JP2002540440A - エナンチオ選択性を決定するための高スループットスクリーニング法 - Google Patents

エナンチオ選択性を決定するための高スループットスクリーニング法

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JP2002540440A JP2000608782A JP2000608782A JP2002540440A JP 2002540440 A JP2002540440 A JP 2002540440A JP 2000608782 A JP2000608782 A JP 2000608782A JP 2000608782 A JP2000608782 A JP 2000608782A JP 2002540440 A JP2002540440 A JP 2002540440A
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、動力学的ラセミ化合物分割およびエナンチオトピック基を有するプロキラル化合物の不斉反応のエナンチオ選択性を決定する方法に関する。本発明の方法によると、同位体基質を同位体特異的検出系、例えば、ＥＳＩ質量分析計が反応生成物の量を決定できるような方法で使用される。該方法は、自動化サンプリングと組み合わせることができ、よって、高スループットスクリーニングに使用できる。該過程に関連するエナンチオ選択的物質変換は、キラル均一または不均一触媒、生体触媒または化学量論量の光学活性試薬によって誘導されることができる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （技術分野） 本発明は、反応生成物を同位体特異的検出系、例えば、ＥＳＩ質量分析計で定
量的に決定できるように、同位体標識された基質を用いることによって、動力学
的光学分割過程およびエナンチオトピック基を有するプロキラル化合物の不斉に
進行する反応のエナンチオ選択性を決定する方法に関する。自動化試料充填と連
結して、該方法は高スループットスクリーニングに用いることができる。関連す
るエナンチオ選択的変換は、キラル均一または不均一触媒、生体触媒または化学
量論量の光学活性試薬によって誘導することができる。
【０００２】 （背景技術） コンビナトリアル化学の方法によるキラル化学触媒の広範囲のライブラリーを
作成するため［ａ）G. Liu, J.A. Ellman, J. Org. Chem. 1995, 60, 7712-7713
; b) K. Burgess, H.-J. Lim, A.M. Porte, G.A. Sulikowski, Angew. Chem. 19
96, 108, 192-194; Angew. Chem. Int., Ed. Engl. 1996, 35, 220-222; c) B.M
. Cole, K.D. Shimizu, C.A. Krueger, J.P.A.Harrity, M.L. Snapper, A.H. Ho
veyda, Angew. Chem. 1996, 108, 1776-1779; Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 19
96, 35, 1668-1671; d) C. Gennari, H.P. Nestler, U. Piarulli, B. Salom, L
iebigs, Ann./Recl. 1997, 637-647］またはイン・ビトロ進化によるエナンチオ
選択的生体触媒のライブラリーの調製のため（M.T. Reetz, A. Zonta, K. Schim
ossek, K. Liebeton, K.-E. Jaeger, Angew. Chem. 1997, 109, 2961-2963; Ang
ew. Chem., Int. Ed. Engl. 1997, 36, 2830-2932）の有効な方法の開発は、現
在、研究中である。これらの新規なテクノロジーの成功の重大な態様は、各触媒
ライブラリーからエナンチオ選択的触媒または生体触媒をスクリーニングするた
めの有効かつ迅速な方法の存在である。生物学的に活性な化合物の大きなライブ
ラリーをスクリーニングするための多くの有効な方法が、活性物質のコンビナト
リアル化学において利用可能であるが［a) F. Balkenhohl, C. von dem Bussche
-Huennefeld, A. Lansky, C. Zechel, Angew. Chem. 1996, 108, 2436-2488; An
gew. Chem., Int. Ed. Engl. 1996, 35, 2288-2337; b) J.S. Fuechtel, G. Jun
g, Angew. Chem. 1996, 108, 19-46; Angew. Chem., Int. Ed. Engl. 1996, 35,
17-42; c) Chem. Rev. 1997, 97 (2), 347-510（コンビナトリアル化学に関す
る特別版）；d) S.R. Wilson, A.W. Czarnick, Combinatorial Chemistry: Synt
hesis and Application, Wiley, New York, 1997］、エナンチオ選択的触媒、生
体触媒または光学活性試薬の高スループットスクリーニングのための方法の開発
は、まだ初期段階である。立体選択的変換の生成物のエナンチオマー過剰率（ｅ
ｅ）の決定は、通常、キラルな固定相上のガスまたは液体クロマトグラフィーに
よって古典的に行われる（G. Schomburg, Gaschromatographie: Grundlagen, Pr
axis, Kapillartechnik, 2nd Ed., VCH, Weinheim, 1987; K.K. Unger, Packing
s and stationary phases in chromatographic technique, Series Chromatogra
phic science; Vol. 47, Marcel Dekker, New York, 1990）。それにより正確な
ｅｅ値を決定できるが、かかる従来法は、分析に必要な時間が各保持時間に依存
するので、単位時間あたり限られた数の試料しか試験することができないという
欠点を有する。
【０００３】 近年、この種の分析上の問題を解決するための第一の提案がなされた。したが
って、例えば、エナンチオ選択的リパーゼのイン・ビトロ進化における研究の範
囲において、それによってキラルなカルボン酸エステルのエナンチオ選択的加水
分解の推移を決定できる比較的粗野な試験方法が開発された（M.T. Reetz, A. Z
onta, K. Schimossek, K. Liebeton, K.-E. Jaeger, Angew. Chem. 1997, 109,
2961-2963; Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1997, 36, 2830-2932）。したがって
、リパーゼ変異体によって触媒される（Ｒ）−および（Ｓ）−配置のカルボン酸
ｐ−ニトロフェノールエステルの加水分解の時間的推移は、ミクロタイトレーシ
ョンプレート上で分光光度計によってモニターされ、それにより、最もエナンチ
オ選択的な変異体を迅速に同定できる。該方法は、正確なｅｅ値が求められない
という事実に加えて、キラルなカルボン酸の種類の物質に限定される。同じこと
が関連する試験方法に適用される（L.E. Janes, R.J. Kazlauskas, J. Org. Che
m. 1997, 62, 4560-4561）。また、この限定は、エステル加水分解の間のｐＨ指
示薬の色の変化に基づく関連方法にも適用される（L.E. Janes, A.C. Loewendah
l, R.J. Kazlauskas, Chem. -Eur. J. 1998, 4, 2324-2331）。キラル触媒の同
定のための全体として異なるアプローチは、赤外線サーモグラフィーに基づいて
いる（M.T. Reetz, M.H. Becker, K.M.Kuehling, A. Holzwarth, Angew. Chem.
1998, 110, 2792-2795; Angew. Chem., Int. Ed. 1998, 37, 2547-2650）。しか
しながら、エナンチオ選択的反応の定量分析を可能にするためのこの方法のさら
なる開発はまだ、するべきことが残っている。
【０００４】 （発明の開示） 本発明は、部分的または完全に同位体標識された基質または天然の分布を逸脱
する同位体分布を有する基質を動力学的光学分割過程またはエナンチオトピック
基を含有するプロキラルな基質との立体選択的反応に用いることによって、これ
らの欠点を改善する。これは、擬似エナンチオマーの変換または相対的割合ある
いはエナンチオマー過剰率の定量的決定のための同位体特異的検出系、例えば、
質量分析イオン化法の使用を可能にする。
【０００５】 以前のアプローチと比べて、本発明は下記の利益を提供する。 １）動力学的光学分割過程およびエナンチオトピック基を有するプロキラル化
合物の不斉に進行する変換のｅｅ値の正確な決定。物質の種類または反応型に関
して制限されることはない。 ２）１）に記載の反応の下での変換の正確な決定。 ３）１）および２）に記載のデータの下での迅速かつ高スループット試験。特
に、一日に少なくとも１０００個の決定が可能である。
【０００６】 本発明に用いられる検出系は質量分析計であり、特に、エレクトロスプレーイ
オン化（ＥＳＩ）［J.B. Fenn, M. Mann, C.K. Meng, S.F. Wong, C.M. Whiteho
use, Science (Washington, DC) 1989, 246, 64-71］またはマトリックス添加レ
ーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）［a) K. Tanaka, H. Waki, Y. Ido, S. Ak
ita, Y. Yoshida, T. Yoshida, Rapid Commun. Mass Spectrom. 1988, 2, 151-1
53; b) M. Karas, F. Hillenkamp, Anal. Chem. 1988, 60, 2299-2301］を用い
る。本発明の方法は、自動化試料充填と連結して（１以上の試料充填ロボットお
よびミクロタイトレーションプレートの使用）、必要ならばいくつかの質量分析
計の使用下で、高スループットスクリーニング法として適当である。
【０００７】 該方法は、不斉に進行する反応のためのキラル触媒またはキラル試薬を見出す
ため、または最適化するために使用できる。これらは、 ａ）アルコール、カルボン酸、カルボン酸エステル、アミン、アミド、オレフ
ィン、アルキン、ホスフィン、ホスホナイト、亜リン酸塩、リン酸塩、ハロゲン
化物、オキシラン、チオール、硫化物、スルホン、スルホキシド、スルホンアミ
ドおよびそれらの誘導体の動力学的光学分割のためのキラル触媒またはキラル試
薬； ｂ）そのエナンチオトピック基がアルコール、カルボン酸、カルボン酸エステ
ル、アミン、アミド、オレフィン、アルキン、ホスフィン、ホスホナイト、亜リ
ン酸塩、リン酸塩、ハロゲン化物、オキシラン、チオール、硫化物、スルホン、
スルホキシド、スルホンアミドまたはそれらの誘導体のクラスからの１以上の官
能基を包含するプロキラル化合物の立体選択的変換のためのキラル触媒（例えば
、キラル均一またはキラルに修飾された不均一触媒、キラル金属錯体）またはキ
ラル試薬； ｃ）アルコール、カルボン酸、カルボン酸エステル、アミン、アミド、オレフ
ィン、アルキン、ホスフィン、ホスホナイト、亜リン酸塩、リン酸塩、ハロゲン
化物、オキシラン、チオール、硫化物、スルホン、スルホキシド、スルホンアミ
ドおよびそれらの誘導体の動力学的光学分割のための、およびそのエナンチオト
ピック基がアルコール、カルボン酸、カルボン酸エステル、アミン、アミド、オ
レフィン、アルキン、ホスフィン、ホスホナイト、亜リン酸塩、リン酸塩、ハロ
ゲン化物、オキシラン、チオール、硫化物、スルホン、スルホキシド、スルホン
アミドまたはそれらの誘導体の物質のクラスからの１以上の官能基を包含するプ
ロキラル化合物の立体選択的変換のための生体触媒、例えば、酵素、抗体、蛋白
質、ホルモン、ファージ、リボザイム、ペプチドまたは他のバイオポリマー を包含する。
【０００８】 本発明の基礎をなす原理は、スキーム１に示されるように、擬似エナンチオマ
ーまたは擬似プロキラル化合物の形態における同位体標識した基質の使用に基づ
く。
【０００９】 通常のラセミ化合物において１のエナンチオマー形態が同位体標識される場合
、かかる化合物は擬似エナンチオマーと呼ばれる。プロキラルな基質の１のエナ
ンチオトピック基が同位体で標識される場合、該化合物は擬似プロキラル、例え
ば、擬似メソと呼ばれる。どの型のエナンチオ選択的変換が本発明によって検査
または試験されるべきであるかによって、スキーム１におけるケースａ、ケース
ｂ、ケースｃおよびケースｄのような異なる状況が関連する。いずれかのキラル
化合物の動力学的光学分割過程において、絶対的配置および官能基における同位
体標識ＦＧ＊が異なる１および２を光学的に純粋な形態で調製し、ラセミ化合物
をシミュレートするために１：１の比率で混合する（スキーム１ａ）。化学反応
が官能基にて起こるエナンチオ選択的変換の後（動力学的光学分割の理想的ケー
スにおいて５０％の変換まで）、真のエナンチオマー３および４が各々、非標識
および標識されたアキラル副産物５および６と一緒に形成する。
【００１０】 質量スペクトルにおける１／２および５／６の強度の比率（準分子イオンのｍ
／ｚ強度）は、エナンチオ選択性（ｅｅ値）および変換の定量的決定を可能にす
る。所望により、内部標準を本発明にしたがって使用してもよい。スキーム１ｂ
に概説されるように、事情により、基質の官能基ではなく、Ｒ２残基に同位体標
識をもたらすことが有利な場合もある。この場合、擬似エナンチオマーの新規な
ペア３／８が生じ（スキーム１ｂ）、エナンチオ選択性および変換は、１／７お
よび３／８の準分子イオンのｍ／ｚ強度を測定することによって、本発明にした
がって確定されている。したがって、どちらの場合も、いわゆる選択性因子（ｓ
またはＥ値）が自動的に利用可能である（H.B. Kagan, J.C. Fiaud in Top. Ste
reochem., Vol. 18 (Eds.: E.L. Eliel, S.H. Wilen), Wiley, New York, 1988,
p. 249-330）。
【００１１】 エナンチオトピック基を有するプロキラルな基質の場合、単一の擬似プロキラ
ル化合物の合成が本発明のスクリーニング系に必要とされる。関連する基質がメ
ソ化合物である場合、試験されるべき立体区別反応は２つのＭＳ−検出可能な擬
似エナンチオマー１０および１１の混合物を生じるので、対応するメソ化合物９
をまず、調製する（スキーム１ｃ）。本発明によると、類似の手法がエナンチオ
トピック基を有する他のプロキラルな基質、例えば、型１２の擬似プロキラル基
質の使用に適用される（スキーム１ｄ）。
【００１２】 スキーム１におけるＦＧ単位は、有機化学の幅広く種々の官能基であってもよ
い。典型的な代表例は、加水分解のような分裂反応の場合、アシルオキシ残基（
−ＯＣ（Ｏ）Ｒ）、チオアシルオキシ残基（−ＳＣ（Ｏ）Ｒ）、アミド残基（−
ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ）、カルボキシ残基（−ＣＯ２Ｒ）であり、さらに、アシル化ま
たはエステル化のような結合形成反応の場合、ヒドロキシ残基（−ＯＨ）、チオ
ール残基（−ＳＨ）、アミノ残基（−ＮＨ２または−ＮＨＲ）またはカルボキシ
残基（−ＣＯ２Ｈ）である。
【００１３】 スキーム１は、単に、本発明の方法を説明または記載するためのものであり、
いかなる方法においてもそれを制限するものではない。むしろ、基質が動力学的
光学分割において天然にキラルであるか、またはそれらがプロキラルであって、
エナンチオトピック基を含有するかぎり、いずれの種類の基質およびいずれの型
の反応も可能である。
【００１４】 高い試料スループットを確実にするために、本発明は、スキーム２における例
示的方法において概要されるような器具の設計を提供する。市販の装置または装
置の部品のこの組み合わせにより、１日あたり少なくとも１０００個のｅｅ決定
を±５％の精度で行うことができる。
【００１５】 実施例１． １−フェニルエチルアセテートの動力学的光学分割 例えば、リパーゼ（野生型または変異体）のような酵素によって触媒される１
−フェニルエチルアセテートの加水分解的動力学的光学分割は、高スループット
スクリーニングの範囲内で、スキーム２に記載の構成でモニターされる。すなわ
ち、ｅｅおよび変換決定が行われる。
【００１６】
【化１】
【００１７】 （１Ｓ）−１−フェニルエチルアセテート（１５）の合成： 空気および水分を排除した２５ｍｌの窒素パージしたフラスコ中において、８
．２８ミリモル（１．０１ｇ、１．００ｍｌ）の（Ｓ）−１−フェニルエタノー
ル（Fluka, ９９％ｅｅ）、１２．４ミリモル（１．５０当量、９８３ｍｇ、１
．００ｍｌ）のピリジンおよび１５ｍｌのジクロロメタンを充填し、０℃に冷却
する（氷浴）。攪拌しながら、１０．８ミリモル（１．３０当量、１．１０ｇ、
１．０２ミリモル）の無水酢酸を１０分にわたって滴下する。１２時間以内に、
混合物を室温に加温し、２０ｍｌの１Ｍ塩酸水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム溶
液および飽和塩化ナトリウム溶液を用いて各２回、連続的に抽出する。有機相を
硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過によって乾燥剤から分離し、回転式蒸発器中に
おいて溶媒を除去する。粗生成物をシリカゲルに付し、クロマトグラフィー（移
動溶媒： ヘキサン：酢酸エチル＝９：１）によって精製する。生成物フラクシ
ョンを合わせ、回転式蒸発器において溶媒を除去する。オイルポンプ真空中で乾
燥後、透明の液体が残存する（１．２５ｇ、７．６２ミリモル、９２％）。 分析：1H-NMR (CDCl3, 200 MHz): δ=1.52 (d) 3J=6.6 Hz [3H], 2.06 (s) [3H]
, 5.94 (q) 3J=6.6 Hz [1H], 7.24-7.38 (m) [5H]; 13C-{1H}-NMR (CDCl3, 50 M
Hz): δ=21.4 (s), 22.2 (s), 72.3 (s), 126.1 (s), 127.9 (s), 128.5 (s), 1
41.7 (s), 170.3 (s); MS (EI, 70 eV, 陽イオン）: m/z (%相対強度）：164 (2
5) [M+], 122 (77), 107 (36), 105 (69), 104 (100), 103 (24), 79 (27), 78
(27), 77 (43), 51 (24), 43 (90); EA: C: 72.95% (計算値73.15%), H: 7.28%
(計算値7.37%); GC (Hewlett Packard 5890, 25m 溶融シリカ, 0.25内径，２，
６−ジメチル−３−フェニル−β−ＣＤ（９５％メチル−／５％フェニルポリシ
ロキサン），FID, ８０℃，４℃ 分−１，１２０℃ ０．２分イソ，０．６３バ
ール水素）：９９．８％ｅｅ
【００１８】 （１Ｒ）−１−フェニルエチルトリジュウテロアセテート（１６）の合成： 空気および水分を排除した２５ｍｌの窒素パージしたフラスコ中において、８
．２８ミリモル（１．０１ｇ、１．００ｍｌ）の（Ｒ）−１−フェニルエタノー
ル（Fluka, ９９％ｅｅ）、１２．４ミリモル（１．５０当量、９８３ｍｇ、１
．００ｍｌ）のピリジンおよび１５ｍｌのジクロロメタンを充填し、０℃に冷却
する（氷浴）。攪拌しながら、１０．８ミリモル（１．３当量、１．１６ｇ、１
．０２ミリモル）のｄ６−無水酢酸（９９原子％のＤ、Aldrich）を１０分にわ
たって滴下する。１２時間以内に、混合物を室温に加温し、２０ｍｌの１Ｍ塩酸
水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム溶液および飽和塩化ナトリウム溶液を用いて各
々２回、連続的に抽出する。有機相を硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過によって
乾燥剤から分離し、回転式蒸発器中において溶媒を除去する。粗生成物をシリカ
ゲルに付し、クロマトグラフィー（移動溶媒： ヘキサン：酢酸エチル＝９：１
）によって精製する。生成物フラクションを合わせ、回転式蒸発器中において溶
媒を除去する。オイルポンプ真空中で乾燥後、透明の液体が残存する（１．２８
ｇ、７．６５ミリモル、９２％）。 分析：1H-NMR (CDCl3, 200 MHz): δ=1.53 (d) 3J=6.6 Hz [3H], 5.88 (q) 3J=6
.6 Hz [1H], 7.24-7.36 (m) [5H]; 13C-{1H}-NMR (CDCl3, 50 MHz): δ=22.2 (s
), 72.3 (s), 126.1 (s), 127.7 (s), 128.5 (s), 141.7 (s), 170.3 (s); MS (
EI, 70 eV, 陽イオン）: m/z (%相対強度）：167 (24) [M+], 123 (77), 108 (3
9), 105 (67), 104 (100), 103 (25), 78 (27), 77 (35), 51 (19), 46 (65), 4
3 (14); EA: C: 71.77% (計算値71.83%), H+D: 6.98% (計算値7.23%); GC (Hewl
ett Packard 5890, 25m 溶融シリカ, 0.25内径，２，６−ジメチル−３−フェニ
ル−β−ＣＤ（９５％メチル−／５％フェニルポリシロキサン），FID, ８０℃
，４℃ 分−１，１２０℃ ０．２分イソ，０．６３バール水素）：９９．８％
ｅｅ
【００１９】 予備実験において、擬似エナンチオマー１５および１６を異なる割合で混合し
た。得られた混合物をまず、キラル固相上における従来のガスクロマトグラフィ
ーによって試験して、擬似ｅｅ値を確定した。次いで、同じ試料をＥＳＩ−ＭＳ
によって試験した。典型的なＥＳＩ質量スペクトルを図１に示す。２セットのデ
ータ間の比較は、±５％以内の一致を示す（表１）。
【００２０】
【表１】
【００２１】 次いで、擬似エナンチオマー１５／１６の１：１混合物をミクロタイトレーシ
ョンプレート上で異なるリパーゼ（野生型および変異体、例えば、P. aeruginos
a由来）を用いて加水分解し、スキーム２に記載のスクリーニング系を用いてエ
ナンチオ選択性および変換について試験した。一日あたり約１０００個の正確な
ｅｅ決定を行うことができた。詳細には、ＣＨ３ＯＨ中における１５および１６
の１ｍＭ １：１混合物１０μｌをＥＳＩ−ＭＳ系のレオダイン（RheodyneR）バ
ルブ中に注入した（ＥＳＩ−ＭＳ条件：六重極イオン誘導を有するHP 59987A AP
Iエレクトロスプレー源II（Analytica of Branford）およびケモステーション（
ChemoStationR）を装備したHP 5989B MSエンジン四重極質量分析計（Engine Qua
drupole Mass Spectrometer）；データ記録：陽イオンモードにおけるスキャン
スペクトル；ｍ／ｚ９０−３００；０．１ｍ／ｚ段階において、単位分割、ガウ
スのマスフィルターｍ／ｚ０．３分；ガウスの時間フィルター０．０５分；ＡＰ
Ｉ源条件：スプレー針と第一電極間の電位差：−５２５０Ｖ、Ｎ２ネブライザー
ガスの圧力：８０ｐｓｉ、Ｎ２乾燥ガスの流速約９１分−１（１５０℃）、溶媒
流速０．０６ｍｌ分−１、ＣＨ３ＯＨ：Ｈ２Ｏ＝８：２）。約２０−３０個のＥ
ＳＩ質量スペクトルを合計し、１５と１６の割合を対応するナトリウム付加物の
シグナルの絶対強度によって決定した（［１５＋Ｎａ］＋および［１６＋Ｎａ］ ＋ 、図１）。シグナルの比率（およびしたがって、１５および１６の合成混合物
のｅｅ値）を自動的に、マクロ命令を用いて個々の測定値のｍ／ｚ強度リストか
らエクセル（ExcelR)表中に移動させた。
【００２２】 実施例２． ２−フェニルプロピオン酸の動力学的光学分割 該実施例において、リパーゼで触媒される動力学的光学分割の範囲内での２−
フェニルプロピオン酸のエナンチオ選択的エステル化を記載する。したがって、
擬似エナンチオマー２１／２２を最初に合成した。
【００２３】
【化２】
【００２４】 ２２の合成： （４Ｒ）−ベンジル−３−Ｎ−ベンジルオキシ−２−オキサゾリジン−２−オ
ンの合成： 空気および水分を排除した２５０ｍｌの窒素パージしたフラスコ中において、
２４．０ミリモル（４．５２ｇ）の（４Ｒ）−ベンジルオキサゾリジン−２−オ
ン（Fluka）を８０ｍｌのテトラヒドロフラン中に溶解し、−７８℃に冷却する
（ドライアイス浴）。攪拌しながら、ヘキサン中における２４．０ミリモル（１
．６Ｍ溶液を１５．０ｍｌ）のｎ−ブチルリチウムを１５分にわたって滴下する
。９０分後、新たに蒸留して得たフェニル酢酸塩化物の溶液（２４．０ミリモル
、３．７１ｇ、３．１８ｍｌ）および１０ｍｌのテトラヒドロフランを−７８℃
で１０分にわたって滴下する。滴下完了後、ドライアイス浴を氷浴に置き換える
。０℃で１時間攪拌後、２５ｍｌの飽和塩化アンモニウム溶液の添加によって反
応を止め、次いで、０℃でさらに１時間攪拌する。次いで、反応混合物を２５０
ｍｌフラスコに移し、回転式蒸発器中において有機溶媒を除去する。残渣を６０
ｍｌのジエチルエーテルで３回、各７０ｍｌの１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液、１
Ｍ塩酸水溶液および飽和塩化ナトリウム溶液で２回抽出する。合わせた有機相を
硫酸マグネシウムで乾燥させ、ろ過によって乾燥剤から分離し、回転式蒸発器中
において溶媒を除去する。粗生成物をシリカゲルに付し、クロマトグラフィー（
移動溶媒： ヘキサン：酢酸エチル＝３：１）によって精製する。生成物フラク
ションを合わせ、回転式蒸発器中において溶媒を除去する。オイルポンプ真空中
で乾燥後、透明の液体が残存する（５．８８ｇ、１９．９ミリモル、８３％）。
分析：1H-NMR (CDCl3, 300 MHz): δ=2.67 (dd) 3J=9.5 Hz, 3J=13.4 Hz [1H],
3.27 (dd) 3J=3.3 Hz, 2J=13.4 Hz [1H], 4.14-4.23 (m) [1H], 4.26 (d) 2J=15
.7 Hz [1H], 4.35 (d) 2J=15.7 Hz [1H], 4.65-4.70 (m) [1H], 7.25-7.36 (m)
[10H]; 13C-{1H}-NMR (CDCl3, 75 MHz): δ=37.7 (s), 41.6 (s), 55.3 (s), 66
.1 (s), 127.26 (s), 127.34 (s), 128.3 (s), 128.6 (s), 128.9 (s), 129.4 (
s), 129.8 (s), 130.0 (s), 133.5 (s), 135.1 (s), 153.4 (s), 171.2 (s); MS
(EI, 70 eV, 陽イオン）: m/z (%相対強度）：295 (44) [M+], 178 (6), 119 (
16), 118 (100), 117 (9), 91 (88), 90 (11), 65 (12); EA: C: 73.31% (計算
値73.20%), H: 5.72% (計算値5.80%); N: 4.68% (計算値4.74%)
【００２５】 （４Ｒ）−ベンジル−３−Ｎ−（（２Ｒ）−３，３，３−トリジュウテロ−２
−フェニルプロピオニル）オキサゾリジン−２−オンの合成： 空気および水分を排除した２５０ｍｌの窒素パージしたフラスコ中において、
１８．０ミリモル（３．２９ｇ）のナトリウムヘキサメチルジシラジドを約５０
ｍｌのテトラヒドロフラン中に溶解し、−７８℃に冷却する（ドライアイス浴）
。攪拌しながら、２５ｍｌのテトラヒドロフラン中における１８．０ミリモル（
５．３０ｇ）の（４Ｒ）−ベンジル−３−Ｎ−ベンジルオキシ−２−オキサゾリ
ジン−２−オンの溶液を３０分にわたって滴下する。−７８℃で９０分攪拌後、
９０．０ミリモル（１３．０ｇ、５．６０ｍｌ）のｄ３−ヨウ化メチル（９９原
子％のＤ、Aldrich)および２０ｍｌのテトラヒドロフランの溶液を３０分にわた
って滴下する。攪拌を−７８℃でさらに１２時間続け、次いで、３０ｍｌの飽和
塩化アンモニウム溶液の添加によって反応を止める。室温に加温後、反応混合物
を２５０ｍｌフラスコに移し、回転式蒸発器中において有機溶媒を除去する。残
渣を６０ｍｌのジエチルエーテルで３回抽出する。合わせたエーテル相を各５０
ｍｌの１０％塩酸水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム溶液および飽和塩化水素溶液
で２回抽出する。合わせた有機相を硫酸マグネシウムで乾燥させ、ろ過によって
乾燥剤から分離し、回転式蒸発器中において溶媒を除去する。粗生成物をエーテ
ル／酢酸エチルから再結晶化する。ろ過およびオイルポンプ真空中での乾燥後、
無色固体を得る（４．６７ｇ、１４．９ミリモル、８３％）。 分析：1H-NMR (CDCl3, 300 MHz): δ=2.80 (dd) 3J=9.8 Hz, 2J=13.3 Hz [1H],
3.35 (dd) 3J=3.2 Hz, 2J=13.3 Hz [1H], 4.02-4.13 (m) [2H], 4.55-4.62 (m)
[2H], 5.10 (s) [1H], 7.21-7.38 (m) [10H]; 13C-{1H}-NMR (CDCl3, 75 MHz):
δ=37.9 (s), 42.9 (s), 55.8 (s), 65.9 (s), 127.3 (s), 127.4 (s), 128.1 (
s), 128.7 (s), 129.0 (s), 129.4 (s), 135.3 (s), 140.2 (s), 152.9 (s), 17
4.6; MS (EI, 70 eV, 陽イオン）: m/z (%相対強度）：312 (34) [M+], 135 (10
0), 108 (72), 107 (18), 91 (14); EA: C: 73.16% (計算値73.05%), H+D: 6.00
% (計算値6.13%); N: 4.41% (計算値4.48%)
【００２６】 （２Ｒ）−３，３，３−トリジュウテロ−２−フェニルプロピオン酸（２２）
の合成： ２５０ｍｌの窒素パージしたフラスコ中において、１１．６ミリモル（３．６
４ｇ）の（４Ｒ）−ベンジル−３−Ｎ−（（２Ｒ）−３，３，３−トリジュウテ
ロ−２−フェニルプロピオニル）オキサゾリジン−２−オンを約１００ｍｌのテ
トラヒドロフラン中に溶解し、得られた溶液を０℃に冷却する。１８．０ｍｌの
３０％過酸化水素水溶液中における２３．３ミリモル（９７８ｍｇ）の水酸化リ
チウム一水化物の溶液を攪拌しながら加える。次いで、０℃で１８時間攪拌する
。０℃で２０ｍｌの飽和硫酸ナトリウム溶液を滴下することによって反応を止め
、反応混合物を２５０ｍｌフラスコ中に移し、回転式蒸発器中において有機溶媒
を除去する。残渣を各７０ｍｌのジクロロメタンで３回、抽出する。１０％塩酸
を用いて水相をｐＨ５に酸性化し、次いで、各７０ｍｌのジエチルエーテルで３
回抽出する。合わせたエーテル相を硫酸マグネシウムで乾燥させ、ろ過によって
乾燥剤から分離し、回転式蒸発器中において溶媒を除去する。オイルポンプ真空
中において乾燥後、無色の液体が残存する（８．６０ミリモル、１．３２ｇ、７
４％）。 分析：1H-NMR (CDCl3, 300 MHz): δ=3.72 (s) [1H], 7.24-7.35 (m) [5H], 11.
5 (s) [1H]; 13C-{1H}-NMR (CDCl3, 75 MHz): δ=45.2 (s), 127.4 (s), 127.6
(s), 128.7 (s), 139.7 (s), 180.8 (s); MS (EI, 70 eV, 陽イオン）: m/z (%
相対強度）：153 (24) [M+], 108 (100), 91 (8), 82 (5), 81 (8), 80 (5), 79
(10), 78 (8), 77 (6), 43 (11); EA: C: 70.35% (計算値73.56%), H+D: 6.62%
(計算値6.58%); HPLC (Varian 5560, 固相：250mm キラルOD-H, 4.6mm 内径,
移動相: ｎ−ヘプタン：２−プロパノール：トリフルオロ酢酸＝98:2:0.1, 298K
, 1.2MPa, 0.5ml 分−１，検出：ＵＶ254nm）：９９．４％ｅｅ
【００２７】 いずれかの妨害する二次同位体効果を排除するために、予備実験において擬似
エナンチオマー２１／２２の反応を２１の真のラセミ化合物と比較した。図２の
データは、いずれの本質的な差も示さず、その結果、変換の結果を曲げることの
できる二次動力学的同位体効果を排除できる。 次いで、リパーゼ（野生型および変異体）を用いるスキーム２における構成を
用いて、一日に約１０００個のｅｅおよび変換決定を行った。
【００２８】 実施例３． メソ−１，４−ジアセトキシ−２−シクロペンテンのエナンチオ
選択的加水分解 該実施例は、エナンチオトピック基（この場合、アセトキシ基）を有するプロ
キラル化合物の反応に関する。
【００２９】
【化３】
【００３０】 （１Ｓ，４Ｒ）−シス−１−アセトキシ−４−トリジュウテロアセトキシ−２
−シクロペンテン（２５）の合成： 空気および水分を排除した１００ｍｌの窒素パージしたフラスコ中において、
５．７９ミリモル（８２３ｍｇ）の（１Ｓ，４Ｒ）−シス−４−アセトキシ−２
−シクロペンテン−１−オール（Fluka、９９％ｅｅ）、６．９５ミリモル（１
．２０当量、５５０ｍｇ、０．５６０ｍｌ）のピリジンおよび５０ｍｌのジクロ
ロメタンを充填し、０℃に冷却する（氷浴）。攪拌しながら、６．３６ミリモル
（１．１０当量、６８８ｍｇ、６００μｌ）のｄ６−無水酢酸（９９原子％のＤ
、Aldrich）を１０分にわたって滴下する。１２時間以内に、混合物を室温に加
温し、４０ｍｌの１Ｍ塩酸水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム溶液および飽和塩化
ナトリウム溶液で各２回、連続抽出する。有機相を硫酸マグネシウムで乾燥させ
、ろ過によって乾燥剤から分離し、回転式蒸発器中において溶媒を除去する。粗
生成物をシリカゲルに付し、クロマトグラフィー（移動溶媒： ヘキサン：酢酸
エチル＝３：１）によって精製する。生成物フラクションを合わせ、回転式蒸発
器中において溶媒を除去する。オイルポンプ真空中で乾燥後、透明の液体が残存
する（１．０１ｇ、５．４０ミリモル、９３％）。 分析：1H-NMR (CDCl3, 300 MHz): δ=1.71-1.78 (m) [2H], 2.07 (s) [3H], 2.8
3-2.93 (m) [2H], 5.55 (dd) 3J=3.8 Hz, 2J=7.5 Hz [2H], 6.10 (s) [2H]; 13C
-{1H}-NMR (CDCl3, 75 MHz): δ=21.5 (s), 37.5 (s), 76.9 (s), 135.0 (s), 1
71.1 (s); MS (EI, 70 eV, 陽イオン）: m/z (%相対強度）：128 (9), 127 (3),
125 (9), 124 (3), 84 (17), 83 (81), 82 (82), 81 (16), 55 (6), 54 (24),
46 (100), 43 (92); EA: C: 57.75% (計算値57.74%), H+D: 6.52% (計算値6.46%
)
【００３１】 次いで、予備実験において、不活性リパーゼ変異体（P. aeruginosa変異体）
および活性酵素（ブタ肝臓エステラーゼ、Sigma）を用いる基質２５の加水分解
を試験した。各質量スペクトルを図３ａおよび３ｂに示す。 図３ａのデータは反応の不在を確かにし、一方、図３ｂのデータは７３％のｅ
ｅ値を導く。従来のガスクロマトグラフィーによる独立した分析は、ＥＳＩ−Ｍ
Ｓ分析と非常によく一致して、７３％のｅｅ値をもたらした。次いで、一日あた
り１００個の試料をｅｅ値について分析した。
【００３２】 実施例４． ビスナフチルアセテートのエナンチオ選択的加水分解 該実施例において、擬似エナンチオマー２８および２９の１：１混合物のエナ
ンチオ選択的加水分解を調べた。
【００３３】
【化４】
【００３４】 したがって、擬似エナンチオマー２８および２９を光学的に純粋な形態で調製
した。
【００３５】 （Ｓ，Ｓ）−１，１’−ビスナフチル−２，２’−ジアセテート（２８）の合
成： 空気および水分を排除した５０ｍｌの窒素パージしたフラスコ中において、５
．００ミリモル（１．４３ｇ）の（Ｓ，Ｓ）−１，１’−ビス−２−ナフトール
（＞９９．９％ｅｅ）を２０ｍｌのジクロロメタン中に溶解し、１５．０ミリモ
ル（３．００当量、１．１９ｇ、１．２１ｍｌ）のピリジンと混合し、０℃に冷
却した（氷浴）。攪拌しながら、１２．５ミリモル（２．５０当量、９８５ｍｇ
、８８８μｌ）の塩化アセチルを５分にわたって滴下する。１２時間以内に、混
合物を室温に加温し、２０ｍｌの１Ｍ塩酸水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム溶液
および飽和塩化ナトリウム溶液で各２回、連続抽出する。有機相を硫酸マグネシ
ウムで乾燥させ、ろ過によって乾燥剤から分離し、回転式蒸発器中において溶媒
を除去する。粗生成物をシリカゲルに付し、クロマトグラフィー（移動溶媒：
ヘキサン：酢酸エチル＝７：３）によって精製する。生成物フラクションを合わ
せ、回転式蒸発器中において溶媒を除去する。オイルポンプ真空中で乾燥後、無
色の固体が残存する（１．８８ｇ、４．９９ミリモル、９９％）。 分析：1H-NMR (d6-DMSO, 300 MHz): δ=1.83 (s) [2H], 6.94 (d) J=8.3 Hz [2H
], 7.29-7.34 (m) [2H], 7.48-7.55 (m) [4H], 8.05-8.15 (m) [4H]; 13C-{1H}-
NMR (d6-DMSO, 75 MHz): δ=20.4 (s), 122.4 (s), 122.6 (s), 125.4 (s), 125
.7 (s), 126.8 (s), 128.2 (s), 129.5 (s), 131.0 (s), 132.7 (s), 146.6 (s
), 168.8 (s); MS (EI, 70 eV, 陽イオン）: m/z (%相対強度）：370 (13) [M+]
, 328 (37), 286 (100), 268 (9), 257 (7), 239 (10), 46 (11); IR (KBr): 波
数(cm-1)=3055 (w), 3019 (w), 2936 (w), 1760 (s), 1622 (m), 1595 (m), 150
8 (m), 1472 (m), 1430 (m), 1367 (s), 1215 (s), 1130 (s), 1074 (m), 1012
(m), 813 (m), 761 (m); EA: C: 77.53% (計算値77.82%), H: 4.92% (計算値4.9
0%)
【００３６】 （Ｒ，Ｒ）−１，１’−ビスナフチル−２，２’−ビス（トリジュウテロアセ
テート）（２９）の合成： 空気および水分を排除した５０ｍｌの窒素パージしたフラスコ中において、５
．００ミリモル（１．４３ｇ）の（Ｒ，Ｒ）−１，１’−ビス−２−ナフトール
（＞９９．９％ｅｅ）を２０ｍｌのジクロロメタン中に溶解し、１５．０ミリモ
ル（３．００当量、１．１９ｇ、１．２１ｍｌ）のピリジンと混合し、０℃に冷
却した（氷浴）。攪拌しながら、１２．５ミリモル（２．５０当量、１．０１９
ｇ、８８９μｌ）のｄ３−塩化アセチル（＞９９原子％のＤ、Aldrich）を５分
にわたって滴下する。１２時間以内に、混合物を室温に加温し、２０ｍｌの１Ｍ
塩酸水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム溶液および飽和塩化水素溶液で各２回、連
続抽出する。有機相を硫酸マグネシウムで乾燥させ、ろ過によって乾燥剤から分
離し、回転式蒸発器中において溶媒を除去する。粗生成物をシリカゲルに付し、
クロマトグラフィー（移動溶媒： ヘキサン：酢酸エチル＝７：３）によって精
製する。生成物フラクションを合わせ、回転式蒸発器中において溶媒を除去する
。オイルポンプ真空中で乾燥後、無色の固体が残存する（１．８５ｇ、４．９９
ミリモル、９９％）。 分析：1H-NMR (d6-DMSO, 300 MHz): δ=6.94 (d) J=8.3 Hz, 7.27-.34 (m) [2H]
, 7.48-7.55 (m) [4H], 8.05-8.15 (m) [4H]; 13C-{1H}-NMR (d6-DMSO, 75 MHz)
: δ=20.4 (s), 122.4 (s), 122.6 (s), 125.4 (s), 125.7 (s), 126.8 (s), 12
8.2 (s), 129.5 (s), 131.0 (s), 132.7 (s), 146.6 (s), 168.8 (s); MS (EI,
70 eV, 陽イオン）: m/z (%相対強度）：376 (17) [M+], 332 (41), 288 (100),
268 (6), 259 (5), 240 (5), 46 (11); IR (KBr): 波数(cm-1)=3054 (w), 3019
(w), 2268 (w), 2147 (w), 2092 (w), 1755 (s), 1622 (m), 1595 (m), 1509 (
m), 1471 (m), 1231 (s), 1146 (s), 1075 (s), 1059 (s), 819 (s), 804 (s),
755 (s); EA: C: 76.23% (計算値76.85%), H+D: 4.89% (計算値4.82%)
【００３７】 ｅｅおよび変換決定のための高スループットスクリーニングの範囲内で、スキ
ーム３に記載のような装置の設計が使用された。 さらに、擬似エナンチオマーの１：１混合物を調製し、リパーゼによって触媒
される動力学的光学分割過程の高スループットスクリーニングにおいて使用した
。
【００３８】 したがって、ドイツ連邦共和国ブレーメンのBruker-Franzen Analytik GmbHの
リフレックスＩＩ ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ（マトリックス添加レーザー脱離／
イオン化飛行時間型質量分析計）を用いた。該装置は、Ｎ２レーザー（２６４ｎ
ｍ）および１ＧＨｚデジタイザーを備え付けている。最大４０スペクトルを自動
的に記録し、合計した。 試料調製ロボットを用いて、各試料をマトリックス溶液（ＣＨ３ＯＨ中におけ
る５％トリヒドロキシアセトフェノン溶液）と１：１（ｖ／ｖ）で混合し、ＭＡ
ＬＤＩ標的上にピペットで移した。 図４において、擬似エナンチオマー２８および２９とブタ肝臓エステラーゼ（
Sigma）との反応の選択されたＭＡＬＤＩ質量スペクトルの断片を示す。［２８
＋Ｎａ］＋および［２９＋Ｎａ］＋のシグナル強度から、エナンチオマー過剰率
を決定した（図４ａ：４０％ｅｅ、図４ｂ：５４％ｅｅ）。
【００３９】
【化５】
【００４０】
【化６】
【００４１】
【化７】
【図面の簡単な説明】
【図１】 擬似エナンチオマー１５および１６の混合物のＥＳＩ質量スペク
トルを示す。
【図２】 擬似エナンチオマー２１／２２の反応と２１の真のラセミ化合物
との比較。
【図３】 不活性リパーゼ変異体（ａ）および活性酵素（ｂ）を用いる基質
２５の加水分解を示す質量スペクトル。
【図４】 擬似エナンチオマー２８および２９とブタ肝臓エステラーゼとの
反応の選択されたＭＡＬＤＩ質量スペクトルの断片。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 37/00 １０３ Ｇ０１Ｎ 37/00 １０３ // Ｃ０７Ｍ 5:00 Ｃ０７Ｍ 5:00 (72)発明者 マンフレート・テオドル・レーツ ドイツ連邦共和国デー−45470ミュールハ イム・アン・デア・ルール、カイザー−ビ ルヘルム−プラッツ１番 (72)発明者 ミヒャエル・ハインリッヒ・ベッカー ドイツ連邦共和国デー−45470ミュールハ イム・アン・デア・ルール、カイザー−ビ ルヘルム−プラッツ１番 (72)発明者 デトレフ・シュテッキヒト ドイツ連邦共和国デー−45470ミュールハ イム・アン・デア・ルール、カイザー−ビ ルヘルム−プラッツ１番 (72)発明者 ハインツ−ベルナー・クライン ドイツ連邦共和国デー−45470ミュールハ イム・アン・デア・ルール、カイザー−ビ ルヘルム−プラッツ１番 Ｆターム(参考） 2G042 AA01 BD01 BD04 BD10 BD13 BD15 CA02 CB03 DA06 DA07 FA07 FB02 4B063 QA01 QA18 QQ32 QQ73 QR12 QR41 QR47 QS14 QS17 QS40 QX04 4G069 AA06 AA20 BA27A CB01 CB57 DA05 4H006 AA05 AB91 AC84 【要約の続き】

Claims (14)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 キラルな基質の動力学的光学分割またはエナンチオトピック
    基を有するプロキラルな基質との立体選択的反応の反応生成物である試料のエナ
    ンチオ選択性を決定する方法であって、 ａ）天然の分布から逸脱する同位体分布を有するか、または部分的もしくは完
    全に同位体標識された基質を用い、次いで ｂ）同位体特異的検出系を用いて、擬似エナンチオマーの変換または相対的割
    合あるいはエナンチオマー過剰率を定量的に決定する ことを特徴とする方法。
  2. 【請求項２】 同位体特異的検出系として質量分析イオン化法を用いる請求
    項１記載の方法。
  3. 【請求項３】 試料充填ロボットを用いて一連の試料について定量的決定を
    行う請求項１または２記載の方法。
  4. 【請求項４】 １以上の試料充填ロボットによって、１以上のミクロタイト
    レーションプレートから１以上の質量分析計へ試料を移動させる請求項３記載の
    方法。
  5. 【請求項５】 ＡＰＣＩ（大気圧化学イオン化）、ＣＩ（化学イオン化）、
    ＥＩ（電子イオン化）、ＥＳＩ（エレクトロスプレーイオン化）、ＦＡＢ（高速
    原子衝撃）、ＦＤ（フィールドデソープション）、ＦＩ（フィールドイオン化）
    、ＬＩＬＢＩＤ（レーザー誘起液体ビームイオン化デソープション）、ＬＳＩＭ
    Ｓ（液体二次イオン質量分析）、ＭＡＬＤＩ（マトリックス添加レーザー脱離／
    イオン化）、ＰＢ（粒子ビーム）、ＰＤ（プラズマ脱離）、ＳＩＭＳ（２次イオ
    ン質量分析）またはＴＳＰ（サーモスプレー）あるいはかかるイオン化法の組み
    合わせを質量分析イオン化法として用いる請求項３または４記載の方法。
  6. 【請求項６】 反応を不斉に触媒する触媒を見出すため、または最適化する
    ための請求項１〜５のいずれか１項記載の方法の使用。
  7. 【請求項７】 反応において１のエナンチオマーの豊富をもたらすキラル試
    薬を見出すための請求項１〜５のいずれか１項記載の方法の使用。
  8. 【請求項８】 アルコール、カルボン酸、カルボン酸エステル、アミン、ア
    ミド、オレフィン、アルキン、ホスフィン、ホスホナイト、亜リン酸塩、リン酸
    塩、ハロゲン化物、オキシラン、チオール、硫化物、スルホン、スルホキシド、
    スルホンアミドおよびそれらの誘導体の動力学的光学分割のための触媒を見出す
    ための請求項６記載の使用。
  9. 【請求項９】 エナンチオトピック基がアルコール、カルボン酸、カルボン
    酸エステル、アミン、アミド、オレフィン、アルキン、ホスフィン、ホスホナイ
    ト、亜リン酸塩、リン酸塩、ハロゲン化物、オキシラン、チオール、硫化物、ス
    ルホン、スルホキシド、スルホンアミドまたはそれらの誘導体のクラスからの１
    以上の官能基を包含するプロキラル化合物の立体選択的変換のためのキラル触媒
    または試薬を見出すための請求項６記載の使用。
  10. 【請求項１０】 立体選択的合成の生体触媒を見出すための請求項６記載の
    使用。
  11. 【請求項１１】 生体触媒が酵素、抗体、蛋白質、ホルモン、ファージ、リ
    ボザイム、ペプチドまたは他のバイオポリマーであってもよい請求項１０記載の
    使用。
  12. 【請求項１２】 立体選択的合成のためのキラル均一触媒を見出すための請
    求項６記載の使用。
  13. 【請求項１３】 立体選択的合成のためのキラル金属錯体を見出すための請
    求項６記載の使用。
  14. 【請求項１４】 立体選択的合成のためのキラルに修飾された不均一触媒を
    見出すための請求項６記載の使用。
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