JP2002541096A - 医薬組成物および使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 同時の、連続したまたは別々の使用のためのビスホスホネートとマトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤を組合わせで含むが、ただし、ＭＭＰ阻害剤がＴＩＭＰ−２であるとき、ビスホスホネートはイバンドロネートではない医薬組成物が、悪性腫瘍の処置のために、例えば、ビスホスホネートでの処置が増加したＭＭＰ分泌をもたらす、ビスホスホネートでの悪性疾患の処置の間の柔組織転移の発症の阻害のために提供される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本発明は、医薬組成物および使用、特に悪性疾患、特に骨転移または過剰の骨
再吸収の発症が付随した、悪性疾患の予防および処置のために使用する医薬組成
物に関する。

【０００２】 ビスホスホネートは、近年、多発性骨髄腫(ＭＭ)の患者の長期処置に利用可能
になってきている。これらのピロホスフェートアナログは、骨格関連事象の発症
を減少するだけでなく、患者に臨床的利点も提供し、生存率を改善する。ビスホ
スフォネートは、インビボで骨再吸収を阻害できる；ビスホスホネートの治療的
効果は、骨のページェット病、腫瘍誘導高カルシウム血症、および、より最近は
骨転移および多発性骨髄腫(ＭＭ)の治療において証明されている(レビューのた
めに、Fleisch H 1997 Bisphosphonates clinical. In Bisphosphonates in Bon
e Disease. From the Laboratory to the Patient. Eds：The Parthenon Publis
hing Group, New York/London pp68-163参照)。ビスホスホネートが骨再吸収を
阻害する機構はまだ殆ど理解されておらず、試験するビスホスネートによって変
わるように見える。ビスホスホネートは、骨のヒドロキシアパタイト結晶に強く
結合し、骨ターンオーバーおよび再吸収を減少させ、血中におけるヒドロキシプ
ロリンまたはアルカリホスファターゼのレベルを減少させ、加えて、破骨細胞の
活性化および活性の両方を阻害することが示されている。

【０００３】 ＭＭは、骨髄内の悪性プラズマ細胞の増殖および蓄積により特徴付けられるプ
ラズマ細胞悪性腫瘍である。主要な臨床的結果は、病的骨折および骨痛が付随す
る融解性骨病変である。これらの病変は、過剰の骨再吸収に起因し、しばしば高
カルシウム血症を導く。ビスホスホネートは、ＭＭの長期治療に、慣用の化学療
法と組合わせて導入されている。近年、クロドロネートおよびパミドロネートの
ようなビスホスホネートが、融解性骨病変および病的骨折のような骨格関連事象
を減少でき、骨痛を軽減でき、患者の生活の質を改善することが示されている。

【０００４】 腫瘍環境、および特に骨髄間質細胞(ＢＭＳＣ)は、ＭＭ病因およびデキサメタ
ゾンのような処置への耐性の両方に重要な役割を担う。骨髄腫細胞の最も強力な
生存および生育因子であるＩＬ−６は、この腫瘍細胞環境に、特に、パラクリン
ループに従って骨髄腫細胞に応答してＩＬ−６を製造するために誘導されたＢＭ
ＳＣに殆ど由来する。更に、我々は、最近、骨リモデリングおよび腫瘍侵入に重
要な役割を担うマトリックスメタロプロテイナーゼ(ＭＭＰ)もＭＭ病因に関与す
ることを示している。ＭＭＰ−１は中性ｐＨでタイプ１コラーゲンの分解を開始
することが知られている唯一のプロテアーゼである。コラーゲン１は骨マトリッ
クスの主要な成分であり、ＭＭＰ−１によるその分解は、骨再吸収の第１段階を
成す。ＭＭＰ−１による分解の後、変性タイプＩコラーゲンはＭＭＰ−２の基質
となる。更に、ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９(即ち、各々ゼラチナーゼＡおよび
Ｂ)の両方とも、基底膜の主要成分であるコラーゲンIVの分解を担い、腫瘍拡散
に関与する。ＢＭＳＣはＭＭＰ−１(間質性コラゲナーゼ)およびＭＭＰ−２(ゼ
ラチナーゼＡ)を分泌する。加えて、我々は、悪性プラズマ細胞が、プロＭＭＰ
−２からＭＭＰ−２への活性化をでき、またＢＭＳＣと骨髄腫細胞の間の共培養
システムにおけるＭＭＰ−１の製造を上方制御できることを示している。

【０００５】 Teronen et al. (USP 5,652,227)は、ビスホスホネートがＭＭＰにおいて著し
い阻害作用を有し、クロドロネート、エチドロネート、パミドロネートおよびア
レンドロネートを含むビスホスホネートが、患者における病理学的に過剰の哺乳
類コラーゲン分解性酵素活性の、および結合組織マトリックスタンパク質の過剰
な分解の減少のための処置法において、ＭＭＰの阻害剤として使用できるという
、彼らの発見を記載している。他の疾患の中で、ビスホスホネートは癌における
結合組織マトリックスタンパク質の過剰な分解、および結合組織の転移進行の処
置に使用し得ることが示されている。

【０００６】 殆どの場合、癌は原発腫瘍が起こった場所に依存して、特定の臓器への、選択
的な転移の非ランダムパターンを示す。例えば、乳および前立腺癌は骨への拡散
に強い偏好を有することが知られている。

【０００７】 近年、StearnsおよびWang(Invasion Metastasis 1996；16:116-131)は、SCID
マウスに尾静脈を介して静脈内注射したヒトPC-3ML前立腺癌サブクローンの確立
および生育における、アレンドロネートとタキソールの組合わせ作用の試験を記
載している。

【０００８】 アレンドロネートでのSCIDマウスの前処理は、骨転移の確立を一部分遮断し、
腹膜および他の柔組織における腫瘍形成をもたらす；一方、タキソールとのアレ
ンドロネート前処理および投与は、骨髄および柔組織におけるPC-3ML腫瘍の生育
を遮断する。イバンドロネートとタキソールのＭＭＰレベルにおける効果は、ザ
イモグラフィーおよびＭＭＰ−２に特異的な抗体でのELISAにより測定し、アレ
ンドロネートとタキソールは、独立して、一部、インビトロおよびインビボの両
方でPC-3ML細胞によるプロテアーゼの製造および分泌を減少し、タキソールと組
み合わさったアレンドロネートは、ＭＭＰ−２製造および分泌を完全に遮断する
ことが判明した。

【０００９】 Yoneda et al.は、ヒトエストロゲン非依存的乳癌ＭＤＡ−２３１細胞の、雌
ヌードマウスの左心室への接種が骨の溶骨性病変をもたらす、実験モデルを使用
した試験を報告している(J Clin Invest 99:2509-2517)。癌侵襲性を阻害するた
めに、ＭＭＰの天然阻害剤であるＭＭＰ−２の組織阻害剤(ＴＩＭＰ−２)を、Ｍ
ＤＡ−２３１細胞中に過発現させた。再吸収を阻害するために、イバンドロネー
トを毎日皮下的に投与した。ヌードマウスは；(ａ)非トランスフェクトＭＤＡ−
２３１細胞；(ｂ)非トランスフェクトＭＤＡ−２３１細胞およびイバンドロネー
ト；ＴＩＭＰ−２−トランスフェクトＭＤＡ−２３１細胞；または(ｄ)ＴＩＭＰ
−２−トランスフェクトＭＤＡ−２３１細胞およびイバンドロネートのいずれか
を投与された。グループ(ａ)からのマウスにおいて、ラジオグラフは複数の溶骨
性病変を確認した。しかし、グループ(ｂ)またはグループ(ｃ)からのマウスにお
いて、溶骨性病変は著しく減少した。イバンドロネートとＴＩＭＰ−２−トラン
スフェクトＭＤＡ−２３１細胞の両方を投与されたグループ(ｄ)からの動物にお
いて、ラジオグラフで検出可能な溶骨性病変はなかった。

【００１０】 我々は、ＩＬ−１β刺激ＢＭＳＣによるＭＭＰの製造における、ビスホスホネ
ートであるパミドロネートおよびゾレドロネートの効果を試験しており、パミド
ロネートではなく、ゾレドロネートがこれらの細胞によるＭＭＰ−１製造を阻害
することを発見した。しかし、最も驚くべきことに、我々はまたパミドロネート
およびより特には、ゾレドロネートがＢＭＳＣによるＭＭＰ−２分泌の上方制御
を担うことを発見した。このように、先の指摘と全く逆に、ビスホスホネートは
分泌されるＭＭＰ、特にＭＭＰ−２のレベルの減少よりむしろ増加を導き得、腫
瘍細胞拡散および転移の増加した危険性が付随する。

【００１１】 したがって、本発明は、同時の、連続したまたは別々の使用のための組み合わ
せでビスホスホネートとマトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤を含む、悪性
腫瘍の処置のための医薬組成物を提供するが、ただしＭＭＰ阻害剤がＴＩＭＰ−
２であるとき、ビスホスホネートはイバンドロネートではない。

【００１２】 更に、本発明は、医薬の製造のための、悪性疾患の処置のためにビスホスホネ
ートと組合わせて使用するための、ビスホスホネートによりもたらされるＭＭＰ
活性の阻害に使用するための、ＭＭＰ阻害剤の使用を提供するが、ただしＭＭＰ
阻害剤がＴＩＭＰ−２であるとき、ビスホスホネートはイバンドロネートではな
い。

【００１３】 更なる態様において、本発明は、患者に有効量のビスホスホネートと、ビスホ
スホネートによりもたらされるＭＭＰ活性を阻害するのに有効な量のＭＭＰ阻害
剤を患者に投与することを含む、悪性疾患に罹患している患者の処置法を提供す
るが、ただしＭＭＰ阻害剤がＴＩＭＰ−２である場合、ビスホスホネートはイバ
ンドロネートではない。

【００１４】 更に別に、本発明は、ビスホスホネートを悪性疾患の処置に使用したときのビ
スホスホネートによりもたらされるＭＭＰ活性を阻害するためのＭＭＰ阻害剤の
使用を提供するが、ただしＭＭＰ阻害剤がＴＩＭＰ−２である場合、ビスホスホ
ネートはイバンドロネートではない。

【００１５】 本明細書において、“処置”なる用語は予防的または防止的処置、ならびに治
療的または疾患修飾処置の両方を含み、疾患に接触する危険性のある患者の処置
、ならびに疾患に罹患している疑いのある患者、ならびに病気の患者の処置を含
む。

【００１６】 本発明は、一般に、ビスホスホネート処置が指示される悪性疾患の処置に適用
可能である。このように、典型的に、疾患は骨転移または過剰骨再吸収の発症が
付随する悪性疾患である。このような疾患の例は、乳および前立腺癌、多発性骨
髄腫(ＭＭ)、腫瘍誘導高血圧(ＴＩＨ)および類似の疾患および状態である。特に
、本発明は乳癌のような癌に付随する骨転移(ＢＭ)の処置に適用可能である。

【００１７】 本発明の組成物、使用および方法は、ビスホスホネートを骨転移または過剰な
骨再吸収の発症を予防または阻止するために使用する、および(本発明により発
見されたように)ビスホスホネート処置が１個以上の分泌されるＭＭＰ酵素、例
えばＭＭＰ−２のレベルの増加をもたらす、悪性疾患の現存の治療の改善を示す
。ＭＭＰ阻害剤の、ビスホスホネートと組合わせた使用は、簡便にはビスホスホ
ネートでの処理に応答して製造されるＭＭＰ活性、ならびに、もしあれば、悪性
疾患に付随した上昇したＭＭＰレベルを阻害する。有利に、骨転移または過剰な
骨再吸収の発症の阻害と一緒のＭＭＰ活性の全体的阻害は、本発明の組合わせＭ
ＭＰ阻害剤／ビスホスホネート処置により達成され、患者の改善された処置結果
および生活の質を導く。特に、ＭＭＰ活性の阻害は、柔組織への転移の発生の低
い発生率または低い重症度を導き、これは好ましくは改善された患者生存率およ
び／または減少した、化学療法または他の細胞毒性処置のような付加処置の必要
性を導く。

【００１８】 したがって、好ましい態様において、本発明は： ａ)ビスホスホネートでの処置が増加したＭＭＰ分泌をもたらす悪性疾患の処置
の間の柔組織転移の発症の阻害のための、同時に、連続して、または別々に使用
するためのビスホスホネートおよびＭＭＰ阻害剤を組合わせて含む医薬組成物； ｂ)ビスホスホネートでの処置が増加したＭＭＰ分泌をもたらす、ビスホスホネ
ートおよびＭＭＰ阻害剤の組合わせでの悪性疾患の処置の間の柔組織転移を阻害
するための医薬の製造における、ＭＭＰ阻害剤の使用； ｃ)有効量のビスホスホネートおよび有効量のＭＭＰ阻害剤を患者に投与するこ
とを含む、悪性疾患の処置の間の患者における柔組織転移の発症を阻害する方法
を提供する。

【００１９】 本発明の医薬組成物および処置法に使用するビスホスホネートは、典型的に、
１個以上の分泌されるＭＭＰ酵素、例えばＭＭＰ−２のレベルの増加を、ビスホ
スホネートを骨転移または過剰の骨再吸収の発症の予防または阻害に使用する投
与量でもたらし得るものである。

【００２０】 したがって、例えば、本発明での使用に適したビスホスホネートは、以下の化
合物またはそれらの薬学的に許容される塩、またはそれらの水和物を含み得る：
３−アミノ−１−ヒドロキシプロパン−１,１−ジホスホン酸(パミドロン酸(pam
idronic acid))、例えばパミドロネート(ＡＰＤ)；３−(Ｎ,Ｎ−ジメチルアミノ
)−１−ヒドロキシプロパン−１,１−ジホスホン酸、例えばジメチル−ＡＰＤ；
４−アミノ−１−ヒドロキシブタン−１,１−ジホスホン酸(アレンドロン酸)、
例えばアレンドロネート；１−ヒドロキシ−エチデン−ビスホスホン酸、例えば
エチンドロネート；１−ヒドロキシ−３−(メチルペンチルアミノ)−プロピリデ
ン−ビスホスホン酸、イバンドロン酸(ibandronic acid)、例えばイバンドロネ
ート；６−アミノ−１−ヒドロキシヘキサン−１,１−ジホスホン酸、例えばア
ミノ−ヘキシル−ＢＰ；３−(Ｎ−メチル−Ｎ−ｎ−ペンチルアミノ)−１−ヒド
ロキシプロパン−１,１−ジホスホン酸、例えばメチル−ペンチル−ＡＰＤ(＝Ｂ
Ｍ ２１.０９５５)；１−ヒドロキシ−２−(イミダゾール−１−イル)エタン−
１,１−ジホスホン酸；１−ヒドロキシ−２−(３−ピリジル)エタン−１,１−ジ
ホスホン酸(リセドロン酸(risedronic acid))、例えばリセドロネート、そのＮ
−メチルピリジニウム塩、例えば、ＮＥ−１０２４４またはＮＥ−１０４４６の
ようなＮ−メチルピリジニウムヨウジドを含む；１−(４−クロロフェニルチオ)
メタン−１,１−ジホスホン酸(チルドロン酸(tiludronic acid))、例えばチルド
ロネート；３−[Ｎ−(２−フェニルチオエチル)−Ｎ−メチルアミノ]−１−ヒド
ロキシプロパン−１,１−ジホスホン酸；１−ヒドロキシ−３−(ピロリジン−１
−イル)プロパン−１,１−ジホスホン酸、例えばＥＢ １０５３(Leo)；１−(Ｎ
−フェニル−アミノチオカルボニル)メタン−１,１−ジホスホン酸、例えばＦＲ
７８８４４(Fujisawa)；５−ベンゾイル−３,４−ジヒドロ−２Ｈ−ピラゾー
ル−３,３−ジホスホン酸テトラエチルエステル、例えばＵ−８１５８１(Upjohn
)；１−ヒドロキシ−２−(イミダゾ[１,２−ａ]ピリジン−３−イル)エタン−１
,１−ジホスホン酸、例えばＹＭ ５２９；および１,１−ジクロロメタン−１,
１−ジホスホン酸(クロドロン酸)、例えばクロドロネート。

【００２１】 薬学的に許容される塩は、好ましくは塩基との塩、簡便には、アルカリ金属塩
、例えば、カリウムおよび特にナトリウム塩、またはアルカリ土類金属、好まし
くはカルシウムまたはマグネシウム塩を含む、元素周期表のグループＩａ、Ｉｂ
、IIａおよびIIｂ由来の金属塩、およびまたアンモニアまたは有機アミンとのア
ンモニウム塩である。

【００２２】 特に好ましい薬学的に許容される塩は、ビスホスホン酸の酸性水素の１個、２
個、３個または４個、特に１個または２個が、薬学的に許容されるカチオン、特
にナトリウム、カリウムまたはアンモニウムで置換されており、最初の例はナト
リウムである。

【００２３】 薬学的に許容される塩の非常に好ましいグループは、１個の酸性水素および１
個の薬学的に許容されるカチオン、特にナトリウムを各ホスホン酸基に有するこ
とにより特徴付けられる。

【００２４】 上記の全てのビスホスホン酸誘導体は、文献から既知である。これは、その製
造を含む(例えば、EP-A-513760, pp. 13-48参照)。例えば、３−アミノ−１−ヒ
ドロキシプロパン−１,１−ジホスホン酸は、例えば、ＵＳ特許３,９６２,４３
２、ならびにＵＳ特許４,６３９,３３８および４,７１１,８８０に記載のように
製造し、１−ヒドロキシ−２−(イミダゾール−１−イル)エタン−１,１−ジホ
スホン酸は、例えばＵＳ特許４,９３９,１３０に記載のように製造する。

【００２５】 本発明の特定の態様は、３−アミノ−１−ヒドロキシプロパン−１,１−ジホ
スホン酸、３−(Ｎ,Ｎ−ジメチルアミノ)−１−ヒドロキシプロパン−１,１−ジ
ホスホン酸；４−アミノ−１−ヒドロキシブタン−１,１−ジホスホン酸；６−
アミノ−１−ヒドロキシヘキサン−１,１−ジホスホン酸、３−(Ｎ−メチル−Ｎ
−ｎ−ペンチルアミノ)−１−ヒドロキシプロパン−１,１−ジホスホン酸；１−
ヒドロキシ−２−(イミダゾール−１−イル)エタン−１,１−ジホスホン酸；１
−ヒドロキシ−２−(３−ピリジル)エタン−１,１−ジホスホン酸、およびそれ
らのＮ−メチルピリジニウム塩；１−(４−クロロフェニルチオ)メタン−１,１
−ジホスホン酸；３−[Ｎ−(２−フェニルチオエチル)−Ｎ−メチルアミノ]−１
−ヒドロキシプロパン−１,１−ジホスホン酸；１−ヒドロキシ−３−(ピロリジ
ン−１−イル)プロパン−１,１−ジホスホン酸；１−(Ｎ−フェニルアミノチオ
カルボニル)メタン−１,１−ジホスホン酸；５−ベンゾイル−３,４−ジヒドロ
−２Ｈ−ピラゾール−３,３−ジホスホン酸テトラエチルエステル；１−ヒドロ
キシ−２−(イミダゾ[１,２−ａ]ピリジン−３−イル)エタン−１,１−ジホスホ
ン酸；またはそれらの薬学的に許容される塩、およびそれらの水和物からなる群
から選択される、ビホスホン酸誘導体の使用により代表される。

【００２６】 本発明の好ましい態様は、３−アミノ−１−ヒドロキシプロパン−１,１−ジ
ホスホン酸；３−(Ｎ,Ｎ−ジメチルアミノ)−１−ヒドロキシプロパン−１,１−
ジホスホン酸；４−アミノ−１−ヒドロキシブタン−１,１−ジホスホン酸；６
−アミノ−１−ヒドロキシヘキサン−１,１−ジホスホン酸；３−(Ｎ−メチル−
Ｎ−ｎ−ペンチルアミノ)−１−ヒドロキシプロパン−１,１−ジホスホン酸、１
−ヒドロキシ−２−(イミダゾール−１−イル)エタン−１,１−ジホスホン酸；
１−ヒドロキシ−２−(３−ピリジル)エタン−１,１−ジホスホン酸；３−[Ｎ−
(２−フェニルチオ−エチル)−Ｎ−メチルアミノ]−１−ヒドロキシプロパン−
１,１−ジホスホン酸；１−ヒドロキシ−３−(ピロリジン−１−イル)−プロパ
ン−１,１−ジホスホン酸；１−ヒドロキシ−２−(イミダゾ[１,２−ａ]ピリジ
ン−３−イル)エタン−１,１−ジホスホン酸；またはそれらの薬学的に許容され
る塩およびそれらの水和物からなる群から選択されるビホスホン酸誘導体の使用
により代表される。

【００２７】 本発明の非常に好ましい態様は、パミドロン酸、アレンドロン酸、イバンドロ
ン酸、３−(Ｎ−メチル−Ｎ−ｎ−ペンチルアミノ)−１−ヒドロキシプロパン−
１,１−ジホスホン酸；１−ヒドロキシ−２−(イミダゾール−１−イル)−エタ
ン−１,１−ジホスホン酸；レシドロン酸およびチルドロン酸；またはそれらの
薬学的に許容される塩およびそれらの水和物から選択されるビスホスホン酸誘導
体の使用により代表される。

【００２８】 本発明の特に好ましい態様は、１−ヒドロキシ−２−(イミダゾール−１−イ
ル)エタン−１,１−ジホスホン酸および３−アミノ−１−ヒドロキシプロパン−
１,１−ジホスホン酸またはそれらの薬学的に許容される塩およびそれらの水和
物から選択されるビスホスホン酸誘導体の使用により代表される。

【００２９】 更に、本発明は３−アミノ−１−ヒドロキシプロパン−１,１−ジホスホン酸
、またはそれらの薬学的に許容される塩またはそれらの水和物、例えばパミドロ
ン酸二ナトリウムまたはパミドロネートの使用に関する。

【００３０】 更に、本発明は１−ヒドロキシ−２−(イミダゾール−１−イル)エタン−１,
１−ジホスホン酸、またはそれらの薬学的に許容される塩またはそれらの水和物
、例えば、ゾレドロネートの使用に関する。

【００３１】 本発明の医薬組成物および処置法において使用されるＭＭＰ阻害剤は、天然お
よび合成ＭＭＰ阻害剤の両方を含む。このように、ＭＭＰ阻害剤は、天然のメタ
ロプロテイナーゼの組織阻害剤(ＴＩＭＰ)またはＭＭＰ阻害部分またはアナログ
、例えば、ＴＩＭＰ−１、ＴＩＭＰ−２またはそれらの機能的部分またはアナロ
グを含み得る。

【００３２】 簡便には、またＭＭＰ阻害剤は合成ＭＭＰ阻害剤、例えばヒドロキサム酸また
はヒドロキサム酸誘導体ＭＭＰ阻害剤であり得る。このような阻害剤の例は、Br
itish Biotechnology公開国際特許出願ＷＯ９８／５２９１０、ＷＯ９８／４６
５６３、ＷＯ／９８／２４７５９、ＷＯ９８／２３５８８、ＷＯ９７／１９０５
３、ＷＯ９７／０３７８３、ＷＯ９７／１９５０、ＷＯ９６／１６９３１、ＷＯ
９５／１９９６１、ＷＯ９５／１９９５６、ＷＯ９５／０９８４１、ＷＯ９４／
２１６２５、ＷＯ９４／２４１４０、ＷＯ９４／１０９９０、ＷＯ９４／０２４
４７、ＷＯ９４／０２４４６、ＷＯ９３／２００４７、ＷＯ９２／１３８３１、
ＷＯ９０／０５７１９、ＷＯ９０／０５７１６；Hoffmann La Roche公開特許出
願ＥＰ０６８４２４０Ａ１、ＥＰ０５７５８４４Ａ２、ＥＰＯ５７５８４４Ａ２
およびＥＰＯ４９７１９２Ａ２；Syntex公開特許出願ＷＯ９５／１２６０３；Me
rck公開特許出願ＷＯ９７／１１９３６、ＵＳ５４０３９５２、ＷＯ９４／０７
４８１およびＷＯ９３／１４１１２；Glaxo公開出願ＷＯ９４／００１１９およ
びＷＯ９８／３８１７９；Celltech公開出願番号ＷＯ９４／２５４３５、ＷＯ９
４／２５４３４およびＷＯ９３／２４４７５；Immunex公開出願ＷＯ９５／０６
０３１およびＷＯ／９６／４１６２４；Glycomed公開出願ＷＯ９５／１９９６５
；ＥＰＯ６０６０４６Ａ１(Ciba)；Chiroscience公開出願ＷＯ９５／１３２８９
およびＷＯ９７／１７０８８；ＷＯ９６／０２２４０およびＷＯ９７／４３２５
０(SmithKline Beecham)；ＷＯ９７／１５５５３(Sankyo)；ＷＯ９７／４２１６
８およびＷＯ９８／４３９５９(Zeneca)；ＷＯ９５／０９２６０、ＷＯ９５／０
４７１５およびＷ０９７／０９０６６(Kanebo)；ＷＯ９５／０９８３３およびＷ
Ｏ９５／０９２６０(Florida State University)；ＷＯ９５／１５９５９(Scher
ing)；ＷＯ９７／２２５８７、ＷＯ９８／１４４２４およびＷＯ９８／４２６６
２(Novartis)；ＷＯ９７／２４１１７(Rhone-Poulenc Rorer)；ＷＯ９７／４７
５９９およびＷＯ９８／２７０６９(Fujisawa)；ＷＯ９７／４８６８８およびＷ
Ｏ９７／４９６７４、ＷＯ９８／１３３４０、ＷＯ９８／１７６４５およびＷＯ
９８／３１６６４(Pharmacia & Upjohn)；ＷＯ９８／０７６９７、ＷＯ９８／３
０５６６、ＷＯ９８／３３７６８、ＷＯ９８／３４９１５、ＷＯ９８／３４９１
８、ＥＰ０８９５９８８およびＷＯ９９／０７６７５(Pfizer)；ＷＯ９８／０３
１６４、ＷＯ９８／３９３１３、ＷＯ９８／３９３１５、ＷＯ９８／３９３１６
、ＷＯ９８／３９３２６およびＷＯ９８／３９３２９(Monsanto)；ＷＯ９８／０
８８５３、ＷＯ９８／０８８２７、ＷＯ９８／０８８２５、ＷＯ９８／０８８２
３、ＷＯ９８／０８８２２、ＷＯ９８／０８８１５およびＷＯ９９／０９００３
(Procter & Gamble)；ＷＯ９８／０９９５７、ＷＯ９８／０９９４０およびＷＯ
９８／０９９３４(Warner Lambert)；ＷＯ９８／１６５０３、ＷＯ９８／１６５
０６、ＷＯ９８／１６５１４、ＷＯ９８／１６５２０、ＷＯ９８／３７８７７お
よびＷＯ９８／３８１６３(American Cyanamid)；ＷＯ９８／４３９６３、ＷＯ
９８／５０３４８(Agouron)；ＥＰ８７７０１８およびＥＰ８７７０１９(Hoechs
t)；ＷＯ９９／０６４１０(Amgen)に記載されている。

【００３３】 好ましくは、ＭＭＰ阻害剤は、ＭＭＰ−２の阻害剤である。

【００３４】 本発明で使用するのに特に好ましいＭＭＰ阻害は、Ro 32,3555(Trocade)、MMI
270、BB 2516(Marimistat)、RS 1308030、AG 3340、BAY 12,95666、より特には
ＥＰＯ６０６０４６Ａ１(Ciba)、およびＷＯ９７／２２５８７、ＷＯ９８／１４
４２４およびＷＯ９８／４２６６２(Novartis)に記載のＭＭＰ阻害剤、例えば、
MMP 090およびTNF 484、特にMMI270である。

【００３５】 ビスホスホネートおよびＭＭＰ阻害剤(以後、本発明の薬剤と呼ぶ)は、異性体
の形、または適当な場合、異性体の混合物の形、典型的に、エナンチオマーまた
はジアステレオアイソマー、または幾何異性、典型的にcis-trans異性体として
使用し得る。光学異性体は、純粋アンチポードおよび／またはラセミ体として得
る。

【００３６】 本発明の薬剤は、その水和物の形で使用でき、またはその結晶化に使用した他
の溶媒を含むことができる。

【００３７】 本発明の薬剤(ビスホスホネートおよびＭＭＰ阻害剤)は、好ましくは、治療的
有効量の活性成分を、所望により、投与に適した無機または有機、固体または液
体の薬学的に許容される担体と共に、または混合物として含む医薬製剤の形で使
用する。ビスホスホネートおよびＭＭＰ阻害剤活性成分は、同じ医薬組成物中に
存在し得るが、別々の医薬組成物中にあるのが好ましい。このように、活性成分
は同じ時(例えば、同時)または異なった時(例えば、連続的)および、互いに別々
であるか、重なり得る異なる時期に渡り投与し得る。

【００３８】 医薬組成物は、例えば、経口、直腸、エアロゾール吸入または経鼻投与のよう
な経腸組成物、非経腸組成物、例えば、静脈内または皮下投与、または経皮投与
(例えば、受動的またはイオントフォレティック(iontophoretic))のための組成
物であり得る。

【００３９】 好ましくは、医薬組成物は経口または非経腸(特に静脈内または経皮)投与に適
している。静脈内および経口、まず第一に静脈内投与が、特に重要であると考え
られる。好ましくは、ビスホスホネート活性成分は非経腸の形であり、最も好ま
しくは静脈内形である。好ましくは、ＭＭＰ阻害剤は経口形である。

【００４０】 投与の特定の形式および投与量は、特定の患者、特に年齢、体重、ライフスタ
イル、活動レベル、ホルモン状態(例えば、閉経後)および骨鉱物密度を適当に考
慮して、主治医により選択され得る。

【００４１】 本発明の薬剤の投与量は、活性成分の有効性および作用の期間、投与の形態、
温血動物種、および／または性別、年齢、体重、および温血動物の個々の状態の
ような種々の因子に依存し得る。

【００４２】 通常、投与量は、ビスホスホネートおよびＭＭＰ阻害剤活性成分の１回投与量
０.００２−３.４０mg／kg、特に０.０１−２.４０mg／kgが、約７５kgの体重の
温血動物に投与されるようなものである。所望により、この投与量は数回の、所
望により等量の分割投与量も取り得る。

【００４３】 “mg／kg”は、処置する哺乳類−ヒトを含む−の体重kgあたりの医薬mgを意味
する。

【００４４】 上記の投与量−１回(好ましい)または複数回のいずれかで投与−は、例えば、
１日に１回、１週間に１回、１ヶ月に１回、３ヶ月に１回、６ヶ月に１回または
１年に１回、繰り返し得る。言いかえると、医薬組成物は、継続的な毎日の治療
から断続的な臨床治療の範囲のレジメで投与し得る。

【００４５】 好ましくは、ビスホスホネートは、ページェット病、腫瘍誘導高カルシウム血
症または骨粗鬆症のようなビスホスホネート誘導体で伝統的に処置されている疾
患の処置に使用するのと同じ桁である投与量を投与する。言いかえると、好まし
くは、ビスホスホン酸誘導体はページェット病、腫瘍誘導高カルシウム血症また
は骨粗鬆症において治療的に有用であるのと同様の投与量を投与する、即ち、好
ましくは、それらは骨再吸収の阻害に同様に有効である投与量を投与する。

【００４６】 好ましくは、ＭＭＰ阻害剤、例えば、癌処置に伝統的に使用されているのと同
様の投与量を、ビスホスホネートによりもたらされるＭＭＰ活性を阻害するのに
十分な付加的なＭＭＰ阻害剤と共に投与する。

【００４７】 １回投与単位の製剤は、好ましくは約１％から約９０％の活性成分を、そして
１回投与単位ではない製剤は、約０.１％から約２０％の活性成分を含む。カプ
セル、錠剤または糖衣錠のような１回投与単位形は、例えば、約１mgから約５０
０mgの活性成分を含む。

【００４８】 経腸および非経腸投与用医薬製剤は、例えば、糖衣錠、錠剤またはカプセルの
ような投与単位形、およびまたアンプルである。それらはそれ自体既知の方法で
、例えば、慣用の混合、造粒、糖衣、溶解または凍結乾燥工程の手段により製造
する。例えば、経口投与用医薬製剤は、活性成分を固体担体と組合わせ、適当な
場合、得られた混合物を造流し、所望によりまたは必要な場合、適当な添加剤の
添加後、混合物または顆粒を錠剤または糖衣錠コアに加工する。

【００４９】 適当な担体は、特に糖、例えばラクトース、サッカロース、マンニトールまた
はソルビトール、セルロース製剤および／またはリン酸カルシウム、例えば三リ
ン酸カルシウムまたはリン酸水素カルシウム、およびまた例えばコーン、小麦、
コメまたはジャガイモ澱粉を使用した澱粉ペースト、ゼラチン、トラガカント、
メチルセルロースおよび／またはポリビニルピロリドンのような結合剤、および
所望により、上記の澱粉、カルボキシメチル澱粉、架橋ポリビニルピロリドン、
寒天またはアルギン酸もしくはアルギン酸ナトリウムのようなその塩のような崩
壊剤である。添加剤は、特に流動調節剤および滑沢剤、例えば、ケイ酸、タルク
、ステアリン酸またはステアリン酸マグネシウムもしくはカルシウムのようなそ
れらの塩、および／またはポリエチレングリコールである。糖衣錠コアは、とり
わけ、胃液に耐性のコーティングを製造するのに適当な有機溶媒または溶媒混合
物、アセチルセルロースフタレートまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース
フタレートのような適当なセルロース製品の溶液、所望によりアラビアガム、タ
ルク、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコールおよび／または二酸化チ
タンを含む濃縮糖溶液、またはラッカー溶液が使用される、胃液に耐性である適
当なコーティングを備えて提供される。着色物質または色素を、例えば、異なる
量の活性成分の同定の目的で、または指示のために錠剤または糖衣錠コーティン
グに添加し得る。

【００５０】 他の経口投与可能医薬製剤は、ゼラチンから成る乾燥充填カプセル、およびま
たゼラチンと、グリセロールまたはソルビトールのような可塑剤から成る軟、密
封カプセルである。乾燥充填カプセルは、例えば、ラクトースのような充填剤、
澱粉のような結合剤、および／またはタルクまたはステアリン酸マグネシウムの
ような滑剤、および適当な場合、安定化剤との混合物の顆粒の形の活性成分を含
み得る。軟カプセルにおいて、活性成分は好ましくは脂肪油、パラフィン油また
は液体ポリエチレングルコールのような適当な液体に溶解または懸濁し、また安
定化剤の添加も可能である。

【００５１】 非経腸製剤は、特に、静脈内、筋肉内、腹腔内、鼻腔内、皮内または皮下のよ
うな種々の方法で有用な注射用液体である。このような液体は、好ましくは使用
前に、例えば、活性成分単独の、または薬学的に許容される担体を共に含む凍結
乾燥製剤から、使用前に製造できる等張性水溶液または懸濁液である。医薬製剤
は滅菌し得および／または、例えば防腐剤、安定化剤、湿潤剤および／または乳
化剤、溶解剤、浸透圧調整用塩および／または緩衝剤を含み得る。

【００５２】 経皮投与に適した製剤は、有効量の活性成分を担体と共に含む。有利な担体は
、宿主の皮膚を介した通過を助ける吸収性の薬理学的に許容される溶媒を含む。
特徴的に、経皮デバイスは裏打ちメンバー、所望により担体と共に化合物を含む
貯蔵部、所望により制御された予定された速度で長期間宿主の皮膚の活性成分を
送達するための速度制御バリア、および皮膚にデバイスを固定する手段を含むバ
ンデージの形である。

【００５３】 以下の実施例は前記の本発明を説明する。“活性成分”なる用語は、本発明に
したがって有用である前記のビホスホン酸誘導体またはＭＭＰ阻害剤の一つであ
ると理解される。実施例７は添付の図１−９を引用し、その中で 図１はビスホスホネート：(Ａ)パミドロネートによるおよび(Ｂ)ゾレドロネート
による骨髄腫増殖の阻害を示すグラフである。［^３Ｈ]−ＴｄＲの取り込みはコ
ントロール±ＳＥとして示す； 図２はゾレドロネートにより誘導される種々のＨＭＣＬのアポトーシスを示すグ
ラフである； 図３はＢＭＳＣによる構造的ＩＬ−６製造におけるパミドロネートまたはゾレド
ロネートの効果を示すグラフである； 図４はパミドロネートまたはゾレドロネートによるり誘導されたＢＭＳＣによる
ＭＭＰ−１製造の阻害を示すグラフである；そして 図５はＭＭＰ−２分泌におけるビスホスホネートの効果の定量的分析を示すグラ
フである。

【００５４】 実施例 実施例１：活性成分として、例えば活性成分パミドロン酸二ナトリウム五水和物
の被覆ペレットを含むカプセル： コアペレット： 活性成分(粉砕) １９７.３mg 微結晶性セルロース ５２.７mg (Avicel(登録商標)PH 105) ２５０.０mg ＋内部コーティング： セルロースHP-M 603 １０.０mg ポリエチレングリコール ２.０mg タルク ８.０mg ２７０.０mg ＋胃液耐性外部コーティング： Eudragits(登録商標)L 30 D(固体) ９０.０mg クエン酸トリエチル ２１.０mg Antifoam(登録商標)ＡＦ ２.０mg 水 タルク ７.０mg ３９０.０mg

【００５５】 パミドロン酸二ナトリウムとAvicel(登録商標)PH 105の混合物を水で湿らせ、
練り、押し出し成型して球形に形作る。乾燥ペレットを次いで、セルロースHP-M
603、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)8000およびタルクを含む内部コーティン
グ、およびEudragite(登録商標)L 30 D、クエン酸トリエチルおよびAntifoam(登
録商標)ＡＦを含む水性胃液耐性コーティングを含む流動床で連続的にコートす
る。コートしてペレットをタルクと共に粉末にし、商品カプセル充填機、例えば
Hoefliger and Kargの手段により、カプセル(カプセルサイズ０)に充填する。

【００５６】 実施例２：活性成分として、例えば、１−ヒドロキシ−２−(イミダゾール−１
−イル)−エタン−１,１−ジホスホン酸を含む、モノリス接着性経皮デバイス： 組成： ポリイソブチレン(ＰＩＢ)３００ ５.０ｇ (Oppanol B1, BASF) ＰＩＢ３５０００ ３.０ｇ (Oppanol B10, BASF) ＰＩＢ１２０００００ ９.０ｇ (Oppanol B100, BASF) 水素化炭化水素樹脂 ４３.０ｇ (Escorez 5320, Exxon) １−ドデシルアザシクロヘプタ−２−オン ２０.０ｇ (Azone, Nelson Res., Irvine/CA) 活性成分 ２０.０ｇ 合成 １００.０ｇ

【００５７】 製剤： 上記成分を１５０ｇの特異的沸点石油フラクション１００−１２５に、ローラ
ーギア床上での回転により一緒に溶解した。溶液を、３００mmドクターブレード
を使用した拡散の手段によりポリエステルフィルム(Hostapham, Kalle)に適用し
、約７５ｇ／ｍのコーティングを得る。乾燥(１５分、６０℃)後、シリコン処理
ポリエステルフィルム(厚さ７５mm、Laufenberg)を、はぎとり式フィルムとして
適用する。完了したシステムを５から３０cm^２の望ましい形のサイズに、穴あけ
器を使用して穴を開ける。完全なシステムを、個々にアルミニウム処理紙のサシ
ェットに密封する。

【００５８】 実施例３：１.０mg乾燥、凍結乾燥１−ヒドロキシ−２−(イミダゾール−１−イ
ル)エタン−１,１−ジホスホン酸(その混合ナトリウム塩)を含むバイアル。１ml
の水で希釈後、i.v.輸液のための溶液(濃度１mg／ml)を得る。 組成： 活性成分(遊離ジホスホン酸) １.０mg マンニトール ４６.０mg クエン酸三ナトリウム×２Ｈ_２Ｏ 約３.０mg 水 １ml 注射用水 １ml。

【００５９】 １mlの水に、活性成分をクエン酸三ナトリウム×２Ｈ_２Ｏと共に、ｐＨ６.０
まで滴定する。次いで、マンニトールを添加し、溶液を凍結乾燥し、凍結乾燥物
をバイアルに充填する。

【００６０】 実施例４：活性成分、例えば、パルミドロン酸二ナトリウム五水和物を水中に含
むアンプル。溶液(濃度３mg／ml)は、希釈後i.v.用である。

【００６１】 組成： 活性成分 １９.７３mg (５.０mgの無水活性成分) マンニトール ２５０mg 注射用水 ５ml。

【００６２】 実施例５：各々５０mgの３−[Ｎ−(２−フェニルチオエチル)−Ｎ−メチルアミ
ノ]−１−ヒドロキシプロパン−１,１−ジホスホン酸またはMMI 270(Ｎ−ヒドロ
キシ−２ (Ｒ)−[[４−メトキシベンゼンスルホニル](３−ピコリル)−アミノ]
−３−メチルブタンアミド塩酸塩)を含む錠剤は、下記の通り製造できる： 組成(１０,０００錠) 活性成分 ５００.０ｇ ラクトース ５００.０ｇ ジャガイモ澱粉 ３２５.０ｇ ゼラチン ８.０ｇ タルク ６０.０ｇ ステアリン酸マグネシウム １０.０ｇ 二酸化珪素(微粉) ２０.０ｇ エタノール 適量

【００６３】 活性成分をラクトースおよび２９２ｇのジャガイモ澱粉と混合し、混合物をゼ
ラチンのエタノール性溶液で湿らせ、ふるいを通して造粒する。顆粒を乾燥させ
た後、ジャガイモ澱粉の残り、ステアリン酸マグネシウムおよび二酸化珪素を添
加して圧縮し、各々１４５.０mgであり、混合物を５０.０mgの活性成分を含む錠
剤を得、それは、所望により、投与量をより精密に調節するために割線を有する
。

【００６４】 実施例６：各々２５mgの活性成分、例えば、Ｎ−ヒドロキシ−２(Ｒ)−[[４−メ
トキシベンゼンスルホニル](３−ピコリル)−アミノ]−３−メチルブタンアミド
塩酸塩を含む３０００カプセルの製造： 活性成分 ７５.０ｇ ラクトース ７５０.０ｇ Avicel PH 102 ３２５.０ｇ (微結晶性セルロース) Polyplasdone XL ３０.０ｇ (ポリビニルピロリドン) 精製水 適量 ステアリン酸マグネシウム ９.０ｇ

【００６５】 活性成分を３０番手動ふるいを通す。 活性成分、ラクトース、Avicel PH 102およびPolyplasdone XLを、１５分間ミ
キサーで混合する。混合物を十分な水(約５００ml)と共に造粒し、３５℃で一晩
オーブンで乾燥させ、２０番ふるいを通す。

【００６６】 ステアリン酸マグネシウムを２０番ふるいを通し、顆粒混合物に添加し、混合
物を５分間ミキサーで混合する。混合物を０番硬ゼラチンカプセルに入れ、各々
２５mgの活性成分と同等な混合物の量を含む。

【００６７】 実施例７−腫瘍細胞および腫瘍細胞環境の試験 材料および方法 試薬 二つのビスホスホネートを使用する：ＭＭの処置に使用されている参照分子で
あるパミドロネートまたは(３−アミノ−１−ヒドロキシプロピリデン)ビスホス
ホネート(ＡＰＤ)、およびゾレドロネートまたは(１−ヒドロキシ−２−(ｌＨ−
イミダゾール−１−イル)エチリデン)ビスホスホネート、両方ともNovartis(Bas
el, Switzerland)。ビスホスホネートをＰＢＳ(リン酸緩衝化食塩水)に溶解し、
使用するまで−２０℃で貯蔵する。

【００６８】 細胞単離および培養条件 ヒト骨髄腫細胞系(ＨＭＣＬ)ＬＰ−１およびＯＰＭ−２をＤＳＭ(Braunschwei
g, Germany)から得た。ＪＪＮ−３は、B Van Camp (VUB, Belgium)から貰った。
細胞を１０％ウシ胎児血清(ＦＣＳ)、２mMグルタミン、抗生物質(１００ＩＵ／m
lペニシリンおよび１００μｇ／mlストレプトマイシン)および１０μＭ ２−β
−メルカプトエタノールを添加したRPMI 1640培養培地に維持する。

【００６９】 ＢＭＳＣは、ＭＭの患者から、骨髄サンプルの長期培養後得る。細胞を１０％
ＦＣＳを添加したＤＭＥＭで平板培養し、３日間接着させ、その後、培地を新
しくする。２から３週間の培養後、コンフルエント接着細胞単層を得、次いで、
トリプシン／ＥＤＴＡ溶液を使用した２回の継代後、ＢＭＳＣを試験のために回
収する。細胞を１０％ ＦＣＳ、２mmol／Ｌグルタミン、１００ｇ／mlストレプ
トマイシン、１００Ｕ／mlペニシリンおよび５.１０^−５Mol／Ｌ ２−β−メル
カプトエタノールを添加したＤＭＥＭに維持する。

【００７０】 ＨＭＣＬの増殖 ３つのＨＭＣＬ、即ちＬＰ−１、ＯＰＭ−２およびＪＪＮ−３を試験する。増
殖アッセイを９６ウェル丸底マイクロタイタープレートで、１０^５細胞／mlの細
胞密度で行う。細胞を３日間、３７℃で５％ＣＯ_２の湿潤雰囲気下に、５ng／ml
組換えヒトＩＬ−６(ｒｈＩＬ−６)の存在下または非存在下で、目的のビスホス
ホネートの存在下(または非存在下)にインキュベートする。次いで、０,５ＭＣ
ｉの[^３Ｈ]−チミジンを最後の１８時間の間添加する。[^３Ｈ]−チミジン取り込
みを液体シンチレーションスペクトロスコピーで測定する。

【００７１】 ＨＭＣＬのアポトーシスの検出 アポトーシス細胞の存在を、ビスホスホネート存在下または非存在下のＨＭＣ
Ｌの１から５日間の培養の後に評価する。アポトーシス細胞の割合を、PE(Immun
otech, Marseilles, France)に結合したAPO 2.7モノクローナル抗体(ｍＡｂ)を
使用したフローサイトメトリーにより測定する(Zhang et al. 1996, J. Immunol
. 157:3980-3987)。

【００７２】 細胞サイクルの分析 ２４ウェルプレートに平板培養したＬＰ−１細胞(２×１０^５細胞)を、５×１
０^４Mol／Ｌのパミドロネートまたはゾレドロネートの存在下でインキュベート
する。ビスホスホネートなしのコントロールを行う。細胞を４日間のインキュベ
ーション期間後に回収し、洗浄する。次いで、それらを４０分、３７℃でTriton
X 100 ０.１％、クエン酸ナトリウム０.１％、５ＩＵのＲＮＡｓｅとインキュ
ベートし、ヨウ化プロピジウム(ＰＩ)５０mg／Ｌで染色する。フローサイトメト
リー分析をFACSCaliburで、CELLQuestプログラム(Becton Dickinson)を使用して
行う。データをF12-Area対FL2-Widthサイトグラム上にゲート制御し、ダブレッ
トおよび凝集を排除し、最小２.５×１０^４ゲート制御細胞をサンプルあたり回
収する。細胞サイクルの分析をModfit LT for Mac V2.01プログラム(Verity Sof
tware House, Inc)を使用して行った。アポトーシス細胞をZamai et al. (1993,
Cytometry 14:891-897)が記載のように、サブディプロイドピークとして検出し
た。

【００７３】 生存実験 接着性ＢＭＳＣ(３×１０^５細胞)を２５cm^２フラスコに入れ、以下の濃度のパ
ミドロネート(ＡＰＤ)またはゾレドロネートとインキュベートする：１０^−４お
よび１０^−５Mol／Ｌ。ビスホスホネートなしのコントロールを行う。３日間の
インキュベーションの後、細胞をＰＢＳで洗浄し、トリプシン−ＥＤＴＡを２０
秒使用して、フラスコから回収する。アポトーシス細胞の割合を、APO 2.7 mAb
(Immunotech, Marseilles, France)(同書)を使用したフローサイトメトリーによ
り測定する。

【００７４】 ＩＬ−６濃度の測定 ９６ウェルプレートで培養した接着性ＢＭＳＣ(１０^４細胞)を、２４時間パミ
ドロネートまたはゾレドロネートのいずれかと予備インキュベートする。培地を
、２％ＦＣＳおよび、種々の濃度の各ビスホスホネート：各々１０^−６、１０^{− ７} 、１０^−８、１０^−９、１０^−１０、１０^−１１Mol／Ｌのゾレ泥ネートおよ
び１０^−６、１０^−７、１０^−８、１０^−９、１０^−１０Mol／Ｌのパミドロネ
ートを含む新しいものに変える。４８時間のインキュベーションの後、上清を回
収し、分析するまで−２０℃で貯蔵する。ＩＬ−６製造をＥＬＩＳＡ(１０から
５００pg／mlの範囲のＥＬＩＳＡ試験濃度)で測定する(Innotest, Besancon, Fr
ance)。ビスホスホネートとＥＬＩＳＡの間に干渉は観察されない(データは示し
ていない)。７つ中６つのＢＭＳＣを、ビスホスホネート存在下でＩＬ−６の製
造の試験をする。

【００７５】 間質性コラゲナーゼ(ＭＭＰ−１)レベルの測定 ９６ウェルプレートで培養した付着性ＢＭＳＣ(１５×１０^３細胞)を、パミド
ロネートまたはゾレドロネートと共に２４時間プレインキュベートする。次いで
、細胞を、異なる濃度の各ビスホスホネート(１０^−６、１０^−７、１０^−８お
よび１０^−９Mol／Ｌ)の存在下、ＦＣＳなしでＩＬ−１β(１０ng／mL)で刺激す
る。４８時間のインキュベーションの後、上清を回収し、分析するまで−２０℃
で貯蔵する。ＭＭＰ−１レベルをＥＬＩＳＡにより測定する(Amersham, Les Uli
s, France)。このアッセイは、その提示の形態(即ち、遊離または結合、反応性
または非反応性)に関係なくＭＭＰ−１を測定する。

【００７６】 ゼラチン基質ゲルザイモグラフィーによるゼラチナーゼＡ(ＭＭＰ−２)レベルの
測定 ９６ウェルプレートで培養した付着性ＢＭＳＣ(１０^４細胞) を、パミドロネ
ートまたはゾレドロネートと共に２４時間プレインキュベートする。次いで、培
地を、ＦＣＳは含まないが、種々の濃度(１０^−６、１０^−７、１０^−８、１０
^−９Mol／Ｌ)の各ビスホスホネートの存在下で新しいものに変える。４８時間の
インキュベーション後、上清を回収し、分析するまで−２０℃で貯蔵する。ＭＭ
Ｐ−２製造は、ゼラチン基質ゲルザイモグラフィーにより示す。上清をドデシル
硫酸ナトリウム(ＳＤＳ)サンプル緩衝液と、還元剤無しで混合し、次いで、タン
パク質を、Heussen and Dowdle (1980 Ann. Biochem. 102:196-202)が先に記載
のように、そしてミニゲルフォーマットに調節した、１mg／mlのゼラチンを含む
７.５％ポリアクリルアミドゲルでＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を
する。,電気泳動後、ＳＤＳをゲルから２.５％ Triton X-100中で、半時間室温
でインキュベーションすることにより回収する。次いで、ゲルを３７℃で５０mM
／Ｌ Tris-HCl ５mM／Ｌ ＣａＣｌ_２含有緩衝液、ｐＨ７.６で２４時間イン
キュベートする。ゲルをクーマシーブルーR250(０.２５％)で染色した。染色ゼ
ラチンの青色バックグラウンドに対する明らかな７２kDaバンドは、ＭＭＰ−２
タンパク質分解活性を証明する。ゼラチン分解性バンドの強度は、デンシトメト
リーにより分析する。ビスホスホネートとゼラチン基質ゲルザイモグラフィーの
間の干渉は、本アッセイを使用して観察されない(データは示していない)。

【００７７】 統計的分析： データは平均±標準偏差として示す。ウィルコクスン符号付き順位検定を、検
出した差異の統計的有意の決定に使用する。

【００７８】 結果 Ａ．パミドロネートおよびゾレドロネートはＨＭＣＬの増殖を阻害する 我々は、３種のＨＭＣＬ、即ちＬＰ−１、ＯＰＭ−２およびＪＪＮ−３の増殖
を、パミドロネートまたはゾレドロネートの存在下で試験している。パミドロネ
ートおよびゾレドロネートの両方とも試験した３種のＨＭＣＬの増殖の阻害を誘
導する。５×１０^−４Mol／Ｌの存在下で、３つの細胞系の増殖の割合は、コン
トロールの２５％である。(図１Ａ)増殖の阻害は、用量依存的であり、５×１０ ^−５ Mol／Ｌのパミドロネートの濃度まで観察される(コントロールと同等の増殖
レベルに回復するのに１×１０^−５Mol／Ｌのパミドロネートの濃度を必要とす
る、より感受性であるＪＪＮ−３以外)。更に、我々は増殖の阻害に、ゾレドロ
ネートはパミドロネートよりも強力であることを示す。５×１０^４Mol／Ｌのゾ
レドロネートの存在下、全てのＨＭＣＬにおいて、パミドロネートでの７５％(
図１Ａ)に対して、約９５％の増殖の阻害が観察される(図１Ｂ)。正常増殖速度
への回復が、ＬＰ−１およびＯＰＭ−２に関して５×１０^−５Mol／Ｌのゾレド
ロネートで、およびＪＪＮ−３に対して１ｘ１０^−５Mol／Ｌで観察される。３
種のＨＭＣＬのＩＣ_５０は、パミドロネートの存在下で非常に類似である(ＩＣ
_{５０ ＬＰ−１}＝２,０７×１０^−４Mol／Ｌ、ＩＣ_{５０ ＪＪＮ−３}＝１,０７×
１０^４Mol／ＬおよびＩＣ_{５０ ＯＰＭ−２}＝２,９３×１０^４Mol／Ｌ)。更に、
ゾレドロネート存在下での細胞系のＩＣ_５０(ＩＣ_{５０ ＬＰ−１}＝１,９３×１
０^４Mol／Ｌ、ＩＣ_{５０ Ｊ１Ｎ−３}＝２,３３.１０^−５Mol／ＬおよびＩＣ_{５０ ＯＰＭ−２} ＝１,５５×１０^４Mol／Ｌ)は、パミドロネートと有意な差は示さな
かった。ＩＬ−６が骨髄腫細胞の増殖に重要な役割を担うため、我々はヒトｒＩ
Ｌ−６(５ng／mL)が、ＨＭＣＬ増殖の阻害を回復する能力を試験した。二つのビ
スホスホネートで、ＨＭＣＬ増殖において観察される阻害効果は、５ng／mlのヒ
トｒＩＬ−６の添加で回復しない。

【００７９】 Ｂ．パミドロネートではなくゾレドロネートがＨＭＣＬのアポトーシスを誘導す
る これらのビスホスホネートがＨＭＣＬ増殖の阻害をどのように誘導するかを説
明するために、我々はAPO 2.7染色を使用してアポトーシスのを誘導する能力を
評価している。図２において、我々は３つのＨＭＣＬにおいて、ゾレドロネート
が強い用量および時間依存的アポトーシスを誘導することを示しているが、一方
パミドロネートはしない(データは示していない)。最大のアポトーシスは、５×
１０^４Mol／Ｌで、ＯＰＭ−２およびＪＪＮ−３に関して４日のインキュベーシ
ョン後、およびＬＰ−１に関して５日のインキュベーション後に観察される。Ｊ
ＪＮ３のみが、１×１０^−４Mol／Ｌの濃度でAPO 2.7で標識する。アポトーシス
細胞の割合は図２に示す。

【００８０】 Ｃ．ゾレドロネートは細胞サイクルにおいてＳ相遮断を誘導する ＬＰ−１の細胞サイクルを、パミドロネートの存在下でＤＮＡ含量により分析
した場合、細胞サイクルの異なる相の修飾は観察されない。他方、ゾレドロネー
トは、細胞サイクル相における著しい修飾を誘導する。Ｓ相の割合の増加(ゾレ
ドロネートサンプルにおける６０％対コントロールにおける３６％)、付随する
Ｇ１相の細胞の減少およびサブＧ１ピークの出現が観察される。サブＧ１ピーク
の存在は、アポトーシス細胞の存在に対応する。

【００８１】 Ｄ．パミドロネートおよびゾレドロネートはヒトＢＭＳＣでアポトーシスを誘導
する あるビスホスホネートが、単核細胞および破骨細胞におけるようにＨＭＣＬで
アポトーシスを誘導することが先に示されていることを考慮して、我々はＢＭＳ
Ｃにおけるその効果を評価している。我々は、パミドロネートおよびゾレドロネ
ートの両方が、１０^−４mol／Ｌの濃度で、ＢＭＳＣの用量依存的アポトーシス
を誘導することを発見している。興味深いことに、ＢＭＳＣアポトーシスの誘導
において、１０^−４mol／Ｌの濃度で、パミドロエートはゾレドロネートよりも
有効である：パミドロネートは、９７％のAPO 2.7染色細胞を誘導し、一方ゾレ
ドロネートでは２４％のAPO 2.7陽性細胞。１×１０^−５Mol／Ｌの各ビスホスホ
ネートの存在下で、パミドロネートもゾレドロネートも有意なＢＭＳＣアポトー
シスを担わない。更なる実験において、細胞生存能とビスホスホネートの間の干
渉を避けるために、１０^−６mol／Ｌより低いまたは同等なビスホスホネート濃
度を使用する。

【００８２】 Ｅ．パミドロネートおよびゾレドロネートのr方法が、ＭＭの患者からのＢＭＳ
ＣによるＩＬ−６の構造的製造を阻害する 我々は、パミドロネートおよびゾレドロネートの、骨髄ＭＭサンプルの長期培
養から得たＢＭＳＣによる、ＩＬ−６の構造的製造における効果を試験している
。ＢＭＳＣの６個の異なるサンプルを試験する。ＢＭＳＣは、５００から４００
０pg／mlの範囲の構造的に高いレベルのＩＬ−６を製造する。パミドロネートは
、ＢＭＳＣによるＩＬ−６製造を有意に阻害する(４０％±１４％；ｐ＝０.０５
)。この阻害は用量と比例はしないが、基底レベルへの回復が１０^−１１mol／Ｌ
の濃度のパミドロネートで観察される(図３)。対照的に、ゾレドロネートはＢＭ
ＳＣによるＩＬ−６製造の強い阻害を誘導し、この効果は用量依存的であり、１
０^−６mol／Ｌ（ｐ＝０.０５)の濃度で最大阻害(６０％±１０％；ｐ＝０.０５)
が得られる。ＢＭＳＣによるＩＬ−６の基底製造への回復は、１０^−９mol／Ｌ
のゾレドロネートの存在下で観察される(図３)。

【００８３】 Ｆ．パミドロネートではなくゾレドロネートが、ＭＭの患者から取ったＢＭＳＣ
によるＩＬ−１β誘導間質性コラゲナーゼ(ＭＭＰ−１)を阻害する。 次ぎに、我々はＢＭＳＣによるＭＭＰ−１の製造におけるパミドロネートおよ
びゾレドロネート両方の効果を試験している。ＢＭＳＣの６個の異なるサンプル
を、ゾレドロネートで試験し、その中の４個をパミドロネートで同じ方法で試験
する。ＭＭＰ−１の基底分泌は、患者サンプルに依存して３から２２ng／mlの範
囲である。パミドロネートまたはゾレドロネートで試験した６名の患者の内、５
名が１０ng／mL以下の基底レベルを示す。ＢＭＳＣによるＭＭＰ−１の基底製造
が非常に弱いため、ＩＬ−１β刺激後のＭＭＰ−１分泌におけるビスホスホネー
トの効果を分析し、最小５倍のＭＭＰ−１上方制御が観察される。ＩＬ−１β刺
激後のＭＭＰ−１分泌は、ＭＭＰ−１分泌の基底レベルに依存し、それに逆比例
する。図４は、パミドロネートまたはゾレドロネートによるＭＭＰ−１分泌の阻
害を説明する。ゾレドロネートの添加は、６名中５名の患者のＭＭＰ−１分泌を
有意に阻害し(４４％±１４％；ｐ＝.０５)、この阻害は用量依存的である。対
照的に、パミドロネートはＭＭＰ−１分泌に有意な効果はなく(平均阻害＝２１
％±２０％)、大きな個体間変化が見られ、４名中２名の患者サンプルのみがパ
ミドロネートへの感受性を示す。ゾレドロネートによる粗阻害は、ＭＭＰ−１分
泌の基底レベルに依存しないことに注目するのは興味深い。

【００８４】 Ｇ．パミドロネートおよび特にゾレドロネートの両方が、ＭＭの患者から取った
ＢＭＳＣによるゼラチナーゼＡ(ＭＭＰ−２)発現を促進する 我々は、次いで、他のマトリックスメタロプロテイナーゼであるＭＭＰ−２(
またはゼラチナーゼＡ)の分泌におけるビスホスホネートの効果を、ゼラチン基
質ゲルザイモグラフィーにより試験する。ＭＭＰ−２は、試験した全７名の患者
サンプルにおいて観察される。７２kDaゼラチナーゼ活性の定量は、デンシトメ
トリーにより得る(図５に示すように)。パミドロネートおよびゾレドロネートの
両方とも、１０^−６mol／Ｌの濃度で強い上方制御を誘導する(パミドロネートお
よびゾレドロネート、各々１６５％±２７％および１８０％±１２％；ｐ＝０.
０５)。パミドロネートにより誘導される弱いＭＭＰ−２上方制御が、試験した
全患者サンプルにおいて１０^−７から１０^−９mol／のＬ範囲の濃度で観察され
る。対照的に、ゾレドロネートは、１０^−６mol／Ｌ(２０５％±７％)から１０
^−９mol／Ｌ(１５９％±１６％)の範囲の全ての濃度でＭＭＰ−２分泌の強い増
加を誘導する。

【図面の簡単な説明】

【図１】 ビスホスホネート：(Ａ)パミドロネートによるおよび(Ｂ)ゾレド
ロネートによる骨髄腫増殖の阻害を示すグラフである。［^３Ｈ]−ＴｄＲの取り
込みはコントロール±ＳＥとして示す。

【図２】 ゾレドロネートにより誘導される種々のＨＭＣＬのアポトーシス
を示すグラフである。

【図３】 ＢＭＳＣによる構造的ＩＬ−６製造におけるパミドロネートまた
はゾレドロネートの効果を示すグラフである。

【図４】 パミドロネートまたはゾレドロネートによるり誘導されたＢＭＳ
ＣによるＭＭＰ−１製造の阻害を示すグラフである。

【図５】 ＭＭＰ−２分泌におけるビスホスホネートの効果の定量的分析を
示すグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 43/00 １１１ Ａ６１Ｐ 43/00 １１１ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ， ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ， ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，Ｋ Ｐ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ， ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，Ｓ Ｇ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4C084 AA20 ZA42 ZA96 ZB26 ZC20 4C086 AA01 AA02 DA34 MA02 MA04 NA05 ZA42 ZA96 ZB26 ZC20 ZC75

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 同時、連続または別の使用のためのビスホスホネートとマト
   リックスメタロプロテイナーゼ阻害剤の組合わせを含み、ＭＭＰ阻害剤がＴＩＭ
   Ｐ−２であるとき、ビスホスホネートはイバンドロネートではない、悪性腫瘍の
   処置のための医薬組成物。
2. 【請求項２】 医薬の製造のための、悪性疾患の処置のためにビスホスホネ
   ートと組み合わせて使用するための、ビスホスホネートによりもたらされるＭＭ
   Ｐ活性の阻害に使用するための、ＭＭＰ阻害剤の使用(ただしＭＭＰ阻害剤がＴ
   ＩＭＰ−２であるとき、ビスホスホネートはイバンドロネートではない。)。
3. 【請求項３】 患者に有効量のビスホスホネートと、ビスホスホネートによ
   りもたらされるＭＭＰ活性を阻害するのに有効な量のＭＭＰ阻害剤を投与するこ
   とを含む、悪性疾患に罹患している患者の処置法(ただしＭＭＰ阻害剤がＴＩＭ
   Ｐ−２であるとき、ビスホスホネートはイバンドロネートではない。)。
4. 【請求項４】 ビスホスホネートを悪性疾患の処置に使用したとき、ビスホ
   スホネートによりもたらされるＭＭＰ活性を阻害するためであるが、ただしＭＭ
   Ｐ阻害剤がＴＩＭＰ−２であるとき、ビスホスホネートはイバンドロネートでは
   ない、ＭＭＰ阻害剤の使用。
5. 【請求項５】 ａ)ビスホスホネートでの処置が増加したＭＭＰ分泌をもた
   らす悪性疾患の処置の間の柔組織転移の発症の阻害のための同時に、連続して、
   または別々に使用するためのビスホスホネートおよびＭＭＰ阻害剤を組合わせて
   含む、医薬組成物； ｂ)ビスホスホネートでの処置が増加したＭＭＰ分泌をもたらす、ビスホスホネ
   ートおよびＭＭＰ阻害剤の組合わせでの悪性疾患の処置の間の柔組織転移を阻害
   するための医薬の製造における、ＭＭＰ阻害剤の使用；または ｃ)有効量のビスホスホネートおよび有効量のＭＭＰ阻害剤を患者に投与するこ
   とを含む、悪性疾患の処置の間の患者における柔組織転移の発症を阻害する方法
   。
6. 【請求項６】 ＭＭＰ阻害剤がＭＭＰ−２の阻害剤である、請求項１記載の
   方法。
7. 【請求項７】 ビスホスホネートがパミドロネートまたはゾレドロネートで
   ある、請求項１記載の方法。