JP2003083892A

JP2003083892A - 化学物質センサおよび化学物質の検出方法

Info

Publication number: JP2003083892A
Application number: JP2001274231A
Authority: JP
Inventors: Mineo Ikematsu; 峰男池松
Original assignee: Sanyo Electric Co Ltd
Current assignee: Sanyo Electric Co Ltd
Priority date: 2001-09-10
Filing date: 2001-09-10
Publication date: 2003-03-19

Abstract

(57)【要約】【課題】所定の化学物質を高感度、迅速かつ低コスト
で検出することが可能な化学物質センサおよび化学物質
の検出方法を提供することである。【解決手段】反応溶液３は、予め蛍光性ニオイ物質が
結合したウシ由来のニオイ結合タンパク質を含む。ニオ
イ物質を含む外気が外気導入部４により反応溶液３に導
入される。ニオイ物質が反応溶液３中のニオイ結合タン
パク質と結合すると、蛍光性ニオイ物質が解離する。そ
れにより、蛍光性ニオイ物質からの蛍光強度が瞬時に減
少する。予めニオイ結合タンパク質に結合した蛍光性ニ
オイ物質からの蛍光強度の変化に基づいてニオイ物質の
有無を判定することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、試料に含まれる化
学物質を検出する化学物質センサおよび化学物質の検出
方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】商品、例えば食品等の品質の管理試験の
１つとして、ニオイ物質の検出が行われている。なお、
ここでは、ニオイの原因となる化学物質を総称してニオ
イ物質と呼ぶ。このニオイ物質の検出は、例えば、製造
または保存している食品等が劣化した際に生じるニオイ
の検出や、ペットボトルなどの容器のニオイなどが内部
の食品に移行していることを検出する場合などに用いら
れている。また、地雷の火薬のニオイを地表から検出す
ることにより、地雷の存在場所などを検出することが試
みられている。

【０００３】こうしたニオイ物質の検出は、従来では、
例えば高分子基板や膜などを用い、この基板または膜に
ニオイ物質が付着した際の基板の導電性の変化や膜電位
の変化を測定することにより行っていた。

【０００４】しかしながら、こうした方法では、ニオイ
物質の結合とニオイ物質以外の物質の結合とを区別する
ことが困難であるという問題がある。このため、こうし
た問題を回避するために、抗体を用いる方法が開発され
ている（「J.E.Roederer andG.J.Bastiaans, Anal. Che
m.,55(1983)2333. 」「K.A.Davis and T.R.,Leary,An
al.Chem.,61(1989)1227. 」「H.Muramatsu et al.,An
al.Chem.,59(1987)2760. 」「M.Thompson et al.,IEE
ETrans.Ultrasonics,Ferroelectrics,Frequency Contro
l, UFFC-34(1987)127. 」「M.Thompson et al.,Anal.
Chem.,58(1986)1206.」「F.Caruso et al.,Colloid I
nterface Sci.,178(1996)104.」）。すなわち、抗体を
高分子基板や膜に固定して、この抗体に特異的なニオイ
物質のみを結合させることとしている。そして、この抗
体に特異的なニオイ物質が結合すると、高分子基板の誘
電率が変化し、または、膜電位が変化するため、この変
化に基づいて特定のニオイ物質の検出が行われ、非特異
的な物質の結合を排除することが可能となる。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】上記のような高分子基
板や膜などを用いた従来のニオイセンサはその感度が低
いもの（〜ｐｐｍ）が多い。また感度が高くても（〜ｐ
ｐｂ）、ニオイ吸着のために必要な基板表面修飾にバリ
エーションが乏しく（高々十数種類）、対応できるニオ
イが制限されていた。

【０００６】一方、ニオイ物質に対する抗体を用いた検
出法では、抗体が高価であるため、検出を行うのにコス
トがかかる。また、抗体を用いた検出法では、反応時間
が長く、検出のために長時間を要する。さらに、このよ
うな抗体を用いた検出法においては、抗体とニオイ物質
との結合における特異性が非常に高いため、通常非常に
多数の物質から構成されるニオイを検出するにはその各
々のニオイ物質に対応した抗体を用意する必要がある。
このため、抗体を用いて複数の種類のニオイ物質を検出
する方法は、抗体作製に要する費用、抗体の熱的不安定
性を考慮すると現実的ではない。

【０００７】本発明の目的は、所定の化学物質を迅速、
高感度かつ低コストで検出することが可能な化学物質セ
ンサおよび化学物質の検出方法を提供することである。

【０００８】

【課題を解決するための手段および発明の効果】種々の
動物は嗅覚器官を有し、この嗅覚器官においてニオイを
検知して識別している。近年では、この嗅覚器官のメカ
ニズムの分子生物学的な解析が進められている。この解
析において、ニオイ物質は、嗅覚粘膜の上皮細胞等に存
在する特異的な受容体と結合し、この受容体を介して嗅
覚細胞内にシグナルを伝達してニオイ物質を検知し識別
を行っていることが明らかになっている。

【０００９】また、この一連のニオイ物質の検知、認識
のメカニズムの詳細な解明の中で、ニオイ物質と結合す
るタンパク（以下、ニオイ結合タンパク質と呼ぶ）が同
定・単離されている（「J.Pevsner et al.,Science,241
(1988)336.」）。なお、ニオイ結合タンパク質は、ニオ
イ物質に限らず、ニオイを有さない特定の化学物質と結
合することも可能である。

【００１０】このニオイ結合タンパク質の生物学的作用
としては、ニオイ物質と結合して、このニオイ物質を粘
膜細胞上の受容体まで運び、受容体にニオイ物質を受け
渡す役割を有していると推測されている。また、このニ
オイ結合タンパク質は、生化学的にも解析され、一定の
ニオイ物質に対する結合力をピークとして、このニオイ
物質と類似の物質に対する広い結合力を有していること
が明らかにされている（「J.Pevsner et al.,J.Biolog.
Chem.,265(1990)6118.」「M.A.Bianchet etal.,Natur
e Struc.Biolog.,3(1996)934.」「M.Tegoni et al.,N
ature Struc.Biolog.,3(1996)863 」）。特に、こうし
たニオイ結合タンパク質は、遺伝子がクローニングされ
ているものも存在し（上記J.Pevsner ら）大量生産を行
うことも可能である。

【００１１】本発明者はこのようなニオイ結合タンパク
質に着目し、このニオイ結合タンパク質を用いて化学物
質の検出方法を鋭意検討した。その結果、ニオイ結合タ
ンパク質を利用することにより、一定の幅のあるニオイ
物質を高感度かつ迅速に検出しうることが可能であるこ
とを見出した。そして以下の本願発明を案出した。

【００１２】本発明に係る化学物質センサは、予めニオ
イ結合タンパク質に結合した蛍光性物質からの蛍光強度
の変化に基づいて所定の化学物質を検出するものであ
る。

【００１３】蛍光性物質が結合したニオイ結合タンパク
質に所定の化学物質が結合すると、蛍光性物質が解離す
る。蛍光性物質からの蛍光は、ニオイ結合タンパク質に
結合しているときのみ、所定の波長で極大となる。その
ため、蛍光性物質がニオイ結合タンパク質から解離する
と、所定の波長の蛍光強度が瞬時に減少する。したがっ
て、予めニオイ結合タンパク質に結合した蛍光性物質か
らの蛍光強度の変化に基づいて所定の化学物質を高感
度、迅速かつ低コストで検出することができる。また、
異なる結合特性を有する複数種類の化学物質を検出する
こともできる。

【００１４】ニオイ結合タンパク質は二量体構造を有す
ることが好ましい。それにより、所定の化学物質が、予
めニオイ結合タンパク質に結合した蛍光性物質と容易に
置換する。

【００１５】本発明に係る化学物質センサは、予め蛍光
性物質が結合しかつ二量体構造を有するニオイ結合タン
パク質と、ニオイ結合タンパク質に励起光を照射する光
源と、ニオイ結合タンパク質に結合した蛍光性物質から
得られる蛍光を検出する蛍光検出部と、蛍光検出部によ
り検出された蛍光の強度変化に基づいて所定の化学物質
の有無を判定する判定手段とを備えたものである。

【００１６】本発明に係る化学物質センサにおいては、
二量体構造を有するニオイ結合タンパク質に予め蛍光性
物質が結合されている。光源によりニオイ結合タンパク
質に励起光が照射され、ニオイ結合タンパク質に結合し
た蛍光性物質から得られる蛍光が蛍光検出部により検出
される。蛍光検出部により検出された蛍光の強度変化に
基づいて判定手段により所定の化学物質の有無が判定さ
れる。

【００１７】蛍光性物質が結合したニオイ結合タンパク
質に所定の化学物質が結合すると、蛍光性物質が解離す
る。蛍光性物質からの蛍光は、ニオイ結合タンパク質に
結合しているときのみ、所定の波長で極大となる。その
ため、蛍光性物質がニオイ結合タンパク質から解離する
と、所定の波長の蛍光強度が瞬時に減少する。

【００１８】したがって、予めニオイ結合タンパク質に
結合した蛍光性物質からの蛍光強度の変化に基づいて所
定の化学物質を高感度でかつ迅速に検出することができ
る。また、このような化学物質センサを用いた方法は、
抗体を用いた従来の方法に比べて低コストで実施するこ
とが可能である。

【００１９】また、ニオイ結合タンパク質は、特定の化
学物質に対する結合力をピークとしてこの化学物質と類
似の化学物質に対しても広く結合力を有している。この
ため、このようなニオイ結合タンパク質を用いる上記の
化学物質センサによれば、幅広く化学物質の検出を行う
ことが可能となる。

【００２０】光源から照射された励起光のうち特定波長
の光を選択的に透過させる第１の波長選択部と、ニオイ
結合タンパク質に結合した蛍光性物質から得られる蛍光
のうち特定波長の光を選択的に透過させる第２の波長選
択部とをさらに備えてもよい。

【００２１】この場合、光源から照射された励起光のう
ち特定波長の光のみが第１の波長選択部を選択的に透過
し、ニオイ結合タンパク質に照射される。また、予めニ
オイ結合タンパク質に結合した蛍光性物質から得られる
蛍光のうち特定波長の光のみが第２の波長選択部を選択
的に透過し、蛍光検出部により検出される。

【００２２】ニオイ結合タンパク質がウシ由来のニオイ
結合タンパク質であってもよい。このようなウシ由来の
ニオイ結合タンパク質は、テルペノイド、エステル類、
アルデヒド類、芳香族等と幅広く親和性を有する。した
がって、このようなウシ由来のニオイ結合タンパク質を
上記の化学物質センサに用いることにより、上記に挙げ
たような幅広い化学物質を高感度で検知することが可能
となる。

【００２３】蛍光性物質はアミノアントラセンであって
もよい。アミノアントラセンがニオイ結合タンパク質か
ら解離した場合には、特定波長の蛍光強度が瞬時に減少
する。したがって、アミノアントラセンからの特定波長
の蛍光強度の減少に基づいて所定の化学物質を迅速に検
出することができる。

【００２４】本発明に係る化学物質の検出方法は、予め
ニオイ結合タンパク質に結合した蛍光性物質からの蛍光
強度の変化に基づいて化学物質を検出するものである。

【００２５】蛍光性物質が結合したニオイ結合タンパク
質に所定の化学物質が結合すると、蛍光性物質が解離す
る。蛍光性物質からの蛍光は、ニオイ結合タンパク質に
結合しているときのみ、所定の波長で極大となる。その
ため、蛍光性物質がニオイ結合タンパク質から解離する
と、所定の波長の蛍光強度が瞬時に減少する。したがっ
て、予めニオイ結合タンパク質に結合した蛍光性物質か
らの蛍光強度の変化に基づいて所定の化学物質を高感
度、迅速かつ低コストで検出することができる。また、
異なる結合特性を有する複数種類の化学物質を検出する
こともできる。

【００２６】ニオイ結合タンパク質が二量体構造を有す
ることが好ましい。それにより、所定の化学物質が、予
めニオイ結合タンパク質に結合した蛍光性物質と容易に
置換する。

【００２７】本発明に係る化学物質の検出方法は、二量
体構造を有するニオイ結合タンパク質に予め蛍光性物質
を結合させる工程と、ニオイ結合タンパク質に励起光を
照射する工程と、ニオイ結合タンパク質に結合した蛍光
性物質から得られる蛍光を検出する工程と、蛍光検出部
により検出された蛍光の強度変化に基づいて所定の化学
物質の有無を判定する工程とを備えたものである。

【００２８】本発明に係る化学物質の検出方法において
は、二量体構造を有するニオイ結合タンパク質に予め蛍
光性物質が結合されている。ニオイ結合タンパク質に励
起光が照射され、ニオイ結合タンパク質に結合した蛍光
性物質から得られる蛍光が検出される。検出された蛍光
の強度変化に基づいて所定の化学物質の有無が判定され
る。

【００２９】蛍光性物質が結合したニオイ結合タンパク
質に所定の化学物質が結合すると、蛍光性物質が解離す
る。蛍光性物質からの蛍光は、ニオイ結合タンパク質に
結合しているときのみ、所定の波長で極大となる。その
ため、蛍光性物質がニオイ結合タンパク質から解離する
と、所定の波長の蛍光強度が瞬時に減少する。

【００３０】したがって、予めニオイ結合タンパク質に
結合した蛍光性物質からの蛍光強度の変化に基づいて所
定の化学物質を高感度でかつ迅速に検出することができ
る。また、このような化学物質の検出方法は、抗体を用
いた従来の方法に比べて低コストで実施することが可能
である。

【００３１】また、ニオイ結合タンパク質は、特定の化
学物質に対する結合力をピークとしてこの化学物質と類
似の化学物質に対しても広く結合力を有している。この
ため、このようなニオイ結合タンパク質を用いる上記の
化学物質の検出方法によれば、幅広く化学物質の検出を
行うことが可能となる。

【００３２】ニオイ結合タンパク質がウシ由来のニオイ
結合タンパク質であってもよい。このようなウシ由来の
ニオイ結合タンパク質は、テルペノイド、エステル類、
アルデヒド類、芳香族等と幅広く親和性を有する。した
がって、このようなウシ由来のニオイ結合タンパク質を
上記の化学物質の検出方法に用いることにより、上記に
挙げたような幅広い化学物質を高感度で検知することが
可能となる。

【００３３】蛍光性物質はアミノアントラセンであって
もよい。アミノアントラセンがニオイ結合タンパク質か
ら解離した場合には、特定波長の蛍光強度が瞬時に減少
する。したがって、アミノアントラセンからの特定波長
の蛍光強度の減少に基づいて所定の化学物質を迅速に検
出することができる。

【００３４】

【発明の実施の形態】以下においては、本発明に係る化
学物質の検出方法をニオイ物質の検出に適用する場合に
ついて説明する。

【００３５】図１は本発明の一実施の形態におけるニオ
イ物質の検出方法の例を示す模式的な構成図である。図
１に示す化学物質センサ１００は、反応溶液３を収納す
る複数の孔部２を備えたマイクロプレート１、外気導入
部４、光源５、第１の波長選択部６、第２の波長選択部
７、蛍光検出部８およびデータ処理部９から構成され
る。

【００３６】化学物質センサ１００において、マイクロ
プレート１の各孔部２には反応溶液３が収納されてい
る。反応溶液３は、ウシ由来のニオイ結合タンパク質
（ＯＢＰ；odorant binding protein,J.Pevsner et. a
l.,J.Biolog.Chem.265(1990)6118）および蛍光性ニオイ
物質をリン酸緩衝液（ＰＢＳ；phosphate buffered sal
ine ）に溶解させて調製したものである。以下において
は、このウシ由来のニオイ結合タンパク質をＯＢＰｂと
呼ぶ。また、蛍光性ニオイ物質は、例えばアミノアント
ラセン（ＡＭＡ）である。蛍光性ニオイ物質は、ＯＢＰ
ｂに結合している。

【００３７】ＯＢＰｂは、種々のテルペノイド、シクロ
ペンタンおよびジャスミン誘導体、エステル類、ムスク
類、アルデヒド類、芳香族類に対して親和性を有してお
り、これらの物質と結合し得る。したがって、ＯＢＰｂ
はこれらの種々のニオイ物質を特異的に検知する際に好
適に利用することが可能である。

【００３８】この場合においては、異なるニオイ物質に
反応するＯＢＰｂをそれぞれ含む反応溶液３が複数の孔
部２にそれぞれ収納されている。すなわち、この場合に
おいては、複数種類のＯＢＰｂが用いられているととも
に、それぞれ異なる種類のＯＢＰｂを含む複数種類の反
応溶液３が用意され、孔部２に収納されている。

【００３９】なお、上記のようなＯＢＰｂの性質の違い
は、ＯＢＰｂを構成するアミノ酸、特に結合部位のアミ
ノ酸の置換により生じる。ここで用いる複数種類のＯＢ
Ｐｂは、このようなアミノ酸の置換により、種々のニオ
イ物質に対する応答が少しずつ異なっている。

【００４０】上記のようなＯＢＰｂは、天然に単離され
たタンパク質である必要はなく、例えば、ＯＢＰｂを構
成するＤＮＡが単離またはクローニング等されている場
合にはこの遺伝子をインビトロで翻訳させたタンパク質
を用いることも可能である。

【００４１】さらに、ＯＢＰｂをコードした遺伝子の塩
基配列を改変し、ニオイ物質に対する親和性を変化させ
たものを用いることも可能である。この遺伝子の改変方
法については既知の点突然変異導入方法、ランダムミュ
ータジェネシスＰＣＲ、クンケル（kunkel）法などを好
適に利用することが可能である。

【００４２】上記の化学物質センサ１００を用いてニオ
イ物質を検出する際には、まず、光源５から光を出射さ
せる。出射された光のうち特定波長の光のみが第１の波
長選択部６を透過する。なお、第１の波長選択部６は、
例えばモノクロームメータまたは波長選択フィルタから
なる。この場合においては、波長２９５ｎｍの光が選択
的に第１の波長選択部６を透過する。

【００４３】このようにして選択された波長２９５ｎｍ
の光は、マイクロプレート１の各孔部２に収納されたＯ
ＢＰｂを含む各反応溶液３に照射される。この照射によ
り、各反応溶液３において、ＯＢＰｂに結合した蛍光性
ニオイ物質が励起され、さらに励起された蛍光性ニオイ
物質から蛍光が生じる。

【００４４】反応溶液３中のＯＢＰｂに結合している蛍
光性ニオイ物質から生じた蛍光のうち特定波長の蛍光の
みが第２の波長選択部７を透過する。なお、第２の波長
選択部７は、例えばモノクロームメータまたは波長選択
フィルタからなる。蛍光性ニオイ物質としてＡＭＡを用
いた場合には、波長４８１ｎｍ付近の蛍光を選択的に第
２の波長選択部７を透過させる。このようにして選択さ
れた波長４８１ｎｍ付近の蛍光が蛍光検出部８により検
出される。さらに、検出された蛍光の強度のデータがデ
ータ処理部９により処理される。

【００４５】以上のようにして、各反応溶液３に含まれ
る各ＯＢＰｂに結合する蛍光性ニオイ物質の蛍光強度を
測定する。

【００４６】次に、各反応溶液３に、複数のニオイ物質
を含む外気を外気導入部４を通じてそれぞれ導入する。

【００４７】外気導入部４は、例えばファンとチューブ
により構成され、ファンにより送風された外気がチュー
ブを通して各孔部２に送られる構成であってもよい。な
お、外気導入部４を設けず、マイクロプレート１を直接
外気にさらすことにより反応溶液３に外気を導入しても
よい。この場合においては、孔部２が外気導入部４とし
て作用する。

【００４８】上記のようにして各反応溶液３に外気を導
入することにより、複数のニオイ物質を含む外気とＯＢ
Ｐｂを含む各反応溶液３とが接触し、外気中に含まれる
ニオイ物質の各々が対応する反応溶液３のＯＢＰｂに結
合する。

【００４９】ＯＢＰｂには予め蛍光性ニオイ物質が結合
している。蛍光性ニオイ物質が結合しているＯＢＰｂに
別のニオイ物質が結合すると、ＯＢＰｂから蛍光性ニオ
イ物質が解離する。蛍光性ニオイ物質がＯＢＰｂに結合
しているときのみ、蛍光性ニオイ物質からの蛍光強度が
特定の波長で極大となる。蛍光性ニオイ物質がＡＭＡで
ある場合には、ＡＭＡからの蛍光強度が波長４８１ｎｍ
付近で極大となる。そのため、ニオイ物質がＯＢＰｂと
結合することにより蛍光性ニオイ物質が解離すると、特
定の波長の蛍光強度が瞬時に減少する。

【００５０】したがって、データ処理部９により特定の
波長の蛍光強度の減少を検出することにより、試料中に
おけるニオイ物質の有無を瞬時に判定することができ
る。

【００５１】すなわち、予め蛍光性ニオイ物質が結合し
たＯＢＰｂを含む反応溶液３における蛍光強度の変化か
ら各種のニオイ物質の有無を判定することができる。例
えば、試料の導入により反応溶液３中のＯＢＰｂに結合
しているＡＭＡの蛍光強度が減少した場合には、この反
応溶液３中に含まれるＯＢＰｂに対応するニオイ物質が
検出されたと判定することができる。一方、試料の導入
により反応溶液３中のＯＢＰｂに結合しているＡＭＡの
蛍光強度が減少しない場合には、この反応溶液３中に含
まれるＯＢＰｂに対応するニオイ物質は非検出であると
判定することができる。

【００５２】上記のようなＯＢＰｂを用いた蛍光測定に
よるニオイ物質の検出方法においては、抗体を用いた従
来の方法と同等以上の高い測定感度を実現することが可
能である。このような検出方法は高価な抗体を用いる必
要がないため、低コストで実施することが可能である。

【００５３】また、蛍光性ニオイ物質が結合したＯＢＰ
ｂに別のニオイ物質が結合すると、蛍光性ニオイ物質が
解離し、蛍光性ニオイ物質からの蛍光強度が瞬時に減少
する。したがって、ニオイ物質を瞬時に検出することが
できる。

【００５４】さらに、ＯＢＰｂは、特定のニオイ物質に
対する結合力をピークとしてこのニオイ物質と類似のニ
オイ物質に対しても広く結合力を有している。このた
め、ＯＢＰｂを用いた上記の検出方法によれば、幅広く
ニオイ物質の検出を行うことが可能となる。

【００５５】特に、ＯＢＰｂを用いた検出方法によれ
ば、新たに検出の必要性が発生した物質に対しても、Ｏ
ＢＰｂのアミノ酸置換および大腸菌内での発現を行うこ
とにより容易に対応でき、当該物質の検出を行うことが
できる。このため、抗体を用いた従来の方法に比べて容
易に検出を行うことが可能となる。

【００５６】また、前述のように、ＯＢＰｂにおいては
アミノ酸の置換等によりニオイ物質に対する結合特性を
容易に変化させることが可能である。このことから、上
記の実施の形態のように、ＯＢＰｂのニオイ物質に対す
る結合特性を変化させるとともにこの結合特性をそれぞ
れ変化させた複数種類のＯＢＰｂを用いてニオイ物質の
検出を行うことにより、ニオイ物質の識別を行うことが
可能となる。また、ニオイ物質の特定を行うことも可能
となる。

【００５７】なお、上記の実施の形態においてはウシ由
来のニオイ結合タンパク質（ＯＢＰｂ）を用いる場合に
ついて説明したが、二量体構造を有しかつ蛍光性ニオイ
物質と別のニオイ物質との置換により蛍光性ニオイ物質
からの蛍光強度が変化する場合には、ウシ由来以外のニ
オイ結合タンパク質を用いることも可能である。

【００５８】また、上記においては、ＯＢＰｂを用いて
ニオイ物質を検出する場合について説明したが、ＯＢＰ
ｂを用いた上記の方法によれば、ニオイ物質以外の化学
物質、例えば環境ホルモン等を検出することも可能であ
る。

【００５９】なお、上記の検出方法により検出される化
学物質の例としては、ジメチルオクタノール（ＤＭ
Ｏ）、シトロネラール、シトロネロール、ゲラニオー
ル、ビスフェノールＡ（ＢＰＡ；bis-phenol Ａ）、ジ
ブチルフタレート、ジエチルヘキシルフタレート、オク
チルフェノール、ヘキシルフェノール、ノニルフェノー
ル等が上げられる。

【００６０】

【実施例】本実施例においては、予め蛍光性ニオイ物質
を結合させたウシ由来のニオイ結合タンパク質（ＯＢＰ
ｂ）に別のニオイ物質が結合した場合の蛍光性ニオイ物
質からの蛍光強度の変化を調べた。

【００６１】ここでは、予めＯＢＰｂに結合させる蛍光
性ニオイ物質としてアミノアントラセン（ＡＭＡ）を用
いた。また、ＡＭＡの結合したＯＢＰｂに添加するニオ
イ物質としてジメチルオクタノール（ＤＭＯ）およびゲ
ラニオールを用いた。

【００６２】まず、濃度１０μＭのＯＢＰｂ溶液を調製
した。また、ＡＭＡ、ＤＭＯおよびゲラニオールをエタ
ノールにそれぞれ溶解させ、濃度１０^-2ＭのＡＭＡ溶
液、ＤＭＯ溶液およびゲラニオール溶液を調製した。

【００６３】ＯＢＰｂ溶液１００μｌにＡＭＡ溶液０．
１μｌを添加し、２５°Ｃで１時間放置してＯＢＰｂへ
ＡＭＡを結合させた。この溶液にリン酸緩衝液（ＰＢ
Ｓ）を添加して４ｍｌとし（ＯＢＰｂの最終濃度：２５
０ｎＭ）、エタノール溶液、ＤＭＯ溶液またはゲラニオ
ール溶液４μｌを添加した後、０、５、１０、２５、２
０、２５、３０、４０および６０分経過時に３００μｌ
ずつ取り出してＡＭＡの蛍光強度（励起波長：２９５ｎ
ｍ、測定波長：４８１ｎｍ）を測定した。ここで用いた
ＰＢＳの組成を表１に示す。

【００６４】

【表１】

【００６５】図２はＡＭＡが結合したＯＢＰｂに各ニオ
イ物質を添加した場合のＡＭＡの蛍光強度変化の測定結
果を示す図である。図２（ｂ）は図２（ａ）のニオイ物
質添加直後（０分経過時）のＡＭＡの蛍光強度と添加し
たニオイ物質との関係を示す図である。

【００６６】エタノールを添加した場合には、ＡＭＡの
蛍光強度が徐々に低下し、時間の経過とともにＡＭＡが
ＯＢＰｂから解離していく様子が分かる。これに対し、
ニオイ物質であるＤＭＯおよびゲラニオールを添加した
場合には、どちらのニオイ物質（ＤＭＯおよびゲラニオ
ール）においても、添加直後（０分）にＡＭＡの蛍光強
度が低下し、ＡＭＡが解離することが分かる。

【００６７】このように、予めＡＭＡを結合させたＯＢ
Ｐｂに別のニオイ物質が結合した場合には、瞬時にＡＭ
Ａの蛍光強度が低下する。したがって、ＡＭＡの蛍光強
度の変化に基づいて所定のニオイ物質を迅速に検出する
ことができる。

【００６８】（結合機構モデル）後述する実験の結果か
ら、ＯＢＰｂへのニオイ物質の結合機構およびニオイ物
質の置換機構を図３のように推定した。

【００６９】ＯＢＰｂは、単量体（monomer ）のタンパ
ク質同士が非共有結合で結ばれた（dimer ）構造をとっ
ている。ＯＢＰｂを構成する各タンパク質の間に形成さ
れたセントラルポケットＣＰ界面（dimer-interface ）
には、ベンゼン環を有するトリプトファンが存在してい
る。

【００７０】１．ニオイ物質Ｍ１は、まずセントラルポ
ケットＣＰに結合する。すると、インターナルキャビテ
ィ（内部空洞）ＩＣが開き、ニオイ物質Ｍ１の結合準備
ができる（図３（ａ）（１）〜（４））。

【００７１】２．この状態で、インターナルキャビティ
ＩＣにニオイ物質Ｍ１が結合すると、ＯＢＰｂに対する
ニオイ物質Ｍ１の親和性が比較的高い場合（少なくとも
ＫＤ＜１．３μＭの場合）、すなわちインターナルキャ
ビティＩＣとニオイ物質Ｍ１との相互作用がセントラル
ポケットＣＰとニオイ物質Ｍ１との相互作用よりも比較
的強い場合、セントラルポケットＣＰに結合していたニ
オイ物質Ｍ１は解離する（図３（ａ）（５）〜
（７））。ここで、ＫＤは解離定数である。

【００７２】他方、ＯＢＰｂに対するニオイ物質Ｍ１の
親和性が比較的低い場合（少なくともＫＤ＞３μＭの場
合）、すなわちセントラルポケットＣＰとニオイ物質Ｍ
１との相互作用がインターナルキャビティＩＣとニオイ
物質Ｍ１との相互作用よりも強い場合、ニオイ物質Ｍ１
はインターナルキャビティＩＣから離れ、結果的にニオ
イ物質Ｍ１がセントラルポケットＣＰに溜まったままと
なる（図３（ａ）（１）〜（４））。

【００７３】３．ニオイ物質Ｍ１が結合した後の他のニ
オイ物質Ｍ２との置換は次の２通りがある。

【００７４】３−１ＯＢＰｂに対する他のニオイ物質
Ｍ２の親和性が比較的低い場合（少なくともＫＤ＞３μ
Ｍ）、他のニオイ物質Ｍ２がセントラルポケットＣＰに
結合すると、インターナルキャビティＩＣに結合してい
たニオイ物質Ｍ１が解離し、ニオイ物質Ｍ１，Ｍ２の置
換が成立する（図３（ｂ）（１）〜（４））。

【００７５】３−２ＯＢＰｂに対する他のニオイ物質
Ｍ２の親和性が比較的高い場合、他のニオイ物質Ｍ２は
２つのインターナルキャビティＩＣのうち予めニオイ物
質Ｍ１が結合していないインターナルキャビティＩＣに
結合し、予め結合していたニオイ物質Ｍ１がインターナ
ルキャビティＩＣから解離する（図３（ｃ）（１）〜
（４））。

【００７６】（結合機構モデルの実証）セントラルポケ
ットＣＰが結合部位（binding site）として機能してい
るかうかを確かめるため、セントラルポケットＣＰを構
成するＣ-末端側アミノ酸を除いたＯＢＰｂを作成し
た。

【００７７】図４（ａ）に示すＯＢＰｂ-normは通常(no
rmal)の（変異を導入していない）ＯＢＰｂである。図
４（ｂ）に示すＯＢＰｂ-delはPhe（フェニルアラニ
ン）149〜Glu（グルタミン酸）159までを除いた(delete
d)ＯＢＰｂである。

【００７８】まず、ＯＢＰｂ-norm およびＯＢＰ-delに
ついてＯＢＰｂ溶液にニオイ物質であるジメチルオクタ
ノール（ＤＭＯ）を添加した場合における添加後経過時
間と相対蛍光強度変化との関係を調べた。

【００７９】ＰＢＳ中のＯＢＰｂの濃度は２５０ｎＭと
し、ＤＭＯ溶液の濃度は１０μＭとした。ＯＢＰｂ溶液
にＤＭＯ溶液を添加後、２５度でインキュベート（定温
放置）し、各時刻で一部を取り出してセントラルポケッ
トＣＰに存在するトリプトファンの蛍光測定（励起波
長：２９５ｎｍ，蛍光波長：３４０ｎｍ）を行った。

【００８０】図５は相対蛍光強度変化の測定結果を示す
図である。図５において、横軸は添加後経過時間であ
り、縦軸は相対蛍光強度差である。相対蛍光強度差は、
時間０での蛍光強度と各時間での蛍光強度との差を時間
０での蛍光強度で割って算出した。

【００８１】図５に示すように、ＯＢＰｂ-normでは、
蛍光強度が２０分で一旦平坦になり、その後もう一段階
上昇している。このように、ＯＢＰｂ-normでは、蛍光
強度が経時的に上昇している。

【００８２】これに対して、ＯＢＰ-delでは、蛍光強度
の上昇も見られるが、最終的に蛍光強度が消失する。す
なわち、ＯＢＰ-delでは、ニオイ物質の有無で差がなく
なった。

【００８３】これらの結果から、ニオイ物質は、まず最
初にセントラルポケットＣＰに結合することが分かる。

【００８４】次に、ニオイ物質であるＤＭＯおよびゲラ
ニオール（geraniol）について、ニオイ物質の結合時の
セントラルポケットＣＰ内のトリプトファンの蛍光スペ
クトルのピークの経時変化を調べた。

【００８５】なお、ニオイ物質がセントラルポケットＣ
Ｐに結合すると、セントラルポケットＣＰが疎水性環境
となり、ニオイ物質がセントラルポケットＣＰから離れ
ると、セントラルポケットＣＰは親水性環境となる。

【００８６】トリプトファンがＯＢＰｂ内にあるときに
は、トリプトファンの蛍光スペクトルのピーク波長は３
４５ｎｍである。一般に、トリプトファンの蛍光波長は
親水性環境では長波長にシフトし、疎水性環境では短波
長にシフトする。ここでは、ニオイ物質の結合時の蛍光
スペクトルを測定し、０分でのスペクトルとの差を算出
し、そのピーク強度と経過時間との関係を調べた。

【００８７】図６はＯＢＰｂ-normにＤＭＯおよびゲラ
ニオールを結合させた場合における各時刻での蛍光スペ
クトルと０分での蛍光スペクトルとの差スペクトルを示
す図である。また、図７はＯＢＰ-delにＤＭＯおよびゲ
ラニオールを結合させた場合における各時刻での蛍光ス
ペクトルと０分での蛍光スペクトルとの差スペクトルを
示す図である。

【００８８】差スペクトルは、０分での蛍光スペクトル
から各時刻での蛍光スペクトルを差し引くことにより算
出した。したがって、ある時刻での蛍光スペクトルのピ
ークが３４５ｎｍより短波長にシフト（すなわち、疎水
性化）していると、差スペクトルのピークは逆に３４５
ｎｍより長波長にシフトすることになる。

【００８９】図６および図７において、ｄ０−１０、ｄ
０−２０、ｄ０−４０およびｄ０−６０は、ＤＭＯにつ
いての０分での蛍光スペクトルとそれぞれ１０分、２０
分、４０分および６０分での蛍光スペクトルとの差スペ
クトルを表す。また、ｇ０−１０、ｇ０−２０、ｇ０−
４０およびｇ０−６０は、ゲラニオールについての０分
での蛍光スペクトルとそれぞれ１０分、２０分、４０分
および６０分での蛍光スペクトルとの差スペクトルを表
す。

【００９０】図８はＯＢＰｂ-normおよびＯＢＰ-delに
ＤＭＯおよびゲラニオールを結合させた場合における蛍
光スペクトルの差スペクトルのピークの経時変化を示す
図である。図８において、縦軸は蛍光スペクトルの差ス
ペクトルのピーク波長であり、横軸はニオイ物質の添加
直後からの経過時間である。

【００９１】図８には、ＤＭＯおよびゲラニオール添加
後０分、２０分、４０分および６０分経過時のＯＢＰｂ
-normおよびＯＢＰ-delにおける差スペクトルのピーク
の変化を示す。

【００９２】ＯＢＰ-delでは、ニオイ物質であるＤＭＯ
およびゲラニオールの結合反応の間中、トリプトファン
の差スペクトルのピーク波長に変化がなかった。すなわ
ち、セントラルポケットＣＰの環境はニオイ物質の有無
でほとんど変化がなく、ニオイ分子とセントラルポケッ
トＣＰとの間の疎水性相互作用が低いことが分かる。

【００９３】ＯＢＰ-normでは、トリプトファンの差ス
ペクトルのピーク波長が上昇したことにより、セントラ
ルポケットＣＰ内の環境が疎水性となることが分かる。
また、この疎水性への変化は、ゲラニオールでは、結合
反応の間中維持されるのに対して、ＤＭＯでは、疎水性
が徐々に低下し、４０分後には親水性に転じ、６０分後
には再度疎水性になっていることが分かる。

【００９４】つまり、ゲラニオールはセントラルポケッ
トＣＰに結合したままであり、ＤＭＯはセントラルポケ
ットＣＰに結合後、解離する。ＯＢＰｂの二量体にはニ
オイ分子が１つ結合することから、ＤＭＯがセントラル
ポケットＣＰから解離する際には、インターナルキャビ
ティＩＣに別のＤＭＯが結合すると考えられる。

【００９５】この反応は、インターナルキャビティＩＣ
にニオイ分子が結合することにより生ずる構造変化によ
って、セントラルポケットＣＰのＤＭＯがもはや結合で
きなくなり解離するというスキームで進行すると思われ
る。

【００９６】さらに、一旦ＯＢＰｂに結合したニオイ物
質は、別のニオイ物質が後から結合する場合、いかなる
挙動をするのかを調べた。予め結合させておくニオイ物
質として、蛍光性ニオイ物質であるアミノアントラセン
（ＡＭＡ）を用い、ＡＭＡ結合に添加するニオイ物質と
して、ＤＭＯおよびゲラニオールを使用した。

【００９７】濃度１０μＭのＯＢＰｂ溶液を調製した。
また、ＡＭＡ、ＤＭＯおよびゲラニオールをエタノール
にそれぞれ溶解させ、濃度１０^-2ＭのＡＭＡ溶液、ＤＭ
Ｏ溶液およびゲラニオール溶液を調製した。

【００９８】ニオイ物質がＯＢＰｂに結合した後の別の
ニオイ物質との置換を調べるための実験の準備段階とし
て、まず、トリプトファンおよびチロシンの蛍光スペク
トルとＡＭＡの吸収スペクトルとの積を測定した。

【００９９】図９はトリプトファンおよびチロシンの蛍
光スペクトルとＡＭＡの蛍光スペクトルとの積の測定結
果を示す図である。図９において、縦軸はトリプトファ
ンまたはチロシンの蛍光強度とＡＭＡの吸収率との積を
示し、横軸は波長を示す。

【０１００】図９の測定結果から、ＡＭＡにはトリプト
ファンまたはチロシンからの蛍光を吸収してしまう性質
があることが分かる。このことは、ＡＭＡがトリプトフ
ァンまたはチロシンの近くに存在すると、トリプトファ
ンまたはチロシンからの蛍光強度が低下することを意味
する。

【０１０１】次に、ＡＭＡ添加時のＡＭＡからの蛍光お
よびトリプトファンからの蛍光の経時変化を測定した。
図１０はＡＭＡ結合時のトリプトファンの蛍光強度変化
の測定結果を示す図である。トリプトファンの励起波長
は２９５ｎｍであり、蛍光波長は３４０ｎｍである。ま
た、図１１はＡＭＡ結合時のＡＭＡの蛍光強度変化の測
定結果を示す図である。ＡＭＡの励起波長は２９５ｎｍ
であり、蛍光波長は４８０ｎｍである。図１０におい
て、横軸は添加後経過時間であり、縦軸は相対蛍光強度
差である。その相対蛍光強度差は、ＡＭＡ添加とエタノ
ールのみの添加の場合における各時間での蛍光強度を時
間０での蛍光強度で割り、両者の差として得られる。

【０１０２】図１０の測定結果において、トリプトファ
ンの蛍光強度は、ＡＭＡの添加後に一旦減少し、その後
上昇している。また、図１１の測定結果において、ＡＭ
Ａの蛍光強度はＡＭＡの添加後に増加し、一定値をとっ
た後、減少している。

【０１０３】これらの結果から次のことが考察される。
トリプトファンの蛍光強度の増加のタイミングとＡＭＡ
の蛍光強度の減少のタイミングとが一致している。ま
た、上記のように、トリプトファンからの蛍光はＡＭＡ
により吸収される。これらのことから、次のことが考え
られる。

【０１０４】ＡＭＡは一旦セントラルポケットＣＰに入
る。セントラルポケットＣＰ内のトリプトファンからの
蛍光はＡＭＡにより吸収されて減少する。同時に、トリ
プトファンからの蛍光を吸収したＡＭＡからの蛍光は０
〜１５分の間増加する。その後、ＡＭＡは、セントラル
ポケットＣＰから放出される。それにより、トリプトフ
ァンからの蛍光が増加し、ＡＭＡからの蛍光が減少す
る。

【０１０５】上記のように、ＯＢＰｂでは、二量体に１
つのニオイ物質が結合することが分かっているので、ニ
オイ物質がセントラルポケットＣＰから放出されるとき
には、一方のインターナルキャビティＩＣにニオイ物質
が結合しているものと考えられる。図８のセントラルポ
ケットＣＰの疎水性の変化で示されたゲラニオールの結
合は、インターナルキャビティＩＣへの結合がない場合
である。

【０１０６】ニオイ物質がインターナルキャビティＩＣ
まで進むか、セントラルポケットＣＰに留まるかは、Ｏ
ＢＰｂに対するニオイ物質の親和性で決まると考えられ
る。ゲラニオールの解離定数ＫＤは３μＭ程度、ＤＭＯ
の解離定数ＫＤは０．３μＭ程度、ＡＭＡの解離定数は
１．３μＭ程度であることから、少なくともインターナ
ルキャビティＩＣに対する結合とセントラルポケットＣ
Ｐに対する結合との境界は、１．３μＭ＜ＫＤ＜３μＭ
にあると考えられる。

【０１０７】次に、ニオイ物質がＯＢＰｂに結合した後
の別のニオイ物質との置換を調べた。

【０１０８】まず、ＯＢＰｂ溶液１００μｌにＡＭＡ溶
液０．１μｌを添加し、２５°Ｃで１時間放置してＯＢ
ＰｂへＡＭＡを結合させた。この溶液にリン酸緩衝液
（ＰＢＳ）を添加して４ｍｌとし（４０倍希釈）、エタ
ノール、ＤＭＯまたはゲラニオール４μｌを添加した
後、０、５、１０、２５、２０、２５、３０、４０およ
び６０分経過時に３００μｌずつ取り出してＡＭＡの蛍
光強度（励起波長：２９５ｎｍ、測定波長：４８１ｎ
ｍ）およびトリプトファンの蛍光強度を測定した。

【０１０９】図１２は各ニオイ物質を添加した場合のＡ
ＭＡの蛍光強度変化の測定結果を示す図である。

【０１１０】エタノールを添加した場合には、ＡＭＡの
蛍光強度が徐々に低下し、時間の経過とともにＡＭＡが
ＯＢＰｂから解離していく様子が分かる。これに対し、
ニオイ物質であるＤＭＯおよびゲラニオールを添加した
場合には、どちらのニオイ物質（ＤＭＯおよびゲラニオ
ール）においても、添加直後（０分）にＡＭＡの蛍光強
度が低下し、ＡＭＡが解離することが分かる。

【０１１１】図１３は各ニオイ物質を添加した場合のチ
ロシンの蛍光強度変化の測定結果を示す図である。

【０１１２】チロシンの蛍光強度測定では、励起波長は
２５０ｎｍであり、測定波長は３００ｎｍである。チロ
シンは、ＯＢＰｂの単量体のインターナルキャビティＩ
Ｃにある。そのため、チロシンの蛍光強度の変化（親水
性になると蛍光強度が低下する）により、インターナル
キャビティＩＣからのニオイ物質の解離を測定すること
ができる。

【０１１３】エタノールを添加した場合およびＤＭＯを
添加した場合には、添加直後（０分）には蛍光強度の変
化が見られなかった。これに対し、ゲラニオールを添加
した場合には、添加直後（０分）に蛍光強度の低下が見
られた。

【０１１４】これらの結果、ゲラニオールに代表される
低親和性ニオイ物質（少なくともＫＤ＞３μＭ）はセン
トラルポケットＣＰに入ることにより、前もって結合し
ているニオイ物質を解離させ、ＤＭＯに代表される高親
和性ニオイ物質はインターナルキャビティＩＣに結合す
ることにより、他方のインターナルキャビティＩＣに前
もって結合しているニオイ物質を解離させることが分か
る。

【０１１５】図１２および図１３の結果は、ＡＭＡがイ
ンターナルキャビティＩＣに結合していることにより得
られるものである。この結果から逆に、ＡＭＡまたはＤ
ＭＯのようなセントラルポケットＣＰから解離するニオ
イ物質が最終的にはインターナルキャビティＩＣに結合
しているという結論を導くことができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の一実施の形態におけるニオイ物質検出
方法の例を示す模式的な構成図である。

【図２】ＡＭＡが結合したＯＢＰｂに各ニオイ物質を添
加した場合のＡＭＡの蛍光強度変化の測定結果を示す図
である。

【図３】ＯＢＰｂへのニオイ物質の結合機構およびニオ
イ物質の置換機構を示す図である。

【図４】通常のＯＢＰｂおよびＣ−末端側アミノ酸を除
いたＯＢＰｂを示す図である。

【図５】相対蛍光強度変化の測定結果を示す図である。

【図６】ＯＢＰｂ-normにＤＭＯおよびゲラニオールを
結合させた場合における各時刻での蛍光スペクトルと０
分での蛍光スペクトルとの差スペクトルを示す図であ
る。

【図７】ＯＢＰ-delにＤＭＯおよびゲラニオールを結合
させた場合における各時刻での蛍光スペクトルと０分で
の蛍光スペクトルとの差スペクトルを示す図である。

【図８】ＯＢＰｂ-normおよびＯＢＰ-delにＤＭＯおよ
びゲラニオールを結合させた場合における蛍光スペクト
ルの差スペクトルのピークの経時変化を示す図である。

【図９】トリプトファンおよびチロシンの蛍光スペクト
ルとＡＭＡの蛍光スペクトルとの積の測定結果を示す図
である。

【図１０】ＡＭＡ結合時のトリプトファンの蛍光強度変
化の測定結果を示す図である。

【図１１】ＡＭＡ結合時のＡＭＡの蛍光強度変化の測定
結果を示す図である。

【図１２】各ニオイ物質を添加した場合のＡＭＡの蛍光
強度変化の測定結果を示す図である。

【図１３】各ニオイ物質を添加した場合のチロシンの蛍
光強度変化の測定結果を示す図である。

【符号の説明】１マイクロプレート２孔部３反応溶液４外気導入部５光源６第１の波長選択部７第２の波長選択部８蛍光検出部９データ処理部１００化学物質センサＣＰセントラルポケットＩＣインターナルキャビティＭ１，Ｍ２ニオイ物質

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】予めニオイ結合タンパク質に結合した蛍
光性物質からの蛍光強度の変化に基づいて所定の化学物
質を検出することを特徴とする化学物質センサ。
【請求項２】前記ニオイ結合タンパク質が二量体構造
を有することを特徴とする請求項１記載の化学物質セン
サ。
【請求項３】予め蛍光性物質が結合しかつ二量体構造
を有するニオイ結合タンパク質と、前記ニオイ結合タン
パク質に励起光を照射する光源と、前記ニオイ結合タン
パク質に結合した前記蛍光性物質から得られる蛍光を検
出する蛍光検出部と、前記蛍光検出部により検出された
蛍光の強度変化に基づいて所定の化学物質の有無を判定
する判定手段とを備えたことを特徴とする化学物質セン
サ。
【請求項４】前記光源から照射された励起光のうち特
定波長の光を選択的に透過させる第１の波長選択部と、
前記ニオイ結合タンパク質に結合した前記蛍光性物質か
ら得られる蛍光のうち特定波長の光を選択的に透過させ
る第２の波長選択部とをさらに備えたことを特徴とする
請求項３記載の化学物質センサ。
【請求項５】前記ニオイ結合タンパク質がウシ由来の
ニオイ結合タンパク質であることを特徴とする請求項３
または４記載の化学物質センサ。
【請求項６】前記蛍光性物質はアミノアントラセンで
あることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の
化学物質センサ。
【請求項７】予めニオイ結合タンパク質に結合した蛍
光性物質からの蛍光強度の変化に基づいて所定の化学物
質を検出することを特徴とする化学物質センサ。
【請求項８】前記ニオイ結合タンパク質が二量体構造
を有することを特徴とする請求項７記載の化学物質の検
出方法。
【請求項９】二量体構造を有するニオイ結合タンパク
質に予め蛍光性物質を結合させる工程と、前記ニオイ結
合タンパク質に励起光を照射する工程と、前記ニオイ結
合タンパク質に結合した前記蛍光性物質から得られる蛍
光を検出する工程と、前記蛍光検出部により検出された
蛍光の強度変化に基づいて所定の化学物質の有無を判定
する工程とを備えたことを特徴とする化学物質の検出方
法。
【請求項１０】前記ニオイ結合タンパク質がウシ由来
のニオイ結合タンパク質であることを特徴とする請求項
７〜９のいずれかに記載の化学物質の検出方法。
【請求項１１】前記蛍光性物質はアミノアントラセン
であることを特徴とする請求項７〜１０のいずれかに記
載の化学物質の検出方法。