JP2002539834A - 遺伝子発現の改変のための組成物と方法 - Google Patents

遺伝子発現の改変のための組成物と方法

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Abstract

(57)【要約】 新規な単離植物ポリヌクレオチドプロモーター配列が、かかるポリヌクレオチドを含むＤＮＡコンストラクトとともに提供される。かかるコンストラクトを関心のあるＤＮＡ配列の転写を改変するために利用する方法が、かかるコンストラクトを含むトランスジェニック植物とともに開示される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ポリヌクレオチド転写および／または発現の調節に関する。より具
体的には、本発明は、ポリヌクレオチドの転写の開始と駆動を可能にする植物か
ら単離されたポリヌクレオチド調節配列と、かかる調節配列を内在性および／ま
たは異種由来のポリヌクレオチドの転写およびポリペプチドの産生の改変に利用
することに関する。ポリペプチド配列も開示される。
【０００２】
【従来の技術】
発明の背景 遺伝子発現は、部分的には、転写に関与する細胞の過程により調節される。転
写の際、転写されるＤＮＡ配列に相補的な１本鎖ＲＮＡがＲＮＡポリメラーゼの
作用で作られる。真核細胞における転写開始は、転写される遺伝子の上流に位置
し、シス（ｃｉｓ）に作用するＤＮＡモチーフと、トランス（ｔｒａｎｓ）に作
用するタンパク質因子との間の複雑な相互作用により調節される。シスに作用す
る調節領域の中には、ＲＮＡポリメラーゼが直接または間接に最初に結合する、
プロモーターというＤＮＡ配列がある。ここで使用された「プロモーター」とい
う用語は、転写と関係する遺伝子の５’−非翻訳領域で、一般的には転写開始点
を含む領域を指す。エンハンサーのような他のシスに作用するＤＮＡモチーフは
、前記開始点からさらに上流および／または下流に位置する。
【０００３】 プロモーターおよびエンハンサーは、両方とも、いくつかの別々の、しばしば
冗長な、エレメントを含むのが一般的であり、該エレメントのそれぞれは、転写
因子として知られ１以上のトランスに作用する調節タンパク質により認識される
。プロモーターは、近位およびより遠位のエレメントの両方を含むのが一般的で
ある。例えば、調節タンパク質の結合に重要ないわゆるＴＡＴＡボックスは、前
記開始点の上流約２５塩基対にみられるのが一般的である。いわゆるＣＡＡＴボ
ックスは、前記開始点の上流約７５塩基対にみられるのが一般的である。プロモ
ーターは約１００ないし１０００個の間のヌクレオチドを含むのが一般的である
が、より長いプロモーター配列もありうる。
【０００４】 トランスジェニック植物の開発のためには、外来遺伝子の発現を強力に駆動す
る構成的なプロモーターが好ましい。現在、広範に利用され、入手可能な構成的
なプロモーターは、カリフラワーモザイクウィルスに由来するプロモーターだけ
しかない。さらにウイルスプロモーターの利用に関する公衆の理解のために（ｄ
ｕｅ ｔｏ ｐｕｂｌｉｃ ｃｏｎｃｅｐｔｉｏｎｓ）、トランスジェニック食
材植物用に植物由来のプロモーターの必要性がある。裸子植物のプロモーターは
ほとんどクローニングされておらず、被子植物由来のプロモーターは裸子植物で
はうまく機能しないことがわかっている。よって、本発明の技術分野においては
、トランスジェニック植物でのポリヌクレオチドの転写と発現を改変するために
用いる、植物から単離されたポリヌクレオチドプロモーター領域の必要性がある
。
【０００５】 発明の概要 簡潔には、遺伝子発現の調節に関与するユーカリとマツ由来の単離されたポリ
ヌクレオチド調節配列が、かかるポリヌクレオチド調節領域を内在性および／ま
たは異種由来のポリヌクレオチドのトランスジェニック植物での発現の改変に利
用するための方法とともに開示される。特に、本発明は、植物遺伝子の５’非翻
訳領域、すなわちノンコーディング領域由来のポリヌクレオチドプロモーター配
列であって、この配列の支配下に置かれたポリヌクレオチドの転写を開始し調節
する配列を、かかるプロモーター配列を含む単離されたポリヌクレオチドととも
に提供する。
【０００６】 第１の局面では、本発明は、（ａ）配列番号１−１４、２０、２２−６２、８
１−８６および８８−１１２に列挙された配列、（ｂ）配列番号１−１４、２０
、２２−６２、８１−８６および８８−１１２に列挙された配列の相補体、（ｃ
）配列番号１−１４、２０、２２−６２、８１−８６および８８−１１２に列挙
された配列の逆相補体、（ｄ）配列番号１−１４、２０、２２−６２、８１−８
６および８８−１１２に列挙された配列の逆配列、（ｅ）前記（ａ）ないし（ｄ
）の配列に対し以下に定義されたヌクレオチド同一性が４０％、６０％、７５％
、または９０％のいずれかである配列からなるグループから選択されたポリヌク
レオチドを含む単離されたポリヌクレオチド配列と、配列番号１−１４、２０、
２２−６２、８１−８６および８８−１１２に提示された配列に対応するプロー
ブおよびプライマーと、配列番号１−１４、２０、２２−６２、８１−８６およ
び８８−１１２として同定されたいずれかのポリヌクレオチドの少なくとも特定
の数の連続した残基を含むポリヌクレオチドと、配列番号１−１４、２０、２２
−６２、８１−８６および８８−１１２に提示された配列の部分を含む拡張され
た配列を提供し、上記の全てをここでは「本発明のポリヌクレオチド」という。
本発明は、添付した配列表において配列番号６３−８０および８７として同定さ
れた単離ポリペプチド配列と、これらの配列のポリペプチド変異体（ｖａｒｉａ
ｎｔ）と、前記単離ポリペプチド配列およびこれらの配列の変異体を含むポリペ
プチドをも提供する。
【０００７】 別の局面では、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含む遺伝子コンストラ
クトを、単独で、あるいは１以上の追加の本発明のポリヌクレオチドとの組合せ
で、あるいは１以上の既知のポリヌクレオチドとの組合せで、かかるコンストラ
クトを含む細胞および標的生物とともに提供する。
【０００８】 関連した局面では、本発明は、５’から３’の方向に、本発明のポリヌクレオ
チドプロモーター配列と、転写されるポリヌクレオチドと、遺伝子ターミネーシ
ョン配列を含む、遺伝子コンストラクトを提供する。転写されるポリヌクレオチ
ドは、関心のあるポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチドのオープン・
リーディング・フレームを含むものであってもよく、関心のあるポリヌクレオチ
ドのノンコーディング領域すなわち非翻訳領域であってもよい。前記オープン・
リーディング・フレームは、センスまたはアンチセンスのいずれの方向でもよい
。前記遺伝子ターミネーション配列は宿主植物で機能することが好ましい。遺伝
子ターミネーション配列は、関心のある遺伝子のものであることが最も好ましい
が、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔ
ｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）菌のノパリンシンターゼのターミネーター（ｎｏｐａｌ
ｉｎ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）のように本発明の技術分野で
一般的に使用されるその他の配列も本発明に有効に利用できる。遺伝子コンスト
ラクトはさらに形質転換された細胞を同定するためのマーカーを含むこともある
。
【０００９】 さらなる局面では、本発明の遺伝子コンストラクトを含むトランスジェニック
細胞が、植物のような生物であってかかるトランスジェニック細胞とを含む生物
と、かかる植物の果実、種子その他の生産物、由来物あるいは子孫とともに提供
される。本発明のトランスジェニック植物の零余子（むかご、ｐｒｏｐａｇｕｌ
ｅ）も本発明に含まれる。ここで用いられる「零余子」という語は、挿し木を含
めて、有性的あるいは無性的な繁殖または増殖に利用される植物のいかなる部分
をも意味する。
【００１０】 植物の品種、特に植物育成者権による登録が可能な植物の品種は、本発明から
除かれる。植物は、単に、該植物またはその先祖の細胞に導入された外来遺伝子
をゲノム中に安定的に含むからというだけで、「植物品種」とされる必要はない
。
【００１１】 また別の局面では、植物のような標的生物における遺伝子発現を改変するため
の方法であって、該生物のゲノム中に本発明のＤＮＡコンストラクトを安定的に
取り込むことを含む方法が提供される。好ましい実施態様では、標的生物は植物
であり、好ましくは木本植物であり、さらに好ましくはユーカリ属またはマツ属
の種からなるグループから選択され、最も好ましくはＥｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｇ
ｒａｎｄｉｓとＰｉｎｕｓ ｒａｄｉａｔａとからなるグループから選択された
木本植物である。
【００１２】 別の局面では、ポリペプチド発現が改変された、植物のような標的生物を作成
する方法であって、トランスジェニック細胞を用意するために本発明の遺伝子コ
ンストラクトで宿主細胞を形質転換すること、再生と成熟した植物の成長に導く
条件下で前記トランスジェニック細胞を培養することを含む方法が提供される。
【００１３】 他の局面では、所望の機能または表現型の原因遺伝子を同定するための方法で
あって、テストされるポリヌクレオチドを操作可能に連結した本発明のポリヌク
レオチドプロモーター配列を含む遺伝子コンストラクトで植物細胞を形質転換す
ること、該植物細胞を再生と成熟した植物の成長に導く条件下で培養すること、
このトランスジェニック植物の表現型を形質転換されない、すなわち野生型の植
物の表現型と比較することを含む方法が提供される。
【００１４】 またさらなる局面では、本発明はユビキチンをエンコードする単離されたポリ
ヌクレオチドを提供する。特定の実施態様では、単離されたポリヌクレオチドは
、（ａ）配列番号１および３４に列挙された配列、（ｂ）配列番号１および３４
に列挙された配列の相補体、（ｃ）配列番号１および３４に列挙された配列の逆
相補体、（ｄ）配列番号１および３４に列挙された配列の逆配列、（ｅ）前記（
ａ）ないし（ｄ）の配列に対しここに定義されたヌクレオチド同一性が４０％、
６０％、７５％または９０％のいずれかである配列からなるグループから選択さ
れたポリヌクレオチドを含む。かかるポリヌクレオチドにエンコードされるポリ
ペプチドも、かかるポリヌクレオチドを含むＤＮＡコンストラクトおよびかかる
ＤＮＡコンストラクトで形質転換された宿主細胞と例えば植物のようなトランス
ジェニック生物とともに提供される。特定の実施態様では、かかるポリペプチド
は配列番号８０または６７に提供される配列を含む。
【００１５】 またさらなる局面では、本発明は、配列番号２１のＤＮＡ配列、配列番号２１
の相補体、逆相補体または変異体を含む単離されたポリヌクレオチドを、かかる
ポリヌクレオチドを含むＤＮＡコンストラクトおよびかかる配列で形質転換され
た細胞とともに提供する。以下に説明するとおり、配列番号２１の配列を配列番
号２１の配列を含むポリヌクレオチドから除去することは該ポリヌクレオチドの
発現を増強する。逆に、配列番号２１の配列を関心のあるポリヌクレオチドを含
む遺伝子コンストラクトに含めることは、該ポリヌクレオチドの発現を減少させ
る。
【００１６】 以下の詳細な説明を参照することにより、本発明の上記のおよびさらなる特長
およびその入手法は明らかとなり、本発明は最も良く理解される。ここで開示さ
れた全ての参照文献は、引用によりそれらの全体があたかも各々が個別に取り込
まれたかのごとくに取り込まれる。
【００１７】 発明の詳細な説明 本発明は、植物の表現型を操作するのに用いることのできる単離されたポリヌ
クレオチド調節領域を、かかる調節領域を含む単離されたポリヌクレオチドとと
もに提供する。より具体的には、マツとユーカリから単離されたポリヌクレオチ
ドプロモーター配列が開示される。上記のとおり、プロモーターは細胞内の「転
写装置」の構成成分であり、遺伝子発現の調節に関与する。組織特異的および時
間特異的な遺伝子発現パターンの両方とも、植物の正常発生においてプロモータ
ーにより開始され、制御されることが知られている。よって、本発明の単離され
たポリヌクレオチドプロモーター配列は、植物の成長および発生と、環境因子お
よび病原体のような外界からの刺激に対する細胞の応答を改変するために用いる
ことができる。
【００１８】 本発明の方法と材料を用いて、関心のある特定のポリペプチドの量を、本発明
のプロモーター配列に操作可能に連結された前記ポリペプチドをエンコードする
遺伝子の追加のコピーを植物のような標的生物のゲノムに取り込むことにより増
減することが可能である。同様に、前記ポリペプチドの量を増減することは、か
かる遺伝子のアンチセンスコピーで標的生物を形質転換することにより行うこと
ができる。
【００１９】 本発明のポリヌクレオチドは、林産植物資源、主にＥｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｇ
ｒａｎｄｉｓおよびＰｉｎｕｓ ｒａｄｉａｔａから単離されたが、通常の合成
技術を用いて合成することが代替策である。具体的には、本発明の単離されたポ
リヌクレオチドには、配列番号１−１４、２０、２２−６２、８１−８６および
８８−１１２として同定された配列と、配列番号１−１４、２０、２２−６２、
８１−８６および８８−１１２として同定された配列の相補体と、配列番号１−
１４、２０、２２−６２、８１−８６および８８−１１２として同定された配列
の逆相補体と、上記のポリヌクレオチドのいずれかの少なくとも特定された数の
連続した残基（ｘ量体）と、上記のポリヌクレオチドのいずれかに対応する拡張
された配列と、上記のポリヌクレオチドのいずれかに対応するアンチセンス配列
と、上記のポリヌクレオチドのいずれかの変異体のグループから選択される配列
を含むポリヌクレオチドが含まれる。
【００２０】 別の実施態様では、本発明は、配列番号６３−８０および８７のポリヌクレオ
チドにエンコードされた単離ポリペプチドを提供する。
【００２１】 本発明のポリヌクレオチドとポリペプチドは、ＤＮＡおよびポリペプチドの類
似性検索により推定的に同定された。添付された配列表では、配列番号１−１４
、２０、２２−６２、８１−８６および８８−１１２はポリヌクレオチド配列で
、配列番号６３−８０および８７はポリペプチド配列である。本発明のポリヌク
レオチドおよびポリペプチドは、植物における転写および／または発現の調節に
関与することが知られたプロモーターとの類似性が証明されている。本発明のポ
リヌクレオチドの推定された正体の説明が、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）また
は推測されるプロモーター領域（残基番号で同定される）とともに以下の表１に
示される。
【００２２】
【表１】
【００２３】 １の実施態様では、本発明は、ユビキチンポリペプチドをエンコードするＰｉ
ｎｕｓ ｒａｄｉａｔａおよびＥｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｇｒａｎｄｉｓから単離
されたポリヌクレオチド配列を提供する。Ｐｉｎｕｓ ｒａｄｉａｔａから単離
されたユビキチンポリヌクレオチドの完全長配列は配列番号１に提供され、イン
トロンを含むプロモーター領域の配列は配列番号２に提供され、イントロンを除
いたプロモーター領域の配列は配列番号３に提供される。Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ
ｇｒａｎｄｉｓから単離されたユビキチンポリヌクレオチドの配列は配列番号
３４に提供される。関連した実施態様では、本発明は、配列番号８０および６７
の配列を含むポリペプチドを含めて、配列番号１および３４の単離ポリヌクレオ
チドにエンコードされる単離ポリペプチドを提供する。
【００２４】 ここで用いられる「ポリヌクレオチド」という用語は、デオキシリボヌクレオ
チドまたはリボヌクレオチドの塩基の１本鎖または２本鎖のポリマーを意味し、
ＤＮＡ分子およびこれと対応する、ＨｎＲＮＡとｍＲＮＡ分子を含めた、センス
鎖とアンチセンス鎖の両方のＲＮＡ分子を含み、全合成または部分合成されたポ
リヌクレオチドとともに、ｃＤＮＡとゲノムＤＮＡと組み換えＤＮＡを含む。Ｈ
ｎＲＮＡ分子はイントロンを含み、ＤＮＡ分子と一般的に１対１に対応する。ｍ
ＲＮＡ分子は、イントロンが切り出されたＨｎＲＮＡおよびＤＮＡ分子に対応す
る。ポリヌクレオチドは、遺伝子全体またはその部分を含む。操作可能なアンチ
センスポリヌクレオチドは対応するポリヌクレオチドの断片を含み、それゆえに
「ポリヌクレオチド」の定義は全てのかかる操作可能なアンチセンス断片を含む
。アンチセンスポリヌクレオチドおよびアンチセンスポリヌクレオチドを伴う技
術は本発明の技術分野において周知であり、例えば、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ−Ｂｅｎ
ｉｏｎ（ロビンソン−ベニオン）ら、「アンチセンス技術（Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ
ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）」、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．（メソ
ッズ イン エンザイモロジー）、２５４巻、２３号、３６３−３７５頁、１９
９５年およびＫａｗａｓａｋｉ（カワサキ）ら、Ａｒｔｉｆｉｃ．Ｏｒｇａｎｓ
（アーティフィシャル オーガンズ）、２０巻、８号、８３６−８４８頁、１９
９６年に記載されている。
【００２５】 ここで記載されたポリヌクレオチドとポリペプチドの全ては当業者に慣用され
る条件で単離精製される。ポリペプチドは、少なくとも約８０％純粋であること
が好ましく、少なくとも９０％純粋であることがより好ましく、少なくとも９９
％純粋であることが最も好ましい。
【００２６】 ここで使用された「相補体」、「逆相補体」、および「逆配列」という用語の
定義は、以下の例で最も良く示されている。５’ＡＧＧＡＣＣ３’という配列に
対して、相補体、逆相補体および逆配列は以下のとおりである。 相補体 ３’ＴＣＣＴＧＧ５’ 逆相補体 ３’ＧＧＴＣＣＴ５’ 逆配列 ５’ＣＣＡＧＧＡ３’
【００２７】 本発明のポリヌクレオチドの一部は、完全長ポリペプチドをエンコードする完
全長遺伝子を意味しないという点で、「部分（ｐａｒｔｉａｌ）」配列である。
かかる部分配列は、プライマーおよび/またはプローブ、並びに周知の雑種形成
技術および/またはＰＣＲ技術を用いて、さまざまなＤＮＡライブラリを分析し
、配列決定することにより拡張できる。部分配列は、ポリペプチドをエンコード
するオープン・リーディング・フレーム、完全長ポリヌクレオチドおよび/また
はポリペプチドを発現可能な遺伝子あるいは別のゲノムの有用な部分が同定され
るまで拡張できる。完全長ポリヌクレオチドおよび遺伝子を含むかかる拡張され
た配列は、この拡張されたポリヌクレオチドが、配列番号１−１４、２０、２２
−６２、８１−８６および８８−１１２の１の配列として同定された配列または
その変異体、あるいはその同定された連続した部分（ｘ量体）またはその変異体
を含むとき、配列番号１−１４、２０、２２−６２、８１−８６および８８−１
１２の１の配列またはその変異体あるいは配列番号１−１４、２０、２２−６２
、８１−８６および８８−１１２の１の配列の部分またはその変異体に「対応す
る（ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｔｏ）」と記載される。かかる拡張されたポ
リヌクレオチドは、約５０個ないし約４、０００個の核酸または塩基対の長さを
有するものであってもよいが、約４、０００個以下の核酸または塩基対の長さを
有するのが好ましく、約３、０００個の核酸または塩基対の長さを有するのがよ
り好ましく、約２、０００個の核酸または塩基対の長さを有するのがさらに好ま
しい。ある状況の下では、本発明の拡張されたポリヌクレオチドは、約１、８０
０個未満の核酸または塩基対を有するものでもよいが、約１、６００個未満の核
酸または塩基対を有するのが好ましく、約１、４００個未満の核酸または塩基対
を有するのがより好ましく、約１、２００個未満の核酸または塩基対を有するの
がさらに好ましく、約１、０００個未満の核酸または塩基対を有するのが最も好
ましい。
【００２８】 同様に、本発明のポリヌクレオチドに対応するＲＮＡ配列、逆配列、相補配列
、アンチセンス配列等は、配列番号１−１４、２０、２２−６２、８１−８６お
よび８８−１１２として同定されたｃＤＮＡ配列を用いて、決まり切った手順で
（ｒｏｕｔｉｎｅｌｙ）確認し、取得することができる。
【００２９】 配列番号１−１４、２０、２２−６２、８１−８６および８８−１１２として
同定されたポリヌクレオチドは、オープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）
またはポリペプチドをエンコードする部分的なオープン・リーディング・フレー
ムを含む。さらに、ポリペプチドをエンコードするオープン・リーディング・フ
レームは、配列番号１−１４、２０、２２−６２、８１−８６および８８−１１
２に提示された配列に対応する拡張された配列または完全長配列において同定で
きる。オープン・リーディング・フレームは、当業者に周知の技術を用いて同定
できる。これらの技術は、例えば既知の開始および終了コドンの位置の解析、コ
ドン頻度にもとづく最も可能性の高い読み枠の同定等を含む。ＯＲＦ解析のため
に適当なツールとソフトウェアは、例えばインターネット上のｈｔｔｐ：／／ｗ
ｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｏｒｆ／ｇｏｒｆ．ｈｔｍｌで入
手可能である。オープン・リーディング・フレームおよびオープン・リーディン
グ・フレームの部分は、本発明のポリヌクレオチドの中に同定できる。ひとたび
部分的なオープン・リーディング・フレームが同定されると、ポリヌクレオチド
は、完全なオープン・リーディング・フレームのポリヌクレオチドが同定できる
まで、当業者に周知の技術を用いて部分オープン・リーディング・フレームの領
域を拡張することができる。よって、ポリペプチドをエンコードするオープン・
リーディング・フレームは、本発明のポリヌクレオチドを用いて同定できる。
【００３０】 ひとたびオープン・リーディング・フレームが本発明のポリヌクレオチドにお
いて同定されると、該オープン・リーディング・フレームは、単離および／また
は合成できる。前記オープン・リーディング・フレームと、当業者に周知の適当
なプロモーター、イニシエーター、ターミネーター等とを含む、発現可能な遺伝
子コンストラクトが構築できる。かかる遺伝子コンストラクトは、前記オープン
・リーディング・フレームにエンコードされたポリペプチドを発現するために宿
主細胞に導入される。適当な宿主細胞は植物細胞、哺乳類細胞、細菌細胞、藻類
等を含むさまざまな前核および真核細胞を含む。
【００３１】 本発明のポリヌクレオチドにエンコードされたポリペプチドは、その生物活性
を決定するため、発現され、さまざまなアッセイ法に使用される。かかるポリペ
プチドは、抗体作成と、相互作用する相手の蛋白質またはその他の化合物の単離
と、相互作用する相手の蛋白質またはその他の化合物のレベルの定量的な測定と
に用いることができる。
【００３２】 ここで使用された「ポリペプチド」という用語は、アミノ酸残基が共有結合で
連結された、完全長を含むいかなる長さのアミノ酸鎖をも含む。本発明のポリペ
プチドは、天然物から精製された産物であっても、組み換え技術を用いて部分的
にあるいは全面的に生産されてもかまわない。ここで使用された「ポリヌクレオ
チドにエンコードされたポリペプチド」という用語は、本発明の部分的に単離さ
れたＤＮＡ配列を含むヌクレオチド配列によりエンコードされたポリペプチドを
含む。
【００３３】 関連する実施態様では、配列番号６３−８０および８７に提供された配列から
なるグループから選択された配列を有するポリペプチドの少なくとも機能性のあ
る部分を含むポリペプチドが提供される。ここで使用されたポリペプチドの「機
能性のある部分」とは、該ポリペプチドの機能に影響を与えるために必須の活性
部位を含む部分、例えば、１個以上の反応物と結合することが可能な分子の部分
をいう。前記活性部位は１以上のポリペプチド鎖上に存在する分離された部分か
らなる場合もあり、一般的に高い結合親和性を示す。
【００３４】 ポリペプチドの機能性のある部分は、まず化学的または酵素的に該ポリペプチ
ドを消化して該ポリペプチドの断片を準備すること、あるいは前記ポリペプチド
をエンコードするポリヌクレオチドの突然変異解析をすることおよび得られた突
然変異ポリペプチドを発現することにより同定できる。つぎに、前記ポリペプチ
ド断片または突然変異ポリペプチドは、例えば以下に提供される代表的なアッセ
イ法を用いて、どの部分が生物活性を保持するかを決定するためにテストされる
。
【００３５】 活性部位を含む機能性のある部分は、１以上のポリペプチド鎖上に存在する分
離した部分からなることもあるが、一般的には高い基質特異性を示す。ここで使
用された「ポリヌクレオチドにエンコードされるポリペプチド」という用語には
、本発明の部分的に単離されたポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドにエン
コードされるポリペプチドが含まれる。
【００３６】 本発明のポリペプチドの部分その他の変異体は、合成または組み換えの手段に
より生成できる。約１００個未満、一般的には約５０個未満のアミノ酸を有する
合成ポリペプチドは、本発明の分野の通常の技量を有する者に周知の技術を用い
て合成することができる。例えば、かかるポリペプチドは、アミノ酸が次々に伸
長中のアミノ酸鎖に付加されていくＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（メリフィールド）固
相合成法のような、いずれかの商業的に利用可能な固相技術を用いて合成するこ
とが可能である（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（ジャ
ーナル オブ アメリカン ケミカル ソサエティ）、８５巻、２１４９−２１
４６頁、１９６３年）。ポリペプチド自動合成装置は、パーキン・エルマー／ア
プライド・バイオシステムズ社（カリフォルニア州、フォスターシティ（Ｆｏｓ
ｔｅｒ Ｃｉｔｙ））のような供給者から商業的に入手可能であり、製造者の指
示に従って操作することができる。天然のポリペプチドの変異体は、オリゴヌク
レオチド指令型（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ）部位特
異的突然変異生成のような標準的な突然変異生成技術を用いて調製される（Ｋｕ
ｎｋｅｌ（クンケル）、プロシーディングス オブ ナショナル アカデミー
オブ サイエンシズ オブ ジ ユナイテッド ステーツ オブ アメリカ（Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２巻、４８８−４９２頁、１
９８５年）。ＤＮＡ配列の部分は、不完全なポリペプチドの調製を可能にするよ
うに標準的な技術を用いて切除される。
【００３７】 ここで使用された「変異体」という用語は、特異的に同定された配列と異なる
ヌクレオチドまたはアミノ酸の配列を含むものであって、１以上のヌクレオチド
またはアミノ酸配列が、欠失、置換または付加されたものをいう。変異体は、自
然界に存在する対立遺伝子の変異体でも、自然界に存在しない変異体でもよい。
変異体配列（ポリヌクレオチドまたはポリペプチド）は、本発明の配列に対し少
なくとも５０％、より好ましくは７５％、さらにより好ましくは９０％の、残基
の同一性を示すものをいう。残基の同一性の百分率は、以下に記載のとおり、比
較する２つの配列のアライメントをとり（ａｌｉｇｎ）、アライメントがとれた
部分の同一残基数を決定し、該同一残基数を本発明の（クエリーの）配列中の全
残基数で除算し、その結果を１００倍したものをいう。
【００３８】 公開で入手可能なコンピューターアルゴリズムを用いて、ポリヌクレオチドお
よびポリペプチド配列のアライメントをとることができ、特定の領域のヌクレオ
チドの同一性の百分率を別のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列に対して
決定することができる。ポリヌクレオチド配列のアライメントおよび類似性同定
のための２つの代表的なアルゴリズムは、ＢＬＡＳＴＮおよびＦＡＳＴＡアルゴ
リズムである。ポリヌクレオチドは、（両方の鎖の）ヌクレオチドのクエリー配
列の６つの読み枠の概念的な翻訳産物をタンパク配列データベースに対して比較
するＢＬＡＳＴＸアルゴリズムを用いても解析できる。ポリペプチド配列の類似
性は、ＢＬＡＳＴＰアルゴリズムを用いて調べることができる。前記ＢＬＡＳＴ
Ｎ、ＢＬＡＳＴＸおよびＢＬＡＳＴＰのプログラムは、ＮＣＢＩの匿名ＦＴＰサ
ーバー（ｆｔｐ：／／ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）上の／ｂｌａｓｔ／
ｅｘｅｃｕｔａｂｌｅｓ／で入手可能である。説明書に記載され、前記アルゴリ
ズムとともに配布された、デフォルトのパラメーター値に設定したＢＬＡＳＴＮ
アルゴリズムバージョン２．０．４（１９９８年２月２４日）および２．０．６
（１９９８年９月１６日）を、本発明による変異体の決定に用いるのが好ましい
。ＢＬＡＳＴＰアルゴリズムを、本発明によるポリペプチド変異体の決定に用い
るのが好ましい。ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴＸを含むＢＬＡ
ＳＴファミリーのアルゴリズムは、ＮＣＢＩのウェッブサイトのＵＲＬ（ｈｔｔ
ｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／ｎｅｗｂｌ
ａｓｔ．ｈｔｍｌ）と、Ａｌｔｓｃｈｕｌ（アルツシュール）らによる「ギャッ
プ入りのＢＬＡＳＴおよびＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：新世代のタンパク質データベー
ス検索プログラム（Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ ａｎｄ ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ： ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓ
ｅ ｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒａｍｓ）」、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．（ニュークレイック アシッズ リサーチ）、２５巻、３３８９−３４０２
頁、１９９７年という刊行物とに記載されている。
【００３９】 コンピューターアルゴリズムのＦＡＳＴＡは、インターネット上のｆｔｐサイ
トｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｖｉｒｇｉｎｉａ．ｅｄｕ／ｐｕｂ／ｆａｓｔａ／で入
手可能である。説明書に記載され、プログラムとともに配布されたデフォルトの
パラメーター値に設定した、バージョン２．０ｕ４（１９９６年２月）を、本発
明による変異体の決定に用いることができる。ＦＡＳＴＡアルゴリズムの使用法
は、Ｐｅａｒｓｏｎ（ピアソン）およびＬｉｐｍａｎ（リップマン）、「生物学
的な配列の解析のための改良されたツール（Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｔｏｏｌｓ ｆ
ｏｒ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ）」、Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５巻、２４４４−２４４８頁、
１９８８年と、Ｐｅａｒｓｏｎ、「ＦＡＳＴＰおよびＦＡＳＴＡを用いる迅速で
敏感な配列比較（Ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｗｉｔｈ ＦＡＳＴＰ ａｎｄ ＦＡＳＴＡ）」、Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１８３巻、６３−９８頁、１９９０年
とに記載されている。
【００４０】 以下のランニングパラメーターを、ポリヌクレオチド配列の以下に説明するＥ
値（Ｅ ｖａｌｕｅｓ）および同一性の百分率に寄与する、ＢＬＡＳＴＮを使う
アライメントおよび類似性の決定に用いるのが好ましい。Ｕｎｉｘ（登録商標）
のランニングコマンドは、「ｂｌａｓｔａｌｌ −ｐ ｂｌａｓｔｎ −ｄ ｅ
ｍｂｌｄｂ −ｅ １０ −Ｇ０ −Ｅ０ −ｒ １ −ｖ ３０ −ｂ ３０ −ｉ ｑｕｅｒｙｓｅｑ −ｏ ｒｅｓｕｌｔｓ」で、パラメーターは以下の
とおりである。 −ｐ プログラムの名称 ［文字列］；−ｄ データベース ［文字列］；
−ｅ 期待値 （Ｅ） ［実数］；−Ｇ ギャップを空けるためのコスト
（ゼロはデフォルトの行動を呼び起こす） ［整数］；−Ｅ ギャップを拡張
するためのコスト （ゼロはデフォルトの行動を呼び起こす） ［整数］；−ｒ ヌクレオチドのマッチの報酬 （ｂｌａｓｔｎのみ） ［整数］；−ｖ
１行説明（ｏｎｅ−ｌｉｎｅ ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ）の数 （Ｖ） ［整
数］；−ｂ 表示するアライメントの数 （Ｂ） ［整数］；−ｉ クェリ
ーファイル ［Ｆｉｌｅ Ｉｎ］；−ｏ ＢＬＡＳＴレポートアウトプットフ
ァイル ［Ｆｉｌｅ Ｏｕｔ］ 任意。
【００４１】 以下のランニングパラメーターを、ポリペプチド配列のＥ値および同一性の百
分率に寄与する、ＢＬＡＳＴＰを使うアライメントおよび類似性の決定に用いる
のが好ましい。「ｂｌａｓｔａｌｌ −ｐ ｂｌａｓｔｐ −ｄ ｓｗｉｓｓｐ
ｒｏｔｄｂ −ｅ １０ −Ｇ ０−Ｅ ０ −ｖ ３０ −ｂ ３０ −ｉ
ｑｕｅｒｙｓｅｑ −ｏ ｒｅｓｕｌｔｓ」で、パラメーターは以下のとおりで
ある。 −ｐ プログラムの名称 ［文字列］；−ｄ データベース ［文字列］；
−ｅ 期待値 （Ｅ） ［実数］；−Ｇ ギャップを空けるためのコスト
（ゼロはデフォルトの行動を呼び起こす） ［整数］；−Ｅ ギャップを拡張
するためのコスト （ゼロはデフォルトの行動を呼び起こす） ［整数］；−ｖ １行説明（ｏｎｅ−ｌｉｎｅ ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ）の数 （Ｖ）
［整数］；−ｂ 表示するアライメントの数 （Ｂ） ［整数］； −ｉ
クェリーファイル ［Ｆｉｌｅ Ｉｎ］；−ｏ ＢＬＡＳＴレポートアウトプ
ットファイル ［Ｆｉｌｅ Ｏｕｔ］ 任意。
【００４２】 ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴＰまたは同様のアルゴリズムにより作
成された、クエリー配列による１以上のデータベース配列への「ヒット」は、配
列の類似部分のアライメントをとって同定する。前記ヒットは、類似性の程度お
よび配列重複の長さの順に並べられる。データベース配列へのヒットは、前記ク
エリー配列の配列長の一部としか重複しないことを意味するのが一般的である。
【００４３】 ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡおよびＢＬＡＳＴＰアルゴリズムは、アライメント
の「期待」（Ｅ）値をも算出する。Ｅ値は、一定の規模のデータベースを検索し
たときに偶然一定数の隣接した配列にわたって発見が「期待」できるヒットの数
を示す。Ｅ値は、好ましいＥＭＢＬデータベースのようなデータベースへのヒッ
トが真の類似性を表すかどうかを決定するための、有意性の閾値として用いられ
る。例えば、あるポリヌクレオチドのヒットに付与されたＥ値が０．１であるこ
とは、ＥＭＢＬデータベースの規模のデータベースにおいて、同様のスコアの配
列のアライメントをとった部分にわたって、偶然０．１回マッチすることが期待
できると解釈される。この判定基準により、前記ポリヌクレオチド配列のアライ
メントがとれてマッチした部分は、９０％が同一である確率を有することになる
。アライメントがとれてマッチした部分にわたって０．０１未満のＥ値を有する
配列については、アルゴリズムＢＬＡＳＴＮまたはＦＡＳＴＡを用いてＥＭＢＬ
データベースで偶然マッチするものを見つける確率は、１％未満である。
【００４４】 １の実施態様によると、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドのそれ
ぞれに関して、「変異体」のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、本発明の
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドのそれぞれよりも核酸またはアミノ酸の数
が同じか少ない配列で、かつ本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドと比
べて０．０１未満のＥ値となる配列を含むのが好ましい。すなわち、変異体ポリ
ヌクレオチドまたはポリペプチドとは、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペ
プチドと同一である確率が９９％以上あり、上記のパラメーター設定でＢＬＡＳ
ＴＮ、ＦＡＳＴＡまたはＢＬＡＳＴＰアルゴリズムを用いてＥ値が０．０１以下
となる、いかなる配列をもいう。好ましい実施態様によると、変異体ポリヌクレ
オチドとは、上記のパラメーター設定でＢＬＡＳＴＮまたはＦＡＳＴＡアルゴリ
ズムを用いるとＥ値が０．０１以下となり、９９％以上の確率で本発明のポリヌ
クレオチドと同一となる、本発明のポリヌクレオチドの核酸の数以下の数の核酸
を有する配列をいう。同様に、好ましい実施態様によると、変異体ポリペプチド
とは、上記のパラメーター設定でＢＬＡＳＴＰアルゴリズムを用いるとＥ値が０
．０１以下となり、９９％以上の確率で本発明のポリペプチドと同一となる、本
発明のポリペプチドよりアミノ酸の数が同じか少ない配列をいう。
【００４５】 本発明の変異体ポリヌクレオチドは、配列番号１−１４、２０、２２−６２、
８１−８６および８８−１１２に列挙されたポリヌクレオチド配列またはこれら
の配列の、相補体、逆配列または逆相補体と、ストリンジェントな条件下で雑種
形成するというのが代替策である。ここで使用された「ストリンジェントな条件
」とは、６Ｘ ＳＳＣと０．２％ ＳＤＳの溶液で前洗浄し、６５°Ｃ、終夜（
ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ）、６Ｘ ＳＳＣと０．２％ ＳＤＳの溶液中で雑種形成さ
せ、その後６５°Ｃ、１Ｘ ＳＳＣと０．１％ ＳＤＳで各３０分ずつ２回洗浄
し、６５°Ｃ、０．２Ｘ ＳＳＣと０．１％ ＳＤＳで各３０分ずつ２回洗浄す
ることを指す。
【００４６】 本発明は、開示された配列とは相違するが、遺伝暗号の縮退の結果本発明のポ
リヌクレオチドにエンコードされるポリペプチドと同じポリペプチドをエンコー
ドするポリヌクレオチドも含む。したがって、保存的置換の結果、配列番号１−
１４、２０、２２−６２、８１−８６および８８−１１２に列挙されたポリヌク
レオチド配列またはこれらの配列の相補体、逆配列または逆相補体と相違する配
列を含むポリヌクレオチドは、本発明により意図されたものであり、本発明に含
まれる。さらに、合計が前配列長の１０％未満の欠失および／または挿入の結果
として、配列番号１−１４、２０、２２−６２、８１−８６および８８−１１２
に列挙されたポリヌクレオチド配列、またはこれらの配列の相補体、逆配列また
は逆相補体と異なる配列を含むポリヌクレオチドも、本発明により意図されたも
のであり、かつ本発明に含まれる。同様に、合計が全配列長の１０％未満のアミ
ノ酸置換、挿入および／または欠失の結果として配列番号６３−８０および８７
に列挙されたポリペプチド配列と異なる配列を含むポリペプチドは、本発明によ
り意図されたものであり、かつ本発明に含まれる。一部の実施態様では、本発明
のポリペプチドおよびポリヌクレオチドの変異体は、本発明のポリペプチドおよ
びポリヌクレオチドの生物活性と同一または類似の生物活性を有する。かかる変
異体ポリヌクレオチドはプロモーター配列として機能し、それゆえ植物の遺伝子
発現を改変することができる。
【００４７】 本発明のポリヌクレオチドはさまざまなライブラリから単離してもよく、ある
いは当業者に周知の技術を用いて合成してもよい。本発明のポリヌクレオチドは
、例えば、５０個以上の核酸のポリヌクレオチドセグメントを得るために、自動
オリゴヌクレオチド合成機（例としてベックマン社オリゴ１０００Ｍ ＤＮＡシ
ンセサイザー）を使用して合成してもよい。複数のかかるポリヌクレオチドセグ
メントは、分子生物学の分野で周知の標準的なＤＮＡ操作技術を用いて連結する
ことができる。１つの通常の代表的なポリヌクレオチド合成技術は、例えば８０
個の核酸を有する１本鎖ポリヌクレオチドセグメントを合成すること、該セグメ
ントを相補的な８５個の核酸セグメントと雑種形成して５ヌクレオチドのオーバ
ーハングを作り出すことを伴う。次のセグメントも同様の手法で反対側の鎖に５
ヌクレオチドのオーバーハングを持つように合成される。この「粘着」末端が、
前記の２つの部分が雑種形成したときに適切に連結することを保証する。このよ
うにして、本発明の完全なポリヌクレオチドは、試験管内で全合成できる。
【００４８】 本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１−１４、２０、２２−６２、８１−
８６および８８−１１２として同定されたポリヌクレオチドと、かかる配列の相
補体と、逆配列と、逆相補体と、それらの変異体とのうちのいずれかの、少なく
とも特定の数の連続した残基を含むポリヌクレオチド（ｘ量体）を含むポリヌク
レオチドを含む。同様に、本発明のポリペプチドは、配列番号６３−８０および
８７として同定されたポリペプチドとそれらの変異体とのうちのいずれかの、少
なくとも特定の数の連続した残基を含むポリペプチド（ｘ量体）を含むポリペプ
チドを含む。ここで使用された「ｘ量体」という用語は、「ｘ」の特定の値に関
して、配列番号１−１４、２０、２２−６２、８１−８６および８８−１１２と
して同定されたポリヌクレオチドまたは配列番号６３−８０および８７として同
定されたポリペプチドのいずれかの、少なくとも特定された数（「ｘ」）の連続
した残基を含む配列を指す。好ましい実施態様によると、ｘの値は少なくとも２
０が好ましく、少なくとも４０がより好ましく、少なくとも６０がさらに好まし
く、少なくとも８０が最も好ましい。よって、本発明のポリヌクレオチドおよび
ポリペプチドは、配列番号１−１４、２０、２２−６２、８１−８６および８８
−１１２として同定されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドおよびそれらの
変異体の２０量体、４０量体、６０量体、８０量体、１００量体、１２０量体、
１５０量体、１８０量体、２２０量体、２５０量体、３００量体、４００量体、
５００量体または６００量体を含む。
【００４９】 上記のとおり、本発明のポリヌクレオチドプロモーター配列は、関心のあるポ
リヌクレオチドの転写および／または発現を駆動するために遺伝子コンストラク
トに用いることができる。関心のあるポリヌクレオチドは形質転換される生物、
例えば植物にとって内在性であるか、あるいは異種由来であるかのいずれであっ
てもかまわない。それゆえ、本発明の遺伝子コンストラクトは野生型植物に存在
する、例えば遺伝子のようなポリヌクレオチドの転写および／または発現のレベ
ルを調整するために用いられ、あるいは野生型植物にはみられないＤＮＡ配列の
転写および／または発現を提供するために用いられる。
【００５０】 一部の実施態様では、関心のあるポリヌクレオチドは標的ポリペプチドをエン
コードするオープン・リーディング・フレームを含む。該オープン・リーディン
グ・フレームは、標的植物へのＤＮＡコンストラクトの形質転換が野生型植物に
比較したポリペプチド量の変化をもたらすように、該ＤＮＡコンストラクトにセ
ンスまたはアンチセンス方向に挿入される。オープン・リーディング・フレーム
をセンス方向に含むＤＮＡコンストラクトでの形質転換は、選択された遺伝子の
過剰発現をもたらすのが一般的であり、オープン・リーディング・フレームをア
ンチセンス方向に含む遺伝子コンストラクトでの形質転換は、選択された遺伝子
の発現の減少をもたらすのが一般的である。本発明のオープン・リーディング・
フレームをセンスまたはアンチセンスどちらかの方向に含むＤＮＡコンストラク
トで形質転換された植物の集団は、当業者に周知の技術を用いて、問題の遺伝子
の発現が増大または減少していることについてスクリーニングされ、所望の表現
型を有する植物が単離される。
【００５１】 標的ポリペプチドの発現は、本発明のオープン・リーディング・フレームの部
分をセンスまたはアンチセンスのいずれかの方向に挿入することにより阻害でき
るというのが代替策である。かかる部分は完全長である必要はないが、本発明の
ポリヌクレオチドの少なくとも２５個の残基を含むことが好ましく、少なくとも
５０個を含むことがより好ましい。しかし、より長い部分または完全なオープン
・リーディング・フレームに対応する完全長ポリヌクレオチドを用いてもかまわ
ない。前記オープン・リーディング・フレームの部分は、標的遺伝子の阻害を達
成するのに十分な配列類似性があることを条件として、内在配列と正確に同一で
ある必要はない。したがって、１つの種由来の配列が、異なる種の遺伝子の発現
を阻害するのに用いられてもよい。
【００５２】 さらなる実施態様では、本発明のＤＮＡコンストラクトは、本発明のポリペプ
チドをコードする遺伝子の非翻訳領域、すなわちノンコーディング領域を含むＤ
ＮＡ配列またはかかる非翻訳領域に相補的なＤＮＡ配列を含む。かかるコンスト
ラクトに有用な非翻訳領域の例には、イントロンおよび５’非翻訳リーダー配列
が含まれる。かかるＤＮＡコンストラクトによる標的植物の形質転換は、例えば
Ｎａｐｏｌｉ（ナポリ）ら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ（プラント セル）、２巻、
２７９−２９０頁、１９９０年およびｄｅ Ｃａｒｖａｌｈｏ Ｎｉｅｂｅｌ（
デ・カルバリョ・ニーベル）ら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ、７巻、３４７−３５８
頁、１９９５年によって論じられたのと同様の手法である、コサプレッションの
過程によって、植物で発現するポリペプチド量の減少をもたらす。
【００５３】 ポリペプチド発現の調節は、適当な配列またはサブ配列（例えばＤＮＡまたは
ＲＮＡ）をリボザイムコンストラクトに挿入することにより達成できるというの
が代替策である（ＭｃＩｎｔｙｒｅ（マッキンタイヤー）およびＭａｎｎｅｒｓ
（マナーズ）、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ．（トランスジェニック リサー
チ）、５巻、４号、２５７−２６２頁、１９９６年）。リボザイムとは、本発明
の１のポリヌクレオチドにエンコードされるｍＲＮＡ分子中の少なくとも５個以
上の連続したヌクレオチドからなる、２つの領域に相補的な雑種形成領域を含む
合成ＲＮＡ分子をいう。リボザイムは特異性の高いエンドヌクレアーゼ活性を有
し、自己触媒的に前記ｍＲＮＡを切断する。
【００５４】 本発明のＤＮＡコンストラクトは、さらに、転写されるＤＮＡ配列を操作可能
に連結した遺伝子プロモーター配列および遺伝子ターミネーション配列を含み、
遺伝子発現を制御する。遺伝子プロモーター配列は転写されるＤＮＡ配列の５’
末端にみられ、該ＤＮＡ配列の転写の開始に用いられるのが一般的である。配列
番号２および３のＰｉｎｕｓ ｒａｄｉａｔａのユビキチンポリヌクレオチドプ
ロモーター配列または配列番号３４に含まれるＥｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｇｒａｎ
ｄｉｓのユビキチンポリヌクレオチドプロモーター配列のような、構成的なプロ
モーターを用いることは、形質転換された植物の全ての部分における関心のある
ＤＮＡ配列の転写に影響を与える。配列番号９−１１の葉特異的プロモーター、
配列番号１３−１４の根特異的プロモーター、配列番号２９−３３、５９および
８９−９０の花特異的プロモーター、配列番号４９−５５および９４の花粉特異
的プロモーター、配列番号４０の芽特異的プロモーターあるいは配列番号４５の
分裂組織特異的プロモーターのような、組織特異的プロモーターを用いることは
、所望のセンスまたはアンチセンスＲＮＡを関心のある組織のみで産生すること
につながる。配列番号５，４１−４４および９２の木部化（ｘｙｌｏｇｅｎｅｓ
ｉｓ）特異的プロモーターのような、時間的に調節されたプロモーターは、形質
転換された植物の発生における特定の時でのＤＮＡ転写速度の調整に影響を与え
るように用いることができる。誘導可能な遺伝子プロモーター配列を用いる遺伝
子コンストラクトでは、ＤＮＡ転写は光、熱、嫌気的ストレス、栄養条件の変動
等のような外界の刺激により調整できる。
【００５５】 さらに本発明の遺伝子コンストラクトは、関心のあるポリヌクレオチドの３’
側に位置する遺伝子ターミネーション配列を含む。本発明の遺伝子コンストラク
トに有効に利用できるさまざまな遺伝子ターミネーション配列は本発明の技術分
野で周知である。かかる遺伝子ターミネーション配列の１つの例は、アグロバク
テリウム・ツメファシエンス菌のノパリンシンターゼ遺伝子の３’末端である。
転写されるＤＮＡ配列の３’側に位置する遺伝子ターミネーション配列は、遺伝
子プロモーター配列が標的植物において機能することを条件として、該標的植物
に内在性のものでもよく、異種由来のものでもかまわない。例えば、ターミネー
ション配列は他の植物種、植物ウイルス、細菌プラスミド等由来でもかまわない
。
【００５６】 本発明の遺伝子コンストラクトは、本発明のコンストラクトを含む形質転換細
胞の検出ができるように、植物細胞で有効な選択マーカーを含むこともある。本
発明の技術分野で周知のかかるマーカーは、１以上の毒素の耐性を有するのが典
型的である。かかるマーカーの１つの例は、その発現により中程度の濃度で植物
細胞に通常は毒性のあるカナマイシンまたはハイグロマイシンの耐性をもたらす
ＮＰＴＩＩ遺伝子である（Ｒｏｇｅｒｓ（ロジャース）ら、Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ
（ワイスバッハ） ＡおよびＨ編、「植物分子生物学の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、アカデミック
・プレス、カリフォルニア州 サンジエゴ、１９８８年）。形質転換細胞は、問
題の抗生物質を含む培地中での増殖能により同定できる。形質転換細胞中に所望
のコンストラクトが存在することは、サザンブロット法およびウェスタンブロッ
ト法のような本発明の技術分野に周知の他の技術によって決定することができる
というのが代替策である。
【００５７】 本発明のＤＮＡコンストラクトの構成要素を操作可能に結合させるための技術
は、本発明の技術分野で周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ（サンブルック
）ら、（「分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏ
ｎｉｎｇ： ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ）」、ＣＳＨＬプレス、
ニューヨーク州、コールド・スプリング・ハーバー、１９８９年）に記載された
、１以上の制限エンドヌクレアーゼ部位を含む合成リンカーの利用を含む。本発
明のＤＮＡコンストラクトは、それぞれの操作が終わるたびに出来上がったコン
ストラクトをクローニングし、配列決定して操作の正確さを決定することが可能
な、例えば、大腸菌のような１以上の複製システムを有するベクターに連結され
てもよい。
【００５８】 本発明の遺伝子コンストラクトは、植物を含むがこれに限定されない、さまざ
まな標的生物を形質転換するために用いられる。本発明のコンストラクトを用い
て形質転換される植物には、単子葉類被子植物（例、牧草、トウモロコシ、穀類
、カラスムギ、コムギ、オオムギ）および双子葉類被子植物（例、シロイヌナズ
ナ、タバコ、マメ科植物、アルファルファ、オーク、ユーカリ、カエデ）の両方
と、裸子植物（例、オウシュウアカマツ（Ｓｃｏｔ ｐｉｎｅ）（Ａｒｏｎｅｎ
（アロネン）、Ｆｉｎｎｉｓｈ Ｆｏｒｅｓｔ Ｒｅｓ． Ｐａｐｅｒｓ（フィ
ニッシュ フォーレスト リサーチ ペーパーズ）、５９５巻、１９９６年）、
ホワイトスプルース（Ｅｌｌｉｓ（エリス）ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（
バイオテクノロジー）、１１巻、８４−８９頁、、１９９３年）、およびカラマ
ツ（ｌａｒｃｈ）（Ｈｕａｎｇ（ファン）ら、Ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ（イ
ン ビトロ セル）、２７巻、２０１−２０７頁、１９９１年）を含む。好まし
い実施態様においては、本発明の遺伝子コンストラクトは、その茎が複数年生存
して木質組織の追加により毎年直径が増大するような樹木または潅木とここでは
定義される、木本植物の形質転換に用いられる。標的植物は、好ましくはユーカ
リとマツの種を含むグループから選択され、最も好ましくはＥｕｃａｌｙｐｔｕ
ｓ ｇｒａｎｄｉｓとＰｉｎｕｓ ｒａｄｉａｔａからなるグループから選択さ
れた。本発明のＤＮＡコンストラクトで有用に形質転換される他の種には、Ｐｉ
ｎｕｓ ｂａｎｋｓｉａｎａ、Ｐｉｎｕｓ ｂｒｕｔｉａ、Ｐｉｎｕｓ ｃａｒ
ｉｂａｅａ、Ｐｉｎｕｓ ｃｌａｕｓａ、Ｐｉｎｕｓ ｃｏｎｔｏｒｔａ、Ｐｉ
ｎｕｓ ｃｏｕｌｔｅｒｉ、Ｐｉｎｕｓ ｅｃｈｉｎａｔａ、Ｐｉｎｕｓ ｅｌ
ｄａｒｉｃａ、Ｐｉｎｕｓ ｅｌｌｉｏｔｉ、Ｐｉｎｕｓ ｊｅｆｆｒｅｙｉ、
Ｐｉｎｕｓ ｌａｍｂｅｒｔｉａｎａ、Ｐｉｎｕｓ ｍｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｐｉ
ｎｕｓ ｎｉｇｒａ、Ｐｉｎｕｓ ｐａｌｕｓｔｒｕｓ、Ｐｉｎｕｓ ｐｉｎａ
ｓｔｅｒ、Ｐｉｎｕｓ ｐｏｎｄｅｒｏｓａ、Ｐｉｎｕｓ ｒｅｓｉｎｏｓａ、
Ｐｉｎｕｓ ｒｉｇｉｄａ、Ｐｉｎｕｓ ｓｅｒｏｔｉｎａ、Ｐｉｎｕｓ ｓｔ
ｒｏｂｕｓ、Ｐｉｎｕｓ ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ、Ｐｉｎｕｓ ｔａｅｄａ、Ｐ
ｉｎｕｓ ｖｉｒｇｉｎｉａｎａのようなマツと、Ａｂｉｅｓ ａｍａｂｉｌｉ
ｓ、Ａｂｉｅｓ ｂａｌｓａｍｅａ、Ａｂｉｅｓ ｃｏｎｃｏｌｏｒ、Ａｂｉｅ
ｓ ｇｒａｎｄｉｓ、Ａｂｉｅｓ ｌａｓｉｏｃａｒｐａ、Ａｂｉｅｓ ｍａｇ
ｎｉｆｉｃａ、Ａｂｉｅｓ ｐｒｏｃｅｒａ、Ｃｈａｍａｅｃｙｐａｒｉｓ ｌ
ａｗｓｏｎｉｏｎａ、Ｃｈａｍａｅｃｙｐａｒｉｓ ｎｏｏｔｋａｔｅｎｓｉｓ
、Ｃｈａｍａｅｃｙｐａｒｉｓ ｔｈｙｏｉｄｅｓ、Ｈｕｎｉｐｅｒｕｓ ｖｉ
ｒｇｉｎｉａｎａ、Ｌａｒｉｘ ｄｅｃｉｄｕａ、Ｌａｒｉｘ ｌａｒｉｃｉｎ
ａ、Ｌａｒｉｘ ｌｅｐｔｏｌｅｐｉｓ、Ｌａｒｉｘ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉ
ｓ、Ｌａｒｉｘ ｓｉｂｅｒｉｃａ、Ｌｉｂｏｃｅｄｒｕｓ ｄｅｃｕｒｒｅｎ
ｓ、Ｐｉｃｅａ ａｂｉｅｓ、Ｐｉｃｅａ ｅｎｇｅｌｍａｎｎｉ、Ｐｉｃｅａ
ｇｌａｕｃａ、Ｐｉｃｅａ ｍａｒｉａｎａ、Ｐｉｃｅａ ｐｕｎｇｅｎｓ、
Ｐｉｃｅａ ｒｕｂｅｎｓ、Ｐｉｃｅａ ｓｉｔｃｈｅｎｓｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏ
ｔｓｕｇａ ｍｅｎｚｉｅｓｉｉ、Ｓｅｑｕｏｉａ ｇｉｇａｎｔｅａ、Ｓｅｑ
ｕｏｉａ ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓ、Ｔａｘｏｄｉｕｍ ｄｉｓｔｉｃｈｕｍ
、Ｔｓｕｇａ ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ、Ｔｓｕｇａ ｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌｌａ
、Ｔｓｕｇａ ｍｅｒｔｅｎｓｉａｎａ、Ｔｈｕｊａ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉ
ｓ、Ｔｈｕｊａ ｐｌｉｃａｔａのような他の裸子植物と、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕ
ｓ ａｌｂａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｂａｎｃｒｏｆｔｉｉ、Ｅｕｃａｌｙｐ
ｔｕｓ ｂｏｔｙｒｏｉｄｅｓ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｂｒｉｄｇｅｓｉａｎ
ａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｃａｌｏｐｈｙｌｌａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｃ
ａｍａｌｄｕｌｅｎｓｉｓ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｃｉｔｒｉｏｄｏｒａ、Ｅ
ｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｃｌａｄｏｃａｌｙｘ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｃｏｃｃ
ｉｆｅｒａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｃｕｒｔｉｓｉｉ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ
ｄａｌｒｙｍｐｌｅａｎａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｄｅｇｌｕｐｔａ、Ｅｕ
ｃａｌｙｐｔｕｓ ｄｅｌａｇａｔｅｎｓｉｓ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｄｉｖ
ｅｒｓｉｃｏｌｏｒ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｄｕｎｎｉｉ、Ｅｕｃａｌｙｐｔ
ｕｓ ｆｉｃｉｆｏｌｉａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｇｌｏｂｕｌｕｓ、Ｅｕｃ
ａｌｙｐｔｕｓ ｇｏｍｐｈｏｃｅｐｈａｌａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｇｕｎ
ｎｉｉ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｈｅｎｒｙｉ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｌａｅ
ｖｏｐｉｎｅａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｍａｃａｒｔｈｕｒｉｉ、Ｅｕｃａｌ
ｙｐｔｕｓ ｍａｃｒｏｒｈｙｎｃｈａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｍａｃｕｌａ
ｔａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｍａｒｇｉｎａｔａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｍ
ｅｇａｃａｒｐａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｍｅｌｌｉｏｄｏｒａ、Ｅｕｃａｌ
ｙｐｔｕｓ ｎｉｃｈｏｌｉｉ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｎｉｔｅｎｓ、Ｅｕｃ
ａｌｙｐｔｕｓ ｎｏｖａ−ａｎｇｌｉｃａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｏｂｌｉ
ｑｕａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｏｂｔｕｓｉｆｌｏｒａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕ
ｓ ｏｒｅａｄｅｓ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｐａｕｃｉｆｌｏｒａ、Ｅｕｃａ
ｌｙｐｔｕｓ ｐｏｌｙｂｒａｃｔｅａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｒｅｇｎａｎ
ｓ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｒｅｓｉｎｉｆｅｒａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｒ
ｏｂｕｓｔａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｒｕｄｉｓ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｓ
ａｌｉｇｎａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｓｉｄｅｒｏｘｙｌｏｎ、Ｅｕｃａｌｙ
ｐｔｕｓ ｓｔｕａｒｔｉａｎａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｔｅｒｅｔｉｃｏｒ
ｎｉｓ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｔｏｒｅｌｌｉａｎａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ
ｕｒｎｉｇｅｒａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｕｒｏｐｈｙｌｌａ、Ｅｕｃａｌ
ｙｐｔｕｓ ｖｉｍｉｎａｌｉｓ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｖｉｒｉｄｉｓ、Ｅ
ｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｗａｎｄｏｏ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｙｏｕｍａｎｎｉ
のようなユーカリと、上記の種のいずれかのハイブリッドとを含むが、これらに
限定されない。
【００５９】 遺伝子コンストラクトを標的植物のゲノムに安定的に取り込むための技術は当
業者に周知であり、アグロバクテリウム・ツメファシエンス菌を介した導入法、
エレクトロポレーション法、プロトプラスト融合法、生殖器官注入法、未熟胚注
入法、高速発射体導入法（ｈｉｇｈ ｖｅｌｏｃｉｔｙ ｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ
ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）等が含まれる。どの技術を選択するかは、形質転
換される標的植物により異なる。例えば、双子葉類植物およびいくつかの単子葉
類および裸子植物は、例えばＢｅｖａｎ（ベバン）（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ
ｓ Ｒｅｓ．１２巻、８７１１−８７２１頁、１９８４年）に記載のアグロバク
テリウムＴｉプラスミド技術によって形質転換できる。本発明の遺伝子コンスト
ラクトの導入の標的には、葉組織のような組織、解離細胞、プロトプラスト、種
子、胚、分裂組織領域、子葉、胚軸およびこれらに類するものが含まれる。ユー
カリおよびマツを形質転換する好ましい方法は、花粉（例えば、Ａｒｏｎｅｎ、
Ｆｉｎｎｉｓｈ Ｆｏｒｅｓｔ Ｒｅｓ．Ｐａｐｅｒｓ、５９５巻、５３頁、１
９９６年を参照）または容易に再生可能な胚組織を用いるバイオリスティック（
ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）な方法である。
【００６０】 細胞が形質転換されると、ゲノムに取り込まれた本発明の遺伝子コンストラク
トを有する細胞は、上で説明したカナマイシン耐性マーカーのようなマーカーに
より選択できる。トランスジェニック細胞は、本発明の技術分野における周知技
術を用いて、植物全体を再生するための適当な培地中で培養される。プロトプラ
ストの場合は、細胞壁は適当な浸透圧条件下で再生させられる。種子または胚の
場合には、適当な発芽またはカルス誘導培地が用いられる。外植体については、
適当な再生培地が用いられる。植物の再生は、多くの種について十分に確立して
いる。林木の再生の総説としては、Ｄｕｎｓｔａｎ（ダンスタン）ら、「木本植
物における体細胞性胚発生（Ｓｏｍａｔｉｃ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉ
ｎ ｗｏｏｄｙ ｐｌａｎｔｓ）」、Ｔｈｏｒｐｅ（ソープ） ＴＡ編、植物の
試験管内胚発生（Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ｐｌ
ａｎｔｓ）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉｏｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｉｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ（カラント プラント サ
イエンス アンド バイオテクノロジー イン アグリカルチャー）、２０巻、
１２号、４７１−５４０頁、１９９５年）を参照のこと。スプルースの再生につ
いての具体的なプロトコールは、Ｒｏｂｅｒｔｓ（ロバーツ）ら、スプルースの
体細胞性胚発生（Ｓｏｍａｔｉｃ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ｓｐｒ
ｕｃｅ）、Ｒｅｄｅｎｂａｕｇｈ（ルダンボー） Ｋ編、シンシード：人工的な
種子の作物改良への応用（Ｓｙｎｓｅｅｄ： ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ
ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｓｅｅｄ ｔｏ ｃｒｏｐ ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ）
、ＣＲＣプレス、２３巻、４２７−４４９頁、１９９３年に説明されている。所
望の表現型を有する形質転換植物は、本発明の技術分野における周知技術を用い
て選抜される。得られた形質転換植物は、本発明の技術分野における周知技術を
用いて、次世代以降のトランスジェニック植物を得るために、有性的または無性
的な生殖で増殖させられる。
【００６１】 前記の説明のとおり、標的細胞中のＲＮＡ産生は、プロモーター配列の選択に
より、または標的宿主のゲノムに取り込まれたポリヌクレオチドの機能的なコピ
ー数またはインテグレーション部位の選択により制御できる。標的生物は、２以
上の本発明の遺伝子コンストラクトで形質転換され、遺伝子以上の活性を調整す
ることもある。同様に遺伝子コンストラクトは、関心のあるポリペプチドをコー
ドする２以上のオープン・リーディング・フレームを含むように、またはかかる
ポリペプチドをコードする遺伝子の２以上の非翻訳領域を含むように構築しても
よい。
【００６２】 本発明の単離ポリヌクレオチドは、ゲノムマッピング、物理地図マッピングお
よび遺伝子のポジショナルクローニングに有用である。さらに、以下に詳しく説
明するとおり、配列番号１−１４、２０、２２−６２、８１−８６および８８−
１１２として同定されたポリヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドプローブおよ
びプライマーを設計するのに利用可能である。本発明のポリヌクレオチドを用い
て設計されたオリゴヌクレオチドプローブは、スロットブロットＤＮＡ雑種形成
技術のような本発明の技術分野における周知技術を用いて、細胞内に十分に類似
性のあるＤＮＡおよびＲＮＡ配列を有するいかなる生物においても、遺伝子の存
在を検出し、遺伝子発現パターンを調べるために用いることができる。本発明の
ポリヌクレオチドを用いて設計されたオリゴヌクレオチドプライマーはＰＣＲ増
幅に利用できる。本発明のポリヌクレオチドを用いて設計されたオリゴヌクレオ
チドプローブおよびプライマーは、Ｓｙｎｔｅｎｉ（シンテーニ）（カリフォル
ニア州、パロ・アルト）のマイクロアレイ技術を含むさまざまなマイクロアレイ
技術との関連でも利用できる。
【００６３】 ここで使用された「オリゴヌクレオチド」という用語は、ポリヌクレオチド配
列の比較的短いセグメントであって、一般的には６個と６０個の間のヌクレオチ
ドを含むセグメントを指し、雑種形成アッセイ法に使用するプローブとポリメラ
ーゼ連鎖反応によるＤＮＡ増幅に使用するプライマーとの両方を含む。
【００６４】 あるオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーが、配列番号１−１４、２
０、２２−６２、８１−８６および８８−１１２として提示された１の配列を含
む本発明のポリヌクレオチドまたは変異体に「対応する（ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄ
ｉｎｇ ｔｏ）」と記載されるのは、前記オリゴヌクレオチドプローブまたはプ
ライマー、あるいはその相補体が、配列番号１−１４、２０、２２−６２、８１
−８６および８８−１１２として提示された１の配列か、または前記配列番号で
特定された配列の１の変異体かに含まれるときである。本発明のオリゴヌクレオ
チドプローブおよびプライマーは、ここに開示されるポリヌクレオチドと実質的
に相補的な配列を有する。
【００６５】 ２つの１本鎖配列に実質的な相補性があると言えるのは、最適なアライメント
をとって比較すると、適当なヌクレオチド挿入および／または欠失を有する一方
の鎖のヌクレオチドが、他方の鎖のヌクレオチドの少なくとも８０％、好ましく
は少なくとも９０％ないし９５％、そしてより好ましくは少なくとも９８％ない
し１００％対合するときである。実質的な相補性が存在するのは、第１のＤＮＡ
鎖が、第２のＤＮＡ鎖と、ストリンジェントな雑種形成条件下で選択的に雑種形
成するときであるとするのが代替策である。相補性を決定するためのストリンジ
ェントな雑種形成条件は、塩類の条件が約１Ｍ未満で、より通常的なのは約５０
０ｍＭ未満で、好ましくは約２００ｍＭ未満である。雑種形成の温度は、５°Ｃ
でもよいが、一般的には約２２°Ｃ以上で、より好ましいのは約３０°Ｃ以上で
、最も好ましいのは約３７°Ｃ以上である。長いＤＮＡ断片ほど、特異的な雑種
形成には高い雑種形成温度が必要である。雑種形成のストリンジェントさは、プ
ローブ組成、有機溶媒の存在および塩基のミスマッチングの程度のような他の要
因の影響を受けるため、パラメーターの組み合わせは、どれか１のパラメーター
だけの絶対的な基準よりも重要である。
【００６６】 特定の実施態様では、オリゴヌクレオチドプローブおよび／またはプライマー
は、本発明のポリヌクレオチド配列に相補的な、少なくとも約６個の連続した残
基を含み、より好ましくは少なくとも約１０個の連続した残基を含み、最も好ま
しくは少なくとも約２０個の連続した残基を含む。本発明のプローブおよびプラ
イマーは約８個から１００個までの塩基対の長さであってもよいが、約１０個か
ら５０個の塩基対の長さが好ましく、約１５個から４０個の長さがより好ましい
。前記プローブは、ＤＮＡ−ＤＮＡ雑種形成のストリンジェントさと、アニーリ
ングおよび融解の温度と、ループ形成の可能性と、本発明の技術分野において周
知のその他の要因とを考慮して、本発明の技術分野で周知の手順を用いて容易に
選択できる。プローブの設計に適した、そして特にＰＣＲプライマーの設計に適
したツールおよびソフトウェアは、インターネット上で、例えばｈｔｔｐ：／／
ｗｗｗ．ｈｏｒｉｚｏｎｐｒｅｓｓ．ｃｏｍ／ｐｃｒ／で入手可能である。ＰＣ
Ｒプライマーの設計のための好ましい技術は、Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ（ディー
フェンバッハ）およびＤｙｋｓｌｅｒ（ディクスラー）、「ＰＣＲプライマー：
実験室マニュアル（ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎ
ｕａｌ）」、ＣＳＨＬプレス、ニューヨーク州、コールド・スプリング・ハーバ
ー、１９９５年にも開示されている。
【００６７】 本発明のポリヌクレオチドに対応する複数のオリゴヌクレオチドプローブまた
はプライマーは、キットの形で提供されるかもしれない。かかるキットは、一般
的には複数のＤＮＡまたはオリゴヌクレオチドプローブを含み、それぞれのプロ
ーブは、あるポリヌクレオチド配列に特異的である。本発明のキットは、配列番
号１−１４、２０、２２−６２、８１−８６および８８−１１２に同定されたポ
リヌクレオチド配列を含み、本発明のポリヌクレオチドに対応する１以上のプロ
ーブまたはプライマーを含む。
【００６８】 ハイスループットアッセイ法に有用な１の実施態様では、本発明のオリゴヌク
レオチドプローブキットは、固体の表面上の予め定められた（ｐｒｅｄｅｔｅｒ
ｍｉｎｅｄ）番地により空間的な位置指定ができる（ｓｐａｔｏａｌｌｙ ａｄ
ｒｅｓｓａｂｌｅ）場所に各プローブが不動化された、アレイ状のフォーマット
の複数のプローブを含む。本発明で有効に用いられるアレイ状フォーマットは、
例えば米国特許明細書第５、４１２、０８７号明細書、第５、５４５、４５１号
明細書および国際公開パンフレットＷＯ第９５／００４５０号に開示されており
、その開示内容は、ここでは参照文献として取り込まれている。
【００６９】 本発明のポリヌクレオチドは、生物またはその繁殖材料のタグづけをし、同定
するためにも用いられる。かかるタグづけは、例えば非破壊的で機能のない異種
由来の識別子ポリヌクレオチドであって、本発明の１つのポリヌクレオチドを含
むポリヌクレオチドを、生物に安定的に導入することにより達成できる。
【００７０】 以下の実施例は、例示のために与えられるのであり、限定のためではない。
【００７１】
【実施例】
実施例１ Ｐｉｎｕｓ ｒａｄｉａｔａ由来ユビキチン遺伝子プロモーターの単離と解析 Ｐｉｎｕｓ ｒａｄｉａｔａ由来ｃＤＮＡ発現ライブラリは以下のとおり構築
され、スクリーニングされた。ｍＲＮＡは、Ｃｈａｎｇ（チャン）ら、（Ｐｌａ
ｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ（プラント モ
レキュラー バイオロジー レポーター）、１１巻、１１３−１１６頁、１９９
３年）のプロトコールに若干の改変を施したものを用いて、植物組織から抽出さ
れた。具体的には、サンプルは、ＣＰＣ−ＲＮＡＸＢ（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−
Ｃｌ、ｐＨ ８，０；２５ｍＭ ＥＤＴＡ；２．０Ｍ ＮａＣｌ；２％ ＣＴＡ
Ｂ；２％ ＰＶＰおよび０．０５％ スペルミジン＊３ＨＣｌ）に溶解され、２
４：１のクロロフォルム：イソアミルアルコールで抽出された。ｍＲＮＡは、エ
タノール沈殿され、全ＲＮＡ調製物は、ポリ（Ａ）クイックｍＲＮＡアイソレー
ションキット（ストラタジーン（Ｓｔｒａｇｔａｇｅｎｅ）、カリフォルニア州
、ラホヤ）を用いて精製された。ｃＤＮＡ発現ライブラリは、この精製ｍＲＮＡ
から製造者のプロトコールに従ってＺＡＰエキスプレスｃＤＮＡ合成キット（ス
トラタジーン）を用いて、逆転写酵素合成された後、得られたｃＤＮＡクローン
をラムダＺＡＰへ挿入することにより構築された。得られたｃＤＮＡは、５μｌ
のライゲーションミックスに１μｌのサンプルＤＮＡを用いて、ギガパックＩＩ
パッケージングエキストラクト（ストラタジーン）でパッケージングを行った。
ライブラリの大量切り出し（ｍａｓｓ ｅｘｃｉｓｉｏｎ）は、ＸＬ１−Ｂｌｕ
ｅ ＭＲＦ’細胞およびＸＬＯＬＲ細胞（ストラタジーン）を、ＥｘＡｓｓｉｓ
ｔヘルパーファージ（ストラタジーン）とともに用いて行われた。切り出された
ファージミドは、ＮＺＹブロス（ギブコＢＲＬ、メリーランド州、ゲイザースバ
ーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ））で希釈され、Ｘ−ｇａｌおよびイソプロピ
ルチオ−β−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）を含むＬＢ−カナマイシン寒天プレート
上に播かれた。
【００７２】 ＤＮＡミニプレップ用にプレートされ釣り上げられたコロニーのうち、９９％
は配列決定に適したインサートを含んでいた。陽性クローンはカナマイシン入り
のＮＺＹブロス中で培養され、ｃＤＮＡはアルカリ溶菌法とポリエチレングリコ
ール（ＰＥＧ）沈殿法により精製された。１％のアガロースゲルが、シーケンシ
ング用鋳型に染色体の混入があるかどうかをスクリーニングするために用いられ
た。ダイプライマー配列は、ターボカタリスト８００マシン(パーキン・エルマ
ー／アプライド・バイオシステムズ部門、カリフォルニア州 フォスターシティ
)を製造者のプロトコールに従って用いて調製された。
【００７３】 陽性クローンのＤＮＡ配列は、パーキン・エルマー／アプライド・バイオシス
テムズ部門のプリズム（Ｐｒｉｓｍ）３７７シーケンサーを用いて得られた。ｃ
ＤＮＡクローンは、まず５’末端側から、そして場合によっては３’末端側から
も配列決定された。一部のクローンについては、内部の配列は、サブクローニン
グされた断片を用いて得られた。サブクローニングは、制限酵素切断部位マッピ
ングおよびｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ＋ベクターへのサブクローニン
グという標準的な手法を用いて行われた。
【００７４】 以下の説明のとおり、同定された配列で最も多かったものの１つはユビキチン
遺伝子で、今後は「スーパーユビキチン」遺伝子という。
【００７５】 ユビキチン遺伝子を含むｃＤＮＡクローンの単離 ユビキチン遺伝子と相同性のあるｃＤＮＡクローンの配列は上記のハイスルー
プットｃＤＮＡ配列決定から得られた。いくつかの独立のクローン由来の配列は
コンティグ（ｃｏｎｔｉｇ）に集約され、コンセンサス配列が重複するクローン
から生成された。単離されたスーパーユビキチンクローンの、プロモーター領域
（イントロンを含む）、コーディング領域および３’非翻訳領域（ＵＴＲ）を含
む決定されたヌクレオチド配列は配列番号１に提供される。５’ＵＴＲは１ない
し２０６４の残基で、イントロンは１１９６ないし２０３３の残基で、３個の直
列反復配列を含むコーディング領域は２０６５ないし２７５１の残基であった。
３’ＵＴＲは３２８残基の長さ（２７５５ないし３０８３の残基）である。イン
トロンを含むスーパーユビキチンプロモーター領域のみのヌクレオチド配列は配
列番号２に示される。イントロンを除いたスーパーユビキチンプロモーター領域
のみのヌクレオチド配列は配列番号３に示される。Ｐｉｎｕｓ ｒａｄｉａｔａ
スーパーユビキチンの予測アミノ酸配列は配列番号８０に提供される。
【００７６】 ユビキチンタンパク質はタンパク質分解経路の一部として機能し、タンパク質
に共有結合して分解のための目印になる（総説として、Ｂｅｌｋｎａｐ（ベルク
ナップ）およびＧａｒｂａｒｉｎｏ（ガルバリーノ）、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐ
ｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（トレンズ イン プラント サイエンシズ）、１
巻、３３１−３３５頁、１９９６年を参照せよ）。このタンパク質は単一ｍＲＮ
Ａにエンコードされた前駆体ポリペプチドから産生される。スーパーユビキチン
ｍＲＮＡはこのユビキチン単量体を３コピー含む。
【００７７】 スーパーユビキチンプロモーターのクローニング スーパーユビキチンプロモーターの断片はＰＣＲにもとづく２つの異なるアプ
ローチでクローニングされた。
【００７８】 第１の方法：長距離遺伝子歩行ＰＣＲ 「長距離遺伝子歩行（Ｌｏｎｇ Ｄｉｓｔａｎｃｅ Ｇｅｎｅ Ｗａｌｋｉｎ
ｇ）」ＰＣＲ（Ｍｉｎ（ミン）およびＰｏｗｅｌｌ（パウエル）、Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｉｑｕｅｓ（バイオテクニクス）、２４巻、３９８−４００頁、１９９８年
）を用いて、ユビキチン遺伝子のコーディング領域の全体と、５’ＵＴＲの９０
０ｂｐのイントロンと、約１００ｂｐのプロモーターとを含む２ｋｂの断片が得
られた。
【００７９】 この断片を生成するために、２本の入れ子（ｎｅｓｔｅｄ）プライマーがマツ
由来の単離スーパーユビキチンｃＤＮＡ配列から設計された。上流の配列を増幅
するためのプライマーの設計には５’ＵＴＲを用いるのが一般的である。しかし
、スーパーユビキチンの利用可能な５’ＵＴＲは非常に短いため、この領域に由
来する２本の最初のプライマーはいかなる断片も増幅できなかった。そこで、３
’ＵＴＲから配列番号１５および１６のプライマーが設計された。
【００８０】 この方法は、はじめに配列番号１５のプライマーを用いてマツのゲノムＤＮＡ
を鋳型とする線形（ｌｉｎｅａｒ）ＰＣＲを行うことと、次にターミナルトラン
スフェラーゼを用いて１本鎖ＤＮＡ産物のＣテーリングを行うことを含む。この
断片を、第２のＰＣＲのステップでは配列番号１６のプライマーと配列番号１７
のＡＰプライマーとを用いる増幅の鋳型に用いた。前記ＡＰプライマーは、前記
ターミナルトランスフェラーゼで生成されたポリＣテール（ｐｏｌｙ Ｃ ｔａ
ｉｌ）に結合するように設計された。配列番号１６および１７の両方のプライマ
ーは、適当なベクターのＮｏｔＩ切断部位に増幅産物をクローニングするための
制限酵素ＮｏｔＩの切断部位を５’側に含んでいた。最終的なＰＣＲ産物は異な
るサイズの断片を含んでいた。これらの断片は電気泳動で分離され、最も大きい
断片がゲルから精製され、制限エンドヌクレアーゼＮｏｔＩで消化され、発現ベ
クターｐＢＫ−ＣＭＶ（ストラタジーン、カリフォルニア州、ラホヤ）のＮｏｔ
Ｉ部位にクローニングされた。これらのクローンの最大のものは、遺伝子の完全
なコーディング領域（イントロンは該コーディング領域にはみられなかった）と
、９００ｂｐのイントロンを含む５’ＵＴＲを含んでいた。
【００８１】 第２の方法：「ゲノム歩行者」キット スーパーユビキチン遺伝子プロモーターは「ゲノム歩行者（Ｇｅｎｏｍｅ Ｗ
ａｌｋｅｒ）」キット（クロンテク、カリフォルニア州、パロアルト）を用いて
クローニングされた。これもＰＣＲにもとづく方法で、２本のＰＣＲプライマー
を構築することが要求され、そのうちの１つは遺伝子特異的でなければならない
。ユビキチンのコーディング領域は高度に保存されているが、異なるユビキチン
遺伝子由来の５’ＵＴＲは保存されておらず、遺伝子特異的なプライマーを設計
するのに用いることができる。２．２ｋｂの断片が増幅され、ｐＧＥＭ−Ｔ−ｅ
ａｓｙ（プロメガ、ウィスコンシン州、マディソン）にサブクローニングされた
。ＰＣＲによる解析とＤＮＡ配列決定により、このクローンは前記９００ｂｐの
イントロンと約１ｋｂのプロモーターと思われる領域を含むスーパーユビキチン
遺伝子の５’ＵＴＲ配列を含むことが示された。５’ＵＴＲにイントロンがある
ことは植物のポリユビキチン遺伝子の共通の特徴であり、遺伝子発現レベルの決
定に関与するのかもしれない。
【００８２】 これらのＰＣＲ反応に用いられた遺伝子特異的プライマーは配列番号１８およ
び１９に提供される。
【００８３】 スーパーユビキチンの発現 遺伝子特異的な５’および３’ＵＴＲ配列由来のプライマーを用いて、異なる
植物組織におけるスーパーユビキチンの発現レベルがＲＴ−ＰＣＲにより調べら
れた。スーパーユビキチンは、枝の篩部と木部、細根（ｆｅｅｄｅｒ ｒｏｏｔ
）、受精した球果（ｃｏｎｅ）、針（ｎｅｅｄｌｅ）、一年性球果、花粉嚢（ｐ
ｏｌｌｅｎ ｓａｃ）、受粉した球果、根の木部、苗条（ｓｈｏｏｔ ｂｕｄ）
、構造根（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｒｏｏｔ）、幹の篩部、および幹を含む、全
ての植物の組織で発現されることがわかった。スーパーユビキチンの植物におけ
る発現は、前記５’ＵＴＲから調製されたＰＣＲプローブを用いるノザンブロッ
トアッセイ法でも証明された。
【００８４】 スーパーユビキチンプロモーターの機能的な解析 植物におけるスーパーユビキチンプロモーターの機能をテストするために、配
列番号２または配列番号３のいずれかの（すなわち、イントロン有りまたは無し
の）スーパーユビキチンプロモーターと操作可能に連結された緑蛍光タンパク質
（ＧＦＰ）のレポーター遺伝子でシロイヌナズナが形質転換された。プロモータ
ーをもたないコンストラクトは陰性の対照実験に用いられ、ＧＦＰの前にクロー
ニングされたＣａＭＶ３５ｓプロモーターを有する植物のＴ−ＤＮＡベクターは
陽性の対照実験に用いられた。これらのコンストラクトはアグロバクテリウムを
介する形質転換によりシロイヌナズナに導入された。
【００８５】 全ての植物培養培地は、Ｖａｌｖｅｋｅｎｓ（バルブケン）およびＶａｎ Ｍ
ｏｎｔａｇｕ（バン・モンターグ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ、８５巻、５５３６−５５４０頁、１９８８年のプロトコールに若干の改
変を施した上で従った。根の形質転換には、消毒した種子が発芽培地の表面に一
列に並べられ、根の回収（ｒｏｏｔ ｈａｒｖｅｓｔｉｎｇ）を容易にするため
プレートは立てかけられ（ｐｌａｃｅｄ ｏｎ ｔｈｅｉｒ ｓｉｄｅｓ）、種
子は２週間、２４°Ｃ、１６時間の光周期で育てられた。
【００８６】 コンストラクトの発現は緑蛍光タンパク質（ＧＦＰ）についてのレポーター遺
伝子の発現レベルを測定することにより調べられた。予備的なＧＦＰの発現（一
過性）がＴ−ＤＮＡ導入の際の初期のトランスジェニックな根で検出された。緑
色のカルスに発生したトランスジェニックな根は、５０μｇ／ｍｌ カナマイシ
ンと１００μｇ／ｍｌ チメンチンを含むシュート誘導培地上で育てられ、さら
にＧＦＰ発現についてテストされた。カナマイシン培地での厳しい選択の数週間
の後、いくつかの独立のトランスジェニックなシロイヌナズナ株が作成され、Ｇ
ＦＰ発現についてテストされた。
【００８７】 イントロンを含むスーパーユビキチンプロモーターとイントロンを含まないス
ーパーユビキチンプロモーターの両方で発現がみられた。しかし、予備的な結果
から、イントロン無しのスーパーユビキチンプロモーターコンストラクトで得ら
れた発現のレベルはイントロンを含むプロモーターで見られた発現よりも著しく
高いことがわかり、前記イントロンにはレプレッサーが含まれるかもしれないこ
とを示唆した。前記イントロンの配列は配列番号２１に提供される。
【００８８】 実施例２ Ｐｉｎｕｓ ｒａｄｉａｔａ由来ＣＤＣプロモーターの単離 細胞分裂制御（ＣＤＣ）タンパク質遺伝子と相同性のある植物のＥＳＴ配列が
、実施例１に記載のＰｉｎｕｓ ｒａｄｉａｔａ由来ｃＤＮＡ発現ライブラリか
ら単離された。上記の「ゲノム歩行者」プロトコールおよびこれらの植物ＥＳＴ
配列から設計された遺伝子特異的プライマーを用いて、Ｐｉｎｕｓ ｒａｄｉａ
ｔａのＣＤＣ遺伝子のプロモーターとおもわれる配列を含む５’ＵＴＲ配列がゲ
ノムＤＮＡから単離された。決定されたヌクレオチド配列は配列番号４に示され
る。
【００８９】 実施例３ Ｐｉｎｕｓ ｒａｄｉａｔａ由来木部化特異的プロモーターの単離 植物の木部化に特異的な植物ＥＳＴ配列は、本質的には実施例１に記載のとお
り、Ｐｉｎｕｓ ｒａｄｉａｔａの木部由来ｃＤＮＡ発現ライブラリから単離さ
れた。上記の「ゲノム歩行者」プロトコールおよびこれらの植物ＥＳＴ配列から
設計された遺伝子特異的プライマーを用いて、Ｐｉｎｕｓ ｒａｄｉａｔａの木
部化特異的プロモーターと思われるものを含む配列がゲノムＤＮＡから単離され
た。決定されたヌクレオチド配列は配列番号５および４１−４４に提供される。
配列番号４１−４４のクローンについての拡張されたｃＤＮＡ配列が配列番号９
２に提供される。
【００９０】 実施例４ Ｐｉｎｕｓ ｒａｄｉａｔａ由来４−クマラートＣｏＡリガーゼプロモーター
の単離 ４−クマラートＣｏＡリガーゼ（４ＣＬ）と相同性のある植物ＥＳＴ配列がＰ
ｉｎｕｓ ｒａｄｉａｔａ由来ｃＤＮＡ発現ライブラリから実施例１に記載のと
おりに単離された。上記の「ゲノム歩行者」プロトコールおよびこれらの植物Ｅ
ＳＴ配列から設計された遺伝子特異的プライマーを用いて、Ｐｉｎｕｓ ｒａｄ
ｉａｔａの４ＣＬプロモーターと思われるものを含む配列がゲノムＤＮＡから単
離された。決定されたヌクレオチド配列は配列番号６に示される。
【００９１】 配列番号６のプロモーターと操作可能に連結された緑蛍光タンパク質（ＧＦＰ
）についてのレポーター遺伝子またはＧＵＳレポーター遺伝子を含むＤＮＡコン
ストラクトが用意され、シロイヌナズナ植物を形質転換するために用いられた。
【００９２】 実施例５ Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｇｒａｎｄｉｓ由来セルロースシンターゼプロモータ
ーの単離 セルロースシンターゼ遺伝子と相同性のある植物ＥＳＴ配列が、本質的には実
施例１に記載のとおり、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｇｒａｎｄｉｓ由来ｃＤＮＡ発
現ライブラリから単離された。上記の「ゲノム歩行者」プロトコールおよびこれ
らの植物ＥＳＴ配列から設計された遺伝子特異的プライマーを用いて、Ｅｕｃａ
ｌｙｐｔｕｓ ｇｒａｎｄｉｓのセルロースシンターゼ遺伝子のプロモーターと
思われるものを含む配列がゲノムＤＮＡから単離された。異なるＤＮＡバンドを
鋳型として用いる独立のＰＣＲ実験から、多数の塩基の相違がある２つの配列が
得られた。一方のバンドは７５０ｂｐの長さで、このバンドのヌクレオチド配列
は配列番号７に示される。他方のバンドは３ｋｂの長さであった。このバンドの
３’末端の配列は、配列番号７に示す配列と対応したが、多数の塩基対の相違が
あった。この３’末端の配列は配列番号８に示される。このバンドの５’末端の
配列は配列番号２０に示される。
【００９３】 実施例６ Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｇｒａｎｄｉｓ由来葉特異的プロモーターの単離 葉に特異的な植物ＥＳＴ配列が、本質的には実施例１に記載のとおり、Ｅｕｃ
ａｌｙｐｔｕｓ ｇｒａｎｄｉｓの葉の組織由来ｃＤＮＡ発現ライブラリから単
離された。上記の「ゲノム歩行者」プロトコールおよびこれらの植物ＥＳＴ配列
から設計された遺伝子特異的プライマーを用いて、新規なＥｕｃａｌｙｐｔｕｓ
ｇｒａｎｄｉｓ遺伝子（機能不明）の葉特異的プロモーターを含む５’ＵＴＲ
配列がゲノムＤＮＡから単離された。異なるＤＮＡバンドを用いる独立のＰＣＲ
実験から、多数の塩基の相違と欠失がある３つの配列が得られた。これら３つの
ＰＣＲ断片の決定されたヌクレオチド配列は配列番号９−１１に示される。
【００９４】 実施例７ Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｇｒａｎｄｉｓ由来Ｏ−メチルトランスフェラーゼプ
ロモーターの単離 Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＯＭＴ）と相同性のある植物ＥＳＴ配列が、
本質的には実施例１に記載のとおり、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｇｒａｎｄｉｓ由
来ｃＤＮＡ発現ライブラリから単離された。上記の「ゲノム歩行者」プロトコー
ルおよびこれらの植物ＥＳＴ配列から設計された遺伝子特異的プライマーを用い
て、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｇｒａｎｄｉｓＯＭＴ遺伝子のプロモーターと思わ
れるものを含む５’ＵＴＲ配列がゲノムＤＮＡから単離された。決定されたヌク
レオチド配列は配列番号１２に示される。
【００９５】 配列番号１２のプロモーターと操作可能に連結された緑蛍光タンパク質（ＧＦ
Ｐ）についてのレポーター遺伝子を含むＤＮＡコンストラクトが用意され、シロ
イヌナズナを形質転換するのに用いられた。
【００９６】 実施例８ Ｐｉｎｕｓ ｒａｄｉａｔａ由来根特異的なプロモーターの単離 根特異的な受容体様キナーゼ遺伝子と相同性のある植物ＥＳＴ配列が実施例１
に記載のとおり、Ｐｉｎｕｓ ｒａｄｉａｔａ由来ｃＤＮＡ発現ライブラリから
単離された。上記の「ゲノム歩行者」プロトコールおよびこれらの植物ＥＳＴ配
列から設計された遺伝子特異的プライマーを用いて、Ｐｉｎｕｓ ｒａｄｉａｔ
ａの根特異的プロモーターと思われるものを含む５’ＵＴＲ配列がゲノムＤＮＡ
から単離された。２回の独立のＰＣＲ実験から、多数の塩基の相違がある配列が
得られた。これらの２回の実験から決定されたヌクレオチド配列が配列番号１３
、１４、１１０および１１１に示される。
【００９７】 実施例９ Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｇｒａｎｄｉｓ由来ＥＦ１−αプロモーターの単離 ユーカリの伸長因子−α（ＥＦ１−α）遺伝子と相同性のある植物ＥＳＴ配列
がＥｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｇｒａｎｄｉｓ由来ｃＤＮＡ発現ライブラリから単離
され、以下のとおり、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｇｒａｎｄｉｓのゲノムＤＮＡラ
イブラリをスクリーニングするのに用いられた。
【００９８】 Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｇｒａｎｄｉｓのゲノムＤＮＡライブラリは、Ｄｏｙ
ｌｅ（ドイル）およびＤｏｙｌｅ、Ｆｏｃｕｓ（フォーカス）、１２巻、１３−
１５頁、１９９０年のプロトコールに若干の改変を施したものに従って、Ｅｕｃ
ａｌｙｐｔｕｓ ｎｉｔｅｎｓ ｘ ｇｒａｎｄｉｓの植物組織から抽出したゲ
ノムＤＮＡを用いて構築された。具体的には、植物組織は液体窒素の下で粉砕さ
れ、２Ｘ ＣＴＡＢ抽出バッファー（２％ ＣＴＡＢ、臭化ヘクサデシルトリメ
チルアンモニウム（ｈｅｘａｄｅｃｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ
ｂｒｏｍｉｄｅ）；１．４Ｍ ＮａＣｌ；２０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ ８．０；
１００ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ８．０；１％ ポリビニルピロリドン）に溶
解された。クロロフォルム：イソアミルアルコール（２４：１）での抽出の後、
１０％ ＣＴＡＢが水層に加えられ、クロロフォルム：イソアミルアルコール抽
出が繰り返された。ゲノムＤＮＡはイソプロパノールで沈殿された。
【００９９】 得られたＤＮＡは、標準的な手順の後、制限エンドヌクレアーゼＳａｕＡ１で
消化され、フェノール：クロロフォルム：イソアミルアルコール（２５：２４：
１）で１回抽出され、エタノールで沈殿された。消化された断片は、超遠心機を
用いてスクロース密度勾配で分離された。９−２３ｋｂの断片を含む分画がプー
ルされてエタノールで沈殿された。得られた断片は、製造者のプロトコールに従
ってギガパックＩＩパッケージングエキストラクト（ストラタジーン、カリフォ
ルニア州、ラホヤ）を用いてパッケージングを行い、ラムダＤＡＳＨ ＩＩ／Ｂ
ａｍＨＩベクター（ストラタジーン）にクローニングされた。このライブラリは
一度増幅された。
【０１００】 このライブラリはＥｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｇｒａｎｄｉｓライブラリ（実施例
１に記載）から単離され、ユーカリのＥＦ１−α遺伝子と相同性を示す放射能標
識ＥＳＴ断片で、スクリーニングされた。ファージのライセート（ｌｙｓａｔｅ
）が陽性のプラークから調製され、ゲノムＤＮＡが抽出された。
【０１０１】 このゲノムＤＮＡから、前記ユーカリ属ＥＦ１−α遺伝子のプロモーターと思
われるものを含む５’ＵＴＲ領域が、ＥＬＯＮＧＡＳＥ増幅システム（ギブコＢ
ＲＬ）を用いて得られた。１０ｋｂの断片が増幅され、制限酵素切断地図が作成
された。前記ユーカリ属伸長因子Ａ（ＥＦ１−α）遺伝子のプロモーターと思わ
れるものは４ｋｂの断片に同定され、工作されたＮｏｔＩ部位を含むｐＵＣ１９
ベクター（ギブコＢＲＬ）にサブクローニングされた。前記プロモーター領域を
含む単離された断片の決定されたゲノムＤＮＡ配列は、配列番号６１および６２
に提供され、配列番号６１にエンコードされた予測アミノ酸配列は配列番号７９
に提供された。
【０１０２】 実施例１０ Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｇｒａｎｄｉｓ由来花特異的プロモーターの単離 花由来の組織に特異的な植物ＥＳＴ配列が、本質的には実施例１に記載のとお
りに、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｇｒａｎｄｉｓの花の組織由来ｃＤＮＡ発現ライ
ブラリから単離された。上記の「ゲノム歩行者」プロトコールおよびこれらの植
物ＥＳＴ配列から設計された遺伝子特異的プライマーを用いて、Ｅｕｃａｌｙｐ
ｔｕｓ ｇｒａｎｄｉｓの花特異的プロモーターと思われるものをそれぞれ含む
いくつかの配列がゲノムＤＮＡから単離された。決定されたヌクレオチド配列は
配列番号２９−３３および５９に示される。配列番号３０−３３のクローンの拡
張されたｃＤＮＡ配列は配列番号８９に提供される。配列番号２９のクローンの
拡張されたｃＤＮＡ配列は配列番号９０に提供される。
【０１０３】 実施例１１ Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｇｒａｎｄｉｓおよびＰｉｎｕｓ ｒａｄｉａｔａ由
来花粉特異的プロモーターの単離 花粉特異的な植物ＥＳＴ配列が、本質的には実施例１に記載のとおりに、Ｅｕ
ｃａｌｙｐｔｕｓ ｇｒａｎｄｉｓおよびＰｉｎｕｓ ｒａｄｉａｔａの花粉由
来ｃＤＮＡ発現ライブラリから単離された。上記の「ゲノム歩行者」プロトコー
ルおよびこれらの植物ＥＳＴ配列から設計された遺伝子特異的プライマーを用い
て、花粉特異的プロモーターと思われるものをそれぞれ含むいくつかの配列がゲ
ノムＤＮＡから単離された。Ｐｉｎｕｓ ｒａｄｉａｔａから単離され決定され
たヌクレオチド配列は配列番号４９−５３に示され、配列番号５１−５３にエン
コードされた予測アミノ酸配列は配列番号７３−７５にそれぞれ提供される。配
列番号４９のクローンについての拡張されたｃＤＮＡ配列は配列番号９４に提供
される。
【０１０４】 実施例１２ Ｐｉｎｕｓ ｒａｄｉａｔａ由来芽特異的および分裂組織特異的プロモーター
の単離 芽および分裂組織に特異的な植物ＥＳＴ配列が、本質的には実施例１に記載の
とおり、Ｐｉｎｕｓ ｒａｄｉａｔａの芽および分裂組織由来ｃＤＮＡ発現ライ
ブラリから単離された。上記の「ゲノム歩行者」プロトコールおよびこれらの植
物ＥＳＴ配列から設計された遺伝子特異的プライマーを用いて、２個の配列、す
なわち一方は芽特異的プロモーターと思われるものを含む配列で、他方は分裂組
織特異的プロモーター特異的プロモーターと思われるものを含む配列がゲノムＤ
ＮＡから単離された。これら２つのプロモーターについて決定されたヌクレオチ
ド配列は配列番号４０および４５に与えられる。配列番号４０および４５にエン
コードされた予測アミノ酸配列は、配列番号７０および７１にそれぞれ提供され
る。
【０１０５】 実施例１３ Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｇｒａｎｄｉｓ由来のプロモーターの単離 さまざまな既知の遺伝子に対してある程度の相同性を示す植物ＥＳＴ配列が、
本質的には実施例１に記載のとおり、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｇｒａｎｄｉｓ由
来ｃＤＮＡ発現ライブラリから単離された。オーキシン誘導性タンパク質（配列
番号２６−２８）、カルボニックアンヒドラーゼ（配列番号３６）、イソフラボ
ンレダクターゼ（配列番号３７および３８）、花粉アレルゲン（配列番号２３−
２５）、花粉コートタンパク質（配列番号２２）、スクロースシンターゼ（配列
番号５６−５８）、ユビキチン（配列番号３４）、グリセルアルデヒド−３−リ
ン酸デヒドロゲナーゼ（配列番号３５および３９）、Ｏ−メチルトランスフェラ
ーゼ（ＯＭＴ、配列番号６０）、哺乳類由来マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩ
Ｆ、配列番号８１−８６）、ＵＤＰグルコース６−デヒドロゲナーゼ（配列番号
１０３）、ラッカーゼ１（配列番号１０５、１０６）、アラビノガラクタン様１
（配列番号１０７）、アラビノガラクタン様２（配列番号１０８、１０９）およ
び理論的に予測されるタンパク質（配列番号１０４）のＥｕｃａｌｙｐｔｕｓ
ｇｒａｎｄｉｓ遺伝子についてプロモーターと思われるものを含む配列が、上記
の「遺伝子歩行者」プロトコールとこれらの植物ＥＳＴ配列から設計された遺伝
子特異的なプロモーターを用いて、ゲノムＤＮＡから単離された。配列番号２２
、２５、２６、２８、３４、３５、３６、５６、５７、６０および８６のＤＮＡ
配列にエンコードされる予測アミノ酸配列は、それぞれ配列番号６３、６４、６
５、６６、６７、６８、６９、７６、７７、７８および８７に提供される。配列
番号５８および３５のクローンについての拡張されたｃＤＮＡ配列は、それぞれ
配列番号９１および９３に提供される。
【０１０６】 実施例１４ Ｐｉｎｕｓ ｒａｄｉａｔａ由来のプロモーターの単離 さまざまな既知遺伝子に対してある程度の相同性を示す植物ＥＳＴ配列が、本
質的には実施例１に記載のとおり、Ｐｉｎｕｓ ｒａｄｉａｔａ由来ｃＤＮＡ発
現ライブラリから単離された。老化（ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ）様タンパク質（配
列番号４６−４８）、ノデュリンのホモログ花粉特異的（配列番号５４および５
５）、カルコン生成酵素（配列番号８８）、ＰｒＭＡＬＥ１（配列番号９５、９
６）、ＵＤＰグルコースグリコシルトランスフェラーゼ（配列番号９７）、伸長
因子１α（配列番号９８、９９）、Ｓ−アデノシルメチオニンシンターゼ（配列
番号１００−１０２）およびＰｉｎｕｓ ｒａｄｉａｔａ脂質転移タンパク質２
（ＰｒＬＴＰ２、配列番号１１２）のＰｉｎｕｓ ｒａｄｉａｔａ遺伝子につい
て、「ゲノム歩行者」プロトコールとこれらの植物ＥＳＴ配列から設計された遺
伝子特異的なプライマーを用いて、プロモーターと思われるものを含む配列がゲ
ノムＤＮＡから単離された。配列番号４６の配列にエンコードされた予測アミノ
酸配列は配列番号７２に提供される。
【０１０７】 実施例１５ ポリヌクレオチドおよびアミノ酸解析 上記の決定されたｃＤＮＡ配列は、（１９９９年９月更新の）ＥＭＢＬデータ
ベース中の既知配列と比較され、アライメントがとられた。具体的には、配列番
号２２−６２および８８−１１２に同定されたポリヌクレオチドは、「ｂｌａｓ
ｔａｌｌ −ｐ ｂｌａｓｔｎ −ｄ ｅｍｂｌｄｂ −ｅ １０ −Ｇ０ −
Ｅ０ −ｒ１ −ｖ３０ −ｂ３０ −ｉ ｑｕｅｒｙｓｅｑ −ｏ ｒｅｓｕ
ｌｔｓ」というＵＮＩＸ（登録商標）ランニングコマンドに設定されたＢＬＡＳ
ＴＮアルゴリズムバージョン２．０．６（１９９８年９月１６日）を用いて比較
された。冗長配列の複数のアライメントが、信頼できるコンセンサス配列を作成
するのに用いられた。他の植物種または非植物種由来の既知配列に対する類似性
にもとづいて、配列番号２２−６２および８８−１１２として同定された本発明
の単離ポリヌクレオチドが上記の表１に示す機能を有するものと推定的に同定さ
れた。
【０１０８】 配列番号１−２２、２３、２５−４２、４５−４９、５７−５９、６２、８８
−９９および１０１−１１２のｃＤＮＡ配列は、上記のとおりにコンピューター
アルゴリズムＢＬＡＳＴＮを用いて前記ＥＭＢＬデータベース中の配列に対して
４０％未満の同一性しかないと決定された。配列番号５６のｃＤＮＡ配列は、上
記のとおりにコンピューターアルゴリズムＢＬＡＳＴＮを用いて前記ＥＭＢＬデ
ータベース中の配列に対して６０％未満の同一性しかないと決定された。配列番
号４３、５２、６０および６１のｃＤＮＡ配列は、上記のとおりにコンピュータ
ーアルゴリズムＢＬＡＳＴＮを用いて前記ＥＭＢＬデータベース中の配列に対し
て７５％未満の同一性しかないと決定された。配列番号２４、５１および１００
のｃＤＮＡは、上記のとおりにコンピューターアルゴリズムＢＬＡＳＴＮを用い
て前記ＥＭＢＬデータベース中の配列に対して９０％未満の同一性しかないと決
定された。
【配列表】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｃ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ライス、 スティーブン ジェイ ニュージーランド オークランド パパト ートー ランジトート ロード １／164 (72)発明者 イーグルトン、 クレア キャサリン ニュージーランド オークランド パクラ ンガ ペニークック プレイス 14 Ｆターム(参考） 2B030 AA03 AB03 AD20 CA06 CA17 CA19 CB03 4B024 AA08 AA11 BA79 CA04 DA01 FA02 FA07 GA11 HA11 4B063 QA08 QA17 QQ04 QR78 QR80 QS31 QS38 QX10 4B065 AA88X AA88Y AB01 AC14 AC20 BA02 CA24 CA53 4H045 AA10 AA20 BA10 CA30 FA74

Claims (22)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 （ａ）配列番号２−１４、２０、２２−３３、３５−４３、
    ４５−４９、５１、５２、５６−６２および８８−１１２に列挙された配列、（
    ｂ）配列番号２−１４、２０、２２−３３、３５−４３、４５−４９、５１、５
    ２、５６−６２および８８−１１２に列挙された配列の相補体、（ｃ）配列番号
    ２−１４、２０、２２−３３、３５−４３、４５−４９、５１、５２、５６−６
    ２および８８−１１２に列挙された配列の逆相補体、（ｄ）配列番号２−１４、
    ２０、２２−３３、３５−４３、４５−４９、５１、５２、５６−６２および８
    ８−１１２に列挙された配列の逆配列、（ｅ）配列番号２−１４、２０、２２−
    ２３、２５−３３、３５−４２、４５−４９、５７−５９、６２、８８−９９お
    よび１０１−１１２に提供された配列に対しコンピューターアルゴリズムＢＬＡ
    ＳＴＮを用いて決定されたヌクレオチド同一性が少なくとも４０％ある配列、（
    ｆ）配列番号２−１４、２０、２２−２３、２５−３３、３５−４２、４５−４
    ９、５６−５９、６２、８８−９９および１０１−１１２に提供された配列に対
    しコンピューターアルゴリズムＢＬＡＳＴＮを用いて決定されたヌクレオチド同
    一性が少なくとも６０％ある配列、（ｇ）配列番号２−１４、２０、２２−２３
    、２５−３３、３５−４９、５２、５６−６１、６２、８８−９９および１０１
    −１１２に提供された配列に対しコンピューターアルゴリズムＢＬＡＳＴＮを用
    いて決定されたヌクレオチド同一性が少なくとも７５％ある配列、（ｈ）配列番
    号２−１４、２０、２２−３３、３５−４９、５１、５２、５６−６１、６２お
    よび８８−１１２に提供された配列に対しコンピューターアルゴリズムＢＬＡＳ
    ＴＮを用いて決定されたヌクレオチド同一性が少なくとも９０％ある配列からな
    るグループから選択された配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
  2. 【請求項２】 （ａ）配列番号１および３４に列挙された配列、（ｂ）配列
    番号１および３４に列挙された配列の相補体、（ｃ）配列番号１および３４に列
    挙された配列の逆相補体、（ｄ）配列番号１および３４に列挙された配列の逆配
    列、（ｅ）配列番号１および３４に列挙された配列に対しコンピューターアルゴ
    リズムＢＬＡＳＴＮを用いて決定されたヌクレオチド同一性が少なくとも４０％
    ある配列、（ｆ）配列番号１および３４に列挙された配列に対しコンピューター
    アルゴリズムＢＬＡＳＴＮを用いて決定されたヌクレオチド同一性が少なくとも
    ６０％ある配列、（ｇ）配列番号１および３４に列挙された配列に対しコンピュ
    ーターアルゴリズムＢＬＡＳＴＮを用いて決定されたヌクレオチド同一性が少な
    くとも７５％ある配列、（ｈ）配列番号１および３４に列挙された配列に対しコ
    ンピューターアルゴリズムＢＬＡＳＴＮを用いて決定されたヌクレオチド同一性
    が少なくとも９０％ある配列からなるグループから選択された配列を含む、単離
    されたポリヌクレオチド。
  3. 【請求項３】（ａ）配列番号１、２２、２５、２６、２８、３４、３５、３
    ６、４０、４５、４６、５１−５３、５６、５７、６０、６１および８６に列挙
    された配列、（ｂ）配列番号１、２２、２５、２６、２８、３４、３５、３６、
    ４０、４５、４６、５１−５３、５６、５７、６０、６１および８６の配列の相
    補体、（ｃ）配列番号１、２２、２５、２６、２８、３４、３５、３６、４０、
    ４５、４６、５１−５３、５６、５７、６０、６１および８６の配列の逆相補体
    、（ｄ）配列番号１、２２、２５、２６、２８、３４、３５、３６、４０、４５
    、４６、５１−５３、５６、５７、６０、６１および８６の配列の逆配列、（ｅ
    ）配列番号１、２２、２５、２６、２８、３４、３５、３６、４０、４５、４６
    、５１−５３、５６、５７、６０、６１および８６に提供された配列に対しヌク
    レオチド同一性が少なくとも４０％ある配列、（ｆ）配列番号１、２２、２５、
    ２６、２８、３４、３５、３６、４０、４５、４６、５１−５３、５６、５７、
    ６０、６１および８６に提供された配列に対しヌクレオチド同一性が少なくとも
    ６０％ある配列、（ｇ）配列番号１、２２、２５、２６、２８、３４、３５、３
    ６、４０、４５、４６、５１−５３、５６、５７、６０、６１および８６に提供
    された配列に対しヌクレオチド同一性が少なくとも７５％ある配列、（ｈ）配列
    番号１、２２、２５、２６、２８、３４、３５、３６、４０、４５、４６、５１
    −５３、５６、５７、６０、６１および８６に提供された配列に対しヌクレオチ
    ド同一性が少なくとも９０％ある配列からなるグループから選択されたポリヌク
    レオチドにエンコードされた、単離されたポリペプチド。
  4. 【請求項４】 前記ポリペプチドは配列番号６３−８０および８７からなる
    グループから選択された配列を含む、請求項３に記載の単離されたポリペプチド
    。
  5. 【請求項５】 請求項１および２のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含
    む、ＤＮＡコンストラクト。
  6. 【請求項６】 ５’から３’の方向に、（ａ）プロモーター配列、（ｂ）関
    心のあるＤＮＡ配列、（ｃ）遺伝子ターミネーション配列を含み、該プロモータ
    ー配列は請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチドを含む、ＤＮＡコンスト
    ラクト。
  7. 【請求項７】 前記関心のあるＤＮＡ配列は関心のあるポリペプチドをエン
    コードするオープン・リーディング・フレームを含む、請求項６に記載のＤＮＡ
    コンストラクト。
  8. 【請求項８】 前記関心のあるＤＮＡ配列は関心のあるポリペプチドをエン
    コードする遺伝子のノンコーディング領域を含む、請求項６に記載のＤＮＡコン
    ストラクト。
  9. 【請求項９】 請求項５ないし８のいずれかに記載のＤＮＡコンストラクト
    を含む、トランスジェニック細胞。
  10. 【請求項１０】 請求項９に記載のトランスジェニック細胞を含む生物。
  11. 【請求項１１】 請求項９に記載のトランスジェニック細胞を含む植物ある
    いは該植物の部分、零余子または子孫。
  12. 【請求項１２】 標的生物における遺伝子発現を改変するための方法であっ
    て、請求項５ないし８に記載のいずれかのＤＮＡコンストラクトを該標的生物の
    ゲノムに安定的に取り込むことを含む方法。
  13. 【請求項１３】 前記生物は植物である、請求項１２に記載の方法。
  14. 【請求項１４】 遺伝子発現が改変された植物を作出するための方法であっ
    て、（ａ）トランスジェニック細胞を用意するために、（ｉ）配列番号１−１４
    、２０、２２−６２、８１−８６および８８−１１２の配列を含むプロモーター
    配列、（ｉｉ）関心のあるＤＮＡ配列、（ｉｉｉ）遺伝子ターミネーション配列
    を含むＤＮＡコンストラクトで植物細胞を形質転換すること、（ｂ）得られたト
    ランスジェニック細胞を再生と成熟した植物の成長に導く条件下で培養すること
    を含む、遺伝子発現が改変された植物を作出するための方法。
  15. 【請求項１５】 標的生物の表現型を改変するための方法であって、（ａ）
    配列番号１−１４、２０、２２−６２、８１−８６および８８−１１２の配列を
    含むプロモーター配列、（ｂ）関心のあるＤＮＡ配列、（ｃ）遺伝子ターミネー
    ション配列を含むＤＮＡコンストラクトを該標的生物のゲノムに安定的に取り込
    むことを含む方法。
  16. 【請求項１６】 前記標的生物は植物である、請求項１５に記載の方法。
  17. 【請求項１７】 （ａ）テストされる遺伝子を操作可能に連結した配列番号
    １−１４、２０、２２−６２、８１−８６および８８−１１２の配列を含むプロ
    モーター配列を含むＤＮＡコンストラクトで植物細胞を形質転換すること、（ｂ
    ）該植物細胞を再生と成熟した植物の成長に導く条件下で培養すること、（ｃ）
    得られたトランスジェニック植物の表現型を形質転換されなかった植物の表現型
    と比較することを含む、所望の機能または表現型の原因遺伝子を同定する方法。
  18. 【請求項１８】 （ａ）配列番号２１に列挙された配列、（ｂ）配列番号２
    １に列挙された配列の相補体、（ｃ）配列番号２１に列挙された配列の逆相補体
    、（ｄ）配列番号２１に列挙された配列の逆配列、（ｅ）配列番号２１に列挙さ
    れた配列に対しコンピューターアルゴリズムＢＬＡＳＴＮを用いて決定されたヌ
    クレオチド同一性が少なくとも４０％ある配列、（ｆ）配列番号２１に列挙され
    た配列に対しコンピューターアルゴリズムＢＬＡＳＴＮを用いて決定されたヌク
    レオチド同一性が少なくとも６０％ある配列、（ｇ）配列番号２１に列挙された
    配列に対しコンピューターアルゴリズムＢＬＡＳＴＮを用いて決定されたヌクレ
    オチド同一性が少なくとも７５％ある配列、（ｈ）配列番号２１に列挙された配
    列に対しコンピューターアルゴリズムＢＬＡＳＴＮを用いて決定されたヌクレオ
    チド同一性が少なくとも９０％ある配列からなるグループから選択された配列を
    含む、単離されたポリヌクレオチド。
  19. 【請求項１９】 請求項１８に記載のオリゴヌクレオチドを含むＤＮＡコン
    ストラクト。
  20. 【請求項２０】 請求項１９に記載のＤＮＡコンストラクトを含むトランス
    ジェニック細胞。
  21. 【請求項２１】 標的生物における遺伝子発現を改変するための方法であっ
    て、請求項１９に記載のＤＮＡコンストラクトを安定的に該標的生物のゲノムに
    取り込むことを含む方法。
  22. 【請求項２２】 配列番号２１の配列を含むポリヌクレオチドの発現を改変
    するための方法であって、該ポリヌクレオチドから配列番号２１の配列を除去す
    ることを含む方法。
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