JP2003047485A - Ｄｎａ固定化法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ＤＮＡマイクロビーズアレイ作製時にマイク
ロビーズに結合したアンチタグ配列と標的ＤＮＡとの間
に共有結合を形成させる過程において、該反応の効率向
上、操作の簡略化及び不完全なプロテアーゼ除去による
次工程の反応効率低下の危険低減のための手段を提供す
ること。 【解決手段】 上記過程においてＤＮＡポリメラーゼ、
例えばＴ４ ＤＮＡポリメラーゼとＤＮＡリガーゼ、例
えばＴ４ ＤＮＡリガーゼを同時に反応させることによ
って操作を簡略化し、反応効率を飛躍的に向上させる方
法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ＤＮＡマイクロビ
ーズアレイ技術において、マイクロビーズに結合したア
ンチタグ配列とマイクロビーズに固定しようとするＤＮ
Ａとの間に共有結合を形成させる方法及び該方法によっ
て調製されたＤＮＡマイクロビーズアレイに関する。

【０００２】

【従来の技術】ＤＮＡマイクロビーズアレイ技術の詳細
についてブレナー（Ｂｒｅｎｎｅｒ）らがプロシーディ
ングズ オブ ナショナル アカデミー オブ サイエ
ンシズＵＳＡ（Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第９７
巻、第１６６５〜１６７０頁、２０００年；以下、文献
１と呼ぶ）で報告している。上記ＤＮＡマイクロビーズ
アレイ技術においては、マイクロビーズに固定しようと
するＤＮＡ（以下、標的ＤＮＡと呼ぶ）に結合した１本
鎖タグと、ビーズ上に結合したアンチタグとの間のハイ
ブリダイゼーションによって１個のマイクロビーズには
単一の標的ＤＮＡが対応づけられる。標的ＤＮＡがハイ
ブリダイゼーションによって結合したマイクロビーズを
セルソーターを用いて選別し、種々の酵素処理と化学処
理によって標的ＤＮＡをアンチタグ配列に共有結合さ
せ、標的ＤＮＡのマイクロビーズから離れた末端にアダ
プターを付加し、競合ハイブリダイゼーションに使用す
るために標的ＤＮＡを１本鎖化する。

【０００３】文献１でブレナーらは以下のように順次、
上記の酵素反応と化学反応を行っている；１：Ｔ４ Ｄ
ＮＡポリメラーゼによるギャップの修復、２：プロナー
ゼによるＴ４ ＤＮＡポリメラーゼの分解、３：Ｔ４
ＤＮＡリガーゼによるニックの連結、４：プロナーゼに
よるＴ４ ＤＮＡリガーゼの分解、５：ＤｐｎＩＩによ
るマイクロビーズに共有結合した蛍光基を含むＤＮＡ断
片の除去、６：プロナーゼによるＤｐｎＩＩの分解、
７：ホスファターゼによる５’リン酸基の除去、８：Ｔ
４ ＤＮＡリガーゼによる蛍光基を持つアダプターの連
結、９：プロナーゼによるホスファターゼとＴ４ ＤＮ
Ａリガーゼの分解、１０：Ｔ４ポリヌクレオチドキナー
ゼによるニック部位の５’−リン酸化とＴ４ ＤＮＡリ
ガーゼによるニックの連結、１１：プロナーゼによるＴ
４ポリヌクレオチドキナーゼとＴ４ＤＮＡリガーゼの分
解、１２：ＮａＯＨによる標的ＤＮＡの１本鎖化。

【０００４】また、ブレナーらの別の文献、ネイチャー
バイオテクノロジー（Nature Biotechnology、第１８
巻、第６３０〜６３４頁、２０００年；以下、文献２と
呼ぶ）によれば、上記工程５のＤｐｎＩＩ反応に続いて
以下の反応を順次行っている；６’：ｄＧＴＰ存在下、
Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼによるＤｐｎＩＩ消化末端の
改変、７’：Ｔ４ ＤＮＡリガーゼによるアダプターの
連結。しかしながらこの場合には、その後の標的ＤＮＡ
塩基配列決定の過程で２本鎖ＤＮＡが固定されたマイク
ロビーズを使用するので標的ＤＮＡの１本鎖化は行って
いない。

【０００５】以上のように、上記ブレナーらの方法によ
れば、マイクロビーズ上のアンチタグ配列と標的ＤＮＡ
との間に共有結合を形成させる過程でＴ４ ＤＮＡポリ
メラーゼ、複数のプロテアーゼの組成物であるプロナー
ゼ、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ及びプロナーゼの４段階の酵
素反応を必要とする。この一連の反応は、操作が煩雑で
あるのみならず反応効率がおおよそ６０％程度であり、
３０％を下回ることもまれではなかった。更に、プロナ
ーゼ反応後にプロナーゼを完全に洗い流さなければ、以
後の酵素反応に重大な悪影響を及ぼす恐れがあった。以
上の理由から、マイクロビーズ上のアンチタグ配列と標
的ＤＮＡとの間に共有結合を形成させるための簡便かつ
高効率な方法が望まれていた。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、ＤＮ
Ａマイクロビーズアレイ作製時にマイクロビーズに結合
したアンチタグ配列と標的ＤＮＡとの間に共有結合を形
成させる過程において、該反応の効率向上、操作の簡略
化及び不完全なプロテアーゼ除去による次工程の反応効
率低下の危険を低減する手段を提供することにある。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは鋭意検討を
重ねた結果、上記過程においてＤＮＡポリメラーゼ、例
えばＴ４ ＤＮＡポリメラーゼとＤＮＡリガーゼ、例え
ばＴ４ ＤＮＡリガーゼを同時に反応させることによっ
て操作が簡略化できることを見出した。さらに、上記方
法によって反応効率が飛躍的に向上することを見出して
本発明を完成させた。

【０００８】本発明を概説すれば、本発明の第１の発明
は、ＤＮＡマイクロビーズアレイ作製時に、固定化すべ
きＤＮＡとマイクロビーズ上のアンチタグＤＮＡとの間
に共有結合を形成させる工程において、ＤＮＡポリメラ
ーゼとＤＮＡリガーゼを同時に反応させることを特徴と
するＤＮＡ固定化法に関する。

【０００９】本発明の第１の発明において使用されるＤ
ＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ合成活性及び５'→３'エキ
ソヌクレアーゼ活性及び／又は３'→５'エキソヌクレア
ーゼ活性を実質的に有するＤＮＡポリメラーゼであるも
のが好適に使用できる。また、本発明の第１の発明にお
いて使用されるＤＮＡポリメラーゼは、特に限定はされ
ないが、例えばＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌由来
ＤＮＡポリメラーゼＩ、大腸菌由来ＤＮＡポリメラーゼ
Ｉ クレノウフラグメント、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラー
ゼ及びＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼからなる群より選択
される１以上のＤＮＡポリメラーゼであることが好まし
い。

【００１０】本発明の第１の発明において使用されるＤ
ＮＡリガーゼは、特に限定はされないが例えば、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼ、大腸菌由来ＤＮＡリガーゼ及びＴａｑ
ＤＮＡリガーゼからなる群より選択される１以上のＤ
ＮＡリガーゼが好適に使用できる。

【００１１】本発明の第１の発明において使用されるＤ
ＮＡポリメラーゼとＤＮＡリガーゼの濃度は、特に限定
はされないが例えば、反応液１ｍｌあたり、２０〜２０
００Ｕ：２００〜５００００Ｕの比率であることが好ま
しい。

【００１２】本発明の第２の発明は、本発明の第１の発
明のＤＮＡ固定化法により調製されたＤＮＡマイクロビ
ーズアレイに関する。

【００１３】

【発明の実施の形態】以下、本発明を具体的に説明す
る。本明細書においてＤＮＡマイクロビーズアレイ技術
とは、文献１と文献２でブレナーらが報告している技術
及びそれと実質的に同等な技術を意味する。即ち、マイ
クロビーズに結合したアンチタグ配列と標的ＤＮＡに結
合したタグ配列との間のハイブリダイゼーションによっ
て特定の標的ＤＮＡを特定のマイクロビーズ上に配置
し、標的ＤＮＡが固定されたマイクロビーズのライブラ
リーを作製する技術である。この時、１個のマイクロビ
ーズ上には単一の標的ＤＮＡが固定される。

【００１４】マイクロビーズの材質には特に限定はな
く、使用目的によって異なるが、例えばガラス、低架橋
ポリスチレン、高架橋ポリスチレン、グリシダルメタク
リレート、磁性体等が挙げられる。また、マイクロビー
ズのサイズにも特に限定はなく、使用目的によって異な
るが、例えば直径が１μｍ〜１００μｍであればよい。

【００１５】本明細書において１本鎖タグとは、特表平
１０−５０７３５７号公表公報（以下、文献３と呼ぶ）
で開示されているオリゴヌクレオチドタグを意味する。

【００１６】本明細書においてアンチタグとは、１本鎖
タグに完全に相補的なオリゴヌクレオチドを意味する。
１本鎖タグとアンチタグがアニールして２本鎖になった
ものをタグまたは２本鎖タグと呼ぶ。

【００１７】１本鎖タグ、アンチタグ、タグ及び２本鎖
タグは他の分子と共有結合していないオリゴヌクレオチ
ドであってもよいし、他のＤＮＡ、マイクロビーズ、蛍
光物質、その他の分子と共有結合したものであってもよ
い。また、塩基の一部または全部が修飾塩基、特に限定
はされないが例えば５−メチルシトシン、７−デアザグ
アニン、６−メチルアデニンで置換されていてもよい。

【００１８】本明細書においてタグ配列とは、上記１本
鎖タグあるいはアンチタグとして用いられるオリゴヌク
レオチドの配列のことを意味し、その構造に特に限定は
ないが、例えば３〜６塩基のオリゴヌクレオチドからな
るサブユニットを複数個含むものが挙げられる。特に限
定はされないが、例えばアンチタグ配列の一例は、文献
１に記載されているものが好適に使用できる。即ち、Ｔ
ＴＡＣ、ＡＡＴＣ、ＴＡＣＴ、ＡＴＣＡ、ＡＣＡＴ、Ｔ
ＣＴＡ、ＣＴＴＴ及びＣＡＡＡのいずれかから選択され
るワード（ｗｏｒｄ、文献３におけるサブユニットに相
当する）が８個連結した３２塩基からなるオリゴヌクレ
オチドで、８^８＝約１７００万種類の配列からなる。ま
た、上記１本鎖タグは、このアンチタグに相補的な３２
塩基のオリゴヌクレオチドであり、アンチタグと同様に
約１７００万種類の配列からなる。さらに上記１本鎖タ
グのいずれかと、それと完全に相補的な配列を有するア
ンチタグがアニールしたものが２本鎖タグであり、３２
塩基対の２本鎖オリゴヌクレオチドである。これも同様
に約１７００万種類の配列からなる。

【００１９】本明細書において標的ＤＮＡとは、マイク
ロビーズに固定しようとするＤＮＡ及び固定された後の
ＤＮＡを意味し、その由来に限定はない。例えば、動
物、植物、真核微生物、原核微生物、ウイルス等が挙げ
られる。また、標的ＤＮＡの調製法に限定はなく、ゲノ
ムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、ＰＣＲ産物、これら
の制限酵素断片、これらを物理的または化学的に処理し
たもののいずれもが好適に使用できる。すなわち、本発
明に使用するＤＮＡマイクロビーズアレイに固定化でき
るものであれば、天然由来のＤＮＡあるいは人工的に調
製したＤＮＡのいずれもが標的ＤＮＡとして好適に使用
できる。

【００２０】本明細書においてＤＮＡマイクロビーズア
レイとは、ＤＮＡマイクロビーズアレイ技術によって作
製した、標的ＤＮＡが共有結合により固定されたマイク
ロビーズの集合体のことを意味する。当該集合体の形態
としては、特に限定はされないが例えば、ＨＬ−６０細
胞で発現している実質的にすべてのｍＲＮＡから調製し
たｃＤＮＡの制限酵素断片を固定したマイクロビーズの
集合体が挙げられる。

【００２１】本明細書において固定化すべきＤＮＡと
は、２本鎖の標的ＤＮＡに１本鎖タグが共有結合したも
ののことを言い、これに更に例えば６−カルボキシルフ
ルオレセイン（ＦＡＭ）等の蛍光物質、ビオチン、ジゴ
キシゲニン等のハプテンといったＤＮＡ以外の物質が共
有結合していてもよい。本発明の方法において、固定化
すべきＤＮＡの密度は、５μｍのマイクロビーズを用い
る場合、マイクロビーズ１個あたり好ましくは１０^３〜
１０^６分子、さらに好ましくは１０^４〜１０^５分子であ
る。

【００２２】本発明に使用されるＤＮＡポリメラーゼ
は、鋳型ＤＮＡに相補的なＤＮＡ合成活性を持つもので
あれば特に限定はなく、ＤＮＡ合成活性のみを持つもの
に加えて、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性及び／ま
たは３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を持っているも
のも好適に使用できる。上記酵素活性を有するＤＮＡポ
リメラーゼであれば、天然由来あるいは変異体のいずれ
もが好適に使用できる。例えばＴ４ ＤＮＡポリメラー
ゼ、大腸菌由来ＤＮＡポリメラーゼＩ、大腸菌由来ＤＮ
ＡポリメラーゼＩ クレノウフラグメント等の常温性酵
素やＴａｑ（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）、
Ｐｆｕ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）等
の好熱菌由来ＤＮＡポリメラーゼが好適に使用できる。
また、本発明の方法において使用されるＤＮＡポリメラ
ーゼの反応時の濃度はＴ４ ＤＮＡポリメラーゼを用い
る場合、特に限定はされないが例えば、Ｎｅｗ Ｅｎｇ
ｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社カタログ（２０００−２０
０１；ｐ８３）に記載の条件に基づくＵ数表示で、好ま
しくは２０〜２０００Ｕ／ｍｌ、さらに好ましくは１０
０〜５００Ｕ／ｍｌである。

【００２３】本発明に使用されるＤＮＡリガーゼは、２
本鎖ＤＮＡのニックを連結できるものであれば良く、例
えばＴ４ ＤＮＡリガーゼ、大腸菌ＤＮＡリガーゼ、Ｔ
ａｑ（Ｔ．ａｑｕａｔｉｃｕｓ） ＤＮＡリガーゼが好
適に使用できる。また、本発明の方法において使用され
るＤＮＡリガーゼの濃度はＴ４ ＤＮＡリガーゼを用い
る場合、特に限定はされないが例えば、Ｎｅｗ Ｅｎｇ
ｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社カタログ（２０００−２０
０１；ｐ９４）に記載の条件に基づくＵ数表示で、好ま
しくは２００〜５００００Ｕ／ｍｌ、さらに好ましくは
１０００〜１００００Ｕ／ｍｌである。

【００２４】本発明の方法においてＤＮＡポリメラーゼ
とＤＮＡリガーゼを作用させるときの反応組成には特に
限定はなく、両酵素が活性を示す組成であればよい。例
えば、ＭｇＣｌ_２、ＮａＣｌ、ＤＴＴ、Ｔｗｅｅｎ ２
０を含むｐＨ中性付近の緩衝液が好適に使用できる。こ
の緩衝液にＤＮＡポリメラーゼの基質としてｄＡＴＰ、
ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰのうち少なくとも１種
類、好ましくは４種類すべてを添加する。これらのヌク
レオチドの一部または全部が、例えば５−メチルｄＣＴ
Ｐ、７−デアザｄＧＴＰ、６−メチルｄＡＴＰのような
修飾塩基を含むヌクレオチドであってもよい。これに加
えてＤＮＡリガーゼ反応に必要なＡＭＰ供与体を加え
る。ＡＭＰ供与体はＤＮＡリガーゼの種類によって適宜
選択すればよく、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼの場合にはＡＴ
Ｐが、大腸菌ＤＮＡリガーゼの場合にはニコチンアミド
アデニン ジヌクレオチド（ＮＡＤ）が好適に使用で
きる。

【００２５】本発明の方法においてＤＮＡポリメラーゼ
とＤＮＡリガーゼの反応時間と反応温度に特に限定はな
く、使用するＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡリガーゼの種
類とこれらの濃度、及び基質となるマイクロビーズ上の
標的ＤＮＡ濃度によって異なるので適宜設定すればよ
い。例えば２００Ｕ／ｍｌのＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ
と４０００Ｕ／ｍｌのＴ４ ＤＮＡリガーゼを使用して
１００μｌの反応液中で２００万個のマイクロビーズに
対して反応を行う場合、反応時間は好ましくは１０分〜
５時間、さらに好ましくは３０分〜２時間であり、反応
温度は好ましくは０〜３７℃、さらに好ましくは５〜２
０℃である。

【００２６】本発明に使用されるプロテアーゼは、ＤＮ
Ａポリメラーゼ、ＤＮＡリガーゼ及びＤｐｎＩＩを完全
に或は部分的に分解してこれらの酵素活性を失わせるも
のであれば特に限定はなく、例えば、プロナーゼ、プロ
テイナーゼＫ、トリプシン、キモトリプシン等が好適に
使用できる。特に本発明においては、プロナーゼが好適
である。また、本発明の方法において使用されるプロテ
アーゼの濃度は使用するプロテアーゼの種類によって適
宜設定すればよいが、例えばプロナーゼを使用する場
合、好ましくは１０〜２０００μｇ／ｍｌ、さらに好ま
しくは５０〜５００μｇ／ｍｌである。さらに、本発明
の方法において反応時間と反応温度も使用するプロテア
ーゼの種類によって適宜設定すればよいが、例えばプロ
ナーゼを使用する場合、反応時間は好ましくは１０分〜
５時間、さらに好ましくは３０分〜２時間であり、反応
温度は好ましくは１０〜５０℃、さらに好ましくは２０
〜４０℃である。

【００２７】本発明のＤＮＡ固定化法の対象となる、標
的ＤＮＡがハイブリダイゼーションによって結合したマ
イクロビーズは、例えば、以下の方法で調製することが
できる。以下に本発明の方法の一態様を示す。また、本
発明のＤＮＡ固定化法は、他の方法で作製された上記標
的ＤＮＡ結合マイクロビーズにも適用できる。

【００２８】まず、マイクロビーズ上に、ＰＣＲプライ
マー結合配列に続いてアンチタグ配列をホスホアミダイ
ト法により合成する。この時、１個のマイクロビーズ上
には単一の配列のアンチタグを合成し、しかも多種類
（例えば約１７００万種類）のアンチタグ付きマイクロ
ビーズの集合体を得る必要があることから「ミックスア
ンド ディバイド」合成法により行う。

【００２９】上記マイクロビーズの一部には更にＰＣＲ
プライマー結合配列を付加し、アンチタグをはさむプラ
イマーを用いたＰＣＲにより２本鎖タグを増幅する。増
幅した２本鎖タグ混合物をプラスミドベクターに連結
し、２本鎖タグが挿入された、約１７００万種類のプラ
スミド混合物（タグベクターと呼ぶ）を得る。

【００３０】以下、動物細胞由来のｃＤＮＡが固定され
たマイクロビーズアレイの作製を例として説明する。ま
ず、動物細胞から調製したｍＲＮＡを鋳型にしてｃＤＮ
Ａを合成し、２本鎖ｃＤＮＡの制限酵素断片をタグベク
ターに挿入してｃＤＮＡライブラリーを作製する。この
場合、２本鎖ｃＤＮＡの制限酵素断片が標的ＤＮＡであ
る。このプラスミド混合物を鋳型にして標的ＤＮＡ及び
２本鎖タグを含む領域をＰＣＲにより増幅する。このと
き標的ＤＮＡ側のプライマーは５’末端が適切な標識化
合物、例えば６−カルボキシルフルオレセイン（ＦＡ
Ｍ）などの蛍光物質で標識されたものを用いてもよい。
また、他の標識化合物としては、例えばＣｙ５、Ｃｙ
３、ビオチン、ジゴキシゲニンが好適に使用できる。非
蛍光性の標識化合物を用いる場合には標識化合物に親和
性を持つ蛍光化合物、例えばビオチンで標識した場合に
は蛍光標識したアビジンを使用することによって標的Ｄ
ＮＡに蛍光物質を結合させることができる。

【００３１】次に、ＰＣＲ法によって得られた増幅ＤＮ
Ａ断片より、制限酵素処理によって２本鎖タグ側のプラ
イマー配列を除去し、ｄＧＴＰ存在下Ｔ４ ＤＮＡポリ
メラーゼ処理で２本鎖タグの一方のストランドを分解す
ることによって１本鎖タグが結合した２本鎖ｃＤＮＡを
得る。

【００３２】１本鎖タグが結合した２本鎖標的ＤＮＡと
アンチタグ付きのマイクロビーズ集合体とを混合してハ
イブリダイゼーションを行う。非特異的に吸着した標的
ＤＮＡを洗浄、除去した後、上記のハイブリダイゼーシ
ョン混合物をセルソーターに供し、標的ＤＮＡが結合し
て蛍光を発するマイクロビーズを分取する。

【００３３】こうして得られた、ハイブリダイゼーショ
ンにより標的ＤＮＡが結合したマイクロビーズ上の標的
ＤＮＡとアンチタグとの間に共有結合を以下の方法によ
り形成させる。すなわち本発明の方法は、２工程からな
る；１：４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸混合物
とＡＴＰの存在下、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼとＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼを同時に作用させてギャップの修復と共有
結合の形成を同時に行う、２：プロテアーゼ処理によっ
てＴ４ ＤＮＡポリメラーゼとＴ４ ＤＮＡリガーゼを
分解する。デオキシヌクレオシド三リン酸のいずれかま
たはすべてが例えば５−メチルｄＣＴＰ、７−デアザｄ
ＧＴＰ、６−メチルｄＡＴＰのような修飾ヌクレオチド
であってもよい。

【００３４】共有結合形成反応効率は、共有結合形成反
応終了後のマイクロビーズの熱処理を行わないもの（試
料Ａ）と熱処理を行ったもの（試料Ｂ）の蛍光強度をフ
ローサイトメーターを用いて測定し、下記の数式によっ
て算出することができる。

【００３５】共有結合形成反応効率（％）＝（試料Ｂの
蛍光強度の平均）／（試料Ａの蛍光強度の平均）×１０
０

【００３６】タグとアンチタグの間の、ハイブリダイゼ
ーションによる結合が解離する限り、熱処理の条件に限
定はない。例えば、１ｍＭ ＥＤＴＡと０．０１％ Ｔ
ｗｅｅｎ ２０を含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝
液（ｐＨ８．０）中では５０℃〜１００℃、好ましくは
６０℃〜９０℃、更に好ましくは７０℃〜８０℃で熱処
理すればよい。

【００３７】本発明の方法は、文献１記載の方法に比較
すると、その工程数が少ないために操作が簡便である上
に操作中のマイクロビーズの欠減を少なくすることがで
きる。さらに、従来の共有結合形成反応効率が通常６０
％〜７０%程度であり、しばしば３０％を下回ることが
あるのに対して、本発明の方法において共有結合形成反
応効率は、通常８０％以上、好適には９０％以上の範囲
であり、当該反応効率は高く、従来法に比べて再現性も
高い。

【００３８】マイクロビーズに固定された標的ＤＮＡ
を、核酸を含有する試料とのハイブリダイゼーションに
使用するためには例えば文献１に記載の以下の反応を行
って１本鎖標的ＤＮＡが固定されたマイクロビーズを調
製すればよい。１：マイクロビーズに共有結合した蛍光
基を含むＤＮＡ断片のＤｐｎＩＩによる除去、２：プロ
テアーゼによるＤｐｎＩＩの分解、３：ｄＧＴＰ存在
下、ＤＮＡポリメラーゼＩラージフラグメントによるＤ
ｐｎＩＩ消化末端の改変、４：プロテアーゼによるＤＮ
ＡポリメラーゼＩ ラージフラグメントの分解、５：Ｔ
４ ＤＮＡリガーゼによるアダプターの連結、６：プロ
テアーゼによるＴ４ ＤＮＡリガーゼの分解、７：Ｎａ
ＯＨによる標的ＤＮＡの１本鎖化。

【００３９】アダプター連結反応効率は、プロテアーゼ
（例えばプロナーゼ）によるＴ４ＤＮＡリガーゼ分解反
応終了後のマイクロビーズ（試料Ｃ）の蛍光強度をフロ
ーサイトメーターを用いて測定し、下記の式によって算
出することができる。

【００４０】アダプター連結反応効率（％）＝（試料Ｃ
の蛍光強度の平均）／（上記試料Ａの蛍光強度の平均）
×１００

【００４１】さらに、標的ＤＮＡ１本鎖化効率は、Ｎａ
ＯＨによる標的ＤＮＡの１本鎖化終了後のマイクロビー
ズ（試料Ｄ）の蛍光強度をフローサイトメーターを用い
て測定し、下記の式によって算出することができる。

【００４２】標的ＤＮＡ１本鎖化効率（％）＝｛１−
（試料Ｄの蛍光強度の平均）／（試料Ｃの蛍光強度の平
均）｝×１００

【００４３】文献１に記載の方法において、上記アダプ
ター連結反応効率と標的ＤＮＡ１本鎖化効率はともに通
常９０％前後である。本発明者らは、上記の一連の反応
からプロナーゼによるＤＮＡポリメラーゼＩ ラージフ
ラグメントの分解反応を省略してもアダプター連結反応
効率と標的ＤＮＡ１本鎖化効率は同等であることを見出
した。

【００４４】当該プロテアーゼ反応を行った場合、反応
後にプロテアーゼを完全に除去しなければ次の酵素反応
に重大な悪影響を及ぼす。従って懸濁、遠心分離、上清
の除去による洗浄を繰り返す必要があり、これはマイク
ロビーズの欠減につながる。従って、本発明の方法によ
り、当該プロテアーゼ処理を省略することができること
から、工程の簡略化のみならずマイクロビーズ欠減率の
改善、不完全なプロテアーゼ除去による次の酵素反応効
率を向上させることができる。

【００４５】本発明のＤＮＡマイクロビーズアレイは上
記の本発明のＤＮＡ固定化法を用いて調製される。本発
明のＤＮＡマイクロビーズアレイは高効率な反応によっ
て調製されるので、１個のマイクロビーズに固定化され
る標的ＤＮＡモル数が従来のマイクロビーズアレイに比
べて多い。従って、文献１の方法で遺伝子発現解析を行
う場合には競合ハイブリダイゼーション後のビーズ１個
あたりの蛍光強度が大きく、より正確なソーティングを
行うことができる。また、文献２の方法で塩基配列の解
析を行う場合にはビーズ１個あたりの蛍光強度が大きい
ことによりＳ／Ｎ比の増大、ひいては解析できる塩基数
を増加させることができ、その結果、１回の解析で得ら
れる配列数を増加させることができる。

【００４６】

【実施例】以下、本発明を実施例により具体的に説明す
るが、本発明の範囲はこれら実施例に限定されるもので
はない。

【００４７】参考例１ １本鎖タグ付き標的ＤＮＡとマ
イクロビーズ上のアンチタグとのハイブリダイゼーショ
ン 文献１の方法に従ってアンチタグ付きマイクロビーズを
調製した。ヒト前骨髄性白血病細胞株ＨＬ−６０（ＡＴ
ＣＣ ＣＣＬ−２４０）を１０％ウシ胎児血清を含むＲ
ＰＭＩ１６４０培地で培養の後に遠心分離によって細胞
を集め、トリゾール試薬（ギブコ社製）を用いて全ＲＮ
Ａを調製した。オリゴテックス^ＴＭ−ｄＴ３０（宝酒造
社製）を用いて全ＲＮＡからｍＲＮＡを精製した。この
ｍＲＮＡを鋳型として文献１の方法でｃＤＮＡを合成
し、タグベクターに挿入して１４万〜１８万クローンか
らなるプラスミドプール６個を調製した。このプラスミ
ドプールを鋳型にして文献１の方法でＰＣＲ、制限酵素
ＰａｃＩ（ニュー イングランド バイオラブズ〔ＮＥ
Ｂ〕社製）による消化及びＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ
（ＮＥＢ社製）によるタグ部分の１本鎖化を行った。

【００４８】１億４４００万個のアンチタグ付きマイク
ロビーズと３００μｇの１本鎖タグを持つｃＤＮＡを混
合し、４００μｌのハイブリダイゼーション緩衝液（１
０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）、０．５Ｍ Ｎａ
Ｃｌ、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ ２０、１．２％ デキ
ストラン硫酸）中で振盪しながら７２℃で３日間ハイブ
リダイゼーションを行った。遠心分離によってマイクロ
ビーズを集め、５００μｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ（ｐＨ７．９）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、５０ｍＭ
ＮａＣｌ、１ｍＭ ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、
０．０１％ Ｔｗｅｅｎ ２０に懸濁して振盪しながら
６４〜７０℃で３０分間洗浄を行った。この洗浄操作を
数回繰り返した後に６プール分のマイクロビーズを集
め、ＭｏＦｌｏサイトメーター（サイトメーション社
製）を用いてＦＡＭの蛍光強度が大きい方から１％のマ
イクロビーズを分取した。以上の操作によって、ｃＤＮ
Ａがハイブリダイゼーションによって結合した約６００
万個のマイクロビーズを得た。

【００４９】実施例１ ＤＮＡリガーゼとＤＮＡポリメ
ラーゼの同時反応 （１）ブレナーらの方法にしたがって以下の反応を行っ
た。参考例で調製した、ｃＤＮＡがハイブリダイゼーシ
ョンによって結合したマイクロビーズ２００万個を１０
０μｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９）、
１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ
ＤＴＴ、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ ２０、各０．１ｍＭ
のｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、５−メチルｄＣＴＰ
に懸濁し、２０ＵのＴ４ ＤＮＡポリメラーゼを添加し
て振盪しながら１２℃で３０分間反応させた。

【００５０】遠心分離によってマイクロビーズを集め、
０．０１％Ｔｗｅｅｎ ２０を含むリン酸緩衝食塩水５
００μｌで洗浄した後、プロナーゼ反応液（０．１４ｍ
ｇ／ｍｌ プロナーゼ、１ｍＭ ＣａＣｌ_２を含むリン
酸緩衝食塩水）に懸濁し、振盪しながら３７℃で１時間
反応させた。遠心分離により上清を捨て、１ｍｌの１０
ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、１ｍＭ
ＥＤＴＡ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ ２０に懸濁した。
この遠心上清除去と懸濁の操作をさらに２回繰り返すこ
とによって、プロナーゼが除去されたマイクロビーズ懸
濁液を得た。本段落の操作を以下「プロナーゼ処理」と
呼ぶ。

【００５１】このマイクロビーズを１００μｌの１０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９）、１０ｍＭ Ｍｇ
Ｃｌ_２、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ、０．０
１％Ｔｗｅｅｎ ２０、１ｍＭ ＡＴＰに懸濁し、４０
０ＵのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ社製）を添加して
振盪しながら３７℃で１時間反応させた後にプロナーゼ
処理を行った。

【００５２】こうして得られたマイクロビーズ懸濁液２
μｌを３００μｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液
（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０１％ Ｔｗ
ｅｅｎ ２０に加えたものを２個用意した。一方は熱処
理を行わずに（試料Ａ）、他方は振盪しながら７２℃で
３０分間反応させた後（試料Ｂ）、コールター エピッ
クス ＸＬ（ベックマン・コールター社製）でマイクロ
ビーズがもつＦＡＭの蛍光強度分布を測定した。下記の
式で共有結合形成反応効率を算出した。

【００５３】共有結合形成反応効率（％）＝（試料Ｂの
蛍光強度の平均）／（試料Ａの蛍光強度の平均）×１０
０

【００５４】その結果、文献１に記載の従来法による共
有結合形成反応効率は４２．１％であった。

【００５５】（２）参考例で調製したｃＤＮＡがハイブ
リダイゼーションによって結合したマイクロビーズ２０
０万個を１００μｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ７．９）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、５０ｍＭ ＮａＣ
ｌ、１．４ｍＭ ＤＴＴ、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ ２
０、各０．１ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、５
−メチルｄＣＴＰ、１ｍＭ ＡＴＰに懸濁し、２０Ｕの
Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼと４００ＵのＴ４ ＤＮＡリ
ガーゼを添加して振盪しながら１２℃で２時間反応させ
た。続いてプロナーゼ処理を行い（プロナーゼ処理
１）、実施例１−（１）に記載の方法で共有結合形成反
応効率を測定した。

【００５６】その結果、共有結合形成反応効率は８８．
９％であった。実施例１−（１）に記載の従来法に比べ
て、ＤＮＡポリメラーゼとＤＮＡリガーゼを同時に反応
させることにより共有結合形成反応効率が約２倍に上昇
した。

【００５７】実施例２ プロナーゼ反応の省略 （１）ブレナーらの方法にしたがって以下の反応を行っ
た。実施例１−（２）でＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ及び
Ｔ４ ＤＮＡ リガーゼに続いてプロナーゼで処理した
マイクロビーズを遠心分離によって集め、５００μｌの
ＤｐｎＩＩ緩衝液（５０ｍＭ Ｂｉｓ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ（ｐＨ６．０）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍＭ Ｄ
ＴＴ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ
２０）に懸濁し、遠心分離して上清を除いた。これを
１００μｌのＤｐｎＩＩ緩衝液に懸濁して１５０ＵのＤ
ｐｎＩＩ（ＮＥＢ社製）を加え、振盪しながら３７℃で
１晩反応させた。次いでこのマイクロビーズに対してプ
ロナーゼ処理を行った（プロナーゼ処理２）。

【００５８】次いで遠心分離によってマイクロビーズを
集め、５００μｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
７．５）、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、７．５ｍＭ ＤＴＴ、
０．０１％ Ｔｗｅｅｎ ２０に懸濁し、遠心分離して
上清を除いた。これを１００μｌの０．０３３ｍＭ ｄ
ＧＴＰを含む上記緩衝液に懸濁し、１０ＵのＤＮＡポリ
メラーゼＩ ラージフラグメント（ＮＥＢ社製）を加え
て振盪しながら２５℃で１５分間反応させた。このマイ
クロビーズに対してプロナーゼ処理を行った（プロナー
ゼ処理３）。

【００５９】続いて遠心分離によってマイクロビーズを
集め、５００μｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
７．９）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍＭ ＤＴＴ、
０．０１％ Ｔｗｅｅｎ ２０に懸濁し、遠心分離して
上清を除いた。これを１００μｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ（ｐＨ７．９）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍ
Ｍ ＤＴＴ、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ ２０、１ｍＭ
ＡＴＰ、５μＭ アダプターに懸濁し、２０００ＵのＴ
４ ＤＮＡリガーゼを加えて振盪しながら１６℃で１晩
反応させた。なお、この反応に用いたアダプターは配列
表の配列番号１で表される合成ＤＮＡと配列表の配列番
号２で表される合成ＤＮＡをアニールさせたものであ
り、配列表の配列番号２で表される合成ＤＮＡの３’末
端には２個のスペーサーを介して、６−カルボキシフル
オレセイン（ＦＡＭ）が付加されている。このマイクロ
ビーズに対してプロナーゼ処理を行った（プロナーゼ処
理４）。スペーサーの構造式を以下に示す。

【００６０】 -O-(CH₂)₂-O-[(CH₂)₂-O]₄-(CH₂)₂-O-POOH-

【００６１】プロナーゼ処理４を行った後のマイクロビ
ーズ懸濁液２μｌを３００μｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０１％
Ｔｗｅｅｎ ２０に加え（試料Ｃ）、コールター エ
ピックス ＸＬでマイクロビーズがもつＦＡＭの蛍光強
度分布を測定した。下記の式でアダプター連結反応効率
を算出した。

【００６２】アダプター連結反応効率（％）＝（試料Ｃ
の蛍光強度の平均）／（実施例１−（２）の試料Ａの蛍
光強度の平均）×１００

【００６３】その結果、ブレナーらの従来法によるアダ
プター連結反応効率は９３．１％であった。

【００６４】プロナーゼ処理４のあとのマイクロビーズ
を遠心分離によって集め、５００μｌのビーズストリッ
ピング溶液（１５０ｍＭ ＮａＯＨ、０．０１％ Ｔｗ
ｅｅｎ ２０）に懸濁した後、遠心分離して上清を除い
た。このマイクロビーズを再度５００μｌのビーズスト
リッピング溶液に懸濁し、室温で１０分間反応させた。
遠心分離により上清を除いたあと、１ｍｌの１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、
０．０１％ Ｔｗｅｅｎ ２０に懸濁した。遠心分離、
上清除去、再懸濁の操作をさらに２回繰り返してマイク
ロビーズ懸濁液を得た。

【００６５】このマイクロビーズ懸濁液２μｌを３００
μｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１
ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ ２０に加え
（試料Ｄ）、コールター エピックス ＸＬでマイクロ
ビーズがもつＦＡＭの蛍光強度分布を測定した。下記の
式で標的ＤＮＡ１本鎖化効率を算出した。

【００６６】標的ＤＮＡ１本鎖化効率（％）＝｛１−
（試料Ｄの蛍光強度の平均）／（試料Ｃの蛍光強度の平
均）｝×１００

【００６７】その結果、ブレナーらの従来法による標的
ＤＮＡ１本鎖化効率は８９．０％であった。

【００６８】（２）実施例２−（１）と同様の操作を行
った。但し、プロナーゼ処理３を行わなかった。その結
果、アダプター連結反応効率は１０３．６％、標的ＤＮ
Ａ１本鎖化効率は８９．２％であった。よって、プロナ
ーゼ処理３を行わない場合でもブレナーらの従来法に従
って操作を行った場合と同等の反応効率が得られた。

【００６９】

【発明の効果】本発明の方法により簡便に、高反応効率
でＤＮＡマイクロビーズアレイを作製することができ
る。本発明の方法によって作製した本発明のＤＮＡマイ
クロビーズアレイを用いれば遺伝子発現解析精度を向上
させることができるとともに、１配列あたり解析できる
塩基数及び１回の配列解析で得られる配列数を増加させ
ることができる。

【００７０】 配列表フリーテキスト SEQ ID NO:1: Designed oligonucleotide for adaptor SEQ ID NO:2: Designed oligonucleotide for adaptor

【００７１】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> TAKARA HOLDINGS INC. <120> Method for immobilizing DNA <130> 183978 <150> JP 2001-164846 <151> 2001-05-31 <160> 2 <210> 1 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide for adaptor <400> 1 gactggcagc tcgt 14 <210> 2 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide for adaptor <400> 2 atcacgagct gccagtc 17

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 峰野 純一 京都府宇治市木幡南山15−78 (72)発明者 加藤 郁之進 京都府宇治市南陵町１−１−150 Ｆターム(参考） 4B024 AA20 CA04 HA12 HA19 4B063 QA01 QA11 QQ42 QR33 QR55 QS25 QS34

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ＤＮＡマイクロビーズアレイ作製時に、
   固定化すべきＤＮＡとマイクロビーズ上のアンチタグＤ
   ＮＡとの間に共有結合を形成させる工程において、ＤＮ
   ＡポリメラーゼとＤＮＡリガーゼを同時に反応させるこ
   とを特徴とするＤＮＡ固定化法。
2. 【請求項２】 使用されるＤＮＡポリメラーゼが、ＤＮ
   Ａ合成活性及び５'→３'エキソヌクレアーゼ活性及び／
   又は３'→５'エキソヌクレアーゼ活性を実質的に有する
   ＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とする請求項１記
   載のＤＮＡ固定化法。
3. 【請求項３】 使用されるＤＮＡポリメラーゼが、Ｔ４
   ＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌由来ＤＮＡポリメラーゼ
   Ｉ、大腸菌由来ＤＮＡポリメラーゼＩ クレノウフラグ
   メント、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ及びＰｆｕ ＤＮ
   Ａポリメラーゼからなる群より選択される１以上のＤＮ
   Ａポリメラーゼであることを特徴とする請求項２記載の
   ＤＮＡ固定化法。
4. 【請求項４】 使用されるＤＮＡリガーゼが、Ｔ４ Ｄ
   ＮＡリガーゼ、大腸菌由来ＤＮＡリガーゼ及びＴａｑ
   ＤＮＡリガーゼからなる群より選択される１以上のＤＮ
   Ａリガーゼであることを特徴とする請求項１〜３のいず
   れか１項に記載のＤＮＡ固定化法。
5. 【請求項５】 使用されるＤＮＡポリメラーゼとＤＮＡ
   リガーゼの濃度が反応液１ｍｌあたり、２０〜２０００
   Ｕ：２００〜５００００Ｕの比率であることを特徴とす
   る請求項１〜４のいずれか１項に記載のＤＮＡ固定化
   法。
6. 【請求項６】 請求項１〜５のいずれか１項に記載のＤ
   ＮＡ固定化法により調製されたＤＮＡマイクロビーズア
   レイ。