JP2003052385A - Ｄｎａアレイ向けプローブ配列決定システム - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】ＤＮＡアレイ用プローブ配列として、測定感
度、再現性を保証するためには、クロスハイブリダイゼ
ーションがなく、均等化したＴｍを有し、二次構造をと
ることが少ないプローブ配列を実現する必要がある。 【解決手段】ゲノムもしくはｃＤＮＡ配列の部分配列か
らなるＤＮＡプローブアレイ向けプローブ候補リストを
作成する工程（リストアップ工程）と、前記プローブ候
補リストのうち、融解温度が予め定められた範囲を逸脱
する、もしくは二次構造の安定性が高い、もしくはクロ
スハイブリダイゼーションの可能性がある候補を除外す
る工程（フィルタリング工程）の、少なくとも２つの工
程を経ることでＤＮＡアレイ向けプローブ配列を決定す
る。 【効果】ＤＮＡプローブアレイ上に固定化するプローブ
ＤＮＡの配列設計方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、生理サンプルにお
ける遺伝子発現分布を測定するためのＤＮＡプローブア
レイもしくはＤＮＡチップと呼ばれている装置のＤＮＡ
プローブの配列設計方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】生体内でＤＮＡ分子上の遺伝子に記述さ
れた遺伝情報は、ＲＮＡに転写され、リボゾーム内でた
んぱく質に翻訳される。このＲＮＡへの転写、たんぱく
質への翻訳までの過程を遺伝子発現と呼ぶ。細胞分裂、
ホメオスタシス、外部刺激に対する反応、老化、アポト
ーシスなどの種々の活動ごとに、異なる遺伝子発現分布
を示すことが知られている。前述の遺伝子発現分布は、
例えば疾患の有無、悪性度によっても異なると言われて
いる。遺伝病などの一部の疾患を除けば、生活習慣病や
アレルギー、ストレスといった多因子性疾患には、複数
の遺伝子の異常が関与している。そこで複数の遺伝子の
異常を同時に見ることが疾患の診断には必要である。遺
伝子の異常は、例えば遺伝子発現量の増加ないしは減少
といった、遺伝子発現量の変化に現れることが多いと考
えられる。つまり複数の遺伝子発現量分布を同時に見る
技術が、疾患の診断等に有用かつ不可欠であるといえ
る。数百から数万の遺伝子の発現量変化を同時に見るこ
とができるＤＮＡアレイ法（Ｄｕｇｇａｎ， Ｄ．Ｊ．
ら、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｕｓ
ｉｎｇ ｃＤＮＡ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ， Ｎａｔ
ｕｒｅ ｇｅｎｅｔｉｃｓｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ， ｖ
ｏｌ．２１， ｐ１０−１４， １９９９）と呼ばれる
技術は複数の遺伝子発現分布を見ることができるので、
例えば多因子性疾患の診断に優れている。また簡便な測
定が可能、高スループット、低コストを同時に達成でき
る実用性も高い。一般に、ＤＮＡアレイはガラススライ
ドの上に、メッセンジャーＲＮＡと相補的な配列を有す
る相補ＤＮＡ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ＤＮＡも
しくはｃＤＮＡ）をプローブとして固定化したものであ
る（Ｌｏｃｋｈａｒｔ， Ｄ．Ｊ．ら、Ｅｘｐｒｅｓｓ
ｉｏｎ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｂｙ ｈｙｂｒｉｄｉ
ｚａｔｉｏｎ ｔｏ ｈｉｇｈ−ｄｅｎｓｉｔｙ ｏｌ
ｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅａｒｒａｙｓ， Ｎａｔｕ
ｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ｖｏｌ．１４，
ｐ．１６７５−１６８０， １９９６）。実験者は、
細胞や臓器等からメッセンジャーＲＮＡを取り出した
後、逆転写酵素と蛍光標識物質を用いて、メッセンジャ
ーＲＮＡから蛍光標識されたｃＤＮＡを合成する。その
後、蛍光標識付ｃＤＮＡを、ＤＮＡアレイ上にふりかけ
る。続いて、ＤＮＡアレイを一定時間一定温度に保持し
て、蛍光標識付ｃＤＮＡとＤＮＡアレイとを塩基配列相
補結合（ハイブリダイズ）させる。その後、ＤＮＡアレ
イを洗浄し、非特異的に結合している蛍光標識付ｃＤＮ
Ａを洗い流す（非特異的に結合しているｃＤＮＡは、特
異的に結合しているｃＤＮＡと比較して相補結合力が弱
い。）最後に、ＤＮＡアレイ上に固定化された個々のプ
ローブに対応する蛍光信号強度を測定する。メッセンジ
ャーＲＮＡ量は対応するプローブとハイブリダイズした
蛍光信号強度に比例する。こうして臓器や細胞内の種々
の遺伝子に対応するメッセンジャーＲＮＡ量を測定する
ことができる。例えば、薬剤投与後の経過時間ごとに細
胞あるいは臓器からメッセンジャーＲＮＡを取り出し
て、ＤＮＡアレイ法で測定することで、遺伝子ごとのメ
ッセンジャーＲＮＡ量の時間変化を見ることができる。
メッセンジャーＲＮＡ量が増加することは、ＤＮＡ分子
からの遺伝情報が活発に転写されることを意味し、遺伝
子の働きが増加することに対応する。この遺伝子の働き
の時間変化を解析することで、疾患に関連した遺伝子異
常の情報が得られる。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】ＤＮＡアレイは、複数
の遺伝子発現分布を同時に簡便に測定する方法として優
れているが、測定再現性や測定下限が他の医療機器、例
えば生化学分析装置、免疫分析装置と比較して満足でき
るレベルに達していない。例えば生化学分析装置や免疫
分析装置の測定再現性は１±０．０５倍（ＣＶ値で５
％）のレベルであるのに対し、ＤＮＡアレイの測定再現
性は約２倍（もしくは１/２倍、ＣＶ値で１００％）で
ある。測定再現性が低い理由の一つに、クロスハイブリ
ダイゼーションが考えられる。クロスハイブリダイゼー
ション（クロスハイブリと短縮する場合もある）とは、
本来１対１に対応すべきサンプルのメッセンジャーＲＮ
ＡやｃＤＮＡと、基板に固定化されたＤＮＡプローブと
が、多対１対応（もしくは１対多対応）になる現象であ
る。異なる遺伝子由来のメッセンジャーＲＮＡでも、互
いに類似した配列があるので（例えば同一スーパーファ
ミリーに属する遺伝子同士は類似配列部位を多く有す
る）、この類似配列を包含するプローブは、例えば同一
スーパーファミリーに属する多くの遺伝子由来のメッセ
ンジャーＲＮＡとハイブリダイズしてしまう。このた
め、仮に測定対象となる遺伝子の発現強度が同一であっ
ても、類似配列を有する遺伝子の発現強度が異なれば、
測定対象の遺伝子の発現強度は変化したと誤って観測さ
れ、ひいては測定再現性の低下を引き起こす。また、ｐ
ＵＣ１８，１９やＭ１３ｍｐ１８などのクローニングベ
クターにインサートされたｃＤＮＡから、ポリメラーゼ
連鎖反応（ＰＣＲ：Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ
Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法により、プローブＤＮＡを増幅
する際、しばしばクローニングベクターの配列の一部を
プライマー（以後、共通プライマーと呼ぶ）として用い
る場合がある。クローニングベクターにインサートされ
たｃＤＮＡ（平均して約千〜二千塩基）を共通プライマ
ーにより増幅すると、類似配列を含んだインサートｃＤ
ＮＡの全長が得られる。そのインサートｃＤＮＡを基板
上に固定化すると、例えば、類似配列部位を多く有する
同一スーパーファミリーに属する複数の遺伝子がハイブ
リダイズすることでクロスハイブリダイゼーションが生
じることがある。そのためプローブＤＮＡはクロスハイ
ブリダイゼーションがないように配列設計する必要があ
る。そして、ＤＮＡアレイ上に固定化された各ＤＮＡ断
片と試料由来ＤＮＡ断片間での、ハイブリダーゼーショ
ンを高精度（ないしは高ストリンジェント、ｈｉｇｈｌ
ｙ ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ）に行うためには、ハイブリダ
イゼーション温度（Ｔｈ， ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏ
ｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）と固定化ＤＮＡ断片の融
解温度（Ｔｍ， ｍｅｌｔｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕ
ｒｅ）の関係が重要である。なぜなら、ＤＮＡ同士の配
列相同性とＴｍには次の関係が知られているからであ
る。それは、２つのＤＮＡ間での１％の塩基配列違い
（ミスマッチ）により、両ＤＮＡのＴｍは約１．４℃低
下するという関係である。すなわち、固定化ＤＮＡ断片
のＴｍイコールＴｈの時、固定化ＤＮＡ断片の塩基配列
と１００％マッチ（配列マッチ度が１００％９する試料
由来ＤＮＡ断片がハイブリダイゼーションする。なお配
列マッチ度とは、比較している２つのＤＮＡ塩基配列が
何パーセント両者で等しいかを表す値で、二者の全塩基
が全て等しい場合の配列マッチ度を１００％と定義す
る。ＴｈとＴｍが１０℃異なるとき、 １００％−（１０℃/１.４℃）＝９２．９％ より、固定化ＤＮＡ断片の塩基配列と約９３%〜１００
％の配列マッチ度を有する試料由来ＤＮＡ断片がハイブ
リダイゼーションする。同様にＴｈとＴｍが２０℃異な
るときは配列マッチ度で８５．７％〜１００％、Ｔｈと
Ｔｍが３０℃異なるときは、配列マッチ度で７８．６％
〜１００％のＤＮＡ同士がハイブリダイゼーションする
と予想される。高精度で分離を行う際は、配列マッチ度
で例えば、少なくとも８０％〜１００％のみがハイブリ
ダイズすることが望ましい。ＴｈとＴｍの差異が３０℃
以下になるとは、プローブのＴｍがある目標値（しばし
ばプローブ全体の平均値）プラスマイナス１５℃以下と
なると言い換えてもよい。このように固定化ＤＮＡ断片
の融解温度とハイブリダイゼーション温度との差異を考
慮することがハイブリダイゼ−ションを高精度で行うた
めに必要である。以後、ＤＮＡプローブアレイ上に固定
化するＤＮＡ断片をプローブＤＮＡと呼ぶ。そして、細
胞や臓器等からメッセンジャーＲＮＡを取り出した後、
逆転写酵素を用いてメッセンジャーＲＮＡから合成した
ｃＤＮＡ、もしくは細胞から取り出したメッセンジャー
ＲＮＡをターゲットもしくは、ターゲットＤＮＡやター
ゲットＲＮＡとよぶ。ターゲットは例えば蛍光標識等で
標識することが多いが、ターゲットは必ずしも標識して
ある必要はない。以後、本願明細書ではターゲットとし
てＤＮＡを用いることを仮定して記述するが、ターゲッ
トがＲＮＡの場合でも本願明細書で開示する方法でプロ
ーブＤＮＡ配列を設計することができる。プローブＤＮ
Ａは、１本鎖ＤＮＡの状態でターゲットとハイブリダイ
ゼーションを行う。一方、１本鎖ＤＮＡは溶液において
自らの水素結合による高次構造を形成している。この高
次構造のことを二次構造とよぶ。プローブ−ターゲット
間のハイブリダイゼーションは、二次構造の形成と競合
する過程である。すなわち、ターゲット濃度が同一の場
合は、二次構造の安定性が小さいほど、プローブ−ター
ゲット間のハイブリダイゼーション頻度が高くなるた
め、ハイブリダイゼーションの信号強度は大きくなる。
このためプローブＤＮＡの二次構造安定性が小さいこと
が望ましい。以上の記述より、ＤＮＡプローブアレイに
用いるプローブＤＮＡは相互に特異性が高く、Ｔｍがそ
ろっていて、二次構造をとることが少ない必要がある。
本願明細書の以下の記述では、ＤＮＡアレイ上に固定化
したプローブが相互に特異性が高く、均等化したＴｍを
有し、二次構造をとることが少ないプローブ配列を実現
するための手段を記す。

【０００４】

【課題を解決するための手段】ＤＮＡアレイ用プローブ
配列を設計するには、まずＧＥＮＢＡＮＫなどの塩基配
列データベース、ないしはＥＳＴ（Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｔａｇ）配列データベース等の公
共もしくは商用データベースから、ゲノムＤＮＡ或いは
メッセンジャーＲＮＡ配列を取得する。プローブはＤＮ
Ａで構成することが多いので、メッセンジャーＲＮＡ配
列の代わりに、メッセンジャーＲＮＡ配列と相補的な配
列であるｃＤＮＡ配列を取得してもよい。これら取得し
たゲノムもしくはｃＤＮＡ配列を、図１に示すようにプ
ローブ設計における出発点とする。このゲノム・ｃＤＮ
Ａ配列上の部分配列が求めたいプローブ配列１５に相当
する。発明が解決しようとする課題にて記載したよう
に、プローブ配列１５はゲノム・ｃＤＮＡ配列１１の部
分配列でありかつ、他遺伝子配列と相同性が低く、Ｔｍ
が設定範囲内であり、二次構造をとることが少ないこと
を特徴とする。これらの条件を満足するように、ゲノム
・ｃＤＮＡ配列１１からプローブ配列１５を決定するこ
とを、以後、プローブ設計と呼ぶ。端的には、ゲノム・
ｃＤＮＡ配列１１の部分配列は全てプローブとなりう
る。以後、プローブとなりうるゲノム・ｃＤＮＡ配列１
１の部分配列をプローブ候補と呼ぶ。しかしプローブ候
補が全てプローブとして適しているわけではない。なぜ
なら他遺伝子配列と相同性が高かったり、Ｔｍが設定範
囲外であったり、二次構造をとりやすい場合があるから
である。そこで、プローブ設計工程フローは、まず、プ
ローブ候補を列挙するプローブ候補リスト作成工程（リ
ストアップ工程）１２により作成したプローブ候補リス
ト１３から、プローブに適さない不適合候補を除外する
工程（フィルタリング工程）１４を経るという、２つの
工程を経ることが望ましい。リストアップ工程１２とフ
ィルタリング工程１４とを同一工程にした場合、ゲノ
ム、ｃＤＮＡ配列１１の全ての部分配列に対し、融解温
度、二次構造、クロスハイブリ可能性をチェックしなく
てはならない。リストアップ工程１２によりプローブ候
補リスト１３を作成すれば、融解温度、二次構造、クロ
スハイブリ可能性のチェックを、リスト１３に対しての
み行えばよいので、計算時間の短縮が行える。フィルタ
リング工程１４に合格したものが、ＤＮＡアレイに使用
可能なプローブ配列１５である。図１が最も単純なプロ
ーブ設計フローであるが、フィルタリング工程１４に時
間がかかりすぎる場合は、図２に示すように、リストア
ップ工程１２を経て作成したプローブ候補１次リスト２
１、更にフィルタリング工程１４を経て作成したプロー
ブ候補２次リスト２２に対し、再検査を行う工程（再検
査工程２３）を行うことで、プローブ配列１５を作成し
てもよい。図２の順でプローブ設計を行うことの利点
は、一般に時間のかかるフィルタリング工程１４からプ
ローブ配列１５の決定までの工程を、フィルタリング工
程１４と再検査工程２３の二者に分割し、例えばフィル
タリング工程１４を計算機Ａ、再検査工程２３を計算機
Ｂに処理を分けることで、プローブ設計時間を短縮する
ことが可能な点である。なお図２のプローブ候補１次リ
スト２１は、図１のプローブ候補リスト１３と同一リス
トであるが、図２ではリストが２段階あることを強調す
るために名称を変更した。図３に示すようにリストアッ
プ工程１２は更に、類似配列部位除外工程３１と、プロ
ーブ長切り取り工程３２から成る。類似配列部位除外工
程３１とは、予めプローブ候補リスト１３を作成する前
に、他遺伝子と類似配列を有する部位、例えばモチーフ
部位や、反復配列部位など含むプローブ候補をプローブ
候補リスト１３から除外するための工程である。他遺伝
子と類似配列を有する部位を隠して（マスク）して、プ
ローブとして用いないためにマスキング工程３１とも呼
ばれる。このマスキング工程３１はプローブ設計におい
て必ずしも必要でないが、他遺伝子と類似配列を有する
配列をプローブ候補リスト１３から除外することで、フ
ィルタリング工程１４をより高速に行うことができるの
で、可能であれば、マスキング工程３１を行うべきであ
る。なおモチーフとは構造やパターンの要素のことであ
るが、ここでは各種のタンパク質のアミノ酸配列中に認
められる一定の構造を指す。モチーフは互いに機能が異
なる幅広いタンパク質に共通して見られる構造である。
なおタンパク質にはドメインと呼ばれる構造があるが、
タンパク質のドメインはモチーフの種々の組み合わせで
できている。本願明細書のモチーフとは、タンパク質の
ドメインよりは小さい構造単位である。モチーフには、
例えばヘリックス−ターン−ヘリックスやジンクフィン
ガーと呼ばれるＤＮＡ結合構造モチーフなどがある。マ
スキング工程３１に続く３２とは、長さＬ１塩基対のゲ
ノム・ｃＤＮＡ配列から、長さＬ２塩基対の部分配列で
あるプローブ候補を得る（切り取る）工程である。例え
ばＬ１＝１０００塩基対、Ｌ２＝１００塩基対とした場
合、切り取られるプローブ候補数は、Ｌ１−Ｌ２＋１＝
１０００−１００＋１＝９０１個ある。なお、ここでは
単純のためにマスキング工程３１は行わないとした。こ
れら９０１個の部分配列すなわちプローブ候補をリスト
化するのがプローブ長切り取り工程３２である。図４に
示すようにフィルタリング工程１４も、複数の工程に分
けられる。フィルタリング工程１４の複数の工程はそれ
ぞれ、プローブ配列１５が備えるべき条件に対応してい
る。プローブ配列１５が備えるべき条件とは、例えば
（１）プローブの融解温度（Ｔｍ）がある一定の範囲内
であること、（２）１本鎖ＤＮＡであるプローブが安定
な二次構造を持たないこと、（３）非特異的配列を生じ
やすい反復配列を持たないこと、（４）他遺伝子と相同
性の高い類似配列をもたないこと、（５）他遺伝子とク
ロスハイブリダイゼーションを生じないこと等である。
そこでフィルタリング工程１４は例えば、前述（１）か
ら（５）のそれぞれに対応した、融解温度フィルタ４
１、二次構造フィルタ４２、反復配列フィルタ４３、類
似配列フィルタ４４、クロスハイブリフィルタ４５の５
工程から成る。融解温度フィルタ４１とは、プローブ候
補リスト１３のそれぞれのプローブ候補に対し、配列よ
り見積もった融解温度が予め定められたある一定の範囲
内にあるかを判定し、一定の範囲内であれば次へ、一定
の範囲外であればそれをプローブ候補リスト１３より棄
却するフィルタである。また二次構造フィルタ４２と
は、溶液内でとる二次構造の安定性（自由エネルギーΔ
Ｇ（二次構造））を見積もり、本来望まれるプローブと
ターゲット間のハイブリダイゼーションの安定性（自由
エネルギーΔＧ（プローブ―ターゲット間ハイブリ））
とを比較した結果、二次構造の安定性が十分に低ければ
次へ、二次構造の安定性があるしきい値を超えて安定な
場合にそれをプローブ候補リスト１３より棄却するフィ
ルタである。二次構造の安定性が十分低いとは、例え
ば、以下の式１を満足することである。 ΔＧ（二次構造）＜α×ΔＧ（プローブ―ターゲット間ハイブリ） （式１） 但しαは、例えば０．０１〜０．５ 二次構造予測には例えばＮｕｓｓｉｎｏｖのアルゴリズ
ムやＺｕｋｅｒのアルゴリズム（Ｒ．Ｄｕｒｂｉｎ他
編、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａ
ｌｙｓｉｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
Ｐｒｅｓｓ，第１０章、１９９８）を用いればよい。
二次構造予測の基本原理は、構造エネルギー最小化であ
る。これは式２に示すボルツマン関数の一種であるモレ
キュラーパーティション関数（Molecular Partition Fu
nction）qの大小により評価できる。q＝Σgi＊exp(−ε
i/kT) （式２）但し、 εi＝i番目のエネルギーレベル gi＝εiのエネルギー k＝ボルツマン定数 Ｔ＝絶対温度 しかし式２を直接用いて二次構造エネルギー最小化を行
うには多大の計算時間を要する。そこで、式３〜５に示
すＺｕｋｅｒの方式に従って計算時間を短縮する。全て
の二次構造ＳはＤＮＡ、ＲＮＡをユニークにループ化さ
せた構造をとっている。このことを定式化すると式３に
なる。 Ｒ＝ ∪ Ｌ(i・j) （式３） i,j∈Ｓ 但し、 Ｒ＝ベースペアセット i, j＝二つのベースペア Ｓ＝二次構造 ＤＮＡ，ＲＮＡは相補結合により二本鎖を形成して安定
する（自由エネルギーは減少する）が、二次構造により
形成される一本鎖部分は反対に不安定化する。この不安
定化は、自由エネルギー増大と言い換えることができ
る。この自由エネルギー増加量δδＧは、一本鎖部分の
塩基長ｌｓが３０ベースペア以下の場合は式４により、
長ｌｓが３０ベースペア以上の場合は式５により定式化
できる。 δδＧ＝１．７５＊ＲＴ＊ｌｎ（ｌｓ） （式４） 但し、 δδＧ＝ループ構造による自由エネルギー増加量 Ｒ＝ガス定数 Ｔ＝絶対温度 ｌｓ＝１本鎖部分の塩基数長 δδＧ＝δδＧ３０＋１．７５＊ＲＴ＊ｌｎ（ｌｓ/３０） （式５） 二次構造の自由エネルギーΔＧ（二次構造）は、二本鎖
部分の安定化エネルギーΔＧ（二本鎖部分）と、一本鎖
部分の不安定化エネルギーδδＧの和として計算でき
る。 ΔＧ（二次構造）＝ΔＧ（二本鎖部分）＋δδＧ （式６） なお二次構造フィルタ４２は基板上に固定化されるプロ
ーブＤＮＡが一本鎖（Ｓｉｎｇｌｅ Ｓｔｒａｎｄ Ｄ
ＮＡ）である場合には行うことが望ましいが、固定化さ
れるプローブＤＮＡが二本鎖（Ｄｏｕｂｌｅ Ｓｔｒａ
ｎｄ ＤＮＡ）である場合には、二次構造フィルタ４２
を省略することもできる。なぜならプローブＤＮＡは溶
液中で二本鎖を形成したり、その一部がほどけて一本鎖
となったりする平衡状態にあると考えられるため、二次
構造の安定性を単純に見積もることが難しいためであ
る。また二次構造フィルタ４２として、ミニヘアピン配
列を検索して、ミニヘアピン配列を有するプローブ候補
をリスト１３から棄却することも望ましい。ミニヘアピ
ンとは例えば、 ＧＣＧＡＡＧＣ （配列１） ＧＣＧＡＡＡＧＣ （配列２） のように短いながらも高い安定性（融解温度が７０度を
超える）を有する短配列のことである。ミニヘアピンの
部分が立体障害となるのでプローブとターゲット間のハ
イブリダイゼーションを阻害することが予想される。こ
れらのミニヘアピンはＮｕｓｓｉｎｏｖのアルゴリズム
やＺｕｋｅｒのアルゴリズムのみで評価すると時として
見落とす場合があるので注意が必要である。次の反復配
列フィルタ４３とは、２塩基リピート、例えばＡＴやＧ
Ｃなどの２塩基が繰り返される配列や、３塩基リピー
ト、例えばＣＸＧリピート（但しＸはＡ，Ｔ，Ｇ，Ｃの
いずれか）、ヒトＡｌｕ反復配列などの反復配列を有す
るプローブ候補をプローブ候補リスト１３から棄却する
フィルタである。反復配列を含む部位は、同様の反復配
列部位を含む他遺伝子由来のターゲットとハイブリダイ
ゼーションする可能性があるため、クロスハイブリダイ
ゼーションを生じる確率が高くなる。また２塩基リピー
トや３塩基リピートは、２塩基ないしは３塩基ずれても
同じ配列となるので、プローブの選択性が低くなる原因
にもなる。続く類似配列フィルタ４４は、プローブ候補
が、他遺伝子と類似配列を有していないかを、他遺伝子
配列と比較して検索する工程であり、もしプローブ候補
が他遺伝子配列と類似配列を有していれば、それをプロ
ーブ候補リスト１３から棄却するフィルタである。他遺
伝子と配列比較をする工程は、相同性検索（ホモロジー
サーチ）とも呼ばれ、ブラスト(ｂｌａｓｔ)アルゴリズ
ム、ファスタ(ＦＡＳＴＡ)アルゴリズムなどの探索的
(ｈｅｕｒｉｓｔｉｃ)アルゴリズムを用いてもよいし、
スミスウォータマン(Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ)法
などのローカルアライメント(ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎ
ｍｅｎｔ)アルゴリズムや、隠れマルコフモデル(Ｈｉｄ
ｄｅｎ Ｍａｒｋｏｖ ｍｏｄｅｌ)を用いたアルゴリ
ズムなどを用いても良い。遺伝子配列データベースのサ
イズが大きいため、一般に、類似配列フィルタ４４がプ
ローブ設計において最も時間のかかる工程である。そこ
で計算速度を向上させるために文字列をいったん数字に
変換しビットシフト計算等を行ってもよい。フィルタリ
ング工程１４の最後の工程は、クロスハイブリフィルタ
工程４５である。このクロスハイブリフィルタ４５と類
似配列フィルタ４４との相違を説明する。類似配列フィ
ルタ４４により比較した配列がどの程度類似しているか
は、期待値Ｅ，もしくは統計的有意水準（ｐ値）で表現
される。例えばＫａｒｌｉｎとＡｌｔｓｃｈｕｌの定式
化に従えば、式７でｐ値が計算できる。(Ｋａｒｌｉ
ｎ、ＳとＡｌｔｓｃｈｕｌ、Ｓ．Ｆ，Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｆｏｒ ａｓｓｅｓｓｉｎｇ ｔｈｅ ｓｔａｔｉｓｔ
ｉｃａｌ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆ ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｆｅａｔｕｒｅｓ ｂ
ｙ ｕｓｉｎｇ ｇｅｎｅｒａｌ ｓｃｏｒｉｎｇ ｓ
ｃｈｅｍｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ，Ｖｏｌ．８７，ｐｐ．２２６４−２２６８，１
９９０) ｐ値＝１−exp[−K＊N＊M＊exp(−λ＊S)] （式７） 但し、 N＝配列Aの塩基長 M＝配列Bの塩基長 λ＝ln(q/p) K＝(q−p)2 /q p＝スコア１が生じる確率 q＝スコア−１が生じる確率 このｐ値は確率論的な指標であり、大抵は、例えばある
プローブ候補と他遺伝子配列に対し、ブラストアルゴリ
ズムで計算したｐ値が１０％以下の場合、比較された二
者のＤＮＡ配列のホモロジーは十分に高い（危険率１０
％以下）とし、プローブ候補を候補リスト１３から棄却
することでクロスハイブリダイゼーションを十分に低減
させることができる。しかし、遺伝子のほぼ全領域にわ
たって、塩基配列が類似している場合、例えば同一のス
ーパーファミリーに属しているような、シトクロムＰ４
５０のＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１８、
ＣＹＰ２Ｃ１９などの遺伝子では、確率論的指標だけで
はプローブとして用いることができるのか否かの明確な
判定が難しいプローブ候補が多数存在する。なぜなら相
同性検索において用いられるＥ値、やｐ値は、配列マッ
チ度が同一でも、配列の長さにより異なる値を示すこと
があるためである。例えばブラストアルゴリズムにより
算出されるｐ値で１．０、すなわち比較対象の二者の相
同性が確率的にはほぼゼロの場合でも、配列マッチ度で
約４０％〜約７５％までの値を示すことがある。相同性
検索の目的は、あるＤＮＡ配列がデータベース中に格納
されている遺伝子配列と一致しないとした場合（帰無仮
説）、その仮説が正しい確率を示す。配列マッチ度が７
５％とは、２５％の配列が異なるということである。配
列長さにもよるが、２５％も配列が異なれば、比較して
いる２配列は異なる遺伝子である確率が高い。そのため
ｐ値がほぼ１．０となり相同性はゼロと判定される。し
かし実際には、配列マッチ度が７５％の配列同士は、ハ
イブリダイゼーションを行う温度が約３０度Ｔｍより低
ければハイブリダイゼーションする。このようにハイブ
リダイゼーションが生じるか否かについてホモロジーサ
ーチのアルゴリズムは直接的な解答を与えない。そのた
めプローブとターゲットの間のハイブリダイゼーション
という物理化学的反応をより直接的に表す、熱力学的指
標、例えば融解温度や自由エネルギーといった指標をホ
モロジーサーチから得られるＥ値やｐ値に加えて用いる
のが望ましい。クロスハイブフィルタ４５では、融解温
度の差、自由エネルギーの差といった、熱力学的指標に
基づいて、プローブ候補を棄却する。なお図４の融解温
度フィルタ４１、二次構造フィルタ４２、反復配列フィ
ルタ４３、類似配列フィルタ４４、クロスハイブリフィ
ルタ４５の順序は、図４に限らない。例えば、二次構造
フィルタ４２が先頭にきてもよいし、反復配列フィルタ
４３が先頭にきてもよい。但し一般に計算時間のかかる
類似配列フィルタ４４は、フィルタリング工程１４の後
半にくることが望ましい。最後の再検査工程２３も図５
に示すように複数の工程に分けることができる。再検査
工程２３は類似配列フィルタ４４を補完するための工程
であり、選択的スプライシング（オールタナティブスプ
ライシング）塩基配列対象類似配列検索工程５１と全塩
基配列対象類似配列検索工程５２等よりなる。オールタ
ナティブスプライシングとは、同一の遺伝子から複数の
転写産物（ＲＮＡ）が産出される現象である。複数の転
写産物同士は同一の遺伝子を元にしているので、配列の
大部分が類似していることが多い。ＤＮＡチップでは、
オールタナティブスプライシングをそれぞれ分離して測
定する場合があるが、その場合、より高精度の配列検索
アルゴリズムが必要になる。そこでオールタナティブス
プライシング塩基配列対象類似配列検索工程５１を設け
ることが望ましい。但しオールタナティブスプライシン
グを分離して測定する必要がない場合は、工程５１は省
略することが可能である。全塩基配列対象類似配列検索
工程５２は、ＧＥＮＢＡＮＫなどの塩基配列データベー
ス、ｄｂＥＳＴなどのＥＳＴデータベース等に登録され
ている全ての塩基配列に対して、類似配列検索を行う工
程である。同一の種内だけの検索にとどまらず、ヒト、
マウス、ラットなど複数種に対して類似検索を行っても
よい。配列マッチ度とクロスハイブリダイゼーションの
関係を調べるために実験を行った。実験のため塩基長が
５０ｂｐ、配列が異なる合成ＤＮＡ（オリゴヌクレオチ
ドＤＮＡ，もしくはオリゴＤＮＡ）を５本用意した。こ
れら５種類のオリゴＤＮＡをプローブとして用いる。図
６に用意したオリゴＤＮＡの塩基配列をしめす。図６の
右欄は種々の組み合わせにおける配列マッチ度を示す。
実験では、各オリゴと相補配列を有するオリゴＤＮＡ末
端に蛍光標識を付けたターゲットＤＮＡを、５種類の中
から１種類選択し、そのターゲットＤＮＡを、図６のオ
リゴＤＮＡ１から５が同一基盤上に固定化されたＤＮＡ
チップに振り掛けて、１２時間、６２℃でハイブリダイ
ゼーションさせた。蛍光標識由来の蛍光信号強度は蛍光
スキャナーにより数値化した。５種類のターゲットＤＮ
Ａのそれぞれに対し３回ずつ実験を行った結果を整理
し、図７に示した。図７の横軸は配列マッチ度を、縦軸
は標的由来信号を未標的由来信号で割った商を示す。エ
ラーバーは標準偏差を示す。標的由来信号とは配列マッ
チ度が１００％のターゲットＤＮＡとプローブＤＮＡ間
のハイブリダイゼーションによる信号強度を示す。たと
えば図６のオリゴ１とその相補配列を有するターゲット
による信号強度である。そして未標的由来信号とは、標
的由来信号を除く、配列マッチ度が８０，７０，６０，
５０，４０％のターゲットＤＮＡとプローブＤＮＡ間の
ハイブリダイゼーションによる信号強度である。従っ
て、図７の縦軸（標的由来信号／未標的由来信号）が
１．０のとき、標的由来信号と未標的由来信号の強度が
等しいことを示す。このとき、クロスハイブリダイゼー
ション（本来ハイブリダイズすべきでないハイブリダイ
ゼーション）が本来のターゲット−プローブ間ハイブリ
ダイゼーションと同程度に生じていることになり、その
プローブは遺伝子ごとの発現を分離して測定していない
ので、ＤＮＡチップのプロ−ブとして用いることができ
ない。図７によると、配列マッチ度が４０、５０、６０
％では、標準偏差を考慮するとクロスハイブリダイゼー
ションは有意でないが、配列マッチ度が７０％で平均約
４割、配列マッチ度が８０％で平均約６割のクロスハイ
ブリダイゼーションが見られた。図７の結果は、ハイブ
リダイゼーション温度や、洗浄の仕方によっても大きく
変わる。洗浄を厳しく（Ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ）行えばク
ロスハイブリダイゼーションは小さくなる。従って、図
７の結果は、全てのＤＮＡチップにはそのままあてはま
らないが、大雑把に言って、配列マッチ度が８０％を超
えた場合にクロスハイブリダイゼーションが生じる危険
性が高いと言える。前述のように、モチーフは異なる遺
伝子間で、比較的類似した配列を有する部位である。モ
チーフは通常、たんぱく質配列によって定義されること
が多い。しかしＤＮＡ配列をコドン（３塩基長配列）ご
とに区切ってアミノ酸に置き換えたものがたんぱく質配
列なので、モチーフ領域においてはたんぱく質配列のみ
ならずＤＮＡ配列も類似していると考えられる。そこ
で、１０００個のたんぱく質配列をＧＥＮＢＡＮＫから
無作為に取得し、ＰＲＯＳＩＴＥを用いたモチーフ検索
を行った。その結果得られた、たんぱく質モチーフ部位
のＤＮＡ配列を、同一モチーフを有する遺伝子同士で相
互比較した。その比較結果を表１から３に示す。

【０００５】

【表１】

【表２】

【表３】 表の左から、モチーフ名称、モチーフ塩基長、前述の１
０００個のたんぱく質配列中で該当モチーフを有する遺
伝子の数（該当遺伝子数）、該当遺伝子から２種類をラ
ンダムに選択した際の配列マッチ度最小値（配列マッチ
度最小値）、該当遺伝子全てで平均した配列マッチ度
（配列マッチ度平均値）、配列マッチ度最大値をそれぞ
れ示す。表１から表３は、配列マッチ度に対して降順に
並んでいる。表１から３より、モチーフ部位ではたんぱ
く質配列のみならず、ＤＮＡ配列においても配列類似度
が高いことが分かる。約３分の１以上のモチーフで配列
マッチ度が７０％を超えるほか、約半数のモチーフで配
列マッチ度が６０％を超えている。図６，７および表
１，２，３の結果より、モチーフ部位をプローブとして
用いた場合、約３分の１程度の頻度で有意なクロスハイ
ブリダイゼーションが生じる恐れがあることが分かる。
従って、モチーフ部位はＤＮＡチップ用プローブとして
用いないことが望ましい。但し、意図的にモチーフ部位
のみを固定化したＤＮＡチップの場合は例外である。モ
チーフ部位を故意にプローブとすることで、該モチーフ
を有する既知および未知の複数遺伝子のターゲットＤＮ
Ａ断片をハイブリダイズさせることができる。一旦ハイ
ブリダイズさせたターゲットＤＮＡを超音波および熱処
理などの方法で、プローブよりはがした後、ターゲット
ＤＮＡの塩基配列を決定することで、該モチーフを有す
る新規遺伝子をクローニングすることが可能である。同
一モチーフを有する遺伝子同士は、類似の機能を有して
いる可能性が大きいので、同一モチーフを有する既知遺
伝子の機能から新規遺伝子の機能を予測することは比較
的容易である。このように類似機能を有する新規遺伝子
のクローニングを目的としたＤＮＡチップにおいては、
モチーフ部位を一部もしくは全体を含んだプローブを用
いることがある。しかし、既知の遺伝子やＥＳＴの発現
分布を測定するＤＮＡチップを作成する場合、モチーフ
部位を含まないようにすることはクロスハイブリダイゼ
ーションを防止するために有益な設計要件である。また
プローブ設計時間を短縮するためにも、図３のマスキン
グ工程３１においてモチーフ部位を含まないよう予めマ
スクしておくことが有益である。モチーフ部位をマスク
することによるプローブ設計時間短縮についての詳細
は、発明の実施の形態において記す。

【０００６】本発明の特長の一つは、フィルタリング工
程により予め複数の遺伝子同士で類似する配列部位をマ
スクすることで計算速度を向上させている点である。本
発明では例えば、モチーフ部位を含む領域をマスクする
ことにした。この理由は、ヒト、マウス、ラットなどす
べてのｃＤＮＡ配列が決定されていない生物種でも、モ
チーフ部位は高い確率で、複数の遺伝子で類似している
と予想できるためである。但し、大腸菌や酵母など全配
列が決定されている場合は、例えばＢＬＡＳＴなどのホ
モロジーサーチアルゴリズムを用いて、配列一致度を計
算し、類似配列部位を同定することができる。本発明で
は、モチーフによる方法とホモロジーサーチのよる方法
のいずれかを用いたフィルタリング工程を行う。

【０００７】配列マッチ度のみを用いてクロスハイブリ
の評価を行うことは大変に危険である。なぜなら、比較
対照の２配列におけるミスマッチの分布が、配列全体に
渡って一様に分布しているのか、それとも局所的に分布
しているのかを区別することができないからである。例
えば４０塩基対が完全にマッチした配列（相補結合を形
成する配列）であってかつ、残りの４０塩基対が完全に
ミスマッチした配列の場合、８０塩基対の配列マッチ度
は５０％である。そして１塩基ごとにマッチ、ミスマッ
チが交互に分布している８０塩基対の配列マッチ度も５
０％である。これは極端な例だが、配列マッチ度が５０
％であっても、クロスハイブリの可能性は明らかに前者
が高い。またBlast等のホモロジーサーチにより計算さ
れる配列マッチ度（％ Identity）や統計的有意水準値
（ｐ値、もしくはE値）は、それぞれ意味することが異
なるので、たとえ配列マッチ度が同一であってもｐ値が
異なることがある。その反対にｐ値が同一であっても配
列マッチ度が異なることもある。従って、これら配列マ
ッチ度や、統計的有意水準値のどちらを用いてクロスハ
イブリの評価を行ったかによって、評価結果が異なるこ
とになる。このあいまいさは、Tm差、ΔG差という物理
化学的指標を用いることで排除することができる。本発
明の特長の一つは、プローブのクロスハイブリダイゼー
ションの可能性を、融解温度差や自由エネルギー差とい
う物理化学的指標をもとに判定する点である。例えばＢ
ＬＡＳＴなどのホモロジーサーチを用いる方法では、単
にＡＴＧＣという文字の並びのみを根拠にクロスハイブ
リ可能性を判定することになる。本発明の指標を用いる
ことにより、現象からみてより根拠のある判定ができ
る。プローブ設計において実際に得られた配列マッチ
度、統計的有意水準値、Tm差、ΔG差の例を表５に示
す。表５のプローブ設計対象遺伝子の列には、プローブ
設計を試みた遺伝子のUnigeneシンボル名が、最も類似
した他遺伝子の列には、プローブ設計対象遺伝子と最も
類似した配列を有する他遺伝子のUnigeneシンボル名が
記載されている。その右側の列は、プローブ設計対象遺
伝子に対して設計されたプローブ配列と、それと最も類
似した他遺伝子における、プローブ配列と最もホモロジ
ーの高い遺伝子断片配列との配列マッチ度、統計的有意
水準値、Tm差、ΔG差が記載されている。表１のケース
１から３は、配列マッチ度が等しくても、統計的有意水
準値が異なる例である。また表1のケース４から７は、
統計的有意水準値が等しくても、配列マッチ度が異なる
例である。しかし、Tm差やΔG差を用いることでケース
１から７の全てにわたって、クロスハイブリのし易さの
順番を正確に評価することができる。

【０００８】

【表４】

【発明の実施の形態】課題を解決するための手段におい
て開示した方法に従って構築した、ＤＮＡプローブアレ
イ用プローブ設計ソフトウェアのフローチャートの一例
を図８に示す。図８のフローチャートは図２のプローブ
候補２次リスト２２を作成するまで示している。図８で
は図２中の工程に加えて、リストアップ工程１２におい
てモチーフ部位をマスキングするためのモチーフ情報入
力工程８１、またフィルタリング工程１４において融解
温度、反復配列、二次構造を計算するために必要な設計
条件入力工程８２が記されている。しかし工程８１、８
２とも図２の工程１２、工程１４に必要な情報を入力し
ている工程にすぎないので、図８は図２と同一であると
いえる。なおボックス形状は異なるものの図８の融解温
度フィルタ８３が図４の融解温度フィルタ４１に相当す
る。図８のＴｈはハイブリダイゼーション温度、Ｔｈ＋
αが融解温度の設定下限値、Ｔｈ＋βが融解温度の設定
上限値をそれぞれ示す。α、βはそれぞれ正負のいずれ
の値でもよい。そして図８の二次構造フィルタ８５は図
４の二次構造フィルタ４２に、図８の類似配列フィルタ
８７は図４の類似配列フィルタ４４、図８のクロスハイ
ブリフィルタ８８は図４のクロスハイブリフィルタ４５
にそれぞれ相当する。なお図４の反復配列フィルタ４３
は、図８では、ミニヘアピン・反復配列フィルタ８４と
長反復配列フィルタ８６の二工程に分割されている。こ
の分割の理由は計算速度の向上である。工程８４と工程
８６を同一アルゴリズムにより処理するよりも、工程８
４と工程８５を別アルゴリズムで行う方が計算上好都合
なこと、工程８５より計算時間のかからない工程８６を
工程８５の前に、工程８５より計算時間のかかる工程８
６を工程８５の後ろにすることが計算速度を向上させる
ために好ましかったことにより、図８の各工程の順序が
定められている。ただし、工程８３から工程８８までの
各工程の順序は、フィルタリング工程１４を通じて計算
時間が最も短くなるようにすればよく、図４や図８の順
番に各工程を行う必要はない。図８のフローチャートの
順番に従って、以下詳細に説明する。ゲノム、ｃＤＮＡ
配列１１は、例えば図９に示すように、ＦＡＳＴＡ形式
と呼ばれる形式などで記述されたテキストファイルを読
み取ることで、プローブ設計システムに入力される。図
９はヒトｃＤＮＡ配列を約４万格納したファイルの冒頭
部分を示している。なおゲノム、ｃＤＮＡ配列１１のフ
ァイルは１つないしは複数の圧縮形式もしくは未圧縮形
式ファイルでよい。また、ＦＡＳＴＡ形式以外の、例え
ば、ＧｅｎＢａｎｋ，ＥＭＢＬ、ＤＤＢＪ形式といった
異なる形式のファイルのいずれでもよい。そして図９の
ように必ず塩基配列が格納されている必要はなく、例え
ばＧｅｎＢａｎｋのアクセション番号や、Ｕｎｉｇｅｎ
ｅのＩＤ番号、ＧＩ番号といった、塩基配列を参照可能
なＩＤ番号等が格納されたファイルであればよい。モチ
ーフ情報入力工程８１は、例えば図１０に示すような形
式でモチーフ情報を格納したテキストファイルを読み取
る工程である。図１０は左列からｃＤＮＡ配列のＧＩ番
号、ｃＤＮＡ配列中に含まれるモチーフ数、モチーフ
名、あるモチーフの開始塩基位置（番号）、あるモチー
フの終了塩基位置（番号）のそれぞれに対応する。そし
て図１０の各行は、図９ファイルの各配列のそれぞれに
対応する。図１０に記載されたモチーフ開始位置と終了
位置に基づき、図９ファイルの塩基配列のなかでモチー
フに相当する領域をマスクする。なお図１０に示すファ
イルを用意しなくても、図９のゲノム、ｃＤＮＡ配列１
１のファイルに記載されているＧＩ番号などに基づき、
Ｇｅｎｂａｎｋ等のＤＮＡ配列、たんぱく質配列モチー
フ情報をデータベースにより検索することも可能であ
る。すなわち、図９中に含まれる例えば、Ｇｅｎｂａｎ
ｋのアクセション番号等からＤＮＡもしくは、たんぱく
質配列をデータベースから取得して、そのＤＮＡもしく
は、たんぱく質配列からモチーフ部位を計算等の手段に
より取得することができれば、図１０のファイルは必ず
しも必要でない。５０００個のＤＮＡプローブを設計し
た際に、モチーフ部位を予めマスクすることによる計算
時間短縮の効果を表４に示す。

【０００９】

【表５】 モチーフ部位をマスクすることにより、計算時間が約３
分の１に短縮された。これは、予めモチーフ部位という
複数の遺伝子において類似した部位をマスクしておくこ
とで、後のフィルタリング工程１４の類似配列フィルタ
８７を約１回で合格する頻度が増えたためである。フィ
ルタリング工程１４で除外されるプロ−ブ候補が多い場
合は、無駄な計算をしていることになるが、予めモチー
フ部位をマスクしておくことは、この無駄な計算をなく
す上で有益である。設計条件入力工程８２で入力する設
計条件とは例えば、プローブ塩基長、ハイブリダイゼ−
ション溶液の塩濃度、ハイブリダイゼーション温度、プ
ローブ融解温度の上限値、下限値、目標値などである。
またプローブの融解温度や二次構造の安定性を計算する
ためのパラメータは、例えば図１１のようなファイルか
ら読み取ればよい。図１１は、最近接塩基法（Ｎｅａｒ
ｅｓｔ Ｎｅｉｇｈｂｏｒ法；ＮＮ法）により融解温度
を計算する際の熱力学パラメータである（ＳａｎｔａＬ
ｕｃｉａ，Ｊ， Ｊｒ． Ａ ｕｎｉｆｉｅｄ ｖｉｅ
ｗ ｏｆ ｐｏｌｙｍｅｒ， ｄｕｍｂｂｅｌｌ， ａ
ｎｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ＤＮＡｎｅａ
ｒｅｓｔ−ｎｅｉｇｈｂｏｒ ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍ
ｉｃｓ， Ｐｏｒｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃ
ｉ． ＵＳＡ， ｖｏｌ．９５， ｐ．１４６０−１４
６５， １９９８）。図１１の左列からΔＨ、ΔＳ、Δ
Ｇ（３７℃）である。図１１の第１行は、コメント欄に
よると、ＡＡ／ＴＴの２塩基配列のΔＨ、ΔＳ、ΔＧ
（３７℃）であることが分かる。なお融解温度（Ｔｍ）
とΔＨ、ΔＳの関係は式８で表される。 Tm＝ΔH/（ΔS＋R＊ｌｎ（Ct）） （式８） 但し、 Ｒ＝ガス定数 Ｃｔ＝オリゴヌクレオチド濃度 最近接塩基法によりΔＧを計算する例を式９にしめす。
例えば塩基配列が以下の場合、 ５‘ Ｃ-Ｇ-Ｔ-Ｔ-Ｇ-Ａ ３’ ３‘ Ｇ-Ｃ-Ａ-Ａ-Ｃ-Ｔ ５’ 最近接塩基法（ＮＮ法）で計算した自由エネルギーΔＧ
（ＮＮ）は、 ΔＧ（ＮＮ）＝ΔＧ（ＣＧ／ＧＣ）＋Δ（ＧＴ／ＣＡ）＋ΔＧ（ＴＴ／ＡＡ） ＋ΔＧ（ＴＧ／ＡＣ）＋ΔＧ（ＧＡ／ＣＴ）＋ΔＧ（init) ＝−２．１７−１．４４−１．００−１．４５−１．３０＋０．９８＋１．０ ３ ＝−５．３５ kcal/mol （式９） 各数値は数表の形で論文に記載されている。ΔＳ、ΔＨ
も式９と同様に計算できる。更に溶液の塩濃度による補
正を例えば式１０で行うことで、溶液中の相補結合の安
定性（自由エネルギー）ΔＧ（溶液中）を計算すること
ができる。 ΔＧ（溶液中）＝ΔＧ（ＮＮ）−０．１７５＊ln[Na+] −０．２０ （式１０） 但し、 [Ｎａ^＋] ＝塩濃度 なおＤＮＡ配列のＴｍの計算には、前述の最近接塩基法
と、経験式に基づく方法（Ｗｅｔｍｕｒｅ， Ｊ．
Ｇ．， ＤＮＡ ｐｒｏｂｅｓ： Ａｐｐｌｉｃａｔｉ
ｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ
ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏ
ｎ， Ｃｒｉｔｉ． Ｒｅｖ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ．
Ａｎｄ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ｖｏｌ．２６，
ｐ．２２７−２５９， １９９１）の２つがある。経験
式に基づくＴｍの計算式は、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダ
イゼーションの場合は式１１、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリ
ダイゼーションの場合は式１２、ＲＮＡ−ＲＮＡハイブ
リダイゼーションの場合は式１３である。 Tm＝８１．５＋１６．６＊log([Na+]/(1+0.7[Na+]))＋０．４１＊（％ＧＣ）− ５００/length （式１１） 但し、 [Ｎａ^＋] ＝塩濃度 ％ＧＣ＝ＧＣ比率 length＝塩基長 Tm＝６７＋１６．６＊log([Na+]/(1+0.7[Na+]))＋０．８＊（％ＧＣ）−５００/ length （式１２） 但し、 [Ｎａ^＋] ＝塩濃度 ％ＧＣ＝ＧＣ比率 length＝塩基長 Tm＝７８＋１６．６＊log([Na+]/(1+0.7[Na+]))＋０．７＊（％ＧＣ）−５００/ length （式１３） 但し、 [Ｎａ^＋] ＝塩濃度 ％ＧＣ＝ＧＣ比率 length＝塩基長 ５０塩基対以下のＤＮＡ配列については式８、９、１０
の最近接塩基法がよく合致し、５０塩基対以上のＤＮＡ
配列に対しては式１１，１２，１３の経験式に基づく方
法がよく合致するという報告もある。しかし前記Ｊ．Ｓ
ａｎｔａＬｕｃｉａ，Ｊｒ．の論文によると、最近接塩
基法も改良されており、配列長さによらず計算できるこ
とが示唆されている。そこで、ＤＮＡ配列のＴｍ計算に
は、塩基長さに応じて最近接塩基法もしくは経験式に基
づく方法のいずれか片方をもちいる、あるいは両者の方
法で計算して得られた値の例えば平均値などを用いれば
良い。モチーフ情報入力工程８１で得られたモチーフ部
位を、図３のマスキング工程３１にてマスクする。続い
て、設計条件入力工程８２により入力されたプローブ塩
基長に基づき、図３のプローブ長切り取り工程３２を実
施することで、プローブ候補１次リスト２１を作成す
る。その次の融解温度フィルタ８３では、プローブ候補
１次リスト２１中のプローブ候補の一つ一つについて融
解温度（Ｔｍ）を計算し、そのＴｍがハイブリダイゼー
ション温度（Ｔｈ）と比較してある一定の範囲、例えば
Ｔｈ＋αからＴｈ＋β（但しα、βの値は正負のどちら
の値でもよい）を外れているＤＮＡ配列をプローブ候補
１次リスト２１から棄却する。その後、プローブ候補１
次リスト２１に残されたそれぞれのプローブ候補とプロ
ーブ融解温度目標値との差を計算し、プローブ融解温度
目標値に近いプローブ候補ほどプローブ候補１次リスト
の先頭にくるようにソートすることもできる。このソー
トは必ずしも必要でないが、プローブ融解温度目標値に
近いプローブをより短い計算時間で設計する際には有用
な処理である。続くミニヘアピン、単純反復配列フィル
タ８４について説明する。１本鎖ＤＮＡは通常、溶液中
ではその一部が折れ曲がって数個の相補的な塩基対を形
成しているが、この構造はヘアピン構造と呼ばれる。こ
のヘアピン構造のうち、配列１や配列２のように異常に
熱安定性が高いヘアピン構造が存在することが分かって
いる（平尾と三浦、１本鎖ＤＮＡの特殊構造異常に熱安
定性が高いミニヘアピン構造、蛋白質核酸酵素、ｖｏ
ｌ．４０，ｐ．１５８３−１５９２，１９９５）。配列
１のＴｍは７６℃にも達する。この７６℃という温度は
一般のハイブリダイゼーション温度（４０℃から６２
℃）と比較して有意に高い。このため、配列１が固定化
ＤＮＡ断片中に含まれた場合、ハイブリダイゼーション
時、その配列部分ないしはより広範囲の領域で相補結合
を形成しない確率が非常に高い。相補結合を形成しない
状態とは、ある意味でミスマッチの状態と同一である。
前述のように、２つのＤＮＡ間でミスマッチがあれば、
両ＤＮＡのＴｍが低下し、ハイブリダイゼーション精度
が低下することになる。このため例えば配列１や配列２
のようなミニヘアピン構造はできる限り、固定化ＤＮＡ
断片中に含まれない方がよい。また配列１，２以外にハ
イブリダイゼーション精度を低下させうる配列に、単純
反復配列がある。単純反復配列とは例えば２塩基リピー
ト、３塩基リピートである。２塩基リピートは例えば、 ＡＴ［ＡＴ］ｎＡＴ（但しｎ＝０，１，２…） （配列３） ＧＣ［ＧＣ］ｎＧＣ（但しｎ＝０，１，２…） （配列４） といった２塩基が何度も繰り返される配列である。そし
て３塩基リピートとは例えば、 ＣＸＧ［ＣＸＧ］ｎＣＸＧ（但しＸ＝Ａ，Ｔ，Ｇ，Ｃのいずれか、ｎ＝０，１， ２…） （配列５） といった３塩基が何度も繰り返される配列である。工程
８４では例えば、文字列のパターンマッチングアルゴリ
ズムを用いて、２塩基リピートや３塩基リピートを検索
して、それらのハイブリダイゼーション精度を低下させ
る可能性のある配列を有するプローブ候補を、プローブ
候補１次リストより棄却する。パターンマッチングの対
象としては、ミニヘアピン、リピート配列の相補配列
（ＧＣＧＡＡＡＧＣであれば、ＣＧＣＴＴＴＣＧ）、反
転配列（ＧＣＧＡＡＡＧＣであれば、ＣＧＡＡＡＧＣ
Ｇ）、相補反転配列（ＧＣＧＡＡＡＧＣであれば、ＧＣ
ＴＴＴＣＧＣ）について対象としてもよい。計算速度を
向上させるために文字列をいったん数字に変換しビット
シフト計算等により比較してもよい。工程８４では、例
えば図１２に示すようなパターンマッチングの対象とな
るパターン配列（検索対象パターン）を格納したファイ
ルを読み取ることでパターンマッチングを行えばよい。
図１２では、複数の検索対象パターンが格納され、各検
索対象パターンは改行により区切られている。続く二次
構造フィルタ８５について説明する。溶液中の１本鎖Ｄ
ＮＡは、ヘアピン構造以外にも、塩基間の水素結合力に
より多様な高次構造をとることが知られているが、ヘア
ピン構造を含めこれらの高次構造は、二次構造と呼ばれ
る。もしもプローブ候補が取りうる二次構造の安定性
が、プローブ−ターゲット間ハイブリダイゼーションの
安定性と比較して無視できない場合は、そのプローブ候
補は、プローブ候補１次リスト２１より棄却される。二
次構造には例えば、ヘアピンループ構造、インターナル
ループ構造、バルジループ構造といった構造がある。予
測された二次構造が有意に安定か否かは、例えば式１の
ように、熱力学的計算により計算された二次構造のΔＧ
と、プローブ−ターゲット間ハイブリダイゼーションの
ΔＧと比較することで判定できる。続く長反復配列フィ
ルタ８６について説明する。ヒトＤＮＡにはヒト特有
の、Ａｌｕ配列と呼ばれる、反復配列を多く含む配列の
存在が知られている。このＡｌｕ配列はヒトＤＮＡに数
多く含まれている。またＡｌｕ配列は、メッセンジャー
ＲＮＡ内、特に５‘非翻訳領域または３’非翻訳領域に
も存在する。仮に、測定対象のメッセンジャーＲＮＡサ
ンプル中にＤＮＡ分子が混入していた場合、メッセンジ
ャーＲＮＡを鋳型として蛍光標識をする工程中、混入Ｄ
ＮＡ内もＡｌｕ配列部分の存在により蛍光標識されてし
まう可能性がある。そしてＡｌｕ配列部分を含む標識さ
れた混入ＤＮＡと、固定化ＤＮＡ断片とが相補結合する
ことも考えられる。本来メッセンジャーＲＮＡのみを測
定すべきが、ＤＮＡをも測定してしまう恐れがある。こ
の混入ＤＮＡによる誤った解析を避けるためには、固定
化ＤＮＡ断片中にＡｌｕ配列と相同性が有意に高い部分
が含まれないことが望ましい。またＡｌｕ配列には反復
構造が多く含まれるので、溶液中で、高次構造をとる可
能性があり、前記のミニヘアピン構造と同様にミスマッ
チを引き起こすことが十分に考えられる。この意味でも
固定化ＤＮＡ断片中にＡｌｕ配列と相同性が有意に高い
部分が含まれないことが望ましい。例えば、Ａｌｕ配列
と固定化ＤＮＡ断片とのホモロジーがブラストアルゴリ
ズムで算出した統計的有意水準（ｐ値）で１０％を超え
るようにすれば、配列相同性が有意に低くなると考えら
れる。ブラストアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，
Ｓ．Ｆ．ら、Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅ
ｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ， Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｖｏｌ．２１５， ｐ．４０３−４１０， １９９
０を用いればよい。Ａｌｕ配列との相同性検索の結果、
Ａｌｕ配列との相同性が大きいプローブ候補は、プロー
ブ候補１次リスト２１より棄却する。ヒトではＡｌｕ配
列のほかに、ＬＩＮＥ（Ｌｏｎｇ Ｉｎｔｅｒｓｐｅｒ
ｓｅｄ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ）、ＳＩＮＥ（Ｓｈｏｒｔ
Ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ）、ＬＴ
Ｒレトロトランスポゾン、ＤＮＡトランスポゾンなどの
反復配列が知られている。またヒト以外でもＡｌｕ配列
に相当するいくつかの反復配列が知られている。これら
の反復配列についても同様に、プローブ候補と相同性検
索を行い、相同性が高いプローブ候補はプローブ候補１
次リスト２１より除外すればよい。相同性検索に用いる
配列は、例えば図１３に示すような、Ａｌｕ配列等をＦ
ＡＳＴＡ形式で格納したファイルを読み込むなどすれば
よい。続く類似配列フィルタ８７では、１枚のＤＮＡプ
ローブアレイ上に固定化するプローブ配列ないしはプロ
ーブ配列を含む遺伝子配列（ゲノム配列、ｃＤＮＡ配
列）同士の相同性検索を行う。プローブ候補のうち、他
プローブ配列や遺伝子配列と相同性が高いプローブ候補
は、クロスハイブリダイゼーションの可能性があるの
で、プローブ候補リスト２１より棄却する。また工程８
７では、例えばヒトの場合、ヒトでは約４万個あると考
えられている全ての遺伝子配列、ヒトでは約１０万個あ
ると考えられている全ての転写産物、もしくはヒト全ゲ
ノム配列との相同性を計算してもよい。測定対象試料に
は、固定化ＤＮＡ断片と本来ハイブリダイズする遺伝子
以外にも、数多くの別遺伝子が含まれている。それら別
遺伝子がハイブリダイズした場合、本来、個々の固定化
ＤＮＡ断片がハイブリダイズすべき遺伝子のみの測定が
できなくなる。そこで、ＤＮＡプローブアレイ上に固定
化するＤＮＡ断片候補の配列と、測定対象試料に含まれ
ている可能性のある遺伝子群のＤＮＡ配列とを比較し
て、相同性が有意に高いＤＮＡ配列は、固定化ＤＮＡ断
片としては選択しないことが望ましい。ＧＥＮＢＡＮＫ
等の遺伝子配列データベースには現在までに知られてい
るヒトないしはげっ歯類、酵母、大腸菌などの配列が全
て格納されている。固定化ＤＮＡ断片と、例えばＧＥＮ
ＢＡＮＫ等のヒトなどの遺伝子配列とのＤＮＡ配列相同
性が、ブラストアルゴリズムにより算出した統計的有意
水準（ｐ値）で１０％を超えることとすれば、より高精
度の測定が行える。また図２に示すように時間のかかる
他遺伝子との相同性検索を、類似配列フィルタ８７では
高速アルゴリズム（高速だが精度が低いアルゴリズム、
例えばブラストアルゴリズム）で行い、図５の再検査工
程２３において低速アルゴリズム（低速だが精度が高い
アルゴリズム、例えばスミスウォーターマンアルゴリズ
ム）による相同性検索を行ってもよい。フィルタリング
工程の最後であるクロスハイブリダイゼーションフィル
タ８８について説明する。前述のように相同性検索は必
ずしもプローブ−ターゲット間ハイブリダイゼーション
という物理化学的過程を考慮していない。そのため、類
似配列フィルタ８７に合格した１つないしは複数のプロ
ーブ候補に対し、クロスハイブリダイゼーションの可能
性を調べる。例えばプローブ候補と最も配列相同性が高
い他遺伝子配列との配列マッチ度、融解温度差（Ｔｍ
差）、自由エネルギー差（ΔＧ差）を計算する。他遺伝
子との配列マッチ度が有意に高いプローブ候補はプロー
ブ候補１次リスト２１より棄却する。配列マッチ度が有
意に高いとは例えば、図７に示すように配列マッチ度が
８０％を超えることである。他遺伝子とのＴｍ差が有意
に小さいプローブ候補はプローブ候補１次リスト２１よ
り棄却する。Ｔｍ差が有意に小さいとは、例えば、Ｔｍ
差が１５℃以下のことである。そして他遺伝子とのΔＧ
差が有意に小さいプローブ候補はプローブ候補１次リス
ト２１より棄却する。こうしてクロスハイブリダイゼー
ションの生じる可能性を物理化学的指標により評価する
ことで、作成されたＤＮＡプローブアレイのクロスハイ
ブリダイゼーションをほぼゼロにすることが可能だと考
えられる。図８に示す一連の工程により設計されたプロ
ーブ２次候補は、図１４に示すようにプローブ２次候補
リスト２２として、リスト化される。この後、再検査工
程２３等を経て、最終的にプローブ配列１５が決定され
る。図１５に本発明のインターフェースの一例を示す。
インターフェースのハードウェアは、例えば表示装置１
５１、ＣＰＵ１５２、入力装置１５３より構成される。
表示装置１５１には、選択ボタン１５４、表示ボタン１
５５、チェックボタン１５６などのボタン群が配置さ
れ、本発明の使用者が、入力装置１５３により、各ボタ
ンをクリックするなどの操作により、条件入力を行え
る。選択ボタン１５４は選択可能な選択肢を予め全て使
用者に提示した後、使用者に望みの選択肢を選択させる
ボタンである。例えば、入力配列がゲノムＤＮＡなのか
ｃＤＮＡなのか、あるいはモチーフ部位をマスキングす
るのかなどを選択させる。表示ボタン１５５をクリック
することにより、より詳細な入力画面や、ヘルプ画面を
参照できる。チェックボタン１５６はトグルになってお
り、チェックされた工程は実行され、チェックされない
工程は省略される。使用者が行った条件入力をもとに、
本発明のリストアップ工程１２、フィルタリング工程１
４、再検査工程２３の組み合わせや、各工程の順序を自
動最適化して、ソフトウェア処理を行うことができる。
こうしてソフトウェア内部を熟知しない使用者でも、様
々な設計条件において、最速のソフトウェア処理を行う
ことができる。本発明を実施することで、クロスハイブ
リダイゼーションがなく、均等化したＴｍを有し、二次
構造をとることが少ないプローブ配列を実現することが
できる。

【００１０】Ｕｎｉｇｅｎｅに登録されている４２７４
個のラット既知遺伝子に対し、８０塩基のオリゴヌクレ
オチドプローブを設計した。その結果、４２７４個の９
８．６％に相当する４２１６遺伝子についてプローブ配
列を決定することができた。４２１６個のプローブ配列
の特性について図１６から図１９に記す。図１６は４２
１６個のプローブの融解温度を示した図である。図１６
の横軸はプローブ番号を、図１６の縦軸はプローブの融
解温度（℃）を示す。設計時のプローブ融解温度の目標
値は７５℃とした。フィルタリング工程の全条件を満た
した上で、最も目標値に近い融解温度を持つ配列がプロ
ーブとして選択されている。４２１６個のプローブ融解
温度の平均値とその標準偏差は７５．０±０．７２℃で
あった。図１７は４２１６個のプローブのクロスハイブ
リダイゼーション可能性について、最類似遺伝子断片と
の一致度（％）を示した図である。プローブ配列は、そ
のプローブと本来ハイブリダイズする遺伝子とは１００
％一致する配列である。その一方、Ｕｎｉｇｅｎｅに登
録されている４２７４個のラット既知遺伝子のなかで、
プローブが本来ハイブリダイズする遺伝子を除いて、最
も類似した８０塩基の部分配列を有する遺伝子配列との
一致度を図１７は示している。図１７によると最も類似
した遺伝子配列との一致度は７０％以下である。４２１
６個のプローブの最類似遺伝子断片との一致度（％）の
平均値とその標準偏差は、５５．１±４．５２％であ
る。この配列一致度は、単にＡＴＧＣの並びが一致する
か否かを示すだけであって、ハイブリダイゼーションと
いう物理化学的現象を直接反映した指標とはいえない。
そこで、図１８に４２１６個のプローブのクロスハイブ
リダイゼーション可能性について、最類似遺伝子断片と
の融解温度差（℃）を、図１９に最類似遺伝子断片との
自由エネルギー差（kcal/mol）を示した。図１８による
とプローブと本来ハイブリダイズする遺伝子と、Ｕｎｉ
ｇｅｎｅに登録されている４２７４個のラット既知遺伝
子のなかで、プローブが本来ハイブリダイズする遺伝子
を除いて、最も類似した８０塩基の部分配列とでは、少
なくとも２０℃以上、融解温度が異なっている。４２１
６個の平均値とその標準偏差は、７５．６±２４．３％
である。核酸同士がハイブリダイゼーションを行う際の
代表的メルティングカーブによると、ほぼ１０〜１５℃
異なれば、クロスハイブリダイゼーションが防止できる
と予想される。この融解温度２０℃以上という差は、ク
ロスハイブリダイゼーションをほぼ１００％防止できる
差異だと考えられる。また図１９によるとプローブと本
来ハイブリダイズする遺伝子と、Ｕｎｉｇｅｎｅに登録
されている４２７４個のラット既知遺伝子のなかで、プ
ローブが本来ハイブリダイズする遺伝子を除いて、最も
類似した８０塩基の部分配列とでは、少なくとも４０kc
al/mol以上安定性（自由エネルギー）が異なっているこ
とが分かる。すなわち、プローブと本来ハイブリダイズ
する遺伝子とがハイブリダイズする安定性は、プローブ
と最類似遺伝子断片とがクロスハイブリする安定性より
も、４０kcal/mol以上、平均で７３．３±８．０１kcal
安定であることが分かる。配列一致度という指標と比べ
て、融解温度差や自由エネルギー差という指標は、プロ
ーブの塩基配列とハイブリダイゼーションという物理化
学的現象を直接反映しているので、より好ましい。本発
明を用いることで、融解温度が均一でかつクロスハイブ
リの可能性が実用上十分に低いプローブ配列が決定でき
ることが分かる。なお４２７４個のラット既知遺伝子に
対し、プローブ配列を決定できなかった遺伝子配列６５
個は、そのｃＤＮＡ全体に渡って、遺伝子相互の配列ホ
モロジーが８０％以上の類似遺伝子が１つ以上存在する
ことを確認した。プローブ配列をより短くするしか、ク
ロスハイブリのないプローブを決めることはできない。
すなわち遺伝子配列そのものに問題があるのであって、
本発明のアルゴリズムでは決定できるプローブ配列は全
て決定できていることが分かる。

【００１１】図２０に全体の工程を表したインターフェ
ースの一例を示す。まず、ゲノム又はｃＤＮＡ配列のデ
ータベース中からプローブ候補の部分配列を選択し、選
択された部分配列の中から、モチーフ部位又は反復配列
部位を含む部分配列を除外するマスキング処理手段を経
て、プローブ候補リスト１を作成する。そして、プロー
ブ候補リスト１の中から、プローブに適さない不適合候
補をＴｍ、二次構造、反復配列、類似配列、ΔＧ差・Ｔ
ｍ差に基づいてフィルタリングし、プローブ候補リスト
２を作成する。その後、再検査工程を経てプローブ配列
を決定する。

【００１２】

【発明の効果】ＤＮＡプローブアレイ上に固定化するプ
ローブＤＮＡの配列設計方法を提供する。

【図面の簡単な説明】

【図１】プローブ設計フローチャートの全体構成の一
例。

【図２】プローブ設計フローチャートの全体構成の一
例。

【図３】リストアップ工程のフローチャートの一例。

【図４】フィルタリング工程のフローチャートの一例。

【図５】再検査工程のフローチャートの一例。

【図６】実験に用いたオリゴＤＮＡ配列と相互の配列マ
ッチ度。

【図７】配列マッチ度と標的由来信号／未標識由来信号
の関係。

【図８】プローブ設計フローチャートの全体構成の一
例。

【図９】ゲノム・ｃＤＮＡ配列ファイルの一例。

【図１０】モチーフ情報ファイルの一例。

【図１１】熱力学計算用パラメータファイルの一例。

【図１２】パターンマッチング対象パターンファイルの
一例。

【図１３】反復配列ファイルの一例。

【図１４】プローブ候補２次リストの一例。

【図１５】プローブ設計システムインターフェースの一
例。

【図１６】プローブの融解温度を示した図。

【図１７】プローブのクロスハイブリダイゼーション可
能性について、最類似遺伝子断片との一致度を示した
図。

【図１８】プローブのクロスハイブリダイゼーション可
能性について、最類似遺伝子断片との融解温度差を示し
た図。

【図１９】最類似遺伝子断片との自由エネルギー差を示
した図。

【図２０】全体の工程を表したインターフェースの一例
である。

【符号の説明】

１１．ゲノム、ｃＤＮＡ配列、１２．プローブ候補リス
ト作成工程（リストアップ工程）、１３．プローブ候補
リスト、１４．不適合候補除外工程（フィルタリング工
程）、１５．プローブ配列、２１．プローブ候補１次リ
スト、２２．プローブ候補２次リスト、２３．再検査工
程、３１．類似配列部位除外工程（マスキング工程）、
３２．プローブ長切り取り工程、４１．融解温度フィル
タ、４２．二次構造フィルタ、４３．反復配列フィル
タ、４４．類似配列フィルタ、４５．クロスハイブリフ
ィルタ、５１．オールタナティブスプライシング塩基配
列対象類似配列検索工程、５２．全塩基配列対象類似配
列検索工程、８１．モチーフ情報入力工程、８２．設計
条件入力工程、８３．融解温度フィルタ、８４．ミニヘ
アピン、単純反復配列フィルタ、８５．二次構造フィル
タ、８６．長反復配列フィルタ、８７．類似配列フィル
タ、８８．クロスハイブリフィルタ、１５１．表示装
置、１５２．ＣＰＵ，１５３．入力装置、１５４．選択
ボタン、１５５．表示ボタン、１５６．チェックボタ
ン。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 斎藤 俊郎 東京都千代田区神田駿河台四丁目６番地 株式会社日立製作所ライフサイエンス推進 事業部内 (72)発明者 奈良原 正俊 東京都千代田区神田駿河台四丁目６番地 株式会社日立製作所ライフサイエンス推進 事業部内 (72)発明者 加藤 宏一 東京都千代田区神田駿河台四丁目６番地 株式会社日立製作所ライフサイエンス推進 事業部内 Ｆターム(参考） 2G045 AA35 DA12 DA13 JA01 4B024 AA11 AA20 CA04 CA09 HA12 4B063 QA13 QQ42 QR32 QR55

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ゲノム又はｃＤＮＡ配列のデータベースか
   らプローブ候補の部分配列を選択する手段と、 前記選択されたプローブ候補の部分配列の中から、モチ
   ーフ部位及び反復配列部位を含む部分配列を除外するマ
   スキング処理手段と、 前記マスキング処理の結果を、第１のプローブ候補リス
   トとして作成する手段と、 前記第１のプローブ候補リストの中から、所定のプロー
   ブ候補を除外するフィルタリング手段と、 前記フィルタリング処理の結果を、第２のプローブ候補
   リストとして作成する手段からなることを特徴とするプ
   ローブ配列決定システム。
2. 【請求項２】請求項１記載のプローブ配列決定システム
   において、前記マスキング処理されたプローブ候補の中
   からさらに、第１の長さの塩基対のゲノム及びｃＤＮＡ
   配列から、前記第１の長さよりも短い第２の長さの塩基
   対の部分配列であるプローブ候補を取得するプローブ配
   列切り取り処理手段を有し、前記プローブ配列切り取り
   処理の結果を、第１のプローブ候補リストとして作成す
   ることを特徴とするプローブ配列決定システム。
3. 【請求項３】請求項１記載のプローブ配列決定システム
   において、前記フィルタリング手段は、熱力学的指標で
   ある融解温度差、自由エネルギー差のいずれか１つ以上
   に基づいてプローブ候補を棄却する手段を有することを
   特徴とするプローブ配列決定システム。
4. 【請求項４】請求項３記載のプローブ配列決定システム
   において、前記第２のプローブ候補リストの中から、一
   の遺伝子から複数の転写産物が産出された場合に配列を
   選択する選択的スプライシング塩基配列対象類似配列検
   索と、データベースに登録されている塩基配列に対して
   類似配列検索を行う塩基配列対象類似配列検索をする再
   検査手段を有し、プローブ配列を決定することを特徴と
   するプローブ配列決定システム。
5. 【請求項５】請求項４記載のプローブ配列決定方法にお
   いて、前記類似配列検索は、複数種に対して類似類似検
   索を行うことを特徴とするプローブ配列決定システム。
6. 【請求項６】ゲノム又はｃＤＮＡ配列のデータベースか
   らプローブ候補の部分配列を選択する手段と、 前記選択されたプローブ候補の部分配列の中から、所定
   の部位を含む部分配列を除外するマスキング手段と、 前記マスキング処理の結果を、第１のプローブ候補リス
   トとして作成する手段と、 前記第１のプローブ候補リストの中から、熱力学的指標
   である融解温度差、自由エネルギー差のいずれか１つ以
   上に基づいてプローブ候補を除外するフィルタリング手
   段と、 前記フィルタリング処理の結果を、第２のプローブ候補
   リストとして作成する手段からなることを特徴とするプ
   ローブ配列決定システム。
7. 【請求項７】請求項６記載のプローブ配列決定システム
   において、前記フィルタリング手段は、さらに融解温
   度、二次構造、反復配列、類似配列のいずれか１つ以上
   に基づいてプローブ候補を棄却する手段を有することを
   特徴とするプローブ配列決定システム。
8. 【請求項８】請求項７記載のプローブ配列決定方法にお
   いて、前記二次構造は、ミニヘアピン配列による二次構
   造であることを特徴とするプローブ配列決定システム。
9. 【請求項９】請求項７記載のプローブ配列決定システム
   において、前記反復配列は、ミニヘアピン配列、単純反
   復配列、長反復配列のいずれか１つ以上であることを特
   徴とするプローブ配列決定システム。