JP2002538820A - ミクロクローンのクローニングされていないｃＤＮＡライブラリーの作製および使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ヒトミクロクローン由来のｃＤＮＡライブラリーの時間的に並べられたパネルの、調製、特徴付け、および利用のための方法が記載される。インビトロで形態発生の分化を受ける各ミクロクローンは、個別の遺伝子発現において異なる。ミクロクローンの発生段階が決定され、そしてミクロクローンの遺伝子発現パターンが、時間的に並べられ、そして発現プロフィールおよび時間的スペクトルに配列される。異なる神経ミクロクローンより産生したｃＤＮＡの直接的比較は、新規のＲＮＡ転写物の同定を可能にする。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （１．０ 発明の背景） 米国政府は、ＮＩＨ／ＮＩＮＤＳ第ＮＳ２９２２５号を通じて、本件出願にお
いて権利を有する。

【０００２】 （１．１ 発明の分野） 本発明は、分子生物学の分野に関し、そして具体的には、時間的に並べられた
幹細胞／前駆細胞由来の遺伝子発現産物のパネルを作製するためのミクロクロー
ンｃＤＮＡ組成物および方法に関する。

【０００３】 （１．２ 関連する技術の記載） 成熟した哺乳動物の脳における神経発生は、数年の間、議論の対象の問題とな
っている。成体ラットの嗅覚および海馬系における持続的な神経発生の存在を支
持する、Ａｌｌｅｎ（１９１２）および他者（Ａｌｔｍａｎ、１９６９ａ；１９
６９ｂ）の研究にもかかわらず、これらは、高度に特異的なケースであり、決し
て成体中枢神経系における神経形成（ｎｅｕｒｏｐｏｉｅｓｉｓ）という概念を
支持しないと考えられた。成体ラットの脳の推定される幹細胞の集団のインビト
ロにおける増殖（ＲｅｙｎｏｌｄｓおよびＷｅｉｓｓ、１９９２；Ｒｉｃｈａｒ
ｄｓら、１９９２）は、神経形成（ｎｅｕｒｏｐｏｉｅｓｉｓ）を示唆する；そ
して後者の研究は、上衣下方帯（ｓｕｂｅｐｅｎｄｙｍａｌ ｚｏｎｅ）、上衣
、および海馬（近年「脳髄（ｂｒａｉｎ ｍａｒｒｏｗ）」という一語に融合さ
れた領域（Ｓｔｅｉｎｄｌｅｒら、１９９６））としての幹細胞／前駆細胞の供
給源を確立した（Ｊｏｈａｎｓｓｏｎら、１９９９；Ｅｒｉｋｓｓｏｎら、１９
９８；Ｋｕｋｅｋｏｖら、１９９９）。

【０００４】 細胞外マトリクス（ＥＣＭ）および他の発生調節される分子は、成体マウスお
よびヒト前脳の持続性の神経原性領域（上衣下方帯（ＳＥＺ）（Ｓｃｈｅｆｆｌ
ｅｒら、１９９９））を規定する。室周ＳＥＺ、ならびに上衣層は、「脳髄（ｂ
ｒａｉｎ ｍａｒｒｏｗ）」と称される。なぜなら、造血性の骨髄（支持細胞お
よび発生学的に調節される分子によって囲まれる幹細胞および前駆細胞の中心核
は、多様な幹細胞／前駆細胞を生じ得る）との類似性のためである（Ｓｔｅｉｎ
ｄｌｅｒら、１９９６）。「幹／前駆」は、所定の組織の全ての細胞を生じ得る
増殖性の細胞の完全なスペクトルを記載するために使用される（Ｓｃｈｅｆｆｌ
ｅｒら、１９９９）。発生中ならびに成熟したげっ歯類の前脳のにおける推定さ
れる幹細胞の初期の研究において、ニューロン前駆体および神経膠前駆体が、増
殖因子（上皮細胞増殖因子、線維芽細胞増殖因子（すなわち、ＥＧＦおよびＦＧ
Ｆ）を含む（ＲｅｙｎｏｌｄｓおよびＷｅｉｓｓ、１９９６；Ｇｒｉｔｔｉら、
１９９６））の存在下において単離された。

【０００５】 神経堤、胎児神経系および胚性神経系由来の多能性前駆体の単離および特徴付
けのための培養方法が充分確立されている（Ｃａｌｏｆら、１９９８）、さらに
成体マウス前脳由来のインビトロにおけるニューロスフェアの産生およびデノボ
産生されたニューロン（ＲｅｙｎｏｌｄｓおよびＷｅｉｓｓ、１９９２；Ｒｉｃ
ｈａｒｄｓら、１９９２）は、成熟したＣＮＳ内における多能性幹細胞／多能性
前駆細胞の最初の確信させる記載を示した。成体脳における有糸分裂活性の最初
に実証された観察（Ａｌｌｅｎ、１９１２）から８０年経っており、そして現在
、幹細胞の全ての特徴を有するような成体ＣＮＳにおける増殖性の祖先について
の強力な証拠が存在する。

【０００６】 脳ニューロスフェア核と、造血性骨髄との類似性が、成体脳由来の幹細胞／前
駆細胞が多能性であるという驚くべき知見によって確認されている（全身性の移
植後に、骨髄に進んだ後に、血液細胞を生じる（Ｂｊｏｒｎｓｏｎら、１９９９
））。

【０００７】 幹細胞／前駆細胞は、クローン化されたコロニー様の単位として、または「ニ
ューロスフェア」としてのみ研究され得るので（Ｓｃｈｅｆｆｌｅｒら、１９９
９）、発現された分子ならびにその増殖および分化に影響する因子を同定するた
めに、これらの細胞を単離する方法が必要とされている。ニューロスフェアの研
究は、ニューロスフェアの集団の遺伝子分析に焦点をあてている。これは明らか
に、個々のニューロスフェアを破壊することの困難さのためである。ニューロス
フェアの機械的または化学的破壊から有意な量の物質を得ることにおける困難さ
もまた存在し、そして個々のクローン内の遺伝子物質より得られる情報の量は限
定されている。

【０００８】 ｃＤＮＡライブラリーおよび差引き方法を使用して、酵母のような種における
遺伝子発現を時間的に並べているが、神経遺伝子発現については、なされていな
い。以前の研究では、「．．．遺伝子発現のパターンにおける類似性に従って遺
伝子を配列する標準的な統計アルゴリズム．．．」を使用してＤＮＡマイクロア
レイハイブリダイゼーションからの遺伝子発現のクラスター分析を記載している
。この方法は、公知の類似の機能に従って遺伝子をクラスターにグループ化する
ために、主に使用される（例えば、出芽酵母であるＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける研究の場合、ならびにヒトにおける場合（Ｅｉ
ｓｅｎら、１９９８））。

【０００９】 逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）が、これらの独特の構造に関連
した、細胞表現型関連分子および増殖因子関連分子の確認のために、ニューロス
フェアの集団に適用されている（ＡｒｓｅｎｉｊｅｖｉｃおよびＷｅｉｓｓ、１
９９８）。しかし、近年強調されるように、「克服される必要がある、培養中の
これらの細胞の増殖に関連する基本的な技術的問題もまた存在する。具体的には
、ヒト胚性幹細胞株および胚性生殖細胞株（ＥＳ／ＥＧ）の細胞のクラスターを
、生存可能な単一の細胞に分離することにおける報告された困難性が問題である
。特にジーンターゲッティング実験について．．．」（ＫｅｌｌｅｒおよびＳｎ
ｏｄｇｒａｓｓ、１９９９）。従って、これらの幹細胞によって生成された細胞
構造（ニューロスフェアに類似する）は、遺伝子発見の研究において類似の障害
を引き起こす。

【００１０】 現在、特異的細胞プロセスを受けている細胞からｃＤＮＡライブラリーを生成
する方法は、そのプロセスの間の特異的な段階での器官または組織から細胞を単
離することに依存する。神経発生の研究のために、ｃＤＮＡライブラリーは、胚
性の脳の発生の種々の段階での胚性脳の神経細胞から単離されなけばならない。
例えば、１１日齢の胚マウス脳から単離されたｃＤＮＡライブラリーを、１７日
齢胚の脳から得られたｃＤＮＡライブラリーと比較し得る。同様に、腫瘍形成を
研究するために、ｃＤＮＡライブラリーを、腫瘍発生の種々の段階において腫瘍
細胞から単離しなければならない。

【００１１】 しかし、これらの方法が遺伝子発現パターンの片鱗を提供する一方で、これら
は非常に限定されている。例えば、組織からｃＤＮＡを単離するために選択され
る特定の時点は、組織それ自体の発生によって限定される。胚性の脳が７日目ま
で可視的でないならば、胚性の脳の発生の最も初期の可能な片鱗は、組織からの
細胞が可視的でありそして単離され得る７日目において取得され得る。このこと
は、遺伝子発現パターンが分析され得ない時間のギャップを残す。たとえ組織が
可視的であっても、無数の発生段階における特定の組織からのｃＤＮＡライブラ
リーの単離の仕事は、怖じ気付かせるものであり、そして大量の種々の発生段階
の特異的組織を必要とする。

【００１２】 現在のｃＤＮＡライブラリー生成戦略は、まさにＲＮＡが抽出される時点での
、所定の細胞集団内に存在する遺伝子転写物の調査に依存する。これらの方法は
、定常的な遺伝子発現の研究においては有用であるが、特定の細胞プロセス間に
生じる動的な遺伝子発現の時間的なプロフィールを提供しない。

【００１３】 Ｅｉｓｅｎら（１９９８）は、「．．．遺伝子発現のパターンにおける類似性
に従って遺伝子を配列する標準的な統計アルゴリズム．．．」を使用するＤＮＡ
マイクロアレイハイブリダイゼーションからの、遺伝子発現についてのクラスタ
ー分析を記載する。この方法は、出芽酵母であるＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、ならびにヒトにおける公知の類似の機能に従ってクラス
ター内の遺伝子をグループ化するために、主に使用される。このアプローチを、
新規の遺伝子の発現の分析のために使用し得る；しかし、研究中の遺伝子の機能
の知識を必要とする。

【００１４】 現在の方法の別の限定的局面は、単離された系を使用しないことである。この
ことは、どの遺伝子（複数および単数）の発現パターンが、どの組織型の一部で
あるのかを決定するにおいて、問題を生じる。例えば、胚性脳は、ニューロンお
よび非ニューロン組織の両方を含有する。従って、胚性脳から単離されたｃＤＮ
Ａライブラリーにおける特定の遺伝子が神経発生に関連するのか、または非神経
組織の発生に関連するのか決定することは、不可能である。

【００１５】 単一細胞ＰＣＲ^TM法は、同定された単一の脳細胞における遺伝子発現の研究に
おいて有用であることが証明されている（Ｖａｎ Ｇｅｌｄｅｒら、１９９０；
Ｅｂｅｒｗｉｎｅら、１９９２）。この方法は、限定されたｃＤＮＡの量に由来
する、ＲＮＡの増幅された不均一集団の産生に依存する。規定された単一の細胞
由来のＲＮＡが、プライマー、ヌクレオチドおよび酵素の単一細胞中へのマイク
ロインジェクション後に増幅される。アンチセンスＲＮＡが増幅され、そして増
幅の第２ラウンドにおいて、より多くの最初の物質を生成する。増幅されたＲＮ
Ａを使用して、ｃＤＮＡライブラリーおよび／またはプローブを生成する。この
方法は、発現ライブラリーを生成するために、単一細胞の分子研究／遺伝的研究
のために使用されている；しかし、ＲＮＡ集団の増幅は、ＲＮＡ分解によって生
じるＲＮＡフラグメントの増幅の顕著な量という危険を生じる。従って、不完全
な遺伝子プロフィールは、不完全なものであり得、従って、研究する細胞発生の
段階に存在する遺伝子を代表しないかもしれない。

【００１６】 １．３ 先行技術における欠損 現在利用可能な方法はいずれも、幹細胞／前駆細胞から始まりかつ分化細胞を
通じて進行する発達の無限の段階における遺伝子発現パターンを決定するために
使用し得る単離された系を提供しない。

【００１７】 成体哺乳動物（ヒトを含む）の脳の不変の神経発生の最近の発見に関して、神
経幹細胞増殖、分化に関する新たな遺伝子および因子、ならびにこのような細胞
増殖カスケードに関する遺伝子の発現パターンを同定する必要性がある。同様に
、正常な細胞プロセスにおける（特に、神経細胞に特異的なヒト遺伝子に関する
ような傷害および障害において）劇的な遺伝子発現パターンの決定に使用するた
めに利用可能なｃＤＮＡプールのパネルは存在しない。

【００１８】 従って、種々の細胞プロセスにおける劇的な遺伝子発現パターンを決定し、そ
して細胞成熟の発達段階に関する新しい遺伝子を同定するために使用され得るｃ
ＤＮＡプールのミクロパネルアレイの開発の必要性がある。

【００１９】 ２．０ 発明の要旨 本発明は、単一の幹細胞／前駆細胞由来の単離された系に示されるニューロス
フェアクローンの新規な一時的アレイのパネルの提供による、前述のいくつかの
欠損に関する。幹細胞／前駆細胞は子孫細胞を惹起して、ｃＤＮＡが単離され得
るものからミクロクローンを提供する。これらのミクロクローンからのｃＤＮＡ
単離は、ミクロクローンの発達のいずれの段階の間でも生じ得る。ミクロクロー
ンの発達の段階およびミクロクローンの型が決定され得るので、異なるミクロク
ローンからのｃＤＮＡライブラリーが、比較され得る。異なる発達段階における
ミクロクローンからの遺伝子発現パターンは、比較され得、そして、一時的に提
供され得る。

【００２０】 １つの局面における発明は、増殖する幹細胞および初期前駆細胞のミクロクロ
ーンからのｃＤＮＡライブラリーを作製かつ使用する方法に関する。ｃＤＮＡが
ミクロクローン発達の任意の段階におけるこれらのミクロクローンから単離され
得るので、作製されたライブラリーは、遺伝子発現パターンを一時的に提示させ
得る。さらに、表現型的に異なるか、もしくは遺伝子型的に異なるミクロクロー
ン、または一組のミクロクローンから単離されたｃＤＮＡライブラリーから発現
される遺伝子の比較は、新しい遺伝子を同定するために使用され得、そして異な
るミクロクローン集団の間で遺伝子発現パターンを比較するために使用され得る
。さらに、ミクロクローンが腫瘍細胞由来の場合、開示される方法は、腫瘍特異
的遺伝子および腫瘍特異的遺伝子発現パターンを発見かつ同定するために使用さ
れ得る。この情報は、ミクロスフィアが由来する腫瘍を有する患者の診断、予知
、および処置の戦略を援助する。

【００２１】 神経組織および非神経組織由来のミクロクローンからのｃＤＮＡを比較して、
神経組織と非神経組織との間の差示的な遺伝子発現を示し得る。傷害した脳細胞
由来のミクロクローンからのｃＤＮＡライブラリーは、脳の発達、傷害および再
生に関する遺伝子を同定する傷害していない脳細胞から単離されたｃＤＮＡライ
ブラリーと比較され得る。

【００２２】 さらに、遺伝子型（例えば、変異、トランスジェニック、野生型）において変
化する幹細胞／前駆細胞からのｃＤＮＡライブラリーは、異なる細胞型の間での
遺伝子発現の相関に有用である。薬剤の存在および非存在における遺伝子発現の
パターンの変化を分析することによって、神経発達における薬剤効果が決定され
得る。

【００２３】 本発明のなおさらに別の局面は、神経遺伝の間の遺伝子発現の一時的なパター
ン化のためのアルゴリズム方を含む。異なる条件下でのニューロスフィア細胞の
培養の間に、ニューロスフィアは、インビボにおいて発達する脳で観察されるミ
ラー細胞（ｍｉｒｒｏｒ ｃｅｌｌ）の増殖および分化の種々の段階を通じて分
化する。神経幹細胞／前駆細胞の異なるクローンからのｃＤＮＡライブラリーの
パネルの作製は、神経および神経膠の増殖および分化の間の遺伝子発現の一時的
な提示を可能にする。

【００２４】 本発明の別の重要な局面は、神経遺伝に関するインビボモデルの提供である。
インビトロでの実例は、遺伝子分析および発見についてのこれらの「ミクロ系」
の作製および簡単なサンプリングを支持する。このようなモデルは、インビトロ
での分化するニューロスフェアの使用によって達成される神経遺伝の間の遺伝子
発見のためのモデルを作製するために、巨大組織収集物および胚性脳組織の文字
通り瞬間瞬間のサンプリングからのｃＤＮＡライブラリーの作製と、従来から平
行していた。本発明は、初期細胞発達および幹細胞／前駆細胞からの成熟の連続
するスペクトルを示すミクロクローンのパネルを提供することによって、このよ
うな退屈かつ時間を浪費する組織サンプリングの必要性を克服する。

【００２５】 本発明の実施において、細胞のミクロクローンは、迅速かつ確実なｃＤＮＡ合
成および増幅を提供する薬剤に曝露される。ミクロクローンは、特定の既定され
た培養条件下で作製される。これらのミクロクローンは、ミクロクローンにおい
て要約されるような発達する遺伝子発現を示す神経遺伝の異なる段階を示す多能
な細胞を含む。ミクロクローンの多能な細胞は発達し、そしてインビトロにおい
て時間をかけて神経および神経膠の異なる型に分化する。従って、この多能な細
胞は、インビボにおける神経遺伝のプロセスを表す遺伝子発現における一時的な
変異についてのモデルとして使用され得る。

【００２６】 この方法は、中枢神経系からの幹細胞、前駆細胞（ｐｒｅｃｕｓｏｒ ｃｅｌ
ｌ ａｎｄ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）の単離および特徴付けを容易に
する培養技術（懸濁培養、半個体培地ならびに抗接着基質ならびに細胞−細胞間
相互作用および細胞−基質間相互作用を干渉する因子を用いる）を利用する（Ｋ
ｕｋｅｋｏｖら、１９９９）。単一および別の幹細胞／前駆細胞由来の異なる細
胞クローンを産生するためのこのような培養手段を使用して、これらのクローン
から遺伝物質が容易に単離される。遺伝子発現のパターンは、比較され得、そし
て重要なことに、一時的に配置され得る。この方法は、新しい遺伝子の発見のた
めの新規な系を提供する。新しい遺伝子の発見は、ヒトおよび他の哺乳動物のゲ
ノム分析、ならびに新しい因子および試薬の発達および作製に関連する。新しい
因子および試薬は、幹細胞の生物学ならびに神経学的障害、外傷性の傷害、神経
変性疾患および脳腫瘍についての最終的な細胞置換治療のための神経生涯（ｎｅ
ｕｒｏｐｏｉｅｓｉｓ）を増大する。

【００２７】 本発明の別の局面は、ミクロアレイの調製である。ｃＤＮＡフラグメントから
のミクロアレイは、神経細胞および神経膠細胞のような表現系を規定する莫大な
遺伝子、ならびにホメオボックス、基本的へリックス−ループ−へリックス、転
写因子、アポトーシス遺伝子、および非アポトーシス遺伝子を含む発生段階の遺
伝子についてのスクリーニングを容易にする。このようなフラグメント分析は、
現在遺伝子／タンパク質発現に関する遺伝子の発見およびスクリーニングに使用
される酵母２ハイブリッドシステムの先例を提示する。

【００２８】 発生段階プロファイルを含むモノクローナル性パネルはさらに、本発明を包含
する。ｃＤＮＡは、単一のニューロスフィアから産生され得る。単一脳資料解離
からのニューロスフィアの多様性は、一時的なプロファイリング手段に従う神経
遺伝子発現の機能的な配置のためのモデル系を提供する。新しい遺伝子は、分化
の異なる状態にある一時的に近接する（ｃｌｏｓｅ（ｎｅｉｇｈｂｏｒ））ニュ
ーロスフィアの交雑比較（ｃｒｏｓｓ−ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ）の結果としてこ
れらの方法を使用して発見され得る。多くのクローンおよびライブラリーの大ス
ケール分析の可能性は、９６ウェルマイクロタイター形式にこれらの方法論の適
合によって現在可能である。開示されるｃＤＮＡパネルは、多くの遺伝子発見の
ためのミクロアレイを作製するために使用され得る。この形式は、高スループッ
ト（例えば、ＤＮＡチップ、自動化またはロボット化アッセイ系および読み取り
機の使用）分析に修正可能である。

【００２９】 本発明の特定の局面において、細胞成熟の異なる段階に関する新規遺伝子は、
種々の神経学的障害（例えば、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンティン
グトン病または脳腫瘍）を有する患者から単離された脳から同定され得る。この
方法は、疾患の原因に関連する遺伝子発現の段階およびパターンを同定するため
に使用され得る。

【００３０】 本発明は、種々の改変および代替形態について可能であるが、本発明の特定の
実施形態は、図面の例によって示されており、そして本明細書中に詳細に記載さ
れている。しかし、本明細書中の特定の実施形態の説明は、開示される特定の形
式に本発明を制限しないことが意図されるが、逆に、本発明は、添付の特許請求
の範囲によって定義されるような本発明の精神および範囲内にある全ての改変、
等価物、および代替物を包含すべきことが理解されるはずである。 （４．０ 発明の詳細な説明） 初めて、発生遺伝子の時間的スペクトルによって示される神経発生の詳細なプ
ロフィールを作製することが可能になった。脳の幹／前駆細胞を起源とするクロ
ーンは、神経形態発生として公知の哺乳動物脳の発生の異なる段階を示す。増殖
および分化の異なる段階での複数のニューロスフェア由来のｃＤＮＡライブラリ
ーのパネルは、神経細胞分裂、増殖、成長、分化、および生存／死のみに関与す
る全ての遺伝子の転写物を含む。このクローニングプロセスは、任意の非神経細
胞（例えば、血管組織または結合組織に関連する細胞）の単離、成長および増殖
を回避し、そしてインビボでの神経形態発生遺伝子発現を総括する、インビトロ
での時間的に調節される遺伝子発現を同定する。これらのパネルは、神経発生の
プロセスに関与する、（ａ）連続的な神経の増殖（神経発生）に関与する新規遺
伝子；および（ｂ）遺伝子発現における変動の時間的プロフィール（既知の遺伝
子のスイッチのオンおよびオフを含む）の同定を可能にする。

【００３１】 新規の反復アルゴリズムの適用とともに、個々のニューロスフェアｃＤＮＡラ
イブラリー生成は、同様の遺伝子機能に基づくクラスター化とは異なっている、
時間的に順番付けられる配列に基づいて、単一の脳クローン中での遺伝子発現を
特徴付けし、そして順番付ける。神経遺伝子の探索は、特定の段階の成熟の組織
試料全体からのライブラリーの作製に依存し、そして種々の細胞型（非神経細胞
、血管−結合組織に関連する細胞を含む）を含むので、遺伝子分析のためのマイ
クロシステムとしてニューロスフェアを使用する本明細書に記載されるアプロー
チは、発生的に多様なｃＤＮＡライブラリーの取得のために高度に制御されたイ
ンビトロパラダイムである。これは、系（すなわち、脳）が複雑すぎて遺伝子探
索研究を開始することができないとかつては考えられた遺伝子分析のための全く
新しいアプローチを示す。

【００３２】 （４．１ 神経発生） 最近の研究により、成人ヒト脳中のクローン原性幹／前駆細胞の存在がインビ
トロでクローン（ニューロスフェア）を形成し得ることが確立された（Ｋｕｋｅ
ｋｏｖら、１９９９）。このことは、インビボでの成体ヒト脳中の神経発生を支
持する（Ｅｒｉｋｓｓｏｎら、１９９８）。この研究はまた、成体ヒト脳中の２
つの供給源（ＳＥＺおよび海馬）由来の多能性幹／前駆細胞の起源を追跡し、そ
して両方の構造からのニューロスフェア内の一般的な遺伝子発現を見出した。

【００３３】 神経新生細胞の多能性および自己再生能力は、造血細胞と同様の様式でこれら
の細胞を分類するために必要とされる少数のマーカーにもかかわらず、注目の的
になった。ニューロスフェアのサブセットは、異なるマーカーを発現すると考え
られる。なぜなら、造血供給源および他の胚供給源由来の幹細胞は、異なる糖質
を認識する段階特異的な胚性抗原（ＳＳＥＡ）抗体で免疫標識され得るからであ
る（Ｔｈｏｍｓｏｎら、１９９８；Ｓｈａｍｂｌｏｔｔら、１９９８）。培養さ
れた胚体（ｅｍｂｒｙｏｉｄ ｂｏｄｙ）の免疫表現型分析は、胚細胞系列の発
生と関連した「細胞表面マーカーディスプレイのプログラムされた配列」を示す
（ＬｉｎｇおよびＬｅｂｅｎ、１９９７）。

【００３４】 異なる分子発現の同様のパターンは、インビトロでのニューロスフェア増殖お
よび成熟を伴うことが示されている。これらの構造内の細胞／分子相互作用への
洞察を提供するニューロスフェア構造の他の局面は、神経細胞の発生中の新規遺
伝子の出現に関連する。各ニューロスフェアは、その成熟または進化の特定の段
階において幹／前駆細胞から生じる潜在的に異なるクローン単位を示すことが実
証されている。各ニューロスフェアは、神経発生の異なる存在段階の間に始まり
得た細胞のクローン増殖を示すと考えられる。ニューロスフェアの異種集団（Ｋ
ｕｋｅｋｏｖら、１９９７）は、分化の種種雑多な段階における細胞の混合物か
ら構成され得る。

【００３５】 （４．２ 細胞マーカー） 造血細胞および神経新生細胞のマーカーは、幹／前駆細胞の運命および増殖の
分子の基礎に関連する。ニューロスフェアの比較研究は、例えば、ＥＳ細胞の研
究に使用される多数の同じ免疫マーカー（例えば、ＳＳＥＡ−１，３，４；アル
カリホスファターゼ、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１）についてスクリー
ニングすることによって行われ得る（Ｔｈｏｍｓｏｎら、１９９８；Ｓｈａｍｂ
ｌｏｔｔら、１９９８）。別のアプローチは、他の始原細胞および系（Ｄｒｏｓ
ｏｐｈｉｌａの幹細胞を含む）における運命マーカーであると考えられる限定数
の遺伝子（Ｄｏｅら、１９９８）、および神経運命付けに対して各々の外胚葉（
ｅｃｏｄｅｒｍａｌ）運命付けの間に発現される遺伝子（例えば、ｎｏｇｇｉｎ
、Ｘｎｒ）（ＣｈａｎｇおよびＨｅｍｍａｔｉ−Ｂｒｉｖａｎｌｏｕ、１９９８
）を分析することである。

【００３６】 一方、ニューロスフェア自体は、遺伝子探索研究を開始する出発点を提供する
。なぜなら、最も始原の造血（例えば、ＣＤ３４、幹細胞因子）および神経新生
（特定の細胞骨格タンパク質（例えば、ネスチン）（ＭｃＫａｙ、１９９７）、
テナスシンおよびＰａｘ−６（Ｋｕｋｅｋｏｖら、１９９９）幹前駆細胞のうち
いくつかによって発現されるマーカーおよび遺伝子は、その後の遺伝子および分
子分析についてこれらの細胞を単離するために使用され得る。例えば、細胞表面
マーカーＰＳＡ−ＮＣＡＭを使用して、Ｒａｏおよび共同研究者（Ｍａｙｅｒ−
Ｐｒｏｓｃｈｅｌら、１９９７）は、ニューロン拘束前駆細胞を単離するために
パンニング方法を使用し、そしてこのようなアプローチを使用して、ＣＮＳ細胞
の特定の集団の運命付けおよび成熟に関与する遺伝子をプロフィール付けするこ
とが可能である。

【００３７】 （４．３ インビトロ神経発生モデル） 本発明者らは、新規遺伝子を同定するために単離されたマイクロシステムとし
てインビトロ成熟／分化の異なる段階において個々のニューロスフェアを使用し
た。これらのニューロスフェアは、成体マウス脳の分離物、およびヒト生検試料
から得られ（Ｋｕｋｅｋｏｖら、１９９９）、そして培養における発生のそれら
の異なる段階のために、成熟しているニューロスフェアの連続性は、インビボで
全てのＣＮＳ細胞型を生成する単離された胚マトリクス域のモデルとして観察さ
れ得る。従って、分化しているニューロスフェアのプロフィールからのｃＤＮＡ
ライブラリーのパネルは、インビボでの神経発生中にみられるような細胞増殖お
よび運命決定を担う遺伝子の転写物の全セットを含む。さらに、驚くべきほどに
延長された死後の期間（例えば、５日までも）で、剖検試料からニューロスフェ
アを生成することが可能だからである（Ｌａｙｗｅｌｌら、１９９９）。ｃＤＮ
Ａライブラリーのパネルは、神経学的に稀な異常な幹／前駆細胞（例えば、パー
キンソン病、アルツハイマー病およびハンチントン病のような神経変性疾患、な
らびに腫瘍に由来する疾患）から作製され得る。

【００３８】 （４．４ ミクロクローンのｃＤＮＡプール） 本明細書に記載される本発明の方法の技術は、ｍＲＮＡのミクロクローンから
、相補的なデオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）のプールを作製する手順に基づく。こ
こで「ｃＤＮＡプール」は、クローニングされていないｃＤＮＡライブラリーと
して定義され得る。この系において、ミクロクローンは、培養で作製された幾何
学的構造であり、ここで全ての子孫は、単一の幹／前駆細胞の子孫である（Ｒｅ
ｙｎｏｌｄｓおよびＷｅｉｓｓ、１９９２；ＲｅｙｎｏｌｄｓおよびＷｅｉｓｓ
、１９９６；Ｋｕｕｋｅｋｏｖら、１９９７）。本発明に従って作製されたｃＤ
ＮＡライブラリーは、ミクロクローンの比較を可能にし、ここで各々のミクロク
ローンは、哺乳動物脳の発生の異なる段階を示す。この方法は、非神経組織にも
同様に適用され得る。

【００３９】 （４．５ ミクロクローン） ミクロクローンは、ミクロクローン中の全ての細胞が単一の始祖または前身細
胞の子孫である種々の細胞型から作製され得る、単離された系である。神経幹／
前駆細胞由来のミクロクローンは、ニューロスフェアともいわれるクローン構造
である。異なる条件下でのそれらの増殖の間に、ニューロスフェア細胞は、イン
ビボでの脳の発生中にみられるような細胞の成長および分化を反映する段階を通
じて分化を経る。これらの脳細胞ミクロクローンの解剖学的および分子超微細構
造分析は、それらのインビトロでの培養中に有意な変化を受ける神経の形態型の
多様な集団を明らかにし、そしてこれらの変化は、異なる細胞相互作用および分
子相互作用を反映する（Ｋｕｋｅｋｏｖら、１９９９）。従って、脳細胞ミクロ
クローンは、神経発生の単離された微細モデルとして観察され得る。同様に、ミ
クロクローン中の全ての細胞が単一の前身腫瘍細胞の子孫である腫瘍細胞ミクロ
クローンもまた、作製され得る。

【００４０】 （４．６ ｃＤＮＡライブラリーの時間的順番付け） これらのミクロクローンからのｃＤＮＡライブラリーは、ｃＤＮＡライブラリ
ーが得られたミクロクローンに基づいて時間的な順番で配置される。マイクロク
ローナルｃＤＮＡプールが作製され、そして任意の公知の遺伝子の発現に従って
配置される。例えば、ｃＤＮＡプールは、発生遺伝子または癌原遺伝子を含むが
これらに限定されない遺伝子の発現に従って配置され得る。従って、遺伝子の順
番付けられたアレイを構成する、クローニングされていないｃＤＮＡライブラリ
ーの作製は、発生または分化の任意の段階での任意の組織に由来する所定のミク
ロクローン中に存在する転写物の恒久的な（ｐｅｒｐｅｔｕａｌ）分析に受け入
れられ得る。例えば、神経発生の初期段階を示す脳細胞ミクロクローンは、初期
神経発生中に発現された遺伝子を含むｃＤＮＡライブラリーを生じる。神経発生
の後期段階を示す脳細胞ミクロクローンは、後期段階の間に発現される遺伝子を
含むｃＤＮＡライブラリーを生じる。これらの種々の段階での脳細胞ミクロクロ
ーン由来のｃＤＮＡを単離することによって、これらのライブラリー内の遺伝子
は、それらが神経形態発生の異なる段階で発現される時期に従って配置され得る
。

【００４１】 （４．７ 差示的な遺伝子発現パネル） 発生の全段階においてミクロクローンから、解像力によって誘導されるｃＤＮ
Ａライブラリのパネルは、天然の細胞の増殖、成長、分化、生存、および死に含
まれる発生に関与する全遺伝子の転写を含む。従って、ｃＤＮＡライブラリーの
このようなパネルは、神経発生のプロセスに関与する、新しい遺伝子の発見に使
用され得る。これらのパネルをまた使用して、神経発生のプロセスに関与する、
新規な遺伝子および公知の遺伝子の両方のスイッチオンおよびオフに導く一連の
事象を分析する。正常の脳細胞から誘導されるミクロクローンから単離されるｃ
ＤＮＡを、異常の脳細胞から誘導されるミクロクローンから単離されるｃＤＮＡ
を比較する場合、これらの２つのミクロクローン集団間の差示的な遺伝子発現パ
ターンの分析により、遺伝子が同定され、そして活性化の経路は、正常および異
常な脳発現および脳機能に関与する。

【００４２】 種々の差示的な方法を使用して、任意の２つのｃＤＮＡプールの比較が、実施
され得る。この方法としては、例えば、提示差示分析（ＲＤＡ）、抑制差引きハ
イブリダイゼーション（ＳＳＨ）、および酵素分解減算（ＥＤＳ）だが、これら
に限定されない。従って、１種のミクロクローンウイルスに特異的である、転写
または転写のフラグメントが、発見され得る。この比較方法または差示的方法は
、公知の配列データを調査および比較するために、新しく発見された遺伝子フラ
グメントをシークエンスする機会を提供する。

【００４３】 （４．８ マイクロアレイの分類） 特に脳のクローンにおいて多様なクローンのプロセスをスクリーニングする反
復性遺伝子もまた、本発明内で意図される。配列または配列のフラグメントを産
生させた後、プライマーを産生させ、そして総ｃＤＮＡプールを特定の遺伝子、
または遺伝子フラグメントの存在についてスクリーニングする。次いで、これは
、特定のミクロクローンによる遺伝子発現の時間的パターンの再構築を可能にす
る。ｎがパネルに含まれるミクロクローンまたはプールの数である場合、このプ
ロセスは、ｎ−１回につき１反復性様式で進む。これは、任意の所与のマイクロ
プレートの成熟または分化の範囲を連続的に再構築するために、ミクロクローン
を繰り返しスクリーニングに供する。

【００４４】 マイクロアレイにおける遺伝子の分類に続いて、公知または未知の遺伝子のフ
ラグメントは、特定の細胞プロセスの正確な時間により確実に影響を与える目的
で再構築され得る。例えば、特定のセットの脳細胞のミクロクローンの分類は、
神経発生に対する時間的遺伝子発現パターンに導く。次いで、これらの遺伝子ま
たは遺伝子フラグメントは、例えば、ＤＮＡチップのような任意の数の市販のア
レイに注がれ得る。マーカー遺伝子の規定の集団は、連続する遺伝子の発見の研
究のために識別する第１方法として使用され得る。使用される方法および一連の
遺伝子マーカーは、特定のミクロクローン集団または選択される集団に基づいて
選択される。アレイの部分集団は、ｃＤＮＡのプールがニューロンのマーカーお
よび神経膠マーカーの両方で明らかとなる場所に存在する。

【００４５】 マイクロアレイ分析に続いて、特定の遺伝子または遺伝子フラグメントを使用
して、インサイチュハイブリダイゼーションおよびインサイチュＲＴ−ＰＣＲ研
究のためにオリゴヌクレオチドおよびリボプローブを産生し、遺伝子発現の存在
を確認し、そして同定されたミクロクローン内でのこの発現の細胞源を同定し得
る。これは、二重標識免疫細胞化学を含む他の方法と結び付けて使用され得る。

【００４６】 マイクロアレイは、遺伝子の分類、特に無数に番号付けされ得る神経遺伝子に
対して有用である。この方法はまた、発生遺伝子、発癌性遺伝子、胚幹細胞遺伝
子、および始原生殖細胞に含まれる非神経組織の研究に対しても同様に適用され
得る。

【００４７】 （４．９ 遺伝子の単離および特徴付け） 一旦、ｃＤＮＡライブラリーが、ミクロクローンから産生されると、発現した
遺伝子が特徴付けされる。ｃＤＮＡの産生に続いて、一方で、発現された配列タ
グ（ＥＳＴ）（Ｐｏｌｙｍｅｒｏｐｏｕｌｏｓら、１９９２）が使用され得る。
他方で、遺伝子ＤＮＡのイントロンによって妨害されないような染色体領域を構
築するために、コンピュータプログラムを使用して、これらのＥＳＴの染色体部
分を迅速に確保するための手順が展開される。次いで、ＰＣＲおよびオリゴヌク
レオチドプライマーを使用して、体細胞性の細胞ハイブリッド染色体パネルから
ＤＮＡテンプレートを使用することによって、このような領域を増幅し得る。次
いで、ｃＤＮＡの染色体配列を構築して、続いて特定のパネルで増幅させた産物
の分離について分析する。無数のＥＳＴを、不偏性様式で焦点をクローンに当て
ることによってヒトの脳のｃＤＮＡクローンを発生させ、次いで異なる発生段階
で脳の転写活性のプロフィールを発生させることで研究し得る（Ａｄａｍｓら、
１９９３）。

【００４８】 対応する遺伝子の定量発現測定のために、ｃＤＮＡのマイクロアレイは、ガラ
スまたはナイロン上に、高速ロボットプリンティング（ｒｏｂｏｔｉｃ ｐｒｉ
ｎｔｉｎｇ）を用いて調製され得る（Ｓｃｈｅｎａら、１９９５）。ほとんどの
ヒト遺伝子、またはさらに全ヒト遺伝子の代表的な配列を有するマイクロアレイ
は、単一反応で、全ヒトゲノムの発現分析を可能にする（Ｓｃｈｅｎａら、１９
９８）。このような情報は、ゲノムＤＮＡクローンをマッピングおよび多型現象
を調査するために使用され得る。標識化プローブは、相補的結合を構築し、それ
故、多数のパラレル遺伝子発現を分析するために使用される。ＤＮＡのサンプル
をＰＣＲによって増幅し、そして蛍光標識を挿入し、そしてマイクロアレイとハ
イブリダイズさせる（Ｒａｍｓａｙ、１９９８）。多数のＤＮＡ配列の分析は、
光ファイバーバイオセンサアレイを使用して達成され得（Ｆｅｒｇｕｓｏｎら、
１９９６）、これは、定量分析のためのポテンシャルを含む。定量分析は、比色
検出およびコンピュータアシストイメージ分析（ｃｏｍｐｕｔｅｒ−ａｓｓｉｓ
ｔｅｄ ｉｍａｇｅ ａｎａｌｙｓｉｓ）（Ｃｈｅｎら、１９９８）を使用して
実施され得る。これらのＤＮＡチップ技術は、以前はニューロスフィアには適用
されなかった。このニューロスフィアは、所望の方法によって得られるｃＤＮＡ
と結びつけて使用され得る。

【００４９】 どちらの方法も、脳細胞のクローン（ニューロスフィア）に適用されてこなか
った。異なる遺伝子発現の同定は、両方の方法の目的であり、そしてこのような
差示的または差引き的な方法（例えば、提示差示分析、ＲＮＡ、またはｃＤＮＡ
）は、任意のマイクロアレイアプローチと結び付けられ得る（Ｗｅｌｆｏｒｄら
、１９９８） 本発明のｃＤＮＡマイクロアレイ方法は異なるが、２つの異なる脳クローンに
またがる遺伝子発現に違いを決定するために、差示的表示と差引き方法とが比較
される。むしろ開示の方法を使用して、クローンにまたがる明確な発現遺伝子を
確認して、そして遺伝子発見の確認のために後にシークエンスし得る新規な転写
物を単離する。

【００５０】 ｍＲＮＡとのｃＤＮＡの差引きハイブリダイゼーションまたはｃＤＮＡライブ
ラリーの差引きハイブリダイゼーションに依存することによって、発生する神経
細胞の発生および成熟の基礎をなす、メッセージの特徴と関連する技術的な注意
点が存在する。この提示差示分析（ＲＤＡ）（Ｌｉｓｉｔｓｙｎら、１９９３：
ＨｕｂａｎｋおよびＳｃｈａｔｚ、１９９４）は、差引きが増幅と結び付けられ
るＲＤＡプロセスに依存する多くの技術的問題を克服する方法である。差示的表
示が、全ての代表的なｍＲＮＡ種からのフラグメントの増幅に依存する場合、Ｒ
ＤＡは、２つの異なる集団に存在するフラグメントを減算し、そしてこの差のみ
を残す。このことは、ｃＤＮＡマイクロアレイを用いて使用するための有利なな
方法である。差示的に発現された遺伝子の豊富なライブラリーを構築することに
よって、反復性プロセスを脳細胞のマイクロアレイに適用して、無数の遺伝子フ
ラグメントの同時スクリーニングのための迅速でかつ信頼のある方法を提供する
。酵素分解減算（ＥＤＳ）（Ｚｅｎｇら、１９９４）および抑制差引きハイブリ
ダイゼーション（ＳＳＨ）（Ｄｉａｔｃｈｅｎｋｏら、１９９６）を含む、他の
差示的方法はまた、脳のニューロスフェアからのマイクロアレイの差示的遺伝子
発生研究のために使用され得る。

【００５１】 （４．１０ 分離された脳由来のマウスニューロスフェア） Ｋｕｋｅｋｏｖら（１９９７）に記載されるプロトコルを使用して、２つのタ
イプの神経球を、ニューロンおよび神経膠の両方を生じる成体マウスニューロス
フェアから単離した。光顕微鏡および電子顕微鏡の両方の研究により、新規（Ｉ
型）の増殖性ニューロスフェアおよび十分に特徴付けられた（ＩＩ型）増殖性ニ
ューロスフェアに存在する細胞型が同定された。異なる形態学および生化学の細
胞を有する前者のＩ型（ネスチン（ｎｅｓｔｉｎ）陰性）および後者のＩＩ型ニ
ューロスフェアの両方と共に、ニューロスフェアの発達の連続が明らかになる。

【００５２】 Ｉ型ニューロスフェアは、懸濁培地中に自然に現れる。これらのニューロスフ
ェアは、経時的に大きく明るくなるフェーズダークの球体である。ＥＭは、Ｉ型
ニューロスフェアが、死んだ細胞由来の細片であり得る綿状材料のコアを時折取
り巻く小さく、密に並んだ細胞の環、ならびに細胞外マトリクスからなることを
示す。Ｉ型細胞は、小胞体、ゴルジ装置、濃染体、およびミトコンドリアを含む
多くの小器官を有する。Ｉ型ニューロスフェアの前者の形態は、鋭く連続した外
縁により特徴付けられる。逆に、後者のＩ型ニューロスフェアは、しばしば、ニ
ューロスフェアから突出し始めている細胞と共に、不連続な外縁を示す。Ｉ型ニ
ューロスフェアは、プラスチック被覆培養基またはラミニン被覆培養基のいずれ
にも容易に結合しない。

【００５３】 これらが培地に現れた直後に、Ｉ型ニューロスフェアは星状細胞ＧＦＡＰ、推
定神経幹細胞の中間フィラメントタンパク質、ネスチン、ニューロンのβ−ＩＩ
Ｉチューブリン、およびＬ１を含む細胞特異的マーカーに対して免疫陰性である
；しかし、これらのニューロスフェアは、示されるように、核をＰＩで陽性標識
することによって、生細胞を含む。インビトロで約２週間後、Ｉ型ニューロスフ
ェアのいくつかの細胞はネスチンに対して免疫陽性になるが、ＧＦＡＰおよびβ
−ＩＩＩチューブリンに対しては免疫陰性のままである。時間が経つと、Ｉ型ニ
ューロスフェアからＩＩ型ニューロスフェアへの変換が示された（Ｋｕｋｅｋｏ
ｖら、１９９７）。

【００５４】 ＩＩ型ニューロスフェアの前者の形態は、それらが大きく、フェーズブライト
の細胞を含むこと以外は、Ｉ型ニューロスフェアと類似しており、そして後者の
ＩＩ型ニューロスフェアにおいてより明らかになる、より明確な細胞突出を有す
るより不連続な外縁を有する。ＩＩ型ニューロスフェアのＥＭは、ＩＩ型ニュー
ロスフェアの細胞質がＩ型より電子密度が小さいこと以外は、Ｉ型細胞より分化
されているような細胞を示す。ＩＩ型ニューロスフェアは、プラスチック培養基
およびラミニン培養基に容易に結合する。結合した後、細胞はニューロスフェア
から移動し、そして突起を仕上げ始める。Ｉ型およびＩＩ型ニューロスフェアは
また、全脳に加えて単離された成体ＳＥＺの分離により、または新生児脳から生
成され得る。

【００５５】 ＩＩ型ニューロスフェアは、ネスチン、ＧＦＡＰ、およびβ−ＩＩＩチューブ
リンに対して免疫陽性である（Ｋｕｋｅｋｏｖら、１９９７の図２Ｅおよび図２
Ｆ）。プラスチック被覆培養基およびラミニン被覆培養基にプレートされた場合
、ＩＩ型ニューロスフェアは容易に結合し、そしてニューロスフェアから移動す
る多くの突起を有する細胞を産生して、ＧＦＡＰ、ネスチン、Ｌ１およびβ−Ｉ
ＩＩチューブリンを含む種々の細胞特異的マーカーに対して免疫陽性である細胞
の単層を形成する。Ｉ型およびＩＩ型ニューロスフェア、およびこれらのニュー
ロスフェア由来のユーロンは、増殖性である（これらは、ＢｒｄＵを取り込む）
。最終的に、ニューロスフェアは、さらに延長した死後間隔（ＰＭＩ）（例えば
、１４０時間）で、成体マウス脳組織から生成され得ることが示された（Ｌａｙ
ｗｅｌｌら、１９９９）。

【００５６】 （４．１１ ヒトニューロスフェア） Ｉ型およびＩＩ型ニューロスフェアは、成人ヒト側頭葉（難治性癲癇のために
実施される側頭葉切断による生検標本）から生成された。光顕微鏡免疫細胞学お
よびＥＭ研究は、成体マウスに見られる特徴と共通した多くの特徴を有するニュ
ーロスフェアおよび細胞型を示す。ニューロスフェア細胞はまた、テネイシンに
対して免疫陽性のようであり（Ｋｕｋｅｋｏｖら、１９９９の図３を参照のこと
）、これはインビボにおけるＳＥＺ吻遊走経路内の推定成熟星状細胞による濃Ｅ
ＣＭ発現に加えて、ニューロスフェアの未熟細胞はまた、それらの増殖および分
化に影響し得るＥＣＭタンパク質を発現することを示唆している。

【００５７】 （４．１２ クローンニューロスフェアのＲＴ−ＰＣＲ） 前駆体、発達、神経膠およびニューロン表現型マーカーの存在は、前者のＩ型
〜後者のＩＩ型ニューロスフェアの単一および集団に関連している。Ｋｕｋｅｋ
ｏｖら（１９９９）は、記載されるように（Ｓｕｓｌｏｖら、２０００）、マウ
スまたはヒト脳組織から発生した単一および複数のニューロスフェア由来のＲＴ
−ＰＣＲ産物を報告した。適切な塩基対数に対応するバンドは、テネイシン、ネ
スチン（未熟細胞の存在、またはおそらく反応性星状細胞における中間フィラメ
ントの存在に関連する（Ｌｉｎら、１９９５））の存在を示す。ＧＦＡＰ、ニュ
ーロン特異的エノラーゼ、およびＰａｘ転写因子遺伝子発現は、ニューロスフェ
アにおいて観察される。

【００５８】 これは、ＳＥＺ遊走経路中の成熟星状細胞において示されたが（Ｔｈｏｍａｓ
ら、１９９６）、ＳＥＺ幹／前駆体細胞によるテネイシンの合成および発現を提
供する第１の証拠である。対ボックス遺伝子、Ｐａｘファミリーは、インビボで
、異なる時間で、発達中の脳の異なる部分において発現されることが示された（
ＳｔｏｙｋｏｖａおよびＧｒｕｓｓ、１９９４）。このファミリーは、個々のク
ローンの成熟の電位差状態の標準マーカーとして有用である。

【００５９】 初期型Ｉ−後期型ＩＩのニューロスフェアでのＲＴ−ＰＣＲにより、これらの
ニューロスフェアを、位相差顕微鏡的な形態学（例えば、暗相 対 明相）、サ
イズ、および培養時間に基づいて最初にグループ化して、大半の未熟ニューロス
フェア形態 対 成熟ニューロスフェア形態について最初にスクリーニングし得
、そして同じ型のいくつかのニューロスフェアにおいて見られるように、１つの
ニューロスフェアにおいて同じ転写物がいくつか発現されていることが示される
。例えば、最も「成熟した」ニューロスフェアのいくつかは、種々のニューロン
マーカーについて異質性を示すが、最初期のニューロスフェアのいくつかは、ネ
スチンについての転写物を明らかにしない。いくつかは、チロシンヒドロキシラ
ーゼ（ＧｌｕＲ６ではなくＧｌｕＲ５）を発現し、そしていくつかはＣｈＡＴを
発現する。これは、異なる成熟状態を示すニューロスフェアにおいて、異なる前
駆体およびニューロン／神経膠の前駆細胞を識別する方法、あるいは異なる型の
幹細胞／前駆細胞から生じたニューロスフェアを識別する方法に関する有用性を
支持する。幹／前駆体または異なる神経原性帯（ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｃ ｚｏｎ
ｅ）由来のクローンにおけるこれらの遺伝子の発現における差異は、一方に対し
て他方のクローンの集団によって発現されるさらなる遺伝子をさらに特徴付ける
ための本発明の方法の用途を実証する。

【００６０】 （４．１３ 核酸セグメント） 本発明はまた、この開示された方法によって単離および同定された遺伝子のア
ミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子を提供す
る。開示されたヌクレオチド配列およびそれによってコードされるタンパク質の
フラグメントおよび改変体もまた、本発明によって包含される。「フラグメント
」とは、ヌクレオチド配列の一部、またはアミノ酸配列の一部、従って、それら
によってコードされるタンパク質を意図する。ヌクレオチド配列のフラグメント
は、ネイティブなタンパク質の生物学的活性を保持するタンパク質フラグメント
をコードし得る。ヌクレオチド配列のフラグメントは、少なくとも約２０ヌクレ
オチド、約５０ヌクレオチド、約１００ヌクレオチドから、ヌクレオチド配列全
体までの範囲であり得る。

【００６１】 タンパク質の生物学的に活性な部分をコードするヌクレオチド配列のフラグメ
ントは、本発明の全長タンパク質において存在するアミノ酸の少なくとも１５、
２５、３０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００
、４５０、５００、６００、７００、８００もしくは１０００個連続したアミノ
酸、またはそのアミノ酸の総数までをコードする。ＰＣＲ^TMプライマーについて
のハイブリダイゼーションプローブとして有用なヌクレオチド配列のフラグメン
トは、一般的に、タンパク質の生物学的に活性な部分をコードする必要はない。

【００６２】 ヌクレオチド配列のフラグメントは、タンパク質の生物学的に活性な部分をコ
ードし得るか、またはヌクレオチド配列のフラグメントは、以下に開示される方
法を使用して、ハイブリダイゼーションプローブまたはＰＣＲ^TMプライマーとし
て用いられ得るフラグメントであり得る。タンパク質の生物学的に活性な部分は
、本発明の１つのヌクレオチド配列の一部を単離すること、そのタンパク質のコ
ードされる部分を発現させること（例えば、インビトロでの組換え発現により）
、そしてそのタンパク質のコードされる部分の活性を評価することによって、調
製され得る。ヌクレオチド配列のフラグメントである核酸分子は、少なくとも約
１６個、約１７個、約１８個、約１９個、約２０個、約２１個、約２２個、約２
３個、約２４個、約２５個、約２６個、約２７個、約２８個、約２９個、および
約３０個程の連続したヌクレオチドを含む。わずかにより長い配列としては、少
なくとも約３１個、約３２個、約３３個、約３４個、約３５個、約３６個、約３
７個、約３８個、約３９個、約４０個、約４１個、約４２個、約４３個、約４４
個、約４５個、約４６個、約４７個、約４８個、約４９個、または約５０個程度
連続したヌクレオチドを含む配列が挙げられる。さらにより長い配列としては、
少なくとも約５１個、約５２個、約５３個、約５４個、約５５個、約５６個、約
５７個、約５８個、約５９個、約６０個、約６１個、約６２個、約６３個、約６
４個、約６５個、約６６個、約６７個、約６８個、約６９個、約７０個程度連続
したヌクレオチドを含む配列が挙げられる。その程度からなおより長い連続した
核酸配列を含む、さらにより長いセグメントを同定することが所望される場合、
約７５、約８０、約８５、約９０、約９５、約１００、約１２５、約１５０、約
１７５、約２００、約２２５、約２５０、約２７５、約３００、約３２５、約３
５０、約３７５、約４００、約４２５、約４５０、約５００、約５５０、約６０
０、約６５０、約７００、約７５０、約８００、約８５０程度のヌクレオチドを
含むポリヌクレオチド、そしてヌクレオチド配列において本発明のヌクレオチド
の数を含めてその数までを含むポリヌクレオチドさえも調製し得る。

【００６３】 「改変体」とは、実質的に類似の配列を意図する。ヌクレオチド配列について
、保存的改変体は、遺伝コードの縮重が理由で、タンパク質の指定されたアミノ
酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。一般的に、本発明のヌクレオチド
配列改変体は、その個々のネイティブなヌクレオチド配列に対して、少なくとも
４０％、５０％、６０％、７０％、一般的には８０％、好ましくは９０％、９５
％、９８％の配列同一性を有する。

【００６４】 「改変体」タンパク質とは、ネイティブなタンパク質のＮ末端および／または
Ｃ末端への１以上のアミノ酸の欠失（いわゆる、短縮化（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ
））または付加；ネイティブなタンパク質における１以上の部位での１以上のア
ミノ酸の欠失または付加；あるいは、ネイティブなタンパク質における１以上の
部位での１以上のアミノ酸の置換によって、ネイティブなタンパク質から誘導さ
れるタンパク質を意図する。このような改変体は、例えば、遺伝的多型または人
為的操作から生じ得る。このような操作の方法は、当該分野において一般的に公
知である。

【００６５】 これらのヌクレオチド配列は、他の相同な配列を単離するために使用され得る
。核酸配列のハイブリダイゼーションのための方法は、当該分野で容易に利用可
能である。他の配列を得るために、ポリペプチド配列全体またはその部分が、対
応するコード配列およびメッセンジャーＲＮＡに特異的にハイブリダイズし得る
プローブとして使用され得る。種々の条件下で特異的なハイブリダイゼーション
を達成するために、このようなプローブは、独特でありかつ、好ましくは約１０
ヌクレオチド長、そして最も好ましくは少なくとも約２０ヌクレオチド長である
配列を含む。このようなプローブを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ^TM ）の周知のプロセスによって、目的のタンパク質コード配列を増幅し得る。この
技術は、さらなるコード配列を単離するために、またはコード配列の存在を決定
するための診断的アッセイとして、使用され得る。

【００６６】 このような技術としては、以下が挙げられる：プレーティングされたＤＮＡラ
イブラリー（プラークまたはコロニーのいずれか）のハイブリダイゼーションス
クリーニング（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）、およびアミノ酸配列間で保存
された配列ドメインに対応するオリゴヌクレオチドプライマーを使用するＰＣＲ ^TM による増幅（Ｉｎｎｉｓら、１９９０）。

【００６７】 このような配列のハイブリダイゼーションは、低減されたストリンジェンシー
条件下、中程度のストリンジェンシー条件下、または高いストリンジェンシー条
件下においてさえも（例えば、それぞれ、３７℃での、５×デンハルト溶液、０
．５％ＳＤＳおよび１×ＳＳＰＥを伴う３５〜４０％ホルムアミドの洗浄ストリ
ンジェンシーによって代表される条件；４２℃での、５×デンハルト溶液、０．
５％ＳＤＳおよび１×ＳＳＰＥを伴う４０〜４５％ホルムアミドの洗浄ストリン
ジェンシーによって代表される条件；ならびに、４２℃での、５×デンハルト溶
液、０．５％ＳＤＳおよび１×ＳＳＰＥを伴う５０％ホルムアミドの洗浄ストリ
ンジェンシーによって代表される条件）、本明細書中に開示されるタンパク質を
コードするＤＮＡに対して、標準的ハイブリダイゼーションアッセイにおいて実
施され得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）。一般的に、本明細書中に開示さ
れるようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列および本明細書中に
開示されるポリヌクレオチド配列の１つ以上にハイブリダイズするポリヌクレオ
チド配列は、開示された配列と少なくとも５０％相同性、７０％相同性、そして
８５％以上さえも相同性である。すなわち、配列の配列類似性は、少なくとも約
５０％、約７０％、そして約８５％さえも配列類似性を共有する範囲であり得る
。

【００６８】 比較のために配列を整列する方法は、当該分野において周知である。比較のた
めの配列の最適整列を、以下によって実施し得る：Ｓｍｉｔｈら（１９８１）ら
の局所的相同性アルゴリズムによって；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら（１９７０）の相
同性アラインメントアルゴリズムによって；Ｐｅａｒｓｏｎら（１９８８）の類
似性方法についての検索によって；以下を含むが、それらに限定されない、これ
らのアルゴリズムのコンピューターインプリメンテーションによって（Ｉｎｔｅ
ｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ
によるＰＣ／ＧｅｎｅプログラムのＣＬＵＳＴＡＬ；Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅ
ｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍ
ｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ、Ｍ
ａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、ＵＳＡのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡ
ＳＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ；ＣＬＵＳＴＡＬプログラムは、Ｈｉｇ
ｇｉｎｓら（１９８８）；Ｈｉｇｇｉｎｓら（１９８９）；Ｃｏｒｐｅｔら（１
９８８）；Ｈｕａｎｇら（１９９２）、およびＰｅｒｓｏｎら（１９９４）によ
って十分に記載されており；好ましいコンピューター整列方法としてはまた、Ｂ
ＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＸアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ
ら、１９９０）が挙げられる。整列はまた、目視および手動の補正によって実施
される。

【００６９】 本明細書中で使用される場合、「配列同一性」または「同一性」は、２つの核
酸配列またはポリペプチド配列の状況では、特定の比較ウィンドウにわたって最
大一致のために整列される場合に、その２つの配列において同一である残基を参
照する。タンパク質を参照して配列同一性のパーセンテージが用いられる場合、
同一でない残基位置はしばしば、保存的アミノ酸置換（ここでアミノ酸残基は、
類似の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する他のアミノ酸残基につ
いて置換され、それにより、その分子の機能的特性を変化させない）によって異
なることが理解される。保存的置換で配列が異なる場合、配列同一性のパーセン
テージは、置換の保存的性質を補正するために上方に調整され得る。このような
保存的置換によって異なる配列は、「配列類似性」または「類似性」を有すると
いわれる。このような調整をなす手段は、当業者に周知である。代表的に、これ
は、全長ではなく部分的なミスマッチとして保存的置換をスコア付けし、それに
よって配列同一性パーセンテージを上昇させることを包含する。従って、例えば
、同一のアミノ酸がスコア１を与えられ、そして非保存的置換がスコア０を与え
られる場合、保存的置換は、０と１との間のスコアを与えられる。保存的置換の
スコア付けは、例えば、プログラムＰＣ／ＧＥＮＥ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔ
ｉｃｓ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）においてインプリメントされてい
るように、算出される。

【００７０】 本明細書中で使用される場合、「配列同一性のパーセンテージ」は、比較ウィ
ンドウにわたって２つの最適に整列された配列を比較することによって決定され
る値を意味し、ここでこの比較ウィンドウにおけるポリヌクレオチド配列の部分
は、２つの配列の最適な整列のために、参照配列（これは、付加も欠失も含まな
い）と比較して、付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。パーセン
テージは、両方の配列において同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が存在する位
置の数を決定して、一致した位置数を算出する工程、その一致した位置数を、比
較ウィンドウにおける位置の総数で除算する工程、そしてこの結果に１００を乗
算して配列同一性のパーセンテージを得る工程によって算出される。

【００７１】 用語ポリヌクレオチド配列の「実質的同一性」は、ポリヌクレオチドが、標準
的なパラメーターを用いて、記載されたアルゴリズムプログラムのうちの１つを
用いて参照配列と比較して、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、
より好ましくは少なくとも９０％、そして最も好ましくは少なくとも９５％の配
列同一性を有する配列を含むことを意味する。当業者は、これらの値が、適切に
調整されて、コドンの縮重、アミノ酸類似性、リーディングフレームの配置など
を考慮して、２つのヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質の対応す
る同一性を決定し得ることを認識する。これらの目的でのアミノ酸配列の実質的
同一性は通常、少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、８０％、
９０％および最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を意味する。

【００７２】 ヌクレオチド配列が実質的に同一である別の指標は、２つの分子が、ストリン
ジェントな条件下で互いにハイブリダイズするか否かである。一般に、ストリン
ジェントな条件は、規定されたイオン強度およびｐＨにおいて、特定の配列につ
いての熱融点（Ｔ_m）よりも約５℃〜約２０℃低いように選択される。Ｔ_mは、標
的配列のうちの５０％が、完全に一致したプローブにハイブリダイズする（規定
されたイオン強度およびｐＨ下での）温度である。代表的に、ストリンジェント
な条件のハイブリダイゼーションは、塩濃度がｐＨ７にて約０．０２Ｍであり、
かつ温度が少なくとも約５０℃、約５５℃、またはさらに約６０℃などである洗
浄条件によって例示される。しかし、ストリンジェントな条件下で互いにハイブ
リダイズしない核酸は、コードするポリペプチドが実質的に同一である場合、依
然として実質的に同一である。このことは、例えば、核酸のコピーが、遺伝暗号
によって許容される最大のコドン縮重を用いて作製される場合に生じ得る。２つ
の核酸配列が実質的に同一である１つの指標は、第１の核酸によってコードされ
るポリペプチドが、第２の核酸によってコードされるポリペプチドと免疫学的に
交叉反応性である場合である。

【００７３】 用語「実質的に同一」は、ペプチドの文脈では、ペプチドが、参照配列に対し
て少なくとも７０％の配列同一性、好ましくは指定された比較ウィンドウについ
て参照配列に対して８０％、より好ましくは８５％、最も好ましくは少なくとも
９０％または９５％の配列同一性を有する配列を含むことを示す。好ましくは、
最適の整列は、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら（１９７０）の相同性整列アルゴリズムを
用いて行われる。２つのペプチド配列が実質的に同一である指標は、１つのペプ
チドが、第２のペプチドに対して惹起された抗体と免疫学的に反応性であること
である。従って、ペプチドは、例えば、２つのペプチドが保存的置換のみによっ
て異なる場合、第２のペプチドに対して実質的に同一である。「実質的に類似」
であるペプチドは、同一でない残基位置が、保存的アミノ酸変化によって異なり
得ることを除いて、上記のような配列を共有する。

【００７４】 タンパク質は、アミノ酸の置換、欠失、短縮および挿入を含む種々の方法で変
更され得る。このような操作のための方法は一般に、当該分野で公知である。例
えば、タンパク質のアミノ酸配列改変体は、ＤＮＡにおける変異によって調製さ
れ得る。変異誘発およびヌクレオチド配列変更のための方法は、当該分野で周知
である（Ｋｕｎｋｅｌ，１９８５；Ｋｕｎｋｅｌら，１９８７；米国特許第４，
８７３，１９２号；ＷａｌｋｅｒおよびＧａａｄｔｒａ，１９８３）。

【００７５】 本発明の遺伝子およびヌクレオチド配列が、天然に存在する配列ならびに変異
体形態の両方を包含することが意図される。同様に、本発明のタンパク質は、天
然に存在するタンパク質、ならびにそれらの改変体および改変形態の両方を包含
する。このような改変体は、活性を保有し続ける。明らかに、改変体をコードす
るＤＮＡにおいて作製される変異は、配列をリーディングフレームの外に配置し
てはならず、好ましくは、二次ｍＲＮＡ構造を生成し得る相補領域を作製しない
（例えば、その全体が本明細書中に参考として特に援用される、欧州特許出願公
開第７５，４４４号を参照のこと）。

【００７６】 （４．１４ 発現ベクター） 誘導性プロモーターに作動的に連結された少なくとも１つのポリヌクレオチド
を含む発現ベクターは、開示された方法によって単離された核酸配列から容易に
構築され得る。従って、１つの実施形態では、発現ベクターは、遺伝子を発現す
るプロモーターに連結された、単離されそして精製されたＤＮＡ分子であり、こ
のコード領域は、転写終結領域に作動可能に連結されており、それによてｔ、こ
のプロモーターは、コード領域の転写を駆動する。

【００７７】 本明細書中で使用される場合、用語「作動的に連結される」とは、プロモータ
ーが、その機能的ＲＮＡの転写がそのプロモーターによって制御および調節され
るように、機能的ＲＮＡをコードする核酸領域に連結されていることを意味する
。機能的ＲＮＡをコードする核酸領域に対してプロモーターを作動的に連結する
ための手段は、当該分野で周知である。

【００７８】 発現ベクターの選択および最終的にどのプロモーターに対してポリペプチドコ
ード領域を作動的に連結するかの選択は、所望される機能的特性（例えば、タン
パク質発現の位置およびタイミング）ならびに形質転換される宿主細胞に直接依
存する。これらは、組換えＤＮＡ分子を構築する分野において固有の、周知の制
限である。しかし、本発明の実施において有用なベクターは、作動的に連結され
た機能的ＲＮＡの発現を指向し得る。

【００７９】 ＲＮＡポリメラーゼは、ポリアデニル化が生じる部位を通してコードＤＮＡ配
列を転写する。代表的に、ポリアデニル化部位の数百塩基対下流に位置するＤＮ
Ａ配列は、転写を終結するように作用する。これらのＤＮＡ配列は、本明細書中
で、転写終結領域と呼ばれる。これらの領域は、転写されたメッセンジャーＲＮ
Ａ（ｍＲＮＡ）の効率的なポリアデニル化のために必要とされる。

【００８０】 種々の方法が、相補的付着末端または平滑末端を介してベクターにＤＮＡを作
動可能に連結するために開発されている。例えば、相補的ホモポリマートラクト
（ｔｒａｃｔ）が、挿入されるＤＮＡセグメントおよびベクターＤＮＡに付加さ
れ得る。次いで、そのベクターおよびＤＮＡセグメントが、その相補的ホモポリ
マーテール間の水素結合によって結合されて、組換えＤＮＡ分子が形成される。

【００８１】 （４．１５ ハイブリダイゼーションプローブおよびプライマーとしての、Ｄ
ＮＡセグメント） 別の局面において、本発明により提供されるＤＮＡ配列情報によって、本明細
書中に開示される選択されたポリヌクレオチドの遺伝子配列に特異的にハイブリ
ダイズする能力を有する、比較的短いＤＮＡ（またはＲＮＡ）配列の調製が可能
である。そのプローブは、所定のサンプル中の相補的配列の存在を検出するため
の種々のアッセイにおいて、そして遺伝子をコードする新規な種または属の同定
において、使用され得る。

【００８２】 特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドプライマーを使用することが有
利である。そのようなプライマーの配列は、開示された核酸セグメントの規定さ
れたセグメントを、ＰＣＲ^TM技術を使用してサンプルから検出、増幅、または変
異することにおける使用のために、本発明のポリヌクレオチドを使用して設計さ
れる。本発明に従って特定の利点を提供するために、ハイブリダイゼーション研
究またはアッセイに使用される好ましい核酸配列は、少なくとも約３１〜５０長
程度のヌクレオチドのストレッチに相補的な配列を含む。少なくとも３１ヌクレ
オチド長の大きさは、そのフラグメントが、安定および選択的の両方である二重
鎖分子を形成するに十分な長さであることを確実にするのを補助する。しかし、
ハイブリッドの安定性および選択性を増加させ、それにより得られる特定のハイ
ブリッド分子の質および程度を改善するために、長さ３１塩基より長いストレッ
チにわたる相補的配列を有する分子が、一般的に好ましい。一般的には、約３１
〜約４０または５０ヌクレオチド程度の（あるいは所望ならばもっと長い）遺伝
子相補的ストレッチを有する核酸分子を設計することが、好ましい。そのような
フラグメントは、例えば、化学的手段によりそのフラグメントを直接合成するこ
とによってか、核酸再生成技術（例えば、米国特許番号４，６８３，１９５およ
び同４，６８３，２０２（各々その全体が本明細書中に参考として特に援用され
る）のＰＣＲ^TM技術の適用によってか、あるいは適切なインサートおよび適切な
制限部位を含む組換えプラスミドから選択されたＤＮＡフラグメントを切り出す
ことによって、容易に調製され得る。

【００８３】 基礎となるテンプレートにハイブリダイズされる変異プライマー鎖を使用して
変異体を調製することを望む場合、または関連する遺伝子の配列、機能的等価物
などを単離することを探求する場合、よりストリンジェントでないハイブリダイ
ゼーション条件が、そのヘテロ二重鎖の形成を可能にするために代表的には必要
とされる。これらの状況において、約０．１５Ｍ塩〜約０．９Ｍ塩、約２０℃〜
約５５℃の範囲の温度のような条件を使用することが、望ましくあり得る。それ
により、交差ハイブリダイズする種が、コントロールハイブリダイゼーションに
対してポジティブにハイブリダイズするシグナルとして容易に同定され得る。い
かなる場合においても、漸増量のホルムアミドの添加によって、条件がよりスト
リンジェントにされ得ることが一般的に理解される。この漸増量のホルムアミド
の添加は、温度の増加と同じ様式で、そのハイブリッド二重鎖を不安定化するよ
うに作用する。従って、ハイブリダイゼーション条件は、容易に操作され得、従
ってそれは一般的に、所望の結果に依存する選り抜きの方法である。

【００８４】 本発明の機能的ＲＮＡの発現を指示することにおける使用に加えて、本明細書
中で意図される核酸配列はまた、他の種々の用途を有する。例えば、それらはま
た、核酸ハイブリダイゼーション実施形態における、プローブまたはプライマー
としての有用性を有する。このように、２１ヌクレオチド長の連続ＤＮＡセグメ
ントと同じ配列を有すかまたはその２１ヌクレオチド長の連続ＤＮＡセグメント
相補的である、少なくとも２１ヌクレオチド長の連続配列からなる配列領域を含
む核酸セグメントが、特に有用性を見出されることが、意図される。より長い連
続同一配列またはより長い連続相補的配列（例えば、約２０、２１、２２、２３
、２４ヌクレオチド長など、３０、３１、３２、３３、３４ヌクレオチド長など
、４０、４１、４２、４３、４４ヌクレオチド長など、５０、５１、５２、５３
、５４ヌクレオチド長など、１００、２００、５００ヌクレオチド長など（中間
の長さすべてを含み、そして全長配列までそして全長配列を含む）の連続同一配
列または連続相補的配列）もまた、特定の実施形態において有用である。

【００８５】 変異種プライマー、合成遺伝子配列、遺伝子融合物および／またはプライマー
の調製のための配列情報の使用を含む、他の用途もまた、意図される。

【００８６】 約１４ヌクレオチド長程度のハイブリダイゼーションプローブの使用によって
、安定および選択的両方である二重鎖分子の形成が可能である。しかし、そのハ
イブリッドの安定性および選択性を増加させ、それにより得られる特定のハイブ
リッド分子の質および程度を改善するために、約１５、１６、１７、１８、１９
、または２０塩基以上の長さのストレッチにわたる連続相補的配列を有する分子
が、一般的には好ましい。所望の場合に、約２１、２２、２３、２４、２５、２
６、２７、２８、２９、または３０個以上連続する長さのヌクレオチドの遺伝子
相補的ストレッチを有する核酸分子を設計することが、一般的に好ましい。

【００８７】 フラグメントはまた、他の技術によって、例えば、機械的せん断によってか、
または制限酵素切断によって、得られ得る。小さい核酸セグメントまたはフラグ
メントは、例えば、自動オリゴヌクレオチド合成機を使用して商業的に実施され
るように、化学的手段によってそのフラグメントを直接合成することによって容
易に調製され得る。また、フラグメントは、核酸再生成技術（例えば、米国特許
番号４，６８３，１９５および同４，６８３，２０２（各々本明細書中に参考と
して援用される）のＰＣＲ^TM技術）の適用によって、組換え産生のために組換え
ベクターに選択された配列を導入することによって、そして分子生物学の当業者
に一般的に公知の他の組換えＤＮＡ技術によって、得られ得る。

【００８８】 したがって、本発明のヌクレオチド配列は、ＤＮＡフラグメントの相補的伸展
を有する二重鎖分子を選択的に形成するその能力のために使用され得る。想像さ
れる適用に依存して、標的配列に対するプローブの選択性の変化する程度を達成
するために、ハイブリダイゼーションの条件の変化の使用が所望され得る。高い
選択性が必要とされる適用のために、代表的にはハイブリッドを形成するための
比較的ストリンジェントな条件の使用（例えば、約０．０２Ｍ〜約０．１５Ｍの
ＮａＣｌで、約５０℃〜約７０℃の温度によって提供される、比較的低い塩およ
び／または高温の条件を選択する）が所望される。このような選択的条件は、存
在する場合、プローブとテンプレートまたは標的ストランドとの間の不一致をほ
とんど許容せず、そして特定のＤＮＡセグメントの単離のために特に適切である
。ハイブリダイゼーションを介するＤＮＡセグメントの検出は、当業者に周知で
あり、そして米国特許第４，９６５，１８８号および米国特許第５，１７６，９
９５号（この各々は本明細書中に参考として援用される）の教示は、ハイブリダ
イゼーション分析の方法の例示である。Ｍａｌｏｙら、１９９４；Ｓｅｇａｌ
１９７６；ＰｒｏｋｏｐおよびＢａｊｐａｉ、１９９１；ならびにＫｕｂｙ、１
９９４の原文において見出されるような教示は、特に適切である。

【００８９】 一般に、本明細書中に記載されるハイブリダイゼーションプローブが、溶液ハ
イブリダイゼーションにおける試薬として、ならびに固相を使用する実施形態に
おける試薬としての両方で有用であることが想像される。固相に関する実施形態
において、試験ＤＮＡ（またはＲＮＡ）は、選択されたマトリックスまたは表面
に吸収されるか、またはさもなければ付着される。次いで、この固定された一本
鎖核酸は、所望の条件下で、選択されたプローブと共に特定のハイブリダイゼー
ションに供される。この選択された条件は、特に必要とされる特定の基準に基づ
く環境に依存する（例えば、Ｇ＋Ｃの含有量、標的核酸の型、核酸の供給源、ハ
イブリダイゼーションプローブの大きさなどに依存する）。非特異的結合プロー
ブ分子を除去するために、ハイブリダイズした表面を洗浄した後、特異的ハイブ
リダイゼーションは、標識の手段によって検出されるか、またはさらに定量化さ
れる。

【００９０】 （４．１６ 生物学的機能的な均等物） 本発明のタンパク質特異的な遺伝子、プロモーター、遺伝子構築物、プラスミ
ド、および／またはポリペプチドの構造における改変および変化がなされ得、そ
して所望の生物学的に活性な特徴を有する機能的分子をさらに得る。以下は、均
等物、またはさらに改良された第二世代分子を作製するための、タンパク質のア
ミノ酸の変化に基づく考察である。このアミノ酸の変化は、表１に示されるコド
ンに従うＤＮＡ配列のコドンの変化によって達成され得る。

【００９１】

【表１】 例えば、あるアミノ酸は、例えば抗体の抗原結合領域または基質分子の結合部
位のような構造との相互作用性結合能力を顕著に喪失することなく、タンパク質
構造中で他のアミノ酸と置換され得る。タンパク質の生物学的機能的活性を規定
するのは、そのタンパク質の相互作用性能力および性質であるので、特定のアミ
ノ酸配列置換が、タンパク質配列（およびもちろんその基礎をなすＤＮＡコード
配列）においてなされ得、そしてそれにもかかわらず、同様な特性を有するタン
パク質を入手し得る。種々の変更が、開示された組成のペプチド配列またはその
ペプチドをコードする対応するＤＮＡ配列において、その生物学的な有用性も活
性も顕著に喪失することなく、なされ得ることは本発明が企図するところである
。

【００９２】 そのような変更において、アミノ酸のハイドロパシー指数が考慮され得る。タ
ンパク質に相互作用性の生物学的機能を付与することにおけるハイドロパシーア
ミノ酸指数の重要性は、当該分野において一般に理解されている（Ｋｙｔｅおよ
びＤｏｏｌｉｔｔｌｅ，１９８２，本明細書に参考として援用する）。アミノ酸
の相対的ハイドロパシー特徴が、得られるタンパク質の二次構造に寄与し、この
二次構造が次にそのタンパク質と他の分子（例えば、酵素、基質、レセプター、
ＤＮＡ、抗体、抗原など）との相互作用を規定するということは受け入れられて
いる。

【００９３】 各アミノ酸には、その疎水性および電荷の特徴に基づいてハイドロパシー指数
が割り当てられている（ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ，１９８２）。これ
らは、イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）
；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオ
ニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン
（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（
−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（
−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラ
ギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５）である
。

【００９４】 あるアミノ酸が、同様なハイドロパシー指数またはスコアを有する他のアミノ
酸により置換され得、そして依然として同様な生物学的活性を有するタンパク質
を入手し得る（すなわち、生物学的機能上等価なタンパク質を依然として入手し
得る）ことは、当該分野において公知である。そのような変更において、ハイド
ロパシー指数が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、ハイドロパシー指数
が±１位内のアミノ酸の置換が特に好ましく、そしてハイドロパシー指数が±０
．５以内のアミノ酸がより特に好ましい。

【００９５】 同様なアミノ酸の置換が、親水性に基づいて効率的になされ得ることもまた当
該分野において理解される。米国特許第４，５５４，１０１号（特に、本明細書
に参考として援用される）は、隣接するアミノ酸の親水性によって支配される、
タンパク質の最大局所平均親水性が、そのタンパク質の生物学的特性と相関する
と述べている。

【００９６】 米国特許第４，５５４，１０１号に詳述されるように、以下の親水性値がアミ
ノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）
；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（
＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（
０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．
５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．
３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）
；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトファン（−
３．４）。

【００９７】 アミノ酸は同様な親水性値を有する別のアミノ酸に置換され得、そして依然と
して生物学的に等価なタンパク質、特に免疫学的に等価なタンパク質を入手し得
ることが理解される。このような変更において、親水性値が±２以内であるアミ
ノ酸の置換が好ましく、親水性値が±１位内のアミノ酸の置換が特に好ましく、
そして親水性値が±０．５以内のアミノ酸がより特に好ましい。

【００９８】 上記のように、したがってアミノ酸置換は、一般に、アミノ酸側鎖置換基の相
対的類似性（例えば、疎水性、親水性、電荷、サイズなど）に基づく。前述の特
徴のいくつかを考慮する代表的な置換は、当該分野において周知であり、そして
以下を包含する：アルギニンおよびリジン；グルタミン酸およびアスパラギン酸
；セリンおよびスレオニン；グルタミンおよびアスパラギン；ならびにバリン、
ロイシンおよびイソロイシン。

【００９９】 （４．１７ ｍＲＮＡに標的化されたアンチセンスオリゴヌクレオチド） アンチセンス組成物は、宿主細胞において、タンパク質コード遺伝子配列の発
現を負に調節するように用いられ得る。遺伝子情報のフローの最終結果は、タン
パク質の合成である。ＤＮＡがポリメラーゼによりメッセンジャーＲＮＡに転写
され、そしてリボソーム上で翻訳されて折り畳まれた機能性タンパク質を生じる
。したがって、非常に複雑な反応セットのこの簡潔な記載からでさえ、タンパク
質合成が阻害され得る経路に沿っていくつかの工程が存在することが明らかであ
る。タンパク質をコードするネイティブのＤＮＡセグメントは、すべてのそのよ
うな哺乳動物ＤＮＡ鎖のように、２つの鎖を有している：水素結合によりくっつ
いているセンス鎖およびアンチセンス鎖。タンパク質をコードするメッセンジャ
ーＲＮＡは、ＤＮＡのチミジンがウリジンに置換されていることを除いて、セン
スＤＮＡ鎖と同じヌクレオチド配列を有する。したがって、アンチセンスヌクレ
オチド配列は、そのポリペプチドをコードするｍＲＮＡと結合し、そしてそのタ
ンパク質の生成を阻害する。

【０１００】 アンチセンスオリゴヌクレオチドをｍＲＮＡに結合させるような標的化は、タ
ンパク質合成を抑制する１つの方法である。例えば、ポリガラクツロナーゼおよ
びムスカリン２型アセチルコリンレセプターの合成は、それらのそれぞれのｍＲ
ＮＡ配列に向けられたアンチセンスオリゴヌクレオチドによって阻害される（米
国特許第５，７３９，１１９号および米国特許第５，７５９，８２９号、米国特
許第５，８０１，１５４号；米国特許第５，７８９，５７３号；米国特許第５，
７１８，７０９号；および米国特許第５，６１０，２８８号、特に、それぞれ本
明細書中にその全体を参考として援用する）。

【０１０１】 例示的な実施形態において、標的遺伝子または翻訳されたｍＲＮＡを認識しそ
して結合し、その結果デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の転写またはメッセンジャー
リボ核酸（ｍＲＮＡ）の翻訳を停止および／または阻害し得る相補的核酸配列で
あるアンチセンスオリゴヌクレオチドが調製され得る。これらのオリゴヌクレオ
チドは、通常には特定のｍＲＮＡを発現する宿種内で、このｍＲＮＡの発現を減
少させるかまたは阻害するように発現され得る。したがって、オリゴヌクレオチ
ドは、適切に形質転換された宿主細胞において、ポリペプチドのレベルを減少さ
せるために有用であり得る。

【０１０２】 オリゴヌクレオチドは、デオキシリボ核酸、リボ核酸、またはペプチド−核酸
を含み得る。特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも９個
、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個
、または少なくとも１４個から全長連続配列までの配列（全長連続配列を含む）
を含む。より長いアンチセンス分子が必要な場合、少なくとも１５個、少なくと
も１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、または少
なくとも２０個から全長連続配列までの配列（全長連続配列を含む）を含むオリ
ゴヌクレオチドを用い得る。このようなアンチセンス分子は、より長い連続ヌク
レオチド配列（例えば、約２１、約２２、約２３、約２４、約２６、約２７、約
２８、約２９または約３０程度の連続ヌクレオチドを含むもの）さえ含み得る。

【０１０３】 （４．１８ 定義） 本発明に従うと、核酸配列は、ＤＮＡ（ゲノムＤＮＡまたはゲノム外ＤＮＡを
含むがこれらに限定されない）、遺伝子、ＲＮＡ（ｍＲＮＡおよびｔＲＮＡを含
むがこれらに限定されない）、ヌクレオシド、およびネイティブな供給源から得
られたか、化学合成されたか、改変されたか、またはそうでなければ、ヒトの手
によって調製されたかのいずれかである適切な核酸セグメント、を含むがこれら
に限定されない。以下の用語および句は、以下に示される意味を有する。

【０１０４】 ａ、ａｎ：長期存続している特許法の条約に従うと、用語「ａ」および「ａｎ
」は、本出願（特許請求の範囲を含む）に使用される場合、「１以上」を示す。

【０１０５】 発現：ポリペプチドを生成するために、コーディングＤＮＡ分子（例えば、構
造遺伝子）が受ける細胞内プロセス（転写および翻訳を含む）の組合せ。

【０１０６】 プロモーター：構造遺伝子についての発現制御エレメントを提供し、そしてＲ
ＮＡポリメラーゼが特異的に結合し、かつその遺伝子のＲＮＡ合成（転写）を開
始する、ＤＮＡ配列またはＤＮＡ配列の群の認識部位。

【０１０７】 構造遺伝子：ポリペプチドを産生するために発現される遺伝子。

【０１０８】 形質転換：外因性ＤＮＡが染色体に組み込まれるかまたは自律的に複製し得る
細胞中に、外因性ＤＮＡ配列（例えば、ベクター、組換えＤＮＡ分子）を、導入
するプロセス。

【０１０９】 形質転換細胞：細胞のＤＮＡが、外因性ＤＮＡのその細胞中への導入によって
変更されている、細胞。

【０１１０】 ベクター：宿主細部中で複製し得るＤＮＡ分子、および／または結合したセグ
メントの複製をもたらすように、別のＤＮＡセグメントが、作動可能に連結され
得るＤＮＡ分子。プラスミドは、例示的なベクターである。

【０１１１】 本発明の例示的実施形態が、以下に記載される。明らかにする目的にて、実際
の実行の特徴すべてが、本明細書中に記載されるとは限らない。このような実際
の実施形態のいずれかの開発において、実行に特異的な多数の決断が、特定の目
的を達成するためになされなければならないことが、当然理解される。さらに、
このような開発の努力が、複雑でありかつ時間がかかり得るが、それにも拘らず
、本開示の恩恵を有する当業者にとっては、慣用的仕事であることが、理解され
る。

【０１１２】 （５．０ 実施例） 以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すために含まれる。以下の実
施例に開示される技術が、本発明の実施において十分に機能するように本発明者
により発見された技術を示すこと、従って、その実施のための好ましい様式を構
成すると見なされ得ることが、当業者により理解されるべきである。しかし、当
業者は、本開示を考慮して、多くの変更が、開示される特定の実施形態において
なされ得、そしてなお本発明の趣旨および範囲から逸脱せずに、類似の結果また
は同様の結果を入手し得ることを、理解すべきである。

【０１１３】 成体のマウスおよびヒトの脳から多様な幹細胞／前駆体細胞の集団を単離しそ
してそれらをインビトロで増殖するための方法；ならびに個々のクローンまたは
ニューロスフェアからｃＤＮＡライブラリーを作製する方法が、開発されている
。ニューロスフェアに類似する異なるコロニー様構造を生成する広範な他の（例
えば、造血）幹細胞／前駆体細胞を単離および培養するための培養アプローチ（
Ｓｃｈｅｆｆｅｒら、１９９９）を使用して、単一の組織分離物から多数のニュ
ーロスフェアを構成的に産生することが可能である。これらのニューロスフェア
は、互いに形態学的および生化学的に異なり、それにより、一定スペクトルまた
は範囲の差示的段階を示し、ならびに異なる幹細胞／前駆体細胞に由来する。

【０１１４】 （５．１．０ 実施例１−ミクロクローンの調製） （５．１．１ １型クローン） 成体ＩＣＲまたはトランスジェニックマウスまたは変異体マウス、あるいはヒ
ト側頭葉由来の生検標本（てんかん手術用）、あるいは死後有意な（少なくとも
１日の）間隔の脳標本を、分離物のための組織供給源として使用した。脳を、以
下のように分離および培養した。取り出した脳組織を、かみそりの刃で切り刻み
、そして氷冷ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地、種々の供給元から市販さ
れている）および抗生物質−抗真菌物質製品（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ
Ｃｏ．カタログ番号Ａ５９５５（ＩＣＯＸ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）；Ｇｉｂ
ｃｏ Ｂｒｌ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）の混合物中で洗浄した。脳片
を、０．２５％トリプシンおよびＥＤＴＡ（エチレンジアミンテトラ酢酸）を含
むビーカーに移し、そして磁気攪拌プレート上で１５分間混合し、プラスチック
ピペットで粉砕し、滅菌ガーゼを通して濾過し、そして１５ｍｌチューブに収集
し、１２００ｒｐｍで５分間遠心分離した。細胞を、ＤＭＥＭ／ＦＩ２培地＋Ｎ
Ｉ補充物（種々の供給元から入手可能な、標準的組織培養培地）＋５％ ＦＢＳ
（ウシ胎仔血清）中に再懸濁し、そして非接着基質（ポリ２−ヒドロキシエチル
メタクリレートでコートした、組織培養プラスチック；Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉ
ｃａｌｓ）上に高密度でプレーティングすることによって、懸濁培養物にて増殖
させた。遠心分離および新鮮な培地中での再懸濁によって、細胞に３〜４日後と
に給餌した。

【０１１５】 Ｉ型細胞を培養するための塩基性培地は、以下の成分を含む：インシュリン（
５μｇ／ｍＬ）、プトレシン（１００μＭ）、プロゲステロン（２０μｍ）、亜
セレン酸ナトリウム（３０μＭ）、下垂体抽出物（２０μｇ／ｍＬ）、トランス
フェリン（ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎｇ）（１００μｇ／ｍＬ）、およびＤＮＥＭ
／ＦＩ２培地中の５％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）。

【０１１６】 Ｉ型細胞は、非接着性基質（例えば、ポリ２−ヒドロキシエチルメタクリレー
ト）を含む懸濁培養物中にのみ現れる。いくつかのＩＩ型細胞もまた、これらの
培養物中に存在する。

【０１１７】 （５．１．２ ＩＩ型クローン） ＩＩ型クローンは、Ｉ型クローンと同様に、成体ＩＣＲマウス、トランスジェ
ニックマウスもしくは変異マウス、またはヒト側頭葉（てんかん手術のため）由
来の生検試料から得た。さらに、ＩＩ型クローンはまた、成体ヒト脳、および動
物が４℃に保たれた場合に長い死亡後の間隔を有する死亡した動物から生成した
。

【０１１８】 脳は、Ｉ型クローンの生成について先に記載されるように分離し、培養した。
手短には、取り出した脳組織をミンスし、洗浄し、そして０．２５％トリプシン
およびＥＤＴＡを含むビーカーに移した。マグネティックスターラープレートで
１５分間混合した後、培養物をプラスチックピペットで倍散し、滅菌ガーゼを通
して濾過し、遠心分離し、そしてＤＭＥＭ／Ｆ１２培地＋ＮＩ補充、＋５％ＦＢ
Ｓ、＋２０μｇ／ｍＬ下垂体抽出物（Ｇｉｂｃｏ）中に再懸濁し、そして高密度
で非接着性基質にプレートすることによって懸濁培養物中で増殖させた。

【０１１９】 細胞を、Ｉ型細胞について上記で記載したようにプレートし、そしてフィード
した。しかし、上記の塩基性培地（インシュリン（５μｇ／ｍＬ）、プトレシン
（１００μＭ）、プロゲステロン（２０μｍ）、亜セレン酸ナトリウム（３０μ
Ｍ）、下垂体抽出物（２０μｇ／ｍＬ）、トランスフェリン（ｔｒａｎｓｇｅｒ
ｒｉｎｇ）（１００μｇ／ｍＬ）、およびＤＮＥＭ／ＦＩ２培地中の５％ウシ胎
仔血清（ＦＣＳ）を含む）はまた、１０ｎｇ／ｍＬの塩基性線維芽細胞成長因子
（ｂＦＧＦ）、および１０ｎｇ／ｍＬの上皮成長因子（ＥＧＦ）を含む。重要な
ことには、この培養培地はさらに、ジスルフィド結合を減少させる接触制限因子
として１００μＭメルカプトエタノールを含む（Ｈｅｒｉｎｇｔｏｎ，１９８６
）。培養物は、１０〜１４日間、高密度な細片を含んだ。次いで、１０〜１４日
後、メルカプトエタノールをこの培地から除去した。ＩＩ型クローンは、これら
の培養物中に存在した。いくつかのＩＩＩ型クローンもまた存在した。

【０１２０】 （５．１．３ ＩＩＩ型クローン） Ｉ型クローンおよびＩＩ型クローンと同様に、ＩＩＩ型クローンは、成体ＩＣ
Ｒマウス、トランスジェニックマウスもしくは変異マウス、またはヒト側頭葉由
来の生検試料から得られたか、あるいは成体ヒト脳または動物が４℃に保たれた
場合は、長い死亡後の間隔を有する死亡した動物から得られた。脳供給源を分離
し、そして細胞を、接触阻害因子なし、または接触阻害因子（例えば、メルカプ
トエタノール）ありのいずれかの、上記の懸濁培養物中で増殖させた。ＩＩＩ型
細胞を培養するための塩基性培地は、ＩＩ型細胞を培養するために使用した培地
と同じであり；すなわち、その培地は、インシュリン（５μｇ／ｍＬ）、プトレ
シン（１００μＭ）、プロゲステロン（２０μｍ）、亜セレン酸ナトリウム（３
０μＭ）、下垂体抽出物（２０μｇ／ｍＬ）、トランスフェリン（ｔｒａｎｓｇ
ｅｒｒｉｎｇ）（１００μｇ／ｍＬ）、１０ｎｇ／ｍＬの塩基性線維芽細胞成長
因子（ｂＦＧＦ）、１０ｎｇ／ｍＬの上皮成長因子（ＥＧＦ）、およびＤＮＥＭ
／ＦＩ２培地中の５％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含んだ。細胞を、遠心分離によ
り３〜４日ごとにフィードし、そして新しい培地中に再懸濁させた。接触制限因
子の除去後、５〜７日後に、ＩＩ型クローンおよびＩＩＩ型クローンの両方が現
れた。ＩＩ型クローンは、接触制限因子の非存在下での連続的な培養の際に、最
終的にＩＩＩ型クローンに進化した。

【０１２１】 単に接触阻害因子を除去することで、細胞−細胞接触を促進することにより、
分化が促進される。しかし、ＩＩＩ型クローンのニューロンまたは神経膠への分
化はまた、他のさらなる因子（β−線維芽細胞成長因子、上皮成長因子のような
成長因子、または塩基性ＩＩＩ型培養培地中に存在する下垂体抽出物に含まれる
因子を含む）によって促進される。他の成長因子（例えば、脳由来の神経栄養性
因子（ＢＤＮＦ）、神経膠由来の神経栄養性因子（ＧＤＮＦ）、ＮＴ３、および
毛様体神経栄養性因子（ＣＮＴＦ）はまた、幹／前駆細胞の分化を促進し得る。

【０１２２】 以下の表は、異なる幹／前駆細胞型を得るための、種々の方法を要約する：

【０１２３】

【表２】 位相差顕微鏡試験を使用して、培養したニューロスフェアを、成熟度（分化）
の全体の指標に関連する４つのカテゴリーにまず分類した；初期Ｉ型（小さい、
段階的に暗い（ｐｈａｓｅ−ｄａｒｋ）スフェア）、後期Ｉ型（大きい、段階的
に暗い〜段階的に明るいスフェア）、初期ＩＩ型（中間サイズ、段階的に明るい
スフェア）、後期ＩＩ型またはＩＩＩ型（大きい、段階的に明るいスフェア）。
代表的なニューロスフェアは、従来の共焦点顕微鏡分析（Ｋｕｋｅｋｏｖら、１
９９７；ｋｕｋｅｋｏｖら、１９９９）を用いる、単一標識および二重標識プロ
トコルにおける使用のための、幹／前駆体、未成熟ニューロンおよび神経膠の存
在の確認についての標準的な免疫蛍光分析のために、培養された。免疫検出のた
めの抗体としては、以下が挙げられる：中間径フィラメントタンパク質、ネスチ
ン（ｎｅｓｔｉｎ）（幹／前駆体および未成熟神経細胞中に存在）、および反応
性アストロサイト（Ｍｃｋａｙ，１９９７）；モノクロナール抗体（Ｄｅｖｅｌ
ｏｐｍｅｎｔａｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｂａｎｋ，Ｉｏｗａ Ｃｉｔｙ，Ｉｏ
ｗａ）；ビメンチン、未成熟アストロサイト中間径フィラメントタンパク質（Ｄ
ｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｂａｎｋ）；アストロサイト
中間タンパク質、神経膠線維状酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）；稀突起膠細胞（例
えば、０２Ａ前駆体）を認識するＡ２Ｂ５；未成熟稀突起膠細胞を認識する０４
抗体（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｂａｎｋ）；若いニ
ューロン（ｎｅｕｔｒｏｎ）成熟ニューロン上のＬ１接着分子に対する抗体（Ｋ
ｕｋｅｋｏｖら、１９９９の図３Ｈを参照のこと）；ならびにニューロンのβ−
ＩＩＩチューブリンアイソフォーム（モノクロナール抗体、Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．
Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）。

【０１２４】 図１は、ｃＤＮＡプールおよびミクロアレイ産生ための供給源として使用した
個々の成体ヒト脳ミクロクローンの、光学顕微鏡写真および電子顕微鏡写真を示
す。図中の挿入図は、単一の成体脳ミクロクローンの、逆光学顕微鏡をとおして
位相光学を用いた、顕微鏡写真である。この光学顕微鏡写真は、輪状の構造に密
接に密集した、多くの細胞型を示す。このようなミクロクローンに存在する数千
個までの細胞が存在し、これらの細胞は、ミクロクローンの多分化能を示す異な
る形態を示す。

【０１２５】 （５．２．０ 実施例２：ｃＤＮＡライブラリーの調製） ＲＮＡ調製物の収量および品質を最大化するために、特定の出発材料について
適切な方法を開発した。少量のｍＲＮＡを、ＰＣＲの感度と逆転写を用いたｃＤ
ＮＡの特異的生成とを組み合わせることによって測定し得る。しかし、インタク
トなＲＮＡの抽出に必要な時間は、しばしば、ＲＴ−ＰＣＲ手順自体に関与する
時間を超過し、そしていくらかのＲＮＡの損失を生じ得る。ＲＮＡ単離なしにＲ
Ｔ−ＰＣＲを利用する確立されたプロトコルがいくつか存在する（Ｋｌｅｂｅら
、１９９６）。

【０１２６】 各脳細胞ミクロクローンは、幹細胞、前駆体細胞および子孫細胞を含み、これ
らは、ニューロン、星状細胞および稀突起膠細胞を生じる。これらの細胞は、非
常に密な細胞外マトリクス中に包埋されている（Ｋｕｋｅｋｏｖら、１９９７）
。これらのマトリクスは、物質の損失無しに従来の方法を用いて破壊することが
困難である。ＲＮＡ単離を伴わないＲＴ−ＰＣＲを利用する多数のプロトコルが
報告されており、そしてこれらのアプローチに伴う利点および欠点が議論されて
いる（Ｓｕｓｌｏｖら、２０００）。他方で、超音波を使用した異なる供給源か
らのＲＮＡの放出のためのいくつかの方法が記載されているが、これらのすべて
は、ＲＮＡ単離のためのさらなる工程を含んでいる。改善されたプロトコルにお
いて、両方のアプローチの利点が組み合わせられた。価値のあるヒト脳検体から
のニューロスフェアの生成が困難であり得、時間がかかり得、そしてこれらの大
多数のクローンを常に得るとは限らないことから、以下の実施例に記載される改
変は、ｍＲＮＡ抽出なしに単一のニューロスフェアからｍＲＮＡを単離および検
出するための迅速で、信頼性が高く、かつ、高感度の方法を提供するように開発
された。

【０１２７】 （５．２．１ ミクロクローンからのｃＤＮＡプール） ＲＴ−ＰＣＲアッセイを、ＲＮＡ単離に関与する時間のかかる手順を除去する
ことによってストリームライン化した。操作を、１つの管において実施し、そし
て増幅したｃＤＮＡを少数の細胞から利用可能なＲＮＡから生成した。ニューロ
スフェアにおける種々の遺伝子についてのｍＲＮＡ転写物、およびニューロスフ
ェアにおける単一の細胞さえもの検出を、極少量の超音波処理物を用いて可能に
した。

【０１２８】 各ニューロスフェアは、新規に生成されたニューロン、星状細胞および稀突起
膠細胞を生じ得る少なくとも５０〜４００幹細胞／子孫細胞を含み、そしてこれ
らの細胞は、極度に密な細胞外マトリクス中に包埋される（Ｋｕｋｅｋｏｖら、
１９９７；Ｋｕｋｅｋｏｖら、１９９９）。これらは、物質を欠失することなく
、従来の方法によってニューロスフェアを破壊することを困難にする。

【０１２９】 単一のニューロスフェア（多細胞性の球状構造として位相顕微鏡において同定
された）は、各々、フィルターチップつきマイクロピペットを用いて０．５μｌ
の容量で収集された。次いで、単一のニューロスフェアを、１０μｌの、５μｌ
のＲＮアーゼインヒビター（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｉｅｓ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）を含み、ＲＮアーゼを含まな
い水へと移した。ニューロスフェアを、５秒間、パワー４、チューン２でＭｉｃ
ｒｏｔｉｐ Ｓｏｎｉｃａｔｏｒ （Ｋｏｎｔｅｓ， Ｖｉｎｅｌａｎｄ， Ｎ
Ｊ）を用いて液体表面に緩和に接触させることによって超音波処理した。その管
は、超音波処理の前および後で氷上に維持した。温度を、超音波処理中、デジタ
ルミニ温度計ＨＨ８１（Ｏｍｅｇａ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｇｉｎｇ Ｉｎｃ．，Ｓ
ｔａｍｆｏｒｄ、ＣＴ）を用いて試験管中で測定した。超音波処理のための最適
な時間範囲を、４〜１０秒間へと定めた。なぜなら、温度は、１０秒間で５５℃
まで上昇したからである。ＲＮＡが完全に放出されることを確実にするために４
秒未満使用することは薦められない。しかし、１０秒を超えるものも薦められな
い。なぜなら、より長い時間は、ＲＮアーゼインヒビター活性を減少させるから
である。多数のサンプルで作業するとき、その超音波処理マイクロチップは、一
連の溶液（１Ｍ ＨＣＩ， １Ｍ ＮａＯＨ， １Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ， ｐ
Ｈ ７．５，氷上で二連蒸留した Ｈ₂０）中でリンスして、交叉汚染を避け、
そしてそのマイクロチップを冷却すべきだからである。ニューロスフェアを、０
．５ｍｌの管へと移した。そしてその管を液体窒素中で瞬間（ｓｎａｐ）凍結し
、次いで３７℃の水浴中で融解する。この手順を３回繰り返した。

【０１３０】 （５．２．３ ｃＤＮＡの第一鎖の合成） ＳＭＡＲＴ ｃＤＮＡ合成技術 （ＣＬＯＮＴＥＣＨ）をｃＤＮＡの第一鎖の
合成のためにいくつかの改変とともに用いた。改変されたオリゴ（ｄＴ）プライ
マー（ＳＤＳ）を用いて、Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈにより記載される一般的な手順を
用いてこの第一鎖合成反応をプライム刺激した。得られた全長の一本鎖ｃＤＮＡ
は、そのｍＲＮＡの完全な５’末端およびＳＭＡＲＴオリゴヌクレオチドに対し
て相補的な配列を含んでいた。ＳＭＡＲＴアンカー配列およびポリＡ配列は、Ｓ
ＭＡＲＴ ＰＣＲ^TMプライマーを用いた末端対末端のｃＤＮＡ増幅のための汎用
プライミング部位として機能した。ＳＭＡＲＴアンカー配列がＰＣＲ^TMに必要で
あることから、不完全ＲＴ活性から生じ、ゲノムＤＮＡおよびポリＡ ＲＮＡか
ら転写されたｃＤＮＡを混入する、未熟に終結したｃＤＮＡは、指数関数的には
増幅しない。

【０１３１】 各反応のために、２μｌの１０μＭのＳＤＳプライマーおよび２μｌの１０μ
ＭのＳＤＳオリゴヌクレオチドを１０μｌの単一ニューロスフェア超音波処理物
に添加した。この管を、２分間７２℃でインキュベートし、次いで氷上で冷却し
た。次いでこの産物を、２つの管中で７μｌのアリコートへと分割した。この第
一の鎖の緩衝液（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、 ｐＨ
８．３；３７．５ｍＭ ＫＣＩ；１．５ｍＭ ＭｇＣｌ₂）、１ｍＭ ｄＮＴ
Ｐ （ＣＬＯＮＴＥＣＨ）、３ｍＭ ＭｇＣ１₂（Ｓｉｇｍａ），５Ｕ ＲＮア
ーゼインヒビター（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を、各管に加えた（すべての濃度は最
終濃度である）。反応の総容量は、各管中で２μｌであった。両方の管は、４２
℃で５分間インキュベートした。次いで、１μｌのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ （
Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を加え、そして管を４２℃でさらに１時間インキュベート
した。

【０１３２】 両方の管からの内容物を、１００μｌの１×ＴＥを添加したときに新たな管へ
と移し、そして７０℃で１５分間インキュベートした。

【０１３３】 第一鎖のｃＤＮＡプールを用いて、Ａｄｖａｎｔａｇｅ ２ ＰＣＲ^TM Ｅｎ
ｚｙｍｅ Ｓｙｓｔｅｍ （ＣＬＯＮＴＥＣＨ） および ＳＭＡＲＴ ＰＣＲ ^TM プライマーを使用してＬＤ（長距離）増幅を行った。この反応混合物を、以
下のとおりに調製した：１×緩衝液（４０ｍＭ トリシン−ＫＯＨ （ｐＨ ９
．２）、１５ ｍＭ ＫＯＡｃ、３．５ｍＭ Ｍｇ（ＯＡｃ）₂， ３．７５μ
ｇ／ｍｌ ＢＳＡ、０．００５％ Ｔｗｅｅｎ−２０（登録商標）、０．００５
％ Ｎｏｎｉｄｅｔ−Ｐ４０（登録商標））； ０．５ｍＭ ｄＮＴＰ、０．５
ｍＭ ＳＭＡＲＴ ＰＣＲプライマー、ならびに１×Ａｄｖａｎｔａｇｅ ２
Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ。ＭＪＲ ＰＣＲ装置を用いて、以下のパラメーターを用
いて増幅した：９５℃で１分間；（９５℃で１５秒環、６５℃で３０秒間）を１
８−２６サイクル、６８℃で６分間。サイクル数は、各ニューロスフェアについ
て個々に最適化した。

【０１３４】 これらの手順の使用は、ＲＮＡ単離に関与する時間のかかる手順を除去するこ
とによってＲＴ−ＰＣＲアッセイをストリームライン化する。すべての操作を、
１つの管中で行った。そして、増幅したｃＤＮＡを、少数の細胞から入手可能な
すべてのＲＮＡから生成した。さらに、このＲＮＡは、高度の純度を有していた
。種々の遺伝子について、極少量の超音波処理物を用いて、ニューロスフェアか
ら、またはニューロスフェア内の単一細胞からでさえ、ｍＲＮＡ転写物を検出す
ることが可能であった。

【０１３５】 （５．２．４ サブトラクティブライブラリー調製物） ２つのｃＤＮＡライブラリーを順方向および逆方向のサブトラクション（ｓｕ
ｂｔｒａｃｔｉｏｎ）に用いた。順方向のサブトラクションについて、第一のラ
イブラリーはテスター（ｔｅｓｔｅｒ）であって、そして第二のものはドライバ
ー（ｄｒｉｖｅｒ）であった。逆方向のサブトラクションについて、第二のｃＤ
ＮＡライブラリーはテスターであって、そして第一のものがドライバーであった
。テスターおよびドライバーのｃＤＮＡは、ＲｓａＩで消化した。ＲｓａＩは、
４塩基切断制限酵素であって、平滑末端を生じる。次いで、テスターｃＤＮＡを
２つの等量のアリコートへと再分割し、そして各アリコートを、異なるｃＤＮＡ
アダプターへと連結した。このアダプターは、同一の配列のストレッチを有して
、一旦切断された末端が充填されるとＰＣＲ^TMプライマーのアニーリングを可能
にする。

【０１３６】 次いで、２つのハイブリダイゼーションを行った。まず、過剰のドライバーを
テスターの各サンプルへと加えた。次いで、このサンプルを熱変性し、そしてア
ニールさせた。第二のハイブリダイゼーションにおいて、２つのプライマーハイ
ブリダイゼーションサンプルを、変性することなくともに混合し、そして新鮮に
変性させたドライバーｃＤＮＡを加える。ＤＮＡポリメラーゼによって末端を充
填させた後、差示的に発現されたテスター配列は、その５’末端および３’末端
におけるネスティドプライマーにつうて異なるアニーリング部位を有した。次い
で、分子の集団全体をＰＣＲ^TMにかけて所望の差示的に発現される配列を増幅し
た。次に、二次ＰＣＲ^TM増幅をネスティドプライマーを用いて行って、任意の背
景ＰＣＲ^TM産物を減少させ、そして差示的に発現される配列についての集団を富
化した。

【０１３７】 サブトラクティブライブラリーの調製前に、ある集団の全長ｃＤＮＡライブラ
リーをハウスキーピング遺伝子、細胞表現型遺伝子、および発生段階遺伝子の代
表的なセットの発現についてスクリーニングし、そしてニューロスフェアの「成
熟」の程度に従って配置した（表３および表４を参照のこと）。表４に記載され
るように、２つの隣接するライブラリーを、サブトラクションのために選択した
。これらのライブラリーを、ＳＭＡＲＴアプローチを用いて増幅し、そしてこれ
は、各ニューロスフェアについて２４サイクルを用いて、１０管を用いたＬＤ増
幅のための１００μｌのテンプレートを生成した。２つの管を、さらなる適用の
ために維持し、そして８管をサブトラクションのために使用した。テスターおよ
びドライバーのｃＤＮＡを、１／１０容量の酢酸ナトリウムおよび２．５容量の
エタノールおよび２０μｇのＤＮアーゼ処置したｔＲＮＡ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ
）を用いてエタノール沈降させた。このテンプレートを、Ａｍｉｃｏｎ−１０濃
縮器を製造業者の指示に従って用いて精製することによって濃縮した。ｃＤＮＡ
を、６０ユニットのＲｓａＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅ
ｖｅｒｌｙ，ＭＡ）による３７℃での一晩の消化に供した。この消化混合物を精
製し、そしてＡｍｉｃｏｎ−１０濃縮器で濃縮した。テスターｃＤＮＡを、２つ
のアリコートへと再分割し、そして２０００ユニットのリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎ
ｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて１０μｌの容量中で１６℃で２０時間異
なるアダプターと連結した。このサンプルを、７２℃で５分間加熱してそのリガ
ーゼを不活化した。第一のハイブリダイゼーションを４μｌの容量中で４０×過
剰のドライバーを用いて行った。そのサンプルに、１滴の鉱油を重層し、そして
これを、１．５分間９８℃でサーマルサイクラー中でインキュベートし、そして
次いで１０時間６８℃でインキュベートした。

【０１３８】 第二のハイブリダイゼーションについて、第一のハイブリダイゼーションから
の異なるアダプターを有する２つのサンプルを、ともに混合し、そして新鮮な１
０×過剰のドライバーｃＤＮＡを添加した。この反応管を、６８℃で一晩インキ
ュベートし、次いで−２０℃で維持した。ＰＣＲ^TM増幅のために、Ａｄｖａｎｔ
ａｇｅ ２ ＰＣＲ^TM Ｅｎｚｙｍｅ Ｓｙｓｔｅｍ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を使
用した。このテンプレートを２０倍に希釈し、そして１μｌを、ＰＣＲ^TM Ｐｒ
ｉｍｅｒ１（１０μＭ）を用いた増幅のために用いた。次いで、３０サイクルの
サーマルサイクリングを行った。

【０１３９】 第二の増幅について、第一のＬＤ ＰＣＲ^TMからの１μｌのテンプレートを以
下の２つのプライマーとともに使用した：ネスティドＰＣＲ^TMプライマー１（１
０μＭ）およびネスティドＰＣＲ^TMプライマー２Ｒ（１０μＭ）で１５サイクル
。この産物をＴ／Ａクローニングベクター中へと挿入した。細菌を形質転換し、
そして９６の陽性クローンをさらなる分析のために選択した。クローンを、差示
的転写物としてのｃＤＮＡ挿入物の存在について試験し、そして配列決定した。
配列決定の結果を、ＧｅｎＢａｎｋに存在する公知の配列と比較し、そして反復
アルゴリズムの底に示されるように（図４）、所定の集団からのｃＤＮＡのすべ
てをスクリーニングした。さらなる反復を行った。図４を参照のこと。

【０１４０】 特定の神経芽表現型および神経表現型のマーカーであるＧＦＡＰ、ネスティン
、およびテナシンの予備的研究におけるのｍＲＮＡ発現の検出（Ｋｕｋｅｋｏｖ
ら、１９９７； Ｓｔｅｉｎｄｌｅｒら、１９９８）は、Ｔｏｕｃｈ Ｄｏｗｎ
（ＴＤ）−ＰＣＲを用いて「ネスティド」プライマーを用いた。ネスティドプ
ライマーを用いて非特異的増幅を除去した。ぷらいまーを、プログラムＯｌｉｇ
ｏ５．１を用いて作製し、そしてＧｉｂｃｏ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉ
ｅｓ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＮＭ）から入手した。

【０１４１】 次いで、ＰＣＲ産物を分析した。エチジウムブロミドを含む２％アガロースゲ
ルを用いて、種々の細胞表現型および発生遺伝子についての個体対成体脳ミクロ
クローンからの遺伝子転写物を可視化した。ｃＤＮＡライブラリー生成の後、個
体のミクロクローンからのｃＤＮＡを、次の分析のために凍結保存した。これら
を使用して、ガラス支持体またはナイロン支持体における次のプレートに従うマ
イクロアレイを開発した。

【０１４２】 （５．３．０：実施例３−マイクロアレイパネル） マイクロアレイを、ｃＤＮＡフラグメントを用いて作製し得る。そして、これ
らのフラグメントは、多数の遺伝子のスクリーニングを可能にする（潜在的に１
ミクロクローンあたり数千〜数十万（ｔｈｏｕｓａｎｄｓ）まで）。これは、個
体のミクロクローンの細胞表現型ならびに発生状態および分化状態を規定する。

【０１４３】 脳組織を記載されるように解離し、そしてメチルセルロース上へプレートした
（Ｋｕｋｅｋｏｖら、１９９７； Ｋｕｋｅｋｏｖら、１９９９）。ｃＤＮＡ
ライブラリーをニューロスフェアから調製し、そして以下に記載するような反復
アルゴリズムに従って試験した。このアルゴリズムは、個々のニューロスフェア
からのｃＤＮＡライブラリーが各ニューロスフェアの成熟の状態に従ってパネル
へと配置されることを可能にする。

【０１４４】 ｃＤＮＡライブラリーの隣接対の比較は、隣接するニューロスフェアの間の遺
伝子発現の相違を反映する差示的転写物の認識を生じる。次いで、これらの転写
物（代表的なｃＤＮＡフラグメントを含む）を、ＤＮＡマイクロアレイとして異
なるマイクロチップ上へとプレートし得る。これらのマイクロアレイは、神経発
生の間の異なる遺伝子の発現の連続的発現を反映するように作製される。本発明
者らは、そのマイクロアレイにおけるハイブリダイゼーションの後、任意のｃＤ
ＮＡライブラリーのスクリーニングのために使用され得ることを意図する。

【０１４５】 マイクロアレイ生成の後に、遺伝子転写物を無作為パターンでプレートし、そ
してアレイを順序づける（ｏｒｄｅｒ）するためにアルゴリズムを用いて繰り返
しスクリーニングし、そして機能的に有意な様式で遺伝子発現を決定する。発生
遺伝子発現および細胞表現型遺伝子発現のこの規定されたパターンは、単一の発
生的に異なるミクロクローン内で発現する。本発明者らは、個々の異なるミクロ
クローン内の遺伝子発現のパターンが確認され得、かつオリゴヌクレオチドプロ
ーブまたはリボプローブ（ｒｉｂｏｐｒｏｂｅ）の生成後に、ミクロクローン自
体に対する分析およびインサイチュハイブリダイゼーションまたはＲＴ−ＰＣＲ
インサイチュハイブリダイゼーションにおけるそれらの適用に拡張され得ること
を意図する。

【０１４６】 図２は、ｃＤＮＡマイクロアレイプールの神経遺伝子発見のための方法および
適用についてのフローチャートを示す。脳組織を解離し、そして上記のようにメ
チルセルロースにプレートした。ｃＤＮＡプールをミクロクローンから調製し、
そして図４に示した反復アルゴリズムに従って試験した。このアルゴリズムを使
用して、個々のミクロクローン由来のｃＤＮＡプールを各ミクロクローンの成熟
状態に従ったパネルに配置するために必要な情報を提供する。各パネル由来のｃ
ＤＮＡプールの隣接する対の比較は、異なる転写物の認識を生じ、これは、隣接
するマイクロスフェア間の遺伝子発現における差異を反映する。これらの転写物
は、ＤＮＡマイクロアレイとして、異なるマイクロチップ上にプレートされた場
合の代表的なｃＤＮＡフラグメントを含む。これらのマイクロアレイを作製して
、神経発生の間の異なる遺伝子の逐次的発現を反映させる。それらを、マイクロ
アレイに対するハイブリダイゼーションの後に、任意のｃＤＮＡライブラリーの
スクリーニングのためにに使用し得る。

【０１４７】 （５．３．１：時間経過順の（ｔｅｍｐｏｒａｌ）マイクロチップアレイ） マイクロチップアレイアプローチを、ｃＤＮＡライブラリーの進行中のスクリ
ーニングから生成し得る。しかし、本発明のミクロクローンｃＤＮＡプールのパ
ネルから作製したアレイは、これまでに記載されたアレイとは全く異なる。脳細
胞ミクロクローンに由来するｃＤＮＡライブラリーのパネルは、神経発生に関与
する全ての遺伝子のみなず、遺伝子発現の時間経過順パターンのプロフィールま
でも含む。他の記載されたアレイは、一次元であり；それらは、この時間経過順
の情報を含まない。従って、既存のアレイと本発明より提供されたアレイとの間
の差異は、一枚のスナップ写真と映画との間の差異に似ている。記載されたパネ
ルおよび方法は、遺伝子発現に対する逐次的な情報を提供する。ハイスループッ
ト分析を任意の所定のアレイに存在する遺伝子の配列および遺伝子の時間経過順
発現パターンに適用し得る。

【０１４８】 （５．３．２：脳ミクロクローン由来の遺伝子転写物比較） マイクロアレイを種々の脳ミクロクローンから作製し得る。図３は、単一ミク
ロクローン（図Ａ〜Ｆ） 対 マルチプルミクロクローン（図Ｇ〜Ｊ）から生成
したＲＴ−ＰＣＲ産物の代表的なサンプルを示す。アガロースゲルの顕微鏡写真
は、個々の脳ミクロクローンおよび脳ミクロクローンの集団において発現した種
々の神経マーカー、神経膠マーカーおよび発生マーカーについての遺伝子転写物
の存在を示す。レーンＡ〜Ｊ（図３）のいずれの側も、ＤＮＡラダーである。転
写物は、以下のとおりである：Ａ：β−アクチン；Ｂ：ＧＦＡＰ；Ｃ：テネイシ
ン（ネスト化（ｎｅｓｔｅｄ）プライマー）；Ｄ：ネスチン（ｎｅｓｔｉｎ）（
ネスト化プライマー）；Ｅ：神経フィラメント−ｍ；Ｆ：ＨｕＤ（ニューロンお
よびニューロン前駆体マーカー）；Ｇ：β−アクチン；Ｈ：テネイシン；Ｉ：Ｇ
ＦＡＰ（ネスト化プライマー）、およびＪ：ネスチン（ネスト化プライマー）。

【０１４９】 単一のミクロクローンは、ミクロクローンの集団によっても発現される遺伝子
の組合わせを発現する。以前の研究により、ニューロスフェアの集団からの遺伝
子発現が報告された；いまや、個々のミクロクローンにおける特異的遺伝子発現
を検出する能力が初めて実証された。

【０１５０】 ミクロクローンの集団に対して個々のミクロクローンを比較することに加えて
、個々の異なるミクロクローン由来の２つ以上のｃＤＮＡライブラリーもまた比
較し得る。この型の比較は、これらのミクロクローン間の差示的な転写物（例え
ば、全長ｃＤＮＡ、または差示的に発現された遺伝子の産物であるｃＤＮＡフラ
グメント）の同定をもたらす。

【０１５１】 （５．４．１：実施例４−ｃＤＮＡプールの時間経過順配置） 本発明は、抑制差し引きハイブリダイゼーション（ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ
ｓｕｂｓｔｒａｃｔｉｖｅ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）（ＳＳＨ）を利用し
て、クローンにまたがる異なる遺伝子発現パターンを確認し、そして新規の転写
物を同定する。ミクロクローンにまたがって変化する遺伝子発現を用いて、遺伝
子発現における時間経過順の変動を決定し得る。他の差示的方法としては、酵素
分解差し引き（ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｄｅｇｒａｄｉｎｇ ｓｕｂｔｒａｃｔｉ
ｏｎ）（ＥＤＳ，Ｚｅｎｇら、１９９４）および代表的な差示的分析（ＲＤＡ）
が挙げられ、これらの方法はまた、マイクロアレイの差示的遺伝子発現研究にお
いて有用である。開示されたパネルのアレイおよび方法を使用することにより、
脳細胞の異なる集団内またはそれにまたがる遺伝子発現における変化を特徴付け
ることが可能である。

【０１５２】 反復プロセス（図４を参照のこと）と組合わせたマイクロアレイの使用は、数
千の遺伝子フラグメントの同時スクリーニングのための迅速かつ信頼性のある方
法を提供する。

【０１５３】 （５．４．２遺伝子発現の反復的な順序付け） ｃＤＮＡプールの順序付られた配置を作製するために使用されるアルゴリズム
の概略的な図が図４に示される。このアルゴリズムの適用は、任意の順序付けの
機能様式（「ｉ＝１」）で配置されないｃＤＮＡプールのパネルで始まる。第１
工程は、別の転写物の存在または非存在を決定するために、差示的な分析を使用
して、第１の対のプールを比較する工程である。差示的な転写物が見出されない
場合、次の対のプールの比較が開始する。例えば、第２のプールは、「ｉ＝１」
を「ｉ＝ｉ＋１」に置き換え、「ｍ_i」および「ｍ_i+1」（ｍは特定のプールであ
る）を導くアルゴリズムの最初に戻すことによって第３のプールと比較される。

【０１５４】 差示的転写物が見出される場合、それらは配列決定され、そしてその配列を、
Ｄａｔａ Ｂａｎｋ内の公開された配列と比較する。これらの配列が公知の配列
に属する場合、これらはＤａｔａ Ｂａｎｋからの名称をつけられる。これらが
新規の配列である場合、プライマーがこれらの配列に対して作製され、どのプー
ルにおいてこれらの遺伝子が発現されたかを決定するために、これらのプライマ
ーを使用してこのパネルでスクリーニングがなされる。次いで、パネル内のプー
ルの順序が、クラスター分析アルゴリズム（ＣＬＵＳＴＥＲ、ＳＡＳ Ｍｕｌｔ
ｉｖａｒｉａｔｅ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ Ｐａｃｋａｇｅ）を使用して特定の
遺伝子転写物の最初の出現に従って配置される。一旦、発現のこの配列的／時間
的順序内に配置されると、プールは、再び、同じアルゴリズム（「ｓｔａｒｔ」
）に供され得る。このアルゴリズムは、「ｉ」が特定のパネルのプールの数（「
ｉ＝ｉ_max」）およびスクリーニングの「ｅｎｄ」に等しくなるまで、反復的に
繰り返される。この収率は、神経形態発生の最初期の段階からほとんど成熟する
までの神経発生の任意の所定の段階に間に存在する差示的な転写物である。神経
形成の異なる段階（例えば、未分化な幹細胞／前駆体細胞から最終的に差示的な
細胞への進行）において、遺伝子の差示カスケード（クラスター）が発現される
。

【０１５５】 図４において、段階１（「ｉ＝１」）は、最初期の幹細胞／前駆体細胞を表し
、そして中間段階は、それらの成熟の異なる段階での前駆体を表す。段階「ｎ」
（「ｉ＝ｉ_max」）は、ニューロンまたは神経膠を含む、最終的に分化した細胞
モルフォタイプを表す。

【０１５６】 それぞれのニューロスフェアが単一の幹細胞（またはＳＦＣ）から生じると推
定される（Ｓｃｈｅｆｆｌｅｒら、１９９９）。幹細胞増殖の間、これらは、非
対称な分裂を行い、１つのコピーの「母」細胞ならびに少しの多能性前駆体細胞
の発生を生じる。前駆体細胞は、細胞間シグナリングおよび増殖培地からの外因
性のシグナルが原因で、それらの「親」よりも制限された子孫を産生する。この
プロセスは、数回繰り返され、それぞれのときに、より「成熟した」モルフォタ
イプを産生し、結果的に、最終的に分化した細胞を産生する。従って、各ニュー
ロスフェアは、幹細胞から、発生の種々の段階のより制限された前駆体細胞に、
そしてある場合には、最終的に分化した細胞に渡る範囲の細胞混合物からなる。
図４は、ニューロスフェアの成熟のプロセスの間の遺伝子発現のパターンの図式
化である。

【０１５７】 図４において、段階１は、発生の最初期段階におけるニューロスフェアの遺伝
子発現を表し、再び、幹細胞のみからなる。段階２（「順序の再配列」の後の第
２の反復（ここで、１つが「ｉ＝１」に戻る））およびニューロスフェア成熟の
差示的段階の間の代表的な遺伝子発現パターン。このモデルに従って、非同期増
殖および細胞の分化に起因して、ニューロスフェアの集団は、ほとんど未成熟か
ら最終的に分化した細胞（例えば、ニューロンおよび神経膠）の範囲の多様なタ
イプのニューロスフェアを含まなければならない。この仮説を試験するために、
ヒトニューロスフィアの３０サンプルを、単一の集団からランダムに選択し、ｃ
ＤＮＡライブラリーを各ニューロスフェアから調製し、そしてそれぞれをＲＴ−
ＰＣＲ^TMによる多数の差示的マーカーの発現のために分析した。分析の結果を表
３に示す。

【０１５８】

【表３】 表３は、ハウスキーピング遺伝子、細胞表現型遺伝子および発生遺伝子の代表
的なセットに対する３０ヒトニューロスフェアｃＤＮＡライブラリーのスクリー
ニングからの結果を示す（この実施例において９個の異なる遺伝子：ｂ−アクチ
ン、ｂ−２−ミクログロブリン、ハウスキーピング遺伝子；ＮＳＥ、ニューロン
特異的エノラーゼ、ニューロン表現型マーカー；Ｐａｘ−６、発生のマーカーと
して使用される１対のボックス遺伝子；テネイシン（ｔｅｎａｓｃｉｎ）、神経
発達の間に発現される細胞外マトリックスタンパク質；ＧＦＡＰ、神経膠原線維
酸性タンパク質、細胞骨格中間フィラメントタンパク質、アストロサイトの表現
型マーカー；ＮＦ−Ｍ、神経フィラメント−Ｍ、ニューロンの細胞骨格マーカー
；ネスチン（ｎｅｓｔｉｎ）、神経膠および幹／前駆体細胞の中間フィラメント
マーカー；およびＭＡＰ２、微小管関連タンパク質２、ニューロンの細胞骨格マ
ーカー）。このパネルにおけるｃＤＮＡライブラリーは、代表的ニューロスフェ
アの大きさおよび推定の成熟度（逆相顕微鏡を使用して決定されるような、初期
タイプＩから後期タイプＩＩまたはタイプＩＩＩ）に従って配置される。

【０１５９】 このアルゴリズムは、いかなる規則的な機能的な様式においても配置されない
ｃＤＮＡライブラリーのパネルで開始する。（反復１）：このアルゴリズムの第
一段階において、１および２の番号を有するｃＤＮＡライブラリーを、差示的な
転写物に関して比較する（「ｉ＝１」）。差示的な転写物が何も見出されない場
合には、次の対のライブラリーの比較を開始する；すなわち、第二のものと第三
のものとを比較し、そして「ｉ＝１」を「ｉ＝ｉ＋１」で置換してこのアルゴリ
ズムの始めに戻り、「ｍ_i」および「ｍ_i+1」（ここで、「ｍ」は特定のライブラ
リーである）に導く。差示的な転写物が見出される場合には、これらをベクター
にクローニングし、細菌を形質転換し、精製した転写物を配列決定し、そして配
列を、データベースＥＭＢＬ、ＧｅｎＢａｎｋ ＰＤＰおよびＳＷＩＳＳＰＲＯ
Ｔにおいて公開された配列と、ＢｌａｓｔＮ／Ｘソフトウェアパッケージを用い
て比較する。比較後、これらの配列が公知の遺伝子に属する場合には、これらを
Ｄａｔａ Ｂａｎｋからそのように名付ける。転写物がＤａｔａ Ｂａｎｋ中に
見出されない場合には、これらは新たな遺伝子発見の候補であり、さらに研究し
得る。

【０１６０】 このアルゴリズムのこの工程において発見される差示的な転写物は、各転写物
に対して合成されたプライマーを用いるＲＴ−ＰＣＲ^TMによるか、またはドット
プロッティングによる、ｃＤＮＡパネルのスクリーニングのために使用される。
このスクリーニングの結果に従って、このパネル内のｃＤＮＡライブラリーの順
序を、クラスター分析の任意の公知のアルゴリズムを用いる、階層的クラスター
分析手順により、再配置する。一旦、発現の連続的／時間的順序で再配置される
と、このパネルは（反復２）に供され得、ここで、同じ工程が、再配置されたパ
ネルにおいて実行される。このアルゴリズムは、ｉ＝ｉ_maxまで反復を繰り返す
。ここで、ｉ_maxは、このパネル内のｃＤＮＡライブラリーの数に等しい。この
アルゴリズムは、ニューロスフェアの代表的なセットにおいて発現される全ての
遺伝子が発見され、そして全てのｃＤＮＡライブラリーがそれらの「成熟度」に
従って配置されるような様式で、設計され、これは、ニューロスフェア分化の間
の遺伝子発現の配列を明瞭にする（神経原性モデル）。

【０１６１】 表３からのｃＤＮＡライブラリーのパネルをモデルとして使用して、ニューロ
スフェア「成熟度」の程度に従うパネルの再配置に対するクラスター分析の適用
可能性を試験した。ＣＬＵＳＴＥＲ手順（ＳＡＳ Ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅ
Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ Ｐａｃｋａｇｅ）を、階層的分析のために使用した。こ
の結果を表４に示す。

【０１６２】

【表４】 表４は、９の異なる遺伝子の出現に従って再配置した、表３に示すものと同じ
ニューロスフェアパネルを示す。このパネルに存在するニューロスフェアの多様
性は、この表の左側（ここに、９の遺伝子がいずれも発現されないニューロスフ
ェアの例が存在する）からこの表の右側（ここに、９の遺伝子全てが発現したニ
ューロスフェアの例が存在する）への転写発現の変動により反映される。実験デ
ータから、ニューロン遺伝子が、胚形成の間に神経膠遺伝子の前に生じることが
、一般に仮定される（Ｌｅｖｉｔｔら、１９８１：Ｊａｃｏｂｓｏｎ、１９７８
）。この表は、神経膠原線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）のような神経膠マーカ
ーまたは神経フィラメントおよび微小管関連タンパク質２（ＮＦ−ＭおよびＭＡ
Ｐ−２）のような神経マーカーの発現を実証する。神経の発達の間の遺伝子発現
のスペクトルは、推定上の最も未熟なニューロスフェアと、最も分化したニュー
ロフェアとの間の差示的な遺伝子発現の出現により、この特定のパネルにおいて
反映される。

【０１６３】 （５．５．０ 実施例５−個々のクローンにおける差示的な遺伝子発現） 異なるヒト脳前駆細胞由来の個々のクローンを調製した。それぞれのセットの
ハウスキーピング遺伝子、細胞表現型遺伝子、および発達遺伝子についてのヒト
ミクロクローンｃＤＮＡパネルのスクリーニングの結果を、表３および４に示す
。この実施例において、９の異なる遺伝子（β−アクチン、β−２−ミクログロ
ブリン、ハウスキーピング遺伝子、ＮＳＥ（ニューロン特異的エノラーゼ（ニュ
ーロン表現型マーカー））、ＰＡＸ−６（発達のマーカーとして使用される、対
ボックス遺伝子）、テネイシン（神経の発達の間に発現される細胞外マトリック
スタンパク質）、ＧＦＡＰ（神経膠原線維酸性タンパク質（星状細胞の細胞骨格
の中間フィラメント表現型マーカー））、ＮＦ−Ｍ（神経フィラメント−Ｍ（ニ
ューロンの細胞骨格のマーカー））、ネスチン（ｎｅｓｔｉｎ）（神経膠および
前駆細胞の中間フィラメントマーカー）およびＭＡＰ２（微小管関連タンパク質
２（ニューロンの細胞骨格表現型マーカー））を含む）がスクリーニングされる
。

【０１６４】 この実施例において、３０のミクロクローンを、ｃＤＮＡプールの調製のため
に使用した。このパネルにおけるプールを、本発明のファージ顕微鏡により決定
されるように、ミクロクローンの大きさおよびフェーズ暗さまたは明度に従って
、配置した。

【０１６５】 （５．５．１ ミクロクローンｃＤＮＡプールの秩序化） 表４に示すミクロクローンパネルを、９の異なる遺伝子の出現に従って、再配
置した。このパネルに存在するミクロクローンの多様性は、表４の左側（ここに
、９の遺伝子がいずれも発現されないミクロクローンの例が存在する）から表４
の右側（ここに、９の遺伝子が全て発現したミクロクローンの例が存在する）へ
の転写発現の変動により反映される。独立した実験データからの一般的な仮定は
、ニューロン遺伝子が、胚形成の間に神経膠遺伝子の前に生じることである（Ｌ
ｅｖｉｔｔら、１９８１：Ｊａｃｏｂｓｏｎ、１９７８）。表４は、ニューロン
マーカーであるニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）の発現を実証することに
より、この仮定を確認する。神経発達の間の遺伝子発現のスペクトルは、最も早
期のミクロクローンと最も後期のミクロクローンとの間の差示的遺伝子発現の出
現により、この特定のパネルに反映される。

【０１６６】 （５．６．０ 実施例６−クローン集団における発達遺伝子およびアポトーシ
ス遺伝子の発現） 正常なヒト幹／前駆細胞および腫瘍細胞の、クローン集団の遺伝子発現プロフ
ィールを比較した。初期の幹細胞および早期の前駆細胞は、血液学的かつリンパ
増殖性の新形成を開始し得る。脳腫瘍もまた、これらの前駆細胞を含むという事
象により、阻害される。

【０１６７】 幹細胞および腫瘍細胞を、個々のミクロクローンとして単離した。ｃＤＮＡを
、これらのクローンから、ならびにクローン混合物から産生した。ＲＴ−ＰＣＲ
を使用して、早期の脳の発達およびアポトーシスに関連する遺伝子の発現を比較
した。

【０１６８】 腫瘍または腫瘍細胞の起源を区別することに加えて、腫瘍における時間的な遺
伝子発現パターンの知識は、これらの腫瘍が由来する患者の診断、予後および処
置ストラテジーにおいて有用である。例えば、種々の段階における腫瘍細胞由来
のミクロクローンからのｃＤＮＡは、遺伝子発現の時間的な秩序化を、これらの
腫瘍段階の関数として導く。従って、特定の腫瘍由来のミクロクローンが特定の
遺伝子発現に関して分析される場合には、この腫瘍の発達段階が決定される。腫
瘍発達の段階（すなわち、例えば、早期または後期）の知識は、その腫瘍が由来
する患者の予後および潜在的な処置プロトコルを決定する際に役立つ。

【０１６９】 単離された腫瘍ミクロクローン由来のｃＤＮＡライブラリーを比較することは
、腫瘍発生のプロセスの間に発現される遺伝子を同定するため、および新たな抗
腫瘍薬物の発見のために、有用である。さらに、腫瘍細胞由来のミクロクローン
の使用は、腫瘍分類のための新たなアプローチを導く。クローニングされた任意
の細胞の分化胎生期発育不全発達は、遺伝子が現れそして消えて、その細胞の発
達の段階を区別するので、連続である。従って、腫瘍は、これらの表現型または
微視的プロフィールよりむしろ、これらの遺伝プロフィールにより規定され得る
。

【０１７０】 異なる原発性神経膠腫由来の集団は、正常なヒト脳幹細胞および前駆細胞の遺
伝子発現に類似する、遺伝子発現の個別のプロフィールを示した。ポリオルニチ
ン／ラミニンを被覆したカバーガラス上にプレートした神経膠腫瘍クローンの二
重免疫染色は、ニューロン（β−ＩＩＩチューブリン）系統および神経膠（ＧＦ
ＡＰ）系統の両方を示した。このことは、個別のクローン内に存在する形態型の
多様性を確認する。これらのデータは、ヒト脳の初期の幹細胞または前駆細胞が
、神経膠腫新生物形質転換に関与し得ることを示す。

【０１７１】 （５．７．０ 実施例７−個々のミクロクローンからの転写物を用いるインサ
イチュハイブリダイゼーション） ｃＤＮＡライブラリーは、ミクロクローンの個々または集団から得られ得る。
ＲＴ−ＰＣＲを、相補的な転写物を生成するために行った。次いで、これらの転
写物を用いて、特定の遺伝子の発現を局在させるために、組織または組織フラグ
メントに戻し得る。

【０１７２】 例えば、ｃＤＮＡライブラリーは、脳細胞ミクロクローンから作製され得る。
ＲＴ−ＰＣＲを、特定の遺伝子について、相補的な転写物を生成させるために、
このライブラリーにおいて行う。次いで、この相補的な転写物を、脳組織または
脳組織フラグメントにハイブリダイズさせて、脳の別個の領域に発現を局在させ
る。他の方法（例えば、免疫標識）と組み合わせて、転写物を用いて、細胞の特
定の集団に、この遺伝子の発現を局在させ得る。この方法は、ミクロクローン性
非クローン化（ｍｉｃｒｏｃｌｏｎａｌ ｕｎｃｌｏｎｅｄ）ｃＤＮＡライブラ
リーから単離した特定の転写物を発現する、脳組織内の特定の脳細胞の同定を導
く。

【０１７３】 （５．８．０ 実施例８−新規遺伝子の単離） クローン＃９および＃２５（表３）を、以前に記載した差引き的な手順に供し
た。差引きハイブリダイゼーション（ＳＳＨを用いる）の産物を、Ｔ／Ａクロー
ニングベクターに挿入し、細菌をエレクトロポレーションを用いて形質転換し、
そして１００を超えるクローンを、さらなる分析のために得た。これらのクロー
ンの９６個を、９６個の選択したクローンの各々についてＰＣＲを使用する挿入
物増幅を用いる詳細な分析のために選択し、そして最後に、９６−ドットｃＤＮ
Ａアレイをさらなるスクリーニングのために調製した。

【０１７４】 偽陽性を回避するために、９６−ドットｃＤＮＡアレイを、順方向差引きプロ
ーブ、および逆方向差引きプローブの両方とハイブリダイズさせた。６個のクロ
ーンを、さらなる詳細な分析のために選択した。ノーザンブロット分析は、行う
必要がなかった。なぜならば、これは、マイクログラム量の幹細胞／前駆細胞−
特異的ｍＲＮＡを必要とするからである。フラグメントのＤＮＡ配列分析を行い
、そして検索をまた、データベース（ＥＭＢＬ、ＧｅｎＢａｎｋ ＰＤＰ、およ
びＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ）で既報告の既に公知の配列に対する選択したフラグメ
ントの相同性について、ＢｌａｓｔＮ／Ｘソフトウェアパッケージを用いて、行
った（表５）。

【０１７５】 （表５ 抑制差引きハイブリダイゼーション（ＳＳＨ）フラグメントの概要）

【０１７６】

【表５】 （５．８．１ クローンの記述） クローンＡ４は、ｈｕｍａｎ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｏｘｉｄａｓｅ ｓｕ
ｂｕｎｉｔ １（これは、全ての好気性生物におけるエネルギー変換に不可欠で
ある）と同一であることを示した。

【０１７７】 クローンＡ１１は、ｈｕｍａｎ ｃａｌｃｙｃｌｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒ
ｏｔｅｉｎ（ＣａｃｙＢＰ）（これは、ヒトおよびマウスの脳およびＥｈｒｌｉ
ｃｈ腹水腫瘍（ＥＡＴ）細胞において同定され、そして主にこれらで発現される
）と同一であることを示した。ＣａｃｙＢＰは、カルサイクリンのように、脳に
存在するので、これらの２つのタンパク質の相互作用は、神経組織におけるカル
シウムシグナル伝達経路に関与し得る。

【０１７８】 クローンＣ６は、データベースで既報告の既知の配列に対して、有意な相同性
を有さなかった。

【０１７９】 クローンＣ９は、データベースで既報告の既知の配列に対して、有意な相同性
を有さなかった。

【０１８０】 クローンＣ１０は、３’ ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ
ｓｔｒｏｍｅｌｙｓｉｎ（結合組織のタンパク質の分解の原因であるヒトメタロ
プロテイナーゼ（ＭＭＰ））に強い相同性を有した。この作用を通じて、これら
は、成長、発生、および組織修復において重要な役割を果たす。最近の研究はま
た、ＭＭＰを癌に用いると、局所的な腫瘍侵襲および腫瘍転移の両方を促進する
ことを示唆する。

【０１８１】 クローンＥ１１は、強い相同性を有さないが、Ｍｙｃ−ｔｙｐｅ，「ｈｅｌｉ
ｘ−ｌｏｏｐ−ｈｅｌｉｘ」ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ ｓｉｇ
ｎａｔｕｒｅを示す。このｍｙｃ遺伝子は、細胞分化および細胞増殖における役
割を果たすと考えられてる。

【０１８２】 クローンＦ４は、以下に対する相同性を示した：

【０１８３】

【化１】 このタンパク質は、カルシウム誘導イオンチャンネル制御、およびＭＡＰキナー
ゼシグナル伝達経路の活性化に関与する。これは、カルシウムフラックスを増加
する神経ペプチド活性化レセプターまたは神経伝達物質の間の重要なシグナル伝
達中間体、およびニューロンの活性を調節する下流シグナルを提示し得る。

【０１８４】

【化２】 これは、ｓｐａｌｔ ｍａｊｏｒ（ｓａｌｍ）遺伝子によりコードされる転写因
子である。これは、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａの胚発生の間に発現される。このタン
パク質は、デカペンタプレジック（ｄｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃ）（ｄｐｐ
）ストライプ（ｓｔｒｉｐｅ）の中心ある、広いくさび（ｂｒｏａｄ ｗｅｄｇ
ｅ）において見出され、そしてＤｐｐシグナル伝達の１つの標的である。

【０１８５】

【化３】 Ｈｕｍａｎ ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌ
ｅ−３（ＩＣＡＭ）−３またはＣＤｗ５０分化抗原は、造血細胞により発現され
、そしてこれまでに、試験された他の細胞によっては発現されない。免疫化学的
研究、機能的研究、およびタンパク質配列決定研究は、このタンパク質が、免疫
応答において重要な役割をおそらく果たすことを示した。

【０１８６】 この方法を用いて、発生／分化の異なる段階でのニューロスフェアの差示的ス
クリーニングを行い得、そしてこのような差示的スクリーニングは、２つのニュ
ーロスフェア（これは、未知の遺伝子および既知の遺伝子を差示的に発現する）
の間の潜在的な差示的遺伝子発現を開示し得る。１組のライブラリーからのスク
リーニングの最初の組では、単一の差引きから、新規の遺伝子が同定され得る。
これは、神経形成および神経細胞分化に重要であるようである。

【０１８７】 （６．０ 参考文献） 以下の参考文献は、これらが、本明細書中に示されるものに対して、模範的な
手順または他の補足を提供するという点で、本明細書中で参考として援用される
。

【０１８８】

【表６】

【０１８９】

【表７】

【０１９０】

【表８】 以下の図面は、本発明の一部を形成し、そして本発明の特定の局面をさらに実
証するために含まれる。本発明は、本明細書中に示される特定の実施形態の詳細
な説明と組み合わせて、添付の図面をとともに以下の説明を参照することによっ
てより良好に理解され得、ここで同様の参照番号は、同様の要素を識別する。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、ミクロクローンの顕微鏡写真であり、この図における挿入図は、１つ
の生体脳ミクロクローンの顕微鏡写真（スケール目盛り＝２０μｍ）である。

【図２】 神経遺伝子探索のためのｃＤＮＡマイクロアレイプールの方法および適用につ
いてのフローチャートである。

【図３】 図３は、複数のミクロクローンに対する１つのミクロクローンからのＲＴ−Ｐ
ＣＲの例示的なサンプル（複数の脳ミクロクローンに対する個々のミクロクロー
ンの種々のニューロンマーカー、神経膠マーカーおよび発生マーカーについての
遺伝子転写物の存在を示すゲルの顕微鏡写真）である；種々の前駆体（例えば、
ネスチン（ｎｅｓｔｉｎ）、細胞外マトリクス（例えば、テナスシン（ｔｅｎａ
ｓｃｉｎ）、ニューロン（例えば、ＭＡＰ−２、神経フィラメント）、神経膠（
例えば、ＧＦＡＰ）遺伝子マーカーを調べるニューロスフェアの集団と比較した
個々からのＲＴ−ＰＣＲ^TM産物を、示す。異なる発生マーカーおよび細胞特異的
マーカーについての転写物を示す成体ニュロースフェアからのＲＴ−ＰＣＲ^TM。
ニューロスフェアの１つ（Ａ〜Ｆ）および集団（Ｇ〜Ｊ）からのＲＴ−ＰＣＲ^TM 。ＤＮＡラダーは、Ａ〜Ｊのいずれかの側にある。Ａ（β−アクチン）；Ｂ（Ｇ
ＦＡＰ）；Ｃ（テナスシン）（ネスト型プライマー）；Ｄ（ネスチン）（ネスト
型プライマー）；Ｅ（神経フィラメント−ｍ）；Ｆ（ＨｕＤ）（ニューロンおよ
びニューロン前駆体マーカー）；Ｇ（β−アクチン）；Ｈ（テナスシン）；Ｉ（
ＧＦＡＰ）（ネスト型プライマー）；およびＪ（ネスチン）（ネスト型プライマ
ー）。

【図４】 図４は、比較分析を行うために使用される反復アルゴリズムの図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ， ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ， ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，Ｋ Ｐ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ， ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，Ｓ Ｇ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ススロフ， オレグ エヌ． アメリカ合衆国 テネシー 38163， メ ンフィス， リンク ビルディング 532， モンロー 855， メンフィス， ザ ユニバーシティ オブ テネシー， デパ ートメント オブ アナトミー アンド ニューロバイオロジー (72)発明者 ステインドラー， デニス エイ． アメリカ合衆国 テネシー 38163， メ ンフィス， リンク ビルディング 532， モンロー 855， メンフィス， ザ ユニバーシティ オブ テネシー， デパ ートメント オブ アナトミー アンド ニューロバイオロジー (72)発明者 クケコフ， バレリー ジー． アメリカ合衆国 テネシー 38017， メ ンフィス， １／２ ジャクソン 1824， ニューロステム， インコーポレイテッ ド Ｆターム(参考） 4B024 AA11 AA20 BA80 CA03 CA04 CA12 HA20 4B065 AA93Y BD50 CA46 CA60

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 神経原性スペクトルを作成するための、多能性神経幹細胞／
   多能性神経前駆細胞の使用であって、以下： 培養した正常な脳の幹細胞／正常な脳の前駆細胞、または罹患した脳の幹細胞
   ／罹患した脳の前駆細胞から単一のニューロスフェアを単離する工程； 該ニューロスフェアを破壊してｍＲＮＡを放出させる工程； ｍＲＮＡの第一鎖合成によってｃＤＮＡを作製する工程； 該第一鎖合成ｃＤＮＡを増幅する工程； 該増幅された第一鎖合成ｃＤＮＡ産物を、神経膠表現型およびニューロン表現
   型を分類するための表現型マーカーについて分析する工程； 該増幅産物から調製したｃＤＮＡライブラリーを、ニューロン細胞の成熟の状
   態に従って配列する工程； 増幅されたｃＤＮＡライブラリーの選択された対を差引き的に比較して、差示
   的な転写物を同定する工程； 神経発生プロフィールを反映する神経発生の遺伝子転写物発現の時間的スペク
   トルを構築する工程、 を包含する使用。
2. 【請求項２】 請求項１に記載の方法によって作成された、時間的な遺伝子
   転写物神経発生プロフィール。
3. 【請求項３】 ニューロスフェアミクロクローンのライブラリーから単離さ
   れた複数の特徴付けされたクローンを含有する時間的な神経形態発生プロフィー
   ルであって、ここで細胞分化の間に各クローンから発現される少なくとも１つの
   神経発生表現型細胞マーカーが、最初に出現した時間に対する発現された表現型
   細胞マーカーの量の順番で配列される場合に、神経発生を表す、プロフィール。
4. 【請求項４】 請求項３に記載のプロフィールであって、ここで前記表現型
   細胞マーカーが、β−アクチン、ＧＦＡＰ、テネイシン、ネスチン、ＭＡＰ−２
   神経フィラメント、神経フィラメント−ｍおよびＨｕＤからなる群から選択され
   るニューロン細胞系列マーカーまたは神経膠細胞系列マーカーである、プロフィ
   ール。
5. 【請求項５】 請求項３に記載のプロフィールであって、ここで前記特徴付
   けされたクローンが、Ｉ型、ＩＩ型またはＩＩＩ型神経多能性細胞を含む、プロ
   フィール。
6. 【請求項６】 請求項３に記載の時間的な神経発生プロフィールによって示
   される、クローンの集団。
7. 【請求項７】 ニューロスフェアから培養された初期Ｉ型細胞由来である、
   請求項６に記載のクローン。
8. 【請求項８】 ニューロスフェアから培養された後期Ｉ型細胞由来である、
   請求項６に記載のクローン。
9. 【請求項９】 ニューロスフェアから培養されたＩＩ型細胞由来である、請
   求項６に記載のクローン。
10. 【請求項１０】 ニューロスフェアから培養されたＩＩＩ型細胞由来である
    、請求項９に記載のクローン。
11. 【請求項１１】 単一の神経幹細胞ニューロスフェア／神経前駆細胞ニュー
    ロスフェアから得られるミクロクローンのライブラリーであって、ここで該ライ
    ブラリーは、クローンの集団を含有し、ここで該クローンの各々は、該クローン
    のゲノム内に、該ニューロスフェアの発生段階に時間的に関連するポリペプチド
    をコードする単離可能なポリヌクレオチドセグメントを含む、ライブラリー。
12. 【請求項１２】 多能性神経幹細胞／多能性神経前駆細胞の発生遺伝子転写
    物の時間的アレイを含む遺伝子転写物スペクトルであって、ここで該スペクトル
    は、以下： 神経幹細胞／神経前駆細胞を培養して、ニューロスフェアを産生する工程； 該ニューロスフェアを破壊して、該ニューロスフェアを含有する第１の選択さ
    れた細胞のＲＮＡを増幅する工程； 該増幅されたＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを調製する工程； 異なる第２の選択された細胞のｃＤＮＡライブラリーから選択されたクローン
    由来のＲＮＡ転写物を差引き的に比較して、神経発生の同定された発生段階に関
    連する転写物を同定する工程； 該転写物を配列して、表現型としての神経細胞発生と関連付けて、該第２の選
    択された細胞について発生遺伝子転写物スペクトルを得る工程、 の工程によって調製される、スペクトル。
13. 【請求項１３】 請求項１２に記載のプロフィールであって、ここで、前記
    神経幹細胞／神経前駆細胞が、初期Ｉ型の多能性幹細胞／多能性前駆細胞を包含
    するニューロスフェアを産生する条件下で培養される、プロフィール。
14. 【請求項１４】 請求項１２に記載の方法であって、ここで、前記神経幹細
    胞／神経前駆細胞が、後期ＩＩ型の多能性幹細胞／多能性前駆細胞を包含するニ
    ューロスフェアまたはミクロクローンを産生する条件下で培養される、方法。
15. 【請求項１５】 請求項１２に記載のプロフィールであって、ここで、前記
    神経幹細胞／神経前駆細胞が、初期ＩＩ型または後期ＩＩ型の多能性幹細胞／多
    能性前駆細胞を包含するニューロスフェアを産生する条件下で培養される、プロ
    フィール。
16. 【請求項１６】 請求項１２に記載のプロフィールであって、ここで、前記
    神経幹細胞／神経前駆細胞が、初期ＩＩＩ型の多能性幹細胞／多能性前駆細胞を
    包含するニューロスフェアを産生する条件下で培養される、プロフィール。
17. 【請求項１７】 請求項１２に記載のプロフィールであって、ここで、前記
    時間的アレイが、少なくとも１つの選択された発生遺伝子を産生するクローンの
    反復する配列によって得られる、プロフィール。
18. 【請求項１８】 請求項１７に記載のプロフィールであって、ここで、前記
    発生遺伝子がノッチ／デルタ遺伝子およびｂＨＬＨ遺伝子からなる群から選択さ
    れる、プロフィール。
19. 【請求項１９】 ヒトニューロスフェアより得られる多能性Ｉ型神経幹細胞
    ／多能性Ｉ型神経前駆細胞の初期発生に関連する遺伝子転写物の集団であって、
    該転写物は、以下： 初期発生Ｉ型神経幹細胞／初期発生Ｉ型神経前駆細胞のみにおける発現；およ
    び ハウスキーピング遺伝子転写物、表現型遺伝子転写物および発生の遺伝子転写
    物とは異なる、 ことによって特徴付けられる、集団。
20. 【請求項２０】 請求項１９に記載の遺伝子転写物の集団であって、ここで
    前記発生遺伝子転写物は、β−アクチン、β−ミクログロブリン、ニューロン特
    異的エノラーゼ、Ｐａｘ−６、テネイシン、神経膠線維性酸性タンパク質、神経
    フィラメント−Ｍ、ネスチンおよび微小管結合蛋白２からなるタンパク質の群か
    ら選択される、集団。
21. 【請求項２１】 請求項１９に記載の遺伝子転写物の集団であって、ここで
    前記発生遺伝子転写物は、ビメンチン、０２Ａ前駆タンパク質、Ｌ１接着タンパ
    ク質、Ａ２Ｂ５、およびβ−ＩＩＩチューブリンからなる群から選択される、集
    団。