JP2002541059A - チオレドキシンによる空中及び接触アレルゲンのアレルゲンポテンシャルの軽減 - Google Patents

チオレドキシンによる空中及び接触アレルゲンのアレルゲンポテンシャルの軽減

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ボイオン シー イー
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Abstract

(57)【要約】 小さいジチオールタンパク質であるチオレドキシンは、アレルゲン性タンパク質、特に花粉及び動植物給源の中に存在するアレルゲン性タンパク質の特異的還元剤である。全ての標的化されたタンパク質は、チオレドキシンによりスルフヒドリル(SH)レベルに還元されるジスルフィド(S-S)結合を有する。これらのタンパク質は、アレルゲン誘発活性があり、酸化型(S-S)において消化性が低い。還元された場合(SH状態)、これらはそのアレルゲン誘発性を失い及び／又はより消化性となる。NADPH-チオレドキシンレダクターゼ(生理的条件)を介したNADPH、又は化学的還元剤であるリポ酸のいずれかにより活性化(還元)された場合、チオレドキシンはこの還元を達成した。感作されたイヌにおいて実施された皮膚試験は、注射前の還元型チオレドキシンによる花粉の処置が、花粉のアレルゲン誘発性を消失又は減弱したことを示した。チオレドキシンによる還元後にペプシンによる花粉タンパク質の消化が増加したことを示す研究がある。チオレドキシンで還元されている花粉タンパク質は、他方で還元されていない花粉タンパク質に曝露された際に発生する動物のアレルギー反応を、減弱又は消失するための有効かつ安全免疫療法剤である。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （クロスレファレンス） この出願は、1991年10月12日提出の出願番号第07/776,109号(現在、放棄され
ている)の一部継続出願である1992年８月25日提出の出願番号第07/935,002号(現
在、放棄されている)の一部継続出願である1994年４月2日提出の出願番号第08/2
11,673号の一部継続出願であり、現在、1998年８月11日に発行された米国特許証
第5,792,506号である、1994年10月21日提出の出願番号第08/326,976号の一部継
続出願である1997年10月17日提出の出願番号第08/953,703号の一部継続出願であ
る。
【０００２】 （発明の分野） 本発明は、穀物タンパク質のような種子タンパク質を還元し、また酵素インヒ
ビタータンパク質、毒液毒素タンパク質、花粉タンパク質及び特定の他のタンパ
ク質の分子内ジスルフィド結合を還元するためのチオールレドックスタンパク質
の使用に関するものである。さらに詳しくは、本発明は、グリアジン、グルテニ
ン、アルブミン及びグロブリンを還元するためにチオレドキシン及びグルタレド
キシンを使用して、ドー及び焼成品の特性を改良して新しいドーを創造し、かつ
アミラーゼ及びトリプシンインヒビターのようなシスチン含有タンパク質を還元
して、食餌及び穀物製品を改良することに関する。さらに、本発明は、プルラナ
ーゼを阻害する新規なタンパク質の単離及びその新規なタンパク質のチオールレ
ドックスタンパク質による還元に関する。さらに、本発明は、油貯蔵種子の２Ｓ
アルブミンタンパク質特性のチオレドキシンによる還元に関する。また、本発明
は、ヘビ神経毒及び特定の昆虫及びサソリ毒液毒素のインビトロ不活性化及び個
体中の対応する毒性の処理に関する。本発明は、チオレドキシンを用いて食品の
アレルゲン性や花粉アレルゲンを低減すること及び食品及び花粉タンパク質のタ
ンパク分解及び食品や花粉の消化性を高めることにも関する。本発明は、リポ酸
又は還元型チオール−レドックスタンパク質又は免疫療法用途のリポ酸と組み合
わせたチオレドキシンによって還元される花粉たんぱく質にも関する。さらに、
本発明は、アレルギー及びアレルギー症状の治療及び予防のためのチオール−レ
ドックスタンパク質とリポ酸の使用に関与する。
【０００３】 本発明は、全米科学財団に与えられた認可契約番号DCB 8825980及びDMB 88-15
980の下、政府の支援で為された。米国政府は、本発明に特定の権利を有する。
【０００４】 （発明の背景） 葉緑体は、フェレドキシン、フェレドキシン−チオレドキシンレダクターゼ及
びチオレドキシンｆ及びｍから構成され、光合成の酵素の制御に光を連結するフ
ェレドキシン／チオレドキシン系を含む（Buchanan,B.B.(1991)「酸素の光合成
におけるＣＯ2同化作用の制御：フェレドキシン／チオレドキシン系。その発見
に関する展望、現在の状況及び将来の発展」、Arch.Biochem.Biophys.288:1-9；
Scheibe,R.(1991)、「葉緑体酵素のレドックス−調節。個々のコントロールの一
般原理」、Plant Physiol.96：1-3）。いくつかの研究が、植物は動物及び多く
の微生物のために確立されるものと類似の系をも含み、その系で、以下のように
、チオレドキシン（ｈ−型）が、ＮＡＤＰＨと、酵素、ＮＡＤＰ−チオレドキシ
ンレダクターゼ（ＮＴＲ）によって還元されることを示した。 ＮＴＲ （１） ＮＡＤＰＨ＋Ｈ+＋チオレドキシンｈ ox ――→ ＮＡＤＰ ＋チオレドキシンｈ red （Florencio F.J.ら(1988),Arch.Biochem.Biophys.266:496-507；Johnson,T.C.
ら(1987),Plant Physiol.85:446-451；Suske,G.ら(1979),Z.Naturforsch.C.34:2
14-221）。現在の証拠は、ＮＡＤＰ／チオレドキシン系が広く植物組織内に分布
され、かつミトコンドリア、小胞体及びサイトゾル内に収容されていることを示
唆している（Bodenstein-Lang,J.ら(1989),FEBS Lett.258:22-26；Marcus,F.ら(
1991),Arch.Biochem.Biophys.287:195-198）。
【０００５】 チオレドキシンｈは、炭水化物代謝のサイトゾル酵素、ピロリン酸フルクトー
ス-6-P、1-ホスホトランスフェラーゼ又はＰＦＰを還元的に活性化することも公
知である（Kiss,F.ら(1991),Arch.Biochem.Biophys.287:337-340）。
【０００６】 種子は、ＮＡＤＰ／チオレドキシン系が植物内の生理活性に基づく唯一の組織
である。また、チオレドキシンｈは、実験室内でチオニンを還元することが示さ
れた（Johnson,T.C.ら(1987),Plant Physiol.85;:446-451）。チオニンは、可溶
性の穀物種子タンパク質であり、シスチンに富む。Johnsonらの調査では、式２
及び３に従い、コムギピューロチオニンが、ＮＡＤＰ−チオレドキシンレダクタ
ーゼ（ＮＴＲ）及びチオレドキシンｈを介して実験的にＮＡＤＰＨによって還元
された。 ＮＴＲ （２） ＮＡＤＰＨ＋チオレドキシンｈ ox ――→ ＮＡＤＰ ＋チオレドキシンｈ red （３） ピューロチオニンox＋チオレドキシンｈ red → ピューロチオニンred ＋チオレドキシンｈ ox
【０００７】 コムギ、ライムギ、コーン、キビ、モロコシ及び米のような穀物種子は、４つ
の主要種子タンパク質群を含む。この４つの群は、アルブミン、グロブリン、グ
リアジン及びグルテニン又は対応たんぱく質である。チオニンは、アルブミン群
又は派に属する。現在、コムギ及びライムギのみが、グルテン又はドーが形成さ
れる２つの穀物である。グルテンは、固い弾性かつゴム状タンパク質複合体であ
り、ドーに粘着性を与える。グルテンは、主にグリアジン及びグルテニンタンパ
ク質から構成される。それは、ライムギ又はコムギドーが水で洗浄されるときに
形成される。パンのドーにその弾性型品質を与えるのはグルテンである。他の主
要穀物、オオムギ、コーン、モロコシ、オートムギ、キビ及び米、また植物、大
豆由来の粉末も、コムギ及びライムギが使用される条件下ではグルテン様の網目
構造を生じない。
【０００８】 グルテニン及びグリアジンは、種子貯蔵タンパク質を含むシスチンであり、不
溶性である。貯蔵タンパク質は、種子内の発芽の際に分解されるタンパク質であ
り、成長及び発生のために発芽実生によって使用される。プロラミンは、コムギ
以外の穀類中の貯蔵タンパク質であり、グリアジンに相当し、一方、グルテリン
は、コムギ以外の穀類中の貯蔵タンパク質であり、グルテニンに相当する。コム
ギ貯蔵タンパク質は、全種子タンパク質の80％までの割合を占める（Kasarda,D.
D.ら(1976),Adv.Cer.Sci.Tech. 1:158-236；及びOsborne,T.B.ら(1893),Amer.Ch
em.J. 15:392-471）。グルテニン及びグリアジンは、ドーの形成ひいてはパンの
品質に重要であるとみなされている。種子貯蔵タンパク質の溶解性が還元時に高
められることがインビトロ実験により示されている（Shewry,P.R.ら(1985),Adv.
Cer.Sci.Tech. 7:1-83）。しかし、以前には、グルテニン及びグリアジンの還元
は、ドーの品質を向上させるのではなく低下させると考えられていた（Dahle,L.
K.ら(1966),Ceral Chem. 43:682-688）。これは、おそらく化学的な還元剤によ
る非特異的還元がドーの低下をもたらしたためである。
【０００９】 「ストレートドー」及び「予備発酵」法は、ドー及び引き続くイーストで膨ら
ませるパン製品の製造の２つの主要な従来法である。 ストレートドー法では、小麦粉、水又は他の液体、及び限定するものではない
が、他の含むことのできるイースト、穀粒、塩、ショートニング、砂糖、イース
ト栄養物、ドーコンディショナー、及び保存剤のすべてがブレンドされて、ドー
が形成され、部分的又は全体的な成長まで混合される。生成したドーは、特定プ
ロセス又は所望の最終製品によって決まる時間だけ発酵される。
【００１０】 該方法の次工程は、そのドーを機械又は手動で、焼成、冷却、及びスライス後
に目的の正味質量を確実に得るのに十分な適宜の大きさの断片に分けることであ
る。そして、ドー断片は、丸められて種々の時間寝かせることが多い（中間プル
ーフ）。これは、ドーを薄くして調製品を成形する前にドーを「緩和」させる。
この時間は、通常５〜15分の範囲であるが、特定の加工要求及び配合によって決
まり、かなり変化しううる。そして、ドー断片が機械で又は手動で適切な形状に
され、焼成前に通常は最後の「プルーフ」が与えられる。そして、ドー断片は、
所望の最終製品を達成するために種々の時間、温度、及び蒸気条件で焼成される
。
【００１１】 予備発酵法では、イーストが他の成分と共に混ぜられ、パン又はロールドーの
最終ミキシングの前に種々の時間発酵される。これら系に対する製パン業界の用
語としては、「水醸成」、「液体発酵」、「液体スポンジ」、及び「スポンジ／
ドー」が挙げられる。０〜100％の範囲の割合の小麦粉が、他の含めることので
きる成分、限定するものではないが、水、イースト、イースト栄養物及びドーコ
ンディショナーと共に混合物され、コントロールされ又は周囲条件下で、ある時
間発酵させられる。その発酵物は、そのまま使用され、又は後で使用するために
冷却されてバルクタンク又はトラフ内に貯蔵される。残りの成分が添加され（小
麦粉、独特な成分、付加的添加剤、付加的水など）、ドーが部分的又は全体的成
長まで混合される。
【００１２】 そして、ドーは種々の時間発酵させられる。典型的には、残りの成分の添加前
にいくらかの発酵が起こるので、必要な時間は最少であるが（すなわち10〜20分
）、設備や製品のタイプによって変化が見られる。第２の発酵工程後、ドーは、
ストレートドー法と同様に処理される。 ここで使用する用語「ドー混合物」は、最低限小麦粉又は穀物の粗粉及びミル
ク又は水のような液体を含む混合物を意味する。 ここで使用する用語「ドー」は、最低限小麦粉、又は穀物の粗粒及びミルク又
は水のような液体を含む弾性の、食用タンパク質網目構造の混合物を意味する。 ここで使用する用語「ドー成分」は、排他的ではないが、以下の成分のいずれ
かを含むことができる：小麦粉、水又は他の液体、穀類、イースト、海綿質、塩
、ショートニング、砂糖、イースト栄養物、ドーコンディショナー及び保存剤。
【００１３】 ここで使用する「焼成品」は、排他的ではないが、イースト発酵され及び化学
的に発酵された、白色及び種々のパンやロール、イングリッシュマフィン、ケー
キ及びクッキー、菓子コーティング、クラッカー、ドーナツ及び他の甘いペスト
リー製品、パイ及びピザ皮、プレッツェル、ピタ(pita)及び他の平らなパン、ト
ルティーヤ、パスタ製品、及び冷蔵及び冷凍ドー製品を含むすべてのパン類を包
含する。
【００１４】 チオレドキシンは、小麦粉中のアルブミンを還元するのに使用されているが、
、チオールレドックスタンパク質は、グルテニン及びグリアジン又は他の水に不
溶性の貯蔵タンパク質を還元し、或いはドー及び焼成品の品質を改良するのに使
用されていない。チオールレドックスタンパク質は、グルテンの品質を改良して
、それによってその価値を高め、又はオオムギ、コーン、モロコシ、オートムギ
、キビ及び米から、或いは大豆粉から調製するのに使用されていない。
【００１５】 多くの穀物種子は、外来源由来の酵素のインヒビターとして作用することがわ
かっているタンパク質をも含む。これら酵素インヒビターは、特定の有害生物に
対して防御することができる（Garcia-Olmedo,F.ら(1987)、Oxford Surveys of
Plant Molecular and Cell Biology 4:275-335；Birk Y.(1976),Meth. Enzymol.
45:695-739、及びLaskowski,M.,Jr.ら(1980),Ann.Reo.Biochem. 49:593-626）。
このようなタイプの２つの酵素インヒビターは、アミラーゼインヒビターとトリ
プシンインヒビターである。さらに、オオムギタンパク質インヒビター（この研
究では試験せず）が、同一源由来のα−アミラーゼを阻害するという証拠がある
（Weselake,R.J.ら(1983９,Plant Physiol.72:809-812)。不運なことに、インヒ
ビタータンパク質は、特定の食品中でしばしば望ましくない影響を及ぼす。大豆
中のトリプシンインヒビターは、特にKunitzトリプシンインヒビター（ＫＴＩ）
及びBowman-Birkトリプシンインヒビター(ＢＢＴＩ)タンパク質は、いずれの大
豆製品もヒト又は家畜によって摂取される前に不活性化されるにちがいない。こ
れら２つのインヒビタータンパク質は、化学的に水素化ホウ素ナトリウムで還元
されるとトリプシンインヒビターとして不活性になることが知られている（Birk
,Y.(1985),Int.J.Peptide Protein Res. 25:113-131、及びBirk,Y.(1976),Meth.
Enzymol. 45:695-739）。プロテアーゼを阻害する他のタンパク質様のこれらイ
ンヒビターは、分子内ジスルフィドを含み、通常熱及びタンパク質分解による不
活性化に安定である（Birk(1976)，前出；Garcia-Olmedoら(1987),前出、及びRy
an(1980)。現在、インヒビターによって引き起こされる逆効果を最少化するため
に、動物及びヒトの食料品中のこれら大豆トリプシンインヒビターと他のトリプ
シンインヒビターが、該食品を高温にさらすことによって処理されている。しか
し、高温処理は、完全にはインヒビター活性を除去しない。さらに、この方法は
、高価であるばかりでなく、重要な栄養価のある他のタンパク質の多くをも破壊
しうる。例えば、120℃、30分で大豆粉のＢＢＴＩの完全な不活性化を導くが、
最初のＫＴＩ活性の約20％が残存している（Friedmanら,1991）。インヒビター
の完全な不活性化に必要な長い又はより高い温度は、シスチン、アルギニン、及
びリジンのようなアミノ酸を破壊してしまう（Chaeら,1984；Skrede及びKrogdah
l,1985）。
【００１６】 α−アミラーゼ活性を必要とするいくつかの工業的方法もある。一例は、活性
なα−アミラーゼを必要とするオオムギの麦芽処理である。オオムギアミラーゼ
／サブチリシン（asi）インヒビター及び他の穀物中のその等価物のようなイン
ヒビターのチオールレドックスタンパク質還元による不活性化は、現在の手法に
よるよりも早くα−アミラーゼを完全に活性にし、それによって、麦芽処理又は
同様の処理の時間を短縮できる。
【００１７】 また、チオールレドックスタンパク質は、以前はトリプシン又はアミラーゼイ
ンヒビタータンパク質の不活性化には使用されていなかった。Kunitz及びBowman
-Birkインヒビタータンパク質のようなトリプシンインヒビターの還元は、それ
らの阻害効果を減少させる（Birk,Y.(1985),Int.J.Protein Res.25:113-131）。
ヒト及び家畜による消費のために設計された大豆製品中のインヒビターの還元に
関連するチオールレドックスタンパク質は、熱を必要とせず、又はタンパク質の
変性のために現在必要とされているより低い熱しか必要とせず、それによって、
大豆製品の品質の変性及び向上のコストを削減する。また、食品業界は化学的添
加剤に対する代替を探しているので、生理的還元剤、いわゆるクリーンな添加剤
（すなわち、「有害な化学薬品」としてみなされる成分の無い添加剤）が非常に
望ましい。さらに、製パン業界では、コムギ及びライムギからのドーの特性を改
良し、かつ穀物粉のような他の穀類の粉又はキャッサバ及び大豆粉からドーを製
造するために、チオールレドックスタンパク質のような生理的還元剤によって制
御された様式で小麦粉の品質に重要な主要コムギ及び種子所蔵タンパク質を選択
的に還元する能力が有用である。
【００１８】 種子の小胞体又は子葉中のタンパク質bodines内に収容されているトウゴマ及
びブラジルナッツのような（Kreisら,1989；Youle及びHuang,1981）２Ｓアルブ
ミンタンパク質系統の油貯蔵種子特性は(Ashtonら,1976；Weberら,1980)、通常
２つの分子間ジスルフィド結合によって連結された異なるサブユニット--７〜９
kDaの１つのサブユニット及び３〜４kDaのもう１つのサブユニットから成る。大
きいサブユニットは、２つの分子内ジスルフィド基を含み、小さいサブユニット
は含まない。２Ｓの大きいサブユニットの分子内ジスルフィドは、大豆Bowman-B
irkインヒビター(Kreisら,1989)のものと相同性を示すが、生理的条件下で還元
を受ける２Ｓタンパク質の能力については知られていない。
【００１９】 これら２Ｓアルブミンタンパク質は、メチオニンに富む。最近、ブラジルナッ
ツ２Ｓタンパク質を産生する遺伝子組換え大豆が生成された。このような大豆中
の２Ｓタンパク質の還元は、大豆タンパク質のドー網目構造への組込みを可能に
し、その結果メチオニンに富んだ大豆を生じる。さらに、これら２Ｓタンパク質
はしばしばアレルゲンである。２Ｓタンパク質の還元は、そのアレルギー活性の
停止をもたらす。
【００２０】 プルラナーゼ（「脱分枝酵素」）は、穀物種子の小胞体のデンプンをα-1,6結
合の加水分解性切断によって分解する酵素である。プルラナーゼは、醸造及び製
パン業にとって基礎となる酵素である。プルラナーゼは、麦芽処理及び砂糖又は
他の炭水化物を添加せずに行われる特有の焼成手順でデンプンを分解するのに必
要である。十分なプルラナーゼ活性を得ることが、麦芽処理業で特に問題である
。先般来、ジチオスレイトール（ＤＴＴ、チオレドキシン用の化学還元剤）が、
穀物調製品（例えば、オオムギ、オートムギ及び米粉）のプルラナーゼを活性化
することがわかっている。生理的に許容可能な系によるプルラナーゼの活性を十
分に活性化又は高めるための方法は、砂糖の有効性が高められ、増量されたアル
コール含量のビールのようなアルコール飲料の影響で、さらに早い麦芽処理法を
導くことができる。
【００２１】 ヘビ咬傷による死及び永久傷害は、多くのアフリカ、アジア及び南アメリカの
国々で重大な問題であり、米国のいくつかの南部及び西部地域における主要関心
事でもある。ヘビ由来の毒液は、分子内（鎖内）シスチン及びいくつかの場合に
は分子間（鎖間）シスチン内に位置するジスルフィド（Ｓ-Ｓ）架橋を含む活発
なタンパク質成分（通常いくつかの）によって特徴づけられる。特定の毒素基内
のシスチン位置は、高度に保存される。分子内Ｓ-Ｓ基の毒性に対する重要さは
、これらの基の還元がマウスの毒性の減少を導くことを示しているレポートから
明白である（Yang,C.C.(1967)Biochem.Biophys.Acta.133:346-355；Howard,B.D.
ら(1977)Biochemistry 16:122-125）。ヘビ毒液の神経毒は、運動神経末端から
の神経伝達物質の放出を変え、かつシナプス前性又はシナプス後性でありうるタ
ンパク質である。ヘビ毒液の神経毒に患う個体で観察される一般の症状は、はれ
、浮腫及び痛み、失神又はめまい、患部の刺痛又はしびれ、けいれん、筋肉収縮
、腎不全、さらに個体の長期壊死及び一般的な衰弱等を含む。
【００２２】 シナプス前性神経毒は、２つの群に分類される。第１の群は、β-神経毒であ
り、３つの異なる分類のタンパク質を含み、それぞれ高度な保存を示すホスホリ
パーゼＡ2成分を有する。ホスホリパーゼＡ2活性の原因であるタンパク質は、６
〜７個のジスルフィド架橋を有する。β-神経毒群は、単一鎖（例えば、カウド
トキシン、ノテキシン(notexin)及びマムシ毒）又は複数鎖（例えば、クロトキ
シン、セルレオ毒及びVipera毒）のどちらかである。２つのサブユニットから成
るβ-ブンガロトキシンは第３の群を構成する。これらサブユニットの１つは、
哺乳類の膵臓由来のKunitz型プロテイナーゼインヒビターに対して相同的である
。複数鎖β−神経毒がイオン的に連結されたタンパク質成分を有するのに対し、
β-ブンガロトキシンの２つのサブユニットは、分子間ジスルフィドによって共
有結合されている。哺乳類の膵臓由来のKunitz型プロテイナーゼインヒビターに
対して相同的でもあるβ-ブンガロトキシンのＢ鎖サブユニットは、３個のジス
ルフィド結合を有する。
【００２３】 第２のシナプス前性毒群、促進性神経毒は、酵素的活性を欠いており、２つの
亜群がある。第１の亜群、デンドロトキシンは、哺乳類の膵臓由来のKunitz型ト
リプシンインヒビターと相同的であり、かつ電位感受性カリウムチャネルを遮断
する、57〜60個のアミノ酸の単一のポリペプチド配列を有する。ファスチクリン
(fasciculins)のような（例えば、ファスチクリン１及びファスチクリン２）第
２の亜群は、コリンエステラーゼインヒビターであり、その他の点では広範に研
究されていない。
【００２４】 シナプス後性の神経毒は、長いか又は短い神経毒として分類される。各タイプ
は、Ｓ-Ｓ基を含むが、ペプチドは独特であり、ホスホリパーゼＡ2又はKunitz又
はKunitz型インヒビタータンパク質のいずれにも似ていない。短い神経毒（例え
ば、エラブトキシンａ及びエラブトキシンｂ）は、４個の分子内ジスルフィド結
合を有する60〜62個のアミノ酸残基長である。長い神経毒（例えば、α-ブンガ
ロトキシン及びα-コブラトキシン）は、65〜74個の残基と５個の分子内ジスル
フィド結合を含む。他のタイプの毒素、細胞毒は、シナプス後的に作用するが、
その毒性の態様は、病気で定義される。これら細胞毒は、不明瞭な薬理学的効果
、例えば、溶血、細胞溶解及び神経脱分極を示す。それらは、神経毒よりも毒性
が低い。細胞毒は、通常60個のアミノ酸と４個の分子内ジスルフィド結合を有す
る。ヘビ毒液の神経毒は、すべて複数の分子内ジスルフィド結合を有する。
【００２５】 有毒なヘビ咬傷を治療するために個体の最初の補助処理後に現在使用されてい
るヘビ抗毒素は、ウマ内で調製された抗毒素の静脈注射を含む。毒物注入後どの
くらいの間該抗毒素を投与でき、有効であるかわからないが、24時間までに使用
することが推奨されている。抗毒素治療は、一般的に血漿、アルブミン、血小板
又は特異的な凝固因子のような静脈内液の投与を伴う。さらに、補助薬、例えば
抗体、抗ヒスタミン、抗破傷風剤、鎮痛薬及び鎮静薬が与えられる。時には、一
般の治療基準が取られてショック、腎不全及び気道不全を最少化する。咬まれた
痕の近位にカルシウム-ＥＤＴＡを投与し、創傷部を切除する以外に毒素中和反
応及び血流中への毒素の阻止の取込みをもたらす局所的治療の公知の手段はない
。これら局所的治療でさえ、意義が疑わしく、通常ウマ血清に対する個体の感受
性のために保留される（Russell,F.E.(1983) Snake Venom Poisning,Schollum I
nterational,Inc. Great Neck,NY）。
【００２６】 ここで、用語「個体」は、動物又はヒトを意味する。 現在使用されている多くの抗毒素は、ウマ血清に感受性の患者内のアレルギー
反応に加え有害な副作用を生じうるという点で問題がある（患者の５％まで）。
非アレルギー性反応としては、発熱性ショック、及び補体欠乏が挙げられる（Ch
ippaur,J.-P.ら(1991)Reptile Venoms and Toxins,A.T.Tuら,Marcel Dekker,Inc
.,pp.529-555）。
【００２７】 ＮＡＤＰＨ及びチオレドキシンレダクターゼの存在下チオレドキシンは、細菌
の神経毒破傷風及びボツリヌス菌Ａをインビトロ還元することがわかった（Schi
avo,G.ら(1990)Infection and Immunity 58:4136-4141；Kistner,A.ら(1992)Nau
nyn-Schmiedeberg's Arch Pharmacol 345:227-234）。チオレドキシンは、破傷
風毒の鎖間ジスルフィド結合の還元に有効であり、かつこのように還元された破
傷風毒はもはや神経毒でない（Schiavoら,前出）。しかし、ボツリヌス菌Ａの鎖
間のジスルフィドのチオレドキシンによる還元は、ずっと緩慢であると報告され
た（Kistenerら,前出）。本発明の中で研究されるヘビ神経毒と対照的に、破傷
風研究グループ（Schoavoら,前出）は、還元されたチオレドキシンが毒素の鎖内
ジスルフィド結合を還元するという破傷風毒について為された仕事における証拠
を見出さなかった。ボツリヌス菌Ａについて為された研究でチオレドキシンが鎖
内ジスルフィドを還元する証拠もなかった。破傷風及びボツリヌス菌Ａ毒は、ヘ
ビ神経毒由来のタンパク質とは、後者が（１）低分子量である；（２）分子内ジ
スルフィド結合に富む；（３）トリプシン及び他の動物プロテアーゼに抵抗性で
ある；（４）酵素的修飾、例えばタンパク質分解的切断せずに活性である；（５
）多くの場合ホスホリパーゼＡ2及びKunitz型プロテアーゼのような動物のタン
パク質に対して相同性を示し；（６）ほとんどの場合、分子間ジスルフィド結合
を欠き、かつ（７）熱及びプロテアーゼのような因子に安定であるという点で有
意に異なる。
【００２８】 １％β-メルカプトエタノールとの６時間のインキュベーション及び８Ｍ尿素
プラス300mMβ-メルカプトエタノールとのインキュベーションによるヘビ咬傷毒
のインビトロ還元的不活性化が文献に報告されている（Howard,B.D.ら(1977)Bio
chemistry 16:122-125；Yang,C.C.(1967)Biochem.Biophys.Acta. 133:346-355）
。しかし、これらの条件は、生理的にはかけ離れている。ここで、毒タンパク質
について定義される「不活性化」は、該毒素がレセプターにもはや結合できない
という点で、該毒素がもはやインビトロ生物活性でないことを意味する。また、
ここで使用する「解毒」は、用語「不活性化」の拡張であり、かつ該毒素が動物
毒性試験によって決定されるように個体内で中和されたことを意味する。
【００２９】 ハチ毒液は、少なくとも40の個体成分を有する複合混合物であり、該毒液の総
質量のそれぞれ50％及び12％を示すメリチン及びホスホリパーゼＡ2として主要
成分と、小さいタンパク質及びペプチド、酵素、アミン、及びアミノ酸のような
少量成分とを含む。 メリチンは、分子量2840の26個のアミノ酸から成るポリペプチドである。それ
は、ジスルフィド架橋を含まない。脂質−水の相間の高いアフィニティのため、
タンパク質は細胞膜のリン脂質二重層に浸透し、その組織された構造を乱す。メ
リチンは、それ自体毒性ではないが、膜の構造を変え、それによってもう一方の
主要成分であり毒液中に存在する主要アレルゲンであるホスホリパーゼＡ2の加
水分解活性を高める。
【００３０】 ハチ毒液のホスホリパーゼＡ2は、128個のアミノ酸の単一のポリペプチド鎖で
あり、４個のジスルフィド橋で架橋され、かつ炭水化物を含む。ハチ毒液の主な
毒性効果は、メリチンに関連して達成されたホスホリパーゼＡ2の強い加水分解
活性に起因する。 ハチ毒液中の他の毒性タンパク質は、低分子量を有し、かつ重要な構造的役割
を演じると考えられる少なくとも２個のジスルフィド架橋を含む。プロテアーゼ
インヒビター（63〜65個のアミノ酸）、ＭＣＤ又は401-ペプチド(22個のアミノ
酸)及びアパミン（18個のアミノ酸）が含まれる。
【００３１】 ハチには数千の種があるが、ミツバチ、Apis melliferaだけがアレルギー反応
の重大な原因である。その応答は、局所的な不快感からショック、低血圧症、呼
吸困難、意識喪失、喘鳴及び／又は死に至りうる胸部圧迫に及ぶ。これら場合に
使用される唯一の治療は、エピネフリンの注射である。 ハチ刺されの治療は、アレルギー反応を有する個体にとってだけでなく重要で
ある。「キラー」又はアフリカ系ハチ、種々のミツバチは、ヨーロッパのミツバ
チよりもずっと攻撃的であり、かつ南北アメリカの両方で危険を表している。ア
フリカ系及びヨーロッパハチ由来の毒液の致死率は同様であるが（Schumacher,M
.I.ら(1989)Nature 337:413）、ミツバチの巣箱の挙動パターンは全く異なる。
アフリカ系ハチはコロニー障害により速く応答し、より多くの数でかつひどく刺
すことが報告された（Collins,A.M.ら(1982)Science 218:72-74）。アフリカ系
ハチによる集団攻撃は、１つの個体を数千箇所刺して死に至らしめうる。「キラ
ー」ハチは、アフリカ系ハチ（Apis mellifera scutellata）とヨーロッパハチ
（Apis mellifera mellifera）との品種間交雑の結果と考えられる。アフリカハ
チは、より熱帯的に順応されたハチによるハチミツ生産の改良を目的に1956年に
ブラジルに導入された。アフリカ系ハチは、南アメリカから北アメリカに移動し
、テキサス及びフロリダで報告された。
【００３２】 メキシコ、ブラジル、北アフリカ及び中東のような世界のいくつかの地域では
、サソリがヒトに対して命の危険を与えている。しかし、Buthidae科（属、Andr
octonus,Buthus,Centruroides,Leiurus及びTiyus）のサソリのみがヒトに毒性で
ある。サソリ毒液の化学的組成は、ヘビやハチ毒液ほど複雑ではない。サソリ毒
液は、ムコ多糖、少量のヒアルロニダーゼ及びホスホリパーゼ、低分子量分子、
プロテアーゼインヒビター、ヒスタミン遊離物質及びセロトニンのような神経毒
を含む。該神経毒は、神経筋接合部内の感圧イオン性チャネルに効果を及ぼす。
神経毒は、３〜４個のジスルフィド架橋を有する塩基性のポリペプチドであり、
２つの群に分類できる：61〜70個のアミノ酸を有し、ナトリウムチャネルを遮断
するペプチド、及び36〜39個のアミノ酸を有し、カリウムチャネルを遮断するペ
プチド。神経毒上のジスルフィド架橋の、ＤＴＴ又はβ-メルカプトエタノール
のような非生理的還元剤による還元は(Watt,D.D.ら(1972)Toxicon 10:173-181)
、それら毒性を減少させる。
【００３３】 有毒なサソリに刺された動物の症状は、過剰興奮性、呼吸困難、けいれん、麻
痺及び死を含む。現在、抗毒素は、サソリ咬傷用の解毒薬のみである。毒液の入
手可能性が抗毒の生産における主要問題である。ヘビ毒液と異なり、サソリ毒液
は、検体毎の毒液の収量が制限され、時には乾燥された毒液の貯蔵がその毒性の
変更を導くので収集が非常に困難である。抗毒素の生産におけるさらなる問題は
、神経毒が非常に乏しい抗原であることである。
【００３４】 生理的条件下におけるヘビ、ハチ及びサソリ毒の還元的不活性化は、報告され
ておらず、還元型リポ酸、ＤＴＴ、又は還元型チオレドキシンのようなチオール
レドックス剤が、個体内でこれら毒液に対して抗体として作用できることも示唆
されていない。
【００３５】 食物アレルギーも、国内及び国際的の両方に重要な長く継続的な問題を呈して
いる。米国人口の12歳未満の子供の５％まで及び成人の１％までが、慢性的に影
響を受けている（食物の副作用AAAI及びNIADレポート,1984,NIH Pub.No.84-2442
,pp.2,3）。いくつかの国では、数字が高く、世界中では、この問題は特に乳児
に増加していると考えられる（T.Matsuda及びR.Nakamura 1993、食物アレルゲン
の分子構造及び免疫学的特性、食品科学と技術の傾向4,289-293）。この問題は
、広範な食物に及ぶ。食物アレルギーは、一般に遺伝子組換え食品についての関
心の結果として最近注目されてきた。
【００３６】 ミルクは、特に乳児に重大な問題を提示する。コムギ及び大豆アレルギーは、
新しい集団がこれら食物を採用するので、重要になっており、ペット（特にドッ
グ）フード、における関心が高まっている。牛肉、米及び卵も多くの個体で重大
なアレルギーを引き起こし、この場合もやはりペットフードに関して重大な関心
事である。
【００３７】 上記食物中の主要アレルギー性タンパク質の多くは、分子内ジスルフィド（Ｓ
-Ｓ）結合を有するが、これまでは、食物アレルギーを最少にするために商業的
に２つの処理が施されていた：（１）加熱、及び（２）酵素的タンパク質分解。
両者の場合、部分的にしか成功しなかった。アレルゲン性を低くする時に、熱処
理は、原因のタンパク質は通常熱的に安定なので、最良の場合でさええ問題を除
去していない。さらに、熱は、リジン、システイン及びアルギニンのような重要
なアミノ酸を栄養的に破壊することによって製品の品質を低下させる。酵素的タ
ンパク質分解は、アレルゲン性を低減するにはうまくいくが、通常フレーバーの
ような望ましい食品特性が失われ、かつ処理にコストがかかる。従って、アレル
ゲン性食物に適用した場合に、フレーバーや栄養を失うことなくアレルゲン性が
減少又はなくなる生理学的に安全な系が極度に有益である。
【００３８】 特定の主要花粉アレルゲンは、非常に温度に耐性のジスルフィドタンパク質で
あることがわかっている。２つの花粉タンパク質が、ブタクサ花粉中の主要アレ
ルゲンとして記述されている。１つは、５kDaの小さいタンパク質、Amb a Vであ
り、４個のジスルフィド架橋を含有する（Goodfriend,L.ら(1985),「Ra5G、巨大
ブタクサ花粉内のRa5の相同体：単離、HLA-DR-関連活性とアミノ酸配列」,Mol.I
mmunol. 22:899-906；Matzler,W.J.ら(1992)、「ブタクサアレルゲンAmb t Vの
核磁気共鳴分光学による三次元解法構造の決定」Biochemistry 31:5117-5127；M
ole,L.E.ら(1975)、「ブタクサアレルゲンRa5のアミノ酸配列」Biochemistry 14
:1216-1220；Metzler,W.J.ら(1992)、「核磁気共鳴分光学によるブタクサアレル
ゲンAmb a Vのプロトン共鳴配置及び三次元解法構造」Biochemistry 31:8697-87
05）。このタンパク質は、短い及び巨大なブタクサ種の両方で相同体であると考
えられる。Amb a Vと呼ばれる短いブタクサタンパク質と、現在Amb t Vと呼ばれ
る巨大ブタクサは、両方とも以前はRa５と呼ばれ、45％の配列が類似性を示す。
【００３９】 他の主要アレルゲンは、Amb a 1.1、Amb a 1.2、Amb a 1.3及びAmb a 1.4と命
名された41kDaタンパク質の系統群を表す。ジスルフィド架橋について述べられ
ていないが、これらタンパク質は、複数のシステインを含む（Rafnarら（1991）
）、「Amb a I（抗原Ｅ）、短いブタクサ花粉の主要アレルゲン系統のクローニ
ング」J.Biol.Chem. 266:1229-1236；Griffith,I.J.ら(1991)、「Ambrosia arte
misiifolia(短いブタクサ)中の主要アレルゲン、Amb a IとAmb a IIの配列多形
性」Int.Arch.Allergy Appl.Immunol. 96:296-304）。さらに公知の他のアレル
ゲンは、それぞれ３個のジスルフィド架橋を有する8.5kDa西部ブタクサAmb P 5-
A及び-B（Ghosh,B.ら(1994)、「Ambrosia psilostachya（西部ブタクサ）花粉由
来のAmb ｐ Vアレルゲンの免疫学的及び分子特性」J.Immunol. 152:2882-2889）
及び１個のジスルフィド架橋を有する短いブタクサの11.4kDaプラストシアニン
様タンパク質、caUed Ra 3（Klapper,D.G.ら(1980)、「ブタクサアレルゲンRa3
のアミノ酸配列」Biochemistry 19:5729-5734）のようなジスルフィドタンパク
質である。
【００４０】 ５kDaのAmb Vブタクサ花粉タンパク質は、よく定義された構造を有し、４個の
分子内ジスルフィド結合の位置が正確にわかっている（Metzler,W.J.ら(1992)Bi
ochemistry 31:5117-5127）。以前の研究は、変性条件下化学的薬剤（尿素プラ
スジチオスレイトール又はβ-メルカプトエタノール）によって還元されると、
ＩｇＧ産生が高められるので、免疫応答がＩｇＥ(アレルギー性)からＩｇＧ(デ
フェンス)にシフトすることを示した（Zhu,X.ら(1995),「ブタクサ花粉アレルゲ
ンAmbrosia artemisiifolia（Amb a 5）とAmbrosia trifida(Amb t 5)のＴ細胞
エピトープマッピング及びＴ細胞認識における遊離スルフヒドリル基の役割」J.
Immunol. 155:5064-73）。
【００４１】 花粉アレルギーは、現在、未変性花粉抽出物による伝統的な免疫療法で治療さ
れている。しかし、このような治療は、特に子供では、潜在的に致死的なアナフ
ィラキシー反応という特有の危険をもたらす。従って、アナフィラキシー反応の
可能性を低減又は除去した免疫療法で使用する弱力化した花粉タンパク質又は花
粉抽出物が要望されている。また、特定の個体のアレルゲンがジスルフィドタン
パク質であるか否かを決定できる生理的に安全な系が要望されている。さらに、
アレルギー症状を軽減するが、現存の入手可能製品よりは副作用が生じない点眼
、鼻スプレー、アエロゾル、又は気化器又は加湿器用の分散剤が極度に有益であ
る。
【００４２】 （発明の概要） 本発明の目的は、非チオニンシスチン含有タンパク質を還元するための方法を
提供することである。 第２の目的は、チオールレドックスタンパク質を単独で又は還元剤若しくは還
元系と組み合わせて用いて、小麦粉又は種子中に存在するグルテニン又はグリア
ジンを還元する方法を提供することである。 また、チオールレドックスタンパク質を単独で、又は還元剤若しくは還元系と
組み合わせて使用して、ドーの強度及び優れた中身品質、焼成品の柔らかさ及び
塊のかさ高さのような焼成品特性を高める方法を提供することを目的とする。 さらに、本発明の目的は、このような方法を実施するのに有用なチオールレド
ックスタンパク質を含有する製剤を提供することである。 さらになお、米、コーン、大豆、オオムギ、オートムギ、キャッサバ、モロコ
シ又はキビ粉からドーを製造する方法を提供することを目的とする。
【００４３】 他の目的は、改良されたグルテンを製造し、又はコムギ又はライムギ以外の穀
物粒からグルテン様の製品を製造する方法を提供することである。 さらに、ジスルフィド結合を有する酵素インヒビタータンパク質を還元する方
法を提供するこが目的である。 本発明のさらなる目的は、チオレドキシンを発現又は過剰発現するように遺伝
的に操作されたイースト細胞を提供することである。 また、本発明の他の目的は、ＮＡＤＰ-チオレドキシンレダクターゼを発現又
は過剰発現するように遺伝的に操作されたイースト細胞を提供することである。 さらに、本発明の他の目的は、このように遺伝的に操作されたイースト細胞を
使用して、ドー又は焼成品の品質を改良する方法を提供することである。
【００４４】 さらになお、本発明の他の目的は、１個より多い分子内シスチンを含む非−チ
オニン、非緑葉体タンパク質の分子内ジスルフィド結合を還元する方法であって
、チオールレドックスタンパク質を、前記シスチン含有タンパク質を含む液体又
は物質に添加する工程、該チオールレドックスタンパク質を還元する工程及び該
シスチン含有タンパク質を、前記チオールレドックスタンパク質によって還元す
る工程を包含する方法を提供することである。 また、本発明の目的は、ジスルフィド結合を有し、かつ８〜15kDaの分子量の
単離プルラナーゼインヒビタータンパク質を提供することである。 さらに、本発明の目的は、オオムギ又はコムギの小胞体から誘導されたプルラ
ナーゼの活性を高める方法であって、プルラナーゼを含有する液体又は物質にチ
オレドキシンを添加する工程及びそのチオレドキシンを還元することによって、
プルラナーゼ活性を高める工程を包含する方法を提供することである。
【００４５】 さらに、本発明の他の目的は、１個以上の分子内シスチンを有する動物の毒液
毒タンパク質を還元する方法であって、該シスチン含有タンパク質を、該タンパ
ク質を還元するの有効量のチオールレドックス（ＳＨ）剤と接触させる工程、及
び１個以上の分子内シスチンの１個以上のジスルフィド架橋を還元するのに十分
な時間その接触を維持することによって、神経毒タンパク質を還元する工程を包
含する方法を提供することである。該チオールレドックス（ＳＨ）剤は、還元型
チオレドキシン、チオレドキシンの存在下の還元型リポ酸、ＤＴＴ又はチオレド
キシンの存在下のＤＴＴでよく、かつヘビ神経毒タンパク質は、シナプス前性又
はシナプス後性神経毒でよい。
【００４６】 さらに、本発明の目的は、ヘビ神経毒タンパク質及びチオールレドックス（Ｓ
Ｈ）剤を含む組成物を提供することである。 さらになお、本発明の目的は、１個以上の分子内シスチンを有する動物の毒液
毒タンパク質の還元方法であって、該タンパク質を、該タンパク質を還元するの
に有効量のＮＡＤＰ−チオレドキシンレダクターゼ、ＮＡＤＰＨ又はＮＡＤＰＨ
発生系及びチオレドキシンと接触させる工程、及び１個以上の分子内シスチンの
１個以上のジスルフィド架橋を還元するのに十分な時間その接触を維持すること
によって、タンパク質を還元する工程を包含する方法を提供することである。
【００４７】 さらに、本発明の他の目的は、１個以上の分子内シスチンを有するヘビ神経毒
素をインビトロ不活性化する方法であって、該毒素に、該毒素を還元するのに有
効量のチオールレドックス（ＳＨ）剤を添加する工程を包含する方法を提供する
ことである。 個体の毒液毒性を治療する方法であって、毒液毒性を患う個体に、該毒液毒性
を軽減するのに有効量のチオールレドックス（ＳＨ）剤を投与する工程を包含す
る方法を提供することである。 本発明の目的に従い、ドー特性を改良するための方法であって、チオールレド
ックスタンパク質をドー成分と混合して、ドーを形成し、前記ドーを焼成する工
程を包含する方法が提供される。
【００４８】 また、本発明の目的に従い、穀粒食料品内の酵素インヒビタータンパク質を不
活性化するための方法であって、チオールレドックスタンパク質を、種子製品と
混合し、該チオールレドックスタンパク質を還元剤又は還元系で還元し、かつそ
の還元されたチオールレドックスタンパク質によって、酵素インヒビターを還元
し、この還元が、該酵素インヒビターを不活性化する工程を包含する方法が提供
される。
【００４９】 ここで使用するチオールレドックスタンパク質は、チオレドキシン及びグルタ
レドキシンを包含しうる。チオレドキシンは、排他的ではないが、大腸菌チオレ
ドキシン、チオレドキシンｈ、ｆ及びｍ及び動物のチオレドキシンを含む。ここ
で使用されるチオレドキシンの還元剤は、リポ酸又はＮＡＤＰチオレドキシンレ
ダクターゼ（ＮＴＲ）と組み合わせたＮＡＤＰＨのような還元系を含むことがで
きる。グルタレドキシンの還元剤は、還元系ＮＡＤＰＨに連結した還元型グルタ
チオン及びグルタチオンレダクターゼを含むことができる。ＮＡＤＰＨは、ＮＡ
ＤＰＨジェネレータ又はイーストのような原料由来のグルコース６-ホスフェー
ト、ＮＡＤＰ及びグルコース６-ホスフェートデヒドロゲナーゼから成るものの
ようなジェネレータ組成物と置換され得る。ＮＡＤＰＨジェネレータは、ドー製
造プロセスの開始時にチオレドキシン及びＮＡＤＰ-チオレドキシンレダクター
ゼと共に添加される。
【００５０】 本発明は、システイン含有タンパク質についても実施できることに留意すべき
である。システインは、まず酸化され、それからチオールレドックスタンパク質
によって還元されうる。 さらに、本発明の目的に従い、アレルゲン性食物タンパク質のアレルゲン性を
減少させるための方法であって、該タンパク質を、該タンパク質のアレルゲン性
を低減するのに有効量のチオレドキシン、ＮＴＲ及びＮＡＤＰＨ又はチオレドキ
シンの存在下で有効量のＤＴＴと接触させる工程と、工程（ａ）で接触されたタ
ンパク質を動物に投与することによって、そうでなければ該動物が未処理タンパ
ク質を受けた場合、前記動物に生じるであろうアレルゲン性症状を低減する工程
を包含する方法が提供される。
【００５１】 本発明の他の目的は、低アレルゲン性の摂取食物を提供することである。該食
物は、ＮＴＲ及びＮＡＤＰＨの存在下でチオレドキシンによる前処理によって低
アレルゲン性にされた。食物は、牛肉、ミルク、大豆、卵、米又はコムギであり
うる。 本発明のさらなる目的は、食物及びアレルゲンタンパク質のたんぱく質分解ひ
いては消化性を高め、その結果としてその多くがアレルゲン性である可消化食物
をも提供することである。食物及びアレルゲンは、上述したようなチオレドキシ
ンの還元剤の存在下でチオレドキシンによる前処理によってタンパク質分解によ
り感受性になり、より消化できるようにされる。 適宜な食物としては、大豆、ナッツ、ミルク、ホエー、牛肉、卵、パン、他の
コムギ製品、及び他の穀粒品が挙げられる。
【００５２】 さらに、本発明の他の目的は、アレルゲン性花粉タンパク質のアレルゲン性を
低減する方法であって、該タンパク質を、該タンパク質のアレルゲン性を低減す
るのに有効量の還元型チオレドキシンと接触させ、該チオレドキシン還元タンパ
ク質を免疫療法の用量で動物に投与し、それによってそうでなければ該動物が未
処理タンパク質にさらされた場合に起こるであろう前記動物のアレルギー症状を
軽減する工程を包含する方法が提供される。
【００５３】 さらに本発明の他の目的は、免疫療法用の還元型ジスルフィド結合を有する低
アレルゲン性の花粉又は花粉タンパク質を提供することである。 本発明のさらに別の目的は、特定の個体にとってジスルフィドタンパク質がア
レルゲンか否かを決定するための方法であって、前記個体にアレルギー試験を施
し、前記アレルゲンを同定し、前記同定されたアレルゲンタンパク質を、還元型
チオレドキシンでインビトロ処理し、かつ前記処理されたアレルゲンタンパク質
を、ジスルフィド結合還元について解析する工程を包含する方法が提供される。
【００５４】 （発明の詳細な説明） この詳細な説明により、以下の定義及び略語を適用する。 ＣＭ −特定のパンコムギα-アミラーゼインヒビター ＤＳＧ −マカロニコムギから単離された特定のα-アミラーゼインヒビター ＤＴＮＢ −2'5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸) ＮＴＲ −ＮＡＤＰ-チオレドキシンレダクターゼ ｍＢＢｒ −モノブロモビメイン（monobromobimane） ＮＡＤＰ-ＭＤＨ −ＮＡＤＰ-マレートデヒドロゲナーゼ ＦＢＰアーゼ −フルクトース-1,6-ビスホスファターゼ ＳＤＳ −ナトリウムドデシルスルフェート ＤＴＴ ジチオスレイトール Cereal −キビ、コムギ、オートムギ、オオムギ、米、モロコシ、又はライムギ ＢＢＴＩ −Bowman-Birk大豆トリプシンインヒビター ＫＴＩ −Kunitz大豆トリプシンインヒビター ＰＡＧＥ −ポリアクリルアミドゲル電気泳動 ＴＣＡ −トリクロ酢酸
【００５５】 酵素インヒビタータンパク質実験 出発原料 （原料） パンコムギ（Triticum aestivum L,cv.Talent）及びマカロニコムギ（Triticu m durum. Desf.,cv.Mondur）は、実験室貯蔵品から得た。 （試薬） 酵素アッセイ用の薬品と精薬品及びナトリウムドデシルスルフェート(ＳＤＳ)
-ポリアクリルアミドゲル電気泳動は、それぞれ、Sigma Chemicals Co.及びBio-
Red 研究所から購入した。モノブロモビメイン（ｍＢＢｒ、商標名Thiolite）は
、Calbiochemから購入した。他の薬品は、商業的な出所から得、入手可能な最高
の品質のものだった。
【００５６】 （酵素） 大腸菌由来のチオレドキシン及びＮＴＲは、American Diagnostics、Inc.から
購入し、かつ形質転換された細胞から単離され、各タンパク質を過剰発現した。
組換え型プラスミド、ｐＦＰ１を含有するチオレドキシン系統は、J.-P.Jacquot
博士の好意で提供された（de la Motte-Guery、F.ら(1991)Eur.J.Biochem. 196:2
87-294）。組換え型プラスミドｐＰＭＲ21を含有するＮＴＲ系統は、Marjorie R
ussel博士及びPeter Model博士の好意で提供された（Russel,M.ら(1988)J.Biol.
Chem. 263:9015-9019）。これらタンパク質用に使用した単離手順は、以下の変
更を伴い、それら研究で述べられている通りだった：細胞は、Ribi細胞分画器内
で1.7×108Pa(25,000psi)で破壊され、ＮＴＲは、Florencioら(Florencio,F.ら(
1988)Arch.Biochem.Biophys.266:496-507)よって記述されている通りに、赤色ア
ガロース工程なしで精製された。サッカロミセスセレビジエ（パン酵母タイプ１
）由来のチオレドキシン及びＮＴＲは、以下の変更を伴い、Florencioらによっ
てホウレンソウの葉用に開発された手順によって単離された：懸濁された細胞[
１部の細胞：５部の緩衝液(W/V)]が、Ribi細胞分画器内で2.8×108Pa(40,000psi
)で３回通過により破壊された。
【００５７】 チオレドキシンｈ及びＮＴＲは、ホウレンソウの葉用に開発された手順でコム
ギ胚芽から単離された(Florencio,F.ら(1988)Arch.Biochem.Biophys.266:496-50
7)。ＮＡＤＰ-マレートデヒドロゲナーゼ(ＮＡＤＰ-ＭＤＨ)及びフルクトース-1
,6-ビスホスファターゼ(ＦＢＰアーゼ)は、それぞれコーンの葉(Jacquot,J.-P.
ら(1981),Plant Physiol. 68:300-304)及びホウレンソウ（Crawford,N.A.ら(198
9),Arch.Biochem.Biophys.271:223-239)から精製された。大腸菌グルタレドキシ
ン及び子ウシ胸腺チオレドキシンは、A.Holmgren教授から得た。
【００５８】 （α-アミラーゼ及びトリプシンインヒビター） ＣＭ-1タンパク質は、以前に記載されているように（Kobrehel,K.ら(1991),Ce
real Chem. 68:1-6）、パンコムギ粉のアルブミン−グロブリンフラクションか
ら単離された。公開されている手順は、マカロニコムギのグルテニンフラクショ
ンからＤＳＧタンパク質（ＤＳＧ-1及びＤＳＧ-2）を単離するのにも使用した（
Kobrehel,K.ら(1989),J.Sci.Food Agric. 48:441-452）。ＣＭ-1、ＤＳＧ-1及び
ＤＳＧ-2タンパク質は、ＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動で均一だった
。トリプシンインヒビターは、Flucaから得たコーンカーネル以外はSigma Chemi
cals Co.から購入した。すべての場合、市販調製品は、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ（クー
マシーブルー染色）で予想通りに移動される単一のタンパク質成分を示したが、
特定の調製品では、バンドがシャープでなかった。
【００５９】 （他のタンパク質） パンコムギ由来のピューロチオニンα及びマカロニコムギ由来のピューロチオ
ニンα-1及びβは、それぞれ、D.D.Kasarda博士及びB.L.Jones博士からの親切な
ギフトだった。ＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動で試験するとき、ピュ
ーロチオニンα試料は、ピューロチオニン系統の２つのメンバーを含んでいた。
ピューロチオニンα-1及びβ試料は、ＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動
で両方とも均一だった。
【００６０】 日常的な方法工程 （酵素活性化アッセイ） ＮＡＤＰ-ＭＤＨ、ＦＢＰアーゼ、ＮＴＲ及びチオレドキシンｈアッセイ法は
、示されるようにわずかに修正して、Florencio,F.ら(1988)Arch.Biochem.Bioph
ys.266:496-507に従った。特に言及しない場合、酵素活性化アッセイのための予
備インキュベーション時間は20分だった。
【００６１】 （ｍＢＢｒ蛍光標識化及びＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動解析） 研究中タンパク質の直接還元は、Crawfordらの方法（Crawford,N.A.ら(1989),
Arch.Biochem.Biophys.271:223-239）を修正して決定された。反応は、0.1mlの
最終体積に10mMＥＤＴＡと16％グリセロールを含有する100mMリン酸カリウム緩
衝液中、ｐＨ7.1で行った。示されるように、0.7μg（0.1μM）ＮＴＲ及び１μg
（0.8μM）チオレドキシンが、両方とも大腸菌から日常的に１mMＮＡＤＰＨと10
μg(２〜17μM)の標的タンパク質を含有する70μlの緩衝溶液に添加された。チ
オレドキシンがジチオスレイトール（ＤＴＴ,0.5mM）で還元されるとき、ＮＡＤ
ＰＨ及びＮＴＲは省略された。還元型グルタチオンによるアッセイは同様に行わ
れたが、最終濃度は１mMだった。20分間のインキュベーション後、100ナノモル
のｍＢＢｒが添加され、反応がさらに15分間継続された。反応を停止し、過剰の
ｍＢＢｒを誘導体化するため、10μlの10％ＳＤＳと10μlの100mMβ-メルカプト
エタノールが添加され、その試料がゲルに与えられた。グルタレドキシンによる
還元の場合、チオレドキシンとＮＴＲは、１μl（0.8mM）大腸菌グルタレドキシ
ンに置き換えられ、ホウレンソウの葉から精製された(Florencio,F.ら(1988)Arc
h.Biochem.Biophys.266:496-507)1.4μg（0.14mM）グルタチオンレダクターゼと
1.5mMＮＡＤＰＨが使用された。
【００６２】 ゲル（1.75％w/v、1.5mm厚さ）が、Laemmli(Laemmli,U.K.(1970),Nature 227:
680-685)に従って調製され、一定電流(９mA)で16時間展開された。電気泳動後、
ゲルは40％メタノールと10％酢酸の溶液中に置かれ、溶液を数回変えながら４〜
６時間浸漬された。そして、ゲルは、近紫外線で蛍光バンドについて調べられ、
Crawfordら（Crawford,N.A.ら(1989),Arch.Biochem.Biophys.271:223-239）に従
って撮影された。最後に、クーマシーブルーでゲルが染色され、従前同様に脱染
された（Crawford,N.A.ら(1989),Arch.Biochem.Biophys.271:223-239）。
【００６３】 （標識タンパク質の定量化） ＮＡＤＰ／チオレドキシン系による試験タンパク質の還元の程度の定量的指標
を得るために、ＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動で見られたそれらの蛍
光バンドの強度が、Crawfordら（Crawford,N.A.ら(1989),Arch.Biochem.Biophys
.271:223-239）の手順の修正を使用して評価された。Pharmacia Ultrascanデン
シトメーターを用いて写真ネガが走査され、ピーク下の領域が、各タンパク質に
ついて決定されている標準曲線との比較によって定量化された。後者の決定のた
め、各タンパク質は（１〜５μgの濃度範囲で）、0.5mMＤＴＴの存在下、100℃
で３分間加熱することによって還元された。そして、ＳＤＳと、β-メルカプト
エタノールで誘導体化された過剰ｍＢＢｒで反応が停止された後、標準は100℃
で２分間加熱されることを除き、上述と同様に、ｍＢＢｒによる標識化が行われ
た。蛍光バンドの強度は、添加されたタンパク質の量に比例するので、使用条件
下で還元が完了すると仮定された。
【００６４】 実施例１ α-アミラーゼインヒビターのチオレドキシン連結還元 （酵素活性化アッセイ） 葉緑体酵素の活性化で特有のチオレドキシンを置換する可能性は、あるタンパ
ク質のチオール基が可逆的なレドックス変化を受ける能力についての一試験であ
る。色素体外タンパク質の場合生理的ではないとしても、この試験はいくつかの
研究で有用であることがわかった。好適例は、ピューロチオニンであり、チオレ
ドキシンｈによって還元されると、葉緑体ＦＢＰアーゼを活性化する（Wada,K.
ら(1981),FEBS Lett. 124:237-240、及びJohnson,T.C.ら(1987),Plant Physiol.
85:446-451）。その生理活性因子がチオレドキシンｆであるＦＢＰアーゼは、
チオレドキシンｈの影響を受けない。この例では、シスチン−リッチのタンパク
質のＦＢＰアーゼ及びＮＡＤＰ-ＭＤＨを活性化する能力が、上述したように試
験された。マカロニコムギ由来のα-アミラーゼインヒビター(ＤＳＧ-1及びＤＳ
Ｇ-2)は、酵素の活性化に有効であることがわかった；しかし、それらは、ＦＢ
ＰアーゼよりもむしろＮＡＤＰ-ＭＤＨに特異性を示す点で、ピューロチオニン
とは異なる(表I)。α-アミラーゼインヒビターは、還元型チオレドキシンｈが存
在する場合のみ活性であり、これら条件下ではそれ自体ＮＡＤＰ-ＭＤＨを有意
には活性化しない。反応順序（ＤＴＴ→チオレドキシン→ＤＳＧ→ＮＡＤＰ-Ｍ
ＤＨ）に従い、ＤＳＧ-1及びＤＳＧ-2は、ＤＴＴ-還元型チオレドキシンｈの存
在下、ＮＡＤＰ-マレートデヒドロゲナーゼを活性化した。
【００６５】 200μlの100mMトリス-ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ7.9内に含まれる活性化用の完全な
系は、10mMＤＴＴ、0.7μgコーンの葉ＮＡＤＰ-ＭＤＨ、0.25μgコムギチオレド
キシンｈ及び10μgのＤＳＧ-1又はＤＳＧ-2だった。一研究では、20mMのβ-メル
カプトエタノール（β-ＭＥＴ）が、ＤＴＴの代わりに使用された。予備インキ
ュベーション後、ＮＡＤＰ-ＭＤＨが分光光度的にアッセイされた。 酵素活性化アッセイでは、チオレドキシンｈは、ＤＴＴで還元され；予想通り
、β-メルカプトエタノール（β-ＭＥＴ）のようなモノチオールは、これら条件
下で有意な速度ではチオレドキシンを還元せず（Jacquot,J.-P.ら(1981),Plant
Physiol. 68:300-304；Nishizawa,A.N.ら(1982),「葉緑体分子生物学における方
法」,(M.Edelman,R.B.Hallick及びN.-H.Chua,eds.)pp.707-714、Elsevier Biome
dical Press,New York,及びCrawford,N.A.ら(1989),Arch.Biochem.Biophys.271:
223-239）、ＤＴＴを置換しなかった。
【００６６】 ＮＡＤＰ-ＭＤＨ活性は、一定のチオレドキシンｈ濃度で、添加されたＤＳＧ-
1及びＤＳＧ-2の濃度に比例した。上述と同様に同一のＤＤＴ処方が使用された
。ＤＳＧ-1又はＤＳＧ-2濃度を変える以外、条件は前述の条件と同一だった。固
定のＤＳＧ濃度で試験した場合、ＮＡＤＰ-ＭＤＨは、チオレドキシンｈを増加
するにつれて活性が高められた。チオレドキシンｈ濃度を変える以外、条件は上
記と同様だった。
【００６７】 表Ｉに示されるように、20μgのＣＭ-1が使用される場合、ＣＭ-1――ＤＳＧ
タンパク質と同様であるが、より低分子量である――もＮＡＤＰ-ＭＤＨを活性
化し、ＦＢＰアーゼを活性化しなかった。この結果は、チオレドキシンｈが種々
のα-アミラーゼインヒビターを還元し、式４〜６に従い、順次、ＮＡＤＰ-ＭＤ
Ｈを活性化することを示している。ＤＴＴがチオレドキシンの不在下で添加され
た場合、これらタンパク質は、酵素活性化に効果がなかった。 （４）ＤＴＴred＋チオレドキシンｈ ox→チオレドキシンｈ red＋ＤＴＴox （５）α-アミラーゼインヒビターox＋チオレドキシンｈ red→α-アミラーゼ インヒビターred＋チオレドキシンｈ ox （６）α-アミラーゼインヒビターred＋ＮＡＤＰ-ＭＤＨox（不活性）→ α-アミラーゼインヒビターox＋ＮＡＤＰ-ＭＤＨred（活性
）
【００６８】 表Ｉ 葉緑体ＮＡＤＰ-マレートデヒドロゲナーゼ及びフルクトースビスホスファタ
ーゼの活性化におけるチオレドキシン-還元型トリプシンインヒビター、チオニ
ン、及びα-アミラーゼインヒビターの有効性 （ＤＴＴ→チオレドキシン→指示タンパク質→標的酵素） この実施例では、試験するＤＳＧ又は他のタンパク質の量が20μgであるこを
除き、上述と同様にＮＡＤＰＨ-ＭＤＨの活性化が行われた。ＦＢＰアーゼ活性
化は、標準ＤＴＴアッセイ法によって、１μgの大腸菌チオレドキシンと20μgの
指示タンパク質で試験された。上記値は、これら条件下、大腸菌チオレドキシン
についてわかっている限定された活性化に対して補正されている。 *活性、nkat/mg 番号 タンパク質 Mr,kDa S-S基 NADP-MDH FBPアーゼ α-アミラーゼインヒビター **ＤＳＧ-2 17 5 2 0 **ＤＳＧ-1 14 5 2 0 §ＣＭ-1 12 5 12 0トリプシンインヒビター シスチン-リッチ (植物) コーンカーネル 12 5 5 0 大豆Bowman-Birk 8 7 3 0他の種類 オボムコイド 28 9 2 0 大豆Kunitz 20 2 2 0 オボインヒビター 49 14 1 0 ウシ肺(アプロチニン) 7 3 痕跡 2チオニン **ピューロチオニン-α1 6 4 1 39 **ピューロチオニン-β 6 4 痕跡 5§ピューロチオニン-α 6 4 0 14 * これら値は、それぞれホウレンソウ葉緑体チオレドキシンｍ(ＮＡＤＰ-ＭＤ
Ｈ)及びチオレドキシンｆで得られた40及び550に対応する値と比較する。 ** マカロニ小麦由来 § パンコムギ由来
【００６９】 実施例２ ＤＴＮＢ還元アッセイ チオールレドックス活性の第２の試験は、スルフヒドリル試薬、2',5'-ジチオ
ビス(2-ニトロ安息香酸)（ＤＴＮＢ）の還元を触媒する能力であり、412nmにお
ける吸収の増加で測定される。ここで、アッセイされるタンパク質は、ＮＴＲ及
びチオレドキシンを介してＮＡＤＰＨによって還元された。ＤＴＮＢアッセイに
よって、マカロニコムギ由来（ＤＳＧ-1及び2）と、パンコムギ由来（ＣＭ-１）
の両方のα-アミラーゼインヒビターに対して有効であることがわかった。ＮＡ
ＤＰ/チオレドキシン系（この場合大腸菌由来のＮＴＲとチオレドキシンを用い
た）によって還元されると、ＤＳＧ-1又はＤＳＧ-2は、いずれもＤＴＮＢの還元
を顕著に促進した（ＮＡＤＰＨ→ＮＴＲ→チオレドキシン→ＤＳＧ→ＤＴＮＢ）
。ＤＴＮＢ還元アッセイは、10μgのチオレドキシンと、10μgのＮＴＲと、20μ
gのＤＳＧ-1又はＤＳＧ-2で行った。ＣＭ-1も、ＮＡＤＰ-ＭＤＨ活性化について
、ＤＴＮＢ還元アッセイで有効であり(表Ｉ)、ＤＳＧタンパク質より検出可能に
活性だった。ＣＭ-1アッセイの条件は、ＤＳＧタンパク質が省略され、ピューロ
チオニンα、20μg又はＣＭ-1、20μgが使用されること以外、ＤＳＧ/ＤＴＮＢ
アッセイと同様だった。このようにして、その結果から、実施例１の酵素活性化
実験を確認し、かつα-アミラーゼインヒビターはＮＡＤＰ/チオレドキシン系に
よって生理的に還元されうることがわかった。これら条件下でのＤＴＮＢの還元
の促進におけるα-アミラーゼインヒビターの役割は、式７〜９に要約されてい
る。 ＮＴＲ （７）ＮＡＤＰＨ＋チオレドキシンox ――→ チオレドキシンred＋ＮＡＤＰ （８）チオレドキシンred＋α-アミラーゼインヒビターox→ チオレドキシンox＋α-アミラーゼインヒビターred （９）α-アミラーゼインヒビターred＋ＤＴＮＢox→ α-アミラーゼインヒビターox＋ＤＴＮＢred
【００７０】 実施例３ タンパク質還元の測定 モノブロモビメイン（ｍＢＢｒ）及びその植物系用途での採用のアベイラビリ
ティは、植物タンパク質のスルフヒドリル基を測定するための新規な技法を与え
た（Crawford,N.A.ら(1989),Arch.Biochem.Biophys.271:223-239）。ＳＤＳ-ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動と連結すると、ｍＢＢｒを使用して、レドックス
活性タンパク質のスルフヒドリル状態の変化を、複雑な混合物においてでさえ定
量化することができる。従って、この技法をインヒビタータンパク質に適用して
、チオレドキシンによる還元に対するそれらの能力を確認できる。ここで、試験
タンパク質は、それ自体すでにＤＴＴ又はＮＡＤＰＨ及びＮＴＲのいずれかによ
って還元されていたチオレドキシンによって還元された。そして、その還元され
たタンパク質のｍＢＢｒ誘導体が調製され、ＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電
気泳動によって他の成分から分離され、その還元状態が蛍光によって調べられた
。後述する実験で、大腸菌由来のチオレドキシンが、各標的タンパク質の還元に
有効であることがわかった。平行実験は、チオレドキシンｈ及び子ウシ胸腺チオ
レドキシンが、それぞれ種子及び動物源由来のタンパク質を還元することを明ら
かにした。
【００７１】 酵素活性化及び染料還元実験の確認において、ＤＳＧ-1がチオレドキシンの存
在下で効率的に還元された。インキュベーション後、そのタンパク質はｍＢＢｒ
で誘導体化され、ＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動後蛍光が可視化した
。還元は、ＤＴＴのみではずっと少なく、ＧＳＨではごくわずかだった。チオレ
ドキシンについて同様の要求が、ＣＭ-1及びＤＳＧ-2の還元に対して観察された
（データは示さず）。使用したチオレドキシンは大腸菌由来であったが、コムギ
チオレドキシンｈについて同様の結果が得られた。ＤＴＴがＮＡＤＰＨ及びＮＴ
Ｒで置換された場合にも、チオレドキシンが必要だった（データは示さず）。
【００７２】 実施例４ シスチン−リッチ植物トリプシンインヒビターのチオレドキシン連結還元 コムギ種子の主要な可溶性シスチン−リッチタンパク質は、外来性のα-アミ
ラーゼのインヒビターとして作用することができるのに対して、多くの他の種子
のシスチン−リッチタンパク質は、この活性を欠いており、特定の場合には、動
物源由来のトリプシンの特異的インヒビターとして作用する。これらタンパク質
は、水素化ホウ素ナトリウム（Birk,Y.(1985),Int.J.Peptide Protein Res. 25:
113-131、及びBirl,Y.(1976),Meth.Enzymol. 45:695-7390）のような強い化学的
還元剤で還元されるが、それらが生理的条件下で還元されうるという証拠はほと
んどない。従って、トリプシンインヒビターのチオレドキシンによって還元され
る能力を試験することは興味深い。試験されたシスチン−リッチの代表例として
は、大豆Bowman-Birk及びコーンカーネルトリプシンインヒビターが挙げられる
。両者の場合の結果は明白であり：各インヒビターはＤＴＴ還元チオレドキシン
の存在下で添加されると、ＮＡＤＰ-ＭＤＨ(ＦＢＰアーゼではなく)を活性化し
（表Ｉ）、かつそれぞれＮＡＤＰＨ、ＮＴＲ及びチオレドキシンの存在下でＤＴ
ＮＢを還元した（データは示さず）。
【００７３】 α-アミラーゼインヒビターについて見られたように、シスチン−リッチトリ
プシンインヒビターのチオレドキシン依存還元は、ｍＢＢｒ/ＳＤＳ-ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動法によって直接監視できた。このように、還元型チオレド
キシンの存在下でのみ両者ともＤＴＴによる有意な還元が観察され、Bowman-Bir
k（ＢＢＴＩ）インヒビターでは高い蛍光性の速い移動バンドを示し、かつコー
ンカーネル（ＣＫＴＩ）トリプシンインヒビターは、チオレドキシンの背後に移
動する高い蛍光性のバンドを示した。
【００７４】 実施例５ 他のトリプシンインヒビター及びピューロチオニンのチオレドキシン連結還元 種子由来のシスチン−リッチトリプシンインヒビターがチオレドキシンによる
特異的な還元を受けうるという発見を考慮すると、他のタイプのトリプシンイン
ヒビタータンパク質がこの性質を共有するかどうかという問題が生じた。この研
究の過程で、このようなインヒビターのいくつか――大豆Kunitz、ウシ肺アプロ
チニン、卵白オボインヒビター及びオボムコイドトリプシンインヒビター――が
試験された。試験したパラメータは、上記シスチン−リッチタンパク質について
のように広範ではないが、酵素活性化及びｍＢＢｒ/ＳＤＳ-ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動法で測定されるように、他のトリプシンインヒビターも、チオレド
キシンによって特異的に還元される能力を示すことがわかった。上記のシスチン
−リッチタンパク質の場合のように、本研究のこの段階で試験されたトリプシン
インヒビターは（大豆Kunitz及び動物のトリプシンインヒビター）、ＦＢＰアー
ゼではなく、ＮＡＤＰ-ＭＤＨを活性化した（表Ｉ）。ウシ肺アプロチニンは、
ＮＡＤＨ-ＭＤＨより、ＦＢＰアーゼをより効率的に活性化するという点で例外
であった。アプロチニンは、それが高いシスチン含量（約10％）を示すという点
で、ここで研究された特定の種子タンパク質に似ていることが注目される（Kass
el,B.ら(1965),Biochem.Biophys.Res.Commun. 20:463-468）。
【００７５】 これらタンパク質の１つであるKunitzインヒビターのチオレドキシン連結還元
に対する蛍光の証拠は、ｍＢＢｒ/ＳＤＳ-ポリアクリルアミド電気泳動ゲル内の
高い蛍光性の遅い移動バンドによって示された。その還元形態では、該Kunitzイ
ンヒビターは、蛍光性の速い移動バンドをも生成した。このより低分子量種の性
質は知られていない。そのゲル上での位置が、それが、Kunitz調製品中に混入物
として存在するBowman-Birkインヒビターを示すことを示唆している；しかし、
このような成分はクーマシーブルー染色ＳＤＳゲル中に見えなかった。予想分子
量の単一蛍光バンドを生成する動物のインヒビターも、還元に対してチオレドキ
シン要求を示した（データは示さず）。
【００７６】 以前の結果の確認において、チオレドキシン還元ピューロチオニンは、一貫し
てＦＢＰアーゼを活性化し、かつ以前に試験されたタイプ、ピューロチオニン-
αは、ＮＡＤＰ-ＭＤＨを活性化し損なった（表Ｉ）（Wada,K.ら(1981),FEBS Le
tt. 124:237-240）。しかし、パンコムギ由来のピューロチオニン-αと対照的に
、以前には調べなかった２つのピューロチオニン（マカロニコムギ由来のピュー
ロチオニンα-1及びβ）は、検出可能にＮＡＤＰ-ＭＤＨを活性化した(表Ｉ)。
この２つのマカロニコムギピューロチオニンは、ＦＢＰアーゼを活性化する能力
も異なる。これらピューロチオニン間の活性の差は、それらのアミノ酸配列（Jo
nes,B.L.ら(1977),Cereal Chem. 54:511-523）及びチオレドキシンによる還元を
受ける能力が非常に類似することを考慮すると予想外だった。チオレドキシンに
対する要求は、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ蛍光法によってピューロチオニン（ここではα-
型）の還元について観察された。
【００７７】 実施例６ 還元の定量化 上記実施例は、チオレドキシンが、ＣＭ及びＤＳＧインヒビターのようなα-
アミラーゼ、及び種子及び動物源由来のトリプシンインヒビターを含む種々のタ
ンパク質を還元することを示している。上記結果は、定性的な意味では明かであ
るが、還元の程度の定量的な指標を何ら与えていない。そこで、Crawfordらの手
順（Crawford,N.A.ら(1989),Arch.Biochem.Biophys.271:223-239）に従って実験
を行った。
【００７８】 表IIに示されるように、大腸菌ＮＡＤＰ/チオレドキシン系による種子インヒ
ビタータンパク質の還元の程度は、時間に依存し、かつ２時間後にタンパク質に
よって決まる、15〜48％還元に達した。主要タンパク質成分によって放出される
蛍光に基づく結果は、チオレドキシンがα-アミラーゼ及びトリプシンインヒビ
ターの還元で触媒的に作用することを示している。チオレドキシン添加２時間後
に還元されたタンパク質の割合は、最も高度に還元されたタンパク質（大豆Bowm
an-Birkトリプシンインヒビター）と最も低度に還元されたタンパク質（コーン
カーネルトリプシンインヒビター）の両者に対する割合――すなわち、それぞれ
２時間の還元時間後７及び２の割合より大きかった。表IIの値は、標準的なアッ
セイ条件下で得られ、かつそれら条件を変更することによって還元を最適化する
ことは何ら試みなかったことに留意すべきである。
【００７９】 表II ｍＢＢｒ/ＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動法を用いたＮＡＤＰ/チオ
レドキシン系による種子タンパク質の還元の程度 以下の濃度のタンパク質が使用された（ナノモル）：チオレドキシン、0.08；
ＮＴＲ、0.01；ピューロチオニン-β、1.7；ＤＳＧ-1、0.7；コーンカーネルト
リプシンインヒビター、1.0；Bowman-Birkトリプシンインヒビター、1.3；及びK
unitzトリプシンインヒビター、0.5。指示された時間の相異を除き、他の条件は
実施例１〜４におけるのと同様だった。 ％還元タンパク質 20分後 120分後 ピューロチオニン-β 15 32 ＤＳＧ-1 22 38 コーンカーネルトリプシンインヒビター 3 15 Bowman-Birkトリプシンインヒビター 25 48Kunitzトリプシンインヒビター 14 22
【００８０】 実施例７ 還元剤としての大腸菌グルタレドキシン 細菌及び動物が、リボヌクレオチド還元のような反応でチオレドキシンを置換
できるチオールレドックスタンパク質、グルタレドキシンを持っていることは公
知である（Holmgren,A.(1985),Annu.Rev.Biochem. 54:237-271）。グルタレドキ
シンは、式10及び11に示されるように還元される。 グルタチオン （10）ＮＡＤＰＨ＋ＧＳＳＧ ―――――→ ２ＧＳＨ＋ＮＡＤＰ レダクターゼ （11）２ＧＳＨ＋グルタレドキシンox → ＧＳＳＧ＋グルタレドキシンred
【００８１】 今日まで、グルタレドキシンが高等植物由来のタンパク質と相互作用するとい
う証拠はない。この能力が、大腸菌由来のグルタレドキシンと、本研究中の種子
タンパク質とを用いて試験された。還元活性は、比重走査を関連させたｍＢＢｒ
/ＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によって監視された。前述した条件
下、グルタレドキシンが、すべての場合ではないが、ある場合に有効にチオレド
キシンを置換できることが観察された。このようにして、グルタレドキシンが、
以下の還元で活性であることがわかった（数値は、大腸菌チオレドキシンに対す
る還元パーセンテージを示す）：ＤＳＧ-1及びＣＭ-1α-アミラーゼインヒビタ
ー（それぞれ、147％及び210％）；コーンカーネルトリプシンインヒビター（42
4％）；及びピューロチオニン（α、α1及びβ型についてそれぞれ82、133、及
び120％）。グルタレドキシンは、ＤＳＧ-2α-アミラーゼインヒビターと、大豆
Bowman-Birk及びKunitzトリプシンインヒビターの反応には有効でなかった。動
物源由来のトリプシンインヒビターも、グルタレドキシンに対して雑多な応答を
示した。卵白オボインヒビターは効率的に還元されたのに対し（大腸菌チオレド
キシンに対して55％還元）、卵白オボムコイドインヒビター及びウシ肺アプロチ
ニンは影響されなかった。意味深いことに、以前報告されたように（Wolosiuk,R
.A.ら(1977),Nature 266:565-567）、グルタレドキシンは、葉緑体、ＦＢＰアー
ゼ及びＮＡＤＰ-ＭＤＨのチオレドキシン連結酵素の活性化において、中間還元
体としてチオレドキシンを置換し損なった（データは示さず）。
【００８２】 上記実施例は、試験した酵素インヒビタータンパク質のいくつかは、チオレド
キシンのみならずグルタレドキシンによっても還元されうることを示している。
チオレドキシンに対して特異的なものとしては、α-アミラーゼインヒビター（
ＤＳＧ-2）、及びいくつかのトリプシンインヒビター（Kunitz、Bowman-Birk、
アプロチニン、及びオボムコイドインヒビター）が挙げられる。チオレドキシン
又はグルタレドキシンのどちらかによって還元されたタンパク質としては、ピュ
ーロチオニン、２つのα-アミラーゼインヒビター（ＤＳＧ-1、ＣＭ-1）、植物
由来のシスチン−リッチトリプシンインヒビター（コーンカーネルインヒビター
）、及び動物由来のトリプシンインヒビター（卵白オボインヒビター）が挙げら
れる。これらの結果は、グルタレドキシンが植物内で生じるかという問題を提起
している。グルタレドキシンは、高等植物ではなく、緑藻類中に（Tsang,M.L.-S
.(1981),Plant Physiol. 68:1098-1104）存在すると報告された。
【００８３】 表Ｉに示されるＮＡＤＰ-ＭＤＨ及びＦＢＰアーゼ標的酵素の活性は、生理的
な葉緑体タンパク質（チオレドキシンｍ又はｆ）による活性化後に見られる活性
に対して相対的に低いが、示された数値は繰返し見られたので、真実であると考
えられる。インヒビタータンパク質によって示される酵素の特異性は、生理学的
に関連しないが、還元時に達成された特定の構造を反映していると考えられる。
このような還元構造が関係して種子又は動物細胞内で機能するかどうかを調べる
ことが残っている。 還元現象に関連するチオレドキシン（又はグルタレドキシン）の生理的因果関
係は、標的タンパク質の機能が不明確な場合、かなり関心がある。本結果は、新
規な可能性を提供する。チオレドキシンが、生理的条件下で種々雑多なインヒビ
タータンパク質を還元するという発見は、区画バリアがない場合、細胞内で還元
が起こりうることを示唆している。
【００８４】 実施例８ 大豆粉内の大豆トリプシンインヒビターの不活性化 この実施例の目標は、大豆のBowman-Birk及びKunitzトリプシンインヒビター
を不活性化することである。以下の手順を動物の食餌調製品に施す。10ｇの大豆
粉に、0.2μgのチオレドキシン、0.1μgのＮＡＤＰ-チオレドキシンレダクター
ゼ及び500ナノモルのＮＡＤＰＨが、１Ｍトリス-ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ7.9と共に
添加され、5.25mlの30mMトリス-ＨＣｌを得る。上記混合物が約30分室温で静置
される。大豆トリプシンインヒビターの直接還元は、以前に記載されたｍＢＢｒ
蛍光標識化／ＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によって測定される（K
obrehel,K.ら(1991),J.Biol.Chem. 266:16135-16140）。トリプシン活性用に処
理された粉の能力の解析は、インスリン及びＢＡＥＥの修正を用いて為される（
Na-ベンゾイル-L-アルギニンエチルエステル）アッセイ（Schoellmann,G.ら(196
3),Biochemistry 252:1963；Gonias,S.L.ら(1983),J.Biol.Chem. 258:14682）。
この解析から、そのようにＮＡＤＰ/チオレドキシン系で処理された大豆粉がト
リプシンを阻害しないことが決定される。
【００８５】 実施例９ 穀物中のα-アミラーゼインヒビターの不活性化 10ｇのオオムギ麦芽に、0.2μgのチオレドキシン、0.1μgのＮＡＤＰ-チオレ
ドキシンレダクターゼ及び500ナノモルのＮＡＤＰＨが、１Ｍのトリス-ＨＣｌ緩
衝液、ｐＨ7.9と共に添加され、5.25mlの30mMトリス-ＨＣｌを得る。上記混合物
が約30分室温で静置される。α-アミラーゼインヒビターの直接還元は、以前に
記載されたｍＢＢｒ蛍光標識化／ＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動法に
よって測定される（Kobrehel,K.ら(1991),J.Biol.Chem. 266:16135-16140）。α
-アミラーゼ活性は、デンプン由来のマルトースの遊離に伴って監視される（Ber
nfeld,P.(1955),Methods in Enzymol. 1:149）。この解析から、そのようにＮＡ
ＤＰ/チオレドキシン系で処理されたオオムギがα-アミラーゼを阻害しないこと
が決定される。
【００８６】 穀物タンパク質の還元 原料及び方法 （植物原料） マカロニコムギ（Triticum durum,Desf.cv.Monroe）の種子及びセモリーナは
、K.Kahm博士の親切なギフトだった。 （コムギ種子の発芽） 20〜30個の種子が、プラスチックのペトリ皿内、５mlの脱イオン水で湿らされ
た３層のWhatman＃1ろ紙の上に置かれた。暗室内、室温で４日間まで発芽が行わ
れた。
【００８７】 （試薬／精薬品） 生化学薬品及び凍結乾燥カップリング酵素は、Sigma Chemicals Co.(St. Loui
s, MO)から得た。大腸菌チオレドキシン及びＮＴＲは、American Diagnostica,
Inc.(Greenwich, CT)から購入した。コムギチオレドキシンｈ及びＮＴＲは、ホ
ウレンソウの葉用に開発された手順に従い（(Florencio,F.ら(1988)Arch.Bioche
m.Biophys.266:496-507)、胚から単離された。大腸菌グルタレドキシンは、A.Ho
lmgren教授の親切なギフトだった。ＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動用
の試薬は、Bio-Red 研究所(Richmond, CA)から購入した。モノブロモビメイン（
ｍＢＢｒ）又はThioliteは、Calbiochem Co.(San Diego, CA)から得た。乳酸ア
ルミニウム及びメチルグリーンは、Fluka Chemicals Co.(Buchs,Switzerland)の
製品だった。
【００８８】 （グリアジン及びグルテニン） 不溶性貯蔵タンパク質の単離のため、連続的に、以下の溶液１mlによって、25
℃で指示された時間、セモリーナ(0.2ｇ)が抽出された：（１）50mMトリス-ＨＣ
ｌ、ｐＨ7.5（20分）；（２）70％エタノール（２時間）；及び（３）0.1Ｍ酢酸
（２時間）。抽出の際、試料は、電気ローター上に置かれ、さらに時々渦式ミキ
サーで撹拌された。各溶媒による抽出後、試料はエッペンドルフ微量遠心管内で
遠心分離され（12,000rpmで５分間）、上清フラクションが解析用に保存された
。各抽出の間に、ペレットが１mlの水で洗浄され、以前同様遠心分離で収集され
、上清洗浄フラクションが捨てられた。慣習により、フラクションは以下のよう
に命名される：（１）アルブミン／グロブリン；（２）グリアジン；及び（３）
グルテニン。
【００８９】 （タンパク質のインビトロｍＢＢｒ標識化） 反応は、100mMトリス-ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ7.9中で行われた。指示されるよう
に、0.7μgのＮＴＲと、１μgのチオレドキシン（特に言及しない場合は、両方
とも大腸菌由来）が、１mMのＮＡＤＰＨと10μgの標的タンパク質を含有する70
μlの緩衝液に添加された。チオレドキシンがジチオスレイトール（ＤＴＴ）に
よって還元される場合、ＮＡＤＰＨ及びＮＴＲは省略され、ＤＴＴが0.5mMまで
加えられた。還元型グルタチオンについてのアッセイは同様に行われたが、最終
濃度は１mMだった。20分のインキュベーション後、100ナノモルのｍＢＢｒが添
加され、さらに15分反応が継続された。反応を停止し、過剰ｍＢＢｒを誘導体化
するため、10μlの10％ＳＤＳと10μlの100mMβ-メルカプトエタノールが添加さ
れ、その試料がゲルに与えられた。グルタレドキシンによる還元のため、チオレ
ドキシン及びＮＴＲは、１μgの大腸菌グルタレドキシン、1.4μgｎグルタチオ
ンレダクターゼ（ホウレンソウの葉から精製された）及び1.5mMＮＡＤＰＨで置
換された。、
【００９０】 （タンパク質のインビボｍＢＢｒ標識化） 指示された時間に、乾燥種子又は発芽実生（同じような基本長に基づいて選択
される）がペトリ皿から取り出され、胚又は発芽軸が除去された。各ロットから
５つの胚乳が秤量され、液体Ｎ2中、乳鉢と乳棒で粉砕された。液体Ｎ2の最後の
痕跡がちょうど消失された時に、100mMトリス-ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ7.9中、１ml
の2.0mMｍＢＢｒが添加された。解凍された混合物がさらに１分粉砕され、微量
遠心管に移された。適宜のｍＢＢｒ又は緩衝溶液で、その懸濁液の体積が１mlに
調整された。アルブミン/グロブリン、グリアジン及びグルテニンのタンパク質
フラクションが、上述したように発芽実生の胚乳から抽出された。その抽出され
たタンパク質フラクションは、使用するまで-20℃で貯蔵された。対照の緩衝液
は各時点でインキュベートされた。
【００９１】 （ＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動） ｍＢＢｒ誘導体化試料のＳＤＳ-ポリアクリルアミド電気泳動は、Laemmli, U.
K.(1970), Nature 227：680-685によって記載されているように、ｐＨ8.5の15％
ゲル内で行われた。1.5mm厚さのゲルが、16時間、９mAの一定電流で展開された
。
【００９２】 （未変性のゲル電気泳動） 異なるタイプのグリアジンを解析するため、Bushuk及びZillmanによって記載
され（Bushuk,W.ら(1978),Can.J.Plant Sci. 58:505-515）、かつSapirstein及
びBushukによって垂直スラブゲル用に改良されたように（Sapirstein,H.D.ら(19
85),Ceral Chem. 62:372-377）、６％ゲル内で未変性のポリアクリルアミドゲル
電気泳動が行われた。最終体積が100mlのゲル溶液は、6.0ｇのアクリルアミド、
0.3ｇのビスアクリルアミド、0.024ｇのアスコルビン酸、0.2mgの硫酸第一鉄ヘ
プタハイドレート及び0.25ｇの乳酸アルミニウムを含んでいた。そのｐＨは、乳
酸で3.1に調節された。ゲル溶液は、２時間氷上で脱気されて、0.5mlの３％過酸
化水素が重合触媒として添加された。実行中の緩衝液も、乳酸でｐＨ3.1に調節
され、１リットル当たり0.5ｇの乳酸アルミニウムを含んでいた。電気泳動の持
続時間は、一定電流50mAで約４時間だった。電気泳動は、メチルグリーン追跡用
染料で標識された溶媒の前面が、ゲルの末端から約１cmまで移動した時に終止さ
れた。
【００９３】 （ｍＢＢｒ除去／蛍光写真） 電気泳動後、ゲルは、12％(w/v)トリクロロ酢酸中に置かれ、溶液を１回変え
て４〜６時間浸漬され、タンパク質を固定し；それからゲルは、８〜10時間、40
％メタノール／10％酢酸の溶液に移動され、過剰ｍＢＢｒを除去した。紫外線源
（365nm）が装着されたライトボックス上にゲルを置くことによって、ｍＢＢｒ
の蛍光、遊離及びタンパク質バンドの両方が可視化された。過剰（遊離）のｍＢ
Ｂｒの除去後、ゲルは、黄色ラッテンゼラチンフィルター８番を通して（カット
オフ＝460nm）ポラロイド（登録商標）ポジティブ／ネガティブランドフィルム 、タイプ55で撮影された（f4.5で、露出時間25〜60秒の範囲）（Crawford,N.A. ら(1989),Arch.Biochem.Biophys.271:223-239）。
【００９４】 （タンパク質染色／脱染／写真） ＳＤＳ-ゲルは、以前に記載されたように（Crawford,N.A.ら(1989),Arch.Bioc
hem.Biophys.271:223-239）、40％メタノール／10％酢酸中、１〜２時間クーマ
シーブリリアントブルーR-250で染色され、一晩中脱染された。乳酸アルミニウ
ムネガティブゲルが、240mlの12％トリクロロ酢酸中、0.1ｇのクーマシーブリリ
アントブルーR-250（10mlの95％エタノール中に溶解された）を含有するろ過溶
液内で一晩中染色された。ゲルは、12％トリクロロ酢酸内で脱染された（Bushuk
,W.ら(1978),Can,J.Plant Sci. 58:505-515、及びSapirstein,H.D.ら(1985),Cer
al Chem. 62:372-377）。
【００９５】 染色されたタンパク質ゲルは、ポラロイドタイプ55フィルムで撮影して、プリ
ント及びネガを作った。プリントを用いてバンドの移動距離と装填効率が決定さ
れた。 蛍光性ゲルのポラロイドネガと湿った染色タンパク質ゲルのプリントが、レー
ザーデンシトメーター（Pharmacia-LKB UltroScan XL）で走査された。GelScan
XLソフトウェアで積分後のピーク領域を評価することによって、蛍光が定量化さ
れた。
【００９６】 （酵素アッセイ） 以前に記載された方法で、粗製抽出物内で以下の活性が決定された：ヘキソキ
ナーゼ（Baldus,B.ら(1981),Phytochem. 20:1811-1814）、グルコース-6-ホスフ
ェートデヒドロゲナーゼ、6-ホスホグルコネートデヒドロゲナーゼ（Schnarrenb
erger,C.ら(1973),Arch.Biochem.Biophys. 154:438-448）、グルタチオンレダク
ターゼ、ＮＴＲ及びチオレドキシンｈ(Florencio,F.ら(1988)Arch.Biochem.Biop
hys.266:496-507)。
【００９７】 （タンパク質の定量） タンパク質濃度は、Bio-Red試薬及び標準としてウシ血清アルブミンによって
、Bradford法（Bradford,M.(1976)Anal.Biochem. 72:248-256）により定量され
た。 （サブユニットの分子量決定） グリアジン及びグルテニンのサブユニットの分子量は、ＳＤＳ-ＰＡＧＥゲル
上で２セットの分子量標準（kDa）を用いて評価された。第１セットは、ＳＢＡ(
66)、オボアルブミン(45)、大豆トリプシンインヒビター(20.1)、ミオグロビン(
17)、チトクロムｃ(12.4)及びアプロチニン(6.5)から成っていた。他のセットは
、BioRad Prestaind Low ＳＤＳ-ＰＡＧＥ標準；ホスホリラーゼｂ(110)、ＢＳ
Ａ(84)、オボアルブミン(47)、カルボニックアンヒドラーゼ(33)、大豆トリプシ
ンインヒビター(24)及びリゾチーム(16)だった。
【００９８】 実施例10 グリアジン類の還元 1世紀前のOsborneおよびその共同研究者等の開拓的貢献の結果として、種子た
んぱく質は、水性および有機溶媒におけるそれらの溶解性に基づき、分画し得る
(20)。小麦の場合、胚乳(小麦粉またはセモリナ)の調製物を4つの溶液で歴史的
に順次抽出して下記のたんぱく質を得ている：（i）水、アルブミン類；(ii)塩
水、グロブリン類；（iii）エタノール/水、グリアジン類；および(iv)酢酸/水
、グルテリン類。多くの証拠により、種々のたんぱく質が各画分中に濃厚化され
ているのが分っている。例えば、アルブミンとグロブリン画分は多くの酵素を含
有し、グリアジンとグルテリン画分は発芽に必要な貯蔵たんぱく質中に存在する
。
【００９９】 前述の実施例1、4および5は、種子自体またはE. coli(大腸菌)由来のNADP/チ
オレドキシン系によって還元される多くの水溶性種子たんぱく質(アルブミン類/
グロブリン類、例えば、α-アミラーゼインヒビター類、シスチンリッチトリプ
シンインヒビター類、他のトリプシンインヒビター類およびチオニン(thionine)
類)を説明している。小麦種子からの不溶性貯蔵たんぱく質、即ち、グリアジン
およびグルテニン画分の代表的なものを還元する本システムの能力を以下に説明
する。下記の添加剤と一緒にインキューベートした後、各グリアジンたんぱく質
をmBBrにより誘導し、蛍光をSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動後に可視化し
た。この第1グリアジンゲルにおける各レーンは、次のとおりである：1．対照：
添加なし。2．GSH/GR/NADPH：還元グルタチオン、グルタチオンリダクターゼ(ほ
うれん草の葉由来)およびNADPH。3．NGS：NADPH、還元グルタチオン、グルタチ
オンリダクターゼ(ほうれん草の葉由来)およびグルタレドキシン(E. coli由来)
。4．NTS：NADPH、NTR、およびチオレドキシン(共に、E. coli由来のたんぱく質
)。5．MET/T(Ec)：β-メルカプトエタノールおよびチオレドキシン(E. coli)。6
．DTT。7．DTT/T(Ec)：DTTおよびチオレドキシン(E. coli)。8．DTT/T(W)：7に
同じ、但し小麦チオレドキシンｈを含む。9．NGS,-グリアジン：3に同じ、但し
グリアジンたんぱく質画分含まず。10．NTS,-グリアジン：4に同じ、但し但しグ
リアジンたんぱく質画分含まず。mBBrとの反応性に基づき、グリアジン画分は、
チオレドキシンにより広く還元された。還元された主要メンバーは、25〜45kDa
範囲のMrを示した。種子α-アミラーゼおよびトリプシンインヒビターたんぱく
質による実施例1、4および5において分かるように、グリアジン類は、未変性(ネ
イティブ)hまたはE. coliタイプのチオレドキシン(共に、同質)のいずれかによ
って還元された；NADPH(およびNTR)またはDTTは、チオレドキシンの還元剤とし
て作用し得ていた。かなり狭い範囲の還元は、グルタチオンおよびグルタレドキ
シン(ある種のE. coliおよび哺乳動物酵素系においてチオレドキシンと置換わり
得るたんぱく質であるが、高級植物において起こることは知られていない)にお
いて観察された。
【０１００】 グリアジン画分は、α、β、γおよびωと標示される4種のたんぱく質タイプ
からなっており、酸性条件下の未変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分
離できる[Bushuk, W. et al. (1978), Can. J. Plant Sci. 58:505-515； Kasar
da, D.D. et al. (1976), Adv. Cer. Sci. Tech. 1:158-236；Sapirstein, H.D.
et al. (1985), Cereal Chem. 62:372-377；およびTatham, A.S. et al. (1990
), Adv. Cer. Sci. Tech. 10:1-78]。ωグリアジン以外は、どの種もシスチン(S
-S)結合を含み、従って、チオレドキシンによって還元される可能性を有する。
この試験においては、 下記の添加剤と一緒にインキューベートした後、各たん
ぱく質をmBBrにより誘導し、蛍光を酸性ポリアクリルアミドゲル電気泳動後に可
視化した。この試験における第2グリアジンゲルにおける各レーンは、次のとお
りである：1．対照：添加なし。2．GSH：還元グルタチオン。3．GSH/GR/NADPH：
還元グルタチオン、グルタチオンリダクターゼ(ほうれん草の葉由来)およびNADP
H。4．NGS：NADPH、還元グルタチオン、グルタチオンリダクターゼ(ほうれん草
の葉由来)およびグルタレドキシン(E. coli由来)。5．NGS + NTS：4と6の組合せ
。6．NTS：NADPH、NTR、およびチオレドキシン(共に、E. coli由来のたんぱく質
)。7．MET/T(Ec)：β-メルカプトエタノールおよびチオレドキシン(E. coli)。8
．DTT/T(Ec)：DTTおよびチオレドキシン(E. coli)。9．NTS(-T)：6に同じ、但し
チオレドキシン含まず。10．NGS + NTS、-グリアジン：5に同じ、但しグリアジ
ン画分含まず。
【０１０１】 チオレドキシン還元グリアジン画分を未変性ゲル電気泳動に供した場合、チオ
レドキシンにより最も特異的に還元されているのが判ったたんぱく質が、α画分
において回収された。βおよびγグリアジンの活性な還元があったが、表3に要
約している濃度計結果から明らかなように、これらの群における還元は非特異性
であり、即ち、比較的高レベルの還元がグルタチオンおよびグルタレドキシンに
よっても達成されていた。DTT還元チオレドキシンによるγグリアジン類のとり
わけ強い還元があった。予期されたように、ωグリアジンの還元はなかった。得
られた証拠は、チオレドキシン(未変性hであれ、E. coliであれ)がある種のグリ
アジン、とりわけαタイプを特異的に還元していることを示唆している。
【０１０２】表3 種々のタイプのグリアジンの還元剤特異性 NADP/チオレドキシン系による還元後のα、βおよびγおよび凝集物のピーク
下の領域は、それぞれ、4.33、8.60、5.67および0.74吸光度単位・時間・mmであ
った。これらの合わせた領域は、実施例10におけるような還元条件により、チオ
レドキシンを第2ゲルにおけるDTTにより還元したときに観察された領域の約65％
であった。 * ゲルに入らなかったたんぱく質
【０１０３】 実施例11 グルテニン類の還元 チオレドキシンに対する応答について試験すべき種子たんぱく質類の残りの群
(グルテニン(glutenin)類)は、最低の水溶性であるけれども、恐らく最大の興味
があるものである。グルテニン類は、小麦粉およびセモリナのクッキング特性に
おけるその重要性のため、多年に亘って注目を集めている(MacRitchie, F. et a
l. (1990), Adv. Cer. Sci. Tech. 10:79-145)。従って、この群のたんぱく質を
還元するチオレドキシンの能力を試験することは、本研究の第1の目的であった
。
【０１０４】 数種のグルテニンは、mBBr/SDS-page法を用い、条件が実施例10の第1ゲルにお
けるようであったとき、チオレドキシンによって特異的に還元された。最も広い
還元は、低分子量範囲(30〜55 kDa)において観察された。それより高分子量範囲
において観察された還元は、あまり顕著ではなかったが、まだ明瞭であった(特
に、100 kDaおよびそれ上の領域においてさえも)。示してないが、還元は、130
kDa範囲においても起り得る。グリアジン類と同様、ある種のグルテニンは、グ
ルタチオンおよびグルタレドキシンによって評価でき得る程度に還元されていた
。しかしながら、すべての場合において、還元は、チオレドキシンにおいて大き
く、ある場合には、チオレドキシンに対し特異性であった(表4、30〜40および60
〜110 kDa範囲のたんぱく質を参照されたい)。試験した他の小麦たんぱく質にお
いて観察されるように、未変性hおよびE. coliチオレドキシンの両方とも活性で
あり、NADPHおよび相応するNTRのいずれによっても、或いはDTTによって還元で
きた。即ち、グリアジン類において見出されたように、ある種のグルテニンは、
チオレドキシンによってインビトロ(試験管内)で特異的に還元されており、一方
、他のグルテニンも、効果は小さかったが、グルタチオンおよびグルタレドキシ
ンによって還元されていた。
【０１０５】表4 グルテニン類の還元剤特異性 DSG-1または-2α-アミラーゼインヒビターによるNADP-MDHの活性化に対しての
チオレドキシンh濃度効果についての実施例1試験におけるような反応条件。 * NADP/チオレドキシン系による還元後の3つの分子量群(高分子から低 分子へ)における領域は、それぞれ、1.5、5.67および5.04吸光度単位・ 時間・mmであった。
【０１０６】 実施例12 インビボ還元試験 上記の実施例は、チオレドキシンが、インビトロで試験したときに、小麦グリ
アジンおよびグルテニン画分の諸成分を特異的に還元することを示唆している。
しかしながら、これらの結果は、これらのたんぱく質が発芽中インビボ(生体内)
で還元されるかどうか(知る限りにおいて、過去対処されていない問題)について
は何ら指標を提供していない(Shutov, A.D. et al. (1987), Phytochem. 26:155
7-1566)。
【０１０７】 この問題に答えるために、mBBr/SDS-PAGE法を用い、発芽中の種子におけるた
んぱく質の還元状態をモニターした。本発明者等は、オズボーン(Osborne)画分
中の成分の還元が時間と共に次第に増大し、発芽2〜3日後にピークに達したこと
を観察した。観察された還元増大は、グリアジン類における2倍から、アルブミ
ン/グロブリンにおける3倍、グルテニン類における5倍までの範囲であった。こ
れらの結果は、小麦たんぱく質群の代表的なものが発芽中に還元されたものであ
るが、正味のレドックス変化はグルテニン類において最大であったこと示してい
る。
【０１０８】 種子貯蔵たんぱく質が発芽中に還元を受けるという新しい証拠を提供している
けれども、上記の結果は、還元がグルタチオンまたはチオレドキシンによって如
何に達成されるのかついての指標を提供していない。この点に関する情報を得る
ために、主要チオレドキシン結合グリアジン類(30〜50 kDa)およびグルテニン類
(30〜40、40〜60 kDa)のインビボ還元レベルを、インビトロ測定からの測定還元
値(表4参照)と比較した。この目的において、発芽中にインビボでおよび適切な
酵素還元系によるインビトロで観察したクーマシー(Choomassie) 染色たんぱく
質に対する蛍光比を算出した。結果(主要チオレドキシン結合グリアジンは25〜4
5 kDrのMr範囲内のものであり、グルテニンは30〜60 kDaのMr範囲のものであっ
た)は、グルタチオンはグリアジン画分のインビボ還元における有意な部分(90％
まで)を占めたものの、この還元は、還元にチオレドキシンを必要とするようで
あるグルテニンの場合にはなかったことを示している。グルタチオン(またはグ
ルタレドキシン)に帰し得た還元のレベルは、発芽中の種子で測定した還元グル
テニンのレベルに達するには不十分であった。
【０１０９】 実施例13 酵素測定 チオレドキシンhのNTR結合還元に必要なNADPH源も試験した。セモリナを、他
の系、とりわけ酸化性ホスフェート経路のデヒドロゲナーゼにおけるNADPHの産
生において機能する酵素について分析した。表5に要約した結果は、胚乳抽出物
がこの経路を経てグルコースからNADPHを産生するのに必要な酵素：ヘキソキナ
ーゼ、グルコース 6-ホスフェートデヒドロゲナーゼおよび6-ホスホグルコネー
トデヒドロゲナーゼを含有するという早期の証拠を確証している(Tatham, A.S.
et al. (1990), Adv. Cer. Sci. Tech. 10:1-78)。注目すべきは、表5において
見られるグルコース 6-ホスフェートデヒドロゲナーゼ活性が還元チオレドキシ
ンに対して感受性がなかったということである(データは示していない)。この点
、胚乳酵素は、葉からのその葉緑体同等物よりもむしろそのサイトゾルに似てい
る(Fickenscher, K. et al. (1986), Arch. Biochem. Biophys. 247:393-402；B
uchanan, B.B. (1991), Arch. Biochem. Biophys. 288:1-9；およびScheibe, R.
et al. (1990), Arch. Biochem. Biophys. 274:290-297)。
【０１１０】 小麦粉における早期の結果(Johnson, T.C. et al. (1987), Planta 171: 321-
331；Suske, G. et al. (1979), Z. Naturforsch. C34:214-221)から予期された
ように、セモリナもチオレドキシンhおよびNTRを含有していた(表5)。興味ある
ことは、活性測定によれば、NTRは、試験した栽培変種植物からの調製物中の律
速成分であるようであった。
【０１１１】表5 セモリナ中のチオレドキシンhの還元を行う酵素の活性 (グルコース→Glu-6-P→6-P-グルコネート→NADP→チオレドキシンh)
【０１１２】 本結果は、チオレドキシンhが小麦種子の発芽に伴う代謝過程を高めるシグ
ナルとして機能していることを示唆している。NTRおよびNADPH(酸化性ペントー
スホスフェート経路を経て産生した)による還元後、チオレドキシンhは、酵素の
活性化においてだけでなく、貯蔵たんぱく質の動員においても機能しているよう
である。
【０１１３】 実施例14 練り粉品質の改良 練り粉品質は、NADP/チオレドキシン系を用いて小麦粉たんぱく質を還元する
ことによって改善された。還元チオレドキシンは、たんぱく質の種々の部分を架
橋させてその折たたみ形状を安定化するイオウ-イオウ結合を特異的に破壊する
。これらの架橋が切断されたとき、たんぱく質は折りたたみを解き、パン中の他
のたんぱく質と一緒になり、練り粉の弾性ネットワークを形成する重なり合う格
子を生成し得る。練り粉は、上記ネットワークが発酵過程における酵母により発
生した炭酸ガスを捕捉することにより膨れ上がる。還元チオレドキシンが小麦粉
中のグリアジンおよびグルテニンを活性化して、グリアジンとグルテニンを、練
り粉を強化する形で再結合させていることが考えられる。還元チオレドキシンは
、練り粉製造中に形成されたたんぱく質ネットワークを強化していた。これらの
試験(フランス、モンテペリエ(Montpellier)の地方製粉業者から入手した中品質
小麦粉または同じくフランス、モンテペリエの地方製粉業者から入手した低品質
小麦粉いずれかの10 gmを使用、この低品質小麦は主としてアポロ(Apollo)栽培
変種を含んでいる)においては、0.2μgのE. coliチオレドキシン、0.1μgのE. c
oli NADP-チオレドキシンリダクターゼおよび５００ナノモルのNADPHを1M Tris-
HCl、pH 7.9バッファーと一緒に加えて、5.25 mlの30 mM Tris-HCl酵素系混合物
を得た。反応は、上記酵素系混合物を上記10 gの小麦粉とマイクロ-ファリノグ
ラフ(micro-farinograph)中で30℃で混合することによって実施した。得られた
ファリノグラフ測定値は、添加したNADP/チオレドキシン系による練り粉の強化
を示していた。低品質の小麦粉においては、ファリノグラフ読取り値は、練り粉
を還元系の存在下に形成させた後少なくとも4分間安定しており；一方、この添
加なしの対照における練り粉の形成後は、読取り値は直ぐに低下した。改良効果
は、持続しており、試験の間中維持されていた。別の方法で言えば、マイクロ・
ファリノグラフ読取り値は、低品質小麦粉対照(酵素系の添加なし)での練り粉形
成後7分においては375ブラベンダー(Brabender)単位であるのに対し、NADP/チオ
レドキシン系(NADPH、チオレドキシンおよびNADP-チオレドキシンリダクターゼ)
の成分で処理した同じ低品質小麦粉においては450ブラベンダー単位であった。
【０１１４】 もう1つのファリノグラフ試験を、上記のようにして、NADPHの濃度のみがナノ
モルの代りに500μモルであった10 gのアポロ(Apollo)小麦粉において実施した
。ファリノグラフ測定値は、この量のNADPHも練り粉の品質において明確な改良
を生じていたことを示した。 練り粉のファリノグラフ測定値が高いほど、改良された練り粉強度、および良
好なパンくず特性、改良された生地および高ローフ(loaf)容量のような改良され
た良好な焼上げ特性に相応する。また、分離されたたんぱく質におけるインビボ
分析に基づき、未変性の小麦種子NADP/チオレドキシン系も練り粉の強化におい
て有効であろう。
【０１１５】 ベーキング目的および本発明の他の局面においては、約0.1〜3.0μg範囲のチ
オレドキシン(好ましくは、E. coliまたはチオレドキシンh)、約0.1〜2.0μgの
リダクターゼ、および約30〜500ナノモルのNADPHを約10 gm毎の小麦粉に加える
。チオレドキシンとリダクターゼの最適値は、小麦粉の品質による。一般に、小
麦粉品質が高い程、高いチオレドキシンおよびリダクターゼ量が必要である。チ
オレドキシンは、NADPH/NADP-チオレドキシンリダクターゼ還元系の代りにリポ
酸によても還元できる。次いで、牛乳または水のような他の練り粉成分を加える
。しかしながら、液成分は、最初NTR/チオレドキシン系に加え、次いで小麦粉に
加えてもよい。好ましいのは、発酵目的の酵母は、還元チオレドキシンが貯蔵た
んぱく質を還元する機会を有した後に加えることである。
【０１１６】 NADPHは、本実施例において、またこれ以降の実施例において、酵母のような
原料からの100μMのグルコース 6-ホスフェート、100μMのNADPおよび0.05単位(
0.2μg)のグルコース 6-ホスフェートデヒドロゲナーゼからなるもののようなNA
DPHジェネレーターで置換えることができる。
【０１１７】 高ファリノグラフ測定値は、10 gmのアポロ栽培変種(CV)小麦を、4.25 mlのH2 Oおよび0.90 mlのTris-HCl(30 mM、pH 7.9)中に含有させた20μlのNADP(25 mM)
、20μlのG6P (25 mM)、0.25μgのG6PDase、0.1μgのNTRおよび0.2μｇのチオレ
ドキシンhと反応させたときに得られた。高ファリノグラフ測定値は、10 gmのア
ポロ小麦を上記と同じであるがNTRまたはチオレドキシンを何ら含まない反応混
合物と反応させたときにも得られた。
【０１１８】 実施例15 小麦パンのベーキング試験 ベーキング試験は、コンピュータモニター型パナソニック(PANASONIC)ベーキ
ング装置を用いて実施した。 パンの組成： 対照： 小麦粉*： 200 gm (乾燥) 水： 70％水和 塩(NaCl) 5.3 g 酵母： 4.8 g (サカロミセス セレビシア(Saccharomiyces cerevisiae)、Safinstant)(乾燥酵母粉末) *小麦粉サンプルは、対照的なベーキング特性を有する純粋パン用栽培変種か
ら得た(動物飼料級および低品質から良品質を有する他の等級を含む)。
【０１１９】 アッセイ： アッセイ用の練り粉は、上記対照の全成分に加え、下記のような変化量のNADP
チオレドキシン系(NTS)および/またはNADP産生系を含んでいた。
【０１２０】 実験条件： ‐小麦粉と塩を秤量し、混合する。 ‐70％水和に達するのに必要な容量の水をベーキング用なべに入れる。 ‐小麦粉と水の混合物を水に加えてコンピュータでモニターするベーキ ングプログラムを開始する。全プログラムは、3時間9分7秒間持続 した。 ‐アッセイの場合は、酵素系成分を、小麦粉-塩混合物を加える前の水に 加える。 ‐酵母を20分3秒の混合後に自動的加えた。
【０１２１】 パナソニック装置をモニターするプログラムは、下記の通りであった： 混合条件： T0 = 混合なし(モーター停止) T1 = 正常混合 T2 = 交互に3秒混合、3秒休止 パンのローフが室温になったときに、パンのローフ容量をベーキング終了時に
測定した。
【０１２２】 栽培変種THESEEのアッセイ フランス小麦栽培変種Theseeは、良好なパン製造品質を有するものとして分類
される。下記の表6は、アッセイの結果を示す。表6 *NADPH産生系、ATPおよびグルコースの組成： 添加容量 NADP、25mM 700μl(17.5μモル) グルコース-6-ホスフェート、25mM 700μl(17.5μモル) グルコース-6-ホスフェートデヒドロゲナーゼ(50μg/ml) 175μl (8.75μg) ATP、25mM 700μl(17.5μモル) グルコース、25mM 700μl(17.5μモル)
【０１２３】 表6に示すように、ローフ容量の増大は、6.0μモルのNADPH、30μgのNTRおよ
び60μgのThの濃度の完全NTSを用い、本実施例で上述した量と条件によって200g
のThesee小麦粉からローフを焼いたときに得られた。特に断らない限り、NTRお
よびチオレドキシン(Th)は、E. coli由来である。産生系を用いた場合或いはNTR
またはThのいずれかを欠いた場合には、同様な容量増大は生じなかった。また、
系中の成分量が上記量の半分以下であった場合もローフ容量に有意の効果は、生
じなかった。
【０１２４】 栽培変種アポロのアッセイ このフランス小麦栽培変種は、低パン製造品質を有するものとして分類される
。本アッセイにおいて用いたNTRおよびチオレドキシンは、E. coli由来であった
。下記の表7は、200gmのアポロ混合物擬古を用いた本アッセイの結果を示す。こ
こでも、特に断らない限り、量と条件は、本実施例の当初において記載した通り
である。
【０１２５】表7 *産生系、ATPおよびグルコースの組成は、表6におけるのと同じである。
【０１２６】 栽培変種アルボン(ARBON)のアッセイ フランス小麦栽培変種アルボンは、飼料用に使用し、パン製造には適さないも
のとして分類されている。下記の表8および9は、改良されたパンローフ容量が、
本実施例の当初に述べた練り粉成分と条件において、NTSまたはNADPHとNTRを用
いてアルボンから得ることができることを示す。本アッセイにおいて用いたNTR
、チオレドキシン、NADPHおよびNADPH産生系成分の量は、表８および9に示して
いる。表9に示したような完全NTSを用いたアルボンパン品質における改良は、対
照と比較した時に明らかに観察し得る。
【０１２７】表8
【０１２８】表9 NADPH、0.6μモル；チオレドキシン、3.5μg；NTR、3μg。 *産生系： 3.5μモル NADP 3.5μモル グルコース-6-ホスフェート 1.75μg グルコース-6-ホスフェートデヒドロゲナーゼ
【０１２９】 実施例16 ライ小麦パンベーキング試験 ライ小麦は、小麦/ライ麦ハイブリッドであり、鶏用飼料として一般に使用す
る。ライ小麦は、小麦よりも栄養はあるが、特に先進国においてはパン製造には
適さないものと一般にみなされている。ライ小麦粉から焼いたローフに対するNT
S系およびその変異体の効果を結果として試験した。特に断らない限り、ベーキ
ング条件および練り粉成分は、実施例15の小麦粉において述べたとおりである。
表10に示すように、ライ小麦練り粉がこの表に示す量でチオレドキシン、NTRお
よびNADPH産生系を含有していたときに、ローフ容量の改善が得られる。しかし
ながら、NTS(即ち、チオレドキシン、NTRおよびNADPH)を用いたときは、相応す
る改善は観察されなかった。パン生地をもっと粘着性があり安定にするパン生地
の改良も、NTR、Thおよび表10に示すNADPH産生系を用いたときに得られていた。
【０１３０】表10 NADPH、0.6μモル；チオレドキシン、3.5μg；NTR、3μg。 *産生系： 4.5μモル NADP 4.5μモル グルコース-6-ホスフェート 4.5μg グルコース-6-ホスフェートデヒドロゲナーゼ
【０１３１】 実施例17 もろこし、コーンおよび米の粉についてのNADPH/チオレドキシン系の効果も測
定した。ベーキング条件は、実施例15で小麦粉について述べたとおりである。本
アッセイにおいて使用するNTSの成分量は、次の通りである：8μモルNADPH、40.
5μg NTRおよび54μgチオレドキシン。チオレドキシンとNTRは、共にE. coli由
来であった。NTSを含有する本試験のパン、とりわけコーンおよびもろこしは、
改善された生地と安定性を示した。
【０１３２】 実施例18 ライ小麦、ライ麦、大麦、カラス麦、米、もろこし、コーンおよびテフからの エタノール可溶性およびミリステート可溶性貯蔵たんぱく質の還元 特に断らない限り、本実施例における方法と材料は、“穀物たんぱく質の還元
、材料および方法”と題した章で説明した方法と材料に従う。
【０１３３】 ライ小麦、ライ麦、大麦、カラス麦およびテフ 各反応は、30 mM Tris-HClバッファー、pH 7.9において実施した。説明したよ
うにして、0.7μgのNTRおよび1μgのE. coli由来チオレドキシンまたは2μgの酵
母由来チオレドキシンを、1 mM NADPHおよび25〜30μgの抽出貯蔵たんぱく質を
含有する上記バッファー70μLに加えた。エタノール抽出貯蔵たんぱく質は、50m
lの70％エタノールを各粉10gmにおいて用い、2時間抽出することによって得た。
テフの場合、200mgの粉砕種子を抽出した。ミリステート抽出たんぱく質は、1gm
の粉を5mlの蒸留H2O中8mgのミリスチル酸ナトリウムで2時間抽出することによっ
て得た。NADPH、NTRおよびチオレドキシンの組合せは、NADP/チオレドキシン系(
NTS)として公知である。説明したように、グルタチオン(GSH)、2.5mMを、還元剤
として、1.5mMのNADPHおよび1.4μgのほうれん草葉グルタチオンリダクターゼ(G
R/GSH/NADPH)の不存在(GSH)または存在下に加えた。20分間のインキュベーショ
ンの後、100 nモルのmBBrを加え、反応をさらに15分間続けた。反応を停止し、
過剰のmBBrを引出し、10μLの10％SDSおよび10μLの100mM 2-メルカプトエタノ
ールを加え、次いで、各サンプルを各ゲルに塗布した。SDS-ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動は、N. A. Crawford et al. により開示された通りであった(1989,
Arch. Biochem. Biophys. 271:223-239)。
【０１３４】 米、もろこしおよびコーン 各反応は、30 mM Tris-HClバッファー、pH 7.9において実施した。たんぱく質
をチオレドキシンにより還元したときは、下記を、70μLのバッファーに加えた
：1.2mMのNADPH、10〜30μgの種子たんぱく質画分、0.5μgのE. coli NTRおよび
1μgのE. coliチオレドキシン。グルタチオンによる還元においては、チオレド
キシンおよびNTRを、2.5mMの還元グルタチオンおよび1μgのグルタチオンリダク
ターゼ(パン焼き酵母、Sigma Chemical社)で置換えた。ジチオスレイトールによ
る還元においては、NTRを省き、0.5mMジチオスレイトールを加えた。すべての場
合において、インキュベーション時間は20分であった。次いで、10μlの10mM mB
Br溶液を加え、反応をさらに15分続けた。反応を停止し、過剰のmBBｒを抜き出
すために、10μlの10％SDSおよび10μlの100mM 2-メルカプトエタノールを加え
、各サンプルを各ゲルに塗布した。各場合において、抽出たんぱく質を得るため
に、1gの粉砕種子を5ml蒸留水中８ｍgミリスチル酸ナトリウムで抽出した。たん
ぱく質の初期酸化還元状態測定は除いて、各サンプルは、22℃で2時間抽出し、
次いで、mBBrの添加前に、16,000rpmで20分間遠心処理した。初期酸化還元相対
測定においては、mBBrは、窒素雰囲気下に上記ミリスチル酸塩と一緒に加え、そ
の後抽出した。
【０１３５】 カラス麦、ライ小麦、ライ麦、大麦およびテフの粉からのミリステート抽出た
んぱく質の還元試験用の別々のSDSSポリアクリルアミド電気泳動ゲルを調製した
。チオレドキシン結合バッファーおよびテフエタノール抽出たんぱく質の度合を
示すゲルも調製した。カラス麦、ライ小麦、ライ麦、大麦、テフ/ミリステート
抽出試験のすべてにおいて、粉を先ず50 mM Tris-HClバッファー、pH 7.5で20分
間、次いで、70％のエタノールで2時間抽出した。さらに、コーン、もろこしお
よび米のミリステート抽出たんぱく質用の各ゲルを調製した。コーン、もろこし
および米においては、粉砕種子をミリステートのみで抽出した。従って、コーン
、もろこしおよび米においては、ミリステート抽出物が全たんぱく質を代表する
のに対し、カラス麦、ライ小麦、ライ麦、大麦およびテフにおいては、ミリステ
ート抽出物は、これらの粉がバッファーおよびエタノールで既に抽出されている
ので、グルテニン等価画分のみしか示さない。ゲル中に描かれた結果は、NTSが
、GSHまたはGSH/GR/NADPHに比較したとき、カラス麦、ライ小麦、ライ麦、大麦
およびテフからのミリステート抽出(グルテニン等価)たんぱく質において最も有
効であることを示している。NTSは、米からの全たんぱく質においても最も有効
である。還元グルタチオンは、コーンおよびもろこしからの全たんぱく質におい
てより有効である。
【０１３６】 コーン、もろこしおよび米からの結論 ミリステート抽出たんぱく質の還元状態についてのNTS対グルタチオンリダク
ターゼの効果に関する第1ゲルにおいては、処理(1)において、mBBrの存在下での
ミリステートによる抽出を窒素雰囲気下に実施し；処理(2)においては、ミリス
テート抽出たんぱく質に、mBBrをたんぱく質の還元なしまたは還元前に添加し；
処理(3)においては、ミリステート抽出たんぱく質をNADP/チオレドキシン系(NTS
)で還元し；処理(4)においては、ミリステート抽出たんぱく質をNADPH、グルタ
チオンおよびグルタチオンリダクターゼによって還元した。ミリステート抽出た
んぱく質のインビボ還元状態およびチオレドキシン結合インビボ還元に関する第
2ゲルにおいては、処理(1)は、第1ゲルにおける処理(2)と同様であり；処理(2)
においては、各種子をmBBrの存在下に窒素中でミリステートで抽出し；処理(3)
においては、各種子をミリステートで抽出し、NTSで還元し、次いでmBBrを加え
；処理(4)においては、たんぱく質をDTTで還元した以外は(3)におけるような条
件であった。第1ゲルにおける処理(1)と第2ゲルにおける処理(2)は、穀物中のた
んぱく質の初期酸化含有源状態を示していた。3種全部の穀物において、種子中
のたんぱく質は、高度に還元されていた。空気中で抽出した場合、たんぱく質は
、とりわけもろこしおよび米において酸化されていた。酸化たんぱく質は、全部
の場合においてNTSによって最高に再酸化し得る。米においては、還元はチオレ
ドキシンに対して比較的特異性であり；コーンにおいては、グルタチオンがチオ
レドキシンと同等に有効であり；もろこしにおいては、グルタチオンがチオレド
キシンよりも僅かに有効である。ジチオスレトール還元剤としては変動性のある
効果を示した。これらの試験は、これらの穀物の貯蔵たんぱく質が小麦の場合よ
りも特異性が低いことを示しており、練り粉ネットワークを形成させるのを試み
るときに、チオレドキシンをグルタチオンの存在および不存在下で試験すべきこ
とを示唆している。
【０１３７】 小麦グルテニンおよびグリアジンそれぞれの酵母NADP/チオレドキシン系によ
る還元試験から得られたゲルも調製した。グルテニン類は、50mlの0.1M酢酸を10
gmの小麦粉毎に用いて2時間抽出することによって得た。グリアジン類は、50ml
の70％エタノールを10gmの小麦粉毎に用いて2時間抽出することによって得た。
各ゲルは、酵母系が、2つの主要群の小麦貯蔵たんぱく質において高度に活性で
あることを示した。
【０１３８】 ライ小麦、ライ麦、カラス麦および大麦それぞれのエタノール抽出たんぱく質
の還元についてのゲルも調製した。得られた結果は、NTSがライ小麦、ライ麦お
よびカラス麦からのエタノール抽出たんぱく質において最も有効であることを示
していた。エタノール抽出大麦たんぱく質は、対照において還元され、チオレド
キシンまたはグルタチオンは殆ど効果はなかった。
【０１３９】 実施例19 Kunitz and Bowman-BirKの大豆トリプシンインヒビターたんぱく質の活性と安 定性についてのチオレドキシン結合還元の効果 植物材料 マカロニ小麦(Triticum durum, Desf. cv. Monroe)は、K. Kahn博士の親切な
提供物であった.小麦発芽は、Sigma Chemical社(ミズーリ州セントルイス)から
入手した。
【０１４０】 化学品および酵素 ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)用の試
薬は、Bio-Rad Laboratories社 (カリフォルニア州リッチモンド)から入手し；D
TTは、Boehringer Mannheim Biochemicals社(インディアナ州インディアナポリ
ス)から入手した。L-1-トシルアミド-2-フェニルエチルクロロメチルケトン(TPC
K)処理トリプシン(タイプXIII、 T8640)、スブチリシン(タイプVIII：細菌性ス
ブチリシンCarbsberg, P5380)、KTI(T9003)、BBTI(T9777)、アゾカセインおよび
他の化学品は、Sigma Chemical社(ミズーリ州セントルイス)から購入した。E. c
oliチオレドキシンおよびNTRは、各たんぱく質を過発現するよう形質転換した細
胞から分離した。組換えプラスミド、pFPIを含有するチオレドキシン株は、J.-P
.Jacquot博士から親切に提供された(de La Motte-Guery et al., 1991)。組換え
プラスミド、pPMR21を含有するNTR株は、Marjorie RusselおよびPeter Model両
博士から親切に提供された(Russel and Model, 1988)。これらのたんぱく質にお
いて使用する分離手順は、下記の変化を加えた研究において開示されている通り
であった：細胞は、Ribi細胞分画器内で25,000psi(1,758 kg/cm2)で破壊し、NTR
は、Florencio等(1988)によって開示されたようにして、赤色アガロース工程な
しで精製した。E. coliチオレドキシンおよびNTRは、それぞれ、SDS-ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動により測定したとき、100％および90％の純度であった。
小麦チオレドキシンhは、以前に開示されているようにして精製した(Johnson et
al., 1987)。
【０１４１】 小麦種子の発芽 小麦種子を、50％(v/v)のジェネリックブリーチ(Generic Bleach)中に1時間室
温で浸漬し、次いで蒸留水で十分に洗浄することによって滅菌した。滅菌種子を
、プラスチックペトリ皿内で、100μg/mlのクロランフェニコールを含有する蒸
留水で湿らせた2層のワットマン(Whatman)濾紙上に置いた。発芽を、暗室内で5
日間まで室温で続けた。
【０１４２】 小麦プロテアーゼの調製 5日間発芽させた小麦種子から根および新芽を削除することによって分離した
胚乳(10〜15g新生重量)を、10mMのβ-メルカプトエタノールを含有する200mMの
酢酸ナトリウム、pH4.6の5容量で4℃、30分間抽出した。ホモジネートを48,000g
、4℃で20分間遠心処理した。ペレットを廃棄し、上清液を30〜70％の硫酸アン
モニウムで分画した。プロテアーゼ調製物を示すこの画分を、10mMのβ-メルカ
プトエタノールを含有する20mMの酢酸ナトリウム、pH4.6の最小容量中に再懸濁
させ、このバッファーに対して一夜、4℃で透析させた。アゾカゼインを基質と
してアッセイしたとき、このプロテアーゼ調製物は、約4.6の最適pHを有し、4℃
で少なくとも1週間安定であった。
【０１４３】 トリプシンインヒビターの還元およびたんぱく質分解感受性 特に断らない限り、トリプシンインヒビター(0.4 mg/ml)の還元は、10 mM EDT
Aを含有する20mMリン酸ナトリウムバッファー、pH7.9の0.1ml中で、30℃、2時間
実施した。チオレドキシン、NTRおよびNADPHの濃度は、それぞれ、0.024 mg/ml
、0.02 mg/mlおよび0.25mMであった。還元剤としてのDTTにおいては、EDTAおよ
びNADP/チオレドキシン系成分を省いた。還元後、インヒビター混合物の各アリ
コートを、トリプシンインヒビター活性またはたんぱく質分解感受性のいずれか
の測定用に取出した。スブチリシン試験においては、インヒビター混合物(50μl
)をスブチリシンと直接混合し、室温で1時間インキュベートした。小麦プロテア
ーゼ調製物においては、インヒビター混合物(50μl)のpHを35μlの200mM酢酸ナ
トリウム、pH4.6と混合することによって4.7に先ず調整し；次いで、10μlの小
麦プロテアーゼ調整物を加え、インキュベーションを37℃で2時間続けた。スブ
チリシンによる消化を停止させるために、2μlの100mMフェニルメチルスルホニ
ルフルオライド(PMSF)と10μlの10％SDSを消化混合物に添加した。この植物プロ
テアーゼ調製物においては、消化を等容量のSDSサンプルバッファー[0.125 M Tr
is-HCl、pH6.8、4%(w/v)SDS、20％(v/v)グリセロール、10%(v/v)β-メルカプト
エタノール、および0.02％ブロモフェノールブルー]を加えることによって停止
させた。たんぱく質分解生成物は、12％または16％SDSポリアクリルアミドスラ
ブゲル(Laemmli、1970)による電気泳動によって分析した。乾燥させたスラブゲ
ルを、レーザー濃度計(Pharmacia-LKB UltraScan XL)でスキャンし、KTIまたはB
BTIたんぱく質バンドのピークの領域をPharmacia GelScan XLソフトウェアプロ
グラムによる集積により得た。
【０１４４】 アッセイ チオレドキシンおよびNTRを、Florencio等(1988)によって以前に開示されたよ
うにしてアッセイした。トリプシン活性は、50 mM Tris-HCl、pH7.9中で、基質
としてのN-ベンゾイル-L-アルギニンエチルエステルによる253 nmでの吸光度の
増大(Mundy等、1984)を追跡することにより、或いはアゾカゼイン基質からのト
リクロロ酢酸(TCA)可溶性画分中へのアゾ染料の放出により測定した(後述参照)
。トリプシン抑制のアッセイにおいては、トリプシン(5〜10μg)を適切な量のKT
IまたはBBTIと一緒に50 mM Tris-HCl、pH7.9中で、室温で5分間予備インキュベ
ートし、次いで、たんぱく質分解活性を測定した。2つの基質は同様なデータを
与えたけれども、結果は、1つの基質だけによって提示する。
【０１４５】 小麦プロテアーゼ活性は、pH4.7でのアゾカゼイン基質からのアゾ染料のTCA溶
液中への放出を追跡することによって測定した。20mM酢酸ナトリウムと10mMのβ
-メルカプトエタノールの溶液、pH4.6中の小麦プロテアーゼ50μlを、50μlの20
0mM酢酸ナトリウム、pH4.6と100μlの2％アゾカゼイン(20mMリン酸ナトリウム、
pH7.0)に加えた。37℃で1時間インキュベーション後に、1mlの10％TCAを加え、
混合物を室温で10分間放置させた。ミクロヒュージ(microfuge) (8000g)中で5分
間遠心処理した後、1mlの上清溶液を取り出し、1mlの１N NaOHと混合した。吸光
度を440nmで読取った。たんぱく質濃度を、標準としてウシ血清アルブミンを用
いたBio-Red試薬によって測定した(Bradford、1976)。
【０１４６】 結果 トリプシン抑制活性 大豆の20 kDa Kunitzおよび8 kDa Bowman-Birkの各トリプシンインヒビターは
、それぞれ、2個および7個のジスルフィド基を含有する(Birk、1976；Wilson、1
988)。その生理学的機能は確立されてないけれども、上記２つのタイプのインヒ
ビターは、その豆科植物種子中での広い分布および栄養学的障害、例えば、肥大
症およびそれに伴う膵臓の機能不全を引起す可能性故に、広く研究されている。
表1および2において示したように、またこれまでの実施例において述べたように
、KTIおよびBBTIは、E. coliまたは植物由来のいずれかのNADP/チオレドキシン
系によって特異的に還元される。グルタチオンおよびグルタレドキシン(ある種
の動物および細菌系においてチオレドキシンを置換し得るチオールたんぱく質、
植物において生ずる事は知られていない(Holmgren、1985))の還元形は、効果な
しであった。
【０１４７】 チオレドキシンによる還元結果を決定するには、KTIおよびBBTIの酸化形およ
び還元形のトリプシン抑制活性を比較した。表11に示すように、NADP/チオレド
キシン系(NTS)による30℃、2時間の予備インキュベーションは、トリプシン抑制
活性の実質的低下をもたらした(即ち、未抑制対照に対してのトリプシン活性の
増大があった)。さらに詳細には、NADP/チオレドキシン系は、KTIおよびBBTIに
おいて、それぞれ、トリプシン活性の3倍および6倍の増大を与えた。同様な結果
は、チオレドキシンの非生理学的置換体であるDTTにおいても、また天然産ジチ
オールであるリポ酸によって還元されたチオレドキシンにおいても得られた。DT
T単独による延長したインキュベーション(室温で1夜)は、両インヒビターの完全
な或いは殆ど完全な不活性化をもたらした(データは示していない)。DTTと異な
り、リポ酸は、チオレドキシンの不存在下ではKTIおよびBBTIを有意には還元(不
活性化)しなかった。
【０１４８】表11 NADP/チオレドキシン系、DTTまたは還元リポ酸による還元後の大豆トリプシンインヒビターのトリプシンを抑制する能力の変化 *未抑制対照トリプシンの特異的活性は、基質としてN-ベンゾイル -L-アルギニンエチルエステルを用いて、0.018ΔA253nm/μg/分で あった。 1 E. coli NTS(NADP/チオレドキシン系)による還元を30℃で2時間 行った。 2 DTT(1mM)による還元を30℃で1時間行った。 3 リポ酸(LA、0.4mM)および小麦チオレドキシンh(Trx h)による還 元を30℃で1時間行った。リポ酸単独(0.4mM)の存在下では、ト リプシン活性は、KTIにおいて20.0％およびBBTIにおいて12.5％ であった。
【０１４９】 Friedmanとその同僚は、大豆粉をイオウ還元剤(亜硫酸ナトリウム、N-アセチ
ル-L-システィン、還元グルタチオンまたはL-システィン)の存在下で加熱するこ
とにより、トリプシンインヒビターが不活性化されることを観察し、大豆粉中の
他のたんぱく質によるジスルフィド基の還元または相互変化であると想定してい
る(Friedman and Gumbmann, 1986 ; Friedman et al.1982, 1984)。これら還元
剤によるトリプシンインヒビターの不活性化は、試験ラットにおいて粉類の消化
性および栄養価を改善していた((Friedman and Gumbmann, 1986)。これら早期の
観察と一緒に考えると、本発明の知見は、チオレドキシンがターゲットとするKT
IおよびBBTI両方のジスルフィド結合がトリプシン抑制活性の維持に対して重要
であることを示唆している。
【０１５０】 熱安定性 プロテアーゼインヒビターたんぱく質は、加熱のような不活性化処理に対して
典型的に安定である。この安定性は、少なくとも1部は、ジスルフィド結合の架
橋性に帰する(Birk，1976；Ryan，1981)。ジスルフィド結合を還元により破壊す
ることにより、熱安定性が低下することは公知である((Friedman等、1982)。問
題は、チオレドキシンによる還元が同様な結果を与えるかどうかに関して生じて
いる。
【０１５１】 表12に示すような結果は、この問題に対して肯定的な答えを提供する。80℃で
15分間加熱したとき、KTIのチオレドキシン還元形は、トリプシンを抑制するそ
の能力を完全に喪失しており、一方、酸化された対等物は、元の活性の約半分を
保持していた(表12)。酸化BBTIは、よれより幾分か安定であり、100℃で25分間
の加熱後に、そのトリプシン抑制活性の大部分を保持していた。にもかかわらず
、BBTIの還元形は、KTIにおけるように、加熱により十分に不活性化されていた(
表12)。これらの結果は、(i)KTI とBBTIは、加熱または還元に対して増大した感
受性を示す；(ii)溶液中の純粋BBTIは、溶液中の純粋KTIよりも熱安定性である
という従来の観察と一致している。紛類において、逆は真なりである(即ち、KTI
は、BBTIよりも熱安定性である(Friedman et al., 1982 and 1991；DiPietro an
d Liener, 1989))。
【０１５２】表12 KunnitzおよびBowman-Birkトリプシンインヒビターの熱安定性：酸化後またはE. coli NADP/チオレドキシン系による還元後 *トリプシンの特異的活性は、基質としてアゾカゼインを用いて、0.319 ΔA440nm/mg/分であった。不活性化において用いた温度は、本発明の 条件下でトリプシンインヒビターの熱安定性を示すように設定した 初期の試験において測定した。 1 nd：測定せず。
【０１５３】プロターゼ感受性 KTIおよびBBTIの還元形がトリプシン以外のプロテアーゼに対しても安定性の
低下を示すかどうかを試験するために、KTIおよびBBTIの還元形および酸化形両
方を、小麦プロテアーゼ調製物またはスブチリシンと一緒にインキュベートし、
たんぱく質分解生成物をSDS-PAGEにより分析した。たんぱく質分解の度合は、レ
ーザー濃度計によりSDS上のインタクトたんぱく質の存在量を測定することによ
って決定した。5日間発芽小麦種子からのプロテアーゼ調製物によって試験した
とき、Kunitzインヒビターの酸化形は消化に対して殆ど完全に抵抗的であったの
に対し、チオレドキシン還元形はプロテアーゼに対して感受的であった。表13に
示すように、KTIの約80％は、NADP/チオレドキシン系(NTS)のすべての成分に依
存する反応において分解していた。BBTIは同じパターンを示していたが、その酸
化たんぱく質は、KTIに対比して大きいたんぱく質分解感受性を示していた。同
様な効果は、植物プロテアーゼ調製物をスブチリシンで置換えたときにも両イン
ヒビターにおいて観察された(データは示していない)。たんぱく質分解反応の本
質は研究しなかったが、ペプチド生成物がSDSゲル上で検出されなかったことは
注目される。
【０１５４】表13 植物プロテアーゼ調製物によるたんぱく質分解に対 するKunitzおよびBowman-Birkトリプシンインヒビターの感受性についてのチオレドキシン結合還元の効果 1 1 E. coliチオレドキシン系による30℃、2時間での還元後に、 200mM酢酸ナトリウム、pH4.6を加えることによって、pHを 4.7に調整した。次いで、小麦プロテアーゼ調製物を加え、37℃ で2時間インキュベートし、その後SDS-PAGE分析を行った。 2 レーザー濃度計で測定。 3 NTS：NADP/チオレドキシン系。 4 測定せず。
【０１５５】 本実施例は、チオレドキシンまたはジチオスレイトール(DTT)による還元が両
たんぱく質の不活性化、並びにこれらたんぱく質の加熱およびプロテアーゼに対
する感受性の増大をもたらしていることを示している。結果は、インヒビターた
んぱく質のチオレドキシン結合還元が工業的加工および種子発芽の両方に対して
価値あることを示唆している。
【０１５６】 これらの結果は、ジスルフィド結合がKTIおよびBBTIのトリプシン抑制活性に
おいて本質的であるということを確認している(Birk, 1985;Friedman and Gumbm
ann, 1986; Friedman et al., 1982,1984)。これらの研究は、還元(不活性化)が
生理学条件下で(即ち、NADPH誘起性チオレドキシンによる低温で)起り得ること
も示している。低温でトリプシンインヒビターを不活性化する能力は、両トリプ
シンインヒビターの完全不活性のための可能性ある方法を提供し、それによって
大豆製品の品質を改善し且つエネルギーを節減する。KTIの完全不活性化方法を
求めることは、その活性の20％が、BBTIが完全に不活性化される条件においても
大豆粉中に一貫して残存していることから、意義のあることである。
【０１５７】 本発明の結果もKTIおよびBBTIのプロテアーゼ感受性に関して新しい情報を追
加している。還元後のそれらプロテアーゼ感受性の増大は、種子の発芽中にプロ
テアーゼインヒビターに暴露された場合、NADP/チオレドキシン系はインヒビタ
ーたんぱく質が改質(不活性化)され、実際には分解されるメカニズムとして機能
し得るであろうことを示唆している(Baumgartner and Chrispeels, 1976; Chris
peels and Baumgartner,1978; Orf et al., 1977; Wilson, 1988; Yoshikawa et
al., 1979)。前述したように、NADP-チオレドキシン系が小麦種子の発芽中のた
んぱく質動員において同様な役割を発揮している証拠は存在している。
【０１５８】 実施例20 チオレドキシンによるひま種子2Sアルブミンたんぱく質の還元 ひま(castor) の種子からの2Sたんぱく質(Sharief and Li, 1982; Youle and
Huang, 1978)を還元するスルフヒドリル剤の下記の試験結果は、チオレドキシン
が2Sの大サブユニットの分子内ジスルフィドを積極的に還元するが2つのサブユ
ニットを結合している分子間ジスルフィドを還元しないことを示している。 材料および方法 材料 ひま(Ricinus communis L.var Hale)は、Bothwell Enterprises(テキサス州プ
ランビュー)から入手した。バイオ薬品は、Sigma Chemical社(ミズーリ州セント
ルイス)から入手した。E. coliチオレドキシンおよびNTRは、各たんぱく質を多
発現するよう形質転換した細胞から分離した。組換えプラスミド、pFPIを含有す
るチオレドキシン株は、J.-P.Jacquot博士から親切に提供された(de La Motte-G
uery et al., 1991)。組換えプラスミド、pPMR21を含有する株は、Marjorie Rus
selおよびPeter Model両博士から親切に提供された(Russel and Model, 1988)。
チオレドキシンおよびNTRは、de La Motte-Guery et al., (1991）およびFloren
cio et al. (1988)のそれぞれの手順によって精製した。SDS-ポリアクリルアミ
ド電気泳動用の試薬は、Bio-Rad Laboratories社(カリフォルニア州リッチモン
ド)から購入した。モノブロモビマン(mBBr)またはチオライト(Thiolite)は、Cal
biochem社(カリフォルニア州サンディエゴ)から入手した。他の化学薬品は、市
販源から入手し、入手可能な最高品質のものであった。NADP-マレートデヒドロ
ゲナーゼおよびフルクトース-1,6-ビスホスフェートは、それぞれ、コーンの葉(
Jacquot etal. 1981)ほうれん草(Nishizawa et al. 1982)から精製した。チオレ
ドキシンhは、ほうれん草たんぱく質(Florencio et al.1988)において工夫した
手順をフォローすることにより小麦種子から分離した。グルタチオンリダクター
ゼは、ほうれん草の葉から調製した(Florencio et al. 1988).
【０１５９】 たんぱく質本体の分離 たんぱく質本体は、非水性法によって分離した(Yatsu and Jacks, 1968)。脱
穀ひま種子、15gを40mlのグリセリンと30秒間ウォーリング(Waring)ブレンダー
内で混合した。混合物を4層のナイロン布で濾過した。粗抽出物を、Beckman J2-
21M遠心機内でJS-20ローターを用いて272×gで5分間遠心処理した。遠心処理後
、上清画分を集め41,400×gで20分間遠心処理した。たんぱく質本体を含有する
ペレットを10mlのグリセリンに再懸濁させ、上記のようにして遠心し(41,400×g
)、ペレットを集めた。この洗浄工程を2回繰返した。可溶性(“マトリックス”)
画分を、ペレットを3mlの100mM Tris-HClバッファー(pH8.5)で3回抽出すること
によって得た。上記のように遠心により集めた残りの不溶性(“クリスタロイド
”)画分は、100mM Tris-HClバッファー(pH8.5)中の6M尿素3mlで抽出した。
【０１６０】 2Sたんぱく質精製手順 2Sたんぱく質は、Tully and Beevers法(1976年)の修正法によって調製した。
マトリックスたんぱく質画分を、5mM Tris-HClバッファー、pH8.5(バッファーA)
で平衡させたDEAE-セルロース(DE-52)カラムに塗布し、バッファーA中での0〜30
0mM NaCl勾配によって溶出させた。2Sたんぱく質を含有する画分をプールし、凍
結乾燥により濃縮させた。濃縮画分を、150mMのNaClを含有するバッファーAでPh
armacia FPLC Superose-12 (HR 10/30)カラムに塗布した。上記Superose-12カラ
ムからの2Sたんぱく質を含有する画分を、バッファーAでFPLC Mono Q HR 5/5カ
ラムに塗布した。カラムを3mlのバッファーA、バッファーA中の0〜300mM 直線勾
配のNaCl 20 ml、最後に1M NaClを含有するバッファーAで順次溶出させた。この
方法で精製した2Sたんぱく質は、クーマシー(Coomassie)ブルーで染色したSDSポ
リアクリルアミドゲルにおいて汚染物を含まなかった(Kobrehel et al. 1991)。
【０１６１】 分析方法 たんぱく質の還元は、Crawford等(1989年)のモノブロモビマン(mBBr)/SDSポリ
アクリルアミドゲル電気泳動によってモニターした。ラベル化たんぱく質を、前
に“穀物たんぱく質の還元、材料および方法”の章において説明したようにして
定量した。たんぱく質は、Bradfordの方法(1976年)によって測定した。
【０１６２】 酵素アッセイ/還元試験 Wada等の1981年プロトコールを用いて、NADP-マレートデヒドロゲナーゼおよ
びフルクトース1,6ビスホスファターゼをチオレドキシンおよび2Sたんぱく質の
存在下にアッセイした。アッセイは、添加したチオレドキシンの量がひま2Sたん
ぱく質を還元するには十分であるがターゲット酵素を認識し得る程に活性化させ
るには不十分であるような条件下で行った。すべてのアッセイが25℃であった。
特に断らない限り、使用したチオレドキシンとNTRは、E. coli由来であった。2S
たんぱく質は、ジチオスレイトールおよびE. coliチオレドキシンによる還元後
のmBBr/SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動による精製中にモニターした(Crawf
ord et al. 1989; Kobrehel et al., 1991)。
【０１６３】 ひま種子からのマトリックスおよびクリスタロイドたんぱく質の還元をmBBr/S
DSポリアクリルアミドゲル電気泳動手順によって測定した。ゲルの各レーン(示
してない)は、下記のとおりである。1および7、対照：添加なし；2および8、GSH
/GR/NADPH：還元グルタチオン、グルタチオンリダクターゼ(ほうれん草の葉由来
)およびNADPH；3および9、NGS：NADPH、還元グルタチオン、グルタチオンリダク
ターゼ(ほうれん草の葉由来)およびE. coli由来のグルタレドキシン；4および10
、NTS：NADPH、NTRおよびチオレドキシン(共にE. coli由来のたんぱく質)；5お
よび11、NADPH；６および12、NADPHおよびE. coli NTR。反応は、100 mM Tris-H
Clバッファー、pH7.8において行う。説明するように、0.7μgのNTRと1μgのチオ
レドキシンを、1mMのNADPHおよびターゲットたんぱく質(処理1〜6においては8μ
gのマトリックスたんぱく質、処理7〜12においては10μgのクリスタロイドたん
ぱく質)を含有する70μlの上記バッファーに加えた。グルタチオンによるアッセ
イは、同様であるが、2mMの最終濃度、1.4μgのグルタチオンリダクターゼ、1μ
gのグルタレドキシン、および1.5mMのNADPHにおいて実施した。反応時間は20分
であった。
【０１６４】 また、mBBr/SDS-Page法を使用し、ひま種子2Sたんぱく質のジスルフィド結合
を還元するチオレドキシンの特異性を測定した。ゲルの各レーン(示してない)は
、次のとおりである、(1)対照(添加なし)；(2)対照 + NTS(マトリックスたんぱ
く質およびクリスタロイドたんぱく質における場合と同じ条件)；(3)対照(100℃
で3分加熱)；(4)対照 + 2 mM DTT(100℃で3分加熱)。5μgの2Sたんぱく質を含有
するサンプルおよび上記添加剤を、30 mM Tris-HCl(pH 7.8)中で20分間インキュ
ベートした。次いで、80 nモルのmBBrを加え、反応を、mBBr/SDSポリアクリルア
ミドゲル電気泳動手順による分析前に、さらに15分間続けた。
【０１６５】 結果 ひま貯蔵たんぱく質は、種子成熟中のたんぱく質本体内に保持されており、そ
の溶解性に基づき2つの画分に分離できる。より可溶性の大きいたんぱく質は、
たんぱく質本体外側部分(“マトリックス”)内にあり、溶解性の小さいたんぱく
質は内側(“クリスタロイド”)内にある。本試験においては、マトリックスおよ
びクリスタロイド成分を分離して、それらの細胞性チオール類、即ち、グルタチ
オン、グルタレドキシンおよびチオレドキシンによる還元を受ける能力を測定し
た。触媒活性チオール基を有する12kDaたんぱく質であるグルタレドキシンは、
バクテリアおよび動物のある種の酵素反応においてチオレドキシンを置換し得る
が(Holmgren et al. 1985)、植物において生ずることは知られていない。
【０１６６】 結果は、多くのひま種子の貯蔵たんぱく質は試験チオール類で還元されていた
が、マトリックスの2Sたんぱく質の大サブユニットに相応する低分子量たんぱく
質のみがチオレドキシンに対して厳格な特異性を示した。クリスタロイド画分の
ある種の高分子量たんぱく質は、還元を受けたが、それらの場合、グルタレドキ
シンとチオレドキシン間で殆ど差異はなかった。ひま種子2S大サブユニットは、
チオレドキシン特異性還元を受けることにおいて前に説明したシスティン含有た
んぱく質に似ているようであった。これらの試験は、この特異性を確認し、還元
されたたんぱく質のある種の性質をはっきりさせるように設定した。予期された
ように、ジスルフィド基がないため、2S小ユニットは、どの試験還元剤において
もmBBrとの反応を本質的に示さなかった。
【０１６７】 その蛍光バンドをレーザー濃度計でモニターしたとき、ひま2S大サブユニット
の還元は、NADP/チオレドキシン系(NADPH、NTRおよびチオレドキシン)の全成分
に依存していることを見出した(表14)。他のチオレドキシン結合たんぱく質(ク
ロロプラスト酵素のような)におけるように、2S大サブユニットの還元において
活性なチオレドキシンは、ジチオスレイトール(DTT)により化学的に、或いはNAD
PHおよびNTRにより酵素的に還元されて得ていた。NADPチオレドキシン系、DTT単
独、およびDTT + チオレドキシンによる還元の度合は、25℃、20分後で、それぞ
れ、84％、67％および90％であった。同様に、一般的に過度の還元さえも上述し
たジスルフィドたんぱく質において観察された(Johnson et al. 1987)。他の種
子タンパクにおけるように、未変性小麦チオレドキシンhおよびE. coliチオレド
キシンは、DTTによる2Sたんぱく質の反応において互換的に使用できた(データは
示していない)。
【０１６８】表14 種々のスルフィドリル還元剤による還元度合。マトリックスおよびクリスタロイ
ドたんぱく質測定における反応条件。2Sたんぱく質を2％SDSおよび2.5％β-メル
カプトエタノールの存在下に3分間加熱したときに得られた還元に100％相応する
還元。NTS：NADPH、NTR、およびチオレドキシン(共に、E. coli由来たんぱく質)
；GSH/GR/NADPH：還元グルタチオン、グルタチオンリダクターゼ(ほうれん草の
葉由来)およびNADPH；NGS：NADPH、還元グルタチオン、グルタチオンリダクター
ゼ(ほうれん草の葉由来)およびグルタレドキシン(E. coli由来)。
【０１６９】 ひま種子2Sたんぱく質を還元するチオレドキシンの能力は、酵素活性化アッセ
イにおいても明らかであった。ここで、チオレドキシンがターゲットとするたん
ぱく質(この場合は、2S)を用いて、クロロプラストのチオレドキシン結合酵素、
NADP-マレートデヒドロゲナーゼまたはフルクトース1,6-ビスホスファターゼを
活性化する。検査した殆どのたんぱく質における限りでは、2Sたんぱく質がNADP
-マレートデヒドロゲナーゼをかなり有効に活性化し、フルクトースビスホスフ
ェートとの活性は殆ど示さなかった(2.6対0.0n/分/mgたんぱく質)。
【０１７０】 ひま種子2Sたんぱく質は、分子間および分子内シスルフィドを含有する。それ
で、2Sたんぱく質は、これら２つのタイプの結合に対するチオレドキシンの特異
性を決定する機会を提供する。この目的のため、ひま種子2Sたんぱく質を、（i
）NADP/チオレドキシン系により室温で酵素的に、(ii) DTTにより100℃で化学的
に還元させた。MBBrとの反応後、還元たんぱく質を、追加のスルフィドリル剤な
しで実施したSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析した。結果は、チ
オレドキシンが分子内ジスルフィド基を積極的に還元したけれども、チオレドキ
シンは、分子間ジスルフィドにはあまり有効ではなかった。
【０１７１】 本発明の結果は、オイル産生植物であるひま種子の2Sたんぱく質の還元に対す
るチオレドキシンの役割を拡大する。チオレドキシンは、2Sたんぱく質の大サブ
ユニットの分子内ジスルフィドを特異的に還元し、大サブユニットと小サブユニ
ットをを結合している分子間ジスルフィドに対しては殆ど活性を示さなかった。
大豆のトリプシンインヒビターにおける結果に基づき、チオレドキシンによる分
子内ジスルフィドは、たんぱく質分解に対するジスルフィドたんぱく質の感受性
を著しく増大させていることは明らかである(Jiao et al. 1992a)。しかしなが
ら、2Sたんぱく質の還元がそのたんぱく質分解(Youle and Huang, 1978)の前に
起こっているかどうかを理解することは、小麦の主要貯蔵たんぱく質における場
合と同様に、そのまま残っている。本研究によって生じた関連問題は、ひま並び
に他のブラジルナット(Altenbach et al.,1987; Ampe et al., 1986)のようなオ
イル産生植物が貯蔵タンパクの機能以外の機能を有するかどうかである。実施例２１ 特定の抑制タンパクの失活による穀類のプルラナーゼのチオレドキシン−依存脱 抑制(deinhibition) プルラナーゼのアッセイ １．マルトトリオースの検量線： 一連の濃度の０．１〜０．２ｍｌの水又は緩衝液中のマルトトリオース（０〜
２ｍｇ）をミクロチューブ中に製造した。これに、０．２ｍｌのジニトロサリチ
ル酸（ＤＡ）試薬（１ｇのＤＡ、３０ｇの酒石酸カリウムナトリウム及び２０ｍ
ｌの２Ｎ ＮａＯＨと最終容量１００ｍｌまでの水とを混合）を添加した。その
試薬を温水浴中に溶解した。混合物を１００℃で５分間加熱し、水浴（室温）中
において冷却した。各サンプルを２ｍｌの水を含むガラス管に移した。Ａ493対
水を読み取った。△Ａ493[マルトトリオースを含むサンプルのＡ493をブランク
（マルトトリオースなし）のＡ493から減じた]をマルトトリオース濃度に対して
プロットした。 ２．プルラナーゼ活性アッセイ プルラナーゼ活性をプルラン基質からの還元糖の放出として測定した。典型的
に、１０〜１００μｌのプルラナーゼサンプル（２０ｍＭトリス-ＨＣｌ（ｐＨ
７．５）中、又は５〜２０のアセテート-ＮＡ（ｐＨ４．６）中）を２５〜１０
０μｌの２００ｍＭアセテート-ＮＡ（ｐＨ５．５）（この緩衝液はアッセイの
最終ｐＨを５．５にするように機能する）及び１０〜２０μｌの２％（ｗ／ｖ）
プルランと混合した。混合物を、３７℃で、プルラナーゼの活性に依存して３０
〜１２０分間インキュベートした。反応は、２００μｌのＤＡ試薬を添加するこ
とにより停止した。還元糖を、その後、上述のように測定した。
【０１７２】 注： １．透析された３０〜６０％の硫酸アンモニウムフラクションから得られたプル
ラナーゼ又は粗抽出物の透析により得られたプルラナーゼの粗抽出物をプルラナ
ーゼ源として使用する場合には、それはアッセイ前に完全に透析しなければなら
ず、なぜなら、粗抽出物中には還元糖が存在するからである。言い換えれば、透
析された３０〜６０％の硫酸アンモニウムフラクション又は透析された粗抽出物
からの粗プルラナーゼサンプルのバックラウンドは非常に高い。このケースにお
いては、ブランクは次のように製造した：２００μｌのＤＡ試薬を最初に添加し
、次いで、酵素サンプル、プルラン及び緩衝液を添加した。 ２．ＤＴＴ（即ち、β−メルカプトエタノール（ＭＥＴ）又はＧＳＨ）の最終濃
度がアッセイ混合物中において２ｍＭより高い場合には、ＯＤ493値は、マイナ
ス−ＤＴＴ（ＭＥＴ、ＧＳＨ）サンプルのものより高いであろう。ＤＴＴ（ＭＥ
Ｔ、ＧＳＨ）は、ブランク、ＤＴＴなしのサンプルに、アッセイの間に反応の終
了時に添加されるべきである。アッセイ混合物中のＤＴＴの最終濃度が２ｍＭ未
満であることを確認することに注意すべきである。
【０１７３】 プルラナーゼ抑制剤の精製、抽出及び硫酸アンモニウムフラクション ２００ｇの大麦麦芽を電気コーヒーグラインダーにより粉砕して微粉とし、６
００ｍｌの５％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌを用いて３０℃で３時間抽出した。30,000ｇ
、４℃で２５分間の遠心分離の後、上清を、固形硫酸アンモニウムでの沈降によ
り分画した。３０〜６０％飽和の硫酸アンモニウムの沈降したタンパクを、最小
量の２０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）中に溶解し、この緩衝液で４℃で一晩
透析を行った。 ＤＥ５２クロマトグラフィー 透析されたサンプルを遠心分離して、不溶性材料を除去し、２Ｎギ酸を用いて
上清のｐＨを４．６に調整した。酸変性タンパクをペレット化した後、ＮＨ4Ｏ
Ｈを用いて上清のｐＨを７．５に再調整し、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．
５）で平衡化されたＤＥ５２カラム（２．５×２６ｃｍ）に充填した。上記緩衝
液８０ｍｌでの洗浄の後、カラムを、直線的０〜５００ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ７．５）で溶出させた。６．７ｍｌのフラクションを収集した。プルラナーゼ
を、約３２５ｍＭ ＮａＣｌで溶出させ、その抑制剤は約１００ｍＭ ＮａＣｌ
で落ちた(come off)。プルラナーゼを、更に、ＣＭ３２（２０ｍＭ酢酸ナトリウ
ム、ｐＨ４．６）及びセファクリル−２００ＨＲ（３０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ７．５）、２００ｍＭ ＮａＣｌ及び１ｍＭ ＥＤＴＡを含有）クロマトグラ
フィにより精製した。プルラナーゼ抑制タンパクを以下のように精製した。
【０１７４】 ＣＭ３２クロマトグラフィ ＤＥ５２工程からのプルラナーゼ抑制サンプル（約９０ｍｌ）を１５０ｍｌフ
ラスコに入れ、７０℃の水浴中において２０分間インキュベートした。遠心分離
後、２Ｎギ酸で清澄化サンプルのｐＨを４．６に調整し、２０ｍＭ酢酸ナトリウ
ム（ｐＨ４．６）で透析させた。透析の間に形成された沈澱物を、遠心分離によ
り除去し、上清を２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．６）で平衡化されたＣＭ３
２カラム（２．５×６ｃｍ）においてクロマトグラフィにかけた。タンパクを直
線的０〜０．４Ｍ ＮａＣｌで２００ｍｌの２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．
６）中において溶出させた。プルラナーゼ抑制活性を有するフラクション（５．
０ｍｌ／フラクション）をプールし、透析し、かつ、２００ｍｌの２０ｍＭ酢酸
ナトリウム（ｐＨ４．０）中において直線的０．２〜１Ｍ ＮａＣｌ勾配を有す
るＣＭ３２カラム（２．５×６ｃｍ）において再びクロマトグラフィにかけた。
セファデックスＧ−７５ろ過 第２のＣＭ３２クロマトグラフィ工程からのプルラナーゼ抑制フラクションを
、固形ショ糖での透析バッグにおいて濃縮し、２００ｍＭ ＮａＣｌ及び１ｍＭ
ＥＤＴＡを含む、３０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）で平衡化されたセファ
デックスＧ−７５カラム（２．５×８５ｃｍ）により分離した。プルラナーゼ抑
制活性を示すフラクション（３．６ｍｌ／フラクション）をプールし、固形ショ
糖での透析により濃縮し、かつ、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で透析
した。
【０１７５】 プルラナーゼ抑制剤の同定及び精製 発芽の間、澱粉が、α−、β−アミラーゼ及びプルラナーゼ（脱分枝酵素、Ｒ
−酵素とも称される）によりグルコースに変換される。アミラーゼ調節について
の広範な研究が行われているが、種子中のプルラナーゼの調節についてはほとん
ど知られていない。ヤマダ（Yamada, J. (1981) Carbohydrate Research 90: 15
3-157）により、還元剤（例えばＤＴＴ）又はプロテアーゼ（例えばトリプシン
）での穀粉のインキュベートによりプルラナーゼ活性の活性化が導かれ、それに
より、還元又はタンパク分解が、プルラナーゼが発芽の間に活性化されるメカニ
ズムであるかもしれないことが示されることが報告されている。米粉におけるよ
うに、発芽した小麦種子からの又は大麦麦芽からのプルラナーゼ抽出物が低い活
性を示し、かつ、ＤＴＴでの２０〜３０分間の予備インキュベートにより３〜５
倍活性化された。しかしながら、アニオン又はカチオン交換クロマトグラフィに
よる粗抽出物（３０〜６０％の硫酸アンモニアフラクションの透析液）の精製の
後、全プルラナーゼ活性が、ＤＴＴでの予備インキュベートなしにアッセイされ
た際のカラムに付されたサンプルの２〜３倍に上昇し、ＤＴＴはプルラナーゼへ
の作用を全く又はほとんど有しない。１つの可能性は、発芽した小麦種子又は大
麦麦芽が高いプロテアーゼ活性を示すので、プルラナーゼが、精製工程の間にタ
ンパク分解により活性化され得ることであった。このケースでは、プロテアーゼ
抑制カクテル(cocktail)により、精製の間のプルラナーゼ活性が防止され得るで
あろう。これと対照的に、プロテアーゼ抑制剤での多くの実験では、これを証明
し損ねている。他の可能性は、硫酸アンモニウムにより沈澱し、かつ、プルラナ
ーゼを抑制する抑制剤が存在することである。ＤＴＴの役割は、還元すること、
従って、このタンパク抑制剤を不活性化し、プルラナーゼの活性化を導くことで
ある。このラインに沿って、大麦麦芽からの３０〜６０％硫酸アンモニウムフラ
クションを、２０ｍＭトリス−ＣＨｌ（ｐＨ７．５）で平衡化したＤＥ５２カラ
ム（２．５×２６ｃｍ）に付した。直線的塩勾配での溶出の後、“脱抑制化され
た”（“活性化された”）プルラナーゼを、約３２５ｍＭ ＮａＣｌ（フラクシ
ョンナンバー４４〜６０）で落ちる(come off)タンパクピークとして同定した。
５０μｌのピークプルラナーゼ活性フラクション（フラクションナンバー４５）
と５０μｌの他のタンパクフラクションからなる予備インキュベート混合物中に
おけるプルラナーゼ活性のアッセイにより、プルラナーゼ抑制活性を示すタンパ
クピークがフラックションナンバー８〜２５で約１００ｍＭ ＮａＣｌによりＤ
Ｅ５２カラムから溶出されたことが示された。 プルラナーゼ抑制サンプルを、更に、ＣＭ３２（ｐＨ４．６及び４．０）での
２連続的カチオン交換クロマトグラフィ工程及びセファデックスＧ−７５でのろ
過により精製した。
【０１７６】 プルラナーゼ抑制の特性 予備試験から、プルラナーゼ抑制タンパクが７０℃で１０分間、ｐＨ４．０の
処理に抵抗性であることが示された。セファデックスＧ−７５ゲルろ過及びＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥのプロフィールによれば、プルラナーゼ抑制剤は、８〜１５ｋＤａ
±２ｋＤａの分子量を有する。その研究により、更に、タンパクがチオレドキシ
ン還元性（Ｓ−Ｓ）結合を含むことが示された。 これらの研究により、表XVに示したように、遍在性ジチオールタンパク質、チ
オレドキシンがオオムギおよびコムギの胚乳のプルラナーゼを阻害する、従来未
知であったジスルフィド-含有タンパク質に対する特異的な還元剤として働くこ
とが分かった。
【０１７７】 表XV
【０１７８】 阻害タンパク質の還元はそのプルラナーゼ阻害能を除去し、それによってプル
ラナーゼ酵素を活性にする。表XVに示された研究は、NADPH、NADP-チオレドキシ
ン還元酵素(NTR)およびチオレドキシン（NADP/チオレドキシン系）からなる生理
学的系によりプルラナーゼを活性化することの可能性を示している。これらの発
見は、プルラナーゼの還元性活性化がどのように起こるかを明らかにするもので
もある（すなわち、特異的な（従来は未知の）阻害剤が還元され、それによって
不活化され、その結果酵素が活性になる）。この反応における活性なチオレドキ
シンはE.coliまたは種子胚乳（チオレドキシン h）のような種々の供給源から得
ることができる。阻害タンパク質(I)の還元的不活性化およびプルラナーゼ酵素(
E)の脱阻害におけるチオレドキシンの役割は式１および式２において与えられる
。
【０１７９】 ＮＴＲ （１）チオレドキシン酸化＋ＮＡＤＰＨ――→チオレドキシン還元＋ＮＡＤＰ （２）チオレドキシン酸化＋［Ｅ不活性：Ｉ酸化］ ――→チオレドキシン酸化＋Ｅ活性＋Ｉ還元
【０１８０】 要約すれば、胚乳粗抽出物をカラムクロマトグラフィー法によって分画した。
これらの工程はタンパク質阻害剤をプルラナーゼ酵素から分離するように働く。
次に、阻害タンパク質を幾つかの工程により高度に精製した。mBBr/SDS-PAGE法
を使用することにより、この新規なタンパク質のジスルフィド基はチオレドキシ
ンによって特異的に還元されること、およびこの還元されたタンパク質はプルラ
ナーゼを阻害する能力を失うことが明らかにされた。他のある種の種子のジスル
フィドタンパク質（例えば、ダイズのKunitzとBowman-Birkトリプシン阻害剤）
のように、プルラナーゼ阻害タンパク質はクロロプラストNADP-リンゴ酸デヒド
ロゲナーゼを活性化することができることが示された。これらの実験において、
ジチオスレイトールを用いてチオレドキシンを還元した。チオレドキシンは次に
阻害剤を還元し、それによってこのデヒドロゲナーゼ酵素を活性化した。
【０１８１】 実施例２２ チオレドキシンおよびNADP-チオレドキシン還元酵素の 過剰発現のための酵母細胞の操作 ２つの酵母（Saccharomyces cerevisiae）チオレドキシン遺伝子(Muller, E.G
,D. (1991), J. Biol. Chem. 266: 9194-9202)、TRX1およびTRX2を、多コピー数
エピソームベクター（その例は、YEp24である）中に、強い構成的プロモーター
要素（その例は、グリセルアルデヒド-3-Pデヒドロゲナーゼ、エノラーゼまたは
ホスホグリセリン酸キナーゼの解糖系プロモーターである）の制御下にクローニ
ングする。組換え構築物は、定量的ウェスタンブロット法により、抗チオレドキ
シンウサギ抗血清を用いてチオレドキシンの過剰発現について評価し(Muller, E
.G.D.ら、(1989), J.Biol. Chem. 264: 4008-4014)、チオレドキシン遺伝子とプ
ロモーター要素との最適な組合せを選択する。最適なチオレドキシン過剰発現系
を有する細胞を生地の改善のためのチオレドキシン供給源として使用する。
【０１８２】 アミノ末端配列から予測されるオリゴヌクレオチドプローブを調製することに
より、NADP-チオレドキシン還元酵素遺伝子をクローニングする。酵素は、ホウ
レンソウの葉について案出された方法（Florencio, F.J.ら(1998),Arch. Bioche
m. Biophys. 266-507）を改変することにより、酵母細胞から調製する。純粋な
還元酵素のアミノ末端は、Applied Biosystems製気相タンパク質シーケンサーを
用いた自動化Exman分解による微量シーケンシングによって決定する。この配列
に基づき、かつ、酵母のコドン使用頻度に従って、20塩基24ボールドの縮退DNA
プローブを調製する。サザンブロット解析により、プローブをEcoRIおよびPstI
切断した単離酵母DNAにハイブリダイズさせる。最も活性な領域をアガロースゲ
ルから抽出し、pUC19プラスミドベクターに導入する（Szekeres, Mら、(1991),
J. Bacteriol. 173;1821-1823）。形質転換後、プラスミド含有E.coliコロニー
を標識したオリゴヌクレオチドプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーショ
ンによってスクリーニングする(Vogeli, G.ら、(1987)、Methods Enzymol. 152:
407-415)。クローンは、DNAをシーケンシングすることにより、上述したSzekere
sらによって与えられたNADP-チオレドキシン還元酵素に対する遺伝子を持つこと
で同定する。同定されたならば、NADP-チオレドキシン還元酵素遺伝子はTRX1お
よびTRX2酵母チオレドキシン遺伝子について上述したように酵母中で過剰発現さ
れる。NADP-チオレドキシン還元酵素を過剰発現している酵母細胞を生地品質を
改善するための還元酵素供給源として使用する。
【０１８３】 実施例２３ 遺伝的に操作された酵母細胞を用いた生地品質の改善 実施例２３に記載した２つの酵母チオレドキシンおよび酵母NAFP-チオレドキ
シン還元酵素を過剰発現するように操作された酵母（Saccharomyces cerevisiae
）細胞を超音波破砕のような確立された手法によって溶解し、凍結乾燥する。チ
オレドキシンおよびNADP-チオレドキシン還元酵素を過剰発現している培養物か
らの乾燥細胞を合わせ、生地品質を改善するために粉を補足するために使用する
。合わせた溶解乾燥細胞の2/10グラムを約300〜約500ナノモルNADPHとともに1M
Tris-HClバッファー、pH7.9に添加し、5.25mlの30mM Tris-HClとする。反応は実
施例１４に記載したように微量ファリノグラフ(microfarinograph)中で30℃にて
行なう。生地の改善が観察され、実施例１４に示した改善と類似している。
【０１８４】 実施例２４ グルテンの改善 生地品質に与えるNADP/チオレドキシン系の正の効果は、この系をグルテンの
調製における粉に適用するという選択肢を与える。目的は、グルテンの収量と特
性を変えることであり、その結果、（１）より強力なグルテン（増加した弾性、
改善された伸展性）を得ること、（２）可溶性タンパク質を捕捉し、NADP-チオ
レドキシン系によって還元し、タンパク質ネットワークにおいて、それらのタン
パク質がグルテン製造の過程で洗い流されることを防止することによってグルテ
ン収量を増加させること、によってその技術的価値を高めることである。この方
法において（10gの粉を使用する場合）、0.2μgのE.coliチオレドキシン、0.1μ
gのE.coli NADP-チオレドキシン還元酵素、および300-500ナノモルのNADPHを1M
Tris-HCl、pH7.9バッファーと共に添加し、5.25mlの30mM Tris-HClとする。グル
テンを一般的な浸出法に従って室温にて製造する。グルテンの収量は質量によっ
て測定し、グルテンの強度は古典的な手動引き伸ばし法（stretch method）によ
って測定する。このNADP/チオレドキシン系によるこの処理によって得られたグ
ルテン産物を小麦粉または他の穀粒中に添加物として使用する。
【０１８５】 実施例２５ 非コムギまたはライムギ粉からの生地を製造する方法 この試験（トウモロコシ、コメまたはソルガムから製粉した粉10gmを使用）の
ために、0.2μgのE.coliチオレドキシン、0.1μgのE.coli NADP-チオレドキシン
還元酵素および500ナノモルのNADPHを1M Tris-HCl、pH7.9バッファーと共に加え
、5.25mlの30mM Tris-HClとする。反応は、10gmの製粉した粉を酵素系と微量フ
ァリノグラフ中で30℃にて混合することによって行なう。ファリノグラフ測定に
より、添加したNADP-チオレドキシン系によるコムギ様生地特性が示された。酵
素系無しの対照においては、混合物が生地を形成できないために微量ファリノグ
ラフ読取は不可能である。形成された生地は永続性があり、その固さは操作を通
して維持される。最終産物はコムギ由来の生地中に形成されるネットワークに類
似している。 動物毒素の還元 本発明は、ハチ、サソリおよびヘビ毒に含まれる毒性惹起蛋白質を化学的に還
元し、それによってこれらの毒の生物学的活性を変化させるとともに、チオール
レドックス（ＳＨ）剤の手段、すなわち還元チオレドキシン、チオレドキシンま
たはＤＴＴの存在下の還元リポ酸によって動物性毒素、特にヘビの神経毒の毒性
を減少させる方法を提供する。チオレドキシンの還元は、好ましくはＮＡＤＰ−
チオレドキシン系（ＮＴＳ）を介して生じる。先に述べたように、ＮＴＳは、Ｎ
ＡＤＰＨ、ＮＡＤＰ−チオレドキシンレダクターゼ（ＮＴＲ）およびチオレドキ
シンを含む。
【０１８６】 「チオールレドックス剤」という用語は、非還元状態の薬剤及び還元状態又は
スルフヒドリル（ＳＨ）状態の薬剤の両方を指すために文献では時に用いられて
きた。本明細書で規定されるように、「チオールレドックス（ＳＨ）剤」という
用語は、還元チオールレドックスタンパク質又は合成剤（例えばＤＴＴ）を意味
する。 神経毒の還元は、液体である媒体、例えば血液、リンパ液もしくは緩衝液など
で、又は、固体である媒体、例えば細胞もしくは他の生体組織で生じるであろう
。本明細書で用いられるように、「液体」という用語単独では個体に存在する生
物学的液体を意味しない。 チオールレドックス（ＳＨ）剤が毒をin vitroで不活化し、さらに個体で毒性
を失わせる性能は、本発明の薬剤が、これら毒性惹起毒の成分中の分子内ジスル
フィド結合を還元する能力におそらく左右される。 全てのヘビの神経毒（シナプス前作用性及びシナプス後作用性の両者）が還元
され、さらに本発明のチオールレドックス（ＳＨ）剤によって少なくとも部分的
にin vitroで不活化される。本発明にしたがってin vitroで不活化されたヘビ神
経毒は、抗毒素の製造で抗原として有用である。神経毒素は、好ましくは適切な
緩衝液中でチオールレドックス（ＳＨ）剤とインキュベートすることにより不活
化される。好ましい緩衝液はトリス−ＨＣｌ緩衝液であるが、他の緩衝液（例え
ばリン酸緩衝液）も用いることができる。好ましいチオールレドックス（ＳＨ）
剤は還元チオレドキシンである。
【０１８７】 ヘビ神経毒を不活化するために有効な量は、１００μｌ中のヘビ神経毒１０μ
ｇにつき、還元チオレドキシンは約０．１μｇから５．０μｇ、好ましくは約０
．５μｇから１．０μｇ；約１．０μｇのチオレドキシンの存在下で還元リポ酸
は約１ナノモルから２０ナノモル、好ましくは５ナノモルから１５ナノモル；還
元ＤＴＴは（好ましくは約１．０μｇのチオレドキシンの存在下で）約１０ナノ
モルから２００ナノモル、好ましくは５０ナノモルから１００ナノモルである。 ＮＡＤＰ−チオレドキシン系の成分を用いてヘビ神経毒を不活化する場合に有
効な量は、１００μｌ中のヘビ神経毒１０μｇにつき、チオレドキシンは約０．
１μｇから５．０μｇ、好ましくは約０．５μｇから１．０μｇ；ＮＴＲは約０
．１μｇから２．０μｇ、好ましくは０．２μｇから１．０μｇ；ＮＡＤＰＨは
約０．０５マイクロモルから０．５マイクロモル、好ましくは約０．１マイクロ
モルから０．２５マイクロモルの範囲である。
【０１８８】 不活化した場合、この不活化神経毒及びチオールレドックス（ＳＨ）薬剤など
を含む緩衝液は、動物（例えばウマ）に注射して抗毒素を製造してもよいし、ま
た注射の前にさらに熱又はホルムアルデヒドで処理してもよい。 本発明のチオールレドックス（ＳＨ）剤はまた、有毒なヘビに咬まれて神経毒
に冒されている個体の治療に用いることもできる。還元されたチオールレドック
ス（ＳＨ）剤投与の好ましい方法は、ヘビの咬傷周辺の皮下に数回注射するもの
である。
【０１８９】 個体で神経毒を無毒化するために用いられる正確なチオールレドックス（ＳＨ
）剤の量は、もちろん咬傷から個体が実際に受けた神経毒の量に左右される。し
かしながら、マウスでヘビの神経毒の毒性を無毒化又は減少させるために有効な
量は、マウスの体重１グラムにつき還元チオレドキシンで約０．０１μｇから０
．３μｇ、好ましくは約０．０２μｇから０．０５μｇ；約０．０５μｇのチオ
レドキシンの存在下で還元リポ酸で約０．１ナノモルから３．０ナノモル、好ま
しくは０．２ナノモルから１．０ナノモル；好ましく０．０５μｇのチオレドキ
シンの存在下でＤＴＴで約１．０ナノモルから３０ナノモル、好ましくは２．０
ナノモルから５．０ナノモルである。 ＮＡＤＰ−チオレドキシン系の成分を用いてマウスでヘビの神経毒を無毒化す
るために有効な量は、マウスの体重１グラムにつき、チオレドキシンで約０．０
１μｇから０．３μｇ、好ましくは約０．０２μｇから０．０５μｇ；ＮＴＲで
約０．００５μｇから０．１２μｇ、好ましくは０．０１μｇから０．０２５μ
ｇ；ＮＡＤＰＨで約５ナノモルから３０ナノモル、好ましくは約１０ナノモルか
ら１５ナノモルの範囲である。
【０１９０】 ＮＴＳを個体に投与する好ましい方法はまた複数回の皮下注射による。ヒトで
使用する場合に好ましいチオールレドックス剤は、ＮＡＤＰチオレドキシン系を
介して、又はリポ酸もしくはＤＴＴとともに投与されるヒトのチオレドキシンで
ある。 神経毒を産生し、本発明の方法で不活化又は無毒化できる有毒なヘビの部分的
なリストは文献に記載されている（J.-P. Chippaur ら(1991), Reptile Venoms
and Toxins(A.T. Tu, ed.), Marcel Dekker, Inc.(pp.529-555）、この文献は参
照により本明細書に含まれる）。 動物毒を不活化又は無毒化することに関する本発明の他の特徴及び利点は以下
の実施例で確認できる。
【０１９１】実施例２６：ハチ、サソリ及びヘビ毒の還元実験及びｍＢＢｒによる標識 反応は、以下のプロテアーゼインヒビターを含む３０ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩
衝液（ｐＨ７．９）中の５０μｇ毒（最終容量１００μｌ）で実施した：フェニ
ルメチルスルフォニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、ロイペプチン及びペプスタチン
（アッセイに用いた最終濃度はそれぞれ１００μＭ、１μＭ及び１μＭ）。還元
剤としてＮＡＤＰＨとともに、本混合物はまた４μｇのチオレドキシン、３．５
μｇのＮＴＲ（ともに大腸菌由来）及び１２．５ｍＭのＮＡＤＰＨを含んでいた
。チオレドキシン（４μｇ、大腸菌又はヒト）がＤＴＴによって還元される場合
、ＮＡＤＰＨ及びＮＴＲを省略し、ＤＴＴを０．５ｍＭの濃度に添加した。最終
濃度５ｍＭ及び１．５μｇのグルタチオンレダクターゼ及び１２．５ｍＭのＮＡ
ＤＰＨの存在下で実施した点を除き、ＧＳＨによるアッセイを同様に実施した。
混合物は室温で２０分間インキュベートし、続いてｍＢＢｒを１．５ｍＭの濃度
に添加し、反応を室温で１５分継続させた。反応を停止させ、１００ｍＭのβ−
メルカプトエタノール１０μｌ、２０％ＳＤＳ５μｌ及び５０％グリセロール１
０μｌを添加して過剰のｍＢＢｒを誘導した。続いて、先に述べたようにサンプ
ルをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析した。
【０１９２】 ＮＡＤＰ−チオレドキシンによる同じ実験を、プロテアーゼインヒビターを添
加せずに実施した。 種々の還元剤を用い、プロテアーゼインヒビターの存在下で室温で２０分間イ
ンキュベートした後、サンプルをｍＢＢｒで誘導し、電気泳動で分離し、蛍光を
分析した。全ての事例でチオレドキシン（大腸菌又はヒト）は特異的に毒の成分
を還元することが示された。このゲルはまた、チオレドキシンは、反応がプロテ
アーゼインヒビターの非存在下で実施されるとき同様な態様で動物毒の成分を還
元することを示した。
【０１９３】 プロテアーゼインヒビターの存在下及び非存在下でのハチ、サソリ及びヘビ毒
のＮＡＤＰ−チオレドキシン系による還元もまた、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲルｎＢＢｒ工程を用いて示された。任意のインヒビターの存在下又は非存在下
でＮＴＳを用い室温で２０分間インキュベートした後、電気泳動によって分離し
、さらに蛍光を先に述べたように調べた。 材料 毒：Apis melliferaのハチ毒、Androctonus australisのサソリ毒及びBungaru
s multicinctusのヘビ毒をシグマケミカル社（Sigma Chemical Co.)(St Louis,
MO）から購入した。 プロテアーゼインヒビター：フェニルメチルスルフォニルフルオリド（ＰＭＳ
Ｆ）、ロイペプチン及びペプスタチンはシグマケミカル社（St. Louis, MO)から
購入した。
【０１９４】 動物毒の無毒化 ハチ、サソリ及びヘビ毒の無毒化はマウスの皮下に注射して決定する。アッセ
イは３組で実施する。注射の前に、動物毒をリン酸緩衝食塩水（１０ｍＭのＮａ 2 ＨＰＯ4／ＮａＨ2ＰＯ4（ｐＨ７．２）中の０．１５Ｍ ＮａＣｌ）で以下のＬ
Ｄ50（マウス１グラム当たり）の２倍の濃度に希釈する：Apis melliferaのハチ
毒２．８μｇ；Androctonus australisのサソリ毒０．３２μｇ；及びBungarus
multicinctusのヘビ毒０．１６μｇ。注射後、５、１０、３０、６０分後、及び
４、１２、２４時間後に、注射したマウスの個々の群に（１）静脈内、及び（２
）皮下（最初の注射部位の周囲の複数の箇所に注射）に注射した。チオレドキシ
ンは以下により還元する：（１）大腸菌ＮＡＤＰ−チオレドキシン系（０．０８
μｇのチオレドキシン、０．０７μｇのＮＴＲ及び２５ナノモルのＮＡＤＰＨを
用いる）；（２）ＤＴＴ又は還元リポ酸によって還元されたチオレドキシン（０
．０８μｇの大腸菌又はヒトチオレドキシンを１ナノモルのジチオスレイトール
又は１ナノモルの還元リポ酸に添加）。濃度は動物に注射された毒１μｇ当たり
のものである。全ての溶液はリン酸緩衝食塩水で調製される。 無毒化に対するチオレドキシンの効果は、（１）チオレドキシンをもたないコ
ントロール群とＬＤ50を比較し、さらに（２）壊死、腫脹及び対象の動物の一般
的不快から明らかな局所反応の程度を追跡することによって決定される。
【０１９５】ヘビ神経毒を還元する還元実験 - 材料と方法 毒素 ブタ膵臓ホスホリパーゼA2、エラブトキシンb及びβ-ブンガロトキシンをシグ
マケミカル社(ミズーリ州セントルイス)から購入した。ホスホリパーゼA2を3.2M
(NH4)2SO4溶液pＨ5.5中で得たので、セントリコン3kDa区分膜を用いて30mMトリ
ス-HCl緩衝液、pＨ7.9中でタンパク質を透析した。α-ブンガロトキシンとα-ブ
ンガロトキシン125IはShalla Verrall博士から恵与されたものである。 試薬及びファインケミカルズ DL-α-リポ酸、ダイズ由来L-α-ホスファチジルコリン、NADPH及びβ-メルカ
プトエタノールをシグマケミカル社(ミズーリ州セントルイス)から購入し、モノ
ブロモビマン(mBBr、商品名チオライト)をカルビオケム(カリフォルニア州サン
ディエゴ)から購入した。ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)-ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動の試薬は、バイオ・ラドラボラトリーズ(カリフォルニア州リッチモン
ド)から購入した。
【０１９６】 タンパク質及び酵素 チオレドキシンとNTRを、Jiaoら,(1992) Ag. Food Chem.(印刷中)に記載され
ているように大腸菌(E. coli)から精製した。チオレドキシンhをコムギ胚芽から
精製し(Florencio, F.J.ら(1988) Arch Biochem. Biophys. 266:496-507)、チオ
レドキシンfとmをホウレンソウ葉から精製した(上記Florencio, F.J.ら)。ヒト
チオレドキシンは、Emanuelle Wollman博士から恵与されたものである。NADPリ
ンゴ酸デヒドロゲナーゼをトウモロコシ葉から精製し(Jacquot, J.-P.ら(1981)
Plant Physiol. 68:300-304)、グルタチオンレダクターゼをホウレンソウ葉から
精製した(上記Florencio, F.J.ら)。大腸菌グルタレドキシンは、A. Holmgren教
授から恵与されたものである。 SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動 SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動を、40mAの定電流で3時間展開される1.5
mm厚さの10〜20％勾配ゲル中で行った。電気泳動後、ゲルを12％(w/v)トリクロ
ロ酢酸に2時間浸漬してから40％メタノールと10％酢酸を含有する溶液に12時間
移して過剰のmBBrを除去した。ゲルを紫外光源(365nm)を備えたライトボックス
に置くことによりタンパク質結合mBBrの蛍光を求めた。ラッテンゼラチン黄色フ
ィルタNo.8(区分＝460nm)(露光時間40sec.、f4.5)を通してポラロイドポジ/ネガ
ランドフィルム、タイプ55でゲルの写真をとった。ゲルについて10％酢酸と40％
メタノール中の0.125％(w/v)クーマシーブルーR-250の溶液で1時間タンパク質を
染色した。クーマシーブルーを除いた同じ溶液でゲルを脱染色した。 ポラロイド陰画の蛍光ゲルと乾燥染色ゲルをレーザデンシトメータ(ファーマ
シア-LKBウルトラスキャンXL)で走査した。ピークの面積又は高さをゲルスキャ
ンXLソフトウエアで評価することによりバンドを定量した。
【０１９７】実施例27 毒素の還元及びmBBrによる標識化 30mMトリス-HCl緩衝液、pＨ7.9中の100μlの最終容量中の10μgの標的毒素と0
.8μgチオレドキシン、0.7μgNTR(共に大腸菌由来)及び2.5mM NADPHとの反応を
行った。チオレドキシンをDTTで還元したとき、NADPHとNTRを除き、DTTを0.5mM
まで添加した。GSHによる分析を、1mMの最終濃度以外は同様に行った。グルタレ
ドキシンによる還元については、チオレドキシンとNTRを1μg大腸菌グルタレド
キシン、0.38μgグルタチオンレダクターゼ(ホウレンソウ葉から部分的に精製し
た)、1mM GSH及び2.5mM NADPH(これらの4成分の組合わせをNADP/グルタレドキシ
ン系と呼ぶ)で置き換えた。リポ酸の還元型による還元を、2つの濃度、100μMと
200μMにおいてそれぞれと0.8μgのチオレドキシンとの100μlの容量で行った。
エラブトキシンbとα-ブンガロトキシンの場合には37℃で2時間、β-ブンガロト
キシンの場合には室温で1時間及びホスホリパーゼA2の場合には室温で20分間混
合液をインキュベートした。インキュベートした後、mBBrを1.5mMまで添加し、
室温で15分間反応を続けた。反応を停止し、10μlの100mMβ-メルカプトエタノ
ール、5μlの20％SDS及び10μl 50％グリセロールを添加することにより過剰のm
BBrを誘導体化した。次に、試料をSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析
した。
【０１９８】 試料を2mM DTT中で3分間煮沸することにより全毒素還元を行った。冷却後、試
料をmBBrで標識し、全試料を2分間煮沸した後にゲルを充填した以外は前のよう
に処理した。2-メルカプトエタノールとグルタチオンのようなモノチオール還元
剤とは反対にジチオトレイトール(DTT)と還元型のチオレドキシンとリポ酸はジ
チオール還元剤である。DTTは合成で調製した化学薬品であるが、チオレドキシ
ンとリポ酸は細胞内で生じる。エラブトキシンbはNTS、DTT及びチオレドキシン
と還元リポ酸とチオレドキシンでほとんど還元された。エラブトキシンbにおい
ては、リポ酸はジチオトレイトールより特異的な還元剤であることがわかった。
ジチオトレイトールはチオレドキンを含まずに毒素を部分的に還元したが、リポ
酸は還元しなかった(レーン8)。結果から、NTS又はDTT＋チオレドキシンがα-ブ
ンガロトキシンとβ-ブンガロトキシンの特異的な還元剤であることがわかった
。
【０１９９】実施例28 NADPリンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性化 5μg毒素を限界のチオレドキシン濃度(酵素の活性化をチオレドキシンで制限
するために):大腸菌チオレドキシン、0.25μg; ヒト、0.9μg; コムギ、1.15μg
; ホウレンソウf及びm、それぞれ0.375g及び0.125μgと前インキュベートするこ
とにより葉緑体NADPリンゴ酸デヒドロゲナーゼを活性化するヘビ毒の能力を行っ
た。100mMトリス-HCl、pＨ7.9、指定したチオレドキシン、及び10mM DTTを含有
する溶液(最終容量0.2ml)に、精製したトウモロコシNADPリンゴ酸デヒドロゲナ
ーゼ、1.4μgを添加した。25分後、100mMトリスHCl、pＨ7.9、指定したチオレド
キシン及び0.25mM NADPHを含有する1ml容量の1cmキュベットに160μlの前インキ
ュベーション混合液を注入した。50μlの50mMオキサ酢酸を添加することにより
反応を開始した。4ウェイチャネルチェンジャを備えたベックマン分光光度計で3
40nmの吸光度の変化をモニターすることによりNADPH酸化を行った。この実験結
果から、エラブトキシンbの異なる還元チオレドキシンによる還元がNADPリンゴ
酸デヒドロゲナーゼを活性化する毒素の生物学的能力を著しく変化させることが
わかった。有効性に差があるが、試験したすべてのチオレドキシンが毒素の作用
を制限するのにある程度機能することを結果が証明している。
【０２００】実施例29 エラブトキシンbのタンパク質分解 エラブトキシンb、10μgを30mMトリス-HCl緩衝液、pＨ7.9(全容量、100μl)と
37℃で2時間インキュベートした。示されたように、緩衝液を0.8μgチオレドキ
シン、0.7μgNTR及び2.5mM NADPHで補足した。チオレドキシンをDTTで還元した
とき、NTRとNADPHを除き、DTTを0.5mMまで添加した。インキュベートした後、試
料を0.4〜2μgのトリプシンで37℃において10分間消化した。DTT、4.8μlの50mM
溶液、5μlの20％SDS及び10μlの50％グリセロールを添加し、試料を3分間煮沸
し、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた。ゲルをクーマシーブルーで
染色し、上記のようにデンシメトリー走査によってタンパク質バンドを定量した
。分析の結果を下記の表XVIに示す。これらの結果から、ヘビ神経毒(エラブトキ
シンb)の還元によって毒素をタンパク質分解に感受性にすることがわかる。この
結論を拡張することにより、毒素の解毒剤として還元チオレドキシンを投与する
と毒液のプロテアーゼによってタンパク質分解不活性化が高めれられるために毒
素を破壊する援助をするにちがいないことが示される。
【０２０１】表XVI トリプシンに対するエラブトキシンbの酸化型と還元型の感受性 エラブトキシンb、10μgを次のように：対照、添加せず; 大腸菌NADP/チオレド
キシン系(NTS)、チオレドキシン、NTR及びNADPHで還元したもの; DTTで還元した
もの、DTT; 及びDTT＋チオレドキシンで還元したもの、大腸菌チオレドキシンで
補足したDTTを30mMトリス-HCl緩衝液、pＨ7.9中で37℃において2時間前インキュ
ベートした。前インキュベートした後、0.4μgと2μgのトリプシンを示されたも
のに添加し、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析した。
【０２０２】実施例30 ホスホリパーゼA2分析 β-ブンガロトキシンのホスホリパーゼA2成分の酸化型と還元型の活性を、Lob
o de Araujoら(1987) Toxicon 25:1181-1188に記載された酸性度の変化により分
光光度法で求めた。還元実験については、10μg毒素を0.8μgチオレドキシン、0
.7μgNTR及び7mM NADPHを含有する30mMトリス-HCl緩衝液、pＨ7.9(最終容量、35
μl)中でインキュベートした。室温で1時間インキュベートした後、10mM CaCl2
、100mM NaCl、4mM胆汁酸ナトリウム、175μMダイズホスファチジルコリン及び5
5μMフェノールレッドを含有する1mlの分析溶液(pＨ7.6に調整した)を含む1cmキ
ュベットに20μlの反応混合液を添加した。ベックマンデュモデル2400分光光度
計で558nmの吸光度の変化を測定することにより反応を行った。本実験の結果か
ら、β-ブンガロトキシンがチオレドキシンで還元した場合にほとんどのホスホ
リパーゼ活性を消失したことが証明された。結果は、毒ヘビ咬傷後の還元チオレ
ドキシンを投与するとホスホリパーゼA2活性を消失させることにより毒素の解毒
を援助するという結論と一致している。
【０２０３】実施例31 アセチルコリン受容体へのα-ブンガロトキシン結合 α-ブンガロトキシン結合を、放射能標識毒素を用いて培養したマウス細胞に
より分析した(Gu, Y.ら(1985) J. Neurosci. 5:1909-1916)。マウス細胞、ライ
ンC2をGuら(上記Gu, Y.ら)に記載されているように増殖し、24ウェルプラスチッ
ク組織培養プレート(ファルコン)に約3000細胞/ウェルの密度で播種した。48時
間後と96時間後に増殖培地を融合培地で置き換えた。更に2日間増殖させた後に
培養物を分析に用いた。 3種類の異なる処理に供した細胞によりα-ブンガロトキシン結合を求めた。[A
] 10nMα-ブンガロトキシン125I(262Ci/ミリモル)を4μgチオレドキシン、3.5μ
g NTR(共に大腸菌由来)及び6.25mM NADPHを含む200μlのリン酸塩-食塩水緩衝液
(10mM Na2HPO4/NaH2PO4 pＨ7.2中0.15M NaCl)中で37℃において2時間前インキュ
ベートした。ある場合には、NTRとNADPHを1.25mM DTTで置き換えた。2時間イン
キュベートした後、混合液をマウス細胞を含むウェルに移し、リン酸塩-食塩水
で2回洗浄し、37℃で2時間インキュベートした。[B] リン酸塩-食塩水緩衝液で2
回細胞を洗浄した後、10nMα-ブンガロトキシン125I(200μlのリン酸塩-食塩水
中)/ウェルを添加した。37℃で2時間インキュベートした後、細胞をリン酸塩-食
塩水緩衝液で洗浄して結合していない毒素を除去した。
【０２０４】 示されたように、0.68mM CaCl2、0.49mM MgCl2、4μgチオレドキシン、3.5μg N
TR及び6.25mM NADPHで補足した200μl食塩水をウェルに添加した。プレートを37
℃で2時間インキュベートした。1.25mMで添加したDTTによる処理からNTRとNADPH
を除いた。[C] 細胞をリン酸塩-食塩水緩衝液で2回洗浄した後、4μgチオレドキ
シン、3.5μg NTR及び6.25mM NADPHを含有する200μlの溶液を各ウェルに添加し
た。ある場合には、NTRとNADPHを1.25mM DTTで置き換えた。プレートを37℃で2
時間インキュベートした。次に、細胞をリン酸塩-食塩水緩衝液で2回洗浄して添
加した還元剤を除去した。0.68mM CaCl2及び0.49mM MgCl2を含有するリン酸塩-
食塩水緩衝液、200μl及び10nMα-ブンガロトキシン125Iを各ウェルに添加した
。37℃で2時間インキュベーションを続けた。本分析の結果を表XVIIに示す。本
実験から、チオレドキシンで還元した場合、β-ブンガロトキシンはもはやアセ
チルコリン受容体に結合し得ないことがわかる。全動物に拡張した場合、チオレ
ドキシン結合還元メカニズムによって標的受容体への毒素の結合を消失すること
により解毒がもたらされる。 各α-ブンガロトキシン結合分析を3回の実験で行った。100倍過剰の非標識α-
ブンガロトキシンをインキュベーション混合液に添加することにより非特異的結
合を測定した。インキュベーション時間後、すべての場合の細胞をリン酸塩-食
塩水で洗浄して結合していない毒素を除去した。細胞を0.1M NaOHに可溶化する
とともにγカウンタで放射能を測定することにより毒素の結合量を求めた。
【０２０５】表XVII マウス細胞のアセチルコリン受容体へのα-ブンガロトキシンの結合 処理A 結合％ 毒素＋還元剤――――――――――→細胞――――――――――→停止 37℃、2時間 37℃、2時間 還元剤なし 100.0 NTS 0.0 DTT＋チオレドキシン 0.0 NTS−NTR 63.0 NTS−チオレドキシン 78.0 NTS−NADPH 101.0処理B ＋ 還元剤 毒素 ＋ 細胞 ――――――――――→ 洗浄細胞 ――――――――――→停止 37℃、2時間 37℃、2時間 還元剤なし 100.0 NTS 78.0 DTT＋チオレドキシン 76.0処理C ＋ 毒素 細胞＋還元剤 ――――――――――→ 洗浄細胞 ――――――――――→停止 37℃、2時間 37℃、2時間 還元剤なし 100.0 NTS 68.7 DTT 85.0 DTT ＋ チオレドキシン 68.8 大腸菌NTS: チオレドキシン、NTR及びNADPH
【０２０６】実施例32 動物における解毒の例 マウスに皮下注射することによりヘビ神経毒の解毒を求めた。注射前に、毒素
をリン酸塩-食塩水緩衝液(10mM Na2HPO4/NaH2PO4 pＨ7.2中0.15M NaCl)にLD50用
量の2倍までの範囲の濃度で希釈した。(LD50は動物の一定のグループの50％を致
死させる毒素の投与量として定義される。) 毒性試験については、次の神経毒
濃度: エラブトキシンb、0.05μg〜0.15μg; α-ブンガロトキシン、0.3μg; 及
びβ-ブンガロトキシン、0.089μgがLD50(マウスのg当たり)に相当する。注射し
た5分、10分、30分、60分及び4時間、12時間及び24時間後に抗原投与マウスの別
個のグループに(1)静脈内、及び(2)皮下注射した(開始注射部位の周りに複数の
局所注射)。チオレドキシンを、(1)0.08μgチオレドキシン、0.07μg NTR及び25
ナノモルNADPHを用いた大腸菌NADP-チオレドキシン系、(2)0.08μg大腸菌又は0.
02μgヒトチオレドキシンを用いたチオレドキシン＋1〜2ナノモルの還元リポ酸
、及び(3)5ナノモルジチオトレイトールを含む0.08μg大腸菌又は0.20μgヒトチ
オレドキシンで還元した(濃度は動物に注射した毒素1μgに対する。すべての溶
液をリン酸塩-食塩水緩衝液中で調製した。)。
【０２０７】 (1)LD50とチオレドキシンを含まない対照グループとを比較する、(2)動物の壊
死、腫脹又は全身の不快感によって明らかなように、局所反応の程度を比較する
、(3)組織損傷の指標であるクレアチンキナーゼの血清レベルを比較することに
より解毒に対するチオレドキシンの効果を求めた。筋細胞の切断の結果として血
液中に放出されるクレアチンキナーゼは、シグマケミカル社(ミズーリ州セント
ルイス)から入手した標準分析キットを用いてモニターする。 ヘビ咬傷の症状は複数であり、種々の要因に左右される。結果として、患者ご
とに異なる。それにもかかわらず、ヒトにおいてチオレドキシン治療によって軽
減されなければならない共通の症状がある。詳しくは、チオレドキシン治療によ
ってヘビ咬傷から生じる神経毒作用や関連の作用に伴う症状が軽減されなければ
ならない。咬傷の周りの腫脹や浮腫、痛み及び水疱の減少、正常な心拍数の回復
、咬傷面積の壊死の制限、罹患した部分をできるだけ少なくすることが含まれる
。これらの症状をできるだけ少なくすることにより、患者の全身の健康や状態の
改善が得られる。
【０２０８】食品タンパク質や花粉タンパク質及びアレルゲンの還元 本発明は、主要なアレルゲンタンパク質、特に食品タンパク質及び花粉アレル
ゲンタンパク質中のジスルフィド結合を化学的に還元するとともにそのタンパク
質を含有する食品を摂取し、そのタンパク質を含有する花粉を吸入、摂取又は粘
膜と接触した状態になる場合に起こるアレルゲン性を低減又は除去する方法を提
供する。 アレルギー反応を低減又は除去する方法は、動物が還元チオレドキシンによっ
て還元されたアレルゲンの種々の用量による免疫療法にある期間にわたって受け
ることが必要である。アレルゲンは、花粉タンパク質又は毒カシのような植物又
はダストダニのような動物に見られるアレルゲンタンパク質であってもよい。 本発明は、また、アレルゲンタンパク質、つまり、食品の消化率だけでなく嚥
下や吸入することができる花粉のような他のタンパク質の消化率を高める方法を
提供する。タンパク質のジスルフィド結合をチオレドキシンによるスルフヒドリ
ル(SH)基に還元した。他の主要な細胞チオール還元剤、グルタチオンは、この能
力に無効であった。タンパク質は、酸化(S-S)状態でアレルゲン活性であり、還
元チオレドキシンで治療した場合に、還元(SH状態)され、アレルゲン性を消失す
る。チオレドキシンは、酵素NADP-チオレドキシンレダクターゼ(生理的還元系)
によってNADPH、又はジチオトレイトール(DTT)、合成化学還元剤又はリポ酸、生
理的還元剤によって活性化(還元)した場合にこの還元を達成する。還元剤として
のNADPHの使用がほとんどすべての場合にしばしば好ましいが、生理的に許容し
うるリポ酸を用いることができ、DTTはあるタンパク質の治療に許容することが
できる。アレルゲンがチオレドキシンを含む場合には、NADPH/NTR又はリポ酸は
ある場合にはチオレドキシンを添加せずに用いることができる。
【０２０９】 おそらく、食品によるアレルゲン性を低減又は除去する還元チオレドキシンの
熟達は、食品中のアレルゲンタンパク質における分子内ジスルフィド結合を還元
する還元チオレドキシンの能力に左右される。また、チオレドキシンによって還
元されたジスルフィド結合をもったアレルゲンは、アレルゲン性を引き起こすこ
とが少ない(即ち、低アレルゲン性である)が、有効な免疫療法剤である能力をな
お保持している。 分子内ジスルフィド結合をもつ食品タンパク質は還元され得、これらのタンパ
ク質を含有する食品のアレルゲン性は少なくとも低減され得、食品が有効な温度
で有効な期間チオレドキシンで処理される場合に消化率は還元チオレドキシンに
よって高められる。食品をインキュベートするのに有効な温度は約4℃〜55℃で
あるが、ジスルフィド結合の還元を可能にするいずれの温度も許容しうる。イン
キュベーションの有効時間は、約20分〜2時間であるが、ジスルフィド結合の還
元を食品の品質をほとんど分解せずに可能にするいずれの時間も許容しうる。例
えば、タンパク質は、約4℃で約48時間インキュベートすることにより還元され
てもよく、還元されているままでもよい。
【０２１０】 還元チオレドキシンで処理した際に低アレルゲン性と高消化率を示す食品の例
は、牛肉、牛乳、ダイズ、卵、コメ、コムギ又はナッツ類である。 哺乳動物が消化した食品のアレルゲン性を低減しかつ消化率を高める好ましい
方法は、NADP-チオレドキシン系(NTS)の成分を用いて食品を前処理又はインキュ
ベートするものである。一般に、成分の有効量は、食品中のタンパク質の1.0g毎
に約0.01mg〜4.0mg、好ましくは約0.10mg〜2mgのチオレドキシン、約0.01mg〜4m
g、好ましくは約0.20mg〜2mgのNTR又は約1マイクロモル〜250マイクロモル、好
ましくは約25マイクロモル〜100マイクロモルのNADPHの範囲である。各成分の有
効量は変動し、他の成分の量、インキュベーション時間と温度、及び具体的な食
品及びその食品中の生来のチオレドキシン又はその還元剤の量に左右される。例
えば、上記チオレドキシンの量は、食品タンパク質1g当たり1mg NTR及び100マイ
クロモルNADPHを用いることに基づいて求めた。NADPHの範囲は、1mg NTRと1mgチ
オレドキシンを用いることに基づいて求めた。適切な成分量は、食品の前処理及
び動物の種類とその状態によって影響することができる。
【０２１１】 NADP/チオレドキシン系は、また、クワモドキ花粉やクサのような空中アレル
ゲン及びダストダニのような皮膚接触アレルゲンのジスルフィドアレルゲンを還
元することができ、よって動物がこれらの還元アレルゲンを全身に受けた場合に
そのアレルゲンに対する動物のIgE応答を軽減することができる。 花粉アレルゲンのようなアレルゲンをNADP/チオレドキシン系で処理する有効
な温度は、約4℃〜55℃であるが、ジスルフィド結合の還元を可能にするいずれ
の温度も許容しうる。インキュベーションに有効な時間は、食品を処理する時間
と同様である(約20分〜約1時間)が、タンパク質をほとんど分解せずにジスルフ
ィド結合の還元を可能にするいずれの時間も許容しうる。例えば、タンパク質は
、約4℃で約24時間インキュベートすることにより還元されてもよく、依然とし
て還元されていてもよい。 還元チオレドキシンで処理した際に低アレルゲン性と高消化率を示すアレルゲ
ンの例は、クワモドキ花粉、クサ花粉、毒カシ又は毒ツタのようなジスルフィド
含有アレルゲン性タンパク質又はダストダニアレルゲンタンパク質を含んでいる
。
【０２１２】 アレルゲン性を低減しかつアレルゲンに対する哺乳動物のIgE応答を軽減する
好ましい方法は、NADP-チオレドキシン系(NTS)の成分を用いてアレルゲンを前処
理又はインキュベートするものである。一般に、食品のように空中アレルゲンや
接触アレルゲンの成分の有効量は、アレルゲンのタンパク質の1g毎に約0.1mg〜6
.0mg、好ましくは約0.1mg〜4.0mgのチオレドキシン、約0.1mg〜8.0mg、好ましく
は約0.2mg〜7.0mgのNTR又は約1mM〜500mM、好ましくは約25mM〜400mMのNADPHの
範囲である。各成分の有効量は変動し、他の成分の量、インキュベーション時間
と温度、及び具体的なアレルゲンタンパク質又はアレルゲンエキス及びそのアレ
ルゲンエキス中の生来のチオレドキシン又はその還元剤の量に左右される。上記
チオレドキシンの量は、アレルゲンタンパク質1g当たり1mg NTR及び100mM NADPH
を用いることに基づいて求めた。NADPHの範囲は、1.0g花粉タンパク質当たりの1
.0μg NTRと1.0μgチオレドキシンを用いることに基づいて求めた。 次に、チオレドキシン還元アレルゲンエキスの種々の用量を所定の時間にわた
って動物に注射する。 適切な成分量は、アレルゲンの前処理、具体的なアレルゲン又は動物の種類と
その状態によって影響されてもよい。 具体的なアレルゲンのアレルゲン性を低減しかつ消化率を高めることについて
の本発明の他の特徴と利点は、次の実施例から確認され得る。
【０２１３】実施例33 チオレドキシンによる牛乳、ダイズ、コムギ又は牛肉の処理 本実験用に、1:20重量/容量(w/v)、貯蔵牛乳アレルゲン性エキス(カタログNo.
3390JG、マイルズ社、インディアナ州エルクハート)の1〜5倍生理食塩水(PBS)
希釈液、1:10w/v、貯蔵ダイズアレルゲン性エキス(カタログNo. 3597ED、マイル
ズ社、インディアナ州エルクハート)の1〜10倍PBS希釈液及び1:10w/v、貯蔵小麦
アレルゲン性エキス(カタログNo. 3708ED、マイルズ社、インディアナ州エルク
ハート)の1〜5倍PBS希釈液を調製した。1:10w/v、貯蔵市販牛肉アレルゲン性エ
キス(カタログNo. 3078JF、マイルズ社、インディアナ州エルクハート)の1〜5倍
PBS希釈液を調製した。
【０２１４】 牛乳の場合には、0.1mlの希釈液をNADP/チオレドキシン系(NTS)で処理し、こ
の場合のアレルゲンを4.8μgチオレドキシン、4.2μg NTR及び1mM NADPHとイン
キュベートする工程を含んでいる(最終容量、0.2ml)。1.5mM DTT及び4.8μgチオ
レドキシンとインキュベートした0.1mlの希釈した牛乳アレルゲンを用いて第2試
料を調製した(最終容量、0.2ml)。本実施例及び後続の実施例における実験を含
むすべてのアレルゲン実験においては、使用チオレドキシンとNTRを、タンパク
質を過剰生産するために形質転換した大腸菌から以前に記載されているように精
製した(de la Motte-Guery, F.ら(1991) Eur. J. Biochem. 196:287-294, Russe
l, M.ら(1988) J. Biol. Chem. 263:9015-9019)。ダイズとコムギについては、0
.05mlの希釈液を2.4μgチオレドキシン、2.1μg NTR及び1mM NADPHとインキュベ
ートした。更に、同じ処理をしたPBS対照試料を調製した。1.5mM DTT及び2.4μg
チオレドキシンとインキュベートした0.05mlの別個のアレルゲン希釈液を用いて
DTT処理ダイズ及びコムギ試料を調製した。対照とすべてのダイズとコムギ試料
の最終容量は0.1mlとした。牛乳とコムギ標品は室温で25分間インキュベートし
、ダイズ標品は37℃で1時間25分インキュベートした。牛肉においては、0.05ml
の希釈液を2.4μgチオレドキシン、2.1μg NTR及び1mM NADPHと(最終容量、0.1m
l)37℃で25分間インキュベートした。他の0.05ml試料を室温以外は同じ方法で処
理した。インキュベートした後、1×103〜1×106又は1×103〜1×107の範囲の1m
l希釈液についてそれぞれ処理した食品エキス標品を調製した。希釈した試料を3
0分以内に試験に用いた。
【０２１５】実施例34 mBBr蛍光標識化/SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いたNADP/チオレドキシン系による食品アレルゲンの還元の定量及びタンパク質分解の増加 方法 本実験用に、実施例33に記載された貯蔵牛乳エキス、牛肉エキス又はコムギエ
キスのPBSとの1〜2.5、1〜5又は1〜1.5倍希釈液をそれぞれ調製した。50μlのこ
れらの希釈液に、2.4μgチオレドキシン、2.1μg NTR及び1mM NADPHを添加した(
最終容量、0.1ml)。対照は、50μlの具体的な希釈エキスと50μlからなるものと
した。標品を室温でと37℃で25分間インキュベートした。インキュベートした後
、8μlの80mM mBBrを添加し、室温で15分間反応を続けた。反応を停止し、10μl
の100mMβ-メルカプトエタノール、10μlの20％SDS及び10μlの50％グリセロー
ルを添加することにより過剰のmBBrを誘導体化した。試料を上記mBBr/SDS-ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動法によって分析した。結果から、NTSが室温と37℃
共にアレルゲン性エキス中のタンパク質を効果的に還元したことがわかった。更
に実験において、実施例33に記載されたダイズ貯蔵エキスのPBS希釈液をNTSで同
様に処理した場合に、mBBr標識化/SDS-PAGE法を用いた分析から、チオレドキシ
ンがダイズタンパク質を還元したことがわかった。しかしながら、ダイズ、牛乳
、コムギ、卵又は牛乳のアレルゲン性タンパク質をグルタチオン、グルタチオン
レダクターゼ又はNADPHとインキュベートした場合、処理したアレルゲン性タン
パク質の還元は非常に少ないか全くなかった。
【０２１６】 市販コメアレルゲン性エキス(カタログNo. 3549ED、マイルズ社、インディア
ナ州エルクハート)のPBS希釈液をNTSと同様にインキュベートし、mBBr/SDS-PAGE
法を用いて分析し、還元チオレドキシンがコメアレルゲンタンパク質を還元する
ことがわかる。 別の実験においては、NTSで還元しトリプシンと更にインキュベートした実施
例33に記載された市販のエキスからの食品アレルゲンタンパク質がNTSで処理し
なかった対照よりタンパク質分解に対する感受性が高いことが見出された。還元
の分析は、mBBr/SDS-PAGE法を用いて行った。更に本実験においては、10μgのNT
S還元精製牛乳アレルゲンタンパク質、β-ラクトグロブリン(シグマケミカル社)
を2μgのトリプシンで処理した場合、同様にトリプシン処理した酸化β-ラクト
グロブリンのわずか50％に比べて100％であった。10μgの他の精製乳アレルゲン
、酸化α-ラクトアルブミン(シグマケミカル社)を2μgトリプシンで同様に処理
した場合、著しいタンパク質分解はなかった。しかしながら、NTSで還元した10
μgの精製α-ラクトアルブミンは、トリプシンで80％タンパク質分解した。0.8
μgのチオレドキシンと0.5mM DTTで還元した10μgのα-ラクトアルブミンは2μg
のトリプシンで100％タンパク質分解した。
【０２１７】実施例35 卵白タンパク質の還元 乾燥ニワトリ卵白をシグマケミカル社から購入した。卵白中の全タンパク質の
約80％はアレルゲンである。20mg/ml卵白溶液をPBSに再懸濁した。材料が全部溶
解しなかったので、14,000RPMで2分間遠心分離した。可溶性卵白タンパク質をmB
Br蛍光標識化及びSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析を用いて還元実験に
用いた。対照(還元剤なし)、NTS、DTT＋チオレドキシン、還元グルタチオン(GSH
)又は還元グルタチオン/グルタチオンレダクターゼ/NADPHを処理に用いた。20mg
/ml卵白懸濁液からの23μlの可溶性タンパク質を100μlの最終容量で含むPBS中
で反応を行った。NTSにおいては、7.5mM NADPH、2.4μgチオレドキシン及び2.1
μgNTRを用いた。チオレドキシンをDTTで還元したとき、NADPH及びNTRを除き、D
TTを1.5mMまで添加した。GSH濃度は3mMを用いた。GSH/GR/NADPH系による還元に
ついては、3mM GSH、4μg GR及び7.5mM NADPHを用いた。混合液を室温で1時間イ
ンキュベートした。インキュベートした後、7μlの80mM mBBrを添加し、室温で1
5分間反応を続けた。反応を停止し、10μlの100mMメルカプトエタノール、10μl
の20％SDS及び10μlの50％グリセロールを添加することにより過剰のmBBrを誘導
体化した。次に、試料をSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析した。本実
験の結果から、NTSとDTT＋チオレドキシンが約80％アレルゲンである卵白タンパ
ク質を還元するのに非常に効果的であることがわかった。GSH又はGSH/GR/NADPH
は、対照として同レベルの還元を示したが、卵白タンパク質の無効な還元剤であ
る。
【０２１８】実施例36 アレルゲン性実験の動物の感作 本実験に用いる動物は、高IgE産生スパニエル犬の近交コロニーからの異なる
ペアの同腹子に生まれたアトピーイヌとした。 兄妹で産む近交IgE応答動物雌イヌに9匹の同腹の子イヌ(雄4匹、雌5匹)が産ま
れた。出生1日目に、牛乳、ダイズ又はコメ実験用に、9匹の子イヌの同腹子を2
つのグループに分けた。グループIの5匹の子イヌに0.2mlアルブミン中実施例33
に記載された1μgの市販ダイズエキスを右腋に皮下(SQ)注射した。グループIIの
4匹の子イヌに0.2ml食塩水と0.2mlアルブミンに可溶化した1μgの市販の乾燥牛
乳エキス(実施例33に記載されている)を右腋にSQ注射した。9匹の子イヌ全部に0
.2mlアルブミン中1μgの1:10w/v貯蔵コメアレルゲン性エキス(カタログNo. 3549
ED、マイルズ社、インディアナ州エルクハート)を左腋に投与した。
【０２１９】 生後3週、7週及び11週に、すべての子イヌに0.5mlの弱毒化ジステンパー肝炎
生ワクチン(ピトマン・ムーア、ペンシルバニア州ワシントンズクロッシング)を
肩にSQでワクチン注射した。それぞれのワクチン注射の2日後と9日後に、出生時
に投与した同じ食品抗原を投与した。例えば、グループIの5匹のイヌに0.2mlア
ルブミン中1μgのダイズエキス、グループIIの4匹のイヌに0.2mlアルブミン中1
μgの牛乳、9匹のイヌ全部に0.2ml中1μgのコメエキスを左右腋にそれぞれ投与
した。 125I標識ウサギ抗イヌIgE血清(Frick, O.L.ら(1983) Am. J. Vet. Res. 44:44
0-445)をRAST分析で用いた。臭化シナノジェン活性化ろ紙ディスクを100μgのダ
イズ、牛乳又はコメ抗原と標準RASTプロトコール(Wide, L.ら (1967) Lancet 2:
1105-1107)のように反応させた。非アトピー性モングレル子イヌからの出生イヌ
臍帯血清のプールを負の対照又はベースラインcpmとして用いた。
【０２２０】 子イヌを6週間育て、感作タンパク質、ダイズミール、乾燥ホエー、及びもみ
殻を含む通常のパピーチャウ(ラルストン・プリナ社、ミズーリ州セントルイス)
で離乳した。カリフォルニア大学、デービス校、動物資源供給施設、獣医学部の
動物の保護と管理によって1回/日食事を与え、自由に水を与えた。6ヵ月後、通
常のフィールド & ファームドッグチャウを与えた。 生後3〜4ヶ月の間に、子イヌが具体的な食品抗原に対するIgE抗体をつくって
いることが見られたとき、同腹の9匹の子イヌ全部に240mlのダイズ又は牛乳幼児
食、豆腐、かゆ、又はバニラ風味ビボネックスタンパク質加水分解物(ノーウィ
ッチ・イートン社、コネチカット州ノーウィッチ)を早朝に二重盲検で与えた。抗
原投与前と1日2時間おきに臍帯レベルで腹部を測定した。獣医がかゆみ又は皮疹
、嘔吐と便通の回数と特徴の臨床上の徴候、及び咳又は呼吸困難や鼻分泌物を厳
密に観察した。4日間そのような反応徴候をモニターした。次の抗原投与の食餌
は7日後に与えた。
【０２２１】 9匹の同腹の子イヌはすべて体重が増え、医学的に何の問題もなく正常に成長
した。感作した食品と抗原投与しなければ下痢も他の胃腸の徴候もなかった。ま
た、皮膚又は呼吸の異常も生じなかった。ワクチン接種又は免疫化に対する有害
な反応はなかった。 3種の食品タンパク質に対するイヌIgE-RASTは、静脈血サンプリングにより2週
間ごとに行った。 著しく多くのIgE抗食品抗体が、対照より対応する牛乳(p＜0.05、4ヶ月目に抗
原投与したとき)及びダイズ(p＜0.0005、最初の3ヶ月間)免疫した動物によって
産生した。IgE抗コメ抗体の平均力価は、5〜10週で上がり、プラトーになり、生
後20〜30週間後に再び鋭く上がった。ダイズや牛乳をそれぞれ食事で与えたとき
のダイズ又は牛乳免疫した動物に下痢や腹部浮腫の統計的に有意な反応が起こっ
た。
【０２２２】 上記方法と同様の方法で牛乳、ダイズ、コムギ又は牛肉にアレルギーの8匹の
イヌの他のグループを生育した。高IgE産生スパニエル犬の記載された近交コロ
ニーの他の同腹子から4匹の同腹子イヌに、実施例33に記載された貯蔵牛乳、ダ
イズ、コムギ又は牛肉アレルゲンエキスのそれぞれ1μgを右腋にSQ注射した。同
じ同腹子から4匹の子イヌを対照とした。8匹の子イヌ全部に0.2mlミョウバン中1
μgのコメエキスをSQに投与した。子イヌに上記のようにワクチン注射し、それ
ぞれのワクチン注射の2日と9日後に出生時に与えたのと同じ食品抗原を同量で投
与した。上記のように、適切な感作タンパク質(即ち、牛乳、ダイズ、牛肉又は
コムギ)を含む食品を同様のスケジュールで与えた。前のダイズと牛乳のアレル
ギー動物のように、これらの免疫したイヌは、対照より著しく多くの抗特異食品
IgE抗体(コムギと牛肉の抗体を含む)を産生した。コムギ、牛肉、ダイズ又は牛
乳を含む食品を抗原投与した場合、免疫した動物に下痢や腹部浮腫の統計的に有
意な反応が起こった。
【０２２３】実施例37 還元チオレドキシンで処理した食品アレルゲンのアレルゲン性の低減の皮膚試験分析 実施例33に記載されたチオレドキシン処理食品アレルゲン希釈液の100μlの各
希釈液のアリコートを、実施例36に記載された適当に感作したイヌの腹部皮膚に
皮内注射した(例えば、牛乳感作したイヌに牛乳希釈液を注射した)。アレルゲン
希釈注射の前に、イヌの前肢静脈に4mlの0.5％エバンスブルー染料を注入した。
アレルギー反応を示すイヌには、アレルゲン注射の領域に青色膨疹が現れた。発
現の10分後に膨疹のサイズ(長さと幅)を測定した。各アレルゲン標品の濃度範囲
を注射した後の膨疹の測定サイズと希釈終点をアレルゲン性の指標として用いた
。チオレドキシン処理により、ダイズの1×105希釈液により50％防御、牛乳の3
×104希釈液により完全防御、コムギの1×106希釈液により完全防御又は牛肉の1
×105希釈液により少なくとも一部の防御が得られることがわかった(それぞれ図
1、2、3、4及び5参照)。
【０２２４】実施例38 還元チオレドキシンで処理した食品アレルゲンのアレルゲン性の食餌試験分析 食餌の約1週間前に、実施例36に記載された方法で感作したイヌを、前実施例
に記載された市販のアレルゲンエキスを用いた適当な食品アレルゲンにより実施
例36のように皮内で皮膚試験した。これらの結果に基づいて、イヌを『対照』グ
ループと『チオレドキシン処理』グループに分けた。各グループを補足感受性を
もつ典型例から構成した。即ち、各グループに同数の強い、中間又は弱い反応イ
ヌを選定した。特にことわらない限り、グループは3匹のイヌから構成された(1
実験当たり6匹のイヌ)。食餌抗原投与前の3日間と投与後の5日間、イヌをヒル処
方食餌イヌd/d食餌(コルゲートパルモリブ社のヒル部門、カンザス州トペカ)で
飼った。この期間中むかつきや嘔吐のような臨床症状をイヌについて観察した。
更に、便通をモニターし、試験される食品に対するアレルゲン性応答の指標とし
て記録した。イヌの便通についてアレルゲン食餌抗原投与前後の3日間を計数し
、一貫性を数字1＝固い、2＝軟らかい、3＝水様で示した。次に、便通の回数に
一貫性因子を掛けることにより便通のスコアを計算した。試験される食品アレル
ゲンに対するアレルゲン応答の指標として、各グループ（『対照』、又は『処理
チオレドキシン』）の1日当たりの最終正味平均便通スコアを、アレルゲン食餌
抗原投与後から前の1日当たりの平均便通スコアを引くことにより計算した。1日
当たりの正味平均便通スコアが高いほどアレルギー応答が強い。 食餌を調製及び投与するために用いられる手順を次に示す。特にことわらない
限り、室温で反応を行った。
【０２２５】 ダイズ 市販のダイズ製品(鉄で補足したイソミル、ロスラボラトリーズ、オハイオ州
コロンブス)、1.026kgを3リットルの水に溶解した。その溶液を1.925リットルの
2つのロットに分け、一方を対照として用い、もう一方をNADP/チオレドキシン系
(NTS)で次のように処理した。45mM NADPH、564μg NADP-チオレドキシンレダク
ターゼ(NTR)及び1.125mgチオレドキシン(すべて30mMトリス-HCl緩衝液、pＨ7.9)
を含む混合液を5分間前インキュベートしてから1.925リットル製品ロットの1つ
に添加した(以後『チオレドキシン処理』ロット)。チオレドキシン系を添加した
後、絶えず撹拌しながら更に1時間インキュベーションを続けた。対照ロットに
同量の緩衝液を添加した。インキュベートした後、600mlの製品を割り当てグル
ープの3匹のイヌのそれぞれに与えた。イヌに与えた部分は、インキュベーショ
ン前に25.0gのダイズタンパク質と等価であった。
【０２２６】 コムギ ガロンサイズのワーリングブレンダ内で無漂白コムギ粉、1.5kgを37℃に予め
加熱した3リットルの水に添加した。1分ブレンドした後、コムギ粉懸濁液を2つ
のロットに分け、一方を対照として用い、もう一方を次のようにNADP/チオレド
キシン系で処理した。45mM NADPH、564μg(NTR)及び1.125mgチオレドキシンを含
む、すべて30mMトリス-HCl緩衝液、pＨ7.9に溶解した混合液を5分間前インキュ
ベートしてから1つのロットに加えた(以後、『チオレドキシン処理』ロット)。
等価量の緩衝液を対照ロットに添加した。両標品をしばしば撹拌しながら37℃で
1時間インキュベートした。各標品から600ml容量を取り出し、1つの缶(0.4kg(15
-3/4 oz))d/d、コムギを含まないコメ/ラムベースのドッグフードと混合し、割
り当てロットの3匹のイヌに与えた。これらの部分は、25gのコムギタンパク質と
等価であった。8匹のイヌの実験においては、コムギ粉を2.0kgまで増やし、それ
に応じて手順を拡大した。 牛乳 水で再構成した乾燥CARNATIONの標品をNADP/チオレドキシン系と同様にインキ
ュベートした。前のように、イヌの3匹に未処理乳を与え、3匹に処理乳を与えた
。イヌに投与された最終部分は、10gの乳タンパク質と等価であった。
【０２２７】結果 使用したNADP/チオレドキシン系の成分のレベルは、上記実施例15に記載され
たドウ実験より著しく高かった。本食餌実験においては、mBBr/SDS-ポリアクリ
ルアミドゲル法によって試験管内で求めたようにアレルゲン性タンパク質を還元
するために高いレベルの化合物が必要であることが予備試験から示された。食餌
試験においてタンパク質1g当たりのそれぞれのイヌに用いられるNADP/チオレド
キシン系の各成分の量は、ベーキング試験に用いられる量に相対して少ない。
【０２２８】 コムギ粉、牛乳、ダイズ製品 * チオレドキシン 5-× NTR 5-× NADPH 2-× ――――――――――――――* 指定された量はコムギ粉タンパク質1g当たり3μgチオレドキシン、1.5μg NTR
及び0.3mM NADPHが添加された上記ベーキング試験に用いた量に相対する。ベー
キング試験においては、約200gコムギ粉又は約20gのコムギ粉タンパク質でロー
フを焼いた。食餌実験用に、食品標品をNADP/チオレドキシン系の成分と室温(牛
乳又はダイズ)又は37℃(コムギ)で1時間インキュベートした。
【０２２９】 『臨床症状』(嘔吐又はむかつき)及び『便通スコア』(図6参照)に基づいて、
チオレドキシン処理がダイズ又はコムギ製品に対するイヌのアレルゲン性応答を
低減させることがわかった。乳製品のアレルゲン性は、NTSで処理することによ
り低減させることができる。使用したチオレドキシンとNTRは大腸菌由来である
が、酵母のような他の供給源由来のチオレドキシンやチオレドキシンh又はmも用
いることができることは留意すべきである。
【０２３０】実施例39 チオレドキシン処理乳タンパク質と牛の生乳の高消化率と低アレルゲン性の定量 牛乳アレルギーは、タンパク質--α-ラクトアルブミン、血清アルブミン、カ
ゼイン、特にβ-ラクトグロブリン(BLG)が原因である。 本実施例から、乳タンパク質のジスルフィド結合とアレルゲンがチオレドキシ
ンで選択的かつ特異的に還元されることがわかった。一旦還元されると、最も活
性なこれらのアレルゲン(BLG)は、アレルゲン性の低減だけでなく、消化率の顕
著な上昇を示した。ペプシンに対する他のジスルフィド乳タンパク質の感受性は
、チオレドキシンによる還元後にある程度増大した。
【０２３１】材料と方法 アレルゲン源 牛の生乳を実験農場、カリフォルニア大学デービス校から入手した。純粋なβ
-ラクトグロブリンAとB及び2つの形の80％混合液をシグマケミカル社、ミズーリ
州セントルイスから購入した。 動物 実施例36〜38に用いた同じ近交コロニーから入手したイヌ、高IgE産生アトピ
ーイヌを感作し、カリフォルニア大学、デービス校、獣医学部、動物資源供給施
設で飼った。出生時に感作したこれらのイヌは、アレルギーに対して遺伝体質を
もち、食品と花粉過敏症の15年の履歴をもっている。 化学薬品と酵素 ドデシル硫酸ナトリウム/ポリアクリルアミド(SDS/PAGE)用試薬をシグマ、ベ
ーリンガーマンハイム、インディアナ州インディアナポリス及びバイオラドラボ
ラトリーズ、カリフォルニア州ハーキュレスから入手した。DTTをベーリンガー
マンハイム、モノブロモビマン(mBBr)をカルビオケム、カリフォルニア州サンデ
ィエゴから購入した。チオレドキシンとNTRをタンパク質を過剰発現する大腸菌
株から精製した。グルタチオンレダクターゼを、ホウレンソウNTRに用いた同じ
手順でホウレンソウ葉から精製した。ブタ胃粘膜からのペプシン、NADPH及び他
の生化学試薬をシグマから購入した。
【０２３２】 アトピーイヌの食品感作 CGBやGCBと呼ばれるアトピーイヌコロニーの2匹の同腹子からの新生子イヌに0
.2mlのアルブミン中のそれぞれ1μgのコムギ、牛乳又は牛肉エキス(マイルズ社
、インディアナ州エルクハート、実施例33に記載されている)を1日目に皮下注射
した。CBBと呼ばれる3番目の同腹子に同じアレルゲンのほかにダイズエキス(マ
イルズ社、実施例33に記載されている)を注射した。子イヌの感作、試験及び飼
養の手順は、実施例36とほとんど同様にした。 皮膚試験 皮膚試験の約3分前に、それぞれのイヌに4〜5mlのろ過した0.5％エバンスブル
ー染料溶液(体重1kg当たり0.2mlの0.5％エバンスブルー染料に等価)を頭静脈に
よって投与して皮膚IgE抗体の評価を高めた。100μlの各試料の連続希釈液を腹
部皮膚に皮内注射して力価を決定した。15〜20分後、青色膨疹反応のサイズ(最
大の長さと幅)を測定することによりアレルギー応答を求めた。試験したそれぞ
れの動物に適切な負の対照(生理食塩水で希釈した緩衝液)を含めた。チオレドキ
シン、NTR、NADPH又はペプシンのみによる反復試験は、一貫して負であった。
【０２３３】 タンパク質分析 標準としてウシγグロブリンを用いたブラッドフォード法によりタンパク質濃
度を求めた。16800の計算モル吸光係数を用いて278nmの吸光度で純粋なBLGの濃
度を求めた(Gill, S.C.ら(1989), Anal. Biochem. 182:319-326)。 タンパク質モデリング 1.8オングストローム分解能におけるBrownlowらによって求められたBLG構造の
モデルをタンパク質データバンク、ブルックヘブン国立研究所から得た(Brownlo
w, S.ら(1997),『1.8分解能におけるウシβ-ラクトグロブリン-なぞめくリポカ
ルシンの静止』, Structure 5:481-495)。単一突然変異C160S(部分的に還元)及
び二重突然変異C160S-C106S(完全に還元)をもつタンパク質のモデルをスイスモ
デルプログラムで構築した(Peitsch, M.C.(1996),『プロモド及びスイスモデル:
自動比較タンパク質モデルのためのインターネットによるツール』, Biochem.
Soc. Trans. 24:274-279)。BLGの三次元モデルをラスモルプログラムv2.6で可視
化した。
【０２３４】 タンパク質還元 タンパク質ジスルフィド結合の還元を、(i)5μlの25mM NADPH、8μlの0.3mg/m
l大腸菌チオレドキシン(即ち、2.4μg全チオレドキシン)及び7μlの0.3mg/ml大
腸菌NTRからなるNADP/チオレドキシン系(NTS)か又は(ii)5μlの25mM NADPH、10
μlの30mM還元グルタチオン(GSH)及び15μlの0.1mg/mlグルタチオンレダクター
ゼから構成されるNADP/グルタチオン系(NGS)により100μlの容量で行った。10μ
gの純粋標的タンパク質又は50μgの生乳を含有する緩衝化した生理食塩水溶液(P
BS;即ち、10mM Na2HPO4、1.8mM KH2PO4、2.7mM KCl及び137mM NaCl、pＨ7.4)中
で反応を行った。反応混合液を4℃で一晩又は37℃と55℃で45分間インキュベー
トした。完全な還元については、試料を5μlの100mM DTTを含有するPBS中でイン
キュベートし、5分間煮沸した。還元タンパク質を下記のmBBr標識化とゲル電気
泳動によりゲル上に可視化した。ゲルを走査することにより還元の程度を求めた
。
【０２３５】 ペプシン分析 BLG、640μg、又は牛乳、1mgタンパク質(即ち、約30μl)を、上記条件下で4℃
(完全に還元した形で得る)か又は55℃(部分的に還元した形)でチオレドキシン系
(NTS)と共に又は含めずにインキュベートした。次に、BLG、320μg、又は牛乳、
500μgタンパク質をAstwood, J.D.ら(1996),『試験管内消化に対する食品アレル
ゲンの安定性』, Nature Biotechnol. 14:1269-1273に記載されているように200
μlの人工胃液(SGF)中で処理した。SGFは、HClでpＨ1.2に調整した0.32％ペプシ
ン(w/v)及び30mM NaClからなる(Board of Trustees(ed.) 1995, 人工胃液, TS.,
pp. 2053, 米国薬局方23, 国民医薬品集18ユナイティッドステーツファーマコ
ペイアルコンベンション社、メリーランド州ロックビル)。反応混合液を37℃で
インキュベートし、インキュベーションの0、0.25、1、2、4、8、15、30及び60
分後に0.375倍容量の160mM Na2CO3(約pＨ7)を添加することにより停止した。次
に、タンパク質混合液をSDS-PAGE(15％ゲル)にかけ、下記のようにクーマシーブ
ルーでタンパク質を染色した。示されたように、消化した試料のアレルゲン性を
皮膚試験分析によって定量した。
【０２３６】 食餌抗原投与 80％純粋なBLG(A型及びB型の混合液)の還元を100mlの水中でそれぞれのイヌに
ついて行った。104mgのNADPH、1mgの大腸菌チオレドキシン及び1mgの大腸菌NTR
の水性混合液を添加することにより各gのBLGを処理した。シェーカー中125rpm、
37℃で45分間反応が起こった。試料を4℃で一晩貯蔵した。翌日、未処理(対照)
又は処理BLG、2.5gを0.3kg(12 oz)缶のP/D食品(ヒルズ)と混合し、イヌに与えた
。抗原投与していないイヌはBLGを含まないドッグフードだけを与え、対照イヌ
は未処理BLGを含むドッグフードを与えた。イヌに未処理フードの1/4缶を最初に
与えて胃の流れを開始させた。15分後、2.5gの未処理か又はチオレドキシン処理
BLGと混合したフード缶の1/3を15分ごとに3回与えた。これらの間隔でイヌをモ
ニターし、GI応答を評価した。次に、イヌを観察し、1時間おきに更に5時間応答
を記録した。
【０２３７】 データ分析 上記食品抗原投与したイヌの消化応答を食餌によって誘導されたタイミング、
容量及び流動性に対する数字を割り当てることにより評価した。流動性: 嘔吐な
し＝0、固形物嘔吐＝1、液体嘔吐＝2、血液又は胆汁との液体嘔吐＝3。容量: 嘔
吐なし＝0、少量嘔吐＝1及び大量嘔吐＝2。タイミング: 遅い嘔吐＝1、すぐに出
てくる嘔吐＝2。 mBBr標識化及びタンパク質の分析 スルフヒドリル基を蛍光mBBr誘導体として可視化した。mBBr、10μlの100mM溶
液を各タンパク質試料に添加した。20分間インキュベートした後、10μlの100mM
2-メルカプトエタノール、10μlの20％SDS及び80％(v/v)グリセロール及び0.00
5％ブロモフェノールブルーを含有する20μlのSDS/PAGE試料緩衝液を添加するこ
とにより反応を停止した。次に、タンパク質を下記のようにSDS/PAGE(10〜20％
アクリルアミド勾配)で分離した。電気泳動後、ゲルを12％トリクロロ酢酸に1時
間固定のために入れ、40％(v/v)メタノール及び10％(v/v)酢酸に数回変えて一晩
以上浸漬して過剰のmBBrを除去した。次に、脱染色ゲルを365nm UV光下に置き蛍
光バンドを可視化した。(i)ポラロイド写真(ポジ/ネガランドフィルム、55型)、
ラッテンゼラチン黄色フィルタNo.8、露光時間45秒、f4.5、又は(ii)ヌクレオテ
ックコーポレーションのヌクレオビジョンシステムで写真をとった。
【０２３８】 SDS/PAGE ゲル(10〜20％アクリルアミド勾配、厚さ1.5mm又は15％アクリルアミド、アク
リルアミド、厚さ0.75mm)は、Laemmli, U.K.、「バクテリオファージT4ヘッド集
成時の構造タンパク質の切断」、Nature、227:680-685(1970)に従い調製した。
電気泳動後、ゲルを、40％メタノール及び10％酢酸を溶媒とする 0.01％クーマ
シーブリリアントブルーR-250で、1時間染色し、かつ20％エタノール及び10％酢
酸の溶液中で一晩脱色した。脱色後、(i)ポラロイド写真(f7での露光時間1/15秒
)、又は(ii)NucleoTech社のNucleovisionシステムのいずれかで、写真撮影した
。
【０２３９】 配列解析 様々な形のBLG(酸化、一部及び完全に還元、10ug)を、mBBr誘導体として、SDS
-PAGE (10〜20％アクリルアミド勾配、厚さ1.5mm又は15％アクリルアミド、厚さ
0.75mm)により分離した。ゲル内消化(in-gel digestion)法を用いて、構造特性
をもたらすであろうcys残基を含むペプチドを得た(Hwang, B.J.ら、「ポリアク
リルアミドゲルから溶出されたタンパク質の内部配列分析」、J. Chromarotogr.
B. Biomed. Appl.、686:165-175(1996))。出発材料として用いた乾燥ゲルを、
水中に置き膨潤させ、かつセロファン層を取り除いた。その後適当なBLGバンド
を、再構成されたゲルから切り出した。各タンパク質バンドを、1〜2mm小片に刻
んだ。簡単に述べると、ゲル小片を、スピードバック(speedvac)中で脱水し、0.
03〜0.05μg Lys-Cエンドペプチダーゼ(Wako社)を含有する0.1 M Tris緩衝液、p
H9及び0.05％SDS、pH 9.0中で再水和し、30℃で一晩インキュベーションした。
ペプチドを、ゲルを水で2時間を2回及び70％アセトニトリル／0.1％トリフルオ
ロ酢酸(TFA)で2時間を2回で抽出することにより溶出した。一緒にした抽出物を
乾燥し、最低容量の6M塩酸グアニジン-Tris、pH8.2中に溶解した。次に抽出した
ペプチドを、ジチオスレイトール(DTT)で還元し、かつヨードアセトアミドでア
ルキル化した。この反応の後、混合液を、4-X水で希釈し、かつ還元されたドデ
シル硫酸グアニジン沈殿を、遠心により除去した。溶液中消化(in-solution dig
estion)を、希釈した反応混合液中でトリプシンによる消化が完了するまで行っ
た。ペプチドは、Applied Biosystems社の172 HPLCシステムを用い、C18ミクロ
ボアカラム(1 mm x 15 cm、VYDAC)を用いて精製した。試料注入後、カラムを95
％溶媒A(水を溶媒とする0.1％ TFA)／5％溶媒B (70アセトニトリル/0/075％ TFA
)で流量80ul/分を用い10分間洗浄した。ペプチドは、5〜70％の溶媒B勾配で90分
間かけて溶出した。精製されたペプチドは、ABI 477又は470Aシーケンサーのい
ずれかを用い、フェニルチオヒダントイン(PTH)アミノ酸のオンラインHPLC同定
により、配列決定した。下記に同定したCys 160及びCys 119のいずれかを含むペ
プチドを単離した。完全に酸化されたタンパク質のジスルフィドは、Cys 106-Cy
s 119及びCys 60-Cys 160に相当している。一部又は完全に還元された形に関連
しているジスルフィド結合を確定するために、各々独自のトリプシンペプチド(
複数)を単離した。一部又は完全に還元された形の両方は、下記のペプチドを示
した：-Leu149-Ser-Phe-Asn-Pro-Thr-Gln-Leu-Glu-Glu-Gln-Cys 160-His-Ile162
。完全に還元されたタンパク質は、更に下記のペプチドを示した：-Tyr102-Leu-
Leu-Phe-Cys106-Met-Glu-Asn-Ser-Ala-Glu-Pro-Glu-Gln-Ser-Leu-Ala-Cys 119-Gl
n-Cys 121-Leu-Val-。
【０２４０】結果 チオレドキシンシステムによる牛乳タンパク質の還元 チレドキシンは、牛乳の最も優勢なジスルフィドタンパク質、すなわちBLGの還
元において有効であった。この目的のために、レドックス状態の純粋なBLG(A及
びB型)を、NADPH、NTR及びチオレドキシンからなるNADP/チオレドキシンシステ
ム(NTS)で処理後、モニタリングした。前述のように、試料を、NTSシステムと共
にインキュベーションし、その後モノブロモビマン(mBBr)／SDSポリアクリルア
ミドゲル電気泳動(PAGE)法を用いて分析した。ここでは、前述のように、mBBrに
由来しかつSDS-PAGEにより分離された標的タンパク質の還元(-SH)型は、紫外線
下で観察した場合に蛍光バンドのように見えた。先の実施例において分子内ジス
ルフィド結合を含むタンパク質のスペクトルにより認められたように、純粋なBL
GのA及びB型は、チオレドキシンにより活性のあるように還元される。牛乳に適
用した場合、チオレドキシンは、BLGのみではなく、図7のゲルについて使用され
たSDS/PAGE/mBBr標識法により決定されたようなα-ラクトアルブミンを含む、数
種類の他のタンパク質も還元した。このゲルについては、PBS中の粗牛乳50μgが
全てのレーンに負荷される。各レーンについての他の変数は以下のとおりである
：レーン1、対照、4℃、添加なし；レーン2、NTS、55℃；レーン3、NTS、4℃；
レーン4、NGS、55℃；レーン5、NGS、4℃；レーン6、5mM DTT、100℃、5分間；
レーン7は、クーマシーブルーで染色した以外は、レーン6と同じ。過剰なNADPH
、NTR及びチオレドキシンは、実験期間中は、標的牛乳タンパク質を還元状態で
維持したことに注意。大きい(24kDa)カゼイン成分(α及びβ)の前を移動する小
さいバンドは、κ-カゼインである。
【０２４１】 温度は、還元について興味深くかつ有用な作用を有することが分かった。図7に
示したように55℃(45分間)処理した場合、BLGは還元されたが、そのゲル内の移
動はわずかに変化したに過ぎなかった。対照的に、4℃でインキュベーションし
た場合(17時間)、大量のBLGの移動は、顕著に減少され、かつ新たなタンパク質
の形が出現した(レーン3、図7)。ゲルスキャニングによる還元の程度の評価は、
BLGが55℃では部分的に還元され、かつ4℃では完全に還元されたことを明らかに
した。公知の構造のBLGによる部分的及び完全に還元された形のトリプシン処理
したペプチドのアミノ酸配列の比較は、この還元の性質に関する更なる情報を提
供した。
【０２４２】 BLGは、両者とも分子内にある、2個のジスルフィドを含むことが分かっている(
図8参照)：1個は、明らかに表面に接近可能であり、かつC-末端近傍(Cys 66-Cys
160)に位置するのに対し、他方は、中心に近く、2個のα-シート構造の間に位
置する(Cys 106-Cys 119又は恐らくCys 106-Cys 121)。配列解析は、露出された
ジスルフィド(Cys 66-Cys 160)が、55℃で還元され(部分的に還元された形)、か
つこれに加えて隠されたジスルフィド(Cys 106-Cys 119又はCys 106-Cys 121)が
、両方共4℃で還元される(完全に還元された形)ことを確認した(材料及び方法の
項参照)。BLGの示差的還元は、pHを変更することでも行うことができる。pH6.8
での還元は、部分的に還元された形のみを生じたのに対して、pH8.0では部分的
及び完全に還元された形の混合物が認められた(両方共37℃)(データは示さず)。
これらの結果は、BLGは、中性より高いpH値では不安定であり(Tanford, C.ら、
「β-ラクトグロブリンのpH7.5における形質転換」、Biochemistry、81:4032-40
36(1959))、かつ40℃以上の温度でコンホメーションの変化を受けること(Qi, X.
L.ら、「β-ラクトグロブリンの二次構造へのpH6.7における温度の作用、CD及び
IR分光による測定：モルテングロビュール仮説の検証」、Biochem. J.、324:341
-346(1997))を示した他の研究者の知見を確認している。有意なことに、緩衝液
を伴わない成分NADP/チオレドキシンシステムのみを粗牛乳に添加した場合、図7
に示したようなBLGと同じ還元結果が得られた。更に、この緩衝液を伴わずに処
理した牛乳中のBLGは、大気中4℃で保存した場合2日間還元され続けた(データは
示さず)。
【０２４３】 図7のゲルのレーン4及び5に認められるように、NADPH及びグルタチオンレダクタ
ーゼにより還元状態で維持されたモノチオールグルタチオンも、BLG及びある程
度は他の牛乳タンパク質を還元するが、NTSよりも効果は少ない。他のジスルフ
ィド還元剤であるジチオスレイトール及びリポ酸が有効であるが、先の実施例に
おいて説明されたように、チオレドキシンと一緒の場合にのみヘビ神経毒につい
て有効である(データは示さず)。
【０２４４】 ペプシン及びトリプシンによる牛乳タンパク質の消化 実施例19及び29に示したように、分子内ジスルフィド結合を有する小タンパク質
(例えば、トリプシンインヒビター、ヘビ神経毒)のトリプシン感受性は、チオレ
ドキシンによる還元後、劇的に増加する。同様にBLG は、これと同じパターンに
従うことが認められ、すなわちチオレドキシンで還元されたBLGは、トリプシン
消化について高感受性であるのに対して、酸化されたBLG(すなわち、純粋な未処
理の)は抵抗性がある(実施例34参照)。同様の結果が、純粋なBLGに加え、前掲の
Astwood, J.D.らに示されたような模擬胃液に晒された牛乳を用いるこの実施例
において得られた。SDS-PAGEにより分離されかつクーマシーブルーで染色された
場合、 BLGは、ペプシンで消化されるが、これはチオレドキシンにより還元され
た後のみであることがわかった(図9参照)。図9は、ミニSDS/PAGE及びクーマシー
ブルー色素により決定された酸化及び還元されたBLGの消化を示している。SGFと
の全てのインキュベーションは、37℃で行った。SGF混合液13.5Mを、指示された
ように負荷した。図9に示したゲルに関する他の変数は以下である：レーン1、BL
G、SGF、0分；レーン2、BLG、SGF、60分；レーン3、NTSにより還元されたBLG、5
5℃、SGF、0分；レーン4、NTSにより還元されたBLG、55℃、SGF、60分；レーン5
、還元されたBLG、4℃、SGF、0分；レーン6、還元されたBLG、55℃、SGF、60分
；レーン7、SGF；レーン8、BLG。図9に認められるように、感受性の差異は、著
しかった。
【０２４５】 牛乳中の酸化されたBLGは、少なくとも60分間は消化に抵抗するのに対して、チ
オレドキシンで還元された形は、60秒以内に消化されたことが分かった(図1OA-1
OC参照)。図10A、10B及び10Cは、ミニSDS/PAGE及びクーマシーブルー色素で決定
されたチオレドキシン還元後のPBSで緩衝された牛乳の消化に対する時間の作用
を示している。試料2-10は、模擬胃液混合物13.5μlを含み、かつ試料3-10は、5
0μg牛乳タンパク質を含んでいた。インキュベーションを0、0.25、1、2、4、8
、15、30、60分行った後、消化を中和により停止し、かつアリコートを、図10A
、1OB及び10Cの各ゲルの適当なレーンに負荷した。図10Aのゲルの他の変数は、
緩衝された牛乳対照であり；図1OBのゲルについては、緩衝された牛乳、NTS、55
℃であり；図10Cのゲルについては、緩衝された牛乳、NTS、4℃である。1個のジ
スルフィド結合の還元で十分であった。BLGの部分的(55℃)及び完全(4℃)で還元
された形は、ペプシン感受性において差異を示さなかった(図1OB及び10Cの比較)
。重要なことに、グルタチオンで処理された試料は、チオレドキシンにより部分
的に還元されたとしても、模擬胃液による消化に対して非感受性であった(デー
タは示さず)。α-ラクトアルブミン及びκ-カゼインの感受性がチオレドキシン
還元により若干増強されたとしても、純粋又は牛乳中かを問わずBLGは、チオレ
ドキシンによる還元がなければ消化されない唯一のタンパク質であることがわか
った(図7、9、及び10A-10C参照)。
【０２４６】 還元されかつ消化された牛乳タンパク質のアレルギー状態 イヌモデルの皮膚試験を用いる牛乳の主要タンパク質(カゼイン、α-ラクトアル
ブミン、BSA、BLG)のアレルゲン誘発性の比較は、BLGが、総膨疹誘導活性の80％
を占めるような主要な牛乳アレルゲンであることを明らかにした。更に、チオレ
ドキシンシステムで処理した場合、牛乳及びBLGの両方が、アレルギー反応誘発
の能力の低下を示した。従って、アレルゲン誘発性を試験する先の実施例の結果
と同様に、粗牛乳のアレルゲン誘発性は、被験イヌの感受性に応じて1/10〜1/30
0に低下された(図11A及び11B参照)。図11A及び11Bのグラフは、感受性の異なる2
匹のイヌにおける、粗牛乳アレルゲンに対する皮膚試験反応のチオレドキシンに
関連した緩和を比較している。図11A 及び11Bに示されたように、膨疹面積(mm2)
で決定されたI型過敏反応は、PBSを溶媒とする牛乳溶液100μlの皮内注射により
誘導された。この溶液は、NADP/チオレドキシンシステムで処理されるか(NTS、4
℃)又は未処理(対照)のいずれかであった。2匹のイヌの反応は、両例において、
感受性の差にも拘らず、チオレドキシン処理がアレルゲン誘発性を緩和したこと
を説明することが示された(すなわち、中感受性(図11B)及び高感受性(図11A)動
物)。PBS/グリセロール対照及びNTSは、各イヌにおいて陰性であることが認めら
れた。更に、異なる感受性を示す多くのイヌの試験は、純粋又は牛乳中のいずれ
かの部分的及び完全な還元型のBLGのアレルゲン誘発性において、一貫した差異
がないことを明らかにした(データは示さず)。従ってこの皮膚試験のデータは、
チオレドキシンによる還元が、BLG及び恐らくは他の牛乳タンパク質のアレルゲ
ン誘発性を減少するように、エピトープの接近しやすさを変更することを示して
いる。純粋なBLGは、牛乳に類似したアレルギー反応を示した(図12A及び12Bの酸
化及び還元されたゼロ時点の試料を比較)。図12A及び12Bにおいて、酸化された
“0”分及び還元された“0”分のバーは、消化処理前の試料を表し、酸化された
60分及び還元された60分のバーは、ペプシン含有SGFで処理された試料を表して
いる。皮膚膨潤面積(mm2)で観察したI型過敏反応は、NADP/チオレドキシンシス
テム(NTS)で処理された(還元された)又は未処理(酸化された対照)のいずれかの
、消化され中和されたBLG(図12A)又は牛乳(図12B)の100μl皮内注射により誘発
された。中和されたSGF対照は、全ての被験イヌについて陰性であることが認め
られた。更に、皮膚試験は、アレルゲン誘発性に対するチオレドキシンの作用に
関して、BLGの純粋なA及びB型の間に差異を認めなかった(データは示さず)。
【０２４７】 BLG及び牛乳の両方で行われた皮膚試験は、ペプシン消化は、両調製物のアレル
ゲン誘発性をほぼ完全に消失したことを明らかにした(図12A及び12B参照)。皮膚
試験を基に、アレルギー反応は、消化を還元と組合せた場合に、1/300〜1/1000
に低下した。更に、消化された試料のアレルゲン誘発性は、高及び中の両方の過
敏性のイヌにおいて、緩和レベルまで低下した。
【０２４８】 これらの結果は、チオレドキシンによる還元が、(1)完全なタンパク質のエピト
ープの接近しやすさを変更し、その結果アレルゲン誘発性がほとんどの動物にお
いて低下され、かつ(2)BLGのような安定したアレルゲンをペプシン消化を受けや
すくし、その結果殆ど完全にアレルゲン特性が失われるという結論と一致してい
る(図13及び14参照)。
【０２４９】 最後に、α-ラクトアルブミン及びBLGがNTSシステムにより還元された場合には
、トリプシンにより消化されることもわかった(実施例34参照)。これらの結果は
、ペプシンに関する本実施例から得た結果と組合せて、チオレドキシンのBLGプ
ロテアーゼを感受性にする能力を確認している。
【０２５０】 アトピーイヌの飼養試験 嘔吐及び下痢に繋がる胃腸管の不調は、食物アレルゲンの摂取に随伴する症状で
あるが、食物タンパク質の摂取可能性(ingestability)によるものではない。更
に、これらの症状の重篤度は、皮膚試験を補完するアレルゲン強度の測定値を提
供する。胃腸管の反応に対する証拠を得るために、感受性イヌの食餌にBLGを添
加した。下記表VIIIに示した結果から分かるように、還元型BLGを2.5g (BLG 2.5
gは、牛乳3/4リットルに相当)を含有する食餌を摂取するイヌは、嘔吐の程度の
有意な低下を示した。反復飼養試験は、平均約70％の胃液逆流の消失を示した。
重要なことに、このパターンは、BLG処理又は未処理のいずれかの食餌が与えら
れた1匹のイヌにおいても認められた。関連する胃腸不調反応の同様の緩和が、B
LGを、各イヌへ投与される食餌1缶当たり表VIIIで使用した2.5gから、1.25gに減
少しても認められた(データは示さず)。これらの知見は、前述の皮膚試験の結果
を補完し、粘膜リンパ系組織によるアレルゲン認識が、チオレドキシン処理によ
り緩和されたことを示している。
【０２５１】 表XVIII 食餌を変更されたイヌのアレルギー反応 未処理又はチオレドキシン処理したβ-ラクトグロブリン ＊誘発された嘔吐の量及び流動性の測定 上部GI指数の反応は、イヌ食餌1缶当たりチオレドキシン処理又は未処理(対照)B
LG 2.5g混合したものを用いて測定した。指数の計算は、2回の個別の飼養実験A
及びBの後に行った。上部GI指数の意味は以下である：嘔吐なし＝０、わずかな
嘔吐＝１、大量の嘔吐＝２、固形物の嘔吐＝１、液体の嘔吐＝２、血液又は胆汁
の混ざった液体の嘔吐＝３、遅発型嘔吐＝１、及び即時型嘔吐＝２
【０２５２】 考察 この実施例において、チオレドキシンは、主要な牛乳アレルゲンであるBLGに
存在する分子内ジスルフィド結合を特異的に還元することが分かった。条件に応
じて、チオレドキシンは、NADPH及びNTRにより還元され、かつこれは純粋なタン
パク質又は牛乳のいずれで分析するかで、BLGの1個又は両方のジスルフィド結合
を還元した。実験的に皮膚試験及び食餌チャレンジから明らかであるエピトープ
分布の変化は、構造モデルにおいて分子レベルで認められた(Peitsch, M.C.、前
掲(1996))。露出されたBLGのジスルフィド結合(Cys66-Cys16O)は、コンピュータ
モデルを用いる、位置指定突然変異により破壊され、125Thr-135Lysエピトープ(
Kaminogawa, S.ら、「ウシβ-ラクトグロブリン変性過程のモニタリングのプロ
ーブとしてのモノクローナル抗体」、Biochemica et Biophisica Acta、998:50-
56(1989))は、その位置が顕著に近傍で変更されるにも拘らず、両方のジスルフ
ィドから離れたエピトープ(8Lys-19Try)は変更されなかった(図13及び14参照)。
埋もれた(buried)ジスルフィド(Cys1O6-Cys119又は恐らくCys1O6-Cys121)の突然
変異は、最早エピトープの位置の変化にはつながらない。同様の知見は、ヒトBL
Gエピトープで調製されたモデルでも得られた (Ball, G.ら、「ヒトIgE結合によ
り認識されたウシβ-ラクトグロブリンの主要連続アレルゲン性エピトープ」、C
linical and Experimental Allergy、24:758-764(1994))。
【０２５３】 本発明は、チオレドキシンによる還元が、2種の方法で、標的タンパク質アレル
ゲンのアレルゲン誘発性を低下することを示唆している。還元は、エピトープの
接近しやすさを制限しかつ消化性を増強しているタンパク質構造の変化に作用す
る。この方法で、アレルゲンの強度は、低下され、かつ加えてより迅速に胃腸管
から消失されるはずである。
【０２５４】実施例40 ペプシン及びトリプシンによる還元されたグリアジンの消化 実施例9及び10に記されたように小麦粉からのエタノール抽出により単離された
グリアジン画分のプロテアーゼの易作用性を調べた。先の実施例10に示されたよ
うに、グリアジンは、チオレドキシンにより特に還元されやすい分子内ジスルフ
ィド結合を有する。グリアジンも、小麦中の主要食物アレルゲンである。Buchan
an, B.B.ら、「チオレドキシンに関連した小麦のアレルギー反応の緩和」、Proc
. Natl. Acad. Sci. USA、94:5372-5377(1997)。チオレドキシンそれ自身は、NA
DPH及びNADP-チオレドキシンレダクターゼにより酵素的に、又は、ジチオスレイ
トール(DTT)により化学的にのいずれかにより還元され得る。この実施例に関し
て、単離されたグリアジン(1.04mg/ml)のアリコート(50μl)を、1mM DTTの存在
又は非存在下で還元されたチオレドキシン(1.0μg)有り又は無しで、Tris-HCl緩
衝液中で室温pH7.5で1時間インキュベーションした。インキュベーション終了時
に、シグマ社のトリプシン(1mg/ml)5μlを各試料に添加した。これらの試料には
、更に1時間30℃で消化を施した。消化は、各試料中のPMSF(フェニルメチルスル
ホニルフルオリド(100mMを2μl))で終結した。試料にSDS(10％を10μl)及びグリ
セロール(50％を15μl)を混合した後、SDS-PAGEで分析した。電気泳動後、15％
ゲルを、クーマシーブルーで染色し、かつメタノール及び酢酸で脱色した。タン
パク質バンドの分析は、グリアジンが、酸化された(未処理)状態では消化に対し
安定しているが、チオレドキシンによる還元後は低分子量の成分に分解されるこ
とを示した。同様の結果が、実施例39におけるように、グリアジンアリコートが
処理されかつトリプシンの代わりにペプシンで処理された場合に得られた。
【０２５５】 本実施例及び実施例34及び39は、チオレドキシンによるアレルゲン還元の結果が
、プロテアーゼに対する感受性を著しく増加することを示している。従って、グ
リアジン及びBLGの酸化された形は、ペプシンに対し抵抗性があるにも拘らず、
還元された形は、高度に易作用性でありかつ容易に消化される。小麦粉中の生来
のチオレドキシンの平均濃度は、約0.01％である(Johnson, T.C.ら、「小麦種子
チオレドキシンシステムによるプロチオニンの還元及び可能性のあるレドックス
制御における二次的チオールメッセンジャーの機能」、Plant Physiol.、85.446
-451(1987))。これは、小麦又はパン1kg当たり約100mg〜約200mgであり、小麦10
0g当たりチオレドキシン約2mgである。しかし、小麦中の天然のチオレドキシン
の上限は、食物タンパク質1g当たり2mgである。例えばチオレドキシン還元剤で
処理されたより高濃度のチオレドキシンを含んだパンは、よりアレルギー性が低
くかつより消化可能なパンである。同じくBLGのモデリングを通じて分子レベル
で認められる、チオレドキシン及びチオレドキシン還元剤で処理された食物タン
パク質によるペプシンに対する感受性の増大は、恐らく胃腸管における摂取され
たBLGのより迅速な消化過程(processing)につながるであろう。全ての動物に拡
張した場合、チオレドキシンシステムによる牛乳及び小麦並びに他の食品の処理
は、注目すべきは浮腫及び下痢であるような、アレルゲン誘発性及び非消化性の
長期にわたる作用からの軽減を提供すると予想されるであろう。
【０２５６】 牛乳に関するチオレドキシン技術の商業化は、低温殺菌前後の牛乳のNTSによる
処理により達成される(すなわち、55℃で45分間又は4℃で少なくとも10時間)。
このような用途は、下記を含む： 1. 粗牛乳又は乳漿への液状のチオレドキシンシステムの適用、及び低温殺菌法
への還元の組合わせ。 2. 粗又は低温殺菌した牛乳の還元されたチオレドキシンに結合したカラムの通
過。チオレドキシンは、牛乳の適用前に、NADPH及びNTRで還元される。チオレド
キシンは、更に、牛乳への適用前に洗浄によりカラムから除去されるジチオスレ
イトールにより還元されることが可能であろう。 3. NTS処理した牛乳の賞味期間を延長するための、例えば充填(full)容器又は真
空容器を用いる、非酸化条件下での貯蔵。 4. 低温殺菌後の、チオレドキシン及びNTRの牛乳への添加、並びに使用直前の固
形のNADPHの添加。 5. チオレドキシンによる処理後、トリプシンのような酵素により、牛乳へ制限
されたタンパク質分解性消化を施す。このような産物は、牛乳−過敏の個体にお
いて忍容性を誘導するように使用することができる。
【０２５７】実施例41 チオレドキシンで処理したブタクサアレルゲンタンパク質の低下したアレルゲン 誘発性及び増大した消化性の決定 花粉タンパク質のチオレドキシンシステムによる還元 バイエル社から購入したジャイアントブタクサアレルゲン抽出物は、標準として
ウシγ-グロブリンを用い、Bradfordアッセイによりタンパク質について分析し
た(Wong, J.H.ら、「チオレドキシン及び種子タンパク質」、Methods Enzymol、
252:228-240(1995))。このタンパク質100μgは、1.25mM NADPH、1.7 μgのE. co
il NADP/チオレドキシンレダクターゼ(NTR)及び1.7μgのE. coli チオレドキシ
ン(Trx)と共に、30mM生理的緩衝生理食塩水(PBS)(10mM Na2HPO4、 1.8mM KH2PO4 、2.7mM KCl及び137mM NaCl、pH7.4)中、最終容量100μlで、37℃で45分間イン
キュベーションすることにより還元した。還元の程度は、前述の及びWongら(同
書)にも記されたSDS-PAGE/モノブロモビマン法により測定した。ゲルはUV下で可
視化した。
【０２５８】 皮膚試験 アレルギー投与量で皮膚試験によりI型過敏反応を測定する方法は、先に説明さ
れたものと実質的に同じである(実施例36、37及び39参照)。簡単に述べると、エ
バンスブルー色素0.5％(0.2ml/kg)を、皮膚試験の5分前に静脈内注射した。花粉
アレルゲン抽出物0.1mlのアリコートを、腹側腹部に半対数(half-log)希釈で皮
下注射した。皮膚試験は、同一の経験豊富な盲検化された観察者により、各ブル
ースポットについて2個の垂線方向直径(perpendicular diameter)をスコア化し
、盲検法で判定された。適当な陰性対照(PBS中に希釈)は、各被験動物について
含めた。
【０２５９】 模擬胃液による花粉タンパク質の消化 花粉タンパク質650μg、又は純粋なAmb t V 100μgを、2.4μg Trx、4.2μg NT
R及び2.5mM NADPHの混合物の存在又は非存在下で、100μl PBS緩衝液中で37℃で
45分間インキュベーションした。その後、325μg花粉タンパク質又は50μg Amb
t Vを含有する各反応混合液50μlを、Astwoodらにより説明された100μl模擬胃
液(SGF)中で消化した(Astwood, J.D.ら、「食物アレルゲンのin vitro消化に対
する安定性」、Nature Biotechnology、14:1269-1273 (1996))。SGFは、0.32％
ブタペプシン(w/v)及び30mM NaClで構成され、HClでpH1.2に調節されている。こ
の消化混合液は、37℃でインキュベーションし、かつ0、0.25、1、2、4、8、15
又は60分の時点で停止し、160mM Na2CO3の0.375容量でpHを中性とした。タンパ
ク質は、SDS-PAGE及び既述の皮膚試験により分析した。
【０２６０】 Amb t V精製 精製は、Roebberらの1985年の方法を用いて行った(Roebber, M.ら、「ジャイア
ントブタクサ花粉由来のRa5ホモログであるAmb.t. V (Ra5G)の免疫化学的及び遺
伝的試験」、J. Immunol.、134:3062-9(1985))。簡単に述べると、脱脂していな
い花粉(Greer Laboratories社)100gを、1Lの緩衝液[50mM Tris-HCl、pH7.4、1μ
Mフェニルメチルスルホニルフルオリド(PMSF)及び1mM EDTA-Naを含有]に懸濁し
、かつ緩徐に30分間室温で攪拌した。次にこの混合液を、 3,840 xgで15分間、4
℃で遠心した。収集した上清画分を、一度ガラスウールを通し、その後2回ワッ
トマン定量用濾紙を通し濾過した。花粉粒子を含むペレットは以後使用しなかっ
た。濾過された上清画分中の多量の脂質は、等量の石油エーテルで抽出し、かつ
11,300 xgで10分間4℃で遠心することにより除去した。この石油エーテル工程は
、4回繰り返した。得られる透明な溶液を、アミコンYM-3膜を通過させて濃縮し
、かつ200mM NaClを添加した20mM Tris-HCl、pH7.5で平衡にしかつ溶出する、セ
ファデックスG-50Fゲル濾過カラム(2.1 x 90cm)上で分離した。5kDaタンパク質
を含有する画分を、15％SDS-PAGEで分析し、一緒にし、かつ再度YM-3膜で濃縮し
た。濃縮したタンパク質に硫酸アンモニウムを添加し、最終濃度2.6Mとした。次
にこのタンパク質混合物を、200mMリン酸緩衝液(pH7.0)で平衡化した1mlのHiTra
pフェニルセラロースカラム(Pharmacia社)上で分画し、かつ同じ緩衝液中の2.5
から0Mへ漸減する硫酸アンモニウム勾配50mlで溶出した。純粋なAmb t Vを、お
よそ0.8Mの単独のピークで回収した。最後に、純粋なタンパク質を、5mMリン酸
カリウム緩衝液(pH7.0)に対して透析し、かつ更なる実験まで-70℃で貯蔵した。
タンパク質含有量は、分子の吸光係数5800を用いて量化した。
【０２６１】 データ解析 花粉アレルゲンのチオレドキシンに関連した緩和を示す皮膚試験結果の統計学的
有意性を、対のある片側t-検定により解析した。未処理 対 チオレドキシン-
処理の花粉タンパク質により誘発された膨疹面積には差がないと仮定する帰無仮
説を、この処理はアレルギー反応の緩和を生じるという対立仮説に対して検定し
た。このt-検定は、全ての敏感イヌ(df＝8)において、各希釈シリーズ(アレルゲ
ン0.07〜219ng)について有意水準0.05で行われた。
【０２６２】 結果及び考察 花粉タンパク質の還元 図15に示されたように、いくつかのタンパク質、すなわち5kDaのAmb t V、並び
に12、14及び35kDaの未同定のタンパク質は、チオレドキシンにより活性がある
ように還元された。更に、還元の程度は、反応温度により変動した。図15に示さ
れるように、還元は37℃以上で最も効率的であった。Amb t Vの場合、結果は、
複数のジスルフィド結合(恐らく全部で4個)が、37℃及び55℃で還元されたのに
対し、4℃ではより少ない数が還元された。並行して、チオレドキシンによる還
元が、Amb t Vについて説明された高い熱安定性に顕著に影響することも認めら
れた(Baer, H.ら、「ショートブタクサ花粉抽出物の熱安定性及び皮膚反応性に
おける個々のアレルゲンの重要度」、J. Allergy Clin. Immunol.、66:281-5(19
80))。タンパク質の沈殿は、チオレドキシンによる還元後55℃で発生することが
認められた(データは示さず)。
【０２６３】 チオレドキシン還元によるアレルゲン誘発性の緩和 下記表XIXに示されるように、チオレドキシンによる還元は、皮膚試験の反応を
効果的に緩和した。牛乳について認められるものほど顕著ではないが(実施例39
参照)、このチオレドキシンが関連した花粉の粗抽出物のアレルゲン誘発性の低
下は、3-〜33-倍の間であった。更に、t検定解析を基に、この緩和は統計学的に
有意であった。
【０２６４】 表XIX 花粉アレルギーに対する皮膚試験反応のチオレドキシンによる緩和の統計学的評
価。2個の試料の平均の対のある片側t検定、P値は0.05以下である。
【０２６５】 ペプシンに対する花粉タンパク質感受性に対するチオレドキシン還元の作用 チオレドキシンによる還元が花粉アレルゲンの消化性を増大するかどうかを決定
するために、精製されたAmb t Vタンパク質の酸化型及び還元型を、SGFで処理し
た(Astwood, J.D.ら、「食物アレルゲンのin vitro消化に対する安定性」、Natu
re Biotechnology、14:1269-1273.12(1996))。最初に、β-ラクトグロブリン同
様、Amb t Vは、チオレドキシンシステムにより還元された場合にのみ消化され
ることが分かった。酸化されたタンパク質は、ペプシンに対して60分以上抵抗し
、図16Aに示したようにそのアレルギー潜在能を保持しつづけた(Astwood, J.D.
、前掲、(1996))。対照的に、チオレドキシンで還元されたタンパク質は、図16B
に示されたように、2分後にはほとんど完全に消失していた。このペプシンに対
する感受性は、8匹のイヌについて試験した粗花粉抽出物で得られた皮膚試験デ
ータにより実証された。酸化された花粉抽出物により誘発された皮膚試験反応は
、これらのイヌの4匹においては、消化後も続いたことが認められ(6CGB1と記さ
れたイヌによって代表される、実施例39参照、「アトピーイヌの食物感作」)、
このことは図17Aに示されるように、これらのアレルゲンがペプシン抵抗性であ
ることを示唆している。対照的に、調製物がチオレドキシンで還元された場合、
アレルギー反応は、これらのイヌにおいて顕著に漸減した。これは、アレルゲン
は、ジスルフィドタンパク質であり、かつこれらのタンパク質はその後消化され
るというゲルデータと一致することを確認している。別の4匹のイヌ(図17B の5C
BB3と記されたイヌによって代表される)は、酸化された(未処理)のタンパク質が
SGFにより消化された場合に、反応の顕著な減少を示し--すなわち、最も活性の
あるアレルゲンは、最初から消化されたことを示した。この知見は、第二群は、
ジスルフィドタンパク質に対する感度が低いことを示している。
【０２６６】 図18のデータは、未処理及びチオレドキシン−処理した調製物に対するこの示差
的反応が、特定の動物のジスルフィドタンパク質アレルゲンに対する感受性に起
因することの証拠を提供している。図17A及び17Bの純粋なAmb t Vについて認め
られたように、粗調製物中のジスルフィドタンパク質(Amb t Vを含有する)は、N
ADPチオレドキシンシステムにより還元されない限りは、ペプシンに対し強力に
抵抗性であった(図18A及び18B)。更に、還元温度が重要である；還元温度が4℃
から37℃、そして55℃と上昇するにつれて、消化は漸増した。還元されないと、
5〜20kDaの範囲のタンパク質は、60分間SGFと共にインキュベーションされた後
であっても消化されなかった。
【０２６７】 前述の結果は、主要アレルゲン--β-ラクトグロブリン--がジスルフィドタン
パク質であるような牛乳とは異なり(del Val, G.ら、「チオレドキシン処理は牛
乳の消化性を増大しアレルゲン誘発性を低下する」、J. of Allergy Clin. Immu
nol.、(1999)印刷中)、ブタクサ花粉は、ジスルフィド結合を伴う又は伴なわな
いの両方のタンパク質からなる複合アレルゲン混合物を含有するという結果と一
致している。
【０２６８】 これらの結果は、NADP/チオレドキシンシステムが、花粉に対するアレルギー反
応を緩和することを示している。更にこれは、アレルゲンの複合混合物における
活性ジスルフィドタンパク質の重要性を、酸化された及びチオレドキシン-還元
された試料のペプシン感受性を比較することで評価することができることも示し
ている。アレルギー反応に対してジスルフィドタンパク質が重要であればあるほ
ど、その反応の緩和においてチオレドキシンがより有効となる。
【０２６９】実施例42 免疫療法のためのチオレドキシン処理したブタクサ花粉アレルゲンの使用 本研究の対象は、ブタクサ花粉タンパク質Amb t Vのエアロゾルを特定量吸引し
た際にくしゃみと咳(気管支痙攣)を発生する動物である。エアロゾル中のAmb t
Vタンパク質は、いずれの還元剤でも処理しなかった。動物には、実施例41に記
されたように精製しかつチオレドキシン、NADPH及びNTRと共にインキュベーショ
ンしたAmb t Vの67μg/ccを含有する臨床溶液を漸増する投与量で皮下注射した
。これらの皮下注射は、処理したAmb t Vに対する局所アレルギー反応が発生す
るのに最も近い投与量及びエンドポイントを決定するためのものであった。0.15
cc中10ナノグラム(ng)で、注射部位に、約5mmの膨疹の発生が認められた。エン
ドポイントは10ngと確立されたので、次に動物に、このエンドポイントの1対数
低い量のAmb t V、この場合1ngを、3日後皮下注射した。この用量は、下記表に
記した注射スケジュールの初回投与量に相当している。
【０２７０】表XX 希釈IV(青) 1:10,000 希釈II(黄) 1:100 初回投与量 - 0.15cc 11回目投与量 - 0.15cc 2回目投与量 - 0.30cc 12回目投与量 - 0.25cc 3回目投与量 - 0.60cc 13回目投与量 - 0.35cc 4回目投与量 - 1.00cc 14回目投与量 - 0.50cc 15回目投与量 - 0.75cc 16回目投与量 - 1.00cc希釈III(緑) 1:1,000 希釈I(赤)濃縮 1:10 5回目投与量 - 0.15cc 17回目投与量 - 0.10cc + 0.10cc生理食塩水 6回目投与量 - 0.25cc 18回目投与量 - 0.15cc + 0.15cc 生理食塩水 7回目投与量 - 0.35cc 19回目投与量 - 0.20cc + 0.20cc 生理食塩水 8回目投与量 - 0.50cc 20回目投与量 - 0.25cc + 0.25cc 生理食塩水 9回目投与量 - 0.75cc 21回目投与量 - 0.30cc + 0.30cc 生理食塩水 10回目投与量 - 1.00cc
【０２７１】 従って、初回投与量は、Amb t V 67μg/cc溶液の1:10,000希釈物の0.15ccの注射
である。この対象は、局所反応について観察した。初回投与量の注射時に反応が
認められないので、該動物に、1:10,000希釈物の0.30cc又は2ngの2回目注射を施
した。3日後、3回目投与量1:10,000希釈物の0.60ccを皮下投与した。その後の注
射スケジュールは、対象が忍容できる最高投与量に到達するまで、3日毎の注射
を行った。最高投与量は、最大局所皮膚反応、すなわち銀貨の寸法よりも大きい
膨潤、及び／又は蕁麻疹(発疹(hives))、くしゃみ、嘔吐又は血圧降下のような
全身症状により示された。この動物の最高投与量は、21回目の投与量であったが
、別の対象では、11回目、15回目又は18回目などであった。最高投与量が確認さ
れたならば、1又は2投与量分減少し用量とし、この減少した用量を新たな最高投
与量とする。3〜4週間毎に、動物に、新たな最高投与量を皮下注射した。3〜4週
間隔で新たな最高投与量を受取っておよそ6ヶ月目に、対象動物は、先にくしゃ
みを引き起こしたものと同量のAmb t Vエアロゾルを吸引した。この吸引の結果
認められたくしゃみ又は咳は、発生しないか、もしくは限定的であった。この動
物は、定期的間隔で新たな最高投与量を受取り続け、かつ還元されないAmb t V
を更に吸引した際にも、くしゃみ及び他のアレルギー反応を生じないか又は比較
的生じない状態を保った。
【０２７２】実施例43 免疫療法の有効性に関するチオロドキシン処理した花粉タンパク質及び未処理の 花粉タンパク質の比較 本研究の対象は、還元していないアレルゲンAmb t Vの特定量の吸引時に、くし
ゃみ及び他のアレルギー反応を呈している全て同種の10匹の動物群である。アレ
ルギーのエンドポイントを決定するために、動物を、各群5匹の2群に分けた。こ
れらの動物は、抗体レベルについて試験し、その後A群には、還元されないAmb t
Vの投与量を増加しつつ注射し、かつB群には、実施例42に記されたようにチオ
レドキシン、NADPH及びNTRとインキュベーションしたAmb t Vの投与量を増加し
つつ注射した。投与された絶対用量が動物ごとに異なったとしても、10匹の動物
全てについてmg/体重kgを基にした投与量は、同じであった。群の各動物のエン
ドポイント投与量を決定した。A群の mg/体重kgを基にした平均エンドポイント
投与量は、B群よりも低かった。その後これらの動物に、実施例42に記された方
法及び注射スケジュールに従い注射した。各動物の最高投与量を決定した。B群
の動物の最高投与量は、A群の動物の最高投与量よりも、一貫して高く、観察さ
れた局所的又は全身的症状はより少なかった。その後実施例42に記した方法で、
動物を新たな最高投与量に割り当て、かつ実施例42にように引き続き3〜4週毎に
この新たな最高投与量を注射した。このような注射をおよそ6ヶ月継続した後、A
群の動物は、その後の還元されないアレルゲンの特定量の吸引時に、若干減弱さ
れたアレルギー反応を示したのに対し、B群の動物は、非常に限定されたもしく
は有意でないアレルギー反応を示した。更に、B群の動物は、このアレルゲンの
非常に高い投与量に対して忍容可能であり、一部例では10〜100倍に及んだ。処
理した動物において抗体レベルを決定する試験は、B群の動物のIgG抗体力価は免
疫療法後上昇したのに対して、IgEの力価は経時的に漸減することを示した。IgG
抗体力価は、A群においても免疫療法後若干高かったが、B群の動物のIgG力価よ
りも平均して非常に低かった。
【０２７３】 これらの結果は以下を示している： ・ブタクサ花粉のチオレドキシン還元はアレルギー反応を緩和する。 ・チオレドキシン還元は、ジスルフィド花粉アレルゲンの消化性を著しく増強す
る。 ・チオレドキシン(及び恐らく他のジスルフィド還元剤、例えばリポ酸など)は、
IgE抗体の代わりにIgG抗体の産生を増強しかつ治療の安全性を向上することによ
り、花粉アレルギー患者の免疫療法のための低−アレルゲン性花粉抽出物におい
て有用である。
【０２７４】 本発明の実施態様は、下記を含有する点眼剤又は点鼻スプレーによる花粉アレル
ギーの治療を含む： −リポ酸 −NADP/チオレドキシンシステム −リポ酸及びNADP/チオレドキシンシステム。
【０２７５】 本発明は、ジスルフィドタンパク質に起因した多くの種類のアレルギー(例え
ば、食物、花粉、チリダニ)を、これらのタンパク質を前述のようにNADP/チオレ
ドキシン又はリポ酸で前処置することにより、治療及び予防するために使用する
ことができる。
【０２７６】結語 前述の一般的本発明の説明及びその適用を例証している具体的な実施例から、本
発明は多方面かつ広範な成果を有することを示すことができる。本発明は、基本
的に、新規ドウ及びドウ混合物、かつ新規ドウの新規製造法並びにダウ及び焙焼
製品の品質を改善するための方法、更にはシリアル製品中の酵素インヒビターを
失活する新規方法を提供する。本発明は更に、動物毒素の生体活性及び不活性を
変更し、かついくつかのアレルゲン、すなわち花粉及び食物、いわゆる小麦、卵
、牛乳、乳漿、大豆、ナッツ及び牛肉のアレルゲン誘発性を消失又は減少するた
めの新規方法を提供する。本発明は更に、花粉並びに食物、特に牛乳、乳漿及び
それらの製品並びに小麦製品のアレルゲンのタンパク質分解性及び消化性を増大
する方法を提供する。加えて本発明は、プルラナーゼインヒビターである新規タ
ンパク質及びその失活法を提供する。
【０２７７】 本発明はその特定の具体的な実施態様に関連して説明されているが、本発明が属
する分野の業者に明らかであるような様々な変更も、添付された「特許請求の範
囲」で定義された本発明の範囲内であることは理解されなければならない。
【図面の簡単な説明】
【図１】 還元型チオレドキシンで大豆アレルゲン抽出物を処理することによる大豆アレ
ルゲンに対する皮膚試験応答の緩和を示す棒グラフである。
【図２】 還元型チオレドキシンでミルクアレルゲン抽出物を処理することによるミルク
アレルゲンに対する皮膚試験応答の緩和を示す棒グラフである。
【図３】 還元型チオレドキシンでコムギアレルゲン抽出物を処理することによるコムギ
アレルゲンに対する皮膚試験応答の緩和を示す棒グラフである。
【図４】 還元型チオレドキシンで牛肉アレルゲン抽出物を室温で処理することによる牛
肉アレルゲンに対する皮膚試験応答の緩和を示す棒グラフである。
【図５】 還元型チオレドキシンで牛肉アレルゲン抽出物を37℃で処理することによる牛
肉アレルゲンに対する皮膚試験応答の緩和を示す棒グラフである。
【図６】 還元型チオレドキシンで食餌を処理することによる大豆とコムギに対する消化
管アレルゲン性応答の緩和を示す棒グラフである。
【図７】 蛍光及びタンパク質染色を用いたチオレドキシン連結還元とグルタレドキシン
連結還元の範囲を示すＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動ゲルの写真である。
【図８】 ジスルフィド架橋及び遊離スルフヒドリル基を示す酸化型ウシβ-ラクトグロ
ブリンの三次構造の図である。
【図９】 チオレドキシン連結還元のウシβ-ラクトグロブリンのペプシン消化に及ぼす
効果を示す染色タンパク質のＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動ゲルの写真であ
る。
【図１０Ａ】 未処理ミルクの消化に及ぼす時間の効果を示す染色タンパク質のＳＤＳポリア
クリルアミド電気泳動ゲルの写真を示す。
【図１０Ｂ】 55℃で起こったチオレドキシン連結還元後のミルクの消化に及ぼす時間の効果
を示す染色タンパク質のＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動ゲルの写真を示す。
【図１０Ｃ】 ４℃で起こったチオレドキシン連結還元後のミルクの消化に及ぼす時間の効果
を示す染色タンパク質のＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動ゲルの写真を示す。
【図１１Ａ】 高度にミルクに感受性のイヌの皮膚試験応答のチオレドキシン連結緩和を示す
棒グラフである。
【図１１Ｂ】 中程度にミルクに感受性のイヌの皮膚試験応答のチオレドキシン連結緩和を示
す棒グラフである。
【図１２Ａ】 β-ラクトグロブリンのアレルゲン性に及ぼすチオレドキシン連結還元と消化
性の効果を示す棒グラフである。
【図１２Ｂ】 ミルクのアレルゲン性に及ぼすチオレドキシン連結還元と消化性の効果を示す
棒グラフである。
【図１３】 マウス抗体（MAb）エピトープを示す酸化型ウシβ-ラクトグロブリンの三次構
造の図である。
【図１４】 シスチン突然変異誘発後の予想モノクロナール抗体エピトープ変化を示すウシ
β-ラクトグロブリンの三次構造のコンピュータ生成分子モデルのグラフである
。
【図１５】 蛍光を用いたブタクサ花粉アレルゲンのチオレドキシン連結還元とグルタレド
キシン連結還元の範囲を示すＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動ゲルの写真であ
る。
【図１６Ａ】 未処理のブタクサアレルゲンAmb ｔ Vの消化に及ぼす時間の効果を示す染色タ
ンパク質のＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動ゲルの写真である。
【図１６Ｂ】 チオレドキシン連結還元後のブタクサアレルゲンAmb ｔ Vの消化に及ぼす時間
の効果を示す染色タンパク質のＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動ゲルの写真で
ある。
【図１７Ａ】 ジスルフィド結合含有タンパク質に対して感受性のイヌの巨大ブタクサ花粉抽
出物のアレルゲン性に及ぼすチオレドキシン連結還元とペプシン消化性の効果を
示す棒グラフである。
【図１７Ｂ】 ジスルフィド結合含有タンパク質に対して感受性が弱いイヌの巨大ブタクサ花
粉抽出物のアレルゲン性に及ぼすチオレドキシン連結還元とペプシン消化性の効
果を示す棒グラフである。
【図１８Ａ】 ４℃で起こったチオレドキシン連結還元後のブタクサ花粉の消化に及ぼす時間
の効果を示す染色タンパク質のＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動ゲルの写真で
ある。
【図１８Ｂ】 37℃及び55℃におけるチオレドキシン連結還元後のブタクサ花粉の消化に及ぼ
す時間の効果を示す染色タンパク質のＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動ゲルの
写真である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ， ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，Ｓ Ｌ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 デル ヴァル グレゴリオ アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94530 エル セリート シュミッド レ ーン 6612 ナンバー ４ (72)発明者 ロサーノ ロサ エム スペイン エー28937 モストレス オリ ヴォス デ ペニャーネヴァダ ５−８ アー (72)発明者 ウォン ヨシュア エイチ アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94080 サウス サン フランシスコ ビ ューモント テラス ９ (72)発明者 イー ボイオン シー アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94598 ウォルナット クリーク プリム ローズ レーン 3215 (72)発明者 フリック オスカー エル アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94117 サン フランシスコ パーナサス アベニュー 370 Ｆターム(参考） 4B063 QA01 QQ79 QR02 QR65 QX02 4C084 AA02 AA06 AA07 BA44 CA13 DA58 NA14 ZB132 4C085 AA02 BB04 CC21 DD01 DD02 DD58 4H045 AA10 AA20 AA30 BA32 CA31 DA86 EA22 FA70 【要約の続き】 た際に発生する動物のアレルギー反応を、減弱又は消失 するための有効かつ安全免疫療法剤である。

Claims (25)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 チオレドキシン、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリ
    ン酸-チオレドキシンレダクターゼ(NTR)及び還元型ニコチンアミドアデニンジヌ
    クレオチドリン酸(NADPH)で処理された、低−アレルゲン性花粉タンパク質。
  2. 【請求項２】 タンパク質がAmb t Vである、請求項１記載の低−アレルゲ
    ン性タンパク質。
  3. 【請求項３】 純粋なタンパク質1g当たりチオレドキシンが約0.01mg〜24mg
    、NTRが約0.01mg〜48mg、及びNADPHが約1.0μmole〜2,500μmoleの量である、請
    求項１記載のタンパク質。
  4. 【請求項４】 チオレドキシン、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリ
    ン酸-チオレドキシンレダクターゼ(NTR)及び還元型ニコチンアミドアデニンジヌ
    クレオチドリン酸(NADPH)で処理されている、還元された花粉タンパク質抽出物
    。
  5. 【請求項５】 抽出物がジャイアントブタクサの花粉タンパク質の抽出物で
    ある、請求項１記載の花粉タンパク質抽出物。
  6. 【請求項６】 花粉タンパク質1.0g当たりチオレドキシンが約0.01mg〜6.0m
    g、NTRが約0.01mg〜8.0mg、及びNADPHが約1.0μmole〜500μmoleの量である、請
    求項４記載の還元された花粉タンパク質抽出物。
  7. 【請求項７】 チオレドキシン、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリ
    ン酸-チオレドキシンレダクターゼ(NTR)及び還元型ニコチンアミドアデニンジヌ
    クレオチドリン酸(NADPH)で処理された、摂取可能な花粉タンパク質。
  8. 【請求項８】 タンパク質がAmb t Vである、請求項７記載の摂取可能な花
    粉タンパク質。
  9. 【請求項９】 チオレドキシン、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリ
    ン酸-チオレドキシンレダクターゼ(NTR)及び還元型ニコチンアミドアデニンジヌ
    クレオチドリン酸(NADPH)で処理される、摂取可能な花粉抽出物。
  10. 【請求項１０】 チオレドキシン、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
    リン酸-チオレドキシンレダクターゼ(NTR)及び還元されたニコチンアミドアデニ
    ンジヌクレオチドリン酸(NADPH)で処理されたタンパク質を含む、低−アレルゲ
    ン性タンパク質。
  11. 【請求項１１】 前記花粉タンパク質にアレルギー性の動物のアレルギー反
    応を減弱又は消失する免疫療法のための還元された花粉タンパク質の用途であり
    、この還元された花粉タンパク質が、有効量のチオレドキシン、ニコチンアミド
    アデニンジヌクレオチドリン酸-チオレドキシンレダクターゼ(NTR)及び還元型ニ
    コチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(NADPH)により還元されているよう
    な用途。
  12. 【請求項１２】 下記の工程を含む、花粉タンパク質の消化性を増大する方
    法： (a)該花粉タンパク質を、該タンパク質の消化性の増大に有効な量のチオレド
    キシン、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸-チオレドキシンレダク
    ターゼ(NTR)及び還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(NADPH)で
    処理する工程；及び (b) 工程(a)で処理したタンパク質を動物に投与し、これにより該動物により
    示された症状により測定されるそのタンパク質の消化性が対照と比較して増大す
    る工程。
  13. 【請求項１３】 タンパク質1g当たりチオレドキシンが約0.1mg〜6.0mg、NT
    Rが約0.01mg〜8.0mg、及びNADPHが約1.0μmole〜500μmoleの量である、請求項1
    2記載の方法。
  14. 【請求項１４】 タンパク質1g当たりチオレドキシンが約0.1mg〜4.0mg、N
    TRが約0.1mg〜7.0mg、及びNADPHが約25μmole〜500μmoleの量である、請求項12
    記載の方法。
  15. 【請求項１５】 タンパク質1g当たりチオレドキシンが約0.01mg、NTRが約0
    .01mg、及びNADPHが約1.0μmoleの量である、請求項12記載の方法。
  16. 【請求項１６】 前記タンパク質が花粉タンパク質である、請求項12記載の
    方法。
  17. 【請求項１７】 前記花粉タンパク質がAmb t Vである、請求項16記載の方
    法。
  18. 【請求項１８】 下記の工程を含む、特定量のジスルフィド結合を有する特
    異的アレルゲンタンパク質に対する動物のアレルゲン誘発性を低下する方法： (a) 該タンパク質を、チオレドキシン、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチ
    ドリン酸チオレドキシンレダクターゼ(NTR)及び還元型ニコチンアミドアデニン
    ジヌクレオチドリン酸(NADPH)で処理することにより、該特異的タンパク質中の
    ジスルフィド結合を減少する工程；及び (b) 工程(a)のタンパク質を該アレルギー性動物に、ある期間にわたって間欠
    的に増量する免疫療法的投与量で投与し、該タンパク質の投与が、該特異的アレ
    ルゲンタンパク質のこの特定量に対する該動物のアレルギー反応の減弱又は消失
    に有効である方法。
  19. 【請求項１９】 タンパク質1g当たりチオレドキシンが約0.01mg〜6.0mg、N
    TRが約0.01mg〜8.0mg、及びNADPHが約1.0μmole〜500μmoleの量である、請求項
    18記載の方法。
  20. 【請求項２０】 タンパク質1g当たりチオレドキシンが約0.1mg〜4.0mg、NT
    Rが約0.1mg〜7.0mg、及びNADPHが約25μmole〜500μmoleの量である、請求項18
    記載の方法。
  21. 【請求項２１】 タンパク質1g当たりチオレドキシンが約0.01mg、NTRが約0
    .01mg、及びNADPHが約1.0μmoleの量である、請求項18記載の方法。
  22. 【請求項２２】 前記タンパク質が花粉タンパク質である、請求項18記載の
    方法。
  23. 【請求項２３】 前記花粉タンパク質がAmb t Vである、請求項22記載の方
    法。
  24. 【請求項２４】 下記の工程を含む、特定のアレルゲンタンパク質中のジス
    ルフィド結合の存在を測定する方法： (a)該アレルゲンタンパク質を、タンパク質ジスルフィド結合を還元するのに
    有効な量のチオレドキシン、NADPH及びNTRと共にインキュベーションする工程；
    及び (b)工程(a)においてインキュベーションされたタンパク質を、ジスルフィド結
    合還元について分析する工程。
  25. 【請求項２５】 下記の工程を含む、ジスルフィド結合を有する花粉タンパ
    ク質のアレルゲン誘発性を減弱する方法： (a)該花粉タンパク質を、該タンパク質のジスルフィド結合を還元するのに有
    効な量のチオレドキシン、NADPH及びNTRと共にインキュベーションする工程；及
    び、 (b)工程(a)においてインキュベーションされたタンパク質を、動物に投与し、
    これにより該動物により示されたアレルギー症状により測定されるそのタンパク
    質のアレルゲン誘発性を対照と比較して減少する工程。
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