SIAH2を過剰発現するHEK293-SI
AH2細胞のライセートと共にインキュベートした。結合
した蛋白質を溶出バッファー（120 mM NaCl, 50 mM Tri
s-HCl (pH 8.0), および 20 mM glutathione (Sigma)）
で溶出し、抗Flag抗体および抗PEG10抗体を用いたイム
ノブロッティングにより解析した。
下のようにして行った。SIAH1およびSIAH2の全コーディ
ング領域を、それぞれプライマー 5'-CGCGAATTCCGCCCAC
AGAAATGAGCC-3'（配列番号：９）および 5'-CATCTCGAGA
CATGGAAATAGTTACATTGATGC-3'（配列番号：１０）、また
は 5'-TGCGAATTCCATGGTTGGTTCGGAGC-3'（配列番号：１
１）および 5'-GTGCTCGAGGACAACATGTAGAAATAGTAAC-3'
（配列番号：１２）を用いて増幅し、pET21bベクター
（Novagen, Madison, WI）またはpCMV-Flag5（Sigma）
の適当なクローニング部位にクローニングした。Hisタ
グを付加した組み換えSIAH-1蛋白質をXpressTM system
（Invitrogen, Carlsbad, CA）を用いて製造もとの推奨
に従って調製した。ProBondTM histidine affinity res
in（Invitrogen）を10μgのHisタグ付加SIAH-1蛋白質の
存在下または非存在下、4℃で1時間インキュベートし、
結合バッファー（20 mM NaH2PO4, 500 mM NaCl, pH 7.
8）でよく洗い、PEG10を外来的に過剰発現するSNU423-P
EG10細胞の細胞抽出物 50μgとNP-40リシスバッファー
（150 mM NaCl, 50 mM Tris (pH 8.0), および 1% NP-4
0）中でインキュベートした。それぞれpH 7.8、pH 6.
0、および pH 5.5で、レジンを洗浄バッファー（20 mM
NaH2PO4 および 500 mM NaCl）で2回ずつ洗い、溶出バ
ッファー（300 mM imidazoleを含む洗浄バッファー）で
蛋白質を溶出した。溶出した蛋白質を抗Hisプローブ抗
体（Santa Cruz）または抗PEG10抗体を用いたイムノブ
ロッティングにより解析した。同様に、GSTまたはGST-P
EG10融合蛋白質をGlutathione SepharoseTM 4Bビーズ
（Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden）に
固定化し、Flagタグ付加SIAH2を過剰発現するHEK293-SI
AH2細胞のライセートと共にインキュベートした。結合
した蛋白質を溶出バッファー（120 mM NaCl, 50 mM Tri
s-HCl (pH 8.0), および 20 mM glutathione (Sigma)）
で溶出し、抗Flag抗体および抗PEG10抗体を用いたイム
ノブロッティングにより解析した。
【００６５】［実施例６］ SIAH1の遺伝子導入に応答
してPEG10蛋白質の発現は低下し、HCC細胞の細胞死が誘
導される SIAH-1はRING fingerドメインを介して標的蛋白質のE2
依存的なユビキチン化に関与し、幾つかの細胞株におい
てアポトーシスを誘導する。本発明者らはSIAH-1がユビ
キチン-プロテオソーム経路を介してPEG10をも分解する
可能性があると考えた。この仮説を検証し、HCC細胞に
おけるSIAH-1の機能を解析するため、mycタグを付加し
たSIAH-1蛋白質（Ad-SIAH1）およびLacZ（Ad-LacZ）を
発現する組み換えアデノウイルスを作製した。SIAH1を
発現するアデノウイルスの製造および調製はAdenovirus
Expression Vector Kit（TaKaRa）を用い、供給もとの
プロトコールに従って行った。まず、SIAH1の全コーデ
ィング領域を増幅し、pcDNA3.1/myc-Cベクター（Invitr
ogen）の適当な部位にクローニングした。次に、mycタ
グを付加したSIAH1断片を、キット（TaKaRa）に附属の
コスミドベクターpAxCAwt中にクローニングした。
してPEG10蛋白質の発現は低下し、HCC細胞の細胞死が誘
導される SIAH-1はRING fingerドメインを介して標的蛋白質のE2
依存的なユビキチン化に関与し、幾つかの細胞株におい
てアポトーシスを誘導する。本発明者らはSIAH-1がユビ
キチン-プロテオソーム経路を介してPEG10をも分解する
可能性があると考えた。この仮説を検証し、HCC細胞に
おけるSIAH-1の機能を解析するため、mycタグを付加し
たSIAH-1蛋白質（Ad-SIAH1）およびLacZ（Ad-LacZ）を
発現する組み換えアデノウイルスを作製した。SIAH1を
発現するアデノウイルスの製造および調製はAdenovirus
Expression Vector Kit（TaKaRa）を用い、供給もとの
プロトコールに従って行った。まず、SIAH1の全コーデ
ィング領域を増幅し、pcDNA3.1/myc-Cベクター（Invitr
ogen）の適当な部位にクローニングした。次に、mycタ
グを付加したSIAH1断片を、キット（TaKaRa）に附属の
コスミドベクターpAxCAwt中にクローニングした。
【００６６】半定量的RT-PCRにより、SIAH1の発現は調
べた6つの肝癌細胞株の全てで、正常肝組織よりも低下
していることが実証された（図６A）。Ad-SIAH1またはA
d-LacZを5つの肝癌細胞株（HepG2、Huh7、Alexander、S
NU423、およびSNU475）に感染させた。これらの各細胞
において、MOI 100におけるトランスフェクション効率
は67.3〜100％であることが判明した。抗myc抗体を用い
たイムノブロット解析により、感染24時間後のmycタグ
付加SIAH-1蛋白質の外来的発現を確認した（図６B）。5
つの細胞株の全てで、Ad-SIAH1を感染させた培養におい
て細胞死が顕著に上昇した（図６C）。
べた6つの肝癌細胞株の全てで、正常肝組織よりも低下
していることが実証された（図６A）。Ad-SIAH1またはA
d-LacZを5つの肝癌細胞株（HepG2、Huh7、Alexander、S
NU423、およびSNU475）に感染させた。これらの各細胞
において、MOI 100におけるトランスフェクション効率
は67.3〜100％であることが判明した。抗myc抗体を用い
たイムノブロット解析により、感染24時間後のmycタグ
付加SIAH-1蛋白質の外来的発現を確認した（図６B）。5
つの細胞株の全てで、Ad-SIAH1を感染させた培養におい
て細胞死が顕著に上昇した（図６C）。
【００６７】フローサイトメトリーにより、SIAH-1発現
の誘導は、G2/Mおよびsub-G1集団の細胞数を有意に増加
させることが示された。またTUNELアッセイにより、ア
ポトーシスを起した細胞数のうちAd-SIAH1が感染してい
る細胞数は、Ad-LacZが感染している細胞数よりも有意
に大きいことが実証された（図６D）。3-(4,5-dimethyl
thiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide（MT
T）アッセイを次のようにして行った。細胞を6ウェルプ
レートに1×105 細胞/ウェルの密度で播き、Ad-SIAH1ま
たはAd-LacZをMOI 0, 20, 50, または 100 で感染させ
た。感染72時間後、他の記載（Akashi, H. et al., In
t. J. Cancer 88, 873-880 (2000)）に従ってMTTアッセ
イを行った。各MOIにおける細胞の生存率をコントロー
ル（MOI 0）と比較した吸光度で表した。特筆すべきこ
とに、感染72時間後のMTTアッセイでは、Ad-SIAH1を感
染させた細胞では、用量依存的に生存率が減少すること
が実証された（図７A）。また、感染48時間後にPEG10蛋
白質のレベルをイムノブロッティングにより調べたとこ
ろ、調べた3つのHCC細胞株（HepG2、Huh7、およびAlexa
nder）で、Ad-SIAH1に応答して減少が見られたが、Ad-L
acZでは見られなかった（図７B）。PEG10蛋白質の過剰
発現が、SIAH-1により誘導される細胞死から肝細胞を保
護できるかを調べるため、外来的にPEG10を安定発現す
るSNU423-PEG10細胞を構築し、Ad-SIAH1を感染させた。
Ad-SIAH1の感染を受けて48時間後の生存率は、親細胞で
あるSNU423またはコントロールのSNU423-Mock細胞（偽
感染）に比べ、SNU423-PEG10細胞では有意に上昇するこ
とが示された（図７C）。これは、SIAH1が媒介する細胞
死に対して、PEG10が保護作用を有することを示してい
る。
の誘導は、G2/Mおよびsub-G1集団の細胞数を有意に増加
させることが示された。またTUNELアッセイにより、ア
ポトーシスを起した細胞数のうちAd-SIAH1が感染してい
る細胞数は、Ad-LacZが感染している細胞数よりも有意
に大きいことが実証された（図６D）。3-(4,5-dimethyl
thiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide（MT
T）アッセイを次のようにして行った。細胞を6ウェルプ
レートに1×105 細胞/ウェルの密度で播き、Ad-SIAH1ま
たはAd-LacZをMOI 0, 20, 50, または 100 で感染させ
た。感染72時間後、他の記載（Akashi, H. et al., In
t. J. Cancer 88, 873-880 (2000)）に従ってMTTアッセ
イを行った。各MOIにおける細胞の生存率をコントロー
ル（MOI 0）と比較した吸光度で表した。特筆すべきこ
とに、感染72時間後のMTTアッセイでは、Ad-SIAH1を感
染させた細胞では、用量依存的に生存率が減少すること
が実証された（図７A）。また、感染48時間後にPEG10蛋
白質のレベルをイムノブロッティングにより調べたとこ
ろ、調べた3つのHCC細胞株（HepG2、Huh7、およびAlexa
nder）で、Ad-SIAH1に応答して減少が見られたが、Ad-L
acZでは見られなかった（図７B）。PEG10蛋白質の過剰
発現が、SIAH-1により誘導される細胞死から肝細胞を保
護できるかを調べるため、外来的にPEG10を安定発現す
るSNU423-PEG10細胞を構築し、Ad-SIAH1を感染させた。
Ad-SIAH1の感染を受けて48時間後の生存率は、親細胞で
あるSNU423またはコントロールのSNU423-Mock細胞（偽
感染）に比べ、SNU423-PEG10細胞では有意に上昇するこ
とが示された（図７C）。これは、SIAH1が媒介する細胞
死に対して、PEG10が保護作用を有することを示してい
る。
【００６８】［実施例７］ PEG10のアンチセンスオリ
ゴヌクレオチドによる肝癌細胞の増殖抑制 PEG10の抑制がHCC細胞の増殖を遅らせ、および/または
細胞死を誘導するかを調べるため、様々なアンチセンス
S-オリゴヌクレオチドを設計した（実施例４参照）。
これらの中で、最初のエクソン-イントロン境界を覆う
アンチセンス S-オリゴヌクレオチド（配列番号：８）
は、大量のPEG10を恒常的に発現するAlexanderおよびHu
h7細胞の内因的PEG10発現を有意に減少させたが、調べ
た他のアンチセンス S-オリゴヌクレオチドやコントロ
ール S-オリゴヌクレオチドでは減少させなかった（図
８A）。このアンチセンス S-オリゴヌクレオチドのトラ
ンスフェクションは、これら２つの細胞株のコロニー形
成を有意に低下させた（図８B）が、PEG10を内因的に発
現しないSNU423細胞にこのアンチセンス S-オリゴヌク
レオチドを導入した場合は、増殖抑制効果は観察されな
かった（データ省略）。これらのコロニー形成アッセイ
の結果は、3つの独立した実験で確認された。
ゴヌクレオチドによる肝癌細胞の増殖抑制 PEG10の抑制がHCC細胞の増殖を遅らせ、および/または
細胞死を誘導するかを調べるため、様々なアンチセンス
S-オリゴヌクレオチドを設計した（実施例４参照）。
これらの中で、最初のエクソン-イントロン境界を覆う
アンチセンス S-オリゴヌクレオチド（配列番号：８）
は、大量のPEG10を恒常的に発現するAlexanderおよびHu
h7細胞の内因的PEG10発現を有意に減少させたが、調べ
た他のアンチセンス S-オリゴヌクレオチドやコントロ
ール S-オリゴヌクレオチドでは減少させなかった（図
８A）。このアンチセンス S-オリゴヌクレオチドのトラ
ンスフェクションは、これら２つの細胞株のコロニー形
成を有意に低下させた（図８B）が、PEG10を内因的に発
現しないSNU423細胞にこのアンチセンス S-オリゴヌク
レオチドを導入した場合は、増殖抑制効果は観察されな
かった（データ省略）。これらのコロニー形成アッセイ
の結果は、3つの独立した実験で確認された。
【００６９】
【発明の効果】本発明により、PEG10を介して細胞増殖
および細胞死を制御する新たな方法が提供された。また
本発明により、PEG10を標的とする癌抑制剤のスクリー
ニングが可能となった。PEG10蛋白質はほとんどの肝細
胞癌で発現が亢進しているが、正常肝ではその発現はほ
とんど見られない。この特徴は、PEG10が肝細胞癌の予
防または治療に対する標的分子として理想的であること
を示している。本発明は、肝細胞癌に対する新たな治療
戦略の開発に大きく貢献するものである。
および細胞死を制御する新たな方法が提供された。また
本発明により、PEG10を標的とする癌抑制剤のスクリー
ニングが可能となった。PEG10蛋白質はほとんどの肝細
胞癌で発現が亢進しているが、正常肝ではその発現はほ
とんど見られない。この特徴は、PEG10が肝細胞癌の予
防または治療に対する標的分子として理想的であること
を示している。本発明は、肝細胞癌に対する新たな治療
戦略の開発に大きく貢献するものである。
【００７０】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> President of Tokyo University
Center of Advanced Science and Technology Incubation, Ltd.
<120> Methods for regulation of proliferation and death
of carcinoma cells
<130> SEN-X0114
<140>
<141>
<160> 12
<170> PatentIn Ver. 2.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: artificially
synthesized sequence
<400> 1
acaacagcct caagatcatc ag 22
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: artificially
synthesized sequence
<400> 2
ggtccaccac tgacacgttg 20
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: artificially
synthesized sequence
<400> 3
aacaacaaca acaactccaa gc 22
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: artificially
synthesized sequence
<400> 4
tctgcacctg gctctgcac 19
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: artificially
synthesized sequence
<400> 5
tccaacaatg acttggcgag t 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: artificially
synthesized sequence
<400> 6
ctttttctgt gtgtggcaga g 21
<210> 7
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: artificially
synthesized sequence
<400> 7
cctcgcgtgg tgagta 16
<210> 8
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: artificially
synthesized sequence
<400> 8
tactcaccac gcgagg 16
<210> 9
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: artificially
synthesized sequence
<400> 9
cgcgaattcc gcccacagaa atgagcc 27
<210> 10
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: artificially
synthesized sequence
<400> 10
catctcgaga catggaaata gttacattga tgc 33
<210> 11
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: artificially
synthesized sequence
<400> 11
tgcgaattcc atggttggtt cggagc 26
<210> 12
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: artificially
synthesized sequence
<400> 12
gtgctcgagg acaacatgta gaaatagtaa c 31
【図１】PEG10の組織発現および構造を示す図である。
A, 成体ヒト組織のPEG10のMulti-tissue ノーザンブロ
ット解析。B, Simple Modular Architecture Research
Tool（SMART ver.3）により予測されたPEG10の蛋白質モ
チーフ。
A, 成体ヒト組織のPEG10のMulti-tissue ノーザンブロ
ット解析。B, Simple Modular Architecture Research
Tool（SMART ver.3）により予測されたPEG10の蛋白質モ
チーフ。
【図２】肝癌細胞株および原発性肝細胞癌におけるPEG1
0蛋白質の発現を示す図である。A, 6つの肝癌細胞株のP
EG10の遺伝子および蛋白質発現。PEG10特異的PCRプライ
マーセットを用いてRT-PCRを行った（上段）。GAPDHを
内部対照とした。また、抗PEG10抗体を用いてイムノブ
ロッティングを行った。SDS-PAGEに適用した蛋白質の量
をCoomassie Brilliant Blue（CBB）染色により評価し
た。B, HCC細胞株におけるPEG10蛋白質の細胞内局在。
倍率 ×600。C, 原発性肝細胞癌および対応する非癌肝
組織におけるPEG10の免疫組織化学染色。倍率 ×600。
0蛋白質の発現を示す図である。A, 6つの肝癌細胞株のP
EG10の遺伝子および蛋白質発現。PEG10特異的PCRプライ
マーセットを用いてRT-PCRを行った（上段）。GAPDHを
内部対照とした。また、抗PEG10抗体を用いてイムノブ
ロッティングを行った。SDS-PAGEに適用した蛋白質の量
をCoomassie Brilliant Blue（CBB）染色により評価し
た。B, HCC細胞株におけるPEG10蛋白質の細胞内局在。
倍率 ×600。C, 原発性肝細胞癌および対応する非癌肝
組織におけるPEG10の免疫組織化学染色。倍率 ×600。
【図３】ヒト肝癌細胞株におけるPEG10の増殖促進効果
を示す図である。A, PEG10の遺伝子導入後のSNU423およ
びSNU475細胞のコロニー形成。mockベクターに対するPE
G10を発現するプラスミドをトランスフェクトしたコロ
ニーの相対数を算出した（平均±SD）。B, 安定なトラ
ンスフェクタント（SNU423-PEG10)細胞のPEG10蛋白質の
発現。C, SNU423-PEG10細胞のPEG10の免疫組織化学染
色。倍率 ×1000。
を示す図である。A, PEG10の遺伝子導入後のSNU423およ
びSNU475細胞のコロニー形成。mockベクターに対するPE
G10を発現するプラスミドをトランスフェクトしたコロ
ニーの相対数を算出した（平均±SD）。B, 安定なトラ
ンスフェクタント（SNU423-PEG10)細胞のPEG10蛋白質の
発現。C, SNU423-PEG10細胞のPEG10の免疫組織化学染
色。倍率 ×1000。
【図４】ヒト肝癌細胞株におけるPEG10の増殖促進効果
を示す図である。A, 10％FBSを含むRPMI1640中で培養し
たSNU423-PEG10細胞の増殖曲線。B, 低血清培養条件下
でのSNU423-PEG10細胞の増殖曲線（0.1％FBSを含むRPMI
1640中で培養）。C, 0.1％FBSを含むRPMI1640中で培養
したmockおよびSNU423-PEG10細胞の細胞周期。G0/G1
期，白いカラム；S期，影付きのカラム；G2/M期，黒い
カラム。
を示す図である。A, 10％FBSを含むRPMI1640中で培養し
たSNU423-PEG10細胞の増殖曲線。B, 低血清培養条件下
でのSNU423-PEG10細胞の増殖曲線（0.1％FBSを含むRPMI
1640中で培養）。C, 0.1％FBSを含むRPMI1640中で培養
したmockおよびSNU423-PEG10細胞の細胞周期。G0/G1
期，白いカラム；S期，影付きのカラム；G2/M期，黒い
カラム。
【図５】PEG10とSIAH-1/2蛋白質との間の相互作用を示
す図である。A, 酵母two-hybrid実験。pAS2-1またはPEG
10遺伝子を含むpAS2-1を、SIAH1またはSIAH2を含むライ
ブラリーベクターと共に酵母株AH109にコトランスフェ
クトした。B, PEG10とSIAH-1とのインビトロ蛋白質結合
アッセイ。PEG10を発現する細胞由来の蛋白質を、SIAH-
1を結合した、または結合していないレジンとインキュ
ベートした。溶出した蛋白質を抗His抗体および抗PEG10
抗体を用いたイムノブロッティングで解析した。最後の
2レーンには、hisタグ付加SIAH-1およびPEG10を含む細
胞抽出物をコントロールとして直接ゲルにロードした。
C, PEG10とSIAH-2のインビトロ蛋白質結合アッセイ。fl
agタグ付加SIAH-2を発現する細胞由来の蛋白質をGST-PE
G10またはGSTと共にインキュベートし、Glutathione se
pharoseビーズで精製した。右の3レーンには、GST-PEG1
0融合蛋白質、GST、およびflagタグ付加SIAH-2蛋白質を
含む細胞抽出物をコントロールとしてロードした。
す図である。A, 酵母two-hybrid実験。pAS2-1またはPEG
10遺伝子を含むpAS2-1を、SIAH1またはSIAH2を含むライ
ブラリーベクターと共に酵母株AH109にコトランスフェ
クトした。B, PEG10とSIAH-1とのインビトロ蛋白質結合
アッセイ。PEG10を発現する細胞由来の蛋白質を、SIAH-
1を結合した、または結合していないレジンとインキュ
ベートした。溶出した蛋白質を抗His抗体および抗PEG10
抗体を用いたイムノブロッティングで解析した。最後の
2レーンには、hisタグ付加SIAH-1およびPEG10を含む細
胞抽出物をコントロールとして直接ゲルにロードした。
C, PEG10とSIAH-2のインビトロ蛋白質結合アッセイ。fl
agタグ付加SIAH-2を発現する細胞由来の蛋白質をGST-PE
G10またはGSTと共にインキュベートし、Glutathione se
pharoseビーズで精製した。右の3レーンには、GST-PEG1
0融合蛋白質、GST、およびflagタグ付加SIAH-2蛋白質を
含む細胞抽出物をコントロールとしてロードした。
【図６】肝癌細胞の生存率およびPEG10発現に対するSIA
H1遺伝子導入の効果を示す図である。A, 肝癌細胞株に
おけるSIAH1の発現をRT-PCRにより調べた。正常肝組織
から抽出したmRNAを比較に用いた。B, アデノウイルス
を介したSIAH1遺伝子導入（100 MOI）によるSNU423細胞
でのmycタグ付加SIAH-1蛋白質の外来的発現。C, 5つの
ヒト肝癌細胞株にAd-LacZまたはAd-SIAH1をMOI 100で感
染し、48時間後の顕微鏡観察像（倍率 ×200）。D, Ad-
SIAH1（100 MOI）で誘導されたHuh7細胞のアポトーシ
ス；Ad-SIAH1またはAd-LacZを感染させた細胞のSub-G1
集団を、感染の48時間後にFACSにより調べた（左パネ
ル）。アポトーシスを起した細胞は、TUNELアッセイに
より緑または黄として検出された（右パネル）。
H1遺伝子導入の効果を示す図である。A, 肝癌細胞株に
おけるSIAH1の発現をRT-PCRにより調べた。正常肝組織
から抽出したmRNAを比較に用いた。B, アデノウイルス
を介したSIAH1遺伝子導入（100 MOI）によるSNU423細胞
でのmycタグ付加SIAH-1蛋白質の外来的発現。C, 5つの
ヒト肝癌細胞株にAd-LacZまたはAd-SIAH1をMOI 100で感
染し、48時間後の顕微鏡観察像（倍率 ×200）。D, Ad-
SIAH1（100 MOI）で誘導されたHuh7細胞のアポトーシ
ス；Ad-SIAH1またはAd-LacZを感染させた細胞のSub-G1
集団を、感染の48時間後にFACSにより調べた（左パネ
ル）。アポトーシスを起した細胞は、TUNELアッセイに
より緑または黄として検出された（右パネル）。
【図７】肝癌細胞の生存率およびPEG10発現に対するSIA
H1遺伝子導入の効果を示す図である。A, Ad-SIAH1をMOI
20、50、および100で感染後にMTTアッセイにより細胞
の生存率を測定した。B, Ad-SIAH1を異なるMOIでHepG2
細胞に感染後の、PEG10蛋白質の用量依存的な減少。感
染の48時間後に蛋白質を抽出し、抗PEG10抗体を用いた
イムノブロットにより解析した。C, SIAH-1により誘導
される細胞死におけるPEG10発現の効果。PEG10を発現す
る細胞（SNU423-PEG10）、その親細胞（SNU423）、また
はコントロール細胞（SNU423-Mock）にAd-SIAH1を感染
させ、48時間後にMTTアッセイにより細胞の生存率を調
べた。データ（平均±SD）はAd-LacZを感染させた細胞
のMTT活性に対するAd-SIAH1を感染させた細胞のMTT活性
の相対値で示した。
H1遺伝子導入の効果を示す図である。A, Ad-SIAH1をMOI
20、50、および100で感染後にMTTアッセイにより細胞
の生存率を測定した。B, Ad-SIAH1を異なるMOIでHepG2
細胞に感染後の、PEG10蛋白質の用量依存的な減少。感
染の48時間後に蛋白質を抽出し、抗PEG10抗体を用いた
イムノブロットにより解析した。C, SIAH-1により誘導
される細胞死におけるPEG10発現の効果。PEG10を発現す
る細胞（SNU423-PEG10）、その親細胞（SNU423）、また
はコントロール細胞（SNU423-Mock）にAd-SIAH1を感染
させ、48時間後にMTTアッセイにより細胞の生存率を調
べた。データ（平均±SD）はAd-LacZを感染させた細胞
のMTT活性に対するAd-SIAH1を感染させた細胞のMTT活性
の相対値で示した。
【図８】PEG10を抑制するように設計されたアンチセン
ス S-オリゴヌクレオチドによる増殖抑制を示す図であ
る。A, センスまたはアンチセンス S-オリゴヌクレオチ
ドをトランスフェクトしたHuh7細胞におけるPEG10蛋白
質レベル。B, センスまたはアンチセンス S-オリゴヌク
レオチドをトランスフェクトしたAlexander細胞およびH
uh7細胞のコロニー。センス S-オリゴヌクレオチドをト
ランスフェクトした細胞のコロニー数に対する、アンチ
センス S-オリゴヌクレオチドをトランスフェクトした
細胞のコロニー数の相対値を調べた（平均±SD）。
ス S-オリゴヌクレオチドによる増殖抑制を示す図であ
る。A, センスまたはアンチセンス S-オリゴヌクレオチ
ドをトランスフェクトしたHuh7細胞におけるPEG10蛋白
質レベル。B, センスまたはアンチセンス S-オリゴヌク
レオチドをトランスフェクトしたAlexander細胞およびH
uh7細胞のコロニー。センス S-オリゴヌクレオチドをト
ランスフェクトした細胞のコロニー数に対する、アンチ
センス S-オリゴヌクレオチドをトランスフェクトした
細胞のコロニー数の相対値を調べた（平均±SD）。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ ４Ｃ０８６
Ｃ１２Ｑ 1/68 33/50 Ｚ
Ｇ０１Ｎ 33/15 33/53 Ｄ
33/50 Ｍ
33/53 33/566
Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ
33/566 5/00 Ｂ
(72)発明者 古川 洋一
神奈川県川崎市宮前区宮崎３丁目10番40
Ｆターム(参考） 2G045 AA40 BA11 BB50 DA13 FB02
4B024 AA01 AA11 BA80 CA01 GA11
GA27
4B063 QA01 QQ08 QQ53 QR32 QR55
QS34 QX01
4B065 AA90X AB01 AC12 AC14
BA01 BA30 CA24 CA44
4C084 AA13 AA17 NA14 ZB21 ZB26
4C086 AA01 AA02 EA16 MA01 MA04
ZB21 ZB26
Claims (17)
- 【請求項１】 細胞におけるPEG10蛋白質レベルを上昇
または低下させる工程を含む、細胞の増殖をそれぞれ促
進または抑制する方法。 - 【請求項２】 細胞におけるPEG10蛋白質レベルを上昇
または低下させる工程を含む、細胞死をそれぞれ抑制ま
たは促進する方法。 - 【請求項３】 細胞におけるPEG10蛋白質レベルを上昇
または低下させる工程が、細胞におけるPEG10蛋白質のS
IAH蛋白質との相互作用レベルを抑制または促進する工
程である、請求項１または２に記載の方法。 - 【請求項４】 細胞におけるPEG10蛋白質レベルを上昇
させる工程が、PEG10遺伝子を外来的に発現させる工程
である、請求項１から３のいずれかに記載の方法。 - 【請求項５】 細胞におけるPEG10蛋白質レベルを低下
させる工程が、PEG10遺伝子に対するアンチセンスポリ
ヌクレオチドを細胞に導入または発現させる工程であ
る、請求項１から３のいずれかに記載の方法。 - 【請求項６】 細胞が癌細胞である、請求項１から５の
いずれかに記載の方法。 - 【請求項７】 癌細胞が肝癌細胞である、請求項６に記
載の方法。 - 【請求項８】 肝癌細胞が肝細胞癌細胞である、請求項
７に記載の方法。 - 【請求項９】 細胞増殖または細胞死を調節する活性を
有する化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）被検化合物を含む試料の存在下、細胞におけるPE
G10遺伝子の発現レベルを検出する工程、（ｂ）該発現
レベルを上昇または低下させる活性を有する化合物を選
択する工程、を含む方法。 - 【請求項１０】 細胞増殖または細胞死を調節する活性
を有する化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）被検化合物を含む試料の存在下、PEG10蛋白質とS
IAH蛋白質との相互作用を検出する工程、（ｂ）該相互
作用を上昇または低下させる活性を有する化合物を選択
する工程、を含む方法。 - 【請求項１１】 細胞増殖または細胞死を調節する活性
を有する化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）被検化合物を含む試料の存在下、PEG10蛋白質を
外来的に発現する細胞を培養する工程、（ｂ）該細胞の
増殖または細胞死を上昇または低下させる活性を有する
化合物を選択する工程、を含む方法。 - 【請求項１２】 請求項９から１１のいずれかに記載の
方法により単離しうる化合物を含む、細胞増殖性疾患の
予防または治療のための医薬組成物。 - 【請求項１３】 PEG10遺伝子に対するアンチセンスポ
リヌクレオチドを含む、請求項１２に記載の医薬組成
物。 - 【請求項１４】 PEG10遺伝子および/またはSIAH遺伝子
の構造変異または発現異常を検出する工程を含む、肝癌
の検査または診断方法。 - 【請求項１５】 肝癌が肝細胞癌である、請求項１４に
記載の検査または診断方法。 - 【請求項１６】 PEG10遺伝子またはSIAH遺伝子の塩基
配列またはその相補鎖の一部を含むポリヌクレオチド、
あるいはPEG10蛋白質またはSIAH蛋白質に結合する抗体
を含む、肝癌の検査または診断試薬。 - 【請求項１７】 肝癌が肝細胞癌である、請求項１６に
記載の検査または診断試薬。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001290248A JP2003093066A (ja) | 2001-09-21 | 2001-09-21 | 癌細胞の増殖および細胞死を制御する方法 |
| US10/490,581 US20050070015A1 (en) | 2001-09-21 | 2002-08-21 | Methods of controlling proliferation of cancer cells and cell death |
| PCT/JP2002/008416 WO2003026696A1 (fr) | 2001-09-21 | 2002-08-21 | Procede permettant de maitriser la proliferation de cellules cancereuses et la mort cellulaire |
| US11/626,540 US20070155689A1 (en) | 2001-09-21 | 2007-01-24 | Methods of regulating growth and death of cancer cells |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001290248A JP2003093066A (ja) | 2001-09-21 | 2001-09-21 | 癌細胞の増殖および細胞死を制御する方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003093066A true JP2003093066A (ja) | 2003-04-02 |
Family
ID=19112590
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001290248A Withdrawn JP2003093066A (ja) | 2001-09-21 | 2001-09-21 | 癌細胞の増殖および細胞死を制御する方法 |
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| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US20050070015A1 (ja) |
| JP (1) | JP2003093066A (ja) |
| WO (1) | WO2003026696A1 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| US20060200878A1 (en) * | 2004-12-21 | 2006-09-07 | Linda Lutfiyya | Recombinant DNA constructs and methods for controlling gene expression |
| US20150218103A1 (en) | 2012-08-25 | 2015-08-06 | The Johns Hopkins University | Gapdh cascade inhibitor compounds and methods of use and treatment of stress induced disorders including mental illness |
| US20140273021A1 (en) * | 2013-03-14 | 2014-09-18 | Enzo Biochem, Inc. | Vitamin d assays |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7625697B2 (en) * | 1994-06-17 | 2009-12-01 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Methods for constructing subarrays and subarrays made thereby |
| DE19936563A1 (de) * | 1999-08-04 | 2001-02-08 | Boehringer Ingelheim Int | Tumorassoziiertes Antigen |
| US7270998B2 (en) * | 2000-06-01 | 2007-09-18 | Japan Science And Technology Corporation | Method of concentrating and separating dopaminergic neurons |
-
2001
- 2001-09-21 JP JP2001290248A patent/JP2003093066A/ja not_active Withdrawn
-
2002
- 2002-08-21 WO PCT/JP2002/008416 patent/WO2003026696A1/ja active Application Filing
- 2002-08-21 US US10/490,581 patent/US20050070015A1/en not_active Abandoned
-
2007
- 2007-01-24 US US11/626,540 patent/US20070155689A1/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20070155689A1 (en) | 2007-07-05 |
| WO2003026696A1 (fr) | 2003-04-03 |
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