CN1353756A - 用于修饰基因表达的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

提供新的分离的植物多核苷酸启动子序列以及包含这类多核苷酸的DNA构建体。也公开了使用这类构建体调节目的DNA序列转录的方法以及包含这类构建体的转基因植物。

Description

用于修饰基因表达的组合物和方法
发明技术领域
本发明涉及多核苷酸转录和/或表达的调节。更具体地讲，本发明涉及从植物中分离的、能够起始和驱动多核苷酸转录的多核苷酸调节序列，涉及这类调节序列在修饰内源和/或异源多核苷酸转录和多肽产生方面的应用。也公开了多肽序列。
发明背景
基因的表达部分受参与转录的细胞过程的调节。在转录期间，通过RNA聚合酶的作用，生成与被转录的DNA序列互补的单链RNA。在真核细胞中转录的起始受位于待转录基因内的顺式作用DNA基序和反式作用蛋白因子之间复杂相互作用的调节。在所述顺式作用调节区中有称为启动子的DNA序列，RNA聚合酶首先或者直接或者间接地与启动子结合。本文所用的术语“启动子”是指与转录相关并且通常包括一个转录起始位点的基因的5’非翻译区。其它顺式作用DNA基序例如增强子，可以位于所述起始位点更上游和/或下游。
启动子和增强子通常都由数个分离的、通常丰余的元件组成，每个元件可以被一种或多种称为转录因子的反式作用调节蛋白识别。启动子通常包括近侧元件和较远的元件。例如，对于调节蛋白的结合重要的所谓的TATA框，通常发现于起始位点上游约25个碱基对处。所谓的CAAT框通常发现于起始位点上游约75个碱基对处。启动子通常含有约100-1000个核苷酸，尽管更长的启动子序列也是可能的。
对于转基因植物的发育，最好使用驱动强转基因表达的组成型启动子。目前，唯一可利用的广泛使用的组成型植物启动子衍生自花椰菜花叶病毒。而且，由于公众关于病毒启动子应用的观念，需要用于转基因食料植物的植物来源的启动子。已经克隆了少数裸子植物启动子，并且已经发现得自被子植物的启动子在裸子植物中的功能差。因此，本领域仍需要从植物中分离的用于在转基因植物中调节多核苷酸转录和表达的多核苷酸启动子区。
发明概述简而言之，公开了从桉树和松树中分离的参与基因表达调节的多核苷酸调节序列以及应用这类多核苷酸调节区在转基因植物中修饰内源和/或源多核苷酸表达的方法。具体地说，本发明提供起始和调节在其控制之下的多核苷酸转录的、来自植物基因的5’非翻译区或非编码区的多核苷酸启动子序列、以及包含这类启动子序列的分离的多核苷酸。
第一方面，本发明提供包含选自以下的一种多核苷酸的分离的多核苷酸序列：(a)SEQ ID NO：1-14、20、22-62、81-86和88-112中的所述序列；(b)SEQ ID NO：1-14、20、22-62、81-86和88-112中所述序列的互补序列；(c)SEQ ID NO：1-14、20、22-62、81-86和88-112中所述序列的反向互补序列；(d)SEQ ID NO：1-14、20、22-62、81-86和88-112中所述序列的反向序列；(e)如本文定义的与(a)-(d)序列有40％、60％、75％或90％相同核苷酸的序列；本发明还提供对应于SEQ ID NO：1-14、20、22-62、81-86和88-112中所述序列的探针和引物；包含鉴定为SEQ ID NO：1-14、20、22-62、81-86和88-112的任一多核苷酸的至少限定数目的连续残基的多核苷酸；和包含SEQ IDNO：1-14、20、22-62、81-86和88-112中所述序列的部分的延伸序列；所有这些此中均称为“本发明的多核苷酸”。本发明也提供在所附序列表中鉴定为SEQ ID NO：63-80和87的分离的多肽序列；那些序列的多肽变异体；和包含所述分离多肽序列的多肽和那些序列的变异体。
另一方面，本发明提供遗传构建体，所述遗传构建体包含或者单独、或者结合一种或多种另外的本发明多核苷酸、或者结合一种或多种已知多核苷酸的本发明多核苷酸，还提供包含这类构建体的细胞和靶有机体。
在一个相关方面，本发明提供以5’-3’方向包含一个本发明多核苷酸启动子序列、一个待转录多核苷酸和一个基因终止序列的遗传构建体。所述待转录多核苷酸可以包含一个编码目的多肽的多核苷酸的可读框，或它可以是目的多核苷酸的非编码区或非翻译区。所述可读框可以以有义或反义方向定向。优选所述基因终止序列在宿主植物中有功能。最优选所述基因终止序列是目的基因的终止序列，但本领域通常使用的其它基因终止序列，例如根癌土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)胭脂碱合酶终止子可以有效地用于本发明中。所述遗传构建体还可以包含一种标记，以鉴定转化细胞。
再一方面，提供包含本发明遗传构建体的转基因植物细胞以及包含这类转基因细胞的有机体例如植物和这类植物的果实、种子和其它产物、衍生物或后代。本发明包括本发明转基因植物的繁殖体。本文所用的词语“繁殖体”是指可以用于有性或无性生殖或繁殖的任何植物部分，包括插条。
按照Plant Breeders’Rights的植物变种，特别是可注册的(registrable)植物变种可以排除在本发明之外。一种植物不需要仅仅因为它在其基因组中稳定地含有一种被引入所述植物细胞或其祖先中的转基因而被认为是“植物变种”。
再一方面，提供用于修饰靶有机体例如植物中基因表达的方法，这类方法包括在所述有机体的基因组中稳定地掺入本发明的遗传构建体。在一个优选实施方案中，所述靶有机体是植物，更优选为木本植物，最优选选自桉树和松树物种，最优选选自Eucalyptus grandis和辐射松(Pinus radiata)。
另一方面，提供用于产生具有修饰的多肽表达的靶有机体例如植物的方法，这类方法包括用本发明的遗传构建体转化植物细胞，以提供转基因细胞，并且在有助于再生和成熟植株生长的条件下培育所述转基因细胞。
在其它方面，提供负责所需功能或表型的基因的鉴定方法，所述方法包括：用遗传构建体转化植物细胞，所述遗传构建体包含一个与待测试多核苷酸有效连接的本发明多核苷酸启动子序列；在有助于再生和成熟植株生长的条件下培育所述植物细胞，以提供转基因植物；和将所述转基因植物的表型与非转化植物或野生型植物的表型进行比较。
在又一方面，本发明提供编码遍在蛋白的分离的多核苷酸。在具体实施方案中，所述分离的多核苷酸包含一种选自以下的多核苷酸：(a)SEQ ID NO：1和34中的所述序列；(b)SEQ ID NO：1和34中所述序列的互补序列；(c)SEQ ID NO：1和34中所述序列的反向互补序列；(d)SEQ ID NO：1和34中所述序列的反向序列；和(e)如本文定义的与(a)-(d)序列有40％、60％、75％或90％相同核苷酸的序列。也提供由这类多核苷酸编码的多肽以及包含这类多核苷酸的DNA构建体和用这类DNA构建体转化的宿主细胞和转基因有机体，例如植物。在具体实施方案中，这类多肽包含SEQ ID NO：80或67中提供的序列。
再一方面，本发明提供分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含SEQID NO：21的DNA序列、或SEQ ID NO：21的互补序列、反向互补序列或变异体，还提供包含这类多核苷酸的DNA构建体以及用这类序列转化的细胞。如下所讨论的，从包含SEQ ID NO：21序列的多核苷酸中除去SEQ ID NO：21的序列，可以增强所述多核苷酸的表达。相反，在包含目的多核苷酸的遗传构建体中包括SEQ ID NO：21的序列，可以降低所述多核苷酸的表达。
通过参考以下更详细的描述，本发明的上述特征和其它特征以及获得所述特征的方式将变得显而易见，并且会最佳地理解本发明。此中公开的所有参考文献均通过引用全部结合到本文中，如同每个参考文献单独引用一样。发明详述
本发明提供可以用于植物表型操作的的分离的多核苷酸调节区以及包含这类调节区的分离的多核苷酸。更具体地讲，公开了从松树和桉树中分离的多核苷酸启动子序列。如上所述，启动子是细胞“转录装置”的组分，并且参与基因表达的调节。已经表明在植物自然发育过程中组织特异性基因表达模式和时序特异性基因表达模式均由启动子起动和控制。因此，本发明的分离的多核苷酸启动子序列可以用于改变植物的生长和发育以及对外部刺激(例如环境因素和病原体)的细胞应答。
运用本发明的方法和材料，可以通过在靶有机体(例如植物)的基因组中加入与本发明启动子序列有效连接的额外拷贝的编码特定目的多肽的基因，增加或减少所述多肽的量。同样，通过用这类基因的反义拷贝转化所述靶植物，可以达到增加或减少所述多肽的量。
本发明的多核苷酸分离自林用植物(forestry plant)资源，即分离自Eucalyptus grandis和辐射松，但另一方面可以用常规合成技术合成本发明的多核苷酸。具体地说，本发明的分离多核苷酸包括包含一段选自以下序列的多核苷酸：鉴定为SEQ ID NO：1-14、20、22-62、81-86和88-112的序列；鉴定为SEQ ID NO：1-14、20、22-62、81-86和88-112序列的互补序列；鉴定为SEQ ID NO：1-14、20、22-62、81-86和88-112序列的反向互补序列；任一上述多核苷酸中至少特定数目的连续残基(x-mers)；对应于任一上述多核苷酸的延伸的序列；对应于任一上述多核苷酸的反义序列；和任一上述多核苷酸的变异体，该术语描述于本说明书中。
在另一实施方案中，本发明提供由SEQ ID NO：63-80和87的多核苷酸编码的分离的多肽。
本发明的多核苷酸和多肽是通过DNA和多肽相似性搜索而推定性鉴定的。在所附的序列表中，SEQ ID NO.1-14、20、22-62、81-86和88-112是多核苷酸序列，而SEQ ID NO.63-80和87是多肽序列。已经证明本发明的多核苷酸和多肽与已知参与植物转录和/或表达调节的启动子有相似性。每种本发明多核苷酸的推定身份(identity)以及5’非翻译区(5’UTR)或推定的启动子区(根据残基编号鉴别)示于以下表1中。
                           表1
    多核苷酸SEQ ID NO：     多肽SEQ ID NO：     5，UTR     身份
    1     80     1-2064 超级遍在蛋白编码区和UTR
    2     -     1-2064 具有内含子的超级遍在蛋白启动子
    3     -     1-1226 无内含子的超级遍在蛋白启动子
    4     -     1-431 细胞分裂控制
    5     -     1-167 木质部发生特异性的
    6     -     1-600 4-香豆酸-CoA连接酶(4CL)
    7     -     1-591 纤维素合酶
    8     -     1-480 3’端，纤维素合酶
    20     -     1-363 5’端，纤维素合酶
    9     -     1-259 叶特异性
    10     -     1-251 叶特异性
    11     -     1-248 叶特异性
    12     -     1-654 O-甲基转移酶
    13     -     1-396 根特异性
    14     -     1-763 根特异性
  多核苷酸SEQ ID NO：     多肽SEQ ID NO：     5’UTR     身份
    22     63     1-406 花粉外被蛋白
    23     -     1-350 花粉变应原
    24     -     1-49 花粉变应原
    25     64     1-284 花粉变应原
    26     65     1-77 生长素诱导的蛋白
    27     -     1-74 生长素诱导的蛋白
    28     66     1-99 生长素诱导的蛋白
    29     -     1-927 花特异性
    30     -     1-411 花特异性
    31     -     1-178 花特异性
    32     -     1-178 花特异性
    33     -     1-178 花特异性
    34     67     1-805 遍在蛋白
    35     68     1-81 甘油醛-3-磷酸脱氢酶
    36     69     1-694 碳酸酐酶
    37     -     1-648 异黄酮还原酶
    38     -     1-288 异黄酮还原酶
    39     -     1-382 甘油醛-3-磷酸脱氢酶
    40     70     1-343 芽特异性
    41     -     1-313 木质部特异性
    42     -     1-713 木质部特异性
    43     -     1-28 木质部特异性
    44     -     1-35 木质部特异性
    45     71     1-180 分生组织特异性
    46     72     1-238 衰老样蛋白(Senescence-like protein)
    47      -     1-91 衰老样蛋白
  多核苷酸SEQ ID NO：     多肽SEQ ID NO：     5’UTR     身份
    48     -     1-91 衰老样蛋白
    49     -     1-809 花粉特异性
    50     -     1-428 花粉特异性
    51     73     1-55 花粉特异性
    52     74     1-575 花粉特异性
    53     75     1-35 花粉特异性
    54     -     1-335 结瘤素同系物花粉特异性
    55     -     1-336 结瘤素同系物花粉特异性
    56     76     1-157 蔗糖合酶
    57     77     1-446 蔗糖合酶
    58     -     1-326 蔗糖合酶
    59     -     1-311 花特异性
    60     78     1-694 O-甲基转移酶
    61     79     1-112 延伸因子A
    62     -     1-420 延伸因子A
    81     -       - MIF同源物
    82     -       - MIF同源物
    83     -       - MIF同源物
    84     -       - MIF同源物
    85     -       - MIF同源物
    86     87     1-87 MIF同源物
    88     1-1156 查耳酮合酶
    89     1-2590 未知的花特异性
    90     1-1172 未知的花特异性
    91     1-446 蔗糖合酶
    92     1-2119 未知的本质部特异性
   多核苷酸SEQ ID NO：     多肽SEQ ID NO：     5’UTR     身份
    93     1-2571 甘油醛-3-磷酸脱氢酶
    94     1-1406 未知的花粉特异性
    95     1-2546 辐射松雄性特异性蛋白(PrMALE1)
    96     1-4726 辐射松雄性特异性蛋白(PrMALE1)
    97     1-635 UDP葡萄糖糖基转移酶
    98     1-468 延伸因子A1
    99     1-222 延伸因子A1
    100     1-410 S-腺苷甲硫氨酸合成酶
    101     1-482 S-腺苷甲硫氨酸合成酶
    102     1-230 S-腺苷甲硫氨酸合成酶
    103     1-596 UDP葡萄糖6脱氢酶
    104     1-653 假定的蛋白
    105     1-342 漆酶1
    106     1-342 漆酶1
    106     1-948 阿拉伯半乳聚糖样1
    108     1-362 阿拉伯半乳聚糖样2
    109     1-326 阿拉伯半乳聚糖样-2
    110     1-296 根受体样激酶
    111     1-723 根受体样激酶
    112     1-1301 辐射松脂质转移蛋白2(PrLTP2)
在一个实施方案中，本发明提供从辐射松和Eucalyptus grandis分离的编码遍在蛋白多肽的多核苷酸序列。从辐射松分离的遍在蛋白多核苷酸的全长序列在SEQ ID NO：1中提供，包括一个内含子的启动子区的序列在SEQ ID NO：2中提供，而不包括内含子的启动子区的序列在SEQ ID NO：3中提供。从Eucalyptus grandis分离的编码遍在蛋白多核苷酸的序列在SEQ ID NO：34中提供。在一个相关实施方案中，本发明提供由SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：34的分离的多核苷酸编码的分离的多肽，包括包含SEQ ID NO：80和67的序列的多肽。
本文所用术语“多核苷酸”是指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸碱基的单链或双链聚合物，包括DNA分子和相应的RNA分子，包括HnRNA和mRNA分子，有义链和反义链，并且包括cDNA、基因组DNA和重组DNA以及全合成或部分合成的多核苷酸。HnRNA分子含有内含子，并以通常的一对一方式对应于一个DNA分子。一种mRNA分子对应于一种HnRNA和已经切除内含子的DNA分子。多核苷酸可以由完整的基因构成或由其任何部分构成。可操作的反义多核苷酸可以包含相应的多核苷酸的片段，因此“多核苷酸”的定义包括所有这类可操作的反义片段。反义多核苷酸和涉及反义多核苷酸的技术是本领域众所周知的，并且描述于例如Robinson-Benion等，“反义技术(Antisense techniques)，”Methods in Enzymol.254(23]：363-375，1995；和Kawasaki等，Artific.Organs20(8)：836-848，1996。
所有本文描述的多核苷酸和多肽正如本领域通常所用的那些术语，是分离的并且是经纯化的。所述多肽和多核苷酸的纯度优选至少约80％，更优选纯度至少约90％，最优选纯度至少约99％。
本文所用术语“互补序列”、“反向互补序列”和“反向序列”的定义通过以下实例作最佳描述。就序列5’AGGACC 3’而论，所述互补序列、反向互补序列和反向序列如下：
互补序列      3’TCCTGG 5’
反向互补序列  3’GGTCCT 5’
反向序列      5’CCAGGA 3’。
本发明的某些多核苷酸是“部分”序列，因为它们不代表编码全长多肽的全长基因。可以通过运用引物和/或探针以及众所周知的杂交和/或PCR技术对各种DNA文库分析和测序，来延伸这类部分序列。部分序列可以被延伸，直至鉴定出编码多肽的可读框、能够表达一种多肽的全长多核苷酸和/或基因、或基因组的另一有用部分。当这类延伸的多核苷酸包含一段鉴定的序列或其变异体、或SEQ ID NO：1-14、20、22-62、81-86和88-112序列之一的一个鉴定的连续部分(x-mer)或其变异体时，这类延伸的序列包括全长多核苷酸和基因被描述为“对应于”鉴定为SEQ ID NO：1-14、20、22-62、81-86和88-112序列之一的序列、或其变异体、或SEQ ID NO：1-14、20、22-62、81-86和88-112序列之一的一个部分、或其变异体。这类延伸的多核苷酸的长度可以为约50至约4,000个核酸或碱基对，优选长度低于约4,000个核酸或碱基对，更优选长度为约低于约3,000个核酸或碱基对，再更优选长度低于约2,000个核酸或碱基对。在某些情况下，本发明的延伸多核苷酸的长度可以低于约1,800个核酸或碱基对，优选低于约1,600个核酸或碱基对，更优选低于约1,400个核酸或碱基对，再更优选低于约1,200个核酸或碱基对，最优选低于约1,000个核酸或碱基对。
同样，对应于本发明多核苷酸的RNA序列、反向序列、互补序列、反义序列等可以采用鉴定为SEQ ID NO：1-14、20、22-62、81-86和88-112的cDNA序列来常规确定和获得。
鉴定为SEQ ID NO：1-14、20、22-62、81-86和88-112的多核苷酸可以含有编码多肽的可读框(“ORF”)或部分可读框。另外，可以在对应于SEQ ID NO：1-14、20、22-62、81-86和88-112中所述序列的延伸的序列或全长序列中鉴定编码多肽的可读框。可以采用本领域众所周知的技术鉴定可读框。这些技术包括例如分析已知起始密码子和终止密码子的位置、根据密码子频率鉴定最可能的读框等。用于ORF分析的合适工具和软件可在例如因特网http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html上获得。可以在本发明的多核苷酸中鉴定可读框和可读框的部分。一旦鉴定出部分可读框，则可以运用本领域熟知的技术在所述部分可读框区域中延伸所述多核苷酸，直至鉴定出所述多核苷酸的整个可读框。因此，可以采用本发明的多核苷酸鉴定编码多肽的可读框。
一旦在本发明的多核苷酸中鉴定出可读框，则可以分离和/或合成所述可读框。然后可以构建包含所述可读框和合适启动子、起始密码子、终止子等(它们是本领域众所周知的)的可表达遗传构建体。可以将这类遗传构建体导入宿主细胞中，以表达由所述可读框编码的多肽。合适的宿主细胞包括各种原核生物和真核生物细胞，包括植物细胞、哺乳动物细胞、细菌细胞、藻类等。
可以表达由本发明多核苷酸编码的多肽，并将其用于各种测定中，以测定其生物活性。这类多肽可以用来产生抗体，分离相应的相互作用蛋白或其它化合物，以及定量测定相互作用蛋白或其它化合物的水平。
本文所用术语“多肽”包括任何长度的氨基酸链，包括全长蛋白，其中氨基酸残基通过共价肽键连接。本发明的多肽可以是天然的纯化产物，或可以部分或完全采用重组技术产生。本文所用术语“由多核苷酸编码的多肽”包括由包括本发明的分离的部分DNA序列的核苷酸序列所编码的多肽。
在一个相关方面，提供包含具有选自SEQ ID NO：63-80和87中所提供序列的序列及其变异体的多肽的至少一个功能部分。本文所用的多肽的“功能部分”是含有影响所述多肽功能所必需的活性部位的部分，例如所述分子中能够结合一种或多种反应物的部分。活性部位可以由存在于一个或多个多肽链上的分离的部分构成，并且通常表现出高结合亲和性。
首先通过或者化学消化或者酶消化多肽制备所述多肽的片段，或者通过对编码所述多肽的多核苷酸进行突变分析，并且随后表达所产生的突变多肽，可以鉴定出所述多肽的功能部分。然后，测试所述多肽片段或突变多肽，以使用例如以下提供的代表性测定，确定哪些部分保留生物活性。
包含一个活性部位的一个功能部分可以由存在于一个或多个多肽链上的几个分离的部分构成，并且通常表现出高底物特异性。本文所用术语“由多核苷酸编码的多肽”包括由包含本发明的分离部分多核苷酸的多核苷酸编码的多肽。
通过合成方法或重组方法，也可以产生本发明多肽的部分和其它变异体。运用本领域技术人员众所周知的技术，可以产生具有少于约100个氨基酸、一般少于约50个氨基酸的合成多肽。例如，运用商业上可得到的固相技术，例如其中将氨基酸顺序加入生长中的氨基酸链的Merrifield固相合成法(Merrifield，J.Am.Chem.Soc.85：2149-2154，1963)，可以合成这类多肽。自动合成多肽的仪器在商业上可得自例如Perkin Elmer/Applied Biosystems，Inc.(Foster City，California)的供应商，并且可以按照生产商的说明进行操作。采用标准诱变技术，例如寡核苷酸指导的定点诱变(Kunkel，Proc.Natl.Acad.Sci.USA82：488-492，1985)，可以制备天然多肽的变异体。可以用标准技术除去DNA序列区段，以允许制备截短的多肽。
本文所用术语“变异体”包括不同于所述具体鉴定的序列、其中缺失、取代或添加一个或多个核苷酸或氨基酸残基的核苷酸序列或氨基酸序列。变异体可以是天然存在的等位基因变异体或是非天然存在的变异体。变异体序列(多核苷酸或多肽)优选表现出与本发明的序列有至少50％、更优选至少75％、最优选至少90％的同一性。通过将待比较的两个序列如下所述进行序列比对，确定序列比对部分中相同的残基数，并将该数值除以本发明(查询)序列中的残基总数，然后将所述得数乘以100，确定同一性百分比。
可以将多核苷酸序列和多肽序列进行序列比对，运用公众可得到的计算机算法，可以针对另一多核苷酸测定的特定区域中相同核苷酸的百分比。用于对多核苷酸序列进行序列比对和鉴定多核苷酸序列相似性的两种典型算法是BLASTN和FASTA算法。也可以利用BLASTX算法分析多核苷酸，该算法针对蛋白序列数据库比较核苷酸查询序列(两条链)的6读框概念性翻译产物(six-frame conceptualtranslation products)。可以用BLASTP算法检查多肽序列的相似性。BLASTN、BLASTX和BLASTP程序可在NCBI无名FTP服务器(ftp：//ncbi.nlm.nih.gov)上的/blast/executables/下得到。BLASTN算法2.0.4版本[2-24-1998]和2.0.6版本[9-16-1998](设定至所述文件中描述并且用所述算法分配的默认参数)优选用于确定按照本发明的多核苷酸变异体。BLASTP算法优选用于确定本发明按照的多肽变异体。BLAST算法系列包括BLASTN、BLASTP和BLASTX的应用描述于URL http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/newblast.html下NCBI网站的以及Altschul，等，″加入空位的BLAST和PSI-BLAST：新一代蛋白质数据库搜索程序(Gapped BLAST and PSI-BLAST：a newgeneration of protein database search programs)，″Nucleic Acids Res.25：3389-3402，1997的出版物中。
计算机算法FASTA可在因特网ftp站点ftp：//ftp.virginia.edu/pub/fasta/上得到。2.0u4版本[1996年2月](设定至该文件中所述并且用所述算法分配的默认参数)可以用于确定按照本发明的变异体。FASTA算法的应用描述于Pearson和Lipman，“改进的生物学序列分析工具(Improved Tools for Biological SequenceAnalysis)，”Proc.Natl.Acad. Sci.USA 85：2444-2448，1988；和Pearson，“采用FASTP和FASTA的快速而灵敏的序列比较(Rapid and SensitiveSequence Comparison with FASTP and FASTA)，”Methods in Enzymol.183：63-98，1990中。
对于采用提供E值和多核苷酸序列的同一性百分比的BLASTN测定序列比对和相似性，优选以下运行参数：Unix运行命令：blastall-p blastn-d embldb-e 10-G0-E0-r1-v30-b30-i queryseq-oresults；所述参数是：-p程序名称[字符串]；-d数据库[字符串]；-e期望值(E)[实数]；-G开放一个空位的罚分(cost)(零引发默认行为)[整数]；-E拓展一个空位的罚分(零引发默认行为)[整数]；-r一个核苷酸匹配的奖分(reward)(仅BLASTN)[整数]；-v一行描述的数目(V)[整数]；-b显示序列比对的数目(B)[整数]；-i查询文件[输入文件]；和-o BLAST报告输出文件[输出文件]，可选择的(Optional)。
对于采用提供E值和多肽序列的同一性百分比的BLASTP测定序列比对和相似性，优选以下运行参数：blastall-P blastp-dswissprotdb-e 10-G0-E0-v30-b30-i queryseq-o results；所述参数是：-p程序名称[字符串]；-d数据库[字符串]；-e期望值(E)[实数]；-G开放一个空位的罚分(零引发缺省行为)[整数]；-E拓展一个空位的罚分(零引发缺省行为)[整数]；-v一行描述的数目(v)[整数]；-b显示序列比对的数目(b)[整数]；-I查询文件[输入文件]；-o BLAST报告输出文件[输出文件]，可选择的。
由BLASTN、FASTA、BLASTP或相似算法产生的一个查询序列“命中”一个或更多个数据库序列，对多个序列进行序列比对，并鉴定序列的相似部分。所述命中按相似性程度和序列重叠的长度的顺序排列。命中一个数据库序列通常代表仅在所述查询序列的一部分序列长度内的一个重叠。
BLASTN、FASTA和BLASTP算法也产生序列比对的“期望”值。所述期望值(E)表明当搜索一定大小的数据库时人们可以“期望”在一定数目连续序列范围内偶然见到的命中数目。该期望值用作确定所述命中一个数据库(例如优选的EMBL数据库)是否表明真正相似性的显著性阈值。例如，一个多核苷酸命中指定的E值为0.1，被解释为是指在EMBL数据库大小的一个数据库中，人们可以预期在具有相似分值的所述序列的序列比对部分中仅仅偶然观察到0.1个匹配。根据该标准，所述多核苷酸序列的序列比对和匹配的部分相同的概率则为90％。对于在序列比对和匹配部分内E值为0.01或更低的序列而言，运用BLASTN或FASTA算法在EMBL数据库中偶然发现一个匹配的概率为1％或更低。
按照一个实施方案，与每个本发明多核苷酸和多肽有关的“变异体”多核苷酸和多肽，优选包含核酸数或氨基酸数与每个本发明多核苷酸或多肽相比相同或更少、并且当与本发明的所述多核苷酸或多肽比较时产生的E值为0.01或更低的序列。亦即变异体多核苷酸或多肽是与用设定在上述参数的BLASTN、FASTA或BLASTP算法测量为E值0.01或更低、本发明的多核苷酸或多肽相同的概率至少为99％的任何序列。按照一个优选实施方案，一种变异体多核苷酸是与本发明的多核苷酸相比核酸数目相同或较少、用设定在上述参数的BLASTN或FASTA算法测量E值为0.01或更低、与本发明的多核苷酸相同的概率至少为99％的序列。同样，按照一个优选实施方案，一种变异体多肽是与本发明的多肽相比氨基酸数目相同或较少、用设定在上述参数的BLASTP算法测量为E值0.01或更低、与本发明的多肽相同的概率至少为99％的序列。
另一方面，本发明的变异体多核苷酸在严格条件下与SEQ ID NO：1-14、20、22-62、81-86和88-112中所述多核苷酸序列、或那些序列的互补序列、反向序列或反向互补序列杂交。本文所用的“严格条件”是指在6X SSC，0.2％SDS的溶液中预洗涤；于65℃，6X SSC，0.2％SDS杂交过夜；然后在1X SSC，0.1％SDS中于65℃洗涤2次，每次30分钟，以及在0.2X SSC，0.1％SDS中于65℃洗涤2次，每次30分钟。
本发明也包括这样的多核苷酸，所述多核苷酸不同于所公开的序列，但由于遗传密码的差异使其编码具有与本发明多核苷酸所编码多肽相似的活性的多肽。因此，本发明设计了这样的多核苷酸，所述多核苷酸包含由于保守取代而不同于SEQ ID NO：1-14、20、22-62、81-86和88-112中所述多核苷酸序列的序列、或其互补序列、反向序列或反向互补序列，并且本发明包括这类多核苷酸。另外，本发明设计了这样的多核苷酸，所述多核苷酸包含由于总共低于总序列长度的10％的缺失和/或插入而不同于SEQ ID NO：1-14、20、22-62、81-86和88-112中所述多核苷酸序列的序列、或其互补序列、反向互补序列或反向序列，并且本发明包括这类多核苷酸。同样，本发明设计了这样的多肽，所述多肽包含由于总共低于总序列长度的10％的氨基酸取代、插入和/或缺失而不同于SEQ ID NO：63-80和87中所述多肽序列的序列，并且本发明包括这类多肽。在某些实施方案中，本发明多肽和多核苷酸的变异体具有与本发明那些多肽或多核苷酸相同或相似的生物活性。这类变异体多核苷酸可以作为启动子序列起作用，并且因此能够在植物中修饰基因表达。
本发明的多核苷酸可以从各种文库中分离，或者可以用本领域众所周知的技术合成。例如采用自动寡核苷酸合成仪(例如BeckmanOligo 1000M DNA合成仪)获得多达50个或更多个核酸的多核苷酸区段，可以合成所述多核苷酸。然后可以采用分子生物学领域熟知的标准DNA操作技术，连接多个这种多核苷酸区段。一种常规的典型多核苷酸合成技术包括合成具有例如80个核酸的单链多核苷酸区段，然后让该区段与合成的85个核酸的互补区段杂交，产生5个核苷酸的突出端。然后以相似方式合成下一个区段，在相反链上产生5个核苷酸的突出端。“粘性”末端确保这两个部分杂交时正确连接。这样，可以在体外完全合成本发明的完整多核苷酸。
本发明的多核苷酸也包括包含鉴定为SEQ ID NO：1-14、20、22-62、81-86和88-112的任一多核苷酸或这类序列的互补序列、反向序列和反向互补序列的至少限定数目的连续残基(x-mers)的多核苷酸及其变异体。同样，本发明的多肽包括包含鉴定为SEQ ID NO：63-80和87的任一多肽的至少限定数目的连续残基(x-mers)的多肽及其变异体。本文所用的与“x，”的特定值有关的术语“x-mer”，是指包含鉴定为SEQ ID NO：1-14、20、22-62、81-86和88-112的任一多核苷酸、或鉴定为SEQ ID NO：63-80和87的任一多肽的至少限定数目(“x”)的连续残基的序列。按照优选的实施方案，x值优选至少为20，更优选至少为40，再更优选至少为60，最优选至少为80。因此，本发明的多核苷酸和多肽包括鉴定为SEQ ID NO：1-14、20、22-62、81-86和88-112的多核苷酸或多肽的20-mer、40-mer、60-mer、80-mer、100-mer、120-mer、150-mer、180-mer、220-mer、250-mer、300-mer、400-mer、500-mer或600-mer及其变异体。
如上所述，本发明的多核苷酸启动子序列可以用于遗传构建体中，以驱动目的多核苷酸的转录和/或表达。所述目的多核苷酸对于待转化的有机体(例如植物)而言可以或者是内源的或者是异源的。本发明的遗传构建体因此可以用来调节野生型植物中存在于的多核苷酸(例如基因)的转录水平和/或表达水平，或可以用来提供在野生型植物中不存在的DNA序列的转录和/或表达。
在某些实施方案中，目的多核苷酸包括一个编码靶多肽的可读框。所述可读框以或者有义方向或者反义方向插入所述遗传构建体中，使得用所述遗传构建体转化靶植物，将导致与野生型植物相比多肽量的改变。用包含有义方向可读框的遗传构建体转化，通常将导致所选多肽的超量表达；而用包含反义方向可读框的遗传构建体转化，通常将导致所选多肽表达的减少。可以用本领域技术人员熟知的技术，根据所研究的多肽表达的增加或减少，筛选用包含或者有义反向或者反义方向的可读框的遗传构建体转化的植物群体，并且可以因此分离出具有所需表型的植物。
另一方面，通过在所述遗传构建体中以或者有义方向或者反义方向插入所述可读框的一部分，可以抑制靶多肽的表达。这类部分不必是全长的，但优选包含所述可读框的至少25个残基，更优选至少50个残基。可以使用长得多的部分或甚至对应于完整可读框的全长DNA。所述可读框的部分不必与所述内源序列完全相同，前提是有足够的序列相似性，以达到对所述靶基因的抑制。因此，得自一个物种的序列可以用来抑制不同物种中基因的表达
在其它实施方案中，本发明的DNA构建体包含一段DNA序列，所述DNA序列包括编码靶多肽的基因的非翻译区或非编码区、或与这类非翻译区互补的DNA序列。在这类构建体中可以有效使用的非翻译区的实例包括内含子和5’非翻译前导序列。用这种DNA构建体转化靶植物，可以以例如Napoli等(Plant Cell 2：279-290，1990)和deCarvalho Niebel等(Plant Cell 7：347-358，1995)所讨论的类似方式，通过共抑制过程，导致所述多肽在所述植物中的表达量减少。
另一方面，通过在核酶构建体中插入合适的序列或亚序列(例如DNA或RNA)，可以达到对多肽表达的调节(McIntyre和Manners，Transgenic Res.5(4)：257-262，1996)。核酶是合成的RNA分子，它们包含一个与两个区互补的杂交区，所述两个区中的每个区包含由本发明多核苷酸之一编码的mRNA分子中的至少5个连续的核苷酸。核酶具有高度特异性的内切核酸酶活性，它自催化切割所述mRNA。
将目的多核苷酸操作性地连接于本发明的多核苷酸启动子序列，使得宿主细胞能够从连接于目的DNA序列的启动子序列转录RNA。所述基因启动子序列通常位于待转录DNA序列的5’末端。应用组成型启动子，例如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3的辐射松遍在蛋白多核苷酸启动子序列或者包含在SEQ ID NO：34中的Eucalyptusgrandis遍在蛋白多核苷酸启动子序列，将影响目的DNA序列在转化植物所有部分中的转录。应用组织特异性启动子，例如SEQ ID NO：9-11的叶特异性启动子、SEQ ID NO：13和14的根特异性启动子、SEQID NO：29-33、59和89-90的花特异性启动子、SEQ ID NO：49-55和94的花粉特异性启动子、SEQ ID NO：40的芽特异性启动子或SEQ IDNO：45的分生组织特异性启动子，将导致仅在目的组织中产生所需的有义或反义RNA。时序调节启动子，例如SEQ ID NO：5、41-44和92的木质部发生特异性启动子，可以用来实现在转化植物发育过程中的特定时间调节DNA转录速率。使用应用诱导型基因启动子序列的遗传构建体，可以通过外部刺激例如光、热、缺氧胁迫、营养条件的改变等，调节DNA转录的速率。
本发明的遗传构建体还可以包含一个位于目的多核苷酸3’端的基因终止序列。可以有效地用于本发明遗传构建体中的各种各样基因终止序列是本领域熟知的。这种基因终止序列的一个实例是根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)胭脂碱合酶基因的3’末端。所述基因终止序列对于靶植物可以是内源的或可以是外源的，前提是所述启动子在所述靶植物中有功能。例如，所述终止序列可以来自其它植物物种、植物病毒、细菌质粒等。
本发明的遗传构建体也可以含有一个在靶有机体(例如植物)的细胞中有效的选择标记，以使得能够检测含有本发明构建体的转化细胞。这类标记是本领域众所周知的，通常赋予对一种或多种毒素的抗性。这样一种标记的一个实例是NPTII基因，其表达导致对卡那霉素或潮霉素的抗性，卡那霉素和潮霉素是在中等浓度下通常对植物细胞有毒性的抗生素(Rogers等，Weissbach，A和H编著，Methods for PlantMolecular Biology，Academic Press Inc.：San Diego，CA，1988)。因此，可以根据在含有上述抗生素的培养基中生长的能力，鉴定转化细胞。或者，可以利用本领域熟知的其它技术，例如DNA印迹法和蛋白质印迹法，确定转化细胞中所需构建体的存在。
有效连接本发明DNA构建体组分的技术是本领域众所周知的，包括应用含一个或多个限制性内切核酸酶位点的合成接头，如例如Sambrook等所述(Molecular cloning：a laboratory manual，CSHL Press：Cold Spring Harbor，NY，1989)。本发明的遗传构建体可以连接至具有至少一个复制系统的载体，例如大肠杆菌，从而在每次操作后，所得的构建体可以被克隆和测序，并且可以确定操作的正确性。
本发明的遗传构建体可以用来转化各种各样的靶有机体，包括但不限于植物。可以用本发明构建体转化的植物包括单子叶被子植物(例如草、玉米、谷类、燕麦、小麦和大麦)；和双子叶被子植物(例如拟南芥属(Arabidopsis)、烟草、豆类、苜蓿、橡树、桉树、槭树)；以及裸子植物(例如欧洲赤松，参见Aronen，Finnish Forest Res.Papers，第595卷，1996)；白云杉(Ellis等，Biotechnology 11：84-89，1993)；和落叶松属(Huang等，In Vitro Cell 27：201-207，1991)。在一个优选实施方案中，本发明的遗传构建体用来转化木本植物，木本植物在此定义为其茎干生活多年并且由于木质组织的增加每年茎直径增加的树或灌木。所述靶植物最好选自桉树和松树物种，最优选选自Eucalyptusgrandis和辐射松。可以有效地用本发明DNA构建体转化的其它物种包括但不限于：松树，例如美国短叶松(Pinus banksiana)、土耳其松(Pinus brutia)、加勒比松(Pinus caribaea)、沙松(Pinus ckausa)、小干松(Pinus contorta)、大果松(Pinus coulteri)、短叶松(Pinus echinata)、Pinuseldarica、湿地松(Pinus ellioti)、约弗松(Pinus jeffreyi)、糖松(Pinuslambertiana)、山白松(Pinus monticola)、欧洲黑松(Pinus nigra)、长叶松(Pinus palustrus)、海岸松(Pinus pinaster)、西黄松(Pinusponderosa)、美加红松(Pinus resinosa)、刚松(Pinus rigida)、晚松(Pinusserotina)、北美乔松(Pinus strobus)、欧洲赤松(Pinus sylvestris)、火炬松(Pinus taeda)、北美二针松(Pinus virginiana)；其它裸子植物，例如太平洋银枞(Abies amabilis)、胶枞(Abies balsamea)、白云杉(Abiesconcolor)、巨冷杉(Abies grandis)、洛杉矶冷杉(Abies lasiocarpa)、红果冷杉(Abies magnifica)、壮丽冷杉(Abies procera)、美国扁柏(Chamaecyparis lawsoniona)、黄扁柏(Chamaecyparis nootkatensis)、美国尖叶扁柏(Chamaecyparis thyoides)、Huniperus virginiana、欧洲落叶松(Larix decidua)、美洲落叶松(Larix laricina)、日本落叶松(Larixleptolepis)、西方落叶松(Larix occidentalis)、新疆落叶松(Larixsiberica)、下延香松(Libocedrus decurrens)、挪威云杉(Picea abies)、恩格曼氏云杉(Picea engelmanni)、白云杉(Picea glauca)、黑云杉(Piceamariana)、锐尖北美云杉(Picea pungens)、红云杉(Picea rubens)、北美云杉(Picea sithensis)、花旗松(Pseudotsuga menziesii)、Sequoiagigantea、北美红杉(Sequoia sempervirens)、落羽杉(Taxodiumdistichum)、加拿大铁杉(Tsuga canadensis)、异叶铁杉(Tsugaheterophylla)、西美山铁杉(Tsuga mertensiana)、北美香柏(Thujaoccidentalis)、北美乔柏(Thuja plicata)；和桉树，例如Eucalyptus alba、Eucalyptus bancroftii、Eucalyptus botyroides、Eucalyptus bridgesiana、Eucalyptus calophylla、赤桉(Eucalyptus camaldulensis)、柠檬桉(Eucalyptus citriodora)、Eucalyptus cladocalyx、Eucalyptus coccifera、Eucalyptus curtisii、Eucalyptus dalrympleana、Eucalyptus deglupta、Eucalyptus delagatensis、Eucalyptus diversicolor、Eucalyptus dunnii、美丽花桉(Eucalyptus ficifolia)、蓝桉(Eucalyptus globulus)、Eucalyptusgomphocephala、Eucalyptus gunnii、Eucalyptus henryi、Eucalyptuslaevopinea、Eucalyptus macarthurii、Eucalyptus macrorhyncha、花皮桉(Eucalyptus maculata)、Eucalyptus marginata、Eucalyptusmegacarpa、Eucalyptus melliodora、Eucalyptus nicholii、Eucalyptusnitens、Eucalyptus nova-anglica、Eucalyptus obliqua、Eucalyptusobtusiflora、Eucalyptus oreades、Eucalyptus pauciflora、Eucalyptuspolybractea、Eucalyptus regnans、Eucalyptus resinifera、大叶桉(Eucalyptus robusta)、野桉(Eucalyptus rudis)、Eucalyptus saligna、Eucalyptus sideroxylon、Eucalyptus stuartiana、细叶桉(Eucalyptustereticornis)、Eucalyptus torelliana、Eucalyptus urnigera、Eucalyptusurophylla、Eucalyptus viminalis、Eucalyptus viridis、Eucalyptus wandoo和Eucalyptus youmanni；以及任何这些物种的杂种。
在靶植物的基因组中稳定掺入遗传构建体的技术是本领域众所周知的，包括根癌土壤杆菌介导的导入、电穿孔、原生质体融合、注射到生殖器官中、注射到未成熟胚中、高速轰击粒子导入等。技术的选择将取决于待转化的靶植物。例如，双子叶植物以及某些单子叶植物和裸子植物可以通过例如由Bevan描述的土壤杆菌Ti质粒技术(Nucleic Acids Res.12：8711-8721，1984)转化。用于导入本发明DNA构建体的靶包括组织例如叶组织、解离的细胞、原生质体、种子、胚、分生组织区；子叶、下胚轴等。转化按树和松树的优选方法是采用花粉(参见例如Aronen，Finnish Forest Res.Papers第595卷，第53页，1996)或容易再生的胚性组织的基因枪法。
一旦细胞被转化，则可以借助标记，例如上述的卡那霉素抗性标记，选择基因组中掺入了本发明遗传构建体的细胞。然后可以采用本领域众所周知的技术，在合适的培养基中培养转基因细胞，以再生完整的植株。在原生质体的情况下，在合适的渗透条件下让细胞壁再形成。在种子或胚的情况下，使用合适的萌发或愈伤组织起始培养基。对于外植体，使用合适的再生培养基。已很好地建立了许多物种的植株再生。关于林木再生的综述，参见Dunstan等，“木本植物的体细胞胚胎发生，”Thorpe TA编著，In Vitro Embryogenesis of Plants(CurrentPlant Science and Biotechnology in Agriculture，第20卷)，第12章，第471-540页，1995。Roberts等(“云杉的体细胞胚胎发生”Redenbaugh K编著，Synseed：applications of synthetic seed to crop improvement，CRCPress：第23章，第427-449页，1993)讨论了用于云杉再生的具体方案。采用本领域熟知的技术可以选择具有所需表型的转化植株。可以采用本领域熟知的方法，将所得的转化植株有性或无性繁殖，以产生转基因植株的连续世代。
如上所述，可以通过选择启动子序列，或通过选择掺入靶宿主基因组中的多核苷酸的功能拷贝数或整合位点，控制靶细胞中RNA的产生。靶有机体可以用一种以上的本发明遗传构建体转化，从而调节一种以上的基因的活性。同样，可以装配含有一个以上的编码目的多肽的可读框、或编码这种多肽的基因的一个以上的非翻译区的遗传构建体。
本发明的分离多核苷酸也可以用于基因组作图、物理作图和基因的定位克隆。如以下详述，鉴定为SEQ ID NO：1-14、20、22-62、81-86和88-112的多核苷酸序列及其变异体可以用来设计寡核苷酸探针和引物。利用本发明多核苷酸设计的寡核苷酸探针，可以用来在其细胞中具有足够相似的DNA和RNA序列的任何有机体中，采用本领域熟知的技术，例如斑点印迹DNA杂交技术，探测基因的存在并且检查基因的表达模式。利用本发明多核苷酸设计的寡核苷酸引物可以用于PCR扩增。利用本发明多核苷酸设计的寡核苷酸探针和引物也可以与各种微阵列技术包括Synteni(Palo Alto，California)的微阵列技术结合使用。
本文所用术语“寡核苷酸”是指多核苷酸序列的一个相对短的区段，通常包含6-60个核苷酸，既包括用于杂交测定的探针，也包括用于通过聚合酶链式反应扩增DNA的引物。
如果寡核苷酸探针或引物或其互补体包含在SEQ ID NO：1-14、20、22-62、81-86和88-112所述序列之一或所述特定序列之一的变异体中，则所述寡核苷酸探针或引物被称为“对应于”本发明的多核苷酸(包括SEQ ID NO：1-14、20、22-62、81-86和88-112所述序列之一)或变异体。本发明的寡核苷酸探针和引物与本文公开的多核苷酸基本上互补。
当一条链的核苷酸在适当地插入和/或缺失核苷酸的情况下与另一条链的核苷酸进行最佳比对和比较时，与所述另一条链的核苷酸至少80％、优选至少90％-95％、更优选至少98％-100％配对时，则这两个单链序列被认为基本上互补。或者，当第一条DNA链在严格杂交条件下选择性地与第二条DNA链杂交时，存在大致互补性。用于确定互补性的严格杂交条件包括低于约1M、更常见低于约500mM、更优选低于约200mM的盐条件。杂交温度可以低至5℃，但一般高于约22℃，更优选高于约30℃，最优选高于约37℃。较长的DNA片段可能需要更高的杂交温度以进行特异性杂交。由于杂交的严格性可以受其它因素例如探针组成、有机溶剂的存在和碱基错配程度的影响，因此参数的组合比任何单独参数的绝对测量更为重要。
在具体实施方案中，所述寡核苷酸探针和/或引物包含与本发明多核苷酸序列互补的至少约6个连续残基、更优选至少约10个连续残基、最优选至少约20个连续残基。本发明的探针和引物的长度可以为约8-100个碱基对，或优选长约10-50个碱基对，或更优选长约15-40个碱基对。采用本领域熟知的方法，考虑DNA-DNA杂交严格性、退火温度和解链温度以及形成环的潜力以及其它因素(这些都是本领域众所周知的)，可以容易地选择所述探针。适用于设计探针、尤其是适用于设计PCR引物的工具和软件可在因特网的例如URLhttp：//www.horizonpress.com/pcr/上获得。用于设计PCR引物的优选技术也公开于Dieffenbach，CW和Dyksler，CS，PCR Primer：alaboratorymanual，CSHL Press：Cold Spring Harbor，NY，1995。
可以以试剂盒的形式提供多种对应于本发明多核苷酸的寡核苷酸探针或引物。这类试剂盒通常包含多种DNA或寡核苷酸探针，每种探针对一种多核苷酸序列是特异性的。本发明的试剂盒可以包含一种或多种对应于本发明多核苷酸的探针或引物，本发明的多核苷酸包括在SEQ ID NO：1-14、20、22-62、81-86和88-112中鉴定的多核苷酸序列。
在可用于高通量测定的一个实施方案中，本发明的寡核苷酸探针试剂盒包含阵列形式的多种探针，其中每种探针固定在固相衬片表面上一个预定的、空间可寻址的位置上。可以有效用于本发明中的阵列形式公开于例如美国专利第5,412,087和5,545,451号；和PCT公布号WO 95/00450中，所述文献的公开内容通过引用结合到本文中。
本发明的多核苷酸也可以用来标记或鉴定有机体或其繁殖材料。例如，通过将非中断的(non-disruptive)非功能性异源多核苷酸鉴别物稳定导入有机体中，所述多核苷酸包含一种本发明的多核苷酸，可以完成这类标记。
提供以下实施例是为了说明本发明，而不是限制本发明。
                    实施例1
得自辐射松的遍在蛋白基因启动子的分离和特征鉴定
如下构建和筛选辐射松cDNA表达文库。采用Chang等的方案Plant Molecular Biology Reporter 11：113-116，1993，并作少许改进，从植物组织中提取mRNA。具体地说，将样品溶于CPC-RNAXB(100mMTris-Cl，pH8,0；25mM EDTA；2.0M NaCl；2％CTAB；2％PVP和0.05％亚精胺*3HCl)中，并用24∶1的氯仿∶异戊醇抽提。用乙醇沉淀mRNA，并用Poly(A)Quik mRNA分离试剂盒(Stratagene，La Jolla，CA)纯化总RNA制备物。通过反转录酶合成，从所述纯化mRNA构建cDNA表达文库，然后用ZAP Express cDNA合成试剂盒(Stratagene)按照生产商的方案，将所得cDNA克隆插入λZAP中。用Gigapack IIPackaging Extract(Stratagene)，用得自5μl连接混合物的1μl样品DNA，包装所得cDNA。用XL1-Blue MRF细胞和XLOLR细胞(Stratagene)与ExAssist辅助噬菌体(Stratagene)进行所述文库的大量切除(mass excision)。切下的噬菌粒用NZY肉汤(Gibco BRL，Gaithersburg，MD)稀释，并平板接种到含有X-gal和异丙基硫代-β-半乳糖苷(IPTG)的LB-卡那霉素琼脂平板上。
在平板接种并挑出用于DNA小量制备的菌落中，99％的菌落含有一个适合于测序的插入片段。将阳性菌落培养在含有卡那霉素的NZY肉汤中，并通过碱裂解和聚乙二醇(PEG)沉淀，纯化cDNA。用1％的琼脂糖凝胶，根据染色体污染来筛选测序模板。用Turbo Catalyst800仪(Perkin Elmer/Applied Biosystems Division，Foster City，CA)按照生产商的方案，制备染料引物序列。
用Perkin Elmer/Applied Biosystems Division Prism 377测序仪获得阳性克隆的DNA序列。首先从5’末端，在某些情况下也从3’末端，对cDNA克隆测序。对于某些克隆，用亚克隆片段获得内部序列。采用限制性作图并亚克隆至pBluescript II SK+载体的标准方法，进行亚克隆。
如下所述，所鉴定的最高丰度的序列之一是遍在蛋白基因，在下文称为“超级遍在蛋白(Super-Ubiquitin)”基因。含所述遍在蛋白基因的cDNA克隆的分离
与所述遍在蛋白基因具有同源性的cDNA克隆序列得自上述的高通量cDNA测序。将得自几个独立克隆的序列装配在一个重叠群中，并且从重叠克隆产生一个共有序列。SEQ ID NO：1中提供了所述分离的超级遍在蛋白克隆的已测定核苷酸序列，所述核苷酸序列包含启动子区(包括一个内含子)、编码区和3’非翻译区(UTR)。残基1-2064代表5’UTR，残基1196-2033代表内含子，而残基2065-2751代表所述基因的编码区，包含三个同向重复。3’UTR长328个残基(残基2755-3083)。SEQ ID NO：2中给出了包括所述内含子的仅超级遍在蛋白启动子区的核苷酸序列。SEQ ID NO：3中给出了不包括所述内含子的仅所述超级遍在蛋白启动子区的核苷酸序列。SEQ ID NO：80中提供了辐射松超级遍在蛋白的预测氨基酸序列。
遍在蛋白作为蛋白降解途径的一部分起作用，其中它们与蛋白质共价连接，从而靶向它们以进行降解(关于综述，参见Belknap和Garbarino，Trends in Plant Sciences 1：331-335，1996)。由单一mRNA编码的前体多肽产生所述蛋白质。所述超级遍在蛋白mRNA含有三个拷贝的所述遍在蛋白单体。所述超级遍在蛋白启动子的克隆
通过两个不同的基于PCR的方法，克隆所述超级遍在蛋白启动子的片段。方法1：长距离基因步查PCR
采用“长距离基因步查”PCR(Min和Powell，Biotechniques24：398-400，1998)，获得含有所述遍在蛋白基因完整编码区、5’UTR中的一个900bp内含子和约100bp所述启动子的一个2kb片段。
为了产生该片段，根据分离自松树的超级遍在蛋白cDNA序列的3′UTR设计2个嵌套引物。一般而言，所述5′UTR用于引物设计，以扩增上游序列。然而，超级遍在蛋白可利用的5′UTR非常短，并且衍生自该区的两个原始引物不能扩增任何片段。因此，根据3′UTR，设计了SEQ ID NO：15和16的引物。
该方法涉及一个用松树基因组DNA作为模板并且采用SEQ IDNO：15的引物的初始线性PCR步骤，随后采用末端转移酶对单链DNA产物进行C端加尾。第二个PCR步骤用这些片段作为模板，以用SEQ ID NO：16的引物和SEQ ID NO：17的引物AP进行扩增。AP引物设计用来结合由末端转移酶产生的polyC尾。这两种引物(SEQ IDNO：16和17)都含有一个5’-NotI限制位点，以将产物克隆到合适载体的NotI位点中。最终的PCR产物含有不同大小的片段。这些片段通过电泳分离，并且从凝胶中纯化最大的片段，用限制性内切核酸酶NotI消化，并且克隆到表达载体pBK-CMV(Stratagene，La Jolla，CA)的NotI位点中。这些克隆中最大的克隆含有该基因的完整编码区(在该编码序列中没有发现内含子)和一个含有900bp内含子的5′UTR。方法2：“基因组步查者(Genome Walker)”试剂盒
用“基因组步查者”试剂盒(Clontech，Palo Alto，CA)克隆所述超级遍在蛋白基因启动子。这也是一种基于PCR的方法，该方法需要构建2个PCR引物，其中一个必须是基因特异性的。虽然遍在蛋白编码区是高度保守的，但来自不同遍在蛋白基因的5′UTR不是保守的，因此可以用来设计基因特异性引物。扩增一个2.2kb片段，将其亚克隆到pGEM-T-easy(Promega，Madison，WI)中。通过PCR分析和DNA测序，表明该克隆含有所述超级遍在蛋白基因的5′UTR序列，包括900bp的内含子和约1kb的推定的启动子区。所述5′UTR中的一个内含子是植物多遍在蛋白基因的一个共同特征，并且可能参与决定基因表达水平。
在SEQ ID NO：18和19中提供了用于这些PCR反应的基因特异性引物。超级遍在蛋白的表达
采用衍生自基因特异性5’和3’UTR序列的引物，利用RT-PCR检查不同植物组织中超级遍在蛋白的表达水平。发现超级遍在蛋白在所检查的所有植物组织中表达，包括枝条韧皮部和木质部、饲养根、受精球花(fertilized cone)、针叶、一年生球果、花粉囊、授粉球花(pollinated cone)、根木质部、枝芽、结构根、茎干韧皮部和茎干。超级遍在蛋白在植物组织中的表达也在RNA印迹分析测定中，用根据5’UTR制备的PCR探针得到证实。超级遍在蛋白启动子的功能分析
为了测试所述超级遍在蛋白启动子在植物中的功能，用含有效连接于或者SEQ ID NO：2或者SEQ ID NO：3(即或者具有内含子或者无内含子)的超级遍在蛋白启动子的绿荧光蛋白(GFP)报道基因的构建体，转化拟南芥(Arabidopsis thaliana)。缺乏启动子的构建体用作阴性对照，带有一个克隆在GFP之前的CaMV 35s启动子的植物T-DNA载体用作阳性对照。将所述构建体通过土壤杆菌介导的转化，导入拟南芥属中。
所有的植物培养基均按照Valvekens和Van Montagu的方案(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5536-5540，1988)并作少许修改。对于根转化，将受精种子在萌发培养基表面上排成一行，将平板侧放，以促进根的获得，并且将种子于24℃培育2周，光周期为16小时。
通过测定绿荧光蛋白(GFP)报道基因的表达水平，测定所述构建体的表达。在T-DNA转移期间，在早期转基因根中检测到初步GFP表达(瞬时)。对于在含50μg/ml卡那霉素和100μg/ml Timentin的芽诱导培养基上培育时发育出绿色愈伤组织的转基因根，进一步测试其GFP表达。在卡那霉素培养基上严格选择数周后，几个独立的转基因拟南芥系被工程改造，测试其GFP表达。
用含内含子的超级遍在蛋白启动子和不含内含子的超级遍在蛋白启动子都观察到表达。然而，初步结果表明，用缺少内含子的超级遍在蛋白启动子构建体获得的表达水平显著高于用含内含子的所述启动子获得的表达水平，提示所述内含子可能含有一个抑制基因。SEQID NO：21中提供了所述内含子的序列。
                      实施例2
              从辐射松分离CDC启动子
如实施例1中所述，从辐射松cDNA表达文库中分离出与细胞分裂控制(CDC)蛋白基因同源的植物EST序列。采用上述“基因组步查者”方案和根据这些植物EST序列设计的基因特异性引物，从基因组DNA中分离出含有辐射松CDC基因的推定启动子的5’UTR序列。SEQ ID NO：4中给出了所测定的核苷酸序列。
                      实施例3
       从辐射松中分离木质部发生特异性启动子
基本上如实施例1中所述，从由木质部制备的辐射松cDNA表达文库中分离植物木质部发生特异性的植物EST序列。采用上述“基因组步查者”方案和根据这些植物EST序列设计的基因特异性引物，从基因组DNA中分离出含有推定的辐射松木质部发生特异性启动子的序列。SEQ ID NO：5和41-44中提供了所测定的核苷酸序列。在SEQID NO：92中提供了SEQ ID NO：41-44克隆的延伸的cDNA序列。
                      实施例4
        从辐射松中分离4-香豆酸-CoA连接酶启动子
如实施例1中所述，从辐射松cDNA表达文库中分离与4-香豆酸-CoA连接酶(4CL)基因同源的植物EST序列。采用上述“基因组步查者”方案和根据这些植物EST序列设计的基因特异性引物，从基因组DNA中分离出含有辐射松4CL基因的推定启动子的序列。SEQ IDNO：6中给出了所测定的核苷酸序列。
制备包含与SEQ ID NO：6启动子有效连接的绿荧光蛋白(GFP)报道基因或GUS报道基因的DNA构建体，并用其转化拟南芥植株。
                      实施例5
     从Eucalyptus grandis中分离纤维素合酶启动子
基本上如实施例1中所述，从Eucalyptus grandis cDNA表达文库中分离与纤维素合酶基因同源的植物EST序列。采用上述“基因组步查者”方案和根据这些植物EST序列设计的基因特异性引物，从基因组DNA中分离出含有E.Grandis纤维素合酶基因的推定启动子的5’UTR序列。用不同DNA条带作为模板的独立的PCR实验，产生含有许多碱基差异的两个序列。一个条带长750 bp，在SEQ ID NO：7中给出了该条带的核苷酸序列。另一个条带长3kb。该条带3’端的序列对应于SEQ ID NO：7中给出的序列，但有许多碱基对差异。SEQ IDNO：8中给出了该3’端的序列。在SEQ ID NO：20中给出了该条带5’端的序列。
                     实施例6
      从Eucalyptus grandis中分离叶特异性启动子
基本上如实施例1中所述，从由叶片组织制备的Eucalyptusgrandis cDNA表达文库中分离叶特异性的植物EST序列。采用上述“基因组步查者”方案和根据这些植物EST序列设计的基因特异性引物，从基因组DNA中分离出含有新的E.grandis基因(功能未知)的叶特异性启动子的5’UTR序列。用不同DNA条带作为模板的独立的PCR实验，产生含有许多碱基差异和缺失的三个序列。在SEQ IDNO：9-11中给出了这三个PCR片段的所测定的核苷酸序列。
                     实施例7
      从Eucalyptus grandis中分离O-甲基转移酶启动子
基本上如实施例1中所述，从Eucalyptus grandis cDNA表达文库中分离与O-甲基转移酶(OMT)基因同源的植物EST序列。采用上述“基因组步查者”方案和根据这些植物EST序列设计的基因特异性引物，从基因组DNA中分离出含有E.grandis OMT基因的推定启动子的5’UTR序列。在SEQ ID NO：12中给出了所测定的核苷酸序列。
制备包含与SEQ ID NO：12启动子有效连接的绿荧光蛋白(GFP)报道基因的DNA构建体，并用其转化拟南芥。
                     实施例8
           从辐射松分离根特异性启动子
如实施例1中所述，从辐射松cDNA表达文库中分离与根特异性受体样激酶基因同源的植物EST序列。采用上述“基因组步查者”方案和根据这些植物EST序列设计的基因特异性引物，从基因组DNA中分离出含有推定辐射松根特异性启动子的5’UTR序列。两个独立的PCR实验产生含有许多碱基差异的多个序列。在SEQ ID NO：13、14、110和111中给出了得自这两个实验的所测定的核苷酸序列。
                      实施例9
        从Eucalyptus Grandis中分离EF1-α启动子
如下从Eucalyptus grandis cDNA表达文库中分离与Eucalyptus延伸因子-α(EF1-α)基因同源的植物EST序列，并将其用来筛选Eucalyptus grandis基因组DNA文库。
用从Eucalyptus nitens x grandis植物组织中提取的基因组DNA，按照Doyle和Doyle，Focus 12：13-15，1990的方案并作少许修改，构建Eucalyptus grandis基因组DNA文库。具体地说，在液氮下研磨植物组织，并将其溶于2X CTAB提取缓冲液(2％CTAB，溴化十六碳烷基三甲铵；1.4M NaCl，20mM EDTA pH8.0，100mM Tris.HCl pH8.0，1％聚乙烯吡咯烷酮)中。用氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提后，将10％CTAB加入水层中，然后重复氯仿∶异戊醇抽提。用异丙醇沉淀基因组DNA。
所得DNA用限制性内切核酸酶Sau3A1按照标准方法消化，用苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提一次，并用乙醇沉淀。消化的片段在蔗糖密度梯度上用超速离心分离。将含有9-23kb片段的部分合并并用乙醇沉淀。按照生产商的方案将所得片段克隆到λDASH II/BamHI载体(Stratagene，La Jolla，CA)中，并且用Gigapack II Packaging Extract(Stratagene)包装。将该文库扩增一次。
用由Eucalyptus grandis文库(如实施例1所述)分离的放射标记的EST片段，筛选该文库，所述EST片段显示出与Eucalyptus EF1-α基因有同源性。由阳性噬菌斑制备噬菌体裂解液，并提取基因组DNA。
用延伸酶扩增系统(ELONGASE Amplification System)(GibcoBRL)，从该基因组DNA获得含有Eucalyptus EF1-α基因的推定启动子的5’UTR区。扩增一个10 kb片段，并对其进行限制性作图。在一个4kb片段上鉴定出Eucalyptus延伸因子A(EF1-α)基因的推定启动子区，将其亚克隆到含有工程化NotI位点的pUC19载体(Gibco BRL)中。在SEQ ID NO：61和62中提供了含有该启动子区的分离片段的测定的基因组DNA序列，而在SEQ ID NO：79中提供了由SEQ ID NO：61编码的预测氨基酸。
                     实施例10
       从Eucalyptus grandis中分离花特异性启动子
基本上如实施例1中所述，从由花组织制备的Eucalyptus grandiscDNA表达文库中分离花衍生组织特异性的植物EST序列。采用上述“基因组步查者”方案和根据这些植物EST序列设计的基因特异性引物，从基因组DNA中分离出几个序列，每个序列含有一个推定的Eucalyptus grandis花特异性启动子。在SEQ ID NO：29-33和59中给出了所测定的核苷酸序列。在SEQ ID NO：89中提供了SEQ ID NO：30-33克隆的延伸的cDNA序列。在SEQ ID NO：90中提供了SEQ IDNO：29克隆的延伸的cDNA序列。
                    实施例11
  从Eucalyptus grandis和辐射松中分离花粉特异性启动子
基本上如实施例1中所述，从由花粉制备的Eucalyptus grandis和辐射松的cDNA表达文库中分离花粉特异性的植物EST序列。采用上述“基因组步查者”方案和根据这些植物EST序列设计的基因特异性引物，从基因组DNA中分离出几个序列，每个序列含有一个推定的花粉特异性启动子。在SEQ ID NO：49-53中给出了分离自辐射松所测定的核苷酸序列，在SEQ ID NO：73-75中分别提供了由SEQ ID NO：51-53编码的预测的氨基酸序列。在SEQ ID NO：94中提供了SEQ IDNO：49克隆的延伸的cDNA序列。
                      实施例12
     从辐射松中分离芽特异性和分生组织特异性启动子
基本上如实施例1中所述，从由芽和分生组织制备的辐射松cDNA表达文库中分离芽和分生组织特异性的植物EST序列。采用上述“基因组步查者”方案和根据这些植物EST序列设计的基因特异性引物，从基因组DNA中分离出两个序列，一个序列含有一个推定的芽特异性启动子，而另一个含有一个推定的分生组织特异性启动子。在SEQ ID NO：40和45中分别给出了这两个启动子的测定的核苷酸序列。在SEQ ID NO：70和71中分别提供了由SEQ ID NO：40和45的DNA序列编码的预测的氨基酸序列。
                     实施例13
         从Eucalyptus grandis中分离多种启动子
基本上如实施例1中所述，从Eucalyptus grandis cDNA表达文库中分离显示出与各种已知基因具有某些同源性的植物EST序列。采用上述“基因组步查者”方案和根据这些植物EST序列设计的基因特异性引物，从基因组DNA中分离出含有以下E.grandis基因的推定启动子的序列：生长素诱导的蛋白(SEQ ID NO：26-28)；碳酸酐酶(SEQ IDNO：36)；异黄酮还原酶(SEQ ID NO：37和38)；花粉变应原(SEQ IDNO：23-25)；花粉外被蛋白(SEQ ID NO：22)，蔗糖合酶(SEQ ID NO：56-58)；遍在蛋白(SEQ ID NO：34)；甘油醛-3-磷酸脱氢酶(SEQ ID NO：35和39)；O-甲基转移酶(OMT；SEQ ID NO：60)；哺乳动物的巨噬细胞移动抑制因子(MIF；SEQ ID NO：81-86)；UDP葡萄糖6-脱氢酶(SEQ IDNO：103)；漆酶1(SEQ ID NO：105，106)；阿拉伯半乳聚糖样1(SEQID NO：107)；阿拉伯半乳聚糖样2(SEQ ID NO：108，109)和一个假定蛋白(SEQ ID NO：104)。在SEQ ID NO：63、64、65、66、67、68、69、76、77、78和87中分别提供了由SEQ ID NO：22、25、26、28、34、35、36、56、57、60和86的DNA序列编码的预测的氨基酸序列。在SEQ ID NO：91和93中分别提供了SEQ ID NO：58和35克隆的延伸的cDNA序列。
                    实施例14
              从辐射松分离多种启动子
基本上如实施例1中所述，从辐射松cDNA表达文库中分离显示出与各种已知基因具有某些同源性的植物EST序列。采用上述“基因组步查者”方案和根据这些植物EST序列设计的基因特异性引物，从基因组DNA中分离出含有以下辐射松基因的推定启动子的序列：衰老样蛋白(SEQ ID NO：46-48)；花粉特异性结瘤素同系物(SEQ ID NO：54和55)；查耳酮合酶(SEQ ID NO：88)；PrMALE1(SEQ ID NO：95，96)；UDP葡萄糖糖基转移酶(SEQ ID NO：97)；延伸因子1α(SEQ IDNO：98，99)；S-腺苷甲硫氨酸合酶(SEQ ID NO：100-102)；和辐射松脂质转运蛋白2(PrLTP2；SEQ ID NO：112)。在SEQ ID NO：72中提供了由SEQ ID NO：46的序列编码的预测的氨基酸序列。
                   实施例15
            多核苷酸和氨基酸分析
将上述已测定的cDNA序列与EMBL数据库(直至1999年9月)中的已知序列进行比较和比对。具体地说，用设定至以下运行参数的BLASTN算法2.0.6版本[9-16-1998]将SEQ ID NO：22-62和88-112中鉴定的多核苷酸与EMBL数据库中的多核苷酸进行比较，所述参数为：Unix运行命令：blastall-p blastn-d embldb-e 10-G0-E0-rl-v30-b30-i queryseq-o results。丰余序列的多重比对用来建立可靠的共有序列。根据与来自其它植物或非植物物种的已知序列的相似性，鉴定为SEQ ID NO：22-62和88-112的本发明的分离多核苷酸推定性地鉴定为具有以上表1中所示的功能。
用计算机算法BLASTN，如上所述测定出SEO ID NO：1-22、23、25-42、45-49、57-59、62、88-99和101-112的cDNA序列与EMBL数据库中的序列的同一性低于40％。如上所述，用BLASTN，测定出SEQ ID NO：56的cDNA序列与EMBL数据库中的序列的同一性低于60％。如上所述，用BLASTN，测定出SEQ ID NO：43、52、60和61的cDNA序列与EMBL数据库中的序列具有的同一性低于75％。如上所述，用BLASTN，测定出SEQ ID NO：24、51和100的cDNA序列与EMBL数据库中的序列具有的同一性低于90％。
             序列表
<110>Perera，J.Ranjan
     Eagleton，Clare
     Rice，Stephen J.
<120>用于修饰基因表达的组合物和方法
<130>11000.1036C1PCT
<160>112
<170>FastSEQ for Windows Version 3.0
<210>1
<211>3083
<212>DNA
<213>辐射松(Pinus radiata)
<220>
<221>5’UTR
<222>(1)...(2064)
<221>内含子
<222>(1196)...(2033)
<221>CDS
<222>(2065)...(2751)
<221>3’UTR
<222>(2755)...(3083)
<400>1aaaacccctc acaaatacat aaaaaaaatt ctttatttaa ttatcaaact ctccactacc    60tttcccacca accgttacaa tcctgaatgt tggaaaaaac taactacatt gatataaaaa    120aactacatta cttcctaaat catatcaaaa ttgtataaat atatccactc aaaggagtct    180agaagatcca cttggacaaa ttgcccatag ttggaaagat gttcaccaag tcaacaagat    240ttatcaatgg aaaaatccat ctaccaaact tactttcaag aaaatccaag gattatagag    300taaaaaatct atgtattatt aagtcaaaaa gaaaaccaaa gtgaacaaat attgatgtac    360aagtttgaga ggataagaca ttggaatcgt ctaaccagga ggcggaggaa ttccctagac    420agttaaaagt ggccggaatc ccggtaaaaa agattaaaat ttttttgtag agggagtgct    480tgaatcatgt tttttatgat ggaaatagat tcagcaccat caaaaacatt caggacacct    540aaaattttga agtttaacaa aaataacttg gatctacaaa aatccgtatc ggattttctc    600taaatataac tagaattttc ataactttca aagcaactcc tcccctaacc gtaaaacttt    660tcctacttca ccgttaatta cattccttaa gagtagataa agaaataaag taaataaaag    720tattcacaaa ccaacaattt atttctttta tttacttaaa aaaacaaaaa gtttatttat    780tttacttaaa tggcataatg acatatcgga gatccctcga acgagaatct tttatctccc    840tggttttgta ttaaaaagta atttattgtg gggtccacgc ggagttggaa tcctacagac    900gcgctttaca tacgtctcga gaagcgtgac ggatgtgcga ccggatgacc ctgtataacc    960caccgacaca gccagcgcac agtatacacg tgtcatttct ctattggaaa atgtcgttgt   1020tatccccgct ggtacgcaac caccgatggt gacaggtcgt ctgttgtcgt gtcgcgtagc   1080gggagaaggg tctcatccaa cgctattaaa tactcgcctt caccgcgtta cttctcatct   1140tttctcttgc gttgtataat cagtgcgata ttctcagaga gcttttcatt caaaggtatg   1200gagttttgaa gggctttact cttaacattt gtttttcttt gtaaattgtt aatggtggtt   1260tctgtggggg aagaatcttt tgccaggtcc ttttgggttt cgcatgttta tttgggttat   1320ttttctcgac tatggctgac attactaggg ctttcgtgct ttcatctgtg ttttcttccc   1380ttaataggtc tgtctctctg gaatatttaa ttttcgtatg taagttatga gtagtcgctg   1440tttgtaatag gctcttgtct gtaaaggttt cagcaggtgt ttgcgtttta ttgcgtcatg   1500tgtttcagaa ggcctttgca gattattgcg ttgtacttta atattttgtc tccaaccttg   1560ttatagtttc cctcctttga tctcacagga accctttctt ctttgagcat tttcttgtgg   1620cgttctgtag taatatttta attttgggcc cgggttctga gggtaggtga ttattccagt   1680gatgtgcttt ccctataagg tcctctatgt gtaagctgtt agggtttgtg cgttactatt   1740gacatgtcac atgtcacata ttttcttcct cttatccttc gaactgatgg ttctttttct   1800aattcgtgga ttgctggtgc catattttat ttctattgca actgtatttt agggtgtctc   1860tttctttttg atttcttgtt aatatttgtg ttcaggttgt aactatgggt tgctagggtg   1920tctgccctct tcttttgtgc ttctttcgca gaatctgtcc gttggtctgt atttgggtga   1980tgaattattt attccttgaa gtatctgtct aattagcttg tgatgatgtg caggtatatt   2040cgttagtcat atttcaattt caag atg cag atc ttt gtc aag act ctc acc      2091
                       Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr
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             30                  35                  40cgt ctg atc ttc gca gga aag cag ctt gag gac ggc cga acc ctt gcc     2235Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ala
         45                  50                  55gat tac aac atc cag aaa gaa tct acc ctc cac ctt gtt ctc cgt ttg     2283Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu Ser Thr Leu His Leu Val Leu Arg Leu
     60                  65                  70agg ggt ggc atg caa atc ttt gta aaa aca cta act gga aag aca att     2331Arg Gly Gly Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile
 75                  80                  85aca ttg gaa gtt gag agc tcg gac acc att gac aac gtc aag gcc aag     2379Thr Leu Glu Val Glu Ser Ser Asp Thr Ile Asp Asn Val Lys Ala Lys90                  95                 100                 105atc cag gac aag gaa gga att ccc cct gac cag cag agg ctt atc ttc     2427Ile Gln Asp Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe
            110                 115                 120gct ggt aag cag ctg gag gat ggc agg acc ttg gct gat tac aat att     2475Ala Gly Lys Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ala Asp Tyr Asn Ile
        125                 130                 135caa aag gaa tcg acc ctg cat ttg gtg ctt cgt cta aga gga ggc atg     2523Gln Lys Glu Ser Thr Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Gly Met
    140                 145                 150caa atc ttt gtg aaa acc ctt aca ggt aaa acc att act ctg gaa gtg     2571Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu Val
155                 160                 165gaa agc tcg gac acc att gac aat gtg aag gct aag atc cag gac aag     2619Glu Ser Ser Asp Thr Ile Asp Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp Lys170                 175                 180                 185gag gga att cca cct gac cag cag agg ttg atc ttt gcc ggt aag cag     2667Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys Gln
            190                 195                 200ctg gaa gat ggt cgt act ctc gcc gat tac aat att cag aag gaa tcg     2715Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ala Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu Ser
        205                 210                 215acc ctt cac ctg gtg ctc cgt ctc cgc ggt ggc ttt taggtttggg          2761Thr Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Gly Phe
    220                 225tgttatttgt ggataataaa ttcgggtgat gttcagtgtt tgtcgtattt ctcacgaata   2821aattgtgttt atgtatgtgt tagtgttgtt tgtctgtttc agaccctctt atgttatatt   2881tttcttttcg tcggtcagtt gaagccaata ctggtgtcct ggccggcact gcaataccat   2941ttcgtttaat ataaagactc tgttatccgt tatgtaattc catgttatgt ggtgaaatgt   3001ggatgaaatt cttagaaatt attattgtaa tttgaaactt ccttcgtcaa taatctgcac   3061aacacattta ccaaaaaaaa aa                                            3083
<210>2
<211>2064
<212>DNA
<213>辐射松
<220>
<221>5’UTR
<222>(1)...(2064)
<221>内含子
<222>(1196)...(2033)
<400>2aaaacccctc acaaatacat aaaaaaaatt ctttatttaa ttatcaaact ctccactacc      60tttcccacca accgttacaa tcctgaatgt tggaaaaaac taactacatt gatataaaaa     120aactacatta cttcctaaat catatcaaaa ttgtataaat atatccactc aaaggagtct     180agaagatcca cttggacaaa ttgcccatag ttggaaagat gttcaccaag tcaacaagat     240ttatcaatgg aaaaatccat ctaccaaact tactttcaag aaaatccaag gattatagag     300taaaaaatct atgtattatt aagtcaaaaa gaaaaccaaa gtgaacaaat attgatgtac     360aagtttgaga ggataagaca ttggaatcgt ctaaccagga ggcggaggaa ttccctagac     420agttaaaagt ggccggaatc ccggtaaaaa agattaaaat ttttttgtag agggagtgct     480tgaatcatgt tttttatgat ggaaatagat tcagcaccat caaaaacatt caggacacct     540aaaattttga agtttaacaa aaataacttg gatctacaaa aatccgtatc ggattttctc     600taaatataac tagaattttc ataactttca aagcaactcc tcccctaacc gtaaaacttt     660tcctacttca ccgttaatta cattccttaa gagtagataa agaaataaag taaataaaag     720tattcacaaa ccaacaattt atttctttta tttacttaaa aaaacaaaaa gtttatttat     780tttacttaaa tggcataatg acatatcgga gatccctcga acgagaatct tttatctccc     840tggttttgta ttaaaaagta atttattgtg gggtccacgc ggagttggaa tcctacagac     900gcgctttaca tacgtctcga gaagcgtgac ggatgtgcga ccggatgacc ctgtataacc     960caccgacaca gccagcgcac agtatacacg tgtcatttct ctattggaaa atgtcgttgt    1020tatccccgct ggtacgcaac caccgatggt gacaggtcgt ctgttgtcgt gtcgcgtagc    1080gggagaaggg tctcatccaa cgctattaaa tactcgcctt caccgcgtta cttctcatct    1140tttctcttgc gttgtataat cagtgcgata ttctcagaga gcttttcatt caaaggtatg    1200gagttttgaa gggctttact cttaacattt gtttttcttt gtaaattgtt aatggtggtt    1260tctgtggggg aagaatcttt tgccaggtcc ttttgggttt cgcatgttta tttgggttat    1320ttttctcgac tatggctgac attactaggg ctttcgtgct ttcatctgtg ttttcttccc    1380ttaataggtc tgtctctctg gaatatttaa ttttcgtatg taagttatga gtagtcgctg    1440tttgtaatag gctcttgtct gtaaaggttt cagcaggtgt ttgcgtttta ttgcgtcatg    1500tgtttcagaa ggcctttgca gattattgcg ttgtacttta atattttgtc tccaaccttg    1560ttatagtttc cctcctttga tctcacagga accctttctt ctttgagcat tttcttgtgg    1620cgttctgtag taatatttta attttgggcc cgggttctga gggtaggtga ttattccagt    1680gatgtgcttt ccctataagg tcctctatgt gtaagctgtt agggtttgtg cgttactatt    1740gacatgtcac atgtcacata ttttcttcct cttatccttc gaactgatgg ttctttttct    1800aattcgtgga ttgctggtgc catattttat ttctattgca actgtatttt agggtgtctc    1860tttctttttg atttcttgtt aatatttgtg ttcaggttgt aactatgggt tgctagggtg    1920tctgccctct tcttttgtgc ttctttcgca gaatctgtcc gttggtctgt atttgggtga    1980tgaattattt attccttgaa gtatctgtct aattagcttg tgatgatgtg caggtatatt    2040cgttagtcat atttcaattt caag                                           2064
<210>3
<211>1226
<212>DNA
<213>辐射松
<220>
<221>5’UTR
<222>(1)...(1266)
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<210>4
<211>485
<212>DNA
<213>辐射松
<220>
<221>5’UTR
<222>(1)...(431)
<221>TATA_信号
<222>(350)...(356)
<221>CAAT_信号
<222>(326)...(333)
<400>4agtaaaattg gcccatgtag gactaagtca aaatcaaaat tccatctcta aaagcggaac      60tttgtcccct gaaaattttg actaatttcc aaccaaaaaa aagtggggga aaatataaaa     120ctctaactaa taaaacaata atcaccaaaa atctatcacc aaaaatgaaa aaagattttg     180aatactaggc catatgagct acacaaattt caaaagtatc ttacacttat tacgcacccg     240gatgtcccca ctttcgaaaa acccgtttca agcctttcac gaaagtccaa cggtcagaaa     300attcaaaatg actgtttgag gcagagccaa tctaggacca cgctccattt atatatggcc     360tctgcttctc tcgaccctta gagtcctctg ctctgcgaat cttgttgtta gttactgtgt     420acgctgtaac aatggatgcc tatgagaagt tggagaaggt gggagaagga acctatggga     480aggtg                                                                 485
<210>5
<211>246
<212>DNA
<213>辐射松
<220>
<221>5’UTR
<222>(1)...(167)
<221>TATA_信号
<222>(185)...(191)
<400>5tgagaacatg ataagctgtg taaattcatg ctagtcacca taacttttct cattgctttt      60catccacact gttgattcat tcattatata agatcagatt cgtatgatat acaggcaacc     120atagaaacaa ccagcaaagt tactagcagg aaatccaact aggtatcatg aagactacca     180acgcaggctc gataatgttg gtgctcatta tttttgggtg ctgtttcatt ggggtcatag     240ctacat                                                                246
<210>6
<211>600
<212>DNA
<213>辐射松
<220>
<221>5’UTR
<222>(1)...(167)
<221>TATA_信号
<222>(471)...(477)
<221>CAAT_信号
<222>(444)...(451)
<400>6caccaattta atgggatttc agatttgtat cccatgctat tggctaagcc atttttctta      60ttgtaatcta accaattcca atttccaccc tggtgtgaac tgactgacaa atgcggcccg     120aaaacagcga atgaaatgtc tgggtgatcg gtcaaacaag cggtgggcga gagaacgcgg     180gtgttggcct agccgggatg ggggtaggta gacggcgtat taccggcgag ttgtccgaat     240ggagttttcg gggtaggtag taacgtagac gtcaatggaa aaagtcataa tctccgtcaa     300aaatccaacc gctccttcac accgcagagt tggtggccac gggaccctcc acccactcac     360tcaatcgatc gcctgccgtg gttgcccatt attcaaccat acgccacttg actcttcacc     420aacaattcca ggccggcttt cgagacaatg tactgcacag gaaaatccaa tataaaaggc     480cggcctccgc ttccttctca gtagccccca gctcattcaa ttcttcccac tgcaggctac     540atttgtcaga cacgttttcc gccatttttc gcctgtttct gcggagaatt tgatcaggtt     600
<210>7
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    35                  40                  45Lys Ala Gln Gly Ala Ala Asp Ala Val Lys Asn Ala Thr Gly Met Asn
50                  55                  60Lys65
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        20                  25                  30Lys Ile Phe Pro Asp Gln Tyr Lys Asn Ile Glu Val Leu Glu Gly Asp
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        100                 105                 110Ser Leu Val Lys Trp Ser Cys Gly Phe Glu Lys Ala Ser Asp Glu Ile
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<213>Eucalyptus grandis
<400>65Met Ala Ala Asn Phe Val Ile Pro Thr Lys Met Lys Ala Trp Val Tyr1               5                  10                  15Arg Glu His Gly Asn Val Ala Asp Val Leu Gly Leu Asp Pro Glu Leu
        20                  25                  30Lys Val Pro Glu Leu Gln Glu Gly Gln Val Leu Val Lys Val Leu Ala
    35                  40                  45Ala Ala Leu Asn Pro Val Asp Ala Ala Arg Met Lys Gly Val Ile Lys
50                  55                  60Leu Pro Gly Phe Ser Leu Pro Ala Val Pro Gly Tyr Asp Leu Ala Gly65                  70                  75                  80Val Val Val Lys Val Gly Arg Glu Val Lys Glu Leu Lys Ile Gly Asp
            85                  90                  95Glu Val Tyr Gly Phe Met Phe His Ala Lys Lys Asp Gly Thr Leu Ala
       100                  105                 110Glu Tyr Ala Ala Val
    115
<210>66
<211>318
<212>PRT
<213>Eucalyptus grandis
<400>66Met Ala Ala Asn Phe Val Ile Pro Thr Lys Met Lys Ala Trp Val Tyr1               5                  10                  15Arg Glu His Gly Asp Val Ala Asn Val Leu Gly Leu Asp Pro Glu Leu
        20                  25                  30Lys Val Pro Glu Leu Gln Glu Gly Gln Val Leu Val Lys Val Leu Ala
    35                  40                  45Ala Ala Leu Asn Pro Ile Asp Thr Ala Arg Val Lys Gly Val Ile Lys
50                  55                  60Leu Pro Gly Phe Ser Leu Pro Ala Val Pro Gly Tyr Asp Leu Ala Gly65                  70                  75                  80Val Val Val Lys Val Gly Arg Glu Val Lys Glu Leu Lys Val Gly Asp
            85                  90                  95Glu Val Tyr Gly Phe Met Phe His Ala Lys Lys Asp Gly Thr Leu Ala
        100                 105                 110Glu Tyr Ala Ala Val Glu Glu Ser Phe Leu Ala Leu Lys Pro Lys Lys
    115                 120                 125Leu Arg Phe Gly Glu Ala Ala Ser Leu Pro Val Val Ile Gln Thr Ala
130                 135                 140Tyr Gly Gly Leu Glu Arg Ala Gly Leu Ser His Gly Lys Ser Leu Leu145                 150                 155                 160Val Leu Gly Gly Ala Gly Gly Val Gly Thr Leu Ile Ile Gln Leu Ala
            165                 170                 175Lys Glu Val Phe Gly Ala Ser Arg Val Ala Ala Thr Ser Ser Thr Gly
        180                 185                 190Lys Leu Glu Leu Leu Lys Ser Leu Gly Ala Asp Leu Ala Ile Asp Tyr
    195                 200                 205Thr Lys Val Asn Phe Glu Asp Leu Pro Glu Lys Phe Asp Val Val Tyr
210                 215                 220Asp Thr Val Gly Glu Ile Glu Arg Ala Ala Lys Ala Val Lys Pro Gly225                 230                 235                 240Giy Ser Ile Val Thr Ile Val Lys Gln Asn Lys Thr Leu Pro Pro Pro
            245                 250                 255Ala Phe Phe Phe Ala Val Thr Ser Asn Arg Ser Thr Leu Glu Lys Leu
        260                 265                 270Lys Pro Phe Leu Glu Ser Gly Lys Val Lys Pro Val Ile Asp Pro Lys
    275                 280                 285Ser Pro Phe Pro Phe Ser Gln Ala Ile Glu Ala Phe Ser Tyr Leu Gln
290                 295                 300Thr Arg Arg Ala Thr Gly Lys Leu Val Ile His Pro Val Pro305                 310                 315
<210>67
<211>156
<212>PRT
<213>Eucalyptus grandis
<400>67Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu1               5                  10                  15Val Glu Ser Ser Asp Thr Val Asp Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp
         20                 25                  30Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys
    35                  40                  45Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ala Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu
50                  55                  60Ser Thr Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Gly Met Gln Ile Phe65                  70                  75                  80Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu Val Glu Ser Ser
            85                  90                  95Asp Thr Val Asp Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp Lys Glu Gly Ile
        100                 105                 110Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys Gln Leu Glu Asp
    115                 120                 125Gly Arg Thr Leu Ala Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu Ser Thr Leu His
130                 135                 140Leu Val Leu Arg Leu Lys Gly Gly Met Gln Ile Phe145                 150                 155
<210>68
<211>238
<212>PRT
<213>Eucalyptus grandis
<400>68Met Ala Thr His Ala Ala Leu Ala Pro Ser Thr Leu Pro Ala Asn Ala1               5                  10                  15Lys Phe Ser Ser Lys Ser Ser Ser His Ser Phe Pro Thr Gln Cys Phe
        20                  25                  30Ser Lys Arg Leu Glu Val Ala Glu Phe Ser Gly Leu Arg Ala Gly Ser
    35                  40                  45Cys Val Thr Tyr Ala Lys Asn Ala Gly Glu Gly Ser Phe Phe Asp Ala
50                  55                  60Val Ala Ala Gln Leu Thr Pro Lys Thr Ser Ala Pro Ala Pro Ala Lys65                  70                  75                  80Gly Glu Thr Val Ala Lys Leu Lys Val Ala Ile Asn Gly Phe Gly Arg
            85                  90                   95Ile Gly Arg Asn Phe Leu Arg Cys Trp His Gly Arg Lys Asn Ser Pro
        100                 105                 110Leu Asp Val Ile Val Val Asn Asp Ser Gly Gly Val Lys Asn Ala Ser
    115                 120                 125His Leu Leu Lys Tyr Asp Ser Met Leu Gly Thr Phe Lys Ala Asp Val
130                 135                 140Lys Ile Val Asp Asn Glu Thr Ile Ser Val Asp Gly Lys Pro Val Lys145                 150                 155                 160Val Val Ser Asn Arg Asp Pro Leu Lys Leu Pro Trp Ala Glu Leu Gly
           165                  170                 175Ile Asp Ile Val Ile Glu Gly Thr Gly Val Phe Val Asp Gly Pro Gly
        180                 185                 190Ala Gly Lys His Ile Gln Ala Gly Ala Lys Lys Val Ile Ile Thr Ala
    195                 200                 205Pro Ala Lys Gly Ala Asp Ile Pro Thr Tyr Val Tyr Gly Val Asn Glu
210                 215                220Thr Asp Tyr Ser His Glu Val Ala Asn Ile Ile Ser Asn Ala225                 230                 235
 <210>69
<211>168
<212>PRT
<213>Eucalyptus grandis
<400>69Met Ser Thr Ser Pro Val Ser Ser Trp Cys Ala Thr Ser Phe Ser Pro1               5                  10                  15Ala His Ser Ser Leu Lys Arg Ala Ala Gly Leu Arg Pro Ser Leu Ser
        20                  25                  30Ala Arg Leu Gly Pro Ser Ser Ser Ser Ser Ser Val Ser Pro Pro Thr
    35                  40                  45Leu Ile Arg Asn Glu Pro Val Phe Ala Ala Pro Ala Pro Val Ile Asn
50                  55                  60Pro Thr Trp Thr Glu Glu Met Gly Lys Asp Tyr Asp Glu Ala Ile Glu65                  70                  75                  80Ala Leu Lys Lys Leu Leu Ser Glu Lys Gly Asp Leu Lys Ala Thr Ala
            85                  90                  95Ala Ala Lys Val Glu Gln Ile Thr Ala Glu Leu Gln Thr Ala Ser Pro
        100                 105                 110Asp Ile Lys Pro Ser Ser Ser Val Asp Arg Ile Lys Thr Gly Phe Thr
    115                 120                 125Phe Phe Lys Lys Glu Lys Tyr Asp Lys Asn Pro Ala Leu Tyr Gly Glu
130                 135                 140Leu Ala Lys Gln Ser Pro Lys Phe Met Val Phe Ala Cys Ser Asp Ser145                 150                 155                 160Arg Val Cys Pro Ser His Val Leu
            165
<210>70
<211>214
<212>PRT
<213>Eucalyptus grandis
<400>70Met Pro Cys Pro Arg Ala Pro Pro Met Met Glu Arg Arg Ile Lys Pro1              5                  10                  15Gln Thr Glu Gln Ala Leu Lys Cys Pro Arg Cys Asp Ser Thr Asn Thr
        20                  25                  30Lys Phe Cys Tyr Tyr Asn Asn Tyr Asn Leu Ser Gln Pro Arg His Phe
    35                  40                  45Cys Lys Thr Cys Arg Arg Tyr Trp Thr Lys Gly Gly Ala Leu Arg Asn
50                  55                  60Val Pro Val Gly Gly Gly Cys Arg Lys Asn Lys Arg Ala Lys Arg Ala65                  70                  75                  80Val Asp His Pro Val Ser Ala Gln Asn Glu Ala Ser Thr Ser Ala Ala
            85                  90                  95Pro Gly Asn Glu Val Pro Asp Arg Ser Pro Phe Glu Pro Pro Ser Ser
        100                 105                 110Lys Ser Ile Tyr Tyr Gly Gly Glu Asn Met Asn Leu Thr Gly Leu Pro
    115                 120                 125Phe Ser Arg Ile Gln Gln Asp Arg Ala Ala Leu Ala His Cys Asn Ser
130                 135                 140Ser Ser Phe Leu Gly Met Ser Cys Gly Thr Gln Ser Ala Ser Leu Glu145                 150                 155                 160Pro His Leu Ser Ala Leu Asn Thr Phe Asn Ser Phe Lys Ser Asn Asn
            165                 170                 175Pro Gly Leu Asp Phe Pro Ser Leu Ser Thr Asp Gln Asn Ser Leu Phe
        180                 185                 190Glu Thr Ser Gln Pro Gln Leu Ser Arg Ala Met Ala Ser Ala Leu Phe
    195                 200                 205Ser Met Pro Met Ala Pro
210
<210>71
<211>166
<212>PRT
<213>辐射松
<400>71Met Ala Ala Leu Ala Thr Thr Glu Val Cys Asp Thr Tyr Pro Arg Leu1               5                  10                  15Val Glu Asn Gly Glu Leu Arg Val Leu Gln Pro Ile Phe Gln Ile Tyr
        20                  25                  30Gly Arg Arg Arg Ala Phe Ser Gly Pro Ile Val Thr Leu Lys Val Phe
    35                  40                  45Glu Asp Asn Val Leu Leu Arg Glu Phe Leu Glu Glu Arg Gly Asn Gly
50                  55                  60Arg Val Leu Val Val Asp Gly Gly Gly Ser Leu Arg Cys Ala Ile Leu65                  70                  75                  80Gly Gly Asn Val Val Val Ser Ala Gln Asn Asn Gly Trp Ser Gly Ile
            85                  90                  95Ile Val Thr Gly Cys Ile Arg Asp VaI Asp Glu Ile Asn Arg Cys Asp
        100                 105                 110Ile Gly Ile Arg Ala Leu Thr Ser Asn Pro Leu Lys Ala Asn Lys Lys
    115                 120                 125Gly Val Gly Glu Lys His Ala Pro Ile Tyr Ile Ala Gly Thr Arg Ile
130                 135                 140Leu Pro Gly Glu Trp Cys Tyr Ala Asp Ser Asp Gly Ile Leu Val Ser145                 150                 155                 160Gln Gln Glu Leu Ser Leu
            165
<210>72
<211>236
<212>PRT
<213>辐射松
<400>72Met Leu Val Leu Ile Ile Phe Gly Cys Cys Phe Ile Gly Val Ile Ala1              5                  10                  15Thr Ser Phe Asp Phe Tyr Tyr Phe Val Gln Gln Trp Pro Gly Ser Tyr
        20                  25                  30Cys Asp Thr Arg Arg Gly Cys Cys Tyr Pro Arg Thr Gly Arg Pro Ala
    35                  40                  45Ser Glu Phe Ser Ile His Gly Leu Trp Pro Asn Tyr Lys Thr Gly Lys
50                  55                  60Trp Pro Gln Phe Cys Gly Ser Ser Glu Glu Phe Asp Tyr Ser Lys Ile65                  70                  75                  80Ser Asp Leu Glu Glu Glu Leu Asn Arg Tyr Trp Gly Ser Leu Ser Cys
            85                  90                  95Pro Ser Ser Asp Gly Gln Glu Phe Trp Gly His Glu Trp Glu Lys His
        100                 105                 110Gly Thr Cys Ser Leu Asn Leu Asp Glu His Ser Tyr Phe Glu Lys Ala
    115                 120                 125Leu Ser Leu Arg Gln Asn Ile Asp Ile Leu Gly Ala Leu Lys Thr Ala
130                 135                 140Gly Ile Lys Pro Asp Gly Ser Gln Tyr Ser Leu Ser Asp Ile Lys Glu145                 150                 155                 160Ala Ile Lys Gln Asn Thr Gly Gln Leu Pro Gly Ile Asp Cys Asn Thr
            165                 170                 175Ser Ala Glu Gly Glu His Gln Leu Tyr Gln Val Tyr Val Cys Val Asp
        180                 185                 190Lys Ser Asp Ala Ser Thr Val Ile Glu Cys Pro Ile Tyr Pro His Ser
    195                 200                 205Asn Cys Pro Ser Met Val Val Phe Pro Pro Phe Gly Glu Asp Gln Glu
210                 215                 220Asp Arg Asp Gly Tyr Thr Glu Gly Met Tyr Glu Leu225                 230                 235
<210>73
<211>92
<212>PRT
<213>辐射松
<400>73Met Ala Ala Pro Arg Ser Ser Ala Lys Leu Gly Ala Leu Leu Ala Ile1               5                  10                  15Leu Leu Ile Val Ala Ala Ala Gln Ala Gln Asp Cys Ser Asn Ala Met
        20                  25                  30Asp Lys Leu Ala Pro Cys Thr Ser Ala Val Gly Leu Ser Ser Asn Gly
    35                  40                  45Val Lys Pro Ser Ser Glu Cys Cys Asp Ala Leu Lys Gly Thr Ser Thr
50                  55                  60Gly Cys Val Cys Lys Ser Val Arg Ala Val Ile Ser Leu Pro Ala Lys65                  70                  75                  80Cys Asn Leu Pro Ala Ile Thr Cys Ser Gly Ser Arg
            85                  90
<210>74
<211>92
<212>PRT
<213>辐射松
<400>74Met Ala Ala Pro Arg Ser Ser Ala Lys Ser Ala Ala Leu Phe Ala Ile1               5                  10                  15Leu Leu Ile Val Ala Ala Val Gln Ala Glu Asp Cys Ser Asn Ala Met
        20                  25                  30Asp Lys Leu Ala Pro Cys Thr Ser Ala Val Gly Leu Ser Ser Asn Gly
    35                  40                  45Val Lys Pro Ser Ser Glu Cys Cys Asp Ala Leu Lys Gly Thr Ser Thr
50                  55                  60Gly Cys Val Cys Lys Ser Val Arg Ala Val Ile Ser Leu Pro Ala Lys65                  70                  75                  80Cys Asn Leu Pro Ala Leu Thr Cys Ser Gly Ser Arg
            85                  90
<210>75
<211>92
<212>PRT
<213>辐射松
<400>75Met Ala Ala Pro Arg Ser Ser Ala Lys Leu Gly Ala Leu Leu Ala Ile1               5                  10                  15Leu Leu Ile Val Ala Ala Ala Gln Ala Gln Asp Cys Ser Asn Ala Met
        20                  25                  30Asp Lys Leu Ala Pro Cys Thr Ser Ala Val Gly Leu Ser Ser Asn Gly
    35                  40                  45Val Lys Pro Ser Ser Glu Cys Cys Asp Ala Leu Lys Gly Thr Ser Thr
50                  55                  60Gly Cys Val Cys Lys Ser Val Arg Ala Val Ile Ser Leu Pro Ala Lys65                  70                  75                  80Cys Asn Leu Pro Ala Ile Thr Cys Ser Gly Ser Arg
            85                  90
<210>76
<211>125
<212>PRT
<213>Eucalyptus grandis
<400>76Met Ala Asp Arg Met Leu Thr Arg Ser His Ser Leu Arg Glu Arg Leu1               5                  10                  15Asp Glu Thr Leu Ser Ala His Arg Asn Asp Ile Val Ala Phe Leu Ser
        20                  25                  30Arg Val Glu Ala Lys Gly Lys Gly Ile Leu Gln Arg His Gln Ile Phe
    35                  40                  45Ala Glu Phe Glu Ala Ile Ser Glu Glu Ser Arg Ala Lys Leu Leu Asp
50                  55                  60Gly Ala Phe Gly Glu Val Leu Lys Ser Thr Gln Glu Ala Ile Val Ser65                  70                  75                  80Pro Pro Trp Val Ala Leu Ala Val Arg Pro Arg Pro Gly Val Trp Glu
            85                  90                  95His Ile Arg Val Asn Val His Ala Leu Val Leu Glu Gln Leu Glu Val
        100                 105                 110Ala Glu Tyr Leu His Phe Lys Glu Glu Leu Ala Asp Gly
    115                 120                 125
<210>77
<211>805
<212>PRT
<213>Eucalyptus grandis
<400>77Met Ala Asp Arg Met Leu Thr Arg Ser His Ser Leu Arg Glu Arg Leu1               5                  10                  15Asp Glu Thr Leu Ser Ala His Arg Asn Asp Ile Val Ala Phe Leu Ser
        20                  25                  30Arg Val Glu Ala Lys Gly Lys Gly Ile Leu Gln Arg His Gln Ile Phe
    35                  40                  45Ala Glu Phe Glu Ala Ile Ser Glu Glu Ser Arg Ala Lys Leu Leu Asp
50                  55                  60Gly Ala Phe Gly Glu Val Leu Lys Ser Thr Gln Glu Ala Ile Val Ser65                  70                  75                  80Pro Pro Trp Val Ala Leu Ala Val Arg Pro Arg Pro Gly Val Trp Glu
            85                  90                  95His Ile Arg Val Asn Val His Ala Leu Val Leu Glu Gln Leu Glu Val
        100                 105                 110Ala Glu Tyr Leu His Phe Lys Glu Glu Leu Ala Asp Gly Ser Leu Asn
    115                 120                 125Gly Asn Phe Val Leu Glu Leu Asp Phe Glu Pro Phe Thr Ala Ser Phe
130                 135                 140Pro Arg Pro Thr Leu Ser Lys Ser Ile Gly Asn Gly Val Glu Phe Leu145                 150                 155                 160Asn Arg His Leu Ser Ala Lys Leu Phe His Asp Lys Glu Ser Leu His
            165                 170                 175Pro Leu Leu Glu Phe Leu Gln Val His Cys Tyr Lys Gly Lys Asn Met
        180                 185                 190Met Val Asn Ala Arg Ile Gln Asn Val Phe Ser Leu Gln His Val Leu
    195                 200                 205Arg Lys Ala Glu Glu Tyr Leu Thr Ser Leu Lys Pro Glu Thr Pro Tyr
210                 215                 220Ser Gln Phe Glu His Lys Phe Gln Glu Ile Gly Leu Glu Arg Gly Trp225                 230                 235                 240Gly Asp Thr Ala Glu Arg Val Leu Glu Met Ile Gln Leu Leu Leu Asp
            245                 250                 255Leu Leu Glu Ala Pro Asp Pro Cys Thr Leu Glu Lys Phe Leu Asp Arg
        260                 265                 270Val Pro Met Val Phe Asn Val Val Ile Met Ser Pro His Gly Tyr Phe
    275                 280                 285Ala Gln Asp Asp Val Leu Gly Tyr Pro Asp Thr Gly Gly Gln Val Val
290                 295                 300Tyr Ile Leu Asp Gln Val Arg Ala Leu Glu Glu Glu Met Leu His Arg305                 310                 315                 320Ile Lys Gln Gln Gly Leu Asp Ile Thr Pro Arg Ile Leu Ile Ile Thr
            325                 330                 335Arg Leu Leu Pro Asp Ala Val Gly Thr Thr Cys Gly Gln Arg Leu Glu
        340                 345                 350Lys Val Phe Gly Thr Glu Tyr Ser His Ile Leu Arg Val Pro Phe Arg
    355                 360                 365Asn Glu Lys Gly Val Val Arg Lys Trp Ile Ser Arg Phe Glu Val Trp
370                 375                 380Pro Tyr Leu Glu Arg Tyr Thr Glu Asp Val Ala Ser Glu Leu Ala Gly385                 390                 395                 400Glu Leu Gln Gly Lys Pro Asp Leu Ile Ile Gly Asn Tyr Ser Asp Gly
            405                 410                 415Asn Ile Val Ala Ser Leu Leu Ala His Lys Leu Gly Val Thr Gln Cys
        420                 425                 430Thr lle Ala His Ala Leu Glu Lys Thr Lys Tyr Pro Glu Ser Asp Ile
    435                 440                 445Tyr Trp Lys Lys Phe Glu Glu Lys Tyr His Phe Ser Cys Gln Phe Thr
450                 455                 460Ala Asp Leu Ile Ala Met Asn His Thr Asp Phe Ile Ile Thr Ser Thr465                 470                 475                 480Phe Gln Glu Ile Ala Gly Ser Lys Asp Thr Val Gly Gln Tyr Glu Ser
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        500                 505                 510Asp Val Phe Asp Pro Lys Phe Asn Ile Val Ser Pro Gly Ala Asp Met
    515                 520                 525Ser Ile Tyr Phe Ala Tyr Thr Glu Gln Glu Arg Arg Leu Lys Ser Phe
530                 535                 540His Pro Glu Ile Glu Glu Leu Leu Phe Ser Asp Val Glu Asn Lys Glu545                 550                 555                 560His Leu Cys Val Leu Lys Asp Lys Lys Lys Pro Ile Ile Phe Thr Met
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130                 135
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<212>PRT
<213>Eucalyptus grandis
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130                 135                 140Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Gly Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu145                 150                 155                 160Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu Val Glu Ser Ser Asp Thr Ile Asp
            165                 170                 175Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln
        180                 185                 190Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu
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<213>Eucalyptus grandis
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<213>Eucalyptus grandis
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    35                  40                  45Met Ala Phe Gly Gly Thr Glu Gln Pro Ala Ala Tyr Gly Glu Leu Val
50                  55                  60Ser Ile Gly Gly Leu Asn Pro Asp Val Asn Lys Lys Leu Ser Ala Ala65                  70                  75                  80Ile Ala Ser Ile Leu Glu Thr Lys Leu Ser Ile Pro Lys Ser Arg Phe
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<213>辐射松
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<400>112actatagggc acgcgtggtc gacggccctg gctggtagcg acagagctgg ttcagtgacc      60gttcgtgatt agccgcagta aaacaaaacc ctaaccgtaa ccctttcgcg cagattccat     120ccttccccgt cctaccaaaa cccaaacttc ttgcccgaac tcaccttcta tgtattaatt     180cttattatta tttaataata ataaatagtt aaacataaat ttataaatta attaattttt     240atgattttta ttttagttta aaaatgtgac attgttatag attaatgctt atgaacgttt     300attggccata attaccctaa ttaattataa ttaaaatata tagttataat taaaaaattg     360tatattttat aaattgaatt aagaatttct gatgatattt catcattcaa ttccatctta     420tcaaagttag agggaatagt taaccatgta ctagatctat tcatagctaa catttgccaa     480gttcgtacta ggagacttgg atttttttta aaacataatt ttggcagtaa aaagtgaatt     540ctattgtttt gaaaacaaaa caaaatacag gaagcgtgat tgtggggttg ttgttgaact     600tgcccgggca aaagaagaat gattagcggt agaggagtta gtagttacgt tcaactaaat     660gcgtgactaa attatttatc ctccgccatg gaagcaggtg attcacacac aacttgctgc     720acacattgct ctcaaacctt tcctataaat atccgtagca ggggctgcga tgatacacaa     780cgcatttaat caaactactt tgattacttt ctgtgggttc tactttcttt gaatagtcag     840ttctgctgtt tttagaagat ttataagaat ggccaaaatt caggtatcaa acgggaacgt     900cgtggtggtg gctgcgatgt tatttatggt ggtggtggcc atgcaaaacc atcacgtcgc     960cgcccaaagt gctgactgcg ccgccaccgc ggagtccctg agcccctgcg cctcggcggt    1020gggaaacaac ccacaggatc ccactcccga atgctgtgct gttcttcaga ccgctaatgt    1080cgactgcatc tgcgccctcg tccaatcaac catgcaattg ccttccgaat gcggtcttga    1140gactcctcag tgcccaagcg actagggtct caagaccgtg actgagtgct ggtttcagag    1200acagtagaca ttctgcctaa taaatgattg tatgagagct tttatatatg gaattgctca    1260tatgctttcc tagatatgaa attattaaat tccatatgct t                        1301

Claims (22)

1.一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含选自以下的一种序列：
(a)  SEQ ID NO：2-14、20、22-33、35-43、45-49、51、52、56-62
     和88-112中所述序列；
(b)  SEQ ID NO：2-14、20、22-33、35-43、45-49、51、52、56-62
     和88-112中所述序列的互补序列；
(c)  SEQ ID NO：2-14、20、22-33、35-43、45-49、51、52、56-62
     和88-112中所述序列的反向互补序列；
(d)  SEQ ID NO：2-14、20、22-33、35-43、45-49、51、52、56-62
     和88-112中所述序列的反向序列；
(e)  用计算机算法BLASTN测定与以下所提供的一种序列有
     至少40％相同核苷酸的序列：SEQ ID NO：2-14、20、22-
     23、25-33、35-42、45-49、57-59、62、88-99和101-112；
(f)  用计算机算法BLASTN测定与以下所提供的一种序列有
     至少60％相同核苷酸的序列：SEQ ID NO：2-14、20、22-
     23、25-33、35-42、45-49、56-59、62、88-99和101-112；
(g)  用计算机算法BLASTN测定与以下所提供的一种序列有
     至少75％相同核苷酸的序列：SEQ ID NO：2-14、20、22-
     23、25-33、35-49、52、56-61、62、88-99和101-112；和
(h)  用计算机算法BLASTN测定与以下所提供的一种序列有
     至少90％相同核苷酸的序列：SEQ ID NO：2-14、20、22-
     33、35-49、51、52、56-61、62和88-112。
2.一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含选自以下的一种序列：
(a)  SEQ ID NO：1和34中所述序列；
(b)  SEQ ID NO：1和34中所述序列的互补序列；(c)  SEQ ID NO：1和34中所述序列的反向互补序列；(d)  SEQ ID NO：1和34中所述序列的反向序列；(e)  用计算机算法BLASTN测定与SEQ ID NO：1和34中所
 述序列有至少40％相同核苷酸的序列；(f)  用计算机算法BLASTN测定与SEQ ID NO：1和34中所
 述序列有至少60％相同核苷酸的序列；(g)  用计算机算法BLASTN测定与SEQ ID NO：1和34中所
 述序列有至少75％相同核苷酸的序列；和(h)  用计算机算法BLASTN测定与SEQ ID NO：1和34中所
述序列有至少90％相同核苷酸的序列。
3.一种分离的多肽，所述多肽由选自以下的一种多核苷酸编码：(a) SEQ ID NO：1、22、25、26、28、34、35、36、40、45、
46、51-53、56、57、60、61和86中所述序列；(b) SEQ ID NO：1、22、25、26、28、34、35、36、40、45、
46、51-53、56、57、60、61和86的序列的互补序列；(c) SEQ ID NO：1、22、25、26、28、34、35、36、40、45、
46、51-53、56、57、60、61和86中一种序列的反向互
补序列；(d) SEQ ID NO：1、22、25、26、28、34、35、36、40、45、
46、51-53、56、57、60、61和86中一种序列的反向序
列；(e) 与以下所提供的一种序列有至少40％相同核苷酸的序
列：SEQ ID NO：1、22、25、26、28、34、35、36、40、
45、46、51-53、56、57、60、61和86；(f) 与以下所提供的一种序列有至少60％相同核苷酸的序
列：SEQ ID NO：1、22、25、26、28、34、35、36、40、
45、46、51-53、56、57、60、61和86；
(g)  与以下所提供的一种序列有至少75％相同核苷酸的序
     列：SEQ ID NO：1、22、25、26、28、34、35、36、40、
     45、46、51-53、56、57、60、61和86；和
(h)  与以下所提供的一种序列有至少90％相同核苷酸的序
     列：SEQ ID NO：1、22、25、26、28、34、35、36、40、
     45、46、51-53、56、57、60、61和86。
4.权利要求3的分离多肽，其中所述多肽包含一种选自SEQIDNO：63-80和87的序列。
5.一种DNA构建体，所述DNA构建体包含一种权利要求1和权利要求2中任一项的多核苷酸。
6.一种DNA构建体，所述DNA构建体以5’-3’方向包含：
(a)  一个启动子序列，
(b)  一个目的DNA序列；和
(c)  一个基因终止序列，
其中所述启动子序列包含一种权利要求1的分离多核苷酸。
7.权利要求6的DNA构建体，其中所述目的DNA序列包含一个编码目的多肽的可读框。
8.权利要求6的DNA构建体，其中所述目的DNA序列包含一个编码目的多肽的基因的非编码区。
9.一种转基因细胞，所述转基因细胞包含权利要求5-8中任一项的DNA构建体。
10.一种有机体，所述有机体包含权利要求9的转基因细胞。
11.一种植物，所述植物包含权利要求9的转基因细胞或其一部分或其繁殖体或后代。
12.一种在靶有机体中修饰基因表达的方法，所述方法包括将权利要求5-8中任一项的DNA构建体稳定掺入到所述有机体的基因组中。
13.权利要求12的方法，其中所述有机体是一种植物。
14.一种产生具有经修饰的基因表达的植物的方法，所述方法包括：
(a)  用DNA构建体转化植物细胞，以提供转基因细胞，其中
     所述DNA构建体包含：(i)一个启动子序列，所述启动子
     序列包含SEQ ID NO：1-14、20、22-62、81-86和88-112
     中的一种序列；(ii)一个目的DNA序列；和(c)一个基因
     终止序列；和
(b)  在有助于再生和成熟植株生长的条件下培育所述转基因
     细胞。
15.  一种修饰靶有机体表型的方法，所述方法包括将DNA构建体稳定掺入到所述靶有机体的基因组中，其中所述DNA构建体包含：
(a)一个启动子序列，所述启动子序列包含SEQ ID NO：1-14、
   20、22-62、81-86和88-112中的一种序列；
(b)一个目的DNA序列；和
(c)一个基因终止序列。
16.权利要求15的方法，其中所述靶有机体是一种植物。
17.一种负责所需功能或表型的基因的鉴定方法，所述方法包括：
(a)  用包含有效连接于待测试基因的启动子序列的DNA构建
     体转化植物细胞，所述启动子序列包含SEQ ID NO：1-
     14、20、22-62、81-86和88-112中的一种序列；
(b)  在有助于再生和成熟植株生长的条件下培育所述植物细
     胞，以提供转基因植物；和
(c)  将所述转基因植物的表型与非转化植物的表型相比较。
18.  一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含选自以下的一种序列：
(a)  SEQ ID NO：21中所述序列；
(b)  SEQ ID NO：21中所述序列的互补序列；
(c)  SEQ ID NO：21中所述序列的反向互补序列；
(d)  SEQ ID NO：21中所述序列的反向序列；
(e)  用计算机算法BLASTN测定与SEQ ID NO：21中所述序
     列有至少40％相同核苷酸的序列；
(f)  用计算机算法BLASTN测定与SEQ ID NO：21中所述序
     列有至少60％相同核苷酸的序列；
(g)  用计算机算法BLASTN测定与SEQ ID NO：21中所述序
     列有至少75％相同核苷酸的序列；和
(h)  用计算机算法BLASTN测定与SEQ ID NO：21中所述序
     列有至少90％相同核苷酸的序列。
19.一种DNA构建体，所述DNA构建体包含一种权利要求18的多核苷酸。
20.一种转基因细胞，所述转基因细胞包含权利要求19的DNA构建体。
21.一种在靶有机体中修饰基因表达的方法，所述方法包括将权利要求19的DNA构建体稳定掺入到所述有机体的基因组中。
22.一种修饰包含SEQ ID NO：21序列的多核苷酸表达的方法，所述方法包括从所述多核苷酸中除去SEQ ID NO：21的序列。
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WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication